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特開2023-29894合理的に設計された、非パリンドローム認識配列を有する単鎖メガヌクレアーゼ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023029894
(43)【公開日】2023-03-07
(54)【発明の名称】合理的に設計された、非パリンドローム認識配列を有する単鎖メガヌクレアーゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 9/16 20060101AFI20230228BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20230228BHJP
【ＦＩ】
C12N9/16 Z ZNA
C12N15/55
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022187981
(22)【出願日】2022-11-25
(62)【分割の表示】P 2020196770の分割
【原出願日】2008-10-31
(31)【優先権主張番号】61/001,247
(32)【優先日】2007-10-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】508117721
【氏名又は名称】プレシジョン バイオサイエンシズ，インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】スミス，ジェイムス，ジェファーソン
(72)【発明者】
【氏名】ジャンツ，デレック
(57)【要約】 （修正有）
【課題】合理的に設計された非天然由来のメガヌクレアーゼを提供する。
【解決手段】第１モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから誘導され、第１認識半部位を有する第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと、第２モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ又はジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから誘導され、第２認識半部位を有する第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットとを含み、前記第１及び第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがリンカに対しＮ末端となり、第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインが前記リンカに対しＣ末端となるように、ポリペプチドリンカにより共有結合され、前記第１及び第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは一緒に機能して、前記第１認識半部位及び前記第２認識半部位のハイブリッドである非パリンドロームＤＮＡ配列を、認識及び切断することができる、組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【選択図】図１
【解決手段】第１モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから誘導され、第１認識半部位を有する第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと、第２モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ又はジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから誘導され、第２認識半部位を有する第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットとを含み、前記第１及び第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがリンカに対しＮ末端となり、第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインが前記リンカに対しＣ末端となるように、ポリペプチドリンカにより共有結合され、前記第１及び第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは一緒に機能して、前記第１認識半部位及び前記第２認識半部位のハイブリッドである非パリンドロームＤＮＡ配列を、認識及び切断することができる、組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから誘導され、第１認識半部位を有す
る第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと、
第２モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ又はジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌク
レアーゼから誘導され、第２認識半部位を有する第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと
を含み、
前記第１及び第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメイ
ンがリンカに対しＮ末端となり、第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインが前記リンカに対しＣ
末端となるように、ポリペプチドリンカにより共有的に結合され、
前記第１及び第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは一緒に機能して、前記第１認識半
部位及び前記第２認識半部位のハイブリッドである非パリンドロームＤＮＡ配列を、認識
及び切断することができる、組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
る第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと、
第２モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ又はジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌク
レアーゼから誘導され、第２認識半部位を有する第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと
を含み、
前記第１及び第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメイ
ンがリンカに対しＮ末端となり、第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインが前記リンカに対しＣ
末端となるように、ポリペプチドリンカにより共有的に結合され、
前記第１及び第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは一緒に機能して、前記第１認識半
部位及び前記第２認識半部位のハイブリッドである非パリンドロームＤＮＡ配列を、認識
及び切断することができる、組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項2】
前記第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩおよびＩ－
ＣｅｕＩからなる群から選択されるモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから誘導
され、
前記第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、（１）Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩおよ
びＩ－ＣｅｕＩからなる群から選択されるモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ、
または（２）Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩおよびＩ－ＡｎｉＩからなる群から選択される
ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼのいずれかから誘導される、
請求項１に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
ＣｅｕＩからなる群から選択されるモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから誘導
され、
前記第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、（１）Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩおよ
びＩ－ＣｅｕＩからなる群から選択されるモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ、
または（２）Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩおよびＩ－ＡｎｉＩからなる群から選択される
ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼのいずれかから誘導される、
請求項１に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項3】
前記第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、前記第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニッ
トとは異なる種から誘導される、請求項１に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
トとは異なる種から誘導される、請求項１に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項4】
前記第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、配列番号１の野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌ
クレアーゼの残基９～１５１、配列番号２の野生型Ｉ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基
１１～１６２、および配列番号３の野生型Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５～２
１０からなる群から選択される第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインと、少なくとも８５％の
配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の組換え単鎖メガヌクレア
ーゼ。
クレアーゼの残基９～１５１、配列番号２の野生型Ｉ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基
１１～１６２、および配列番号３の野生型Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５～２
１０からなる群から選択される第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインと、少なくとも８５％の
配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の組換え単鎖メガヌクレア
ーゼ。
【請求項5】
前記第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、配列番号１の野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌ
クレアーゼの残基９～１５１、配列番号２の野生型Ｉ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基
１１～１６２、配列番号３の野生型Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５～２１０、
配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩの残基９～９６、配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩの残
基１０５～１７８、配列番号５の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基３２～１２３、配列番号５の
野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基１３４～２２５、配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基４～
１２１、および配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基１３６～２５４からなる群から選
択される第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインと、少なくとも８５％の配列同一性を有するポ
リペプチド配列を含む、請求項２に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
クレアーゼの残基９～１５１、配列番号２の野生型Ｉ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基
１１～１６２、配列番号３の野生型Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５～２１０、
配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩの残基９～９６、配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩの残
基１０５～１７８、配列番号５の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基３２～１２３、配列番号５の
野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基１３４～２２５、配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基４～
１２１、および配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基１３６～２５４からなる群から選
択される第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインと、少なくとも８５％の配列同一性を有するポ
リペプチド配列を含む、請求項２に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項6】
前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットはそれぞれ、配列番号１の野生型Ｉ－ＣｒｅＩメ
ガヌクレアーゼの残基９～１５１、配列番号２の野生型Ｉ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの
残基１１～１６２、配列番号３の野生型Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５～２１
０、配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩの残基９～９６、配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩ
の残基１０５～１７８、配列番号５の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基３２～１２３、配列番号
５の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基１３４～２２５、配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基
４～１２１、および配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基１３６～２５４からなる群か
ら独立して選択されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインと、少なくとも８５％の配列同一性を
含み、
前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインの少なくとも１つは、表１１、１２、１３および１４
のいずれかに開示された少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、
請求項２に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
ガヌクレアーゼの残基９～１５１、配列番号２の野生型Ｉ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの
残基１１～１６２、配列番号３の野生型Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５～２１
０、配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩの残基９～９６、配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩ
の残基１０５～１７８、配列番号５の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基３２～１２３、配列番号
５の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基１３４～２２５、配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基
４～１２１、および配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基１３６～２５４からなる群か
ら独立して選択されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインと、少なくとも８５％の配列同一性を
含み、
前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインの少なくとも１つは、表１１、１２、１３および１４
のいずれかに開示された少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、
請求項２に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項7】
少なくとも一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがＩ－ＣｒｅＩから誘導され、かつ少な
くとも一つの修飾が表１１、１２、１３および１４のいずれかの表１から選択され、
少なくとも一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがＩ－ＭｓｏＩから誘導され、かつ少な
くとも一つの修飾が表１２から選択され、
少なくとも一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがＩ－ＣｅｕＩから誘導され、かつ少な
くとも一つの修飾が表１３から選択され、または
少なくとも一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがＩ－ＳｃｅＩから誘導され、かつ少な
くとも一つの修飾が表１４から選択される、
請求項６に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
くとも一つの修飾が表１１、１２、１３および１４のいずれかの表１から選択され、
少なくとも一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがＩ－ＭｓｏＩから誘導され、かつ少な
くとも一つの修飾が表１２から選択され、
少なくとも一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがＩ－ＣｅｕＩから誘導され、かつ少な
くとも一つの修飾が表１３から選択され、または
少なくとも一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがＩ－ＳｃｅＩから誘導され、かつ少な
くとも一つの修飾が表１４から選択される、
請求項６に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項8】
前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットはそれぞれ、配列番号７～３０からなる群から選
択される認識半部位を有する、請求項２に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
択される認識半部位を有する、請求項２に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項9】
前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの少なくとも１つは、配列番号７～３０からなる
群から選択される認識半部位を有し、
他の前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、少なくとも一つの塩基対の修飾により、
配列番号７～３０からなる群から選択される認識半部位と異なる認識半部位を有する、
請求項８に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
群から選択される認識半部位を有し、
他の前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、少なくとも一つの塩基対の修飾により、
配列番号７～３０からなる群から選択される認識半部位と異なる認識半部位を有する、
請求項８に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項10】
前記ポリペプチドリンカは、可撓性リンカである、請求項１～９のいずれか１項に記載
の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項11】
前記リンカは、１５～４０個の残基を含む、請求項１０に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼ。
アーゼ。
【請求項12】
前記リンカは、２５～３１個の残基を含む、請求項１０に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼ。
アーゼ。
【請求項13】
前記リンカの少なくとも５０％は極性非荷電残基を含む、請求項１０に記載の組換え単
鎖メガヌクレアーゼ。
鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項14】
前記ポリペプチドリンカは、安定な二次構造を有する、請求項１～９のいずれか１項に
記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項15】
前記安定な二次構造は、少なくとも二つのαへリックス構造を含む、請求項１４に記載
の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項16】
前記安定な二次構造は、Ｎ末端からＣ末端まで、第１のループ、第１のαへリックス、
第１のターン、第２のαへリックスおよび第２のループを含む、請求項１４に記載の組換
え単鎖メガヌクレアーゼ。
第１のターン、第２のαへリックスおよび第２のループを含む、請求項１４に記載の組換
え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項17】
前記リンカは、２３～５６個の残基を含む、請求項１４に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼ。
アーゼ。
【請求項18】
真核細胞の染色体中に挿入された目的の外因性配列を含有する遺伝子組換え真核細胞を
製造する方法であって、
（ｉ）メガヌクレアーゼをコードする第１核酸配列と、
（ｉｉ）前記目的の配列を含む第２核酸配列と
を含む一つ以上の核酸を、真核細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体内に切断部位が作られ、該切断部位で前記目的
の配列が前記染色体に挿入され、
前記メガヌクレアーゼは、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌク
レアーゼである、方法。
製造する方法であって、
（ｉ）メガヌクレアーゼをコードする第１核酸配列と、
（ｉｉ）前記目的の配列を含む第２核酸配列と
を含む一つ以上の核酸を、真核細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体内に切断部位が作られ、該切断部位で前記目的
の配列が前記染色体に挿入され、
前記メガヌクレアーゼは、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌク
レアーゼである、方法。
【請求項19】
前記第２核酸は、更に、前記切断部位に隣接する配列に相同性のある配列を含み、前記
目的の配列は前記切断部位で相同組換えによって挿入される、請求項１８に記載の方法。
目的の配列は前記切断部位で相同組換えによって挿入される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記第２核酸は、前記切断部位に対し実質的な相同性を欠き、前記目的の配列は非相同
的末端結合によって前記染色体に挿入される、請求項１８に記載の方法。
的末端結合によって前記染色体に挿入される、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
真核細胞の染色体中に挿入された目的の外因性配列を含有する遺伝子組換え真核細胞を
製造する方法であって、
メガヌクレアーゼタンパク質を真核細胞に導入することと、
前記目的の配列を含む核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすることと、を含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で前記目的の
配列を前記染色体に挿入し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼである、
遺伝子組換え真核細胞を製造する方法。
製造する方法であって、
メガヌクレアーゼタンパク質を真核細胞に導入することと、
前記目的の配列を含む核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすることと、を含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で前記目的の
配列を前記染色体に挿入し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼである、
遺伝子組換え真核細胞を製造する方法。
【請求項22】
前記核酸は、更に、前記切断部位に隣接する配列に相同性のある配列を含み、前記目的
の配列を前記切断部位で相同組換えによって挿入する、請求項２１に記載の方法。
の配列を前記切断部位で相同組換えによって挿入する、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記核酸は、前記切断部位に対し実質的な相同性を欠き、前記目的の配列を非相同的末
端結合によって前記染色体に挿入する、請求項２１に記載の方法。
端結合によって前記染色体に挿入する、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
真核細胞の染色体中で標的配列を破壊することによって、遺伝子組換え真核細胞を製造
する方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする核酸を、真核細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で前記標的配
列を非相同的末端結合によって破壊し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼである、方法。
する方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする核酸を、真核細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で前記標的配
列を非相同的末端結合によって破壊し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼである、方法。
【請求項25】
遺伝子組換え生物を製造する方法であって、
請求項１８～２４のいずれか１項に記載の方法に従って遺伝子組換え真核細胞を製造す
ることと、
前記遺伝子組換え真核細胞を成長させ、前記遺伝子組換え生物を製造することと
を含む方法。
請求項１８～２４のいずれか１項に記載の方法に従って遺伝子組換え真核細胞を製造す
ることと、
前記遺伝子組換え真核細胞を成長させ、前記遺伝子組換え生物を製造することと
を含む方法。
【請求項26】
前記真核細胞が、配偶子、接合子、胚盤胞細胞、胚性幹細胞、及びプロトプラスト細胞
からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
真核生物において遺伝子治療により疾患を治療する方法であって、
（ｉ）メガヌクレアーゼをコードする第１核酸配列と、
（ｉｉ）目的の配列を含有する第２核酸配列と
を含有する１種以上の核酸を前記真核生物の少なくとも一つの細胞にトランスフェクト
することを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で前記目的の
配列を前記染色体に挿入し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記目的の配列の挿入によって前記疾患の前記遺伝子治療を提供する方法。
（ｉ）メガヌクレアーゼをコードする第１核酸配列と、
（ｉｉ）目的の配列を含有する第２核酸配列と
を含有する１種以上の核酸を前記真核生物の少なくとも一つの細胞にトランスフェクト
することを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で前記目的の
配列を前記染色体に挿入し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記目的の配列の挿入によって前記疾患の前記遺伝子治療を提供する方法。
【請求項28】
前記第２核酸配列は、更に、前記切断部位に隣接する配列に相同性のある配列を含み、
前記目的の配列を前記切断部位で相同組換えによって挿入する、請求項２７に記載の方法
。
前記目的の配列を前記切断部位で相同組換えによって挿入する、請求項２７に記載の方法
。
【請求項29】
前記第２核酸配列は、前記切断部位に対し実質的な相同性を欠き、前記目的の配列を非
相同的末端結合によって前記染色体に挿入する、請求項２７に記載の方法。
相同的末端結合によって前記染色体に挿入する、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
真核生物において遺伝子治療によって疾患を治療する方法であって、
メガヌクレアーゼタンパク質を前記真核生物の少なくとも一つの細胞に導入することと
、
目的の配列を含有する核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすることと、を含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で前記染色体
に前記目的の配列を挿入し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記目的の配列の挿入によって前記疾患の前記遺伝子治療を提供する方法。
メガヌクレアーゼタンパク質を前記真核生物の少なくとも一つの細胞に導入することと
、
目的の配列を含有する核酸を前記真核細胞にトランスフェクトすることと、を含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で前記染色体
に前記目的の配列を挿入し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記目的の配列の挿入によって前記疾患の前記遺伝子治療を提供する方法。
【請求項31】
前記核酸は、更に、前記切断部位に隣接する配列に相同性のある配列を含み、前記目的
の配列を前記切断部位で相同組換えによって挿入する、請求項３０に記載の方法。
の配列を前記切断部位で相同組換えによって挿入する、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記核酸は前記切断部位に対し実質的な相同性を欠き、前記目的の配列を非相同的末端
結合によって前記染色体に挿入する、請求項３０に記載の方法。
結合によって前記染色体に挿入する、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
真核細胞の染色体中で標的配列を破壊することによって、前記真核生物において遺伝子
治療により疾患を治療する方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする核酸を前記真核生物の少なくとも一つの細胞にトランス
フェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で非相同的末
端結合により前記標的配列を破壊し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記標的配列の破壊により前記疾患の前記遺伝子治療を提供する方法。
治療により疾患を治療する方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする核酸を前記真核生物の少なくとも一つの細胞にトランス
フェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で非相同的末
端結合により前記標的配列を破壊し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記標的配列の破壊により前記疾患の前記遺伝子治療を提供する方法。
【請求項34】
ウィルス性病原体のゲノム中で標的配列を破壊することによって、真核生物宿主におけ
る前記ウィルス性病原体感染を治療する方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする核酸を、前記真核生物宿主の少なくとも一つの感染細胞
にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記ウィルス性ゲノム中に切断部位を作り、該切断部位で
非相同的末端結合により前記標的配列を破壊し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記標的配列の破壊により前記感染の治療を提供する、方法。
る前記ウィルス性病原体感染を治療する方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする核酸を、前記真核生物宿主の少なくとも一つの感染細胞
にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記ウィルス性ゲノム中に切断部位を作り、該切断部位で
非相同的末端結合により前記標的配列を破壊し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記標的配列の破壊により前記感染の治療を提供する、方法。
【請求項35】
ウィルス性病原体のゲノム中で標的配列を破壊することによって、真核生物宿主におけ
る前記ウィルス性病原体感染を治療する方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする第１核酸と、第２核酸とを、前記真核生物宿主の少なく
とも一つの感染細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記ウィルス性ゲノム中に切断部位を作り、該切断部位で
前記ウィルス性ゲノム及び前記第２核酸の相同組換えにより前記標的配列を破壊し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記第２核酸は前記切断部位に隣接する配列に相同性のある配列を含み、
前記標的配列の破壊により前記感染の治療を提供する、方法。
る前記ウィルス性病原体感染を治療する方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする第１核酸と、第２核酸とを、前記真核生物宿主の少なく
とも一つの感染細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記ウィルス性ゲノム中に切断部位を作り、該切断部位で
前記ウィルス性ゲノム及び前記第２核酸の相同組換えにより前記標的配列を破壊し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記第２核酸は前記切断部位に隣接する配列に相同性のある配列を含み、
前記標的配列の破壊により前記感染の治療を提供する、方法。
【請求項36】
原核細胞系病原体のゲノム中で標的配列を破壊することによって、真核生物宿主におけ
る前記原核細胞系病原体の感染を治療する方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする核酸を、前記真核生物宿主に感染する前記原核細胞系病
原体の少なくとも細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記原核細胞系ゲノム中に切断部位を作り、該切断部位で
非相同的末端結合により前記標的配列を破壊し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記標的配列の破壊により前記感染の治療を提供する、方法。
る前記原核細胞系病原体の感染を治療する方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする核酸を、前記真核生物宿主に感染する前記原核細胞系病
原体の少なくとも細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記原核細胞系ゲノム中に切断部位を作り、該切断部位で
非相同的末端結合により前記標的配列を破壊し、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記標的配列の破壊により前記感染の治療を提供する、方法。
【請求項37】
原核細胞系病原体のゲノム中で標的配列を破壊することによって、真核生物宿主におけ
る前記原核細胞系病原体の感染を治療する方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする第１核酸と、第２核酸とを、前記真核生物宿主に感染す
る前記原核細胞系病原体の少なくとも細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記原核細胞系ゲノム中に切断部位を作り、該切断部位に
おける前記原核細胞系ゲノム及び前記第２核酸の相同組換えにより前記標的配列を破壊し
、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記第２核酸は前記切断部位に隣接する配列に相同性のある配列を含み、
前記標的配列の破壊により前記感染の治療を提供する、方法。
る前記原核細胞系病原体の感染を治療する方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする第１核酸と、第２核酸とを、前記真核生物宿主に感染す
る前記原核細胞系病原体の少なくとも細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記原核細胞系ゲノム中に切断部位を作り、該切断部位に
おける前記原核細胞系ゲノム及び前記第２核酸の相同組換えにより前記標的配列を破壊し
、
前記メガヌクレアーゼは請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレ
アーゼであり、
前記第２核酸は前記切断部位に隣接する配列に相同性のある配列を含み、
前記標的配列の破壊により前記感染の治療を提供する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分子生物学および組換え核酸技術の分野に関する。特に本発明は、異なる認
識配列半部位に関して特異性を持つ一対の酵素サブユニットが単鎖ポリペプチドに結合さ
れ、非パリンドローム認識配列を持つ機能的へテロ二量体を形成する、合理的に設計され
た非天然由来のメガヌクレアーゼに関する。また本発明は、該メガヌクレアーゼを製造す
る方法、および該メガヌクレアーゼを使用して組換え核酸および生物を製造する方法にも
関する。
識配列半部位に関して特異性を持つ一対の酵素サブユニットが単鎖ポリペプチドに結合さ
れ、非パリンドローム認識配列を持つ機能的へテロ二量体を形成する、合理的に設計され
た非天然由来のメガヌクレアーゼに関する。また本発明は、該メガヌクレアーゼを製造す
る方法、および該メガヌクレアーゼを使用して組換え核酸および生物を製造する方法にも
関する。
【背景技術】
【0002】
ゲノム工学には、ゲノム内の特異的な遺伝子配列を挿入、欠失、置換およびその他操作
する性能が必要とされ、数多くの治療的および生物工学的な用途がある。ゲノム修飾の効
果的な手段の開発は、遺伝子治療、農業技術および合成生物学において大きな目的を残し
ている（非特許文献１、２、３、）。ＤＮＡ配列を挿入または修飾する一般的な方法は、
ゲノム標的に相同性のある配列に挟まれた遺伝子導入ＤＮＡ配列を導入することと、効果
を挙げた相同組換え事象を選択またはスクリーニングすることとを含む。遺伝子導入ＤＮ
Ａを用いる組換えが起こることはまれであるが、該組換えは、標的部位で、ゲノムＤＮＡ
中の二本鎖切断端によって刺激される可能性がある。ＤＮＡ二本鎖切断端を作るために数
多くの方法が使用されてきており、照射処理および化学処理が挙げられる。これらの方法
は組換えを効率的に刺激するが、該二本鎖切断端はゲノム中に無作為に分散し、この状態
は、変異原性および毒性が高い可能性がある。現在、染色体バックグラウンド内で固有の
部位に対し遺伝子修飾を標的にすることができないことは、ゲノム工学の成功への大きな
障害となっている。
する性能が必要とされ、数多くの治療的および生物工学的な用途がある。ゲノム修飾の効
果的な手段の開発は、遺伝子治療、農業技術および合成生物学において大きな目的を残し
ている（非特許文献１、２、３、）。ＤＮＡ配列を挿入または修飾する一般的な方法は、
ゲノム標的に相同性のある配列に挟まれた遺伝子導入ＤＮＡ配列を導入することと、効果
を挙げた相同組換え事象を選択またはスクリーニングすることとを含む。遺伝子導入ＤＮ
Ａを用いる組換えが起こることはまれであるが、該組換えは、標的部位で、ゲノムＤＮＡ
中の二本鎖切断端によって刺激される可能性がある。ＤＮＡ二本鎖切断端を作るために数
多くの方法が使用されてきており、照射処理および化学処理が挙げられる。これらの方法
は組換えを効率的に刺激するが、該二本鎖切断端はゲノム中に無作為に分散し、この状態
は、変異原性および毒性が高い可能性がある。現在、染色体バックグラウンド内で固有の
部位に対し遺伝子修飾を標的にすることができないことは、ゲノム工学の成功への大きな
障害となっている。
【0003】
この目的を達成するための一つの取組みとして、ゲノム内の単一部位のみに存在する十
分に大きい配列に対して特異性のあるヌクレアーゼを使用して、標的遺伝子座中の二本鎖
切断端で相同組換えを刺激することがある（たとえば、非特許文献１参照）。この方法の
有効性は、遺伝子操作されたＺｎフィンガＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ制限酵素の非特
異的ヌクレアーゼドメインとの間のキメラ融合を使用する種々の生物において実証されて
いる（非特許文献４、５、６）。これらの人工的Ｚｎフィンガヌクレアーゼは、部位特異
的組換えを刺激するが、ヌクレアーゼドメインの制御が十分でないことに起因して、残存
非特異的切断活性を保持し、しばしば予想外の部位で切断する（非特許文献７）。このよ
うな予想外の切断により、処置された生物では、突然変異および毒性を起こす可能性があ
る（非特許文献１）。
分に大きい配列に対して特異性のあるヌクレアーゼを使用して、標的遺伝子座中の二本鎖
切断端で相同組換えを刺激することがある（たとえば、非特許文献１参照）。この方法の
有効性は、遺伝子操作されたＺｎフィンガＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ制限酵素の非特
異的ヌクレアーゼドメインとの間のキメラ融合を使用する種々の生物において実証されて
いる（非特許文献４、５、６）。これらの人工的Ｚｎフィンガヌクレアーゼは、部位特異
的組換えを刺激するが、ヌクレアーゼドメインの制御が十分でないことに起因して、残存
非特異的切断活性を保持し、しばしば予想外の部位で切断する（非特許文献７）。このよ
うな予想外の切断により、処置された生物では、突然変異および毒性を起こす可能性があ
る（非特許文献１）。
【0004】
植物および菌類のゲノム中に一般的に見出される１５－４０塩基対切断部位を認識する
一群の天然由来のヌクレアーゼにより、低毒性のゲノム工学的代替物が提供されるかもし
れない。そのような「メガヌクレアーゼ」または「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、
グループＩ自己スプライシングイントロンおよびインテインのような寄生性ＤＮＡエレメ
ントに会合していることが多い。これらは、染色体中で二本鎖切断端を生成することによ
って、宿主ゲノム中の特異的な位置で相同組換えまたは遺伝子挿入を自然に促進し、これ
により細胞内ＤＮＡ修復機構が動員される（非特許文献８）。メガヌクレアーゼは、一般
的に、四つのファミリ、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリ、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリ、Ｈｉｓ
－ＣｙｓボックスファミリおよびＨＮＨファミリに分類される。これらのファミリは、触
媒活性および認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。たとえば、ＬＡＧＬＩ
ＤＡＤＧファミリのメンバは、保存ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの一つまたは二つのコピ
ーを有することを特徴とする（非特許文献９参照）。一コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチ
ーフを持つＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（「モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌク
レアーゼ」）は、ホモ二量体を形成し、一方二コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを持
つメンバ（「ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」）は単量体として見出される。
Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩおよびＩ－ＭｓｏＩのようなモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガ
ヌクレアーゼは、パリンドローム性または擬似パリンドローム性であるＤＮＡ部位を認識
、切断し、一方、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＡｎｉＩおよびＩ－ＤｍｏＩのようなジ－ＬＡＧＬ
ＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、一般的に、非パリンドローム性であるＤＮＡ部位を認識
する（非特許文献８）。
一群の天然由来のヌクレアーゼにより、低毒性のゲノム工学的代替物が提供されるかもし
れない。そのような「メガヌクレアーゼ」または「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、
グループＩ自己スプライシングイントロンおよびインテインのような寄生性ＤＮＡエレメ
ントに会合していることが多い。これらは、染色体中で二本鎖切断端を生成することによ
って、宿主ゲノム中の特異的な位置で相同組換えまたは遺伝子挿入を自然に促進し、これ
により細胞内ＤＮＡ修復機構が動員される（非特許文献８）。メガヌクレアーゼは、一般
的に、四つのファミリ、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリ、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリ、Ｈｉｓ
－ＣｙｓボックスファミリおよびＨＮＨファミリに分類される。これらのファミリは、触
媒活性および認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。たとえば、ＬＡＧＬＩ
ＤＡＤＧファミリのメンバは、保存ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの一つまたは二つのコピ
ーを有することを特徴とする（非特許文献９参照）。一コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチ
ーフを持つＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（「モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌク
レアーゼ」）は、ホモ二量体を形成し、一方二コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを持
つメンバ（「ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」）は単量体として見出される。
Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩおよびＩ－ＭｓｏＩのようなモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガ
ヌクレアーゼは、パリンドローム性または擬似パリンドローム性であるＤＮＡ部位を認識
、切断し、一方、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＡｎｉＩおよびＩ－ＤｍｏＩのようなジ－ＬＡＧＬ
ＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、一般的に、非パリンドローム性であるＤＮＡ部位を認識
する（非特許文献８）。
【0005】
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリからの天然メガヌクレアーゼは、植物、酵母、ショウジョ
ウバエ、哺乳類細胞およびマウスにおいて、部位特異的なゲノム修飾を効果的に促進する
ために使用されているが、この取組みは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同遺伝
子の修飾（非特許文献１０）、または認識配列が導入されているプレエンジニアリングさ
れたゲノムに対する修飾（非特許文献１１、１２、１３、１４、１５）のいずれかに限定
されている。
ウバエ、哺乳類細胞およびマウスにおいて、部位特異的なゲノム修飾を効果的に促進する
ために使用されているが、この取組みは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同遺伝
子の修飾（非特許文献１０）、または認識配列が導入されているプレエンジニアリングさ
れたゲノムに対する修飾（非特許文献１１、１２、１３、１４、１５）のいずれかに限定
されている。
【0006】
ヌクレアーゼ刺激遺伝子修飾の体系的実施には、ゲノム中の既存部位へのＤＮＡ破壊を
標的にするようにカスタマイズされた特異性をもつ遺伝子操作された酵素を使用すること
が必要であり、したがって、医学または生物工学関連部位で遺伝子修飾を促進するために
、メガヌクレアーゼを適用することは、大きな関心がもたれてきている（非特許文献１、
１６、１７）。
標的にするようにカスタマイズされた特異性をもつ遺伝子操作された酵素を使用すること
が必要であり、したがって、医学または生物工学関連部位で遺伝子修飾を促進するために
、メガヌクレアーゼを適用することは、大きな関心がもたれてきている（非特許文献１、
１６、１７）。
【0007】
Ｉ－ＣｒｅＩは、葉緑体染色体中の２２塩基対認識配列を認識および切断するＬＡＧＬ
ＩＤＡＤＧファミリのメンバであり、メガヌクレアーゼ再設計用の魅力的な標的を提供す
る。野生型酵素は、各単量体が完全長認識配列において９塩基対と直接接触するホモ二量
体である。遺伝的選択技術は、野生型Ｉ－ＣｒｅＩ切断部位の優先度を変更するために使
用されてきた（非特許文献１６、１８、１９、２０、２１、２２、特許文献１、２、３、
４、５、６、７、８、９、１０、１１）。つい最近では、哺乳類、酵母、植物、細菌およ
びウィルスのゲノム中の部位を始めとする多様なＤＮＡ部位を標的にするために、Ｉ－Ｃ
ｒｅＩおよび他のそのようなメガヌクレアーゼを包括的に再設計しうる、モノ－ＬＡＧＬ
ＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記述された（特許文献１２）。
ＩＤＡＤＧファミリのメンバであり、メガヌクレアーゼ再設計用の魅力的な標的を提供す
る。野生型酵素は、各単量体が完全長認識配列において９塩基対と直接接触するホモ二量
体である。遺伝的選択技術は、野生型Ｉ－ＣｒｅＩ切断部位の優先度を変更するために使
用されてきた（非特許文献１６、１８、１９、２０、２１、２２、特許文献１、２、３、
４、５、６、７、８、９、１０、１１）。つい最近では、哺乳類、酵母、植物、細菌およ
びウィルスのゲノム中の部位を始めとする多様なＤＮＡ部位を標的にするために、Ｉ－Ｃ
ｒｅＩおよび他のそのようなメガヌクレアーゼを包括的に再設計しうる、モノ－ＬＡＧＬ
ＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記述された（特許文献１２）。
【0008】
大部分の遺伝子工学的用途のために、Ｉ－ＣｒｅＩのようなモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ
メガヌクレアーゼを使用することの主な限界は、これらの酵素が、パリンドローム性ＤＮ
Ａ認識部位を自然に標的にするという事実である。そのような冗長な（１０～４０ｂｐ）
パリンドローム性ＤＮＡ部位は、実際にはまれであり、関心のあるＤＮＡ部位において偶
然に起こることは、到底不可能である。モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを持
つ非パリンドロームＤＮＡ部位を標的にするために、二つの異なる半部位を認識し、ヘテ
ロ二量体化し、所望の非パリンドローム部位を切断するメガヌクレアーゼを形成する一対
の単量体を製造することができる。ヘテロ二量体化は、宿主細胞中で一対のメガヌクレア
ーゼ単量体を共発現することによって、またはインビトロで一対の精製ホモ二量体メガヌ
クレアーゼを混合し、該サブユニットをヘテロ二量体に再会合させることによって達成す
ることができる（非特許文献２３、２４、特許文献１２、１３、１４、１５、１６）。ど
ちらの取組みも２つの主要な限界を負う。すなわち、（１）これらは、所望のヘテロ二量
体種を製造するために、２個のメガヌクレアーゼ遺伝子の発現が必要であること（これは
、遺伝子送達およびインビボでの使用を複雑にする）および（２）その結果物は、約２５
％の第１ホモ二量体、５０％のヘテロ二量体および２５％の第２ホモ二量体の混合物であ
るが、所望のものはヘテロ二量体のみであることである。この後者の限界は、特許文献１
２、１７、１８、および非特許文献２５に記載されるように、二つのメガヌクレアーゼの
二量体化境界面を遺伝子操作して、ホモ二量体化よりヘテロ二量体化を促進することによ
ってかなりの程度まで克服することができる。たとえそうであっても、二つのメガヌクレ
アーゼ遺伝子を発現しなければならず、ホモ二量体化が、完全に阻止されるわけではない
。
メガヌクレアーゼを使用することの主な限界は、これらの酵素が、パリンドローム性ＤＮ
Ａ認識部位を自然に標的にするという事実である。そのような冗長な（１０～４０ｂｐ）
パリンドローム性ＤＮＡ部位は、実際にはまれであり、関心のあるＤＮＡ部位において偶
然に起こることは、到底不可能である。モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを持
つ非パリンドロームＤＮＡ部位を標的にするために、二つの異なる半部位を認識し、ヘテ
ロ二量体化し、所望の非パリンドローム部位を切断するメガヌクレアーゼを形成する一対
の単量体を製造することができる。ヘテロ二量体化は、宿主細胞中で一対のメガヌクレア
ーゼ単量体を共発現することによって、またはインビトロで一対の精製ホモ二量体メガヌ
クレアーゼを混合し、該サブユニットをヘテロ二量体に再会合させることによって達成す
ることができる（非特許文献２３、２４、特許文献１２、１３、１４、１５、１６）。ど
ちらの取組みも２つの主要な限界を負う。すなわち、（１）これらは、所望のヘテロ二量
体種を製造するために、２個のメガヌクレアーゼ遺伝子の発現が必要であること（これは
、遺伝子送達およびインビボでの使用を複雑にする）および（２）その結果物は、約２５
％の第１ホモ二量体、５０％のヘテロ二量体および２５％の第２ホモ二量体の混合物であ
るが、所望のものはヘテロ二量体のみであることである。この後者の限界は、特許文献１
２、１７、１８、および非特許文献２５に記載されるように、二つのメガヌクレアーゼの
二量体化境界面を遺伝子操作して、ホモ二量体化よりヘテロ二量体化を促進することによ
ってかなりの程度まで克服することができる。たとえそうであっても、二つのメガヌクレ
アーゼ遺伝子を発現しなければならず、ホモ二量体化が、完全に阻止されるわけではない
。
【0009】
一つ以上のモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに由来する非パリンドローム認
識部位を持つメガヌクレアーゼの形成への代替の取組みは、二つのメガヌクレアーゼに由
来するＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの融合を含む単鎖ポリペプチドの製造である。そ
のようなメガヌクレアーゼを製造するために二つの一般的方法を適用することができる。
識部位を持つメガヌクレアーゼの形成への代替の取組みは、二つのメガヌクレアーゼに由
来するＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの融合を含む単鎖ポリペプチドの製造である。そ
のようなメガヌクレアーゼを製造するために二つの一般的方法を適用することができる。
【0010】
第１の方法では、ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの二つのＬＡＧＬＩＤＡＤ
Ｇサブユニットの一つを、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼからＬＡＧＬＩＤ
ＡＤＧサブユニットによって置き換えることができる。この取組みは、ジ－ＬＡＧＬＩＤ
ＡＤＧ Ｉ－ＤｍｏＩメガヌクレアーゼのＣ末端サブユニットをＩ－ＣｒｅＩサブユニッ
トに置き換えることによって実証された。（非特許文献１７、２６、特許文献１９）。結
果物は、ハイブリッドＤＮＡ部位を認識および切断したハイブリッドＩ－ＤｍｏＩ／Ｉ－
ＣｒｅＩメガヌクレアーゼであった。
Ｇサブユニットの一つを、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼからＬＡＧＬＩＤ
ＡＤＧサブユニットによって置き換えることができる。この取組みは、ジ－ＬＡＧＬＩＤ
ＡＤＧ Ｉ－ＤｍｏＩメガヌクレアーゼのＣ末端サブユニットをＩ－ＣｒｅＩサブユニッ
トに置き換えることによって実証された。（非特許文献１７、２６、特許文献１９）。結
果物は、ハイブリッドＤＮＡ部位を認識および切断したハイブリッドＩ－ＤｍｏＩ／Ｉ－
ＣｒｅＩメガヌクレアーゼであった。
【0011】
第２の方法では、一対のモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを、ペプチドリンカに
よって結合し、「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」を作成することができる。そのよ
うなＩ－ＣｒｅＩの単鎖誘導体を製造する１つの試みが報告されている（非特許文献１７
、特許文献１９）。しかし、本明細書および非特許文献２５で検討するように、現在、こ
の方法では、共有結合したＩ－ＣｒｅＩサブユニットが一緒に機能し、非パリンドローム
認識部位を認識および切断する、単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼは製造されないこと
を示唆する証拠がある。
よって結合し、「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」を作成することができる。そのよ
うなＩ－ＣｒｅＩの単鎖誘導体を製造する１つの試みが報告されている（非特許文献１７
、特許文献１９）。しかし、本明細書および非特許文献２５で検討するように、現在、こ
の方法では、共有結合したＩ－ＣｒｅＩサブユニットが一緒に機能し、非パリンドローム
認識部位を認識および切断する、単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼは製造されないこと
を示唆する証拠がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0012】
【特許文献1】国際公開公報第２００８／０１０００９号
【特許文献2】国際公開公報第２００７／０９３９１８号
【特許文献3】国際公開公報第２００７／０９３８３６号
【特許文献4】国際公開公報第２００６／０９７７８４号
【特許文献5】国際公開公報第２００８／０５９３１７号
【特許文献6】国際公開公報第２００８／０５９３８２号
【特許文献7】国際公開公報第２００８／１０２１９８号
【特許文献8】国際公開公報第２００７／０６０４９５号
【特許文献9】国際公開公報第２００７／０４９１５６号
【特許文献10】国際公開公報第２００６／０９７８５３号
【特許文献11】国際公開公報第２００４／０６７７３６号
【特許文献12】国際公開公報第２００７／０４７８５９号
【特許文献13】国際公開公報第２００６／０９７８５４号
【特許文献14】国際公開公報第２００７／０５７７８１号
【特許文献15】国際公開公報第２００７／０４９０９５号
【特許文献16】国際公開公報第２００７／０３４２６２号
【特許文献17】国際公開公報第２００８／０９３２４９号
【特許文献18】国際公開公報第２００８／０９３１５２号
【特許文献19】国際公開公報第２００３／０７８６１９号
【非特許文献】
【0013】
【非特許文献1】Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５），Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７－７３
【非特許文献2】Ｔｚｆｉｒａら（２００５），Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５６７－９
【非特許文献3】ＭｃＤａｎｉｅｌら（２００５），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４７６－８３
【非特許文献4】Ｐｏｒｔｅｕｓ（２００６），Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：４３８－４６
【非特許文献5】Ｗｒｉｇｈｔら（２００５），Ｐｌａｎｔ Ｊ．４４：６９３－７０５
【非特許文献6】Ｕｒｎｏｖら（２００５），Ｎａｔｕｒｅ４３５：６４６－５１
【非特許文献7】Ｓｍｉｔｈら（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：３３６１－９
【非特許文献8】Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６），Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９－９５
【非特許文献9】Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７－３７７４
【非特許文献10】Ｍｏｎｎａｔら（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５：８８－９３
【非特許文献11】Ｒｏｕｅｔら（１９９４），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８０９６－１０６
【非特許文献12】Ｃｈｉｌｔｏｎら（２００３），Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３３：９５６－６５
【非特許文献13】Ｐｕｃｈｔａら（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：５０５５－６０
【非特許文献14】Ｒｏｎｇら（２００２），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：１５６８－８１
【非特許文献15】Ｇｏｕｂｌｅら（２００６），Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．８（５）：６１６－６２２
【非特許文献16】Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１－４１
【非特許文献17】Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－６２
【非特許文献18】Ｃｈａｍｅｓら（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅｌ７８
【非特許文献19】Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０－９
【非特許文献20】Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３－５８
【非特許文献21】Ｒｏｓｅｎら（２００６），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：４７９１－４８００
【非特許文献22】Ａｒｎｏｕｌｄら（２００７）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７１：４９－６５，
【非特許文献23】Ｓｍｉｔｈら（２００６），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：１４９－１５７
【非特許文献24】Ｃｈａｍｅｓら（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：１７８－１８６
【非特許文献25】Ｆａｊａｒｄｏ－Ｓａｎｃｈｅｚら（２００８）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：２１６３－２１７３
【非特許文献26】Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ１０：８９５－９０５
【非特許文献27】Ｃａｈｉｌｌら（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６
【非特許文献28】Ｐｒｉｅｔｏら（２００７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：３２６２－３２７１
【非特許文献29】Ｊｕｒｉｃａら（１９９８），ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ２：４６９－４７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
したがって、当該分野では、非パリンドロームＤＮＡ部位を認識および切断するために
、Ｉ－ＣｒｅＩのようなモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ酵素に由来する単鎖ヘテロ二量体メガ
ヌクレアーゼを製造する方法の必要性が残っている。
、Ｉ－ＣｒｅＩのようなモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ酵素に由来する単鎖ヘテロ二量体メガ
ヌクレアーゼを製造する方法の必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明は、ペプチドリンカが二つの異種ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼサブユニ
ットを共有結合で連結して「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」または「単鎖メガヌク
レアーゼ」を形成し、少なくともＮ末端サブユニットはモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌ
クレアーゼに由来し、およびサブユニットは一緒に機能して、二つのサブユニットの認識
半部位のハイブリッドである非パリンドロームＤＮＡ認識部位に優先的に結合し、これを
切断する融合タンパク質の開発に、一部基づく。特に、本発明は、天然由来のメガヌクレ
アーゼが認識しない、非パリンドロームＤＮＡ配列を認識する単鎖メガヌクレアーゼを遺
伝子操作するために、使用することができる。また、本発明は、特に、遺伝子操作、遺伝
子治療、病原性感染の治療ならびに診断および研究においてインビトロで使用するために
、メガヌクレアーゼを利用して生物のゲノム内の限られた数の遺伝子座で所望の遺伝子配
列の組換えを起こすことによって、前記メガヌクレアーゼを使用して組換え核酸および生
物を製造する方法を提供する。
ットを共有結合で連結して「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」または「単鎖メガヌク
レアーゼ」を形成し、少なくともＮ末端サブユニットはモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌ
クレアーゼに由来し、およびサブユニットは一緒に機能して、二つのサブユニットの認識
半部位のハイブリッドである非パリンドロームＤＮＡ認識部位に優先的に結合し、これを
切断する融合タンパク質の開発に、一部基づく。特に、本発明は、天然由来のメガヌクレ
アーゼが認識しない、非パリンドロームＤＮＡ配列を認識する単鎖メガヌクレアーゼを遺
伝子操作するために、使用することができる。また、本発明は、特に、遺伝子操作、遺伝
子治療、病原性感染の治療ならびに診断および研究においてインビトロで使用するために
、メガヌクレアーゼを利用して生物のゲノム内の限られた数の遺伝子座で所望の遺伝子配
列の組換えを起こすことによって、前記メガヌクレアーゼを使用して組換え核酸および生
物を製造する方法を提供する。
【0016】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、一種以上のモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤ
Ｇメガヌクレアーゼに由来する一対の共有結合されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットで
あって、一緒に機能して非パリンドローム認識部位を認識および切断するサブユニットを
含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。いくつかの実施形態では、該モノ－ＬＡＧ
ＬＩＤＡＤＧサブユニットは、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩおよびＩ－ＣｅｕＩから選択
される野生型メガヌクレアーゼに由来する。
Ｇメガヌクレアーゼに由来する一対の共有結合されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットで
あって、一緒に機能して非パリンドローム認識部位を認識および切断するサブユニットを
含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。いくつかの実施形態では、該モノ－ＬＡＧ
ＬＩＤＡＤＧサブユニットは、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩおよびＩ－ＣｅｕＩから選択
される野生型メガヌクレアーゼに由来する。
【0017】
他の実施形態では、本発明は、Ｎ末端サブユニットはＩ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩおよ
びＩ－ＣｅｕＩから選択される野生型メガヌクレアーゼに由来し、Ｃ末端サブユニットも
Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩおよびＩ－ＣｅｕＩから選択される野生型メガヌクレアーゼ
に由来するが、Ｎ末端サブユニットは、Ｃ末端サブユニットとは異なる種の野生型メガヌ
クレアーゼに由来する、一対のモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む組換え単鎖
メガヌクレアーゼを提供する。
びＩ－ＣｅｕＩから選択される野生型メガヌクレアーゼに由来し、Ｃ末端サブユニットも
Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩおよびＩ－ＣｅｕＩから選択される野生型メガヌクレアーゼ
に由来するが、Ｎ末端サブユニットは、Ｃ末端サブユニットとは異なる種の野生型メガヌ
クレアーゼに由来する、一対のモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む組換え単鎖
メガヌクレアーゼを提供する。
【0018】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｎ末端サブユニットはＩ－ＣｒｅＩ、Ｉ－Ｍｓｏ
ＩおよびＩ－ＣｅｕＩから選択される野生型メガヌクレアーゼに由来し、およびＣ末端サ
ブユニットはＩ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩおよびＩ－ＡｎｉＩから選択される野生型ジ－
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼからの単一ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに由来
する、一対のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供
する。
ＩおよびＩ－ＣｅｕＩから選択される野生型メガヌクレアーゼに由来し、およびＣ末端サ
ブユニットはＩ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩおよびＩ－ＡｎｉＩから選択される野生型ジ－
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼからの単一ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに由来
する、一対のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供
する。
【0019】
野生型モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼとして、配列番号１のＩ－ＣｒｅＩ
メガヌクレアーゼ、配列番号２のＩ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ、および配列番号３のＩ
－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。野生型ジ－ＬＡＧ
ＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼとして、配列番号４のＩ－ＤｍｏＩメガヌクレアーゼ、配
列番号５のＩ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ、および配列番号６のＩ－ＡｎｉＩメガヌクレ
アーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
メガヌクレアーゼ、配列番号２のＩ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ、および配列番号３のＩ
－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。野生型ジ－ＬＡＧ
ＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼとして、配列番号４のＩ－ＤｍｏＩメガヌクレアーゼ、配
列番号５のＩ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ、および配列番号６のＩ－ＡｎｉＩメガヌクレ
アーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【0020】
野生型ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインとして、配列番号１の野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌク
レアーゼの残基９～１５１、配列番号２の野生型Ｉ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基１
１～１６２、および配列番号３の野生型Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５～２１
０、配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩの残基９－９６、配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩ
の残基１０５～１７８、配列番号５の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基３２～１２３、配列番号
５の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基１３４～２２５、配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基
４～１２１、および配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基１３６～２５４が挙げられる
が、これらに限定されない。
レアーゼの残基９～１５１、配列番号２の野生型Ｉ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基１
１～１６２、および配列番号３の野生型Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５～２１
０、配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩの残基９－９６、配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩ
の残基１０５～１７８、配列番号５の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基３２～１２３、配列番号
５の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基１３４～２２５、配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基
４～１２１、および配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基１３６～２５４が挙げられる
が、これらに限定されない。
【0021】
野生型ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに由来するＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニッ
トとして、配列番号１の野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基９～１５１、配列番
号２の野生型Ｉ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基１１～１６２、および配列番号３の野
生型Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５～２１０、配列番号４の野生型Ｉ－Ｄｍｏ
Ｉの残基９～９６、配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩの残基１０５～１７８、配列番号５
の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基３２～１２３、配列番号５の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基１３
４～２２５、配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基４～１２１、および配列番号６の野
生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基１３６～２５４のいずれか一つと、少なくとも８５％の配列同一
性、または８５％～１００％の配列同一性を有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインを含有す
るサブユニットが挙げられるが、これらに限定されない。
トとして、配列番号１の野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基９～１５１、配列番
号２の野生型Ｉ－ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基１１～１６２、および配列番号３の野
生型Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５～２１０、配列番号４の野生型Ｉ－Ｄｍｏ
Ｉの残基９～９６、配列番号４の野生型Ｉ－ＤｍｏＩの残基１０５～１７８、配列番号５
の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基３２～１２３、配列番号５の野生型Ｉ－ＳｃｅＩの残基１３
４～２２５、配列番号６の野生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基４～１２１、および配列番号６の野
生型Ｉ－ＡｎｉＩの残基１３６～２５４のいずれか一つと、少なくとも８５％の配列同一
性、または８５％～１００％の配列同一性を有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインを含有す
るサブユニットが挙げられるが、これらに限定されない。
【0022】
また、野生型ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに由来するＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブ
ユニットとして、一つ以上のアミノ酸修飾が、国際公開公報第２００７／０４７８５９号
に開示された、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法に従って含
有されている前記ポリペプチド配列のいずれかと、当該分野で公知の他の非天然由来のメ
ガヌクレアーゼ変異体とを含むサブユニットが挙げられるが、これらに限定されない。
ユニットとして、一つ以上のアミノ酸修飾が、国際公開公報第２００７／０４７８５９号
に開示された、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法に従って含
有されている前記ポリペプチド配列のいずれかと、当該分野で公知の他の非天然由来のメ
ガヌクレアーゼ変異体とを含むサブユニットが挙げられるが、これらに限定されない。
【0023】
ある実施形態では、本発明は、それぞれが配列番号７～３０から選択される野生型ＤＮ
Ａ半部位を認識する天然由来のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに由来する、一対のＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。
Ａ半部位を認識する天然由来のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに由来する、一対のＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。
【0024】
他の実施形態では、本発明は、ＤＮＡ結合特異性に関して遺伝子操作された一対のＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧサブユニットであって、それぞれが、少なくとも一つの塩基が、配列番号
７～３０から選択される野生型ＤＮＡ半部位とは異なるＤＮＡ半部位を認識するサブユニ
ットを含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。
ＧＬＩＤＡＤＧサブユニットであって、それぞれが、少なくとも一つの塩基が、配列番号
７～３０から選択される野生型ＤＮＡ半部位とは異なるＤＮＡ半部位を認識するサブユニ
ットを含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。
【0025】
他の実施形態では、本発明は、一つのサブユニットは天然であり、配列番号７～３０か
ら選択される野生型ＤＮＡ半部位を認識し、もう一つは、ＤＮＡ結合特異性に関して遺伝
子操作され、少なくとも一つの塩基が、配列番号７～３０から選択される野生型ＤＮＡ半
部位とは異なるＤＮＡ部位を認識する一対のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む組換
え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。
ら選択される野生型ＤＮＡ半部位を認識し、もう一つは、ＤＮＡ結合特異性に関して遺伝
子操作され、少なくとも一つの塩基が、配列番号７～３０から選択される野生型ＤＮＡ半
部位とは異なるＤＮＡ部位を認識する一対のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む組換
え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。
【0026】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを結合するポリペプチドリ
ンカは、可撓性リンカである。特定の実施形態では、該リンカは、１５～４０個の残基、
２５～３１個の残基、またはこれらの範囲の任意の数の残基を含有することができる。他
の特定の実施形態では、リンカを形成する残基の少なくとも５０％または５０％～１００
％が、極性非荷電残基である。
ンカは、可撓性リンカである。特定の実施形態では、該リンカは、１５～４０個の残基、
２５～３１個の残基、またはこれらの範囲の任意の数の残基を含有することができる。他
の特定の実施形態では、リンカを形成する残基の少なくとも５０％または５０％～１００
％が、極性非荷電残基である。
【0027】
他の実施形態では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを結合するポリペプチドリンカは
、安定な二次構造を有する。特定の実施形態では、該安定な二次構造は、少なくとも二つ
のαへリックス構造を含む。他の特定の実施形態では、該安定な二次構造は、Ｎ末端から
Ｃ末端までに、第１のループ、第１のαへリックス、第１のターン、第２のαへリックス
および第２のループを含む。ある特定の実施形態では、該リンカは、２３～５６個の残基
、または該範囲内の任意の数の残基を含有することができる。
、安定な二次構造を有する。特定の実施形態では、該安定な二次構造は、少なくとも二つ
のαへリックス構造を含む。他の特定の実施形態では、該安定な二次構造は、Ｎ末端から
Ｃ末端までに、第１のループ、第１のαへリックス、第１のターン、第２のαへリックス
および第２のループを含む。ある特定の実施形態では、該リンカは、２３～５６個の残基
、または該範囲内の任意の数の残基を含有することができる。
【0028】
他の態様では、本発明は、本明細書で記載し、実施可能な単鎖メガヌクレアーゼを使用
する種々の方法を提供する。これらの方法は、遺伝子組換え細胞および生物を製造するこ
と、遺伝子治療によって疾患を治療すること、病原体感染を治療すること、および診断ま
たは研究のためのインビトロでの用途のために組換え単鎖メガヌクレアーゼを使用するこ
とを含む。
する種々の方法を提供する。これらの方法は、遺伝子組換え細胞および生物を製造するこ
と、遺伝子治療によって疾患を治療すること、病原体感染を治療すること、および診断ま
たは研究のためのインビトロでの用途のために組換え単鎖メガヌクレアーゼを使用するこ
とを含む。
【0029】
したがって、一態様では、本発明は、（ｉ）本発明のメガヌクレアーゼをエンコードす
る第１核酸配列および（ｉｉ）関心のある配列を含む第２核酸配列を、細胞にトランスフ
ェクトすることによって、染色体中に挿入された前記関心のある外因性配列を含有する遺
伝子組換え真核細胞を製造する方法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中に切断部
位を作り、該切断部位で、相同組換えまたは非相同的末端結合のどちらかにより、関心の
ある配列を染色体に挿入する方法を提供する。
る第１核酸配列および（ｉｉ）関心のある配列を含む第２核酸配列を、細胞にトランスフ
ェクトすることによって、染色体中に挿入された前記関心のある外因性配列を含有する遺
伝子組換え真核細胞を製造する方法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中に切断部
位を作り、該切断部位で、相同組換えまたは非相同的末端結合のどちらかにより、関心の
ある配列を染色体に挿入する方法を提供する。
【0030】
あるいは、他の態様では、本発明は、本発明のメガヌクレアーゼタンパク質を細胞に導
入し、関心のある配列を含有する核酸を該細胞にトランスフェクトすることによって、染
色体中に挿入された関心のある外因性配列を含有する遺伝子組換え真核細胞を製造する方
法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中で切断部位を作り、該切断部位で、相同組
換えまたは非相同的末端結合のどちらかにより、関心のある配列を染色体に挿入する方法
を提供する。
入し、関心のある配列を含有する核酸を該細胞にトランスフェクトすることによって、染
色体中に挿入された関心のある外因性配列を含有する遺伝子組換え真核細胞を製造する方
法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中で切断部位を作り、該切断部位で、相同組
換えまたは非相同的末端結合のどちらかにより、関心のある配列を染色体に挿入する方法
を提供する。
【0031】
他の態様では、本発明は、染色体中の標的配列を混乱させ、本発明のメガヌクレアーゼ
をエンコードする核酸を細胞にトランスフェクトすることにより、遺伝子組換え真核細胞
を製造する方法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中に切断部位を作り、該切断部
位で、非相同的末端結合により、標的配列を混乱させる方法を提供する。
をエンコードする核酸を細胞にトランスフェクトすることにより、遺伝子組換え真核細胞
を製造する方法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中に切断部位を作り、該切断部
位で、非相同的末端結合により、標的配列を混乱させる方法を提供する。
【0032】
他の態様では、本発明は、先に記載した方法に従って遺伝子組換え真核細胞を製造し、
該遺伝子組換え真核細胞を成長させ、遺伝子組換え生物を製造することによって、遺伝子
組換え生物を製造する方法を提供する。これらの実施形態では、真核細胞を、配偶子、接
合子、胚盤胞細胞、胚性幹細胞およびプロトプラスト細胞から選択することができる。
該遺伝子組換え真核細胞を成長させ、遺伝子組換え生物を製造することによって、遺伝子
組換え生物を製造する方法を提供する。これらの実施形態では、真核細胞を、配偶子、接
合子、胚盤胞細胞、胚性幹細胞およびプロトプラスト細胞から選択することができる。
【0033】
他の態様では、本発明は、（ｉ）本発明のメガヌクレアーゼをエンコードする第１核酸
配列および（ｉｉ）関心のある配列を含む第２核酸配列を含有する一つ以上の核酸を、真
核生物の少なくとも一つの細胞にトランスフェクトすることで、真核生物において遺伝子
治療により疾患を治療する方法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中に切断部位を
作り、関心のある配列を相同組換えまたは非相同的末端結合により染色体に挿入し、該関
心のある配列の挿入により疾患の遺伝子治療がもたらされる方法を提供する。
配列および（ｉｉ）関心のある配列を含む第２核酸配列を含有する一つ以上の核酸を、真
核生物の少なくとも一つの細胞にトランスフェクトすることで、真核生物において遺伝子
治療により疾患を治療する方法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中に切断部位を
作り、関心のある配列を相同組換えまたは非相同的末端結合により染色体に挿入し、該関
心のある配列の挿入により疾患の遺伝子治療がもたらされる方法を提供する。
【0034】
あるいは他の態様では、本発明は、本発明のメガヌクレアーゼタンパク質を真核生物の
少なくとも一つの細胞に導入し、関心のある配列を含む核酸を細胞にトランスフェクトす
ることで、真核生物において遺伝子治療により疾患を治療する方法であって、メガヌクレ
アーゼにより染色体中に切断部位を作り、該切断部位で、相同組換えまたは非相同的末端
結合により関心のある配列を染色体に挿入し、該関心のある配列の挿入により疾患の遺伝
子治療がもたらされる方法を提供する。
少なくとも一つの細胞に導入し、関心のある配列を含む核酸を細胞にトランスフェクトす
ることで、真核生物において遺伝子治療により疾患を治療する方法であって、メガヌクレ
アーゼにより染色体中に切断部位を作り、該切断部位で、相同組換えまたは非相同的末端
結合により関心のある配列を染色体に挿入し、該関心のある配列の挿入により疾患の遺伝
子治療がもたらされる方法を提供する。
【0035】
他の態様では、本発明は、本発明のメガヌクレアーゼをエンコードした核酸を真核生物
の少なくとも一つの細胞にトランスフェクトすることにより、真核生物の染色体中の標的
配列を混乱させて、真核生物において遺伝子治療により疾患を治療する方法であって、メ
ガヌクレアーゼにより染色体中に切断部位を作り、該切断部で非相同的末端結合により標
的配列を混乱させ、該標的配列の混乱により疾患の遺伝子治療がもたらされる方法を提供
する。
の少なくとも一つの細胞にトランスフェクトすることにより、真核生物の染色体中の標的
配列を混乱させて、真核生物において遺伝子治療により疾患を治療する方法であって、メ
ガヌクレアーゼにより染色体中に切断部位を作り、該切断部で非相同的末端結合により標
的配列を混乱させ、該標的配列の混乱により疾患の遺伝子治療がもたらされる方法を提供
する。
【0036】
他の態様では、本発明は、本発明のメガヌクレアーゼをエンコードした核酸を宿主の少
なくとも一つの感染細胞にトランスフェクトすることにより、病原体のゲノム中の標的配
列を混乱させて、真核生物宿主におけるウィルス性または原核細胞系病原体感染を治療す
る方法であって、メガヌクレアーゼによりゲノム中に切断部位を作り、（１）該切断部位
での非相同的末端結合または（２）第２核酸を用いる相同組換えのいずれかにより標的配
列を混乱させ、該標的配列の混乱により感染の治療がもたらされる方法を提供する。
なくとも一つの感染細胞にトランスフェクトすることにより、病原体のゲノム中の標的配
列を混乱させて、真核生物宿主におけるウィルス性または原核細胞系病原体感染を治療す
る方法であって、メガヌクレアーゼによりゲノム中に切断部位を作り、（１）該切断部位
での非相同的末端結合または（２）第２核酸を用いる相同組換えのいずれかにより標的配
列を混乱させ、該標的配列の混乱により感染の治療がもたらされる方法を提供する。
【0037】
これらおよび本発明の他の態様および実施形態は、以下の本発明の詳細な説明に基づき
、当業者に明らかになるであろう。
、当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】本発明のリンカ（リンカ９）、および該ライナーによって結合されたエンドヌクレアーゼサブユニットのＮ末端およびＣ末端残基の一実施形態の構造成分の図である。
【発明を実施するための形態】
【0039】
１．１ 導入
本発明は、ペプチドリンカが二つの異種ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼサブユニ
ットを共有結合で連結して「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」を形成し、該サブユニ
ットは一緒に機能して、該二つのサブユニットの認識半部位のハイブリッドである非パリ
ンドロームＤＮＡ認識部位に優先的に結合し、これを切断する融合タンパク質の開発に、
一部基づく。特に、天然由来のメガヌクレアーゼが認識しない、非パリンドロームＤＮＡ
配列を認識する単鎖メガヌクレアーゼを遺伝子操作するために、本発明を使用することが
できる。
本発明は、ペプチドリンカが二つの異種ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼサブユニ
ットを共有結合で連結して「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」を形成し、該サブユニ
ットは一緒に機能して、該二つのサブユニットの認識半部位のハイブリッドである非パリ
ンドロームＤＮＡ認識部位に優先的に結合し、これを切断する融合タンパク質の開発に、
一部基づく。特に、天然由来のメガヌクレアーゼが認識しない、非パリンドロームＤＮＡ
配列を認識する単鎖メガヌクレアーゼを遺伝子操作するために、本発明を使用することが
できる。
【0040】
この発見は、以下に詳細に記載するように、自然ではホモ二量体として機能するモノ－
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを、単鎖メガヌクレアーゼに結合するために使用さ
れている。さらに、本発明は、ＤＮＡ認識特異性に関して再設計されたモノ－ＬＡＧＬＩ
ＤＡＤＧメガヌクレアーゼを、二つのメガヌクレアーゼホモ二量体によって認識されるパ
リンドローム性部位のハイブリッドであるＤＮＡ配列を認識および切断する単鎖ヘテロ二
量体に、結合するために使用されている。本発明は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを
単鎖ポリペプチドに結合するための代表的なペプチドリンカ配列を提供する。本発明が、
リンカ配列の一般的製造方法および異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットをつなぐため
の融合ポイントの一般的選択方法を提供し、機能的な、合理的に設計された単鎖メガヌク
レアーゼを製造することは重要である。
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを、単鎖メガヌクレアーゼに結合するために使用さ
れている。さらに、本発明は、ＤＮＡ認識特異性に関して再設計されたモノ－ＬＡＧＬＩ
ＤＡＤＧメガヌクレアーゼを、二つのメガヌクレアーゼホモ二量体によって認識されるパ
リンドローム性部位のハイブリッドであるＤＮＡ配列を認識および切断する単鎖ヘテロ二
量体に、結合するために使用されている。本発明は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを
単鎖ポリペプチドに結合するための代表的なペプチドリンカ配列を提供する。本発明が、
リンカ配列の一般的製造方法および異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットをつなぐため
の融合ポイントの一般的選択方法を提供し、機能的な、合理的に設計された単鎖メガヌク
レアーゼを製造することは重要である。
【0041】
また、本発明は、特に、遺伝子操作、遺伝子治療、病原性感染および癌の治療、ならび
に診断および研究におけるインビトロでの使用のために、メガヌクレアーゼを利用して生
物のゲノム内の限られた数の遺伝子座で所望の遺伝子配列の組換えを起こすことによって
、前記メガヌクレアーゼを使用して組換え核酸、細胞および生物を製造する方法も提供す
る。
に診断および研究におけるインビトロでの使用のために、メガヌクレアーゼを利用して生
物のゲノム内の限られた数の遺伝子座で所望の遺伝子配列の組換えを起こすことによって
、前記メガヌクレアーゼを使用して組換え核酸、細胞および生物を製造する方法も提供す
る。
【0042】
一般的事項として、本発明は、二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットであって、Ｎ末
端サブユニットは、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩまたはＩ－ＣｅｕＩ、あるいはこれらの
変異体のような天然のモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに由来し、Ｃ末端サブ
ユニットは、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼか、あるいはＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ
－ＤｍｏＩまたはＩ－ＡｎｉＩのようなジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの二つ
のドメインのうちの一つのいずれかに由来するサブユニットを含む単鎖メガヌクレアーゼ
を生成する方法を提供する。該方法は、先に記載された方法（非特許文献１７、２６、特
許文献１９）とは、Ｎ末端サブユニットがモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに
由来する組換え単鎖メガヌクレアーゼを製造するために、特異的な新規リンカ配列および
融合ポイントの使用が必要である点で異なる。
端サブユニットは、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩまたはＩ－ＣｅｕＩ、あるいはこれらの
変異体のような天然のモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに由来し、Ｃ末端サブ
ユニットは、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼか、あるいはＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ
－ＤｍｏＩまたはＩ－ＡｎｉＩのようなジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの二つ
のドメインのうちの一つのいずれかに由来するサブユニットを含む単鎖メガヌクレアーゼ
を生成する方法を提供する。該方法は、先に記載された方法（非特許文献１７、２６、特
許文献１９）とは、Ｎ末端サブユニットがモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに
由来する組換え単鎖メガヌクレアーゼを製造するために、特異的な新規リンカ配列および
融合ポイントの使用が必要である点で異なる。
【0043】
以下に詳細に記載するように、組換え単鎖メガヌクレアーゼを製造する方法は、結合さ
れるべき二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットにおいて特定された融合ポイントを使用
することと、単鎖ポリペプチドに結合するために特定されたリンカ配列を使用することと
を含む。さらに、本明細書では明記されていない融合ポイントを同定するため、および本
明細書では明記されていない機能的リンカ配列を製造するために、一組の規則を規定する
。
れるべき二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットにおいて特定された融合ポイントを使用
することと、単鎖ポリペプチドに結合するために特定されたリンカ配列を使用することと
を含む。さらに、本明細書では明記されていない融合ポイントを同定するため、および本
明細書では明記されていない機能的リンカ配列を製造するために、一組の規則を規定する
。
【0044】
したがって、一態様では、本発明は、組換え単鎖ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ
を製造する方法を提供する。他の態様では、本発明は、これらの方法により得られる組換
え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。他の態様では、本発明は、細胞または生物のゲノム
内の所望のＤＮＡ配列または遺伝子座がＤＮＡ配列の挿入、欠失、置換またはその他の操
作によって修飾されている組換え核酸、細胞および生物を製造するために、そのような単
鎖メガヌクレアーゼを使用する方法を提供する。他の態様では、本発明は、病原体に特異
的なまたは癌に特異的な認識配列を有する単鎖メガヌクレアーゼを使用して、病原体また
は癌細胞の生存率を下げる方法を提供する。
を製造する方法を提供する。他の態様では、本発明は、これらの方法により得られる組換
え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。他の態様では、本発明は、細胞または生物のゲノム
内の所望のＤＮＡ配列または遺伝子座がＤＮＡ配列の挿入、欠失、置換またはその他の操
作によって修飾されている組換え核酸、細胞および生物を製造するために、そのような単
鎖メガヌクレアーゼを使用する方法を提供する。他の態様では、本発明は、病原体に特異
的なまたは癌に特異的な認識配列を有する単鎖メガヌクレアーゼを使用して、病原体また
は癌細胞の生存率を下げる方法を提供する。
【0045】
１．２ 参考文献および定義
本明細書で記載されている特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を構築する
。本明細書で挙げた、発行された米国特許、許可された出願、公開された米国およびＰＣ
Ｔ国際出願、およびＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む参考文献は、それぞれ、具体
的かつ個別に、参照により本発明に組み込まれると記載されているように、参照により本
明細書に組み込まれる。
本明細書で記載されている特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を構築する
。本明細書で挙げた、発行された米国特許、許可された出願、公開された米国およびＰＣ
Ｔ国際出願、およびＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む参考文献は、それぞれ、具体
的かつ個別に、参照により本発明に組み込まれると記載されているように、参照により本
明細書に組み込まれる。
【0046】
本明細書で使用される用語「メガヌクレアーゼ」は、認識配列で二本鎖ＤＮＡを結合す
るエンドヌクレアーゼであって、長さが１２塩基対を超えるものをいう。天然由来のメガ
ヌクレアーゼは、単量体（たとえば、Ｉ－ＳｃｅＩ）または二量体（たとえば、Ｉ－Ｃｒ
ｅＩ）である可能性がある。本明細書で使用される用語メガヌクレアーゼは、単量体メガ
ヌクレアーゼ、二量体メガヌクレアーゼ、会合して二量体メガヌクレアーゼを形成する単
量体、または本発明の組換え単鎖メガヌクレアーゼを指すために使用することができる。
用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、用語「メガヌクレアーゼ」と同義である。
るエンドヌクレアーゼであって、長さが１２塩基対を超えるものをいう。天然由来のメガ
ヌクレアーゼは、単量体（たとえば、Ｉ－ＳｃｅＩ）または二量体（たとえば、Ｉ－Ｃｒ
ｅＩ）である可能性がある。本明細書で使用される用語メガヌクレアーゼは、単量体メガ
ヌクレアーゼ、二量体メガヌクレアーゼ、会合して二量体メガヌクレアーゼを形成する単
量体、または本発明の組換え単鎖メガヌクレアーゼを指すために使用することができる。
用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、用語「メガヌクレアーゼ」と同義である。
【0047】
本明細書で使用される用語「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は、天然では二量
体である、単一ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含有するメガヌクレアーゼ、または天然で
は単量体である、二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧを含有するメガヌクレアーゼを言う。この二
つを区別する必要がある場合は、用語「モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は
、本明細書では、単一ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含有するメガヌクレアーゼを指すた
めに使用され、用語「ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は、本明細書では、二
つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含有するメガヌクレアーゼを指すために使用される。
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含有し、酵素活性を有するジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌ
クレアーゼの二つの構造ドメインのそれぞれ、およびモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌク
レアーゼの個々の単量体のそれぞれは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニット、または単純に
「サブユニット」と言うことができる。
体である、単一ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含有するメガヌクレアーゼ、または天然で
は単量体である、二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧを含有するメガヌクレアーゼを言う。この二
つを区別する必要がある場合は、用語「モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は
、本明細書では、単一ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含有するメガヌクレアーゼを指すた
めに使用され、用語「ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は、本明細書では、二
つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含有するメガヌクレアーゼを指すために使用される。
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含有し、酵素活性を有するジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌ
クレアーゼの二つの構造ドメインのそれぞれ、およびモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌク
レアーゼの個々の単量体のそれぞれは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニット、または単純に
「サブユニット」と言うことができる。
【0048】
ペプチド配列に関して、本明細書で使用される「終わり」はＣ末端を指し、「始まり」
はＮ末端を指す。したがって、たとえば、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの始まり」は、
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むペプチド配列中のＮ最末端アミノ酸を指し、一方、「
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの終わり」は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むペプチド
配列中のＣ最末端アミノ酸を指す。
はＮ末端を指す。したがって、たとえば、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの始まり」は、
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むペプチド配列中のＮ最末端アミノ酸を指し、一方、「
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの終わり」は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むペプチド
配列中のＣ最末端アミノ酸を指す。
【0049】
本明細書で使用される用語「合理的に設計された」は、非天然由来のおよび／または遺
伝子操作された、を意味する。本発明の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、野生型
または天然由来のメガヌクレアーゼと、それらのアミノ酸配列または一次構造が異なり、
それらの第二、第三、第四次構造も異なる場合もある。さらに、本発明の合理的に設計さ
れたメガヌクレアーゼは、野生型または天然由来のメガヌクレアーゼと、認識配列特異性
および／または活性においても異なる。
伝子操作された、を意味する。本発明の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、野生型
または天然由来のメガヌクレアーゼと、それらのアミノ酸配列または一次構造が異なり、
それらの第二、第三、第四次構造も異なる場合もある。さらに、本発明の合理的に設計さ
れたメガヌクレアーゼは、野生型または天然由来のメガヌクレアーゼと、認識配列特異性
および／または活性においても異なる。
【0050】
タンパク質に関して、本明細書で使用される用語「組換え」は、タンパク質をエンコー
ドする核酸、およびタンパク質を発現する細胞または生物に対する遺伝子操作技術の適用
の結果、変化したアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関し、用語「組換え」は
、遺伝子操作技術の適用の結果、変化した核酸配列を有することを意味する。遺伝子操作
技術として、ＰＣＲおよびＤＮＡクローニング技術、トランスフェクション、トランスフ
ォーメーションおよび他の遺伝子転移技術、相同組換え、部位特異的変異誘発および遺伝
子融合が挙げられるが、これらに限定されない。この定義によれば、天然由来のタンパク
質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主におけるクローニングおよび発現によって
製造されたタンパク質は、組換えとみなされない。
ドする核酸、およびタンパク質を発現する細胞または生物に対する遺伝子操作技術の適用
の結果、変化したアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関し、用語「組換え」は
、遺伝子操作技術の適用の結果、変化した核酸配列を有することを意味する。遺伝子操作
技術として、ＰＣＲおよびＤＮＡクローニング技術、トランスフェクション、トランスフ
ォーメーションおよび他の遺伝子転移技術、相同組換え、部位特異的変異誘発および遺伝
子融合が挙げられるが、これらに限定されない。この定義によれば、天然由来のタンパク
質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主におけるクローニングおよび発現によって
製造されたタンパク質は、組換えとみなされない。
【0051】
組換えタンパク質に関し、本明細書で使用される用語「修飾」は、基準配列（たとえば
、野生型）に対する組換え配列において、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換のいずれ
かを意味する。
、野生型）に対する組換え配列において、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換のいずれ
かを意味する。
【0052】
本明細書で使用される用語「遺伝子組換え」は、ゲノムＤＮＡ配列が、組換え技術によ
って計画的に修飾されている細胞または生物、またはこれらの原種が修飾されているもの
を指す。本明細書で使用される用語「遺伝子組換え」は、用語「遺伝子導入」を包含する
。
って計画的に修飾されている細胞または生物、またはこれらの原種が修飾されているもの
を指す。本明細書で使用される用語「遺伝子組換え」は、用語「遺伝子導入」を包含する
。
【0053】
本明細書で使用される用語「野生型」は、メガヌクレアーゼの任意の天然由来の形態を
指す。用語「野生型」は、自然の酵素の最も一般的な対立遺伝子変異体を意味するのでは
なく、自然に見出される全ての対立遺伝子変異体を意味するものである。野生型メガヌク
レアーゼは、組換えまたは非天然由来のメガヌクレアーゼとは区別される。
指す。用語「野生型」は、自然の酵素の最も一般的な対立遺伝子変異体を意味するのでは
なく、自然に見出される全ての対立遺伝子変異体を意味するものである。野生型メガヌク
レアーゼは、組換えまたは非天然由来のメガヌクレアーゼとは区別される。
【0054】
本明細書で使用される用語「認識配列半部位」、または単純に「半部位」は、モノ－Ｌ
ＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの単量体、またはジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレ
アーゼの一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットによって認識される二本鎖ＤＮＡ分子中
の核酸配列を意味する。
ＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの単量体、またはジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレ
アーゼの一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットによって認識される二本鎖ＤＮＡ分子中
の核酸配列を意味する。
【0055】
本明細書で使用される用語「認識配列」は、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアー
ゼ二量体またはジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体のどちらかによって、結
合および切断される半部位の一対を言う。二つの半部位は、酵素によって特異的に認識さ
れない塩基対によって分離されても、されなくてもよい。Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩお
よびＩ－ＣｅｕＩの場合、各単量体の認識配列半部位は、９塩基対に広がり、二つの半部
位は、酵素の結合により直接接触していないが、実際の切断部位（４塩基対オーバーハン
グを有する）を構築する四つの塩基対によって分離される。したがって、Ｉ－ＣｒｅＩ、
Ｉ－ＭｓｏＩおよびＩ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ二量体の組合わされた認識配列は、通
常、４塩基対切断部位の横に位置する、二つの９塩基対半部位を含む２２塩基対に広がる
。ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体であるＩ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ
の場合、認識配列は、約１８ｂｐ非パリンドローム配列であり、特異的に認識されない中
心塩基対は存在しない。慣例により、二本のストランドの一本を「センス」鎖といい、も
う一本を「アンチセンス」鎖と言うが、どちらの鎖もタンパク質をエンコードしていなく
てよい。
ゼ二量体またはジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体のどちらかによって、結
合および切断される半部位の一対を言う。二つの半部位は、酵素によって特異的に認識さ
れない塩基対によって分離されても、されなくてもよい。Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩお
よびＩ－ＣｅｕＩの場合、各単量体の認識配列半部位は、９塩基対に広がり、二つの半部
位は、酵素の結合により直接接触していないが、実際の切断部位（４塩基対オーバーハン
グを有する）を構築する四つの塩基対によって分離される。したがって、Ｉ－ＣｒｅＩ、
Ｉ－ＭｓｏＩおよびＩ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ二量体の組合わされた認識配列は、通
常、４塩基対切断部位の横に位置する、二つの９塩基対半部位を含む２２塩基対に広がる
。ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体であるＩ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ
の場合、認識配列は、約１８ｂｐ非パリンドローム配列であり、特異的に認識されない中
心塩基対は存在しない。慣例により、二本のストランドの一本を「センス」鎖といい、も
う一本を「アンチセンス」鎖と言うが、どちらの鎖もタンパク質をエンコードしていなく
てよい。
【0056】
本明細書で使用される用語「特異性」は、認識配列と言われる塩基対の特定の配列のみ
で、または認識配列の特定の一組のみで、二本鎖ＤＮＡ分子を認識、切断する、メガヌク
レアーゼの能力を意味する。認識配列の組みは、ある保存位置または配列モチーフを共有
するが、一つ以上の位置で縮重していてもよい。高度に特異的なメガヌクレアーゼは、一
つだけまたは非常に少ない数の認識配列を切断することができる。特異性は、実施例１で
記載するような切断アッセイによって測定することができる。本明細書で使用されるメガ
ヌクレアーゼは、生理的条件下で、基準メガヌクレアーゼ（たとえば、野生型）によって
、結合されるのではなく切断される認識配列を、結合し切断する場合、あるいは認識配列
の切断速度が、標準メガヌクレアーゼに対して生理学的に相当な量（たとえば、少なくと
も２倍、または２倍～１０倍）によって増加または減少する場合、「変化した」特異性を
有する。
で、または認識配列の特定の一組のみで、二本鎖ＤＮＡ分子を認識、切断する、メガヌク
レアーゼの能力を意味する。認識配列の組みは、ある保存位置または配列モチーフを共有
するが、一つ以上の位置で縮重していてもよい。高度に特異的なメガヌクレアーゼは、一
つだけまたは非常に少ない数の認識配列を切断することができる。特異性は、実施例１で
記載するような切断アッセイによって測定することができる。本明細書で使用されるメガ
ヌクレアーゼは、生理的条件下で、基準メガヌクレアーゼ（たとえば、野生型）によって
、結合されるのではなく切断される認識配列を、結合し切断する場合、あるいは認識配列
の切断速度が、標準メガヌクレアーゼに対して生理学的に相当な量（たとえば、少なくと
も２倍、または２倍～１０倍）によって増加または減少する場合、「変化した」特異性を
有する。
【0057】
本明細書で使用される用語「パリンドローム性」は、同一の半部位の逆方向反復を構成
する認識配列を指す。しかし、パリンドローム性配列は、酵素の結合によって直接接触し
ていない中心塩基対（たとえば、Ｉ－ＣｒｅＩ認識部位の四つの中心塩基対）に関して、
パリンドローム性である必要はない。天然由来の二量体メガヌクレアーゼの場合、パリン
ドローム性ＤＮＡ配列は、二つの単量体が同一の半部位と接触しているホモ二量体によっ
て認識される。
する認識配列を指す。しかし、パリンドローム性配列は、酵素の結合によって直接接触し
ていない中心塩基対（たとえば、Ｉ－ＣｒｅＩ認識部位の四つの中心塩基対）に関して、
パリンドローム性である必要はない。天然由来の二量体メガヌクレアーゼの場合、パリン
ドローム性ＤＮＡ配列は、二つの単量体が同一の半部位と接触しているホモ二量体によっ
て認識される。
【0058】
本明細書で使用される用語「擬似パリンドローム性」は、同一でないまたは不完全なパ
リンドローム性半部位の逆方向反復を構成する認識配列を指す。酵素の結合により直接接
触していない中心塩基対の他に、擬似パリンドローム性配列は、二つの半部位のそれぞれ
において、１～３塩基対で、二つの認識半部位の間のパリンドローム性配列から逸脱する
可能性がある。擬似パリンドローム性ＤＮＡ配列は、二つの同一の酵素単量体が僅かに異
なる半部位に接触する野生型ホモ二量体メガヌクレアーゼによって認識される天然ＤＮＡ
部位に特有のものである。
リンドローム性半部位の逆方向反復を構成する認識配列を指す。酵素の結合により直接接
触していない中心塩基対の他に、擬似パリンドローム性配列は、二つの半部位のそれぞれ
において、１～３塩基対で、二つの認識半部位の間のパリンドローム性配列から逸脱する
可能性がある。擬似パリンドローム性ＤＮＡ配列は、二つの同一の酵素単量体が僅かに異
なる半部位に接触する野生型ホモ二量体メガヌクレアーゼによって認識される天然ＤＮＡ
部位に特有のものである。
【0059】
本明細書で使用される用語「非パリンドローム」は、メガヌクレアーゼの二つの無関係
な半部位で構成された認識配列を指す。この場合、非パリンドローム配列は、二つの半部
位のそれぞれで、中心塩基対または４以上の塩基対のいずれかに関して、パリンドローム
性である必要はない。非パリンドロームＤＮＡ配列は、ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌク
レアーゼ、高縮重モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（たとえば、Ｉ－ＣｅｕＩ
）によって、または同一でない半部位を認識するモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレア
ーゼ単量体のヘテロ二量体によって認識される。後者の場合、二つの異なるモノ－ＬＡＧ
ＬＩＤＡＤＧ単量体のヘテロ二量体は、これらが単鎖ポリペプチドに融合していてもして
いなくても、各単量体によって認識される一つの半部位を含む認識配列を切断するので、
非パリンドローム認識配列を「ハイブリッド配列」と言ってもよい。したがって、ヘテロ
二量体認識配列は、二つのホモ二量体認識配列のハイブリッドである。
な半部位で構成された認識配列を指す。この場合、非パリンドローム配列は、二つの半部
位のそれぞれで、中心塩基対または４以上の塩基対のいずれかに関して、パリンドローム
性である必要はない。非パリンドロームＤＮＡ配列は、ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌク
レアーゼ、高縮重モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（たとえば、Ｉ－ＣｅｕＩ
）によって、または同一でない半部位を認識するモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレア
ーゼ単量体のヘテロ二量体によって認識される。後者の場合、二つの異なるモノ－ＬＡＧ
ＬＩＤＡＤＧ単量体のヘテロ二量体は、これらが単鎖ポリペプチドに融合していてもして
いなくても、各単量体によって認識される一つの半部位を含む認識配列を切断するので、
非パリンドローム認識配列を「ハイブリッド配列」と言ってもよい。したがって、ヘテロ
二量体認識配列は、二つのホモ二量体認識配列のハイブリッドである。
【0060】
本明細書で使用される用語「リンカ」は、二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを単
鎖ポリペプチドに結合するために使用される外因性ペプチド配列を言う。リンカは、天然
のタンパク質中に見出される配列を有してもよいし、またはいかなる天然のタンパク質中
にも見出されない人工的な配列であってもよい。リンカは、可撓性で二次構造が欠けてい
てもよいし、または生理的条件下で特異的な三次元構造を形成する傾向を有してもよい。
鎖ポリペプチドに結合するために使用される外因性ペプチド配列を言う。リンカは、天然
のタンパク質中に見出される配列を有してもよいし、またはいかなる天然のタンパク質中
にも見出されない人工的な配列であってもよい。リンカは、可撓性で二次構造が欠けてい
てもよいし、または生理的条件下で特異的な三次元構造を形成する傾向を有してもよい。
【0061】
本明細書で使用される用語「融合ポイント」は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットとリ
ンカとの間の接合点を指す。具体的には、「Ｎ末端融合ポイント」は、リンカ配列の前の
、Ｎ末端ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの最終の（Ｃ最末端）アミノ酸であり、「Ｃ末
端融合ポイント」は、リンカ配列の後の、Ｃ末端ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの最初
の（Ｎ最末端）アミノ酸である。
ンカとの間の接合点を指す。具体的には、「Ｎ末端融合ポイント」は、リンカ配列の前の
、Ｎ末端ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの最終の（Ｃ最末端）アミノ酸であり、「Ｃ末
端融合ポイント」は、リンカ配列の後の、Ｃ末端ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの最初
の（Ｎ最末端）アミノ酸である。
【0062】
本明細書で使用される用語「単鎖メガヌクレアーゼ」は、リンカによって結合された、
一対のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含むポリペプチドを指す。単鎖メガヌクレアー
ゼは、組織：Ｎ末端サブユニット－リンカ－Ｃ末端サブユニットを有する。単鎖メガヌク
レアーゼは、Ｎ末端サブユニットがモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから由来
していなければならない点において、天然のジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼと
区別され、したがって、リンカは、Ｎ末端サブユニットに対して外因性でなければならな
い。
一対のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含むポリペプチドを指す。単鎖メガヌクレアー
ゼは、組織：Ｎ末端サブユニット－リンカ－Ｃ末端サブユニットを有する。単鎖メガヌク
レアーゼは、Ｎ末端サブユニットがモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから由来
していなければならない点において、天然のジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼと
区別され、したがって、リンカは、Ｎ末端サブユニットに対して外因性でなければならな
い。
【0063】
本明細書で使用される用語「相同組換え」は、修復テンプレートとして相同ＤＮＡ配列
を用いて、二本鎖ＤＮＡ切断が修復される自然の細胞内プロセスを指す（たとえば、非特
許文献２７参照）。相同ＤＮＡ配列は、内因性の染色体配列であっても、または細胞に送
達された外因性核酸であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、合理的に設
計されたメガヌクレアーゼは、標的配列内の認識配列を切断するために使用され、標的配
列に対し相同性を持つまたは実質的な配列類似性を持つ外因性核酸が細胞に送達され、相
同組換えによって修復のためのテンプレートとして使用される。これによって、標的配列
と大きく相違するかもしれない外因性核酸のＤＮＡ配列が、染色体の配列に導入される。
相同組換えのプロセスは、主として、真核生物の生物において起こる。用語「相同性」は
、本明細書では、「配列類似性」と同等のものとして使用され、血統または系統的な関連
性による同一性は必要とされないものである。
を用いて、二本鎖ＤＮＡ切断が修復される自然の細胞内プロセスを指す（たとえば、非特
許文献２７参照）。相同ＤＮＡ配列は、内因性の染色体配列であっても、または細胞に送
達された外因性核酸であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、合理的に設
計されたメガヌクレアーゼは、標的配列内の認識配列を切断するために使用され、標的配
列に対し相同性を持つまたは実質的な配列類似性を持つ外因性核酸が細胞に送達され、相
同組換えによって修復のためのテンプレートとして使用される。これによって、標的配列
と大きく相違するかもしれない外因性核酸のＤＮＡ配列が、染色体の配列に導入される。
相同組換えのプロセスは、主として、真核生物の生物において起こる。用語「相同性」は
、本明細書では、「配列類似性」と同等のものとして使用され、血統または系統的な関連
性による同一性は必要とされないものである。
【0064】
本明細書で使用される用語「非相同的末端結合」は、二本鎖ＤＮＡ切断が二つの非相同
性ＤＮＡセグメントの直接結合によって修復される、自然の細胞内プロセスを指す（たと
えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９
７６参照）。非相同的末端結合によるＤＮＡ修復は、エラーを起こしがちで、しばしば、
修復部位で非テンプレート付加またはＤＮＡ配列の欠失を起こす結果となる。したがって
、ある実施形態では、非相同的末端結合によって、遺伝子を混乱させる（たとえば、塩基
挿入、塩基欠失またはフレームシフト突然変異を導入することによって）ように標的配列
内のメガヌクレアーゼ認識配列で、二本鎖切断端を製造するために、合理的に設計された
メガヌクレアーゼを使用することができる。他の実施形態では、標的配列に対する相同性
、または実質的な配列類似性を欠く外因性核酸を、非相同的末端結合によって、メガヌク
レアーゼで刺激された二本鎖ＤＮＡ切断の部位で捕獲してもよい（たとえば、Ｓａｌｏｍ
ｏｎら（１９９８），ＥＭＢＯＪ．１７：６０８６－６０９５参照）。非相同的末端結合
のプロセスは、真核生物および細菌のような原核生物の両方において起こる。
性ＤＮＡセグメントの直接結合によって修復される、自然の細胞内プロセスを指す（たと
えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９
７６参照）。非相同的末端結合によるＤＮＡ修復は、エラーを起こしがちで、しばしば、
修復部位で非テンプレート付加またはＤＮＡ配列の欠失を起こす結果となる。したがって
、ある実施形態では、非相同的末端結合によって、遺伝子を混乱させる（たとえば、塩基
挿入、塩基欠失またはフレームシフト突然変異を導入することによって）ように標的配列
内のメガヌクレアーゼ認識配列で、二本鎖切断端を製造するために、合理的に設計された
メガヌクレアーゼを使用することができる。他の実施形態では、標的配列に対する相同性
、または実質的な配列類似性を欠く外因性核酸を、非相同的末端結合によって、メガヌク
レアーゼで刺激された二本鎖ＤＮＡ切断の部位で捕獲してもよい（たとえば、Ｓａｌｏｍ
ｏｎら（１９９８），ＥＭＢＯＪ．１７：６０８６－６０９５参照）。非相同的末端結合
のプロセスは、真核生物および細菌のような原核生物の両方において起こる。
【0065】
本明細書で使用される用語「関心のある配列」は、タンパク質、ＲＮＡまたは調節エレ
メント（たとえば、エンハンサ、サイレンサまたはプロモータ配列）をコードする場合、
メガヌクレアーゼタンパク質を使用して、ゲノムに挿入されうる、またはゲノムＤＮＡ配
列の置換えに使用されうる任意の核酸配列を意味する。関心のある配列は、該関心のある
配列から発現されるタンパク質またはＲＮＡにタグをつけることを可能にする異種ＤＮＡ
配列を有する可能性がある。たとえば、エピトープ（たとえば、ｃ－ｍｙｃ、ＦＬＡＧ）
または他のリガンド（たとえば、ポリ－Ｈｉｓ）（これらに限定されない）を始めとする
タグで、タンパク質にタグをつけることができる。さらに、関心のある配列は、当該分野
で公知の技術に従って融合タンパク質をエンコードすることができる（たとえば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ １９９９参照）。いくつかの実施形態では、関心のある配列は、
切断用の組換えメガヌクレアーゼに認識されるＤＮＡ配列の横に配置されている。したが
って、フランキング配列は切断され、関心のある配列が組換えメガヌクレアーゼによって
切断されたゲノム認識配列へ正しく挿入される。いくつかの実施形態では、相同組換えに
より標的配列が関心のある配列に効率的に置き換わるように、関心のある配列全体が、ゲ
ノム中の標的配列に相同性があるか、あるいは実質的な配列類似性を有する。他の実施形
態では、相同組換えによりゲノム内の関心のある配列が標的配列の遺伝子座で挿入される
ように、関心のある配列は、標的配列と相同性であるか、あるいは実質的に配列類似性の
あるＤＮＡ配列に挟まれている。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼが関心のあ
る配列によって修飾された後、標的配列を切断できないように、関心のある配列は、メガ
ヌクレアーゼ認識配列において、突然変異または他の修飾以外の標的配列に対し実質的に
同一である。
メント（たとえば、エンハンサ、サイレンサまたはプロモータ配列）をコードする場合、
メガヌクレアーゼタンパク質を使用して、ゲノムに挿入されうる、またはゲノムＤＮＡ配
列の置換えに使用されうる任意の核酸配列を意味する。関心のある配列は、該関心のある
配列から発現されるタンパク質またはＲＮＡにタグをつけることを可能にする異種ＤＮＡ
配列を有する可能性がある。たとえば、エピトープ（たとえば、ｃ－ｍｙｃ、ＦＬＡＧ）
または他のリガンド（たとえば、ポリ－Ｈｉｓ）（これらに限定されない）を始めとする
タグで、タンパク質にタグをつけることができる。さらに、関心のある配列は、当該分野
で公知の技術に従って融合タンパク質をエンコードすることができる（たとえば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ １９９９参照）。いくつかの実施形態では、関心のある配列は、
切断用の組換えメガヌクレアーゼに認識されるＤＮＡ配列の横に配置されている。したが
って、フランキング配列は切断され、関心のある配列が組換えメガヌクレアーゼによって
切断されたゲノム認識配列へ正しく挿入される。いくつかの実施形態では、相同組換えに
より標的配列が関心のある配列に効率的に置き換わるように、関心のある配列全体が、ゲ
ノム中の標的配列に相同性があるか、あるいは実質的な配列類似性を有する。他の実施形
態では、相同組換えによりゲノム内の関心のある配列が標的配列の遺伝子座で挿入される
ように、関心のある配列は、標的配列と相同性であるか、あるいは実質的に配列類似性の
あるＤＮＡ配列に挟まれている。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼが関心のあ
る配列によって修飾された後、標的配列を切断できないように、関心のある配列は、メガ
ヌクレアーゼ認識配列において、突然変異または他の修飾以外の標的配列に対し実質的に
同一である。
【0066】
アミノ酸配列および核酸配列の両方に関して、本明細書で使用される用語「類似性百分
率」および「配列類似性」は、整列アミノ酸残基またはヌクレオチド間の類似性を最大に
し、配列アラインメントにおける、同一または類似する残基またはヌクレオチドの数、残
基またはヌクレオチド総数、およびギャップの存在および長さの関数である、配列のアラ
インメントに基づく二つの配列が類似する程度の測定値を言う。標準パラメータを使用し
て配列類似性を測定するために、種々のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムが入
手可能である。本明細書で使用される配列類似性は、どちらも、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅ
ｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）より入手可能であり、アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴ
ｐプログラムおよび核酸配列用のＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、たとえば
、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、
ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２
７２、Ｍａｄｄｅｎら（１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４
１、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３
３ ８９－３４０２）、Ｚｈａｎｇら（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（
ｌ－２）：２０３－１４に記載されている。本明細書で使用される二つのアミノ酸配列の
類似性百分率は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズム用の以下のパラメータ：語長＝３、ギャップ
・オープニング・ペナルティ＝－１１、ギャップ・エクステンション・ペナルティ＝－１
、およびスコアマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２に基づくスコアである。本明細書で使用
される二つの核酸配列の類似性百分率は、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズム用の以下のパラメー
タ：語長＝１１、ギャップ・オープニング・ペナルティ＝－５、ギャップ・エクステンシ
ョン・ペナルティ＝－２、マッチリワード＝１、およびミスマッチペナルティ＝－３に基
づくスコアである。
率」および「配列類似性」は、整列アミノ酸残基またはヌクレオチド間の類似性を最大に
し、配列アラインメントにおける、同一または類似する残基またはヌクレオチドの数、残
基またはヌクレオチド総数、およびギャップの存在および長さの関数である、配列のアラ
インメントに基づく二つの配列が類似する程度の測定値を言う。標準パラメータを使用し
て配列類似性を測定するために、種々のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムが入
手可能である。本明細書で使用される配列類似性は、どちらも、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅ
ｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）より入手可能であり、アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴ
ｐプログラムおよび核酸配列用のＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、たとえば
、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、
ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２
７２、Ｍａｄｄｅｎら（１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４
１、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３
３ ８９－３４０２）、Ｚｈａｎｇら（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（
ｌ－２）：２０３－１４に記載されている。本明細書で使用される二つのアミノ酸配列の
類似性百分率は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズム用の以下のパラメータ：語長＝３、ギャップ
・オープニング・ペナルティ＝－１１、ギャップ・エクステンション・ペナルティ＝－１
、およびスコアマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２に基づくスコアである。本明細書で使用
される二つの核酸配列の類似性百分率は、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズム用の以下のパラメー
タ：語長＝１１、ギャップ・オープニング・ペナルティ＝－５、ギャップ・エクステンシ
ョン・ペナルティ＝－２、マッチリワード＝１、およびミスマッチペナルティ＝－３に基
づくスコアである。
【0067】
二つのタンパク質またはアミノ酸配列の修飾に関して、本明細書で使用される用語「に
対応する」は、第１タンパク質の特定の修飾が、第２のタンパク質の修飾と同じアミノ酸
残基の置換であり、二つのタンパク質を、標準配列アラインメント（たとえば、ＢＬＡＳ
Ｔｐプログラムを使用して）に供した場合、第１タンパク質の修飾のアミノ酸の位置が、
第２のタンパク質の修飾のアミノ酸位置に対応するまたは一致することを示すために使用
される。したがって、もし、配列アラインメントにおいて残基ＸおよびＹが互いに対応す
れば、ＸおよびＹが異なる数であっても、第１タンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸
「Ａ」への修飾は、第２のタンパク質における残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への修飾に対
応することになる。
対応する」は、第１タンパク質の特定の修飾が、第２のタンパク質の修飾と同じアミノ酸
残基の置換であり、二つのタンパク質を、標準配列アラインメント（たとえば、ＢＬＡＳ
Ｔｐプログラムを使用して）に供した場合、第１タンパク質の修飾のアミノ酸の位置が、
第２のタンパク質の修飾のアミノ酸位置に対応するまたは一致することを示すために使用
される。したがって、もし、配列アラインメントにおいて残基ＸおよびＹが互いに対応す
れば、ＸおよびＹが異なる数であっても、第１タンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸
「Ａ」への修飾は、第２のタンパク質における残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への修飾に対
応することになる。
【0068】
本明細書で使用される変数に関する数字の範囲の記述は、本発明が、その範囲内の任意
の値に等しい変数を用いて実施できることを伝えるものである。したがって、本質的に不
連続な変数に関して、該変数は、その範囲の終点を含む数字の範囲内の任意の整数と同一
でありうる。同様に、本質的に連続した変数に関して、該変数は、その範囲の終点を含む
数字の範囲内の任意の実数値と同一でありうる。限定ではない、例示として、もし変数が
本質的に不連続であれば、０と２との間の値を持つと記載された変数は、０、１または２
の値をとることができ、変数が本質的に連続であれば、変数は、０．０、０．１、０．０
１、０．００１、または≧０および≦２の他の任意の実数をとりうる。
の値に等しい変数を用いて実施できることを伝えるものである。したがって、本質的に不
連続な変数に関して、該変数は、その範囲の終点を含む数字の範囲内の任意の整数と同一
でありうる。同様に、本質的に連続した変数に関して、該変数は、その範囲の終点を含む
数字の範囲内の任意の実数値と同一でありうる。限定ではない、例示として、もし変数が
本質的に不連続であれば、０と２との間の値を持つと記載された変数は、０、１または２
の値をとることができ、変数が本質的に連続であれば、変数は、０．０、０．１、０．０
１、０．００１、または≧０および≦２の他の任意の実数をとりうる。
【0069】
他に特定の示唆がない限り、本明細書で使用される用語「または」は、「および／また
は」を含む意味で使用され、「どちらか／または」の意味は含まない。
は」を含む意味で使用され、「どちらか／または」の意味は含まない。
【0070】
２．ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに由来する単鎖メガヌクレアーゼ
天然のモノ－およびジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの構造比較は、ジ－ＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼのＮ末端サブユニットが、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ単
量体より小さい傾向にあることを明らかにする。この結果は、ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメ
ガヌクレアーゼの場合、Ｎ末端サブユニットの終点（Ｃ末端）は、Ｃ末端サブユニットの
始点（Ｎ末端）に非常に近いということである。これは、比較的短い（たとえば、５～２
０アミノ酸）リンカは、二つのサブユニットを結合するのに十分であることを意味する。
モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの場合、一つの単量体のＣ末端は、一般的に
、第２単量体のＮ末端から非常に遠い（Ｉ－ＣｒｅＩの場合、約４８Å）。したがって、
一対のモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを単鎖ポリペプチドに融合するには、
この距離に広がることができるより長い（たとえば、＞２０アミノ酸）ペプチドリンカが
必要である。Ｎ末端サブユニットをＣ末端サブユニットの始点に空間的により近い点でト
ランケートする代替方法は、先に報告されている（非特許文献１７、特許文献１９）が、
以下の実施例１に示すように、この方法では、どのような機能的へテロ二量体も殆ど製造
されない。Ｉ－ＣｒｅＩに由来する機能的単鎖メガヌクレアーゼの製造に関する難しさに
ついての広範な検討は、非特許文献２５に見出すことができる。
天然のモノ－およびジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの構造比較は、ジ－ＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼのＮ末端サブユニットが、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ単
量体より小さい傾向にあることを明らかにする。この結果は、ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメ
ガヌクレアーゼの場合、Ｎ末端サブユニットの終点（Ｃ末端）は、Ｃ末端サブユニットの
始点（Ｎ末端）に非常に近いということである。これは、比較的短い（たとえば、５～２
０アミノ酸）リンカは、二つのサブユニットを結合するのに十分であることを意味する。
モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの場合、一つの単量体のＣ末端は、一般的に
、第２単量体のＮ末端から非常に遠い（Ｉ－ＣｒｅＩの場合、約４８Å）。したがって、
一対のモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを単鎖ポリペプチドに融合するには、
この距離に広がることができるより長い（たとえば、＞２０アミノ酸）ペプチドリンカが
必要である。Ｎ末端サブユニットをＣ末端サブユニットの始点に空間的により近い点でト
ランケートする代替方法は、先に報告されている（非特許文献１７、特許文献１９）が、
以下の実施例１に示すように、この方法では、どのような機能的へテロ二量体も殆ど製造
されない。Ｉ－ＣｒｅＩに由来する機能的単鎖メガヌクレアーゼの製造に関する難しさに
ついての広範な検討は、非特許文献２５に見出すことができる。
【0071】
２．１ Ｉ－ＣｒｅＩに関する融合ポイント
野生型Ｉ－ＣｒｅＩ、またはそのＤＮＡ切断部位優先度に関して変更されたＩ－Ｃｒｅ
Ｉの操作された変異体（「ＣＣＲ２」と示される、配列番号３１、特許文献１２参照）の
どちらかを、天然Ｃ末端アミノ酸、Ｐｒｏ１６３の前で停止させた、一連のトランケーシ
ョン変異体を作った（表１）。変異体ホモ二量体がＥ．ｃｏｌｉ中で発現し、これを精製
し、野生型認識配列（配列番号３４～３５）またはＣＣＲ２認識配列（配列番号３２～３
３）のどちらかで培養して、切断活性の試験を行った。
野生型Ｉ－ＣｒｅＩ、またはそのＤＮＡ切断部位優先度に関して変更されたＩ－Ｃｒｅ
Ｉの操作された変異体（「ＣＣＲ２」と示される、配列番号３１、特許文献１２参照）の
どちらかを、天然Ｃ末端アミノ酸、Ｐｒｏ１６３の前で停止させた、一連のトランケーシ
ョン変異体を作った（表１）。変異体ホモ二量体がＥ．ｃｏｌｉ中で発現し、これを精製
し、野生型認識配列（配列番号３４～３５）またはＣＣＲ２認識配列（配列番号３２～３
３）のどちらかで培養して、切断活性の試験を行った。
【表1】
【0072】
野生型Ｉ－ＣｒｅＩは、残基１４８以上のＣ末端残基でトランケートされた場合は活性
であるが、残基１４１以上のＮ末端残基でトランケートされた場合は不活性であることが
わかった。したがって、野生型活性のためには、残基１４１から１４７の少なくともいく
つかの残基、またはそれらの残基の保存的置換が必要である。同様に、ＣＣＲ２は、残基
１５１以上のＣ末端残基でトランケートされた場合は活性であるが、残基１４８以上のＮ
末端残基で停止された場合は不活性であることがわかった。したがって、ＣＣＲ２活性の
ためには、残基１４８から１５０の少なくともいくつかの残基、またはそれらの残基の保
存的置換が必要である。野生型Ｉ－ＣｒｅＩと合理的に設計されたＣＣＲ２メガヌクレア
ーゼとの間の違いは、おそらく、未成熟Ｃ末端トランケーションによりさらなる不安定化
に対してより敏感になるように、ＣＣＲ２メガヌクレアーゼの構造的安定性における減少
によるものであろう。これらのトランケーションの結果は、Ｉ－ＣｒｅＩのＣ末端ループ
（アミノ酸１３８－１４２）は、切断活性に必須であることが発見されたというＰｒｉｅ
ｔｏらの刊行物（Ｐｒｉｅｔｏら（２００７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：
３２６２－３２７１）と一致する。まとめると、これらの結果は、Ｉ－ＣｒｅＩのＣ末端
に近傍のいくつかの残基は、ＤＮＡ結合および／または触媒活性に必須であり、残基１４
２のほぼ前のＩ－ＣｒｅＩサブユニットをトランケートする単鎖メガヌクレアーゼの製造
方法（たとえば、Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：
２９５２－６２、国際公開公報第２００３／０７８６１９号）によって、両ＬＡＧＬＩＤ
ＡＤＧサブユニットが触媒的に活性な単鎖メガヌクレアーゼを得ることは見込みがないこ
とを示す。
であるが、残基１４１以上のＮ末端残基でトランケートされた場合は不活性であることが
わかった。したがって、野生型活性のためには、残基１４１から１４７の少なくともいく
つかの残基、またはそれらの残基の保存的置換が必要である。同様に、ＣＣＲ２は、残基
１５１以上のＣ末端残基でトランケートされた場合は活性であるが、残基１４８以上のＮ
末端残基で停止された場合は不活性であることがわかった。したがって、ＣＣＲ２活性の
ためには、残基１４８から１５０の少なくともいくつかの残基、またはそれらの残基の保
存的置換が必要である。野生型Ｉ－ＣｒｅＩと合理的に設計されたＣＣＲ２メガヌクレア
ーゼとの間の違いは、おそらく、未成熟Ｃ末端トランケーションによりさらなる不安定化
に対してより敏感になるように、ＣＣＲ２メガヌクレアーゼの構造的安定性における減少
によるものであろう。これらのトランケーションの結果は、Ｉ－ＣｒｅＩのＣ末端ループ
（アミノ酸１３８－１４２）は、切断活性に必須であることが発見されたというＰｒｉｅ
ｔｏらの刊行物（Ｐｒｉｅｔｏら（２００７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：
３２６２－３２７１）と一致する。まとめると、これらの結果は、Ｉ－ＣｒｅＩのＣ末端
に近傍のいくつかの残基は、ＤＮＡ結合および／または触媒活性に必須であり、残基１４
２のほぼ前のＩ－ＣｒｅＩサブユニットをトランケートする単鎖メガヌクレアーゼの製造
方法（たとえば、Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：
２９５２－６２、国際公開公報第２００３／０７８６１９号）によって、両ＬＡＧＬＩＤ
ＡＤＧサブユニットが触媒的に活性な単鎖メガヌクレアーゼを得ることは見込みがないこ
とを示す。
【0073】
したがって、本発明によれば、位置１４２～１５１の任意の位置、または残基１５１に
対するＣ末端の任意の位置を含む、Ｎ末端融合ポイント（すなわち、Ｎ末端Ｉ－ＣｒｅＩ
サブユニットとリンカとの間）は、Ｎ末端サブユニットの残基１４２に対するＣ末端にあ
るべきである。Ｉ－ＣｒｅＩの残基１５４－１６３は、非構造的であり（Ｊｕｒｉｃａら
（１９９８），ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ２：４６９－４７６）、したがって、これらの残基を含
むことにより可撓性が増し、得られる単鎖メガヌクレアーゼの構造の不安定性もおそらく
増すであろう。逆に、可撓性を少なくし、構造安定性を強めることが望ましいまたは必要
であると決めた場合は、残基１４２－１５３の融合ポイントを選択することができる。
対するＣ末端の任意の位置を含む、Ｎ末端融合ポイント（すなわち、Ｎ末端Ｉ－ＣｒｅＩ
サブユニットとリンカとの間）は、Ｎ末端サブユニットの残基１４２に対するＣ末端にあ
るべきである。Ｉ－ＣｒｅＩの残基１５４－１６３は、非構造的であり（Ｊｕｒｉｃａら
（１９９８），ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ２：４６９－４７６）、したがって、これらの残基を含
むことにより可撓性が増し、得られる単鎖メガヌクレアーゼの構造の不安定性もおそらく
増すであろう。逆に、可撓性を少なくし、構造安定性を強めることが望ましいまたは必要
であると決めた場合は、残基１４２－１５３の融合ポイントを選択することができる。
【0074】
単鎖メガヌクレアーゼのＣ末端ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットがＩ－ＣｒｅＩに由来
するという条件下で、リンカのＣ末端融合ポイントは、Ｉ－ＣｒｅＩ配列のＮ末端に向い
ている。残基７、８および９は、（１）ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼファミリメ
ンバの間に構造的に保存され、したがって、ヘテロ二量体の形成において、他のＬＡＧＬ
ＩＤＡＤＧファミリメンバとの大きな適合性を提供でき、（２）触媒機能に関与する保存
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むαへリックスを開始するという理由で、Ｉ－ＣｒｅＩ
中のＣ末端融合ポイントとして特に関心がもたれる。しかし、残基１－６の任意の残基を
含む残基７に対する融合ポイントＮ末端も、本発明に従って使用することができる。
するという条件下で、リンカのＣ末端融合ポイントは、Ｉ－ＣｒｅＩ配列のＮ末端に向い
ている。残基７、８および９は、（１）ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼファミリメ
ンバの間に構造的に保存され、したがって、ヘテロ二量体の形成において、他のＬＡＧＬ
ＩＤＡＤＧファミリメンバとの大きな適合性を提供でき、（２）触媒機能に関与する保存
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むαへリックスを開始するという理由で、Ｉ－ＣｒｅＩ
中のＣ末端融合ポイントとして特に関心がもたれる。しかし、残基１－６の任意の残基を
含む残基７に対する融合ポイントＮ末端も、本発明に従って使用することができる。
【0075】
以下のＩ－ＣｒｅＩ Ｎ末端およびＣ末端融合ポイントは、さらなる実験のために選択
したが、本発明の範囲を限定するように考えるべきではない。
したが、本発明の範囲を限定するように考えるべきではない。
【表2】
【0076】
２．２ Ｉ－ＣｒｅＩに由来する単鎖メガヌクレアーゼ用のリンカ
一対のＩ－ＣｒｅＩ単量体を単鎖ポリペプチドに結合する目的で、二つの一般的なクラ
スのリンカ、（１）二次構造を欠く非構造化リンカ、および（２）二次構造を有する構造
化リンカについて考慮した。非構造化リンカの例は、当該分野で周知であり、ＧＩｙおよ
びＳｅｒ含有率が高い、または反復を含む人工配列が挙げられる。構造化リンカも当該分
野で周知であり、タンパク質ホールディングの基本的な原理を使用して設計されたもの（
たとえば、ＡｕｒｏｒａおよびＲｏｓｅ（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７：２
１－３８、Ｆｅｒｓｈｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ １９９８）が挙げられる。
一対のＩ－ＣｒｅＩ単量体を単鎖ポリペプチドに結合する目的で、二つの一般的なクラ
スのリンカ、（１）二次構造を欠く非構造化リンカ、および（２）二次構造を有する構造
化リンカについて考慮した。非構造化リンカの例は、当該分野で周知であり、ＧＩｙおよ
びＳｅｒ含有率が高い、または反復を含む人工配列が挙げられる。構造化リンカも当該分
野で周知であり、タンパク質ホールディングの基本的な原理を使用して設計されたもの（
たとえば、ＡｕｒｏｒａおよびＲｏｓｅ（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７：２
１－３８、Ｆｅｒｓｈｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ １９９８）が挙げられる。
【0077】
「ＬＡＭｌ」（配列番号３６）および「ＬＡＭ２」（配列番号３７）と呼ばれる一対の
合理的に設計されたＩ－ＣｒｅＩ単量体を使用して、本発明を検証した。これらの合理的
に設計されたエンドヌクレアーゼは、国際公開公報第２００７／０４７８５９号に記載さ
れた方法を使用して製造され、該公報で特徴付けられている。しかし、当業者には明らか
であろうが、ＬＡＭ１およびＬＡＭ２単量体は、野生型モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユ
ニット、Ｎ末端および／またはＣ－末端がトランケートされた野生型モノ－ＬＡＧＬＩＤ
ＡＤＧサブユニット、Ｎ末端および／またはＣ末端がトランケートされた野生型ジ－ＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧサブユニットおよび先に記載した任意のものの合理的に設計された修飾形
態を始めとする、使用することができる多くの単量体の単なる例示である。
合理的に設計されたＩ－ＣｒｅＩ単量体を使用して、本発明を検証した。これらの合理的
に設計されたエンドヌクレアーゼは、国際公開公報第２００７／０４７８５９号に記載さ
れた方法を使用して製造され、該公報で特徴付けられている。しかし、当業者には明らか
であろうが、ＬＡＭ１およびＬＡＭ２単量体は、野生型モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユ
ニット、Ｎ末端および／またはＣ－末端がトランケートされた野生型モノ－ＬＡＧＬＩＤ
ＡＤＧサブユニット、Ｎ末端および／またはＣ末端がトランケートされた野生型ジ－ＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧサブユニットおよび先に記載した任意のものの合理的に設計された修飾形
態を始めとする、使用することができる多くの単量体の単なる例示である。
【0078】
単量体の一例であるＬＡＭ１は、野生型Ｉ－ＣｒｅＩとは７つのアミノ酸が異なり、半
部位：
５’－ＴＧＣＧＧＴＧＴＣ－３’（配列番号３８）
３’－ＡＣＧＣＣＡＣＡＧ－５’（配列番号３９）
を認識する。したがって、ＬＡＭ１ホモ二量体は、パリンドローム性認識配列（ここで、
各Ｎは非拘束型である）：
５’－ＴＧＣＧＧＴＧＴＣＮＮＮＮＧＡＣＡＣＣＧＣＡ－３’（配列番号４０）
３’－ＡＣＧＣＣＡＣＡＧＮＮＮＮＣＴＧＴＧＧＣＧＴ－５’（配列番号４１）
を認識する。
部位：
５’－ＴＧＣＧＧＴＧＴＣ－３’（配列番号３８）
３’－ＡＣＧＣＣＡＣＡＧ－５’（配列番号３９）
を認識する。したがって、ＬＡＭ１ホモ二量体は、パリンドローム性認識配列（ここで、
各Ｎは非拘束型である）：
５’－ＴＧＣＧＧＴＧＴＣＮＮＮＮＧＡＣＡＣＣＧＣＡ－３’（配列番号４０）
３’－ＡＣＧＣＣＡＣＡＧＮＮＮＮＣＴＧＴＧＧＣＧＴ－５’（配列番号４１）
を認識する。
【0079】
他の単量体の例示であるＬＡＭ２は、野生型Ｉ－ＣｒｅＩとは５個のアミノ酸が異なり
、半部位：
５’－ＣＡＧＧＣＴＧＴＣ－３’（配列番号４２）
３’－ＧＴＣＣＧＡＣＡＧ－５’（配列番号４３）
を認識する。したがって、ＬＡＭ２ホモ二量体は、パリンドローム性認識配列（ここで、
各Ｎは非拘束型である）：
５’－ＣＡＧＧＣＴＧＴＣＮＮＮＮＧＡＣＡＧＣＣＴＧ－３’（配列番号４４）
３’－ＧＴＣＣＧＡＣＡＧＮＮＮＮＣＴＧＴＣＧＧＡＣ－５’（配列番号４５）
を認識する。
、半部位：
５’－ＣＡＧＧＣＴＧＴＣ－３’（配列番号４２）
３’－ＧＴＣＣＧＡＣＡＧ－５’（配列番号４３）
を認識する。したがって、ＬＡＭ２ホモ二量体は、パリンドローム性認識配列（ここで、
各Ｎは非拘束型である）：
５’－ＣＡＧＧＣＴＧＴＣＮＮＮＮＧＡＣＡＧＣＣＴＧ－３’（配列番号４４）
３’－ＧＴＣＣＧＡＣＡＧＮＮＮＮＣＴＧＴＣＧＧＡＣ－５’（配列番号４５）
を認識する。
【0080】
一つのＬＡＭ１単量体と一つのＬＡＭ２単量体とを含む（「ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ
二量体」）ヘテロ二量体は、そのため、ハイブリッド認識配列：
５’－ＴＧＣＧＧＴＧＴＣＮＮＮＮＧＡＣＡＧＣＣＴＧ－３’（配列番号４０）
３’－ＡＣＧＣＣＡＣＡＧＮＮＮＮＣＴＧＴＣＧＧＡＣ－５’（配列番号４１）
を認識する。
二量体」）ヘテロ二量体は、そのため、ハイブリッド認識配列：
５’－ＴＧＣＧＧＴＧＴＣＮＮＮＮＧＡＣＡＧＣＣＴＧ－３’（配列番号４０）
３’－ＡＣＧＣＣＡＣＡＧＮＮＮＮＣＴＧＴＣＧＧＡＣ－５’（配列番号４１）
を認識する。
【0081】
２．２．１ 単鎖メガヌクレアーゼ用の可撓性リンカ
種々の高可撓性ペプチドリンカは当該分野で公知であり、本発明に従って使用すること
ができる。たとえば、限定ではないが、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ反復単位を含むペプチド
リンカは、非構造的で、可撓性であることが知られている（Ｆｅｒｓｈｔ，Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗ．Ｈ
．Ｆｒｅｅｍａｎ １９９８）。この組成および類似する組成を持つリンカは、たとえば
、単鎖抗体（Ｍａｃｋら（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ９２：７
０２１－７０２５）、成長因子受容体（Ｕｅｄａら（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４１：１５９－１７０）、酵素（Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓら（２００２）
，２６９：３５７０－３５７７）、およびＤＮＡ結合およびヌクレアーゼドメイン（Ｋｉ
ｍら（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１１５６－１１６０）
と一緒に、タンパク質ドメインを融合するために、しばしば使用される。
種々の高可撓性ペプチドリンカは当該分野で公知であり、本発明に従って使用すること
ができる。たとえば、限定ではないが、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ反復単位を含むペプチド
リンカは、非構造的で、可撓性であることが知られている（Ｆｅｒｓｈｔ，Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗ．Ｈ
．Ｆｒｅｅｍａｎ １９９８）。この組成および類似する組成を持つリンカは、たとえば
、単鎖抗体（Ｍａｃｋら（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ９２：７
０２１－７０２５）、成長因子受容体（Ｕｅｄａら（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４１：１５９－１７０）、酵素（Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓら（２００２）
，２６９：３５７０－３５７７）、およびＤＮＡ結合およびヌクレアーゼドメイン（Ｋｉ
ｍら（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１１５６－１１６０）
と一緒に、タンパク質ドメインを融合するために、しばしば使用される。
【0082】
一般的事項として、可撓性リンカは、生理的条件下で安定な二次構造を形成しない任意
のポリペプチド配列を含みうる。いくつかの実施形態では、リンカは、高い割合（たとえ
ば、＞５０％、６０％、７０％、８０％または９０％、あるいは一般的には、５０％～１
００％）で、極性非荷電残基（すなわち、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧＩｎ、Ｔ
ｙｒ、Ｔｈｒ）を含有する。さらに、いくつかの実施形態では、リンカは、大きな疎水性
残基（すなわち、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ）を含有する割合が低い。リンカは、種々の長
さの繰返し（たとえば、（ＳＧ）ｎ、（ＧＳＳ）ｎ、（ＳＧＧＳ）ｎ）、ランダム配列、
またはこれらの二つの組合せを含んでもよい。
のポリペプチド配列を含みうる。いくつかの実施形態では、リンカは、高い割合（たとえ
ば、＞５０％、６０％、７０％、８０％または９０％、あるいは一般的には、５０％～１
００％）で、極性非荷電残基（すなわち、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧＩｎ、Ｔ
ｙｒ、Ｔｈｒ）を含有する。さらに、いくつかの実施形態では、リンカは、大きな疎水性
残基（すなわち、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ）を含有する割合が低い。リンカは、種々の長
さの繰返し（たとえば、（ＳＧ）ｎ、（ＧＳＳ）ｎ、（ＳＧＧＳ）ｎ）、ランダム配列、
またはこれらの二つの組合せを含んでもよい。
【0083】
したがって、本発明に従って、Ｖａｌ－１５１またはＡｓｐ－１５３をＮ末端融合ポイ
ントとして、およびＰｈｅ－９をＣ末端融合ポイントとして使用して、高可撓性ペプチド
リンカがＮ末端（ＬＡＭ１）サブユニットをＣ末端（ＬＡＭ２）サブユニットに共有結合
した一組の単鎖融合を、ＬＡＭ１とＬＡＭ２との間に製造した。単鎖タンパク質は、Ｅ．
ｃｏｌｉで発現し、これを精製し、一つのＬＡＭ１半部位と一つのＬＡＭ２半部位と（配
列番号４６および４７）を含むハイブリッドＤＮＡ部位を切断する能力に関して、試験し
た。切断活性を、－：活性は検出不能、＋：最小活性、＋＋：中程度の活性、＋＋＋：エ
ンドヌクレアーゼ精製前のＥ．ｃｏｌｉ中の二つの単量体の共発現により製造されたＬＡ
Ｍ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体に匹敵する活性の四点スケールで評価した。また、発現また
は精製中にリンカ領域がタンパク分解され、二つのサブユニットを遊離する程度を測定す
るＳＤＳ－ＰＡＧＥによっても、該タンパク質を評価した。
ントとして、およびＰｈｅ－９をＣ末端融合ポイントとして使用して、高可撓性ペプチド
リンカがＮ末端（ＬＡＭ１）サブユニットをＣ末端（ＬＡＭ２）サブユニットに共有結合
した一組の単鎖融合を、ＬＡＭ１とＬＡＭ２との間に製造した。単鎖タンパク質は、Ｅ．
ｃｏｌｉで発現し、これを精製し、一つのＬＡＭ１半部位と一つのＬＡＭ２半部位と（配
列番号４６および４７）を含むハイブリッドＤＮＡ部位を切断する能力に関して、試験し
た。切断活性を、－：活性は検出不能、＋：最小活性、＋＋：中程度の活性、＋＋＋：エ
ンドヌクレアーゼ精製前のＥ．ｃｏｌｉ中の二つの単量体の共発現により製造されたＬＡ
Ｍ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体に匹敵する活性の四点スケールで評価した。また、発現また
は精製中にリンカ領域がタンパク分解され、二つのサブユニットを遊離する程度を測定す
るＳＤＳ－ＰＡＧＥによっても、該タンパク質を評価した。
【表3】
【0084】
結果は、表３中のＧｌｙ－Ｓｅｒリンカのような可撓性リンカは、長さが正しければ、
単鎖メガヌクレアーゼ製造に適することを示した（実施例２も参照）。たとえば、表３に
関して、それぞれ合計２２個および２５個のアミノ酸を含むリンカ１および２を含有する
単鎖メガヌクレアーゼは、試験された融合ポイントに関して、いかなる検出可能な切断活
性も発揮しなかった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによれば、これらのメガヌクレアーゼは未変化で
、プロテアーゼによって分解されなかったことが示され、つまり、これらの単鎖メガヌク
レアーゼは、構造的には安定であるが、機能的には、あまりに短すぎて個々のＬＡＧＬＩ
ＤＡＤＧサブユニットに、ＤＮＡ結合および／または触媒作用のために必要な立体配座を
適用できないリンカによって制約されているという結論に達した。それぞれ２８、２９、
３０および２８個のアミノ酸を含むリンカ３、６、７および８は、全て、低い切断活性の
レベルを示した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによれば、それぞれ、少量（５％～１０％）は、個々
のサブユニットにタンパク分解されるが、一方、大部分は、完全長単鎖メガヌクレアーゼ
（約４０キロダルトン）に対応する分子量を持つことが示された。３および８は、同じリ
ンカ配列を有するが、Ｎ末端融合ポイントは、それぞれ、Ｖａｌ－１５１およびＡｓｐ－
１５３であった。両単鎖メガヌクレアーゼは、同等の活性を示し、この場合、正確な融合
ポイントは重大な意味を持つものではないことを示した。最後に、Ｅ．ｃｏｌｉから精製
した場合、それぞれ、３１個および３４個のアミノ酸を含むリンカ４および５からは、検
出しうる単鎖メガヌクレアーゼが得られなかった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出された
ように、これらのリンカは、個々のＬＡＭ１および／またはＬＡＭ２サブユニットに完全
にタンパク分解され、したがって、これらのメガヌクレアーゼの切断活性は、これ以上調
べなかった。
単鎖メガヌクレアーゼ製造に適することを示した（実施例２も参照）。たとえば、表３に
関して、それぞれ合計２２個および２５個のアミノ酸を含むリンカ１および２を含有する
単鎖メガヌクレアーゼは、試験された融合ポイントに関して、いかなる検出可能な切断活
性も発揮しなかった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによれば、これらのメガヌクレアーゼは未変化で
、プロテアーゼによって分解されなかったことが示され、つまり、これらの単鎖メガヌク
レアーゼは、構造的には安定であるが、機能的には、あまりに短すぎて個々のＬＡＧＬＩ
ＤＡＤＧサブユニットに、ＤＮＡ結合および／または触媒作用のために必要な立体配座を
適用できないリンカによって制約されているという結論に達した。それぞれ２８、２９、
３０および２８個のアミノ酸を含むリンカ３、６、７および８は、全て、低い切断活性の
レベルを示した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによれば、それぞれ、少量（５％～１０％）は、個々
のサブユニットにタンパク分解されるが、一方、大部分は、完全長単鎖メガヌクレアーゼ
（約４０キロダルトン）に対応する分子量を持つことが示された。３および８は、同じリ
ンカ配列を有するが、Ｎ末端融合ポイントは、それぞれ、Ｖａｌ－１５１およびＡｓｐ－
１５３であった。両単鎖メガヌクレアーゼは、同等の活性を示し、この場合、正確な融合
ポイントは重大な意味を持つものではないことを示した。最後に、Ｅ．ｃｏｌｉから精製
した場合、それぞれ、３１個および３４個のアミノ酸を含むリンカ４および５からは、検
出しうる単鎖メガヌクレアーゼが得られなかった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出された
ように、これらのリンカは、個々のＬＡＭ１および／またはＬＡＭ２サブユニットに完全
にタンパク分解され、したがって、これらのメガヌクレアーゼの切断活性は、これ以上調
べなかった。
【0085】
これらの結果により、本発明者らは、リンカの長さが、２５アミノ酸より長く３１アミ
ノ酸より短ければ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカは、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアー
ゼＩ－ＣｒｅＩおよび使用した特定の融合ポイントのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに
基づく単鎖メガヌクレアーゼの製造にふさわしいと結論付けた。これらの融合ポイントを
持つＩ－ＣｒｅＩ系単鎖メガヌクレアーゼに関しては、より短いリンカは触媒作用を妨げ
るが、より長いリンカは、不安定で、プロテアーゼによってクリッピングする傾向がある
。
ノ酸より短ければ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカは、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアー
ゼＩ－ＣｒｅＩおよび使用した特定の融合ポイントのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに
基づく単鎖メガヌクレアーゼの製造にふさわしいと結論付けた。これらの融合ポイントを
持つＩ－ＣｒｅＩ系単鎖メガヌクレアーゼに関しては、より短いリンカは触媒作用を妨げ
るが、より長いリンカは、不安定で、プロテアーゼによってクリッピングする傾向がある
。
【0086】
ふさわしいリンカの長さにおける融合ポイントの変化の効果は、日常的な実験により経
験的に測定することができおよび／またはタンパク質構造の三次元モデル化に基づいて予
測することができる。融合ポイントはＮ末端またはＣ末端を移動させるので、融合ポイン
トに近いタンパク質の第二および第三次構造に依存して、他の融合ポイントにより近くに
、あるいは該ポイントからより遠くに動きうるということは重要である。したがって、た
とえば、Ｃ末端方向へ（たとえば、残基１５０から残基１５５へＮ末端融合ポイントを）
動かすが、物理的にＣ末端融合ポイントに近いＮ末端融合ポイントとなる結果には必ずし
もならない。なぜなら、たとえば、その領域内のＮ末端残基は、Ｃ末端融合ポイントに向
かう、あるいは該ポイントから離れる方向を指す第二／第三次構造の一部であるかもしれ
ないからである。したがって、Ｎ末端融合ポイントをＮ末端またはＣ末端方向に動かす、
またはＣ末端融合ポイントをＮ末端またはＣ末端方向に動かすことによって、ふさわしい
リンカ長さの範囲内で、より長いまたはより短いリンカに向かってシフトすることになる
可能性がある。しかし、該シフトは、本明細書で報告されている実験例、日常の実験およ
び／または三次元モデル化によって示されるように、簡単に測定される。
験的に測定することができおよび／またはタンパク質構造の三次元モデル化に基づいて予
測することができる。融合ポイントはＮ末端またはＣ末端を移動させるので、融合ポイン
トに近いタンパク質の第二および第三次構造に依存して、他の融合ポイントにより近くに
、あるいは該ポイントからより遠くに動きうるということは重要である。したがって、た
とえば、Ｃ末端方向へ（たとえば、残基１５０から残基１５５へＮ末端融合ポイントを）
動かすが、物理的にＣ末端融合ポイントに近いＮ末端融合ポイントとなる結果には必ずし
もならない。なぜなら、たとえば、その領域内のＮ末端残基は、Ｃ末端融合ポイントに向
かう、あるいは該ポイントから離れる方向を指す第二／第三次構造の一部であるかもしれ
ないからである。したがって、Ｎ末端融合ポイントをＮ末端またはＣ末端方向に動かす、
またはＣ末端融合ポイントをＮ末端またはＣ末端方向に動かすことによって、ふさわしい
リンカ長さの範囲内で、より長いまたはより短いリンカに向かってシフトすることになる
可能性がある。しかし、該シフトは、本明細書で報告されている実験例、日常の実験およ
び／または三次元モデル化によって示されるように、簡単に測定される。
【0087】
したがって、いくつかの実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼ系の二つのＩ－ＣｒｅＩ
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに関して、有用な可撓性リンカは、表３に示すように
、２５残基を超え、３１残基未満（間の全ての値を含む）の長さを有する。しかし、他の
実施形態では、リンカが広範囲にタンパク分解されず、単鎖メガヌクレアーゼが、本明細
書に記載する簡単なアッセイによって測定されるＤＮＡ結合および切断活性を保持すると
いう条件下で、有用な可撓性リンカは、異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットおよび／
または異なる融合ポイントを使用して、１５を超えおよび４０未満の残基（間の全ての値
を含む）の長さを有することができる。
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに関して、有用な可撓性リンカは、表３に示すように
、２５残基を超え、３１残基未満（間の全ての値を含む）の長さを有する。しかし、他の
実施形態では、リンカが広範囲にタンパク分解されず、単鎖メガヌクレアーゼが、本明細
書に記載する簡単なアッセイによって測定されるＤＮＡ結合および切断活性を保持すると
いう条件下で、有用な可撓性リンカは、異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットおよび／
または異なる融合ポイントを使用して、１５を超えおよび４０未満の残基（間の全ての値
を含む）の長さを有することができる。
【0088】
２．２．２ 単鎖メガヌクレアーゼ用に設計、構造化されたリンカ
長期間にわたって保存が十分安定でかつタンパク分解に対して十分な耐性がある、天然
の二量体酵素に匹敵するヌクレアーゼ活性を持つ単鎖Ｉ－ＣｒｅＩ系メガヌクレアーゼを
製造することを目的として、サブユニットを共有結合するために、安定な二次構造を有す
るリンカを使用することができる。タンパク質データバンク（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ
）検索では、Ｉ－ＣｒｅＩ中で認識されたＮおよびＣ末端融合ポイント間の長い距離（約
４８Å）にわたって広がるのに適したリンカを持つ、任意の構造的に特徴付けられたＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧタンパク質は、明らかにされなかった。したがって、二つのサブユニット
を結合するのに適した構造要素を持つことが期待される一組のリンカを製造するために、
タンパク質構造を管理する公知の最初の原理（たとえば、ＡｕｒｏｒａおよびＲｏｓｅ（
１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７：２１－３８、Ｆｅｒｓｈｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ １９９８）を使用した。具体的には、適切なリンカは、以下（Ｎ末端融
合ポイントからＣ末端融合ポイントまでを挙げる）を含むと仮定した。
長期間にわたって保存が十分安定でかつタンパク分解に対して十分な耐性がある、天然
の二量体酵素に匹敵するヌクレアーゼ活性を持つ単鎖Ｉ－ＣｒｅＩ系メガヌクレアーゼを
製造することを目的として、サブユニットを共有結合するために、安定な二次構造を有す
るリンカを使用することができる。タンパク質データバンク（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ
）検索では、Ｉ－ＣｒｅＩ中で認識されたＮおよびＣ末端融合ポイント間の長い距離（約
４８Å）にわたって広がるのに適したリンカを持つ、任意の構造的に特徴付けられたＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧタンパク質は、明らかにされなかった。したがって、二つのサブユニット
を結合するのに適した構造要素を持つことが期待される一組のリンカを製造するために、
タンパク質構造を管理する公知の最初の原理（たとえば、ＡｕｒｏｒａおよびＲｏｓｅ（
１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７：２１－３８、Ｆｅｒｓｈｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ １９９８）を使用した。具体的には、適切なリンカは、以下（Ｎ末端融
合ポイントからＣ末端融合ポイントまでを挙げる）を含むと仮定した。
【0089】
（１）ループ１．この構造要素は、Ｎ末端融合ポイントから始まり、それ自身の上でペ
プチド鎖の方向を逆転させる（１８０°ターン）。配列は、３～８アミノ酸が可能であり
、少なくとも一つのグリシン残基、いくつかの実施形態では、２～３グリシンを含みうる
。この構造要素は、「Ｃキャッピング」モチーフを導入することによって安定化すること
ができ、Ｉ－ＣｒｅＩのＣ末端αへリックスを終わらせ、後続のターンを開始する。へリ
ックス・キャップ・モチーフは、普通、へリックスの最終ターン中の疎水性アミノ酸で始
まるように記載される（ＡｕｒｏｒａおよびＲｏｓｅ（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ
ｃｉ．７：２１－３８）。Ｃキャップは、表４に挙げる形態の任意のものをとることがで
きる。
表中、ｈ＝疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ
、Ｔｈｒ、またはＣｙｓ）、ｐ＝極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌ
ｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）、ｎ＝β分岐していないアミノ酸（Ｖａｌ、Ｉｌ
ｅ、ＴｈｒまたはＰｒｏではない）、ｘ＝ｈまたはｐ基からの任意のアミノ酸、Ｇ＝グリ
シン、およびＰ＝プロリンである。Ｔｈｒは、その側鎖に、疎水性（メチル基）および極
性（水酸基）官能基の両方を持つので、ｈ基およびｐ基の両方に現れることに注意すべき
である。ハイフンは、αへリックスの末端を示し、ｈ１は、へリックスの最終ターンにお
ける疎水性アミノ酸（すなわち、Ｎ末端融合ポイントの前の疎水性アミノ酸、０～４個の
アミノ酸）である。Ｉ－ＣｒｅＩの場合、ｈ１は、普通、Ｖａｌ－１５１またはＬｅｕ－
１５２である。したがって、モチーフ７の例は、配列：Ｖ１５１Ｌ１５２Ｄ１５３Ｓ－Ｐ
ＧＳＶである（たとえば、表６、リンカ９参照）。
プチド鎖の方向を逆転させる（１８０°ターン）。配列は、３～８アミノ酸が可能であり
、少なくとも一つのグリシン残基、いくつかの実施形態では、２～３グリシンを含みうる
。この構造要素は、「Ｃキャッピング」モチーフを導入することによって安定化すること
ができ、Ｉ－ＣｒｅＩのＣ末端αへリックスを終わらせ、後続のターンを開始する。へリ
ックス・キャップ・モチーフは、普通、へリックスの最終ターン中の疎水性アミノ酸で始
まるように記載される（ＡｕｒｏｒａおよびＲｏｓｅ（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ
ｃｉ．７：２１－３８）。Ｃキャップは、表４に挙げる形態の任意のものをとることがで
きる。
【表4】
、Ｔｈｒ、またはＣｙｓ）、ｐ＝極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌ
ｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）、ｎ＝β分岐していないアミノ酸（Ｖａｌ、Ｉｌ
ｅ、ＴｈｒまたはＰｒｏではない）、ｘ＝ｈまたはｐ基からの任意のアミノ酸、Ｇ＝グリ
シン、およびＰ＝プロリンである。Ｔｈｒは、その側鎖に、疎水性（メチル基）および極
性（水酸基）官能基の両方を持つので、ｈ基およびｐ基の両方に現れることに注意すべき
である。ハイフンは、αへリックスの末端を示し、ｈ１は、へリックスの最終ターンにお
ける疎水性アミノ酸（すなわち、Ｎ末端融合ポイントの前の疎水性アミノ酸、０～４個の
アミノ酸）である。Ｉ－ＣｒｅＩの場合、ｈ１は、普通、Ｖａｌ－１５１またはＬｅｕ－
１５２である。したがって、モチーフ７の例は、配列：Ｖ１５１Ｌ１５２Ｄ１５３Ｓ－Ｐ
ＧＳＶである（たとえば、表６、リンカ９参照）。
【0090】
（２）αへリックス１．ループ１の後、リンカ中のこの最初のαへリックスが、約３０
Åの距離でタンパク質の外面上をＩ－ＣｒｅＩ中のＣ末端へリックス（アミノ酸１４４～
１５３）に対し逆平行に走るように設計される。このセグメントは、長さが１０－２０ア
ミノ酸であるべきで、ＮおよびＣキャッピングモチーフ（下方）の外側にグリシンアミノ
酸もプロリンアミノ酸も含むべきではなく、一つのへリックス面（疎水性面）はＮ末端Ｉ
－ＣｒｅＩサブユニットの面に対して埋められ、一方他の面は溶剤に触れるように、３～
４アミノ酸周期性を持つ疎水性および極性アミノ酸が交互に並んでいる。たとえば、該へ
リックスは、形態：ｐｐｈｐｐｈｈｐｐｈｐｐ（ここで、ｐは任意の極性アミノ酸であり
、ｈは任意の疎水性アミノ酸である）をとることができるが、配列：ＳＱＡＳＳＡＡＳＳ
ＡＳＳのようなグリシンでもプロリンでもない（たとえば、表６、リンカ９参照）。ペプ
チド配列の螺旋性向を測定するために、複数のアルゴリズムが利用可能であり（たとえば
、ＢＭＥＲＣ－ＰＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｂｍｅｒｃ－ｗｗｗ．ｂｕ．ｅｄｕ／ｐｓａ／、
ＮＮＰＲＥＤＩＣＴ，ｈｔｔｐ：／／ａｌｅｘａｎｄｅｒ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｕｃｓｆ．
ｅｄｕ／～ｎｏｍｉ／ｎｎｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ，
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｇ）、αヘリカル二次構造
への適用が期待できる適正な長さの配列を作るために、これらのどれでも使用することが
できる。あるいは、このへリックス配列は、既存の天然または設計されたタンパク質にお
いてαヘリカル二次構造を適用することが知られているペプチド配列に由来しうる。その
ようなペプチド配列の数多くの例が、タンパク質データバンク（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒ
ｇ）にある。
Åの距離でタンパク質の外面上をＩ－ＣｒｅＩ中のＣ末端へリックス（アミノ酸１４４～
１５３）に対し逆平行に走るように設計される。このセグメントは、長さが１０－２０ア
ミノ酸であるべきで、ＮおよびＣキャッピングモチーフ（下方）の外側にグリシンアミノ
酸もプロリンアミノ酸も含むべきではなく、一つのへリックス面（疎水性面）はＮ末端Ｉ
－ＣｒｅＩサブユニットの面に対して埋められ、一方他の面は溶剤に触れるように、３～
４アミノ酸周期性を持つ疎水性および極性アミノ酸が交互に並んでいる。たとえば、該へ
リックスは、形態：ｐｐｈｐｐｈｈｐｐｈｐｐ（ここで、ｐは任意の極性アミノ酸であり
、ｈは任意の疎水性アミノ酸である）をとることができるが、配列：ＳＱＡＳＳＡＡＳＳ
ＡＳＳのようなグリシンでもプロリンでもない（たとえば、表６、リンカ９参照）。ペプ
チド配列の螺旋性向を測定するために、複数のアルゴリズムが利用可能であり（たとえば
、ＢＭＥＲＣ－ＰＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｂｍｅｒｃ－ｗｗｗ．ｂｕ．ｅｄｕ／ｐｓａ／、
ＮＮＰＲＥＤＩＣＴ，ｈｔｔｐ：／／ａｌｅｘａｎｄｅｒ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｕｃｓｆ．
ｅｄｕ／～ｎｏｍｉ／ｎｎｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ，
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｇ）、αヘリカル二次構造
への適用が期待できる適正な長さの配列を作るために、これらのどれでも使用することが
できる。あるいは、このへリックス配列は、既存の天然または設計されたタンパク質にお
いてαヘリカル二次構造を適用することが知られているペプチド配列に由来しうる。その
ようなペプチド配列の数多くの例が、タンパク質データバンク（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒ
ｇ）にある。
【0091】
さらに、その構造を安定化するために、Ｎキャッピングモチーフを持つαへリックスか
ら開始することが望ましいこともある（ＡｕｒｏｒａおよびＲｏｓｅ（１９９８），Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７：２１－３８）。このモチーフは、ループ－αへリックス接合点
に広がり、普通、表５に示される形態の一つを有する。
表中、記号は、先の表４と同じであり、ハイフンは、ループとへリックスとの間の接合
点を表わす。モチーフ番号２の例は、配列：Ｌ－ＳＰＳＱＡである（たとえば、表６、リ
ンカ９参照）。
ら開始することが望ましいこともある（ＡｕｒｏｒａおよびＲｏｓｅ（１９９８），Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７：２１－３８）。このモチーフは、ループ－αへリックス接合点
に広がり、普通、表５に示される形態の一つを有する。
【表5】
表中、記号は、先の表４と同じであり、ハイフンは、ループとへリックスとの間の接合
点を表わす。モチーフ番号２の例は、配列：Ｌ－ＳＰＳＱＡである（たとえば、表６、リ
ンカ９参照）。
【0092】
（３）ターン１．αへリックス１の後、ペプチド鎖の全配向を、αへリックス１の配向
に対して約９０°曲げるために、短い、可撓性ペプチド配列が導入される。この配列は、
長さが３～８アミノ酸であってもよく、１、またはいくつかの実施形態では、２～３グリ
シンを含みうる。また、この配列は、αへリックス１を安定化し、ターンを開始するため
に、表４のモチーフの１つのようなＣキャップを含むこともできる。例示として、Ｃキャ
ッピングモチーフ番号６に一致する配列：ＡＳＳＳ－ＰＧＳＧＩがある（たとえば、表６
、リンカ９参照）。この場合、配列：ＡＳＳＳは、αへリックス１の最終ターンであり、
一方配列：ＰＧＳＧＩはターン１である。
に対して約９０°曲げるために、短い、可撓性ペプチド配列が導入される。この配列は、
長さが３～８アミノ酸であってもよく、１、またはいくつかの実施形態では、２～３グリ
シンを含みうる。また、この配列は、αへリックス１を安定化し、ターンを開始するため
に、表４のモチーフの１つのようなＣキャップを含むこともできる。例示として、Ｃキャ
ッピングモチーフ番号６に一致する配列：ＡＳＳＳ－ＰＧＳＧＩがある（たとえば、表６
、リンカ９参照）。この場合、配列：ＡＳＳＳは、αへリックス１の最終ターンであり、
一方配列：ＰＧＳＧＩはターン１である。
【0093】
（４）αへリックス２．このヘリックスは、ターン１の後に続き、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ
サブユニット間の境界面に作られた溝中のＩ－ＣｒｅＩの面に存在するように設計される
。この溝の面は、本質的に、Ｎ末端サブユニットのアミノ酸９４～１００および１３４～
１３９、ならびにＣ末端サブユニットのアミノ酸４８～６１を含む。
サブユニット間の境界面に作られた溝中のＩ－ＣｒｅＩの面に存在するように設計される
。この溝の面は、本質的に、Ｎ末端サブユニットのアミノ酸９４～１００および１３４～
１３９、ならびにＣ末端サブユニットのアミノ酸４８～６１を含む。
【0094】
αへリックス２は、αへリックス１より短くなるように設計することができ、該へリッ
クス（４～１２個のアミノ酸）のターンを１～３つ含むことができる。αへリックス２は
、αへリックス１と同じ全アミノ酸組成を有することができ、表５のＮキャッピングモチ
ーフの追加によって安定化することもできる。配列：Ｉ－ＳＥＡＬＲは、Ｎキャッピング
モチーフ番号１と一致する例（たとえば、表６、リンカ９）である。リンカ９は、約二つ
のターンを作ることが予測される配列：ＳＥＡＬＲＡを含む、比較的短いαへリックス２
を取込む。異なるリンカαへリックス２配列に関する実験により、リンカのこの領域での
ヘリカルレジスタの重要性が実証されている。グリシンアミノ酸を用いてαへリックス２
の停止前の単一アミノ酸（たとえば、Ａ、リンカ１１）、二つのアミノ酸（たとえば、Ａ
Ｓ、リンカ１２）、あるいは三つのアミノ酸（たとえば、ＡＳＳ、リンカ１３）を付加す
ることにより、不安定で、Ｅ．ｃｏｌｉからの精製ですぐに析出する単鎖Ｉ－ＣｒｅＩタ
ンパク質（表６）となる可能性がある。対照的に、一つの追加の完全ターンを作り、ヘリ
カルレジスタをリンカ１のものに回復することが予測される、四つのアミノ酸（たとえば
、ＡＳＳＡ、リンカ１４）の付加は、安定で活性である。
クス（４～１２個のアミノ酸）のターンを１～３つ含むことができる。αへリックス２は
、αへリックス１と同じ全アミノ酸組成を有することができ、表５のＮキャッピングモチ
ーフの追加によって安定化することもできる。配列：Ｉ－ＳＥＡＬＲは、Ｎキャッピング
モチーフ番号１と一致する例（たとえば、表６、リンカ９）である。リンカ９は、約二つ
のターンを作ることが予測される配列：ＳＥＡＬＲＡを含む、比較的短いαへリックス２
を取込む。異なるリンカαへリックス２配列に関する実験により、リンカのこの領域での
ヘリカルレジスタの重要性が実証されている。グリシンアミノ酸を用いてαへリックス２
の停止前の単一アミノ酸（たとえば、Ａ、リンカ１１）、二つのアミノ酸（たとえば、Ａ
Ｓ、リンカ１２）、あるいは三つのアミノ酸（たとえば、ＡＳＳ、リンカ１３）を付加す
ることにより、不安定で、Ｅ．ｃｏｌｉからの精製ですぐに析出する単鎖Ｉ－ＣｒｅＩタ
ンパク質（表６）となる可能性がある。対照的に、一つの追加の完全ターンを作り、ヘリ
カルレジスタをリンカ１のものに回復することが予測される、四つのアミノ酸（たとえば
、ＡＳＳＡ、リンカ１４）の付加は、安定で活性である。
【0095】
（５）ループ２．このループは、αへリックス２を停止し、Ｃ末端融合ポイントで、Ｃ
末端Ｉ－ＣｒｅＩサブユニットと結合するために、ペプチド鎖をそれ自身の上で逆転させ
る。ループ１のように、この配列は、長さが３～８アミノ酸とすることができ、一つ以上
のグリシンを含みうる。また、αへリックス２を安定化するために、表４のＣキャッピン
グモチーフを含みうる。たとえば、リンカ９からの配列：ＡＬＲＡ－ＧＡは、Ｃキャッピ
ングモチーフ番号１と一致する。さらに、このセグメントは、Ｃ末端Ｉ－ＣｒｅＩサブユ
ニットのＮ末端αへリックス（アミノ酸７～２０）上で、Ｎキャップを開始することがで
きる。たとえば、リンカ９からの配列：Ｔ－ＫＳＫ７Ｅ８Ｆ９は、Ｎキャッピングモチー
フ番号２と一致する。この場合、Ｃ末端融合ポイントはＬｙｓ－７である。他の場合、融
合ポイントを第２サブユニット（たとえば、アミノ酸８または９）にさらに移動させるこ
とができ、場合によっては、１～２アミノ酸をループ２に付加することで、Ｃ末端融合ポ
イントを移動させるように、ヘリカルレジスタの変化を補う。たとえば、以下の表６のリ
ンカ１５～２３は、Ｃ末端融合ポイントとしてＧｌｕ－８を有し、全て、リンカ１～６に
対しループ２内に追加のアミノ酸を有する。
末端Ｉ－ＣｒｅＩサブユニットと結合するために、ペプチド鎖をそれ自身の上で逆転させ
る。ループ１のように、この配列は、長さが３～８アミノ酸とすることができ、一つ以上
のグリシンを含みうる。また、αへリックス２を安定化するために、表４のＣキャッピン
グモチーフを含みうる。たとえば、リンカ９からの配列：ＡＬＲＡ－ＧＡは、Ｃキャッピ
ングモチーフ番号１と一致する。さらに、このセグメントは、Ｃ末端Ｉ－ＣｒｅＩサブユ
ニットのＮ末端αへリックス（アミノ酸７～２０）上で、Ｎキャップを開始することがで
きる。たとえば、リンカ９からの配列：Ｔ－ＫＳＫ７Ｅ８Ｆ９は、Ｎキャッピングモチー
フ番号２と一致する。この場合、Ｃ末端融合ポイントはＬｙｓ－７である。他の場合、融
合ポイントを第２サブユニット（たとえば、アミノ酸８または９）にさらに移動させるこ
とができ、場合によっては、１～２アミノ酸をループ２に付加することで、Ｃ末端融合ポ
イントを移動させるように、ヘリカルレジスタの変化を補う。たとえば、以下の表６のリ
ンカ１５～２３は、Ｃ末端融合ポイントとしてＧｌｕ－８を有し、全て、リンカ１～６に
対しループ２内に追加のアミノ酸を有する。
【0096】
先に記載した原理を使用して、表６に概要を述べたリンカの組を発現させた。ＬＡＭ１
サブユニットとＬＡＭ２サブユニットとの間にリンカを取込む一組の単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメ
ガヌクレアーゼを構築し、それぞれについて、ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド認識配列
に対する活性を試験した。全ての場合で、Ｎ末端融合ポイントはＬＡＭ１のＡｓｐ－１５
３であり、Ｃ末端融合ポイントは、ＬＡＭ２のＬｙｓ－７またはＧｌｕ－８（「ＣＦＰ」
カラム中で表示される）のどちらかであった。切断活性を、－：活性は検出不能、＋：最
小活性、＋＋：中程度の活性、＋＋＋：エンドヌクレアーゼ精製前にＥ．ｃｏｌｉ中で二
つの単量体を共発現することにより製造したＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体に匹敵する
活性の四点スケールで評価した。精製直後、単鎖メガヌクレアーゼを遠心（２１００ｇ１
０分間）し、沈殿したタンパク質（構造不安定性を示す）をペレット化し、観測した沈殿
物の量（ｐｐｔ）をスコア化した。－：沈殿なし、＋：僅かに沈殿、＋＋：有意に沈殿。
有意な程度まで沈殿したタンパク質サンプルは、切断活性に関してアッセイできなかった
。
サブユニットとＬＡＭ２サブユニットとの間にリンカを取込む一組の単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメ
ガヌクレアーゼを構築し、それぞれについて、ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド認識配列
に対する活性を試験した。全ての場合で、Ｎ末端融合ポイントはＬＡＭ１のＡｓｐ－１５
３であり、Ｃ末端融合ポイントは、ＬＡＭ２のＬｙｓ－７またはＧｌｕ－８（「ＣＦＰ」
カラム中で表示される）のどちらかであった。切断活性を、－：活性は検出不能、＋：最
小活性、＋＋：中程度の活性、＋＋＋：エンドヌクレアーゼ精製前にＥ．ｃｏｌｉ中で二
つの単量体を共発現することにより製造したＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体に匹敵する
活性の四点スケールで評価した。精製直後、単鎖メガヌクレアーゼを遠心（２１００ｇ１
０分間）し、沈殿したタンパク質（構造不安定性を示す）をペレット化し、観測した沈殿
物の量（ｐｐｔ）をスコア化した。－：沈殿なし、＋：僅かに沈殿、＋＋：有意に沈殿。
有意な程度まで沈殿したタンパク質サンプルは、切断活性に関してアッセイできなかった
。
【表6】
【0097】
単鎖メガヌクレアーゼでは、１１～１３および２３（これらは調べなかった）以外のこ
れらのリンカのそれぞれは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で所望の分子量（約４０キロダルト
ン）の単一バンドとして走り、リンカ配列のタンパク質分解切断に対して抵抗性があるこ
とを示していた。少なくとも一つのケース（リンカ９）では、単鎖ＬＡＭメガヌクレアー
ゼを、切断活性の劣化または喪失のいかなる証拠もなしに、４℃で４週間を超えて保存す
ることができた。さらに、数多くの単鎖ＬＡＭエンドヌクレアーゼ（９、１０および１４
）は、精製ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体に匹敵する効率で、ハイブリッドＬＡＭ１／
ＬＡＭ２認識配列を切断し、これらのリンカを使用してＩ－ＣｒｅＩサブユニットを融合
することで、エンドヌクレアーゼ活性は大きく損なわれないことが示された（実施例２参
照）。
れらのリンカのそれぞれは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で所望の分子量（約４０キロダルト
ン）の単一バンドとして走り、リンカ配列のタンパク質分解切断に対して抵抗性があるこ
とを示していた。少なくとも一つのケース（リンカ９）では、単鎖ＬＡＭメガヌクレアー
ゼを、切断活性の劣化または喪失のいかなる証拠もなしに、４℃で４週間を超えて保存す
ることができた。さらに、数多くの単鎖ＬＡＭエンドヌクレアーゼ（９、１０および１４
）は、精製ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体に匹敵する効率で、ハイブリッドＬＡＭ１／
ＬＡＭ２認識配列を切断し、これらのリンカを使用してＩ－ＣｒｅＩサブユニットを融合
することで、エンドヌクレアーゼ活性は大きく損なわれないことが示された（実施例２参
照）。
【0098】
精製ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体（これは、実際、ホモおよびヘテロ二量体の混合
物）とは全く対照的に、表６のリンカを導入する単鎖ＬＡＭメガヌクレアーゼは、パリン
ドローム性配列のどれよりも、ハイブリッド部位をより高い効率で切断する（実施例２参
照）。パリンドローム性配列は、普通、ハイブリッド部位に対して＜５％の効率で切断さ
れる。この予想外のパリンドローム性ＤＮＡ部位の切断は、（１）一対の異なる単鎖タン
パク質からのＬＡＭ１またはＬＡＭ２サブユニットのホモ二量体化、（２）単鎖メガヌク
レアーゼ内の単一サブユニット（ＬＡＭ１またはＬＡＭ２）によるパリンドローム性配列
の両鎖の逐次ニッキング、または（３）単鎖メガヌクレアーゼをその個々のサブユニット
にタンパク質分解切断された後に形成される、僅かな量のホモ二量体ＬＡＭ１またはＬＡ
Ｍ２のためであろう（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果は、この後の説明をなさそうにするが）。単
鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼは、パリンドローム性ＤＮＡ部位に対するある活性を維
持するが、該活性は、ハイブリッド部位のほうに非常に大きく偏り、この取組みは今ある
方法を超えて、非常に大きな重要性を示す。
物）とは全く対照的に、表６のリンカを導入する単鎖ＬＡＭメガヌクレアーゼは、パリン
ドローム性配列のどれよりも、ハイブリッド部位をより高い効率で切断する（実施例２参
照）。パリンドローム性配列は、普通、ハイブリッド部位に対して＜５％の効率で切断さ
れる。この予想外のパリンドローム性ＤＮＡ部位の切断は、（１）一対の異なる単鎖タン
パク質からのＬＡＭ１またはＬＡＭ２サブユニットのホモ二量体化、（２）単鎖メガヌク
レアーゼ内の単一サブユニット（ＬＡＭ１またはＬＡＭ２）によるパリンドローム性配列
の両鎖の逐次ニッキング、または（３）単鎖メガヌクレアーゼをその個々のサブユニット
にタンパク質分解切断された後に形成される、僅かな量のホモ二量体ＬＡＭ１またはＬＡ
Ｍ２のためであろう（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果は、この後の説明をなさそうにするが）。単
鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼは、パリンドローム性ＤＮＡ部位に対するある活性を維
持するが、該活性は、ハイブリッド部位のほうに非常に大きく偏り、この取組みは今ある
方法を超えて、非常に大きな重要性を示す。
【0099】
３．Ｉ－ＭｓｏＩに由来する単鎖メガヌクレアーゼ
Ｉ－ＭｓｏＩは、Ｉ－ＣｒｅＩに近い構造的同族体であり、このメガヌクレアーゼのＤ
ＮＡ結合特異性を再設計するために、類似の方法が存在している（国際公開公報第２００
７／０４７８５９号）。先に挙げた単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの製造方法は、Ｉ
－ＭｓｏＩに直接適用することができる。Ｉ－ＭｓｏＩのアミノ酸Ｐｈｅ－１６０、Ｌｅ
ｕ－１６１およびＬｙｓ－１６２は、それぞれ、Ｉ－ＣｒｅＩのＶａｌ－１５１、Ｌｅｕ
－１５２およびＡｓｐ－１５３と、構造的に相同性がある。したがって、これらのアミノ
酸を、Ｉ－ＭｓｏＩ用のＮ末端融合ポイントとして選択することができる。さらに、Ｉ－
ＭｓｏＩのＸ線結晶構造により、アミノ酸１６１～１６６は、自然にＣ－キャップとして
作用し、ペプチド鎖の方向を逆転するタンパク質のＣ末端でターンを開始することが明ら
かである。したがって、ループ１のＣキャップ部分を取除くために、リンカをそのＮ末端
で縮められれば、Ｉｌｅ－６６を、Ｎ末端融合ポイントとして選択することができる。Ｉ
－ＭｓｏＩのＰｒｏ－９、Ｔｈｒ－１０およびＧｌｕ－１１は、それぞれ、Ｉ－ＣｒｅＩ
のＬｙｓ－７、Ｇｌｕ－８およびＰｈｅ－９と、構造的に相同性があり、Ｉ－ＭｓｏＩに
関するＣ末端融合ポイントとして選択することができる（表７）。さらに、Ｉ－ＭｓｏＩ
の配列：Ｌ７Ｑ８Ｐ９Ｔ１０Ｅ１１Ａ１２は、天然Ｎ－キャップ（表５のモチーフ２）を
形成するので、Ｌｅｕ－７を、融合ポイントとして挙げることができる。
Ｉ－ＭｓｏＩは、Ｉ－ＣｒｅＩに近い構造的同族体であり、このメガヌクレアーゼのＤ
ＮＡ結合特異性を再設計するために、類似の方法が存在している（国際公開公報第２００
７／０４７８５９号）。先に挙げた単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの製造方法は、Ｉ
－ＭｓｏＩに直接適用することができる。Ｉ－ＭｓｏＩのアミノ酸Ｐｈｅ－１６０、Ｌｅ
ｕ－１６１およびＬｙｓ－１６２は、それぞれ、Ｉ－ＣｒｅＩのＶａｌ－１５１、Ｌｅｕ
－１５２およびＡｓｐ－１５３と、構造的に相同性がある。したがって、これらのアミノ
酸を、Ｉ－ＭｓｏＩ用のＮ末端融合ポイントとして選択することができる。さらに、Ｉ－
ＭｓｏＩのＸ線結晶構造により、アミノ酸１６１～１６６は、自然にＣ－キャップとして
作用し、ペプチド鎖の方向を逆転するタンパク質のＣ末端でターンを開始することが明ら
かである。したがって、ループ１のＣキャップ部分を取除くために、リンカをそのＮ末端
で縮められれば、Ｉｌｅ－６６を、Ｎ末端融合ポイントとして選択することができる。Ｉ
－ＭｓｏＩのＰｒｏ－９、Ｔｈｒ－１０およびＧｌｕ－１１は、それぞれ、Ｉ－ＣｒｅＩ
のＬｙｓ－７、Ｇｌｕ－８およびＰｈｅ－９と、構造的に相同性があり、Ｉ－ＭｓｏＩに
関するＣ末端融合ポイントとして選択することができる（表７）。さらに、Ｉ－ＭｓｏＩ
の配列：Ｌ７Ｑ８Ｐ９Ｔ１０Ｅ１１Ａ１２は、天然Ｎ－キャップ（表５のモチーフ２）を
形成するので、Ｌｅｕ－７を、融合ポイントとして挙げることができる。
【表7】
【0100】
表３または６中のリンカはどれも、単鎖Ｉ－ＭｓｏＩエンドヌクレアーゼの製造に使用
することができる。たとえば、Ｌｙｓ－１６２およびＰｒｏ－９を融合ポイントとして使
用して一対のＩ－ＭｓｏＩサブユニットを機能的単鎖メガヌクレアーゼに結合するために
、表６のリンカ９を使用してもよい。一実施形態では、プロリンは構造的に制約されてい
るので、Ｐｒｏ－９を異なるアミノ酸（たとえば、アラニンまたはグリシン）に変える。
これは、Ｔｈｒ－１０をＣ末端融合ポイントとして選択すること、および表３または６に
列挙されたリンカのＣ末端への付加的アミノ酸を付加することと類似している。たとえば
、表８のリンカ２６および２７は、Ｃ末端での単一アミノ酸の付加を除いて表６のリンカ
９と同一であり、Ｃ末端融合ポイントにおいてＰｒｏ－９（Ｉ－ＣｒｅＩ Ｌｙｓ－７と
構造的に相同性のある）からＴｈｒ－１０（Ｉ－ＣｒｅＩ Ｇｌｕ－８に構造的に相同性
のある）への変化する原因となる。
することができる。たとえば、Ｌｙｓ－１６２およびＰｒｏ－９を融合ポイントとして使
用して一対のＩ－ＭｓｏＩサブユニットを機能的単鎖メガヌクレアーゼに結合するために
、表６のリンカ９を使用してもよい。一実施形態では、プロリンは構造的に制約されてい
るので、Ｐｒｏ－９を異なるアミノ酸（たとえば、アラニンまたはグリシン）に変える。
これは、Ｔｈｒ－１０をＣ末端融合ポイントとして選択すること、および表３または６に
列挙されたリンカのＣ末端への付加的アミノ酸を付加することと類似している。たとえば
、表８のリンカ２６および２７は、Ｃ末端での単一アミノ酸の付加を除いて表６のリンカ
９と同一であり、Ｃ末端融合ポイントにおいてＰｒｏ－９（Ｉ－ＣｒｅＩ Ｌｙｓ－７と
構造的に相同性のある）からＴｈｒ－１０（Ｉ－ＣｒｅＩ Ｇｌｕ－８に構造的に相同性
のある）への変化する原因となる。
【0101】
別の実施形態では、実施例４に記載するように、Ｉ－１６６がＮ末端融合ポイントとし
て選択され、Ｌｅｕ－７がＣ末端融合ポイントとして選択される、表８のリンカ２８～３
０から選択されるリンカ配列を使用して、Ｉ－Ｍｓｏに由来する単鎖メガヌクレアーゼの
製造を成功させることもできる。Ｉ－１６６がＮ末端融合ポイントとして選択されるので
、ループ１のＣキャップ部分（表６の各リンカの最初の６個のアミノ酸に対応する）を移
動させることができる。さらに、リンカ２８－３０のαへリックス１は、表６に挙げられ
るリンカに対して、へリックスの追加の１ターンに対応する３個のアミノ酸（ＡＡＳ、表
８中の下線部）で延長される。リンカ２８－３０および特定の融合ポイントを使用して、
一対のＩ－Ｍｓｏ－由来サブユニットを含む、プロテアーゼ－耐性型の高活性単鎖メガヌ
クレアーゼを製造することが可能である（実施例４参照）。
て選択され、Ｌｅｕ－７がＣ末端融合ポイントとして選択される、表８のリンカ２８～３
０から選択されるリンカ配列を使用して、Ｉ－Ｍｓｏに由来する単鎖メガヌクレアーゼの
製造を成功させることもできる。Ｉ－１６６がＮ末端融合ポイントとして選択されるので
、ループ１のＣキャップ部分（表６の各リンカの最初の６個のアミノ酸に対応する）を移
動させることができる。さらに、リンカ２８－３０のαへリックス１は、表６に挙げられ
るリンカに対して、へリックスの追加の１ターンに対応する３個のアミノ酸（ＡＡＳ、表
８中の下線部）で延長される。リンカ２８－３０および特定の融合ポイントを使用して、
一対のＩ－Ｍｓｏ－由来サブユニットを含む、プロテアーゼ－耐性型の高活性単鎖メガヌ
クレアーゼを製造することが可能である（実施例４参照）。
【表8】
【0102】
４．Ｉ－ＣｅｕＩに由来する単鎖メガヌクレアーゼ
Ｉ－ＣｅｕＩは、Ｉ－ＣｒｅＩに構造的に近い同族体であり、このメガヌクレアーゼの
ＤＮＡ結合特異性を再設計する類似の方法が存在している（国際公開公報第２００７／０
４７８５９号）。先に挙げた単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの製造方法は、Ｉ－Ｃｅ
ｕＩに直接適用することができる。Ｉ－ＣｅｕＩのアミノ酸Ａｌａ－２１０、Ａｒｇ－２
１１およびＡｓｎ－２１２は、それぞれ、Ｉ－ＣｒｅＩのＶａｌ－１５１、Ｌｅｕ－１５
２およびＡｓｐ－１５３と構造的に相同性がある。したがって、これらのアミノ酸を、Ｉ
－ＣｅｕＩ用のＮ末端融合ポイントとして選択することができる。Ｉ－ＣｅｕＩのＳｅｒ
－５３、Ｇｌｕ－５４およびＳｅｒ－５５は、それぞれ、Ｉ－ＣｒｅＩのＬｙｓ－７、Ｇ
ｌｕ－８およびＰｈｅ－９と構造的に相同性があり、Ｉ－ＣｅｕＩ用のＣ末端融合ポイン
トとして選択しうる（表９）。
Ｉ－ＣｅｕＩは、Ｉ－ＣｒｅＩに構造的に近い同族体であり、このメガヌクレアーゼの
ＤＮＡ結合特異性を再設計する類似の方法が存在している（国際公開公報第２００７／０
４７８５９号）。先に挙げた単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの製造方法は、Ｉ－Ｃｅ
ｕＩに直接適用することができる。Ｉ－ＣｅｕＩのアミノ酸Ａｌａ－２１０、Ａｒｇ－２
１１およびＡｓｎ－２１２は、それぞれ、Ｉ－ＣｒｅＩのＶａｌ－１５１、Ｌｅｕ－１５
２およびＡｓｐ－１５３と構造的に相同性がある。したがって、これらのアミノ酸を、Ｉ
－ＣｅｕＩ用のＮ末端融合ポイントとして選択することができる。Ｉ－ＣｅｕＩのＳｅｒ
－５３、Ｇｌｕ－５４およびＳｅｒ－５５は、それぞれ、Ｉ－ＣｒｅＩのＬｙｓ－７、Ｇ
ｌｕ－８およびＰｈｅ－９と構造的に相同性があり、Ｉ－ＣｅｕＩ用のＣ末端融合ポイン
トとして選択しうる（表９）。
【表9】
【0103】
表３または６中のいずれのリンカも、単鎖Ｉ－ＣｅｕＩエンドヌクレアーゼの製造に効
果的である可能性がある。たとえば、Ｉ－ＣｅｕＩサブユニットは、Ａｓｎ－２１２をＮ
末端融合ポイントとして、Ｓｅｒ－５３をＣ末端融合ポイントとして使用して、表６のリ
ンカ９によって結合しうる。
果的である可能性がある。たとえば、Ｉ－ＣｅｕＩサブユニットは、Ａｓｎ－２１２をＮ
末端融合ポイントとして、Ｓｅｒ－５３をＣ末端融合ポイントとして使用して、表６のリ
ンカ９によって結合しうる。
【0104】
Ｉ－ＣｅｕＩ用に選択されたＣ末端融合ポイントは、アミノ酸１～５２をＣ末端Ｉ－Ｃ
ｅｕＩサブユニットから除去する結果となる。構造分析（Ｓｐｉｅｇｅｌら（２００６）
，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１４：８６９－８８０）は、これらのアミノ酸が、Ｉ－ＣｅｕＩの
面に静止し、アミノ酸９４～１２３により提供される疎水性表面積の相当量を埋める、構
造ドメインを形成することを明らかにする。したがって、このＮ末端ドメインの除去によ
り、単鎖メガヌクレアーゼ中のＣ末端Ｉ－ＣｅｕＩサブユニットが不安定化される可能性
がある。この可能性を軽減するため、このＮ末端ドメインの除去によって、曝される疎水
性アミノ酸を極性アミノ酸に突然変異させることができる（たとえば、β分岐状ではない
疎水性アミノ酸をＳｅｒに突然変異させることができ、一方β分岐状の疎水性アミノ酸を
Ｔｈｒに突然変異させることができる）。たとえば、Ｌｅｕ－１０１、Ｔｙｒ－１０２、
Ｌｅｕ－１０５、Ａｌａ－１２１およびＬｅｕ－１２３をＳｅｒに突然変異させることが
でき、一方、Ｖａｌ－９５、Ｖａｌ－９８およびＩｌｅ－１１３をＴｈｒに突然変異させ
ることができる。
ｅｕＩサブユニットから除去する結果となる。構造分析（Ｓｐｉｅｇｅｌら（２００６）
，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１４：８６９－８８０）は、これらのアミノ酸が、Ｉ－ＣｅｕＩの
面に静止し、アミノ酸９４～１２３により提供される疎水性表面積の相当量を埋める、構
造ドメインを形成することを明らかにする。したがって、このＮ末端ドメインの除去によ
り、単鎖メガヌクレアーゼ中のＣ末端Ｉ－ＣｅｕＩサブユニットが不安定化される可能性
がある。この可能性を軽減するため、このＮ末端ドメインの除去によって、曝される疎水
性アミノ酸を極性アミノ酸に突然変異させることができる（たとえば、β分岐状ではない
疎水性アミノ酸をＳｅｒに突然変異させることができ、一方β分岐状の疎水性アミノ酸を
Ｔｈｒに突然変異させることができる）。たとえば、Ｌｅｕ－１０１、Ｔｙｒ－１０２、
Ｌｅｕ－１０５、Ａｌａ－１２１およびＬｅｕ－１２３をＳｅｒに突然変異させることが
でき、一方、Ｖａｌ－９５、Ｖａｌ－９８およびＩｌｅ－１１３をＴｈｒに突然変異させ
ることができる。
【0105】
あるいは、Ｃ末端Ｉ－ＣｅｕＩサブユニットのＮ末端ドメインを、大部分、無処理のま
ま残し、トランケートされたリンカを介してＮ末端サブユニットに結合することができる
。これは、Ｃ末端融合ポイントとしてＬｙｓ－７、Ｐｒｏ－８、Ｇｌｙ－９またはＧｌｕ
－１０を使用して、達成することができる。該リンカは、その長さ（すなわち、（ＧＳＳ
）４Ｇまたは（ＧＳＳ）５Ｇ）の約５０％までトランケートされた、可撓性Ｇｌｙ－Ｓｅ
ｒリンカ（たとえば、表３のリンカ）でありえる。あるいは、該リンカは、ターン１内で
トランケートされた表６のリンカのいずれであってもよい。したがって、例として、表６
のリンカ９を使用して、単鎖Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼを以下の組成で作ることがで
きる。
Ｎ末端サブユニットＮ２Ｉ２－ＳＬＰＧＳＶＧＧＬＳＰＳＱＡＳＳＡＡＳＳＡＳＳＳＰ
ＧＳ－Ｇ９Ｃ末端サブユニット
ま残し、トランケートされたリンカを介してＮ末端サブユニットに結合することができる
。これは、Ｃ末端融合ポイントとしてＬｙｓ－７、Ｐｒｏ－８、Ｇｌｙ－９またはＧｌｕ
－１０を使用して、達成することができる。該リンカは、その長さ（すなわち、（ＧＳＳ
）４Ｇまたは（ＧＳＳ）５Ｇ）の約５０％までトランケートされた、可撓性Ｇｌｙ－Ｓｅ
ｒリンカ（たとえば、表３のリンカ）でありえる。あるいは、該リンカは、ターン１内で
トランケートされた表６のリンカのいずれであってもよい。したがって、例として、表６
のリンカ９を使用して、単鎖Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼを以下の組成で作ることがで
きる。
Ｎ末端サブユニットＮ２Ｉ２－ＳＬＰＧＳＶＧＧＬＳＰＳＱＡＳＳＡＡＳＳＡＳＳＳＰ
ＧＳ－Ｇ９Ｃ末端サブユニット
【0106】
５．二種の異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリメンバに由来する単鎖メガヌクレアーゼ
また、本発明により、サブユニットのそれぞれが異なる天然ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメイ
ンに由来する単鎖メガヌクレアーゼの製造も可能になる。本明細書で記載される「異なる
」は、同じ天然ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリメンバに由来しないＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブ
ユニットを言う。したがって、本明細書で使用されるように、同じファミリメンバから合
理的に設計されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニット（たとえば、ＤＮＡ切断特異性に関し
て遺伝子操作されている、二つのＩ－ＣｒｅＩサブユニット）は、「異なる」とは考えな
い。具体的には、本発明は、異なるモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ、または
ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインのどちら
かに由来するＣ末端サブユニットに結合するモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ
（たとえば、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩまたはＩ－ＣｅｕＩ）に由来するＮ末端サブユ
ニットを含む、単鎖メガヌクレアーゼの製造を可能にする。たとえば、ＤＮＡ認識部位特
異性に関して合理的に設計されていても、されていなくてもよいＣ末端Ｉ－ＭｓｏＩサブ
ユニットに結合するＮ末端Ｉ－ＣｒｅＩサブユニット（これも、ＤＮＡ認識部位特異性に
関して合理的に設計されていても、されていなくてもよい）を含む単鎖メガヌクレアーゼ
を製造することができる。
また、本発明により、サブユニットのそれぞれが異なる天然ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメイ
ンに由来する単鎖メガヌクレアーゼの製造も可能になる。本明細書で記載される「異なる
」は、同じ天然ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリメンバに由来しないＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブ
ユニットを言う。したがって、本明細書で使用されるように、同じファミリメンバから合
理的に設計されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニット（たとえば、ＤＮＡ切断特異性に関し
て遺伝子操作されている、二つのＩ－ＣｒｅＩサブユニット）は、「異なる」とは考えな
い。具体的には、本発明は、異なるモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ、または
ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインのどちら
かに由来するＣ末端サブユニットに結合するモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ
（たとえば、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩまたはＩ－ＣｅｕＩ）に由来するＮ末端サブユ
ニットを含む、単鎖メガヌクレアーゼの製造を可能にする。たとえば、ＤＮＡ認識部位特
異性に関して合理的に設計されていても、されていなくてもよいＣ末端Ｉ－ＭｓｏＩサブ
ユニットに結合するＮ末端Ｉ－ＣｒｅＩサブユニット（これも、ＤＮＡ認識部位特異性に
関して合理的に設計されていても、されていなくてもよい）を含む単鎖メガヌクレアーゼ
を製造することができる。
【0107】
Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩおよびＩ－ＣｅｕＩの場合、望ましい融合ポイントおよび
リンカは先に記載した通りである。たとえば、単鎖Ｉ－ＣｒｅＩからＩ－ＭｓｏＩ融合は
、Ｉ－ＣｒｅＩ Ａｓｐ－１５３をＩ－ＭｓｏＩ Ｔｈｒ－１０に結合するため、表６の
リンカ９を使用して製造することができる。表９は、ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレ
アーゼＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩおよびＩ－ＡｎｉＩからの個々のＬＡＧＬＩＤＡＤＧ
ドメイン用の可能性のあるＣ末端融合ポイントを列挙する。
リンカは先に記載した通りである。たとえば、単鎖Ｉ－ＣｒｅＩからＩ－ＭｓｏＩ融合は
、Ｉ－ＣｒｅＩ Ａｓｐ－１５３をＩ－ＭｓｏＩ Ｔｈｒ－１０に結合するため、表６の
リンカ９を使用して製造することができる。表９は、ジ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレ
アーゼＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩおよびＩ－ＡｎｉＩからの個々のＬＡＧＬＩＤＡＤＧ
ドメイン用の可能性のあるＣ末端融合ポイントを列挙する。
【表10】
【0108】
表７、９および１０に列挙された融合ポイントは、問題になっているメガヌクレアーゼ
と、Ｉ－ＣｒｅＩ融合ポイントに構造的に相同性のあるアミノ酸位置が同定されたＩ－Ｃ
ｒｅＩとの間の構造比較に基づいている。また、融合ポイントは、Ｉ－ＣｒｅＩに対する
タンパク質配列アラインメントを使用して、構造的に特徴付けられていないＬＡＧＬＩＤ
ＡＤＧサブユニットにおいても同定することができる。これは、保存ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ
モチーフの位置に基づき、任意のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットにおいて簡単に同定す
ることができるＣ末端融合ポイントに特に当てはまることである。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモ
チーフの始点の４～６残基Ｎ末端であるアミノ酸は、許容可能なＣ末端融合ポイントであ
る。
と、Ｉ－ＣｒｅＩ融合ポイントに構造的に相同性のあるアミノ酸位置が同定されたＩ－Ｃ
ｒｅＩとの間の構造比較に基づいている。また、融合ポイントは、Ｉ－ＣｒｅＩに対する
タンパク質配列アラインメントを使用して、構造的に特徴付けられていないＬＡＧＬＩＤ
ＡＤＧサブユニットにおいても同定することができる。これは、保存ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ
モチーフの位置に基づき、任意のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットにおいて簡単に同定す
ることができるＣ末端融合ポイントに特に当てはまることである。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモ
チーフの始点の４～６残基Ｎ末端であるアミノ酸は、許容可能なＣ末端融合ポイントであ
る。
【0109】
異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼからのサブユニット間の二量体化の境界
面は変化するので、該サブユニットは、単鎖ポリペプチドとして共有結合されたとしても
、機能的「ヘテロ二量体」に会合しないかもしれない。会合を促進するために、二つのサ
ブユニットの間の境界面を国際公開公報第２００７／０４７８５９号に記載するように、
合理的に設計することができる。最も簡単には、これは、境界面残基を一つのサブユニッ
トから他へ置換することを含む。たとえば、Ｉ－ＣｒｅＩおよびＩ－ＭｓｏＩは、本質的
に、Ｉ－ＣｒｅＩ Ｇｌｕ－８（これは、Ｉ－ＭｓｏＩの相同位置におけるＴｈｒ、アミ
ノ酸１０である）、およびＬｅｕ－１１（これは、Ｉ－ＭｓｏＩの相同位置におけるＡｌ
ａ、アミノ酸１３である）での界面領域において相違する。したがって、Ｉ－ＣｒｅＩお
よびＩ－ＭｓｏＩサブユニットは、Ｉ－ＣｒｅＩサブユニットのＧｌｕ－８およびＬｅｕ
－１１を、それぞれ、ＴｈｒおよびＡｌａに変えることによって、あるいはＩ－ＭｓｏＩ
サブユニットのＴｈｒ－１０およびＡｌａ－１３を、それぞれ、ＧｌｕおよびＬｅｕに変
えることによって、効率的に相互作用させることができる。
面は変化するので、該サブユニットは、単鎖ポリペプチドとして共有結合されたとしても
、機能的「ヘテロ二量体」に会合しないかもしれない。会合を促進するために、二つのサ
ブユニットの間の境界面を国際公開公報第２００７／０４７８５９号に記載するように、
合理的に設計することができる。最も簡単には、これは、境界面残基を一つのサブユニッ
トから他へ置換することを含む。たとえば、Ｉ－ＣｒｅＩおよびＩ－ＭｓｏＩは、本質的
に、Ｉ－ＣｒｅＩ Ｇｌｕ－８（これは、Ｉ－ＭｓｏＩの相同位置におけるＴｈｒ、アミ
ノ酸１０である）、およびＬｅｕ－１１（これは、Ｉ－ＭｓｏＩの相同位置におけるＡｌ
ａ、アミノ酸１３である）での界面領域において相違する。したがって、Ｉ－ＣｒｅＩお
よびＩ－ＭｓｏＩサブユニットは、Ｉ－ＣｒｅＩサブユニットのＧｌｕ－８およびＬｅｕ
－１１を、それぞれ、ＴｈｒおよびＡｌａに変えることによって、あるいはＩ－ＭｓｏＩ
サブユニットのＴｈｒ－１０およびＡｌａ－１３を、それぞれ、ＧｌｕおよびＬｅｕに変
えることによって、効率的に相互作用させることができる。
【0110】
また、コンピュータによるタンパク質設計アルゴリズムのような技術も、サブユニット
境界面を合理的に設計するために使用することができる。該方法は、当該分野で公知であ
る。たとえば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒらは、Ｉ－ＣｒｅＩおよびＩ－ＤｍｏＩのＮ末端ＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧドメインの間の境界面を再設計するために、コンピュータによるアルゴリ
ズムを使用して、該二つが相互作用することを可能にした（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２０
０２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５）。これらの結果を考慮に入れれば、
Ｉ－ＣｒｅＩに由来するＮ末端サブユニットと、Ｉ－ＤｍｏＩのＮ末端ＬＡＧＡＬＩＤＡ
ＤＧドメインに由来するＣ末端サブユニットとを含む単鎖メガヌクレアーゼは、（１）表
２のＩ－ＣｒｅＩ中のＮ末端融合ポイントを選択し、（２）表１０のＩ－ＤｍｏＩ中のＣ
末端融合ポイントを選択し、（３）表６のリンカを選択し（または、規定される規則に基
づいて類似するリンカを設計し）、および（４）Ｃｈｅｖａｌｉｅｒらが提案するように
、突然変異Ｌ１１Ａ、Ｆ１６Ｉ、Ｋ９６ＮおよびＬ９７ＦをＩ－ＣｒｅＩサブユニットに
、および突然変異Ｉ１９Ｗ、Ｈ５１ＦおよびＬ５５ＲをＩ－ＤｍｏＩサブユニットに取り
込むことによって製造することができる。
境界面を合理的に設計するために使用することができる。該方法は、当該分野で公知であ
る。たとえば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒらは、Ｉ－ＣｒｅＩおよびＩ－ＤｍｏＩのＮ末端ＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧドメインの間の境界面を再設計するために、コンピュータによるアルゴリ
ズムを使用して、該二つが相互作用することを可能にした（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２０
０２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５）。これらの結果を考慮に入れれば、
Ｉ－ＣｒｅＩに由来するＮ末端サブユニットと、Ｉ－ＤｍｏＩのＮ末端ＬＡＧＡＬＩＤＡ
ＤＧドメインに由来するＣ末端サブユニットとを含む単鎖メガヌクレアーゼは、（１）表
２のＩ－ＣｒｅＩ中のＮ末端融合ポイントを選択し、（２）表１０のＩ－ＤｍｏＩ中のＣ
末端融合ポイントを選択し、（３）表６のリンカを選択し（または、規定される規則に基
づいて類似するリンカを設計し）、および（４）Ｃｈｅｖａｌｉｅｒらが提案するように
、突然変異Ｌ１１Ａ、Ｆ１６Ｉ、Ｋ９６ＮおよびＬ９７ＦをＩ－ＣｒｅＩサブユニットに
、および突然変異Ｉ１９Ｗ、Ｈ５１ＦおよびＬ５５ＲをＩ－ＤｍｏＩサブユニットに取り
込むことによって製造することができる。
【0111】
あるいは、定向進化のような実験的な方法を、二つの異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユ
ニットの間の境界面を操作するために使用することができる。該方法は当該分野で公知で
ある。たとえば、サブユニット境界面中の特異的なアミノ酸が無作為化された遺伝子ライ
ブラリを作ることができ、該二つのサブユニット間の相互作用を可能にするライブラリメ
ンバを、実験的にスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニング方法は、
当該分野で公知であり（たとえば、Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３４２：３１－４１、Ｃｈａｍｅｓら（２００５），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．３３：ｅｌ７８、Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
３０：３８７０－９，Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：
４４３－５８）、そして酵母または細菌の細胞内でハイブリッドＤＮＡ部位を切断する、
二つの異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む単鎖メガヌクレアーゼの能力に関し
て、試験を行うことができる。
ニットの間の境界面を操作するために使用することができる。該方法は当該分野で公知で
ある。たとえば、サブユニット境界面中の特異的なアミノ酸が無作為化された遺伝子ライ
ブラリを作ることができ、該二つのサブユニット間の相互作用を可能にするライブラリメ
ンバを、実験的にスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニング方法は、
当該分野で公知であり（たとえば、Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３４２：３１－４１、Ｃｈａｍｅｓら（２００５），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．３３：ｅｌ７８、Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
３０：３８７０－９，Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：
４４３－５８）、そして酵母または細菌の細胞内でハイブリッドＤＮＡ部位を切断する、
二つの異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む単鎖メガヌクレアーゼの能力に関し
て、試験を行うことができる。
【0112】
６．変更されたＤＮＡ切断特異性、活性および／またはＤＮＡ結合親和性を持つ単鎖メガ
ヌクレアーゼ
本発明は、種々の方法を使用して、ＤＮＡ切断特異性に関して遺伝子操作されている、
個々のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む単鎖メガヌクレアーゼを製造するために使
用することができる。該方法として、合理的な設計（たとえば、国際公開公報第２００７
／０４７８５９号）、コンピュータを用いる設計（たとえば、Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２０
０６），Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９）、および遺伝子選択（Ｓｕｓｓｍａｎ
ら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１－４１、Ｃｈａｍｅｓら（２００
５），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅｌ７８、Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２
），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０－９，Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６
），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３－５８）が挙げられる。そのようなメガヌク
レアーゼは、野生型メガヌクレアーゼによって認識される部位とは異なるＤＮＡ部位に的
を絞ることができる。また、本発明は、合理的に設計され、変更した活性（たとえば、国
際公開公報第２００７／０４７８５９号、Ａｒｎｏｕｌｄら（２００７），Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ３７１（１）：４９－６５）、または国際公開公報第２００７／０４７８５９号
に記載されるようなＤＮＡ結合親和性を有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを結合す
るためにも、使用することができる。
ヌクレアーゼ
本発明は、種々の方法を使用して、ＤＮＡ切断特異性に関して遺伝子操作されている、
個々のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む単鎖メガヌクレアーゼを製造するために使
用することができる。該方法として、合理的な設計（たとえば、国際公開公報第２００７
／０４７８５９号）、コンピュータを用いる設計（たとえば、Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２０
０６），Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９）、および遺伝子選択（Ｓｕｓｓｍａｎ
ら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１－４１、Ｃｈａｍｅｓら（２００
５），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅｌ７８、Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２
），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０－９，Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６
），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３－５８）が挙げられる。そのようなメガヌク
レアーゼは、野生型メガヌクレアーゼによって認識される部位とは異なるＤＮＡ部位に的
を絞ることができる。また、本発明は、合理的に設計され、変更した活性（たとえば、国
際公開公報第２００７／０４７８５９号、Ａｒｎｏｕｌｄら（２００７），Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ３７１（１）：４９－６５）、または国際公開公報第２００７／０４７８５９号
に記載されるようなＤＮＡ結合親和性を有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを結合す
るためにも、使用することができる。
【0113】
７．組換え細胞および生物の製造方法
本発明の態様は、さらに、単鎖メガヌクレアーゼを使用して、組換え、遺伝子導入また
はその他、遺伝子組換え細胞および生物を産生する方法も提供する。したがって、ある実
施形態では、細胞または生物のゲノムＤＮＡ中の単一部位または比較的少ない部位で、二
本鎖切断端を特異的に起こすように、組換え単鎖メガヌクレアーゼを成長させ、相同組換
えにより関心のある配列を正確に挿入すること（複数を含む）を可能にする。他の実施形
態では、細胞または生物のゲノムＤＮＡ中の単一部位または比較的少ない部位で、二本鎖
切断端を特異的に起こすように、組換えメガヌクレアーゼを成長させ、（ａ）非相同的末
端結合による関心のある配列の挿入を殆ど起こさせないようにすること、あるいは（ｂ）
非相同的末端結合により標的配列を混乱することを可能にする。関心のある配列の相同組
換えまたは非相同的末端結合に関して、本明細書で使用される用語「挿入」は、関心のあ
る配列が染色体に組み込まれるように、関心のある配列を染色体に連結することを意味す
る。相同組換えの場合、本来のＤＮＡが、該ＤＮＡと同じ長さであるが、変更されたヌク
レオチド配列を持つ外因性ＤＮＡによって置き換えられるように、挿入された配列は、内
因性配列を置き換えることができる。あるいは、挿入された配列は、それが置き換える配
列よりも多いまたは少ない塩基を含みうる。
本発明の態様は、さらに、単鎖メガヌクレアーゼを使用して、組換え、遺伝子導入また
はその他、遺伝子組換え細胞および生物を産生する方法も提供する。したがって、ある実
施形態では、細胞または生物のゲノムＤＮＡ中の単一部位または比較的少ない部位で、二
本鎖切断端を特異的に起こすように、組換え単鎖メガヌクレアーゼを成長させ、相同組換
えにより関心のある配列を正確に挿入すること（複数を含む）を可能にする。他の実施形
態では、細胞または生物のゲノムＤＮＡ中の単一部位または比較的少ない部位で、二本鎖
切断端を特異的に起こすように、組換えメガヌクレアーゼを成長させ、（ａ）非相同的末
端結合による関心のある配列の挿入を殆ど起こさせないようにすること、あるいは（ｂ）
非相同的末端結合により標的配列を混乱することを可能にする。関心のある配列の相同組
換えまたは非相同的末端結合に関して、本明細書で使用される用語「挿入」は、関心のあ
る配列が染色体に組み込まれるように、関心のある配列を染色体に連結することを意味す
る。相同組換えの場合、本来のＤＮＡが、該ＤＮＡと同じ長さであるが、変更されたヌク
レオチド配列を持つ外因性ＤＮＡによって置き換えられるように、挿入された配列は、内
因性配列を置き換えることができる。あるいは、挿入された配列は、それが置き換える配
列よりも多いまたは少ない塩基を含みうる。
【0114】
したがって、本発明のこの態様によれば、組換え生物として、コメ、コムギ、コーン（
トウモロコシ）およびライムギのような単子葉植物種、およびマメ科植物（たとえば、イ
ンゲンマメ、ダイズ、レンズマメ、ピーナッツ、エンドウマメ）、アルファルファ、クロ
ーバ、タバコ、およびアラビドプシスのような双子葉植物種が挙げられるが、これらに限
定されない。さらに、組換え生物として、ヒトおよびヒトではない霊長類、ウマ、ウシ、
ヤギ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、トカゲ、サカナ、およ
びショウジョウバエ種のような昆虫を挙げることができるが、これらに限定されない。他
の実施形態では、生物は、カンジダ、パンカビまたは酵母類のような真菌類である。
トウモロコシ）およびライムギのような単子葉植物種、およびマメ科植物（たとえば、イ
ンゲンマメ、ダイズ、レンズマメ、ピーナッツ、エンドウマメ）、アルファルファ、クロ
ーバ、タバコ、およびアラビドプシスのような双子葉植物種が挙げられるが、これらに限
定されない。さらに、組換え生物として、ヒトおよびヒトではない霊長類、ウマ、ウシ、
ヤギ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、トカゲ、サカナ、およ
びショウジョウバエ種のような昆虫を挙げることができるが、これらに限定されない。他
の実施形態では、生物は、カンジダ、パンカビまたは酵母類のような真菌類である。
【0115】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、関心のある配列を、成熟組換え生物になり
うる、または得られた遺伝子組換え生物がそのゲノム中に挿入された関心のある配列を持
つ子孫を生じさせる生殖細胞または幹細胞のような細胞に導入することを含む。
うる、または得られた遺伝子組換え生物がそのゲノム中に挿入された関心のある配列を持
つ子孫を生じさせる生殖細胞または幹細胞のような細胞に導入することを含む。
【0116】
メガヌクレアーゼタンパク質は、細胞に送達され、ゲノムＤＮＡを切断することができ
、これによって、当該分野で公知の種々の異なるメカニズムにより、該切断部位で、関心
のある配列を相同組換えまたは非相同的末端結合させる。たとえば、組換えメガヌクレア
ーゼタンパク質は、マイクロインジェクションまたはリポソームトランスフェクション（
たとえば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｃａｒｌｓ
ｂａｄ，ＣＡ）（これらに限定されない）を始めとする技術によって、細胞に導入するこ
とができる。リポソーム形成は、標的細胞を持つ脂質二重膜融合を促進するために使用す
ることができ、これによって、その表面と会合しているリポソームまたはタンパク質の内
容物を、細胞中に持ち込むことが可能になる。あるいは、酵素を融合し、細胞摂取を指示
するＨＩＶ ＴＡＴタンパク質からの摂取ペプチドのような、適正な摂取ペプチドとする
ことができる（たとえば、Ｈｕｄｅｃｚら（２００５），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５
：６７９－７３６参照）。
、これによって、当該分野で公知の種々の異なるメカニズムにより、該切断部位で、関心
のある配列を相同組換えまたは非相同的末端結合させる。たとえば、組換えメガヌクレア
ーゼタンパク質は、マイクロインジェクションまたはリポソームトランスフェクション（
たとえば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｃａｒｌｓ
ｂａｄ，ＣＡ）（これらに限定されない）を始めとする技術によって、細胞に導入するこ
とができる。リポソーム形成は、標的細胞を持つ脂質二重膜融合を促進するために使用す
ることができ、これによって、その表面と会合しているリポソームまたはタンパク質の内
容物を、細胞中に持ち込むことが可能になる。あるいは、酵素を融合し、細胞摂取を指示
するＨＩＶ ＴＡＴタンパク質からの摂取ペプチドのような、適正な摂取ペプチドとする
ことができる（たとえば、Ｈｕｄｅｃｚら（２００５），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５
：６７９－７３６参照）。
【0117】
あるいは、当該分野で公知の技術を使用して、メガヌクレアーゼタンパク質をエンコー
ドする遺伝子配列をベクタに挿入し、真核細胞にトランスフェクトする（たとえば、Ａｕ
ｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ１ ９９９参照）。関心のある配列を、同じベクタ、異なるベク
タに、または当該分野で公知の他の方法によって、導入することができる。
ドする遺伝子配列をベクタに挿入し、真核細胞にトランスフェクトする（たとえば、Ａｕ
ｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ１ ９９９参照）。関心のある配列を、同じベクタ、異なるベク
タに、または当該分野で公知の他の方法によって、導入することができる。
【0118】
ＤＮＡトランスフェクション用のベクタの限定ではない例示として、ウィルス性ベクタ
、プラスミド、コスミドおよびＹＡＣベクタが挙げられる。ＤＮＡ配列のトランスフェク
ションは、当業者に公知の種々の方法によって達成することができる。たとえば、リポソ
ームおよび免疫リポソームは、ＤＮＡ配列を細胞に送達するために使用される（たとえば
、Ｌａｓｉｃら（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１２７５－７６参照）。さらに
、ベクタを細胞に導入するために、ウィルスを利用することができる（たとえば、米国特
許第７，０３７，４９２号参照）。あるいは、トランスフェクション手法は、ベクタをネ
イキッドＤＮＡとして導入するように、利用することができる（たとえば、Ｒｕｉら（２
００２），Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７１（１５）：１７７１－８参照）。
、プラスミド、コスミドおよびＹＡＣベクタが挙げられる。ＤＮＡ配列のトランスフェク
ションは、当業者に公知の種々の方法によって達成することができる。たとえば、リポソ
ームおよび免疫リポソームは、ＤＮＡ配列を細胞に送達するために使用される（たとえば
、Ｌａｓｉｃら（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１２７５－７６参照）。さらに
、ベクタを細胞に導入するために、ウィルスを利用することができる（たとえば、米国特
許第７，０３７，４９２号参照）。あるいは、トランスフェクション手法は、ベクタをネ
イキッドＤＮＡとして導入するように、利用することができる（たとえば、Ｒｕｉら（２
００２），Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７１（１５）：１７７１－８参照）。
【0119】
核酸を細胞に送達する一般的方法として、（１）化学的方法（Ｇｒａｈａｍら（１９７
３），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５４（２）：５３６－５３９、Ｚａｔｌｏｕｋａｌら（１９９２
），Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：１３６－１５３、（２）マイクロイ
ンジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８０），Ｃｅｌｌ ２２（２）：４７９－４８
８）、エレクトロポレーション（Ｗｏｎｇら（１９８２），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０７（２）：５８４－５８７、Ｆｒｏｍｍら（１９８５
），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（１７）：５８２４－５８
２８、米国特許第５，３８４，２５３号）、およびバリスティックインジェクション（Ｊ
ｏｈｎｓｔｏｎら（１９９４），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４３（Ａ）：３
５３－３６５、Ｆｙｎａｎら（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９０（２４）：１１４７８－１１４８２）のような物理的方法、（３）ウィルス
性ベクタ（Ｃｌａｐｐ（１９９３），Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．２０（１）：１５
５－１６８、Ｌｕら（１９９３），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８（６）：２０８９－２０
９６、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８８），Ａｖｄ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４１：１
９－２７、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６
０８－６１４）、および（４）受容体介在性メカニズム（Ｃｕｒｉｅｌら（１９９１），
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８（１９）：８８５０－８８５４
、Ｃｕｒｉｅｌら（１９９２），Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３（２）：１４７－１５４
、Ｗａｇｎｅｒら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
９（１３）：６０９９－６１０３）が挙げられる。
３），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５４（２）：５３６－５３９、Ｚａｔｌｏｕｋａｌら（１９９２
），Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：１３６－１５３、（２）マイクロイ
ンジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８０），Ｃｅｌｌ ２２（２）：４７９－４８
８）、エレクトロポレーション（Ｗｏｎｇら（１９８２），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０７（２）：５８４－５８７、Ｆｒｏｍｍら（１９８５
），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（１７）：５８２４－５８
２８、米国特許第５，３８４，２５３号）、およびバリスティックインジェクション（Ｊ
ｏｈｎｓｔｏｎら（１９９４），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４３（Ａ）：３
５３－３６５、Ｆｙｎａｎら（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９０（２４）：１１４７８－１１４８２）のような物理的方法、（３）ウィルス
性ベクタ（Ｃｌａｐｐ（１９９３），Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．２０（１）：１５
５－１６８、Ｌｕら（１９９３），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８（６）：２０８９－２０
９６、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８８），Ａｖｄ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４１：１
９－２７、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６
０８－６１４）、および（４）受容体介在性メカニズム（Ｃｕｒｉｅｌら（１９９１），
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８（１９）：８８５０－８８５４
、Ｃｕｒｉｅｌら（１９９２），Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３（２）：１４７－１５４
、Ｗａｇｎｅｒら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
９（１３）：６０９９－６１０３）が挙げられる。
【0120】
ある実施形態では、ゲノムに挿入された関心のある配列を含有する、遺伝子組換え植物
を産生する。ある実施形態では、植物細胞に、組換えメガヌクレアーゼおよび関心のある
配列に対応するＤＮＡ配列であって、メガヌクレアーゼ認識配列および／または標的配列
に実質的に同一の配列によって挟まれていても、あるいは挟まれていなくてもよいＤＮＡ
配列をトランスフェクトすることによって、遺伝子組換え植物を産生する。他の実施形態
では、植物細胞に、切断により非相同的末端結合が促進され、認識配列を含有する標的配
列を混乱させるような、組換えメガヌクレアーゼだけに対応するＤＮＡ配列をトランスフ
ェクトすることによって、遺伝子組換え植物を産生する。そのような実施形態では、メガ
ヌクレアーゼ配列は、宿主植物細胞においてメガヌクレアーゼの発現を可能にする調節配
列のコントロール下にある。これらの調節配列として、ＮＯＳプロモータのような構成植
物プロモータ、デキサメタゾン誘導性プロモータ（たとえば、Ｇｒｅｍｉｌｌｏｎら（２
００４），Ｐｌａｎｔ Ｊ．３７：２１８－２２８参照）のような化学的誘導性遺伝子プ
ロモータ、およびＬＧＣ１プロモータ（たとえば、Ｓｉｎｇｈら（２００３），ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．５４２：４７－５２参照）のような植物組織特異的プロモータが挙げられる
が、これらに限定されない。
を産生する。ある実施形態では、植物細胞に、組換えメガヌクレアーゼおよび関心のある
配列に対応するＤＮＡ配列であって、メガヌクレアーゼ認識配列および／または標的配列
に実質的に同一の配列によって挟まれていても、あるいは挟まれていなくてもよいＤＮＡ
配列をトランスフェクトすることによって、遺伝子組換え植物を産生する。他の実施形態
では、植物細胞に、切断により非相同的末端結合が促進され、認識配列を含有する標的配
列を混乱させるような、組換えメガヌクレアーゼだけに対応するＤＮＡ配列をトランスフ
ェクトすることによって、遺伝子組換え植物を産生する。そのような実施形態では、メガ
ヌクレアーゼ配列は、宿主植物細胞においてメガヌクレアーゼの発現を可能にする調節配
列のコントロール下にある。これらの調節配列として、ＮＯＳプロモータのような構成植
物プロモータ、デキサメタゾン誘導性プロモータ（たとえば、Ｇｒｅｍｉｌｌｏｎら（２
００４），Ｐｌａｎｔ Ｊ．３７：２１８－２２８参照）のような化学的誘導性遺伝子プ
ロモータ、およびＬＧＣ１プロモータ（たとえば、Ｓｉｎｇｈら（２００３），ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．５４２：４７－５２参照）のような植物組織特異的プロモータが挙げられる
が、これらに限定されない。
【0121】
植物細胞にＤＮＡを導入する適切な方法としては、ＤＮＡを細胞に導入することができ
る実質的にいかなる方法も挙げられ、たとえば、アグロバクテリウム感染、プロトプラス
トのＰＥＧ介在形質転換（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら（１９９３），Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１：４１５－４２８）、乾燥／抑制介在ＤＮＡ摂取、エレ
クトロポレーション、シリコンカーバイド繊維による攪拌、バリスティックインジェクシ
ョン、または微粒子銃などが挙げられるが、これらに限定されない。
る実質的にいかなる方法も挙げられ、たとえば、アグロバクテリウム感染、プロトプラス
トのＰＥＧ介在形質転換（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら（１９９３），Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１：４１５－４２８）、乾燥／抑制介在ＤＮＡ摂取、エレ
クトロポレーション、シリコンカーバイド繊維による攪拌、バリスティックインジェクシ
ョン、または微粒子銃などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0122】
他の実施形態では、組換えメガヌクレアーゼを使用して遺伝子組換え動物を産生する。
植物細胞と同様に、核酸配列を、生殖細胞または最終的に遺伝子導入生物になる細胞に導
入する。いくつかの実施形態では、細胞は受精卵であり、外因性ＤＮＡ分子を受精卵の前
核に注入することができる。次いで、マイクロインジェクトされた卵を、偽妊娠仮親の卵
管に移し、成長させる。組換えメガヌクレアーゼは受精卵中で発現し（たとえば、３－ホ
スホグリセリン酸キナーゼのような、構成プロモータのコントロール下で）、ゲノム中の
１個または数個の別々の部位への関心のある配列の相同組換えを容易にする。あるいは、
Ｇｏｓｓｌｅｒら（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３
：９０６５ ９０６９によって記載されているように、遺伝子導入発生用の組換え胚幹（
「ＥＳ」）細胞を利用することによって、遺伝子組換え動物を得ることができる。
植物細胞と同様に、核酸配列を、生殖細胞または最終的に遺伝子導入生物になる細胞に導
入する。いくつかの実施形態では、細胞は受精卵であり、外因性ＤＮＡ分子を受精卵の前
核に注入することができる。次いで、マイクロインジェクトされた卵を、偽妊娠仮親の卵
管に移し、成長させる。組換えメガヌクレアーゼは受精卵中で発現し（たとえば、３－ホ
スホグリセリン酸キナーゼのような、構成プロモータのコントロール下で）、ゲノム中の
１個または数個の別々の部位への関心のある配列の相同組換えを容易にする。あるいは、
Ｇｏｓｓｌｅｒら（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３
：９０６５ ９０６９によって記載されているように、遺伝子導入発生用の組換え胚幹（
「ＥＳ」）細胞を利用することによって、遺伝子組換え動物を得ることができる。
【0123】
ある実施形態では、組換え哺乳類発現ベクタは、特定の細胞型において、核酸の組織特
異的発現を優先的に導くことができる。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知で
ある。適切な組織特異的プロモータの限定ではない例示として、アルブミンプロモータ（
肝臓特異的なもの、Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－
２７７）、リンパ系特異的プロモータ（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８），Ａ
ｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモータ（Ｗ
ｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９），ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３
）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３），Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７
４０、ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３），Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７
４８）、神経特異的プロモータ（たとえば、神経フィラメントプロモータ、Ｂｙｒｎｅお
よびＲｕｄｄｌｅ（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６
：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモータ（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５），Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、および乳腺特異的プロモータ（たとえば、乳漿プ
ロモータ、米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許公報第０２６４１６６号）が
挙げられる。また、発育的に調節されたプロモータも包含され、たとえば、マウスｈｏｘ
プロモータ（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３７
４－３７９）およびα胎児タンパク質プロモータ（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ
（１９８９），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）がある。
異的発現を優先的に導くことができる。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知で
ある。適切な組織特異的プロモータの限定ではない例示として、アルブミンプロモータ（
肝臓特異的なもの、Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－
２７７）、リンパ系特異的プロモータ（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８），Ａ
ｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモータ（Ｗ
ｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９），ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３
）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３），Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７
４０、ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３），Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７
４８）、神経特異的プロモータ（たとえば、神経フィラメントプロモータ、Ｂｙｒｎｅお
よびＲｕｄｄｌｅ（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６
：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモータ（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５），Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、および乳腺特異的プロモータ（たとえば、乳漿プ
ロモータ、米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許公報第０２６４１６６号）が
挙げられる。また、発育的に調節されたプロモータも包含され、たとえば、マウスｈｏｘ
プロモータ（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３７
４－３７９）およびα胎児タンパク質プロモータ（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ
（１９８９），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）がある。
【0124】
ある実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼに、ペプチドエピトープ（たとえば、ＨＡ、
ＦＬＡＧまたはＭｙｃエピトープ）でタグを付け、発現レベルや局在化をモニターしても
よい。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、核局在化シグナル（たとえば、Ｓ
Ｖ４０からの核局在化シグナル）のようなサブ細胞局在化シグナル、あるいは葉緑体また
はミトコンドリア局在化シグナルに融合してもよい。他の実施形態では、メガヌクレアー
ゼを、核外移行シグナルに融合し、これを細胞質に局在化してもよい。また、メガヌクレ
アーゼを、ＤＮＡ修復または相同組換えを刺激するタンパク質（たとえば、ｒｅｃＡ、Ｒ
ＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５７またはＢＲＣＡ２）のような無関係のタ
ンパク質またはタンパク質ドメインに融合してもよい。
ＦＬＡＧまたはＭｙｃエピトープ）でタグを付け、発現レベルや局在化をモニターしても
よい。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、核局在化シグナル（たとえば、Ｓ
Ｖ４０からの核局在化シグナル）のようなサブ細胞局在化シグナル、あるいは葉緑体また
はミトコンドリア局在化シグナルに融合してもよい。他の実施形態では、メガヌクレアー
ゼを、核外移行シグナルに融合し、これを細胞質に局在化してもよい。また、メガヌクレ
アーゼを、ＤＮＡ修復または相同組換えを刺激するタンパク質（たとえば、ｒｅｃＡ、Ｒ
ＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５７またはＢＲＣＡ２）のような無関係のタ
ンパク質またはタンパク質ドメインに融合してもよい。
【0125】
８．遺伝子治療の方法
本発明の態様は、遺伝子治療のために組換えメガヌクレアーゼを使用することを可能に
する。本明細書で使用される「遺伝子治療」は、少なくとも一つの遺伝子または遺伝子調
節配列、たとえば、プロモータ、エンハンサまたはサイレンサの機能コピーを患者に導入
し、その構造および／または機能に欠陥のある遺伝子または遺伝子調節領域を置き換える
ことを含む、治療的処置を意味する。また、用語「遺伝子治療」は、遺伝子の発現を減ら
すまたは消す、有害な遺伝子または調節エレメント（たとえば、癌遺伝子）に対してなさ
れる修飾を指すこともできる。遺伝子治療は、先天的な状態、突然変異または患者の生涯
にわたる特異的な遺伝子座に対する障害に起因する状態、または感染性生物に起因する状
態を治療するために行うことができる。
本発明の態様は、遺伝子治療のために組換えメガヌクレアーゼを使用することを可能に
する。本明細書で使用される「遺伝子治療」は、少なくとも一つの遺伝子または遺伝子調
節配列、たとえば、プロモータ、エンハンサまたはサイレンサの機能コピーを患者に導入
し、その構造および／または機能に欠陥のある遺伝子または遺伝子調節領域を置き換える
ことを含む、治療的処置を意味する。また、用語「遺伝子治療」は、遺伝子の発現を減ら
すまたは消す、有害な遺伝子または調節エレメント（たとえば、癌遺伝子）に対してなさ
れる修飾を指すこともできる。遺伝子治療は、先天的な状態、突然変異または患者の生涯
にわたる特異的な遺伝子座に対する障害に起因する状態、または感染性生物に起因する状
態を治療するために行うことができる。
【0126】
本発明のいくつかの態様では、遺伝子発現に影響を及ぼすゲノムの領域に外因性核酸配
列を挿入することによって、機能障害性遺伝子を、置換えまたは無能にする。ある実施形
態では、状態を緩和するように、組換えメガヌクレアーゼを、修飾されるべきゲノムの領
域内の特定の配列に標的化する。配列は、エクソン、イントロン、プロモータまたは遺伝
子の機能障害性発現を起こしている他の調節領域内の領域が可能である。本明細書で使用
される用語「機能障害性発現」は、遺伝子産物をあまりにも少なく、遺伝子産物をあまり
にも多く産生する細胞による、あるいは必要な機能のない、または必要以上の機能を持つ
異なる機能を有する遺伝子産物を産生することによる、遺伝子産物の異常な発現を意味す
る。
列を挿入することによって、機能障害性遺伝子を、置換えまたは無能にする。ある実施形
態では、状態を緩和するように、組換えメガヌクレアーゼを、修飾されるべきゲノムの領
域内の特定の配列に標的化する。配列は、エクソン、イントロン、プロモータまたは遺伝
子の機能障害性発現を起こしている他の調節領域内の領域が可能である。本明細書で使用
される用語「機能障害性発現」は、遺伝子産物をあまりにも少なく、遺伝子産物をあまり
にも多く産生する細胞による、あるいは必要な機能のない、または必要以上の機能を持つ
異なる機能を有する遺伝子産物を産生することによる、遺伝子産物の異常な発現を意味す
る。
【0127】
修飾領域に挿入された外因性核酸配列は、遺伝子を正常化する「修復された」配列を提
供するために使用することができる。遺伝子修復は、正しい遺伝子配列を、再構築される
べき正しい機能を可能にする遺伝子に導入することによって、達成することができる。こ
れらの実施形態では、挿入されるべき核酸配列は、タンパク質の完全コード配列が可能で
あり、またはある実施形態では、修復されるべき領域だけを含む遺伝子のフラグメントが
可能である。他の実施形態では、挿入されるべき核酸配列は、異常な発現または調節を起
こす突然変異が修復されているプロモータ配列または他の調節エレメントを含む。他の実
施形態では、挿入されるべき核酸配列は、変異遺伝子中にはない適正な翻訳停止コドンを
含有する。また、核酸配列は、適正な翻訳停止シグナルのない組換え遺伝子において、翻
訳を停止するための配列を有することもできる。
供するために使用することができる。遺伝子修復は、正しい遺伝子配列を、再構築される
べき正しい機能を可能にする遺伝子に導入することによって、達成することができる。こ
れらの実施形態では、挿入されるべき核酸配列は、タンパク質の完全コード配列が可能で
あり、またはある実施形態では、修復されるべき領域だけを含む遺伝子のフラグメントが
可能である。他の実施形態では、挿入されるべき核酸配列は、異常な発現または調節を起
こす突然変異が修復されているプロモータ配列または他の調節エレメントを含む。他の実
施形態では、挿入されるべき核酸配列は、変異遺伝子中にはない適正な翻訳停止コドンを
含有する。また、核酸配列は、適正な翻訳停止シグナルのない組換え遺伝子において、翻
訳を停止するための配列を有することもできる。
【0128】
あるいは、核酸配列は、遺伝子の調節配列を混乱させることにより、または遺伝子機能
を排除するサイレンサを提供することにより、遺伝子機能を一斉に除去することができる
。いくつかの実施形態では、外因性核酸配列は、翻訳停止コドンを提供し、遺伝子産物の
発現を阻止する。他の実施形態では、外因性核酸配列は、転写停止要素を提供し、完全長
ＲＮＡ分子の発現を阻止する。さらに他の実施形態では、遺伝子機能を、塩基挿入、塩基
欠失および／または非相同的末端結合によるフレームシフト突然変異を導入することによ
って、メガヌクレアーゼで直接混乱させる。
を排除するサイレンサを提供することにより、遺伝子機能を一斉に除去することができる
。いくつかの実施形態では、外因性核酸配列は、翻訳停止コドンを提供し、遺伝子産物の
発現を阻止する。他の実施形態では、外因性核酸配列は、転写停止要素を提供し、完全長
ＲＮＡ分子の発現を阻止する。さらに他の実施形態では、遺伝子機能を、塩基挿入、塩基
欠失および／または非相同的末端結合によるフレームシフト突然変異を導入することによ
って、メガヌクレアーゼで直接混乱させる。
【0129】
多くの場合、正しい遺伝子配列を、標的細胞または疾患状態の原因である細胞集団に導
くことが望ましい。そのような治療上の標的化は、健康な細胞が治療による標的となるこ
とを回避する。これにより、治療の効率は増加し、一方、治療による健康な細胞へ与える
可能性のある潜在的な副作用は減少する。
くことが望ましい。そのような治療上の標的化は、健康な細胞が治療による標的となるこ
とを回避する。これにより、治療の効率は増加し、一方、治療による健康な細胞へ与える
可能性のある潜在的な副作用は減少する。
【0130】
ゲノムに挿入されるべき組換えメガヌクレアーゼ遺伝子および関心のある配列を、関心
のある細胞に送達することは、種々のメカニズムによって達成することができる。いくつ
かの実施形態では、ウィルスの複製を阻止するために不活性化した、特別のウィルス性遺
伝子を持つウィルスによって、核酸を細胞に送達する。したがって、標的細胞内のみへ送
達および維持することができるが、標的細胞または組織内で複製する能力は保持しないよ
うに、ウィルスを変更することができる。一つ以上のＤＮＡ配列を、ベクタのように作用
するウィルス性ゲノムを産生するように、変更されたウィルス性ゲノムに導入することが
でき、これを宿主ゲノムに挿入し次いでこれを発現させてもよいし、しなくてもよい。よ
り具体的には、ある実施形態は、ＭＦＧまたはｐＬＪベクタ（これらに限定されない）の
ようなレトロウィルス性ベクタを使用することを含む。ＭＦＧベクタは、ｐｏｌおよびｅ
ｎｖタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列が欠失し、複製欠損になっている、単純化さ
れたモロニーマウス白血病ウィルスベクタ（ＭｏＭＬＶ）である。また、ｐＬＪレトロウ
ィルス性ベクタは、ＭｏＭＬＶの形態でもある（たとえば、Ｋｏｒｍａｎら（１９８７）
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４：２１５０－２１５４参照）。他の
実施形態では、組換えアデノウィルスまたはアデノ関連ウィルスを、送達ベクタとして使
用することができる。
のある細胞に送達することは、種々のメカニズムによって達成することができる。いくつ
かの実施形態では、ウィルスの複製を阻止するために不活性化した、特別のウィルス性遺
伝子を持つウィルスによって、核酸を細胞に送達する。したがって、標的細胞内のみへ送
達および維持することができるが、標的細胞または組織内で複製する能力は保持しないよ
うに、ウィルスを変更することができる。一つ以上のＤＮＡ配列を、ベクタのように作用
するウィルス性ゲノムを産生するように、変更されたウィルス性ゲノムに導入することが
でき、これを宿主ゲノムに挿入し次いでこれを発現させてもよいし、しなくてもよい。よ
り具体的には、ある実施形態は、ＭＦＧまたはｐＬＪベクタ（これらに限定されない）の
ようなレトロウィルス性ベクタを使用することを含む。ＭＦＧベクタは、ｐｏｌおよびｅ
ｎｖタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列が欠失し、複製欠損になっている、単純化さ
れたモロニーマウス白血病ウィルスベクタ（ＭｏＭＬＶ）である。また、ｐＬＪレトロウ
ィルス性ベクタは、ＭｏＭＬＶの形態でもある（たとえば、Ｋｏｒｍａｎら（１９８７）
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４：２１５０－２１５４参照）。他の
実施形態では、組換えアデノウィルスまたはアデノ関連ウィルスを、送達ベクタとして使
用することができる。
【0131】
他の実施形態では、組換えメガヌクレアーゼタンパク質および／または組換えメガヌク
レアーゼ遺伝子配列の標的細胞への送達を、リポソームを使用することによって達成する
。核酸および／またはタンパク質カーゴを含有するリポソームの製造は、当該分野で公知
である（たとえば、Ｌａｓｉｃら（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１２７５－７
６参照）。免疫リポソームは、細胞関連抗原に対する抗体をリポソームに取込み、メガヌ
クレアーゼ用のＤＮＡ配列、またはメガヌクレアーゼそれ自体を特異的な細胞型に送達す
ることができる（たとえば、Ｌａｓｉｃら（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１２
７５－７６、Ｙｏｕｎｇら（２００５），Ｊ．Ｃａｌｉｆ．Ｄｅｎｔ．Ａｓｓｏｃ．３３
（１２）：９６７－７１、Ｐｆｅｉｆｆｅｒら（２００６），Ｊ．Ｖａｃｅ．Ｓｕｒｇ．
４３（５）：１０２１－７参照）。リポソーム製剤を製造し使用する方法は、当該分野に
おいて周知である（たとえば、米国特許第６，３１６，０２４号、米国特許第６，３７９
，６９９号、米国特許第６，３８７，３９７号、米国特許第６，５１１，６７６号および
米国特許第６，５９３，３０８号、およびこれらに挙げてある参考文献を参照）。いくつ
かの実施形態では、関心のある配列、および組換えメガヌクレアーゼタンパク質または組
換えメガヌクレアーゼ遺伝子配列を送達するために、リポソームを使用する。
レアーゼ遺伝子配列の標的細胞への送達を、リポソームを使用することによって達成する
。核酸および／またはタンパク質カーゴを含有するリポソームの製造は、当該分野で公知
である（たとえば、Ｌａｓｉｃら（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１２７５－７
６参照）。免疫リポソームは、細胞関連抗原に対する抗体をリポソームに取込み、メガヌ
クレアーゼ用のＤＮＡ配列、またはメガヌクレアーゼそれ自体を特異的な細胞型に送達す
ることができる（たとえば、Ｌａｓｉｃら（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１２
７５－７６、Ｙｏｕｎｇら（２００５），Ｊ．Ｃａｌｉｆ．Ｄｅｎｔ．Ａｓｓｏｃ．３３
（１２）：９６７－７１、Ｐｆｅｉｆｆｅｒら（２００６），Ｊ．Ｖａｃｅ．Ｓｕｒｇ．
４３（５）：１０２１－７参照）。リポソーム製剤を製造し使用する方法は、当該分野に
おいて周知である（たとえば、米国特許第６，３１６，０２４号、米国特許第６，３７９
，６９９号、米国特許第６，３８７，３９７号、米国特許第６，５１１，６７６号および
米国特許第６，５９３，３０８号、およびこれらに挙げてある参考文献を参照）。いくつ
かの実施形態では、関心のある配列、および組換えメガヌクレアーゼタンパク質または組
換えメガヌクレアーゼ遺伝子配列を送達するために、リポソームを使用する。
【0132】
９．病原体感染を治療する方法
また、本発明の態様は、病原体による感染を治療する方法も提供する。病原体生物とし
て、単純ヘルペスウィルス１、単純ヘルペスウィルス２、ヒト免疫不全ウィルス１、ヒト
免疫不全ウィルス２、痘瘡ウィルス、ポリオウィルス、エプスタイン・バー・ウィルス、
およびヒトパピローマウィルス（これらに限定されない）のようなウィルス、およびバシ
ラスアンスラシス、ヘモフィルス種、肺炎球菌種、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス
種、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌およびマイコプラスマ結核病原体（これらに限定され
ない）のような細菌生物が挙げられる。また、病原体生物として、カンジダ、ブラストミ
セス、クリプトコッカスおよびヒストプラズマ種（これらに限定されない）のような真菌
生物が挙げられる。
また、本発明の態様は、病原体による感染を治療する方法も提供する。病原体生物とし
て、単純ヘルペスウィルス１、単純ヘルペスウィルス２、ヒト免疫不全ウィルス１、ヒト
免疫不全ウィルス２、痘瘡ウィルス、ポリオウィルス、エプスタイン・バー・ウィルス、
およびヒトパピローマウィルス（これらに限定されない）のようなウィルス、およびバシ
ラスアンスラシス、ヘモフィルス種、肺炎球菌種、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス
種、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌およびマイコプラスマ結核病原体（これらに限定され
ない）のような細菌生物が挙げられる。また、病原体生物として、カンジダ、ブラストミ
セス、クリプトコッカスおよびヒストプラズマ種（これらに限定されない）のような真菌
生物が挙げられる。
【0133】
いくつかの実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼは、病原体ゲノム内の認識配列、たと
えば、成長、複製、または病原体の毒性に必須の遺伝子または調節エレメントに、標的化
されうる。ある実施形態では、認識配列は、細菌プラスミド中にあってもよい。病原体ゲ
ノムにおける認識配列のメガヌクレアーゼ介在切断は、非相同的末端結合を刺激すること
によって、標的化された必須遺伝子内で、挿入、欠失またはフレームシフトの形態で、突
然変異を刺激することができる。あるいは、細菌プラスミドの切断により、プラスミドと
ともにそこにエンコードされていた全ての遺伝子、たとえば、毒性遺伝子（たとえば、炭
疽菌致死因子遺伝子）または抗生物質耐性遺伝子も消滅する結果となりうる。先に記載し
たように、メガヌクレアーゼを、当該分野で一般的な技術を使用して、タンパク質あるい
は核酸の形態で、感染した患者、動物または植物に送達してもよい。ある実施形態では、
メガヌクレアーゼ遺伝子を、病原体細菌に送達するバクテリオファージゲノムに取込んで
もよい。
えば、成長、複製、または病原体の毒性に必須の遺伝子または調節エレメントに、標的化
されうる。ある実施形態では、認識配列は、細菌プラスミド中にあってもよい。病原体ゲ
ノムにおける認識配列のメガヌクレアーゼ介在切断は、非相同的末端結合を刺激すること
によって、標的化された必須遺伝子内で、挿入、欠失またはフレームシフトの形態で、突
然変異を刺激することができる。あるいは、細菌プラスミドの切断により、プラスミドと
ともにそこにエンコードされていた全ての遺伝子、たとえば、毒性遺伝子（たとえば、炭
疽菌致死因子遺伝子）または抗生物質耐性遺伝子も消滅する結果となりうる。先に記載し
たように、メガヌクレアーゼを、当該分野で一般的な技術を使用して、タンパク質あるい
は核酸の形態で、感染した患者、動物または植物に送達してもよい。ある実施形態では、
メガヌクレアーゼ遺伝子を、病原体細菌に送達するバクテリオファージゲノムに取込んで
もよい。
【0134】
また、本発明の態様は、ある形態の癌を処置するための治療を提供する。ヒトウィルス
は、しばしば、腫瘍形成（たとえば、エプスタイン・バー・ウィルスと上咽頭癌、ヒトパ
ピローマウィルスと子宮頸癌）と関連するので、これらのウィルス性病原体の不活性化に
より、癌の発現および進行を阻止してもよい。あるいは、単鎖メガヌクレアーゼを使用し
て、これらの腫瘍関連ウィルスのゲノムに標的化された二本鎖切断端に対して、ＤＮＡ損
傷応答経路によりアポトーシスを開始させるように使用してもよい。この方法では、ウィ
ルス性ゲノムを内部に持つ腫瘍細胞に、アポトーシスを選択的に誘導することが可能であ
るかもしれない。
は、しばしば、腫瘍形成（たとえば、エプスタイン・バー・ウィルスと上咽頭癌、ヒトパ
ピローマウィルスと子宮頸癌）と関連するので、これらのウィルス性病原体の不活性化に
より、癌の発現および進行を阻止してもよい。あるいは、単鎖メガヌクレアーゼを使用し
て、これらの腫瘍関連ウィルスのゲノムに標的化された二本鎖切断端に対して、ＤＮＡ損
傷応答経路によりアポトーシスを開始させるように使用してもよい。この方法では、ウィ
ルス性ゲノムを内部に持つ腫瘍細胞に、アポトーシスを選択的に誘導することが可能であ
るかもしれない。
【0135】
１０．遺伝子型同定および病原体同定方法
また、本発明の態様は、インビトロでの分子生物学研究開発のためのツールも提供する
。真核生物および原核細胞系生物から、プラスミド、ＰＣＲ産生物、ＢＡＣ配列、ＹＡＣ
配列、ウィルスおよびゲノム配列のような核酸を、単離、クローニングおよび操作するた
めに、部位特異的なエンドヌクレアーゼ（たとえば、制限酵素）を使用することは、当該
分野ではよくあることである（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ １９９９参照）
。したがって、いくつかの実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼを、核酸配列をインビト
ロで操作するために使用する。たとえば、同じＤＮＡ分子内の一対の認識配列を認識する
単鎖メガヌクレアーゼを、細菌プラスミド、ＢＡＣまたはＹＡＣへの連結のような後続の
操作のために、介在ＤＮＡセグメントを単離するために使用することができる。
また、本発明の態様は、インビトロでの分子生物学研究開発のためのツールも提供する
。真核生物および原核細胞系生物から、プラスミド、ＰＣＲ産生物、ＢＡＣ配列、ＹＡＣ
配列、ウィルスおよびゲノム配列のような核酸を、単離、クローニングおよび操作するた
めに、部位特異的なエンドヌクレアーゼ（たとえば、制限酵素）を使用することは、当該
分野ではよくあることである（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ １９９９参照）
。したがって、いくつかの実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼを、核酸配列をインビト
ロで操作するために使用する。たとえば、同じＤＮＡ分子内の一対の認識配列を認識する
単鎖メガヌクレアーゼを、細菌プラスミド、ＢＡＣまたはＹＡＣへの連結のような後続の
操作のために、介在ＤＮＡセグメントを単離するために使用することができる。
【0136】
他の態様では、本発明は、病原体遺伝子および生物を同定するツールを提供する。一実
施形態では、単鎖メガヌクレアーゼを、疾患を起こす対立遺伝子を健康な対立遺伝子から
区別するために、疾患と相関関係がある多形性遺伝子領域に対応する認識部位を切断する
のに使用することができる（たとえば、ヒトＣＦＴＲ遺伝子のΔＦ－５０８対立遺伝子を
認識する単鎖メガヌクレアーゼ、実施例４参照）。この実施形態では、ヒト患者または他
の生物から単離されたＤＮＡ配列を、可能であれば追加の部位特異的なヌクレアーゼとと
もに、単鎖メガヌクレアーゼで消化し、得られたＤＮＡフラグメントパターンを、ゲル電
気泳動法、キャピラリ電気泳動法、質量分析法、または当該分野で公知の他の方法によっ
て分析する。この細分化パターンおよび、具体的には、単鎖メガヌクレアーゼによる切断
の存在または不存在は、認識配列がゲノム中に存在するか否かを明らかにすることにより
、生物の遺伝子型を示す。別の実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼを、病原体ウィルス
、真菌または細菌のゲノム中の多形領域に対して標的化し、生物を同定するために使用す
る。この実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼは、病原体に固有の認識配列を切断し（た
とえば、バクテリア中の１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域、たと
えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｉｅｓｓｅｎら（１９９４），Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １
４０：１１０３－１１０８参照）、ゲノムのエンドヌクレアーゼ消化後の他の密接に関連
した生物から病原体を区別し、電気泳動、質量分析、または当該分野で公知の他の方法に
よるその後の細分化パターンの分析のために使用することができる。
施形態では、単鎖メガヌクレアーゼを、疾患を起こす対立遺伝子を健康な対立遺伝子から
区別するために、疾患と相関関係がある多形性遺伝子領域に対応する認識部位を切断する
のに使用することができる（たとえば、ヒトＣＦＴＲ遺伝子のΔＦ－５０８対立遺伝子を
認識する単鎖メガヌクレアーゼ、実施例４参照）。この実施形態では、ヒト患者または他
の生物から単離されたＤＮＡ配列を、可能であれば追加の部位特異的なヌクレアーゼとと
もに、単鎖メガヌクレアーゼで消化し、得られたＤＮＡフラグメントパターンを、ゲル電
気泳動法、キャピラリ電気泳動法、質量分析法、または当該分野で公知の他の方法によっ
て分析する。この細分化パターンおよび、具体的には、単鎖メガヌクレアーゼによる切断
の存在または不存在は、認識配列がゲノム中に存在するか否かを明らかにすることにより
、生物の遺伝子型を示す。別の実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼを、病原体ウィルス
、真菌または細菌のゲノム中の多形領域に対して標的化し、生物を同定するために使用す
る。この実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼは、病原体に固有の認識配列を切断し（た
とえば、バクテリア中の１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域、たと
えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｉｅｓｓｅｎら（１９９４），Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １
４０：１１０３－１１０８参照）、ゲノムのエンドヌクレアーゼ消化後の他の密接に関連
した生物から病原体を区別し、電気泳動、質量分析、または当該分野で公知の他の方法に
よるその後の細分化パターンの分析のために使用することができる。
【0137】
１１．カスタムＤＮＡ結合ドメインの製造方法
他の態様では、本発明は、エンドヌクレアーゼ切断活性のない単鎖ＤＮＡ結合タンパク
質を提供する。単鎖メガヌクレアーゼの触媒活性は、触媒作用（たとえば、Ｉ－ＣｒｅＩ
におけるＱ４７のＥへの突然変異、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ．４３：１４０１５－１４０２６参照）、Ｉ－ＳｃｅＩにおけるＤ４４または
Ｄ１４５のＮへの突然変異、Ｉ－ＣｅｕＩにおけるＥ６６のＱへの突然変異、Ｉ－Ｍｓｏ
ＩにおけるＤ２２のＮへの突然変異）に関与するアミノ酸に突然変異を起こすことによっ
て、除去することができる。次いで、不活性化されたメガヌクレアーゼを、転写アクチベ
ータ（たとえば、ＧＡＬ４トランス活性化ドメインまたはＶＰ１６トランス活性化ドメイ
ン）、転写抑制因子（たとえば、クルッペルタンパク質からのＫＲＡＢドメイン）、ＤＮ
Ａメチラーゼドメイン（たとえば、Ｍ．ＣｖｉＰＩまたはＭ．ＳｓｓＩ）、またはヒスト
ンアセチル基転移酵素ドメイン（たとえば、ＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２）（これらに限
定されない）を始めとする他のタンパク質から効果ドメインに融合することができる。操
作されたＤＮＡ結合ドメイン、いわゆる操作されたＺｎフィンガドメイン、および効果ド
メインを構成するキメラタンパク質は、当該分野で公知である（たとえば、Ｐａｐｗｏｒ
ｔｈら（２００６），Ｇｅｎｅ ３６６：２７－３８参照）。
他の態様では、本発明は、エンドヌクレアーゼ切断活性のない単鎖ＤＮＡ結合タンパク
質を提供する。単鎖メガヌクレアーゼの触媒活性は、触媒作用（たとえば、Ｉ－ＣｒｅＩ
におけるＱ４７のＥへの突然変異、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ．４３：１４０１５－１４０２６参照）、Ｉ－ＳｃｅＩにおけるＤ４４または
Ｄ１４５のＮへの突然変異、Ｉ－ＣｅｕＩにおけるＥ６６のＱへの突然変異、Ｉ－Ｍｓｏ
ＩにおけるＤ２２のＮへの突然変異）に関与するアミノ酸に突然変異を起こすことによっ
て、除去することができる。次いで、不活性化されたメガヌクレアーゼを、転写アクチベ
ータ（たとえば、ＧＡＬ４トランス活性化ドメインまたはＶＰ１６トランス活性化ドメイ
ン）、転写抑制因子（たとえば、クルッペルタンパク質からのＫＲＡＢドメイン）、ＤＮ
Ａメチラーゼドメイン（たとえば、Ｍ．ＣｖｉＰＩまたはＭ．ＳｓｓＩ）、またはヒスト
ンアセチル基転移酵素ドメイン（たとえば、ＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２）（これらに限
定されない）を始めとする他のタンパク質から効果ドメインに融合することができる。操
作されたＤＮＡ結合ドメイン、いわゆる操作されたＺｎフィンガドメイン、および効果ド
メインを構成するキメラタンパク質は、当該分野で公知である（たとえば、Ｐａｐｗｏｒ
ｔｈら（２００６），Ｇｅｎｅ ３６６：２７－３８参照）。
【実施例0138】
本発明を、以下の実施例によってされに説明するが、これらの実施例を、限定として解
釈すべきではない。当業者は単なる日常の実験、本明細書に記載の特定の物質および手段
と数多くの同等のものを使用することで、認識し、あるいは確認することができるであろ
う。そのような同等のものとは、以下の実施例に続く、請求項の範囲に包含されるもので
ある。実施例１では、先に記載した単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの製造方法（Ｅｐ
ｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－６２
、国際公開公報第２００３／０７８６１９号）が、非パリンドロームＤＮＡ部位を認識す
るメガヌクレアーゼの製造としては十分ではないという証拠を示す。実施例２および３で
は、可撓性Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカ（実施例２）または設計された構造化リンカ（実施例３
）を使用する、本明細書に記載された方法が、非パリンドロームＤＮＡ部位を認識する単
鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを製造するのに十分であるという証拠を示す。実施例２
および３は、以下で、特にＩ－ＣｒｅＩに基づく単鎖メガヌクレアーゼについて記載する
が、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＡｎｉＩに由来するサブユニット
で構成される単鎖メガヌクレアーゼおよび他のＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼも本
明細書で記載されるのと同様に製造および使用することができる。
釈すべきではない。当業者は単なる日常の実験、本明細書に記載の特定の物質および手段
と数多くの同等のものを使用することで、認識し、あるいは確認することができるであろ
う。そのような同等のものとは、以下の実施例に続く、請求項の範囲に包含されるもので
ある。実施例１では、先に記載した単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの製造方法（Ｅｐ
ｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－６２
、国際公開公報第２００３／０７８６１９号）が、非パリンドロームＤＮＡ部位を認識す
るメガヌクレアーゼの製造としては十分ではないという証拠を示す。実施例２および３で
は、可撓性Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカ（実施例２）または設計された構造化リンカ（実施例３
）を使用する、本明細書に記載された方法が、非パリンドロームＤＮＡ部位を認識する単
鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを製造するのに十分であるという証拠を示す。実施例２
および３は、以下で、特にＩ－ＣｒｅＩに基づく単鎖メガヌクレアーゼについて記載する
が、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＡｎｉＩに由来するサブユニット
で構成される単鎖メガヌクレアーゼおよび他のＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼも本
明細書で記載されるのと同様に製造および使用することができる。
【実施例0139】
Ｅｐｉｎａｔらの方法の評価
【0140】
１．Ｅｐｉｎａｔらの方法を使用する単鎖メガヌクレアーゼ
Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２
－６２および国際公開公報第２００３／０７８６１９号は、Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアー
ゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼの製造を報告する。具体的には、筆者らは、Ｉ－Ｄｍ
ｏＩに由来する１１アミノ酸ペプチドリンカ（Ｉ－ＤｍｏＩのアミノ酸９４～１０４，配
列：ＭＬＥＲＩＲＬＦＮＭＲ）を使用して、Ｎ末端Ｉ－ＣｒｅＩサブユニット（Ｉ－Ｃｒ
ｅＩのアミノ酸１～９３）をＣ末端Ｉ－ＣｒｅＩサブユニット（アミノ酸８～１６３）に
結合した。このＮ末端サブユニット－リンカＣ末端サブユニットの特定の配置は、ジ－Ｌ
ＡＧＬＩＤＡＤＧ Ｉ－ＤｍｏＩメガヌクレアーゼのドメイン組織を最もよく模倣してい
るので、これを選択した。筆者らは、単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを実験的に評価
し、野生型Ｉ－ＣｒｅＩホモ二量体に対して有意に少ない割合でも、野生型Ｉ－ＣｒｅＩ
認識配列を効率的に切断することを見出した。
Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２
－６２および国際公開公報第２００３／０７８６１９号は、Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアー
ゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼの製造を報告する。具体的には、筆者らは、Ｉ－Ｄｍ
ｏＩに由来する１１アミノ酸ペプチドリンカ（Ｉ－ＤｍｏＩのアミノ酸９４～１０４，配
列：ＭＬＥＲＩＲＬＦＮＭＲ）を使用して、Ｎ末端Ｉ－ＣｒｅＩサブユニット（Ｉ－Ｃｒ
ｅＩのアミノ酸１～９３）をＣ末端Ｉ－ＣｒｅＩサブユニット（アミノ酸８～１６３）に
結合した。このＮ末端サブユニット－リンカＣ末端サブユニットの特定の配置は、ジ－Ｌ
ＡＧＬＩＤＡＤＧ Ｉ－ＤｍｏＩメガヌクレアーゼのドメイン組織を最もよく模倣してい
るので、これを選択した。筆者らは、単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを実験的に評価
し、野生型Ｉ－ＣｒｅＩホモ二量体に対して有意に少ない割合でも、野生型Ｉ－ＣｒｅＩ
認識配列を効率的に切断することを見出した。
【0141】
該筆者らによって製造された融合タンパク質は、両方とも同じＤＮＡ半部位を認識する
、二つの別の野生型サブユニットを含んでいたので、擬似パリンドローム性野生型ＤＮＡ
部位を使用して、単鎖メガヌクレアーゼを試験する必要があった。したがって、前記筆者
らは、観察された切断活性が、個々の単鎖メガヌクレアーゼによる切断ではなく、それぞ
れの一つのドメインが会合し、野生型ホモ二量体のように、効率的に挙動する機能的メガ
ヌクレアーゼを形成する、二つの単鎖メガヌクレアーゼの分子間二量体による切断のため
であるという可能性を取除くことはできなかった。事実、Ｎ末端Ｉ－ＣｒｅＩサブユニッ
トの実質的な部分（アミノ酸９４～１６３）は、Ｅｐｉｎａｔらによって報告されている
単鎖メガヌクレアーゼの製造において、除去された。三次元Ｉ－ＣｒｅＩ結晶構造検査（
Ｊｕｒｉｃａら（１９９８），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２：４６９－４７６）により、このト
ランケーションにより、三つのαへリックスがＮ末端サブユニットの表面から除去され、
次いで、大部分の疎水性表面積が溶剤に曝されたことは明らかである。したがって、本発
明者らは、Ｅｐｉｎａｔらの単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼからのＮ末端サブユニッ
トは不安定で、不活性であり、観察されたＤＮＡ切断活性は、実際、二つの単鎖タンパク
質からのＣ末端サブユニットの二量体化によるものであると仮定した。Ｅｐｉｎａｔらの
方法の適用から生じるタンパク質安定性の問題は、Ｆａｊａｒｄｏ－Ｓａｎｃｈｅｚら（
２００８），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：２１６３－２１７３でも検討
されている。
、二つの別の野生型サブユニットを含んでいたので、擬似パリンドローム性野生型ＤＮＡ
部位を使用して、単鎖メガヌクレアーゼを試験する必要があった。したがって、前記筆者
らは、観察された切断活性が、個々の単鎖メガヌクレアーゼによる切断ではなく、それぞ
れの一つのドメインが会合し、野生型ホモ二量体のように、効率的に挙動する機能的メガ
ヌクレアーゼを形成する、二つの単鎖メガヌクレアーゼの分子間二量体による切断のため
であるという可能性を取除くことはできなかった。事実、Ｎ末端Ｉ－ＣｒｅＩサブユニッ
トの実質的な部分（アミノ酸９４～１６３）は、Ｅｐｉｎａｔらによって報告されている
単鎖メガヌクレアーゼの製造において、除去された。三次元Ｉ－ＣｒｅＩ結晶構造検査（
Ｊｕｒｉｃａら（１９９８），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２：４６９－４７６）により、このト
ランケーションにより、三つのαへリックスがＮ末端サブユニットの表面から除去され、
次いで、大部分の疎水性表面積が溶剤に曝されたことは明らかである。したがって、本発
明者らは、Ｅｐｉｎａｔらの単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼからのＮ末端サブユニッ
トは不安定で、不活性であり、観察されたＤＮＡ切断活性は、実際、二つの単鎖タンパク
質からのＣ末端サブユニットの二量体化によるものであると仮定した。Ｅｐｉｎａｔらの
方法の適用から生じるタンパク質安定性の問題は、Ｆａｊａｒｄｏ－Ｓａｎｃｈｅｚら（
２００８），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：２１６３－２１７３でも検討
されている。
【0142】
２．Ｅｐｉｎａｔらの方法を使用した単鎖ＬＡＭメガヌクレアーゼの設計
Ｅｐｉｎａｔらによって報告されている単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの製造方法
（Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２
－６２、国際公開公報第２００３／０７８６１９号）を、さらにはっきりと評価するため
に、ＮおよびＣ末端Ｉ－ＣｒｅＩドメインが異なるＤＮＡ半部位を認識する単鎖メガヌク
レアーゼを製造した。Ｅｐｉｎａｔらが報告する方法を使用して、一つのＬＡＭ１ドメイ
ンと一つのＬＡＭ２ドメインとを含む、一対の単鎖メガヌクレアーゼを製造した。この「
ＬＡＭ１ｅｐＬＡＭ２」メガヌクレアーゼ（配列番号：４８）は、Ｎ末端ＬＡＭ１ドメイ
ンと、Ｃ末端ＬＡＭ２ドメインを含み、一方、「ＬＡＭ２ｅｐＬＡＭ１」（配列番号：４
９）は、Ｎ末端ＬＡＭ２ドメインとＣ末端ＬＡＭ１ドメインを含む。全体で、両単鎖メガ
ヌクレアーゼは、Ｅｐｉｎａｔらによって報告されたものとは１１アミノ酸が異なり、全
アミノ酸変化は、サブユニット相互作用に影響を及ぼすことが期待されない、ＤＮＡ認識
に関与する酵素の領域内で起こる。
Ｅｐｉｎａｔらによって報告されている単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの製造方法
（Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２
－６２、国際公開公報第２００３／０７８６１９号）を、さらにはっきりと評価するため
に、ＮおよびＣ末端Ｉ－ＣｒｅＩドメインが異なるＤＮＡ半部位を認識する単鎖メガヌク
レアーゼを製造した。Ｅｐｉｎａｔらが報告する方法を使用して、一つのＬＡＭ１ドメイ
ンと一つのＬＡＭ２ドメインとを含む、一対の単鎖メガヌクレアーゼを製造した。この「
ＬＡＭ１ｅｐＬＡＭ２」メガヌクレアーゼ（配列番号：４８）は、Ｎ末端ＬＡＭ１ドメイ
ンと、Ｃ末端ＬＡＭ２ドメインを含み、一方、「ＬＡＭ２ｅｐＬＡＭ１」（配列番号：４
９）は、Ｎ末端ＬＡＭ２ドメインとＣ末端ＬＡＭ１ドメインを含む。全体で、両単鎖メガ
ヌクレアーゼは、Ｅｐｉｎａｔらによって報告されたものとは１１アミノ酸が異なり、全
アミノ酸変化は、サブユニット相互作用に影響を及ぼすことが期待されない、ＤＮＡ認識
に関与する酵素の領域内で起こる。
【0143】
３．単鎖メガヌクレアーゼの構成
ＬＡＭ１ｅｐＬＡＭ２およびＬＡＭ２ｅｐＬＡＭ１を、Ｉ－ＤｍｏＩリンカ配列（ＭＬ
ＥＲＩＲＬＦＮＭＲに翻訳する）を導入するプライマー、およびクローニング用の制限酵
素部位を用い、既存のＬＡＭ１およびＬＡＭ２遺伝子のＰＣＲによって製造した。次いで
、２個の該ＬＡＭサブユニットを、精製用完全長単鎖遺伝子（Ｎｏｖａｇｅｎ社，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の３’終点で融合された六ヒスチジンタグで、ｐＥＴ－２１ａベク
タにクローン化した。全ての核酸配列を、Ｓａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド配列決定
（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７４
（１２）：５４６３－７参照）を用いて確認した。
ＬＡＭ１ｅｐＬＡＭ２およびＬＡＭ２ｅｐＬＡＭ１を、Ｉ－ＤｍｏＩリンカ配列（ＭＬ
ＥＲＩＲＬＦＮＭＲに翻訳する）を導入するプライマー、およびクローニング用の制限酵
素部位を用い、既存のＬＡＭ１およびＬＡＭ２遺伝子のＰＣＲによって製造した。次いで
、２個の該ＬＡＭサブユニットを、精製用完全長単鎖遺伝子（Ｎｏｖａｇｅｎ社，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の３’終点で融合された六ヒスチジンタグで、ｐＥＴ－２１ａベク
タにクローン化した。全ての核酸配列を、Ｓａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド配列決定
（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７４
（１２）：５４６３－７参照）を用いて確認した。
【0144】
以下の方法を使用して、ＬＡＭｅｐメガヌクレアーゼを発現させ、精製した。ｐＥＴ２
１ａベクタにクローン化された構築物を、化学的に形質転換受容性のあるＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、２００μｇ／ｍｌのカルベニシリンの入った標準の２ｘＹ
Ｔプレートに播いた。一晩成長させた後、形質転換細菌コロニを、プレートからこすり落
とし、５０ｍｌの２ＸＹＴブロスを接種するために使用した。細胞を振盪しながら３７℃
で６００ｎｍの波長の吸光度が０．９になるまで成長させた。次いで、成長温度を３７℃
から２２℃に下げた。タンパク質発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘発し、細胞を攪
拌しながら２時間半培養した。次いで、細胞を６０００×ｇで１０分、遠心分離によって
ペレット化した。ペレットをボルテックス処理によって１ｍｌの結合緩衝液（２０ｍＭの
トリ－ＨＣＬ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）に再懸濁
した。次いで、細胞を５０％電力で１２パルスの音波処理によって崩壊し、細胞の残骸を
１４，０００×ｇで１５分間の遠心分離によってペレット化した。細胞上澄みを４ｍｌの
結合緩衝液で希釈し、２００μｌのニッケルを詰めた金属キレート・セファロース・カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に充填した。
１ａベクタにクローン化された構築物を、化学的に形質転換受容性のあるＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、２００μｇ／ｍｌのカルベニシリンの入った標準の２ｘＹ
Ｔプレートに播いた。一晩成長させた後、形質転換細菌コロニを、プレートからこすり落
とし、５０ｍｌの２ＸＹＴブロスを接種するために使用した。細胞を振盪しながら３７℃
で６００ｎｍの波長の吸光度が０．９になるまで成長させた。次いで、成長温度を３７℃
から２２℃に下げた。タンパク質発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘発し、細胞を攪
拌しながら２時間半培養した。次いで、細胞を６０００×ｇで１０分、遠心分離によって
ペレット化した。ペレットをボルテックス処理によって１ｍｌの結合緩衝液（２０ｍＭの
トリ－ＨＣＬ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）に再懸濁
した。次いで、細胞を５０％電力で１２パルスの音波処理によって崩壊し、細胞の残骸を
１４，０００×ｇで１５分間の遠心分離によってペレット化した。細胞上澄みを４ｍｌの
結合緩衝液で希釈し、２００μｌのニッケルを詰めた金属キレート・セファロース・カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に充填した。
【0145】
続いて、カラムを、４ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭのトリ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０
０ｍＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのイミダゾール）、および０．２ｍｌの溶離緩衝液（２０ｍ
Ｍのトリ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのイミダゾール）で
洗浄した。メガヌクレアーゼ酵素を、追加の０．６ｍｌ溶離緩衝液で溶離し、Ｖｉｖｏｓ
ｐｉｎ使い捨て濃縮器（ＩＳＣ社，Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，ＵＴ）を使用して、５０～１３
０μｌに濃縮した。アッセイおよび保存のため、該酵素を、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（
Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、
ＳＡ緩衝液（２５ｍＭのトリ－ＨＣＬ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭ
ｇＣｌ２、５ｍＭのＥＤＴＡ）に交換した。酵素濃度を、２３，５９０Ｍ－１ｃｍ－１の
吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。次いで、酵素の純度およ
び分子量を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により確かめた。
０ｍＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのイミダゾール）、および０．２ｍｌの溶離緩衝液（２０ｍ
Ｍのトリ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのイミダゾール）で
洗浄した。メガヌクレアーゼ酵素を、追加の０．６ｍｌ溶離緩衝液で溶離し、Ｖｉｖｏｓ
ｐｉｎ使い捨て濃縮器（ＩＳＣ社，Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，ＵＴ）を使用して、５０～１３
０μｌに濃縮した。アッセイおよび保存のため、該酵素を、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（
Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、
ＳＡ緩衝液（２５ｍＭのトリ－ＨＣＬ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭ
ｇＣｌ２、５ｍＭのＥＤＴＡ）に交換した。酵素濃度を、２３，５９０Ｍ－１ｃｍ－１の
吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。次いで、酵素の純度およ
び分子量を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により確かめた。
【0146】
４．切断アッセイ
先に記載したように精製した全ての酵素の活性を、メガヌクレアーゼ認識配列を含む直
鎖二本鎖ＤＮＡ基質を用いる培養によってアッセイした。認識配列のセンスおよびアンチ
センス鎖の両方に対応する合成オリゴヌクレオチドをアニールし、ブラントエンド連結に
より、ｐＵＣ１９プラスミドのＳｍａｌ部位にクローン化した。クローン化された結合部
位の配列を、Ｓａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド配列決定によって確認した。全てのプ
ラスミド基質を、メガヌクレアーゼ消化と同時にＸｍｎＩまたはＳｃａＩにより直線化し
た。酵素分解物は、５μｌの０．０５μＭのＤＮＡ基質、２．５μｌの５μＭ単鎖メガヌ
クレアーゼ、９．５μｌのＳＡ緩衝液、および０．５μｌのＸｍｎＩまたはＳｃａＩを含
んでいた。分解物を３７℃で４時間培養した。分解を０．３ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼ
Ｋおよび０．５％ＳＤＳを加えることによって停止し、分解物を３７℃で１時間培養した
。分解物を１．５％アガロースで分析し、臭化エチジウム染色によって視覚化した。
５．結果
先に記載したように精製した全ての酵素の活性を、メガヌクレアーゼ認識配列を含む直
鎖二本鎖ＤＮＡ基質を用いる培養によってアッセイした。認識配列のセンスおよびアンチ
センス鎖の両方に対応する合成オリゴヌクレオチドをアニールし、ブラントエンド連結に
より、ｐＵＣ１９プラスミドのＳｍａｌ部位にクローン化した。クローン化された結合部
位の配列を、Ｓａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド配列決定によって確認した。全てのプ
ラスミド基質を、メガヌクレアーゼ消化と同時にＸｍｎＩまたはＳｃａＩにより直線化し
た。酵素分解物は、５μｌの０．０５μＭのＤＮＡ基質、２．５μｌの５μＭ単鎖メガヌ
クレアーゼ、９．５μｌのＳＡ緩衝液、および０．５μｌのＸｍｎＩまたはＳｃａＩを含
んでいた。分解物を３７℃で４時間培養した。分解を０．３ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼ
Ｋおよび０．５％ＳＤＳを加えることによって停止し、分解物を３７℃で１時間培養した
。分解物を１．５％アガロースで分析し、臭化エチジウム染色によって視覚化した。
５．結果
【0147】
Ｅｐｉｎａｔらの方法を使用して製造されたＬＡＭｅｐメガヌクレアーゼを、ＬＡＭ１
パリンドローム（配列番号：４０および４１）、ＬＡＭ２パリンドローム（配列番号：４
４および４５）、またはＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位（配列番号：４６および４
７）を含むＤＮＡ基質で培養した。ＬＡＭ１ｅｐＬＡＭ２単鎖メガヌクレアーゼは、主と
してＬＡＭ２パリンドロームを切断することが確認され、一方ＬＡＭ２ｅｐＬＡＭ１単鎖
メガヌクレアーゼは、主としてＬＡＭ１パリンドロームを切断することが見られた。どち
らの単鎖メガヌクレアーゼも、ハイブリッド部位を有意な程度に切断しなかった。これら
の結果は、Ｅｐｉｎａｔらの方法では、実際、非パリンドロームＤＮＡ配列を切断するこ
とができない単鎖メガヌクレアーゼを産生することを示唆している。両単鎖メガヌクレア
ーゼは、Ｃ末端サブユニットによって認識される半部位のパリンドロームに対応する認識
配列を主として切断することが見られ、Ｎ末端サブユニットは不活性であることを示唆し
ている。したがって、Ｅｐｉｎａｔらによって特徴付けられた活性メガヌクレアーゼ種は
、本質的に、一対の単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＣ末端サブユニット間の二量体
であるようである。あるいは、パリンドローム性ＤＮＡ部位の切断は、異なる単鎖Ｉ－Ｃ
ｒｅＩメガヌクレアーゼのＣ末端サブユニットによる逐次一本鎖ニッキングによるためか
もしれない。どちらの場合も、Ｅｐｉｎａｔらによる主張とは対照的に、該方法では、実
質的に機能的な単鎖Ｉ－ＣｒｅＩヘテロ二量体を産生せず、一般的に、非パリンドローム
ＤＮＡ部位の認識および切断に有用ではない。
パリンドローム（配列番号：４０および４１）、ＬＡＭ２パリンドローム（配列番号：４
４および４５）、またはＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位（配列番号：４６および４
７）を含むＤＮＡ基質で培養した。ＬＡＭ１ｅｐＬＡＭ２単鎖メガヌクレアーゼは、主と
してＬＡＭ２パリンドロームを切断することが確認され、一方ＬＡＭ２ｅｐＬＡＭ１単鎖
メガヌクレアーゼは、主としてＬＡＭ１パリンドロームを切断することが見られた。どち
らの単鎖メガヌクレアーゼも、ハイブリッド部位を有意な程度に切断しなかった。これら
の結果は、Ｅｐｉｎａｔらの方法では、実際、非パリンドロームＤＮＡ配列を切断するこ
とができない単鎖メガヌクレアーゼを産生することを示唆している。両単鎖メガヌクレア
ーゼは、Ｃ末端サブユニットによって認識される半部位のパリンドロームに対応する認識
配列を主として切断することが見られ、Ｎ末端サブユニットは不活性であることを示唆し
ている。したがって、Ｅｐｉｎａｔらによって特徴付けられた活性メガヌクレアーゼ種は
、本質的に、一対の単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＣ末端サブユニット間の二量体
であるようである。あるいは、パリンドローム性ＤＮＡ部位の切断は、異なる単鎖Ｉ－Ｃ
ｒｅＩメガヌクレアーゼのＣ末端サブユニットによる逐次一本鎖ニッキングによるためか
もしれない。どちらの場合も、Ｅｐｉｎａｔらによる主張とは対照的に、該方法では、実
質的に機能的な単鎖Ｉ－ＣｒｅＩヘテロ二量体を産生せず、一般的に、非パリンドローム
ＤＮＡ部位の認識および切断に有用ではない。
【実施例0148】
可撓性Ｇｌｖ－Ｓｅｒリンカを用いて製造された単鎖Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ
【0149】
１．Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカを用いた単鎖ＬＡＭメガヌクレアーゼの設計
表３のリンカ３を使用して、設計されたＬＡＭ１およびＬＡＭ２エンドヌクレアーゼを
融合し、単鎖ポリペプチドとした。Ｖａｌ－１５１をＮ末端融合ポイント（ＬＡＭ１サブ
ユニットに対する）として使用し、一方Ｐｈｅ－９をＣ末端融合ポイント（ＬＡＭ２サブ
ユニットに対する）として使用した。実施例１に記載したように、得られた単鎖メガヌク
レアーゼ、「ＬＡＭ１ｇｓＬＡＭ２」（配列番号：５０）をｐＥＴ２１ａにクローン化し
、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、精製した。
表３のリンカ３を使用して、設計されたＬＡＭ１およびＬＡＭ２エンドヌクレアーゼを
融合し、単鎖ポリペプチドとした。Ｖａｌ－１５１をＮ末端融合ポイント（ＬＡＭ１サブ
ユニットに対する）として使用し、一方Ｐｈｅ－９をＣ末端融合ポイント（ＬＡＭ２サブ
ユニットに対する）として使用した。実施例１に記載したように、得られた単鎖メガヌク
レアーゼ、「ＬＡＭ１ｇｓＬＡＭ２」（配列番号：５０）をｐＥＴ２１ａにクローン化し
、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、精製した。
【0150】
２．結果
ＬＡＭ１ｇｓＬＡＭ２の切断活性を、実施例１記載のものと同じＤＮＡ基質および培養
条件を使用してアッセイした。ＬＡＭｅｐメガヌクレアーゼに関する結果とは対照的に、
ＬＡＭ１ｇｓＬＡＭ２は、主にハイブリッドＬＡＭ１／ＬＡＭ２認識配列（配列番号：４
６および４７）を切断することが見られた。切断の程度は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＬＡＭ１お
よびＬＡＭ２単量体を共発現することによって製造したＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体
に比べて有意に減少した。同じ反応条件下で、ヘテロ二量体はＬＡＭ１／ＬＡＭ２認識配
列を完全に切断し、これは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカは、ある程度切断活性を弱めることを
示唆する。それにもかかわらず、ＬＡＭ１ｇｓＬＡＭ２は、ハイブリッド部位に関し、パ
リンドローム性ＬＡＭ１またはＬＡＭ２部位よりも非常に強い優先度を示し、したがって
、これは、特異性が活性より大きく重要である用途のために有用性がある。
ＬＡＭ１ｇｓＬＡＭ２の切断活性を、実施例１記載のものと同じＤＮＡ基質および培養
条件を使用してアッセイした。ＬＡＭｅｐメガヌクレアーゼに関する結果とは対照的に、
ＬＡＭ１ｇｓＬＡＭ２は、主にハイブリッドＬＡＭ１／ＬＡＭ２認識配列（配列番号：４
６および４７）を切断することが見られた。切断の程度は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＬＡＭ１お
よびＬＡＭ２単量体を共発現することによって製造したＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体
に比べて有意に減少した。同じ反応条件下で、ヘテロ二量体はＬＡＭ１／ＬＡＭ２認識配
列を完全に切断し、これは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカは、ある程度切断活性を弱めることを
示唆する。それにもかかわらず、ＬＡＭ１ｇｓＬＡＭ２は、ハイブリッド部位に関し、パ
リンドローム性ＬＡＭ１またはＬＡＭ２部位よりも非常に強い優先度を示し、したがって
、これは、特異性が活性より大きく重要である用途のために有用性がある。
