特開 2023-36319 難消化性オリゴ糖の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023036319

(43)【公開日】2023-03-14

(54)【発明の名称】難消化性オリゴ糖の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/14 20060101AFI20230307BHJP

   C12P 19/04 20060101ALI20230307BHJP

   C07H 3/00 20060101ALI20230307BHJP

【ＦＩ】

C12P19/14 Z

C12P19/04 A

C07H3/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021143307

(22)【出願日】2021-09-02

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼ 集会の開催日 ２０２０年９月１０日 ▲２▼ 集会名、開催場所 ２０２０年度（第６９回）日本応用糖質科学会 応用糖質科学シンポジウム オンライン開催（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｊｓａｇ２０２０／ｓｔａｔｉｃ／ｏｎｌｉｎｅ）

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼ 集会の開催日 ２０２１年３月２０日 ▲２▼ 集会名、開催場所 日本農芸化学会２０２１年度大会 オンライン開催（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｓｂｂａ．ｏｒ．ｊｐ／２０２１／）

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼ ウェブサイトの掲載日 ２０２０年９月３日 ▲２▼ ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｊｓａｇ２０２０／ｎｏｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼ ウェブサイトの掲載日 ２０２１年３月５日 ▲２▼ ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｓｂｂａ．ｏｒ．ｊｐ／ＭｅｅｔｉｎｇｏｆＪＳＢＢＡ／２０２１／ＭｅｅｔｉｎｇｏｆＪＳＢＢＡ２０２１．ｐｄｆ

(71)【出願人】

【識別番号】598096991

【氏名又は名称】学校法人東京農業大学

(74)【代理人】

【識別番号】100122574

【弁理士】

【氏名又は名称】吉永 貴大

(72)【発明者】

【氏名】徳岡 昌文

【テーマコード（参考）】

4B064

4C057

【Ｆターム（参考）】

4B064AF04

4B064CA05

4B064CA21

4B064CE20

4B064DA01

4B064DA10

4B064DA20

4C057AA02

4C057BB01

(57)【要約】

【課題】消費者の心理的障害となる、熱処理や酵素処理などの人為的なグルコシド結合の形成過程を介さずに、穀物等原料そのものに由来する機能性（又は難消化性）オリゴ糖の調製方法を提供すること。
【解決手段】糖質原料を糊化することにより糊化澱粉を調製する工程と、前記糊化澱粉に酵素を添加して加水分解することにより加水分解物を調製する工程と、前記加水分解物を遠心分離して上澄み液を得る工程と、を有する難消化性オリゴ糖の製造方法により解決する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

糖質原料を糊化することにより糊化澱粉を調製する工程と、
前記糊化澱粉に酵素を添加して加水分解することにより加水分解物を調製する工程と、
前記加水分解物を遠心分離して上澄み液を得る工程と、
を有する難消化性オリゴ糖の製造方法。

【請求項2】

前記糖質原料が、澱粉である、請求項１記載の難消化性オリゴ糖の製造方法。

【請求項3】

前記糖質原料が、穀類、芋類、それらの加工品や加工品の副産物からなる群から選択された少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の難消化性オリゴ糖の製造方法。

【請求項4】

前記酵素が、αーアミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼである、請求項１～３のいずれか１項に記載の難消化性オリゴ糖の製造方法。

【請求項5】

前記酵素が、糸状菌由来の酵素である、請求項１～４のいずれか１項に記載の難消化性オリゴ糖の製造方法。

【請求項6】

前記酵素が、アスペルギルスオリゼ、アスペルギルスルーチュエンシス、リゾプスオリゼからなる群から選択された少なくとも１種を由来とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の難消化性オリゴ糖の製造方法。

【請求項7】

前記難消化性オリゴ糖が、下記式で表される構造を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の難消化性オリゴ糖の製造方法。

【化1】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糖質原料から難消化性オリゴ糖を製造する難消化性オリゴ糖の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

オリゴ糖とは重合度２から20程度の単糖の重合物であり、その構成糖や結合様式の違いから多様なオリゴ糖が存在する。

【0003】

近年、オリゴ糖は様々な生物活性を示すことが明らかとなっており、注目されている。特に各種加水分解酵素による消化性が低いことを特徴とする難消化性のオリゴ糖は、食生活の欧米化により問題となっている食物繊維の摂取量の減少の課題を解決する方法として注目されている。また、オリゴ糖は、健康維持と疾病予防に対して有効であるとされており、プレバイオティクスと言われる腸内微生物叢の改善効果や、低う蝕性の甘味料として利用されるほか、パンの品質維持への利用など、幅広く種々の飲食物に利用されている。

【0004】

これら難消化性オリゴ糖の製造は、澱粉を原料とした焙焼法や酵素法で製造されている。焙焼法は澱粉を一定の酸を含む条件で高熱処理することで、加水分解と重合を生じさせることで、複雑な分岐を形成させる方法であり、難消化性の糖が生成される。

【0005】

焙焼法で得たオリゴ糖は刺激臭があり、味覚上も好ましくない。しかし、それらをα－アミラーゼ処理、グルコアミラーゼ処理、トランスグルコシダーゼ処理、水素添加処理、イオン交換趣旨による脱塩やクロマト分離を行うことで除去することによる難消化性オリゴ糖の製造法がある（特許平２－１４５１６９号公報、特開平２－１５４６６４号公報）。

【0006】

一方で、酵素作用によりあらたなグルコシド結合を形成させることで、難消化性オリゴ糖をつくる方法も知られる。例えば、グルカノトランスフェラーゼを用いることで（α１→４）と（α１→６）のグルコシド結合を含むグルコオリゴ糖の混合物を製造する方法（特表２０１２－５２５８４０号公報）、耐熱性の糖転移酵素を用いることで（α１→２）（α１→３）結合を含むオリゴ糖を合成する方法（特開２０１１－１７７１１８号公報）などが知られる。

【0007】

その他、キシラン分解により得られるキシロオリゴ糖や、寒天を分解して得られるアガロオリゴ糖なども難消化性オリゴ糖として製造されているが、原料の入手が限られたり、分解に、用いる酵素が特殊で高価であったりすることが課題である。

【0008】

一方、穀類やイモ類から得られる澱粉は、夾雑物が少なく、異味、異臭、着色性がほとんど無く、しかも安価である。ただし、これら澱粉は消化性が良く、これらを原料とした難消化性オリゴ糖組成物を製造する方法はない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特許平２－１４５１６９号公報

【特許文献2】特開平２－１５４６６４号公報

【特許文献3】特表２０１２－５２５８４０号公報

【特許文献4】特開２０１１－１７７１１８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

広い分野に使用されているオリゴ糖であるが、口に入れるものである場合、特に消費者は天然物である方が心理的な障害が少なく、受け入れられやすい傾向がある。そのため、新たなグリコシド結合を形成させることで製造される難消化性オリゴ糖よりは、天然物に含まれるグリコシド結合を利用し、それを含むオリゴ糖を抽出する製造方法がより好ましい。

【0011】

また、現在の製造方法の一部には、原料の入手が困難であるなどの課題のほか、分岐形成に必要な酵素が高価な場合や入手困難である場合がある。

【0012】

そこで、本発明は、消費者の心理的障害となる、熱処理や酵素処理などの人為的なグルコシド結合の形成過程を介さずに、穀物等原料そのものに由来する機能性（又は難消化性）オリゴ糖の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者らは清酒中のオリゴ糖が特徴的な構造のオリゴ糖であることから清酒オリゴ糖として研究を行ってきた（Journal of Bioscience and Bioengineering 124(2)171-177）。重合度６～８のオリゴ糖の構造解析から、これらオリゴ糖の一部には、α－１，４結合の主鎖の非還元末端領域に隣接した２つのα－１，６結合の分岐が存在することを見出した。その１つであるＤＰ６－１の立体構造式を図１に示す。ＤＰ６－１は、イソマルトオリゴ糖やマルトオリゴ糖と比較して、グルコアミラーゼによる消化性が著しく低いことを発見した（Carbohydrate Polymers Volume 251, 1 January 2021, 116993）。

【0014】

このようなパターンの分岐構造を澱粉中から見出されていないことから、糖転移などの影響をしらべたものの、糖転移による生成ではなく、澱粉に含まれる隣接した分岐構造が米澱粉中に存在することを見出した。本分岐を非還元末端にもつ清酒オリゴ糖ＤＰ６－１は、難消化性であることから、焙炒や酵素による糖転移を介さずに、澱粉に本来含まれる分岐構造を抽出することで、難消化性のオリゴ糖を製造できると考えるに至った。さらに、幅広い穀物の澱粉に当該の分岐構造が含まれることを見出したことから、澱粉を含む様々な穀類から、難消化性のオリゴ糖を調製できる点にもメリットがあると考え、本発明を完成した。

【0015】

本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、糖質原料を糊化することにより糊化澱粉を調製する工程と、前記糊化澱粉に酵素を添加して加水分解することにより加水分解物を調製する工程と、前記加水分解物を遠心分離して上澄み液を得る工程と、を有する難消化性オリゴ糖の製造方法を提供するものである。

【発明の効果】

【0016】

本発明によれば、食習慣のある糖質原料を用いて、安全な難消化性オリゴ糖を低コストで製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明により製造された難消化性オリゴ糖の立体構造式である。

【図2】米の酵素分解物から抽出したオリゴ糖をＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳで分析した結果を示す図である。

【図3】図２のピークの化合物をカラム精製しNMR解析した結果を示す図である。

【図4】種々の糖質原料の酵素分解物から抽出したオリゴ糖をＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳで分析した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【実施例0018】

１．米のα－アミラーゼ消化およびグルコアミラーゼ消化
山田錦（精米歩合７０％）２０ｇをミキサーでよく粉砕後、２０ｍＭ酢酸緩衝液 （ｐＨ５．０）４００ｍＬに懸濁した。沸騰浴中で３０分間処理した後、３０分間オートクレーブ処理し、糊化状態にした。豚すい臓α－アミラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１，０００Ｕを添加し、２４時間、５５℃で消化後、グルコアミラーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ由来、東洋紡株式会社）４０Ｕを添加し、２４時間、４０℃で消化した。沸騰浴中に１０分間保つことで酵素を失活させた後、４℃、１０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心処理後、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターに通し試料とした。

【0019】

２．米澱粉由来オリゴ糖の精製
酵素消化試料にクロマトグラフ用活性炭３２ｇを加えてよく撹拌し、ブフナー漏斗を用いてろ紙（Ｎｏ．２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ）でろ過した後、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水２Ｌを加えて再度ろ過した。次に、５０％エタノール４００ｍＬを加えて溶出し、回収液をエバポレーターで２ｍＬに濃縮後、Ｓｈｏｄｅｘ ＨＩＬＩＣｐａｋ ＶＮ－５０ １０Ｅカラム（１０.０ｍｍ×２５０ｍｍ、粒径５μｍ、昭和電工株式会社）を用い、移動相７０％アセトニトリル、流速３．０ｍＬ／ｍｉｎのアイソクラティック溶出を４０℃で行った。試料導入量は５０μＬとし、フラクションコレクター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ＣＨＦ－１２２ＳＣ）により分取した。

【0020】

３．分析
（１）ＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳ分析
ＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳ分析には、アセトニトリルと等量混合したのち、０．４５μｍ孔のシリンジフィルターで処理した試料を用いた。

【0021】

ＨＰＬＣにはＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ） を用いた。カラムにはＳｈｏｄｅｘ ＨＩＬＩＣｐａｋ ＶＮ－５０ ４Ｄ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、粒径５μｍ、昭和電工株式会社） を用い、７０％アセトニトリルのアイソクラティック溶出を流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで行った。カラム温度は４０℃とした。ポストカラムで１５ｍＭ塩化リチウムを含む７５％アセトニトリルを、流速１μＬ／ｍｉｎで混合しＥＳＩに導入した。Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ２８０℃、ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｇａｓ ｆｌｏｗｓ ８００Ｌ／ｈ、ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ １．１ｋＶとし、検出質量範囲をｍ／ｚ＝５０-３，２００とした。

【0022】

ＴＯＦ／ＭＳにはＸｅｖｏＧ２－ＸＳ Ｑ－ＴＯＦ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。イオン化はＥＳＩによるポジティブモードを選択し、ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ６００℃、ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｇａｓ ｆｌｏｗｓ １，２００Ｌ／ｈ、ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅは３．０ｋＶとした。ＬＣ／ＭＳの操作とデータ解析にはＷａｔｅｒｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ Ｖ４．１を用い、ｓｃａｎ ｔｉｍｅは１ｓｅｃとし、検出質量範囲をｍ／ｚ＝５０-７００とした。ＥＩＣの作成の際のｍ／ｚは誤差範囲を±０．０５Ｄａとした。

【0023】

（２）ＮＭＲ解析
試料を重水（９９．８％）数ｍＬに溶解後、エバポレーターにより乾固させた。再度、この操作を行うことで、水酸基の水素を重水素に置換した。この試料を重水６５０μＬに溶解し、ＮＭＲ管（４．２２ｍｍ×１８０ｍｍ、株式会社シゲミ）に注入した。ＪＥＯＬ ＥＣＺ ６００Ｒ（日本電子株式会社）を用いて^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを測定した。内部標準物質としてアセトン（δ_Ｈ：２．２３ｐｐｍ、δ_ｃ：３０．５ｐｐｍ）を用いた。

【0024】

４．結果
山田錦より精製したオリゴ糖をＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳで分析したところ、清酒オリゴ糖ＤＰ６－１と溶出時間が一致する明瞭なピークが検出された（図２）。このピークの化合物をカラム精製し、ＮＭＲ解析したところ、清酒オリゴ糖ＤＰ６－１と一致する^１Ｈ－ＮＭＲスペクトラムが検出された（図３）。このことから、本化合物が清酒オリゴ糖ＤＰ６－１と同一の構造のオリゴ糖（図１）であることが示された。

【実施例0025】

１．様々な穀類由来澱粉からの隣接した分岐を含むオリゴ糖の抽出
試料として、試薬として市販されている、とうもろこし由来澱粉（富士フィルム和光純薬株式会社）、小麦由来澱粉（富士フィルム和光純薬株式会社）、ばれいしょ由来澱粉（富士フィルム和光純薬株式会社）、米由来澱粉（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。その他、タイ米（タイ国産）、α化米（飯田商事株式会社）、インディカ米としてタイ米（タイ国産）を粉砕したもの、及び、ジャポニカ米としてうるち米を粉砕した上新粉（新潟県産）、もち米粉（佐賀県産）を用いた。

【0026】

試料０．５ｇを２０ｍｌの２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁し、３０分間沸騰水中で処理した後、１２０℃３０分間オートクレーブにより処理し、直ちに４０℃の湯浴につけることで糊化澱粉を調製した。

【0027】

糊化澱粉試料を５Ｕの豚すい臓α－アミラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及び４０Ｕのグルコアミラーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ由来、東洋紡株式会社）により、４０℃、２４時間酵素処理し、その後沸騰水中で１０分間処理することで酵素反応を停止させた。その後、室温で１５，０００ｒｐｍで遠心処理し、上澄みを試料とした。

【0028】

２．分析
（１）ＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳ分析
ＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳ分析には、アセトニトリルと等量混合したのち、０．４５μｍ孔のシリンジフィルターで処理したものを用いた。

【0029】

ＨＰＬＣにはＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いた。カラムにはＳｈｏｄｅｘ ＨＩＬＩＣｐａｋ ＶＮ－５０ ４Ｄ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、粒径５μｍ、昭和電工株式会社）を用い、７０％アセトニトリルのアイソクラティック溶出を流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで行った。カラム温度は４０℃とした。ポストカラムで１５ｍＭ塩化リチウムを含む７５％アセトニトリルを、流速１μＬ／ｍｉｎで混合しＥＳＩに導入した。Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ２８０℃、ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｇａｓ ｆｌｏｗｓ ８００Ｌ／ｈ、ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ １．１ｋＶとし、検出質量範囲をｍ／ｚ＝５０-３，２００とした。

【0030】

ＴＯＦ／ＭＳにはＸｅｖｏＧ２－ＸＳ Ｑ－ＴＯＦ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。イオン化はＥＳＩによるポジティブモードを選択し、ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ６００℃、ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ ｇａｓ ｆｌｏｗｓ １，２００Ｌ／ｈ、ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅは３．０ｋＶとした。ＬＣ／ＭＳの操作とデータ解析にはＷａｔｅｒｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ Ｖ４．１を用い、ｓｃａｎ ｔｉｍｅは１ｓｅｃとし、検出質量範囲をｍ／ｚ＝５０-７００とした。ＥＩＣの作成の際のｍ／ｚは誤差範囲を±０．０５Ｄａとした。

【0031】

隣接した分岐を持つオリゴ糖である清酒オリゴ糖ＤＰ６－１との溶出時間の一致を確認するために、ＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳの分析の際は、試料の前後に、ＤＰ６－１を含む清酒試料を分析した。

【0032】

３．結果
マスクロマトグラムの比較（図４）より、とうもろこし由来澱粉とタイ米の試料において、清酒オリゴ糖ＤＰ６－１と溶出時間が異なるピークが検出されたことから、これら試料からは隣接した分岐を持つＤＰ６－１を抽出できなかったが、それ以外の穀類等の試料からは、ＤＰ６－１と一致する溶出時間のピークが検出された。したがって、米のみならず、小麦、ばれいしょといった穀類中にも隣接した分岐が存在し、その酵素分解物からは、その隣接した分岐を含む、難消化性のオリゴ糖が抽出できることが示された。