(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023029903
(43)【公開日】2023-03-07
(54)【発明の名称】発現及び分泌システム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230228BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230228BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230228BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230228BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230228BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230228BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230228BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20230228BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230228BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230228BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
C12P21/08
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/00
C07K19/00
C12N15/11 Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022189048
(22)【出願日】2022-11-28
(62)【分割の表示】P 2020188390の分割
【原出願日】2013-07-03
(31)【優先権主張番号】61/668,397
(32)【優先日】2012-07-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】61/852,483
(32)【優先日】2013-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】61/819,063
(32)【優先日】2013-05-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】テーザー， デヴィン
(72)【発明者】
【氏名】チェン， シャオチョン
(72)【発明者】
【氏名】デニス， マーク
(72)【発明者】
【氏名】ホッツェル， イシドロ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】原核細胞における第一の融合タンパク質及び真核細胞における第二の融合タンパク質の発現及び分泌のための発現及び分泌系及びその使用方法を提供する。また、核酸分子、ベクター及びそのようなベクター及び核酸分子を含む宿主細胞を提供する。
【解決手段】可変重鎖ドメイン（ＶＨ）のＶＨ－ＨＶＲ１、ＶＨ－ＨＶＲ２及びＶＨ－ＨＶＲ３を含む第一ポリペプチド及び／又は可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のＶＬ－ＨＶＲ１、ＶＬ－ＨＶＲ２及びＶＬ－ＨＶＲ３を含む第二ポリペプチドをコードする核酸分子であって、該核酸分子は、原核細胞及び真核細胞の両方で機能的であり、及び、第一及び／又は第二ポリペプチド配列に作動可能に連結される核酸配列によってコードされているシグナル配列を更にコードし、及び、完全長抗体は、核酸分子の第一及び／又は第二ポリペプチドから発現される核酸分子を提供する。
【選択図】図１４
【解決手段】可変重鎖ドメイン（ＶＨ）のＶＨ－ＨＶＲ１、ＶＨ－ＨＶＲ２及びＶＨ－ＨＶＲ３を含む第一ポリペプチド及び／又は可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のＶＬ－ＨＶＲ１、ＶＬ－ＨＶＲ２及びＶＬ－ＨＶＲ３を含む第二ポリペプチドをコードする核酸分子であって、該核酸分子は、原核細胞及び真核細胞の両方で機能的であり、及び、第一及び／又は第二ポリペプチド配列に作動可能に連結される核酸配列によってコードされているシグナル配列を更にコードし、及び、完全長抗体は、核酸分子の第一及び／又は第二ポリペプチドから発現される核酸分子を提供する。
【選択図】図１４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
可変重鎖ドメイン（ＶＨ）のＶＨ－ＨＶＲ１、ＶＨ－ＨＶＲ２及びＶＨ－ＨＶＲ３を含む第一ポリペプチド及び／又は可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のＶＬ－ＨＶＲ１、ＶＬ－ＨＶＲ２及びＶＬ－ＨＶＲ３を含む第二ポリペプチドをコードする核酸分子であって、該核酸分子は、原核細胞及び真核細胞の両方で機能的であり、及び、第一及び／又は第二ポリペプチド配列に作動可能に連結される核酸配列によってコードされているシグナル配列を更にコードし、及び、完全長抗体は、核酸分子の第一及び／又は第二ポリペプチドから発現される核酸分子。
【請求項2】
原核細胞及び真核細胞内で、可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをコードし、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインに作動可能に連結され、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインの発現を可能にする、原核生物プロモーター及び／又は真核生物プロモーターを含む核酸分子であって、ＶＨドメイン及び／又はＶＬは、真核細胞によって発現された場合にユーティリティペプチドに連結され、核酸は、原核細胞及び真核細胞の両方で機能的であるシグナル配列を更にコードする、核酸分子。
【請求項3】
ＶＬ及びＶＨがユーティリティペプチドに連結される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項4】
ＶＨはＣＨ１に更に連結され、ＶＬドメインはＣＬに連結される、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項5】
ユーティリティペプチドは、Ｆｃ、タグ、標識及びコントロールタンパク質からなる群から選択される、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項6】
ＶＬはコントロールタンパク質に連結され、ＶＨはＦｃに連結される、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項7】
コントロールタンパク質は、ｇＤタンパク質又はその断片である、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項8】
第一及び／又は第二ポリペプチドは、コートタンパク質又はアダプタータンパク質に融合される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項9】
コートタンパク質又はアダプタータンパク質をコードする核酸分子は合成イントロン内に含まれる、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項10】
合成イントロンは、ＶＨドメインをコードする核酸及びＦｃ又はヒンジをコードする核酸との間に位置する、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項11】
合成イントロンは、ＩｇＧ１からの天然に存在するイントロンをコードする核酸を含む、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項12】
天然に存在するイントロンが、ＩｇＧ１からのイントロン１、イントロン２又はイントロン３を含む群から選択される、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項13】
天然に存在するイントロンが、ＩｇＧ１からのイントロン１である、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項14】
アダプタータンパク質は、ロイシンジッパーである、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項15】
アダプタータンパク質は、配列番号８、９、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項16】
アダプタータンパク質は、配列番号８、９、１２、１３、１４又は１５の少なくとも一のアミノ酸配列の改変を有するアミノ酸配列を含み、及びアダプタータンパク質は、配列番号８、９、１２、１３、１４又は１５の少なくとも一残基での改変を含み、及び改変はアダプタータンパク質の別のアダプタータンパク質への親和性を維持又は増大させる、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項17】
コートタンパク質は、バクテリオファージＭ１３、ｆ１又はｆｄのｐＩ、ｐＩＩ、ｐＩＩＩ、ｐＩＶ、ｐＶ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＩＸ及びｐＸからなる群から選択される、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項18】
コートタンパク質は、ｐＩＩＩタンパク質又はその断片である、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項19】
ｐＩＩＩ断片は、ｐＩＩＩタンパク質のアミノ酸２６７から４２１又は２６２から４１８である、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項20】
原核細胞においては第一融合タンパク質が発現され、真核細胞においては第二融合タンパク質が発現される、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項21】
第一融合タンパク質と第二融合タンパク質は同一である、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項22】
第一融合タンパク質と第二融合タンパク質は異なる、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項23】
第一融合タンパク質は、Ｆａｂ－ファージ融合タンパク質である、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項24】
Ｆａｂ－ファージ融合タンパク質はｐＩＩＩに融合したＶＨ／ＣＨ１を含む、請求項２３に記載の核酸分子。
【請求項25】
第二融合体は、Ｆａｂ－Ｆｃ又はＦａｂ－ヒンジ－Ｆｃ融合タンパク質である、請求項２４に記載の核酸分子。
【請求項26】
Ｆａｂ－Ｆｃ又はＦａｂ－ヒンジ－Ｆｃ融合タンパク質はＦｃに融合したＶＨ／ＣＨ１を含む、請求項２５に記載の核酸分子。
【請求項27】
シグナル配列は真核細胞における小胞体への又は細胞外へのタンパク質分泌を指示する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項28】
シグナル配列は原核細胞におけるペリプラズムへの又は細胞外へのタンパク質分泌を指示する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項29】
ＣＨ１ドメインをコードする核酸は、天然スプライスドナー配列の一部を含む、請求項２８に記載の核酸分子。
【請求項30】
Ｆｃをコードする核酸は、天然スプライスアクセプター配列の一部を含む、請求項２８に記載の核酸分子。
【請求項31】
ＣＨ１ドメインをコードする核酸は、改変されたスプライスドナー配列の一部を含む、請求項２８に記載の核酸分子。
【請求項32】
改変されたスプライスドナー配列は少なくとも一の核酸残基の改変を含み、その改変はスプライシングを増加させる、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項33】
アダプタータンパク質は、配列番号６（ＡＳＩＡＲＬＲＥＲＶＫＴＬＲＡＲＮＹＥＬＲＳＲＡＮＭＬＲＥＲＶＡＱＬＧＧＣ）又は配列番号７（ＡＳＬＤＥＬＥＡＥＩＥＱＬＥＥＥＮＹＡＬＥＫＥＩＥＤＬＥＫＥＬＥＫＬＧＧＣ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項34】
原核生物のプロモーターは、ｐｈｏＡ、Ｔａｃ、Ｔｐｈａｃ又はＬａｃプロモーターである、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項35】
真核生物のプロモーターは、ＣＭＶ又はＳＶ４０である、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項36】
シグナル配列は、配列番号１０（ＸＭＫＦＴＶＶＡＡＡＬＬＬＬＧＡＶＲＡ、ここでＸ＝０アミノ酸又は１又は２アミノ酸（例えば、Ｘ＝Ｍ又はＸ＝ＭＴ又はＸは存在しない）のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列によりコードされる、請求項２７又は２８に記載の核酸分子。
【請求項37】
シグナル配列はｍＢＩＰをコードする核酸配列及びその変異体によってコードされる、請求項２７又は２８に記載の核酸分子。
【請求項38】
シグナル配列は、配列番号３（ｍＢＩＰアミノ酸配列）から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされ、該シグナル配列は原核細胞及び真核細胞の両方において機能する、請求項２７又は２８に記載の核酸分子。
【請求項39】
シグナル配列は、配列番号１１（コンセンサスｍＢＩＰ配列、Ｘ ＡＴＧ ＡＡＮ ＴＴＮ ＡＣＮ ＧＴＮ ＧＴＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＧＧＮ ＧＣＮ ＧＴＮ ＣＧＮ ＧＣＮ、ここでＮ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ここでＸ＝ＡＴＧ、Ｘ＝ＡＴＧ ＡＣＣ又はＸは存在しない）の核酸配列によってコードされる、請求項２７又は２８に記載の核酸分子。
【請求項40】
シグナル配列は、配列番号１６（Ｏｐｔ１）、配列番号１７（Ｏｐｔ２）及び配列番号１８（Ｏｐｔ３）の群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項41】
原核生物のプロモーターによる発現は、細菌細胞内で起きる、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項42】
真核生物のプロモーターによる発現は、哺乳動物細胞内で起きる、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項43】
細菌細胞は大腸菌細胞である、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項44】
哺乳動物細胞は、酵母細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞又はＮＳＯ細胞である、請求項４２に記載の核酸分子。
【請求項45】
請求項１から４４の何れか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項46】
請求項４５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項47】
宿主細胞は細菌細胞である、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項48】
細菌細胞は大腸菌細胞である、請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項49】
宿主細胞は真核細胞である、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項50】
真核細胞は、酵母細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞又はＮＳＯ細胞である、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項51】
核酸が発現されるように、請求項４６に記載の宿主細胞を培養することを含む抗体を生成するための方法。
【請求項52】
宿主細胞により発現された抗体を回収することを更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
抗体が宿主細胞培養培地から回収される、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
配列番号８、９、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸配列の少なくとも一残基の改変を含むアダプタータンパク質。
【請求項55】
アダプタータンパク質は、配列番号６（ＡＳＩＡＲＬＲＥＲＶＫＴＬＲＡＲＮＹＥＬＲＳＲＡＮＭＬＲＥＲＶＡＱＬＧＧＣ）又は配列番号７（ＡＳＬＤＥＬＥＡＥＩＥＱＬＥＥＥＮＹＡＬＥＫＥＩＥＤＬＥＫＥＬＥＫＬＧＧＣ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載のアダプタータンパク質。
【請求項56】
請求項５４又は５５に記載のアダプタータンパク質をコードする核酸分子。
【請求項57】
配列番号３のアミノ酸配列を含むｍＢＩＰポリペプチド又はその変異体をコードする単離された核酸分子であって、原核細胞及び真核細胞の両方で機能する核酸分子。
【請求項58】
配列番号３から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項59】
配列番号３のアミノ酸配列を含むｍＢＩＰポリペプチド又はその変異体を発現する細菌細胞。
【請求項60】
原核細胞及び真核細胞の両方において、配列番号３のアミノ酸配列を含むｍＢＩＰポリペプチド又はその変異体を発現する方法。
【請求項61】
合成イントロンは、抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードする核酸の間に位置する、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項62】
合成イントロンは、抗体のヒンジ領域及びＣＨ２ドメインをコードする核酸の間に位置する、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項63】
配列番号３のアミノ酸配列を含むシグナル配列、又はその変異体、ＶＨドメインがＶＬドメインのＮ末端に連結された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含むポリペプチド。
【請求項64】
配列番号３のアミノ酸配列を含むシグナル配列、又はその変異体、ＶＨドメインがＶＬドメインのＣ末端に連結された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含むポリペプチド。
【請求項65】
配列番号３のアミノ酸配列を含むシグナル配列、又はその変異体、及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）のＶＨ－ＨＶＲ１、ＶＨ－ＨＶＲ２、及びＶＨ－ＨＶＲ３を含むポリペプチド。
【請求項66】
配列番号３のアミノ酸配列を含むシグナル配列、又はその変異体、及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のＶＬ－ＨＶＲ１、ＶＬ－ＨＶＲ２、及びＶＬ－ＨＶＲ３を含むポリペプチド。
【請求項67】
配列番号３のアミノ酸配列を含むシグナル配列、又はその変異体、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）のＶＨ－ＨＶＲ１、ＶＨ－ＨＶＲ２及びＶＨ－ＨＶＲ３、及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のＶＬ－ＨＶＲ１、ＶＬ－ＨＶＲ２及びＶＬ－ＨＶＲ３を含むポリペプチド。
【請求項68】
ポリペプチドが抗体又は抗体断片である、請求項６３から６７の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項69】
抗体が、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、ダイアボディー、及び一本鎖抗体分子からなる群から選択される、請求項１又は６８に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項70】
アンバー変異を含むヘルパーファージが、ファージ上のｐＩＩＩに融合したタンパク質のディスプレイを増強する、ｐＩＩＩにアンバー変異を含むヘルパーファージのヌクレオチド配列。
【請求項71】
アンバー変異は、Ｍ１３ＫＯ７の核酸のヌクレオチド２６１３、２６１４及び２６１６における変異である、請求項７０に記載のヌクレオチド配列。
【請求項72】
Ｍ１３ＫＯ７の核酸のヌクレオチド２６１３、２６１４及び２６１６における変異は、アンバー終止コドンを導入する、請求項７１に記載のヌクレオチド配列。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【0001】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１２年７月５日に出願された米国仮出願番号６１／６６８３９７、２０１３年３月１５日に出願された６１／８５２４８３及び２０１３年５月３日に出願された６１／８１９０６３の利益を主張し、それらの全ては、本明細書にその全体が参考として援用される。
この出願は、２０１２年７月５日に出願された米国仮出願番号６１／６６８３９７、２０１３年３月１５日に出願された６１／８５２４８３及び２０１３年５月３日に出願された６１／８１９０６３の利益を主張し、それらの全ては、本明細書にその全体が参考として援用される。
【技術分野】
【0002】
発明の分野
本発明は、核酸がファージディスプレイのために原核細胞に形質転換された場合には一のＦａｂ融合タンパク質、核酸が発現及び精製のために真核細胞にトランスフェクトされた場合には別個又は同一のＦａｂ融合タンパク質の発現及び分泌のための、発現及び分泌系及びその使用方法に関する。また、本明細書で提供されるのは、核酸分子、ベクター及びそのようなベクター及び核酸分子を含む宿主細胞である。
本発明は、核酸がファージディスプレイのために原核細胞に形質転換された場合には一のＦａｂ融合タンパク質、核酸が発現及び精製のために真核細胞にトランスフェクトされた場合には別個又は同一のＦａｂ融合タンパク質の発現及び分泌のための、発現及び分泌系及びその使用方法に関する。また、本明細書で提供されるのは、核酸分子、ベクター及びそのようなベクター及び核酸分子を含む宿主細胞である。
【背景技術】
【0003】
背景
繊維状ファージ粒子上のペプチド又はタンパク質のファージディスプレイは、変異体ペプチド又はタンパク質の大きなプールから所望の特性を有するペプチド又はタンパク質の選択を可能にするインビトロの技術である(McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Sidhu et al., Current Opinion in Biotechnology, 11: 610-616 (2000); Smith et al., Science, 228: 1315-1317 (1985))。ファージディスプレイは、抗体の検出の場において、Ｆａｂのような抗体断片を含む、ペプチド又はタンパク質の多様なライブラリーを、後に目的の特定の抗原への結合のために選択される、糸状ファージ粒子の表面上に提示するために使用することができる。抗体断片は、抗体断片の遺伝子をファージコートタンパク質の遺伝子に対して融合することによって、繊維状ファージ粒子の表面上に提示することができ、コードされた抗体断片を表面上に表示するファージ粒子を生じる。この技術は、大きなファージライブラリーから、多数の抗原に対して所望の親和性を有する抗体断片の単離を可能にする。
繊維状ファージ粒子上のペプチド又はタンパク質のファージディスプレイは、変異体ペプチド又はタンパク質の大きなプールから所望の特性を有するペプチド又はタンパク質の選択を可能にするインビトロの技術である(McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Sidhu et al., Current Opinion in Biotechnology, 11: 610-616 (2000); Smith et al., Science, 228: 1315-1317 (1985))。ファージディスプレイは、抗体の検出の場において、Ｆａｂのような抗体断片を含む、ペプチド又はタンパク質の多様なライブラリーを、後に目的の特定の抗原への結合のために選択される、糸状ファージ粒子の表面上に提示するために使用することができる。抗体断片は、抗体断片の遺伝子をファージコートタンパク質の遺伝子に対して融合することによって、繊維状ファージ粒子の表面上に提示することができ、コードされた抗体断片を表面上に表示するファージ粒子を生じる。この技術は、大きなファージライブラリーから、多数の抗原に対して所望の親和性を有する抗体断片の単離を可能にする。
【0004】
ファージに基づく抗体発見のため、選択された抗体断片及び機能アッセイ（標的結合、細胞ベースの活性アッセイ、インビボでの半減期など）におけるそれらの同族ＩｇＧの特性の評価は、ファージディスプレイのために使用されたベクターのうち、ＨＣ及びＬＣをコードするＤＮＡ配列を、ＩｇＧ発現用の哺乳類発現ベクター中へサブクローニングすることによる、完全長のＩｇＧへのＦａｂ重鎖（ＨＣ）配列と軽鎖（ＬＣ）配列の再フォーマットを必要とする。選択したＨＣ／ＬＣペアの数十又は数百をサブクローニングする労力の要るプロセスは、ファージに基づく抗体の検出プロセスにおける主要なボトルネックを表している。更に、選択されたＦａｂのかなりの割合は、一度再フォーマットされると、初期スクリーニングアッセイにおいて満足に機能することができないので、この再フォーマット化／スクリーニング工程を通して運ばれたクローンの数を増やすことにより、最終的な成功確率を大幅に増加させる。
【0005】
本明細書では、大腸菌に形質転換された場合のＦａｂファージ融合体の発現を駆動するための発現及び分泌系の生成、及び哺乳動物細胞にトランスフェクトされた場合に、同一のＦａｂ断片を有する完全長ＩｇＧの発現の駆動の生成を説明する。我々は、マウスの結合性免疫グロブリンタンパク質からの哺乳動物シグナル配列（ｍＢｉＰ）（Haas et al., 免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Immunoglobulin heavy chain binding protein), Nature, 306: 387-389 (1983); Munro et al., ＥＲにおけるＨｓｐ７０様タンパク質は、７８ｋｄのグルコース調節タンパク質及び免疫グロブリン重鎖結合タンパク質と同一である（An Hsp70-like protein in the ER: identify with the 78 kd glucose-regulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein), Cell, 4:291-300 (1986) は、原核細胞及び真核細胞の両方で効率的なタンパク質の発現を駆動することができることを示している。ヒトＩｇＧ１ ＨＣのヒンジ領域内に挿入されたファージ融合ペプチドを含有する合成イントロンを除去するために、我々は、哺乳動物のｍＲＮＡスプライシングを用いて、宿主細胞依存的に二つの異なるタンパク質：大腸菌においてファージディスプレイアダプターペプチドに融合したＦａｂ断片及び哺乳動物細胞における天然型ヒトＩｇＧ１を生成することができる。この技術は、サブクローニングを必要としない、哺乳動物細胞におけるその後の発現及び同族完全長ＩｇＧの精製を伴う、ファージディスプレイライブラリーからの、目的の抗原に結合するＦａｂ断片の選択を可能にする。
【発明の概要】
【0006】
概要
一態様において、本発明は、（１）原核細胞における非原核生物起源の機能のシグナル配列及び（２）異なったＦａｂ融合タンパク質は、ｍＲＮＡプロセシングが原核細胞でなく真核細胞において起きる場合に、宿主細胞依存的に同一の核酸分子から発現される（原核細胞中のＦａｂファージ融合タンパク質及び真核細胞中のＦａｂ－Ｆｃ融合タンパク質）ことを実証する実験的発見に一部基づいている。従って、本明細書中に記載されるのは、サブクローニングを必要とせずに、核酸が、原核生物宿主細胞（例えば大腸菌）に形質転換された場合に、細菌におけるファージディスプレイのための、ファージ粒子タンパク質、コートタンパク質又はアダプタータンパク質に融合したＦａｂ断片、及び核酸が真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）に形質転換された場合に、Ｆｃに融合したＦａｂ断片の発現及び分泌のための核酸分子、及びその使用の方法である。
一態様において、本発明は、（１）原核細胞における非原核生物起源の機能のシグナル配列及び（２）異なったＦａｂ融合タンパク質は、ｍＲＮＡプロセシングが原核細胞でなく真核細胞において起きる場合に、宿主細胞依存的に同一の核酸分子から発現される（原核細胞中のＦａｂファージ融合タンパク質及び真核細胞中のＦａｂ－Ｆｃ融合タンパク質）ことを実証する実験的発見に一部基づいている。従って、本明細書中に記載されるのは、サブクローニングを必要とせずに、核酸が、原核生物宿主細胞（例えば大腸菌）に形質転換された場合に、細菌におけるファージディスプレイのための、ファージ粒子タンパク質、コートタンパク質又はアダプタータンパク質に融合したＦａｂ断片、及び核酸が真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）に形質転換された場合に、Ｆｃに融合したＦａｂ断片の発現及び分泌のための核酸分子、及びその使用の方法である。
【0007】
一実施態様において、本発明は、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）のＶＨ－ＨＶＲ１、ＶＨ－ＨＶＲ２及ＨＶＲ３を含む第一ポリペプチド、及び／又は可変軽鎖ドメインのＶＬ－ＨＶＲ１、ＶＬ－ＨＶＲ２及びＶＬ－ＨＶＲ３を含む第二ポリペプチドをコードする核酸分子を提供し、ここで、その核酸分子は、原核細胞及び真核細胞の両方で機能的であり、及び、第一及び／又は第二ポリペプチド配列に作動可能に連結される核酸配列によってコードされているシグナル配列を更にコードし、完全長抗体は、核酸分子の第一及び／又は第二ポリペプチドから発現される。別の実施態様において、第一及び／又は第二ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを更に含む。更なる実施態様では、ＶＨドメインはＣＨ１に連結され、ＶＬドメインはＣＬに連結される。
【0008】
一態様において、本発明は、原核細胞及び真核細胞内で、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）のＶＨ－ＨＶＲ１、ＶＨ－ＨＶＲ２及びＶＨ－ＨＶＲ３及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のＶＬ－ＨＶＲ１、ＶＬ－ＨＶＲ２及びＶＬ－ＨＶＲ３をコードし、ＶＨのＨＶＲ及び／又はＶＬのＨＶＲに作動可能に連結され、ＶＨのＨＶＲ及びＶＬのＨＶＲの発現を可能にする、原核生物プロモーター及び真核生物プロモーターを含む核酸分子を提供し、ここで、ＶＨ及び／又はＶＬのＨＶＲは、真核細胞によって発現された場合にユーティリティペプチド（utility peptide）に連結され、核酸は、原核細胞及び真核細胞の両方で機能的であるシグナル配列を更にコードする。
【0009】
一態様において、本発明は、原核細胞及び真核細胞内で、可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをコードし、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインに作動可能に連結され、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインの発現を可能にする、原核生物プロモーター及び真核生物プロモーターを含む核酸分子を提供し、ここで、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインは、真核細胞によって発現された場合にユーティリティペプチド（utility peptide）に連結され、核酸は、原核細胞及び真核細胞の両方で機能的であるシグナル配列を更にコードする。
【0010】
一実施態様において、ＶＬ及びＶＨはユーティリティペプチドに連結される。更なる実施態様では、ＶＨはＣＨ１に更に連結され、ＶＬはＣＬに連結される。ユーティリティペプチドは、Ｆｃ、タグ、標識及びコントロールタンパク質からなる群から選択される。一実施態様において、ＶＬは、コントロールタンパク質に連結され、ＶＨはＦｃに連結される。例えば、コントロールタンパク質は、ｇＤタンパク質、又はその断片である。
【0011】
更に別の実施態様において、本発明の第一及び／又は第二ポリペプチドは、コートタンパク質（例えば、バクテリオファージＭ１３、ｆ１又はｆｄのｐＩ、ｐＩＩ、ｐＩＩＩ、ｐＩＶ、ｐＶ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＩＸ及びｐＸ、又はそれらの断片であって、例えばｐＩＩＩタンパク質のアミノ酸２６７－４２１又は２６２－４１８等（「ｐＩ」、「ＰＩＩ」、「ｐＩＩＩ」、「ｐＩＶ」、「ｐＶ」、「ｐＶＩ」、「ｐＶＩＩ」、「ｐＶＩＩＩ」、「ｐＩＸ」、及び「ｐＸ」は本明細書で使用される場合、特に断らない限り、完全長タンパク質又はその断片を指す））又はアダプタータンパク質
又はその変異体（改変され得る配列番号１２及び配列番号１３のアミノ酸は、限定されないが、下線で太字で記載されるものを含む）に融合されており、ここで、変異体はアミノ酸の改変を有し、その改変は、アダプタータンパク質の、別のアダプタータンパク質、又は配列番号６（ＡＳＩＡＲＬＲＥＲＶＫＴＬＲＡＲＮＹＥＬＲＳＲＡＮＭＬＲＥＲＶＡＱＬＧＧＣ）又は配列番号７（ＡＳＬＤＥＬＥＡＥＩＥＱＬＥＥＥＮＹＡＬＥＫＥＩＥＤＬＥＫＥＬＥＫＬＧＧＣ））からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は、配列番号８（ＧＡＢＡ－Ｒ１：ＥＥＫＳＲＬＬＥＫＥＮＲＥＬＥＫＩＩＡＥＫＥＥＲＶＳＥＬＲＨＱＬＱＳＶＧＧＣ）又は配列番号９（ＧＡＢＡ－Ｒ２：ＴＳＲＬＥＧＬＱＳＥＮＨＲＬＲＭＫＩＴＥＬＤＫＤＬＥＥＶＴＭＱＬＱＤＶＧＧＣ）又は配列番号１４（Ｃｙｓ：ＡＧＳＣ）又は配列番号１５（Ｈｉｎｇｅ：ＣＰＰＣＰＧ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドへの親和性を維持するか又は増加させる。コートタンパク質又はアダプタータンパク質をコードする核酸分子は合成イントロン内に含まれる。合成イントロンは、ＶＨドメインをコードする核酸及びＦｃをコードする核酸との間に位置する。合成イントロンは、天然に存在するイントロンが、ＩｇＧ１からのイントロン１、イントロン２又はイントロン３を含む群から選択され得る、ＩｇＧ１からの天然に存在するイントロンをコードする核酸を更に含む。
【0012】
一実施態様において、本発明は、原核細胞においては第一融合タンパク質が発現され、真核細胞においては第二融合タンパク質が発現される核酸分子を提供する。第一融合タンパク質と第二融合タンパク質は、同一であるか異なる場合がある。更なる実施態様において、第一融合タンパク質は、Ｆａｂファージ融合タンパク質（例えば、Ｆａｂファージ融合タンパク質はｐＩＩＩに融合したＶＨ／ＣＨ１を含む）及び第二融合体は、Ｆａｂ－Ｆｃ又はＦａｂ－ヒンジ－Ｆｃ融合タンパク質であってもよい（例えば、Ｆａｂ－Ｆｃ又はＦａｂ－ヒンジ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃに融合したＶＨ／ＣＨ１を含む）。
【0013】
一実施態様において、本発明は、シグナル配列は、真核細胞において、細胞の小胞体又は外部へのタンパク質の分泌を指示し、及び／又はシグナル配列は、原核細胞において、細胞のペリプラズム又は外部へのタンパク質分泌を指示する核酸分子を提供する。更に、シグナル配列は、配列番号１０（ＸＭＫＦＴＶＶＡＡＡＬＬＬＬＧＡＶＲＡ、ここでＸ＝０アミノ酸又は１又は２アミノ酸（例えば、Ｘ＝Ｍ（配列番号３；ＭＭＫＦＴＶＶＡＡＡＬＬＬＬＧＡＶＲＡ；野生型ｍＢＩＰ）又はＸ＝ＭＴ（配列番号１９；ＭＴＭＫＦＴＶＶＡＡＡＬＬＬＬＧＡＶＲＡ）又はＸは存在しない（配列番号２０；ＭＫＦＴＶＶＡＡＡＬＬＬＬＧＡＶＲＡ）のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列により、又はｍＢＩＰ（配列番号４；ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＴＴ ＡＣＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＣＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＧＣＧ ＧＴＣ ＣＧＣ ＧＣＧ）及びその変異体をコードする核酸配列により、又は配列番号３（ｍＢＩＰアミノ酸配列）から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列によりコードされ得、且つここではシグナル配列は原核細胞及び真核細胞の両方で機能し、又は配列番号１１（コンセンサスｍＢＩＰ配列、Ｘ ＡＴＧ ＡＡＮ ＴＴＮ ＡＣＮ ＧＴＮ ＧＴＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＧＧＮ ＧＣＮ ＧＴＮ ＣＧＮ ＧＣＮ、ここでＮ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ、ここでＸ＝ＡＴＧ（配列番号５；ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＡＮ ＴＴＮ ＡＣＮ ＧＴＮ ＧＴＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＧＧＮ ＧＣＮ ＧＴＮ ＣＧＮ ＧＣＮ）、Ｘ＝ＡＴＧ ＡＣＣ（配列番号２１；ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＮ ＴＴＮ ＡＣＮ ＧＴＮ ＧＴＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＧＧＮ ＧＣＮ ＧＴＮ ＣＧＮ ＧＣＮ）又はＸ＝は存在しない （配列番号２２； ＡＴＧ ＡＡＮ ＴＴＮ ＡＣＮ ＧＴＮ ＧＴＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＧＣＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＣＴＮ ＧＧＮ ＧＣＮ ＧＴＮ ＣＧＮ ＧＣＮ）の核酸配列により、又は配列番号１６（ｍＢＩＰ．Ｏｐｔ１：ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＴＴ ＡＣＣ ＧＴＴ ＧＴＴ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＴＡ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＣＧ ＧＴＣ ＣＧＣ ＧＣＡ）、配列番号１７（ｍＢＩＰ．Ｏｐｔ２：ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＴＴ ＡＣＴ ＧＴＴ ＧＴＴ ＧＣＧ ＧＣＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＴＣ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＣＧ ＧＴＣ ＣＧＣ ＧＣＡ）及び配列番号１８（ｍＢＩＰ．Ｏｐｔ３：ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＴＴ ＡＣＴ ＧＴＴ ＧＴＣ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＴＡ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＣＧ ＧＴＣ ＣＧＣ ＧＣＡ）の群から選択される核酸配列によりコードされ得る。
【0014】
更なる実施態様において、核酸分子中の合成イントロンは、その５’末端でＣＨ１をコードする核酸及びその３’末端でＦｃをコードする核酸に隣接している。更に、ＣＨ１ドメインをコードする核酸は、天然のスプライスドナー配列の一部、及びＦｃをコードする核酸は、天然のスプライスアクセプター配列の一部を含む。あるいは、ＣＨ１ドメインをコードする核酸は、改変したスプライスドナー配列の一部を含み、ここで改変されたスプライスドナー配列は少なくとも一の核酸残基の改変を含み、そしてその改変はスプライシングを増加させる。
【0015】
一実施態様において、原核生物のプロモーターは、ｐｈｏＡ、Ｔａｃ、Ｔｐｈａｃ又はＬａｃプロモーターであり、及び／又は真核生物プロモーターは、ＣＭＶ又はＳＶ４０又はモロニーマウス白血病ウイルスのＵ３領域又はヤギ関節炎脳炎ウイルスのＵ３領域又はビスナウイルスのＵ３領域又はレトロウイルスのＵ３領域配列である。原核生物のプロモーターによる発現は、細菌細胞内で起き、真核生物のプロモーターによる発現は、哺乳動物細胞内で起こる。更なる実施態様において、細菌細胞は大腸菌細胞であり、真核細胞は、酵母細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞又はＮＳＯ細胞である。
【0016】
別の実施態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクター、及び／又はそのベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、細菌細胞（例えば大腸菌細胞）又は真核細胞（例えば酵母細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞又はＮＳＯ細胞）であり得る。
【0017】
別の実施形態において、本発明は、核酸が発現されるように、本明細書に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を生成するための方法を提供する。本方法は、宿主細胞により発現された抗体を回収する工程を更に含み、そして抗体は宿主培養培地から回収される。
【0018】
一態様において、本発明は、配列番号８、９、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸配列の少なくとも一残基の改変を含むアダプタータンパク質を提供する。一実施態様において、アミノ酸配列は、配列番号６（ＡＳＩＡＲＬＲＥＲＶＫＴＬＲＡＲＮＹＥＬＲＳＲＡＮＭＬＲＥＲＶＡＱＬＧＧＣ）又は配列番号７（ＡＳＬＤＥＬＥＡＥＩＥＱＬＥＥＥＮＹＡＬＥＫＥＩＥＤＬＥＫＥＬＥＫＬＧＧＣ）からなる群から選択される。一実施態様において、本発明は、そのようなアダプタータンパク質をコードする核酸を提供する。
【0019】
一態様において、本発明は、原核細胞及び真核細胞の両方で機能的である、配列番号３のアミノ酸配列を含むｍＢＩＰポリペプチド又はその変異体、又は配列番号３のアミノ酸配列と８５％の相同性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。一実施態様において、本発明は、原核細胞及び真核細胞の両方において、配列番号３のアミノ酸配列を含むｍＢＩＰポリペプチド又はその変異体を発現する方法を提供する。一実施態様において、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含むｍＢＩＰ配列又はその変異体を発現する細菌細胞を提供する。
【0020】
一態様において、本発明は、合成イントロンが抗体のＶＨドメインをコードする核酸とＦｃ又はヒンジをコードする核酸の間、抗体のＣＨ２とＣＨ３ドメインをコードする核酸の間、抗体のヒンジ領域とＣＨ２ドメインをコードする核酸の間に位置することを与える。
【0021】
一態様において、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含むシグナル配列、又はその変異体、ＶＨドメインがＶＬドメインのＮ末端に連結された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含むポリペプチド、又は配列番号３のアミノ酸配列を含むシグナル配列、又はその変異体、ＶＨドメインがＶＬドメインのＣ末端に連結された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含むポリペプチド、又は配列番号３のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）のＶＨ－ＨＶＲ１、ＶＨ－ＨＶＲ２、及びＶＨ－ＨＶＲ３を含むポリペプチド、又は配列番号３のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のＶＬ－ＨＶＲ１、ＶＬ－ＨＶＲ２、及びＶＬ－ＨＶＲ３を含むポリペプチド、又は配列番号３のアミノ酸配列を含むシグナル配列、又はその変異体、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）のＶＨ－ＨＶＲ１、ＶＨ－ＨＶＲ２、及びＶＨ－ＨＶＲ３、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のＶＬ－ＨＶＲ１、ＶＬ－ＨＶＲ２、及びＶＬ－ＨＶＲ３を含むポリペプチドを含む。一実施態様において、本発明のポリペプチドは、抗体又は抗体断片である。本発明の抗体又は抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、ダイアボディー、及び一本鎖抗体分子からなる群から選択され得る。
【0022】
一態様において、本発明は、タンパク質のファージディスプレイを増強するための変異型ヘルパーファージを含む。一実施態様において、ヘルパーファージのヌクレオチド配列はｐＩＩＩにアンバー変異を含み、そのアンバー変異を含むヘルパーファージは、ファージ上のｐＩＩＩに融合したタンパク質のディスプレイを増強する。更なる実施態様においては、アンバー変異は、Ｍ１３ＫＯ７の核酸のヌクレオチド２６１３、２６１４及び２６１６における変異である、請求項７０に記載のヌクレオチド配列である。更に別の実施態様においては、Ｍ１３ＫＯ７の核酸のヌクレオチド２６１３、２６１４及び２６１６における変異は、アンバー終止コドンを導入する、請求項７１に記載のヌクレオチド配列である。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】（Ａ）４つの異なる真核生物のシグナル配列（ｍＢｉＰ、Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ、ｙＢＧＬ２、ＨＧＨ）の制御下で、抗Ｈｅｒ２のＦａｂを示す精製されたファージのＨｅｒ２ファージＥＬＩＳＡ。一般的にファージミドに使用される熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）原核生物のシグナル配列は、ベンチマークとしての役割を果たす。（Ｂ）ファージライブラリーパニングにより得られた、野生型真核生物ｍＢｉＰシグナル配列（ｍＢｉＰ．ｗｔ）に融合した抗Ｈｅｒ２ Ｆａｂファージディスプレイ、及びコドンを最適化したバージョン（ｍＢｉＰ．Ｏｐｔ１、ｍＢｉＰ．Ｏｐｔ２及びｍＢｉｐ．Ｏｐｔ３（配列番号１６－１８））。
【図2】（Ａ）個々のクローンの３０ｍＬの２９３細胞懸濁培養からの発現収率及び（Ｂ）真核生物のｍＢｉＰ又は原核生物の天然型ＩｇＧ ＨＣ（ＶＨＳ）シグナル配列のいずれかに対する融合体として発現されたｈＩｇＧ１クローンの総統計。
【図3】（Ａ）３つの天然型イントロンを含むヒトＩｇＧ１ ＨＣのゲノム構造。イントロン１は、ヒンジ領域の直前に存在する。（Ｂ）イントロン１又は３からの合成イントロンを含み、ファージアダプター融合ペプチドを含むＨＣコンストラクト。合成イントロンは、天然のイントロンスプライスドナー（Ｄ）とイントロン１又は３からのアクセプター（Ａ）に隣接している。（Ｃ）イントロン１又は３からの合成イントロンを含み、ファージコート融合タンパク質を含むＨＣコンストラクト。合成イントロンは、天然のイントロンスプライスドナー（Ｄ）とイントロン１又は３からのアクセプター（Ａ）に隣接している。（Ｂ）及び（Ｃ）の両方のコンストラクトは、アダプターペプチド又はファージコートタンパク質配列の３’末端に終止コドンを含む。
【図4】（Ａ）イントロン無し、ファージアダプターペプチドを含む合成イントロン（図３Ｂを参照）、又はファージコートタンパク質を含む合成イントロン（遺伝子ＩＩＩは、図３Ｃを参照）の何れかを含むコンストラクトからのｈ４Ｄ５ ＩｇＧの発現レベル。（Ｂ）トランスフェクトした細胞からのｈＩｇＧ１ ＨＣのＲＴ－ＰＣＲ。適切にスプライスされたｍＲＮＡ ＨＣについて予測される大きさは１６５０ｎｔである。アダプター＋イントロン１のコンストラクトにおけるバンドは、スプライシングされていない前駆体ｍＲＮＡを表す。アダプターと遺伝子－ＩＩＩ含有コンストラクト中の下側のバンドは、ＶＨにおける潜在スプライスドナーによって誤ってスプライシングされる。
【図5】（Ａ）天然のイントロン１スプライスドナーで生成される点変異は、哺乳類のｍＲＮＡのコンセンサススプライスドナーへの適合性を向上させる。（Ｂ）イントロンスプライスドナーの最適化は、スプライシングされていない、及び誤ってスプライシングされたＨＣのｍＲＮＡの蓄積を排除し、（Ｃ）哺乳動物細胞における発現を、イントロンが存在しない場合に観察されるレベルまで増加させる。
【図6】（Ａ）ｐＤＶ．５．０及び野生型ＫＯ７（一価ディスプレイ）又はアダプターＫＯ７（多価ディスプレイ）の何れかを使用したディスプレイの調節。（Ｂ）三つの異なる哺乳動物細胞株におけるｐＤＶ．５．０からの４つの異なるｍＡｂの発現。
【図7】原核細胞及び真核細胞におけるポリペプチドの発現及び分泌のためのベクターの模式図。合成イントロンは、ｈＩｇＧ１からの天然に存在するイントロン配列の何れかとともに、アダプター配列、又はファージコートタンパク質の配列の何れかを含んでいてもよい。ＨＣ及びＬＣの両方とも、１）ＯＲＦの上流の哺乳動物プロモーター及び細菌プロモーター、２）ＯＲＦの上流の細菌プロモーターのみ（図１４も参照）、又は３）ＯＲＦの上流の哺乳動物プロモーターのみの何れかを有する可能性がある。ＨＣ及びＬＣの両方が、両方のプロモーターの種類を持っているコンストラクトが示される。アダプタペプチド融合体とともに遺伝子－ＩＩＩを含むカセット（ｐＤＶ５．０、示される）は、合成イントロンがアダプターペプチド融合体を含む場合においてのみ存在するが、ファージコートタンパク質融合体が合成イントロンに存在しない場合には存在しない。
【図8】Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ上に融合したタンパク質のディスプレイを増強する、変異ヘルパーファージアンバーＫＯ７のｐＩＩＩのヌクレオチド配列（ヌクレオチド１５７９から２８５３（配列番号２４））。アンバーＫＯ７は部位特異的変異誘発によってＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージゲノムに導入されたアンバーコドンを有する。下線の残基は、コドン３４６でアンバー終止（ＴＡＧ）を、及びＭ１３ＫＯ７遺伝子ＩＩＩのコドン３４５でのＡｖｒＩＩ制限部位のためのサイレント変異を導入するヌクレオチド２６１３、２６１４及び２６１６での変異（Ｔ２６１３Ｃ、Ｃ２６１４Ｔ及びＡ２６１６Ｇ）である。Ｍ１３ＫＯ７のヌクレオチド１は、固有のＨｐａＩ制限部位の第三番目の残基である。
【図9】アンバーＫＯ７ヘルパーファージの使用によるＭ１３のファージのｐＩＩＩ上のＦａｂ断片の増強されたディスプレイ。野生型Ｍ１３ＫＯ７を含む従来の高ディスプレイファージミド（白菱形）は、野生型Ｍ１３ＫＯ７がファージ生成のために使用される場合、Ｆａｂディスプレイのレベルを、低ディスプレイファージミドベクターによって達成されるものよりも有意に高く上昇させる（黒四角）。ｐＩＩＩ中にアンバー変異を有する改変されたＭ１３ＫＯ７（アンバーＫＯ７）の使用は、低ディスプレイファージミド（閉三角形）のディスプレイレベルを野生型Ｍ１３ＫＯ７（白菱形）の高ディスプレイファージミドのものへと上昇させる。
【図10】図１０は、固定化ＶＥＧＦに対する、実施例５に記載のナイーブ二重ベクターＦａｂファージライブラリーのファージライブラリー選別から選択されるクローンの（ファージＥＬＩＳＡによって測定される）結合を示す棒グラフである。４ラウンドの選択の後に個々のクローンを採取し、ファージ上清を、結合特異性を評価するために、固定化抗原（ＶＥＧＦ）及び無関係なタンパク質（Ｈｅｒ２の）に対する結合について試験した。
【図11】図１１は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００装置上でのＦｃ捕獲アッセイにより測定される、ＶＥＧＦに結合する抗原についてのＢＩＡｃｏｒｅによる、ＩｇＧフォーマットで選択されたファージクローンのスクリーニングを示す。配列解析及びファージＥＬＩＳＡのために採取した９６個のクローンを２９３Ｓ細胞にトランスフェクトし（１ｍＬ）、ＩｇＧの発現のために７日間培養した。上清を０．２μｍで濾過し、ビアコアＴ１００装置上でのＦｃ－捕獲アッセイによるＶＥＧＦ抗原の結合を評価するために使用した。
【図12】図１２は、実施例５におけるＶＥＧＦパニング実験からのポジティブバインダーの配列を示す。８つのクローン（ＶＥＧＦ５０（出現順にそれぞれ、配列番号２５－２７）、ＶＥＧＦ５１（出現順にそれぞれ、配列番号２８－３０）、ＶＥＧＦ５２（出現順にそれぞれ、配列番号３１－３３）、ＶＥＧＦ５９出現順にそれぞれ、配列番号３４－３６）、ＶＥＧＦ５５（出現順にそれぞれ、配列番号３７－３９）、ＶＥＧＦ６０（出現順にそれぞれ、配列番号４０－４２）、ＶＥＧＦ６１（出現順にそれぞれ、配列番号４３－４５）及びＶＥＧＦ６４（出現順にそれぞれ、配列番号４６－４８））の重鎖ＣＤＲ配列が示される。全てのクローンは、同一の軽鎖ＣＤＲ配列を共有する。
【図13】図１３は、ＶＥＧＦに対するファージソーティングから選択された選択された抗ＶＥＧＦ ＩｇＧの、ＶＥＧＦのその天然受容体の一つであるＶＥＧＦ－Ｒ１への結合を阻害する能力を示す。ＶＥＧＦに対してのソーティングから選択された抗体は、ＣＨＯ細胞で発現され、精製されたＩｇＧは、ＶＥＧＦ－Ｒ１へのＶＥＧＦの結合を阻害する、選択されたクローンの能力を測定するために用いられた。一つのクローン（ＶＥＧＦ５５）は、ベバシズマブ（アバスチン）のの３．５倍範囲内であるＩＣ５０でＶＥＧＦ－Ｒ１結合を阻害した。
【図14】図１４は、原核細胞及び真核細胞におけるポリペプチドの発現及び分泌のためのベクターの概略を示し、ここで、合成イントロンがｈＩｇＧ１由来で天然に存在するイントロン配列の何れかとともに、ｐＩＩＩを含み、そしてＬＣは、ＯＲＦの上流に細菌プロモーターを有し、そしてＨＣはＯＲＦの上流に哺乳類と細菌プロモーターの両方を有する。図７に示すベクターとは異なり、このベクター（ｐＤＶ６．５）は、ファージ粒子への融合のための付加的なｇＩＩＩカセットを必要としない。大腸菌及び哺乳動物細胞における発現から生じるタンパク質は、ベクターの模式図の下に示されている。破線は、哺乳動物細胞においてスプライシングされた重鎖転写物中のイントロンを示す。ＩｇＧ１のヒンジをコードする配列の一部は、大腸菌及び哺乳動物細胞の両方で発現されたタンパク質を包含することを可能にするために、ベクター中に繰り返されることに注意のこと。
【0024】
本発明の実施態様の詳細な記述
Ｉ．定義
用語「合成イントロン」は、本明細書において、ＣＨ１をコードする核酸とヒンジ－Ｆｃ又はＦｃをコードする核酸との間に位置している核酸のセグメントを定義するために使用される。「合成イントロン」は、ファージ粒子のタンパク質又はコートタンパク質（例えばＰＩ、ＰＩＩ、ｐＩＩＩ、ｐＩＶ、ＰＶ、ＰＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＩＸ、ｐＸ）、又はアダプタータンパク質（例えば、ロイシンジッパーなど）、又はそれらの任意の組み合わせなどの、タンパク質合成のためにコードしない任意の核酸、タンパク質合成のためにコードしない任意の核酸であってもよい。一実施態様において、「合成イントロン」は、スプライス事象を可能にするスプライスドナー配列及びスプライスアクセプター配列の一部を含む。スプライスドナー配列及びスプライスアクセプター配列は、スプライス事象を可能にし、天然又は合成の核酸配列を含んでもよい。
Ｉ．定義
用語「合成イントロン」は、本明細書において、ＣＨ１をコードする核酸とヒンジ－Ｆｃ又はＦｃをコードする核酸との間に位置している核酸のセグメントを定義するために使用される。「合成イントロン」は、ファージ粒子のタンパク質又はコートタンパク質（例えばＰＩ、ＰＩＩ、ｐＩＩＩ、ｐＩＶ、ＰＶ、ＰＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＩＸ、ｐＸ）、又はアダプタータンパク質（例えば、ロイシンジッパーなど）、又はそれらの任意の組み合わせなどの、タンパク質合成のためにコードしない任意の核酸、タンパク質合成のためにコードしない任意の核酸であってもよい。一実施態様において、「合成イントロン」は、スプライス事象を可能にするスプライスドナー配列及びスプライスアクセプター配列の一部を含む。スプライスドナー配列及びスプライスアクセプター配列は、スプライス事象を可能にし、天然又は合成の核酸配列を含んでもよい。
【0025】
本明細書において、用語「ユーティリティーポリペプチド」は、タンパク質精製、タンパク質のタグ付け、タンパク質標識化（例えば、検出可能な化合物又は組成物（例えば、放射性標識、蛍光標識又は酵素標識）による標識化）に有用であるなど数多くの活動に有用であるポリペプチドを言及するために使用される。標識は、間接的に、アミノ酸側鎖、活性化されたアミノ酸側鎖、システイン改変抗体などとコンジュゲートさせることができる。例えば、抗体はビオチンとコンジュゲートすることができ、上述した標識の３つの広範なカテゴリーのいずれかが、アビジン又はストレプトアビジン、又はその逆にコンジュゲートさせることができる。ビオチンは、ストレプトアビジンに選択的に結合し、従って、標識はこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートすることができる。あるいは、ポリペプチド変異体と標識の間接的結合を達成するために、ポリペプチド変異体は小ハプテン（例えば、ジゴキシン）とコンジュゲートされ、そして、上述した標識の異なるタイプのうちの１つは抗ハプテンポリペプチド変異体（例えば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートされる。このように、ポリペプチド変異体との標識の間接的なコンジュゲーションを達成することができる（Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego）。
【0026】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作動可能に連結」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されている場合、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にある場合、コード配列と作動可能に連結している。一般的に、「作動可能に連結される」とは、それらが、核酸として、又はそれらによって発現されるタンパク質としてお互いに機能的な関係を有する様式で、連結されたＤＮＡ配列が核酸分子中に存在することを意味する。それらは、連続であってもなくてもよい。分泌リーダーの場合には、それらはしばしば連続しており、読取段階にある。しかし、エンハンサーは必ずしも連続している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【0027】
ＶＨドメイン又はＶＬドメインは、異種タンパク質配列（例えば、ＶＨ又はＶＬドメイン）をコードする核酸が、ファージコートタンパク質（例えば、ｐＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ又はｐＩＸ）をコードする核酸に直接挿入される場合に、ファージに「連結」される。原核細胞に導入された場合、コートタンパク質がＶＨ又はＶＬドメインをディスプレイすることができるファージが生成される。一実施態様では、得られたファージ粒子は、ファージコートタンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端に融合した抗体断片をディスプレイする。
【0028】
本明細書で使用される用語「連結された」又は「連結」又は「連結」は、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列が、それぞれペプチド結合又はホスホジエステル結合を介して一緒に共有結合することを意味し、そのような結合は結合される２つのアミノ酸配列又は核酸配列の間に任意の数の付加的アミノ酸配列又は核酸配列を含むことができる。例えば、第一と第二アミノ酸配列の間の直接ペプチド結合の連鎖又は第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列の間に一以上のアミノ酸配列を含む連鎖であっても良い。
【0029】
本明細書で用いられる「リンカー」とは、２以上のアミノ酸長のアミノ酸配列を意味する。リンカーは、天然の極性又は非極性アミノ酸から成り得る。リンカーは、例えば、２から１００アミノ酸長、例えば２アミノ酸長と５０アミノ酸長の間、例えば、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０アミノ酸長であり得る。リンカーは、例えば自己切断又は酵素的もしくは化学的切断により、「切断可能」であり得る。アミノ酸配列内の切断部位ならびにそのような部で切断する酵素及び化学物質は、当該技術分野において周知であり、本明細書にも記載する。
【0030】
用語「シグナル配列の機能」は、分泌されるタンパク質をＥＲ（真核生物において）又はペリプラズム（原核生物において）又は細胞の外側へと導くシグナル配列の生物学的活性をいう。
【0031】
本明細書で使用される「コントロールタンパク質」は、その発現が、タンパク質配列のディスプレイのレベルを定量化するために測定されるタンパク質配列を指す。例えば、タンパク質配列は、ＶＨ又はＶＬが、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いた親和性精製によって容易に精製されることを可能にする「エピトープタグ」であり得る。タグポリペプチド及びそれらの適切なそれぞれの抗体は、ポリ－ヒスチジン（ポリ－Ｈｉｓ）又はポリ－ヒスチジン－グリシン（ポリ－ｈｉｓ－ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５[Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]；ｃ－ｍｙｃタグ並びにその８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体[Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体[Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]が含まれる。他のタグポリペプチドは、Ｆｌａｇ－ペプチド[Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]；α－チューブリンエピトープペプチド[Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
【0032】
本明細書で使用する「コートタンパク質」は，ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩの及びｐＩＸを含むファージ粒子の成分である５つのカプシドタンパク質の何れかを指す。一実施態様において、「コートタンパク質」とは、タンパク質又はペプチドをディスプレイするために使用することができる（Phage Display, A Practical Approach, Oxford University Press, edited by Clackson and Lowman, 2004, p. 1-26を参照）。一実施態様において、コートタンパク質は、ｐＩＩＩタンパク質又は一部の変異体、その一部及び／又はその誘導体であってもよい。例えば、Ｍ１３ファージのタンパク質ＩＩＩのＣ末端残基２６７から４２１をコードする配列など、Ｍ１３バクテリオファージのｐＩＩＩコートタンパク質のＣ末端部分（ｃＰ３）を使用することができる。一実施態様において、ｐＩＩＩ配列は、配列番号１（ＡＥＤＩＥＦＡＳＧＧＧＳＧＡＥＴＶＥＳＣＬＡＫＰＨＴＥＮＳＦＴＮＶＷＫＤＤＫＴＬＤＲＹＡＮＹＥＧＣＬＷＮＡＴＧＶＶＶＣＴＧＤＥＴＱＣＹＧＴＷＶＰＩＧＬＡＩＰＥＮＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＴＫＰＰＥＹＧＤＴＰＩＰＧＹＴＹＩＮＰＬＤＧＴＹＰＰＧＴＥＱＮＰＡＮＰＮＰＳＬＥＥＳＱＰＬＮＴＦＭＦＱＮＮＲＦＲＮＲＱＧＡＬＴＶＹＴＧＴＶＴＱＧＴＤＰＶＫＴＹＹＱＹＴＰＶＳＳＫＡＭＹＤＡＹＷＮＧＫＦＲＤＣＡＦＨＳＧＦＮＥＤＰＦＶＣＥＹＱＧＱＳＳＤＬＰＱＰＰＶＮＡＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳＧＤＦＤＹＥＫＭＡＮＡＮＫＧＡＭＴＥＮＡＤＥＮＡＬＱＳＤＡＫＧＫＬＤＳＶＡＴＤＹＧＡＡＩＤＧＦＩＧＤＶＳＧＬＡＮＧＮＧＡＴＧＤＦＡＧＳＮＳＱＭＡＶＧＤＧＤＮＳＰＬＭＮＮＦＲＱＹＬＰＳＬＰＱＳＶＥＣＲＰＦＶＦＳＡＧＫＰＹＥＦＳＩＤＣＤＫＩＮＬＦＲＧＶＦＡＦＬＬＹＶＡＴＦＭＹＶＦＳＴＦＡＮＩＬＲＮＫＥＳ）のアミノ酸配列を含む。一実施態様において、ｐＩＩＩ断片は、配列番号２（ＳＧＧＧＳＧＳＧＤＦＤＹＥＫＭＡＮＡＮＫＧＡＭＴＥＮＡＤＥＮＡＬＱＳＤＡＫＧＫＬＤＳＶＡＴＤＹＧＡＡＩＤＧＦＩＧＤＶＳＧＬＡＮＧＮＧＡＴＧＤＦＡＧＳＮＳＱＭＡＱＶＧＤＧＤＮＳＰＬＭＮＮＦＲＱＹＬＰＳＬＰＱＳＶＥＣＲＰＦＶＦＧＡＧＫＰＹＥＦＳＩＤＣＤＫＩＮＬＦＲＧＶＦＡＦＬＬＹＶＡＴＦＭＹＶＦＳＴＦＡＮＩＬＲＮＫＥＳ）のアミノ酸配列を含む。
【0033】
本明細書で使用する「アダプタータンパク質」とは、溶液中の他のアダプタータンパク質配列と特異的に相互作用するタンパク質配列を意味する。一実施態様において、「アダプタータンパク質」とは、ヘテロ多量体化ドメインを含む。一実施態様において、アダプタータンパク質は、ｃＪＵＮタンパク質又はＦｏｓ蛋白質である。別の実施態様において、アダプタータンパク質は、配列番号６（ＡＳＩＡＲＬＲＥＲＶＫＴＬＲＡＲＮＹＥＬＲＳＲＡＮＭＬＲＥＲＶＡＱＬＧＧＣ）又は配列番号７（ＡＳＬＤＥＬＥＡＥＩＥＱＬＥＥＥＮＹＡＬＥＫＥＩＥＤＬＥＫＥＬＥＫＬＧＧＣ）の配列を含む。
【0034】
本明細書に記載されるように、「ヘテロ多量体化ドメイン」は生体分子に対して、ヘテロ多量体形成を促進し、ホモ多量体の形成を阻害するなどの改変や追加を指す。ホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成について強い優先度を持つ任意のヘテロ二量体化ドメインが、本発明の範囲内にある。実例となる例として、限定されないが、例えば、米国特許出願公開第２００３００７８３８５号（Arathoon et al. Genentech；ノブ・イントゥー・ホールを記載）；国際公開第２００７１４７９０１号（Kjaergaard et al. Novo Nordisk：イオン性相互作用を記載）；国際公開第２００９０８９００４号(Kannan et al. Amgen：静電的ステアリング効果（electrostatic steering effects）を記載）；国際公開第２０１１／０３４６０５号（Christensen et al. - Genentech；コイルドコイルを記載）を含む。また、例えば、ロイシンジッパーを記述するPack, P. & Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992)、又はヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフを記述するPack et al., Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993) を参照。語句「ヘテロ多量体化ドメイン」及び「ヘテロ多二量体化ドメイン」は、本明細書にて互換的に用いられる。
【0035】
本明細書中で使用される用語「Ｆａｂ融合タンパク質」は、原核細胞中のＦａｂファージ融合タンパク質及び／又は真核細胞中のＦａｂ－Ｆｃ融合タンパク質を指す。Ｆａｂ－Ｆｃ融合はまた、Ｆａｂ－ヒンジ－Ｆｃ融合とすることもできる。
【0036】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【0037】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【0038】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【0039】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【0040】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメインで構成される：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
【0041】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【0042】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
【0043】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４－３４、Ｌ２の５０－５６、Ｌ３の８９－９７、Ｈ１の３１－３５Ｂ、Ｈ２の５０－６５、及びＨ３の９５－１０２で生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」をも含む。ＳＤＲは、略称（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ－ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２、及びａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１－３４、Ｌ２の５０－５５、Ｌ３の８９－９６、Ｈ１の３１－３５Ｂ、Ｈ２の５０－５８、及びＨ３の９５－１０２で生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【0044】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【0045】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【0046】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【0047】
「抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【0048】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、例えば、天然に存在する変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【0049】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【0050】
「天然型抗体」は、天然に存在する様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【0051】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【0052】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【0053】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なように連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【0054】
ＩＩ．詳細の説明
ファージに基づく抗体の検出プロセスは、個々のファージクローン１－３の大規模なプールから所望の結合特異性を有するＦａｂ断片を選択するファージディスプレイ技術を利用する。このアプローチでは、直接的又は間接的に主要コートタンパク質の一つ介してＭ１３繊維状ファージ粒子に融合し、多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＦａｂ断片からなるファージライブラリーは、確立された分子生物学技術及び特殊なファージディスプレイベクターを使用して生成される（Tohidkia et al., Journal of drug targeting, 20: 195-208 (2012); Bradbury et al., Nature biotechnology, 29: 245-254 (2011); Qi et al., Journal of molecular biology, 417: 129-143 (2012)）。そうしたライブラリーの理論的多様性は、１０２５のユニークな配列を容易に超過ことができるが、ファージプールの構築における実際的な限界は、実際の多様性を、特定のライブラリにおいて≦１０１１のクローンへ制限する（Sidhu et al., Methods in enzymology, 328: 333-363 (2000)）。
ファージに基づく抗体の検出プロセスは、個々のファージクローン１－３の大規模なプールから所望の結合特異性を有するＦａｂ断片を選択するファージディスプレイ技術を利用する。このアプローチでは、直接的又は間接的に主要コートタンパク質の一つ介してＭ１３繊維状ファージ粒子に融合し、多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＦａｂ断片からなるファージライブラリーは、確立された分子生物学技術及び特殊なファージディスプレイベクターを使用して生成される（Tohidkia et al., Journal of drug targeting, 20: 195-208 (2012); Bradbury et al., Nature biotechnology, 29: 245-254 (2011); Qi et al., Journal of molecular biology, 417: 129-143 (2012)）。そうしたライブラリーの理論的多様性は、１０２５のユニークな配列を容易に超過ことができるが、ファージプールの構築における実際的な限界は、実際の多様性を、特定のライブラリにおいて≦１０１１のクローンへ制限する（Sidhu et al., Methods in enzymology, 328: 333-363 (2000)）。
【0055】
出発ライブラリーに含めることのできるユニークな配列の実質的な数を考慮すると、選択したクローンのスクリーニングのスループットは非常に重要である。ファージに基づく抗体発見のため、選択されたＦａｂ及び機能アッセイ（標的結合、細胞ベースの活性アッセイ、インビボでの半減期など）におけるそれらの同族完全長ＩｇＧの特性の十分な評価は、ディスプレイのために使用されたファージミドベクターのうち、ＨＣ及びＬＣをコードするＤＮＡ配列を、ＩｇＧ発現用の哺乳類発現ベクター中へサブクローニングすることによる、完全長のＩｇＧへのＦａｂ重鎖（ＨＣ）配列と軽鎖（ＬＣ）配列の再フォーマットを必要とする。選択したＨＣ／ＬＣペアの数十又は数百をサブクローニングする労力の要るプロセスは、ファージに基づく抗体の検出プロセスにおける主要なボトルネックを表している。更に、選択されたＦａｂのかなりの割合は、一度再フォーマットされると、初期スクリーニングアッセイにおいて満足に機能することができないので、この再フォーマット化／スクリーニング工程を通して運ばれたクローンの数を増やすことにより、最終的な成功確率を大幅に増加させる。
【0056】
我々は、本明細書において、原核細胞において一のＦａｂ融合タンパク質、及び真核細胞において異なる（又は同一の）Ｆａｂ融合体の発現及び分泌のための発現及び分泌系の作製を記述する。例えば、発現及び分泌系は、大腸菌に形質転換された場合のＦａｂファージ融合体の発現を駆動し、哺乳動物細胞にトランスフェクトされた場合には、同一のＦａｂ断片を有する完全長ＩｇＧの発現を駆動する。我々は、マウスの結合性免疫グロブリンタンパク質（ｍＢｉＰ）８，９からの哺乳動物シグナル配列は、原核細胞及び真核細胞の両方で効率的なタンパク質の発現を駆動することができることを実証する。ヒトＩｇＧ１ ＨＣのヒンジ領域内に挿入されたファージ融合ペプチドを含有する合成イントロンを除去するために、我々は、哺乳動物のｍＲＮＡスプライシングを用いて、宿主細胞依存的に二つの異なるタンパク質：大腸菌においてファージディスプレイアダプターペプチドに融合したＦａｂ断片及び哺乳動物細胞における天然型ヒトＩｇＧ１を生成することができる。この技術は、サブクローニングを必要としない、哺乳動物細胞におけるその後の発現及び同族完全長ＩｇＧの精製を伴う、ファージディスプレイライブラリーからの、目的の抗原に結合するＦａｂ断片の選択を可能にする。
【0057】
本発明は、（１）非細菌起源のシグナル配列は、真核細胞においてＩｇＧの発現を損なうことなく、ファージライブラリの選別のために十分なレベルで、原核細胞において機能し、及び（２）異なるＦａｂ融合タンパク質は、ｍＲＮＡプロセシングが原核細胞でなく真核細胞において起きる場合に、宿主細胞依存的に同一の核酸分子から発現される（原核細胞中のＦａｂファージ融合タンパク質及び真核細胞中のＦａｂ－Ｆｃ融合タンパク質）ことを実証する実験的発見に一部基づいている。従って、本明細書に記載されるのは、サブクローニングを必要とせずに、原核宿主細胞（例えば大腸菌）におけるファージディスプレイのためのファージ粒子タンパク質、コートタンパク質又はアダプタータンパク質に融合されたＦａｂ断片、及び真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）においてＦｃに融合したＦａｂ断片の発現及び分泌のための発現及び分泌系、及びその発現及び分泌システムの構築及び使用に関する方法である。特に、原核細胞におけるＦａｂ－ファージ融合タンパク質及び真核細胞におけるＦａｂ－Ｆｃ融合タンパク質の発現及び分泌のためのベクター、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質又はペプチドの発現及び分泌のための核酸分子、及びそのようなベクターを含む宿主細胞が本明細書に記載される。更に、目的のタンパク質に対する新規抗体のスクリーニング及び選択のための発現及び分泌系の使用方法を含む、発現及び分泌系の使用方法が本明細書中に記載される。
【0058】
発明を実施するための様式
本発明の実施は、特に明記しない限り、当分野の技術の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」，第２版（Sambrook et al., 1989）；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」（M.J. Gait, ed., 1984）；「動物細胞培養（Animal Cell Culture）」（R.I. Freshney, ed., 1987）；「酵素学における方法（Methods in Enzymology）」（Academic Press, Inc.）；「実験免疫学のハンドブック（Handbook of Experimental Immunology）」，第４版（D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987）；「哺乳動物細胞のための遺伝子導入ベクター（Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells）」（J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987）；「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（F.M. Ausubel et al., eds., 1987）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR: The Polymerase Chain Reaction)」, (Mullis et al., eds., 1994）；及び「免疫学の最新プロトコル（Current Protocols in Immunology)」 (J.E. Coligan et al., eds., 1991）などの文献において十分に説明されている。
本発明の実施は、特に明記しない限り、当分野の技術の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」，第２版（Sambrook et al., 1989）；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」（M.J. Gait, ed., 1984）；「動物細胞培養（Animal Cell Culture）」（R.I. Freshney, ed., 1987）；「酵素学における方法（Methods in Enzymology）」（Academic Press, Inc.）；「実験免疫学のハンドブック（Handbook of Experimental Immunology）」，第４版（D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987）；「哺乳動物細胞のための遺伝子導入ベクター（Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells）」（J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987）；「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（F.M. Ausubel et al., eds., 1987）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR: The Polymerase Chain Reaction)」, (Mullis et al., eds., 1994）；及び「免疫学の最新プロトコル（Current Protocols in Immunology)」 (J.E. Coligan et al., eds., 1991）などの文献において十分に説明されている。
【0059】
原核細胞及び真核細胞のための発現及び分泌システム
原核細胞及び真核細胞のための発現及び分泌系は、目的のタンパク質（例えば、ＩｇＧ分子の重鎖又は軽鎖）の調節配列及びコード化配列を含むベクターを含み、ここで原核生物プロモーター及び真核生物プロモーター（例えば、ＣＭＶ（真核生物）及びＰｈｏＡ（原核生物））は、目的の遺伝子の上流にタンデムに配置され、単一のシグナル配列が、原核細胞及び真核細胞における目的のタンパク質の発現を駆動する。本発明は、宿主細胞依存的に、ＩｇＧ１のＶＨ／ＣＨ１とヒンジ－Ｆｃ領域との間に位置する合成イントロンであって、真核細胞におけるｍＲＮＡプロセシング中にスプライスされる合成イントロンを使用することにより、目的のタンパク質の２つの異なる融合形態を生成するこのベクターのための手段を提供する。
原核細胞及び真核細胞のための発現及び分泌系は、目的のタンパク質（例えば、ＩｇＧ分子の重鎖又は軽鎖）の調節配列及びコード化配列を含むベクターを含み、ここで原核生物プロモーター及び真核生物プロモーター（例えば、ＣＭＶ（真核生物）及びＰｈｏＡ（原核生物））は、目的の遺伝子の上流にタンデムに配置され、単一のシグナル配列が、原核細胞及び真核細胞における目的のタンパク質の発現を駆動する。本発明は、宿主細胞依存的に、ＩｇＧ１のＶＨ／ＣＨ１とヒンジ－Ｆｃ領域との間に位置する合成イントロンであって、真核細胞におけるｍＲＮＡプロセシング中にスプライスされる合成イントロンを使用することにより、目的のタンパク質の２つの異なる融合形態を生成するこのベクターのための手段を提供する。
【0060】
Ａ．原核細胞及び真核細胞両方で機能するシグナル配列
原核生物（大腸菌）細胞及び真核生物（哺乳動物）細胞で目的のタンパク質を発現することが可能なベクターの構築における一つの問題は、これらの細胞型に見い出されるシグナル配列の違いから生じる。シグナル配列の特定の機能は、一般的に原核細胞及び真核細胞の両方で保存されているが（例えば配列の中央に位置する疎水性残基のパッチ及び成熟ポリペプチドのＮ末端における切断部位に隣接する極性／荷電残基）、他の機能は、他方よりも一細胞型でより特徴的なものである。また、配列が全て哺乳動物起源であっても、別のシグナル配列は、哺乳動物細胞における発現レベルに大きな影響を与えることができることが当技術分野で知られている（Hall et al., J of Biological Chemistry, 265: 19996-19999 (1990); Humphreys et al., Protein Expression and Purification, 20: 252-264 (2000)）。例えば、細菌のシグナル配列は、典型的には正に帯電した残基（最も一般的にリジン）を開始メチオニンの直後に有するが、一方哺乳動物のシグナル配列には必ずしも存在しない。両方の細胞型において分泌を指示することができるシグナル配列が知られているが、そのようなシグナル配列は、典型的には、一方の細胞型又は他方においてのみ、タンパク質分泌の高レベルを指向する。
原核生物（大腸菌）細胞及び真核生物（哺乳動物）細胞で目的のタンパク質を発現することが可能なベクターの構築における一つの問題は、これらの細胞型に見い出されるシグナル配列の違いから生じる。シグナル配列の特定の機能は、一般的に原核細胞及び真核細胞の両方で保存されているが（例えば配列の中央に位置する疎水性残基のパッチ及び成熟ポリペプチドのＮ末端における切断部位に隣接する極性／荷電残基）、他の機能は、他方よりも一細胞型でより特徴的なものである。また、配列が全て哺乳動物起源であっても、別のシグナル配列は、哺乳動物細胞における発現レベルに大きな影響を与えることができることが当技術分野で知られている（Hall et al., J of Biological Chemistry, 265: 19996-19999 (1990); Humphreys et al., Protein Expression and Purification, 20: 252-264 (2000)）。例えば、細菌のシグナル配列は、典型的には正に帯電した残基（最も一般的にリジン）を開始メチオニンの直後に有するが、一方哺乳動物のシグナル配列には必ずしも存在しない。両方の細胞型において分泌を指示することができるシグナル配列が知られているが、そのようなシグナル配列は、典型的には、一方の細胞型又は他方においてのみ、タンパク質分泌の高レベルを指向する。
【0061】
細菌のシグナル配列は哺乳動物細胞中で任意の機能性を示すことがごくまれに示されているが、細菌のペリプラズムへのトランスロケーションを駆動することが可能な哺乳動物起源のシグナル配列が報告されている（Humphreys et al., The Protein Expression and Purification, 20: 252-264 (2000））。しかし、シグナル配列の単なる機能は、ファージディスプレイ及びＩｇＧの発現のために使用される堅牢な二重発現系に適していない。むしろ、選択されたシグナル配列は、低レベルのディスプレイはファージパニング実験を行うためのシステムの能力を損なうであろうファージディスプレイのために、両方の発現系において十分に機能しなければならない。
【0062】
本発明は、非細菌起源のシグナル配列は、真核細胞においてＩｇＧの発現を損なうことなく、ファージライブラリの選別のために十分なレベルで、原核細胞において機能するというに発見に一部基づいている。
【0063】
本発明は、目的のポリペプチドを原核生物においてはペリプラズムへ、及び真核生物においては小胞体／胞体へと標的にし、使用することができる任意のシグナル配列（コンセンサスシグナル配列を含む）を提供する。使用することができるシグナル配列は、限定されるものではないが、マウス結合性免疫グロブリンタンパク質（ｍＢｉＰ）シグナル配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：アクセッションＰ２００２９）、ヒト成長ホルモン由来シグナル配列（ｈＧＨ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：アクセッションＢＩＡ４Ｇ６）、Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：アクセッションＱ９ＢＬＺ２）、酵母エンド－１，３－グルカナーゼ（ｙＢＧＬ２）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：アクセッションＰ１５７０３）が含まれる。一実施態様において、シグナル配列は、天然又は合成のシグナル配列である。更なる実施態様において、合成シグナル配列は、最適化されていない天然のシグナル配列と比較して、最適化されたレベルでディスプレイのレベルを駆動する最適化されたシグナル分泌配列である。
【0064】
原核細胞において目的のポリペプチドのディスプレイを駆動するシグナル配列の能力を測定するための適切なアッセイとしては、例えば、本明細書に記載されるファージＥＬＩＳＡを含む。
【0065】
真核細胞において目的のポリペプチドのディスプレイを駆動するシグナル配列の能力を測定するための適切なアッセイとしては、例えば、本明細書に記載されるように、目的のシグナルとともに目的のポリペプチドをコードする哺乳動物発現ベクターを、培養された哺乳動物細胞へのトランスフェクション、一定期間の細胞の増殖、培養細胞からの上清の回収、及びアフィニティークロマトグラフィーによる上清からＩｇＧの精製が含まれる。
【0066】
Ｂ．同じ核酸からホスト依存性融合タンパク質の発現をもたらす合成イントロン
本発明は、異なるＦａｂ融合タンパク質は、原核細胞でなく真核細胞においてｍＲＮＡのプロセシング中に起きるイントロンスプライシングの天然のプロセスを利用することにより、宿主細胞依存的に同一の核酸分子から発現され得るという発見に一部基づいている。
本発明は、異なるＦａｂ融合タンパク質は、原核細胞でなく真核細胞においてｍＲＮＡのプロセシング中に起きるイントロンスプライシングの天然のプロセスを利用することにより、宿主細胞依存的に同一の核酸分子から発現され得るという発見に一部基づいている。
【0067】
ｈＩｇＧ１のＨＣ定常領域のゲノム配列は、３つの天然イントロン（図３Ａ）、イントロン１、イントロン２及びイントロン３が含まれている。イントロン１は、ＨＣ可変ドメイン／ＣＨ１（ＶＨ／ＣＨ１）及びヒンジ領域との間に位置する３９１塩基対のイントロンである。イントロン２は、ヒンジ領域及びＣＨ２との間に位置する１１８塩基対のイントロンである。イントロン３は、ＣＨ２及びＣＨ３との間に位置する９７塩基対のイントロンである。
【0068】
本発明は、ＶＨ／ＣＨ１とヒンジ領域の間に位置するイントロン１を含むベクターを提供する。他の例としては、ＶＨ／ＣＨ１とヒンジ領域との間に位置するイントロン２又はイントロン３を含む。幾つかのベクターにおいて、コートタンパク質又はアダプタータンパク質をコードする核酸は、その５’末端でイントロンに対する天然のスプライスドナー、その３’末端で天然のスプライスアクセプターにより、ＶＨ／ＣＨ１及びヒンジ領域との間に位置するイントロンに挿入される。
他の例としては、スプライスドナーの８つの位置のうち、位置１と５で置換を有する変異体スプライスドナーを含む。
他の例としては、スプライスドナーの８つの位置のうち、位置１と５で置換を有する変異体スプライスドナーを含む。
【0069】
例えば、ファージＥＬＩＳＡは、原核細胞での発現及び分泌系を分析するために使用することができる。
【0070】
例えば、プロテインＡ及びゲル濾過クロマトグラフィーを用いる培養上清からのＩｇＧの精製は、真核細胞における発現及び分泌系を分析するために使用することができる。更に、ＲＴ－ＰＣＲは、真核細胞中で合成イントロンを含有するＨＣカセットのスプライシングを分析するために使用することができる。
【0071】
Ｃ．原核細胞及び真核細胞におけるポリペプチドの発現及び分泌のためのベクター。
原核細胞及び真核細胞におけるＦａｂ融合タンパク質の発現及び分泌のための発現及び分泌系は、当該分野の技術範囲内である様々な技術を用いて構築することができる。
原核細胞及び真核細胞におけるＦａｂ融合タンパク質の発現及び分泌のための発現及び分泌系は、当該分野の技術範囲内である様々な技術を用いて構築することができる。
【0072】
一態様では、発現及び分泌系は、（１）哺乳動物プロモーター；（２）（５’から３’の順に）細菌プロモーター、シグナル配列、抗体軽鎖配列、コントロールタンパク質（ｇＤ）を含む、ＬＣカセット；（３）（５’から３’の順に）哺乳動物のポリアデニル化／転写終止シグナル、原核細胞における転写を停止させるための転写ターミネーター配列、ＨＣの発現を駆動するための哺乳動物プロモーター及び細菌プロモーターを含む合成カセット；（４）シグナル配列及び抗体の重鎖配列を含むＨＣカセット；（５）哺乳動物ポリアデニル化／転写終止シグナル及び原核細胞における転写を停止させるための転写ターミネーター配列を含む第２の合成カセットを含むベクターを含む。ＬＣ及びＨＣに先行する分泌シグナル配列は、原核細胞及び真核細胞の両方で機能する同じシグナル配列（例えば、哺乳動物ｍＢｉＰシグナル配列）でもあってもよい。一実施態様において、抗体の重鎖配列は、合成イントロンを含む。合成イントロンは、（その５’末端で）ＶＨ／ＣＨ１ドメインに（その３’末端で）ヒンジ領域に配置される。一実施態様において、合成イントロンは、５’末端で最適化されたスプライスドナー配列、及び３’末端で天然のイントロン１のスプライスアクセプター配列により隣接される。一実施態様において、合成イントロンは、直接融合ディスプレイのためにファージコートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩ）（図１４を参照）、又は間接融合ディスプレイのためにイントロン１へヌクレオチドレベルで融合したアダプタータンパク質（図７を参照）をコードするヌクレオチド配列を含む。間接的融合ディスプレイでは、ベクターは（５’から３’の順に）細菌プロモーター、細菌のシグナル配列、パートナーのアダプターペプチドがコートタンパク質のＮ末端にヌクレオチドレベルで融合したファージコートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩ）及び転写ターミネーター配列を含む別個の細菌発現カセットを更に含む（図７参照）。更に、ＨＣ及びＬＣの両方がタンデムな哺乳動物及び細菌プロモーターによって制御され（図７参照）、又は一方のみ（例えば、ＨＣ）のカセットがタンデムな哺乳動物及び細菌プロモーターによって制御されるのに対して、他方（例えば、ＬＣ）カセットは、細菌のプロモーターによってのみ制御される、上記コンストラクトの異なる実施態様が可能である（図１４を参照）。
【0073】
更に、ベクターは、細菌の複製起点、哺乳動物の複製起点、コントロール（例えばｇＤタンパク質）として有用な又はタンパク質精製、タンパク質のタグ付け、タンパク質の標識化（検出可能な化合物又は組成物、例えば標識（例えば、放射性標識、蛍光可能な標識又は酵素標識）による標識化）などの活性のために有用なポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0074】
一実施態様において、哺乳動物プロモーター及び細菌プロモーター及びシグナル配列は抗体軽鎖配列に作動可能に連結され、哺乳動物プロモーター及び細菌プロモーター及びシグナル配列は抗体重鎖配列に作動可能に連結される。
【0075】
Ｄ．目的の抗原に対する抗体の選択とスクリーニング
本発明は、ａｂベースのライブラリのファージ又は細菌ディスプレイによって目的のタンパク質に対する抗体をスクリーニングし選択する方法、又は同様の方法により、既存の抗体を最適化する方法を提供する。上述の二重ベクターの使用は、原核細胞におけるＦａｂ断片のスクリーニング及び選択、及びサブクローニングを必要としない更なる試験用に、完全長ＩｇＧ分子として容易に発現することができるＦａｂの選択のために使用することができる。
本発明は、ａｂベースのライブラリのファージ又は細菌ディスプレイによって目的のタンパク質に対する抗体をスクリーニングし選択する方法、又は同様の方法により、既存の抗体を最適化する方法を提供する。上述の二重ベクターの使用は、原核細胞におけるＦａｂ断片のスクリーニング及び選択、及びサブクローニングを必要としない更なる試験用に、完全長ＩｇＧ分子として容易に発現することができるＦａｂの選択のために使用することができる。
【0076】
発明の抗体
本発明の更なる態様では、上記実施態様のいずれかに記載の抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
本発明の更なる態様では、上記実施態様のいずれかに記載の抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
【0077】
更なる態様にて、以下のセクション１－７で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる：
【0078】
１．抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍから１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍから１０－１３Ｍ）である。
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍから１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍから１０－１３Ｍ）である。
【0079】
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）－標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Thermo Scientific）を、５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２～５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した目的のＦａｂと混合する（例えば、Presta等， (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ－１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０ＴＭ；Packard）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγ計測器（Packard）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
【0080】
他の実施態様に従って、～１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５, BIAcore Inc.）を、提供者の指示書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（～０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、 Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ－１ｓ－１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（stop-flow equipped spectrophometer）（Aviv Instruments）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ThermoSpectronic）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【0081】
２．抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【0082】
ダイアボディは２価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【0083】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照）。
【0084】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【0085】
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【0086】
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【0087】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５，８２１，３３７、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)（「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【0088】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及びRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
【0089】
４．ヒト抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【0090】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６，０７５，１８１号及び６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）も参照のこと。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【0091】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【0092】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に説明する。
【0093】
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性又は活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
本発明の抗体は、所望の活性又は活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【0094】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、Griffiths等，EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のように如何なる免疫化をも伴うことなく、幅広い非自己抗原及び自己抗原に対する抗体の単一源を提供することが可能である。最終的には、ナイーブライブラリーは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを利用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードせしめ、インビトロでの再配列を達成させることによって合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び２００９／０００２３６０を含む。
【0095】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【0096】
６．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つは第一抗原に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。所定の実施態様において、二重特異性抗体は、第一抗原の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまた第一抗原を発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つは第一抗原に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。所定の実施態様において、二重特異性抗体は、第一抗原の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまた第一抗原を発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【0097】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)）、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブ－イン－ホール（knob-in-hole）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ－ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号；及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体断片を作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【0098】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。
【0099】
本明細書中の抗体又は断片はまた、第一抗原並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Dual Acting）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【0100】
７．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
【0101】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
【0102】
【0103】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【0104】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【0105】
置換された変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【0106】
改変（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し再選択すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３がしばしば標的にされる。
【0107】
所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【0108】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【0109】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【0110】
ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【0111】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ－結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
【0112】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。
【0113】
フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「非フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号Ａ１、Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２号Ａ１、Adams et al., 特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、アルファ－１、６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【0114】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairettら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Umanaら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【0115】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、１つ又は複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
ある実施態様において、１つ又は複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【0116】
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の464ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に記述されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代わりとして、又は更に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等， (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。また、ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定は、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
【0117】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【0118】
ＦｃＲへの結合を改善又は減少させた特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)）。
【0119】
所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【0120】
幾つかの実施態様において、改変された（即ち、改善されたか又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。
【0121】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号Ａ１（Hinton et al.）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【0122】
Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【0123】
ｄ）システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー－薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Kabatの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
ある実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー－薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Kabatの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【0124】
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
【0125】
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005）。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体－非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【0126】
組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【0127】
抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【0128】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号及び第５，８４０，５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照）。発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され、更に精製することができる。
【0129】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【0130】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【0131】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【0132】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３又は２９３Ｔ細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の評価については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。
【0133】
アッセイ
本明細書で提供される抗体は、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性について同定され、スクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
本明細書で提供される抗体は、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性について同定され、スクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
【0134】
１．結合アッセイとその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【0135】
別の態様において、競合アッセイが、目的の抗原に結合するための本発明の抗体と競合する抗体を同定するために用いることができる。所定の実施態様において、このような競合する抗体は、本発明の抗体により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
【0136】
典型的な競合アッセイにおいて、目的の固定化抗原は、目的の抗原に結合する第一の標識された抗体（例えば、本発明の抗体）、及び目的の抗原へ結合について第一の抗体と競合する能力について試験される第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、目的の固定化抗原が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。目的の抗原への第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化された目的の抗原に結合した標識の量が測定される。もし、固定化した目的の抗原に結合した標識の量が、対照サンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が目的の抗原への結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【0137】
２．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するその抗体を同定するために提供される。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するその抗体を同定するために提供される。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【0138】
所定の実施態様において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。
【0139】
以下の実施例は、事例のためだけであって、本発明の権利範囲が制限されるものでは決してない。
【0140】
本明細書で引用した全ての特許文献及び参考文献は、本明細書において参照によりその全体が明確に援用される。
【実施例0141】
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【0142】
Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージは、New England Biolabsからであった。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びＴｗｅｅｎ２０は、Sigmaからであった。カゼインは、Pierceから入手した。抗Ｍ１３コンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）はAmersham Pharmaciaからであった。マキシソープイムノプレートはＮＵＮＣからであった。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質は、Kirkegaard及びPerry Laboratoriesからであった。他の全てのタンパク質抗原は、ジェネンテック社での研究グループによって生成された。
【0143】
実施例１：原核細胞及び真核細胞での発現のためのシグナル配列の選択
ベクターが、大腸菌及び真核（哺乳動物）細胞の両方において目的のタンパク質を発現することができるかどうかを検討するために、哺乳動物細胞中で機能することができるとする考えを支持する事例証拠が存在する非細菌起源の４つのシグナル配列が選択された。我々は、これらのシグナル配列を、ファージＥＬＩＳＡを使用してＭ１３ファージ上で抗Ｈｅｒ２（ｈ４Ｄ５）Ｆａｂディスプレイを駆動するその能力について試験した（図１Ａ）。ディスプレイのレベルは、細菌の熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）のシグナル配列と比較して評価した。Ｆａｂファージディスプレイを駆動するシグナル配列の能力は大きく変化し、マウス結合性免疫グロブリンタンパク質（ｍＢｉＰ）からの、一つのシグナル配列が、Ｆａｂディスプレイの効率的なレベルを恐らくは可能としうるディスプレイのレベルを駆動した。
ベクターが、大腸菌及び真核（哺乳動物）細胞の両方において目的のタンパク質を発現することができるかどうかを検討するために、哺乳動物細胞中で機能することができるとする考えを支持する事例証拠が存在する非細菌起源の４つのシグナル配列が選択された。我々は、これらのシグナル配列を、ファージＥＬＩＳＡを使用してＭ１３ファージ上で抗Ｈｅｒ２（ｈ４Ｄ５）Ｆａｂディスプレイを駆動するその能力について試験した（図１Ａ）。ディスプレイのレベルは、細菌の熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）のシグナル配列と比較して評価した。Ｆａｂファージディスプレイを駆動するシグナル配列の能力は大きく変化し、マウス結合性免疫グロブリンタンパク質（ｍＢｉＰ）からの、一つのシグナル配列が、Ｆａｂディスプレイの効率的なレベルを恐らくは可能としうるディスプレイのレベルを駆動した。
【0144】
細菌中での真核生物シグナル配列の機能はコドン使用頻度により大きく影響されることが以前に実証されていたので、ｍＢｉＰシグナル配列の能力を更に向上させるため、我々はファージに基づくコドン最適化アプローチを利用した（Humphreys et al., The Protein Expression and Purification, 20: 252-264 (2000)。ｍＢｉＰシグナル配列が、標準的なファージミドベクター中でｈ４Ｄ５ Ｆａｂ ＨＣのＮ末端に融合したファージライブラリーを構築した。ｍＢｉＰシグナルペプチドのＤＮＡ配列は、サイレント変異のみを可能とする、最初の二つのメチオニンに続く各コドンの３番目の塩基が多様化していた。固定化Ｈｅｒ２に対する固相パニングを４ラウンドの後、個々のクローンを採取し、配列決定した。我々は、選択されたクローンのコンセンサス配列は、グアニン又はシトシンよりむしろ、ランダム化した位置でアデニン又はチミンを非常に好むということを見いだした。この結果は、野生型ｍＢｉＰの配列内の１７のコドンのうち１５は、第三塩基の位置でグアニン又はシトシンを含むが、選別されたライブラリ内の１７コドンのそれぞれは、６０－９０％の確率でこれらの位置にアデニン又はチミンを含んでいたという事実によって強調される。ＥＬＩＳＡファージで試験した場合、最適化されたｍＢｉＰシグナル配列は、原核生物のＳＴＩＩシグナル配列に匹敵するレベルでｈ４Ｄ５ Ｆａｂのディスプレイを駆動し、ｍＢｉＰシグナル配列は、能力の明らかな減少を伴うことなく、原核生物のＳＴＩＩシグナル配列の代わりに、ファージディスプレイ実験及びパニング実験のために利用することができることを示唆している（図１Ｂ）。
【0145】
次いで、哺乳動物細胞におけるＩｇＧの発現及び分泌を支援するｍＢｉＰシグナル配列の能力を評価した。各々がＮ末端に融合したｍＢｉＰシグナル配列を有するｈ４Ｄ５ ｈＩｇＧ１のＨＣ及びＬＣをコードする哺乳動物発現ベクターが懸濁液の２９３Ｓ細胞に同時導入され、５日間増殖させ、その後に上清を回収し、そしてＩｇＧをアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。３０ｍＬの培養物からのＩｇＧの収率は決まって約２．０ｍｇであり、両方の鎖の天然型ＨＣシグナル（ＶＨＳ）を使用して得られた収率に匹敵する（データ非表示）。興味深いことに、ｍＢｉＰシグナル配列のコドンが最適化された形態に対する野生型の使用は、ＩｇＧの発現レベルにおいて識別可能な影響を及ぼさなかった（データ非表示）。ゲル濾過クロマトグラフィー及び質量分析において、精製されたタンパク質は溶液中で＞９０％が単量体であり、ｍＢｉＰシグナル配列はＨＣ及びＬＣ両方の適切な位置で完全に切断されたことを確認した（データ非表示）。ｈ４Ｄ５は良好な発現体であることが知られているので、我々は、ファージパニング実験から任意に選択された未同定クローンのプールでＶＨＳに比較したｍＢｉＰの性能を試験した。これらのクローンからの平均収量は、３０ｍＬの懸濁培養から約１．０ｍｇであって、有意な差は、２つのシグナル配列の間で観察されなかった（図２Ａ及びＢ）。
【0146】
要約すると、ｍＢｉＰ哺乳動物分泌シグナル配列は、スクリーニング用に十分なレベルで、哺乳動物細胞中でＩｇＧを発現させることができ、そしてまた一度コドンが最適化されると、ＩｇＧの発現レベルを損なうことなく、ファージ上で堅牢なＦａｂディスプレイを駆動することができた。
【0147】
実施例２：原核細胞及び真核細胞における代替のＦａｂ融合体の発現
宿主細胞依存的に異なるＦａｂ融合タンパク質を生成するために、我々は、原核細胞でなく真核生物においてｍＲＮＡのプロセシング中に生じるイントロンスプライシングの天然のプロセスを活用しようとした。ｈＩｇＧ１のＨＣ定常領域のゲノム配列は、３つの天然イントロンが含まれる（図３Ａ）。これらのうち最初（イントロン１）は、ＨＣ可変ドメイン（ＶＨ）及びヒンジ領域との間に位置する３８４塩基対のイントロンである。ＲＴ－ＰＣＲ及び転写産物の配列決定によって評価されるように、イントロン１及び最適化されたスプライスドナー配列を含むＨＣ発現ベクターは、完全にスプライシングされたｍＲＮＡを発現し、ＬＣベクターを同時導入されると、イントロンを含まないベクターに匹敵するレベルでＩｇＧ１を発現した（図５）。
宿主細胞依存的に異なるＦａｂ融合タンパク質を生成するために、我々は、原核細胞でなく真核生物においてｍＲＮＡのプロセシング中に生じるイントロンスプライシングの天然のプロセスを活用しようとした。ｈＩｇＧ１のＨＣ定常領域のゲノム配列は、３つの天然イントロンが含まれる（図３Ａ）。これらのうち最初（イントロン１）は、ＨＣ可変ドメイン（ＶＨ）及びヒンジ領域との間に位置する３８４塩基対のイントロンである。ＲＴ－ＰＣＲ及び転写産物の配列決定によって評価されるように、イントロン１及び最適化されたスプライスドナー配列を含むＨＣ発現ベクターは、完全にスプライシングされたｍＲＮＡを発現し、ＬＣベクターを同時導入されると、イントロンを含まないベクターに匹敵するレベルでＩｇＧ１を発現した（図５）。
【0148】
イントロン１の配列内に埋め込まれたファージアダプターペプチドへのＦａｂ断片が、細菌細胞及び哺乳動物細胞のそれぞれにおいてファージ上のディスプレイ及びＩｇＧの発現の両方を可能にするかどうかを決定するため、アダプターペプチド（図３Ｂ）又はファージコートタンパク質遺伝子ＩＩＩ（図３Ｃ）が、イントロン１又はイントロン３の５’末端で、ｈ４Ｄ５ ＨＣ．イントロン１のコンストラクトに挿入されたイントロン１又は３からの天然スプライスドナーは、アダプタペプチドのすぐ上流に移動させた。ＨＣ－アダプター．イントロン１コンストラクトが、哺乳動物細胞においてｈ４Ｄ５ ＬＣと共発現させた場合、ｈ４Ｄ５ ＩｇＧの発現はイントロンを含まないコントロールコンストラクトのそれの約４０％（アダプターを含むイントロンについて）であり、又は約５％（遺伝子－ＩＩＩ含有イントロンについて）であった（図４Ａ）。ＲＴ－ＰＣＲは、ＨＣ－アダプターｍＲＮＡの一部は適切にスプライシングされつつ（図４Ｂ、中央のバンド）、ＶＨ領域における潜在性スプライスドナーから有意な量のｍＲＮＡがスプライシングされなかった（図４Ｂ、上のバンド）又は不正確にスプライシングされた（図４Ｂ、下のバンド）かの何れかであることを実証した。。ＨＣ－遺伝子－ＩＩＩのｍＲＮＡは、ほぼ完全に潜在性スプライスドナーからスプライシングされた。潜在性スプライスドナー配列のサイレント変異は、スプライシングされていないｍＲＮＡの蓄積のみをもたらした（非表示）。
【0149】
アダプター配列を挿入したときに、イントロンの効率的なスプライシングの不全に照らして、我々は、哺乳動物のｍＲＮＡのためのスプライスドナーの既知のコンセンサス配列に対して天然のスプライスドナーの配列を比較した（Stephens et al., J of Molecular Biology, 228: 1124-1136 (1992)）。図５に示すように、ｈＩｇＧ１のイントロン１からの天然スプライスドナーは、８つのうち３つの位置でコンセンサスドナー配列とは異なる。位置１及び５での置換は、これらの位置が位置８よりも保存されているので更に分析された。位置１及び５での塩基がコンセンサス配列と一致するように変更された変異体スプライスドナー（ドナー１）（図５Ａ）が生成され、ＨＣにおいて合成イントロンのスプライシングを媒介するこれらの改変されたドナーの能力を試験した。この最適化されたスプライスドナーは、イントロンを含まないコントロールコンストラクトのレベルと一致したレベルまでｈ４Ｄ５ ＩｇＧの発現の随伴性増加を伴って（図５Ｃ）、完全に合成イントロンのスプライシングを回復した（図５Ｂ）。合成イントロンがアダプターペプチド又は遺伝子ＩＩＩを含むか、及びまた、合成イントロンがｈＩｇＧ１のイントロン１又はイントロン３に基づいているかによらず、スプライシング及びＩｇＧの発現の改善が観察された。
【0150】
実施例３：原核細胞及び真核細胞のための発現及び分泌システムの生成
二重ベクタープラスミドの生成のために、我々はファージディスプレイに現在使用したｐＢＲ３２２由来のファージミドベクター、ｐＲＳを使用した。このバイシストロン性ベクターは、その関連するＳＴＩＩシグナル配列を有する抗体の軽鎖カセット、続いて関連するＳＴＩＩシグナル配列を有する抗体の重鎖カセットの発現を駆動する細菌のＰｈｏＡプロモーターからなる。軽鎖配列の最後に、ファージ粒子上のＦａｂディスプレイを検出するためのｇＤエピトープタグがある。従来のファージミドでは、重鎖配列は、ｈＩｇＧのＶＨ及びＣＨ１ドメインのみからなり、ファージ融合タンパク質、ほとんどの場合ファージコートタンパク質ｐＩＩＩ又はアダプターペプチドをコードする、遺伝子ＩＩＩなどのユーティリティペプチドに対してヌクレオチドレベルで融合される。軽鎖及び重鎖カセットの３’末端は、大腸菌において転写を停止するためのラムダ転写ターミネーター配列を含む。このベクターは、単一のｍＲＮＡ転写産物からの軽鎖及び重鎖のｐＩＩＩを生成するので、ＬＣ配列及びＨＣ配列間に転写調節エレメントは存在しない。ベクターは、アンピシリン耐性を付与するβ－ラクタマーゼ（ＢＬＡの）遺伝子、大腸菌における複製のためのｐＭＢ１起点、及びＭ１３ファージによる感染を可能にする細菌表面上での線毛の発現のためのｆ１起点を含む。このベクターの別の形態はまた、哺乳動物細胞の適切な菌株におけるプラスミドのエピソーム複製のためのＳＶ４０複製起点を含む。
二重ベクタープラスミドの生成のために、我々はファージディスプレイに現在使用したｐＢＲ３２２由来のファージミドベクター、ｐＲＳを使用した。このバイシストロン性ベクターは、その関連するＳＴＩＩシグナル配列を有する抗体の軽鎖カセット、続いて関連するＳＴＩＩシグナル配列を有する抗体の重鎖カセットの発現を駆動する細菌のＰｈｏＡプロモーターからなる。軽鎖配列の最後に、ファージ粒子上のＦａｂディスプレイを検出するためのｇＤエピトープタグがある。従来のファージミドでは、重鎖配列は、ｈＩｇＧのＶＨ及びＣＨ１ドメインのみからなり、ファージ融合タンパク質、ほとんどの場合ファージコートタンパク質ｐＩＩＩ又はアダプターペプチドをコードする、遺伝子ＩＩＩなどのユーティリティペプチドに対してヌクレオチドレベルで融合される。軽鎖及び重鎖カセットの３’末端は、大腸菌において転写を停止するためのラムダ転写ターミネーター配列を含む。このベクターは、単一のｍＲＮＡ転写産物からの軽鎖及び重鎖のｐＩＩＩを生成するので、ＬＣ配列及びＨＣ配列間に転写調節エレメントは存在しない。ベクターは、アンピシリン耐性を付与するβ－ラクタマーゼ（ＢＬＡの）遺伝子、大腸菌における複製のためのｐＭＢ１起点、及びＭ１３ファージによる感染を可能にする細菌表面上での線毛の発現のためのｆ１起点を含む。このベクターの別の形態はまた、哺乳動物細胞の適切な菌株におけるプラスミドのエピソーム複製のためのＳＶ４０複製起点を含む。
【0151】
初期二重ベクター（ここでは「ｐＤＶ．６．０」と呼ぶ）の構築のため、我々は最初に、ｐＲＫ（ＩｇＧの発現及び他のタンパク質のために使用される哺乳動物発現ベクター）からの哺乳動物のＣＭＶプロモーターを、ＬＣ－ＨＣのシストロンを駆動するｐｈｏＡプロモーターの上流に挿入した。ＬＣ抗体コード配列の終端に、我々は、アンバーサプレッサー大腸菌株でディスプレイされたときにファージ上のタグ付きＬＣの検出を可能とする、アンバー終止コドン、続いてｇＤエピトープタグを挿入した。ベクターが哺乳動物細胞で発現される場合、エピトープタグは存在しない。従って、ＬＣカセットは（５’から３’の順に）、真核生物プロモーター、細菌プロモーター、シグナル配列、抗体軽鎖（ＬＣ）をコードする配列、及びエピトープタグ（ｇＤ）を含む。
【0152】
次に、ＨＣカセットとＬＣカセットとの間に、我々は（５’から３’から順に）ＳＶ４０哺乳動物ポリアデニル化／転写終止シグナル、大腸菌における転写終結のためのラムダターミネーター配列、ＣＭＶプロモーター及びＰｈｏＡプロモーターを含む合成カセットを挿入した。
【0153】
次に、ＳＶ４０哺乳動物ポリアデニル化／転写終止シグナル及びラムダターミネーター配列をＨＣカセットの後に挿入した。ＨＣカセットは、シグナル配列、及び抗体重鎖（ＨＣ）コード配列を含む。
【0154】
原核細胞と真核細胞の両方において目的の融合タンパク質の分泌を可能にするために、我々は、ＬＣ及びＨＣの前のＳＴＩＩシグナル配列を真核生物のマウス結合性免疫グロブリンタンパク質（ｍＢｉＰ）シグナル配列と置換した。幾つかの候補シグナル配列のスクリーニングは、このシグナル配列は、原核生物の発現（即ち、ファージディスプレイ）及び／又は真核生物の発現（即ち、哺乳動物細胞におけるＩｇＧの発現）を必要とする用途で機能することが可能であり、そしてｍＢｉＰは、この作業の前に用いられた各々のシグナル配列が機能を果たしたのと同様に、これらの設定の両方で良好に機能を果たしたという発見へと我々を導いている。
【0155】
大腸菌内でＦａｂファージを、及び哺乳動物細胞中でＩｇＧの発現を可能にするために、我々は、ＨＣカセット中に合成イントロンを生成した。我々は、ファージ粒子上にディスプレイするための融合タンパク質（遺伝子ＩＩＩ）を含む合成イントロンを作製するために、ヒトＩｇＧ１のイントロン１又はイントロン３からの天然イントロンを改変した。ヒトＩｇＧ１からのイントロン１（又はイントロン３）のゲノム配列が、大腸菌でＦａｂ ＨＣ－ｐ３融合体を生成するために停止コドンによって分離される遺伝子ＩＩＩ配列の直後に挿入された。合成イントロンの５’フランキング領域で天然のスプライスドナーオクタヌクレオチドの配置は、大腸菌で発現された場合、ヒンジ領域中に２つのアミノ酸変異を必要とし（Ｅ２１２Ｇ及びＰ２１３Ｋ、Ｋａｂａｔの番号付け）、最適化されたスプライスドナーを作製するための変異は、リジンに変異されているこれらの残基の両方を生じる。これらの変異は、ファージ上のディスプレイのレベルに影響を与えず（非表示）、ファージヒンジ領域はスプライシングプロセスの間に除去されるので、哺乳動物細胞で発現する完全長ＩｇＧには存在しないであろう。
【0156】
また、アダプターファージディスプレイの利用のために、我々は、異なる合成イントロンを有し、上記のｐＤＶ６．０ベクターに類似するベクターを生成した（ｐＤＶ５．０と呼ぶ。図７に示す）。遺伝子ＩＩＩ配列は、ロイシンジッパー対の２つのメンバーの片方（本明細書では「アダプター」と呼ばれる）と置換した。この合成イントロンでは、アダプターペプチド配列の後に、終止コドン及びイントロン１又は３のゲノム配列が続く。このコンストラクトでは、我々はまた、ロイシンジッパー対の同族メンバーに融合された遺伝子ＩＩＩからなる別個の細菌発現カセットを挿入した。ＬＣ ＣＭＶプロモーターの上流に導入され、ＰｈｏＡプロモーターによって制御されるこの別個の細菌発現カセットは、大腸菌に対してアダプター遺伝子ＩＩＩの発現を制限するＳＴＩＩシグナル配列を含み、そしてすぐ下流にラムダターミネーターを含む。大腸菌で発現された場合、重鎖及び軽鎖はペリプラズム中で会合してＦａｂを形成し、重鎖に融合したアダプターはｐＩＩＩ－アダプタータンパク質上の同族アダプターに安定的に結合する。この会合したＦａｂアダプターｐＩＩＩ複合体のファージ粒子中へのパッケージングは、目的のＦａｂをディスプレイするファージを得ることとなる。加えて、我々は、パートナーアダプターが遺伝子ＩＩＩのＮ末端へ融合される（アダプター－ＫＯ７）ＫＯ７ヘルパーファージのカスタム変異体を生成した。アダプター－ＫＯ７とｐＤＶ．５．０を有する大腸菌の感染は、アダプターに融合した成熟ファージミド上に存在するｐＩＩＩの全てのコピーを生じる。その結果、ｐＤＶ５から由来するｐＩＩＩのそれらのコピーのみよりむしろＦａｂアダプターに結合するｐＩＩＩの全てのコピーが利用可能である。しかしながら、時には、低レベルのディスプレイは、まれな高親和性クローンが求められるときに望ましい場合がある（例えば、親和性成熟の用途において）。この場合、従来のＫＯ７ヘルパーファージとともにｐＤＶ．５．０を保有する大腸菌の感染は、ファージ粒子上にディスプレイされる（ｐＤＶ．５．０からの）アダプター－ｐＩＩＩ及び（ＫＯ７ヘルパーファージからの）野生型ｐＩＩＩの混合物を生じるであろう。このシナリオでは、全体的なｐＩＩＩプールのサブセットのみがアダプター－Ｆａｂと結合することができるので、得られるディスプレイレベルは、アダプターＫＯ７を用いた場合よりも低くなるであろう。単に適切なヘルパーファージを選択することにより、ディスプレイレベルを調節する能力が本発明のユニークな利点である。
【0157】
我々は、哺乳動物細胞において異なるＩｇＧを発現するｐＤＶ５．０の能力を評価した。四つの異なるヒトＩｇＧからのＨＣ及びＬＣはｐＤＶ５．０にサブクローニングされ、２９３細胞中で発現させた。若干驚くべきことに、ｐＤＶからの総収量は、２－プラスミド系からよりも一貫して約１０倍低かった。しかしながら、収量は依然として３０ｍＬの培養あたり約０．１－０．４ｍｇのオーダーである（図６Ｂ）。物質のこの量は、日常的なスクリーニングアッセイのためより適切であり、より大量の物質が必要な場合、容易に０．１－１Ｌ以上までスケールアップすることができる。ＩｇＧは溶液中で、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、＞９０％が単量体であることが示された。
【0158】
実施例４：遺伝子－ＩＩＩ中にアンバー変異を有する、変異型ヘルパーファージ、Ｍ１３ＫＯ７の構築（アンバーＫＯ７）
Ｍ１３ファージ上のｐＩＩＩに融合したタンパク質のディスプレイを増強するため、我々は部位特異的突然変異誘発を使用して、変異体ヘルパーファージ、アンバーＫＯ７を生成させた。アンバーＫＯ７は部位特異的変異誘発によってＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージゲノムに導入されたアンバーコドンを有する。ｐＩＩＩのヌクレオチド配列（変異体ヘルパーファージアンバーＫＯ７のヌクレオチド１５７９から２８５３）が図８に示されている。
Ｍ１３ファージ上のｐＩＩＩに融合したタンパク質のディスプレイを増強するため、我々は部位特異的突然変異誘発を使用して、変異体ヘルパーファージ、アンバーＫＯ７を生成させた。アンバーＫＯ７は部位特異的変異誘発によってＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージゲノムに導入されたアンバーコドンを有する。ｐＩＩＩのヌクレオチド配列（変異体ヘルパーファージアンバーＫＯ７のヌクレオチド１５７９から２８５３）が図８に示されている。
【0159】
アンバーＫＯ７を生成するため、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７が大腸菌ＣＪ２３６株（遺伝子型ｄｕｔ－／ｕｎｇ－）を感染させるために使用され、子孫のビリオンは、ｓｓＤＮＡを精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してｓｓＤＮＡを精製するために回収された。合成オリゴヌクレオチド（配列５’－ＧＴＧＡＡＴＴＡＴＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＡＧＧＣＣＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＡＧＣＣＡ－３’）（配列番号２３）が、オリゴヌクレオチド特異的部位変異誘発によってＭ１３ＫＯ７の遺伝子－ＩＩＩを変異させるために使用された。変異誘発されたＤＮＡが大腸菌ＸＬ１－ブルー細胞を形質転換するために使用され（Agilent Technologies）、ソフト寒天プレート上で感染していないＸＬ１－ブルー細胞の菌叢に播種した。プラークを個別に採取し、細胞は５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で増殖させた。二本鎖複製形態（ＲＦ）のＤＮＡを、ＤＮＡミニプレップキットを用いて抽出し、アンバー終止変異の存在を確認するために配列決定した。個体群の均質性を、ＲＦ ＤＮＡのＡｖｒＩＩ制限エンドヌクレアーゼ消化及び寒天ゲル電気泳動により確認した。全ての組換えＤＮＡ操作工程を記載されるように行った（Sambrook, J. et al., A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratroy Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001）。
【0160】
アンバーＫＯ７を用いて生成されたファージ粒子上のＦａｂディスプレイのレベルは、ファージＥＬＩＳＡによって測定した。抗原（Ｈｅｒ２）をイムノプレート上に固定化し、野生型ＫＯ７（ＷＴ ＫＯ７）又はｐＩＩＩヘルパーファージ中にアンバー変異を有する改変されたＭ１３ＫＯ７（アンバーＫＯ７）の何れかを使用して、抗Ｈｅｒ２ Ｆａｂを有するファージがＸＬ１－ブルー細胞中で生成された。結合は、マウス抗Ｍ１３－ＨＲＰコンジュゲートと共にインキュベートし、その後４５０ｎｍでのＴＭＢ基質ＯＤ測定により検出した。アンバーＫＯ７の使用は、野生型ＫＯ７がファージ生成のために使用される場合に同じファージミドによって達成されるレベルと比較して（閉じた四角形）、低ディスプレイファージミドから、より高いディスプレイレベルをもたらした（閉じた三角形）（図９）。アンバーＫＯ７を使用した低ディスプレイファージミドによるＦａｂディスプレイのレベル（閉じた三角形）はまた、野生型ＫＯ７による高ディスプレイファージミドを使用した場合に観察されたＦａｂディスプレイのレベルと同様であった（白い菱形）（図９）。
【0161】
実施例５：ナイーブＨＣ－のみライブラリーの生成のための原核細胞及び真核細胞の発現及び分泌系の生成及びファージパニング用システムの利用
実施例３に記載のＨＣ及びＬＣの両方で、原核生物プロモーター及び真核生物プロモーターを特徴づける直接的及び間接的な融合ベクターに加えて（ｐＤＶ５．０とｐＤＶ６．０）、我々は、改変された直接融合二重ベクターコンストラクトを生成し（図１４に示すｐＤＶ．６．５）、ここではＦａｂ ＬＣはＳＴＩＩシグナル配列に融合され、細菌のＰｈｏＡプロモーターによってのみ駆動されるが、一方Ｆａｂ ＨＣ（哺乳動物細胞における完全長ｈＩｇＧ１ ＨＣの発現のための遺伝子ＩＩＩ－合成イントロン配列及びｈＩｇＧ Ｆｃ配列を含有する）は、真核生物のＣＭＶプロモーター、及び原核生物のＰｈｏＡプロモーターの両方によって駆動された。このコンストラクトは、多様性がＨＣのみに導入される、前述の合成ヒトＦａｂライブラリーを再現するために使用された（Lee, et al., Journal of Molecular Biology, 340. 1073-1093 (2004)）。このベクターからの完全長ＩｇＧの発現は、ＬＣをコードする哺乳動物発現ベクターの同時導入を必要とする。
実施例３に記載のＨＣ及びＬＣの両方で、原核生物プロモーター及び真核生物プロモーターを特徴づける直接的及び間接的な融合ベクターに加えて（ｐＤＶ５．０とｐＤＶ６．０）、我々は、改変された直接融合二重ベクターコンストラクトを生成し（図１４に示すｐＤＶ．６．５）、ここではＦａｂ ＬＣはＳＴＩＩシグナル配列に融合され、細菌のＰｈｏＡプロモーターによってのみ駆動されるが、一方Ｆａｂ ＨＣ（哺乳動物細胞における完全長ｈＩｇＧ１ ＨＣの発現のための遺伝子ＩＩＩ－合成イントロン配列及びｈＩｇＧ Ｆｃ配列を含有する）は、真核生物のＣＭＶプロモーター、及び原核生物のＰｈｏＡプロモーターの両方によって駆動された。このコンストラクトは、多様性がＨＣのみに導入される、前述の合成ヒトＦａｂライブラリーを再現するために使用された（Lee, et al., Journal of Molecular Biology, 340. 1073-1093 (2004)）。このベクターからの完全長ＩｇＧの発現は、ＬＣをコードする哺乳動物発現ベクターの同時導入を必要とする。
【0162】
ファージディスプレイライブラリーは、オリゴヌクレオチド特異的（クンケル）変異誘発、及び終止コドン（ＴＡＡ）が３つ全ての重鎖ＣＤＲに配置されたｐＤＶ．６．５の「終止テンプレート」バージョンを使用して生成された。これらの終止は、ＣＤＲＨ１、Ｈ２及びＨ３をコードする領域にわたってアニールし、縮重コドンとのランダム化のために選択された位置でコドンを置換したオリゴヌクレオチドの混合物による変異誘発反応の間に修復された。変異誘発反応は、ＸＬ１－ブルー細胞に電気穿孔され、培養物を、アンバーＫＯ７ヘルパーファージ、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した２ＹＴブロス中で温度シフトプロトコール（３７℃で４時間、続いて３０℃で３６時間）を用いて増殖させた。ファージを、ＰＥＧ／ＮａＣｌによる沈殿によって培養液から回収した。各電気穿孔反応は、約５μｇのＤＮＡを使用し、１×１０８－７×１０８の形質転換体が得られた。
【0163】
このベクター中に生成されたナイーブファージライブラリーのパニングは、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対して実施された。ファージライブラリーの選別のため、タンパク質抗原をマキシソープイムノプレート上に固定化し、ライブラリーを４から５ラウンドの結合選択に供した。ウェルは、交互のラウンドで、ＢＳＡ又はカゼインを用いて交互に遮断した。ラウンド３から５を通じて選択されたランダムクローンは、標的抗原（ＶＥＧＦ）及び非特異的結合をチェックするための無関係なタンパク質（Ｈｅｒ２）への結合を比較するためにファージＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。簡潔には、ファージクローンは、アンバー．ＫＯ７ヘルパーファージを補充した２ＹＴブロス１．６ｍＬの中で一晩増殖させた（実施例４）。上清を、固定化抗原又は無関係なタンパク質でコーティングされたプレートに室温で１時間結合させた。洗浄後、結合したファージはＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３抗体を用いて検出し（室温で２０分間）続いてＴＭＢ基質で検出した。我々は、ＶＥＧＦについてＥＬＩＳＡ陽性であるが、無関係のコントロールタンパク質（Ｈｅｒ２）についてはＥＬＩＳＡ陽性でない複数のクローンを単離した（図１０－棒グラフ）。
【0164】
ＶＥＧＦに対する特異性を実証したこれらのクローンからのＤＮＡは、その後、完全長ｈＩｇＧ１の発現用の小規模懸濁培養物中で、２９３細胞において共通のＬＣをコードする哺乳動物の発現ベクターの同時導入によって完全長ＩｇＧを発現させるために使用した。１ｍＬの培養物は、製造業者の説明書に従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ又はＪｅｔＰＥＩを使用してトランスフェクトし、３７℃／８％ＣＯ２で５～７日間インキュベートした。スケールアップしたトランスフェクションを、３０ｍＬの２９３細胞中で実施した。
【0165】
培養上清は、次いで、ビアコアＴ１００機器でのＦｃ捕獲アッセイで、ＶＥＧＦ結合についてＩｇＧをスクリーニングするために使用した（図１１）。１ｍＬの培養物からのＩｇＧの上清を、抗原結合についてスクリーニングした。抗ヒトＦｃ捕獲抗体は、シリーズＳ ＣＭ５センサーチップ上に固定化した（１００００ＲＵ）。上清からのＩｇＧの捕獲を可能にするため（５０～１５０ＲＵ）、上清を順次フローセル２、３及び４の上に流し（５μＬ／分で４分間）、その後抗原（１００－１０００ｎＭ）を固定化されたＩｇＧ上に流し（３０μＬ／分で２分間）、結合応答を測定した。
【0166】
正の結合剤の配列決定は、正の結合特性を有する８つの固有配列を示している（重鎖ＣＤＲ配列は図１２に示されている）。ファージＥＬＩＳＡ（図１０）及びビアコアデータ（図１１）と組み合わせた配列決定データ（図１２）が、更なる分析のための８つの抗ＶＥＧＦクローンのプールを選択するために使用された。
【0167】
これらの８つのクローンの発現は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物１００ｍＬにスケールアップされ（図１５を参照）、そして精製された物質は、抗ＶＥＧＦクローンの、受容体遮断ＥＬＩＳＡを介したその同族受容体（ＶＥＧＦＲ１）の一つへのＶＥＧＦの結合をブロックする能力を評価するために使用された。ビオチニル化ｈＶＥＧＦ１６５（２ｎＭ）を、ＰＢＳ／０．５％のＢＳＡ／０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０で３倍に連続希釈した抗ＶＥＧＦ抗体（２００ｎＭの上限濃度）とともにインキュベートした。室温でのインキュベーションの１～２時間後に、混合物をＶＥＧＦＲ１固定プレートに移し、１５分間インキュベートした。次いで、ＶＥＧＦＲ－１に結合したＶＥＧＦを３０分間、ストレプトアビジン－ＨＲＰによって検出し、続いてＴＭＢ基質で現像し、ＩＣ５０値を測定した。
【0168】
我々は、市販の抗ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブと同等のＩＣ５０を有する１クローン（ＶＥＧＦ５５）を同定した（図１３）。この方法では、我々は、ファージパニングからＩｇＧ発現へ直接移行することができ、全てはサブクローニングする必要性無く、クローンのプールを単一候補に至るまで順序をトリアージで決定することができた。
【0169】
要約すれば、この改変された直接融合二重ベクター（ｐＤＶ．６．５）を、大腸菌においてランダム化された重鎖及び定常軽鎖によるファージディスプレイライブラリーの構築に使用することができ、そして、軽鎖発現ベクターで補われる場合にはサブクローニングすることなく、哺乳動物細胞における天然のＩｇＧ１として選択されるクローンを続いて発現させるために使用することもできた。哺乳動物のＣＭＶプロモーターはＨＣのみの上流に存在するので、ＰＤＶは、大腸菌ではＦａｂ ＬＣとＦａｂ ＨＣ－ｐＩＩＩの両方を発現したが、しかし、哺乳動物細胞ではｈＩｇＧ１ＨＣのみを発現した。このベクターは、複数の抗原を結合するナイーブ合成ＦａｂライブラリーからＦａｂ断片を選択し、その後、改変された直接融合二重ベクタークローンに、共通のＬＣをコードする哺乳動物発現ベクターを同時導入することにより、哺乳動物の２９３細胞及びＣＨＯ細胞において選択されたクローンから完全長天然ｈＩｇＧ１を発現するために使用された。天然型ＩｇＧ１は、いくつかのアッセイを行うためのこれらの発現実験から、例えば、ＥＬＩＳＡ及びビアコアによる結合活性を示す８つの固有の抗ＶＥＧＦクローンのプールから得られ、我々は、元のファージベクタークローンからＨＣ配列をサブクローニングする必要なく、ＩｇＧ形態の候補の溶液内の挙動、非特異的結合、及び生物学的活性を評価する単一候補ｂｏまで順序をトリアージで決定することができた。
【0170】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許及び本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。
SEQUENCE LISTING
<110> GENENTECH, INC. ET AL.
<120> EXPRESSION AND SECRETION SYSTEM
<130> P4825R1-WO
<140>
<141>
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<151> 2012-07-05
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 418
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn Tyr Glu Gly
35 40 45
Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly Asp Glu Thr
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser Gln Pro Leu
130 135 140
Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg Gln Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly Thr Asp Pro Val Lys
165 170 175
Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met Tyr Asp Ala
180 185 190
Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser Gly Phe Asn
195 200 205
Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro
210 215 220
Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp
260 265 270
Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala
275 280 285
Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val
290 295 300
Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser
305 310 315 320
Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn
325 330 335
Ser Gln Met Ala Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn
340 345 350
Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro
355 360 365
Phe Val Phe Ser Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp
370 375 380
Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala
385 390 395 400
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Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly
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50 55 60
Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln
65 70 75 80
Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr
85 90 95
Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Gly
100 105 110
Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu
115 120 125
Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr
130 135 140
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preference with respect to those in the annotation
for the variant position"
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absent"
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preference with respect to those in the annotation
for the variation position"
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1 5 10 15
Asn Tyr Ala Leu Arg Lys Glu Val Glu Asp Leu Gln Lys Gln Ala Glu
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atgatgaaat ttactgttgt cgctgctgct cttctacttc ttggagcggt ccgcgca 57
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Met Thr Met Lys Phe Thr Val Val Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ala Val Arg Ala
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Met Lys Phe Thr Val Val Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly Ala Val
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Arg Ala
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<212> DNA
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<222> (45)..(45)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (48)..(48)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (51)..(51)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (54)..(54)
<223> a, c, t or g
<400> 22
atgaanttna cngtngtngc ngcngcnctn ctnctnctng gngcngtncg ngcn 54
<210> 23
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 23
gtgaattatc accgtcaccg acctaggcca tttgggaatt agagcca 47
<210> 24
<211> 1275
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 24
gtgaaaaaat tattattcgc agttccttta gttgttcctt tctattctca ctcagctgag 60
actgttgaaa gttgtttagc aaaaccccat acagaaaatt catttactaa cgtctggaaa 120
gacgacaaaa ctttagatcg ttacgctaac tatgagggtt gtctgtggaa tgctacaggc 180
gttgtagttt gtactggtga cgaaactcag tgttacggta catgggttcc tattgggctt 240
gctatccctg aaaatgaggg tggtggctct gagggtggcg gttctgaggg tggcggttct 300
gagggtggcg gtactaaacc tcctgagtac ggtgatacac ctattccggg ctatacttat 360
atcaaccctc tcgacggcac ttatccgcct ggtactgagc aaaaccccgc taatcctaat 420
ccttctcttg aggagtctca gcctcttaat actttcatgt ttcagaataa taggttccga 480
aataggcagg gggcattaac tgtttatacg ggcactgtta ctcaaggcac tgaccccgtt 540
aaaacttatt accagtacac tcctgtatca tcaaaagcca tgtatgacgc ttactggaac 600
ggtaaattca gagactgcgc tttccattct ggctttaatg aggatccatt cgtttgtgaa 660
tatcaaggcc aatcgtctga cctgcctcaa cctcctgtca atgctggcgg cggctctggt 720
ggtggttctg gtggcggctc tgagggtggt ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc 780
ggctctgagg gaggcggttc cggtggtggc tctggttccg gtgattttga ttatgaaaag 840
atggcaaacg ctaataaggg ggctatgacc gaaaatgccg atgaaaacgc gctacagtct 900
gacgctaaag gcaaacttga ttctgtcgct actgattacg gtgctgctat cgatggtttc 960
attggtgacg tttccggcct tgctaatggt aatggtgcta ctggtgattt tgctggctct 1020
aattcccaaa tggcctaggt cggtgacggt gataattcac ctttaatgaa taatttccgt 1080
caatatttac cttccctccc tcaatcggtt gaatgtcgcc cttttgtctt tagcgctggt 1140
aaaccatatg aattttctat tgattgtgac aaaataaact tattccgtgg tgtctttgcg 1200
tttcttttat atgttgccac ctttatgtat gtattttcta cgtttgctaa catactgcgt 1260
aataaggagt cttaa 1275
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 25
Thr Ser Tyr Ala
1
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 26
Gly Gly Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 27
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 27
Ala Arg Pro Gly Pro Gly Gly Gly Phe Asp Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 28
Thr Asp Tyr Ala
1
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 29
Gly Phe Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 30
Ala Arg Glu Val His Phe Trp Tyr Tyr Ser Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 31
Ser Ser Tyr Gly
1
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 32
Gly Trp Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 33
Ala Arg Phe Gly Tyr Asp Val Leu Arg Tyr Trp Asp Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Met Ala Tyr
<210> 34
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 34
Ser Asn Thr Ser
1
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 35
Gly Trp Ile Tyr Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 36
Ala Arg Phe Gly Tyr Gln His Glu Val Gln Phe Ser Asp His Tyr Tyr
1 5 10 15
Ala Met Asp Tyr
20
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 37
Ser Gly Thr Tyr
1
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 38
Gly Phe Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Tyr Thr Asp
1 5 10
<210> 39
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 39
Ala Arg Leu Gln Phe Asn Thr Met Trp Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 40
Ser Ser Tyr Ala
1
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 41
Gly Ser Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn
1 5 10
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 42
Ala Arg Ile Gly Phe Gly Ser Leu Cys Phe Asp Cys Asn Leu Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Met Asp Tyr
20
<210> 43
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 43
Ser Ser Thr Ala
1
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 44
Ala Gly Ile Thr Pro Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 45
Ala Arg Ile Gly Ser Gly Ser His Trp Ser Ala Phe Asp His Tyr Tyr
1 5 10 15
Ala Met Asp Tyr
20
<210> 46
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 46
Ser Ser Tyr Ala
1
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 47
Gly Ser Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn
1 5 10
<210> 48
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 48
Ala Arg Thr Gly Phe Gly Gly Ile Val Val Asp Trp Ser Leu Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Met Asp Tyr
20
SEQUENCE LISTING
<110> GENENTECH, INC. ET AL.
<120> EXPRESSION AND SECRETION SYSTEM
<130> P4825R1-WO
<140>
<141>
<150> 61/819,063
<151> 2013-05-03
<150> 61/852,483
<151> 2013-03-15
<150> 61/668,397
<151> 2012-07-05
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 418
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 1
Ala Glu Asp Ile Glu Phe Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Glu Thr
1 5 10 15
Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser Phe Thr Asn
20 25 30
Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn Tyr Glu Gly
35 40 45
Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly Asp Glu Thr
50 55 60
Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala Ile Pro Glu Asn
65 70 75 80
Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro Ile Pro Gly
100 105 110
Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro Gly Thr Glu
115 120 125
Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser Gln Pro Leu
130 135 140
Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg Gln Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly Thr Asp Pro Val Lys
165 170 175
Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met Tyr Asp Ala
180 185 190
Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser Gly Phe Asn
195 200 205
Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro
210 215 220
Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp
260 265 270
Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala
275 280 285
Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val
290 295 300
Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser
305 310 315 320
Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn
325 330 335
Ser Gln Met Ala Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn
340 345 350
Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro
355 360 365
Phe Val Phe Ser Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp
370 375 380
Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala
385 390 395 400
Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys
405 410 415
Glu Ser
<210> 2
<211> 158
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 2
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala
1 5 10 15
Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu
20 25 30
Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly
50 55 60
Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln
65 70 75 80
Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr
85 90 95
Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Gly
100 105 110
Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu
115 120 125
Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr
130 135 140
Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser
145 150 155
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 3
Met Met Lys Phe Thr Val Val Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Val Arg Ala
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 4
atgatgaaat ttaccgtggt ggcggcggcg ctgctgctgc tgggcgcggt ccgcgcg 57
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(9)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (12)..(12)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(15)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(18)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(21)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (27)..(27)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (30)..(30)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (33)..(33)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (36)..(36)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (39)..(39)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (42)..(42)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (45)..(45)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (48)..(48)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (51)..(51)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (54)..(54)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (57)..(57)
<223> a, c, t or g
<400> 5
atgatgaant tnacngtngt ngcngcngcn ctnctnctnc tnggngcngt ncgngcn 57
<210> 6
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 6
Ala Ser Ile Ala Arg Leu Arg Glu Arg Val Lys Thr Leu Arg Ala Arg
1 5 10 15
Asn Tyr Glu Leu Arg Ser Arg Ala Asn Met Leu Arg Glu Arg Val Ala
20 25 30
Gln Leu Gly Gly Cys
35
<210> 7
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 7
Ala Ser Leu Asp Glu Leu Glu Ala Glu Ile Glu Gln Leu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Ala Leu Glu Lys Glu Ile Glu Asp Leu Glu Lys Glu Leu Glu
20 25 30
Lys Leu Gly Gly Cys
35
<210> 8
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 8
Glu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Glu Lys Glu Asn Arg Glu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Ile Ile Ala Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser Glu Leu Arg His Gln Leu
20 25 30
Gln Ser Val Gly Gly Cys
35
<210> 9
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 9
Thr Ser Arg Leu Glu Gly Leu Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met
1 5 10 15
Lys Ile Thr Glu Leu Asp Lys Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu
20 25 30
Gln Asp Val Gly Gly Cys
35
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(2)
<223> /replace=" "
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> /note="This region may encompass 'Met' or 'Met-Thr' or be
absent"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> /note="Variant residues given in the sequence have no
preference with respect to those in the annotation
for the variant position"
<400> 10
Met Thr Met Lys Phe Thr Val Val Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ala Val Arg Ala
20
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<220>
<221> variation
<222> (1)..(6)
<223> /replace=" "
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> /note="This region may encompass 'ATG' or 'ATGACC' or be
absent"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> /note="Variant nucleotides given in the sequence have no
preference with respect to those in the annotation
for the variation position"
<220>
<221> modified_base
<222> (12)..(12)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(15)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(18)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(21)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (27)..(27)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (30)..(30)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (33)..(33)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (36)..(36)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (39)..(39)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (42)..(42)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (45)..(45)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (48)..(48)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (51)..(51)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (54)..(54)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (57)..(57)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (60)..(60)
<223> a, c, t or g
<400> 11
atgaccatga anttnacngt ngtngcngcn gcnctnctnc tnctnggngc ngtncgngcn 60
<210> 12
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 12
Ala Ser Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln
1 5 10 15
Asn Tyr Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala
20 25 30
Gln Leu Gly Gly Cys
35
<210> 13
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 13
Ala Ser Ile Asp Glu Leu Gln Ala Glu Val Glu Gln Leu Glu Glu Arg
1 5 10 15
Asn Tyr Ala Leu Arg Lys Glu Val Glu Asp Leu Gln Lys Gln Ala Glu
20 25 30
Lys Leu Gly Gly Cys
35
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 14
Ala Gly Ser Cys
1
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 15
Cys Pro Pro Cys Pro Gly
1 5
<210> 16
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 16
atgatgaaat ttaccgttgt tgctgctgct ctgctacttc ttggagcggt ccgcgca 57
<210> 17
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 17
atgatgaaat ttactgttgt tgcggctgct cttctccttc ttggagcggt ccgcgca 57
<210> 18
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 18
atgatgaaat ttactgttgt cgctgctgct cttctacttc ttggagcggt ccgcgca 57
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 19
Met Thr Met Lys Phe Thr Val Val Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ala Val Arg Ala
20
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 20
Met Lys Phe Thr Val Val Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly Ala Val
1 5 10 15
Arg Ala
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<220>
<221> modified_base
<222> (12)..(12)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(15)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(18)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(21)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (27)..(27)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (30)..(30)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (33)..(33)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (36)..(36)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (39)..(39)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (42)..(42)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (45)..(45)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (48)..(48)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (51)..(51)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (54)..(54)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (57)..(57)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (60)..(60)
<223> a, c, t or g
<400> 21
atgaccatga anttnacngt ngtngcngcn gcnctnctnc tnctnggngc ngtncgngcn 60
<210> 22
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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oligonucleotide"
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<221> modified_base
<222> (6)..(6)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(9)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
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<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(15)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(18)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(21)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (27)..(27)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (30)..(30)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (33)..(33)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (36)..(36)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (39)..(39)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (42)..(42)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (45)..(45)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (48)..(48)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (51)..(51)
<223> a, c, t or g
<220>
<221> modified_base
<222> (54)..(54)
<223> a, c, t or g
<400> 22
atgaanttna cngtngtngc ngcngcnctn ctnctnctng gngcngtncg ngcn 54
<210> 23
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 23
gtgaattatc accgtcaccg acctaggcca tttgggaatt agagcca 47
<210> 24
<211> 1275
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 24
gtgaaaaaat tattattcgc agttccttta gttgttcctt tctattctca ctcagctgag 60
actgttgaaa gttgtttagc aaaaccccat acagaaaatt catttactaa cgtctggaaa 120
gacgacaaaa ctttagatcg ttacgctaac tatgagggtt gtctgtggaa tgctacaggc 180
gttgtagttt gtactggtga cgaaactcag tgttacggta catgggttcc tattgggctt 240
gctatccctg aaaatgaggg tggtggctct gagggtggcg gttctgaggg tggcggttct 300
gagggtggcg gtactaaacc tcctgagtac ggtgatacac ctattccggg ctatacttat 360
atcaaccctc tcgacggcac ttatccgcct ggtactgagc aaaaccccgc taatcctaat 420
ccttctcttg aggagtctca gcctcttaat actttcatgt ttcagaataa taggttccga 480
aataggcagg gggcattaac tgtttatacg ggcactgtta ctcaaggcac tgaccccgtt 540
aaaacttatt accagtacac tcctgtatca tcaaaagcca tgtatgacgc ttactggaac 600
ggtaaattca gagactgcgc tttccattct ggctttaatg aggatccatt cgtttgtgaa 660
tatcaaggcc aatcgtctga cctgcctcaa cctcctgtca atgctggcgg cggctctggt 720
ggtggttctg gtggcggctc tgagggtggt ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc 780
ggctctgagg gaggcggttc cggtggtggc tctggttccg gtgattttga ttatgaaaag 840
atggcaaacg ctaataaggg ggctatgacc gaaaatgccg atgaaaacgc gctacagtct 900
gacgctaaag gcaaacttga ttctgtcgct actgattacg gtgctgctat cgatggtttc 960
attggtgacg tttccggcct tgctaatggt aatggtgcta ctggtgattt tgctggctct 1020
aattcccaaa tggcctaggt cggtgacggt gataattcac ctttaatgaa taatttccgt 1080
caatatttac cttccctccc tcaatcggtt gaatgtcgcc cttttgtctt tagcgctggt 1140
aaaccatatg aattttctat tgattgtgac aaaataaact tattccgtgg tgtctttgcg 1200
tttcttttat atgttgccac ctttatgtat gtattttcta cgtttgctaa catactgcgt 1260
aataaggagt cttaa 1275
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
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Thr Ser Tyr Ala
1
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 26
Gly Gly Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 27
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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peptide"
<400> 27
Ala Arg Pro Gly Pro Gly Gly Gly Phe Asp Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met
1 5 10 15
Asp Tyr
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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peptide"
<400> 28
Thr Asp Tyr Ala
1
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 29
Gly Phe Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
<400> 30
Ala Arg Glu Val His Phe Trp Tyr Tyr Ser Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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peptide"
<400> 31
Ser Ser Tyr Gly
1
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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peptide"
<400> 32
Gly Trp Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 33
Ala Arg Phe Gly Tyr Asp Val Leu Arg Tyr Trp Asp Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Met Ala Tyr
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
<400> 34
Ser Asn Thr Ser
1
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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peptide"
<400> 35
Gly Trp Ile Tyr Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Asn
1 5 10
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<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 36
Ala Arg Phe Gly Tyr Gln His Glu Val Gln Phe Ser Asp His Tyr Tyr
1 5 10 15
Ala Met Asp Tyr
20
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 37
Ser Gly Thr Tyr
1
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 38
Gly Phe Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Tyr Thr Asp
1 5 10
<210> 39
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 39
Ala Arg Leu Gln Phe Asn Thr Met Trp Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
<400> 40
Ser Ser Tyr Ala
1
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 41
Gly Ser Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn
1 5 10
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 42
Ala Arg Ile Gly Phe Gly Ser Leu Cys Phe Asp Cys Asn Leu Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Met Asp Tyr
20
<210> 43
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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peptide"
<400> 43
Ser Ser Thr Ala
1
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 44
Ala Gly Ile Thr Pro Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 45
Ala Arg Ile Gly Ser Gly Ser His Trp Ser Ala Phe Asp His Tyr Tyr
1 5 10 15
Ala Met Asp Tyr
20
<210> 46
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 46
Ser Ser Tyr Ala
1
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 47
Gly Ser Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn
1 5 10
<210> 48
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 48
Ala Arg Thr Gly Phe Gly Gly Ile Val Val Asp Trp Ser Leu Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Met Asp Tyr
20
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-12-23
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載された一発明。
【外国語明細書】