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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023035019
(43)【公開日】2023-03-13
(54)【発明の名称】モデル動物及びその製造方法、並びに石灰化剤
(51)【国際特許分類】
A01K 67/027 20060101AFI20230306BHJP
【ＦＩ】
A01K67/027 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021141591
(22)【出願日】2021-08-31
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和３年１月２７日、科研費の２０１９年度 実績報告書（ｈｔｔｐｓ：／／ｋａｋｅｎ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｊａ／ｒｅｐｏｒｔ／ＫＡＫＥＮＨＩ－ＰＲＯＪＥＣＴ－１７Ｈ０４３１７／１７Ｈ０４３１７２０１９ｊｉｓｓｅｋｉ／）
(71)【出願人】
【識別番号】504013775
【氏名又は名称】学校法人 埼玉医科大学
(71)【出願人】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】片桐 岳信
(72)【発明者】
【氏名】塚本 翔
(72)【発明者】
【氏名】倉谷 麻衣
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 治
(72)【発明者】
【氏名】濱井 瞭
(72)【発明者】
【氏名】土屋 香織
(57)【要約】 （修正有）
【課題】筋組織内に石灰化物を有し、長期間安定なモデル動物、筋組織内に高効率で石灰化物を誘導することができ、長期間安定なモデル動物の製造方法、及び筋組織内に高効率で石灰化物を誘導することができる筋線維の石灰化剤の提供。
【解決手段】ヒドロキシアパタイト結晶を含有する石灰化物を筋組織内に有するモデル動物、非ヒト動物にノテキシンを投与することを含み、筋組織内に石灰化物を誘導することを特徴とするモデル動物の製造方法、及びノテキシンを含有することを特徴とする筋線維の石灰化剤を提供する。
【選択図】図９
【解決手段】ヒドロキシアパタイト結晶を含有する石灰化物を筋組織内に有するモデル動物、非ヒト動物にノテキシンを投与することを含み、筋組織内に石灰化物を誘導することを特徴とするモデル動物の製造方法、及びノテキシンを含有することを特徴とする筋線維の石灰化剤を提供する。
【選択図】図９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
筋組織内に石灰化物を有することを特徴とするモデル動物。
【請求項2】
石灰化物が、ヒドロキシアパタイト結晶を含有する請求項１に記載のモデル動物。
【請求項3】
石灰化物が、骨芽細胞及び破骨細胞を含有しない請求項１から２のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項4】
異所性石灰化の病態モデルである請求項１から３のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項5】
非ヒト動物にノテキシンを投与することを含み、筋組織内に石灰化物を誘導することを特徴とするモデル動物の製造方法。
【請求項6】
モデル動物が、筋組織内に石灰化物を有する請求項５に記載のモデル動物の製造方法。
【請求項7】
動物が、げっ歯目動物である請求項５から６のいずれかに記載のモデル動物の製造方法。
【請求項8】
ノテキシンを含有することを特徴とする筋線維の石灰化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、モデル動物及びその製造方法、並びに石灰化剤に関する。
【背景技術】
【0002】
骨格筋組織は、柔軟な筋線維によって構成され、特に運動機能に重要である。しかし、ある種の病的な状態、例えば、遺伝性疾患、強い外傷、脳挫傷、火傷、人工関節周囲などでは、筋組織の中に固く石灰化した硬組織が形成されることが知られている。筋組織内で異所性に形成された石灰化物は、しばしば長期間残存し、痛みや運動機能等に障害を与える。これまで、このような硬組織が骨組織か否かの議論に結論は得られておらず、石灰化物の性状や、その形成メカニズム、予防法、及び治療法についても明らかになっていないという問題がある。そのため、異所性石灰化のモデル動物の提供が求められている。
【0003】
異所性石灰化疾患モデル動物として、ラットのアキレス腱にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍを注入し、アキレス腱に石灰化を誘導したモデル動物が提案されている（特許文献１参照）。
しかしながら、アキレス腱は、コラーゲンの線維から形成されており（非特許文献１参照）、筋線維とはその構造が全く異なるものであるため、前述の筋組織の病的な状態のモデルとしては使用できない。
しかしながら、アキレス腱は、コラーゲンの線維から形成されており（非特許文献１参照）、筋線維とはその構造が全く異なるものであるため、前述の筋組織の病的な状態のモデルとしては使用できない。
【0004】
したがって、筋組織に形成される石灰化物の性状や、その形成メカニズム、予防法、及び治療法の研究のために、筋組織の中に固く石灰化した硬組織が形成された、安定なモデルの確立が強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２００５－８７０８２号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】坂井 建雄、河原 克雅（編集）、「人体の正常構造と機能」、日本医事新報社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、筋組織内に石灰化物を有し、長期間安定なモデル動物、筋組織内に高効率で石灰化物を誘導することができ、長期間安定なモデル動物の製造方法、及び筋組織内に高効率で石灰化物を誘導することができる筋線維の石灰化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 筋組織内に石灰化物を有することを特徴とするモデル動物である。
＜２＞ 石灰化物が、ヒドロキシアパタイト結晶を含有する前記＜１＞に記載のモデル動物である。
＜３＞ 石灰化物が、骨芽細胞及び破骨細胞を含有しない前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のモデル動物である。
＜４＞ 異所性石灰化の病態モデルである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のモデル動物である。
＜５＞ 非ヒト動物にノテキシンを投与することを含み、筋組織内に石灰化物を誘導することを特徴とするモデル動物の製造方法である。
＜６＞ モデル動物が、筋組織内に石灰化物を有する前記＜５＞に記載のモデル動物の製造方法である。
＜７＞ 動物が、げっ歯目動物である前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載のモデル動物の製造方法である。
＜８＞ ノテキシンを含有することを特徴とする筋線維の石灰化剤である。
＜１＞ 筋組織内に石灰化物を有することを特徴とするモデル動物である。
＜２＞ 石灰化物が、ヒドロキシアパタイト結晶を含有する前記＜１＞に記載のモデル動物である。
＜３＞ 石灰化物が、骨芽細胞及び破骨細胞を含有しない前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のモデル動物である。
＜４＞ 異所性石灰化の病態モデルである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のモデル動物である。
＜５＞ 非ヒト動物にノテキシンを投与することを含み、筋組織内に石灰化物を誘導することを特徴とするモデル動物の製造方法である。
＜６＞ モデル動物が、筋組織内に石灰化物を有する前記＜５＞に記載のモデル動物の製造方法である。
＜７＞ 動物が、げっ歯目動物である前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載のモデル動物の製造方法である。
＜８＞ ノテキシンを含有することを特徴とする筋線維の石灰化剤である。
【発明の効果】
【0009】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、筋組織内に石灰化物を有し、長期間安定なモデル動物、筋組織内に高効率で石灰化物を誘導することができ、長期間安定なモデル動物の製造方法、及び筋組織内に高効率で石灰化物を誘導することができる筋線維の石灰化剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図5B】図５Ｂは、試験例４における、ノテキシン投与マウスの筋組織中の石灰化物のＸ線回折の結果を示す図である。矢印はヒドロキシアパタイト結晶のピークを示す。縦軸は強度（ｃｐｓ）、横軸は２θ（ｄｅｇ）である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
（モデル動物及びモデル動物の製造方法）
本発明のモデル動物は、筋組織内に石灰化物を有する動物である。
本発明のモデル動物の製造方法は、非ヒト動物にノテキシン（Ｎｏｔｅｘｉｎ）を投与する投与工程を含み、更に必要に応じて、その他の工程を含む。
本発明のモデル動物は、本発明のモデル動物の製造方法により好適に製造される。以下、モデル動物の製造方法の説明と併せて、本発明のモデル動物について説明する。
本発明のモデル動物は、筋組織内に石灰化物を有する動物である。
本発明のモデル動物の製造方法は、非ヒト動物にノテキシン（Ｎｏｔｅｘｉｎ）を投与する投与工程を含み、更に必要に応じて、その他の工程を含む。
本発明のモデル動物は、本発明のモデル動物の製造方法により好適に製造される。以下、モデル動物の製造方法の説明と併せて、本発明のモデル動物について説明する。
【0012】
＜投与工程＞
前記投与工程は、非ヒト動物にノテキシンを投与する工程である。これにより、前記非ヒト動物の筋組織内に石灰化物が誘導される。
前記投与工程は、非ヒト動物にノテキシンを投与する工程である。これにより、前記非ヒト動物の筋組織内に石灰化物が誘導される。
【0013】
－ノテキシン－
前記ノテキシンは、Ｔｉｇｅｒ ｓｎａｋｅ由来のヘビ毒である。
前記ノテキシンは、市販品を使用してもよく、Ｔｉｇｅｒ ｓｎａｋｅから調製してもよい。前記ノテキシンの市販品としては、Ｌａｔｏｘａｎ社から入手することができる。
前記ノテキシンは、Ｔｉｇｅｒ ｓｎａｋｅ由来のヘビ毒である。
前記ノテキシンは、市販品を使用してもよく、Ｔｉｇｅｒ ｓｎａｋｅから調製してもよい。前記ノテキシンの市販品としては、Ｌａｔｏｘａｎ社から入手することができる。
【0014】
従来、ヘビ毒の一種である、Ｎａｊａ ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ由来のカルディオトキシン（Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）が筋組織の損傷や再生誘発剤として多用されてきた。しかしながら、カルディオトキシンを非ヒト動物に投与しても、筋組織内に石灰化物を誘導することはできない。同じヘビ毒であっても、ノテキシンの投与により筋組織内に石灰化物を誘導することができることは、本発明者らの予想外の知見である。
【0015】
前記ノテキシンの形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、そのまま投与してもよいが、溶媒と混合したノテキシン溶液の形態で投与することが好ましい。
【0016】
前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0017】
前記ノテキシン溶液におけるノテキシンの濃度としては、特に制限はなく、前記非ヒト動物の種類に応じて適宜選択することができるが、その下限値としては、０．５μｇ／ｍＬ以上が好ましく、１．０μｇ／ｍＬ以上がより好ましく、１．５μｇ／ｍＬ以上が特に好ましく、またその上限値としては、２０μｇ／ｍＬ以下が好ましく、１０μｇ／ｍＬ以下がより好ましく、５μｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。前記下限値と前記上限値とは適宜組み合わせることができ、前記ノテキシン溶液におけるノテキシンの濃度としては、０．５μｇ／ｍＬ～２０μｇ／ｍＬが好ましく、１．０μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬがより好ましく、１．５μｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬが特に好ましい。
【0018】
前記非ヒト動物への前記ノテキシン溶液の投与量としては、特に制限はなく、前記非ヒト動物の種類に応じて適宜選択することができるが、その下限値としては、１０μＬ以上が好ましく、１００μＬ以上がより好ましく、１５０μＬ以上が特に好ましく、またその上限値としては、１，０００μＬ以下が好ましく、５００μＬ以下がより好ましく、３００μＬ以下が特に好ましい。前記下限値と前記上限値とは適宜組み合わせることができ、前記非ヒト動物への前記ノテキシン溶液の投与量としては、１０μＬ～１，０００μＬが好ましく、１００μＬ～５００μＬがより好ましく、１５０μＬ～３００μＬが特に好ましい。
【0019】
前記ノテキシンの投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、直接的又は間接的に、筋組織内に前記ノテキシンを投与できる方法が好ましく、例えば、筋肉内投与、皮下投与などが挙げられる。これらの中でも、前記ノテキシンの投与方法としては、筋肉内投与が好ましい。
【0020】
前記ノテキシンの投与回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単回投与であってもよく、複数回投与してもよいが、単回投与が簡便で好ましい。前記モデル動物の製造方法は、ノテキシンを単回投与しても、筋組織内に石灰化物を好適に誘導することができる。
【0021】
前記モデル動物におけるノテキシンの投与の経過期間としては、特に制限はなく、前記モデル動物の使用目的に応じて適宜選択することができる。したがって、前記モデル動物は、ノテキシンを投与した直後の動物、ノテキシンの投与から７日間後の動物、ノテキシンの投与から３週間後の動物、ノテキシンの投与から６カ月後の動物、ノテキシンの投与から１６カ月後の動物、ノテキシンの投与から１６カ月以上経過した動物など、前記非ヒト動物にノテキシンを投与した動物は、いずれも本発明の範囲内である。即ち、前記モデル動物の製造方法は、前記非ヒト動物の筋組織内に石灰化物を誘導することを特徴としており、前記モデル動物の製造方法により得られたモデル動物には、筋組織内に石灰化物を有するものだけでなく、前記非ヒト動物にノテキシンを投与後、筋組織内に石灰化物が完全に形成される前（筋組織内に石灰化物が誘導されている状態又は筋組織内に石灰化物が形成される過程）の動物も含まれる。更に、前記モデル動物は、筋組織内の石灰化物を長期間、安定に有するものであるため、様々な目的で使用できる点で有利である。
例えば、筋線維の石灰化の性状の解析、筋線維に石灰化物が形成されるメカニズムの解析、筋線維の石灰化の生理的役割の解析、筋組織内に石灰化を伴う様々な疾患の発症機序の解明、前記疾患の予防方法又は治療方法の研究、前記疾病に対する予防薬又は治療薬のスクリーニングや開発などの用途に応じて、適宜選択した石灰化の過程又は状態を有するモデル動物を使用することができる。
例えば、筋線維の石灰化の性状の解析、筋線維に石灰化物が形成されるメカニズムの解析、筋線維の石灰化の生理的役割の解析、筋組織内に石灰化を伴う様々な疾患の発症機序の解明、前記疾患の予防方法又は治療方法の研究、前記疾病に対する予防薬又は治療薬のスクリーニングや開発などの用途に応じて、適宜選択した石灰化の過程又は状態を有するモデル動物を使用することができる。
【0022】
－非ヒト動物－
前記非ヒト動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、げっ歯目動物、ウサギ目動物、ネコ目動物、ウシ目動物、サル目動物、イヌ目動物、イタチ目動物、イノシシ目動物、霊長目動物などが挙げられる。
前記げっ歯目動物としては、例えば、マウス、ラット、スナネズミ、オキナワハツカネズミ、シッキムハツカネズミ、チャイニーズハムスター、モルモットなどが挙げられる。
他の前記非ヒト動物としては、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、フェレット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、カニクイザル、アカゲザル、マーモセットなどが挙げられる。
これらの中でも、前記非ヒト動物は、実験動物として取り扱い易く有用である点で、げっ歯目動物が好ましく、マウス、ラットがより好ましく、マウスが特に好ましい。
前記非ヒト動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、げっ歯目動物、ウサギ目動物、ネコ目動物、ウシ目動物、サル目動物、イヌ目動物、イタチ目動物、イノシシ目動物、霊長目動物などが挙げられる。
前記げっ歯目動物としては、例えば、マウス、ラット、スナネズミ、オキナワハツカネズミ、シッキムハツカネズミ、チャイニーズハムスター、モルモットなどが挙げられる。
他の前記非ヒト動物としては、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、フェレット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、カニクイザル、アカゲザル、マーモセットなどが挙げられる。
これらの中でも、前記非ヒト動物は、実験動物として取り扱い易く有用である点で、げっ歯目動物が好ましく、マウス、ラットがより好ましく、マウスが特に好ましい。
【0023】
＜モデル動物＞
前記モデル動物が有する前記石灰化物は、非ヒト動物に前記ノテキシンを投与することで形成されるものである。
前記石灰化物は、マイクロＸ線ＣＴ（例えば、ＣｏｓｍｏＳｃａｎ ＧＸ、株式会社リガク製）で確認することができる。
前記モデル動物が有する前記石灰化物は、非ヒト動物に前記ノテキシンを投与することで形成されるものである。
前記石灰化物は、マイクロＸ線ＣＴ（例えば、ＣｏｓｍｏＳｃａｎ ＧＸ、株式会社リガク製）で確認することができる。
【0024】
前記石灰化物の性状としては、リン酸カルシウムのヒドロキシアパタイト結晶を含有し、骨芽細胞及び破骨細胞を含有しないものである。
前記石灰化物が、リン酸カルシウムのヒドロキシアパタイト結晶を含有することは、フォンコッサ染色、アリザリンレッドＳ染色、Ｘ線回折、走査電子顕微鏡などにより確認することができる。
前記石灰化物が、リン酸カルシウムのヒドロキシアパタイト結晶を含有することは、フォンコッサ染色、アリザリンレッドＳ染色、Ｘ線回折、走査電子顕微鏡などにより確認することができる。
【0025】
前記モデル動物では、筋組織内に石灰化物を有することの他、炎症反応が起きているという性状も有する。具体的には、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色で炎症細胞と考えられる細胞群の浸潤が観察され、更には、単球マクロファージのマーカーであるＣＤ１１ｂの浸潤、ＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現の亢進、ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現の亢進などが認められる。
これらの炎症反応は、ＨＥ染色、免疫染色、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）などで確認することができる。
これらの炎症反応は、ＨＥ染色、免疫染色、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）などで確認することができる。
【0026】
前記モデル動物は、筋組織の病的な状態、例えば、遺伝性疾患、強い外傷、脳挫傷、火傷、人工関節周囲などにより誘導される筋線維の石灰化の性状や、その形成メカニズム、生理的役割の解析などに利用可能である。
また、図１に示すように、ヒトにおける石灰化（石灰沈着性）筋壊死（Ｃａｌｃｉｆｉｃ ｍｙｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）（Ｂａｒｒｏｎ ＳＬ ＆ ＭａｃＧｒｏｒｙ ＢＪ， Ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔ Ｔｏｄａｙ， ２０１８， ４（４）， ｐ．４２１－４２５参照）のＣＴ像と、本発明のモデル動物における石灰化物のマイクロＸ線ＣＴ像は非常に類似している。したがって、前記モデル動物は、筋組織内に石灰化（異所性石灰化）を伴う様々な疾患、例えば、進行性骨化性線維異形成症（ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ：ＦＯＰ）や石灰化（石灰沈着性）筋壊死（Ｃａｌｃｉｆｉｃ ｍｙｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）の病態モデルとして有用であり、更に、これらの疾患の発症機序の解明や、前記疾患の予防方法、治療方法、予防薬、治療薬などの開発への応用が期待できる。
また、図１に示すように、ヒトにおける石灰化（石灰沈着性）筋壊死（Ｃａｌｃｉｆｉｃ ｍｙｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）（Ｂａｒｒｏｎ ＳＬ ＆ ＭａｃＧｒｏｒｙ ＢＪ， Ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔ Ｔｏｄａｙ， ２０１８， ４（４）， ｐ．４２１－４２５参照）のＣＴ像と、本発明のモデル動物における石灰化物のマイクロＸ線ＣＴ像は非常に類似している。したがって、前記モデル動物は、筋組織内に石灰化（異所性石灰化）を伴う様々な疾患、例えば、進行性骨化性線維異形成症（ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ：ＦＯＰ）や石灰化（石灰沈着性）筋壊死（Ｃａｌｃｉｆｉｃ ｍｙｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）の病態モデルとして有用であり、更に、これらの疾患の発症機序の解明や、前記疾患の予防方法、治療方法、予防薬、治療薬などの開発への応用が期待できる。
【0027】
（筋線維の石灰化剤）
本発明の筋線維の石灰化剤は、ノテキシンを含有し、更に必要に応じて、その他の成分を含有する。
本発明の筋線維の石灰化剤は、ノテキシンを含有し、更に必要に応じて、その他の成分を含有する。
【0028】
＜ノテキシン＞
前記ノテキシンとしては、前述の（モデル動物の製造方法）の＜投与工程＞の項目に記載の通りである。
前記ノテキシンとしては、前述の（モデル動物の製造方法）の＜投与工程＞の項目に記載の通りである。
【0029】
前記ノテキシンの含有量としては、筋組織に石灰化物を誘導することができれば、特に制限はなく、投与対象などに応じて適宜選択することができる。
【0030】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、溶媒などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、溶媒などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0031】
前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。
【0032】
前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等のカチオン性界面活性剤などが挙げられる。
【0033】
前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾール、チメロサール、フェノキシエタノールなどが挙げられる。
【0034】
前記粘結剤、前記増粘剤、又は前記固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デンプン、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【0035】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【0036】
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
【0037】
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
【0038】
前記ｐＨ調整剤又は前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【0039】
前記等張化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
【0040】
前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
【0041】
前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0042】
－剤型－
前記筋線維の石灰化剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、液剤などが挙げられる。これらの中でも、液剤が好ましい。
前記筋線維の石灰化剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、液剤などが挙げられる。これらの中でも、液剤が好ましい。
【0043】
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤、混餌剤、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。
【0044】
－製造方法－
前記筋線維の石灰化剤の製造方法としては、前記ノテキシンと、更に必要に応じて、前記その他の成分とを混合することができれば、特に制限はなく、剤型などに応じて公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができる。
前記筋線維の石灰化剤の製造方法としては、前記ノテキシンと、更に必要に応じて、前記その他の成分とを混合することができれば、特に制限はなく、剤型などに応じて公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができる。
【0045】
前記筋線維の石灰化剤は、筋組織内に石灰化物を有するモデル動物の作製や、インビトロでの培養細胞（例えば、筋芽細胞など）による筋線維での石灰化のメカニズムの解析に好適に用いることができる。また、筋組織内に石灰化（異所性石灰化）を伴う様々な疾患、の発症機序の解明や、前記疾患の予防方法、治療方法、予防薬、治療薬などの開発研究への応用が期待できる。
【実施例0046】
以下に試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。
【0047】
（試験例１：ヘビ毒投与による筋組織の損傷誘発）
野生型マウスのヘビ毒投与に対する影響を組織切片で解析した。２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）又は１０μＭのカルディオトキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与した。投与３日間後に、安楽死させ、皮膚を剥離し、後肢の筋組織を採取した。また、対照として、ヘビ毒非投与のマウスについても同様にして、後肢の筋組織を採取した。
採取した筋組織を４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク株式会社製）で２日間固定した後、エタノール脱水を行い、キシレンへ置換し、パラフィンで包埋した。回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製）を用いてパラフィン切片を作製し、定法に従いヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を施し、ＢＺ－９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）により筋損傷を評価した。
野生型マウスのヘビ毒投与に対する影響を組織切片で解析した。２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）又は１０μＭのカルディオトキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与した。投与３日間後に、安楽死させ、皮膚を剥離し、後肢の筋組織を採取した。また、対照として、ヘビ毒非投与のマウスについても同様にして、後肢の筋組織を採取した。
採取した筋組織を４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク株式会社製）で２日間固定した後、エタノール脱水を行い、キシレンへ置換し、パラフィンで包埋した。回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製）を用いてパラフィン切片を作製し、定法に従いヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を施し、ＢＺ－９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）により筋損傷を評価した。
【0048】
結果を図２に示す。ＨＥ染色像から、ノテキシン投与マウス及びカルディオトキシン投与マウスでは、非投与マウスに比較して、筋線維が損傷し、炎症細胞と考えられる細胞群の浸潤が観察された。
【0049】
（試験例２：ヘビ毒投与による異所性の硬組織形成）
２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）又は１０μＭのカルディオトキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与した。また、対照として、ヘビ毒非投与のマウスも同時に飼育した。投与７日間後、２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、マイクロＸ線ＣＴ（ＣｏｓｍｏＳｃａｎ ＧＸ、株式会社リガク製）を用い、後肢の筋組織を解析した。
２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）又は１０μＭのカルディオトキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与した。また、対照として、ヘビ毒非投与のマウスも同時に飼育した。投与７日間後、２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、マイクロＸ線ＣＴ（ＣｏｓｍｏＳｃａｎ ＧＸ、株式会社リガク製）を用い、後肢の筋組織を解析した。
【0050】
結果を図３に示す。ノテキシン投与マウスでは、筋組織中にＸ線不透過の異所性石灰化が観察された。一方、カルディオトキシン投与マウスでは、筋組織中にＸ線不透過は観察されなかった。
【0051】
（試験例３：ノテキシン投与による異所性の硬組織形成）
２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与した。投与７日間後に、安楽死させ、皮膚を剥離し、後肢の筋組織を採取した。また、対照として、ノテキシン非投与のマウスについても同様にして、後肢の筋組織を採取した。
採取した筋組織を４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク株式会社製）で２日間固定した後、エタノール脱水を行い、キシレンへ置換し、パラフィンで包埋した。回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製）を用いてパラフィン切片を作製し、定法に従いフォンコッサ染色又はアリザリンレッドＳ染色を施し、ＢＺ－９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）により筋損傷を評価した。
２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与した。投与７日間後に、安楽死させ、皮膚を剥離し、後肢の筋組織を採取した。また、対照として、ノテキシン非投与のマウスについても同様にして、後肢の筋組織を採取した。
採取した筋組織を４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク株式会社製）で２日間固定した後、エタノール脱水を行い、キシレンへ置換し、パラフィンで包埋した。回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製）を用いてパラフィン切片を作製し、定法に従いフォンコッサ染色又はアリザリンレッドＳ染色を施し、ＢＺ－９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）により筋損傷を評価した。
【0052】
結果を図４に示す。フォンコッサ染色はリン酸カルシウムを染色し、アリザリンレッドＳ染色はカルシウムを染色する。これらの染色像から、ノテキシン投与マウスでは、筋組織内にカルシウムの石灰化が認められた。
【0053】
（試験例４：異所性硬組織の成分解析）
２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与した。投与７日間後に、安楽死させ、皮膚を剥離し、後肢の筋組織を採取し、以下の解析の試料とした。また、対照として、ノテキシン非投与のマウスについても同様にして、後肢の筋組織を採取し、回収組織をアルコールに固定後に自然乾燥して、以下の解析の試料とした。
２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与した。投与７日間後に、安楽死させ、皮膚を剥離し、後肢の筋組織を採取し、以下の解析の試料とした。また、対照として、ノテキシン非投与のマウスについても同様にして、後肢の筋組織を採取し、回収組織をアルコールに固定後に自然乾燥して、以下の解析の試料とした。
【0054】
＜Ｘ線回折による解析＞
Ｘ線回折装置（ＭｉｎｉＦｌｅｘ ６００、株式会社リガク製）を用い、採取した筋組織中の石灰化物の結晶構造の分析を行った。Ｘ線には単色化されたＣｕＫα線（波長１．５４１８６２Å）を用い、Ｃｕ管球の電圧は４０ｋＶ、電流は１５ｍＡに設定した。スキャンスピードは１°／ｓｅｃ、ステップ幅は０．０２°に設定し、ホルダー上に固定した試料の回折Ｘ線を計測することで、Ｘ線回折（ＸＲＤ）パターンを得た。その際、計測の範囲は、２θ＝３°～６０°とした。
Ｘ線回折装置（ＭｉｎｉＦｌｅｘ ６００、株式会社リガク製）を用い、採取した筋組織中の石灰化物の結晶構造の分析を行った。Ｘ線には単色化されたＣｕＫα線（波長１．５４１８６２Å）を用い、Ｃｕ管球の電圧は４０ｋＶ、電流は１５ｍＡに設定した。スキャンスピードは１°／ｓｅｃ、ステップ幅は０．０２°に設定し、ホルダー上に固定した試料の回折Ｘ線を計測することで、Ｘ線回折（ＸＲＤ）パターンを得た。その際、計測の範囲は、２θ＝３°～６０°とした。
【0055】
非投与マウスの筋組織中の石灰化物のＸ線回折の結果を図５Ａに、ノテキシン投与マウスの筋組織中の石灰化物のＸ線回折の結果を図５Ｂに示す。ノテキシン投与マウスでは、ヒドロキシアパタイト結晶のピーク（図５Ｂ中、矢印で示すピーク）が確認され、石灰化物は、骨と同様のリン酸カルシウムのヒドロキシアパタイト結晶を含むことが分かった。一方、非投与マウスでは、筋組織中の石灰化物のＸ線回折において、ヒドロキシアパタイト結晶のピークは観察されなかった。
【0056】
＜走査電子顕微鏡による解析＞
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＪＳＭ－６３９０ＬＡ、日本電子株式会社製）を用い、採取した筋組織中の石灰化物の観察を行った。観察前には、カーボンテープ上に固定した試料をＡｕ－Ｐｄでコーティングした。ＳＥＭ観察における電子線の加速電圧は、１５ｋＶとした。また、観察された石灰化物の元素分析には、ＳＥＭ付属のエネルギー分散型Ｘ線分析装置（ＥＤＳ）を用いた。
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：ＪＳＭ－６３９０ＬＡ、日本電子株式会社製）を用い、採取した筋組織中の石灰化物の観察を行った。観察前には、カーボンテープ上に固定した試料をＡｕ－Ｐｄでコーティングした。ＳＥＭ観察における電子線の加速電圧は、１５ｋＶとした。また、観察された石灰化物の元素分析には、ＳＥＭ付属のエネルギー分散型Ｘ線分析装置（ＥＤＳ）を用いた。
【0057】
結果を図６に示す。ノテキシン投与マウスでは、筋組織内に、ヒドロキシアパタイトの結晶構造と認められる棒状の結晶構造が認められた。一方、非投与マウスでは、前記棒状の結晶構造は観察されなかった。
【0058】
（試験例５：異所性硬組織の組織解析）
骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ）の移植による異所性の骨組織と、ノテキシン投与マウスの筋組織の石灰化について、以下の方法で比較検討を行った。
骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ）の移植による異所性の骨組織と、ノテキシン投与マウスの筋組織の石灰化について、以下の方法で比較検討を行った。
【0059】
＜ＢＭＰ移植マウス＞
直径４ｍｍの円形状に切り取ったＣｏｌｌａ Ｔａｐｅ（登録商標）（ジンマー・バイオメット・デンタル合同会社製）に、２．０μｇのＢＭＰ－２（コアフロント株式会社製）を染み込ませ、凍結乾燥し、ＢＭＰ－２ペレットを作製した。１０週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）を、２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、大腿を切開し、ＢＭＰ－２ペレットを大腿筋に移植した。ＢＭＰ－２ペレットの移植から１４日間後に、安楽死させ、大腿筋を採取し、皮膚を剥離後、採取した筋組織を４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク株式会社製）で２日間固定した後、エタノール脱水を行い、キシレンへ置換し、パラフィンで包埋した。
直径４ｍｍの円形状に切り取ったＣｏｌｌａ Ｔａｐｅ（登録商標）（ジンマー・バイオメット・デンタル合同会社製）に、２．０μｇのＢＭＰ－２（コアフロント株式会社製）を染み込ませ、凍結乾燥し、ＢＭＰ－２ペレットを作製した。１０週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）を、２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、大腿を切開し、ＢＭＰ－２ペレットを大腿筋に移植した。ＢＭＰ－２ペレットの移植から１４日間後に、安楽死させ、大腿筋を採取し、皮膚を剥離後、採取した筋組織を４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク株式会社製）で２日間固定した後、エタノール脱水を行い、キシレンへ置換し、パラフィンで包埋した。
【0060】
＜ノテキシン投与マウス＞
９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシンを２００μＬ筋肉内に単回投与した。ノテキシンの投与から７日間後に、安楽死させ、皮膚を剥離し、後肢の筋組織を採取した。採取した筋組織を４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク株式会社製）で２日間固定した後、エタノール脱水を行い、キシレンへ置換し、パラフィンで包埋した。
９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシンを２００μＬ筋肉内に単回投与した。ノテキシンの投与から７日間後に、安楽死させ、皮膚を剥離し、後肢の筋組織を採取した。採取した筋組織を４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク株式会社製）で２日間固定した後、エタノール脱水を行い、キシレンへ置換し、パラフィンで包埋した。
【0061】
回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて、ＢＭＰ移植群及びノテキシン投与群のそれぞれのパラフィン切片を作製し、定法に従い、アリザリンレッドＳ染色、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色、及び酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色を実施し、ＢＺ－９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）で組織切片を観察した。
【0062】
結果を図７に示す。染色像から、ＢＭＰ－２で誘導した筋組織の異所性骨組織の周囲には、ＡＬＰ陽性の骨芽細胞及びＴＲＡＰ染色陽性の破骨細胞が認められた。一方、ノテキシン投与マウスの筋組織では、ＡＬＰ陽性の骨芽細胞及びＴＲＡＰ染色陽性の破骨細胞は観察されなかった。
骨では、骨形成の代謝回転（ターンオーバー）が行われることが知られており、まず、破骨細胞によって骨吸収が起こり、その後に骨芽細胞によって骨形成が行われる。ノテキシン投与マウスの筋組織では、骨芽細胞及び破骨細胞が観察されなかったことから、ノテキシン投与による筋組織中の石灰化物は、骨ではなく、ヒドロキシアパタイト結晶が物理的に析出した構造であると考えられた。
骨では、骨形成の代謝回転（ターンオーバー）が行われることが知られており、まず、破骨細胞によって骨吸収が起こり、その後に骨芽細胞によって骨形成が行われる。ノテキシン投与マウスの筋組織では、骨芽細胞及び破骨細胞が観察されなかったことから、ノテキシン投与による筋組織中の石灰化物は、骨ではなく、ヒドロキシアパタイト結晶が物理的に析出した構造であると考えられた。
【0063】
（試験例６－１：ノテキシン投与による炎症反応）
２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与し、１日間後、２日間後、又は３日間後に安楽死させ、皮膚を剥離し、後肢の筋組織を採取した。また、対照として、ノテキシン非投与のマウスについても同様に後肢の筋組織を採取した。
採取した筋組織を４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク株式会社製）で２日間固定した後、エタノール脱水を行い、キシレンへ置換し、パラフィンで包埋した。回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製）を用いてパラフィン切片を作製し、定法に従い、ＨＥ染色、フォンコッサ染色、又は組織免疫染色を行った。
２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与し、１日間後、２日間後、又は３日間後に安楽死させ、皮膚を剥離し、後肢の筋組織を採取した。また、対照として、ノテキシン非投与のマウスについても同様に後肢の筋組織を採取した。
採取した筋組織を４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク株式会社製）で２日間固定した後、エタノール脱水を行い、キシレンへ置換し、パラフィンで包埋した。回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製）を用いてパラフィン切片を作製し、定法に従い、ＨＥ染色、フォンコッサ染色、又は組織免疫染色を行った。
【0064】
組織免疫染色は、酵素ブロッキング用試薬（ＳＰ－６０００、ＶＥＣＴＯＲ製）を用いて、パラフィン切片の内因性のペルオキシダーゼを不活化処理した後、ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ Ｈｉｓｔｏ、ナカライテスク株式会社製）を用いて、非特異的吸着を抑制し、ＣＤ１１ｂ抗体（Ａｂｃａｍ社製）を４℃で一晩反応させた。ＣＤ１１ｂ抗体の検出には、二次抗体として、ＨＲＰ標識のＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（ＩｍｍＰＲＥＳＳ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＶＥＣＴＯＲ製）を使用した。またＤＡＢ（３，３’‐ジアミノベンジジン四塩酸塩）を用いて、二次抗体のＨＲＰを検出し、可視化した後、ＢＺ－９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）で観察を行った。
【0065】
結果を図８Ａに示す。ノテキシン投与から３日間後に、筋組織内に、フォンコッサ陽性のリン酸カルシウムの結晶が認められた。これと同時に、単球マクロファージのマーカーであるＣＤ１１ｂも筋組織内に出現した。
【0066】
（試験例６－２：ノテキシン投与による炎症反応）
２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与し、３日間後に安楽死させ、皮膚を剥離し、後肢の筋組織を採取した。また、対照として、ノテキシン非投与のマウスについても同様に後肢の筋組織を採取した。
採取した筋組織から、Ｎｕｃｌｅｏ Ｓｐｉｎ ＲＮＡ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを鋳型に、ＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ ＥｃｏＤｒｙ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。更に、得られたｃＤＮＡを鋳型として、下記プライマー及びＰｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を用いてＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ８００（タカラバイオ株式会社製）で定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を行い、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６のＲＮＡの発現量を定量化した。なお、各遺伝子のＲＮＡの発現量は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＲＮＡの発現量で補正した。
［プライマー］
－ＴＮＦ－α－
・ フォワード ： ＡＴＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＣＡＴＧＡ（配列番号：１）
・ リバース ： ＡＧＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＧＴＧＧＴ （配列番号：２）
－ＩＬ－６－
・ フォワード ： ＣＣＴＣＴＧＧＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣ（配列番号：３）
・ リバース ： ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号：４）
－ＧＡＰＤＨ－
・ Ｍｏｕｓｅ Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用。
２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与し、３日間後に安楽死させ、皮膚を剥離し、後肢の筋組織を採取した。また、対照として、ノテキシン非投与のマウスについても同様に後肢の筋組織を採取した。
採取した筋組織から、Ｎｕｃｌｅｏ Ｓｐｉｎ ＲＮＡ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを鋳型に、ＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ ＥｃｏＤｒｙ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。更に、得られたｃＤＮＡを鋳型として、下記プライマー及びＰｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を用いてＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ８００（タカラバイオ株式会社製）で定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を行い、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６のＲＮＡの発現量を定量化した。なお、各遺伝子のＲＮＡの発現量は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＲＮＡの発現量で補正した。
［プライマー］
－ＴＮＦ－α－
・ フォワード ： ＡＴＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＣＡＴＧＡ（配列番号：１）
・ リバース ： ＡＧＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＧＴＧＧＴ （配列番号：２）
－ＩＬ－６－
・ フォワード ： ＣＣＴＣＴＧＧＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣ（配列番号：３）
・ リバース ： ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号：４）
－ＧＡＰＤＨ－
・ Ｍｏｕｓｅ Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用。
【0067】
結果を図８Ｂに示す。ノテキシン投与から３日間後に、炎症性サイトカインであるＴＮＦ－α及びＩＬ－６のｍＲＮＡの発現量は、非投与と比較してノテキシン投与で１００倍程度上昇した。この炎症反応が、筋組織内でリン酸カルシウム結晶の析出を促す重要な機序と予想される。
【0068】
（試験例７：ノテキシン投与による異所性石灰化の持続性）
２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与した。同一個体の後肢を、ノテキシン投与前、ノテキシン投与から１週間後、３週間後、６ヶ月後、及び１６ヶ月後に、２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、マイクロＸ線ＣＴ（ＣｏｓｍｏＳｃａｎ ＧＸ、株式会社リガク製）を用い、筋組織を解析した。
２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、９週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア株式会社より入手）の後肢に２μｇ／ｍＬのノテキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）を２００μＬ筋肉内に単回投与した。同一個体の後肢を、ノテキシン投与前、ノテキシン投与から１週間後、３週間後、６ヶ月後、及び１６ヶ月後に、２体積％イソフルラン吸引麻酔下で、マイクロＸ線ＣＴ（ＣｏｓｍｏＳｃａｎ ＧＸ、株式会社リガク製）を用い、筋組織を解析した。
【0069】
結果を図９に示す。ノテキシン投与による異所性石灰化は、１年以上残存していた。
試験例４の結果より、筋組織内の石灰化物は、骨と同様のリン酸カルシウムのヒドロキシアパタイト結晶であるものの、試験例５の結果より、骨組織のように骨を吸収する破骨細胞が出願しないため、長期間に渡り生体内に残存するものと考えられた。
試験例４の結果より、筋組織内の石灰化物は、骨と同様のリン酸カルシウムのヒドロキシアパタイト結晶であるものの、試験例５の結果より、骨組織のように骨を吸収する破骨細胞が出願しないため、長期間に渡り生体内に残存するものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【0070】
本発明のモデル動物は、筋組織の病的な状態、例えば、遺伝性疾患、強い外傷、脳挫傷、火傷、人工関節周囲などにより誘導される筋組織中の石灰化の性状や、その形成メカニズム、生理的役割の解析などに利用可能である。また、本発明のモデル動物は、筋組織内に石灰化（異所性石灰化）を伴う様々な疾患、例えば、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）や石灰化（石灰沈着性）筋壊死（Ｃａｌｃｉｆｉｃ ｍｙｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）の病態モデルとして有用であり、更に、これらの疾患の発症機序の解明や、前記疾患の予防方法、治療方法、予防薬、治療薬などの開発への応用が期待できる。
また、本発明のモデル動物の製造方法は、筋組織内に高効率で石灰化物を誘導することができ、長期間安定なモデル動物の製造方法として好適に利用可能である。
更に、本発明の筋線維の石灰化剤は、筋組織内に石灰化物を有するモデル動物の作製や、インビトロでの培養細胞（例えば、筋芽細胞など）による筋線維での石灰化のメカニズムの解析に好適に用いることができる。また、筋組織内に石灰化（異所性石灰化）を伴う様々な疾患、の発症機序の解明や、前記疾患の予防方法、治療方法、予防薬、治療薬などの開発研究への応用が期待できる。
また、本発明のモデル動物の製造方法は、筋組織内に高効率で石灰化物を誘導することができ、長期間安定なモデル動物の製造方法として好適に利用可能である。
更に、本発明の筋線維の石灰化剤は、筋組織内に石灰化物を有するモデル動物の作製や、インビトロでの培養細胞（例えば、筋芽細胞など）による筋線維での石灰化のメカニズムの解析に好適に用いることができる。また、筋組織内に石灰化（異所性石灰化）を伴う様々な疾患、の発症機序の解明や、前記疾患の予防方法、治療方法、予防薬、治療薬などの開発研究への応用が期待できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【配列表】