特開 2023-36648 遺伝子改変されたナチュラルキラー細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023036648

(43)【公開日】2023-03-14

(54)【発明の名称】遺伝子改変されたナチュラルキラー細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20230307BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230307BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230307BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230307BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230307BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20230307BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230307BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230307BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230307BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230307BHJP

   A61K 31/7076 20060101ALI20230307BHJP

   A61K 31/7068 20060101ALI20230307BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230307BHJP

   A61K 35/50 20150101ALI20230307BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20230307BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N5/0783

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12N15/867 Z

C12N15/12

C12N15/31

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/04

A61K35/17

A61K31/7076

A61K31/7068

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K35/50

A61K9/19

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022196025

(22)【出願日】2022-12-08

(62)【分割の表示】P 2019535369の分割

【原出願日】2017-12-28

(31)【優先権主張番号】62/440,909

(32)【優先日】2016-12-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】520169074

【氏名又は名称】セルラリティ インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100097456

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 徹

(72)【発明者】

【氏名】チャン，シャオクイ

(72)【発明者】

【氏名】イエ， キアン

(72)【発明者】

【氏名】リ，ティエンジィエン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，チュアン

(72)【発明者】

【氏名】バラサン，ミニ

(72)【発明者】

【氏名】ハーズバーグ，ユリ

(72)【発明者】

【氏名】ハリリ，ロバート，ジェイ．

(57)【要約】      （修正有）

【課題】遺伝子改変された（ＧＭ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＧＭＮＫ細胞の集団を産生する方法を提供する。また、腫瘍細胞の増殖を抑制するため、または病原体感染、例えば、ウイルス感染を阻害するために、ＧＭＮＫ細胞を使用する方法が提供される。
【解決手段】ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭＮＫ細胞は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／もしくは機能を欠き、またはＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／もしくは機能の低減を示す。ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭＮＫ細胞は、改変されたＣＤ１６を含む。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ナチュラルキラー細胞の集団であって、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ＮＫ阻害性
分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されてい
るナチュラルキラー細胞の集団。

【請求項2】

ＮＫ阻害性分子が、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択され
る１種または複数のＮＫ阻害性分子である、請求項１に記載の集団。

【請求項3】

遺伝子改変されたＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されて
いないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する、請求項１または２に記
載の集団。

【請求項4】

腫瘍細胞が、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部
癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ
腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺
癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞
腫細胞からなる群から選択される、請求項３に記載の集団。

【請求項5】

腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である、請求項４に記載の集団。

【請求項6】

固形腫瘍細胞が、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神
経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の集団。

【請求項7】

ＮＫ阻害性分子の発現が、ノックアウトされている、請求項１に記載の集団。

【請求項8】

ＮＫ阻害性分子の発現が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレ
アーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている、請求項７に記載
の集団。

【請求項9】

ＮＫ阻害性分子の発現が、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている、請
求項７に記載の集団。

【請求項10】

ＮＫ阻害性分子がＣＢＬＢである、請求項１または２に記載の集団。

【請求項11】

ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも
、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮ
Ｋ細胞の集団を生成する、請求項７から１０のいずれか一項に記載の集団。

【請求項12】

ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも
、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞
の集団を生成する、請求項７から１０のいずれか一項に記載の集団。

【請求項13】

脱顆粒が、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される、請求項１２に記載の集団。

【請求項14】

ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較
して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓ
ＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパーフォリンのうち
１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項７から１０のい
ずれか一項に記載の集団。

【請求項15】

ＮＫ阻害性分子がＮＫＧ２Ａである、請求項１または２に記載の集団。

【請求項16】

ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトが、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よ
りも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激
された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項１５から１９のい
ずれか一項に記載の集団。

【請求項17】

脱顆粒が、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される、請求項１６に記載の集団。

【請求項18】

ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトが、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と
比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、
ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を
有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項１６または１７に記載の集団。

【請求項19】

ＮＫ阻害性分子がＴＧＦＢＲ２である、請求項１または２に記載の集団。

【請求項20】

ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトが、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細
胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性
を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項１９に記載の集団。

【請求項21】

ナチュラルキラー細胞の集団であって、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、改変された
ＣＤ１６を含むように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団。

【請求項22】

改変されたＣＤ１６が、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する、請
求項２１に記載の集団。

【請求項23】

改変されたＣＤ１６が、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する、請求項２２に記載
の集団。

【請求項24】

改変されたＣＤ１６が、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である、請求項２１に記載の集
団。

【請求項25】

改変されたＣＤ１６が、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する、請求項２４に記
載の集団。

【請求項26】

改変されたＣＤ１６が、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する、請求項２１から２５のい
ずれか一項に記載の集団。

【請求項27】

改変されたＣＤ１６が、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する、請求項２１から２６の
いずれか一項に記載の集団。

【請求項28】

改変されたＣＤ１６が、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される、請求項２１から
２７のいずれか一項に記載の集団。

【請求項29】

改変されたＣＤ１６が、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞が
ＮＫ細胞に分化する、請求項２８に記載の集団。

【請求項30】

改変されたＣＤ１６が、レンチウイルスベクターを介して導入される、請求項２８から
２９に記載の集団。

【請求項31】

レンチウイルスベクターが、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する、
請求項３０に記載の集団。

【請求項32】

レンチウイルスベクターが、１種または複数の薬物選択マーカーを含む、請求項３０ま
たは３１に記載の集団。

【請求項33】

改変されたＣＤ１６が、レトロウイルスベクターを介して導入される、請求項２８また
は２９に記載の集団。

【請求項34】

レトロウイルスベクターが、１種または複数の薬物選択マーカーを含む、請求項３３に
記載の集団。

【請求項35】

ＮＫ細胞が、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である、請求項１から３４のいずれか一項に記載
の集団。

【請求項36】

腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、腫瘍細胞を、請求項１から３５または５５か
ら５９のいずれか一項に記載の集団に由来するナチュラルキラー細胞と接触させることを
含む方法。

【請求項37】

前記接触が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記接触が、ｉｎ ｖｉｖｏで起こる、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

前記接触が、ヒト個体、好ましくは、抗癌療法を受けるように選択された個体において
起こる、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与することを含む、請求項３９に記載の方法
。

【請求項41】

前記腫瘍細胞が、多発性骨髄腫細胞である、請求項３６から４０のいずれかに記載の方
法。

【請求項42】

前記腫瘍細胞が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である、請求項３６から４０のいず
れかに記載の方法。

【請求項43】

前記個体が、再発性／難治性ＡＭＬを有する、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記個体が、ＡＭＬに対する少なくとも１種の非自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）治療が
失敗しているＡＭＬを有する、請求項４２に記載の方法。

【請求項45】

前記個体が、６５歳以上であり、最初の寛解中である、請求項４０に記載の方法。

【請求項46】

前記個体が、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前にフルダラビン、シタラビンまた
は両方を用いてコンディショニングされている、請求項４０から４５のいずれかに記載の
方法。

【請求項47】

腫瘍細胞が、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部
癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ
腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺
癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞
腫細胞からなる群から選択される、請求項４０から４６のいずれかに記載の方法。

【請求項48】

腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である、請求項４０から４７のいずれかに記載の集団。

【請求項49】

固形腫瘍細胞が、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神
経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される、請求項４８に記載の集団。前記ナチ
ュラルキラー細胞が、抗ＣＤ３３抗体とともに投与される、請求項４０から４９のいずれ
か一項に記載の方法。

【請求項50】

前記ナチュラルキラー細胞が、抗ＣＤ２０抗体とともに投与される、請求項４０から４
９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記ナチュラルキラー細胞が、抗ＣＤ１３８抗体とともに投与される、請求項４０から
４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記ナチュラルキラー細胞が、抗ＣＤ３８抗体とともに投与される、請求項４０から４
９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記ナチュラルキラー細胞が、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されている
、請求項３６から５３のいずれかに記載の方法。

【請求項54】

前記ナチュラルキラー細胞が、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されていな
い、請求項３６から５３のいずれかに記載の方法。

【請求項55】

ナチュラルキラー細胞が、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＣＤ１１７^＋ＣＤ１１ａ^＋であり、パー
フォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およ
びＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない、請求項１から５４のいずれか一項に記
載の集団。

【請求項56】

前記ナチュラルキラー細胞が、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、
アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない、請求項５５に記載の集
団。

【請求項57】

前記ナチュラルキラー細胞が、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および
／またはＮＫＧ２Ｄをさらに発現する、請求項５５または５６に記載の集団。

【請求項58】

前記ナチュラルキラー細胞が、ＣＤ９４を発現する、請求項５５から５７のいずれか一
項に記載の集団。

【請求項59】

前記ナチュラルキラー細胞が、ＣＤ９４を発現しない、請求項５５から５７のいずれか
一項に記載の集団。

【請求項60】

胎盤またはその一部に由来し、それによって胎盤由来ＮＫ細胞（ｐＮＫ細胞）を含むナ
チュラルキラー細胞の集団であって、ｐＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、また
はＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞
の集団。

【請求項61】

ＮＫ阻害性分子が、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択され
る１種または複数のＮＫ阻害性分子である、請求項６０に記載の集団。

【請求項62】

遺伝子改変されたＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されて
いないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する、請求項６０または６１
に記載の集団。

【請求項63】

腫瘍細胞が、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部
癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ
腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺
癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞
腫細胞からなる群から選択される、請求項６２に記載の集団。

【請求項64】

腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である、請求項６２に記載の集団。

【請求項65】

固形腫瘍細胞が、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神
経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される、請求項６４に記載の集団。

【請求項66】

ＮＫ阻害性分子の発現が、ノックアウトされている、請求項６０に記載の集団。

【請求項67】

ＮＫ阻害性分子の発現が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレ
アーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている、請求項６６に記
載の集団。

【請求項68】

ＮＫ阻害性分子の発現が、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている、請
求項６６に記載の集団。

【請求項69】

ＮＫ阻害性分子が、ＣＢＬＢである、請求項６０または６１に記載の集団。

【請求項70】

ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも
、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮ
Ｋ細胞の集団を生成する、請求項６９に記載の集団。

【請求項71】

ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも
、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞
の集団を生成する、請求項６９に記載の集団。

【請求項72】

脱顆粒が、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される、請求項７１に記載の集団。

【請求項73】

ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較
して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓ
ＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリ
ンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項６９か
ら７２のいずれか一項に記載の集団。

【請求項74】

ＮＫ阻害性分子が、ＮＫＧ２Ａである、請求項６０または６１に記載の集団。

【請求項75】

ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトが、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よ
りも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激
された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項７４に記載の集団
。

【請求項76】

脱顆粒が、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される、請求項７５に記載の集団。

【請求項77】

ＣＤ１０７ａの増大が、ＦＡＣｓによって測定される、請求項７６に記載の集団。

【請求項78】

ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトが、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞、
例えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ
１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンの
うち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する、請求項７４から７
７のいずれか一項に記載の集団。

【請求項79】

胎盤由来ナチュラルキラー細胞（ｐＮＫ）の集団であって、ｐＮＫ細胞が、改変された
ＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている胎盤由来ナチュラルキラー細胞（ｐＮＫ）の
集団。

【請求項80】

改変されたＣＤ１６が、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する、請
求項７９に記載の集団。

【請求項81】

改変されたＣＤ１６が、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する、請求項８０に記載
の集団。

【請求項82】

改変されたＣＤ１６が、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である、請求項７９に記載の集
団。

【請求項83】

ＣＤ１６が、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する、請求項８２に記載の集団。

【請求項84】

改変されたＣＤ１６が、ＩｇＫシグナルペプチドまたはＣＤ１６シグナルペプチドを含
有する、請求項７９から８３のいずれか一項に記載の集団。

【請求項85】

改変されたＣＤ１６が、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される、請求項７９から
８４のいずれか一項に記載の集団。

【請求項86】

改変されたＣＤ１６が、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞が
ＮＫ細胞に分化する、請求項８５に記載の集団。

【請求項87】

改変されたＣＤ１６が、レンチウイルスベクターを介して導入される、請求項８５また
は８６に記載の集団。

【請求項88】

レンチウイルスベクターが、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する、
請求項８７に記載の集団。

【請求項89】

レンチウイルスベクターが、１種または複数の薬物選択マーカーを含む、請求項８５ま
たは８６に記載の集団。

【請求項90】

選択マーカーが、ＰｕｒｏＲ遺伝子、ＺｅｏＲ遺伝子、ＨｙｇｒｏＲ遺伝子、ｎｅｏＲ
遺伝子および／またはブラストサイジン耐性遺伝子などの選択剤に対する耐性を付与する
タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項８９に記載の集団。

【請求項91】

改変されたＣＤ１６が、レトロウイルスベクターを介して導入される、請求項８５また
は８６に記載の集団。

【請求項92】

レトロウイルスベクターが、１種または複数の薬物選択マーカーを含む、請求項９１に
記載の集団。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

任意の優先出願の参照による組込み
本願は、２０１６年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／４４０，９０９
号の優先権の利益を主張する。前記の出願の全開示内容は、その全文が参照により本明細
書に明確に組み込まれる。

【0002】

Ｉ．分野
遺伝子改変（遺伝子組み換え）された（ＧＭ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＧ
Ｍ ＮＫ細胞を含む細胞集団を産生する方法が、本明細書に記載される。また、例えば、
腫瘍細胞の増殖を抑制するため、病原体感染、例えば、細菌感染もしくはウイルス感染を
調節するため、または病原体感染、例えば、細菌感染もしくはウイルス感染を阻害するた
めに、ＧＭ ＮＫ細胞を含むこれらの細胞集団を使用する方法も開示される。ある特定の
代替法では、ＧＭ ＮＫ細胞を含む細胞の集団は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしく
はＴＧＦＢＲ２の発現を欠き、ならびに／またはＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくは
ＴＧＦＢＲ２の発現および／もしくは機能の低減を示す。ある特定の代替法では、細胞集
団は、改変されたＣＤ１６を含むＧＭ ＮＫ細胞を含む。

【背景技術】

【0003】

ＩＩ．背景
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の主構成成分を構成する細胞傷害性リン
パ球である。

【0004】

ＮＫ細胞は、インターフェロンまたはマクロファージ由来サイトカインに応答して活性
化される。ＮＫ細胞の細胞傷害性活性は、「活性化受容体」または「阻害性受容体」と考
えられ得る２種類の表面受容体によって高度に調節されるが、いくつかの受容体、例えば
、ＣＤ９４および２Ｂ４（ＣＤ２４４）は、リガンド相互作用に応じていずれかの方法で
働く。

【0005】

ＮＫ細胞は、その他の活性の中でも、腫瘍の宿主拒絶において役割を果たし、ウイルス
感染細胞を死滅させることができるとわかっている。ナチュラルキラー細胞は、主要組織
適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質を欠く、またはその低減したレベルを示す細胞によって
活性化され得る。自己クラスＩ ＭＨＣ発現のレベルが変更されたまたは低減した癌細胞
は、ＮＫ細胞感受性の誘導をもたらし得る。末梢血由来の活性化および増殖されたＮＫ細
胞、いくつかの場合には、ＬＡＫ細胞は、進行癌を有する患者のｅｘ ｖｉｖｏ療法およ
びｉｎ ｖｉｖｏ治療の両方において使用されており、骨髄関連疾患、例えば、白血病、
乳癌および特定の種類のリンパ腫に対して一部成功している。改変ＮＫ細胞を開発するた
めのさらなるアプローチが必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際特許出願公開ＷＯ２０１６／１０９６６１

【特許文献2】米国特許第８，２６３，０６５号

【特許文献3】米国特許出願公開第２０１１／０２８０８４９号

【特許文献4】米国特許出願公開第２０１５／０３６６９１０号

【特許文献5】米国特許第８，９２６，９６４号

【特許文献6】米国特許出願公開第２０１５／０２２５６９７号

【特許文献7】国際特許公開ＷＯ２０１６／１０９６６８

【特許文献8】米国特許第７，９４８，１７１号

【特許文献9】米国特許第７，４６８，２７６号

【特許文献10】米国特許第８，０５７，７８８号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、２００５、Ｂｌｏｏｄ １０５：３０５１－３０５７

【非特許文献2】ルブニッツ（Ｒｕｂｎｉｔｚ）ら、２０１０、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２８：９５５－９５９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

ＩＩＩ．概要
遺伝子改変された（ＧＭ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、例えば、ヒトＮＫ細胞、Ｇ
Ｍ ＮＫ細胞を含む細胞の集団を産生する方法ならびに例えば、腫瘍細胞の増殖を抑制す
るため、病原体感染（例えば、細菌感染もしくはウイルス感染）を調節するため、または
病原体感染、例えば、細菌感染もしくはウイルス感染を阻害するために本明細書に記載さ
れるＧＭ ＮＫ細胞またはＧＭ ＮＫ細胞を含む細胞の集団を使用する方法が、本明細書
に記載される。

【課題を解決するための手段】

【0009】

いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の
低減を示すように遺伝子改変されているＮＫ細胞の集団が提供される。いくつかの代替法
では、ＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現を調節する、またはＮＫ阻害性分子の発現を阻
害するように遺伝子改変されている。例えば、いくつかの代替法では、本明細書において
提供される改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現レベルに関して改変されていな
いＮＫ細胞（このような細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現以外の点で天然に存在する細胞か
ら改変されていてもよいが、「非改変細胞」と本明細書において呼ばれる）よりも低いレ
ベルで、１種または複数のＮＫ阻害性分子を発現するように遺伝子改変されているＮＫ細
胞を含む細胞の集団を含む。ＮＫ阻害性分子のレベルが比較される非改変細胞は、例えば
、天然に存在するＮＫ細胞または本明細書に記載されるものなどの方法を使用して得られ
、天然に存在しないＮＫ細胞であり得る。ある特定の代替法では、調節された、低減され
たまたはヌルレベルで発現されるＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／また
はＴＧＦＢＲ２である。

【0010】

ある特定の代替法では、ＮＫ細胞において調節された、低減されたまたはヌルレベルで
発現されるＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけ
るＣＢＬＢ発現は、ノックアウトされている。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞における
ＣＢＬＢ発現は、ゲノム編集（遺伝子編集）技術によって、例えば、ＣＲＩＳＰＲまたは
ＣＲＩＳＰＲ関連技術を使用することなどによってノックアウトされている。ある特定の
代替法では、ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢの発現を低減も
しくは排除するように遺伝子改変されていない天然に存在するＮＫ細胞または天然に存在
しないＮＫ細胞であり得る、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも腫瘍細
胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞の集団またはＮＫ細胞を含む細胞の集団を生成
する。特定の代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。特定の代替法では、腫
瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞
である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。特定の代替法では、腫
瘍細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｈ
Ｌ６０細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＫＧ１細胞である。ある特定の代替
法では、ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされ
ていない非改変ＮＫ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞よりも高いＩＦＮγ分泌を有
するＮＫ細胞の集団を生成する。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢ発現
のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも高い脱顆粒を有
するＮＫ細胞の集団を生成する。特定の代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増加によ
って測定される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢ発現のノックアウト
は、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性Ｃ
Ｄ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフ
ォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。ある特定
の代替法では、ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウ
トされていないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、
可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまた
はパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。

【0011】

ある特定の代替法では、ＮＫ細胞を含む細胞の集団において発現が調節または低減され
るＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ノ
ックアウトされている。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ＣＲＩＳＰＲまたは
ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。ある特定の代替法では、ＮＫ細
胞におけるＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮ
Ｋ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞よりも腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する
ＮＫ細胞を含む細胞の集団を生成する。特定の代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細
胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。特定の代替法
では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細
胞である。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、
ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細
胞の集団を生成する。ある特定の代替法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアゴニストＮＫＧ２Ａ
抗体の存在下でＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激されたＮＫ細胞から分泌された
ＩＦＮγを測定する。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ａ発現のノック
アウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも高い脱顆粒を有するＮ
Ｋ細胞の集団を生成する。特定の代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増加によって測
定される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、
ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ
１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォ
リンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。本明細書に
おけるいくつかの代替法では、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａノックア
ウトを有さない未処理細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、細胞毒性の最
大３倍またはそれより多い増大を有する。

【0012】

ある特定の代替法では、ＮＫ細胞を含む細胞の集団において発現が調節または低減され
るＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞を含む細胞
の集団においてＴＧＦＢＲ２発現がノックアウトされている。ある特定の代替法では、Ｔ
ＧＦＢＲ２発現は、ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされ
ている。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞におけるＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、
ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細
胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対して耐性である細胞の集団を生成する。特定の代
替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰ
ＭＩ８２２６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｋ５６２細胞である。特定の
代替法では、腫瘍細胞は、ＨＬ－６０細胞である。

【0013】

ある特定の代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、改変されたＣＤ１６、例え
ば、改変されたＣＤ１６ａを含むように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集
団が提供される。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりも
ＩｇＧに対して高い親和性を有する、例えば、改変されたＣＤ１６ａは、野生型ＣＤ１６
ａよりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１
６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣ
Ｄ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。ある特定の代替法では、ＣＤ１６は、
ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１
６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴ
ＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷ
ＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶ
ＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴ
ＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮ
ＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡ
ＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１
）を有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを
含有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを
含む。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に
導入される。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血
細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。ある特定の代替法では、改変さ
れたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。ある特定の代替法では、
レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。あ
る特定の代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを
含む。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して
導入される。ある特定の代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物
選択マーカーを含む。

【0014】

腫瘍細胞を、本明細書に記載されるように調製された、遺伝子改変されたナチュラルキ
ラー細胞の１種または複数の集団と接触させることを含む、腫瘍細胞の増殖を抑制する方
法が本明細書に記載される。ある特定の代替法では、前記接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで起
こる。ある特定の代替法では、前記接触は、ｉｎ ｖｉｖｏで起こる。ある特定の代替法
では、前記接触は、ヒト個体において起こる。ある特定の代替法では、ヒト個体は、癌療
法を必要とするものとして選択または同定される。ある特定の代替法では、前記方法は、
前記ナチュラルキラー細胞を前記の選択または同定された個体に投与することを含む。あ
る特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。ある特定の代替法では
、前記腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。ある特定の代替法では、前
記個体は、再発性／難治性ＡＭＬを有する。ある特定の代替法では、前記個体は、ＡＭＬ
に対する少なくとも１種の非自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）治療が失敗しているＡＭＬを
有する。ある特定の代替法では、前記個体は、６５歳以上であり、最初の寛解中である。
ある特定の代替法では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前にフルダラ
ビン、シタラビンまたは両方を用いてコンディショニングされている。ある特定の代替法
では、前記腫瘍細胞は、乳癌細胞、頭頸部癌細胞または肉腫細胞である。ある特定の代替
法では、前記腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性
骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ
）細胞、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直
腸腺癌細胞および／または網膜芽細胞腫細胞である。ある特定の代替法では、前記腫瘍細
胞は、固形腫瘍細胞である。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞であ
る。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、肺腫瘍細胞である。ある特定の代替法では
、前記腫瘍細胞は、膵臓腫瘍細胞である。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、腎腫
瘍細胞である。ある特定の代替法では、前記腫瘍細胞は、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞
である。

【0015】

ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３３抗体と併せて投与さ
れる。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ２０抗体と併せて投
与される。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ１３８抗体と併
せて投与される。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３８抗体
と併せて投与される。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３２
抗体と併せて投与される。

【0016】

ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に先立
って凍結保存されている。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記接
触または前記投与に先立って凍結保存されていない。

【0017】

ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＣＤ１１７
^＋ＣＤ１１ａ^＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、
アリール炭化水素受容体および／またはＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。
ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよび／またはＥＯ
ＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体および／またはＩＬ１Ｒ１のいず
れも発現しない。ある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞はさらに、Ｔ－ｂｅ
ｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および／またはＮＫＧ２Ｄを発現する。ある特定
の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。ある特定の代替法で
は、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。

【0018】

第１の態様において、ナチュラルキラー細胞の集団であって、ナチュラルキラー（ＮＫ
）細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すよう
に遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法で
は、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択さ
れる１種または複数のＮＫ阻害性分子である。いくつかの代替法では、遺伝子改変された
ＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトされていないまたは低減されていない
ＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する。いくつかの代替法では、腫瘍
細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞
、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞
、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞
、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞
からなる群から選択される。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。
いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎
腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。いくつかの代
替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、
ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレア
ーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法
では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている
。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、
ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、
ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ
細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬ
ＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺
激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では
、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ
発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発
性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７
）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパーフォリンのうち１種または
複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害
性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは
、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の
存在下で、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有する
ＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によ
って測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａ
がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓ
ＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリ
ンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代
替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ
２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して
、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性を有するＮＫ
細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、改変
されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、改変された
ＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いくつかの代替
法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。いくつかの
代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。いくつかの
代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。いく
つかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。いくつ
かの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつ
かの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞中に導入される
。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞中に導
入され、造血細胞は、次いで、ＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変された
ＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レン
チウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１ａプロモーターのいずれかを有する。いくつ
かの代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む
。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入
される。いくつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択
マーカーを含む。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。
いくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３－ＣＤ１１７＋ＣＤ
１１ａ＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリー
ル炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替
法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲ
γｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。いくつかの代替
法では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０
および／またはＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキ
ラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は
、ＣＤ９４を発現しない。

【0019】

第２の態様において、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、腫瘍細胞を、本明細書
におけるナチュラルキラー細胞の代替集団のいずれか１つの集団に由来するナチュラルキ
ラー細胞と接触させることを含む方法が提供される。いくつかの代替法では、ナチュラル
キラー（ＮＫ）細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低
減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつ
かの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる
群から選択される１種または複数のＮＫ阻害性分子である。いくつかの代替法では、遺伝
子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されていない
ＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する。いくつかの代替法では、腫瘍
細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞
、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞
、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞
、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞
からなる群から選択される。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。
いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎
腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。いくつかの代
替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、
ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレア
ーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法
では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている
。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、
ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、
ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ
細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬ
ＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺
激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では
、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ
発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発
性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７
）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパーフォリンのうち１種または
複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害
性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは
、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の
存在下でＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮ
Ｋ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によっ
て測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａが
ノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣ
Ｄ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリン
のうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替
法では、ＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２
発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、
腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性を有するＮＫ細
胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、改変さ
れたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、改変されたＣ
Ｄ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いくつかの代替法
では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。いくつかの代
替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。いくつかの代
替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。いくつ
かの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。いくつか
の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつか
の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。い
くつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され
、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は
、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルス
ベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法
では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつか
の代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。い
くつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを
含む。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いくつかの
代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３－ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋で
あり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素
受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前
記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリ
ール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。いくつかの代替法では、前
記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および／ま
たはＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は
、ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４
を発現しない。方法のいくつかの代替法では、前記接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる。
方法のいくつかの代替法では、前記接触は、ｉｎ ｖｉｖｏで起こる。方法のいくつかの
代替法では、前記接触は、ヒト個体、好ましくは、抗癌療法を受けるように選択された個
体において起こる。方法のいくつかの代替法では、前記方法は、前記ナチュラルキラー細
胞を前記個体に投与することを含む。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、多
発性骨髄腫細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、急性骨髄性白血
病（ＡＭＬ）細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、再発性／難治性Ａ
ＭＬを有する。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、ＡＭＬに対する少なくとも１
種の非自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）治療が失敗しているＡＭＬを有する。方法のいくつ
かの代替法では、前記個体は、６５歳以上であり、最初の寛解中である。方法のいくつか
の代替法では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前にフルダラビン、シ
タラビンまたは両方を用いてコンディショニングされている。方法のいくつかの代替法で
は、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸
部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リン
パ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸
腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細
胞腫細胞からなる群から選択される。方法のいくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫
瘍細胞である。方法のいくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細
胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択
される。方法のいくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３３抗体ととも
に投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ２０
抗体とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、
抗ＣＤ１３８抗体とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキ
ラー細胞は、抗ＣＤ３８抗体とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナ
チュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されている。方法の
いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に先立っ
て凍結保存されていない。

【0020】

第３の態様では、胎盤またはその一部に由来し、それによって胎盤由来ＮＫ細胞（ｐＮ
Ｋ細胞）を含むナチュラルキラー細胞の集団であって、ｐＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の
発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチ
ュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢ
ＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻
害性分子である。いくつかの代替法では、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子
の発現がノックアウトまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細
胞毒性を有する。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白
血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急
性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発
性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細
胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。いくつかの代
替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、
肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）
細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノッ
クアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／
ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによっ
てノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳ
ＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子
は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢ
がノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激
された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法
では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よ
りも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ
細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって
測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノック
アウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、Ｇ
Ｍ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、
ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細
胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。い
くつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａがノックアウトされ
ていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ－１およびＭ
ＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いく
つかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替
法では、ＣＤ１０７ａの増大は、ＦＡＣｓによって測定される。いくつかの代替法では、
ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞、例
えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１
３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのう
ち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。

【0021】

第４の態様では、胎盤由来ナチュラルキラー細胞（ｐＮＫ）の集団であって、ｐＮＫ細
胞は、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、
改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いく
つかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。
いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。
いくつかの代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。いく
つかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドまたはＣＤ１６シグ
ナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染
を介してＮＫ細胞に導入される。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイル
ス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの
代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いく
つかの代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのい
ずれかを有する。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の
薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、選択マーカーは、ＰｕｒｏＲ遺伝子、
ＺｅｏＲ遺伝子、ＨｙｇｒｏＲ遺伝子、ｎｅｏＲ遺伝子および／またはブラストサイジン
耐性遺伝子などの選択剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。
いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入さ
れる。いくつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マ
ーカーを含む。

【図面の簡単な説明】

【0022】

ＩＶ．図面の簡単な説明

【図1A】ＧＭ ＮＫ細胞におけるＣＢＬＢノックアウト効率を示す図である。

【図1B】ＧＭ ＮＫ細胞におけるノックアウト後の増殖倍数を示す図である。

【図2A】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３４／３５日目のＲＰＭＩ８２２６ならびにＣＢＬＢ－ノックアウト（四角）のＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。

【図2B】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３４／３５日目のＵ２６６ならびにＣＢＬＢ－ノックアウト（四角）のＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。

【図2C】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３４／３５日目のＡＲＨ７７細胞に対する未処理（菱形）ならびにＣＢＬＢ－ノックアウト（四角）のＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。

【図3A】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３段階プロセスの３４／３５日目の（３Ａ）ＲＰＭＩ８２２６ならびにＣＢＬＢ^－ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。

【図3B】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＵ２６６ならびにＣＢＬＢ^－ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。

【図3C】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＡＲＨ７７細胞に対する未処理（菱形）ならびにＣＢＬＢ^－ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。

【図4A】ＨＬ－６０細胞に対する未処理（ＮＴ）ならびにＣＢＬＢ^－ノックアウト（ＣＢＬＢ ＫＯ）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。

【図4B】ＫＧ１細胞に対する未処理（ＮＴ）ならびにＣＢＬＢ^－ノックアウト（ＣＢＬＢ ＫＯ）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。

【図5A】１．２５μｇ／ｍｌのＩＣＡＭ－１の存在下で種々の量における主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連鎖Ａ（ＭＩＣＡ）刺激の際の、未処理（右）およびＣＢＬＢ^－ノックアウト（左）３段階ＮＫ細胞のＩＦＮ－γ分泌アッセイを示す図である。

【図5B】１．２５μｇ／ｍｌのＩＣＡＭ－１の存在下で種々の量における主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連鎖Ａ（ＭＩＣＡ）刺激の際の、未処理（右）およびＣＢＬＢ^－ノックアウト（左）３段階ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ／脱顆粒アッセイを示す図である。

【図6A】ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫ細胞の、ＲＰＭＩ８２２６との同時インキュベーションの間に分泌されたサイトカインのレベルを、未処理３段階ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌のパーセンテージとして表す図である。

【図6B】ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫ細胞の、Ｕ２６６との同時インキュベーションの間に分泌されたサイトカインのレベルを、未処理３段階ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌のパーセンテージとして表す図である。

【図6C】ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫ細胞の、ＡＲＨ７７細胞との同時インキュベーションの間に分泌されたサイトカインのレベルを、未処理３段階ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌のパーセンテージとして表す図である。

【図7】ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫプロセスの模式図である。

【図8】－１日または－５日にブスルファンを用いた、３段階ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞または未処理ＮＫ細胞の投与後７日のＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの脾臓、骨髄（ＢＭ）、血液、肝臓、肺における、および合計のヒトＣＤ４５^＋細胞の数を示す図である。

【図9】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫ細胞または未処理ＮＫ細胞の投与後１４日のＮＳＧマウスの脾臓、ＢＭ、血液、肝臓、肺における、および合計のヒトＣＤ４５^＋細胞の数を示す図である。

【図10】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫ細胞または未処理ＮＫ細胞の投与後２１日のＮＳＧマウスの脾臓、ＢＭ、血液、肝臓、肺における、および合計のヒトＣＤ４５^＋細胞の数を示す図である。

【図11A】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日の脾臓におけるＣＤ５６^＋ＣＤ１１ａ^＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。

【図11B】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日の肝臓におけるＣＤ５６^＋ＣＤ１１ａ^＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。

【図11C】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日の骨髄におけるＣＤ５６^＋ＣＤ１１ａ^＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。

【図11D】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日の肺におけるＣＤ５６^＋ＣＤ１１ａ^＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。

【図12A】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの脾臓におけるＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。

【図12B】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの肝臓におけるＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。

【図12C】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの骨髄におけるＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。

【図12D】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの肺におけるＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。

【図13A】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの脾臓におけるＣＤ５６^＋ＣＤ１５８ｂ１、ｂ２、ｊ^＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。

【図13B】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの肝臓におけるＣＤ５６^＋ＣＤ１５８ｂ１、ｂ２、ｊ^＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。

【図13C】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの骨髄におけるＣＤ５６^＋ＣＤ１５８ｂ１、ｂ２、ｊ^＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。

【図13D】－１日または－５日にブスルファンを用いた、ＣＢＬＢノックアウトまたは未処理を用いる投与後７、１４および２１日のＮＳＧマウスの肺におけるＣＤ５６^＋ＣＤ１５８ｂ１、ｂ２、ｊ^＋３段階ＮＫ細胞パーセントを示す図である。

【図14A】Ｋ５６２に対する、ＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、単離され、精製された３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウトまたは対照の細胞毒性を示す図である。対照は低パーセントキラーとして示される。

【図14B】ＨＬ６０細胞に対する、ＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、単離され、精製された３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウトまたは対照の細胞毒性を示す図である。対照は低パーセントキラーとして示される。

【図15A】Ｋ５６２細胞、ＨＬ６０細胞と同時インキュベートされた、または細胞を伴わないＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、単離され、精製された３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のＧＭ－ＣＳＦ分泌を示す図である。

【図15B】Ｋ５６２細胞、ＨＬ６０細胞と同時インキュベートされた、または細胞を伴わないＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、単離され、精製された３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のＩＦＮ－γ分泌を示す図である。

【図15C】Ｋ５６２細胞、ＨＬ６０細胞と同時インキュベートされた、または細胞を伴わないＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、単離され、精製された３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のｓＣＤ１３７分泌を示す図である。

【図15D】Ｋ５６２細胞、ＨＬ６０細胞と同時インキュベートされた、または細胞を伴わないＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、単離され、精製された３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のＴＮＦα分泌を示す図である。

【図16A】２種のＡＭＬ患者異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍細胞とともに同時培養されたＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のＧＭ－ＣＳＦ分泌を示す図である。

【図16B】２種のＡＭＬ患者異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍細胞とともに同時培養されたＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のＩＦＮ－γ分泌を示す図である。

【図16C】２種のＡＭＬ患者異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍細胞とともに同時培養されたＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のｓＣＤ１３７分泌を示す図である。

【図16D】２種のＡＭＬ患者異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍細胞とともに同時培養されたＮＳＧマウス由来の投与後１４日の、３段階ＮＫ細胞、ＣＢＬＢノックアウト（右）または対照（左）のＴＮＦα分泌を示す図である。

【図17A】ＮＫＧ２ＡノックアウトＧＭ ＮＫ効率を示す図である。

【図17B】ノックアウト後の増殖倍数を示す図である。

【図18A】種々のＥ：Ｔ比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＫ５６２細胞に対する、未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ－ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。

【図18B】種々のＥ：Ｔ比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＲＰＭＩ８２２６細胞に対する、未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ－ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。

【図18C】種々のＥ：Ｔ比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＵ２６６細胞に対する、未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ－ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。

【図18D】種々のＥ：Ｔ比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＡＲＨ７７細胞に対する、未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ－ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。

【図19A】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＲＰＭＩ８２２６細胞に対する未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ－ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。

【図19B】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＵ２６６細胞に対する未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ－ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。

【図19C】２０：１、１０：１および５：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における、３段階プロセスの３４／３５日目のＡＲＨ７７細胞に対する未処理（菱形）およびＮＫＧ２Ａ－ノックアウト（四角）３段階ＮＫ細胞の相対細胞毒性を示す図である。

【図20】１．２５μｇ／ｍｌのＩＣＡＭ－１および５μｇ／ｍｌのＭＩＣＡのすべて存在下での、ＮＫＧ２Ａ抗体を用いる野生型３段階ＮＫ細胞（四角）、ＮＫＧ２Ａ抗体を用いるＮＫＧ２Ａノックアウト３段階ＮＫ細胞（三角）、ＩｇＧを用いる野生型３段階ＮＫ細胞（丸）およびＩｇＧを用いるＮＫＧ２Ａノックアウト３段階ＮＫ細胞（菱形）のＣＤ１０７ａ（プレートに結合された）アッセイ結果を示す図である。

【図21A】未処理３段階ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌のパーセンテージとして表される、ＮＫＧ２Ａノックアウト３段階ＮＫ細胞のＲＰＭＩ８２２６細胞との同時インキュベーションの間に分泌されたサイトカインのレベルを示す図である。

【図21B】未処理３段階ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌のパーセンテージとして表される、ＮＫＧ２Ａノックアウト３段階ＮＫ細胞のＵ２６６細胞との同時インキュベーションの間に分泌されたサイトカインのレベルを示す図である。

【図21C】未処理３段階ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌のパーセンテージとして表される、ＮＫＧ２Ａノックアウト３段階ＮＫ細胞のＡＲＨ７７細胞との同時インキュベーションの間に分泌されたサイトカインのレベルを示す図である。

【図22】５日目（四角）対１０日目（×ｓ）での、トランスフェクションの際の３５日の３段階ＮＫプロセスの間のＴＧＦＢＲ２ノックアウトのノックアウト効率を示す図である。

【図23A】アッセイの４８時間前の２０ｎｇ／ｍＬ（四角）または４０ｎｇ／ｍＬ（三角）のＴＧＦ－β１を用いる処置の際の、または未処理のままの（菱形）、種々のＥ：Ｔ比における、３段階ＮＫ細胞対腫瘍細胞株、対照ＮＫ対Ｋ５６２の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。

【図23B】アッセイの４８時間前の２０ｎｇ／ｍＬ（四角）または４０ｎｇ／ｍＬ（三角）のＴＧＦ－β１を用いる処置の際の、または未処理のままの（菱形）、種々のＥ：Ｔ比における、３段階ＮＫ細胞対腫瘍細胞株、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト対Ｋ５６２の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。

【図23C】アッセイの４８時間前の２０ｎｇ／ｍＬ（四角）または４０ｎｇ／ｍＬ（三角）のＴＧＦ－β１を用いる処置の際の、または未処理のままの（菱形）、種々のＥ：Ｔ比における、３段階ＮＫ細胞対腫瘍細胞株、対照ＮＫ対ＲＰＭＩ８２２６の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。

【図23D】アッセイの４８時間前の２０ｎｇ／ｍＬ（四角）または４０ｎｇ／ｍＬ（三角）のＴＧＦ－β１を用いる処置の際の、または未処理のままの（菱形）、種々のＥ：Ｔ比における、３段階ＮＫ細胞対腫瘍細胞株、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト対ＲＰＭＩ８２２６の細胞毒性（死滅パーセントによって測定されるような）を示す図である。

【図24A】対照細胞対ＨＬ６０細胞の、ＴＧＦ－β１の不在下（上側の線）または存在下（下側の線）での４時間細胞毒性アッセイを示す図である。

【図24B】ＴＧＦＢＲ２ノックアウト細胞対ＨＬ６０細胞の、ＴＧＦ－β１の不在下（上側の線）または存在下（下側の線）での４時間細胞毒性アッセイを示す図である。

【図24C】対照細胞対Ｋ５６２細胞の、ＴＧＦ－β１の不在下（上側の線）または存在下（下側の線）での４時間細胞毒性アッセイを示す図である。

【図24D】ＴＧＦＢＲ２ノックアウト細胞対Ｋ５６２細胞の、ＴＧＦ－β１の不在下（上側の線）または存在下（下側の線）での４時間細胞毒性アッセイを示す図である。

【図25】未処理またはＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞の培養の間の３段階ＮＫ細胞におけるＣＤ１６発現の持続を示す図である。

【図26A】未処理のまま（上側の線）またはＣＤ１６ＶＰを用いて形質導入された（下側の線）３段階ＮＫ細胞の増殖倍数を示す図である。

【図26B】未処理（左）またはＣＤ１６ＶＰが形質導入された（右）細胞の、３５日のうちの３３日目の３段階ＮＫ培養のマーカー発現を示す図である。

【図27A】Ｄａｕｄｉ細胞に対する４時間ＡＤＣＣアッセイにおける抗ＣＤ２０抗体の存在下でのＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞のＡＤＣＣ平均特異的死滅を示す図である。

【図27B】Ｄａｕｄｉ細胞に対する４時間ＡＤＣＣアッセイにおける抗ＣＤ３８抗体の存在下でのＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞のＡＤＣＣ平均特異的死滅を示す図である。

【図28A】種々の条件下での４時間ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞のＩＦＮ－γ分泌を示す図である。

【図28B】種々の条件下での４時間ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞のＧＭ－ＣＳＦ分泌を示す図である。

【図28C】種々の条件下での４時間ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞のＴＮＦ－α分泌を示す図である。

【図29】偽トランスフェクション（菱形、９５５．８９）、ＴＧＦＢＲ２単一ノックアウト（四角、３８０）、ＣＢＬＢ単一ノックアウト（三角、５００．１７５）およびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウト（×ｓ、３２２．６９）を示す、二重ノックアウト３段階ＧＭ ＮＫの増殖倍数を示す図である。

【図30A】ＴＧＦβ処置の存在下におけるＨＬ６０に対する二重ノックアウト３段階ＧＭ ＮＫのエフェクター機能を示す図である。

【図30B】ＴＧＦβ処置の不在下におけるＨＬ６０に対する二重ノックアウト３段階ＧＭ ＮＫのエフェクター機能を示す図である。

【図31A】ＴＧＦβ処置の存在下でのＫ５６２に対する二重ノックアウト３段階ＧＭ ＮＫのエフェクター機能を示す図である。

【図31B】ＴＧＦβ処置の不在下でのＫ５６２に対する二重ノックアウト３段階ＧＭ ＮＫのエフェクター機能を示す図である。

【図32A】ＴＧＦβ処置の存在または不在下、およびＫ５６２、ＨＬ６０、ＲＰＭＩまたはＫＧ１細胞の存在下で、ＮＫ細胞のＧＭ－ＣＳＦ分泌を示す図である。棒は、左から右に、偽トランスフェクトされたもの、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト、ＣＢＬＢノックアウトおよびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウトの分泌を示す。

【図32B】ＴＧＦβ処置の存在または不在下、およびＫ５６２、ＨＬ６０、ＲＰＭＩまたはＫＧ１細胞の存在下で、ＮＫ細胞のｓＣＤ１３７分泌を示す図である。棒は、左から右に、偽トランスフェクトされたもの、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト、ＣＢＬＢノックアウトおよびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウトの分泌を示す。

【図32C】ＴＧＦβ処置の存在または不在下、およびＫ５６２、ＨＬ６０、ＲＰＭＩまたはＫＧ１細胞の存在下で、ＮＫ細胞のＩＦＮ－γ分泌を示す図である。棒は、左から右に、偽トランスフェクトされたもの、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト、ＣＢＬＢノックアウトおよびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウトの分泌を示す。

【図32D】ＴＧＦβ処置の存在または不在下、およびＫ５６２、ＨＬ６０、ＲＰＭＩまたはＫＧ１細胞の存在下で、ＮＫ細胞のＴＮＦ－α分泌を示す図である。棒は、左から右に、偽トランスフェクトされたもの、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト、ＣＢＬＢノックアウトおよびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウトの分泌を示す。

【図32E】ＴＧＦβ処置の存在または不在下、およびＫ５６２、ＨＬ６０、ＲＰＭＩまたはＫＧ１細胞の存在下で、ＮＫ細胞のパーフォリン分泌を示す図である。棒は、左から右に、偽トランスフェクトされたもの、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト、ＣＢＬＢノックアウトおよびＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウトの分泌を示す。

【図33】ＣＤ１６形質導入効率を示す図である。ＣＤ３４細胞の形質導入は、種々の条件を試験して最適化した。レンチウイルス形質導入は、７０％を超える（８人の異なるドナー（９２番～９９番）から得られた細胞について４３～８１％）中央値形質導入効率を達成するように、６００ｇで５日目に１００ＭＯＩで１×形質導入で最適化した。

【図34】８人の異なるドナー（９２番～９９番）から得られた細胞のＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰ増殖結果を示す図である。

【図35】８人の異なるドナー（９２番～９９番）から得られた細胞の増殖後ＰＮＫ－ＣＤ１６ＣＰ表現型データを示す図である。

【図35Cont.1】８人の異なるドナー（９２番～９９番）から得られた細胞の増殖後ＰＮＫ－ＣＤ１６ＣＰ表現型データを示す図である。

【図35Cont.2】８人の異なるドナー（９２番～９９番）から得られた細胞の増殖後ＰＮＫ－ＣＤ１６ＣＰ表現型データを示す図である。

【図36】８人の異なるドナー（９２番～９９番）から得られた細胞のＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰ構築物検証データを示す図である。左のパネルに示されるように、上側の線は、ＣＤ１６ＶＰのデータであり、下側の線は、ＰＮＫ－ＮＴのものである。右パネルの棒グラフでは、ＰＭＡによる活性化の６つの棒の順序は、以下の通りである：未処理、ＰＭＡ処理、ＰＭＡ＋ａ－ＴＡＣＥ Ｄ１（Ａ１２）未処理、ＰＭＡ処理およびＰＭＡ＋ａ－ＴＡＣＥ Ｄ１（Ａ１２）。ＡＤＣＣによる活性化のデータを示す棒グラフでは、６つの棒の順序は、Ｄａｕｄｉコーティングされていない、Ｄａｕｄｉ＋ＩｇＧ、Ｄａｕｄｉ＋ａ－ＣＤ３８、Ｄａｕｄｉコーティングされていない、Ｄａｕｄｉ＋ＩｇＧおよびＤａｕｄｉ＋ａ－ＣＤ３８である。

【図36Cont.】８人の異なるドナー（９２番～９９番）から得られた細胞のＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰ構築物検証データを示す図である。左のパネルに示されるように、上側の線は、ＣＤ１６ＶＰのデータであり、下側の線は、ＰＮＫ－ＮＴのものである。右パネルの棒グラフでは、ＰＭＡによる活性化の６つの棒の順序は、以下の通りである：未処理、ＰＭＡ処理、ＰＭＡ＋ａ－ＴＡＣＥ Ｄ１（Ａ１２）未処理、ＰＭＡ処理およびＰＭＡ＋ａ－ＴＡＣＥ Ｄ１（Ａ１２）。ＡＤＣＣによる活性化のデータを示す棒グラフでは、６つの棒の順序は、Ｄａｕｄｉコーティングされていない、Ｄａｕｄｉ＋ＩｇＧ、Ｄａｕｄｉ＋ａ－ＣＤ３８、Ｄａｕｄｉコーティングされていない、Ｄａｕｄｉ＋ＩｇＧおよびＤａｕｄｉ＋ａ－ＣＤ３８である。

【図37】８人の異なるドナー（９２番～９９番）から得られた細胞のＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰ ＡＤＣＣ機能を示すデータを示す図である。示されるように、ＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰは、ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ３１９を用いた場合の、Ｄａｕｄｉに対するＡＤＣＣの改善を示した。

【図37Cont.】８人の異なるドナー（９２番～９９番）から得られた細胞のＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰ ＡＤＣＣ機能を示すデータを示す図である。示されるように、ＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰは、ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ３１９を用いた場合の、Ｄａｕｄｉに対するＡＤＣＣの改善を示した。

【発明を実施するための形態】

【0023】

Ｖ．技術用語
以下の説明では、用語は、明細書に照らして読まれる場合にその平易で普通の意味を与
えられるべきである。当業者ならば、明細書全体を考慮して使用されるように用語を理解
するであろう。

【0024】

本明細書において使用されるように、用語「免疫調節性化合物」および「ＩＭｉＤ（商
標）」は、サリドマイドを包含しない。

【0025】

「遺伝子改変する」は、明細書に照らして読まれる場合にその平易で普通の意味を有し
、それだけには限らないが、例えば、遺伝子工学技術を使用して変更されている核酸など
の遺伝物質を用いて、細菌などの生物または細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などのリンパ球
、細菌細胞、真核細胞、昆虫、植物または哺乳動物を改変するプロセスを含み得る。例え
ば、分子クローニング方法を使用して対象の遺伝物質をまず単離およびコピーしてＤＮＡ
配列を生成することによって、またはＤＮＡを合成することによって、次いで、この構築
物を宿主生物中に挿入することによってＤＮＡなどの核酸を宿主ゲノム中に挿入できる。
遺伝子および遺伝子発現はまた、ゲノム編集を使用して除去または「ノックアウト」でき
る。当業者ならば、遺伝子をノックアウトする多数の技術を理解できる。制限されるもの
ではないが、遺伝子および／または遺伝子発現は、例えば、ＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲま
たはＴＡＬＥＮを使用する技術を用いてノックアウトできる。遺伝子ターゲティングは、
相同組換えを使用して内因性遺伝子を変化させる異なる技術であり、遺伝子を欠失させ、
エキソンを除去し、遺伝子を付加し、または点突然変異を導入するために使用できる。

【0026】

形質導入によって実施された遺伝子改変が本明細書に記載されている。「形質導入」は
、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らな
いが、例えば、ベクターによって、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの遺伝物質を細胞に
導入する方法を含み得る。一般的な技術は、ウイルスベクター、エレクトロポレーション
および細胞透過性を増大するための化学試薬を使用する。ＤＮＡは、ウイルスによって、
またはウイルスベクターを介して導入することができる。本明細書に記載されるように、
免疫細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞を改変する方法が提供される。ウイルスベクタ
ーは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスおよびレンチウ
イルスに由来し得る。

【0027】

送達のために組換え感染性ウイルス粒子を利用する種々の形質導入技術が開発されてい
る。これは、細胞の形質導入への現在好ましいアプローチに相当する。形質導入ために使
用してもよいウイルスベクターとして、サルウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴
ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスに由来するウイルス
ベクターを挙げることができる。したがって、遺伝子導入および発現方法は多数あるが、
本質的に、哺乳動物細胞において遺伝物質を導入し発現するように機能する。リン酸カル
シウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、および組
換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクタ
ーによる感染を含む、上記の技術のうちいくつかを、細胞を形質導入するために使用でき
る。リンパ球は、エレクトロポレーションによって、およびレトロウイルスまたはレンチ
ウイルス感染によって成功裏に形質導入されている。そのようなものとして、レトロウイ
ルスおよびレンチウイルスベクターは、真核細胞における遺伝子導入のための高度に効率
的な方法を提供し得る。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターは、Ｔ細胞および
ＮＫ細胞などのリンパ球への遺伝子導入のための高度に効率的な方法を提供する。さらに
、レトロウイルスまたはレンチウイルス組み込みは、制御された様式で起こり、細胞あた
り新規遺伝情報の１つまたは２、３コピーの安定な組み込みをもたらす。

【0028】

「ゲノム編集」は、明細書に照らして読まれる場合にその平易で普通の意味を有し、そ
れだけには限らないが、例えば、ヌクレアーゼまたは操作されたヌクレアーゼ（単数また
は複数）を使用して生物のゲノムにおいてＤＮＡが挿入、欠失または置き換えられる遺伝
子工学の種類を含み得る。制限されるものではないが、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／
ＣＡＳ９システムのもの、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼ
であり得る。ヌクレアーゼは、遺伝子座または核酸配列上の標的化された遺伝子座を標的
とするために使用できる。

【0029】

「ＴＡＬＥＮ」または「転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ」は、明細書
に照らして読まれる場合にその平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例え
ば、ＤＮＡの特定の配列を切断するように操作され得る制限酵素を含み得る。それらは、
ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌ
クレアーゼ）と融合することによって作製される。転写アクチベーター様エフェクター（
ＴＡＬＥ）は、任意の所望のＤＮＡ配列と実際に結合するように操作することができ、そ
のため、ヌクレアーゼと組み合わされた場合に、ＤＮＡを特定の位置で切断できる。制限
酵素は、ゲノム編集において使用するために、またはｉｎ ｓｉｔｕでのゲノム編集、操
作されたヌクレアーゼを用いるゲノム編集として知られる技術のために細胞中に導入する
ことができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と並んで、
ＴＡＬＥＮは、ゲノム編集の分野において卓越したツールである。これらのヌクレアーゼ
は、遺伝子を「ノックアウト」するために使用してもよい。

【0030】

「ＣＲＩＳＰＲ」（クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅ
ｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉ
ｃ ｒｅｐｅａｔｓ））は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を
有し、それだけには限らないが、例えば、塩基配列の短い反復を含有する原核生物ＤＮＡ
のセグメントを含み得る。各反復に、細菌ウイルスまたはプラスミドに対する先の曝露に
由来する「スペーサーＤＮＡ」の短いセグメントが続く。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
は、プラスミドおよびファージなどの外来遺伝要素に対する耐性を付与する原核生物の免
疫系であり、獲得免疫性の一形態を提供する。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核生物にお
けるＲＮＡｉと同様の方法でこれらの外因性遺伝要素を認識し、切断する。ＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓシステムは、生命の樹を通して種においてゲノム編集（特定の遺伝子の配列の付
加、破壊または変更）および遺伝子調節のために使用されている。Ｃａｓ９タンパク質お
よび適当なガイドＲＮＡを細胞中に送達することによって、生物のゲノムを任意の所望の
位置で切断できる。当業者ならば、集団全体のゲノムを変更可能な、ＲＮＡによってガイ
ドされるゲノム編集ツールを構築するためのＣＲＩＳＰＲの使用を理解し得る。

【0031】

「レナリドミド」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し
、それだけには限らないが、例えば、３－（４’アミノイソインドリン－１’－オン）－
１－ピペリジン－２，６－ジオン（ケミカル・アブストラクツ・サービス（Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ）名）または２，６－ピペリジンジオン，３
－（４－アミノ－１，３－ジヒドロ－１－オキソ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－
（国際純粋・応用化学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｒｅ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（ＩＵＰＡＣ）名）を含み得る。本明
細書において使用されるように、「ポマリドミド」は、４－アミノ－２－（２，６－ジオ
キソピペリジン－３－イル）イソインドール－１，３－ジオンを意味する。

【0032】

「複能性」とは、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、そ
れだけには限らないが、例えば、細胞に言及する場合には、別の細胞種の細胞に分化する
能力を有する細胞を挙げることができ、意味する。ある特定の代替法では、「複能性細胞
」は、哺乳動物の身体のおよそ２６０細胞種のサブセットに成長する能力を有する細胞で
ある。多能性細胞とは異なり、複能性細胞は、すべての細胞種を形成する能力は有さない
。

【0033】

「フィーダー細胞」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有
し、それだけには限らないが、例えば、第２の種類の細胞が維持され、おそらくは増殖す
ることができる環境を提供するために、第２の種類の細胞と同時培養されるある種の細胞
を含み得る。いずれかの理論に捉われようとは思わないが、フィーダー細胞は、標的細胞
に、例えば、ペプチド、ポリペプチド、電気的シグナル、有機分子（例えば、ステロイド
）、核酸分子、成長因子（例えば、ｂＦＧＦ）、その他の因子（例えば、サイトカイン）
および代謝的栄養素を提供し得る。ある特定の代替法では、フィーダー細胞は、単層で成
長する。

【0034】

「ナチュラルキラー細胞」または「ＮＫ細胞」は、明細書に照らして読まれる場合に、
その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、任意の組織供給源に由
来するナチュラルキラー細胞を挙げることができ、本明細書に記載されるものなどの方法
を使用して産生されるナチュラルキラー細胞を含む。

【0035】

「胎盤灌流液」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、
それだけには限らないが、例えば、胎盤、例えば、ヒト胎盤の少なくとも一部を通って、
例えば、胎盤脈管構造を通って通過した灌流溶液を挙げることができ、胎盤を通る通過の
際に灌流溶液によって集められる複数の細胞を含む。

【0036】

「胎盤灌流液細胞」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有
し、それだけには限らないが、例えば、有核細胞、例えば、胎盤灌流液から単離された、
またはそれから単離可能な総有核細胞を含み得る。

【0037】

「腫瘍細胞抑制」、「腫瘍細胞増殖の抑制」などは、明細書に照らして読まれる場合に
、その平易で普通の意味を有し、それだけには限らないが、例えば、本明細書に記載され
る３段階法を使用して産生されたＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団を、腫瘍細胞の集団と接触
させることまたは近接させること、例えば、腫瘍細胞の集団を、本明細書に記載される３
段階法を使用して産生されたＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団と接触させることによって、例
えば、腫瘍細胞の前記集団中の１種または複数の腫瘍細胞を死滅させることによる、例え
ば、腫瘍細胞の集団の成長の減速を含み得る。ある特定の代替法では、前記接触は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで起こる。その他の代替法では、前記接触は、ｉｎ ｖｉｖｏで起こる。

【0038】

「造血細胞」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、そ
れだけには限らないが、例えば、造血幹細胞および造血前駆体細胞を含み得る。

【0039】

「ＣＢＬＢ」、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ｃａｓｉｔａｓ Ｂリンパ系リンパ腫ｂ）は
、Ｔ細胞活性化の負のレギュレーターである。本明細書に記載されるいくつかの代替法で
は、ナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が提供され、これでは、ナチュラルキラー（
ＮＫ）細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示す
ように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、Ｔ細胞活性化
の負のレギュレーターである。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢであ
る。

【0040】

「ＮＫＧ２Ａ」は、ＮＫ細胞およびＣＤ８^＋Ｔリンパ球のサブセットの表面で主に発現
されるＣ型レクチン受容体の一形態である。これらの受容体は、ＮＫ細胞の細胞傷害性活
性を刺激または阻害し、したがって、それらはその機能に従って活性化および阻害性受容
体にわけられる。本明細書に記載されるいくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞を
含む細胞の集団が提供される、これでは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＮＫ阻害性
分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されてい
る。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、Ｃ型レクチン受容体の一形態である。い
くつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。本明細書におけるいくつか
の代替法では、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、天然に存在するＮＫ細胞などのＮＫ
Ｇ２Ａノックアウトを有さない未処理細胞との比較において細胞毒性において最大３倍ま
たはそれより多い増大を有する。

【0041】

「ＴＧＦＢＲ２」は、ＴＧＦベータ受容体である。本明細書に記載されるいくつかの代
替法では、ナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が提供され、ここでナチュラルキラー
（ＮＫ）細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示
すように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、このＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦ
ＢＲ２である。

【0042】

「ＣＤ１６」は、免疫細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球多形核白血球、単
球およびマクロファージの表面で見られる低い親和性Ｆｃ受容体である。

【0043】

「ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７」（ＡＤＡＭ１７）は、ＴＡＣＥとしても
知られ、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼのＡＤＡＭタンパク質ファミリー
に属する酵素である。ＡＤＡＭは、ＴＮＦ－αのプロセシングに関与し得る。本明細書に
おけるいくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が提供され、ここ
で、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、改変されたまたは突然変異体ＣＤ１６を含むよう
に遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、改変されたまたは突然変異体ＣＤ１６
は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。

【0044】

「薬物選択マーカー」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を
有し、ベクターを受け取っている、選択マーカーを有する宿主細胞の同定または選択を促
進するために選択マーカーを含み得る。制限するものではないが、選択マーカーは、選択
剤、例えば、ＰｕｒｏＲ遺伝子、ＺｅｏＲ遺伝子、ＨｙｇｒｏＲ遺伝子、ｎｅｏＲ遺伝子
および／またはブラストサイジン耐性遺伝子に対する耐性を付与するタンパク質をコード
する遺伝子を含み得る。

【0045】

「未定義の構成成分」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を
有し、それだけには限らないが、例えば、成分が一般に提供されていない、または定量化
されていない構成成分を含み得る。「未定義の構成成分」の例として、制限するものでは
ないが、血清、例えば、ヒト血清（例えば、ヒト血清ＡＢ）および胎児血清（例えば、ウ
シ胎児血清またはウシ胎児血清）が挙げられる。

【0046】

本明細書において、「＋」とは、特定の細胞性マーカーの存在を示すために使用される
場合には、細胞性マーカーがアイソタイプ対照を上回って蛍光活性化セルソーターにおい
て検出可能に存在し、定量的または半定量的ＲＴ－ＰＣＲにおいてバックグラウンドを上
回って検出可能であることを意味する。

【0047】

本明細書において、「－」とは、特定の細胞性マーカーの存在を示すために使用される
場合には、細胞性マーカーがアイソタイプ対照を上回って蛍光活性化セルソーターにおい
て検出可能に存在せず、定量的または半定量的ＲＴ－ＰＣＲにおいてバックグラウンドを
上回って検出可能ではないことを意味する。

【0048】

「胎盤由来ＮＫ細胞」またはｐＮＫ細胞は、明細書に照らして読まれる場合に、その平
易で普通の意味を有し、分娩後胎盤および臍帯由来のＮＫ細胞を含み得る。ｐＮＫ細胞の
プロセシングに先立って、ドナー適格性は、血清学、細菌学およびＨＬＡタイピングなど
の一連の試験によって行われる。単離は、当業者によって滅菌条件下で実施される。

【0049】

「発現される」は、明細書に照らして読まれる場合に、その平易で普通の意味を有し、
それだけには限らないが、例えば、特定の細胞性マーカーの存在を示すためを含むことが
でき、細胞性マーカーが、当業者に公知のタンパク質または核酸の存在を検出する技術を
使用して、検出可能に存在する、またはバックグラウンドを上回って検出可能に存在する
ことを意味する。本明細書において、「発現されない」、または「発現を欠く」、などは
、特定の細胞性マーカーの存在を示すために使用される場合には、細胞性マーカーが、当
業者に公知のタンパク質または核酸の存在を検出する技術を使用して、検出可能に存在し
ない、またはバックグラウンドを上回って検出可能ではないことを意味する。

【0050】

本明細書において、「機能を欠く」、「機能しない」、などは、特定の機能の存在を示
すために使用される場合には、機能が、当技術分野で公知の前記機能を検出するための標
準アッセイを使用して、検出可能に存在しない、またはバックグラウンドを上回って検出
可能ではないことを意味する。

【0051】

ＶＩ．詳細な説明
腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を死滅させるＮＫ細胞の有利な特性にもかかわらず、
殺腫瘍性機能を保持するナチュラルキラー細胞を産生および増殖させる効率的な方法を開
発する必要性が当技術分野において依然としてある。

【0052】

ＮＫ細胞は、自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）である。自然リンパ系細胞は、発達のために
転写因子ＩＤ２に対するその依存性によって関連している。

【0053】

遺伝子改変された（ＧＭ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団、ＧＭ ＮＫ細胞の集
団を産生する方法およびＧＭ ＮＫ細胞を使用する方法が、本明細書において提供される
。

【0054】

１．ＮＫ阻害性分子の発現が変更されたＧＭ ＮＫ細胞
ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ ＮＫ細胞は、ＣＢＬＢ、Ｎ
ＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／もしくは機能を欠く、または天然
に存在するＮＫ細胞もしくは非改変ＮＫ細胞対照と比較して、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよ
び／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／もしくは機能の低減を示す。ＣＢＬＢ、ＮＫＧ
２ＡおよびＴＧＦＢＲ２の遺伝子配列は当業者に公知であり、例示的配列が本明細書に記
載されている。当業者に公知の標準技術を使用して、本明細書に記載される配列を改変で
きる。

【0055】

ＣＢＬＢ（Ｃａｓｉｔａｓ Ｂリンパ系リンパ腫原癌遺伝子Ｂ）は、ＲＴＫ、ＣＤ２８
、ＣＴＬＡ４およびＴＧＦｂシグナル伝達経路の下流に作用し、免疫性および耐性の間の
バランスを維持する細胞内タンパク質である。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｑ１３１
９１．２は、例示的ヒトＣＢＬＢアミノ酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託
番号ＮＭ＿００１３２１７８８．１は、例示的ヒトＣＢＬＢヌクレオチド配列を提供する
。任意の特定の機序または理論に捉われようとは思わないが、ＮＫ細胞においてＣＢＬＢ
をノックアウトすることは、ＮＫ細胞活性化閾値を低下させ、ＮＫ細胞を活動亢進にする
と仮定される。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢの発現を欠くＧＭ ＮＫ細胞の集団が本
明細書において提供される。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢの発現が低減されたＧＭ
ＮＫ細胞の集団が本明細書において提供される。ある特定の代替法では、ＧＭ ＮＫ細胞
は、ヒトＧＭ ＮＫ細胞である。ある特定の代替法では、ＧＭ ＮＫ細胞の集団が本明細
書において提供され、ここで、ＣＢＬＢ発現がノックアウトされている。遺伝子は、ＲＮ
Ａ干渉、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用する技術を用いてノックアウトされてもよ
い。特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によって
実施される。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢノックア
ウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞よりも
、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞の集団を生成する。特定の代替法では
、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２
２６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。特定の代替法で
は、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノック
アウトは、ＣＢＬＢノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するまたは非
改変ＮＫ細胞よりも高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。ある特定の代
替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢノックアウトを有さないＮＫ細胞、
例えば、天然に存在するＮＫ細胞または非改変ＮＫ細胞よりも高い脱顆粒を有するＮＫ細
胞の集団を生成する。特定の代替法では、より高い脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によっ
て測定される。免疫応答のマーカーの測定技術は、当業者に公知である。ＣＤ１０７ａは
、例えば、抗ＣＤ１０７ａ抗体を使用するフローサイトメトリーベースの方法によって測
定されてもよい。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢノッ
クアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するまたは非改変ＮＫ細胞と比較して
、ＮＫ細胞におけるＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩ
Ｐ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を
もたらす。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢノックアウ
トを有さないＮＫ細胞、例えば、天然に存在するまたは非改変ＮＫ細胞と比較して、ＮＫ
細胞におけるＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α
、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌濃度の変化をも
たらす。

【0056】

ＮＫＧ２Ａは、ＮＫ細胞においてＣＤ９４と結合し、ＮＫ活性を阻害するタンパク質で
ある。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＡＬ６５２３４．１は、例示的ヒトＮＫＧ２Ａ
アミノ酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＦ４６１８１２．１は、例
示的ヒトＮＫＧ２Ａヌクレオチド配列を提供する。任意の特定の機序または理論に捉われ
ようとは思わないが、ＮＫＧ２Ａが欠損した、機能的に成熟したＮＫ細胞生成物の生成は
、治療活性の増強を提供すると仮定される。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａの発現を
欠くＧＭ ＮＫ細胞の集団が本明細書において提供される。ある特定の代替法では、ＧＭ
ＮＫ細胞は、ヒトＧＭ ＮＫ細胞である。ある特定の代替法では、ＧＭ ＮＫ細胞の集
団は、ＮＫＧ２Ａの発現が低減している。本明細書において提供される特定の代替法は、
ＧＭ ＮＫ細胞の集団に関し、これでは、ＮＫＧ２Ａ発現は、ノックアウトされている。
遺伝子は、ＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用する技術を用いてノックア
ウトできる。特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ関連技
術によって実施される。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫ
Ｇ２Ａノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在する
ＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞の集団を生成する。特
定の代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は
、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。
特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。ある特定の代替法では、ＮＫＧ
２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改
変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞よりも高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集
団を生成する。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａノ
ックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞
よりも高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。特定の代替法では、より高い脱顆
粒は、ＣＤ１０７ａ検出の増大によって測定される。ある特定の代替法では、ＮＫＧ２Ａ
発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変Ｎ
Ｋ細胞または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞におけるＧＭ－ＣＳＦ、ｓＣ
Ｄ１３７、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンの
うち１種または複数の分泌の変化をもたらす。ある特定の代替法では、ＣＢＬＢ発現のノ
ックアウトは、ＣＢＬＢノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞また
は天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞におけるＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３
７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパー
フォリンのうち１種または複数の分泌濃度の変化をもたらす。本明細書におけるいくつか
の代替法では、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａノックアウトを有さない
未処理細胞と比較して、細胞毒性の最大３倍またはそれより多い増大を有する。

【0057】

ＴＧＦ－β１は、ＮＫ細胞抗腫瘍免疫からの回避を促進する強力な免疫抑制剤である。
ＴＧＦβシグナル伝達は、ＴＧＦβ２型受容体２（ＴＧＦＢＲ２またはＴβＲＩＩ）を通
して作用し、下流の数百種の遺伝子の発現を制御する。下流の事象は、Ｓｍａｄ２／３リ
ン酸化およびＮＫ活性化受容体の下流制御を含む。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＢ
Ｇ６５６３２．１は、例示的ヒトＴＧＦＢＲ２アミノ酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ
（商標）受託番号ＫＵ１７８３６０．１は、例示的ヒトＴＧＦＢＲ２ヌクレオチド配列を
提供する。したがって、任意の特定の機序または理論に捉われようとは思わないが、ＮＫ
細胞におけるＴＧＦＢＲ２ノックアウトの生成は、より大きなエフェクター機能および活
性化受容体のより高い発現を有するＮＫ細胞の集団を提供すると仮定される。本明細書に
おいて提供される、ある特定の代替法は、ＴＧＦＢＲ２の発現を欠くＧＭ ＮＫ細胞の集
団を含む。ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ ＮＫ細胞の集団は
、ＴＧＦＢＲ２の低減された発現を有する。ある特定の代替法では、ＧＭ ＮＫ細胞の集
団が本明細書において提供され、これでは、ＴＧＦＢＲ２発現がノックアウトされている
。遺伝子は、ＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用する技術を用いてノック
アウトできる。ある特定の代替法では、ＧＭ ＮＫ細胞は、ヒトＧＭ ＮＫ細胞である。
特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によって
実施される。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２
ノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細
胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞を有するＮＫ細胞の集団を生
成する。特定の代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。特定の代替法では、
腫瘍細胞は、慢性骨髄性白血病細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、急性骨髄性
白血病細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。特定
の代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、Ｋ５
６２細胞である。特定の代替法では、腫瘍細胞は、ＨＬ－６０細胞である。特定の代替法
では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現の
ノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトを有さないＮＫ細胞よりも高いＩＦＮγ分泌
を有するＮＫ細胞をもたらす。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウト
は、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然
に存在するＮＫ細胞よりも高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。特定の代替法
では、より高い脱顆粒は、ＣＤ１０７ａ検出の増大によって測定される。免疫応答のマー
カーの測定技術は、当業者に公知である。ＣＤ１０７ａは、例えば、抗ＣＤ１０７ａ抗体
を使用するフローサイトメトリーベースの方法によって測定され得る。ある特定の代替法
では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトを有さないＮＫ細
胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞におけ
るＧＭ－ＣＳＦ、ｓＣＤ１３７、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／
またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化をもたらす。ある特定の代替法で
は、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば
、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞におけるＧＭ－Ｃ
ＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦ
αおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌濃度の変化をもたらす。ある
特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトを有
さないＮＫ細胞、例えば、非改変ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、Ｓ
ｍａｄ２／３リン酸化のレベルの低減をもたらす。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２
発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトを有さないＮＫ細胞、例えば、非改変
ＮＫ細胞または天然に存在するＮＫ細胞と比較して、Ｓｍａｄ２／３リン酸化のレベルの
増大をもたらす。ある特定の代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＤＮＡＭ
－１、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＮＫｐ３０のうち１種または複数の発現の増大をもたら
す。

【0058】

２．改変されたＣＤ１６を含むＧＭ ＮＫ細胞
ＣＤ１６の遺伝子配列は、当業者に公知であり、例示的配列が本明細書に記載されてい
る。当業者に公知の標準技術を使用して、本明細書に記載される配列を改変できる。

【0059】

ＣＤ１６（分化のクラスター１６）は、それぞれＣＤ１６ａおよびＣＤ１６ｂとしても
知られる、２つのアイソフォーム、Ｆｃ受容体、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩ
ｂからなる。ＣＤ１６ａは、ナチュラルキラー細胞で見られる。ＣＤ１６は、ＩｇＧ抗体
のＦｃ部分と結合し、これが、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）のためにナチ
ュラルキラー細胞を活性化する。ＣＤ１６ａおよびＣＤ１６ｂは両方ともＡＤＡＭ１７に
より標的とされる切断部位を含有する。ＡＤＡＭ１７によるＣＤ１６ａのタンパク質分解
による切断は、ＮＫ細胞活性化で起こり、血漿中への可溶性ＣＤ１６放出につながる。Ｇ
ｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＮＰ＿０００５６０．６は、例示的ヒト野生型ＣＤ１６ａ
アミノ酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＢＣ０３６７２３．１は、例
示的ヒト野生型ＣＤ１６ａヌクレオチド配列を提供する。

【0060】

ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６を含むＧＭ ＮＫ細胞が本明細書において
提供される。ある特定の代替法では、ＧＭ ＮＫ細胞は、ヒトＧＭ ＮＫ細胞である。あ
る特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、改変されたヒトＣＤ１６である。特定の代
替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有
する。より特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリン
（ＶａｌまたはＶ）を有する。特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７
切断に対して耐性である。より特定の代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａ中の位置１９
７にプロリン（ＰｒｏまたはＰ）を有する（Ｓ１９７Ｐ突然変異）。ある特定の代替法で
は、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有し、Ａ
ＤＡＭ１７切断に対して耐性である。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配
列番号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰ
ＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥ
ＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶ
ＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮ
ＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥ
ＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧ
ＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有す
る。ある特定の代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有し、ＣＤ
１６ａの位置１９７にプロリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は
、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、
ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、
ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１
６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する
。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベクターを介して導入
される。ある特定の代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロ
モーターのいずれかを有する。ある特定の代替法では、レンチウイルスベクターは、１種
または複数の薬物選択マーカーを含む。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、
レトロウイルスベクターを介して導入される。ある特定の代替法では、レトロウイルスベ
クターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。

【0061】

ある特定の代替法では、本明細書において開示される改変されたＣＤ１６を有するＧＭ
－ＮＫ細胞は、野生型ＣＤ１６を有するＮＫ細胞、例えば、天然に存在するＮＫ細胞より
も改善された抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示す。

【0062】

３．遺伝子改変を含むＧＭ ＮＫ細胞
ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ ＮＫ細胞は、（１）ＣＢＬ
Ｂ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／または機能を欠き、または
ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＴＧＦＢＲ２の発現および／または機能の低減を
示し、ならびに／または（２）本明細書に記載される改変されたＣＤ１６を含む。特定の
代替法では、本明細書において提供されるＧＭ ＮＫ細胞は、ＣＢＬＢおよびＴＧＦＢＲ
２の発現および／または機能を欠く。

【0063】

４．ＧＭ ＮＫ細胞およびＧＭ ＮＫ細胞集団の産生
ある特定の代替法では、本方法によるＧＭ ＮＫ細胞および／またはＧＭ ＮＫ細胞集
団の産生は、造血細胞の集団を増殖させることを含む。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞
は、本明細書において、および参照によりその全文が本明細書に組み込まれる（特許文献
１）に記載されるような、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの１、２
、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１
８、１９、２０または２１日目に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は
、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの１、２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは
２１日目、または前記の日数のうちいずれか２つによって規定される範囲の間の任意の日
数に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するための
３５日の、３段階プロセスの３、５、７または９日目に遺伝子改変される。ある特定の代
替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの３、５、
７もしくは９日目、または任意の２つの前記の日数によって規定される範囲の間の任意の
日数に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するため
の３５日の、３段階プロセスの５日目に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、ＮＫ
細胞は、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの３日目に遺伝子改変され
る。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プ
ロセスの７日目に遺伝子改変される。ある特定の代替法では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産
生するための３５日の、３段階プロセスの９日目に遺伝子改変される。ある特定の代替法
では、遺伝子改変は、本明細書に記載されるようなＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／または
ＴＧＦＢＲ２のノックアウトを含む。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、本明細書に
記載されるようなＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＴＧＦＢＲ２のノックアウトを含
む。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、本明細書に記載されるような改変されたＣＤ
１６の導入を含む。

【0064】

本明細書に記載されるようなノックアウトによる遺伝子改変は、当業者に公知の任意の
方法によって行うことができる。例えば、ノックアウトは、ゲノム編集技術によって行う
ことができる。遺伝子は、ＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用する技術を
用いてノックアウトできる。ある特定の代替法では、ゲノム編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ関
連技術である。ある特定の代替法では、ゲノム編集技術は、メガヌクレアーゼ関連技術で
ある。ある特定の代替法では、ゲノム編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦ
Ｎ）関連技術である。ある特定の代替法では、ゲノム編集技術は、転写アクチベーター様
エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）関連技術である。

【0065】

特定の代替法では、ＣＲＩＳＰＲ関連技術は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを含む
。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してノックアウトを産生するために、
ＣｒｉｓｐｒガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を化学的に修飾し、単一ガイド（ｓｇＲＮＡ）形
式で合成することができる。次いで、Ｃａｓ９をプソイドウリジン（Ψ）修飾を有するｍ
ＲＮＡとして送達してもよい。次いで、ヌクレオフェクター（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ
）を利用して、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡを細胞に送達することができる。

【0066】

本明細書に記載される改変された遺伝子の導入は、当業者に公知の任意の方法によって
行うことができる。例えば、遺伝子改変された遺伝子を、レトロウイルスベクターを介し
て導入してもよい。いくつかの代替法では、遺伝子改変された遺伝子は、レンチウイルス
ベクターを介して導入される。

【0067】

例えば、ＮＫ細胞を産生するための３段階法における細胞増殖の際に、造血細胞集団内
の複数の造血細胞がＮＫ細胞に分化する。このプロセスの際に、前記ＮＫ細胞は、得られ
たＮＫ細胞がＧＭ ＮＫ細胞であるように遺伝子改変される。ある特定の代替法では、遺
伝子改変は、細胞がＮＫ細胞に分化する前に実施される。ある特定の代替法では、遺伝子
改変は、細胞がＮＫ細胞に分化した後に実施される。ある特定の代替法では、遺伝子改変
は、ＮＫ前駆体細胞で実施される。一態様では、造血幹細胞または前駆体細胞、例えば、
ＣＤ３４^＋幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）
を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生すること、続いて、前記の第１
の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）を含み、Ｔ
ｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生すること、続いて、前記の
第２の細胞の集団を、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨを
欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することを含む方法によってＮＫ
細胞を産生することを含むＧＭ ＮＫ細胞を産生する方法であって、第３の細胞の集団は
、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少
なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または前記のパー
センテージのいずれか２つによって規定される範囲内に入るパーセンテージが生存可能で
ある方法が、本明細書において提供される。ある特定の代替法では、このようなナチュラ
ルキラー細胞は、ＣＤ１６^－であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の代替法では
、このようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４^＋であるナチュラルキラー細胞を含む。
ある特定の代替法では、このようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４^＋またはＣＤ１６
^＋であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の代替法では、このようなナチュラルキ
ラー細胞は、ＣＤ９４^－またはＣＤ１６^－であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定
の代替法では、このようなナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４^＋およびＣＤ１６^＋である
ナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の代替法では、このようなナチュラルキラー細胞
は、ＣＤ９４^－およびＣＤ１６^－であるナチュラルキラー細胞を含む。ある特定の代替法
では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）
および／またはマクロファージ炎症性タンパク質－１アルファ（ＭＩＰ－Ια）を欠く。
ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦＭ
Ｓ様チロシンキナーゼ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の
第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ－１αを欠き、前記
の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代
替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低
分子量ヘパリンを含まない。

【0068】

一態様では、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエ
チン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（
ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）を
含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ
）第２の細胞の集団を、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含み、ＬＭＷＨを欠く第３の培地中
で培養して、第３の細胞の集団を産生することとを含む方法によってＮＫ細胞を産生する
ことを含むＧＭ ＮＫ細胞を産生する方法であって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６^＋、
ＣＤ３^－およびＣＤ１１ａ^＋であるナチュラルキラー細胞を含む方法が、本明細書におい
て提供される。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培
地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質－１ア
ルファ（ＭＩＰ－１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、
ＭＩＰ－１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）を
欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／
またはＭＩＰ－１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／または
Ｆｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地の
いずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。

【0069】

一態様では、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエ
チン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（
ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）を
含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ
）第２の細胞の集団を、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含み、幹細胞因子（ＳＣＦ）および
ＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することとを含
む方法によってＮＫ細胞を産生することを含むＧＭ ＮＫ細胞を産生する方法であって、
第３の細胞の集団が、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－およびＣＤ１１ａ^＋であるナチュラルキラー
細胞を含む方法が本明細書において提供される。ある特定の代替法では、前記の第１の培
地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害性因子（ＬＩＦ）および／またはマク
ロファージ炎症性タンパク質－１アルファ（ＭＩＰ－１α）を欠く。ある特定の代替法で
は、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナー
ゼ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前
記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ－１αを欠き、前記の第３の培地は、Ｌ
ＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培
地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含
まない。

【0070】

一態様では、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエ
チン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（
ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）を
含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ
）第２の細胞の集団を、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含み、ＳＣＦ、幹細胞動員剤および
ＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することとを含
む方法によってＮＫ細胞を産生することを含むＧＭ ＮＫ細胞を産生する方法であって、
第３の細胞の集団が、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－およびＣＤ１１ａ^＋であるナチュラルキラー
細胞を含む方法が本明細書において提供される。ある特定の代替法では、前記の第１の培
地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロ
ファージ炎症性タンパク質－１アルファ（ＭＩＰ－１α）を欠く。ある特定の代替法では
、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ
－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記
第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ－１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ
、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、
第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まな
い。

【0071】

一態様では、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエ
チン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、（
ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）を
含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、（ｃ
）第２の細胞の集団を、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含み、幹細胞動員剤およびＬＭＷＨ
の各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することと、（ｄ）第３
の細胞の集団からＣＤ１１ａ^＋細胞を単離して、第４の細胞の集団を産生することとを含
む方法によってＮＫ細胞を産生することを含むＧＭ ＮＫ細胞を産生する方法であって、
第４の細胞の集団が、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－およびＣＤ１１ａ^＋であるナチュラルキラー
細胞を含む方法が、本明細書において提供される。ある特定の代替法では、前記の第１の
培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマク
ロファージ炎症性タンパク質－１アルファ（ＭＩＰ－１α）を欠く。ある特定の代替法で
は、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナー
ゼ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前
記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ－１αを欠き、前記の第３の培地は、Ｌ
ＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培
地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含
まない。

【0072】

上記の代替法のいずれかのある特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パー
フォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現する。ある特定の代替法では、前記ナチュラル
キラー細胞は、ＲＯＲγｔおよび／またはＩＬ１Ｒ１のいずれかを発現しない。

【0073】

本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞は、任意の種類のＮＫ細胞から、またはＮＫ細胞
を産生する任意の産生方法によって産生できる。本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞は
、本明細書に記載される方法を使用して単離または産生できる。ある特定の代替法では、
本明細書における方法を使用して産生されたＮＫ細胞が、産生後にＧＭ ＮＫ細胞を産生
するために改変される。ある特定の代替法では、本明細書における方法を使用して産生さ
れたＮＫ細胞が、産生の際にＧＭ ＮＫ細胞を産生するために改変される。ある特定の代
替法では、本明細書における方法を使用して産生されたＮＫ細胞は、産生前にＧＭ ＮＫ
細胞を産生するために改変される。本明細書においてＧＭ ＮＫ細胞は、遺伝子改変が直
接行われた細胞および遺伝子改変を含むこのような細胞の任意の後代を指す。ある特定の
代替法では、本明細書において提供されるＧＭ ＮＫ細胞は、３段階法、例えば、参照に
よりその全文が本明細書に組み込まれる（特許文献１）に記載されるような３段階法によ
って産生される。ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ ＮＫ細胞は
、胎盤ＮＫ細胞、例えば、各々参照によりその全文が本明細書に組み込まれる（特許文献
２）、（特許文献３）および／または（特許文献４）に記載されるような胎盤ＮＫ細胞か
ら産生される。ある特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ ＮＫ細胞は、
各々参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、（特許文献５）および／または（特
許文献６）に記載されるような２ステップまたは３ステップ法によって産生される。ある
特定の代替法では、本明細書において提供されるＧＭ ＮＫ細胞は、参照によりその全文
が本明細書に組み込まれる（特許文献７）に記載される方法のいずれかによって産生され
る。

【0074】

ａ．６．４．１ ３段階法を使用するＧＭ ＮＫ細胞集団の産生
１つの代替法では、本明細書において提供されるＧＭ ＮＫ細胞は、３段階法、例えば
、その全文が参照により本明細書に組み込まれる（特許文献１）に記載されるような３段
階法によって産生される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、第１、第２および／ま
たは第３段階の間にＮＫ細胞中に導入される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、第
１および第２の段階の間にＮＫ細胞中に導入される。ある特定の代替法では、遺伝子改変
は、第１および第３段階の間にＮＫ細胞中に導入される。ある特定の代替法では、遺伝子
改変は、第２および第３段階の間にＮＫ細胞中に導入される。ある特定の代替法では、遺
伝子改変は、第１段階の間にＮＫ細胞中に導入される。ある特定の代替法では、遺伝子改
変は、第２段階の間にＮＫ細胞中に導入される。ある特定の代替法では、遺伝子改変は、
第３段階の間にＮＫ細胞中に導入される。

【0075】

特定の代替法では、３段階法は、造血幹細胞または前駆体細胞、例えば、ＣＤ３４^＋幹
細胞または前駆体細胞を、第１の細胞の集団を産生するために、本明細書に記載されるよ
うに第１の培地中で指定の期間培養することを含む第１段階（「段階１」）を含む。ある
特定の代替法では、第１の培地は、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含
む。ある特定の代替法では、第１の培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、ＬＭＷ
Ｈ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－７、Ｇ－ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳ
Ｆのうち１種または複数を含む。特定の代替法では、第１の培地は、幹細胞動員剤および
Ｔｐｏに加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－７、Ｇ－ＣＳＦお
よび／またはＧＭ－ＣＳＦの各々を含む第１の培地の各々を含む。特定の代替法では、第
１の培地は、添加されるＬＭＷＨを欠く。特定の代替法では、第１の培地は、添加される
脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠く。特定の代替法では、第１の培地は、ＬＭＷＨを欠
く。特定の代替法では、第１の培地は、脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠く。特定の代
替法では、第１の培地は、幹細胞動員剤およびＴｐｏに加えて、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、
ＩＬ－６、ＩＬ－７、Ｇ－ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳＦのうち各々を含む第１の培
地の各々を含む。特定の代替法では、第１の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、マクロ
ファージ阻害性タンパク質－１アルファ（ＭＩＰ１α）または両方を欠く。

【0076】

ある特定の代替法では、続いて、「段階２」において、前記細胞は、第２の細胞の集団
を産生するために、本明細書に記載されるように第２の培地中で指定の期間培養される。
ある特定の代替法では、第２の培地は、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１５（Ｉ
Ｌ－１５）を含み、Ｔｐｏを欠く。ある特定の代替法では、第２の培地は、幹細胞動員剤
およびＩＬ－１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ－３、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－７、Ｇ－
ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳＦのうち１種または複数を含む。ある特定の代替法では
、第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩＬ－１５に加えて、ＬＭＷＨ、Ｆｌｔ－３、ＳＣ
Ｆ、ＩＬ－６、ＩＬ－７、Ｇ－ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳＦの各々を含む。特定の
代替法では、第２の培地は、添加されるＬＭＷＨを欠く。特定の代替法では、第２の培地
は、添加される脱硫酸化グリコサミノグリカンを欠く。特定の代替法では、第２の培地は
、ヘパリン、例えば、ＬＭＷＨを欠く。特定の代替法では、第２の培地は、脱硫酸化グリ
コサミノグリカンを欠く。ある特定の代替法では、第２の培地は、幹細胞動員剤およびＩ
Ｌ－１５に加えて、Ｆｌｔ－３、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－７、Ｇ－ＣＳＦおよび／また
はＧＭ－ＣＳＦの各々を含む。特定の代替法では、第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩ
Ｆ）、マクロファージ阻害性タンパク質－１アルファ（ＭＩＰ－１α）または両方を欠く
。

【0077】

ある特定の代替法では、続いて、「段階３」において、前記細胞は、第３の細胞の集団
、例えば、ナチュラルキラー細胞を産生するために、本明細書に記載されるように第３の
培地中で指定の期間培養される。ある特定の代替法では、第３の培地は、ＩＬ－２および
／またはＩＬ－１５を含み、幹細胞動員剤および／またはＬＭＷＨを欠く。ある特定の代
替法では、第３の培地は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５に加えて、ＳＣＦ、ＩＬ－
６、ＩＬ－７、Ｇ－ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳＦのうち１種または複数を含む。あ
る特定の代替法では、第３の培地は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５に加えて、ＳＣ
Ｆ、ＩＬ－６、ＩＬ－７、Ｇ－ＣＳＦおよび／またはＧＭ－ＣＳＦの各々を含む。特定の
代替法では、第１の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌのうち１種
、２種または３種すべてを欠く。特定の代替法では、第３の培地は、添加される脱硫酸化
グリコサミノグリカンを欠く。特定の代替法では、第３の培地は、脱硫酸化グリコサミノ
グリカンを欠く。特定の代替法では、第３の培地は、ヘパリン、例えば、ＬＭＷＨを欠く
。

【0078】

特定の代替法では、ＮＫ細胞集団を産生するために３段階法が使用される。ある特定の
代替法では、３段階法は、間質フィーダー細胞支持体の不在下で実施される。ある特定の
代替法では、３段階法は、外因的に添加されるステロイド（例えば、コルチゾン、ヒドロ
コルチゾンまたはそれらの誘導体）の不在下で実施される。

【0079】

ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも２０％のＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ナチュラル
キラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、
少なくとも４０％のＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細
胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも６０％のＣＤ５６^＋ＣＤ３
^－ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、
段階法は、少なくとも７０％のＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ナチュラルキラー細胞を含むナチュラ
ルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、少なくとも８０％のＣＤ５
６^＋ＣＤ３^－ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の
態様では、３段階法は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％も
しくは８０％または前記のパーセンテージのいずれか２つによって規定される範囲の間の
パーセントのＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産
生する。

【0080】

ある特定の態様では、本明細書に記載される３段階法は、少なくとも２０％のＣＤ５６
^＋ＣＤ３^－ＣＤ１１ａ^＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。
ある特定の態様では、本明細書に記載される３段階法は、少なくとも４０％のＣＤ５６^＋
ＣＤ３^－ＣＤ１１ａ^＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。あ
る特定の態様では、本明細書に記載される３段階法は、少なくとも６０％のＣＤ５６^＋Ｃ
Ｄ３^－ＣＤ１１ａ^＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある
特定の態様では、本明細書に記載される３段階法は、少なくとも８０％のＣＤ５６^＋ＣＤ
３^－ＣＤ１１ａ^＋ナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。ある特
定の態様では、本明細書に記載される３段階法は、少なくとも２０％、３０％、４０％、
５０％、６０％、７０％もしくは８０％または前記のパーセンテージのいずれか２つによ
って規定される範囲の間のパーセントのＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＣＤ１１ａ^＋ナチュラルキラ
ー細胞を含むナチュラルキラー細胞を産生する。

【0081】

ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞および前記Ｋ５６２細胞
が、１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで同時培養される場合に、Ｋ５６２細胞に対して少
なくとも２０％の細胞毒性を示すナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では
、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞および前記Ｋ５６２細胞が、１０：１の比でｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで同時培養される場合に、Ｋ５６２細胞に対して少なくとも３５％の細胞
毒性を示すナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナ
チュラルキラー細胞および前記Ｋ５６２細胞が、１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで同時
培養される場合に、Ｋ５６２細胞に対して少なくとも４５％の細胞毒性を示すナチュラル
キラー細胞を産生する。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞お
よび前記Ｋ５６２細胞が、１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで同時培養される場合に、Ｋ
５６２細胞に対して少なくとも６０％の細胞毒性を示すナチュラルキラー細胞を産生する
。ある特定の態様では、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞および前記Ｋ５６２細胞
が、１０：１の比でｉｎ ｖｉｔｒｏで同時培養される場合に、Ｋ５６２細胞に対して少
なくとも７５％の細胞毒性を示すナチュラルキラー細胞を産生する。ある特定の態様では
、３段階法は、前記ナチュラルキラー細胞および前記Ｋ５６２細胞が、１０：１の比でｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで同時培養される場合に、Ｋ５６２細胞に対して少なくとも３５％、４５
％、５５％、６５％もしくは７５％または前記のパーセンテージのいずれか２つによって
規定される範囲の間のパーセントの細胞毒性を示すナチュラルキラー細胞を産生する。

【0082】

ある特定の態様では、前記の第３の培養ステップ後、前記の第３の細胞の集団、例えば
、前記のＧＭ ＮＫ細胞の集団は、凍結保存される。ある特定の態様では、前記の第４の
ステップ後、前記の第４の細胞の集団、例えば、前記のＧＭ ＮＫ細胞の集団は、凍結保
存される。

【0083】

ある特定の態様では、ナチュラルキラー細胞、すなわち、本明細書に記載される３段階
法によって産生されたナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団が、本明細書において提供
される。したがって、本明細書に記載される３段階法によって産生された単離されたナチ
ュラルキラー細胞集団が、本明細書において提供される。特定の代替法では、前記ナチュ
ラルキラー細胞集団は、少なくとも２０％のＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ナチュラルキラー細胞を
含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも４０％のＣＤ５
６^＋ＣＤ３^－ナチュラルキラー細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細
胞集団は、少なくとも６０％のＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ナチュラルキラー細胞を含む。特定の
代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少なくとも８０％のＣＤ５６^＋ＣＤ３^－
ナチュラルキラー細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、少
なくとも６０％のＣＤ１６^－細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞
集団は、少なくとも８０％のＣＤ１６^－細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラル
キラー細胞集団は、少なくとも２０％、４０％、６０％もしくは８０％または前記のパー
センテージのいずれか２つによって規定される範囲の間のパーセントのＣＤ５６^＋ＣＤ３
^－ナチュラルキラー細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞集団は、
少なくとも２０％のＣＤ９４^＋細胞を含む。特定の代替法では、前記ナチュラルキラー細
胞集団は、少なくとも４０％のＣＤ９４^＋細胞を含む。

【0084】

ある特定の態様では、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＣＤ１１７^＋ＣＤ１１ａ^＋ナチュラルキラー
細胞の集団が本明細書において提供され、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンお
よび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）およ
び／またはＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。ある特定の態様では、前記ナ
チュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール
炭化水素受容体および／またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。ある特定の態様では、
前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および／
またはＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は
、ＣＤ９４を発現する。ある特定の態様では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を
発現しない。

【0085】

ある特定の態様では、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロ
ンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生するこ
とと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１５（ＩＬ－
１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生すること
と、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５を含み、幹細胞動員
剤および／またはＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産
生することと、（ｄ）第３の細胞の集団からＣＤ１１ａ^＋細胞およびＣＤ１１ａ^－細胞を
分離することと、（ｅ）ＣＤ１１ａ^＋細胞を、ＣＤ１１ａ^－細胞を、５０：１、４０：１
、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、
１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０または１：５０の比
で、または前記の比のいずれか２つによって規定される範囲の間の比で組み合わせて、第
４の細胞の集団を産生することとを含むＧＭ ＮＫ細胞を含む細胞集団を産生する方法が
、本明細書において提供される。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／また
は前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性
タンパク質－１アルファ（ＭＩＰ－１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の
培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３リガンド（
Ｆｌｔ－３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は
、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ－１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１
αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地ま
たは第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。ある特定
の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ^＋細胞およびＣＤ１１ａ^－細胞は、５０
：１、２０：１、１０：１、５：１もしくは１：１または上記の比のいずれか２つによっ
て規定される範囲の間の任意の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の細胞の
集団では、ＣＤ１１ａ^＋細胞およびＣＤ１１ａ^－細胞は、５０：１の比で組み合わされる
。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ^＋細胞およびＣＤ１１ａ^－細
胞は、２０：１の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、Ｃ
Ｄ１１ａ^＋細胞およびＣＤ１１ａ^－細胞は、１０：１の比で組み合わされる。ある特定の
態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ^＋細胞およびＣＤ１１ａ^－細胞は、５：１
の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ^＋細胞
およびＣＤ１１ａ^－細胞は、１：１の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の
細胞の集団では、ＣＤ１１ａ^＋細胞およびＣＤ１１ａ^－細胞は、１：５の比で組み合わさ
れる。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ^＋細胞およびＣＤ１１ａ
^－細胞は、１：１０の比で組み合わされる。ある特定の態様では、第４の細胞の集団では
、ＣＤ１１ａ^＋細胞およびＣＤ１１ａ^－細胞は、１：２０の比で組み合わされる。ある特
定の態様では、第４の細胞の集団では、ＣＤ１１ａ^＋細胞およびＣＤ１１ａ^－細胞は、１
：５０の比で組み合わされる。

【0086】

５．ＮＫ細胞の単離
ナチュラルキラー細胞を単離する方法は、当技術分野で公知であり、ＮＫ細胞、例えば
、ＧＭ ＮＫ細胞を単離するために使用できる。例えば、ＮＫ細胞を、例えば、細胞を、
１つの代替法では、ＣＤ５６およびＣＤ３に対する抗体を用いて染色することおよびＣＤ
５６^＋ＣＤ３^－細胞を選択することによって単離または濃縮できる。ある特定の代替法で
は、ＮＫ細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較に
おいて、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－細胞について濃縮される。ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記
載される３段階法を使用して産生された細胞を、市販のキット、例えば、ＮＫ細胞単離キ
ット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離できる。ＮＫ細胞、例えば、本
明細書に記載される３段階法を使用して産生された細胞はまた、ＮＫ細胞、例えば、本明
細書に記載される３段階法を使用して産生された細胞を含む細胞の集団におけるＮＫ細胞
以外の細胞の除去によって単離または濃縮できる。例えば、ＮＫ細胞、例えば、本明細書
に記載される３段階法を使用して産生された細胞を、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４
、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１２３、ＨＬＡ ＤＲおよび／また
はＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）のうち１種または複数に対する抗体を使用する、非Ｎ
Ｋ細胞マーカーを示す細胞の枯渇によって単離または濃縮してもよい。陰性単離は、市販
のキット、例えば、ＮＫ細胞陰性単離キット（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して
実施できる。これらの方法によって単離された細胞を、ＣＤ１１ａ^＋およびＣＤ１１ａ^－
細胞ならびに／またはＣＤ１１７^＋およびＣＤ１１７^－細胞および／またはＣＤ１６^＋お
よびＣＤ１６^－細胞および／またはＣＤ９４^＋およびＣＤ９４^－を分離するためにさらに
選別してもよい。ある特定の代替法では、細胞、例えば、本明細書に記載される３ステッ
プ法によって産生された細胞が、ＣＤ１１ａ^＋およびＣＤ１１ａ^－細胞を分離するために
選別される。特定の代替法では、ＣＤ１１ａ^＋細胞は単離される。ある特定の代替法では
、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において
、ＣＤ１１ａ^＋細胞について濃縮される。特定の代替法では、ＣＤ１１ａ^－細胞が単離さ
れる。ある特定の代替法では、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生さ
れた総細胞との比較において、ＣＤ１１ａ^－細胞について濃縮される。ある特定の代替法
では、細胞は、ＣＤ１１７^＋およびＣＤ１１７^－細胞を分離するために選別される。特定
の代替法では、ＣＤ１１７^＋細胞が単離される。ある特定の代替法では、細胞は、本明細
書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ１１７^＋細
胞について濃縮される。特定の代替法では、ＣＤ１１７^－細胞が単離される。ある特定の
代替法では、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比
較において、ＣＤ１１７^－細胞について濃縮される。細胞を選択および濃縮する方法は、
当業者に公知であり、細胞を、例えば、細胞表面タンパク質を標的化することによって選
択してもよい。ある特定の代替法では、細胞は、ＣＤ１６^＋およびＣＤ１６^－細胞を分離
するために選別される。特定の代替法では、ＣＤ１６^＋細胞が単離される。ある特定の代
替法では、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較
において、ＣＤ１６^＋細胞について濃縮される。特定の代替法では、ＣＤ１６^－細胞が単
離される。ある特定の代替法では、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産
生された総細胞との比較において、ＣＤ１６^－細胞について濃縮される。ある特定の代替
法では、細胞は、ＣＤ９４^＋およびＣＤ９４^－細胞を分離するために選別される。特定の
代替法では、ＣＤ９４^＋細胞が単離される。ある特定の代替法では、細胞は、本明細書に
記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において、ＣＤ９４^＋細胞につ
いて濃縮される。特定の代替法では、ＣＤ９４^－細胞が単離される。ある特定の代替法で
は、細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較におい
て、ＣＤ９４^－細胞について濃縮される。ある特定の代替法では、単離は、磁性分離を使
用して実施される。ある特定の代替法では、単離は、フローサイトメトリーを使用して実
施される。

【0087】

１つの代替法では、ＮＫ細胞、例えば、ＧＭ ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＣＤ９
４^＋ＣＤ１１ａ^＋細胞について選択することによって単離または濃縮される。ある特定の
代替法では、ＮＫ細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞と
の比較において、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＣＤ９４^＋ＣＤ１１ａ^＋細胞について濃縮される。
１つの代替法では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＣＤ９４^＋ＣＤ１１ａ^＋ＣＤ１１７
^－細胞について選択することによって単離または濃縮される。ある特定の代替法では、Ｎ
Ｋ細胞は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生された総細胞との比較において
、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－ＣＤ９４^＋ＣＤ１１ａ^＋ＣＤ１１７^－細胞について濃縮される。

【0088】

細胞分離は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ
）によって、または１つの代替法では、特異的抗体とコンジュゲートしているミクロビー
ズを使用する磁性セルソーティングによって達成できる。細胞は、例えば、磁性活性化セ
ルソーティング（ＭＡＣＳ）技術、１種または複数の特異的抗体、例えば、抗ＣＤ５６抗
体を含む磁性ビーズ（例えば、０．５～１００μｍ径）と結合するその能力に基づいて粒
子を分離する方法を使用して単離できる。磁性細胞分離は、例えば、ＡＵＴＯＭＡＣＳ（
商標）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して実施および自動化できる。種
々の有用な改変は、特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結
合付加を含む磁性ミクロスフェアで実施できる。次いで、ビーズを細胞と混合し、結合さ
せる。次いで、細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離除去す
る。１つの代替法では、次いで、これらの細胞を、単離し、さらなる細胞表面マーカーに
対する抗体にカップリングされた磁性ビーズと再度混合してもよい。細胞を磁場に再度通
し、両抗体に結合された細胞を単離する。次いで、このような細胞を希釈し、クローン単
離のためにマイクロタイターディッシュなどの別個のディッシュに分離してもよい。

【0089】

６．ＧＭ ＮＫ細胞
本明細書において提供されるＧＭ ＮＫ細胞は、本明細書に記載される方法のいずれか
によって産生されるＮＫ細胞の集団ならびに任意の組織供給源、例えば、ヒト組織供給源
から単離されたＮＫ細胞を含む。

【0090】

ａ．６．６．１ ３段階法によって産生されたＧＭ ＮＫ細胞
別の代替法では、単離されたＧＭ ＮＫ細胞集団が本明細書において提供され、これで
は、ＮＫ細胞は、上記の３段階法に従って産生され、遺伝子改変は、ＧＭ ＮＫ細胞集団
を産生するための３段階のうちの１つまたは複数の間に導入される。

【0091】

１つの代替法では、単離されたＧＭ ＮＫ細胞集団が本明細書において提供され、これ
では、ＮＫ細胞集団は、本明細書に記載される３段階法によって産生され、前記ＮＫ細胞
集団は、ＧＭ ＮＫ細胞集団を産生するために遺伝子改変され、前記ＮＫ細胞集団は、５
０％またはそれより多いＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記Ｎ
Ｋ細胞集団中のＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞は、さらにＮＫｐ４６^＋であるＣＤ３^－ＣＤ５６
^＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細
胞は、さらにＣＤ１６^－であるＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞を含む。ある特定の代替法では、
前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞は、さらにＣＤ１６^＋であるＣＤ３^－
ＣＤ５６^＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３^－ＣＤ
５６^＋細胞は、さらにＣＤ９４^－であるＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞を含む。ある特定の代替
法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞は、さらにＣＤ９４^＋である
ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ
３^－ＣＤ５６^＋細胞は、さらにＣＤ１１ａ^＋であるＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞を含む。ある
特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞は、さらにＮＫｐ
３０^＋であるＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団
中の前記ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞は、さらにＣＤ１６１^＋であるＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞
を含む。ある特定の代替法では、前記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞は、
さらにＤＮＡＭ－１^＋であるＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞を含む。ある特定の代替法では、前
記ＮＫ細胞集団中の前記ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞は、さらにＴ－ｂｅｔ^＋であるＣＤ３^－
ＣＤ５６^＋細胞を含む。

【0092】

１つの代替法では、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は
、ＣＤ１１７^＋である細胞を含む。１つの代替法では、本明細書に記載される３段階法に
よって産生されるＮＫ細胞集団は、ＮＫＧ２Ｄ^＋である細胞を含む。１つの代替法では、
本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は、ＮＫｐ４４^＋である
細胞を含む。１つの代替法では、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ
細胞集団は、ＣＤ２４４^＋である細胞を含む。１つの代替法では、本明細書に記載される
３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は、パーフォリンを発現する細胞を含む。１つ
の代替法では、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は、ＥＯ
ＭＥＳを発現する細胞を含む。１つの代替法では、本明細書に記載される３段階法によっ
て産生されるＮＫ細胞集団は、グランザイムＢを発現する細胞を含む。１つの代替法では
、本明細書に記載される３段階法によって産生されるＮＫ細胞集団は、ＩＦＮγ、ＧＭ－
ＣＳＦおよび／またはＴＮＦαを分泌する細胞を含む。

【0093】

７．細胞の保存
細胞、例えば、本明細書において提供される、または本明細書に記載される方法を使用
して産生されるＧＭ ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載される３段階法を使用して産生
されるＧＭ ＮＫ細胞集団は、保存できる、すなわち、長期貯蔵を可能にする条件下また
は例えば、アポトーシスもしくは壊死による細胞死を阻害する条件下に置くことができる
。

【0094】

適した凍結保存培地として、それだけには限らないが、生理食塩水、例えば、成長培地
を含む培養培地または細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、Ｃ２６９５
、Ｃ２６３９またはＣ６０３９（Ｓｉｇｍａ）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、
ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（Ｂ
ｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が挙げられる。１つの代替法では、凍結保存培地は
、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０％（ｖ／ｖ）または上記の
パーセンテージのうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセントｖ／ｖ
の濃度のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含む。凍結保存培地は、さらなる薬剤、例
えば、メチルセルロース、デキストラン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、
トレハロースおよび／またはグリセロールを含み得る。ある特定の代替法では、凍結保存
培地は、約１％～１０％のＤＭＳＯ、約２５％～７５％デキストランおよび／または約２
０～６０％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。ある特定の代替法では、凍結保存培
地は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％のＤＭＳＯ
または上記のパーセンテージのうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパー
センテージのＤＭＳＯを含む。ある特定の代替法では、凍結保存培地は、２５％、３５％
、４５％、５５％、６５％、７０％、７５％のデキストランまたは上記のパーセンテージ
のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージのデキストランを
含む。ある特定の代替法では、凍結保存培地は、２０％、３０％、４０％、５０％または
６０％のＨＳＡまたは上記のパーセンテージのうち任意の２つによって規定される範囲の
間の任意のパーセンテージのＨＳＡを含む。ある特定の代替法では、凍結保存培地は、１
％～１０％のＤＭＳＯ、２５％～７５％のトレハロースおよび／または２０～６０％のヒ
トＨＳＡを含む。ある特定の代替法では、凍結保存培地は、１％、２％、３％、４％、５
％、６％、７％、８％、９％または１０％のＤＭＳＯまたは上記のパーセンテージのうち
任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージのＤＭＳＯを含む。ある
特定の代替法では、凍結保存培地は、２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７０％
、７５％のトレハロースまたは上記のパーセンテージのうち任意の２つによって規定され
る範囲の間の任意のパーセンテージのトレハロースを含む。ある特定の代替法では、凍結
保存培地は、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％のＨＳＡまたは上記のパーセ
ンテージのうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージのＨＳＡ
を含む。特定の代替法では、凍結保存培地は、５％のＤＭＳＯ、５５％のデキストランお
よび４０％のＨＳＡを含む。より特定の代替法では、凍結保存培地は、５％のＤＭＳＯ、
５５％のデキストラン（生理食塩水中１０％ ｗ／ｖ）および４０％のＨＳＡを含む。別
の特定の代替法では、凍結保存培地は、５％のＤＭＳＯ、５５％のトレハロースおよび４
０％のＨＳＡを含む。より特定の代替法では、凍結保存培地は、５％のＤＭＳＯ、５５％
のトレハロース（生理食塩水中１０％ ｗ／ｖ）および４０％のＨＳＡを含む。別の特定
の代替法では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５を含む。別の特定
の代替法では、凍結保存培地は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０を含む。

【0095】

本明細書において提供される細胞は、種々の方法のいずれかよって、細胞培養、増殖ま
たは分化のいずれかの段階で凍結保存してもよい。例えば、本明細書において提供される
細胞は、起源組織または臓器、例えば、胎盤灌流液または臍帯血からの単離直後に、また
は上記で概説される方法の第１、第２または第３のステップのいずれかの間、もしくはそ
の後に凍結保存してもよい。ある特定の代替法では、造血細胞、例えば、造血幹細胞また
は前駆体細胞を、起源組織または臓器からの単離後１、５、１０、１５、２０、３０、４
５分以内または１、２、４、６、１０、１２、１８、２０もしくは２４時間以内または上
記の時点のうち任意の２つによって規定される範囲内である時間の間以内に凍結保存する
。ある特定の代替法では、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆体細胞を、起源組織
または臓器からの単離後、１、５、１０、１５、２０、３０、４５分もしくは上記の分数
のうち任意の２つによって規定される範囲内の任意の分数以内または１、２、４、６、１
０、１２、１８、２０もしくは２４時間以内もしくは上記の時点のうち任意の２つによっ
て規定される範囲内で凍結保存する。ある特定の代替法では、前記細胞を、起源組織また
は臓器からの単離後１、２または３日以内で凍結保存する。ある特定の代替法では、前記
細胞を、上記のように第１の培地中で培養した後、１、２、３、４、５、６、７、８、９
、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、
２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８日または上記の日数のうち任意の２つによっ
て規定される範囲の間の任意の日数の間で凍結保存する。いくつかの代替法では、前記細
胞を、上記のように第１の培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２
５、２６、２７もしくは２８日または上記の日数のうち任意の２つによって規定される範
囲の間の任意の日数の間培養した後、および上記のように、第２の培地中で、１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、
１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８日または上記の日
数のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の日数の間培養した後凍結保存す
る。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞を、本明細書に記載される３段階法を使用して作製
する場合に、前記細胞を、第１の培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４もしくは２５日または上記の日数のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意
の日数培養した後、および／または第２の培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９
、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、
２３、２４もしくは２５日または上記の日数のうち任意の２つによって規定される範囲の
間の任意の日数培養した後、および／または第３の培地中で約１、２、３、４、５、６、
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２
１、２２、２３、２４もしくは２５日または上記の日数のうち任意の２つによって規定さ
れる範囲の間の任意の日数培養した後、凍結保存する。特定の代替法では、ＮＫ細胞、例
えば、ＧＭ ＮＫ細胞を、本明細書に記載される３段階法を使用して作製し、前記細胞を
、第１の培地中で１０日間培養した後、第２の培地中で４日間培養した後、および第３の
培地中で２１日間培養した後凍結保存する。

【0096】

一態様では、ＮＫ細胞の集団、例えば、ＧＭ ＮＫ細胞を凍結保存する方法が本明細書
において提供される。１つの代替法では、前記方法は、造血幹細胞または前駆体細胞、例
えば、ＣＤ３４^＋幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔ
ｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、続いて、前
記の第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）を
含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、続い
て、前記の第２の細胞の集団を、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５を含み、幹細胞動員
剤および／またはＬＭＷＨを欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生する
ことであって、第３の細胞の集団は、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－、ＣＤ１６^－またはＣＤ１６
^＋およびＣＤ９４^＋またはＣＤ９４^－であるナチュラルキラー細胞を含み、少なくとも７
０％もしくは少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％または上記のパーセンテ
ージのうち任意の２つによって規定される範囲内のパーセンテージのナチュラルキラー細
胞が生存可能であることと、次に、ＮＫ細胞を凍結保存培地中で凍結保存することとを含
む。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血
病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質－１アルファ（Ｍ
ＩＰ－１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＴＰ－１
αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）を欠く。特定
の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩ
Ｐ－１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌ
を欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、
ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。特定の代替法では、前記凍結保存ステ
ップは、（１）細胞懸濁液溶液を調製するステップと、（２）ステップ（１）からの細胞
懸濁液溶液に凍結保存培地を添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップと、（３）ス
テップ（２）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存サンプルを得るステップと、
（４）－８０℃未満で凍結保存サンプルを保存するステップとをさらに含む。ある特定の
代替法では、方法は、中間ステップを含まない。

【0097】

１つの代替法では、前記方法は、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤
およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を
産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１
５（ＩＬ－１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産
生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含み、ＬＭＷＨ
を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することであって、第３の細胞
の集団が、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－およびＣＤ１１ａ^＋であるナチュラルキラー細胞を含む
ことと、次に、ＮＫ細胞を凍結保存培地中で凍結保存することとを含む。細胞動員剤は、
当業者に公知であり、例えば、プレリキサホルなどのＣＸＣＲ４アンタゴニストを含み得
る。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血
病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質－１アルファ（Ｍ
ＩＰ－１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１
αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）を欠く。特定
の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩ
Ｐ－１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌ
を欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、
ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。特定の代替法では、前記凍結保存ステ
ップは、（１）細胞懸濁液溶液を調製するステップと、（２）ステップ（１）からの細胞
懸濁液溶液に凍結保存培地を添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステップと、（３）ス
テップ（２）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存サンプルを得るステップと、
（４）－８０℃未満で凍結保存サンプルを保存するステップとをさらに含む。ある特定の
代替法では、方法は、中間ステップを含まない。

【0098】

１つの代替法では、前記方法は、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤
およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を
産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１
５（ＩＬ－１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産
生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含み、幹細胞因
子（ＳＣＦ）および／またはＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞
の集団を産生することであって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－およびＣＤ
１１ａ^＋であるナチュラルキラー細胞を含むことと、次に、ＮＫ細胞を凍結保存培地中で
凍結保存することとを含む。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前
記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タン
パク質－１アルファ（ＭＩＰ－１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地
は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３リガンド（Ｆｌ
ｔ－３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、Ｌ
ＩＦおよびＭＩＰ－１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／ま
たはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培
地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。特定の代替法では、前
記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁液溶液を調製するステップと、（２）ステップ（
１）からの細胞懸濁液溶液に凍結保存培地を添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステッ
プと、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存サンプルを得
るステップと、（４）－８０℃未満で凍結保存サンプルを保存するステップとをさらに含
む。ある特定の代替法では、方法は、中間ステップを含まない。

【0099】

１つの代替法では、前記方法は、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤
およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を
産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１
５（ＩＬ－１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産
生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含み、ＳＣＦ、
幹細胞動員剤および／またはＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞
の集団を産生することであって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－およびＣＤ
１１ａ^＋であるナチュラルキラー細胞を含むことと、次に、ＮＫ細胞を凍結保存培地中で
凍結保存することとを含む。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前
記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タン
パク質－１アルファ（ＭＩＰ－１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地
は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３リガンド（Ｆｌ
ｔ－３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記第２の培地は、ＬＩ
Ｆおよび／またはＭＩＰ－１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよ
び／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第
３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。特定の代替法で
は、前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁液溶液を調製するステップと、（２）ステ
ップ（１）からの細胞懸濁液溶液に凍結保存培地を添加して、凍結保存細胞懸濁液を得る
ステップと、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存サンプ
ルを得るステップと、（４）－８０℃未満で凍結保存サンプルを保存するステップとをさ
らに含む。ある特定の代替法では、方法は、中間ステップを含まない。

【0100】

１つの代替法では、前記方法は、（ａ）造血幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤
およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を
産生することと、（ｂ）第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１
５（ＩＬ－１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産
生することと、（ｃ）第２の細胞の集団を、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含み、幹細胞動
員剤および／またはＬＭＷＨの各々を欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を
産生することと、第３の細胞の集団からＣＤ１１ａ^＋細胞を単離して、第４の細胞の集団
を産生することであって、第４の細胞の集団が、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－およびＣＤ１１ａ
^＋であるナチュラルキラー細胞を含むことと、次に、ＮＫ細胞を凍結保存培地中で凍結保
存することとを含む。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第
２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質
－１アルファ（ＭＩＰ－１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、Ｌ
ＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３リガンド（Ｆｌｔ－３
Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦお
よび／またはＭＩＰ－１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／
またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の
培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。特定の代替法では、
前記凍結保存ステップは、（１）細胞懸濁液溶液を調製するステップと、（２）ステップ
（１）からの細胞懸濁液溶液に凍結保存培地を添加して、凍結保存細胞懸濁液を得るステ
ップと、（３）ステップ（３）からの凍結保存細胞懸濁液を冷却して凍結保存サンプルを
得るステップと、（４）－８０℃未満で凍結保存サンプルを保存するステップとをさらに
含む。ある特定の代替法では、方法は、中間ステップを含まない。

【0101】

本明細書において提供される細胞は、凍結保存の際に、制御速度フリーザー中で、例え
ば、０．１、０．３、０．５、１または２℃／分または上記の温度のうち任意の２つによ
って規定される範囲の間の任意の温度で冷却することができる。１つの代替法では、凍結
保存温度は、－８０℃～－１８０℃または－１２５℃～－１４０℃である。凍結保存細胞
を液体窒素に移し、その後、使用するために解凍してもよい。いくつかの代替法では、例
えば、アンプルが、－９０℃に到達すると、それらを液体窒素貯蔵領域に移す。凍結保存
細胞は、２５℃～４０℃の温度で解凍してもよい、より詳しくは、３７℃の温度に解凍し
てもよい。凍結保存細胞を、２５℃、３５℃、４０℃または４０℃または任意の２つの上
記の温度によって規定される範囲の間の任意の温度で解凍してもよい。ある特定の代替法
では、１、２、４、６、１０、１２、１８、２０もしくは２４時間もしくは上記の値のう
ち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の時間数の間または１、２、３、４、５
、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２
０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８日もしくは上記の値のうち
任意の２つによって規定される範囲の間の任意の日数の間、凍結保存された後、凍結保存
細胞を解凍する。ある特定の代替法では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、２６、２７もしくは２８ヶ月もしくは上記の値のうち任意の２つによって規定
される範囲の間の任意の月数の間、凍結保存された後、凍結保存細胞を解凍する。ある特
定の代替法では、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０年もしくは上記の値
のうち任意の２つによって規定される範囲の間の任意の年数の間、凍結保存された後、凍
結保存細胞を解凍する。

【0102】

適した解凍培地として、それだけには限らないが、生理食塩水、例えば、成長培地、例
えば、ＲＰＭＩ培地を含むプラズマライト（ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ）培養培地が挙げられ
る。ある特定の代替法では、解凍培地は、１種または複数の培地上清（例えば、栄養素、
サイトカインおよび／または因子）を含む。本明細書において提供される細胞を解凍する
のに適した培地上清として、例えば、制限するものではないが、ヒト血清ＡＢ、ウシ胎児
血清（ＦＢＳ）またはウシ胎児血清（ＦＣＳ）などの血清、ビタミン、ヒト血清アルブミ
ン（ｈａｓ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、アミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、
脂肪酸（例えば、オレイン酸、リノール酸またはパルミチン酸）、インスリン（例えば、
組換えヒトインスリン）、トランスフェリン（鉄飽和ヒトトランスフェリン）、β－メル
カプトエタノール、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ－３リガンド（Ｆ
ｌｔ３－Ｌ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）
、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）などのサイトカイン、トロンボポエチン（Ｔｐ
ｏ）またはヘパリンが挙げられる。特定の代替法では、本明細書において提供される方法
において有用な解凍培地は、ＲＰＭＩを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は、
プラズマライトを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は、０．５～２０％ ＦＢ
Ｓを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は、０．５、１、５、１５、１５または
２０％のＦＢＳまたは上記のパーセンテージの任意の２つによって規定される範囲の間の
任意のパーセンテージのＦＢＳを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は、１、２
、５、１０、１５または２０％のＦＢＳを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は
、０．５％～２０％のＨＳＡを含む。別の特定の代替法では、前記解凍培地は、０．５、
１、５、１５、１５または２０％のＨＳＡまたは上記のパーセンテージの任意の２つによ
って規定される範囲の間の任意のパーセンテージのＨＳＡを含む。別の特定の代替法では
、前記解凍培地は、１、２．５、５、１０、１５または２０％のＨＳＡを含む。より特定
の代替法では、前記解凍培地は、ＲＰＭＩおよび１０％のＦＢＳを含む。別のより特定の
代替法では、前記解凍培地は、プラズマライトおよび５％のＨＳＡを含む。

【0103】

本明細書において提供される凍結保存方法は、長期貯蔵、またはアポトーシスもしくは
壊死による細胞死を阻害する条件下を可能にするように最適化することができる。１つの
代替法では、解凍後細胞は、例えば、自動細胞カウンタまたはトリパンブルー法によって
決定されるような、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％
または９８％より多い生存可能である細胞を含む。１つの代替法では、解凍後細胞は、６
０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％より多い
生存可能である細胞または上記のパーセンテージの任意の２つによって規定される範囲の
間の任意のパーセンテージ含む。別の代替法では、解凍後細胞は、０．５、１、５、１０
、１５、２０または２５％の死滅細胞を含む。別の代替法では、解凍後細胞は、０．５、
１、５、１０、１５、２０または２５％の死滅細胞または上記のパーセンテージの任意の
２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテージの死滅細胞を含む。別の代替法
では、解凍後細胞は、０．５、１、５、１０、１５、２０または２５％の早期アポトーシ
ス細胞を含む。別の代替法では、解凍後細胞は、０．５、１、５、１０、１５、２０また
は２５％の早期アポトーシス細胞または上記のパーセンテージの任意の２つによって規定
される範囲の間の任意のパーセンテージの早期アポトーシス細胞を含む。別の代替法では
、０．５、１、５、１０、１５または２０％の解凍後細胞は、例えば、アポトーシスアッ
セイ（例えば、ＴＯ－ＰＲＯ３またはＡｎｎＶ／ＰＩアポトーシスアッセイキット）によ
って決定されるように、解凍された後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４
、２５、２６、２７または２８日後に、アポトーシスを起こす。ある特定の代替法では、
解凍後細胞を、本明細書において提供される方法を使用して培養、増殖または分化させた
後、再度凍結保存する。

【0104】

８．ＧＭ ＮＫ細胞を含む組成物
本明細書において提供されるＧＭ ＮＫ細胞を含む組成物、例えば、医薬組成物は、本
明細書に記載される方法のいずれかによって産生されたＮＫ細胞の集団を含む組成物なら
びに任意の組織供給源、例えば、ヒト組織供給源から単離されたＮＫ細胞を含む組成物を
含む。

【0105】

ａ．６．８．１ ３段階法を使用して産生されたＧＭ ＮＫ細胞
いくつかの代替法では、単離されたＮＫ細胞集団、例えば、ＧＭ ＮＫ細胞集団を含む
組成物、例えば、医薬組成物が、本明細書において提供される。特定の代替法では、前記
の単離されたＮＫ細胞集団は、胎盤灌流液、臍帯血および／または末梢血から単離された
造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆体細胞から産生される。別の特定の代替法では
、前記の単離されたＮＫ細胞集団は、組成物中に少なくとも５０％の細胞を含む。別の特
定の代替法では、前記の単離されたＮＫ細胞集団、例えば、ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞は、
組成物中の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の細胞を含
む。ある特定の代替法では、前記の単離されたＮＫ細胞集団中の５％、１０％、１５％、
２０％、２５％、３０％、３５％または４０％以下の細胞が、ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞で
ある。ある特定の代替法では、前記ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞は、ＣＤ１６^－である。

【0106】

ＮＫ細胞集団、例えば、ＧＭ ＮＫ細胞集団は、ｉｎ ｖｉｖｏで使用するために医薬
組成物に製剤化することができる。このような医薬組成物は、薬学的に許容される担体、
例えば、生理食塩水溶液またはｉｎ ｖｉｖｏ投与のためのその他の許容される生理学的
に許容される溶液中にＮＫ細胞の集団を含む。本発明の医薬組成物は、本明細書において
別の場所に記載されるＮＫ細胞集団のいずれかを含み得る。

【0107】

本明細書に記載される医薬組成物は、５０％の生存可能である細胞またはそれ以上を含
む（すなわち、例えば、集団中の細胞の少なくとも５０％が機能的であるまたは生存して
いる）ＮＫ細胞の集団を含む。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも６０％が、生存可
能である。より好ましくは、医薬組成物中の集団中の細胞の少なくとも７０％、８０％、
９０％、９５％または９９％または上記のパーセンテージの任意の２つによって規定され
る範囲内の任意のパーセンテージが生存可能である。

【0108】

本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、移植を容易にする１種または複数の化合
物、アルブミン、デキストラン４０、ゼラチンおよび／またはヒドロキシエチルデンプン
などの安定化剤を含み得る。

【0109】

注射用溶液として製剤化される場合には、１つの代替法において、医薬組成物は、１．
２５％のＨＳＡおよび２．５％のデキストランを含み得る。細胞生成物の投与に適したそ
の他の注射用製剤を使用してもよい。

【0110】

１つの代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、全身
または局所投与に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、
例えば、医薬組成物は、非経口投与に適している。特定の代替法では、本明細書において
提供される組成物、例えば、医薬組成物は、注射、注入、静脈内（ＩＶ）投与、大腿内投
与または腫瘍内投与に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成
物、例えば、医薬組成物は、デバイス、マトリックスまたはスキャフォールドによる投与
に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組
成物は、注射に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例
えば、医薬組成物は、カテーテルによる投与に適している。特定の代替法では、本明細書
において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、局所注射に適している。より特定の
代替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、固形腫瘍（例
えば、肉腫）への直接的な局所注射に適している。特定の代替法では、本明細書において
提供される組成物、例えば、医薬組成物は、シリンジによる注射に適している。特定の代
替法では、本明細書において提供される組成物、例えば、医薬組成物は、ガイドされた送
達による投与に適している。特定の代替法では、本明細書において提供される組成物、例
えば、医薬組成物は、腹腔鏡検査、内視鏡、超音波、コンピューター断層撮影法、磁気共
鳴または放射線医学によって補助される注射に適している。

【0111】

ある特定の代替法では、ＮＫ細胞、例えば、ＧＭ ＮＫ細胞を含む本明細書において提
供される組成物、例えば、医薬組成物は、医薬等級の投与可能な単位として提供される。
このような単位は、別個の容量、例えば、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、３
５ｍＬ、４０ｍＬ、４５ｍＬ、５０ｍＬ、５５ｍＬ、６０ｍＬ、６５ｍＬ、７０ｍＬ、７
５ｍＬ、８０ｍＬ、８５ｍＬ、９０ｍＬ、９５ｍＬ、１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍ
Ｌ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、３５０ｍＬ、４００ｍＬ、４５０ｍＬ、５００ｍＬなどま
たは上記の容量量の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の容量で提供できる。
このような単位は、指定の細胞数、例えば、ＧＭ ＮＫ細胞、例えば、１ミリリットルあ
たり１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×
１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８個の、もしくはそれより多い細胞、または
単位当たり１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６
、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１
０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１個の、もしくはそれより多い細胞または上記の値の
任意の２つによって規定される範囲の間の、単位あたりの任意の細胞数を含有するように
提供できる。特定の代替法では、単位は、１ミリリットルあたり約、少なくとも約、また
は多くて約１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６
個の、もしくはそれより多いＧＭ ＮＫ細胞、または単位あたり１×１０^４、５×１０^４
、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１
０^８、５ｘ１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１
１個の、もしくはそれより多い細胞または上記の値の任意の２つによって規定される範囲
内のミリリットルまたは単位あたりの任意の細胞数を含み得る。このような単位は、指定
の数のＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団および／または任意のその他の細胞を含有するように
提供できる。特定の代替法では、ＮＫ細胞は本明細書において提供されるような比で存在
する。

【0112】

別の特定の代替法では、前記組成物中の前記の単離されたＮＫ細胞、例えば、ＧＭ Ｎ
Ｋ細胞は、単一個体に由来する。より特定の代替法では、前記の単離されたＮＫ細胞は、
少なくとも２つの異なる個体に由来するＮＫ細胞を含む。別の特定の代替法では、前記組
成物中の前記の単離されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を用いる処置が意図される個体とは異な
る個体に由来する。別の特定の代替法では、前記ＮＫ細胞は、前記ＮＫ細胞が、同等数の
ナチュラルキラー細胞、すなわち、前記免疫調節性化合物またはサリドマイドと接触され
ていない、または近接されていないＮＫ細胞よりも多くグランザイムＢおよび／またはパ
ーフォリンを検出可能に発現するのに十分な量および時間、免疫調節性化合物またはサリ
ドマイドと接触されている、または近接されている。別の特定の代替法では、前記組成物
は、免疫調節性化合物もしくはサリドマイドをさらに含む、または免疫調節性化合物もし
くはサリドマイドとの製剤組合せで、もしくはそれとともに（例えば、その前、その間ま
たはその後であるが、別個に）提供される。ある特定の代替法では、免疫調節性化合物は
、以下に記載される化合物である。例えば、その開示内容が参照により全文で本明細書に
組み込まれる（特許文献８）を参照のこと。ある特定の代替法では、免疫調節性化合物は
、アミノ置換イソインドリンである。１つの代替法では、免疫調節性化合物は、３－（４
－アミノ－１－オキソ－１，３－ジヒドロイソインドール－２－イル）－ピペリジン－２
，６－ジオン、３－（４’アミノイソインドリン（ａｍｉｎｏｉｓｏｌｉｎｄｏｌｉｎｅ
）－１’－オン）－１－ピペリジン－２，６－ジオン、４－（アミノ）－２－（２，６－
ジオキソ（３－ピペリジル））－イソインドリン－１，３－ジオンまたは４－アミノ－２
－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）イソインドール－１，３－ジオンである。
別の代替法では、免疫調節性化合物は、ポマリドミドまたはレナリドミドである。別の代
替法では、前記免疫調節性化合物は、以下の構造：

【0113】

【化1】

［式中、ＸおよびＹのうち一方は、Ｃ＝Ｏであり、ＸおよびＹのうちもう一方は、Ｃ＝Ｏ
またはＣＨ_２であり、Ｒ^２は、水素または低級アルキルである］
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、包接体、エナンチ
オマー、ジアステレオマー、ラセミ体または立体異性体の混合物である。別の代替法では
、前記免疫調節性化合物は、以下の構造：

【0114】

【化2】

［式中、ＸおよびＹのうち一方は、Ｃ＝Ｏであり、もう一方は、ＣＨ_２またはＣ＝Ｏであ
り、
Ｒ^１は、Ｈ、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキル、（Ｃ_３～Ｃ_７）シクロアルキル、（Ｃ_２～Ｃ_８
）アルケニル、（Ｃ_２～Ｃ_８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ_０～Ｃ_４）アルキ
ル－（Ｃ_１～Ｃ_６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ_０～Ｃ_４）アルキル－（Ｃ_２～Ｃ_５）ヘ
テロアリール、Ｃ（Ｏ）Ｒ^３、Ｃ（Ｓ）Ｒ^３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ^４、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキル
－Ｎ（Ｒ^６）_２、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキル－ＯＲ^５、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキル－Ｃ（Ｏ）
ＯＲ^５、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^３、Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ^３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ^３Ｒ^３’、Ｃ（Ｓ）ＮＲ^３
Ｒ^３’または（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキル－Ｏ（ＣＯ）Ｒ^５であり、
Ｒ^２は、Ｈ、Ｆ、ベンジル、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキル、（Ｃ_２～Ｃ_８）アルケニルまた
は（Ｃ_２～Ｃ_８）アルキニルであり、
Ｒ^３およびＲ^３’は独立に、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキル、（Ｃ_３～Ｃ_７）シクロアルキル
、（Ｃ_２～Ｃ_８）アルケニル、（Ｃ_２～Ｃ_８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ_０
～Ｃ_４）アルキル－（Ｃ_１～Ｃ_６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ_０～Ｃ_４）アルキル－（
Ｃ_２～Ｃ_５）ヘテロアリール、（Ｃ_０～Ｃ_８）アルキル－Ｎ（Ｒ^６）_２、（Ｃ_１～Ｃ_８）
アルキル－ＯＲ^５、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキル－Ｃ（０）ＯＲ^５、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキル
－Ｏ（ＣＯ）Ｒ^５またはＣ（Ｏ）ＯＲ^５であり、
Ｒ^４は、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキル、（Ｃ_２～Ｃ_８）アルケニル、（Ｃ_２～Ｃ_８）アルキ
ニル、（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキル－ＯＲ^５、ベンジル、アリール、（Ｃ_０～Ｃ_４）アルキル
－（Ｃ_１～Ｃ_６）ヘテロシクロアルキルまたは（Ｃ_０～Ｃ_４）アルキル－（Ｃ_２～Ｃ_５）
ヘテロアリールであり、
Ｒ^５は、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキル、（Ｃ_２～Ｃ_８）アルケニル、（Ｃ_２～Ｃ_８）アルキ
ニル、ベンジル、アリールまたは（Ｃ_２～Ｃ_５）ヘテロアリールであり、
Ｒ^６の各出現は独立に、Ｈ、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキル、（Ｃ_２～Ｃ_８）アルケニル、（
Ｃ_２～Ｃ_８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ_２～Ｃ_５）ヘテロアリールまたは（
Ｃ_０～Ｃ_８）アルキル－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ^５であるか、またはＲ^６基を接続して、ヘテロシ
クロアルキル基を形成してもよく、
ｎは、０または１であり、
＊は、キラル炭素中心を表す］
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、包接体、エナンチ
オマー、ジアステレオマー、ラセミ体または立体異性体の混合物である。別の代替法では
、前記免疫調節性化合物は、以下の構造：

【0115】

【化3】

［式中、
ＸおよびＹのうち一方は、Ｃ＝Ｏであり、もう一方は、ＣＨ_２またはＣ＝Ｏであり、
Ｒは、ＨまたはＣＨ_２ＯＣＯＲ’であり、
（ｉ）Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３もしくはＲ^４は各々、他とは独立に、ハロ、１～４個の炭素原
子のアルキルもしくは１～４個の炭素原子のアルコキシであるか、または（ｉｉ）Ｒ^１、
Ｒ^２、Ｒ^３もしくはＲ^４のうち１つは、ニトロもしくは－ＮＨＲ^５であり、Ｒ^１、Ｒ^２、
Ｒ^３もしくはＲ^４の内の残りは水素であり、
Ｒ^５は、水素または１～８個の炭素のアルキルであり、
Ｒ^６は、水素、１～８個の炭素原子のアルキル、ベンゾ、クロロまたはフルオロであり
、
Ｒ’は、Ｒ^７－ＣＨＲ^１０－Ｎ（Ｒ^８Ｒ^９）であり、
Ｒ^７は、ｍ－フェニレンまたはｐ－フェニレンまたは－（Ｃ_ｎＨ_２ｎ）－（式中、ｎは
、０～４の値を有する）であり、
Ｒ^８およびＲ^９は各々独立して、水素もしくは１～８個の炭素原子のアルキルであるか
、またはＲ^８およびＲ^９は一緒になって、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチ
レンまたは－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｘ_１ＣＨ_２ＣＨ_２－（式中、Ｘ_１は、－Ｏ－、－Ｓ－または－
ＮＨ－である）であり、
Ｒ^１０は、水素もしくは１～８個の炭素原子のアルキルまたはフェニルであり、
＊は、キラル炭素中心を表す］
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、包接体、エナンチ
オマー、ジアステレオマー、ラセミ体または立体異性体の混合物である。

【0116】

別の特定の代替法では、本明細書に記載される組成物は、１種または複数の抗癌化合物
、例えば、１種または複数の以下に記載される抗癌化合物をさらに含む、またはそれとの
生成物組合せで、もしくはそれとともに投与される。

【0117】

より特定の代替法では、組成物は、遺伝子改変されているか否かに関わらず、別の供給
源に由来する、または別の方法によって作製されたＮＫ細胞を含む。特定の代替法では、
前記のその他の供給源は、胎盤血液および／または臍帯血である。別の特定の代替法では
、前記のその他の供給源は、末梢血である。より特定の代替法では、前記組成物中のＮＫ
細胞集団は、別の供給源に由来する、または別の方法で作製されたＮＫ細胞と、約１００
：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５
：３５、６０：４０、５５：４５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、
３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１
、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１，７０：１、６５：１、６０：１
、５５：１、５０：１，４５：１，４０：１、３５：１，３０：１，２５：１，２０：１
、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：
２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：
６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００など
の比、または任意の２つの上記の比によって規定される範囲の間の任意の比で組み合わさ
れる。

【0118】

別の特定の代替法では、組成物は、本明細書に記載される３段階法を使用して産生され
たＮＫ細胞集団および単離された胎盤灌流液または単離された胎盤灌流液細胞のいずれか
を含む。より特定の代替法では、前記胎盤灌流液は、前記ＮＫ細胞集団と同一個体に由来
する。別のより特定の代替法では、前記胎盤灌流液は、前記ＮＫ細胞集団とは異なる個体
に由来する胎盤灌流液を含む。別の特定の代替法では、前記胎盤灌流液中のすべてまたは
実質的にすべて（例えば、９０％、９５％、９８％または９９％より多く）の細胞は、胎
児細胞である。別の特定の代替法では、胎盤灌流液または胎盤灌流液細胞は、胎児および
母体細胞を含む。より特定の代替法では、前記胎盤灌流液中の胎児細胞は、前記灌流液中
の９０％、８０％、７０％、６０％または５０％未満の（ただしゼロではない）細胞また
は上記のパーセンテージの任意の２つによって規定される範囲の間の任意のパーセンテー
ジの細胞を含む。別の特定の代替法では、前記灌流液は、胎盤脈管構造を通る０．９％の
ＮａＣｌ溶液の通過によって得られる。別の特定の代替法では、前記灌流液は、培養培地
を含む。別の特定の代替法では、前記灌流液は、赤血球を除去するように処置されている
。別の特定の代替法では、前記組成物は、免疫調節性化合物、例えば、以下に記載される
免疫調節性化合物、例えば、アミノ置換イソインドリン化合物を含む。別の特定の代替法
では、組成物は、１種または複数の抗癌化合物、例えば、１種または複数の以下に記載さ
れる抗癌化合物をさらに含む。

【0119】

別の特定の代替法では、組成物は、ＮＫ細胞集団および胎盤灌流液細胞を含む。より特
定の代替法では、前記胎盤灌流液細胞は、前記ＮＫ細胞集団と同一個体に由来する。別の
より特定の代替法では、前記胎盤灌流液細胞は、前記ＮＫ細胞集団とは異なる個体に由来
する。別の特定の代替法では、組成物は、単離された胎盤灌流液および単離された胎盤灌
流液細胞を含み、前記の単離された灌流液および前記の単離された胎盤灌流液細胞は、異
なる個体に由来する。胎盤灌流液を含む上記の代替法のいずれかの別のより特定の代替法
では、前記胎盤灌流液は、少なくとも２つの個体に由来する胎盤灌流液を含む。胎盤灌流
液細胞を含む上記の代替法のいずれかの別のより特定の代替法では、前記の単離された胎
盤灌流液細胞は、少なくとも２人の個体に由来する。別の特定の代替法では、前記組成物
は、免疫調節性化合物を含む。別の特定の代替法では、組成物は、１種または複数の抗癌
化合物、例えば、１種または複数の以下に記載される抗癌化合物をさらに含む。

【0120】

９．ＧＭ ＮＫ細胞の使用
本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載される３段階法によっ
て産生されるＧＭ ＮＫ細胞は、癌を有する個体、例えば、固形腫瘍細胞および／もしく
は血液癌細胞を有する個体またはウイルス感染を有する人に、療法を提供する方法におい
て使用できる。いくつかのこのような代替法では、ＮＫ細胞の有効投与量は、１×１０^４
～５×１０^４、５×１０^４～１×１０^５、１×１０^５～５×１０^５、５×１０^５～１×１
０^６、１×１０^６～５×１０^６、５×１０^６～１×１０^７個の範囲またはそれより多い細
胞／体重１キログラムである。いくつかのこのような代替法では、ＮＫ細胞の有効投与量
は、１×１０^４～５×１０^４、５×１０^４～１×１０^５、１×１０^５～５×１０^５、５×
１０^５～１×１０^６、１×１０^６～５×１０^６、５×１０^６～１×１０^７個の範囲または
それより多い細胞／体重１キログラムまたは上記の値の任意の２つによって規定される範
囲の間の任意の細胞数／体重１キログラムである。ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載さ
れるＧＭ ＮＫ細胞はまた、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法において使用できる。

【0121】

ａ．６．９．１癌を有する個体の治療
１つの代替法では、癌、例えば、血液癌または固形腫瘍を有する個体に療法を提供する
方法が本明細書において提供され、前記個体、好ましくは、抗癌療法を受けるように選択
または同定されているものに、治療上有効な量の本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞、
例えば、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞集団を投与することを含む。ある特定の代
替法では、個体は、ナチュラルキラー細胞の欠乏、例えば、個体の癌に対して活性のＮＫ
細胞の欠乏を有し、前記個体は、療法を受け取る前にそのようなものとして同定または選
択されている。特定の代替法では、方法は、前記個体に、単離された胎盤灌流液または単
離された胎盤灌流液細胞、例えば、治療上有効な量の胎盤灌流液または単離された胎盤灌
流液細胞を投与することをさらに含む。いくつかの代替法では、個体は、単離された胎盤
灌流液または単離された胎盤灌流液細胞を受けるように選択されている。別の特定の代替
法では、方法は、前記個体に、有効量の免疫調節性化合物、例えば、上記の免疫調節性化
合物またはサリドマイドを投与することをさらに含む。いくつかの代替法では、個体は、
免疫調節性化合物を受けるように選択されている。本明細書において、「有効量」とは、
例えば、個体が患っている癌の１つまたは複数の症状の、検出可能な改善、進行の減少、
排除をもたらす量である。

【0122】

単離されたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、全身である場合も局
所である場合もある。特定の代替法では、投与は、非経口である。特定の代替法では、対
象への単離されたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、注射、注入、静
脈内（ＩＶ）投与、大腿内投与または腫瘍内投与による。特定の代替法では、対象への単
離されたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、デバイス、マトリックス
またはスキャフォールドを用いて実施される。特定の代替法では、対象への単離されたＧ
Ｍ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、注射による。特定の代替法では、対
象への単離されたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、カテーテルによ
る。特定の代替法では、ＧＭ ＮＫ細胞の注射は、局所注射である。より特定の代替法で
は、局所注射は、固形腫瘍（例えば、肉腫）へ直接的である。特定の代替法では、対象へ
の単離されたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、シリンジによる注射
による。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組
成物の投与は、ガイドされた送達による。特定の代替法では、注射による対象への単離さ
れたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、腹腔鏡検査、内視鏡、超音波
、コンピューター断層撮影法、磁気共鳴または放射線医学によって補助される。

【0123】

特定の代替法では、癌は、血液癌、例えば、白血病またはリンパ腫である。より特定の
代替法では、癌は、急性白血病、例えば、急性Ｔ細胞白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ
）、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、前駆Ｂ急性
リンパ性白血病、前駆Ｔ急性リンパ性白血病、バーキット白血病（バーキットリンパ腫）
または急性混合型（ｂｉｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ）白血病、慢性白血病、例えば、慢性骨髄
性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性単球性白血病、慢性リンパ性白血病（Ｃ
ＬＬ）／小リンパ性リンパ腫またはＢ細胞前リンパ性白血病、ヘアリー細胞リンパ腫、Ｔ
細胞前リンパ性白血病またはリンパ腫、例えば、組織球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リ
ンパ腫（例えば、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症）、脾臓周辺帯リンパ腫、
形質細胞新生物（例えば、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、モノクローナル免疫グロブリン
沈着症または重鎖病）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、節性辺縁帯
Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞
型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ
腫、原発性滲出液リンパ腫、Ｔ細胞大型顆粒リンパ性白血病、侵攻性ＮＫ細胞白血病、成
体Ｔ細胞白血病／リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻腔型、腸症型Ｔ細胞リンパ
腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉症（セザリー症候群）、
原発性皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害（例えば、原発性皮膚未分化大細胞リン
パ腫またはリンパ腫様丘疹症）、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫
、不特定の未分化大細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫または結節性リンパ球優位型ホジキ
ンリンパ腫である。別の特定の代替法では、癌は、多発性骨髄腫または骨髄異形成症候群
である。

【0124】

ある特定の他の特定の代替法では、癌は、固形腫瘍、例えば、癌腫、例えば、腺癌、副
腎皮質癌腫、結腸腺癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌腫、腺管細胞癌腫、肺癌腫、甲状腺癌
腫、鼻咽頭癌腫、黒色腫（例えば、悪性黒色腫）、非黒色腫皮膚癌腫または不特定癌腫、
類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫、生殖細胞腫瘍（例え
ば、精巣癌、卵巣癌、絨毛癌、卵黄嚢腫瘍、胚細胞腫など）、肝芽腫（ｈｅｐａｔｏｓｂ
ｌａｓｔｏｍａ）、肝細胞癌腫、神経芽細胞腫、非横紋筋肉腫軟組織肉腫、骨肉腫、網膜
芽細胞腫、横紋筋肉腫またはウィルムス腫瘍である。別の代替法では、固形腫瘍は、膵臓
癌または乳癌である。その他の代替法では、固形腫瘍は、聴神経腫瘍、星状細胞腫（例え
ば、グレードＩ毛様細胞性星状細胞腫、グレードＩＩ低悪性度星状細胞腫、グレードＩＩ
Ｉ未分化星状細胞腫またはグレードＩＶ多形神経膠芽腫）、脊索腫、頭蓋咽頭腫、神経膠
腫（例えば、脳幹神経膠腫、上衣腫、混合膠腫、視神経神経膠腫または上衣下腫）、神経
膠芽腫、髄芽腫、髄膜腫、転移性脳腫瘍、乏突起神経膠腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、原
始神経外胚葉性腫瘍またはシュワン腫である。別の代替法では、癌は、前立腺癌である。
別の代替法では、癌は、肝臓癌である。別の代替法では、癌は、肺癌である。別の代替法
では、癌は、腎癌である。

【0125】

ある特定の代替法では、癌、例えば、血液癌または固形腫瘍を有する個体、例えば、ナ
チュラルキラー細胞の欠乏を有する個体は、前記投与の前に骨髄移植を受けている個体で
ある。ある特定の代替法では、骨髄移植は、前記癌の治療においてであった。ある特定の
その他の代替法では、骨髄移植は、前記癌以外の状態の治療においてであった。ある特定
の代替法では、個体は、前記骨髄移植に加えて免疫抑制剤を受け取った。ある特定の代替
法では、骨髄移植を受けていた個体は、前記投与の時間に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の
１つまたは複数の症状を示す。ある特定のその他の代替法では、骨髄移植を受けていた個
体に、ＧＶＨＤの症状が示される前に前記細胞が投与される。

【0126】

ある特定の代替法では、癌、例えば、血液癌を有する個体は、前記投与の前に、少なく
とも１用量のＴＮＦα阻害剤、例えば、エタネルセプト（登録商標）（エンブレル）を受
け取っている。特定の代替法では、前記個体は、前記癌の診断の１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月以内に、または上記の期間のうち任意の２つに
よって規定される範囲内にＴＮＦα阻害剤の前記用量を受け取った。特定の代替法では、
一定用量のＴＮＦα阻害剤を受け取っている個体は、急性骨髄性白血病を示す。より特定
の代替法では、一定用量のＴＮＦα阻害剤を受け取っている個体は、急性骨髄性白血病を
示し、血液細胞において染色体５の長腕の欠失をさらに示す。別の代替法では、癌、例え
ば、血液癌を有する個体は、フィラデルフィア染色体を示す。

【0127】

ある特定のその他の代替法では、前記個体における癌、例えば、血液癌または固形腫瘍
は、１種または複数の抗癌薬に対して抵抗性である。特定の代替法では、癌は、グリベッ
ク（登録商標）（メシル酸イマチニブ）に対して抵抗性である。

【0128】

ある特定の代替法では、前記個体における癌、例えば、血液癌は、少なくとも１種の抗
癌薬に対して応答し、この代替法では、本明細書に記載される胎盤灌流液、単離された胎
盤灌流液細胞、単離されたナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤ナチュラルキラー細胞、
例えば、胎盤由来中間体ナチュラルキラー細胞、単離された混合ナチュラルキラー細胞ま
たはＮＫ細胞および／またはそれらの組合せならびに任意選択で、免疫調節性化合物を、
補助療法として、または前記抗癌薬との併用療法として添加する。ある特定のその他の代
替法では、癌、例えば、血液癌を有する個体は、少なくとも１種の抗癌薬を受け取ってお
り、前記投与の前に再発していた。ある特定の代替法では、療法を受ける個体は、抵抗性
癌を有している。１つの代替法では、本明細書に記載される細胞を用いる癌治療法は、癌
の再発に対して保護する（例えば、予防または遅延する）。１つの代替法では、本明細書
に記載される癌治療法は、１ヶ月もしくはそれより多い、２、３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１もしくは１２ヶ月もしくはそれより多い、１年もしくはそれより多い、２
年もしくはそれより多い、３年もしくはそれより多い、または４年もしくはそれより多い
間、癌の寛解をもたらす。

【0129】

１つの代替法では、多発性骨髄腫を有する個体に療法を提供する方法であって、個体に
（１）レナリドミド、（２）メルファランおよび（３）ＧＭ ＮＫ細胞を投与することを
含む方法が、本明細書において提供され、これでは、前記ＧＭ ＮＫ細胞は、前記個体に
おいて多発性骨髄腫を治療するのに有効である。特定の代替法では、前記ＧＭ ＮＫ細胞
は、臍帯血ＮＫ細胞または臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から産生されたＮＫ細胞
に由来する。別の代替法では、前記ＧＭ ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するために本明細
書に記載される３段階法によって産生されている。別の代替法では、前記レナリドミド、
メルファランおよび／またはＧＭ ＮＫ細胞は、互いに別個に投与される。多発性骨髄腫
を有する個体を治療する方法のある特定の代替法では、前記ＧＭ ＮＫ細胞は、造血幹細
胞または前駆体細胞、例えば、ＣＤ３４^＋幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およ
びトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生
することと、続いて、前記の第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン
－１５（ＩＬ－１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団
を産生することと、続いて、前記の第２の細胞の集団を、ＩＬ－２および／またはＩＬ－
１５を含み、幹細胞動員剤および／またはＬＭＷＨを欠く第３の培地中で培養して、第３
の細胞の集団を産生することであって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－、Ｃ
Ｄ１６－またはＣＤ１６^＋およびＣＤ９４^＋またはＣＤ９４^－であるナチュラルキラー細
胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０％、８５％、
９０％または９５％が生存可能であることを含む方法によってＮＫ細胞を産生することを
含む方法によって産生される。ある特定の代替法では、前記の第１の培地および／または
前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タ
ンパク質－１アルファ（ＭＩＰ－１α）を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培
地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３リガンド（Ｆ
ｌｔ－３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、
ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αお
よび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では。第１の培地、第２の培地または
第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない。

【0130】

別の代替法では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する個体を治療する方法であって、
個体にＮＫ細胞（任意選択で、ＩＬ２単独またはＩＬ－１５単独、ＩＬ２およびＩＬ１２
およびＩＬ１８、ＩＬ１２およびＩＬ１５、ＩＬ１２およびＩＬ１８、ＩＬ２およびＩＬ
１２およびＩＬ１５およびＩＬ１８またはＩＬ２およびＩＬ１５およびＩＬ１８を用いる
前処理によって活性化された）を投与することを含む方法が本明細書において提供され、
これでは、前記ＮＫ細胞は、前記個体においてＡＭＬを治療するのに有効である。特定の
代替法では、単離された、本明細書に記載される３段階法を使用して産生されたＮＫ細胞
集団は、前記投与に先立って、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８またはＩＬ１５のうち１種ま
たは複数を用いて前処理されている。特定の代替法では、前記ＧＭ ＮＫ細胞は、臍帯血
ＮＫ細胞または臍帯血造血細胞、例えば、造血幹細胞から産生されたＮＫ細胞に由来する
。別の代替法では、前記ＧＭ ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産生するための本明細書に記載さ
れる３段階法によって産生されていた。ＡＭＬを有する個体を治療する方法のある特定の
代替法では、前記ＮＫ細胞は、本明細書に記載されるような３段階法によって産生される
。特定の代替法では、前記の方法によって治療されるべきＡＭＬは、難治性ＡＭＬ、予後
不良ＡＭＬまたは小児ＡＭＬを含む。難治性ＡＭＬ、予後不良ＡＭＬまたは小児ＡＭＬの
治療のためにＮＫ細胞を投与するための当技術分野で公知の方法は、この目的のために適
応され得る、例えば、各々参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、（非特許文献
１）；（非特許文献２）を参照のこと。ある特定の代替法では、前記個体は、ＡＭＬに対
する少なくとも１種の非ナチュラルキラー細胞治療薬が失敗しているＡＭＬを有する。特
定の代替法では、前記個体は、６５歳以上であり、最初の寛解中である。特定の代替法で
は、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前に、フルダラビン、シタラビン
または両方を用いてコンディショニングされている。

【0131】

ＡＭＬを有する個体を治療する方法のその他の特定の代替法では、前記ＧＭ ＮＫ細胞
は、造血幹細胞または前駆体細胞、例えば、ＣＤ３４^＋幹細胞または前駆体細胞を、幹細
胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞
の集団を産生することと、続いて、前記の第１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびイン
ターロイキン－１５（ＩＬ－１５）を含み、Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２
の細胞の集団を産生することと、続いて、前記の第２の細胞の集団を、ＩＬ－２および／
またはＩＬ－１５を含み、幹細胞動員剤および／またはＬＭＷＨを欠く第３の培地中で培
養して、第３の細胞の集団を産生することであって、第３の細胞の集団が、ＣＤ５６^＋、
ＣＤ３^－、ＣＤ１６－またはＣＤ１６^＋およびＣＤ９４^＋またはＣＤ９４^－であるナチュ
ラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少なくとも７０％または少なくとも８０
％、８５％、９０％または９５％が生存可能であることを含む方法によってＮＫ細胞を産
生することを含む方法によって産生される。ある特定の代替法では、前記の第１の培地お
よび／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）および／またはマクロファ
ージ炎症性タンパク質－１アルファ（ＭＩＰ－１α）を欠く。ある特定の代替法では、前
記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３
リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）を欠く。特定の代替法では、前記の第１の培地および前記の第
２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ－１αを欠き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、
ＭＩＰ－１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある特定の代替法では、第１の培地、第
２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例えば、低分子量ヘパリンを含まない
。

【0132】

別の代替法では、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する個体を治療する方法であって
、個体に、（１）レナリドミド、（２）メルファラン、（３）フルダラビンおよび（４）
ＮＫ細胞、例えば、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞の治療上有効用量を投与するこ
とを含む方法が、本明細書において提供され、これでは、前記ＧＭ ＮＫ細胞は、前記個
体において前記ＣＬＬを治療する、または寛解させる、または阻害するのに有効である。
特定の代替法では、前記ＧＭ ＮＫ細胞は、臍帯血ＮＫ細胞または臍帯血造血幹細胞から
産生されたＮＫ細胞に由来する。別の代替法では、前記ＧＭ ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を産
生するために本明細書に記載される３段階法によって産生されている。上記の方法のいず
れかの特定の代替法では、前記レナリドミド、メルファラン、フルダラビンおよびＧＭ
ＮＫ細胞は、前記個体に別個に投与される。ＣＬＬを有する個体に療法を提供する方法の
ある特定の代替法では、前記ＧＭ ＮＫ細胞は、造血幹細胞または前駆体細胞、例えば、
ＣＤ３４^＋幹細胞または前駆体細胞を、幹細胞動員剤およびトロンボポエチン（Ｔｐｏ）
を含む第１の培地中で培養して、第１の細胞の集団を産生することと、続いて、前記の第
１の細胞の集団を、幹細胞動員剤およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）を含み、
Ｔｐｏを欠く第２の培地中で培養して、第２の細胞の集団を産生することと、続いて、前
記の第２の細胞の集団を、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５を含み、幹細胞動員剤およ
びＬＭＷＨを欠く第３の培地中で培養して、第３の細胞の集団を産生することであって、
第３の細胞の集団が、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－、ＣＤ１６－またはＣＤ１６^＋およびＣＤ９
４^＋またはＣＤ９４^－であるナチュラルキラー細胞を含み、ナチュラルキラー細胞の少な
くとも７０％または少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％が生存可能であるこ
とを含む方法によってＮＫ細胞を産生することを含む方法によって産生される。ある特定
の代替法では、前記の第１の培地および／または前記の第２の培地は、白血病阻害因子（
ＬＩＦ）および／またはマクロファージ炎症性タンパク質－１アルファ（ＭＩＰ－１α）
を欠く。ある特定の代替法では、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／ま
たはＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）を欠く。特定の代替法では
、前記の第１の培地および前記の第２の培地は、ＬＩＦおよび／またはＭＩＰ－１αを欠
き、前記の第３の培地は、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１αおよび／またはＦｌｔ３Ｌを欠く。ある
特定の代替法では、第１の培地、第２の培地または第３の培地のいずれも、ヘパリン、例
えば、低分子量ヘパリンを含まない。

【0133】

ｂ．６．９．２腫瘍細胞増殖の抑制
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を、腫
瘍細胞と近接させること、例えば、腫瘍細胞を、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞と
接触させることを含む方法が、本明細書においてさらに提供される。任意選択で、単離さ
れた胎盤灌流液または単離された胎盤灌流液細胞は、腫瘍細胞および／または本明細書に
記載されるＧＭ ＮＫ細胞と近接される。別の特定の代替法では、免疫調節性化合物、例
えば、上記の免疫調節性化合物またはサリドマイドが、腫瘍細胞および／または本明細書
に記載されるＧＭ ＮＫ細胞とさらに近接され、その結果、腫瘍細胞の増殖が、本明細書
に記載されるＧＭ ＮＫ細胞と近接されない同種の腫瘍細胞と比較して検出可能に低減さ
れる。任意選択で、単離された胎盤灌流液または単離された胎盤灌流液細胞は、免疫調節
性化合物と接触されている、またはそれと近接されている、腫瘍細胞および／または本明
細書に記載されたＧＭ ＮＫ細胞と近接される。

【0134】

本明細書において、ある特定の代替法では、細胞に関して、「接触させること」または
「近接させること」とは、１つの代替法において、ナチュラルキラー細胞、例えば、本明
細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞集団と腫瘍細胞の間の直接の物理的な、例えば、細胞－
細胞接触を包含する。別の代替法では、「接触させること」は、同一物理的空間における
存在を包含する、例えば、ナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載されるＧＭ
ＮＫ細胞および／または単離された組み合わされたナチュラルキラー細胞が、腫瘍細胞と
同一容器（例えば、培養ディッシュ、マルチウェルプレート）中に入れられる。別の代替
法では、ナチュラルキラー細胞、例えば、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞および腫
瘍細胞を「接触させること」は、例えば、ナチュラルキラー細胞、例えば、ＧＭ ＮＫ細
胞を、個体、例えば、腫瘍細胞を含むヒト、例えば、癌患者に注射または注入することに
よって達成される。免疫調節性化合物および／またはサリドマイドに関連して「接触させ
ること」とは、例えば、細胞と、免疫調節性化合物および／またはサリドマイドが、互い
に直接的に物理的に接触されること、または同一物理的容量（例えば、細胞培養容器また
は個体）内に入れられることを意味する。

【0135】

特定の代替法では、腫瘍細胞は、血液癌細胞、例えば、白血病細胞またはリンパ腫細胞
である。より特定の代替法では、癌は、急性白血病、例えば、急性Ｔ細胞白血病細胞、急
性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、急性前骨髄球性白血病細胞、急性骨髄芽球性白血病細胞
、急性巨核芽球性白血病細胞、前駆体Ｂ急性リンパ性白血病細胞、前駆体Ｔ急性リンパ性
白血病細胞、バーキット白血病（バーキットリンパ腫）細胞または急性混合型（ｂｉｐｈ
ｅｎｏｔｙｐｉｃ）白血病細胞、慢性白血病細胞、例えば、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢
性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、慢性単球性白血病細胞、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）
／小リンパ性リンパ腫細胞またはＢ細胞前リンパ性白血病細胞、ヘアリー細胞リンパ腫細
胞、Ｔ細胞前リンパ性白血病細胞またはリンパ腫細胞、例えば、組織球性リンパ腫細胞、
リンパ形質細胞性リンパ腫細胞（例えば、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症細
胞）、脾臓周辺帯リンパ腫細胞、形質細胞新生物細胞（例えば、形質細胞骨髄腫細胞、形
質細胞腫細胞、モノクローナル免疫グロブリン沈着症または重鎖病）、節外性辺縁帯Ｂ細
胞リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）細胞、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）細胞、濾
胞性リンパ腫細胞、マントル細胞リンパ腫細胞、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞、
縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞、原発性
滲出液リンパ腫細胞、Ｔ細胞大型顆粒リンパ性白血病細胞、侵攻性ＮＫ細胞白血病細胞、
成体Ｔ細胞白血病／リンパ腫細胞、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫－鼻腔型細胞、腸症型Ｔ
細胞リンパ腫細胞、肝脾Ｔ細胞リンパ腫細胞、芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫細胞、菌状息肉
症（セザリー症候群）、原発性皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害（例えば、原発
性皮膚未分化大細胞リンパ腫またはリンパ腫様丘疹症）細胞、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リ
ンパ腫細胞、末梢Ｔ細胞リンパ腫－不特定細胞、未分化大細胞リンパ腫細胞、ホジキンリ
ンパ腫細胞または結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫細胞である。別の特定の代替法
では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞または骨髄異形成症候群細胞である。

【0136】

特定の代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞、例えば、癌腫細胞、例えば、腺癌細胞
、副腎皮質癌腫細胞、結腸腺癌細胞、結腸直腸腺癌細胞、結腸直腸癌腫細胞、腺管細胞癌
腫細胞、肺癌腫細胞、甲状腺癌腫細胞、鼻咽頭癌腫細胞、黒色腫細胞（例えば、悪性黒色
腫細胞）、非黒色腫皮膚癌腫細胞または不特定癌腫細胞、類腱腫細胞、線維形成性小円形
細胞腫瘍細胞、内分泌腫瘍細胞、ユーイング肉腫細胞、生殖細胞腫瘍細胞（例えば、精巣
癌細胞、卵巣癌細胞、絨毛癌細胞、卵黄嚢腫瘍細胞、胚細胞腫細胞など）、肝芽腫（ｈｅ
ｐａｔｏｓｂｌａｓｔｏｍａ）細胞、肝細胞癌腫細胞、神経芽細胞腫細胞、非横紋筋肉腫
軟組織肉腫細胞、骨肉腫細胞、網膜芽細胞腫細胞、横紋筋肉腫細胞またはウィルムス腫瘍
細胞である。別の代替法では、腫瘍細胞は、膵臓癌細胞または乳癌細胞である。その他の
代替法では、固形腫瘍細胞は、聴神経腫瘍細胞、星状細胞腫細胞（例えば、グレードＩ毛
様細胞性星状細胞腫細胞、グレードＩＩ低悪性度星状細胞腫細胞、グレードＩＩＩ未分化
星状細胞腫細胞またはグレードＩＶ多形神経膠芽腫細胞）、脊索腫細胞、頭蓋咽頭腫細胞
、神経膠腫細胞（例えば、脳幹神経膠腫細胞、上衣腫細胞、混合膠腫細胞、視神経神経膠
腫細胞または上衣下腫細胞）、神経膠芽腫細胞、髄芽腫細胞、髄膜腫細胞、転移性脳腫瘍
細胞、乏突起神経膠腫細胞、松果体芽腫細胞、下垂体腫瘍細胞、原始神経外胚葉性腫瘍細
胞またはシュワン腫細胞である。別の代替法では、腫瘍細胞は、前立腺癌細胞である。

【0137】

本明細書において、「治療上有益な」および「治療的利益」として、それだけには限ら
ないが、例えば、腫瘍の大きさの低減、腫瘍の増殖の減少または停止、転移性疾患を低減
することまたは予防すること、単位容量あたりの組織サンプル、例えば、血液サンプル中
の癌細胞数の低減、前記個体が有する特定の癌または腫瘍の任意の症状における臨床的改
善、個体が有する特定の癌の任意の症状の悪化の減少または停止などが挙げられる。

【0138】

ｃ．６．９．３．ＧＭ ＮＫ細胞およびその他の抗癌剤を使用する癌の治療
本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を使用して癌を有する個体に療法を提供すること
は、１種または複数のさらなる抗癌剤を含む抗癌療法レジメンの一部であり得る。さらに
またはあるいは、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を使用して癌を有する個体に療法
を提供することを使用して、１種または複数のその他の抗癌剤を含む抗癌療法を補うこと
ができる。このような抗癌剤は、当技術分野で周知であり、抗炎症剤、免疫調節剤、細胞
傷害性薬剤、癌ワクチン、化学療法薬、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＨＤＡＣ６ｉ（ＡＣＹ
－２４１））およびｓｉＲＮＡを含む。本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞に加えて、
癌を有する個体、例えば、腫瘍細胞を有する個体に投与してもよい特定の抗癌剤として、
それだけには限らないが、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン
、アドゼレシン、アドリアマイシン、アドルシル、アルデスロイキン、アルトレタミン、
アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイ
シン、アスパラギナーゼ（例えば、エルウィニア・クリサン（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙ
ｓａｎ）由来；エルウィナーゼ（Ｅｒｗｉｎａｚｅ））、アスペルリン、アバスチン（ベ
バシズマブ）、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ
、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ビスナフィドジメシレート（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ
ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブ
ロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマ
ー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール
、セレコキシブ（ＣＯＸ－２阻害剤）、セルビジン、クロラムブシル、シロレマイシン、
シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビ
ン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプ
ラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソル
ビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオ
ン酸ドロモスタノロン、ズアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロミチン、エルサ
ミトルシン、エルスパー（Ｅｌｓｐａｒ）、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロ
ピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、リ
ン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エ
トポフォス（Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ）、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、
フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシ
タビン、ホスキドンフォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒ
ドロキシ尿素、イダマイシン、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、イプ
ロプラチン、イリノテカン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸
リュープロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロ
ソキサントロン、マソプロコール、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロ
ール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカププリン、メトトレ
キサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、マイ
トカルシン、マイトクロミン、マイトギリン、マイトマルシン、マイトマイシン、マイト
スペル、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマ
イシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパルガーゼ、ペリオ
マイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピ
ポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナ
トリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、プロロイキン
（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、プリネトール（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）、ピューロマイシン、
塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、レウマトレックス、リボプリン、サフィンゴール
、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルホセートナトリウム、スパル
ソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニ
グリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タブロイド（Ｔａｂｌｏｉｄ）、タリソマイ
シン、テコガランナトリウム、タキソテール、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモ
ポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン
、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トポサル（Ｔｏｐｏｓａｒ）、クエン酸トレ
ミフェン、酢酸トレストロン、トレキサル（Ｔｒｅｘａｌｌ）、リン酸トリシリビン、ト
リメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾー
ル、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラス
チン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビング
リシネート、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾ
リジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチンおよび／または塩酸ゾルビシンが挙げ
られる。

【0139】

ＧＭ ＮＫ細胞が絡むいくつかの考慮される方法において提供してもよいさらなる抗癌
薬として、それだけには限らないが、２０－エピ－１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、
５－アザシチジン、５－エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフル
ベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ＡＬＬ－ＴＫアンタゴニスト
、アルトレタミン、アンバムスチン、アミドックス、アミホスチン、アミノレブリン酸、
アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラフォリド
、脈管形成阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリクス、抗背方化形
態形成タンパク質－１、抗アンドロゲン、前立腺癌腫、抗エストロゲン剤、アンチネオプ
ラストン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アフィジコリングリシネート、アポトーシ
ス遺伝子モジュレーター、アポトーシスレギュレーター、アプリン酸、ａｒａ－ＣＤＰ－
ＤＬ－ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチ
ン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、ア
ザトキシン、アザチロシン、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、Ｂ
ＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、ベータラ
クタム誘導体、ベータ－アレチン、ベタクラマイシンＢ、ベツリン酸、ｂＦＧＦ阻害剤、
ビカルタミド、ビサントレン、ビスアジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテ
ンＡ、ビゼレシン、ブレフレート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシミ
ン、カルシポトリオール、カルスチンＣ、カンプトサール（カンプトとも呼ばれる、イリ
ノテカン）カンプトテシン誘導体、カペシタビン、カルボキサミド－アミノ－トリアゾー
ル、カルボキシアミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔ Ｍ３、ＣＡＲＮ ７００、軟骨由来
阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン、Ｃ
Ｃ－１２２、ＣＣ－２２０、ＣＣ－４８６、セクロピンＢ、セトロレリクス、クロリン（
ｃｈｌｏｒｌｎ）、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シス－ポルフィ
リン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリ
スマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クラ
ムベスシジン８１６、クリスナトール、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体
、クラシンＡ、シクロペンタントラキノン、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビン
億ホスフェート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒド
ロジデンミンＢ、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシホスファミド、デクスラゾキサ
ン、デクスベラパミル、ジアジクオン、ジデムニンＢ、ジドックス、ジエチルノルスペル
ミン、ジヒドロ－５－アザシチジン、ジヒドロタキソール、９－；ジオキサマイシン、ジ
フェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジ
ン、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンＳＡ、エ
ブセレン、エコムスチン、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロールニチン、エレメン
、エミテフール、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲ
ンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキ
セメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィ
ナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン（例え
ば、フルダラ）、塩酸フルオロダウノルニシン、フォルフェニメックス、フォルメスタン
、フォストリエシン、ホテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロ
シタビン、ガニレリクス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘ
プスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロ
ン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモホシン、イロマスタット
、イマチニブ（例えば、グリベック（登録商標））、イミキモド、免疫賦活薬ペプチド、
インスリン様成長因子－１受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロ
ン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール、４－
；イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンＢ、イタ
セトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメラリン－Ｎトリアセテート、ランレ
オチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン、レトロ
ゾール、白血病阻害因子、白血球アルファインターフェロン、リュープロリド＋エストロ
ゲン＋プロゲステロン、リュープロレリン、レバミソール、リアロゾール、直鎖ポリアミ
ン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リッソクリナミド７、ロバプラチン
、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロキソリビン、ル
ルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶解性ペプチド、マイタンシン
、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリライシン阻害
剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、
メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、
ミリモスチム、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン類似体、ミトナフィド、
マイトトキシン線維芽細胞成長因子－サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モル
グラモスチム、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、アービタックス（セツキシマブ））、抗ＣＤ１
９抗体、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、抗ＣＳ－１抗体（例えば、エロツズ
マブ（ＢＭＳ／ＡｂｂＶｉｅ））、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ（Ｇｅｎｍａ
ｂ／Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、抗ＣＤ１３８抗体（例えば、インダツキシマブ
（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）（Ｂｉｏｔｅｓｔ ＡＧ Ｄｒｅｉｅｉｃｈ））、抗ＰＤ－
１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、デュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ））、抗
ＮＫＧ２Ａ抗体（例えば、モナリズマブ（ｍｏｎａｌｉｚｕｍａｂ）（ＩＰＨ２２０１；
Ｉｍｍａｔｅ Ｐｈａｒｍａ））、抗ＤＬＬ４抗体（例えば、デミシズマブ（Ｏｎｃｏｍ
ｅｄ／Ｃｅｌｇｅｎｅ））、抗ＤＬＬ４および抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体、抗ＲＳＰＯ３
抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、ＩＣＯＳアゴニスト抗体、抗ジシアロガングリオシド（ＧＤ２
）抗体（例えば、モノクローナル抗体３Ｆ８またはｃｈ１４．１８），抗ＥｒｂＢ２抗体
（例えば、ヘルセプチン）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバ
クテリウム細胞壁ｓｋ、モピダモール、マスタード抗癌剤、ミカペルオキシドＢ、マイコ
バクテリア細胞壁抽出物、ミリアポロン、Ｎ－アセチルジナリン、Ｎ－置換ベンズアミド
、ナファレリン、ナグレスチップ、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン
、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、ニルタミド、ニサマ
イシン、一酸化窒素モジュレーター、窒素酸化物酸化防止剤、ニトルリン、オブリメルセ
ン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））、Ｏ^６－ベンジルグアニン、オクトレオチド、オ
キセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン
、オラシン、経口サイトカインインデューサー、オルマプラチン、オサテロン、オキサリ
プラチン（例えば、フロキサチン（Ｆｌｏｘａｔｉｎ））、オキサウノマイシン、パクリ
タキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイル
リゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリ
プチン、ペグアスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリスルフェートナトリウム、ペ
ントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリリルアルコー
ル、フェナジノマイシン、酢酸フェニル、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニール、塩酸ピ
ロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノ
ゲンアクチベーター阻害剤、白金複合体、白金加賀応物、白金－トリアミン複合体、ポル
フィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルビス－アクリドン、
プロスタグランジンＪ２、プロテアソーム阻害剤、プロテインＡベースの免疫モジュレー
ター、タンパク質キナーゼＣ阻害剤、タンパク質キナーゼＣ阻害剤、微細藻類、タンパク
質チロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリ
ン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲー
ト、ｒａｆアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ｒａｓファルネシルタン
パク質トランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ阻害剤、ｒａｓ－ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レ
テリプチン、レニウムＲｅ １８６エチドロネート、リゾキシン、リボザイム、ＲＩＩレ
チナミド、ロヒツキン、ロムルチド、ロキニメックス、ルビギノンＢ１、ルボキシル、サ
フィンゴール、サイントピン、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、
Ｓｄｉ １ミメティクス、セムスチン、老化由来阻害剤１、センスオリゴヌクレオチド、
シグナル伝達阻害剤、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、酢酸フ
ェニルナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルフ
ォシン酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１
、スクアラミン、スチピアミド、ストロメライシン阻害剤、スルフィノシン、超活性血管
作用性小腸ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スウェインソニン、タリム
スチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウ
ム、テガフール、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テニポシド
、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、タリブラスチン、チオコラリン、トロンボ
ポエチン、トロンボポエチンミメティック、チマルファシン、サイモポエチン受容体アゴ
ニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、；エチルエチオプルプリンスズ、チラパザ
ミン、二塩化チタノセン、トプセンチン、トレミフェン、翻訳阻害剤、トレチノイン、ト
リアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセト
ロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメ
クス、尿生殖洞由来成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、
バリオリンＢ、ベクティビックス（パニツムマブ）ベラレゾール、ベラミン、ベルジン、
ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ボロゾール、ウェルコ
ボリン（Ｗｅｌｃｏｖｏｒｉｎ）（ロイコボリン）、ゼローダ（カペシタビン）、ザノテ
ロン、ゼニプラチン、ジラスコルブおよび／またはジノスタチンスチマラマーが挙げられ
る。

【0140】

本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を使用する癌を有する個体に提供される療法は、
１種または複数の免疫チェックポイントモジュレーターを含む抗癌療法レジメンの一部で
あり得る。ある特定の代替法では、免疫チックポイントモジュレーターは、ＣＤ２８、Ｏ
Ｘ４０、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、Ｃ
Ｄ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）
、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有－３（ＴＩＭ－３）、リンパ球活性化
遺伝子３（ＬＡＧ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞
活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、ＢおよびＴリンパ球ア
テニュエーター（ＢＴＬＡ）、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１などの免疫チェックポ
イント分子を調節する。ある特定の代替法では、免疫チェックポイント分子は、抗体また
はその抗原結合断片である。ある特定の代替法では、免疫チェックポイントモジュレータ
ーは、免疫チェックポイント分子のアゴニストである。ある特定の代替法では、免疫チェ
ックポイント分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容
体関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ（ＣＤ
２７８）、誘導可能Ｔ細胞共刺激分子）および／またはヘルペスウイルス侵入メディエー
ター（ＨＶＥＭ）である。ある特定の代替法では、免疫チェックポイントモジュレーター
は、抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の代替法では、免疫チェックポイント
モジュレーターは、免疫チェックポイント分子のアンタゴニストである。ある特定の代替
法では、免疫チェックポイント分子は、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有
－３（ＴＩＭ－３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関
連抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（
ＶＩＳＴＡ）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ＰＤ－１および／ま
たはＰＤ－Ｌ１である。ある特定の代替法では、免疫チェックポイントモジュレーターは
、抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の代替法では、免疫チェックポイントモ
ジュレーターは、抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の代替法では、抗体また
はその抗原結合断片は、ＰＤ－１と結合する。ある特定の代替法では、ＰＤ－１と結合す
る抗体またはその抗原結合断片は、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標）、ＢＭＳ－９３
６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕ
ｉｂｂ、Ｏｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）、ペムブロリズマブ（キ
イトルーダ（登録商標）、ランブロリズマブ、ＭＫ－３４７５；Ｍｅｒｃｋ）、ピディリ
ズマブ（ＣＴ－０１１；Ｃｕｒｅｔｅｃｈ、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、ＭＥＤＩ０６８０
（ＡＭＰ－５１４；Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＰＤＲ－００１（
Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＳＨＲ１２１０またはＩＮＣＳＨＲ１２１０；Ｉｎｃｙｔｅ、Ｊｉ
ａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ）である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合
断片は、ＰＤ－Ｌ１と結合する。ある特定の代替法では、ＰＤ－Ｌ１と結合する抗体また
はその抗原結合断片は、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６；Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ、Ａｓ
ｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍ
ｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒ
ｏｎｏ、Ｐｆｉｚｅｒ）またはアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ－３２８０Ａ；Ｇｅｎｅｎｔｅ
ｃｈ、Ｒｏｃｈｅ）である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合断片は、Ｌ
ＡＧ－３と結合する。ある特定の代替法では、ＬＡＧ－３と結合する抗体またはその抗原
結合断片は、ＢＭＳ－９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｇ
ＳＫ２８３１７８１（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）またはＬＡＧ５２５（Ｎｏｖａ
ｒｔｉｓ）である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＴＬＡ－
４と結合する。ある特定の代替法では、ＣＴＬＡ－４と結合する抗体またはその抗原結合
断片は、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（商標）、ＢＭＳ－７３４０１６、ＭＤＸ０１０、
ＭＤＸ－１０１；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）またはトレメリムマブ（
ＣＰ－６７５，２０６；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である。ある特
定の代替法では、抗体またはその抗原結合断片は、ＯＸ４０と結合する。ある特定の代替
法では、ＯＸ４０と結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＭＥＤＩ６４６９（Ｍｅｄ
Ｉｍｍｕｎｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＥＤＩ０５６２（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、Ａ
ｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）またはＫＨＫ４０８３（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｉｒｉｎ）
である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合断片は、ＧＩＴＲと結合する。
ある特定の代替法では、ＧＩＴＲと結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＴＲＸ５１
８（Ｌｅａｐ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）またはＭＥＤＩ１８７３（ＭｅｄＩｍｍｕｎ
ｅ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合
断片は、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）と結合する。ある特定の代替法では、ＣＤ１３７（４
－１ＢＢ）と結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＰＦ－２５６６（ＰＦ－０５０８
２５６６；Ｐｆｉｚｅｒ）またはウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３；Ｂｒｉｓｔｏｌ－
Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）である。ある特定の代替法では、抗体またはその抗原結合断
片は、ＣＤ２７と結合する。ある特定の代替法では、ＣＤ２７と結合する抗体またはその
抗原結合断片は、バリルマブ（ｖａｒｉｌｕｍａｂ）（ＣＤＸ－１１２７；Ｃｅｌｌｄｅ
ｘ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）である。

【0141】

ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を使用する、癌を有する
個体のための療法は、レナリドミドまたはポマリドミドを含む抗癌療法レジメンの一部で
ある。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を使用する、癌を有
する個体のための療法は、ＨＤＡＣ阻害剤を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特
定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫを使用する、癌を有する個体のための
療法は、抗ＣＳ－１抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、
本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗Ｃ
Ｄ３８抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記
載されるＧＭ ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＣＤ１３８抗体
を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧ
Ｍ ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＰＤ－１抗体を含む抗癌療
法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫを使
用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む抗癌療法レジメンの一
部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を使用する、癌
を有する個体のための療法は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含む抗癌療法レジメンの一部である。
ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個
体のための療法は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ、リツキサン（登録商標））
を含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧ
Ｍ ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、ＣＣ－１２２を含む抗癌療法
レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を
使用する、癌を有する個体のための療法は、ＣＣ－２２０を含む抗癌療法レジメンの一部
である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を使用する、癌を
有する個体のための療法は、抗ＤＬＬ４抗体（例えば、デミシズマブ）を含む抗癌療法レ
ジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を使
用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＤＬＬ４および抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体を
含む抗癌療法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ
ＮＫ細胞を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＲＳＰＯ３抗体を含む抗癌療
法レジメンの一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞
を使用する、癌を有する個体のための療法は、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む抗癌療法レジメン
の一部である。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を使用する
、癌を有する個体のための療法は、ＩＣＯＳアゴニスト抗体を含む抗癌療法レジメンの一
部である。

【0142】

いくつかの代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を使用する、癌を有する
個体のための療法は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）のための抗癌療法レジ
メンの一部である。１つの代替法では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載されるＧＭ
ＮＫ細胞と組み合わせた１種または複数の抗体（例えば、前記の段落に記載される抗体
）の投与を含む。それだけには限らないが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）またはその他
のＢ細胞悪性腫瘍（リンパ腫および 白血病）、神経芽細胞腫、黒色腫、乳癌および頭頸
部癌を含むいくつかの種類の癌は、このようなＡＤＣＣ法を使用して阻害または治療する
ことができる。特定の代替法では、ＡＤＣＣ療法は、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細
胞と組み合わせた、以下の抗体抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、アービタックス（セツキシマブ
））、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、抗ジシアロガングリ
オシド（ＧＤ２）抗体（例えば、モノクローナル抗体３Ｆ８またはｃｈ１４．１８）また
は抗ＥｒｂＢ２抗体（例えば、ヘルセプチン）のうち１種または複数の投与を含む。１つ
の代替法では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞と組み合わせ
た、抗ＣＤ３３ 抗体の投与を含む。１つの代替法では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書
に記載されるＧＭ ＮＫ細胞と組み合わせた、抗ＣＤ２０抗体の投与を含む。１つの代替
法では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞と組み合わせた、抗
ＣＤ１３８抗体の投与を含む。１つの代替法では、ＡＤＣＣレジメンは、本明細書に記載
されるＧＭ ＮＫ細胞と組み合わせた、抗ＣＤ３２抗体の投与を含む。

【0143】

ｄ． ６．９．４．ウイルス感染の治療
別の代替法では、ウイルス感染を有する個体の療法を提供する方法であって、前記個体
に、治療上有効な量の、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を投与することを含む方法
が、本明細書において提供される。ある特定の代替法では、個体は、ナチュラルキラー細
胞の欠乏、例えば、ＮＫ細胞または個体のウイルス感染に対して活性なその他の自然リン
パ系細胞の欠乏を有する。ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞
は、前記投与に先立って、免疫調節性化合物、例えば、上記の免疫調節性化合物またはサ
リドマイドと接触される、または近接される。ある特定の他の特定の代替法では、前記の
投与することは、前記の本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞に加えて、前記個体に、免
疫調節性化合物、例えば、上記の免疫調節性化合物またはサリドマイドを投与することを
含み、ここで、前記量は、前記ウイルス感染の１つまたは複数の症状の、検出可能な改善
、進行の減少、排除をもたらす量である。特定の代替法では、ウイルス感染は、アデノウ
イルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉ
ｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（
Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、レ
トロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍ
ｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、
パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｏｍｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈ
ａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）またはトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス
による感染である。より特定の代替法では、前記ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈ
ＩＶ）、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ポリオウイルス、エプス
タイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペス１型（ＨＳＶ１）、単純ヘルペス２型（
ＨＳＶ２）、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス８型（ＨＨＶ
８）、帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ ｚｏｓｔｅｒ）ウイルス（水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺ
Ｖ）または帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ）ウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ
型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）
、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイ
ルス、インフルエンザＣウイルスまたはトゴトウイルス）、麻疹ウイルス、ムンプスウイ
ルス、パラインフルエンザウイルス、パピローマウイルス、狂犬病ウイルスまたは風疹ウ
イルスである。

【0144】

その他のより特定の代替法では、前記ウイルスは、アデノウイルス種Ａ、血清型１２、
１８または３１；アデノウイルス種Ｂ、血清型３、７、１１、１４、１６、３４、３５ま
たは５０；アデノウイルス種Ｃ、血清型１、２、５または６；種Ｄ、血清型８、９、１０
、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、
３０、３２、３３、３６、３７、３８、３９、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４
８、４９または５１；種Ｅ、血清型４；または種Ｆ、血清型４０または４１である。

【0145】

ある特定のその他のより特定の代替法では、ウイルスは、アポイウイルス（ＡＰＯＩＶ
）、アロアウイルス（ＡＲＯＡＶ）、バガザ（ｂａｇａｚａ）ウイルス（ＢＡＧＶ）、ベ
ンジ（Ｂａｎｚｉ）ウイルス（ＢＡＮＶ）、ブブイ（Ｂｏｕｂｏｕｉ）ウイルス（ＢＯＵ
Ｖ）、カシパコア（Ｃａｃｉｐａｃｏｒｅ）ウイルス（ＣＰＣＶ）、カレー島（Ｃａｒｅ
ｙ Ｉｓｌａｎｄ）ウイルス（ＣＩＶ）、カウボーンリッジ（Ｃｏｗｂｏｎｅ Ｒｉｄｇ
ｅ）ウイルス（ＣＲＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、エッジヒル（Ｅｄｇｅ Ｈｉｌ
ｌ）ウイルス（ＥＨＶ）、ガシェッツガリー（Ｇａｄｇｅｔｓ Ｇｕｌｌｙ）ウイルス（
ＧＧＹＶ）、イルへウス（Ｉｌｈｅｕｓ）ウイルス（ＩＬＨＶ）、イスラエルシチメンチ
ョウ髄膜脳脊髄炎ウイルス（ＩＴＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ジュグラ（Ｊｕｇ
ｒａ）ウイルス（ＪＵＧＶ）、ジュチアパ（Ｊｕｔｉａｐａ）ウイルス（ＪＵＴＶ）、カ
ダム（ｋａｄａｍ）ウイルス（ＫＡＤＶ）、ケドゥグ（Ｋｅｄｏｕｇｏｕ）ウイルス（Ｋ
ＥＤＶ）、ココベラウイルス（ＫＯＫＶ）、コウタンゴ（Ｋｏｕｔａｎｇｏ）ウイルス（
ＫＯＵＶ）、キャサヌール森林病ウイルス（ＫＦＤＶ）、ランガットウイルス（ＬＧＴＶ
）、メアバン（Ｍｅａｂａｎ）ウイルス（ＭＥＡＶ）、モドック（Ｍｏｄｏｃ）ウイルス
（ＭＯＤＶ）、モンタナミオチス白質脳炎（Ｍｏｎｔａｎａ ｍｙｏｔｉｓ ｌｅｕｋｏ
ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス（ＭＭＬＶ）、マレー渓谷脳炎ウイルス（ＭＶＥＶ
）、ンタヤ（Ｎｔａｙａ）ウイルス（ＮＴＡＶ）、オムスク出血熱ウイルス（ＯＨＦＶ）
、ポワッサンウイルス（ＰＯＷＶ）、リオブラボーウイルス（ＲＢＶ）、ロイヤルファー
ム（Ｒｏｙａｌ Ｆａｒｍ）ウイルス（ＲＦＶ）、サボヤ（Ｓａｂｏｙａ）ウイルス（Ｓ
ＡＢＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、サルビエジャ（Ｓａｌ Ｖｉｅｊａ
）ウイルス（ＳＶＶ）、サンペルリタ（Ｓａｎ Ｐｅｒｌｉｔａ）ウイルス（ＳＰＶ）、
ソーマレズリーフ（Ｓａｕｍａｒｅｚ Ｒｅｅｆ）ウイルス（ＳＲＥＶ）、セピック（Ｓ
ｅｐｉｋ）ウイルス（ＳＥＰＶ）、テンブス（Ｔｅｍｂｕｓｕ）ウイルス（ＴＭＵＶ）、
ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、チュレーニー（Ｔｙｕｌｅｎｉｙ）ウイルス（ＴＹ
ＵＶ）、ウガンダ（Ｕｇａｎｄａ）Ｓウイルス（ＵＧＳＶ）、ウスツ（Ｕｓｕｔｕ）ウイ
ルス（ＵＳＵＶ）、ヴェッセルスブロン（Ｗｅｓｓｅｌｓｂｒｏｎ）ウイルス（ＷＥＳＳ
Ｖ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、ヤウンデ（Ｙａｏｕｎｄｅ）ウイルス（ＹＡ
ＯＶ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、ヨコセ（Ｙｏｋｏｓｅ）ウイルス（ＹＯＫＶ）また
はジカウイルス（ＺＩＫＶ）である。

【0146】

その他の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を、１種または複数のその
他の抗ウイルス剤を含む抗ウイルス療法レジメンの一部としてウイルス感染を有する個体
に投与する。いくつかの代替法では、個体は、遺伝子改変されたＮＫ細胞、抗ウイルス剤
を受けるように選択されている。ウイルス感染を有する個体に投与してもよい具体的な抗
ウイルス剤として、それだけには限らないが、イミキモド、ポドフィロックス、ポドフィ
リン、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、レチコロス（ｒｅｔｉｃｏｌｏｓ）、ノ
ノキシノール－９、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル
、シドホビル、アマンタジン、リマンタジン、リバビリン、ザナマビル（ｚａｎａｍａｖ
ｉｒ）およびオセルタマビル（ｏｓｅｌｔａｕｍａｖｉｒ）；インジナビル、ネルフィナ
ビル、リトナビルまたはサキナビルなどのプロテアーゼ阻害剤；ジダノシン、ラミブジン
、スタブジン、ザルシタビンまたはジドブジンなどのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤；お
よびネビラピンまたはエファビレンツなどの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤が挙げられ
る。

【0147】

ｅ．６．９．５．投与
単離されたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、全身である場合も局
所である場合もある。特定の代替法では、投与は、非経口である。特定の代替法では、対
象への単離されたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、注射、注入、静
脈内（ＩＶ）投与、大腿内投与または腫瘍内投与による。特定の代替法では、対象への単
離されたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、デバイス、マトリックス
またはスキャフォールドを用いて実施される。特定の代替法では、対象への単離されたＧ
Ｍ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、注射による。特定の代替法では、対
象への単離されたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、カテーテルによ
る。特定の代替法では、ＧＭ ＮＫ細胞の注射は、局所注射である。より特定の代替法で
は、局所注射は、固形腫瘍（例えば、肉腫）へ直接的である。特定の代替法では、対象へ
の単離されたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、シリンジによる注射
による。特定の代替法では、対象への単離されたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組
成物の投与は、ガイドされた送達による。特定の代替法では、注射による対象への単離さ
れたＧＭ ＮＫ細胞の集団またはその医薬組成物の投与は、腹腔鏡検査、内視鏡、超音波
、コンピューター断層撮影法、磁気共鳴または放射線医学によって補助される。

【0148】

ｉ．６．９．５．１．細胞の投与
ある特定の代替法では、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞は、ウイルス感染、癌ま
たは腫瘍細胞を有する個体、例えば、腫瘍細胞、固形腫瘍または血液癌を有する個体、例
えば、癌患者に検出可能な治療上の利益をもたらす任意の量または数、例えば、有効量で
使用される、例えば、個体に投与される。このような細胞は、細胞の絶対数によって個体
に投与することができる、例えば、前記個体に、少なくともまたは多くて１×１０^５、５
×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８
、１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０または１×１０^１１個の本明細
書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞または上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間
の任意の数の細胞を投与することができる。その他の代替法では、本明細書に記載される
ＧＭ ＮＫ細胞を、細胞の相対数によってこのような個体に投与することができる、例え
ば、前記個体に、少なくともまたは多くて、個体の１キログラムあたり１×１０^５、５×
１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、
１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０または１×１０^１１個の本明細書
に記載されるＧＭ ＮＫ細胞または上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の
個体の１キログラムあたりの任意の細胞数を投与することができる。その他の代替法では
、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を、細胞の相対数によって、このような個体に投
与することができる、例えば、前記個体に、少なくともまたは多くて、個体の１キログラ
ムあたり１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、
１×１０^８または５×１０^８個の本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞または上記の値の
任意の２つによって規定される範囲の間の個体の１キログラムあたりの任意の細胞数を投
与することができる。本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を、ＧＭ ＮＫ細胞数と前記
個体における腫瘍細胞数（例えば、推定数）の間の適当な比に従ってこのような個体に投
与することができる。例えば、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞を、個体における腫
瘍細胞数に対する、少なくともまたは多くて１：１、１：１、３：１、４：１、５：１、
６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１
、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１
、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１または１００：１の比または上記
の比のいずれか２つによって規定される範囲の間にある、個体における腫瘍細胞数に対す
るＧＭ ＮＫ細胞の比で投与することができる。このような個体における腫瘍細胞数は、
例えば、個体から得た組織のサンプル、例えば、血液サンプル、生検などにおける腫瘍細
胞数をカウントすることによって推定することができる。特定の代替法では、例えば、固
形腫瘍について、前記カウントは、腫瘍（単数または複数）のイメージングと組み合わせ
て実施されて、およその腫瘍容量が得られる。特定の代替法では、免疫調節性化合物また
はサリドマイド、例えば、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞に加えて、有効量の免疫
調節性化合物またはサリドマイドを、個体に投与する。

【0149】

ある特定の代替法では、例えば、個体において腫瘍細胞の増殖を抑制する方法、個体の
ナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の療法または療法またはウイルス感染を有する
個体のための療法または癌を有する個体、例えば、腫瘍細胞、血液癌もしくは固形腫瘍を
有する個体の療法は、腫瘍細胞を、ＧＭ ＮＫ細胞ならびに１種または複数の胎盤灌流液
および／または胎盤灌流液細胞の組合せと近接させること、または前記個体に、それを投
与することを含む。特定の代替法では、方法は、腫瘍細胞を、免疫調節性化合物またはサ
リドマイドと近接させること、または個体にそれを投与することをさらに含む。

【0150】

特定の代替法では、例えば、個体のナチュラルキラー細胞の欠乏（例えば、ＮＫ細胞数
の、またはＮＫ細胞の癌、腫瘍もしくはウイルス感染した細胞に対する反応性の欠乏）を
有する個体の療法または癌もしくはウイルス感染を有する個体の療法または腫瘍細胞増殖
の抑制は、前記腫瘍細胞を、単離された胎盤灌流液細胞または胎盤灌流液が補給された本
明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞と近接させること、または前記個体にそれを投与する
ことを含む。特定の代替法では、１ミリリットルあたり１×１０^４、５×１０^４、１×１
０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５
×１０^８個もしくはそれより多いＮＫ細胞が本明細書に記載される方法を使用して産生さ
れ、もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の、ミリリットルあたり
の任意の細胞数が産生されるか、または１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０
^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×
１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１個もしくはそれより多
いＧＭ ＮＫ細胞もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間のＧＭ Ｎ
Ｋ細胞の任意の数が、本明細書に記載される方法を使用して産生され、少なくとも、１ミ
リリットルあたり１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×
１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８個もしくはそれより多い単離
された胎盤灌流液細胞もしくは１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×
１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、
５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１個もしくはそれより多い単離さ
れた胎盤灌流液細胞を用いて補給される。その他のより特定の代替法では、約１×１０^４
、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１
０^７、１×１０^８、５×１０^８個もしくはそれより多いＧＭ ＮＫ細胞もしくは上記の値
の任意の２つによって規定される範囲の間のＧＭ ＮＫ細胞の任意の数が、本明細書に記
載される方法を使用して産生され、または１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１
０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１
×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１個もしくはそれより
多いＧＭ ＮＫ細胞もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間のＧＭ
ＮＫ細胞の任意の数が、本明細書に記載される方法を使用して産生され、少なくとも、１
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５
、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２
００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７
００、７５０、８００、８５０、９００、９５０もしくは１０００ｍＬの灌流液、または
１単位の灌流液を用いて補給される。

【0151】

別の特定の代替法では、個体のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の療法、癌療
法を有する個体の、ウイルス感染を有する個体の療法または腫瘍細胞増殖の抑制は、腫瘍
細胞を本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞と近接させることまたは個体にそれを投与す
ることを含み、これでは、前記細胞は、接着性胎盤細胞、例えば、接着性胎盤幹細胞また
は複能性細胞、例えば、ＣＤ３４^－、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋組織培養
プラスチック接着性胎盤細胞が補給される。特定の代替法では、本明細書に記載されるＧ
Ｍ ＮＫ細胞は、１ミリリットルあたり１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０
^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８個もし
くはそれより多い接着性胎盤幹細胞もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範
囲の間の、１ミリリットルあたりの接着性胎盤幹細胞の任意の数、または１×１０^４、５
×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７
、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１
×１０^１１個もしくはそれより多い接着性胎盤細胞もしくは上記の値の任意の２つによっ
て規定される範囲の間の、１ミリリットルあたりの接着性胎盤幹細胞の任意の数、例えば
、接着性胎盤幹細胞もしくは複能性細胞が補給される。

【0152】

別の特定の代替法では、個体のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の療法、癌療
法を有する個体の療法、ウイルス感染を有する個体の療法または腫瘍細胞増殖の抑制は、
本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞と組み合わせた免疫調節性化合物またはサリドマイ
ドを使用して実施され、これでは、前記細胞は、コンディショニングされた培地、例えば
、ＣＤ３４^－、ＣＤ１０^＋、ＣＤ１０５^＋、ＣＤ２００^＋組織培養プラスチック接着性胎
盤細胞によってコンディショニングされた培地、例えば、灌流液の単位あたり、または１
０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０または１０^１１個の、本明細
書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞もしくは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の
間の任意の数のＧＭ ＮＫ細胞あたり、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．
６、０．１、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＬの、もし
くは上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の容量の幹細胞によってコ
ンディショニングされた培養培地が補給される。ある特定の代替法では、組織培養プラス
チック接着性胎盤細胞は、開示内容が参照によりその全文で本明細書に組み込まれる（特
許文献９）および（特許文献１０）において記載される複能性接着性胎盤細胞である。別
の特定の代替法では、方法は、腫瘍細胞を免疫調節性化合物またはサリドマイドと近接さ
せること、または個体にそれを投与することをさらに含む。

【0153】

別の特定の代替法では、前記の本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞に、胎盤灌流液細
胞が補給される、個体のナチュラルキラー細胞の欠乏を有する個体の療法、癌を有する個
体の療法、ウイルス感染を有する個体の療法または腫瘍細胞増殖の抑制、灌流液細胞を、
前記の近接させることに先立つ一定期間、インターロイキン－２（ＩＬ－２）と近接させ
る。ある特定の代替法では、前記期間は、少なくともまたは多くて、前記の近接させるこ
とに先立って１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２
０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６
もしくは４８時間または上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の時間
数である。

【0154】

抗癌療法の過程の間に、ウイルス感染を有する個体、癌を有する個体または腫瘍細胞を
有する個体に、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞および任意選択で灌流液または灌流
液細胞を１回投与してもよい、または複数回、例えば、療法の間、１、２、３、４、５、
６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２もしくは２３時間ごとに１回、もしくは１、２、３、４、５、６もしくは７
日ごとに１回、もしくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２４、３６もしく
はそれより多い週ごとに１回投与してもよい。いくつかの代替法では、抗癌療法の過程の
間に、ウイルス感染を有する個体、癌を有する個体または腫瘍細胞を有する個体に、ＧＭ
ＮＫ細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、
１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３時間または上記の値の任
意の２つによって規定される範囲の間の任意の時間量ごとに１回投与する。いくつかの代
替法では、抗癌療法の過程の間に、ウイルス感染を有する個体、癌を有する個体または腫
瘍細胞を有する個体に、ＧＭ ＮＫ細胞を、１、２、３、４、５、６もしくは７日または
上記の値の任意の２つによって規定される範囲の間の任意の時間量ごとに１回投与する。
いくつかの代替法では、抗癌療法の過程の間に、ウイルス感染を有する個体、癌を有する
個体または腫瘍細胞を有する個体に、ＧＭ ＮＫ細胞を１、２、３、４、５、６、７、８
、９、１０、２４、３６もしくはそれより多い週または上記の値の任意の２つによって規
定される範囲の間の任意の時間量ごとに１回投与する。細胞および免疫調節性化合物また
はサリドマイドが使用される代替法では、免疫調節性化合物またはサリドマイドおよび細
胞または灌流液を、一緒に、例えば、同一製剤中で、別個に、例えば、別個の製剤中で、
およそ同時に個体に投与する、または別個に、例えば、異なる投薬スケジュールで、もし
くは１日の異なる時間に投与してもよい。同様に、細胞および抗ウイルス化合物または抗
癌化合物が使用される代替法では、抗ウイルス化合物または抗癌化合物および細胞または
灌流液を、一緒に、例えば、同一製剤中で、別個に、例えば、別個の製剤中で、およそ同
時に個体に投与してもよい、または別個に、例えば、異なる投薬スケジュールで、もしく
は１日の異なる時間に投与してもよい。本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞、灌流液ま
たは灌流液細胞が、過去に個体に投与されたか否かに関わらず、本明細書に記載されるＧ
Ｍ ＮＫ細胞および灌流液または灌流液細胞を投与してもよい。

【0155】

１０．キット
本明細書に記載される組成物、例えば、１種もしくは複数のＧＭ ＮＫ細胞の集団を含
む組成物のうち１種もしくは複数が詰められた医薬パックまたは１種もしくは複数の容器
を含むキットが、本明細書において提供される。任意選択で、このような容器（複数可）
を、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定
された形式の通知と関連づけてもよく、この通知は、ヒト投与のための製造、使用または
販売の機関による承認を反映する。

【0156】

本明細書に記載される方法、例えば、腫瘍細胞の成長を抑制する方法および／または癌
、例えば、血液学的癌を治療する方法および／またはウイルス感染を治療する方法に従っ
て、本明細書において包含されるキットを使用してもよい。１つの代替法では、キットは
、本明細書に記載されるＧＭ ＮＫ細胞またはその組成物を、１つまたは複数の容器中に
含む。特定の代替法では、１種もしくは複数の本明細書に記載されるＮＫ細胞集団または
その組成物を含むキットが本明細書において提供される。

【0157】

１１．さらなる代替法
いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠
くまたはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラ
ー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫ
Ｇ２Ａおよび／またはＴＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、
ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現は、ノックアウトされている。い
くつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィン
ガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いく
つかの代替法では、ＣＢＬＢ発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされて
いる。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウト
されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞をもたら
す。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの代替法で
は、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ
２６６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。いくつ
かの代替法では、腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病細胞である。いくつかの代替法では、腫
瘍細胞は、ＨＬ６０細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＫＧ１細胞である
。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされ
ていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い
ＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノッ
クアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ－１および
ＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞もたらす。いくつかの
代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では
、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較
して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓ
ＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち
１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、ＮＫ
阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現はノックアウ
トされている。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳｓ９シ
ステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックア
ウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によ
ってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは
、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒
性を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞
である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。いくつかの
代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、Ａ
ＲＨ７７細胞である。いくつかの代替法では、ＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２
ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、
ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞を
もたらす。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。
いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａがノックアウトさ
れていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、Ｉ
ＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の
分泌の変化を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、Ｔ
ＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現は、ノックアウトされてい
る。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジ
ンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされて
いる。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノッ
クアウトされている。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧ
ＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の
細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性をもたらす。いくつかの代替法では、腫瘍細
胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６
細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病細胞である。いくつ
かの代替法では、腫瘍細胞は、Ｋ５６２細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は
、慢性骨髄性白血病細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＨＬ－６０細胞で
ある。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いくつかの
代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６^＋ＣＤ３－ＣＤ１１７^＋ＣＤ１１ａ^＋で
あり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素
受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前
記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリ
ール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。方法のいくつかの代替法で
は、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およ
びＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、
ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を
発現しない。

【0158】

いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、改変されたＣＤ１６を含む
ように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替
法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有す
る。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを
有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性
である。いくつかの代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有す
る。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥ
ＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡ
ＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫ
ＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩ
ＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩ
ＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤ
ＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。いくつかの代替法では、改変
されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変さ
れたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改変さ
れたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。いくつかの代替法では、
改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞はＮ
Ｋ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルスベク
ターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭＶま
たはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法では、レンチウイルス
ベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、改変さ
れたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、
レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替
法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いくつかの代替法では、ナチュラ
ルキラー細胞は、ＣＤ５６^＋ＣＤ３－ＣＤ１１７^＋ＣＤ１１ａ^＋であり、パーフォリンお
よび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ
１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細
胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体ま
たはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキ
ラー細胞は、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄをさらに
発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する。
いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。

【0159】

いくつかの代替法では、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法は、腫瘍細胞を、本明細書にお
ける代替法のいずれか１つの集団に由来するナチュラルキラー細胞を接触させることを含
む。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現
の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が提供される。
いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＴＧＦ
ＢＲ２である。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの
代替法では、ＣＢＬＢ発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＣＢＬ
Ｂ発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡ
ＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ
発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では
、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも
腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、腫
瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２
２６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ２６６細胞である。いくつかの
代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、
急性骨髄性白血病細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＨＬ６０細胞である
。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＫＧ１細胞である。いくつかの代替法では、ＣＢ
ＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣ
ＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞
をもたらす。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノック
アウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場
合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ
１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウ
トは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同
時培養された場合に、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、Ｍ
ＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化
を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａで
ある。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ノックアウトされている。いくつかの
代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌ
クレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの
代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている
。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａがノックアウト
されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有するＮＫ細胞をもたら
す。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの代替法で
は、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、Ｕ
２６６細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＡＲＨ７７細胞である。いくつ
かの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａがノックアウトされてい
ないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣ
Ａを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞をもたらす。いくつかの代替
法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、Ｎ
ＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較
して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩ
Ｐ１β、ＴＮＦαまたはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細
胞をもたらす。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。いくつ
かの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現は、ノックアウトされている。いくつかの代替法では
、ＴＧＦＢＲ２発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアー
ゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いくつかの代替法で
は、ＴＧＦＢＲ２発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いく
つかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトさ
れていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性
阻害に対する耐性をもたらす。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞で
ある。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＲＰＭＩ８２２６細胞である。いくつかの代
替法では、腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞
は、Ｋ５６２細胞である。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、慢性骨髄性白血病細胞で
ある。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、ＨＬ－６０細胞である。いくつかの代替法で
は、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いくつかの代替法では、改変されたＣ
Ｄ１６を含むように遺伝子改変されているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が提供される。
いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高
い親和性を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１
５８にバリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示
されるアミノ酸配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬ
ＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱ
ＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬ
ＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹ
ＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩ
ＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫ
ＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。いくつか
の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。いくつか
の代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。いくつかの代
替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。いくつかの代替
法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつかの代替
法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。いくつか
の代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次い
で造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レン
チウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクタ
ーは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法では、
レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替
法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつか
の代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。
いくつかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６^＋ＣＤ３－ＣＤ１１７^＋ＣＤ
１１ａ^＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリー
ル炭化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替
法では、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲ
γｔ、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。方法のいくつか
の代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫ
ｐ３０およびＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラ
ー細胞は、ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、
ＣＤ９４を発現しない。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）で
ある。方法のいくつかの代替法では、接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる。方法のいくつ
かの代替法では、前記接触は、ｉｎ ｖｉｖｏで起こる。方法のいくつかの代替法では、
前記接触は、ヒト個体において起こる。方法のいくつかの代替法では、前記方法は、前記
ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与することを含む。方法のいくつかの代替法では、
前記腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞
は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記個体は
、再発性／難治性ＡＭＬを有する。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、ＡＭＬに
対する少なくとも１種の非自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）治療が失敗しているＡＭＬを有
する。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、６５歳以上であり、最初の寛解中であ
る。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前
にフルダラビン、シタラビンまたは両方を用いてコンディショニングされている。方法の
いくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、乳癌細胞、頭頸部癌細胞または肉腫細胞である
。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性
Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細
胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直
腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞または網膜芽細胞腫細胞である。方法のいくつかの代替法
では、前記腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細
胞は、肝臓腫瘍細胞である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、肺腫瘍細胞
である。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、膵臓腫瘍細胞である。方法のい
くつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、腎腫瘍細胞である。方法のいくつかの代替法では
、前記腫瘍細胞は、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞である。方法のいくつかの代替法では
、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３３抗体とともに投与される。いくつかの代替法
では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ２０抗体とともに投与される。いくつかの代
替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ１３８抗体とともに投与される。いくつ
かの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤＦ３８抗体とともに投与される。
方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に
先立って凍結保存されている。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前
記接触または前記投与に先立って凍結保存されていない。いくつかの代替法では、ナチュ
ラルキラー細胞は、ＣＤ５６^＋ＣＤ３－ＣＤ１１７^＋ＣＤ１１ａ^＋であり、パーフォリン
および／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ１
Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー
細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体
またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラル
キラー細胞は、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄをさら
に発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現する
。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。

【0160】

いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠
く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキ
ラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、Ｎ
ＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻害性分子
である。いくつかの代替法では、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現が
ノックアウトまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を
有する。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（Ａ
ＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞
白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫
（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸
直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では
、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍
細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞から
なる群から選択される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノックアウト
されている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９
システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノック
アウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連
技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢ
ＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノック
アウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場
合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、Ｃ
ＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、Ｉ
ＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集
団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定され
る。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトさ
れていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ－ＣＳ
Ｆ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦα
およびパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成す
る。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法で
は、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞
よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺
激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では
、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２
Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、
ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β
、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ
細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である
。いくつかの代替法では、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２がノックア
ウトされていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ
媒介性阻害に対する耐性を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ナ
チュラルキラー（ＮＫ）細胞は、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている
。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して
高い親和性を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置
１５８にバリンを有する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７
切断に対して耐性である。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの
位置１９７にプロリンを有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番
号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡ
ＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬ
ＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩ
ＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫ
ＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶ
ＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹ
ＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。
いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。い
くつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。い
くつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入され
る。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導
入され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ
１６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウ
イルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの
代替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。い
くつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入され
る。いくつかの代替法では、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マー
カーを含む。いくつかの代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いく
つかの代替法では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３－ＣＤ１１７＋ＣＤ１１
ａ＋であり、パーフォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭
化水素受容体およびＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法で
は、前記ナチュラルキラー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ
、アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。いくつかの代替法で
は、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およ
び／またはＮＫＧ２Ｄをさらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー
細胞は、ＣＤ９４を発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、Ｃ
Ｄ９４を発現しない。

【0161】

いくつかの代替法では、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、腫瘍細胞を、本明細
書における代替ナチュラルキラー細胞の集団のいずれか１つの集団に由来するナチュラル
キラー細胞と接触させることを含む方法が提供される。いくつかの代替法では、ナチュラ
ルキラー細胞の集団が提供され、これでは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＮＫ阻害
性分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されて
いる。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢ
Ｒ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻害性分子である。いくつかの代替
法では、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減
されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する。いくつかの代替
法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、
頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性
リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、
結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜
芽細胞腫細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍
細胞である。いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓
腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。
いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノックアウトされている。いくつかの
代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィン
ガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている。いく
つかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウ
トされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢＬＢである。いくつかの
代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ
細胞よりも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌
を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウ
トは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣ
Ａを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつか
の代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替法で
は、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比
較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（
ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパーフォリンのう
ち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法で
は、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノ
ックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴ
ニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱
顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７
ａの増大によって測定される。いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは
、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性Ｃ
Ｄ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／また
はパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。
いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＴＧＦＢＲ２である。いくつかの代替法では
、ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトは、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細
胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性
を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ナチュラルキラー（ＮＫ）
細胞は、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では
、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。い
くつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する
。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である
。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを
有する。ある特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示されるアミノ酸
配列（ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶ
ＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤ
ＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶ
ＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦ
ＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰ
ＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴ
ＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。いくつかの代替法では、
改変されたＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改
変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつかの代替法では、改
変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。いくつかの代替法で
は、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞
はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、レンチウイルス
ベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイルスベクターは、ＣＭ
ＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替法では、レンチウイ
ルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの代替法では、改
変されたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法で
は、レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつかの
代替法では、ＮＫ細胞は、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である。いくつかの代替法では、ナチ
ュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３－ＣＤ１１７＋ＣＤ１１ａ＋であり、パーフォリ
ンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およびＩＬ
１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラ
ー細胞は、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容
体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラ
ー細胞は、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および／またはＮＫＧ２Ｄを
さらに発現する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現
する。いくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ９４を発現しない。い
くつかの代替法では、胎盤またはその一部に由来し、それによって胎盤由来ＮＫ細胞（ｐ
ＮＫ細胞）を含むナチュラルキラー細胞の集団であって、ｐＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子
の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナ
チュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、Ｃ
ＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ
阻害性分子である。いくつかの代替法では、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分
子の発現がノックアウトまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い
細胞毒性を有する。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性
白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、
急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多
発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫
細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。いくつかの
代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は
、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ
）細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノ
ックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ
／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによ
ってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩ
ＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分
子は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬ
ＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺
激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替
法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞
よりも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮ
Ｋ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によっ
て測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノッ
クアウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、
ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β
、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ
細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。
いくつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａがノックアウトさ
れていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ－１および
ＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。い
くつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代
替法では、ＣＤ１０７ａの増大は、ＦＡＣｓによって測定される。いくつかの代替法では
、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞、
例えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ
１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンの
うち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法
では、細胞の集団は、胎盤由来ナチュラルキラー細胞（ｐＮＫ）のものであって、ｐＮＫ
細胞は、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では
、改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。い
くつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する
。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である
。
いくつかの代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。あ
る特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷ
ＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳ
ＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤ
ＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤ
ＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡ
ＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦ
ＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤ
ＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。いくつかの代替法では、改変された
ＣＤ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドまたはＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いく
つかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される
。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入
され、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１
６は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイ
ルスベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代
替法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いく
つかの代替法では、選択マーカーは、ＰｕｒｏＲ遺伝子、ＺｅｏＲ遺伝子、ＨｙｇｒｏＲ
遺伝子、ｎｅｏＲ遺伝子および／またはブラストサイジン耐性遺伝子などの選択剤に対す
る耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの代替法では、改変さ
れたＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、
レトロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。方法のいくつか
の代替法では、前記接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる。方法のいくつかの代替法では、
前記接触は、ｉｎ ｖｉｖｏで起こる。方法のいくつかの代替法では、前記接触は、ヒト
個体、好ましくは、抗癌療法を受け取るよう選択された個体において起こる。方法のいく
つかの代替法では、前記方法は、前記ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与することを
含む。方法のいくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞である。方法の
いくつかの代替法では、前記腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。方法
のいくつかの代替法では、前記個体は、再発性／難治性ＡＭＬを有する。方法のいくつか
の代替法では、前記個体はＡＭＬに対する少なくとも１種の非自然リンパ球系細胞（ＩＬ
Ｃ）治療が失敗しているＡＭＬを有する。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、６
５歳以上であり、最初の寛解中である。方法のいくつかの代替法では、前記個体は、前記
ナチュラルキラー細胞を投与する前にフルダラビン、シタラビンまたは両方を用いてコン
ディショニングされている。方法のいくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細
胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞
、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（Ｃ
ＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞
、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択され
る。方法のいくつかの代替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。方法のいくつかの
代替法では、固形腫瘍細胞は、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞お
よび多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される。方法のいくつかの代替法
では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３３抗体とともに投与される。方法のいくつ
かの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ２０抗体とともに投与される。方
法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ１３８抗体とともに投
与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３８抗体
とともに投与される。方法のいくつかの代替法では、前記ナチュラルキラー細胞は、前記
接触または前記投与に先立って凍結保存されている。方法のいくつかの代替法では、前記
ナチュラルキラー細胞は、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されていない。

【0162】

第３の態様では、胎盤またはその一部に由来し、それによって胎盤由来ＮＫ細胞（ｐＮ
Ｋ細胞）を含むナチュラルキラー細胞の集団であって、ｐＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の
発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチ
ュラルキラー細胞の集団が提供される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＣＢ
ＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択される１種または複数のＮＫ阻
害性分子である。いくつかの代替法では、遺伝子改変されたＮＫ細胞は、ＮＫ阻害性分子
の発現がノックアウトまたは低減されていないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細
胞毒性を有する。いくつかの代替法では、腫瘍細胞は、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白
血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急
性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発
性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細
胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞腫細胞からなる群から選択される。いくつかの代
替法では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの代替法では、固形腫瘍細胞は、
肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）
細胞からなる群から選択される。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ノッ
クアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ／
ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによっ
てノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子の発現は、ＣＲＩＳ
ＰＲ関連技術によってノックアウトされている。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子
は、ＣＢＬＢである。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢ
がノックアウトされていないＮＫ細胞よりも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激
された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いくつかの代替法
では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よ
りも、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ
細胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって
測定される。いくつかの代替法では、ＣＢＬＢ発現のノックアウトは、ＣＢＬＢがノック
アウトされていないＮＫ細胞と比較して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、Ｇ
Ｍ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、
ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細
胞の集団を生成する。いくつかの代替法では、ＮＫ阻害性分子は、ＮＫＧ２Ａである。い
くつかの代替法では、ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２Ａがノックアウトされ
ていないＮＫ細胞よりも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ－１およびＭ
ＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する。いく
つかの代替法では、脱顆粒は、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される。いくつかの代替
法では、ＣＤ１０７ａの増大は、ＦＡＣｓによって測定される。いくつかの代替法では、
ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトは、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞、例
えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１
３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのう
ち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する。

【0163】

第４の態様では、胎盤由来ナチュラルキラー細胞（ｐＮＫ）の集団であって、ｐＮＫ細
胞は、改変されたＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている。いくつかの代替法では、
改変されたＣＤ１６は、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する。いく
つかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する。
いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である。
いくつかの代替法では、ＣＤ１６は、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する。ある
特定の代替法では、改変されたＣＤ１６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＭＷＱ
ＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶ
ＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤ
ＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰ
ＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴ
ＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＰＴＩＳＳＦＦ
ＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨ
ＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ；配列番号１）を有する。いくつかの代替法では、改変されたＣ
Ｄ１６は、ＩｇＫシグナルペプチドまたはＣＤ１６シグナルペプチドを含有する。いくつ
かの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される。
いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６は、ウイルス感染を介して造血細胞に導入さ
れ、次いで造血細胞はＮＫ細胞に分化する。いくつかの代替法では、改変されたＣＤ１６
は、レンチウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レンチウイル
スベクターは、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する。いくつかの代替
法では、レンチウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。いくつ
かの代替法では、選択マーカーは、ＰｕｒｏＲ遺伝子、ＺｅｏＲ遺伝子、ＨｙｇｒｏＲ遺
伝子、ｎｅｏＲ遺伝子および／またはブラストサイジン耐性遺伝子などの選択剤に対する
耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの代替法では、改変され
たＣＤ１６は、レトロウイルスベクターを介して導入される。いくつかの代替法では、レ
トロウイルスベクターは、１種または複数の薬物選択マーカーを含む。

【0164】

ａ． ７．１代替法１：ＣＢＬＢノックアウト３段階ＮＫ細胞
ｉ． ７．１．１ ＣＢＬＢノックアウト特性決定
本明細書およびその全文が参照により本明細書に組み込まれる（特許文献１）に記載さ
れるような、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの３、５または７日目
の間にＮＫ細胞においてＣＢＬＢ遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトを実施することによ
って、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞を生成した。

【0165】

ＣＢＬＢノックアウトの平均効率は、ＴＩＤＥ（分解によるインデルの追跡）アッセイ
によって測定されるように、３５日のプロセスの３５日目に８０％を上回る（図１Ａ）。

【0166】

ノックアウト後のＮＫ細胞の増殖倍数を測定し、生存細胞およびＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細
胞のパーセンテージを決定した。増殖倍数は、未処理細胞と比較して低減したが（図１Ｂ
）、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞における生存細胞およびＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞の割
合は、未処理細胞と同等であった。

【0167】

３段階プロセスの３４または３５日目に、種々の多発性骨髄腫細胞株（ＲＰＭＩ８２２
６、Ｕ２６６、ＡＲＨ２７７）に対する細胞毒性を、２０：１、１０：１および５：１の
エフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で決定した（図２Ａ～Ｃ）。ＣＢＬＢノックアウ
トＮＫ細胞は、試験した各細胞株について、すべての比で、未処理細胞と比較して増大し
た細胞毒性を有するとわかった（図３Ａ～Ｃ）。次いで、細胞毒性データを正規し、ＣＢ
ＬＢノックアウトＮＫ細胞は、未処理細胞との比較において細胞毒性の最大４倍の増大を
有するとわかった。図４Ａ～Ｂに示されるように、ＨＬ６０およびＫＧ１細胞に対するＣ
ＢＬＢノックアウトＮＫ細胞の細胞毒性も決定した。

【0168】

細胞毒性データに加えて、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）および
ＩＣＡＭ－１を用いる刺激の際のＩＦＮγ分泌およびＣＤ１０７ａのレベル、脱顆粒の尺
度を測定した。一貫したレベルのＩＣＡＭ－１の存在下で、変動するレベルのＭＩＣＡ刺
激を用いた場合のＣＢＬＢノックアウトおよび未処理ＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌レベルは、
図５Ａに示されている。一貫したレベルのＩＣＡＭ－１の存在下で、変動するレベルのＭ
ＩＣＡ刺激を用いた場合のＣＢＬＢノックアウトおよび未処理ＮＫ細胞両方におけるＣＤ
１０７ａアッセイの結果は、図５Ｂに示されている。５Ａおよび５Ｂに示されるように、
未処理は、図８における棒グラフの対中の右側の棒グラフであり、処理は、左側の棒グラ
フである。

【0169】

ＧＭ－ＣＳＦ、ｓＣＤ１３７、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパ
ーフォリンのサイトカイン分泌はまた、ＭＩＣＡ刺激を用いずに、多発性骨髄腫細胞株Ｒ
ＰＭＩ、Ｕ２６６またはＡＲＨ７７の存在下で測定した。サイトカイン分泌アッセイの結
果は、図６Ａ～Ｃに示されている。

【0170】

ｉｉ． ７．１．２． ＣＢＬＢノックアウト前臨床データ
ｉｎ ｖｉｖｏにおける、実施例７．１．１において産生されたような、ＣＢＬＢノッ
クアウトＮＫ細胞の体内分布および残留性を決定するために、図７に示されるように研究
を設計した。２群、－１日目にブスルファン（抗新生物剤）プレコンディションを用いる
１群、および－５日目にブスルファンプレコンディショニングを用いる１群を研究した。
ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス組織への細胞注入の７、１４および２１日後に
、脾臓、骨髄（ＢＭ）、血液、肝臓および肺においてヒトＣＤ４５^＋カウントをとり、総
カウントも集計した（図８～１０）。体内分布および残留性は、７日後に未処理およびＣ
ＢＬＢノックアウトＮＫ細胞において同様であるとわかった（図８）。１４日後、体内分
布および残留性の類似性は、群間で維持されたが、ヒトＣＤ４５^＋カウントの絶対数が高
かった（図８～９）。２１日後、残留性および体内分布は、同様であり続けたが、ヒトＣ
Ｄ４５^＋カウントの絶対数は低下し、これは、残留性は、ＩＬ－１５補給と関連している
ことを示唆した（図１０）。ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞の細胞増殖を誘導するサイトカイン
である。

【0171】

７、１４および２１日目に、ＣＤ５６^＋ＣＤ１１ａ^＋細胞の存在も、脾臓、肝臓、骨髄
および肺において測定した（図１１）。未処理およびＣＢＬＢノックアウト条件について
同様の頻度のＣＤ５６^＋ＣＤ１１ａ^＋細胞が見られ、その他の組織と比較して骨髄におい
て低い頻度のＣＤ５６^＋ＣＤ１１ａ^＋細胞が見られた（図１１）。脾臓、肝臓、骨髄およ
び肺におけるＣＤ１６およびＫＩＲ発現も測定し、未処理およびＣＢＬＢノックアウト条
件について同様の頻度が見られた（図１２および１３）。ＣＤ１６およびＫＩＲ発現が両
方とも、注入前プロフィールとの比較においてｉｎ ｖｉｖｏで増大したことが留意され
た。

【0172】

ＮＳＧマウスにおけるＮＫ細胞の増殖を測定し、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞は、Ｎ
Ｋ細胞投与の１４日目までに、対照処理細胞よりも迅速に増殖するとわかった。

【0173】

投与の１４日後にＮＳＧマウス組織から単離されたＮＫ細胞を精製し、Ｋ５６２および
ＨＬ６０細胞株に対する細胞毒性を決定した（図１４Ａ～Ｂ）。ＣＢＬＢノックアウトＮ
Ｋ細胞は、対照処理細胞との比較において、ｅｘ ｖｉｖｏでの両細胞に対する細胞毒性
の増強を有するとわかった（図１４Ａ～Ｂ）。図１４Ａ～１４Ｂでは、対照は、両グラフ
において低パーセントキラーとして示されている。ｅｘ ｖｉｖｏで、単離されたＣＢＬ
Ｂノックアウト細胞はまた、対照処理細胞との比較において、腫瘍細胞同時培養において
増大したレベルのＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ｓＣＤ１３７およびＴＮＦαサイトカインを
放出するとわかった（図１５Ａ～Ｄ）。したがって、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞は、
ＮＳＧマウスにおいて１４日後にその増強された機能活性を保持する。

【0174】

最後に、ＣＢＬＢノックアウトＮＫ細胞の機能活性を、新たに単離された患者由来ＡＭ
Ｌ異種移植片（ＰＤＸ）に対して試験した（図１６Ａ～Ｄ）。ＣＢＬＢノックアウトＮＫ
細胞は、対照と比較して、分泌されたＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ｓＣＤ１３７およびＴＮ
Ｆαの増大を示した（図１６Ａ～Ｄ）。

【0175】

ｂ． ７．２ 代替法２：ＮＫＧ２Ａノックアウト３段階ＮＫ細胞
本明細書およびその全文が参照により本明細書に組み込まれる（特許文献１）に記載さ
れるような、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの３、５または７日目
の間に、ＮＫ細胞においてＮＫＧ２Ａ遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウトを実施すること
によって、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞を作製した。

【0176】

ＮＫＧ２Ａノックアウトの平均効率は、ＴＩＤＥ（分解によるインデルの追跡）アッセ
イによって測定されるように、３５日のプロセスの３５日目に約６０％である（図１７Ａ
）。

【0177】

ノックアウト後のＮＫ細胞の増殖倍数を測定し、生存細胞およびＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細
胞のパーセンテージを決定した。増殖倍数は、未処理細胞と比較して低減したが（図１７
Ｂ）、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞における生存細胞およびＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞
の割合は、未処理細胞と同等であった。

【0178】

３段階プロセスの３４または３５日目に、種々の多発性骨髄腫細胞株（ＲＰＭＩ８２２
６、Ｕ２６６、ＡＲＨ２７７）に対する細胞毒性を、２０：１、１０：１および５：１の
Ｅ：Ｔ比で決定した（図１８Ａ～Ｄ）。Ｋ５６２細胞に対する細胞毒性は、１０：１、５
：１および２．５：１のＥ：Ｔ比で決定した。ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、ＲＰ
ＭＩ８２２６、Ｕ２６６およびＡＲＨ２７７細胞株の各々について、すべての比で、未処
理細胞との比較において増大した細胞毒性を有するとわかった（図１９Ａ～Ｃ）が、Ｋ５
６２細胞に対して未処理細胞を用いる場合に同等の細胞毒性を有していた。Ｋ５６２細胞
に対する細胞毒性は、最大レベルに到達したということが仮定される。次いで、多発性骨
髄腫細胞株に対する細胞毒性データを正規化し、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、未
処理細胞との比較において細胞毒性の最大３倍の増大を有するとわかった。本明細書にお
けるいくつかの代替法では、ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、未処理細胞との比較に
おいて細胞毒性の最大３倍の増大を有するとわかった。

【0179】

プレートに結合された脱顆粒アッセイを実施して、ＭＩＣＡおよびＩＣＡＭ－１刺激の
存在下でのＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体に対するＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞の応答を
試験した（図２０）。対照ＩｇＧ抗体の存在下で、ＮＫＧ２Ａノックアウト細胞は、野生
型ＮＫＧ２Ａを有する対照ＮＫ細胞と同様に、高活性を示した（ＣＤ１０７ａパーセント
）。対照（非ノックアウト）ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、予測さ
れたように低活性を示した。ＮＫＧ２ＡノックアウトＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａアゴニスト
抗体の存在下で、中間の活性を示した。したがって、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体は、対照
ＮＫ細胞活性を低減するとわかったが、ＮＫＧ２Ａノックアウト細胞においてはあまり有
効ではなく、これは、これらの細胞が、ＮＫＧ２Ａ媒介性阻害性シグナルに対してより耐
性であることを示す。

【0180】

ＧＭ－ＣＳＦ、ｓＣＤ１３７、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパ
ーフォリンのサイトカイン分泌はまた、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ、Ｕ２６６およびＡ
ＲＨ７７の存在下で、ＭＩＣＡ刺激を用いず測定した。サイトカイン分泌アッセイの結果
は、図２１Ａ～Ｃに示されている。

【0181】

ｃ． ７．３ 代替法３：ＴＧＦ－βノックアウト３段階ＮＫ細胞
ＣＲＩＳＰＲ関連技術を使用して、ＮＫ－９２細胞においてＴＧＦ－β受容体ＩＩ（Ｔ
ＧＦＢＲ２）をノックアウトし、その結果、ＴＧＦＢＲ２発現が有意に減少した。ＴＧＦ
－βシグナル伝達経路の遮断を示す、リン酸化Ｓｍａｄ２／３（ｐＳｍａｄ２／３）が低
減されたことを示すことによって、結果をＮＫ－９２細胞においてさらに検証した。これ
らの細胞では、ＴＧＦ－β誘発活性化マーカー（ＮＫｐ３０）下方制御も消失した。

【0182】

次いで、本明細書およびその全文が参照により本明細書に組み込まれる（特許文献１）
に記載されるような、ＮＫ細胞を産生するための３５日の、３段階プロセスの０、５、１
０または１４日目の間にＮＫ細胞においてＴＧＦＢＲ２遺伝子のＣＲＩＳＰＲノックアウ
トを実施することによって、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＮＫ細胞を作製した。５日目ノッ
クアウトの特性決定を以下に記載する。

【0183】

ＴＧＦＢＲ２ノックアウトの効率は、５日目の７０％から８０％を上回るまで急速に高
まり、３５日のプロセスを通じて安定したままであった（図２２）。同様に、突然変異ス
ペクトルは、プロセスを通じて不変のままであった。ＮＫ－９２細胞と同様に、５日目Ｔ
ＧＦ－βノックアウトＧＭ ＮＫ細胞は、ＴＧＦ－βシグナル伝達の遮断を示し、これは
、ｐＳｍａｄ２－３の低減をもたらした。ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫｐ３０な
どの受容体について、ＴＧＦＢＲ２ノックアウト細胞において、活性化受容体下方制御も
また抑制された。表１に示されるように、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＮＫ細胞の分化は、
対照、未処理群と同様であるとわかった。

【0184】

【表1】

【0185】

３４または３５日目に、Ｋ５６２およびＲＰＭＩ８２２細胞株に対する細胞毒性を一定
範囲のＥ：Ｔ比で決定した。細胞毒性は、ＴＧＦ－β１処理を用いない対照における細胞
毒性に対して、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＮＫ細胞において同様であり（図２３Ａ～Ｄ）
、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＮＫ細胞は、細胞毒性アッセイの間にＴＧＦ－β１阻害に対
する耐性を付与するとわかった。

【0186】

トランスフェクションの種々の日数での、および種々の細胞バッチにおけるＴＧＦＢＲ
２ノックアウトの結果の遺伝子および表現型解析が、表２に示されている。種々の時点で
の複数のドナーにわたってＧＭ ＮＫについて高レベルのＴＧＦＢＲ２欠失（８８．１％
平均）が達成された。これらの結果は、表現型変化、例えば、シグナル伝達遮断およびＮ
Ｋマーカー下方制御の変化を対応させることによって確認された。

【0187】

【表2】

【0188】

４時間細胞毒性アッセイにおいてＨＬ６０細胞およびＫ５６２細胞に対してＴＧＦＢＲ
２ノックアウト細胞のエフェクター機能も試験した（図２４Ａ～Ｄ）。ＴＧＦＢＲ２ノッ
クアウト細胞は、ＨＬ６０およびＫ５６２細胞の両方における抗腫瘍細胞毒性に対するＴ
ＧＦ－β１誘発阻害に対する耐性を実証した（図２４Ａ～Ｄ）。

【0189】

ｄ． ７．４ 代替法４：改変されたＣＤ１６を有するＮＫ細胞
表３に示されるように、遺伝子改変されたＣＤ１６を含むレンチウイルスベクターを開
発した。

【0190】

【表3】

【0191】

所望の突然変異－高ＩｇＧ結合親和性突然変異体Ｆ１５８ＶおよびＡＤＡＭ１７耐性突
然変異体Ｓ１９７Ｐとともに、２種の異なるシグナルペプチド、ＩｇＫおよびＣＤ１６を
使用し、２種の異なるプロモーター、ＥＦ１αおよびＣＭＶを使用した。レンチウイルス
ベクターはまた、形質導入後濃縮のためのピューロマイシン選択のために設計した。

【0192】

５日目に形質導入されたＮＫ細胞について、本明細書および（特許文献１）（その全文
が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような、ＮＫ細胞を産生するための
３５日の、３段階プロセスにおけるＣＤ１６発現の残留性を試験した。ＣＤ１６発現を、
抗ＣＤ１６ＦＩＴＣ抗体（ＢＤカタログ番号５５５４０６、クローン３Ｇ８）を使用して
ＦＡＣＳによって決定した。野生型と比較してＣＤ１６ＶＰ形質導入細胞において、安定
な高いレベルのＣＤ１６が明白であった（図２５）（図２５中の棒グラフの対中の右の棒
グラフ）。したがって、３５日の、３段階プロセスＮＫ細胞に遺伝子改変されたＣＤ１６
を送達するためにレンチウイルスベクターを使用することの実現可能性が確認された。

【0193】

ＣＤ１６切断に起因するＣＤ１６シェディングの量を調べるために、ＮＫ細胞が、５０
μＭのプロテイナーゼ阻害剤ＴＡＰＩを用いて３０分間、次いで、ＰＭＡ（１μｇ／ｍＬ
）を用いて、または用いずに４時間処理されるアッセイを開発した。ＰＭＡ活性化は、Ｃ
Ｄ１６を、末梢血ＮＫ細胞において９７％、３５日の、３段階プロセスＮＫ細胞において
８９％低減するとわかった。ＴＡＰＩ処理は、末梢血および３段階ＮＫ細胞の両方におい
てＣＤ１６シェディングを阻害できた。ＣＤ１６ＶＰを用いて形質導入されたＮＫ細胞は
、ＰＭＡによって誘導されるＣＤ１６シェディングに対して耐性を示した。未処理細胞で
は、ＣＤ１６の９４％がシェディングしたのに対し、ＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞
では、ＣＤ１６の１７％しかシェディングしなかった。

【0194】

ＣＤ１６ＶＰを用いて形質導入された、３５日の、３段階プロセスＮＫ細胞の増殖およ
び表現型を、未処理細胞と比較した。形質導入された細胞と未処理細胞の間に、増殖にお
いて、またはＮＫ成熟マーカーにおいて有意差は見られなかった（図２６Ａ～Ｂ）。（図
２６Ｂでは、棒グラフの対の左の棒グラフは、未処理を表す。図２６Ｂ中の棒グラフの対
の右の棒グラフは、ＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞を表す。

【0195】

抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を研究して、ＣＤ１６ＶＰを用いる形質導
入の効果を評価した。標的癌細胞（ＤａｕｄｉまたはＵ２６６）を、ｍＡｂ（抗ＣＤ２０
または抗ＣＤ３８）とともに３０分間インキュベートし、ｍＡｂなしおよびＩｇＧを対照
として使用した。エフェクター細胞および癌細胞を、１．２５：１のＥ：Ｔ比で一緒に添
加し、エフェクター細胞を用いない対照を実施した。生存細胞について染色するためにＴ
ｏｐｏ５を添加した。ＦＡＣＳ解析によって、エフェクター細胞による特異的死滅のパー
センテージを決定した。ＣＤ１６ＶＰが形質導入された細胞は、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ
３８抗体の両方を用いて、未処理ＮＫ細胞と比較して、Ｄａｕｄｉ細胞に対する改善され
たＡＤＣＣを有するとわかった（図２７Ａ～Ｂ）。１：１のＥ：Ｔで２４時間のＡＤＣＣ
の間に、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－αの分泌も試験し、ＣＤ１６ＶＰが形
質導入されたＮＫ細胞は、未処理ＮＫ細胞と比較して、増大されたサイトカイン分泌を示
した（図２８Ａ～Ｃ）。

【0196】

ｅ． ７．５ 代替法５：ＴＧＦＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウト３段階ＮＫ細胞
ＣＲＩＳＰＲ関連技術を使用して、５日目のＧＭ ＮＫ細胞でＴＧＦＢＲ２およびＣＢ
ＬＢ遺伝子のノックアウトを実施して、以下の集団を作製した：偽トランスフェクション
、ＴＧＦＢＲ２ノックアウトＧＭ ＮＫ、ＣＢＬＢノックアウトＧＭ ＮＫおよびＴＧＦ
ＢＲ２／ＣＢＬＢ二重ノックアウトＧＭ ＮＫ。ＴＩＤＥ（分解によるインデルの追跡）
解析と組み合わせた標的化アンプリコンシーケンシングによって、ゲノム編集効率を評価
した。ＧＭ ＮＫ細胞および対照の免疫表現型決定は、通例の免疫表現型決定プロトコー
ルに従って実施した。エフェクター機能および分泌された分析物評価に先立って、ＴＧＦ
β１を用いて、または用いずに４８時間細胞を処理した。血液学的癌細胞株、すなわち、
Ｋ５６２、ＨＬ６０、ＫＧ－１およびＲＰＭＩ８２６６においてエフェクター機能を調べ
るために、４時間、フローベースの細胞毒性アッセイを利用した。分泌された分析物評価
のために、ＧＭ ＮＫおよび対照を、血液学的癌細胞株と、１：１ Ｅ：Ｔ比で２４時間
同時培養した。上清を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘイムノアッセイによ
って解析されるまで－２０℃で保存した。

【0197】

二重ノックアウトＧＭ ＮＫの遺伝子ノックアウト効率。ノックアウト効率は、二重ノ
ックアウト中のＴＧＦＢＲ２およびＣＢＬＢ遺伝子座各々について、単一ノックアウト対
照に対して同等であった、表４を参照のこと。

【0198】

【表4】

【0199】

二重ノックアウトＧＭ ＮＫの免疫表現型決定。免疫表現型決定解析は、二重ノックア
ウトＧＭ ＮＫは、対照と同様の表現型を有していたことを示した（表５）。

【0200】

【表5】

【0201】

二重ノックアウトＧＭ ＮＫの増殖倍数。全体的な増殖倍数は、単一ノックアウトが偽
トランスフェクション対照よりも少なく増殖したこと、および二重ノックアウトが単一ノ
ックアウトよりも増殖がさらに減少したことを示した（図２９）。

【0202】

細胞毒性アッセイ。二重ノックアウトＧＭ ＮＫは、両方の単一ノックアウトからの組
み合わされた利点を実証した。二重ノックアウトは、ＣＢＬＢ－ＧＭ ＮＫの増強された
特異的死滅およびＴＧＦＢＲ２－ＧＭ ＮＫ のＴＧＦβ誘発阻害に対する非感受性の両
方を示した。したがって、図３０および３１に示されるように、ＴＧＦβの存在下で、二
重ノックアウトＧＭ ＮＫ細胞は、標的腫瘍細胞株に対して最も多い死滅を示した。

【0203】

同時培養上清中の分泌された分析物。ＣＢＬＢ－ＧＭ ＮＫ由来の分泌された分析物は
、その増強されたエフェクター機能を反映した。ＣＢＬＢ－ＧＭ ＮＫにおいて、対照群
と比較した場合に、ｓＣＤ１３７の大きな増大ならびにＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦ
αおよびパーフォリンの中程度の増大が観察された。これらの分析物の分泌は、ＣＢＬＢ
－ＧＭ ＮＫおよびＧＭ ＮＫ対照の両方においてＴＧＦβ処置によって有意に低減され
た（図３２Ａ～Ｅ）。

【0204】

ＧＭ ＮＫ対照と比較して、ＴＧＦＢＲ２－ＧＭ ＮＫは、同様のレベルのＧＭ－ＣＳ
Ｆ、ｓＣＤ１３７、ＴＮＦαおよびパーフォリンだけでなく、より大きく増大された、あ
る特定の標的細胞に対するＩＦＮγも分泌した。これらの分析物の分泌は、ＴＧＦβ処理
によって阻害されなかった（図３２Ａ～Ｅ）。

【0205】

二重ノックアウトＧＭ ＮＫは、両方の単一ノックアウトからの組み合わされた利点を
実証した。ＧＭ－ＣＳＦ、ｓＣＤ１３７、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびパーフォリンなどの
分泌された分析物は、増大されただけでなく、ＴＧＦβ誘発低減に対して耐性であった。
ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγおよびＴＮＦαについて相互作用も観察された。それらの場合に
は、二重ノックアウトＧＭＮＫは、組み合わされた両方の単一ノックアウトと同等または
より多い分析物を分泌した（図３２Ａ～Ｅ）。

【0206】

ｆ． ７．６． 代替法６：ＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰ
ｉ．ＣＤ１６ＶＰ構築物および実験設定の背景
ＣＤ１６構築物を、ＰＮＫ（胎盤由来ＮＫ細胞）細胞における過剰発現のために作出し
、増強されたＡＤＣＣ機能を有する遺伝子改変ＰＮＫ細胞を作製した。ＣＤ１６を、２つ
の点突然変異、高親和性バリン変異体（１５８Ｖ／Ｖ）を作出するための１つおよびＣＤ
１６をＡｄａｍ１７（Ｓ１９７Ｐ）によって切断できなくするための第２のものを用いて
作出した。ＣＤ１６変異体は、ＣＤ１６ＶＰと名付けられた。レンチウイルスベクターを
作製し、増殖プロセスの５日目にＣＤ３４細胞に形質導入した。培養の間にＣＤ１６の発
現をモニタリングし、培養期間の最後に機能を評価した。ＣＤ１６ＶＰを有する、または
有さないＰＮＫ細胞を、ＩｇＧ１ｋ抗体に対する親和性の改善ならびに活性化誘導性シェ
ディングに対する耐性について試験した。

【0207】

ｉｉ．形質導入効率、ＰＮＫ増殖および表現型
目的１：レンチウイルスベクターを使用してＰＮＫ細胞でのＣＤ１６ＶＰの高い発現効
率を達成するため。
方法論：ＰＮＫ細胞でのＣＤ１６ＶＰの高い発現を達成するために、ＣＤ３４細胞を、
以下に列挙される種々の条件によって形質導入した：
・５および１０日目または培養
・１～２ラウンドの感染
・５ＭＯＩ～２００ＭＯＩの範囲の感染多重度（ＭＯＩ）
・６００ｇおよび１２００ｇのスピノキュレーション（Ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）
遠心分離速度

【0208】

結果：５および１０日目での形質導入は、同様の形質導入効率をもたらし、したがって
、レンチウイルス形質導入の標準時間枠として５日目を選択した。形質導入のラウンド数
（１対２）は、低い方のＭＯＩ（５０ＭＯＩ）でわずかな改善を示したが、高い方のＭＯ
Ｉ（１００ＭＯＩ）では、効率は異ならなかった。形質導入効率は、５０から１００ＭＯ
Ｉで増大したが、２００ＭＯＩではさらなる改善は示さなかった。６００ｇの遠心分離速
度は、１２００ｇと同様の形質導入効率をもたらした。したがって、最適化されたプロト
コールは、５日目での１００ＭＯＩで１ラウンド感染を用いる６００ｇ／１時間のスピノ
キュレーションプロトコールであると決定した。１０～２０μｇ／ｃｍ２レトロネクチン
を用いてコーティングされた非組織培養物処理４８ウェルプレートを使用して形質導入を
実施した（図３３）。

【0209】

最適化された形質導入プロトコールを、ＣＤ３４ドナー（ｎ＝７）を用いて評価し、７
０％を上回る中央値形質導入効率が達成された。

【0210】

目的２：ＰＮＫ細胞の増殖能に対する遺伝子改変および形質導入プロセスの影響を評価
するため。
方法論：最適化された形質導入プロセスにしたがって、細胞をこれまでに報告されたよ
うに培養した。

【0211】

結果：一部のドナーが、非形質導入対照と比較してＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰによる増殖倍
率の低下を示したものの、最適化された形質導入プロセスは、細胞の中央値増殖能に影響
を与えなかった（ｎ＝６）（図３４）。ＰＮＫ－ＮＴの増殖の範囲は、８１～５８６３で
あり、ＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰは、１３４～７８１８倍であった。

【0212】

目的３：ＰＮＫ細胞表現型に対するレンチウイルス遺伝子改変の影響を評価するため。
方法論：以前に報告されたように、フローサイトメトリーによってＰＮＫ細胞をＣＤ３
、ＣＤ５６、ＣＤ１１ａおよびＣＤ１６の発現について評価した。

【0213】

結果：レンチウイルス遺伝子改変は、製品定義基準（３５日目までに８５％のＣＤ３^－
ＣＤ５６^＋の）により、ＣＤ５６陽性細胞の出現にわずかな遅延を引き起こした。３５か
ら３８日への３日間の培養期間の増大は、８５％閾値を上回る改善されたＣＤ３^－ＣＤ５
６^＋表現型パーセントをもたらした。ＣＤ１６発現は、非形質導入細胞よりも高く持続し
、ＰＮＫ細胞の約５５％において中央値ＣＤ１６発現を有した。ＰＮＫ－ＮＴと比較して
、ＣＤ１６ＶＰにおいてＣＤ１１ａ陽性集団のわずかな増大も観察された（図３５）。遺
伝子改変は、ＣＤ５６分化の遅延を引き起こし、これは、培養スケジュールを３日延長す
ること（３８日）によって克服された。増殖後の遺伝子改変された群における中央値ＣＤ
１６発現は、５５を上回ると示された。ＣＤ１６ＶＰを用いて改変された細胞におけるＣ
Ｄ１１ａの中央値発現は、非形質導入対照よりも高いと思われる。

【0214】

遺伝子改変によって引き起こされたＣＤ５６^＋ＰＮＫ細胞の分化の遅延は、培養期間を
３日間延長することによって克服された。

【0215】

ｉｉｉ．ＰＮＫ ＣＤ１６ＶＰ構築物検証：ＣＤ１６誘導性脱顆粒および活性化誘導性
切断に対する耐性
目的１：ＩｇＧ１カッパ治療用抗体に向けたＣＤ１６ＶＰ構築物の機能的応答を評価す
るため。
方法論：ＣＤ１６ＶＰ発現に由来するＰＮＫ細胞を、４時間脱顆粒アッセイにおいてプ
レートに結合されたユニツキシン（Ｕｎｉｔｕｘｉｎ）抗体に対する応答性について試験
した。変動する濃度のユニツキシン（０μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／
ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ）を、高結合平底９６ウェルプレート上に４℃で一晩コーティン
グした。洗浄後、ＣＤ１０７ａ－ＰＥ抗体およびモネンシン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ）の存在下で、プレートにＰＢＳ、ＰＮＫ－ＮＴまたはＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰ細胞を
用いて播種した。ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間の刺激後、ＣＤ５６－ＡＰ
Ｃ、ＣＤ１６－ＢＶ４２１、ＣＤ１１ａ－ＦＩＴＣおよびＣＤ１０７ａ－ＰＥ（すべて、
ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の抗体）を用いて細胞を染色し、ＰＮＫ細胞による脱顆
粒を評価した。細胞を洗浄し、固定し、Ｕ底９６ウェルプレートに移し、ＦＡＣＳＣａｎ
ｔｏ Ｉフローサイトメーターを使用して読み取った。

【0216】

結果：プレートに結合されたＧＤ２抗体（ユニツキシン）を用いる活性化後、ＰＮＫ－
ＮＴおよびＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰの両方とも、コーティングされていないウェルと比較し
た１μｇ／ｍｌのユニツキシンコーティングでのＰＮＫ細胞でのＣＤ１０７ａの発現によ
って実証される脱顆粒応答を示した。遺伝子改変（ＣＤ１６ＶＰ）によるＣＤ１６の発現
の増大は、ＰＮＫ－ＮＴと比較したＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰによる脱顆粒応答の増大につな
がり、これによって、操作されたＣＤ１６ＶＰタンパク質の機能が損なわれていないとい
う驚くべき結果が確認された（図３６）。

【0217】

目的２：ＣＤ１６ＶＰ構築物を活性化誘導性シェディングに対する耐性について評価す
るため。
方法論：ＣＤ１６ＶＰ発現に由来するＰＮＫ細胞を活性化誘導性切断に対する耐性につ
いて試験した。ＡＤＡＭ－１７阻害性抗体（抗ＴＡＣＥ、クローンＤ１（Ａ１２））の存
在下または不在下で免疫細胞アクチベーターであるホルボール（ｐｈｏｒｂａｌ）１２－
ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）を用いてＰＮＫ細胞を４時間処理した。抗ＣＤ
１６抗体を使用してＣＤ１６の発現を評価した。

【0218】

結果：ＰＭＡ媒介性活性化後、非形質導入ＰＮＫ（ＰＮＫ－ＮＴ）細胞は、ＣＤ１６発
現の約９０％までの著しい喪失を示し、これは、ＡＤＡＭ－１７阻害剤抗ｔａｃｅ抗体の
存在下で防がれた。ＰＭＡを用いる刺激時にＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰ細胞からのＣＤ１６の
発現の有意な喪失はなかった（発現の約６％の喪失）。ここでもまた、ＡＤＡＭ－１７阻
害剤の存在が、ＣＤ１６発現の観察された６％の喪失を防いだ。データは、ＣＤ１６ＶＰ
構築物は、ＰＮＫ細胞の活性化の際にシェディングに対して耐性であることを示す。ＰＮ
Ｋ－ＮＴにおける野生型ＣＤ１６のＰＭＡ媒介性シェディングの作用機序は、野生型ＣＤ
１６発現の喪失の防止におけるＡＤＡＭ－１７阻害剤の能力によって証明される（文献に
おいて実証されるような）ＡＤＡＭ－１７の作用に起因し得る。

【0219】

操作されたタンパク質ＣＤ１６ＶＰは、機能的に無傷であった－－ＰＮＫ－ＣＤ１６Ｖ
Ｐによって脱顆粒応答を誘発でき、予測されるように、活性化媒介性受容体切断に対して
耐性であった。

【0220】

ｉｖ．抗体依存性細胞性細胞同性（ＡＤＣＣ）
目的：ＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰの改善されたＡＤＣＣ能を評価するため。
方法論：ＡＤＣＣアッセイを、これまでに記載されたように設定し、腫瘍標的を、ＰＫ
Ｈ－２６色素を用いて予備染色し、次いで、２０μｇ／ｍｌの治療用抗体（ＣＤ２０、Ｃ
Ｄ３８およびＣＤ３１９）を用いて、アッセイバッファー中、３７℃で３０分間染色し、
過剰の結合していない抗体を除去するために洗浄した。アッセイは、Ｕ底９６ウェルプレ
ートにおいて１０：１および２．５：１のＥ：Ｔ比で設定した。

【0221】

結果：試験した３種の抗体は、ＰＮＫ－ＮＴと比較して、ＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰによる
腫瘍標的Ｄａｕｄｉの溶解において改善を示した。（図３７）

【0222】

示されるように、ｐＮＫ細胞を使用する試験から、これらの細胞は増殖され、特徴付け
られてもよく、癌などの疾患の処置に使用され得る生成物を生じ得る。

【0223】

最適化されたレンチウイルス形質導入プロセスを開発し、７０％の中央値（４３～８１
％）の形質導入効率を達成し、増殖の最後に５０％を上回る中央値発現を維持した。実験
はまた、形質導入プロセスが、ＰＮＫ－ＮＴと比較してＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰ細胞の中央
値増殖能に対して負に影響を及ぼさなかったこと（８１～７８１８の範囲）を示す。

【0224】

ＣＤ５６陽性ＰＮＫ細胞の分化は、わずかに遅延し、これは、培養期間を３日間延長す
ることによって克服された。

【0225】

しかし、ＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰでのＣＤ１６のさらなる発現は、プレートに結合された
治療用ＩｇＧ１カッパ抗体ユニツキシンに応じたＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰによるより高い脱
顆粒につながった－これは、操作されたタンパク質の機能が損なわれていないことを示し
た。

【0226】

ＣＤ１６ＶＰは、活性化誘導性シェディング／切断に対して耐性であると確認された。

【0227】

驚くべきことに、ＰＮＫ－ＣＤ１６ＶＰ細胞は、ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ３１９
抗体に対してＤａｕｄｉ腫瘍株に対してより高い細胞毒性を示した。

【0228】

本発明は、本明細書に記載される特定の代替法による範囲に制限されるべきではない。
実際、記載されたものに加えて、本発明の種々の改変が、上記の説明および添付の図面か
ら当業者には明らかになろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入るよう意
図される。

【0229】

本明細書において引用されたすべての参考文献は、各個々の刊行物、特許または特許出
願が全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれるように具体的に、個々に示さ
れるのと同程度に、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。いか
なる刊行物の引用も、出願日前のその開示のためであり、本発明が先行発明のためにその
ような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されてはならない。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図24D】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図27A】

【図27B】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図29】

【図30A】

【図30B】

【図31A】

【図31B】

【図32A】

【図32B】

【図32C】

【図32D】

【図32E】

【図33】

【図34】

【図35】

【図35Cont.1】

【図35Cont.2】

【図36】

【図36Cont.】

【図37】

【図37Cont.】

【手続補正書】

【提出日】2023-01-06

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本願明細書に実質的に記載された、新規な物、方法及び製造方法。

【手続補正書】

【提出日】2023-01-06

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２２９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0229】

本明細書において引用されたすべての参考文献は、各個々の刊行物、特許または特許出
願が全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれるように具体的に、個々に示さ
れるのと同程度に、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。いか
なる刊行物の引用も、出願日前のその開示のためであり、本発明が先行発明のためにその
ような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されてはならない。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
ナチュラルキラー細胞の集団であって、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ＮＫ阻害性
分子の発現を欠く、またはＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されてい
るナチュラルキラー細胞の集団。
（態様２）
ＮＫ阻害性分子が、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択され
る１種または複数のＮＫ阻害性分子である、態様１に記載の集団。
（態様３）
遺伝子改変されたＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されて
いないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する、態様１または２に記
載の集団。
（態様４）
腫瘍細胞が、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部
癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ
腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺
癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞
腫細胞からなる群から選択される、態様３に記載の集団。
（態様５）
腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である、態様４に記載の集団。
（態様６）
固形腫瘍細胞が、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神
経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される、態様５に記載の集団。
（態様７）
ＮＫ阻害性分子の発現が、ノックアウトされている、態様１に記載の集団。
（態様８）
ＮＫ阻害性分子の発現が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレ
アーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている、態様７に記載
の集団。
（態様９）
ＮＫ阻害性分子の発現が、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている、請
求項７に記載の集団。
（態様１０）
ＮＫ阻害性分子がＣＢＬＢである、態様１または２に記載の集団。
（態様１１）
ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも
、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮ
Ｋ細胞の集団を生成する、態様７から１０のいずれか一項に記載の集団。
（態様１２）
ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも
、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞
の集団を生成する、態様７から１０のいずれか一項に記載の集団。
（態様１３）
脱顆粒が、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される、態様１２に記載の集団。
（態様１４）
ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較
して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓ
ＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよびパーフォリンのうち
１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する、態様７から１０のい
ずれか一項に記載の集団。
（態様１５）
ＮＫ阻害性分子がＮＫＧ２Ａである、態様１または２に記載の集団。
（態様１６）
ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトが、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よ
りも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激
された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する、態様１５から１９のい
ずれか一項に記載の集団。
（態様１７）
脱顆粒が、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される、態様１６に記載の集団。
（態様１８）
ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトが、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞と
比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、
ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンのうち１種または複数の分泌の変化を
有するＮＫ細胞の集団を生成する、態様１６または１７に記載の集団。
（態様１９）
ＮＫ阻害性分子がＴＧＦＢＲ２である、態様１または２に記載の集団。
（態様２０）
ＴＧＦＢＲ２発現のノックアウトが、ＴＧＦＢＲ２がノックアウトされていないＮＫ細
胞と比較して、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性のＴＧＦβ媒介性阻害に対する耐性
を有するＮＫ細胞の集団を生成する、態様１９に記載の集団。
（態様２１）
ナチュラルキラー細胞の集団であって、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、改変された
ＣＤ１６を含むように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞の集団。
（態様２２）
改変されたＣＤ１６が、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する、請
求項２１に記載の集団。
（態様２３）
改変されたＣＤ１６が、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する、態様２２に記載
の集団。
（態様２４）
改変されたＣＤ１６が、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である、態様２１に記載の集
団。
（態様２５）
改変されたＣＤ１６が、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する、態様２４に記
載の集団。
（態様２６）
改変されたＣＤ１６が、ＩｇＫシグナルペプチドを含有する、態様２１から２５のい
ずれか一項に記載の集団。
（態様２７）
改変されたＣＤ１６が、ＣＤ１６シグナルペプチドを含有する、態様２１から２６の
いずれか一項に記載の集団。
（態様２８）
改変されたＣＤ１６が、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される、態様２１から
２７のいずれか一項に記載の集団。
（態様２９）
改変されたＣＤ１６が、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞が
ＮＫ細胞に分化する、態様２８に記載の集団。
（態様３０）
改変されたＣＤ１６が、レンチウイルスベクターを介して導入される、態様２８から
２９に記載の集団。
（態様３１）
レンチウイルスベクターが、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する、
態様３０に記載の集団。
（態様３２）
レンチウイルスベクターが、１種または複数の薬物選択マーカーを含む、態様３０ま
たは３１に記載の集団。
（態様３３）
改変されたＣＤ１６が、レトロウイルスベクターを介して導入される、態様２８また
は２９に記載の集団。
（態様３４）
レトロウイルスベクターが、１種または複数の薬物選択マーカーを含む、態様３３に
記載の集団。
（態様３５）
ＮＫ細胞が、胎盤由来（ＰＮＫ細胞）である、態様１から３４のいずれか一項に記載
の集団。
（態様３６）
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、腫瘍細胞を、態様１から３５または５５か
ら５９のいずれか一項に記載の集団に由来するナチュラルキラー細胞と接触させることを
含む方法。
（態様３７）
前記接触が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる、態様３６に記載の方法。
（態様３８）
前記接触が、ｉｎ ｖｉｖｏで起こる、態様３６に記載の方法。
（態様３９）
前記接触が、ヒト個体、好ましくは、抗癌療法を受けるように選択された個体において
起こる、態様３８に記載の方法。
（態様４０）
前記ナチュラルキラー細胞を前記個体に投与することを含む、態様３９に記載の方法
。
（態様４１）
前記腫瘍細胞が、多発性骨髄腫細胞である、態様３６から４０のいずれかに記載の方
法。
（態様４２）
前記腫瘍細胞が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である、態様３６から４０のいず
れかに記載の方法。
（態様４３）
前記個体が、再発性／難治性ＡＭＬを有する、態様４２に記載の方法。
（態様４４）
前記個体が、ＡＭＬに対する少なくとも１種の非自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）治療が
失敗しているＡＭＬを有する、態様４２に記載の方法。
（態様４５）
前記個体が、６５歳以上であり、最初の寛解中である、態様４０に記載の方法。
（態様４６）
前記個体が、前記ナチュラルキラー細胞を投与する前にフルダラビン、シタラビンまた
は両方を用いてコンディショニングされている、態様４０から４５のいずれかに記載の
方法。
（態様４７）
腫瘍細胞が、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部
癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ
腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺
癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞
腫細胞からなる群から選択される、態様４０から４６のいずれかに記載の方法。
（態様４８）
腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である、態様４０から４７のいずれかに記載の集団。
（態様４９）
固形腫瘍細胞が、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神
経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される、態様４８に記載の集団。前記ナチ
ュラルキラー細胞が、抗ＣＤ３３抗体とともに投与される、態様４０から４９のいずれ
か一項に記載の方法。
（態様５０）
前記ナチュラルキラー細胞が、抗ＣＤ２０抗体とともに投与される、態様４０から４
９のいずれか一項に記載の方法。
（態様５１）
前記ナチュラルキラー細胞が、抗ＣＤ１３８抗体とともに投与される、態様４０から
４９のいずれか一項に記載の方法。
（態様５２）
前記ナチュラルキラー細胞が、抗ＣＤ３８抗体とともに投与される、態様４０から４
９のいずれか一項に記載の方法。
（態様５３）
前記ナチュラルキラー細胞が、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されている
、態様３６から５３のいずれかに記載の方法。
（態様５４）
前記ナチュラルキラー細胞が、前記接触または前記投与に先立って凍結保存されていな
い、態様３６から５３のいずれかに記載の方法。
（態様５５）
ナチュラルキラー細胞が、ＣＤ５６ ^＋ ＣＤ３ ^－ ＣＤ１１７ ^＋ ＣＤ１１ａ ^＋ であり、パー
フォリンおよび／またはＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、アリール炭化水素受容体およ
びＩＬ１Ｒ１のうち１種または複数を発現しない、態様１から５４のいずれか一項に記
載の集団。
（態様５６）
前記ナチュラルキラー細胞が、パーフォリンおよびＥＯＭＥＳを発現し、ＲＯＲγｔ、
アリール炭化水素受容体またはＩＬ１Ｒ１のいずれも発現しない、態様５５に記載の集
団。
（態様５７）
前記ナチュラルキラー細胞が、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＺＭＢ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０および
／またはＮＫＧ２Ｄをさらに発現する、態様５５または５６に記載の集団。
（態様５８）
前記ナチュラルキラー細胞が、ＣＤ９４を発現する、態様５５から５７のいずれか一
項に記載の集団。
（態様５９）
前記ナチュラルキラー細胞が、ＣＤ９４を発現しない、態様５５から５７のいずれか
一項に記載の集団。
（態様６０）
胎盤またはその一部に由来し、それによって胎盤由来ＮＫ細胞（ｐＮＫ細胞）を含むナ
チュラルキラー細胞の集団であって、ｐＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現を欠く、また
はＮＫ阻害性分子の発現の低減を示すように遺伝子改変されているナチュラルキラー細胞
の集団。
（態様６１）
ＮＫ阻害性分子が、ＣＢＬＢ、ＮＫＧ２ＡおよびＴＧＦＢＲ２からなる群から選択され
る１種または複数のＮＫ阻害性分子である、態様６０に記載の集団。
（態様６２）
遺伝子改変されたＮＫ細胞が、ＮＫ阻害性分子の発現がノックアウトまたは低減されて
いないＮＫ細胞よりも、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性を有する、態様６０または６１
に記載の集団。
（態様６３）
腫瘍細胞が、多発性骨髄腫細胞、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、乳癌細胞、頭頸部
癌細胞、肉腫細胞、腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ
腫細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺癌腫細胞、結腸腺
癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌腫細胞、結腸直腸腺癌細胞および網膜芽細胞
腫細胞からなる群から選択される、態様６２に記載の集団。
（態様６４）
腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である、態様６２に記載の集団。
（態様６５）
固形腫瘍細胞が、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、腎腫瘍細胞および多形神
経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞からなる群から選択される、態様６４に記載の集団。
（態様６６）
ＮＫ阻害性分子の発現が、ノックアウトされている、態様６０に記載の集団。
（態様６７）
ＮＫ阻害性分子の発現が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム、ジンクフィンガーヌクレ
アーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼによってノックアウトされている、態様６６に記
載の集団。
（態様６８）
ＮＫ阻害性分子の発現が、ＣＲＩＳＰＲ関連技術によってノックアウトされている、請
求項６６に記載の集団。
（態様６９）
ＮＫ阻害性分子が、ＣＢＬＢである、態様６０または６１に記載の集団。
（態様７０）
ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも
、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高いＩＦＮγ分泌を有するＮ
Ｋ細胞の集団を生成する、態様６９に記載の集団。
（態様７１）
ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞よりも
、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞
の集団を生成する、態様６９に記載の集団。
（態様７２）
脱顆粒が、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される、態様７１に記載の集団。
（態様７３）
ＣＢＬＢ発現のノックアウトが、ＣＢＬＢがノックアウトされていないＮＫ細胞と比較
して、多発性骨髄腫細胞と同時培養された場合に、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓ
ＣＤ１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリ
ンのうち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する、態様６９か
ら７２のいずれか一項に記載の集団。
（態様７４）
ＮＫ阻害性分子が、ＮＫＧ２Ａである、態様６０または６１に記載の集団。
（態様７５）
ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトが、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞よ
りも、ＮＫＧ２Ａアゴニスト抗体の存在下で、ＩＣＡＭ－１およびＭＩＣＡを用いて刺激
された場合に、高い脱顆粒を有するＮＫ細胞の集団を生成する、態様７４に記載の集団
。
（態様７６）
脱顆粒が、ＣＤ１０７ａの増大によって測定される、態様７５に記載の集団。
（態様７７）
ＣＤ１０７ａの増大が、ＦＡＣｓによって測定される、態様７６に記載の集団。
（態様７８）
ＮＫＧ２Ａ発現のノックアウトが、ＮＫＧ２ＡがノックアウトされていないＮＫ細胞、
例えば、天然に存在するＮＫ細胞と比較して、ＧＭ－ＣＳＦ、可溶性ＣＤ１３７（ｓＣＤ
１３７）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＴＮＦαおよび／またはパーフォリンの
うち１種または複数の分泌の変化を有するＮＫ細胞の集団を生成する、態様７４から７
７のいずれか一項に記載の集団。
（態様７９）
胎盤由来ナチュラルキラー細胞（ｐＮＫ）の集団であって、ｐＮＫ細胞が、改変された
ＣＤ１６を含むように遺伝子改変されている胎盤由来ナチュラルキラー細胞（ｐＮＫ）の
集団。
（態様８０）
改変されたＣＤ１６が、野生型ＣＤ１６よりもＩｇＧに対して高い親和性を有する、請
求項７９に記載の集団。
（態様８１）
改変されたＣＤ１６が、ＣＤ１６ａの位置１５８にバリンを有する、態様８０に記載
の集団。
（態様８２）
改変されたＣＤ１６が、ＡＤＡＭ１７切断に対して耐性である、態様７９に記載の集
団。
（態様８３）
ＣＤ１６が、ＣＤ１６ａの位置１９７にプロリンを有する、態様８２に記載の集団。
（態様８４）
改変されたＣＤ１６が、ＩｇＫシグナルペプチドまたはＣＤ１６シグナルペプチドを含
有する、態様７９から８３のいずれか一項に記載の集団。
（態様８５）
改変されたＣＤ１６が、ウイルス感染を介してＮＫ細胞に導入される、態様７９から
８４のいずれか一項に記載の集団。
（態様８６）
改変されたＣＤ１６が、ウイルス感染を介して造血細胞に導入され、次いで造血細胞が
ＮＫ細胞に分化する、態様８５に記載の集団。
（態様８７）
改変されたＣＤ１６が、レンチウイルスベクターを介して導入される、態様８５また
は８６に記載の集団。
（態様８８）
レンチウイルスベクターが、ＣＭＶまたはＥＦ１αプロモーターのいずれかを有する、
態様８７に記載の集団。
（態様８９）
レンチウイルスベクターが、１種または複数の薬物選択マーカーを含む、態様８５ま
たは８６に記載の集団。
（態様９０）
選択マーカーが、ＰｕｒｏＲ遺伝子、ＺｅｏＲ遺伝子、ＨｙｇｒｏＲ遺伝子、ｎｅｏＲ
遺伝子および／またはブラストサイジン耐性遺伝子などの選択剤に対する耐性を付与する
タンパク質をコードする遺伝子を含む、態様８９に記載の集団。
（態様９１）
改変されたＣＤ１６が、レトロウイルスベクターを介して導入される、態様８５また
は８６に記載の集団。
（態様９２）
レトロウイルスベクターが、１種または複数の薬物選択マーカーを含む、態様９１に
記載の集団。

【外国語明細書】