特開 2023-27726 ナノ粒子の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023027726

(43)【公開日】2023-03-02

(54)【発明の名称】ナノ粒子の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C01G 49/08 20060101AFI20230222BHJP

   B01J 13/22 20060101ALI20230222BHJP

   C01G 49/00 20060101ALI20230222BHJP

   C01B 33/18 20060101ALI20230222BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20230222BHJP

   A61K 47/04 20060101ALI20230222BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20230222BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20230222BHJP

【ＦＩ】

C01G49/08 A

B01J13/22

C01G49/00 H

C01B33/18 Z

A61K9/14

A61K47/04

A61K47/34

B82Y40/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021133041

(22)【出願日】2021-08-17

(71)【出願人】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構

(74)【代理人】

【識別番号】110000648

【氏名又は名称】弁理士法人あいち国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100087723

【弁理士】

【氏名又は名称】藤谷 修

(74)【代理人】

【識別番号】100165962

【弁理士】

【氏名又は名称】一色 昭則

(74)【代理人】

【識別番号】100206357

【弁理士】

【氏名又は名称】角谷 智広

(72)【発明者】

【氏名】巨 陽

(72)【発明者】

【氏名】森田 康之

(72)【発明者】

【氏名】小林 耕大

【テーマコード（参考）】

4C076

4G002

4G005

4G072

【Ｆターム（参考）】

4C076AA29

4C076AA95

4C076DD29A

4C076EE26

4G002AA04

4G002AA12

4G002AB05

4G002AD04

4G002AE02

4G005AA02

4G005AB09

4G005AB12

4G005BA12

4G005BB12

4G005DA04X

4G005DA05X

4G005DD35Z

4G005DD37Y

4G005DD37Z

4G005EA03

4G072AA25

4G072AA35

4G072AA38

4G072BB15

4G072BB20

4G072EE01

4G072EE10

4G072GG02

4G072HH30

4G072JJ26

4G072KK15

4G072LL06

4G072MM01

4G072MM23

4G072MM33

4G072MM36

4G072QQ06

4G072QQ07

4G072RR05

4G072RR12

4G072UU30

(57)【要約】

【課題】コアを磁性粒子、シェルをメソポーラスシリカとし、シェルの表面にウレイド高分子を付加したナノ粒子について、その粒径を制御すること。
【解決手段】磁性粒子を界面活性剤およびシリカ源を含む溶液に混合し、シリカ源を縮重合させて磁性粒子を覆うシリカを形成し、その後シリカ中の界面活性剤を除去することによりメソポーラスシリカを形成する第１工程と、メソポーラスシリカの表面にアミノ基を修飾し、そのアミノ基をカルボキシ基に置換して活性化させた後、ウレイド高分子を含む溶液を加えてメソポーラスシリカの表面にウレイド高分子を付加する第２工程と、を有する。第１工程において磁性粒子の平均粒径を５～２０ｎｍ、磁性粒子の濃度を０．２～０．３ｍｇ／ｍＬとし、第２工程においてウレイド高分子の濃度を０．５～１ｍｇ／ｍＬとする。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

球状の磁性粒子と、前記磁性粒子を覆う球殻状のメソポーラスシリカと、前記メソポーラスシリカの表面に付加されたウレイド高分子と、を有したナノ粒子の製造方法において、
前記磁性粒子、界面活性剤およびシリカ源を混合し、前記シリカ源を縮重合させて前記磁性粒子を覆うシリカを形成し、その後前記シリカ中の前記界面活性剤を除去することにより前記メソポーラスシリカを形成する第１工程と、
前記メソポーラスシリカの表面にアミノ基を修飾し、そのアミノ基をカルボキシ基に置換して活性化させた後、前記ウレイド高分子を加えて前記メソポーラスシリカの表面に前記ウレイド高分子を付加する第２工程と、
を有し、
前記第１工程において前記磁性粒子の平均粒径を５～２０ｎｍ、前記磁性粒子の濃度を０．２～０．３ｍｇ／ｍＬとし、前記第２工程においてウレイド高分子の濃度を０．５～１ｍｇ／ｍＬとする、
ことを特徴とするナノ粒子の製造方法。

【請求項2】

前記ウレイド高分子は、重量平均分子量が５０００～１０００００のポリアミノ酸を含む溶液にシアン酸塩を加えて反応させることにより作製し、前記ポリアミノ酸の濃度を４０～６０ｍｇ／ｍＬ、反応温度を２０～６０℃、反応時間を１２～４８時間とする、
ことを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。

【請求項3】

前記磁性粒子の粒径の標準偏差は５ｎｍ以下である、ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載のナノ粒子の製造方法。

【請求項4】

前記第１工程において前記シリカ源の濃度を２～６μｇ／ｍＬとする、ことを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、球状の磁性粒子と、磁性粒子を覆う球殻状のメソポーラスシリカと、メソポーラスシリカの表面に付加されたウレイド高分子と、を有したナノ粒子の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ナノ粒子に薬剤を保持させ、ナノ粒子から薬剤を放出させるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が提案されている。特に、光や温度など外部からの刺激によって薬剤の放出を制御することが可能な粒子が注目されている。

【0003】

非特許文献１－３には、コアをマグネタイト、シェルをメソポーラスシリカとする磁性メソポーラスシリカ（ＭＭＳ）のナノ粒子表面にウレイド高分子（ＰＡＵ）を付加したナノ粒子（以下、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子）をＤＤＳに用いることが記載されている。ウレイド高分子は、温度が高くなると疎水性から親水性に相転移する材料である。

【0004】

ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子を用いた薬剤の放出制御は、次のようにして行う。メソポーラスシリカの細孔に薬剤を保持したＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子に対して交流磁場を印加し、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子中のマグネタイトを発熱させる。その熱によってＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子中のＰＡＵを疎水性から親水性に相転移させる。ＰＡＵを親水性とすることでミセル構造を崩壊させ、ＰＡＵによるメソポーラスシリカの細孔の蓋が開放され、細孔から薬剤が放出される。

【0005】

ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子をキャリアとして用いたＤＤＳは、次のような利点がある。第１に、ＭＭＳは生体適合性が高い。第２に、メソポーラスシリカは無機材料で機械的強度が高いため薬剤の漏出の危険性が少ない。第３に、ＰＡＵは相転移温度をある程度自由に設定できるので、体内での薬剤保持、放出の制御が容易に設定できる。第４に、磁場による薬剤放出制御であり、磁場は体内深部まで到達させることが可能であるため、体内深部での薬剤放出制御が可能である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】小林耕大、森田康之、徳悠葵、巨陽、”温度応答性高分子を応用した機能性ＤＤＳの開発”、日本機械学会 第３２回バイオエンジニアリング講演会講演論文集

【非特許文献2】小林耕大、森田康之、脇本卓摩、徳悠葵、巨陽、”放出制御型ＤＤＳの目指したコアシェル型ナノ粒子への温度応答性高分子の利用”、日本機械学会 ２０１８年度年次大会 講演論文集

【非特許文献3】小林耕大、森田康之、脇本卓摩、木村康裕、徳悠葵、巨陽、”温度応答性高分子を利用した放出制御型ＤＤＳキャリアの開発”、日本機械学会 Ｍ＆Ｍ２０１９ 材料力学カンファレンス 講演論文集

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子をＤＤＳに用いる場合、その粒径を制御し、所望の値とする必要がある。たとえば１００ｎｍ以下とすることが望まれている。しかし、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子は、マグネタイトからなるコア、メソポーラスシリカからなるシェル、シェル表面に付加されたＰＡＵの３層構造であるため、粒径を制御するためのパラメータが非常に多数あり、粒径を制御することが難しかった。

【0008】

そこで本開示の目的は、コアを磁性粒子、シェルをメソポーラスシリカとし、シェルの表面にウレイド高分子を付加したナノ粒子について、その粒径を制御することが可能な製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本開示は、球状の磁性粒子と、磁性粒子を覆う球殻状のメソポーラスシリカと、メソポーラスシリカの表面に付加されたウレイド高分子と、を有したナノ粒子の製造方法において、磁性粒子、界面活性剤およびシリカ源を混合し、シリカ源を縮重合させて磁性粒子を覆うシリカを形成し、その後シリカ中の界面活性剤を除去することによりメソポーラスシリカを形成する第１工程と、メソポーラスシリカの表面にアミノ基を修飾し、そのアミノ基をカルボキシ基に置換して活性化させた後、ウレイド高分子を加えてメソポーラスシリカの表面にウレイド高分子を付加する第２工程と、を有し、第１工程において磁性粒子の平均粒径を５～２０ｎｍ、磁性粒子の濃度を０．２～０．３ｍｇ／ｍＬとし、第２工程においてウレイド高分子の濃度を０．５～１ｍｇ／ｍＬとする、ことを特徴とするナノ粒子の製造方法である。

【発明の効果】

【0010】

本開示によれば、コアを磁性粒子、シェルをメソポーラスシリカとし、シェルの表面にウレイド高分子を付加したナノ粒子について、その粒径を制御することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】第１の実施形態に係るＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の構造を示した図。

【図2】マグネタイトナノ粒子のＴＥＭ像。

【図3】ＭＭＳ粒子のＴＥＭ像。

【図4】細孔４の容積と細孔４の半径の関係を示したグラフ。

【図5】分散液を撮影した写真。

【図6】温度と光透過度の関係を示したグラフ。

【図7】ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子のＴＥＭ像。

【図8】時間と薬剤放出率の関係を示したグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0012】

（第１実施形態）
第１実施形態は、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に用いるナノ粒子およびその製造方法に関するものである。まずナノ粒子の構造を説明する。

【0013】

第１実施形態に係るＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子は、図１に示すように、磁性体からなる球状のコア１と、メソポーラスシリカからなりコア１を覆う殻状のシェル２と、を有した磁性メソポーラスシリカ（ＭＭＳ）ナノ粒子と、ＭＭＳナノ粒子のシェル２表面に付加されたウレイド高分子（ＰＡＵ）３と、を有している。

【0014】

（コア１の構成）
コア１は、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）からなり、交流磁場の印加によって発熱させるために用いるものである。コア１は、球状であり、その平均粒径は５～２０ｎｍである。平均粒径を５ｎｍ以上とすることで、コア１の発熱量を十分としている。また、平均粒径を２０ｎｍ以下とすることで、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の粒径が１００ｎｍ以下となるようにしている。

【0015】

ここで本明細書において粒径は、粒子の平面視の形状を楕円で近似し、その楕円の短径とする。たとえば、粒子のＴＥＭ像などの画像を取得し、その画像をＩｍａｇｅＪなどの画像解析ソフトを利用して解析することにより平均粒径を求めることができる。

【0016】

発熱効率の点やＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の粒径を１００ｎｍ以下とする点から、コア１の平均粒径は１０～１５ｎｍがより好ましく、さらに好ましくは１１～１３ｎｍである。また、コア１の粒径の標準偏差は、５ｎｍ以下とすることが好ましく、より好ましくは３ｎｍ以下、さらに好ましくは２ｎｍ以下である。

【0017】

コア１の材料は、マグネタイトの他にも強磁性体であれば任意の材料でよく、鉄、コバルト、ニッケル、酸化クロム、フェライト、などを用いることができる。発熱効率や製造の容易さの点からは、マグネタイト、フェライト、などが好ましい。

【0018】

効率的に発熱させる点から、コア１の形状はなるべく球に近いことが好ましい。たとえば、コア１の平面視の形状を楕円で近似したときに、短径に対する長径の比が１．１以下であることが好ましい。

【0019】

（シェル２の構成）
シェル２は、コア１を覆う球殻状の形状である。シェル２は、メソポーラスシリカからなる。メソポーラスシリカは、規則的に配列された細孔４を有したシリカ（二酸化ケイ素）である。細孔の直径は２～５０ｎｍである。この細孔４に薬剤を保持する。

【0020】

ここで細孔４の直径は、ＮＬＤＦＴ法によって求めた細孔４の直径分布におけるピーク値とする。細孔４の直径を２ｎｍ以上とすることで、薬剤の保持量を十分に高くすることができる。また、細孔４の直径を５０ｎｍ以下とすることで、シェル２からの薬剤の漏れを抑制し、シェル２の物理的強度を十分とすることができる。より好ましい細孔４の直径の範囲は、３～４０ｎｍ、さらに好ましくは３～３０ｎｍである。

【0021】

ＭＭＳナノ粒子の平均粒径は、２０～８０ｎｍであることが好ましい。平均粒径を２０ｎｍ以上とすることで、シェル２を十分に厚くすることができ、薬剤の保持量を十分に高めることができる。また、平均粒径を８０ｎｍ以下とすることで、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の粒径を１００ｎｍ以下とすることが容易となる。より好ましくは３０～７５ｎｍ、さらに好ましくは４０～７０ｎｍである。また、ＭＭＳナノ粒子の粒径の標準偏差は、１５ｎｍ以下が好ましく、より好ましくは１０ｎｍ以下、さらに好ましくは８ｎｍ以下である。

【0022】

（ＰＡＵ３について）
ＰＡＵ３は、シェル２の表面に付加されている。ＰＡＵ３は、温度が上昇すると疎水性から親水性に相転移するウレイド高分子である。ウレイド高分子は、アミノ酸が重合したポリアミノ酸であって、その側鎖の一部にウレイド基が結合している（ウレイド化されている）物質である。ＰＡＵ３が疎水性の場合、シェル２表面のＰＡＵ３はミセル構造を作り、シェル２の細孔４開口を覆って蓋をした状態となる。そのため、細孔４に保持された薬剤は外に拡散しない。一方、ＰＡＵ３が親水性の場合、シェル２表面のＰＡＵ３のミセル構造は崩壊し、シェル２の細孔４開口は覆われない状態となる。そのため、細孔４に保持された薬剤は外に拡散する。

【0023】

ＰＡＵ３の相転移温度は、ウレイド化率によって制御することができ、ウレイド化率が高いほど相転移温度を高くすることができる。ＤＤＳに用いる場合、生体深部の温度はおよそ３７℃であることから、相転移温度が３８℃以上となるようにウレイド化率を設定する。相転移温度は理想的には一意に決まるが、実際のＰＡＵ３では、各分子のウレイド化率にばらつきを有するため、相転移温度に幅を有する。そのため、ウレイド化率のばらつきをなるべく抑えることが好ましい。たとえば、相転移温度の幅が５℃以下となるようにすることが好ましい。より好ましくは４℃以下である。また、ウレイド化率の平均は、たとえば９０～９５％である。

【0024】

ＰＡＵ３の重量平均分子量Ｍｗは、たとえば５０００～１０００００である。Ｍｗが高いほどＰＡＵ３の相転移温度は高くなる。

【0025】

ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の平均粒径は、１００ｎｍ以下である。ＤＤＳのキャリアとして用いる場合、肝臓や脾臓などの細胞内皮系に属する臓器に捕獲されないようにする必要があり、またＥＰＲ効果を発現させるためである。ＥＰＲ効果は、固形がん組織において高分子が長く保持される現象である。より好ましいＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の平均粒径は、９０ｎｍ以下である。また、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の粒径の標準偏差は、２０ｎｍ以下が好ましく、より好ましくは１５ｎｍ以下である。

【0026】

（薬剤の放出制御について）
ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子を用いた薬剤の放出制御について説明する。

【0027】

まず、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子のシェル２の細孔４に薬剤を保持させる。ＰＡＵ３の相転移温度未満の温度において、薬剤を含む溶液にＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子を混合して超音波処理することにより、細孔４に薬剤を含む溶液を充填する。振とうによってＰＡＵ３による細孔４の蓋を一時的に開放させ、その間に細孔４に薬剤を含む溶液を充填するものである。振とうを止めると細孔４は元通りにＰＡＵ３により蓋をされるため、薬剤を保持することができる。他の方法として、薬剤を含む溶液にＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子を混合してＰＡＵ３の相転移温度以上の温度に加熱し、その後に相転移温度未満の温度に冷却することで細孔４に薬剤を含む溶液を充填してもよい。

【0028】

ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子が保持する薬剤を放出するためには、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子に交流磁場を印加する。交流磁場の印加によりコア１が発熱し、その熱がＰＡＵ３に伝導して相転移温度以上になると、ＰＡＵ３は疎水性から親水性に相転移して細孔４の蓋が開放される。これにより、細孔４に保持された薬剤が外に拡散される。交流磁場の周波数を３００ｋＨｚ以上とすることで、コア１を効率的に発熱させることができる。また、磁場の印加による制御であるため、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子が体内深部であっても薬剤を放出させることができる。

【0029】

（ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の製造方法）
次に、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の製造方法について説明する。

【0030】

まず、平均粒径が５～２０ｎｍのマグネタイトからなる磁性粒子を用意する。このような磁性粒子は、たとえば熱分解法によって作製することができる。熱分解法は、有機溶媒中で金属錯体を熱分解することで金属ナノ粒子を生成する方法である。熱分解法では、金属錯体と配位子のモル比や、加熱温度などによって平均粒径を制御することができる。熱分解法を用いることにより、鉄のような遷移金属のナノ粒子を容易に作製することができる。

【0031】

金属錯体は、鉄－オレイン酸錯体などを用いることができる。

【0032】

次に、磁性粒子の表面に、テンプレート法を用いてメソポーラスシリカを形成して、コア１を磁性粒子、シェル２をメソポーラスシリカとするＭＭＳナノ粒子を作製する。テンプレート法では、次のようにしてメソポーラスシリカを作製する。まず、磁性粒子を界面活性剤およびシリカ源を含む溶液に混合する。界面活性剤は磁性粒子の表面にミセルを形成する。このミセルを型として、シリカ源を縮重合させて磁性粒子を覆うシリカを形成する。その後、シリカ中の界面活性剤を除去して細孔４とすることにより、メソポーラスシリカを形成する。シリカ中の界面活性剤は、加熱により分解除去したり、塩酸などによりエッチングしたりすることで除去することができる。

【0033】

界面活性剤には、臭化セチルトリメチルアンモニウムなどを用いることができる。

【0034】

シリカ源には、テトラエチルオルトケイ酸（ＴＥＯＳ）、テトラメチルオルトケイ酸、テトラプロピルオルトケイ酸、などを用いることができる。

【0035】

ここで、磁性粒子の濃度（溶液に磁性粒子を混合した時点での濃度）は、０．２～０．３ｍｇ／ｍＬとする。これにより、ＭＭＳナノ粒子の平均粒径を十分に小さく制御することができ、最終的なＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の粒径を１００ｎｍ以下に制御することができる。より好ましくは０．２～０．２６ｍｇ／ｍＬである。

【0036】

ここで、シリカ源の濃度（溶液に磁性粒子を混合した時点での濃度）は、２～６μｇ／ｍＬとすることが好ましい。ＭＭＳナノ粒子の作製成功率を向上させることができる。より好ましくは、４～６μｇ／ｍＬである。

【0037】

一方で、ＰＡＵ３を作製する。ＰＡＵ３は、ポリアミノ酸を含む溶液にシアン酸塩を加えてポリアミノ酸の側鎖の一部にウレイド基を導入する反応をさせることにより作製する。ＰＡＵ３の相転移温度は、ウレイド化率によって制御することができ、３７℃以上とすることができる。なお、側鎖の全部にウレイド基を導入すると、ＭＭＳナノ粒子の表面にＰＡＵ３を付加することができなくなるため、ウレイド化率は１００％未満とする。好ましくは９０～９９％、さらに好ましくは９５～９８％である。

【0038】

ポリアミノ酸は、ポリアリルアミン（ＰＡＡ）などである。

【0039】

ポリアミノ酸の重量平均分子量Ｍｗは、５０００～１０００００とする。この範囲とすることで、ＰＡＵ３の相転移温度を３７℃以上とすることが容易となる。より好ましくは７０００～５００００、さらに好ましくは８０００～２００００である。

【0040】

ポリアミノ酸の濃度（溶液にシアン酸塩を加えた時点での濃度）は４０～６０ｍｇ／ｍＬ、反応温度は２０～６０℃、反応時間は１２～４８時間とする。このようにポリアミノ酸の濃度を低くし、反応温度を低くして長時間反応させることにより、ＰＡＵ３のウレイド化率を揃えることができ、相転移温度の幅を小さくすることができる。

【0041】

より好ましいポリアミノ酸の濃度は、４５～５９ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５２～５８．５ｍｇ／ｍＬである。

【0042】

より好ましい反応温度は、４０～６０℃、さらに好ましくは５０～６０℃である。

【0043】

より好ましい反応時間は、２４～４８時間、さらに好ましくは３６～４８時間である。

【0044】

次に、ＭＭＳナノ粒子のシェル２表面に、ＰＡＵ３をアミド結合させて付加する。ＰＡＵ３の付加は、次のようにして行う。

【0045】

まず、シェル２の表面にアミノ基を修飾する。アミノ基の修飾は、アミノプロピルエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、アミノプロピルメトキシシラン、などのシランカップリング剤を混合した溶液に、ＭＭＳナノ粒子を混合することで行うことができる。

【0046】

次に、ＭＭＳナノ粒子のシェル２表面に修飾されたアミノ基をカルボキシ基に置換して活性化させる。アミノ基のカルボキシ基への置換は、無水コハク酸、無水マレイン酸、などを溶解した溶液に、ＭＭＳナノ粒子を混合することで行うことができる。また、カルボキシ基の活性化は、１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ－ジヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）などの架橋剤を溶解した溶液に、カルボキシ基が修飾されたＭＭＳナノ粒子を混合することで行うことができる。

【0047】

次に、カルボキシ基が修飾されたＭＭＳナノ粒子を含む溶液に、ＰＡＵ３を加える。これにより、ＭＭＳナノ粒子の表面に修飾されたカルボキシ基と、ＰＡＵ３の側鎖のアミノ基をアミド結合させる。以上によりＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子が作製される。

【0048】

ＰＡＵ３の濃度（溶液にＰＡＵ３を加えた時点での濃度））は、０．５～１ｍｇ／ｍＬとする。ＰＡＵ３の濃度によってＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の粒径を制御することができ、濃度範囲を上記範囲とすることによりＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の平均粒径を１００ｎｍ以下に制御することができる。

【0049】

以上、第１実施形態によれば、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の粒径を制御することができ、平均粒径を１００ｎｍ以下とすることができる。そのため、ＤＤＳのキャリアとしてＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子を利用することができる。なお、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子は、ＤＤＳのキャリア以外に、温熱治療にも用いることができる。

【実施例0050】

１．マグネタイトナノ粒子の作製
まず、エタノール（８０ｍＬ）、純水（６０ｍＬ）、ヘキサン（１４０ｍＬ）を混合し、その溶液に塩化鉄（III）六水和物（１０．８ｇ）、オレイン酸ナトリウム（３６．５ｇ）を加えて溶解させた。次に、その溶液を４５０ｒｐｍで攪拌しながら７０℃まで加熱し、その後、同温、同回転数で４時間攪拌した。次に、溶液の有機層を分液ロートにより回収し、純水で３回洗浄後、ロータリエボパレータを用いて９０℃で減圧濃縮し、溶媒を除去した。さらに、残渣を７０℃で一晩真空乾燥させて溶媒をさらに除去した。このようにして鉄－オレイン酸錯体を作製した。

【0051】

次に、１－オクタデセン（２００ｇ）、オレイン酸（５．７ｇ）を混合し、その混合溶液に上記により作製した鉄－オレイン酸錯体（３６ｇ）を溶解させ、加熱攪拌した。攪拌の回転数は２００ｒｐｍ、昇温速度は３．３℃／ｍｉｎで３２０℃まで加熱し、その後は同温、同回転数で３０分間攪拌した。その後、自然冷却により溶液を室温に戻し、ヘキサンとアセトンを１：５で混合した混合液を２００ｍＬ添加してマグネタイトナノ粒子を析出させた。このナノ粒子を含む溶液を回転数８０００ｒｐｍの遠心分離にかけて、溶液の上澄みを取り除き、マグネタイトナノ粒子を回収した。

【0052】

回収したナノ粒子をヘキサンとアセトンを１：５で混合した混合液（５０ｍＬ）に加え、超音波洗浄機により洗浄後、遠心分離を行ってナノ粒子を回収した。この作業を３回繰り返し、不純物を取り除いた。

【0053】

得られたマグネタイトナノ粒子のＴＥＭ像を図２に示す。図２のように、マグネタイトナノ粒子は均一な粒径であることがわかった。ＴＥＭ像を画像解析ソフトＩｍａｇｅＪによって解析し、粒径を求めた。具体的にはＴＥＭ像を二値化して粒子を楕円で近似し、その短軸の長さとして粒径を求めた。その結果、平均粒径は１２．５ｎｍ、標準偏差は１．６ｎｍであった。粒径１０～１５ｎｍの粒子が約９５％を占めており、粒径分布が非常に狭いことがわかった。また、粒子のアスペクト比（長径／短径）は全ての粒子が１．２５以下であり、約８０％の粒子が１．１以下であり、形状が球状に近いことがわかった。

【0054】

２．ＭＭＳナノ粒子の作製
純水を水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）によってｐＨ１２に調製し、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を溶解させ、ＣＴＡＢの濃度を１５ｍｇ／ｍＬとし、７０℃で１時間攪拌した。また一方で、上記により作製したマグネタイトナノ粒子を濃度２３．４ｍｇ／ｍＬとなるようにクロロホルム中に分散させ、１時間超音波処理した。次に、ＣＡＴＢの溶液に、マグネタイトナノ粒子を分散させた分散液１ｍＬを３０分かけて滴下し、その後温度を８０℃まで上げて１時間攪拌した。これにより、マグネタイトナノ粒子表面にＣＴＡＢを付加してミセル構造を生じさせた。

【0055】

次に、テトラエチルオルトケイ酸（ＴＥＯＳ）を０．１５ｍＬ滴下して３０分間攪拌し、さらにＴＥＯＳを０．７５ｍＬ滴下して１．５時間攪拌した。次に、溶液を回転数８０００ｒｐｍの遠心分離にかけて、溶液の上澄みを取り除いた。これにより、マグネタイトナノ粒子をコア１とし、そのコア１をシリカからなるシェル２が覆うナノ粒子を得た。次に得られたナノ粒子をエタノールに加え、超音波処理した後、遠心分離を行って上澄みを取り除いた。この作業を３回繰り返し、不純物を取り除いた。その後、真空乾燥させた。

【0056】

次に、得られたナノ粒子を８００℃で６時間加熱した。これにより、シェル２中に残るＣＴＡＢを除去した。ＣＴＡＢの部分が細孔として残り、シェル２はメソポーラスシリカとなった。このようにして、ＭＭＳナノ粒子を作製した。

【0057】

得られたＭＭＳナノ粒子のＴＥＭ像を図３に示す。図３のように、ＭＭＳナノ粒子は均一に分散しており、マグネタイトナノ粒子からなるコア１に均一な厚さのシェル２を有した構造であることがわかった。図３中、粒子の中心部の黒い点状の領域がマグネタイトからなるコア１であり、その周囲の部分がメソポーラスシリカからなるシェル２である。ＴＥＭ像を画像解析ソフトＩｍａｇｅＪによって解析し、粒径を求めた。その結果、平均粒径は６６．１ｎｍ、標準偏差は７．５４ｎｍであった。ＤＤＳのキャリアとして十分に適用できる大きさでなることが確認できた。

【0058】

ＭＭＳナノ粒子のシェル２の細孔の半径をＮＬＤＦＴ法によって測定した。図４は、細孔４の容積と細孔４の半径の関係を示したグラフである。図４のように、細孔４の半径のピークは２．６ｎｍであり、ＭＭＳナノ粒子のシェル２は薬剤の保持に適した細孔４を有していることがわかった。

【0059】

３．ＰＡＵの作製
和光株式会社製のポリアリルアミン塩酸塩（Ｍｗ：１５０００）（１１７０ｍｇ）と純水２０ｍＬを混合した。また一方で、シアン酸カリウム（ＫＯＣＮ）（４０５ｍｇ）を純水１ｍＬに溶解させた。そして、混合溶液にＫＯＣＮの溶液を少しずつ滴下した。そして、６０℃に加熱して４８時間攪拌し、これによりＰＡＵ３を生成した。その後、副生成物の塩化カリウムを透析チューブに２４時間かけて除去した。さらに遠心分離を１２０００ｒｐｍで３０分間行い、ＰＡＵ３を得た。また、この際、ＰＡＵ３が疎水性となるように、生理食塩水中、低温で行った。

【0060】

上記により作製したＰＡＵ３をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に分散させ、その分散液を観察した。図５は、分散液を撮影した写真であり、図５（ａ）は低温下、図５（ｂ）は高温下である。図５のように、分散液は低温下では白濁、高温下では無色透明であった。これは、低温ではＰＡＵ３が疎水性となり吸光するためである。このように、ＰＡＵ３は温度上昇によって疎水性から親水性に相転移することが確認できた。

【0061】

ＰＡＵ３をＰＢＳに分散させた分散液について、分光光度計を用いて光の透過度の測定を行った。図６は、温度と光透過度の関係を示したグラフである。光透過度は、ＰＢＳの透過度を１００％として規格化した値である。透過度が高いほど、親水性のＰＡＵ３の割合が高い状態である。図６のように、作製したＰＡＵ３は、３９～４１℃で急激に疎水性から親水性に相転移していることがわかった。相転移温度は一意に決まるのが理想であるが、実際にはＰＡＵ３のウレイド基の導入率が一定でないため、相転移温度に幅が生じていると考えられる。作製したＰＡＵ３は相転移温度に幅を有するものの、体内に投与した時点では疎水性であることがわかった。

【0062】

４．ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の作製
アミノプロピルエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）（１ｍＬ）とエタノール（８０ｍＬ）の混合溶液に、上記作製したＭＭＳナノ粒子を加え、室温にて２００ｒｐｍで２４時間攪拌してＭＭＳナノ粒子を分散させた。これにより、ＭＭＳナノ粒子の表面にアミノ基を導入した。以下、このナノ粒子をＭＭＳ－アミノ基ナノ粒子とする。

【0063】

その後、分散液に対して遠心分離を行い、上澄みを除去し、エタノール（５０ｍＬ）を加え、超音波洗浄した。これを３回繰り返して余剰な物質を取り除いた。

【0064】

次に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＦ）（２０ｍＬ）に無水コハク酸（３ｇ）を溶解させ、その溶液に上記作製したＭＭＳ－アミノ基ナノ粒子を加え、室温にて２００ｒｐｍで２４時間攪拌し、ＭＭＳ－アミノ基ナノ粒子を分散させた。これにより、ＭＭＳ－アミノ基ナノ粒子中のアミノ基をカルボキシ基に置換した。以下、このナノ粒子をＭＭＳ－カルボキシル基ナノ粒子とする。

【0065】

その後、ＭＭＳ－カルボキシ基ナノ粒子の分散液に対して遠心分離を行い、上澄みを除去してエタノール（５０ｍＬ）を加え、超音波処理した。この作業を３回繰り返し、余剰な物質を取り除いてＭＭＳ－カルボキシ基ナノ粒子の純度を高めた。

【0066】

純水に上記作製したＭＭＳ－カルボキシ基ナノ粒子を１ｍｇ／ｍＬの濃度で分散させた。その分散液（３０ｍＬ）に１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（３０ｍｇ）、Ｎ－ジヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）（９ｍｇ）を混合して３０分間超音波処理し、その後、３０分間攪拌した。これにより、ＭＭＳ－カルボキシ基ナノ粒子のカルボキシ基を活性化した。

【0067】

次に、分散液にＰＡＵ３溶液（１ｍＬ）を加えて２４時間振とうした。ＰＡＵ３溶液は溶媒を純水とし、ＰＡＵ３の濃度が２０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。これにより、ＭＭＳナノ粒子の表面にＰＡＵ３をアミド結合させて付加し、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子を生成した。

【0068】

次に、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の分散液に対して遠心分離を行い、上澄みを除去し、純水（３０ｍＬ）を加え、超音波処理した。さらにもう一度遠心分離を行い、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子を回収した。

【0069】

作製したＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子のＴＥＭ像を図７に示す。図７のＭＭＳナノ粒子に比べて全体的に粒子径が大きく、色も黒く曇っていることがわかった。これは、ＭＭＳにＰＡＵが付加したためと考えられる。ＴＥＭ像を画像解析ソフトＩｍａｇｅＪによって解析し、粒径を求めた。その結果、平均粒径は８８．５ｎｍ、標準偏差は１１．２ｎｍであった。これは、ＤＤＳのキャリアとして十分に適用できる大きさ（１００ｎｍ以下）であることが確認できた。

【0070】

次に、作製したＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子によって薬剤の放出を制御可能かどうか、実際に確認した。薬剤はドキソルビシン塩酸塩（ＤＯＸ）とした。

【0071】

まず、ＤＯＸを純水に溶解させてその濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。この溶液に、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子（３０ｍｇ）を分散させた。そして、１時間超音波処理し、室温下で２４時間振とうした。その後、分散液に対して８０００ｒｐｍで遠心分離を行い、上澄みを除去した。これにより、シェル２の細孔４にＤＯＸの溶液を保持させた。

【0072】

さらに、ＰＢＳ（３ｍＬ）にＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子を分散させ、回転数８０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを除去した。この作業を４回繰り返して余剰な物質を取り除いた。

【0073】

ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子を分散させる前のＤＯＸ溶液の吸光度と、上澄み液、洗浄液の吸光度から、ＤＯＸを保持したＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の薬剤充填量を測定したところ、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子１ｍｇ当たり７２μｇのＤＯＸを含むことがわかった。

【0074】

ＤＯＸを保持したＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子（１５ｍｇ）をＰＢＳ（３ｍＬ）に分散させ、その分散液を透析チューブに入れた。さらに、その透析チューブをＰＢＳ（３０ｍＬ）中に投入した。そして、３７℃にて振とうしながら、透析チューブの外側のＰＢＳの吸光度を測定した。吸光度が一定となった８時間後に、ＤＯＸを保持するＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子に磁場を印加した。磁場は周波数４１５ｋＨｚ、磁場の強さ２．２５ｋＡ／ｍの交流磁場で、印加時間は３分とした。磁場の印加後、再び３７℃にて振とうしながら、透析チューブの外側のＰＢＳの吸光度を測定した。

【0075】

求めた吸光度から薬剤放出率を求めた。図８は、時間と薬剤放出率の関係を示したグラフである。図８のように、磁場を印加していない状態では、５時間経過当たりまでは時間とともに薬剤放出率が約１０％まで徐々に上昇するが、それ以降は薬剤放出率が一定となった。これは、３７℃ではＰＡＵ３の相転移温度未満であるためＰＡＵ３が疎水性でミセル構造を作っており、ＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子の細孔４に保持されたＤＯＸがＰＡＵ３のミセル構造により蓋をされて外にほとんど拡散しないためであると考えられる。また、８時間後に磁場を印加すると、薬剤放出率が急激に上昇し、約７５％に達していることがわかった。これは、磁場の印加によってＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子のコア１が発熱し、その熱が伝導してＰＡＵ３が加熱され、ＰＡＵ３の相転移温度以上の温度に加熱されて親水性となり、ミセル構造が崩壊して細孔４に保持されていたＤＯＸが外に拡散したためであると考えられる。以上の結果、実施例１により作製したＭＭＳ－ＰＡＵナノ粒子は、磁場の印加によって薬剤の放出制御が可能であることがわかった。

【産業上の利用可能性】

【0076】

本開示のナノ粒子は、ドラッグデリバリーシステムのキャリアとして利用することができる。

【符号の説明】

【0077】

１：コア
２：シェル
３：ＰＡＵ
４：細孔

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】