特開 2023-29376 カナバン病の治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023029376

(43)【公開日】2023-03-03

(54)【発明の名称】カナバン病の治療

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20230224BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230224BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20230224BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20230224BHJP

   A61K 35/33 20150101ALI20230224BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20230224BHJP

   A61K 35/35 20150101ALI20230224BHJP

   A61K 35/36 20150101ALI20230224BHJP

   C12N 5/0797 20100101ALI20230224BHJP

   A61K 35/30 20150101ALN20230224BHJP

   A61K 35/545 20150101ALN20230224BHJP

   C12N 9/80 20060101ALN20230224BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20230224BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230224BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20230224BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

A61P25/00

A61K35/12

A61L27/38 300

A61K35/33

A61K35/15

A61K35/35

A61K35/36

C12N5/0797

A61K35/30

A61K35/545

C12N9/80

C12N15/55

C12N15/09 100

C12N15/63

【審査請求】有

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022199966

(22)【出願日】2022-12-15

(62)【分割の表示】P 2018567237の分割

【原出願日】2017-06-22

(31)【優先権主張番号】62/353,515

(32)【優先日】2016-06-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】598004424

【氏名又は名称】シティ・オブ・ホープ

【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100091214

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 進介

(72)【発明者】

【氏名】シ，ヤンホン

(72)【発明者】

【氏名】チャオ，ジャンフェイ

(72)【発明者】

【氏名】リ，ウェンドン

(57)【要約】

【課題】
被験体の脳において外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させることにより、被験体のＡＳＰＡ酵素活性を回復させることにより、被験体のカナバン病を治療する方法である。
【解決手段】
外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現する、ＮＰＣ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞を作製する方法、並びに、当該方法によって作製された神経前駆細胞である。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）神経前駆細胞を製造する方法であって、以下の：
カナバン病に罹患した被験体から分離した体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）にリプログラミング又は変換すること、
前記ｉＰＳＣに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入し、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣを得ること、
前記遺伝学的に修正されたｉＰＳＣを神経前駆細胞に分化させること；及び
ＣＤ１３３の正の選択とＳＳＥＡ４の負の選択により、前記神経前駆細胞を選別すること、
を含む方法。

【請求項2】

アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）神経前駆細胞を製造する方法であって、以下の：
カナバン病に罹患した被験体から分離した体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）にリプログラミング又は変換すること、
前記ｉＰＳＣを神経前駆細胞へ分化させること、
前記神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入し、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得ること；及び
ＣＤ１３３の正の選択及びＳＳＥＡ４の負の選択により、前記遺伝的に修正された神経前駆細胞を選別すること、
を含む方法。

【請求項3】

リプログラミングは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８及びＭＹＣを含む１つ以上のリプログラミング因子の存在下で行われる、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

リプログラミングは、エピソーマルなリプログラミング又はウイルス導入により行われる、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

リプログラミングされたｉＰＳＣのＡＳＰＡ遺伝子は、１つ以上の変異を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項6】

ＡＳＰＡ遺伝子の変異はヘテロ接合性変異である、請求項５記載の方法。

【請求項7】

ＡＳＰＡ遺伝子の変異はホモ接合体変異である、請求項５記載の方法。

【請求項8】

ＡＳＰＡ遺伝子の変異は、５２７Ｇ＞Ａ、９１４Ｃ＞Ａ、又は８５４Ａ＞Ｃである、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

体細胞は、線維芽細胞、血球、泌尿器細胞（ｕｒｉｎａｒｙ ｃｅｌｌｓ）、脂肪細胞、ケラチノサイト、歯髄細胞等の利用できる体細胞である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項10】

野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入することは、野生型ＡＳＰＡ遺伝子を含むベクターでｉＰＳＣ又は神経前駆細胞を形質転換するか、又は遺伝子編集技術による、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項11】

ベクターはレンチウイルスである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

神経前駆細胞は、ＮＰＣ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項13】

被験体のカナバン病の治療に用いるための、請求項１～１２のいずれか一項により製造された神経前駆細胞であって、前記神経前駆細胞は被験体の脳内に移植され、それにより被験体のＡＳＰＡ酵素活性が回復される、神経前駆細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［優先権の主張］
本出願は、２０１６年６月２２日に出願された発明の名称が「カナバン病の治療」である米国仮特許出願第６２／３５３，５１５号の優先権を主張し、当該米国仮特許出願は、本明細書において完全に記載されているように、その全体について参照により援用される。
［政府出資の陳述］
本発明は、カリフォルニア再生医療機構（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅ）によって与えられた認可番号ＴＲ２－０１８３２及びＲＢ４－０６２７７の下で政府の支援を受けてなされた。

【背景技術】

【0002】

カナバン病（Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＣＤ）は、幼児期に発症して急速に進行する症状を伴う破壊的な神経疾患である。起こり得る症状としては、精神遅滞、獲得された運動能力の喪失、摂食困難、異常な筋緊張、巨頭、麻痺、盲目及び聴力損失があげられる。カナバン病は、脳内のオリゴデンドロサイト（乏突起膠細胞）によって合成される代謝酵素をコードする、アスパルトアシラーゼ（ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ）（ＡＳＰＡ）遺伝子の遺伝子変異によって発症する（非特許文献１５）。ＡＳＰＡは、脳内に非常に豊富に存在するアミノ酸誘導体である、Ｎ－アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）を分解する。ＮＡＡの産生と分解のサイクルは、ミエリンによって覆われる神経線維からなる脳の白質を維持するために、決定的に重要であると思われる。カナバン病の兆候としては、ＡＳＰＡ活性の欠如、脳内のＮＡＡの蓄積、並びに脳の海綿状変性及び脱髄化があげられる。

【0003】

近年、カナバン病に対する潜在的な治療法の開発に指向したより多くの研究が開始されている。ヒトＡＳＰＡ発現非ウイルスベクター又はＡＡＶベクターを用いたカナバン病に対する遺伝子療法は、カナバン病動物モデル、及びカナバン病患者に対する臨床試験でともに報告されている（非特許文献１６～２２）。これらの研究は、ＡＳＰＡベクターが動物とヒトの被験体ともに十分な耐容性を示し、様々な生化学的及び臨床的な改善が観察されていることを実証している（非特許文献１６～２２）。修飾されたＡＳＰＡタンパク質は、カナバン病マウスモデルにおいて酵素補充療法としての潜在的な使用について試験されている（非特許文献２３）。治療を受けたマウスの脳において、高められたＡＳＰＡ活性及び低下させられたＮＡＡレベルが観察された（非特許文献２３）。それが海綿状の変性、脱髄及び運動機能障害を改善することができるかどうかは、なお試験が必要である。リチウムは、カナバン病動物モデル及び患者において評価されており、ＮＡＡレベルを低下させ、ＣＤ様ラット及びＣＤ患者において正常なミエリン発達に指向する傾向を誘発することが示されている。しかしながら、それではカナバン患者の運動機能は改善されない。食事性のグリセリルトリアセテート及びトリヘプタノインは、カナバン病動物モデルで試験されており、治療されたマウスにおいてミエリン形成及び運動能力の改善が観察されている。しかしながら、ＮＡＡレベルの低下は観察されず、病理学的特質の部分的な寛解しか観察されなかった。現在まで、これらの手法のいずれも、疾患表現型の完全な克服を達成していない。この病気に対する治癒法も標準治療もまだない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｏｈｎｕｋｉ，Ｍ．，Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，Ｔｏｍｏｄａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ １３１，８６１－８７２（２００７）．

【非特許文献2】Ｙｕ，Ｊ．，Ｖｏｄｙａｎｉｋ，Ｍ．Ａ．，Ｓｍｕｇａ－Ｏｔｔｏ，Ｋ．，Ａｎｔｏｓｉｅｗｉｃｚ－Ｂｏｕｒｇｅｔ，Ｊ．，Ｆｒａｎｅ，Ｊ．Ｌ，Ｔｉａｎ，Ｓ．，Ｎｉｅ，Ｊ．，Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ，Ｇ．Ａ．，Ｒｕｏｔｔｉ，Ｖ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｒ．，Ｓｌｕｋｖｉｎ，ＩＩ，ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８，１９１７－１９２０（２００７）．

【非特許文献3】Ｌｏｗｒｙ，Ｗ．Ｅ．，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｌ，Ｙａｃｈｅｃｈｋｏ，Ｒ．，Ｐｙｌｅ，Ａ．Ｄ．，Ｔｃｈｉｅｕ，Ｊ．，Ｓｒｉｄｈａｒａｎ，Ｒ．，Ｃｌａｒｋ，Ａ．Ｔ．，ａｎｄ Ｐｌａｔｈ，Ｋ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５，２８８３－２８８８（２００８）．

【非特許文献4】Ｐａｒｋ，Ｉ．Ｈ．，Ｚｈａｏ，Ｒ．，Ｗｅｓｔ，Ｊ．Ａ．，Ｙａｂｕｕｃｈｉ，Ａ．，Ｈｕｏ，Ｈ．，Ｉｎｃｅ，Ｔ．Ａ．，Ｌｅｒｏｕ，Ｐ．Ｈ．，Ｌｅｎｓｃｈ，Ｍ．Ｗ．，ａｎｄ Ｄａｌｅｙ，Ｇ．Ｑ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ（２００８）．

【非特許文献5】Ｒａｙａ，Ａ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｐｉｚａ，Ｉ．，Ｇｕｅｎｅｃｈｅａ，Ｇ．，Ｖａｓｓｅｎａ，Ｒ．，Ｎａｖａｒｒｏ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｒｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｏｎｓｉｇｌｉｏ，Ａ．，Ｃａｓｔｅｌｌａ，Ｍ．，Ｒｉｏ，Ｐ．，Ｓｌｅｅｐ，Ｅ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．，Ｔｉｓｃｏｒｎｉａ，Ｇ．，Ｇａｒｒｅｔａ，Ｅ．，Ａａｓｅｎ，Ｔ．，Ｖｅｉｇａ，Ａ．，Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｓｕｒｒａｌｌｅｓ，Ｊ．，Ｂｕｅｒｅｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｉｚｐｉｓｕａ Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，Ｊ．Ｃ．Ｄｉｓｅａｓｅ－ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｆａｎｃｏｎｉ ａｎａｅｍｉａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４６０，５３－５９（２００９）．

【非特許文献6】Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａ，Ｓ．，Ｇａｒｒｉｇｕｅ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｏｕｌｉｅｒ，Ｊ．，Ｌｉｍ，Ａ．，Ｍｏｒｉｌｌｏｎ，Ｅ．，Ｃｌａｐｐｉｅｒ，Ｅ．，Ｃａｃｃａｖｅｌｌｉ，Ｌ，Ｄｅｌａｂｅｓｓｅ，Ｅ．，Ｂｅｌｄｊｏｒｄ，Ｋ．，Ａｓｎａｆｉ，Ｖ．，Ｍａｃｌｎｔｙｒｅ，Ｅ．，Ｄａｌ Ｃｏｒｔｉｖｏ，Ｌ，Ｒａｄｆｏｒｄ，Ｉ．，Ｂｒｏｕｓｓｅ，Ｎ．，Ｓｉｇａｕｘ，Ｆ．，Ｍｏｓｈｏｕｓ，Ｄ．，Ｈａｕｅｒ，Ｊ．，Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ，Ａ．，Ｂｅｌｏｈｒａｄｓｋｙ，Ｂ．Ｈ．，Ｗｉｎｔｅｒｇｅｒｓｔ，Ｕ．，Ｖｅｌｅｚ，Ｍ．Ｃ，Ｌｅｉｖａ，Ｌ，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｒ．，Ｗｕｌｆｆｒａａｔ，Ｎ．，Ｂｌａｎｃｈｅ，Ｓ．，Ｂｕｓｈｍａｎ，Ｆ．Ｄ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ａ．，ａｎｄ Ｃａｖａｚｚａｎａ－Ｃａｌｖｏ，Ｍ．Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ４ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ＳＣＩＤ－Ｘ１．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１８，３１３２－３１４２（２００８）．

【非特許文献7】Ｇｌａｓｅｒ，Ｔ．，Ｓｃｈｍａｎｄｔ，Ｔ．，ａｎｄ Ｂｒｕｓｔｌｅ，Ｏ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｌｉａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２６５，４７－５８（２００８）．

【非特許文献8】Ｂｒｕｓｔｌｅ，Ｏ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．Ｎ．，Ｌｅａｒｉｓｈ，Ｒ．Ｄ．，Ｋａｒｒａｍ，Ｋ．，Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ，Ｋ．，Ｗｉｅｓｔｌｅｒ，Ｏ．Ｄ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｉ．Ｄ．，ａｎｄ ＭｃＫａｙ，Ｒ．Ｄ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｌｉａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ：ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５，７５４－７５６（１９９９）．

【非特許文献9】Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ，Ｈ．Ｓ．，Ｎｉｓｔｏｒ，Ｇ．，Ｂｅｒｎａｌ，Ｇ．，Ｔｏｔｏｉｕ，Ｍ．，Ｃｌｏｕｔｉｅｒ，Ｆ．，Ｓｈａｒｐ，Ｋ．，ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｏ．Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ ａｎｄ ｒｅｓｔｏｒｅ ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５，４６９４－４７０５（２００５）．

【非特許文献10】Ｇｌａｓｅｒ，Ｔ．，Ｐｅｒｅｚ－Ｂｏｕｚａ，Ａ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｂｒｕｓｔｌｅ，Ｏ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｆａｓｅｂ Ｊ １９，１１２－１１４（２００５）．

【非特許文献11】Ｐｅｒｅｚ－Ｂｏｕｚａ，Ａ．，Ｇｌａｓｅｒ，Ｔ．，ａｎｄ Ｂｒｕｓｔｌｅ，Ｏ．ＥＳ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｌｉａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅｌｙ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １５，２０８－２１６（２００５）．

【非特許文献12】Ｗａｎｇ，Ｓ．，Ｂａｔｅｓ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｓｃｈａｎｚ，Ｓ．，Ｃｈａｎｄｌｅｒ－Ｍｉｌｉｔｅｌｌｏ，Ｄ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｃ，Ｍａｈｅｒａｌｉ，Ｎ．，Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌ，Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ， Ｋ．，Ｗｉｎｄｒｅｍ，Ｍ．，ａｎｄ Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｓ．Ａ．Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｍｙｅｌｉｎａｔｅ ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２，２５２－２６４（２０１３）．

【非特許文献13】Ｐｉａｏ，Ｊ．，Ｍａｊｏｒ，Ｔ．，Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｇ．，Ｐｏｌｉｃａｒｐｉｏ，Ｅ．，Ｍｅｎｏｎ，Ｊ．，Ｄｒｏｍｓ，Ｌ，Ｇｕｔｉｎ，Ｐ．，Ｕｒｙｕ，Ｋ．，Ｔｃｈｉｅｕ，Ｊ．，Ｓｏｕｌｅｔ，Ｄ．，ａｎｄ Ｔａｂａｒ，Ｖ．Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅ／／１６，１９８－２１０（２０１５）．

【非特許文献14】Ｄｏｕｖａｒａｓ，Ｐ．，Ｗａｎｇ Ｊ．，Ｚｉｍｍｅｒ，Ｍ．，Ｈａｎｃｈｕｋ，Ｓ．，Ｏ’Ｂａｒａ，Ｍ．Ａ．，Ｓａｄｉｑ，Ｓ．，Ｓｉｍ，Ｆ．Ｊ．，Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｆｏｓｓａｔｉ，Ｖ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｉｍａｒｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３，２５０－２５９（２０１４）．

【非特許文献15】Ｍａｔａｌｏｎ，Ｒ．，Ｍｉｃｈａｌｓ，Ｋ．，Ｓｅｂｅｓｔａ，Ｄ．，Ｄｅａｎｃｈｉｎｇ，Ｍ．，Ｇａｓｈｋｏｆｆ，Ｐ．，ａｎｄ Ｃａｓａｎｏｖａ，Ｊ．Ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ Ｎ－ａｃｅｔｙｌａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄｕｒｉａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ２９，４６３－４７１（１９８８）．

【非特許文献16】Ｌｅｏｎｅ，Ｐ．，Ｊａｎｓｏｎ，Ｃ．Ｇ．，Ｂｉｌａｎｉｕｋ，Ｌ，Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｓｏｒｇｉ，Ｆ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ，Ｍａｔａｌｏｎ，Ｒ．，Ｋａｕｌ，Ｒ．，Ｚｅｎｇ，Ｚ．，Ｆｒｅｅｓｅ，Ａ．，ＭｃＰｈｅｅ，Ｓ．Ｗ．，Ｍｅｅ，Ｅ．，ａｎｄ Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．Ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ４８，２７－３８（２０００）．

【非特許文献17】Ｊａｎｓｏｎ，Ｃ，ＭｃＰｈｅｅ，Ｓ．，Ｂｉｌａｎｉｕｋ，Ｌ，Ｈａｓｅｌｇｒｏｖｅ，Ｊ．，Ｔｅｓｔａｉｕｔｉ，Ｍ．，Ｆｒｅｅｓｅ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｈｅｒａ，Ｄ．，Ｈｕｒｈ，Ｐ．，Ｒｕｐｉｎ，Ｊ．，Ｓａｓｌｏｗ，Ｅ．，Ｇｏｌｄｆａｒｂ，Ｏ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｌａｒｉｊａｎｉ，Ｇ．，Ｓｈａｒｒａｒ，Ｗ．，Ｌｉｏｕｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｃａｍｐ，Ａ．，Ｋｏｌｏｄｎｙ，Ｅ．，Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｊ．，ａｎｄ Ｌｅｏｎｅ，Ｐ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ： ＡＡＶ－２ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ（ＡＳＰＡ） ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ ７７７ｅｒ１３，１３９１－１４１２（２００２）．

【非特許文献18】Ｍａｔａｌｏｎ，Ｒ．，Ｓｕｒｅｎｄｒａｎ，Ｓ．，Ｒａｄｙ，Ｐ．Ｌ，Ｑｕａｓｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｇ．Ａ．，Ｍａｔａｌｏｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｔｙｒｉｎｇ，Ｓ．Ｋ．，Ｗｅｉ，Ｊ．，Ｐｅｄｅｎ，Ｃ．Ｓ．，Ｅｚｅｌｌ，Ｅ．Ｌ，Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，ａｎｄ Ｍａｎｄｅｌ，Ｒ．Ｊ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｆｏｒ ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ７，５８０－５８７（２００３）．

【非特許文献19】ＭｃＰｈｅｅ，Ｓ．Ｗ．，Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｊ．，Ｊａｎｓｏｎ，Ｃ．Ｇ．，Ｓｅｒｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｈｙｌａｎｄ，Ｋ．，Ｏｎｇ，Ｅ．Ｏ．，Ｒａｇｈａｖａｎ，Ｓ．Ｓ．，Ｆｒｅｅｓｅ，Ａ．，ａｎｄ Ｌｅｏｎｅ， Ｐ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＡＶ－２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅｍｏｒ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １３５，１１２－１２１（２００５）．

【非特許文献20】ＭｃＰｈｅｅ，Ｓ．Ｗ．，Ｊａｎｓｏｎ，Ｃ．Ｇ．，Ｌｉ，Ｃ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，Ｃａｍｐ，Ａ．Ｓ．，Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｊ．，Ｓｈｅｒａ，Ｄ．，Ｌｉｏｕｔｅｒｍａｎｎ，Ｌ．，Ｆｅｅｌｙ，Ｍ．，Ｆｒｅｅｓｅ，Ａ．，ａｎｄ Ｌｅｏｎｅ，Ｐ．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＡＡＶ ｉｎ ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｆｏｒ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ８，５７７－５８８（２００６）．

【非特許文献21】Ｌｅｏｎｅ，Ｐ．，Ｓｈｅｒａ，Ｄ．，ＭｃＰｈｅｅ，Ｓ．Ｗ．，Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｊ． Ｓ．，Ｋｏｌｏｄｎｙ，Ｅ．Ｈ．，Ｂｉｌａｎｉｕｋ，Ｌ．Ｔ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ａｓｓａｄｉ，Ｍ．，Ｇｏｌｄｆａｒｂ，Ｏ．，Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｈ．Ｗ．，Ｆｒｅｅｓｅ，Ａ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．，Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．，Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ Ｊａｎｓｏｎ，Ｃ．Ｇ．Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｆｏｌｌｏｗ－ ｕｐ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４，１６５ｒａ１６３（２０１２）．

【非特許文献22】Ａｈｍｅｄ，Ｓ．Ｓ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｃａｏ，Ｃ，Ｓｉｋｏｇｌｕ，Ｅ．Ｍ．，Ｄｅｎｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｒ．，Ｓｕ，Ｑ．，Ｅａｔｏｎ，Ｓ．，Ｌｉｓｏ Ｎａｖａｒｒｏ，Ａ．Ａ．，Ｘｉｅ，Ｊ．，Ｓｚｕｃｓ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｃ，Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｓｅｙｆｒｉｅｄ，Ｔ．Ｎ．，Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｒ．，Ｍａｔａｌｏｎ，Ｒ．，ａｎｄ Ｇａｏ，Ｇ．Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｒＡＡＶ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｓ ｌａｔｅ ａｓ Ｐ２０ ａｃｈｉｅｖｅｓ ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ＣＮＳ Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｃａｎａｖａｎ ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ Ｔｆｔｅｒ ２１，２１３６－２１４７（２０１３）．

【非特許文献23】Ｚａｎｏ，Ｓ．，Ｍａｌｉｋ，Ｒ．，Ｓｚｕｃｓ，Ｓ．，Ｍａｔａｌｏｎ，Ｒ．，ａｎｄ Ｖｉｏｌａ，Ｒ．Ｅ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｓｅ ｉｎ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ １０２，１７６－１８０（２０１１）．

【非特許文献24】Ｍａｄｈａｖａｒａｏ，Ｃ．Ｎ．，Ａｒｕｎ，Ｐ．，Ａｎｉｋｓｔｅｒ，Ｙ．，Ｍｏｇ， Ｓ．Ｒ．，Ｓｔａｒｅｔｚ－Ｃｈａｃｈａｍ，Ｏ．，Ｍｏｆｆｅｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｒｕｎｂｅｒｇ，Ｎ．Ｅ．，Ｇａｈｌ，Ｗ．Ａ．，ａｎｄ Ｎａｍｂｏｏｄｉｒｉ，Ａ．Ｍ．Ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉａｃｅｔａｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｔｒｉａｌ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｄｏｓｅ ｆｏｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅｍｏｒ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ．Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ３２，６４０－６５０（２００９）．

【非特許文献25】Ａｓｓａｄｉ，Ｍ．，Ｊａｎｓｏｎ，Ｃ，Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｏｌｄｆａｒｂ，Ｏ．，Ｓｕｒｉ，Ｎ．，Ｂｉｌａｎｉｕｋ，Ｌ，ａｎｄ Ｌｅｏｎｅ，Ｐ．Ｌｉｔｈｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｉｎｔｒａ－ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｎ－ａｃｅｔｙｌ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｉｎ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｅｕｒ Ｊ Ｐａｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ １４，３５４－３５９（２０１０）．

【非特許文献26】Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｍａｒｋｏｖ，Ｖ．，ａｎｄ Ｌｅｏｎｅ，Ｐ．Ｄｉｅｔａｒｙ ｔｒｉｈｅｐｔａｎｏｉｎ ｒｅｓｃｕｅｓ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｌｏｓｓ， ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｒ７ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ３７，３６９－３８１（２０１４）．

【非特許文献27】Ａｒｕｎ，Ｐ．，Ｍａｄｈａｖａｒａｏ，Ｃ．Ｎ．，Ｍｏｆｆｅｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｋ．，Ｇｒｕｎｂｅｒｇ，Ｎ．Ｅ．，Ａｒｉｙａｎｎｕｒ，Ｐ．Ｓ．，Ｇａｈｌ，Ｗ．Ａ．，Ａｎｉｋｓｔｅｒ，Ｙ．，Ｍｏｇ，Ｓ．，Ｈａｌｌｏｗｓ，Ｗ．Ｃ，Ｄｅｎｕ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｎａｍｂｏｏｄｉｒｉ，Ａ．Ｍ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｃｅｔａｔｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅｍｏｒ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ３３，１９５－２１０（２０１０）．

【非特許文献28】Ｍａｔａｌｏｎ，Ｒ．ａｎｄ Ｍｉｃｈａｌｓ－Ｍａｔａｌｏｎ，Ｋ．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｄｖ Ｐｅｄｉａｔｒｙ，４９３－５０６（１９９９）．

【非特許文献29】Ｋａｕｌ，Ｒ．，Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｂａｌａｍｕｒｕｇａｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｍａｔａｌｏｎ，Ｒ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ ｃＤＮＡ ａｎｄ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ Ｓ，１１８－１２３（１９９３）．

【非特許文献30】Ｋａｕｌ，Ｒ．，Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ａｌｏｙａ，Ｍ．，Ｂａｌａｍｕｒｕｇａｎ，Ｋ．，Ｐｅｔｒｏｓｋｙ，Ａ．，Ｍｉｃｈａｌｓ，Ｋ．，ａｎｄ Ｍａｔａｌｏｎ，Ｒ．Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ：ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ Ｊｅｗｉｓｈ ａｎｄ ｎｏｎ－Ｊｅｗｉｓｈ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ５５，３４－４１（１９９４）．

【非特許文献31】Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍｌｉｎｅ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４４８，３１３－３１７（２００７）．

【非特許文献32】Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｙ．，Ｓａｔｏ，Ｙ．，Ｏｋａｄａ，Ａ．，Ｍｏｒｉｚａｎｅ，Ａ．，Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｈｏｎｇ，Ｈ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｋ．，Ｓｈｉｂａｔａ，Ｔ．，Ｋｕｎｉｓａｄａ，Ｔ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｊ．，Ｓａｊｉ，Ｈ．，ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．Ａ ｍｏｒｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ－ｆｒｅｅ ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，４０９－４１２（２０１１）．

【非特許文献33】Ｌｉｕ，Ｇ．Ｈ．，Ｑｕ，Ｊ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｎｉｖｅｔ，Ｅ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｍｏｎｔｓｅｒｒａｔ，Ｎ．，Ｙｉ，Ｆ．，Ｘｕ，Ｘ．，Ｒｕｉｚ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｕ．，Ｋｉｍ，Ａ．，Ｒｅｎ，Ｂ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｇｏｅｂｌ，Ａ．，Ｋｉｍ，Ｊ．，Ｓｏｌｉｇａｌｌａ，Ｒ．Ｄ．，Ｄｕｂｏｖａ，Ｉ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．，Ｙａｔｅｓ，Ｊ．，３ｒｄ，Ｅｓｔｅｂａｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｓａｎｃｈｏ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｉ．，ａｎｄ Ｉｚｐｉｓｕａ Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，Ｊ．Ｃ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ＬＲＲＫ２．Ｎａｔｕｒｅ ４９１，６０３－６０７（２０１２）．

【非特許文献34】Ｔｒａｋａ，Ｍ．，Ｗｏｌｌｍａｎｎ，Ｒ．Ｌ，Ｃｅｒｄａ，Ｓ．Ｒ．，Ｄｕｇａｓ，Ｊ．，Ｂａｒｒｅｓ，Ｂ．Ａ．，ａｎｄ Ｐｏｐｋｏ，Ｂ．Ｎｕｒ７ ｉｓ ａ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｃａｕｓｅｓ ｓｐｏｎｇｙ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＮＳ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２８，１１５３７－１１５４９（２００８）．

【非特許文献35】Ｍａｔａｌｏｎ，Ｒ．，Ｒａｄｙ，Ｐ．Ｌ，Ｐｉａｔｔ，Ｋ．Ａ．，Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｈ．Ｂ．，Ｑｕａｓｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｇ．Ａ．，Ｍａｔａｌｏｎ，Ｋ．，Ｃｅｃｉ，Ｊ．Ｄ．，Ｔｙｒｉｎｇ，Ｓ．Ｋ．，Ｎｅｈｌｓ，Ｍ．，Ｓｕｒｅｎｄｒａｎ，Ｓ．，Ｗｅｉ，Ｊ．，Ｅｚｅｌｌ，Ｅ．Ｌ．，ａｎｄ Ｓｚｕｃｓ，Ｓ．Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｆｏｒ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２，１６５－１７５（２０００）．

【非特許文献36】Ｍｅｒｓｍａｎｎ，Ｎ．，Ｔｋａｃｈｅｖ，Ｄ．，Ｊｅｌｉｎｅｋ，Ｒ．，Ｒｏｔｈ，Ｐ．Ｔ．，Ｍｏｂｉｕｓ，Ｗ．，Ｒｕｈｗｅｄｅｌ，Ｔ．，Ｒｕｈｌｅ，Ｓ．，Ｗｅｂｅｒ－Ｆａｈｒ，Ｗ．，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ａ．，ａｎｄ Ｋｌｕｇｍａｎｎ，Ｍ．Ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ－ｌａｃＺ ｋｎｏｃｋｉｎ ｍｉｃｅ：ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ Ｓ，ｅ２０３３６（２０１１）．

【非特許文献37】Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｊ．Ｎ．Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｈｅａｌｔｈ， ｓｅｎｓｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｍｏｔｏｒ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ，ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｔｅｓｔｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ８３５，１８－２６（１９９９）．

【非特許文献38】Ｊａｎｓｏｎ，Ｃ．Ｇ．，Ａｓｓａｄｉ，Ｍ．，Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｊ．，Ｂｉｌａｎｉｕｋ，Ｌ，Ｓｈｅｒａ，Ｄ．，ａｎｄ Ｌｅｏｎｅ，Ｐ．Ｌｉｔｈｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ ３３，２３５－２４３（２００５）．

【非特許文献39】Ｂａｓｌｏｗ，Ｍ．Ｈ．，Ｋｉｔａｄａ，Ｋ．，Ｓｕｃｋｏｗ，Ｒ．Ｆ．，Ｈｕｎｇｕｎｄ，Ｂ．Ｌ．，ａｎｄ Ｓｅｒｉｋａｗａ，Ｔ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｔｈｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｂｒａｉｎ Ｎ－ ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ－ｌｉｋｅ ｒａｔｓ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ ２７，４０３－４０６（２００２）．

【非特許文献40】Ｓｏｌｓｏｎａ，Ｍ．Ｄ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｌ．Ｌ．，Ｂｏｑｕｅｔ，Ｅ．Ｍ．，ａｎｄ Ａｎｄｒｅｓ，Ｊ．Ｌ．Ｌｉｔｈｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ａｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ ３５，１５０－１５１（２０１２）．

【非特許文献41】Ｓｕｒｅｎｄｒａｎ，Ｓ．，Ｓｈｉｈａｂｕｄｄｉｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｊ．，Ｔａｋｓｉｒ，Ｔ．Ｖ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｇ．Ｒ．，Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｇ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．，Ｔｙｒｉｎｇ，Ｓ．Ｋ．，Ｍｉｃｈａｌｓ－Ｍａｔａｌｏｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｍａｔａｌｏｎ，Ｒ．Ｍｏｕｓｅ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ａ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｄｅｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １５３，１９－２７（２００４）．

【非特許文献42】Ｕｃｈｉｄａ，Ｎ．，Ｃｈｅｎ，Ｋ．，Ｄｏｈｓｅ，Ｍ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｋ．Ｄ．，Ｄｅａｎ，Ｊ．，Ｂｕｓｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｒｉｄｄｌｅ，Ａ．，Ｂｅａｒｄｓｌｅｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｗａｎ，Ｙ．，Ｇｏｎｇ，Ｘ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｂ．Ｊ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｔａｍａｋｉ，Ｓ．Ｊ．，Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ａ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．Ｇ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｋｒｏｅｎｋｅ，Ｃ．Ｄ．，ａｎｄ Ｂａｃｋ，Ｓ．Ａ．Ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．Ｓｃｉ ＴｒａｎｓＩ Ｍｅｄ ４，１５５ｒａ１３６（２０１２）．

【非特許文献43】Ｍａｄｈａｖａｒａｏ，Ｃ．Ｎ．，Ｈａｍｍｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｑｕａｒｌｅｓ，Ｒ．Ｈ．，ａｎｄ Ｎａｍｂｏｏｄｉｒｉ，Ｍ．Ａ．Ａ ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３０８，３１４－３１９（２００２）．

【非特許文献44】Ｌｅ Ｂｅｌｌｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｎ．Ｇ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｒ．，ａｎｄ Ｂｈａｋｏｏ，Ｋ．Ｋ．Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ １ Ｈ－ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．ＮＭＲ Βｉοηｉθａ ΛΒ，２＞１－ＡＡ（２００２）．

【非特許文献45】Ｗｅｓｔ，Ｊ．Ｂ．，Ｆｕ，Ｚ．，Ｄｅｅｒｉｎｃｋ，Ｔ．Ｊ．，Ｍａｃｋｅｙ，Ｍ．Ｒ．，Ｏｂａｙａｓｈｉ，Ｊ．Ｔ．，ａｎｄ Ｅｌｌｉｓｍａｎ，Ｍ．Ｈ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ａｉｒ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｕｎｇ ｕｓｉｎｇ ３Ｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｒｅｓｐｉｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １７０，２０２－２０９（２０１０）．

【非特許文献46】Ｃｌａｒｎｅｒ，Ｔ．，Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ，Ｎ．，Ｋｒａｕｓｐｅ，Ｂ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｋ．，Ｂｅｙｅｒ，Ｃ， ａｎｄ Ｋｉｐｐ，Ｍ．Ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕａｐｏｒｉｎ ４ ｄｕｒｉｎｇ ｓｐｏｎｇｙ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５３，２２－３０（２０１４）．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

それゆえに、当業界では、カナバン病に対して効果的な治療法を提供するという課題がある。本明細書で開示される発明は、この課題を解決する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

一つの態様では、本開示は、被験体のカナバン病を治療する方法に関連する。本方法は、被験体の脳において外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させることによって被験体のＡＳＰＡ酵素活性を回復させる。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡ酵素活性は、被験体の脳に、神経前駆細胞（ＮＰＣｓ）、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、野生型ＡＳＰＡ発現神経前駆細胞を提供することによって回復させる。

【0007】

一つの関連する態様では、本開示は、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現する、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞であって、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得る工程、並びに、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞に分化させる工程、を含むプロセスによって作製された、神経前駆細胞、に関連する。あるいは、外因性の野生型ＡＳＰＡを発現する、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞は、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、リプログラムされたｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させる工程、及び、神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得る工程、を含むプロセスによって作製される。

【0008】

一つの他の態様では、本開示は、被験体のカナバン病を治療する方法に関連する。
本方法は、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得る工程、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む神経前駆細胞に分化させる工程、並びに、神経前駆細胞を被験体の脳に移植する工程（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）、を伴う。あるいは、本方法は、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、ｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む神経前駆細胞に分化させるステップ、神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得る工程、及び、遺伝的に修正された神経前駆細胞を被験体の脳に移植する工程、がある。

【0009】

いくつかの実施形態では、体細胞は、線維芽細胞、血球、泌尿器細胞（ｕｒｉｎａｒｙ ｃｅｌｌｓ）、脂肪細胞、角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）、歯髄細胞（ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ ｃｅｌｌｓ）、及び他の容易に利用できる体細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｐ５３ ｓｈＲＮＡ、並びに（ｃ‐ＭＹＣ及びＬ‐ＭＹＣ等の）ＭＹＣを含む１つ以上のリプログラミング因子の存在下でｉＰＳＣｓに転換される。いくつかの実施形態では、リプログラムする工程は、エピソーマルなリプログラミング又はウイルス形質導入を介して行われる。

【0010】

他の態様では、本開示は、カナバン病を治療するための、ＡＳＰＡ酵素の供給源、並びに、ＷＴ ＡＳＰＡ発現オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）及びオリゴデンドロサイトを発生させるための神経前駆体として機能する、野生型ＡＳＰＡ発現神経前駆細胞を作製する方法、に関連する。
本方法は、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得る工程、及び、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む神経前駆細胞に分化させるステップ、を含む。あるいは、本方法は、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、ｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む神経前駆細胞に分化させる工程、並びに、前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された前駆細胞を得る工程、を含む。

【0011】

本出願は、カラーで制作された少なくとも一つの図面を包含する。カラーの（複数の）図面を含む本出願の写しは、請求及び必要な手数料の支払いにより、官庁によって提供されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ＷＴ及びＣＤ患者の線維芽細胞に由来するｉＰＳＣｓの特徴付けを説明する。ＣＤ ｉＰＳＣｓにおけるヒトＥＳＣマーカーの発現。三人の患者、ＣＤ患者１、ＣＤ患者２及びＣＤ患者３に由来するＣＤ ｉＰＳＣｓは、ヒト多能性因子ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ、並びにヒトＥＳＣ細胞表面マーカーＳＳＥＡ４、ＴＲＡ‐１‐６０及びＴＲＡ‐１‐８１を発現した。ＩＭＲ９０細胞に由来するＷＴ ｉＰＳＣｓは、ＷＴ対照として含む。スケールバー：１００μｍ。

【0013】

【図2】図２Ａ‐２Ｄは、ＣＤ患者ｉＰＳＣｓ及びＡＳＰＡ ｉＰＳＣｓがヒトＥＳＣマーカーを発現することを説明する。図２Ａは、ＷＴ、ＣＤ及びＡＳＰＡ ｉＰＳＣｓにおける内因性ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧ発現のＲＴ‐ＰＣＲ解析を示す。ＣＤ患者線維芽細胞（ｆｉｂ）は、陰性対照として含む。アクチンは、ローディング対照として含む。図２Ｂ及び２Ｃは、ＷＴ、ＣＤ及びＡＳＰＡ ｉＰＳＣｓにおける外因性リプログラミング因子のＲＴ‐ＰＣＲ解析を示す。ヒトＥＳＣｓは陰性対照として含められ、個々の因子を発現するプラスミドＤＮＡｓは陽性対照として含む。図２Ｄは、対照及びＣＤ ｉＰＳＣの核型を示す。

【0014】

【図3】図３Ａ‐３Ｆは、ＣＤ ｉＰＳＣｓにおける変異の特徴付け及びｉＰＳＣｓの多能性の検証を説明する。図３Ａは、ＣＤ ｉＰＳＣｓが患者特異的なＡＳＰＡ変異を包含していたことを示す。図３Ｂは、生体外でのｉＰＳＣ多能性の検証を示す。ＣＤ１、ＣＤ２及びＣＤ３ ｉＰＳＣｓは、ＥＢ形成アッセイにおいて、３つの胚葉全て、ＳＯＸ１７陽性内胚葉、ＳＭＡ陽性中胚葉及びＴＵＪ１陽性外胚葉に分化することができた。ＩＭＲ９０細胞に由来するＷＴ ｉＰＳ細胞は、対照として含む。図３Ｃ及び図３Ｄは、生体内でのｉＰＳＣ多能性の検証を示す。免疫不全ＮＳＧマウスへの注射の後に、ＣＤ１ ｉＰＳＣｓ（３Ｃ）、並びにＣＤ２ ｉＰＳＣｓ及びＣＤ３ ｉＰＳＣｓ（３Ｄ）は、３つの胚葉の各々に特徴的な組織を包含する奇形腫を形成しえた。スケールバー：図３Ｂ‐３Ｄについては１００μｍ。図３Ｅ及び３Ｆは、親のＣＤ１線維芽細胞（ｆｉｂ）及びＣＤ１ ｉＰＳＣｓにおけるＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧプロモーター領域のバイサルファイト配列解析を示す。白丸及び黒丸は、それぞれ、非メチル化及びメチル化ＣｐＧｓを示す。

【0015】

【図4】図４Ａ‐４Ｍは、ＡＳＰＡ ｉＰＳＣｓがＷＴ ＡＳＰＡ遺伝子を包含し、多能性因子を発現することを説明する。図４Ａ、４Ｄ及び４Ｇは、ゲノムＤＮＡ配列決定が、ＡＳＰＡ１、ＡＳＰＡ２及びＡＳＰＡ３ ｉＰＳＣｓにおけるＷＴ ＡＳＰＡ配列の存在を確認することを示す。図４Ｂ、４Ｅ及び４Ｈは、ＡＳＰＡ１、ＡＳＰＡ２及びＡＳＰＡ３ ｉＰＳＣｓにおけるヒト多能性因子ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現を示す。核Ｄａｐｉ染色を青色で示す。スケールバー：１００μｍ。図４Ｃ、４Ｆ及び４Ｉは、ＡＳＰＡ ｉＰＳＣｓにおけるヒトＥＳＣ細胞表面マーカーＳＳＥＡ４、ＴＲＡ‐１‐６０及びＴＲＡ‐１‐８の発現を示す。核Ｄａｐｉ染色を青色で示す。図４Ｊは、ゲノムＤＮＡ配列決定が、ＡＳＰＡ１、ＡＳＰＡ２ ｉＰＳＣｓにおけるＷＴ ＡＳＰＡ配列の存在を確認することを示す。図４Ｋ及び４Ｌは、ＲＴ‐ＰＣＲ（４Ｋ）及びウエスタンブロット解析（４Ｌ）によって明らかにされた、ＡＳＰＡ１ ｉＰＳＣｓにおける形質導入されたＡＳＰＡの発現を示す。ＧＡＰＤＨ及びチューブリンは、ローディング対照として含んだ。図４Ｍは、生体内でのＡＳＰＡ１ ｉＰＳＣｓ、ＡＳＰＡ２ ｉＰＳＣｓ及びＡＳＰＡ３ ｉＰＳＣｓの発達的潜在能力の検証を示す。免疫不全ＮＳＧマウスへの注射の後に、ＡＳＰＡ１ ｉＰＳＣｓ、ＡＳＰＡ２ ｉＰＳＣｓ及びＡＳＰＡ３ｉＰＳＣｓは、３つの胚葉の各々に特徴的な組織を包含する奇形腫を形成しえた。スケールバー：１００μｍ。

【0016】

【図5】図５Ａ‐５Ｇは、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓの特徴付けを説明する。図５Ａは、ＷＴ、ＣＤ１及びＡＳＰＡ１ ｉＰＳＣｓに由来するＮＰＣにおける、ＮＰＣマーカーＰＡＸ６、ＳＯＸ２、ＮＣＡＤ、ＳＯＸ１及びＮＥＳＴＩＮについての免疫染色を示す。核Ｄａｐｉ染色を青色で示す。スケールバー：５０μｍ。図５Ｂは、ＲＴ‐ＰＣＲによって明らかにされた、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣにおけるＡＳＰＡ及びＮＰＣマーカーの発現を示す。ＷＴ及びＣＤ１ ＮＰＣｓは、対照として含んだ。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照として含んだ。図５Ｃは、ＲＴ‐ＰＣＲによって明らかにされた、ＷＴ、ＣＤ１及びＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓにおける多能性因子の発現の欠如を示す。ＷＴ ｉＰＳＣｓ及びＣＤ１線維芽細胞は、それぞれ陽性対照及び陰性対照として含んだ。図５Ｄは、ＡＳＰＡ ＮＰＣｓが、ＣＤ１ ＮＰＣｓに比べて、強力なＡＳＰＡ酵素活性を発揮したことを示す。エラーバーは、平均値の標準偏差（ｓ．ｄ．）（ｎ＝５反復）である。＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による。図５Ｅ及び５Ｆは、ＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２を用いた、ＣＤ１ ＮＰＣｓ若しくはＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓに由来するｐｒｅ‐ＯＰＣｓの免疫染色（５Ｅ）、又は、Ｏ４を用いた、ＣＤ１ ＮＰＣｓ若しくはＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓに由来するＯＰＣｓの生体染色（ｌｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）（５Ｆ）を示す。スケールバー：５Ｅについては１００μｍ、５Ｆについては５０μｍ。図５Ｇは、ＣＤ１ ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓのＦＡＣＳ解析を示す。

【0017】

【図6】図６Ａ及び６Ｂは、移植されたＣＤマウス脳においてＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓが生存し、ＯＬＩＧ２を発現したことを説明する。図６Ａは、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓが新生仔ＣＤマウスに移植されたことを示す。移植の１ヶ月後にマウスの脳を採取し、ヒト核抗原及びＯＬＩＧ２に対する抗体を用いて免疫染色した。スケールバー：１００μｍ。図６Ｂは、移植の１ヶ月後のロータロッド試験において明らかになった、ＡＳＰＡ‐ＣＤ１ ＮＰＣｓの移植がＣＤマウスの運動機能障害を克服したことを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．）である（ｎ＝６マウス）。＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。

【0018】

【図7】図７Ａ‐７Ｃは、移植されたＣＤマウス脳においてＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓがＯＬＩＧ２＋細胞を生じさせたことを説明する。図７Ａは、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓが新生仔ＣＤマウスに移植されたことを示す。移植の３ヶ月後にマウスの脳を採取し、ヒト核抗原（緑色）及びＯＬＩＧ２（赤色）に対する抗体を用いて免疫染色した。図７Ｂは、移植の３ヶ月後にマウスの脳を採取し、ヒト核抗原（緑色）及びＭＢＰ（赤色）に対する抗体を用いて免疫染色したことを示す。矢印で示したヒト核抗原（緑色）及びＭＢＰ（赤色）‐二重陽性細胞の拡大画像を下方のパネルに示した。図７Ｃは、生着ヒト細胞が、ＧＦＡＰ＋（赤）グリア細胞に分化したことを示す。スケールバー：パネルＡは１００μｍ、パネルＢの上方は６３μｍ、下方のパネルは１０μｍ、パネルＣは６３μｍ。

【0019】

【図8】図８Ａ‐８Ｅは、ＣＤマウスにおいてＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓがＮＡＡレベル及び空胞化（ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）が低下したことを説明する。図８Ａは、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣ移植の３ヶ月後のＣＤマウスにおける高められたＡＳＰＡ酵素活性を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差（ｎ＝５マウス）である。図８Ｂ及び８Ｃは、ＮＭＲを用いて測定された、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣを移植したＣＤマウス脳で低下したＮＡＡレベルを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差である（ｎ＝５マウス）。図８Ｄ及び８Ｅは、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣを移植したＣＤマウス脳における、低下した空胞化を示す。対照ＣＤマウス及びＡＳＰＡ１ ＮＰＣを移植したＣＤマウスにおける視床、小脳及び脳幹のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色をパネル８Ｄに示し、百分率空胞化の定量化をパネル８Ｅに示す。スケールバー：１００μｍ。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．）である（ｎ＝６マウス）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、全ての定量化についてスチューデントのｔ検定による。

【0020】

【図9】図９Ａ‐９Ｅは、ＣＤマウスにおいてＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓがミエリン形成及び運動機能を改善したことを示す。図９Ａ及び９Ｂは、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣを移植したＣＤマウスの回復したミエリン形成を示す。３月齢の野生型（ＷＴ）マウスの脳において無傷で厚いミエリンが検出されたことに対し、同腹仔のＣＤマウスの脳においては分裂した、より薄いミエリンが見られた。３ヶ月間にわたってＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓを移植したＣＤマウスにおけるミエリンは、より無傷でより厚いようだった。脳幹領域の画像が示されている。スケールバー：１μｍ。矢印はミエリンを示す。図９Ｃは、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓの移植がＣＤマウスにおける体重減少を克服したことを示す。図９Ｄ及び９Ｅは、ロータロッド（９Ｄ）又はワイヤ懸垂（９Ｅ）試験において明らかにされた、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓの移植がＣＤマウスの運動機能障害を克服したことを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．）である（ｎ＝６マウス）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、図９Ｂ‐９Ｅについてスチューデントのｔ検定による。

【0021】

【図10】図１０Ａ‐１０Ｄは、ＡＳＰＡ２ ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３ ＮＰＣｓが生体外で強力なＡＳＰＡ酵素活性を呈したことを説明する。図１０Ａは、免疫染色で、ＡＳＰＡ２ ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３ ＮＰＣｓにおけるＮＰＣマーカーＮＥＳＴＩＮ及びＳＯＸ１の発現を示す。合成画像で、核Ｄａｐｉ染色を青色で示す。スケールバー：１００μｍ。図１０Ｂは、ＲＴ‐ＰＣＲで明らかにされた、ＡＳＰＡ２ ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３ ＮＰＣｓにおける多能性因子ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現の欠如を示す。ＥＳＣｓ及びＣＤ２、ＣＤ３線維芽細胞（Ｆｉｂ）は各々陽性対照及び陰性対照として含んだ。図１０Ｃは、ＡＳＰＡ２ ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３ ＮＰＣｓのＦＡＣＳ解析を示す。図１０Ｄは、ＡＳＰＡ２ ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３ ＮＰＣｓが、ＣＤ２ ＮＰＣｓ及びＣＤ３ ＮＰＣｓに比べて、有意に上昇したＡＳＰＡ酵素活性を発揮したことを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．）である（ｎ＝６反復）。＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。

【0022】

【図11】図１１Ａ‐１１Ｃは、Ａｓｐａ^{ｎｕｒ７／ｎｕｒ７}／Ｒａｇ２^－／－（Ａｓｐａ^ｎｕｒ７／Ｒａｇ２^－／－）マウスが、親のＡｓｐａ^{ｎｕｒ７／ｎｕｒ７}（Ａｓｐａ^ｎｕｒ７）マウスと同様の病理学的特質を呈したことを実証する。図１１Ａは、Ａｓｐａ^ｎｕｒ７／Ｒａｇ２^－／－マウス及び親のＡｓｐａ^ｎｕｒ７マウスの脳における同様のＡＳＰＡ酵素活性を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差（ｎ＝５マウス）である。＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。図１１Ｂ及び１１Ｃは、Ａｓｐａ^ｎｕｒ７／Ｒａｇ２^－／－マウス及び親のＡｓｐａ^ｎｕｒ７マウスの脳における同様の空胞化を示す。対照ＣＤマウス及びＡＳＰＡ‐ＣＤ１ ＮＰＣが移植されたＣＤマウスにおける視床、小脳及び脳幹のヘマトキシリン・エオシン染色は１１Ｂに示し、定量化は１１Ｃに示す。スケールバー：１００μｍ。エラーバーは、平均値の標準誤差である（ｎ＝６マウス）。

【0023】

【図12】図１２Ａ‐１２Ｂは、ＣＤマウス脳においてＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓがＯＬＩＧ２＋オリゴデンドログリア系統細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌｓ）及びＭＢＰ＋オリゴデンドロサイトを発生したことを実証する。図１２Ａは、生着の３ヶ月後の、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣを移植したＣＤ脳における全ての生着ヒト細胞からのヒト核抗原（ｈＮｕ）＋及びＯＬＩＧ２＋細胞の百分率の定量化を示す。ＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓを、新生仔ＣＤマウスに移植した。移植３ヶ月後にマウスの脳を採取し、ヒト核抗原（緑色）及びＭＢＰ（赤色）に対する抗体を用いて免疫染色した。全てのｈＮｕ＋細胞のうちのｈＮｕ＋及びＯＬＩＧ２＋細胞を百分率で示した。エラーバーは、平均値の標準誤差である（ｎ＝６マウス）。図１２Ｂは、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣを移植したＣＤマウス脳におけるヒト核抗原及びＭＢＰに対する共染色を示す、直交図である。スケールバー：１０μｍ。

【0024】

【図13】図１３は、移植されたＣＤマウス脳においてＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓがＧＦＡＰ＋細胞に分化し得ることを示す。ＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓを、新生仔ＣＤマウスに移植した。移植の３ヶ月後にマウスの脳を採取し、ヒト核抗原（緑色）及びＧＦＡＰ（赤色）に対する抗体を用いて免疫染色した。スケールバー：６３μｍ。

【0025】

【図14】図１４Ａ及び１４Ｂは、移植されたＣＤマウス脳においてＡＳＰＡ２及びＡＳＰＡ３ ＮＰＣｓが生存し、ＯＬＩＧ２及びＧＦＡＰを発現したことを示す。 ＡＳＰＡ２ ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３ ＮＰＣｓを新生仔ＣＤマウスに移植した。図１４Ａは、移植の３ヶ月後にマウスの脳を採取し、ヒト核抗原（緑色）及びＯＬＩＧ２（赤色）に対する抗体を用いて免疫染色したことを示す。スケールバー：２５μｍ。図１４Ｂは、移植の３ヶ月後にマウスの脳を採取し、ヒト核抗原（緑色）及びＧＦＡＰ（赤色）に対する抗体を用いて免疫染色したことを示す。スケールバー：５０μｍ。

【0026】

【図15】図１５Ａ‐１５Ｇは、ＣＤマウスにおいてＡＳＰＡ２及びＡＳＰＡ３ ＮＰＣｓにより空胞化が低下し、運動機能が改善されたことを示す。図１５Ａは、ＡＳＰＡ２ ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３ ＮＰＣｓを移植したＣＤマウスを、ヒト核抗原（緑色）及びＭＢＰ（赤色）について免疫染色したことを示す。矢印で示されたヒト核抗原（緑色）及びＭＢＰ（赤色）‐二重陽性細胞の拡大画像を下方のパネルに示した。スケールバー：上方は５０μｍ、下方のパネルは１０μｍ。図１５Ｂは、ＡＳＰＡ２ ＮＰＣ又はＡＳＰＡ３ ＮＰＣを移植したＣＤマウス脳におけるヒト核抗原及びＭＢＰに対する共染色を示す、直交図である。スケールバー：１０μｍ。図１５Ｃは、ＡＳＰＡ２ ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３ＮＰＣｓを用いた移植の３ヶ月後のＣＤマウスの視床、小脳及び脳幹における亢進したＡＳＰＡ活性を実証する。エラーバーは、平均値の標準誤差である（ｎ＝６マウス）。＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による。図１５Ｄ及び１５Ｅは、ＡＳＰＡ２ ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３ ＮＰＣを移植したＣＤマウス脳における空胞化の低下を示す。空胞化比率の定量化を１５Ｄに示す。エラーバーは、平均値の標準誤差である（ｎ＝６マウス）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。対照ＣＤマウス又はＡＳＰＡ２ ＮＰＣｓ若しくはＡＳＰＡ３ ＮＰＣｓを移植したＣＤマウスにおける視床、小脳及び脳幹のヘマトキシリン・エオシン染色を１５Ｅに示す。スケールバー：１００μｍ。図１５Ｆ及び１５Ｇは、ロータロッド（１５Ｆ）又はワイヤ懸垂（１５Ｇ）試験において、ＡＳＰＡ２ ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３ ＮＰＣｓを移植したＣＤマウスの運動機能障害が克服されたことを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．）である（ｎ＝６マウス）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。

【0027】

【図16】図１６Ａ‐図１６Ｂは、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣを移植したＣＤマウスの脳内に腫瘍形成がないことを実証する。腫瘍は、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓを用いた移植の１０ヶ月後に、ヘマトキシリン・エオシン染色を通じて解析された。ＡＳＰＡ１ ＮＰＣを移植したＣＤマウス脳内に、典型的な腫瘍組織は発見されなかった。スケールバー：１００μｍ。

【0028】

【図17】図１７Ａ‐１７Ｂは、移植の３ヶ月後での、ヒト生着細胞のＫｉ６７指数が低いことを示す。図１７Ａは、ＡＳＰＡ‐ＣＤ１ ＮＰＣｓをＣＤマウス脳に移植したことを示す。移植の３ヶ月後に生着された脳を、ヒト核抗原（緑色）及びＫｉ６７（赤色）で免疫染色した。スケールバー：５０μｍ。図１７Ｂは、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣを移植したＣＤマウス脳における、全てのｈＮｕ＋細胞のうちのヒト核抗原（ｈＮｕ）＋及びＫｉ６７＋細胞の％定量化を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差である（ｎ＝６マウス）。

【発明を実施するための形態】

【0029】

以下の本発明の記載は、本発明の様々な実施形態を例示するように意図するにすぎない。そのため、論じられる具体的な改変は、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。本発明の範囲から逸脱することなく様々な均等物、変更及び改変がなされ得ることが、当業者にとって明らかであろう。また、そのような均等な実施形態が本明細書に含まれることが理解される。

【0030】

幹細胞技術は、神経障害の治療のために大いに有望である。しかしながら、幹細胞の増殖可能な供給源の利用可能性は、幹細胞技術を臨床に移行させる上で決定的に重要な問題である。成人のヒト線維芽細胞をリプログラミングすることによって誘発されたヒトｉＰＳＣｓは、個々の患者からの特定の体細胞型及び組織の生成のための、継続的かつ自己由来のドナー供給源を提供し得る（非特許文献１～１４）。ｉＰＳＣｓは、患者特異的でなければしえないでないであろう、疾患細胞型の無限の貯蔵庫を提供することができる。さらに、患者特異的なｉＰＳＣｓは特定の個人に適合されているため、免疫拒絶反応の可能性が低い。そのうえ、最近の研究は、野生型（ＷＴ）遺伝子のウイルス形質導入又は部位特異的な遺伝子編集によって、マウス及びヒトで遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓが作製されうることが実証されている。これらのｉＰＳＣｓは、細胞療法のため及び疾患メカニズムを研究するために、有望な展望をもたらしうる。

【0031】

遺伝子療法と細胞療法の併用は、様々な遺伝性障害に対して極めて有望である。患者特異的なｉＰＳＣｓの遺伝子療法との治療的併用により、生体外で遺伝子欠損が修正される機会をもたらし、次いでこれらの遺伝的に修復されたｉＰＳＣｓは、遺伝子修正が正確であることを確実にするように適当な特徴付けがされてよく、それにより、無作為の遺伝子挿入等の、直接的な遺伝子療法と関連する安全性に関する懸念が低減する（非特許文献５及び６）。

【0032】

ｉＰＳＣ技術の画期的な開発以来、神経変性疾患の患者からｉＰＳＣｓを発生させることにかなりの関心が喚起されている。これらの患者特異的なｉＰＳＣｓは、疾患モデリング、創薬及び細胞置換（補充）療法のために多くの機会を提供する。その一方で、多能性幹細胞を異なる複数の神経系統に分化させる方法を開発及び最適化するために、広範囲にわたる努力がなされてきた。これらの方法により、細胞置換療法のために遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓからの神経細胞型が生成される。

【0033】

脱髄疾患は、ミエリン再生（再ミエリン化）が単一細胞型を用いて達成されることができ、移植されたミエリン形成性細胞は複雑な神経回路網に統合する必要がないため、中枢神経系障害の細胞系治療とって特に極めて有望な標的である（非特許文献７）。実際、げっ歯類及びヒトの多能性幹細胞派生株のミエリン形成能は、様々な動物モデルで詳細に記録されている（非特許文献８～１４）。動物モデルにおいて観察され得る広範なミエリン形成は、細胞治療がミエリン形成不全及び脱髄の疾患における潜在的な治療的手法を提供するという考えを支持する。

【0034】

本明細書では、野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現する、遺伝的に修正された患者ｉＰＳＣｓ（ＡＳＰＡ ｉＰＳＣｓ）を生成させるために、遺伝子療法手法と併用されるｉＰＳＣ系細胞療法手法が開示される。その後、ＡＳＰＡ ｉＰＳＣｓは、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞、オリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞に分化し、それらの治療的な潜在能力は免疫不全カナバン病マウスモデルにおいて評価される。

【0035】

したがって、本明細書では、被験体のカナバン病を治療する方法が開示される。本方法は、ＷＴ ＡＳＰＡ遺伝子を発現する遺伝的に修正された患者ｉＰＳＣｓを開発するために、患者特異的なｉＰＳＣｓを遺伝子療法と併用する。ＡＳＰＡ ｉＰＳＣｓは、ＮＰＣｓに分化した。あるいは、遺伝子修正は、神経前駆細胞レベルで生じてよく、すなわち、遺伝的に修正された神経前駆細胞を生成するために、患者に由来するリプログラムされたｉＰＳＣｓが神経前駆細胞に分化した後、野生型ＡＳＰＡ遺伝子が神経前駆細胞に導入される。ＣＤ疾患表現型を緩和するこれらの神経前駆体の機能は、実施例で実証されるように、ＣＤマウスモデルで試験した。また、ＣＤに対する治療候補として機能する、遺伝的に修正された患者ｉＰＳＣｓに由来する神経前駆細胞についての前臨床の効能は、実施例で実証された。

【0036】

ＣＤはＡＳＰＡ遺伝子の遺伝子変異によって生じるため、ＣＤ患者のｉＰＳＣｓ又は神経前駆細胞は、レンチウイルス形質導入を通じてＷＴ ＡＳＰＡ遺伝子を導入することで遺伝的に修正される。結果として生じるＡＳＰＡ ｉＰＳＣｓは、神経前駆細胞に分化する。検出可能なＡＳＰＡ活性をほとんど呈しないＣＤ ｉＰＳＣ由来のＣＤ ＮＰＣｓとは対照的に、ＡＳＰＡ神経前駆細胞は強力なＡＳＰＡ活性を呈する。
ＡＳＰＡ神経前駆細胞は、ＡＳＰＡ活性の喪失、ＮＡＡレベルの亢進及び様々な脳領域における広範囲にわたる海綿変性を含むＣＤの主要な病理学的表現型を呈する、ＣＤマウスモデルに移植される。移植されたＡＳＰＡ神経前駆細胞は、移植後に生存し、オリゴデンドログリア系統細胞に分化することができる。さらに、移植された細胞は、強力なＡＳＰＡ酵素活性を呈し、移植されたＣＤマウスの脳内のＮＡＡレベル及び海綿変性を低下させることができる。ＡＳＰＡ‐ＣＤ神経前駆細胞の移植はまた、ＣＤマウスの体重減少及び行動障害を克服することができる。重要なことに、移植されたマウスにおいて腫瘍発生又は他の有害作用は観察されない。これらの結果は、ＡＳＰＡ‐ＣＤ神経前駆細胞がＣＤに対する潜在的な細胞置換治療上の候補として機能することができることを示す。

【0037】

ＣＤに対する治癒法は存在せず、対症療法のみである。細胞療法を適用すると広い治療的影響を及ぼしうるので、大きな勢いを得ている。生着細胞は、欠損した酵素の持続的な供給源として機能するだけでなく、宿主で欠失した細胞を置換することができる。本明細書で開示される、神経前駆細胞は、ＣＤで欠失したオリゴデンドログリア系統細胞にへの分化能があるため、ｉＰＳＣ由来の神経前駆細胞はＣＤに対する細胞療法候補となり得る。具体的には、遺伝的に修正された、ＷＴ ＡＳＰＡ発現ＣＤ ｉＰＳＣｓに由来する神経前駆細胞が用いられてよい。なぜなら、ＡＳＰＡ‐ＣＤ神経前駆細胞は欠失したオリゴデンドログリア系統細胞に置換するだけでなく、欠失したＡＳＰＡ酵素を再構成することができるからである。細胞療法をヒトに移行させるための主な障害は、患者への移植のために十分な細胞を入手することである。ｉＰＳＣｓは、それらの容易なアクセス可能性及び広範囲にわたる増殖可能性
のために、それがなければ細胞置換療法ができない、細胞の無限の供給源を提供し得る。そのうえ、患者特異的なｉＰＳＣは、同種異系の細胞移植と関連する免疫原性を回避し得る、自己由来の細胞の供給源を提供することができ、従って、細胞置換療法を用いるヒト疾患の治療のための選択肢を提供する。

【0038】

ｉＰＳＣｓが分化した産物は、奇形腫を形成することが示されない。潜在的な奇形腫の発達と関連する安全性への懸念に対処するために、最終的なｉＰＳＣ由来の製品に未分化細胞が確実に含まれないことが重要である。本明細書で開示される方法は、非常に高い効率でヒトｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させる。実施例で実証されるように、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓのＦＡＣＳ解析は、９８％を超える細胞が、ヒトＮＰＣｓの細胞表面マーカーであるＣＤ１３３に対して陽性であることを示した。対照的に、０．０５４％の細胞のみが、ヒトＥＳＣ表面マーカーであるＳＳＥＡ４に対して陽性である。ＡＳＰＡ２ ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３ ＮＰＣｓについては、高率のＣＤ１３３陽性細胞も検出された。そのうえ、多能性幹細胞の混入がないことを確実にすべく、ＡＳＰＡ２及びＡＳＰＡ３ ＮＰＣ移植のために、ＣＤ１３３についての正の選択及びＳＳＥＡ４についての負の選択を通じて選別された細胞を用いた。

【0039】

遺伝子療法は、ＣＤに対する有望な臨床的な選択肢である。前臨床及び臨床の遺伝子療法研究で、野生型ヒトＡＳＰＡ遺伝子をＣＤ動物モデル又はＣＤ患者に送達することによって行われ、進歩が促進されてきた（非特許文献１６～２２）。しかしながら、おそらく瀕死のオリゴデンドロサイトは遺伝子療法によって置換されないため、病理学的特質の部分的な寛解しか達成されていない。オリゴデンドロサイトの前駆体へのＷＴ ＡＳＰＡの標的化送達は、おそらくＷＴ ＡＳＰＡがオリゴデンドログリア系統細胞において再構成されたため、その成果が改善され、ＣＤに対する治療設計においてオリゴデンドロサイトを標的とすることの重要性が支持される。それにもかかわらず、遺伝子療法だけでは、欠失した宿主細胞の置換能はなく、疾患の進行を妨げ、快復を促進することを助長しうる潜在的な栄養的支持は提供されえない。遺伝子療法の他に、最近の研究は、ＮＡＡシンターゼＮａｔ８Ｌ（Ｎ‐アセチルトランスフェラーゼ‐８様）遺伝子をノックアウトして、それらのＮＡＡの生成能を消失させることによって、ＡＳＰＡ^{ｎｕｒ７／ｎｕｒ７}マウスがＣＤのある一定の病理学的態様の進行が阻害させることを実証した。

【0040】

ＣＤは脳のＡＳＰＡ酵素及びオリゴデンドロサイトが欠乏するため、ＣＤの治療のための理想的な戦略は、細胞療法及び遺伝子治療を併用して、脳のＡＳＰＡ活性を回復させ、瀕死のオリゴデンドロサイトを置換することであろう。回復したＡＳＰＡ活性により、ＮＡＡレベルが低下しうる。ＷＴヒトＡＳＰＡ遺伝子を発現し、ＯＰＣｓ及びオリゴデンドロサイトへの分化能があるＮＰＣｓの移植は、欠失したＡＳＰＡ酵素及び欠失したオリゴデンドログリア系統細胞を再構成することで、ＣＤに対する魅力的な治療的手法を提供する。実際に、ＷＴ ＡＳＰＡ遺伝子を用いて形質導入されたマウス神経前駆細胞は生存し、オリゴデンドロサイトに分化することができ、ＣＤマウスの脳の中への移植の後に、検出可能なＡＳＰＡ活性を呈した（非特許文献４１）。このことは、神経前駆細胞がＣＤに対する細胞療法の潜在的な供給源として用いられうることを示唆する。しかしながら、この以前の研究はマウス細胞を用いており、これは臨床的に適用できない（非特許文献４１）。そのうえ、おそらくレトロウイルスベクターからの短期間の生体内の遺伝子発現のために、上昇したＡＳＰＡ酵素活性は移植後３週間で検出されたのみであり、ＡＳＰＡ活性は移植後５週間で検出不能になった（非特許文献４１）。さらに、ＣＤの病理学的表現型に対する移植されたマウスＮＰＣｓの効果は、以前の研究では研究されていない（非特許文献４１）。実施形態では詳述されるように、ＣＤ患者ｉＰＳＣｓは、ＷＴ ＡＳＰＡ遺伝子を発現するレンチウイルスを用いてＣＤ ｉＰＳＣｓに形質導入することによって、遺伝的に修正されたヒトＡＳＰＡ ｉＰＳＣｓを生成させるために、遺伝子療法手法と併用される。これらのｉＰＳＣｓは、続いてＡＳＰＡ神経前駆細胞に分化される。あるいは、ＣＤ患者ｉＰＳＣｓが神経前駆細胞に分化した後、ＷＴ ＡＳＰＡ遺伝子が神経前駆細胞に導入される。結果として生じるＡＳＰＡ神経前駆細胞は、ＡＳＰＡ酵素の供給源として、そしてＷＴ ＡＳＰＡ発現オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）及びオリゴデンドロサイトを生成させるための神経前駆細胞として機能した。移植の３ヶ月後でさえ、移植されたＣＤマウス脳における強健な（ｒｏｂｕｓｔ）ＡＳＰＡ酵素活性が検出された。より重要なことには、実質的なＡＳＰＡ活性の亢進、ＮＡＡレベル及び空胞形成の低下、ミエリン形成の亢進、体重の増加並びに運動機能の改善を含む、ＣＤマウスにおける主な病理学的表現型及び行動障害の実質的な克服がみられた。したがって、これらの患者特異的なかつ遺伝的に修正されたＡＳＰＡ神経前駆細胞は、ＣＤ患者にとって一つの理想的な細胞置換療法として機能する。

【0041】

カナバン病に対する既存の治療法は、ある程度まで機能回復の改善をもたらした；しかしながら、本疾患と関連する病理学的特質の完全な修正を結果としてもたらしたものはない。本明細書で開示される方法は、細胞療法を遺伝子療法と併用して酵素補充及び細胞置換を提供することによって、はるかに改善された臨床的な成果を呈する、カナバン病に対する新規療法を提供する。

【0042】

本明細書に開示されるＣＤの免疫学的に欠陥のあるマウスのモデルを用いることにより、免疫拒絶反応がなくヒト神経前駆細胞が移植できた。ＷＴとＡＳＰＡのＣＤ変異体との間には、最小限のアミノ酸の相違があるのみである。ＷＴ ＡＳＰＡ遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルスベクターを用いたＣＤに対する遺伝子療法の臨床試験では、ＣＤ患者に長期の有害事象は観察されなかった。したがって、さらなる利点は、ＡＳＰＡ‐ＣＤ神経前駆細胞におけるＷＴ ＡＳＰＡ遺伝子の発現から免疫拒絶反応が結果としてもたらされないことである。

【0043】

一つの態様では、本開示は、被験体のカナバン病を治療する方法に関連する。本方法は、被験体の脳において外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させることによって被験体のＡＳＰＡ酵素活性を回復させる。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＡ酵素活性は、被験体の脳にＡＳＰＡ神経前駆細胞を移植することによって回復する。これらのＡＳＰＡ神経前駆細胞は、ＡＳＰＡ酵素の供給源として、並びにＷＴ ＡＳＰＡ発現オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）及びオリゴデンドロサイトを生成させるための神経前駆細胞として機能する。本開示において詳述されるように、ＡＳＰＡ神経前駆細胞は、患者特異的なｉＰＳＣｓに由来してもよい。例えば、本方法は、さらに、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得る工程、及び、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞に分化させる工程、を含む。あるいは、本方法は、さらに、カナバン病に罹患した被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、ｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞に分化させる工程、並びに、神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得る工程、を含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、体細胞は、線維芽細胞、血球、泌尿器細胞、脂肪細胞、角化細胞、歯髄細胞、及び他の容易にアクセス可能な体細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｐ５３ ｓｈＲＮＡ、並びに（ｃ‐ＭＹＣ及びＬ‐ＭＹＣのような）ＭＹＣを含む１つ以上のリプログラミング因子の存在下でｉＰＳＣｓに転換される。いくつかの実施形態では、リプログラムするステップは、エピソーマルなリプログラミング又はウイルス形質導入を介して行われる。
患者の体細胞をｉＰＳＣｓに転換するためのリプログラミング技術を選択することは、当業者の知識の範囲内である。いくつかの実施形態では、野生型ＡＳＰＡ遺伝子は、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を含むベクターを用いてリプログラムされたｉＰＳＣｓに形質導入することによって、リプログラムされたｉＰＳＣｓに導入される。形質導入後に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させるための適当なベクター及びプロモーターを選択することは、当業者の知識の範囲内である。いくつかの実施形態では、野生型ＡＳＰＡ遺伝子は、（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術のような）遺伝子編集技術によって、導入される。

【0045】

一つの他の態様では、本開示は、被験体のカナバン病を治療する方法に関連する。本方法は、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得る工程、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させる工程、及び、神経前駆細胞を被験体の脳に移植する工程、がある。いくつかの実施形態では、本方法は、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、ｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させる工程、神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得る工程、及び、遺伝的に修正された神経前駆細胞を被験体の脳に移植する工程、がある。

【0046】

いくつかの実施形態では、体細胞は、線維芽細胞、血球、泌尿器細胞、脂肪細胞、角化細胞、歯髄細胞、及び他の容易に利用できる体細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｐ５３ ｓｈＲＮＡ、並びに（ｃ‐ＭＹＣ及びＬ‐ＭＹＣのような）ＭＹＣを含む１つ以上のリプログラミング因子の存在下でｉＰＳＣｓに転換される。

【0047】

いくつかの実施形態では、リプログラムする工程は、エピソーマルなリプログラミング又はウイルス形質導入を介して行われる。患者の体細胞をｉＰＳＣｓに転換するためのリプログラミング技術を選択することは、当業者の知識の範囲内である。患者の体細胞から転換されたｉＰＳＣｓは、ＡＳＰＡタンパク質に１つ以上の変異を包含する。例えば、カナバン病を患っている一部の患者は、それぞれ第９１４番目のコドンＣがＡに変異していることを示す９１４Ｃ＞Ａ、又は第８５４番目のコドンＡがＣに変異していることを示す８５４Ａ＞Ｃ及び第５２７番目のコドンＧがＡに変異していることを示す５２７Ｇ＞Ａのコドン変化から結果として生じる、Ａ３０５Ｅ、Ｅ２８５Ａ又はＧ１７６Ｅ変異のように、ＡＳＰＡタンパク質に１つ以上の変異を保持している。一部のカナバン病患者は、ＡＳＰＡタンパク質の異なる領域に他の変異を保持しているかも知れない。野生型ＡＳＰＡ遺伝子を患者ｉＰＳＣｓに導入すると、これらのｉＰＳＣｓは、外因性の野生型ＡＳＰＡタンパク質を発現し、ＡＳＰＡ酵素活性を呈するように遺伝子操作される。

【0048】

いくつかの実施形態では、野生型ＡＳＰＡ遺伝子は、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を含むベクターを用いてリプログラムされたｉＰＳＣｓに形質導入することによって、リプログラムされたｉＰＳＣｓに導入される。形質導入後に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させるための適当なベクター及びプロモーターを選択することは、当業者の知識の範囲内である。例えば、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子は、野生型ＡＳＰＡ遺伝子を含むレンチウイルスを用いて患者ｉＰＳＣｓに形質導入することによって、導入されてもよい。カナバン病患者ｉＰＳＣｓにおけるＡＳＰＡ遺伝子変異はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術のような、遺伝子編集技術によって修正されてもよい。遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓは生体外で神経前駆細胞に分化され、それもまた野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現する。カナバン病に罹患している被験体の脳にこれらのＡＳＰＡ ＮＰＣｓを移植した後に、ＡＳＰＡ神経前駆細胞が生体内でオリゴデンドログリア系統細胞に分化し、それにより正常なＡＳＰＡ酵素活性を回復させることによって疾患を治療してもよい。いくつかの実施形態では、遺伝的修正は、神経前駆細胞レベルで同様に起こる。ＣＤ患者ｉＰＳＣｓが神経前駆細胞に分化された後、野生型ＡＳＰＡ遺伝子が、当技術分野において既知の技術である、形質導入又は遺伝子編集によって神経前駆細胞に導入される。

【0049】

一つの他の態様では、本開示は、カナバン病を治療するために、ＡＳＰＡ酵素の供給源並びにＷＴ ＡＳＰＡ発現オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）及びオリゴデンドロサイトを生成するための神経前駆細胞として機能する、ＡＳＰＡ神経前駆細胞を作製する方法に関する。ＡＳＰＡ神経前駆細胞は、患者特異的なｉＰＳＣｓに由来する。本方法は、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得る工程、及び、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させる工程、を含む。あるいは、本方法は、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、ｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させる工程、及び、神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得る工程、を含む。

【0050】

一つの関連する態様では、本開示は、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現する神経前駆細胞であって、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得る工程、及び、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させる工程、を含むプロセスによって作製された神経前駆細胞、に
関する。あるいは、プロセスは、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換する工程、ｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させる工程、及び、神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入して野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得る工程、を含む。本明細書において使用される場合、神経前駆細胞は、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、体細胞は、線維芽細胞、血球、泌尿器細胞、脂肪細胞、角化細胞、歯髄細胞、及び他の容易に利用できる体細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、カナバン病に罹患している被験体から分離された体細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｐ５３ ｓｈＲＮＡ、並びに（ｃ‐ＭＹＣ及びＬ‐ＭＹＣのような）ＭＹＣを含む１つ以上のリプログラミング因子の存在下でｉＰＳＣｓに転換される。いくつかの実施形態では、リプログラムするステップは、エピソーマルなリプログラミング又はウイルス形質導入を介して行われる。
患者の体細胞をｉＰＳＣｓに転換するためのリプログラミング技術を選択することは、当業者の知識の範囲内である。いくつかの実施形態では、野生型ＡＳＰＡ遺伝子は、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を含むベクターを用いてリプログラムされたｉＰＳＣｓに形質導入することによって、又は遺伝子編集技術によって、リプログラムされたｉＰＳＣｓに導入される。形質導入後に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させるための適当なベクター及びプロモーターを選択することは、当業者の知識の範囲内である。

【0052】

症状について、本明細書で用いられる用語「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、その状態を予防すること、その状態の発症又は進展を遅延させること、その状態が進展するリスクを低減すること、その状態と関連する症状の進展を予防又は遅延させること、その状態と関連する症状を軽減又は終了させること、その状態の完全又は部分的な回帰を生成すること、又はいつくかのそれらの併用をいう。いくつかの実施形態では、症状を治療することは、症状が再発することなく治癒することを意味する。

【0053】

本明細書で用いられる用語「被験体」と「患者」は互換的に用いられる。いくつかの実施形態では、被験体又は患者はカナバン病に罹患している。いくつかの実施形態では、被験体又は患者は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、被験体又は患者はヒトである。

【0054】

以下の実施例は、本開示の様々な実施形態をさらに説明する。実施例が本発明の範囲を限定することは決してない。

【実施例0055】

材料及び方法
［ｉＰＳＣｓ生成］ エピソーマルなｉＰＳＣ誘導のために、ＩＭＲ９０線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ、Ｉ９０‐１０）及びＣＤ患者線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ、ＧＭ０４２６８）は、記載されているように、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ‐Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８及びｐ５３ ｓｈＲＮＡを発現するエピソーマルベクターを用いてリプログラムされた（非特許文献３２）。端的には、５×１０^５個の線維芽細胞を、１．２５μｇの各エピソーマルベクターを用いて電気穿孔され、その日を０日目とした。トランスフェクトされた細胞は、線維芽細胞培地（ＮＥＡＡ含有ＭＥＭ、１５％非熱失活ウシ胎仔血清）中で培養され、培地は一日おきに交換した。細胞を５日目に解離し（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ）、６日目にＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８）培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１５１６９－０１）に切り替えた。ｉＰＳＣクローンは２０日目前後に収集して、Ｅ８培地中で増殖させた。ウイルス性のｉＰＳＣ誘導のために、ＩＭＲ９０線維芽細胞又はＣＤ患者線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ、ＧＭ０００５９、ＧＭ０００６０及びＧＭ０４２６８）を、線維芽細胞培地中、ウェルあたり１×１０^５細胞で６ウェルプレート上に播種した。翌日、ｉＰＳＣｓは、記載されているように、新たに調製されたＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃＭｙｃのウイルスを用いて形質導入され（非特許文献１）、その日を０日目とした。ウイルス形質導入の第２ラウンドは、１日目に行った。５日目に、細胞を解離し、１～５でに分けた。６日目に、細胞はＥ８培地に切り替え、その後培地は毎日交換した。ｉＰＳＣクローンは２０日目前後に収集してＥ８培地中で増殖させた。

【0056】

［胚様体（ＥＢ）形成］ ＥＢｓを形成するために、ｉＰＳＣｓを、０．０５ｍＭのＥＤＴＡを用いて小さなクラスターに解離し、Ｔ２５フラスコ中のＥ８培地に移した。Ｅ８培地中で２日間培養した後に、ＥＢ球（ＥＢ ｓｐｈｅｒｅｓ）は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％ノックアウト血清、１ｍＭ Ｌ－グルタミンを包含するがｂＦＧＦ非含有ヒトＥＳＣ培地に切り替えた。２週間後に、ＥＢｓは、ゼラチンコートされた１２ウェルプレート上にプレーティングし、免疫染色解析の前にさらに２週間培養した。

【0057】

［奇形腫形成］ ｉＰＳＣｓは、ＰＢＳで１～２倍希釈したａｃｃｕｔａｓｅを用いて解離し、Ｅ８培地とＭａｔｒｉｇｅｌ（１：１）の氷冷混合液に１×１０^７細胞／ｍｌの密度で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（１×１０^６細胞）を、免疫不全Ｎｏｄ Ｓｃｉｄ Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスの背側腹部に皮下注射した。注射後８～１２週間に、奇形腫を解剖し、ホルマリンで固定した。固定した組織を、パラフィンで包埋し、切片にしてヘモトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。

【0058】

［ＡＳＰＡウイルス調製及び形質導入］ ＡＳＰＡ発現ウイルスを作製するため、鋳型としてヒトＡＳＰＡ ｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ、ＭＧＣ‐３４５１７）を用いてヒトＡＳＰＡコード配列をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を、ｐＳＩＮ‐ＥＦ２‐Ｓｏｘ２‐ｐｕｒからＳｏｘ２を除去する（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１６５７７）ことによって生成した、レンチウイルスベクターｐＳＩＮ‐ＥＦ２‐ｐｕｒにクローン化した。ＡＳＰＡ発現ウイルスをパッケージするために、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて、１５μｇのｐＳＩＮ‐ＥＦ２‐ｈＡＳＰＡ‐ｐｕｒ、５μｇのＶＳＶ‐Ｇ、５μｇのＲＥＶ及び１５μｇのＭＤＬをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８～７２時間後に、ウイルス含有培地を採取し、０．４５μｍフィルターを通して濾過した。ウイルス形質導入のために、新たに採取されたＡＳＰＡ発現ウイルスをＣＤ ｉＰＳＣｓに加えた。ウイルス形質導入の２日後、ピューロマイシン選択を開始し、７日間続けた。選択されたＡＳＰＡ‐ｉＰＳＣクローンを増殖し、特徴付けた。

【0059】

［ＡＳＰＡゲノムＤＮＡのエクソン配列決定］ ゲノムＤＮＡｓをＣＤ ｉＰＳＣｓから抽出した。各エクソンを配列決定するために用いたプライマーを以下の表１に列挙する。

【表1】

【0060】

［ヒトｉＰＳＣｓの神経前駆細胞（ＮＰＣｓ）への分化］ ＮＰＣｓを、確立されたプロトコルに従ってヒトｉＰＳＣｓから得た（非特許文献３３）。神経誘導を開始するため、ヒトｉＰＳＣｓを、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて解離し、Ｅ８培地中２０％の集密度でマトリゲルコートされたプレート上に継代した。２４時間後、細胞を、５０％Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１３３０‐０３２）、５０％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１１０３‐０４９）、Ｎ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０２‐０４８）、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２５８７‐０１０）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３５０５０‐０６１）、４μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｄ＆Ｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＤＣ９７０３）、３μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｒ＆Ｄ、１６１４）及び２μＭ Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ５４９９）含有神経誘導培地１（Ｎｅｕｒａｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ １）（ＮＩＭ‐１）に切り替えた。細胞をＮＩＭ‐１で２日間処理した後、さらに５日間、５０％Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、５０％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、１×Ｎ２、１×Ｂ２７、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、４μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ‐１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４‐００７４）含有神経誘導培地２（ＮＩＭ‐２）に切り替えた。その後細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ、Ａ６９６４）を用いて解離し、５０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２、５０％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、１×Ｎ２、１×Ｂ２７、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、２μＭ ＳＢ４３１５４２、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ含有神経幹細胞維持培地（ＮＳＭＭ）中で維持した。最初の６継代については、ＮＰＣｓを解離するときに１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤で処理した。ＮＰＣｓを、１４継代以内に新生仔マウスに移植した。

【0061】

［ｉＰＳＣ由来のＮＰＣｓのオリゴデンドロサイトへの分化］ 生体外でｉＰＳＣ由来のＮＰＣｓをオリゴデンドロサイトに分化させるため、ＮＰＣｓを、ＮＳＭＭ培地（上記参照）から、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１×Ｎ２、１×ＮＥＡＡ、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５μｇ／ｍＬ インシュリン、０．１μＭ ＲＡ及び１μＭ ＳＡＧ含有神経誘導培地３（ＮＩＭ‐３）に切り替え、毎日培地を交換しながら、ＮＩＭ‐３培地中で４日間培養した。次に細胞は解離し、ＮＩＭ‐３に再懸濁し、ＮＩＭ‐３中で８日間培養した。その後、細胞は、次の１０日間、２日毎に培地を交換しながら、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１×Ｎ２、１×ＮＥＡＡ、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５μｇ／ｍＬ インシュリン（Ｓｉｇｍａ、１９２７８）、５ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２９４‐ＨＧ‐０２５）、１０ｎｇ／ｍＬ ＰＤＧＦ‐ＡＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２２１‐ＡＡ‐０５０）、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ‐１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２９１‐Ｇ１‐２００）、１０ｎｇ／ｍＬ ＮＴ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧＦ０３１）、６０ｎｇ／ｍＬ Ｔ３（Ｓｉｇｍａ、Ｔ２８７７）、１００ｎｇ／ｍＬ ビオチン（Ｓｉｇｍａ、４６３９）及び１μＭ ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ０２６０）含有ＰＤＧ培地に切り替えた。次いで細胞は、マトリゲルコートされた６ウェルプレート上に付着し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１×Ｎ２、１×ＮＥＡＡ、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５μｇ／ｍＬ インシュリン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｈ４０３４）、６０ｎｇ／ｍＬ Ｔ３、１００ｎｇ／ｍＬ ビオチン、１μＭ ｃＡＭＰ及び２５μｇ／ｍＬ アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、Ａ４４０３）含有グリア培地中で、４５日間又はそれ以上培養した。

【0062】

［免疫不全ＣＤマウスの生成及び維持］ 全ての動物飼育条件及び外科的処置は、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅの機関内の動物飼育及び使用委員会によって承認され、それに従って行った。ＡＳＰＡ^{ｎｕｒ７／＋}（ＡＳＰＡ^ｎｕｒ７／Ｊ、００８６０７）及びＲａｇ２－／－マウス（Ｂ６（Ｃｇ）‐Ｒａｇ２^{ｔｍ１．１Ｃｇｎ}／Ｊ、００８４４９）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＡＳＰＡ^{ｎｕｒ７／＋}マウスは、Ｒａｇ２－／－マウスと４世代戻し交配し、ＡＳＰＡ^{ｎｕｒ７／ｎｕｒ７}及びＲａｇ２^－／－変異のホモ接合性についてスクリーニングした。

【0063】

［定位的な移植］ 新生仔マウス（Ｐ２‐Ｐ４）を、氷上で４分間麻酔した後、定位固定装置上に配置した。細胞懸濁液を、３３ゲージ針付きハミルトンシリンジを用いて新生仔マウス脳に注射した。公開された研究（非特許文献４２）から、移植のために修正された以下の座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）を用いた。視床：（－０．５，１，－２．５）、小脳：（－２．０，０．８，－２．５）、及び脳幹（－２．０，０．８，－３．２）。全ての座標は、ラムダを参照して（Ａ，Ｌ，Ｖ）である。各々、Ａは正中線からの前後を表し、Ｌは正中線からの横側を表し、Ｖは脳の表面からの腹側（ｖｅｎｔｒａｌ）を表す。１４継代以内のＮＰＣｓを、１部位あたり２００，０００細胞、２μＬ及びマウスあたり６部位で、視床、並びに小脳白質及び脳幹に両側に（ｂｉｌａｔｅｒａｌｌｙ）移植した。

【0064】

［ＡＳＰＡ酵素活性アッセイ］ ＡＳＰＡ酵素アッセイは、公開されたプロトコルに基づいて開発された（非特許文献４３）。４０マイクロリットルの細胞溶解物又は脳組織タンパク質上清を、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ，ｐＨ８．０、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、０．２５％非イオン性界面活性剤、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭ ＮＡＡ（Ｓｉｇｍａ、００９２０）を含有する、１０μｌのアッセイ緩衝液に加えた。反応混合物は３７℃で９０分間インキュベートした後チューブを沸騰水中で３分間インキュベートして反応を停止した。反応ブランクは、タンパク質ホモジネートの代わりに４０μｌのＨ_２Ｏを加えて作製した。反応混合物の沈殿物を除去するために１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ，ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ α‐ケトグルタル酸、０．１５ｍＭ β‐ＮＡＤＨ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ並びに各１０単位のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸‐オキサロ酢酸トランスアミナーゼ含有酵素アッセイ緩衝液に加えた。反応物を、室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートした。上清を透明な９６ウェル平底プレートに移し、プレートリーダーを用いて３４０ｎｍで吸光度を測定した。

【0065】

［ＮＡＡレベル測定］ 水性の代謝産物を、記載されているように、過塩素酸（ＰＣＡ、Ｓｉｇｍａ、２４４２５３）の方法を用いて、指示されたマウスの視床、脳幹及び小脳から抽出した（非特許文献４４）。簡潔には、組織を迅速に小片に切り刻み、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに集めた。５ｍｌ／ｇ（湿重量基準）の６％氷冷ＰＣＡを各チューブに加えた後、３０秒間ボルテックスし、さらに１０分間氷上でサンプルをインキュベートした。混合物を、４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離した。ＰＣＡ上清を、新しいチューブに移し、２Ｍ Ｋ_２ＣＯ_３を用いて中和し、蓋をあけてＣＯ_２を開放して氷上に置いた。各試料をボルテックスし、過塩素酸カリウム塩を沈殿させるために氷上で３０分間インキュベートした。上清ｐＨを７．４±０．２に調製した後４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離した。
上清をエッペンドルフチューブに移し、ドライアイス上で凍結し。次いで試料について、Ｃｉｔｙ ｏｆ ＨｏｐｅのＮＭＲコア施設でＮＭＲ解析を行った。

【0066】

［電子顕微鏡法（ＥＭ）］ マウスを、イソフルランを用いて深く麻酔し、３７℃で、０．９％食塩水、続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）及び２．５％グルタルアルデヒド含有０．１Ｍ ミロニヒ緩衝液（Ｍｉｌｌｏｎｉｇ’ｓ ｂｕｆｆｅｒ）を用いて灌流した。脳組織を解剖し、同じ固定液（ｆｉｘａｔｉｖｅ）中で一晩、後固定した。Ｍａｒｋ Ｅｌｌｉｓｍａｎ博士のグループによって開発された重金属染色プロトコル（非特許文献４５）に従った。標的組織は、Ｌｅｉｃａ ＶＴ １０００Ｓビブラトームを用いて約１５０μｍ（～１５０μｍ）のビブラトーム切片に切断した。次いでビブラトーム切片は、２．５％グルタルアルデヒド及び２ｍＭ 塩化カルシウム含有０．１５Ｍ カコジル酸緩衝液，ｐＨ７．４中で一晩固定した。翌日、組織切片は、２ｍＭ 塩化カルシウム含有０．１５Ｍ カコジル酸緩衝液，ｐＨ７．４中で５×３分間洗浄した後１．５％フェロシアン化カリウム、２％水性四酸化オスミウム（ａｑｕｅｏｕｓ ｏｓｍｉｕｍ ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ）及び２ｍＭ 塩化カルシウム含有０．１５Ｍカコジル酸緩衝液，ｐＨ７．４中で１時間置いた。次いで試料を、１％チオカルボヒドラジド（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）中に２０分間配置した後、２％四酸化オスミウム中で３０分間固定した。次いで試料を、４℃で１％水性酢酸ウラニル水溶液中に一晩置いた。水を用いて５×３分間洗浄した後、試料を、ウォルトンのアスパラギン酸鉛（Ｗａｌｔｏｎ’ｓ ｌｅａｄ ａｓｐａｒｔａｔｅ）を用いて、６０℃のオーブン内で３０分間、まとめて（ｅｎ ｂｌｏｃ）染色した。さらに５×３分間水中ですすいだ後に、試料を脱水し、Ｄｕｒｃｕｐａｎ ＡＣＭ樹脂（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に包埋した。７０ｎｍ厚の超薄切片を、ダイヤモンドナイフを備えたＬｅｉｃａ Ｕｌｔｒａｃｕｔ ＵＣＴウルトラミクロトームを用いて切断し、２００メッシュの銅ＥＭグリッド上にピックアップした。透過型電子顕微鏡法は、Ｃｉｔｙ ｏｆ ＨｏｐｅのＥＭコア施設において、Ｇａｔａｎ Ｕｌｔｒａｓｃａｎ ２Ｋ ＣＣＤカメラを備えたＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ １２透過型電子顕微鏡によって実施した。

【0067】

［ロータロッド試験］ マウスの運動能は、記載されているように、マウスをロータロッドトレッドミル（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって試験された（非特許文献３４）。指示された細胞を用いて移植された１ヶ月齢又は３ヶ月齢のＡｓｐａ^{ｎｕｒ７／ｎｕｒ７}Ｒａｇ２－／－マウス（ＣＤマウス）を評価した。マウスは、５分間の試行期間中にロッドの速度を加速して（５‐６５ｒｐｍ）回転していた場合のロッド上の潜時について試験した。各マウスは、試験あたり３回、潜時についてモニターした。

【0068】

［ワイヤ懸垂試験］ 肢の強さを、記載されているように、四肢の“ワイヤ懸垂”手法を通じて、神経筋機能の指標として評価した（非特許文献４６）。１０ｃｍ×１５．５ｃｍのフィールドを形成するようにテープをワイヤケージの蓋に設け、フィールド中にマウスを置いた。マウスがワイヤを強く握った後に、蓋は静かに逆さまに回され、クッションを備えた地面の上、およそ２０ｃｍに保持された。マウスが落下するまでの潜時を測定した。
野生型マウスは通常、少なくとも６０秒間蓋を握ることができ、従ってカットオフ潜時は６０秒に設定した。神経筋が不能であれば、蓋から落下が早過ぎてしまうだろう。

【0069】

［ＲＮＡ調製及びＲＴ‐ＰＣＲ解析］ 全ＲＮＡは、ＴＲＩａｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６０１８）を用いて、細胞から抽出された。逆転写を、Ｔｅｔｒｏ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ、ＢＩＯ‐６５０４３）を用いて、１μｇのＲＮＡを用いて行った。ＰＣＲ用プライマーを表２に列挙する。
表２ プライマーの配列

【表2】

【0070】

［免疫細胞化学］ 細胞を、４％ＰＦＡを用いて室温で５‐１０分間固定した。固定後、細胞を、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、０．１％トリトン含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を用いて２０分間ブロックした。固定された細胞を、一次抗体と共に室温で１時間又は４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳを用いて２回洗浄した後二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、洗浄した。用いた一次抗体を表３に列挙した。
表３ 一次抗体のリスト

【表3】

【0071】

［免疫組織化学］ 免疫組織化学を、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定組織に対して行った。動物を深く麻酔し、氷冷０．９％食塩水、続いて４％ＰＦＡを用いて経心的に（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）灌流した。灌流された脳を取り出し、４％ＰＦＡ中で一晩、後固定した後３０％スクロースを用いて凍結保護した（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）。凍結保護された脳を急速冷凍し、－８０℃で保存した。免疫組織化学解析用の脳切片を、ＰＢＳＴを含むＰＢＳ中で２０分間透過処理し、ＰＢＳＴ中で３×５分間洗浄した。切片を一次抗体（表３）と共に４℃で一晩インキュベートした。一次抗体のインキュベーション及び洗浄の後、切片を、抗マウスＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、７１５‐１６５‐１５０）、抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２０６）、及び抗マウスＤｙｌｉｇｈｔ ４８８（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、７１５‐４８７‐００３）を含む二次抗体と共に、室温で２時間インキュベートし、１×ＰＢＳを用いて洗浄し、Ｄａｐｉを用いて対比染色し、４％ＰＶＡ封入剤を用いて封入した。染色を最適化するための抗原回収（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）又は界面活性剤は必要なかった。細胞運命及び増殖状態の評価は、抗ヒト核抗原ＳＣ１０１を、ＯＬＩＧ２、ＭＡＰ２、ＧＦＡＰ又はＫｉ６７に対する抗体と共に用いて二重免疫染色することによって行った。共焦点顕微鏡法（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によって行い、結果として得られた画像をＺｅｎ２．３ｌｉｔｅソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて解析した。脳全体を走査した。全てのマーカーについて染色の全深度を捉えるため、Ｚ‐積み重ね画像化（Ｚ－ｓｔａｃｋ ｉｍａｇｉｎｇ）を行った。ヒト核抗原＋細胞、ヒト核抗原＋ＯＬＩＧ２＋細胞又はヒト核抗原＋Ｋｉ６７＋細胞を計数した。定量化のため、各マウス脳から８切片毎のスライドを選択した。直交図ツールを、二重陽性細胞におけるヒト核抗原及びＭＢＰについての共染色を確認するために用いた。

【0072】

［空胞化解析］ ８分の１シリーズの切片（ｏｎｅ－ｉｎ－ｅｉｇｈｔ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｓｅｃｔｉｏｎｓ）を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色し、視床、小脳及び脳幹を含む脳領域の体積の測定に用いた。全領域がＺｅｉｓｓ共焦点顕微鏡下で走査した。Ｚ‐積み重ね画像を取得した。空胞化した脳領域及び無傷の脳領域の表面積を全領域の画像を用いて画像Ｊでモニターした。体積は、表面積の合計にサンプリングされた切片間の距離を掛けて計算した。％空胞化（％Ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）＝空胞化した脳領域の体積／空胞化した脳領域の体積＋無傷の脳領域の体積。

【0073】

［ＡＳＰＡ１ ＮＰＣを移植したマウスにおける腫瘍モニタリング］ ＡＳＰＡ１ ＮＰＣｓをＣＤマウスに最大１０ヶ月まで移植した。１０ヶ月の期間中、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣを移植したＣＤマウスを毎月モニターした。移植の１０ヶ月後に、ＡＳＰＡ１ ＮＰＣを移植したＣＤマウスを灌流し、切片にして、Ｈ＆Ｅ染色又はＫｉ６７染色を行った。

【0074】

［統計解析］ 図の説明文に明記されているように、データは、平均値±標準偏差又は平均値±標準誤差として示す。処置群あたりのマウスの数は、対応する図の説明文で“ｎ”と示す。除外基準は適用されない。動物を無作為に処置群に割り当てた。本研究は、ブラインドでない。各図の説明文で報告されるように、統計解析にはスチューデントｔ検定を用いた。ｐ＜０．０５を、統計学的に有意とみなした。

【実施例0075】

ＣＤ ｉＰＳＣｓの誘導及び特徴付け
一次皮膚線維芽細胞を、３人の臨床的に罹患しているカナバン病患者から得た（表４）。２人のカナバン病患者（ＣＤ１及びＣＤ２）は各々、ＡＳＰＡ遺伝子のヌクレオチド５２７（５２７Ｇ＞Ａ）及びヌクレオチド９１４（９１４Ｃ＞Ａ）にヘテロ接合性の変異があり、結果としてコドン１７６におけるグルタミン酸によるグリシンの置換（Ｇ１７６Ｅ）及びコドン３０５におけるアラニンのグルタミン酸による置換（Ａ３０５Ｅ）がもたらされる。第３のカナバン病患者（ＣＤ３）は、ＡＳＰＡ遺伝子のヌクレオチド８５４にホモ接合性の変異があり（８５４Ａ＞Ｃ）、結果としてコドン２８５におけるアラニンによるグルタミン酸の置換がもたらされる（Ｅ２８５Ａ）。Ｅ２８５Ａは、アシュケナージ系ユダヤ人集団の間で優勢な突然変異（変異の８２％以上を占める）であり（非特許文献２８及び２９）、一方Ａ３０５Ｅは、非ユダヤ人のカナバン病患者で最も一般的な変異（６０％）である（非特許文献３０）。Ｇ１７６Ｅは、本明細書では、カナバン病患者において同定された新しいＡＳＰＡ変異が開示される。正常なヒト線維芽細胞ＩＭＲ９０を野生型（ＷＴ）対照として含む（表４）。
表４ 実施例にて用いられた野生型細胞及びＣＤ細胞

【表4】

【0076】

ＷＴ及びＣＤ患者ｉＰＳＣｓ（ＣＤ ｉＰＳＣｓ）を得るため、エピソーマルなリプログラミング（非特許文献３１及び３２）又はウイルス形質導入（非特許文献１）を介して、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８及びＭＹＣを含むリプログラミング因子を用いて、これらの線維芽細胞をリプログラムした。正常なヒト線維芽細胞及びＣＤ患者線維芽細胞の両方に由来するｉＰＳＣ系統は、主要なヒト多能性遺伝子、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ、並びにヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）特異的表面マーカー、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ‐１‐６０及びＴＲＡ‐１‐８１を発現した（図１）。ＲＴ‐ＰＣＲ解析によって明らかにされるように、内因性ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧ遺伝子発現の活性化が、ＷＴ及びＣＤ ｉＰＳＣｓの両方で観察された（図２Ａ）。対照的に、外因性リプログラミング因子、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８及びＭＹＣの発現は、これらのｉＰＳＣｓでは検出可能でなかった（図２Ｂ及び２Ｃ）。細胞遺伝学的解析により、試験された全てのｉＰＳＣクローンにおいて正常な核型が確認された（図２Ｄ）。

【0077】

配列解析は、ＣＤ患者１（ＣＤ１）及びＣＤ患者２（ＣＤ２）ｉＰＳＣｓがＡＳＰＡ遺伝子のヌクレオチド５２７（５２７Ｇ＞Ａ）及びヌクレオチド９１４（９１４Ｃ＞Ａ）に２つのヘテロ接合性の変異を含み、その一方でＣＤ患者３（ＣＤ３）ｉＰＳＣｓがＡＳＰＡ遺伝子のヌクレオチド８５４にホモ接合性の変異がある（８５４Ａ＞Ｃ）ことを確認した（図３Ａ）。同定されたＣＤ ｉＰＳＣクローンの多能性の潜在能を実証するために胚様体（ＥＢ）形成アッセイを行った。ＷＴ及びＣＤ ｉＰＳＣｓはともに、特徴的なＳＯＸ１７陽性内胚葉細胞、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）陽性中胚葉細胞、及びβＩＩＩチューブリン（ＴＵＪ１）陽性外胚葉細胞に分化した（図３Ｂ）。ＣＤ ｉＰＳＣｓの生体内での発達的潜在能を奇形腫形成アッセイで実証した。
ＣＤ ｉＰＳＣｓは、移植された免疫不全ＮＳＧマウスで、３つの胚葉全てを代表する組織を包含する奇形腫を発達させた（図３Ｃ及び３Ｄ）。

【0078】

バイサルファイト配列解析により、内因性Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇプロモーターがＣＤ ｉＰＳＣｓで大部分が脱メチル化されていることが示された。対照的に、親のＣＤ線維芽細胞中のＯｃｔ４及びＮａｎｏｇプロモーターは高度にメチル化されていた（図３Ｅ及び３Ｆ）。まとめると、これらの結果は、特徴的な多能性幹細胞であり、かつ患者のＡＳＰＡ変異を包含するＣＤ ｉＰＳＣｓを本発明者らが誘発しえたことを実証する。