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特開2023-3172細胞培養装置検証用模擬細胞、細胞培養装置検証用模擬細胞分散液及び細胞培養装置検証方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023003172
(43)【公開日】2023-01-11
(54)【発明の名称】細胞培養装置検証用模擬細胞、細胞培養装置検証用模擬細胞分散液及び細胞培養装置検証方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/34 20060101AFI20221228BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221228BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20221228BHJP
【ＦＩ】
C12M1/34 A
C12Q1/02
C12N5/071
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021104185
(22)【出願日】2021-06-23
(71)【出願人】
【識別番号】000002299
【氏名又は名称】清水建設株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100149548
【弁理士】
【氏名又は名称】松沼 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100161506
【弁理士】
【氏名又は名称】川渕 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(72)【発明者】
【氏名】阿部 公揮
(72)【発明者】
【氏名】栗原 隆
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB11
4B029BB20
4B029CC01
4B029FA15
4B063QA05
4B063QQ08
4B063QQ70
4B063QR45
4B063QR66
4B063QR77
4B063QR83
4B063QR85
4B063QS39
4B063QX01
4B065AA99X
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】細胞に近似した比重、表面特性及び強度を有する細胞培養装置検証用模擬細胞及び細胞培養装置検証方法を提供する。
【解決手段】脂質二重膜１と内水相２とを有するリポソーム１００からなり、脂質二重膜１は少なくとも１種の第１の色素３を含み、内水相２は第１の色素３とは異なる少なくとも１種の第２の色素４を含む、細胞培養装置検証用模擬細胞。
【選択図】図１
【解決手段】脂質二重膜１と内水相２とを有するリポソーム１００からなり、脂質二重膜１は少なくとも１種の第１の色素３を含み、内水相２は第１の色素３とは異なる少なくとも１種の第２の色素４を含む、細胞培養装置検証用模擬細胞。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
脂質二重膜と内水相とを有するリポソームからなり、
前記脂質二重膜は少なくとも１種の第１の色素を含み、
前記内水相は前記第１の色素とは異なる少なくとも１種の第２の色素を含む、
細胞培養装置検証用模擬細胞。
前記脂質二重膜は少なくとも１種の第１の色素を含み、
前記内水相は前記第１の色素とは異なる少なくとも１種の第２の色素を含む、
細胞培養装置検証用模擬細胞。
【請求項2】
前記リポソームの粒子径が１～１００μｍである、請求項１に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
【請求項3】
前記第１の色素及び前記第２の色素がいずれも蛍光色素である、請求項１又は２に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
【請求項4】
前記第１の色素及び前記第２の色素の一方の蛍光波長が５７０～８２０ｎｍであり、他方の蛍光波長が４２０～５４０ｎｍである、請求項３に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
【請求項5】
前記第１の色素及び前記第２の色素の一方の励起波長が５５０～８００ｎｍであり、他方の励起波長が４００～５２０ｎｍである、請求項３に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
【請求項6】
前記第１の色素がローダミン又はローダミン誘導体であり、前記第２の色素がＦＩＴＣ又はＦＩＴＣ誘導体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
【請求項7】
前記脂質二重膜がリン脂質二重膜である、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
【請求項8】
前記リポソームが多層小胞型、小型単層小胞型、大型単層小胞型又は渦巻型である、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞と分散媒とを含む細胞培養装置検証用模擬細胞分散液。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞を培養対象の細胞の代わりに用いる細胞培養装置検証方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞培養装置検証用模擬細胞、細胞培養装置検証用模擬細胞分散液及び細胞培養装置検証方法に関する。
【背景技術】
【0002】
心臓冠動脈や末梢動脈の閉塞疾患に対するバイパス手術において、患者の内皮細胞により被覆された血栓が形成されにくい合成繊維製の人工血管を使用する外科治療が注目されている。そのような人工血管を多くの人が利用できるようにするために、血管を構成する種々の細胞を効率的に培養することができるような細胞培養装置が用いられる（特許文献１）。
【0003】
細胞培養装置の開発の際に、培養細胞の代わりに細胞サイズの合成樹脂製ビーズからなる模擬細胞を使用する場合がある。
細胞培養装置の開発の際に培養細胞を用い場合、細胞培養に必要な施設、設備を準備し、さらに細胞を培養する時間と細胞培養のための技術を有する者が必要であり、コストと時間がかかるのに対して、模擬細胞を用いる場合、細胞を培養する必要が無いことから、これらのコスト及び時間を大幅に節約することができる。
細胞培養装置の開発の際に培養細胞を用い場合、細胞培養に必要な施設、設備を準備し、さらに細胞を培養する時間と細胞培養のための技術を有する者が必要であり、コストと時間がかかるのに対して、模擬細胞を用いる場合、細胞を培養する必要が無いことから、これらのコスト及び時間を大幅に節約することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特許第４８２０９７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかし、従来使用されているポリスチレン等の合成樹脂製のビーズからなる模擬細胞は、培養対象である細胞と比重、表面特性及び強度が大きく異なっていた。
【0006】
本発明は、細胞に近似した比重、表面特性及び強度を有する細胞培養装置検証用模擬細胞、細胞培養装置検証用模擬細胞分散液及び細胞培養装置検証方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
［１］ 脂質二重膜と内水相とを有するリポソームからなり、
前記脂質二重膜は少なくとも１種の第１の色素を含み、
前記内水相は前記第１の色素とは異なる少なくとも１種の第２の色素を含む、
細胞培養装置検証用模擬細胞。
［２］ 前記リポソームの粒子径が１～１００μｍである、［１］に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［３］ 前記第１の色素及び前記第２の色素がいずれも蛍光色素である、［１］又は［２］に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［４］ 前記第１の色素及び前記第２の色素の一方の蛍光波長が５７０～８２０ｎｍであり、他方の蛍光波長が４２０～５４０ｎｍである、［３］に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［５］ 前記第１の色素及び前記第２の色素の一方の励起波長が５５０～８００ｎｍであり、他方の励起波長が４００～５２０ｎｍである、［３］に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［６］ 前記第１の色素がローダミン又はローダミン誘導体であり、前記第２の色素がＦＩＴＣ又はＦＩＴＣ誘導体である、［１］～［５］のいずれかに記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［７］ 前記脂質二重膜がリン脂質二重膜である、［１］～［６］のいずれかに記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［８］ 前記リポソームが多層小胞型、小型単層小胞型、大型単層小胞型又は渦巻型である、［１］～［７］のいずれかに記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［９］ ［１］～［８］のいずれかに記載の細胞培養装置検証用模擬細胞と分散媒とを含む細胞培養装置検証用模擬細胞分散液。
［１０］ ［１］～［８］のいずれかに記載の細胞培養装置検証用模擬細胞を培養対象の細胞の代わりに用いる細胞培養装置検証方法。
前記脂質二重膜は少なくとも１種の第１の色素を含み、
前記内水相は前記第１の色素とは異なる少なくとも１種の第２の色素を含む、
細胞培養装置検証用模擬細胞。
［２］ 前記リポソームの粒子径が１～１００μｍである、［１］に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［３］ 前記第１の色素及び前記第２の色素がいずれも蛍光色素である、［１］又は［２］に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［４］ 前記第１の色素及び前記第２の色素の一方の蛍光波長が５７０～８２０ｎｍであり、他方の蛍光波長が４２０～５４０ｎｍである、［３］に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［５］ 前記第１の色素及び前記第２の色素の一方の励起波長が５５０～８００ｎｍであり、他方の励起波長が４００～５２０ｎｍである、［３］に記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［６］ 前記第１の色素がローダミン又はローダミン誘導体であり、前記第２の色素がＦＩＴＣ又はＦＩＴＣ誘導体である、［１］～［５］のいずれかに記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［７］ 前記脂質二重膜がリン脂質二重膜である、［１］～［６］のいずれかに記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［８］ 前記リポソームが多層小胞型、小型単層小胞型、大型単層小胞型又は渦巻型である、［１］～［７］のいずれかに記載の細胞培養装置検証用模擬細胞。
［９］ ［１］～［８］のいずれかに記載の細胞培養装置検証用模擬細胞と分散媒とを含む細胞培養装置検証用模擬細胞分散液。
［１０］ ［１］～［８］のいずれかに記載の細胞培養装置検証用模擬細胞を培養対象の細胞の代わりに用いる細胞培養装置検証方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、細胞に近似した比重、表面特性及び強度を有する細胞培養装置検証用模擬細胞、細胞培養装置検証用模擬細胞分散液及び細胞培養装置検証方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下では、本発明を実施するための形態を説明するが、本発明は後述する実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない限り種々の変形が可能である。
【0011】
［細胞培養装置評価用模擬細胞］
以下では図面を適宜参照しながら、本実施形態の細胞培養装置検証用模擬細胞を詳細に説明する。
図１に示す本実施形態に係る細胞培養装置検証用模擬細胞は、脂質二重膜１と内水相２とを有するリポソーム１００からなる。
脂質二重膜１を構成する脂質は、リポソームの脂質膜を構成しうる脂質であって、脂質二重膜を構成しうる脂質であれば特に限定されない。脂質二重膜を構成し得る脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール及びリン脂質が挙げられる。
以下では図面を適宜参照しながら、本実施形態の細胞培養装置検証用模擬細胞を詳細に説明する。
図１に示す本実施形態に係る細胞培養装置検証用模擬細胞は、脂質二重膜１と内水相２とを有するリポソーム１００からなる。
脂質二重膜１を構成する脂質は、リポソームの脂質膜を構成しうる脂質であって、脂質二重膜を構成しうる脂質であれば特に限定されない。脂質二重膜を構成し得る脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール及びリン脂質が挙げられる。
【0012】
グリセロ糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、及びグリコシルジグリセリド等が挙げられる。スフィンゴ糖脂質としては、例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド及びガングリオシドが挙げられる。
【0013】
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン及び水素添加リン脂質等の天然又は合成のリン脂質が挙げられる。
【0014】
ホスファチジルコリンとしては、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられる。
ホスファチジルエタノールアミンとしては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
ホスファチジルセリンとしては、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン及びジステアロイルホスファチジルセリン等が挙げられる。
ホスファチジルグリセロールとしては、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、及びジステアロイルホスファチジルグリセロール等が挙げられる。
ホスファチジルイノシトールとしては、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール及びジステアロイルホスファチジルイノシトール等が挙げられる。
ホスファチジルエタノールアミンとしては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
ホスファチジルセリンとしては、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン及びジステアロイルホスファチジルセリン等が挙げられる。
ホスファチジルグリセロールとしては、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、及びジステアロイルホスファチジルグリセロール等が挙げられる。
ホスファチジルイノシトールとしては、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール及びジステアロイルホスファチジルイノシトール等が挙げられる。
【0015】
脂質二重膜１を構成する脂質としては、リン脂質が好ましい。
【0016】
脂質二重膜１は、脂質の他に、膜安定化剤、酸化防止剤等を必要に応じて含むことができる。酸化防止剤としては、アスコルビン酸、尿酸又はトコフェロール同族体（例えば、ビタミンＥ）等が挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ、δの４種の異性体が存在するが、本実施形態ではいずれも使用できる。
【0017】
脂質二重膜１は外膜１ａと内膜１ｂとで構成されるが、外膜１ａを構成する脂質と、内膜１ｂを構成する脂質とは、同じ種類であってもよいし、異なる種類であってもよい。通常、リポソーム１００の製造の容易さから、脂質二重膜１において、外膜１ａと内膜１ｂとは同じ種類の脂質で構成される。
【0018】
内水相の水系成分（溶媒）は、特に限定されないが、例えば、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）水溶液、炭酸－重炭酸緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液、グルコース、ショ糖等の糖類水溶液が挙げられる。
内水相のｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ５．５～８．５が好ましく、ｐＨ６．０～８．０がより好ましく、ｐＨ６．０～７．５がさらに好ましい。内水相のｐＨが上記範囲内であると、本実施形態の模擬細胞が培養細胞により近似する。
内水相の浸透圧は、特に限定されないが、２５０～３２０ｍＯｓｍ／Ｌが好ましく、２６０～３１０ｍＯｓｍ／Ｌがより好ましく、２７０～３００ｍＯｓｍ／Ｌがさらに好ましい。内水相の浸透圧が上記範囲内であると、本実施形態の模擬細胞が培養細胞により近似する。
内水相のｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ５．５～８．５が好ましく、ｐＨ６．０～８．０がより好ましく、ｐＨ６．０～７．５がさらに好ましい。内水相のｐＨが上記範囲内であると、本実施形態の模擬細胞が培養細胞により近似する。
内水相の浸透圧は、特に限定されないが、２５０～３２０ｍＯｓｍ／Ｌが好ましく、２６０～３１０ｍＯｓｍ／Ｌがより好ましく、２７０～３００ｍＯｓｍ／Ｌがさらに好ましい。内水相の浸透圧が上記範囲内であると、本実施形態の模擬細胞が培養細胞により近似する。
【0019】
脂質二重膜１は少なくとも１種の第１の色素を含み、内水相２は第１の色素とは異なる少なくとも１種の第２の色素を含む。
第１の色素は、脂質二重膜に含みうるものであれば特に限定されないが、脂溶性の色素が好ましい。脂溶性の色素は、色素自体が脂溶性であってもよいし、脂溶性化合物を色素で標識したものであってもよい。
第２の色素は、内水相に含み得るものであれば特に限定されないが、水溶性の色素が好ましい。水溶性の色素は、色素自体が水溶性であってもよいし、水溶性化合物を色素で標識したものであってもよい。
第１の色素は、脂質二重膜に含みうるものであれば特に限定されないが、脂溶性の色素が好ましい。脂溶性の色素は、色素自体が脂溶性であってもよいし、脂溶性化合物を色素で標識したものであってもよい。
第２の色素は、内水相に含み得るものであれば特に限定されないが、水溶性の色素が好ましい。水溶性の色素は、色素自体が水溶性であってもよいし、水溶性化合物を色素で標識したものであってもよい。
【0020】
第１の色素及び第２の色素としては、蛍光色素又はその誘導体が好ましく、例えば、以下の者が挙げられる。
ＤｙＬｉｇｈｔ ４０５（励起４００ｎｍ、蛍光４２０ｎｍ）、ＤＹ－４０５（励起４００ｎｍ、蛍光４２０ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５（励起４０１ｎｍ、蛍光４２１ｎｍ）、ＡＭＣＡ（励起３５３ｎｍ、蛍光４４０ｎｍ）、ＡＭＣＡ－Ｘ（励起３４７ｎｍ、蛍光４４７ｎｍ）、Ｐａｃｉｆｉ ｃ Ｂｌｕｅ（励起４０５ｎｍ、蛍光４５５ｎｍ）、ＤＹ－４１５（励起４１８ｎｍ、蛍光４６７ｎｍ）、Ｒｏｙａｌ Ｂｌｕｅ（励起４２６ｎｍ、蛍光４８０ｎｍ）及びＡＴＴＯ ４２５（励起４３６ｎｍ、蛍光４８４ｎｍ）；
ＤｙＬｉｇｈｔ ４０５（励起４００ｎｍ、蛍光４２０ｎｍ）、ＤＹ－４０５（励起４００ｎｍ、蛍光４２０ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５（励起４０１ｎｍ、蛍光４２１ｎｍ）、ＡＭＣＡ（励起３５３ｎｍ、蛍光４４０ｎｍ）、ＡＭＣＡ－Ｘ（励起３４７ｎｍ、蛍光４４７ｎｍ）、Ｐａｃｉｆｉ ｃ Ｂｌｕｅ（励起４０５ｎｍ、蛍光４５５ｎｍ）、ＤＹ－４１５（励起４１８ｎｍ、蛍光４６７ｎｍ）、Ｒｏｙａｌ Ｂｌｕｅ（励起４２６ｎｍ、蛍光４８０ｎｍ）及びＡＴＴＯ ４２５（励起４３６ｎｍ、蛍光４８４ｎｍ）；
【0021】
Ｃｙ２（励起４８９ｎｍ、蛍光５０５ｎｍ）、ＡＴＴＯ ４６５（励起４５３ｎｍ、蛍光５０８ｎｍ）、ＤＹ－４７５ＸＬ（励起４９２ｎｍ、蛍光５０９ｎｍ）、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ ４９３（励起４９３ｎｍ、蛍光５１４ｎｍ）、ＤＹ－４９０（励起４９０ｎｍ、蛍光５１６ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８（励起４９３ｎｍ、蛍光５１８ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（励起４９５ｎｍ、蛍光５１９ｎｍ）、５－ＦＩＴＣ（励起４９４ｎｍ、蛍光５１９ｎｍ）、ＦＡＭ（５’ＦＡＭ）（励起４９５ｎｍ、蛍光５２０ｎｍ）、ＤＹ－４９５－Ｘ５（励起４９５ｎｍ、蛍光５２０ｎｍ）、ＤＹ－４９５（励起４９３ｎｍ、蛍光５２１ｎｍ）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（励起４９４ｎｍ、蛍光５２１ｎｍ）、ＦＩＴＣ（励起４９８ｎｍ、蛍光５２２ｎｍ）、ＡＴＴＯ ４８８（励起５０１ｎｍ、蛍光５２３ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｏｕｒ ４８８（励起４９９ｎｍ、蛍光５２３ｎｍ）、ＭＦＰ４８８（励起５０１ｎｍ、蛍光５２３ｎｍ）、ＡＴＴＯ ４９５（励起４９５ｎｍ、蛍光５２７ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ５００（励起５０５ｎｍ、蛍光５３０ｎｍ）及びＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ（励起４９７ｎｍ、蛍光５３８ｎｍ）；
【0022】
ＡＴＴＯ ５２０（励起５２５ｎｍ、蛍光５４５ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５３２（励起５３２ｎｍ、蛍光５５３ｎｍ）、ＤＹ－５００ＸＬ（励起５０５ｎｍ、蛍光５５５ｎｍ）、ＤＹ－４８５ＸＬ（励起４８５ｎｍ、蛍光５６０ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（励起５５５ｎｍ、蛍光５６５ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｐｌｕｓ ５５５（励起５５２ｎｍ、蛍光５６７ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４９（励起５５０ｎｍ、蛍光５６８ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５（励起５５３ｎｍ、蛍光５６８ｎｍ）、Ｃｙ３（励起５５０ｎｍ、蛍光５７０ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４７（励起５５７ｎｍ、蛍光５７０ｎｍ）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（励起５５０ｎｍ、蛍光５７０ｎｍ）、ＴＲＩＴＣ（励起５５０ｎｍ、蛍光５７０ｎｍ）、ＤＹ－５４８（励起５５８ｎｍ、蛍光５７２ｎｍ）、ＤＹ－５５４（励起５５１ｎｍ、蛍光５７２ｎｍ）、ＤＹ－５５５（励起５４７ｎｍ、蛍光５７２ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（励起５５６ｎｍ、蛍光５７３ｎｍ）、ＤＹ－５５６（励起５４８ｎｍ、蛍光５７３）、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ ５５７（励起５５７ｎｍ、蛍光５７４ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ５５０（励起５５５ｎｍ、蛍光５７４ｎｍ）、５－ＴＡＭＲＡ（励起５４７ｎｍ、蛍光５７４ｎｍ）、ＤＹ－５０５－Ｘ５（励起５０５ｎｍ、蛍光５７４ｎｍ）、ＤＹ－５４７（励起５５７ｎｍ、蛍光５７４ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６（励起５６２ｎｍ、蛍光５７５ｎｍ）、ＤＹ－５４９（励起５６０ｎｍ、蛍光５７５ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５５０（励起５５４ｎｍ、蛍光５７６ｎｍ）、ＰＥ（励起４８８ｎｍ、蛍光５７８ｎｍ）、Ｂ－ＰＥ（励起５４５ｎｍ、蛍光５７８ｎｍ）、Ｒ－ＰＥ（励起５６６ｎｍ、蛍光５７８ｎｍ）、ＤＹ－５６０（励起５５９ｎｍ、蛍光５７８ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（励起５５５ｎｍ、蛍光５８０ｎｍ）、ＭＦＰ５５５（励起５６０ｎｍ、蛍光５８５ｎｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅ（励起５５９ｎｍ、蛍光５８８ｎｍ）及びＤＹ－５１０ＸＬ（励起５０９ｎｍ、蛍光５９０ｎｍ）；
【0023】
ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ＴＲ（励起５９１ｎｍ、蛍光６２２ｎｍ）、ＡＴＴＯ ５９０（励起５９４ｎｍ、蛍光６２４ｎｍ）、ＭＦＰ５９０（励起５９７ｎｍ、蛍光６２４ｎｍ）、ＤＹ－６１０（励起６１０ｎｍ、蛍光６３０ｎｍ）、ＤＹ－４８０ＸＬ（励起５００ｎｍ、蛍光６３０ｎｍ）、ＡＴＴＯ ６１０（励起６１５ｎｍ、蛍光６３４ｎｍ）、ＤＹ－６１５（励起６２１ｎｍ、蛍光６４１ｎｍ）、Ｃ－ＰＣ（Ｃ－Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）（励起６１６ｎｍ、蛍光６４７ｎｍ）、ＡＴＴＯ ６２０（励起６１９ｎｍ、蛍光６４３ｎｍ）、Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（励起６２０ｎｍ、蛍光６５０ｎｍ）、ＤＹ－４８１ＸＬ（励起５１５ｎｍ、蛍光６５０ｎｍ）、ＡＴＴＯ ６３３（励起６２９ｎｍ、蛍光６５７ｎｍ）、ＤＹ－６３０（励起６３６ｎｍ、蛍光６５７ｎｍ）、ＤＹ－６３２（励起６３７ｎｍ、蛍光６５７ｎｍ）、ＤＹ－６３３（励起６３７ｎｍ、蛍光６５７ｎｍ）、ＭＦＰ６３１（励起６３３ｎｍ、蛍光６５８ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３（励起６３８ｎｍ、蛍光６５８ｎｍ）、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ ６３７（励起６３７ｎｍ、蛍光６５８ｎｍ）、ＤＹ－６３１（励起６３７ｎｍ、蛍光６５８ｎｍ）、ＤＹ－６３４（励起６３５ｎｍ、蛍光６５８ｎｍ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）（励起６５０ｎｍ、蛍光６６０ｎｍ）、ＡＰＣ－ＸＬ（励起６５０ｎｍ、蛍光６６２ｎｍ）、ＤＹ－５２０ＸＬ（励起５２０ｎｍ、蛍光６６４ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（励起６５０ｎｍ、蛍光６６５ｎｍ）、Ｃｙ５（励起６４３ｎｍ、蛍光６６７ｎｍ）、ＤＹ－５２１ＸＬ（励起５２３ｎｍ、蛍光６６８ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５（励起６５０ｎｍ、蛍光６６９ｎｍ）、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｒｅｄ（励起４８８ｎｍ、蛍光６７０ｎｍ）、Ｔｒｉ－Ｃｏｌｏｒ（励起４８８ｎｍ、蛍光６７０ｎｍ）、ＤＹ－６３５（励起６４７ｎｍ、蛍光６７１ｎｍ）、ＤＹ－６３６（励起６４５ｎｍ、蛍光６７１ｎｍ）、ＤＹ－６４７（励起６５３ｎｍ、蛍光６７２ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４７（励起６５２ｎｍ、蛍光６７３ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７（励起６５３ｎｍ、蛍光６７３ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９（励起６４６ｎｍ、蛍光６７４ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｐｌｕｓ ６４７（励起６４９ｎｍ、蛍光６７４ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ６５０（励起６５５ｎｍ、蛍光６７４ｎｍ）、ＤＹ－６４８（励起６５３ｎｍ、蛍光６７４ｎｍ）、ＤＹ－６５０（励起６５３ｎｍ、蛍光６７４ｎｍ）、ＰｅｒＣＰ（励起４８８ｎｍ、蛍光６７５ｎｍ）、ＤＹ－６５２（励起６５４ｎｍ、蛍光６７５ｎｍ）、ＤＹ－６４９（励起６５５ｎｍ、蛍光６７６ｎｍ）、ＤＹ－６５１（励起６５６ｎｍ、蛍光６７８ｎｍ）、Ｏｙｓｔｅｒ ６５６（励起６６２ｎｍ、蛍光６７９ｎｍ）、ＡＴＴＯ ６５５（励起６６３ｎｍ、蛍光６８４ｎｍ）、Ｃｙ５．５（励起６７５ｎｍ、蛍光６９４ｎｍ）、ＤＹ－６７７（励起６７３ｎｍ、蛍光６９４ｎｍ）、ＤＹ－６７８（励起６７４ｎｍ、蛍光６９８ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６８０（励起６７８ｍ、蛍光６９９ｎｍ）、ＤＹ－６７５（励起６７４ｎｍ、蛍光６９９ｎｍ）、ＤＹ－６７６（励起６７４ｎｍ、蛍光６９９ｎｍ）、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ（励起６８９ｎｍ、蛍光７００ｎｍ）、ＤＹ－６８１（励起６９１ｎｍ、蛍光７０８ｎｍ）、ＤＹ－６８０（励起６９０ｎｍ、蛍光７０９ｎｍ）、ＤＹ－６８２（励起６９０ｎｍ、蛍光７０９ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６８０（励起６８２ｎｍ、蛍光７１５ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（励起７０２ｎｍ、蛍光７２３ｎｍ）、ＤＹ－７００（励起７０７ｎｍ、蛍光７３０ｎｍ）及びＤＹ－７０１（励起７０６ｎｍ、蛍光７３１ｎｍ）；
【0024】
ＤＹ－７３０（励起７３２ｎｍ、蛍光７５８ｎｍ）、ＤＹ－７３２（励起７３６ｎｍ、蛍光７５９ｎｍ）、ＤＹ－７３４（励起７３６ｎｍ、蛍光７５９ｎｍ）、ＤＹ－７３１（励起７３６ｎｍ、蛍光７６０ｎｍ）、ＤＹ－７５２（励起７４８ｎｍ、蛍光７７２ｎｍ）、ＤＹ－７５０（励起７４７ｎｍ、蛍光７７６ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０（励起７５２ｎｍ、蛍光７７８ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ７５０（励起７５４ｎｍ、蛍光７７８ｎｍ）、ＤＹ－７４９（励起７５２ｎｍ、蛍光７７８ｎｍ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｐｌｕｓ ７５０（励起７５１ｎｍ、蛍光７７９ｎｍ）、ＤＹ－７５１（励起７５１ｎｍ、蛍光７７９ｎｍ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ８００（励起７７０ｎｍ、蛍光７９４ｎｍ）、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（励起７７４ｎｍ、蛍光８００ｎｍ）、ＤＹ－７８０（励起７８２ｎｍ、蛍光８００ｎｍ）、ＤＹ－７８１（励起７８３ｎｍ、蛍光８００ｎｍ）、ＤＹ－７８２（励起７８４ｎｍ、蛍光８００ｎｍ）、ＤＹ－７７６（励起７７１ｎｍ、蛍光８０１ｎｍ）、ＤＹ－７７７（励起７７１ｎｍ、蛍光８０１ｎｍ）及びＩＲＤｙｅ８００（励起７７８ｎｍ、蛍光８０６ｎｍ）；
【0025】
並びに、これらの誘導体。
【0026】
第１の色素及び第２の色素は、いずれも蛍光色素であることが好ましい。
蛍光の波長が異なり、第１の色素と第２の色素とを区別しやすいことから、第１の色素及び第２の色素の一方の蛍光波長は５７０～８２０ｎｍが好ましく、他方の蛍光波長は４２０～５４０ｎｍが好ましい。
励起光の波長が異なり、第１の色素と第２の色素とを区別しやすいことから、第１の色素及び第２の色素の一方の励起波長は５５０～８００ｎｍが好ましく、他方の励起波長は４００～５２０ｎｍが好ましい。
第１の色素は、ローダミンを疎水化したローダミン誘導体が好ましく、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンをローダミンＢで標識したＲｈｏｄａｍｉｎｅ ＰＥ（ローダミンＢ－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）が特に好ましい。
第２の色素は、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）を親水化したＦＩＴＣ誘導体が好ましく、ヒト血清アルブミンをＦＩＴＣで標識したＦＩＴＣ－ＨＳＡ（ＦＩＴＣ－ヒト血清アルブミン）が特に好ましい。
蛍光の波長が異なり、第１の色素と第２の色素とを区別しやすいことから、第１の色素及び第２の色素の一方の蛍光波長は５７０～８２０ｎｍが好ましく、他方の蛍光波長は４２０～５４０ｎｍが好ましい。
励起光の波長が異なり、第１の色素と第２の色素とを区別しやすいことから、第１の色素及び第２の色素の一方の励起波長は５５０～８００ｎｍが好ましく、他方の励起波長は４００～５２０ｎｍが好ましい。
第１の色素は、ローダミンを疎水化したローダミン誘導体が好ましく、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンをローダミンＢで標識したＲｈｏｄａｍｉｎｅ ＰＥ（ローダミンＢ－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）が特に好ましい。
第２の色素は、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）を親水化したＦＩＴＣ誘導体が好ましく、ヒト血清アルブミンをＦＩＴＣで標識したＦＩＴＣ－ＨＳＡ（ＦＩＴＣ－ヒト血清アルブミン）が特に好ましい。
【0027】
リポソーム１００の粒子径は、特に限定されないが、１～１００μｍが好ましく、１０～１００μｍがより好ましく、５０～１００μｍがさらに好ましい。リポソーム１００の粒子径がこの範囲内であると、本実施形態の模擬細胞が培養細胞により近似する。
ここで、リポソームの粒子径は、レーザー回析／散乱式粒子径分布測定装置により測定した体積基準の粒子径分布から求めた５０％粒子径である。
ここで、リポソームの粒子径は、レーザー回析／散乱式粒子径分布測定装置により測定した体積基準の粒子径分布から求めた５０％粒子径である。
【0028】
リポソーム１００は大型単層小胞型であるが、本実施形態の模擬細胞におけるリポソームはこれに限定されず、リポソーム多層小胞型、小型単層小胞型、渦巻型のいずれであってもよい。
【0029】
本実施形態の模擬細胞は、分散媒に分散させて使用することが好ましい。この場合の分散媒は、細胞培養に用いる培養液の代わりとなるものである。分散媒としては、リポソームを形成する際に使用した外相液をそのまま用いてもよいし、外相液を他の適切な分散媒に置換してもよい。
【0030】
＜リポソームの作製方法＞
本実施形態の模擬細胞に用いるリポソームの作製方法は、特に限定されないが、薄膜法、超音波法、界面活性剤処理法、溶媒注入法、フレンチプレス法、逆相蒸発法、マイクロカプセル化法、コアセルベーション法等が挙げられる。
本実施形態の模擬細胞に用いるリポソームの作製方法は、特に限定されないが、薄膜法、超音波法、界面活性剤処理法、溶媒注入法、フレンチプレス法、逆相蒸発法、マイクロカプセル化法、コアセルベーション法等が挙げられる。
【0031】
薄膜法はバンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）法ともいい、脂質の薄膜に水溶液を添加し水和することで、脂質が自己組織化を起こしリポソームが形成される方法である。内包したい化合物が脂溶性の場合は予め脂質と一緒に混合しておき、水溶性の場合は水和する水溶液に溶かしておくことで化合物を内包することができる。
薄膜法によるリポソームの調製法の概略は以下のようになる。
（１）脂質を有機溶媒（クロロホルム、ジクロロメタン等）に溶解する。
（２）脂質溶液を丸底フラスコに入れ、ロータリー・エバポレーターで有機溶媒を除去し、フラスコ底部に脂質の薄膜を形成する。
（３）内水相となる水溶液を脂質薄膜上に注入し、脂質を水和（又は、膨潤）させ、リポソームを形成させる。
まず、（１）では、比較的沸点の低い有機溶媒に脂質を完全に溶解させる。脂質濃度は数十μｍｏ１から数十ｍｍｏｌ程度がよい。添加物としての荷電物質（ジセチルリン酸、ステアリルアミン等）及びコレステロール等を用いる場合には、この時点で脂質と同時に低沸点溶媒に均一に溶解させておく。
次に、（２）では、脂質濃度とフラスコの大きさの関係が重要であり、フラスコ底部にできる限りリン脂質の薄い膜が作成できる濃度にする必要がある。さらに、溶媒を完全に除去する必要があるので、減圧デシケーター中で一昼夜乾燥させておくとよい。
（３）では、相転移温度（Ｔｃ，脂質が液晶形から結晶形に相変化するときの温度）以上での水和と水和時間が最も重要な因子となる。また、水和する際の水相は、脂質に対して５０体積％以上必要である。
薄膜法によるリポソームの調製法の概略は以下のようになる。
（１）脂質を有機溶媒（クロロホルム、ジクロロメタン等）に溶解する。
（２）脂質溶液を丸底フラスコに入れ、ロータリー・エバポレーターで有機溶媒を除去し、フラスコ底部に脂質の薄膜を形成する。
（３）内水相となる水溶液を脂質薄膜上に注入し、脂質を水和（又は、膨潤）させ、リポソームを形成させる。
まず、（１）では、比較的沸点の低い有機溶媒に脂質を完全に溶解させる。脂質濃度は数十μｍｏ１から数十ｍｍｏｌ程度がよい。添加物としての荷電物質（ジセチルリン酸、ステアリルアミン等）及びコレステロール等を用いる場合には、この時点で脂質と同時に低沸点溶媒に均一に溶解させておく。
次に、（２）では、脂質濃度とフラスコの大きさの関係が重要であり、フラスコ底部にできる限りリン脂質の薄い膜が作成できる濃度にする必要がある。さらに、溶媒を完全に除去する必要があるので、減圧デシケーター中で一昼夜乾燥させておくとよい。
（３）では、相転移温度（Ｔｃ，脂質が液晶形から結晶形に相変化するときの温度）以上での水和と水和時間が最も重要な因子となる。また、水和する際の水相は、脂質に対して５０体積％以上必要である。
【0032】
超音波法はソニケーション（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）法ともいい、脂質を水に懸濁させて超音波を照射すると、光学的にほぼ透明な脂質分散溶液が得られる。
が得られることを発表した。
超音波法によるリポソームの調製法の概略は以下のようになる。
（１）薄膜法により多重層リポソームを調製する。
（２）この多重層リポソームに対して超音波照射を行なう。この調製法では、多重層リポソームを調製後又はリン脂質を水相に均一に懸濁後、超音波処理すると微細なリポソームを作成することができる。
が得られることを発表した。
超音波法によるリポソームの調製法の概略は以下のようになる。
（１）薄膜法により多重層リポソームを調製する。
（２）この多重層リポソームに対して超音波照射を行なう。この調製法では、多重層リポソームを調製後又はリン脂質を水相に均一に懸濁後、超音波処理すると微細なリポソームを作成することができる。
【0033】
界面活性剤処理法は、界面活性剤の可溶化力を利用してリン脂質とミセル混合物を作成し、透析法により界面活性剤だけを取り除く方法である。調製法の概略は以下となる。
（１）脂質分散溶液とコール酸（又はデオキシコール酸）を水溶液中で撹拌し、混合ミセルをつくる。
（２）透析チューブに混合ミセルを入れ、蒸留水中でコール酸（又はデオキシコール酸）を除去する。
まず（１）では、薄膜法、超音波法の調製法に従って脂質薄膜、多重層リポソーム、一枚膜リポソームに対し、コール酸又はデオキシコール酸（いずれもＮａ塩が好ましい）を加え、撹拌又は超音波処理し、混合ミセルを調製する。なお、抽出した脂質を直接、上記の界面活性剤とともに混合してもよい。また、コール酸又はデオキシコール酸以外の適当な界面活性剤を使用することもできる。
次に（２）では、透析の他に、超遠心又はゲルろ過等を用いることもできる。例えば、ゲルろ過では、脂質：コール酸ナトリウムのモル比を１：２とし、ゲルろ過によりコール酸ナトリウムを除去することが好ましい。
（１）脂質分散溶液とコール酸（又はデオキシコール酸）を水溶液中で撹拌し、混合ミセルをつくる。
（２）透析チューブに混合ミセルを入れ、蒸留水中でコール酸（又はデオキシコール酸）を除去する。
まず（１）では、薄膜法、超音波法の調製法に従って脂質薄膜、多重層リポソーム、一枚膜リポソームに対し、コール酸又はデオキシコール酸（いずれもＮａ塩が好ましい）を加え、撹拌又は超音波処理し、混合ミセルを調製する。なお、抽出した脂質を直接、上記の界面活性剤とともに混合してもよい。また、コール酸又はデオキシコール酸以外の適当な界面活性剤を使用することもできる。
次に（２）では、透析の他に、超遠心又はゲルろ過等を用いることもできる。例えば、ゲルろ過では、脂質：コール酸ナトリウムのモル比を１：２とし、ゲルろ過によりコール酸ナトリウムを除去することが好ましい。
【0034】
溶媒注入法の概略は次のとおりである。
（１）脂質をエタノール（又はエーテル）に溶解する。
（２）適度に温めた水溶液中へ（１）の脂質－エタノール溶液（又は５５～６５℃に加温した水溶液中へ脂質－エーテル溶液）を注入する。
まず（１）では、脂質の濃度を変化させることにより、リポソームの粒径を適度にコントロールすることができる。
（２）では、脂質の相転移温度以上に加温した水溶液中へ、脂質－エタノール溶液を注入する。なお、注入速度は、最終的に調製されてくるリポソームの物性に大きな影響を与えない。
エタノール注入法はきわめて簡単であり、リポソームの大きさや形においても再現性に優れている。
一方、エーテル法に関しては、まず（１）では、ジエチルエーテルの代わりにジエチルエーテル－メタノールの混液も利用できる。系の温度が５５～６５℃であると、ジエチルエーテル（沸点３９℃）は水相を介して蒸発していく。
（１）脂質をエタノール（又はエーテル）に溶解する。
（２）適度に温めた水溶液中へ（１）の脂質－エタノール溶液（又は５５～６５℃に加温した水溶液中へ脂質－エーテル溶液）を注入する。
まず（１）では、脂質の濃度を変化させることにより、リポソームの粒径を適度にコントロールすることができる。
（２）では、脂質の相転移温度以上に加温した水溶液中へ、脂質－エタノール溶液を注入する。なお、注入速度は、最終的に調製されてくるリポソームの物性に大きな影響を与えない。
エタノール注入法はきわめて簡単であり、リポソームの大きさや形においても再現性に優れている。
一方、エーテル法に関しては、まず（１）では、ジエチルエーテルの代わりにジエチルエーテル－メタノールの混液も利用できる。系の温度が５５～６５℃であると、ジエチルエーテル（沸点３９℃）は水相を介して蒸発していく。
【0035】
フレンチプレス法は、試料を細い間隙に対して高圧で押し出す方法であり、概略は次のとおりである。
（１）薄膜法に従いリポソーム懸濁液を調製する。
（２）（１）で調製したリポソーム懸濁液をフレンチプレスに入れ、温度４℃において２０，０００ｌｂｓ／ｉｎ２の圧力で押し出す。
（１）薄膜法に従いリポソーム懸濁液を調製する。
（２）（１）で調製したリポソーム懸濁液をフレンチプレスに入れ、温度４℃において２０，０００ｌｂｓ／ｉｎ２の圧力で押し出す。
【0036】
逆相蒸発法の概略は次のとおりである。
（１）脂質を溶解した有機溶媒（ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル等）に水相を加え、超音波処理し、Ｗ／０エマルションをつくる。
（２）Ｗ／Ｏエマルション中の有機溶媒を減圧留去する。
（３）ボルテックスミキサーを用いて約２０分間撹拌することにより転相をおこさせ、０／Ｗサスペンションとなったところでリポソームが得られる。
（４）残存する有機溶媒を完全に除去する。
（１）脂質を溶解した有機溶媒（ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル等）に水相を加え、超音波処理し、Ｗ／０エマルションをつくる。
（２）Ｗ／Ｏエマルション中の有機溶媒を減圧留去する。
（３）ボルテックスミキサーを用いて約２０分間撹拌することにより転相をおこさせ、０／Ｗサスペンションとなったところでリポソームが得られる。
（４）残存する有機溶媒を完全に除去する。
【0037】
マイクロカプセル化法の概略は次のようになる。
（１）高濃度（１３５ｍＭ程度）の脂質を有機溶媒（塩化メチレン、クロロホルム等）に溶解する。
（２）マーカー又は薬物を溶解した水相を（１）の脂質有機溶液と混合乳化し、Ｗ／０型エマルションを調製する。
（３）得られたＷ／０型エマルションを大量の蒸留水又は塩溶液にすばやく添加して分散させ、複合Ｗ／０／Ｗ型エマルションを形成させる。
（４）さらに撹拌を続け、脂質を溶解した有機溶媒を水相へ徐々に溶解させ、水相母液表面より蒸発させて除去し、リポソーム懸濁液を得る。
（１）高濃度（１３５ｍＭ程度）の脂質を有機溶媒（塩化メチレン、クロロホルム等）に溶解する。
（２）マーカー又は薬物を溶解した水相を（１）の脂質有機溶液と混合乳化し、Ｗ／０型エマルションを調製する。
（３）得られたＷ／０型エマルションを大量の蒸留水又は塩溶液にすばやく添加して分散させ、複合Ｗ／０／Ｗ型エマルションを形成させる。
（４）さらに撹拌を続け、脂質を溶解した有機溶媒を水相へ徐々に溶解させ、水相母液表面より蒸発させて除去し、リポソーム懸濁液を得る。
【0038】
コアセルベーション法その概略は次のようになる。
（１）メタノール、エタノール、１－プロパノール又は２－プロパノール等のアルコールに脂質を溶解する。
（２）この脂質－アルコール溶液一定量に貧溶媒である水又は塩溶液を徐々に添加して、コアセルベーションを生起させる。
（３）得られたコアセルベート中又は系中に含まれるアルコールを大量の水で透析することにより、アルコールを系外へ除去する。
（１）メタノール、エタノール、１－プロパノール又は２－プロパノール等のアルコールに脂質を溶解する。
（２）この脂質－アルコール溶液一定量に貧溶媒である水又は塩溶液を徐々に添加して、コアセルベーションを生起させる。
（３）得られたコアセルベート中又は系中に含まれるアルコールを大量の水で透析することにより、アルコールを系外へ除去する。
【0039】
本実施形態の模擬細胞を製造するためのリポソームの形成方法としては、脂質の薄膜に水溶液を添加し水和することで、脂質が自己組織化を起こしリポソームが形成される薄膜法（バンガム法）が簡便であることから好ましい。この方法でリポソームを形成し、目的に応じてエクストルーダーや超音波でリポソームのサイズを調整することで、所望の粒子径のリポソームを容易に得ることができる。
【0040】
［細胞培養装置検証用模擬細胞分散液］
本実施形態の細胞培養装置検証用模擬細胞分散液は、上記細胞培養装置検証用模擬細胞と分散媒とを含む。
上記分散媒としては、特に限定されず、上述した外水相の他、細胞培養用培養液、緩衝液等を使用できる。
本実施形態の細胞培養装置検証用模擬細胞分散液は、上記細胞培養装置検証用模擬細胞と分散媒とを含む。
上記分散媒としては、特に限定されず、上述した外水相の他、細胞培養用培養液、緩衝液等を使用できる。
【0041】
［細胞培養装評価方法］
本実施形態の模擬細胞は、細胞培養装置検証方法において、培養対象の細胞の代わりに用いることができる。
細胞培養装置の検証のために細胞を培養する必要が無いため、細胞培養のために必要な施設、設備、時間、技能等が不要となる。
本実施形態の模擬細胞は、細胞培養装置検証方法において、培養対象の細胞の代わりに用いることができる。
細胞培養装置の検証のために細胞を培養する必要が無いため、細胞培養のために必要な施設、設備、時間、技能等が不要となる。
【0042】
本実施形態の模擬細胞を用いることで、細胞培養装置が細胞に与えるダメージを視覚化することができ、細胞培養装置の検証をより容易に行うことができる。
【0043】
［作用効果］
本発明の細胞培養装置検証用模擬細胞は、リポソームを基本構造としたことで、細胞に近似した比重、表面特性及び強度を有する。そのため、細胞の代わりに細胞培養装置の検証に用いると、従来必要であった細胞培養用の施設、設備、技術、時間が不要となり、細胞培養装置の検証に要する時間及びコストを低減できる。
また、リポソームの脂質二重膜と内水相に異なる色素を含むため、細胞へのダメージを可視化できる。また、細胞操作への影響の評価が吸光度測定等により可能となる。そのため、本発明の細胞培養装置検証用模擬細胞を用いると、細胞培養装置の検証をより容易に行うことができる。
本発明の細胞培養装置検証用模擬細胞は、リポソームを基本構造としたことで、細胞に近似した比重、表面特性及び強度を有する。そのため、細胞の代わりに細胞培養装置の検証に用いると、従来必要であった細胞培養用の施設、設備、技術、時間が不要となり、細胞培養装置の検証に要する時間及びコストを低減できる。
また、リポソームの脂質二重膜と内水相に異なる色素を含むため、細胞へのダメージを可視化できる。また、細胞操作への影響の評価が吸光度測定等により可能となる。そのため、本発明の細胞培養装置検証用模擬細胞を用いると、細胞培養装置の検証をより容易に行うことができる。
【実施例0044】
以下では実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は後述する実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない限り種々の変形が可能である。
【0045】
［実施例１］
＜リポソームの作製＞
（１）脂質溶液の調製
ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）のクロロホルム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ濃度）に流動パラフィンを添加して、ＰＯＰＣの終濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。このＰＯＰＣ溶液を、ロータリー・エバポレーターを用いて８０℃で２０分間の処理を行い、ＰＯＰＣ溶液からクロロホルムを除去した。ＰＯＰＣの流動パラフィン溶液（以下「脂質溶液Ａ」という。）を得た。
コレステロール（３β－ヒドロキシ－５－コレステン）のクロロホルム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ濃度）に流動パラフィンを添加して、コレステロールの終濃度を４．５５ｍｇ／ｍＬに調整した。このコレステロール溶液を、ロータリー・エバポレーターを用いて８０℃で２０分間の処理を行い、コレステロール溶液からクロロホルムを除去した。コレステロールの流動パラフィン溶液（以下「脂質溶液Ｂ」という。）を得た。
脂質溶液Ａ及び脂質溶液Ｂのそれぞれを、８０℃加温下で２０分間撹拌した。
脂質溶液Ａと脂質溶液Ｂとを、ＰＯＰＣ：コレステロール＝９：１の質量比になるように混合し、３７℃で１０分間静置して、ＰＯＰＣ及びコレステロールを含む流動パラフィン溶液（以下「脂質溶液Ｃ」という。）を得た。
＜リポソームの作製＞
（１）脂質溶液の調製
ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）のクロロホルム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ濃度）に流動パラフィンを添加して、ＰＯＰＣの終濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。このＰＯＰＣ溶液を、ロータリー・エバポレーターを用いて８０℃で２０分間の処理を行い、ＰＯＰＣ溶液からクロロホルムを除去した。ＰＯＰＣの流動パラフィン溶液（以下「脂質溶液Ａ」という。）を得た。
コレステロール（３β－ヒドロキシ－５－コレステン）のクロロホルム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ濃度）に流動パラフィンを添加して、コレステロールの終濃度を４．５５ｍｇ／ｍＬに調整した。このコレステロール溶液を、ロータリー・エバポレーターを用いて８０℃で２０分間の処理を行い、コレステロール溶液からクロロホルムを除去した。コレステロールの流動パラフィン溶液（以下「脂質溶液Ｂ」という。）を得た。
脂質溶液Ａ及び脂質溶液Ｂのそれぞれを、８０℃加温下で２０分間撹拌した。
脂質溶液Ａと脂質溶液Ｂとを、ＰＯＰＣ：コレステロール＝９：１の質量比になるように混合し、３７℃で１０分間静置して、ＰＯＰＣ及びコレステロールを含む流動パラフィン溶液（以下「脂質溶液Ｃ」という。）を得た。
【0046】
（２）ジャイアントリポソームの作製
最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＦＩＴＣ－ＨＳＡ（ＦＩＴＣ－ヒト血清アルブミン）を添加した９０μＬの内水相溶液（組成：１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２００ｍＭスクロース）に、９００μＬの脂質溶液Ｃを添加して激しく撹拌した後、氷上で１０分間静置して、脂質を含む内水相溶液（以下「内水相溶液Ｂ」という。）を得た。
２１５μＬの外水相溶液（組成：１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２００ ｍＭグルコース）に１０μＬのＲｈｏｄａｍｉｎｅ ＰＥ（ローダミンＢ－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）のエタノール溶液（１ｍｇ／ｍＬ濃度）を混合して、赤色色素を含む外水相溶液（以下「外水相溶液Ｂ」という。）を得た。
得られた外水相溶液Ｂに、２５０μＬの内水相溶液Ｂを慎重に添加して混合液を得た。
得られた混合液を４℃で４５分間の遠心分離を加速度１６０００×ｇ、８５００×ｇ、５９００×ｇの３条件で行った後、上清を廃棄し、沈殿を３００μＬの外水相溶液で懸濁して、懸濁液（以下、「懸濁液Ｂ１」（１６０００×ｇで遠心）、「懸濁液Ｂ２」（８５００×ｇで遠心）、「懸濁液Ｂ３」（５９００×ｇで遠心）という。）を得た。
懸濁液Ｂ１、懸濁液Ｂ２、懸濁液Ｂ３のそれぞれを４℃で１０分間の遠心分離（１６０００×ｇ）を行った後、沈殿を３００μＬの外水相溶液で懸濁して、懸濁液（以下、それぞれ、「懸濁液Ｃ１」、「懸濁液Ｃ２」、「懸濁液Ｃ３」という。）を得た。
懸濁液Ｃ１、懸濁液Ｃ２、懸濁液Ｃ３を、４℃で１０分間の遠心分離（１６０００×ｇ）を行った後、沈殿を３００μＬの外水相溶液で懸濁して、リポソームの懸濁液（以下、それぞれ、「サンプル１」、「サンプル２」、「サンプル３」という。）を得た。
最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＦＩＴＣ－ＨＳＡ（ＦＩＴＣ－ヒト血清アルブミン）を添加した９０μＬの内水相溶液（組成：１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２００ｍＭスクロース）に、９００μＬの脂質溶液Ｃを添加して激しく撹拌した後、氷上で１０分間静置して、脂質を含む内水相溶液（以下「内水相溶液Ｂ」という。）を得た。
２１５μＬの外水相溶液（組成：１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２００ ｍＭグルコース）に１０μＬのＲｈｏｄａｍｉｎｅ ＰＥ（ローダミンＢ－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）のエタノール溶液（１ｍｇ／ｍＬ濃度）を混合して、赤色色素を含む外水相溶液（以下「外水相溶液Ｂ」という。）を得た。
得られた外水相溶液Ｂに、２５０μＬの内水相溶液Ｂを慎重に添加して混合液を得た。
得られた混合液を４℃で４５分間の遠心分離を加速度１６０００×ｇ、８５００×ｇ、５９００×ｇの３条件で行った後、上清を廃棄し、沈殿を３００μＬの外水相溶液で懸濁して、懸濁液（以下、「懸濁液Ｂ１」（１６０００×ｇで遠心）、「懸濁液Ｂ２」（８５００×ｇで遠心）、「懸濁液Ｂ３」（５９００×ｇで遠心）という。）を得た。
懸濁液Ｂ１、懸濁液Ｂ２、懸濁液Ｂ３のそれぞれを４℃で１０分間の遠心分離（１６０００×ｇ）を行った後、沈殿を３００μＬの外水相溶液で懸濁して、懸濁液（以下、それぞれ、「懸濁液Ｃ１」、「懸濁液Ｃ２」、「懸濁液Ｃ３」という。）を得た。
懸濁液Ｃ１、懸濁液Ｃ２、懸濁液Ｃ３を、４℃で１０分間の遠心分離（１６０００×ｇ）を行った後、沈殿を３００μＬの外水相溶液で懸濁して、リポソームの懸濁液（以下、それぞれ、「サンプル１」、「サンプル２」、「サンプル３」という。）を得た。
【0047】
＜評価方法及び結果＞
機械操作後の液体の顕微鏡観察及び蛍光スペクトル測定により評価した。図２に顕微鏡写真を、図３に蛍光スペクトルを、それぞれ示す。
顕微鏡観察は、２倍希釈したサンプル１、サンプル２、サンプル３を、白色光、（Ｌｉｇｈｔ）又は蛍光を用いて、倍率４００倍で観察した。図２の白色光で確認された円形状の像と同じ個所にＲｈｏｄａｍｉｎｅ ＰＥ、ＦＩＴＣ－ＨＳＡが確認できることから、リポソーム外層、内層にそれぞれの蛍光物質が埋包出来ていることが確認された。模擬細胞の損傷が生じた場合は液中に蛍光物質が流出するため、顕微鏡像全体が蛍光色素で染色されるため、撮像に変化が現れる。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＰＥ、ＦＩＴＣ－ＨＳＡの染色範囲と円形形状の多少などから、細胞へのダメージ度合いを判別することができる。
蛍光スペクトル測定は、サンプル１、サンプル２、サンプル３を外水相溶液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２００ｍＭグルコース）で１０倍希釈後、分光光度計（ＲＦ５３００，島津製作所社製）を用いて、励起（ＦＩＴＣ：励起波長４９５ｎｍ；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ：励起波長５４４ｎｍ）し、蛍光スペクトルを測定した。図３で検出された蛍光強度は、リポソームの存在により確認されたと推察される。模擬細胞の損傷が生じた場合は液中に蛍光物質が流出するため、上清の蛍光スペクトル測定により、強度により、細胞へのダメージ度合いを判別することができる。
機械操作後の液体の顕微鏡観察及び蛍光スペクトル測定により評価した。図２に顕微鏡写真を、図３に蛍光スペクトルを、それぞれ示す。
顕微鏡観察は、２倍希釈したサンプル１、サンプル２、サンプル３を、白色光、（Ｌｉｇｈｔ）又は蛍光を用いて、倍率４００倍で観察した。図２の白色光で確認された円形状の像と同じ個所にＲｈｏｄａｍｉｎｅ ＰＥ、ＦＩＴＣ－ＨＳＡが確認できることから、リポソーム外層、内層にそれぞれの蛍光物質が埋包出来ていることが確認された。模擬細胞の損傷が生じた場合は液中に蛍光物質が流出するため、顕微鏡像全体が蛍光色素で染色されるため、撮像に変化が現れる。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＰＥ、ＦＩＴＣ－ＨＳＡの染色範囲と円形形状の多少などから、細胞へのダメージ度合いを判別することができる。
蛍光スペクトル測定は、サンプル１、サンプル２、サンプル３を外水相溶液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２００ｍＭグルコース）で１０倍希釈後、分光光度計（ＲＦ５３００，島津製作所社製）を用いて、励起（ＦＩＴＣ：励起波長４９５ｎｍ；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ：励起波長５４４ｎｍ）し、蛍光スペクトルを測定した。図３で検出された蛍光強度は、リポソームの存在により確認されたと推察される。模擬細胞の損傷が生じた場合は液中に蛍光物質が流出するため、上清の蛍光スペクトル測定により、強度により、細胞へのダメージ度合いを判別することができる。
【0048】
［実施例２］
＜リポソームの作製＞
（１）脂質溶液の調製
脂質（ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール））及び赤色蛍光色素（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－ＰＥ）を秤量し、脂質と等モルのフルクトースとともに、メタノール－クロロホルム混合液（体積比 メタノール：クロロホルム＝２．１）に溶解して、脂質及び赤色蛍光色素を含む溶液（以下「脂質溶液Ｄ」という。）を得た。
脂質溶液Ｄを穏やかに混合しながら、５０℃、減圧下で溶媒を留去し、さらに、溶媒を完全に除去するために真空乾燥を行って、赤色蛍光色素を含む脂質（以下「脂質Ｂ」という。）を得た。
＜リポソームの作製＞
（１）脂質溶液の調製
脂質（ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール））及び赤色蛍光色素（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－ＰＥ）を秤量し、脂質と等モルのフルクトースとともに、メタノール－クロロホルム混合液（体積比 メタノール：クロロホルム＝２．１）に溶解して、脂質及び赤色蛍光色素を含む溶液（以下「脂質溶液Ｄ」という。）を得た。
脂質溶液Ｄを穏やかに混合しながら、５０℃、減圧下で溶媒を留去し、さらに、溶媒を完全に除去するために真空乾燥を行って、赤色蛍光色素を含む脂質（以下「脂質Ｂ」という。）を得た。
【0049】
（２）ジャイアントリポソームの作製
脂質Ｂを、ＦＩＴＣ－ＨＳＡ（ＦＩＴＣ－ヒト血清アルブミン）溶液をＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）に溶解した水溶液で再水和し、５０℃で穏やかにミキシングして脂質混合液（以下「脂質混合液Ｃ」という。）を得た。
脂質混合液Ｃを、４℃で１０分間、８００ｒｐｍで遠心処理し、上清を除去してＨＥＰＥＳ緩衝液（同上）を加えた。この操作を２回行って、リポソームの分散液（以下、「サンプル４」（１６０００×ｇで遠心）、「サンプル５」（８５００×ｇで遠心）、「サンプル６」（５９００×ｇで遠心）を得た。
脂質Ｂを、ＦＩＴＣ－ＨＳＡ（ＦＩＴＣ－ヒト血清アルブミン）溶液をＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）に溶解した水溶液で再水和し、５０℃で穏やかにミキシングして脂質混合液（以下「脂質混合液Ｃ」という。）を得た。
脂質混合液Ｃを、４℃で１０分間、８００ｒｐｍで遠心処理し、上清を除去してＨＥＰＥＳ緩衝液（同上）を加えた。この操作を２回行って、リポソームの分散液（以下、「サンプル４」（１６０００×ｇで遠心）、「サンプル５」（８５００×ｇで遠心）、「サンプル６」（５９００×ｇで遠心）を得た。
【0050】
＜評価方法及び結果＞
機械操作後の液体の顕微鏡観察及び蛍光スペクトル測定により評価した。図４に顕微鏡写真を、図５に蛍光スペクトルを、それぞれ示す。
顕微鏡観察は、２倍希釈したサンプル４を、白色光（Ｌｉｇｈｔ）又は蛍光を用いて、倍率４００倍で観察した。図４の白色光で確認された円形状の像と同じ個所にＲｈｏｄａｍｉｎｅ ＰＥ、ＦＩＴＣ－ＨＳＡが確認できることから、リポソーム外層、内層にそれぞれの蛍光物質が埋包出来ていることが確認された。模擬細胞の損傷が生じた場合は液中に蛍光物質が流出するため、顕微鏡像全体が蛍光色素で染色されるため、撮像に変化が現れる。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＰＥ、ＦＩＴＣ－ＨＳＡの染色範囲と円形形状の多少などから、細胞へのダメージ度合いを判別することができる。
蛍光スペクトル測定は、サンプル４、サンプル５、サンプル６を外水相溶液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２００ｍＭグルコース）で１０倍希釈後、分光光度計（ＲＦ５３００，島津製作所社製）を用いて、励起（ＦＩＴＣ：励起波長４９５ｎｍ；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ：励起波長５４４ｎｍ）し、蛍光スペクトルを測定した。リポソームが懸濁された外水相溶液には色素が含まれていないことから、図５で検出された蛍光強度は、リポソームの存在により確認されたと推察される。模擬細胞の損傷が生じた場合は液中に蛍光物質が流出するため、上清の蛍光スペクトル測定により、強度により、細胞へのダメージ度合いを判別することができる。
機械操作後の液体の顕微鏡観察及び蛍光スペクトル測定により評価した。図４に顕微鏡写真を、図５に蛍光スペクトルを、それぞれ示す。
顕微鏡観察は、２倍希釈したサンプル４を、白色光（Ｌｉｇｈｔ）又は蛍光を用いて、倍率４００倍で観察した。図４の白色光で確認された円形状の像と同じ個所にＲｈｏｄａｍｉｎｅ ＰＥ、ＦＩＴＣ－ＨＳＡが確認できることから、リポソーム外層、内層にそれぞれの蛍光物質が埋包出来ていることが確認された。模擬細胞の損傷が生じた場合は液中に蛍光物質が流出するため、顕微鏡像全体が蛍光色素で染色されるため、撮像に変化が現れる。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＰＥ、ＦＩＴＣ－ＨＳＡの染色範囲と円形形状の多少などから、細胞へのダメージ度合いを判別することができる。
蛍光スペクトル測定は、サンプル４、サンプル５、サンプル６を外水相溶液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２００ｍＭグルコース）で１０倍希釈後、分光光度計（ＲＦ５３００，島津製作所社製）を用いて、励起（ＦＩＴＣ：励起波長４９５ｎｍ；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ：励起波長５４４ｎｍ）し、蛍光スペクトルを測定した。リポソームが懸濁された外水相溶液には色素が含まれていないことから、図５で検出された蛍光強度は、リポソームの存在により確認されたと推察される。模擬細胞の損傷が生じた場合は液中に蛍光物質が流出するため、上清の蛍光スペクトル測定により、強度により、細胞へのダメージ度合いを判別することができる。
【符号の説明】
【0051】
１…脂質二重膜、１ａ…外膜、１ｂ…内膜、２…内水相、３…第１の色素、４…第２の色素、１００…リポソーム
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】