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特開2023-36921蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための物質および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023036921
(43)【公開日】2023-03-14
(54)【発明の名称】蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための物質および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20230307BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230307BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20230307BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230307BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230307BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230307BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20230307BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N5/10 ZNA
A61P27/16
A61K48/00
A61K35/76
A61K9/08
A61K9/10
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023000088
(22)【出願日】2023-01-04
(62)【分割の表示】P 2019542464の分割
【原出願日】2018-02-06
(31)【優先権主張番号】62/455,197
(32)【優先日】2017-02-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】596115687
【氏名又は名称】ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション
【住所又は居所原語表記】３００ Ｌｏｎｇｗｏｏｄ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ ０２１１５ Ｕ．Ｓ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】ホルト ジェフリー
(72)【発明者】
【氏名】ゲレオク グウェナエル
(72)【発明者】
【氏名】浅井 友香子
(57)【要約】 （修正有）
【課題】核酸を蝸牛および前庭細胞に効率的に送達するための物質および方法、ならびに遺伝子異常と関連する感覚トランスダクション障害を治療する方法を提供する。
【解決手段】Anc80に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するカプシドをコードし、かつEspinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターからなる群より選択される、ハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンcポリペプチドの発現を誘導するプロモーターを含む、内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、該ベクターを使用した、対象におけるアッシャー症候群を治療する方法を提供する。
【選択図】図１－１
【解決手段】Anc80に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するカプシドをコードし、かつEspinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターからなる群より選択される、ハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンcポリペプチドの発現を誘導するプロモーターを含む、内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、該ベクターを使用した、対象におけるアッシャー症候群を治療する方法を提供する。
【選択図】図１－１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Anc80に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するカプシドをコードし、かつ
Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターからなる群より選択される、ハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンcポリペプチドの発現を誘導するプロモーターを含む、
内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター。
Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターからなる群より選択される、ハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンcポリペプチドの発現を誘導するプロモーターを含む、
内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター。
【請求項2】
少なくとも約70％またはより高い効率で内有毛細胞および外有毛細胞に形質導入する、請求項1記載の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター。
【請求項3】
請求項1記載の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを含む、細胞。
【請求項4】
外有毛細胞または内有毛細胞である、請求項3記載の細胞。
【請求項5】
対象の細胞を、請求項1記載の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる段階を含む、対象におけるアッシャー症候群を治療する方法。
【請求項6】
対象の細胞を、請求項1記載の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる段階を含む、欠陥遺伝子の野生型形態をアッシャー症候群の対象に導入する方法。
【請求項7】
対象の細胞を内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる段階を含み、該ベクターが、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターからなる群より選択されるプロモーターを含み、該プロモーターが、ミオシン7a、ハーモニン、カドヘリン23、プロトカドヘリン15、SANS、ならびにカルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2からなる群より選択されるヒトUSH1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を誘導する、対象におけるアッシャー症候群を治療する方法。
【請求項8】
ヒトポリペプチドが、TMC1、TMC2、ハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンcである、請求項7記載の方法。
【請求項9】
投与が聴力喪失を好転させる、請求項7記載の方法。
【請求項10】
聴力喪失が、部分的な聴力喪失または完全な聴力消失である、請求項9記載の方法。
【請求項11】
聴覚機能の回復が、毛束形態の保存および／またはメカノトランスダクションの回復と関連する、請求項9記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本特許出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2017年2月6日に出願された米国特許仮出願第62/455,197号への優先権およびその恩典を主張する。
本特許出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2017年2月6日に出願された米国特許仮出願第62/455,197号への優先権およびその恩典を主張する。
【背景技術】
【0002】
背景
遺伝性難聴は、人工内耳以外に治療選択肢が少ない深刻な障害である。遺伝性聴力障害は、多くの場合、単一遺伝子異常によるものである。言語習得前難聴は乳児の1/500において診断され、そのうち約50％が遺伝的病因を有する。それぞれが多数の異なる遺伝子のいずれかの変異によって生じ得る多数の異なる臨床サブタイプと関連するアッシャー症候群が、幼児期難聴の3～6％の原因とされている。すべての遺伝性難聴の1～2％であると推定される、より一般的な遺伝子異常の1つがTMC1遺伝子において発生する。アッシャー症候群のもっとも重篤な形態であるUSH1は、6つの遺伝子：USH1、MYO7A（ミオシン7a）、USH1C（harmonin「ハーモニン」）、CDH23（カドヘリン23）、PCDH15（プロトカドヘリン15）、SANS（sans；USH1Gとも知られる）、およびCIB2（カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2）の異常と関連する。
遺伝性難聴は、人工内耳以外に治療選択肢が少ない深刻な障害である。遺伝性聴力障害は、多くの場合、単一遺伝子異常によるものである。言語習得前難聴は乳児の1/500において診断され、そのうち約50％が遺伝的病因を有する。それぞれが多数の異なる遺伝子のいずれかの変異によって生じ得る多数の異なる臨床サブタイプと関連するアッシャー症候群が、幼児期難聴の3～6％の原因とされている。すべての遺伝性難聴の1～2％であると推定される、より一般的な遺伝子異常の1つがTMC1遺伝子において発生する。アッシャー症候群のもっとも重篤な形態であるUSH1は、6つの遺伝子：USH1、MYO7A（ミオシン7a）、USH1C（harmonin「ハーモニン」）、CDH23（カドヘリン23）、PCDH15（プロトカドヘリン15）、SANS（sans；USH1Gとも知られる）、およびCIB2（カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2）の異常と関連する。
【0003】
内耳、たとえば蝸牛、特に蝸牛中の内有毛細胞および外有毛細胞（IHCおよびOHC）は、様々な病因の聴力喪失および難聴、とりわけ、一遺伝子形態の遺伝性難聴に介入するためのポリヌクレオチド治療法にとって魅力的な標的である。しかし、IHCおよびOHCならびに遺伝子治療法に関連し得る他の内耳細胞を効率的にターゲッティングし、形質導入することは難題であった。
【発明の概要】
【0004】
概要
本発明は、対象の内耳の細胞（たとえば内有毛細胞または外有毛細胞）をターゲッティングし、関心対象のポリペプチド（たとえばTMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7 USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc））をコードする導入遺伝子を発現させるための組成物および方法を提供する。1つの態様において、内耳有毛細胞ターゲッティングAAVが、聴覚および／または前庭メカノセンセーションに遺伝子異常を有する対象の内耳に投与される。
本発明は、対象の内耳の細胞（たとえば内有毛細胞または外有毛細胞）をターゲッティングし、関心対象のポリペプチド（たとえばTMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7 USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc））をコードする導入遺伝子を発現させるための組成物および方法を提供する。1つの態様において、内耳有毛細胞ターゲッティングAAVが、聴覚および／または前庭メカノセンセーションに遺伝子異常を有する対象の内耳に投与される。
【0005】
本明細書に示すように、Anc80と呼ばれる祖先足場カプシドタンパク質または特定のAnc80カプシドタンパク質（たとえばAnc80-0065）を含有するアデノ随伴ウイルス（AAV）が、内耳中の様々な細胞、たとえばインビボでIHCおよびOHCを効率的にターゲッティングする。
【0006】
動物モデルにおける内耳細胞への遺伝子導入は、1つまたは複数のタイプの細胞、たとえば外有毛細胞への限られた形質導入のせいで、限られた効能しか有しない。しかし、Anc80カプシドタンパク質を含有するAAVに基づく新たな組成物および方法を含む、本明細書に記載される新規な遺伝子送達モダリティは、IHCおよびOHCの両方を含む内耳細胞への非常に効率的な遺伝子導入を提供する。
【0007】
1つの局面において、本発明は、ヒトUSH1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し、USH1ポリペプチドが、ミオシン7a、ハーモニン（たとえばハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンc）、カドヘリン23、プロトカドヘリン15、SANS、ならびにカルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2、または本明細書に記載される任意の他のポリペプチドである、内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを提供する。
【0008】
もう1つの局面において、本発明は、Anc80L65に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するカプシドをコードし、ヒトTMC1またはTMC2ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターを含有する内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを提供する。
【0009】
もう1つの局面において、本発明は、下流ポリヌクレオチドの発現を誘導するEspinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、またはTMHS（LHFPL5）プロモーターであるプロモーターを含有する内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを提供する。
【0010】
もう1つの局面において、本発明は、前記局面の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを含有する細胞を提供する。
【0011】
もう1つの局面において、本発明は、内耳の細胞を、関心対象のポリペプチドをコードする内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる工程を含み、AAVベクターが、内耳の細胞の少なくとも約70％をトランスフェクトし、祖先AAV配列を含有する、対象の内耳中でポリペプチドを発現させる方法を提供する。
【0012】
もう1つの局面において、本発明は、内耳の細胞を、関心対象のヒトポリペプチドをコードする合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる工程を含み、AAVベクターが、Anc80L65に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するカプシドをコードする、対象の内耳中でポリペプチドを発現させる方法を提供する。
【0013】
もう1つの局面において、本発明は、対象の細胞を内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる工程を含み、ベクターが、ヒトUSH1ポリペプチドをコートするポリヌクレオチドを含有し、USH1ポリペプチドが、ミオシン7a、ハーモニン、カドヘリン23、プロトカドヘリン15、SANS、ならびにカルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2のいずれか1つまたは複数である、対象における感覚トランスダクション障害を治療する方法を提供する。
【0014】
もう1つの局面において、本発明は、対象の細胞を内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる工程を含み、ベクターが、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターのいずれかであるプロモーターを含有する、対象における感覚トランスダクション障害を治療する方法を提供する。
【0015】
もう1つの局面において、本発明は、対象の細胞を内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる工程を含み、ベクターが、Anc80L65に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するカプシドをコードし、ミオシン7a、ハーモニン、カドヘリン23、プロトカドヘリン15、SANS、およびカルシウムまたはインテグリン結合タンパク質2であるUSH1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含有する、対象における感覚トランスダクション障害を治療する方法を提供する。
【0016】
本明細書に記載される発明の上記局面または任意の他の局面の様々な態様において、感覚トランスダクション障害とは、内耳中に発現するポリペプチドの遺伝子変化と関連する遺伝子疾患である。上記局面の他の態様において、プロモーターは、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターの任意の1つまたは複数である。上記局面の他の態様において、ベクターは、少なくとも約70％以上の効率で内有毛細胞および外有毛細胞に形質導入する。上記局面の他の態様において、ハーモニンポリペプチドは、ハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンcである。上記局面の他の態様において、細胞は外有毛細胞または内有毛細胞である。上記局面の他の態様において、ベクターは、下流ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターを含有し、プロモーターは、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、またはTMHS（LHFPL5）プロモーターである。上記局面の他の態様において、下流ポリヌクレオチドは、TMC1、TMC2、または、ミオシン7a、ハーモニン、カドヘリン23、プロトカドヘリン15、SANS、ならびにカルシウムまたはインテグリン結合タンパク質2であるUSH1ポリペプチドである。上記局面の特定の態様において、ハーモニンポリペプチドは、ハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンcである。上記局面の他の態様において、内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、内有毛細胞および外有毛細胞を少なくとも約70％、80％、90％、95％以上の効率、さらには100％の効率でターゲッティングする。上記局面の他の態様において、ヒトポリペプチドは、TMC1、TMC2、ハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンcである。上記局面の他の態様において、感覚トランスダクション障害は聴覚障害または前庭障害である。上記局面の他の態様において、感覚トランスダクション障害はアッシャー症候群である。
【0017】
定義
別段の定めがない限り、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献が、本発明において使用される用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Vcrlag (1991)およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において使用される以下の用語は、別段の指定がない限り、以下それらに与えられる意味を有する。
別段の定めがない限り、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献が、本発明において使用される用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Vcrlag (1991)およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において使用される以下の用語は、別段の指定がない限り、以下それらに与えられる意味を有する。
【0018】
「祖先AAV配列」とは、天然に存在するAAVの分析および進化的祖先の予測から生じる遺伝子操作の産物である、設計された配列をいう。
【0019】
「Anc80ポリペプチド」とは、以下のポリペプチド配列に対して少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有するカプシドポリペプチドをいう。
【0020】
「Anc80ポリヌクレオチド」とは、Anc80ポリペプチドをコードする核酸分子をいう。
【0021】
「血清陽性率」とは、血清学的（血清）検体に基づき、特定の疾患に関して陽性と判定される集団中の人数をいう。1つの態様において、血清陽性率は、検査された全検体のパーセント値として、または検査された100,000人あたりの割合として特性決定される。
【0022】
「内耳有毛細胞ターゲッティングAAV」とは、対象の内耳への投与または内耳由来の細胞とのインビトロでの接触ののち、少なくとも内有毛細胞の70％および外有毛細胞の70％をトランスフェクトするアデノ随伴ウイルスをいう。好ましくは、内耳有毛細胞ターゲッティングAAVは、蝸牛へのインビボ注入ののち、少なくとも内有毛細胞の90％および外有毛細胞の90％をトランスフェクトするAAVである。トランスフェクション効率は、マウスモデルにおいてGFPをコードする遺伝子を使用して評価され得る。
【0023】
「メカノセンセーション」とは、機械的刺激に対する反応をいう。機械的刺激から神経シグナルへの変換の例の触覚、聴覚および平衡。メカノセンセーション入力は、「メカノトランスダクション」と呼ばれるプロセスを通して、機械的刺激に対する反応へと変換される。
【0024】
「TMC1ポリペプチド」とは、メカノトランスダクションチャネル活性を有する、NCBI Reference Sequence: NP_619636.2に対して少なくとも約85％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片をいう。TMC1の例示的アミノ酸配列を以下に提供する。
【0025】
「TMC1ポリヌクレオチド」とは、TMC1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをいう。例示的なTMC1ポリヌクレオチドの配列が、以下に再現されるNCBI Reference Sequence: NM_138691.2に提供されている。
【0026】
「TMC2ポリペプチド」とは、メカノセンセーションにおいて機能する、NCBI Reference Sequence: NP_542789に対して少なくとも約85％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片をいう。TMC2の例示的アミノ酸配列を以下に提供する。
【0027】
「ハーモニンポリペプチド」とは、メカノセンセーションにおいて機能するまたはUSH1C、USH1G、CDH23、およびMYO7Aのいずれか1つもしくは複数と相互作用する、Q9Y6N9-1（アイソフォーム1）、Q9Y6N9-2、Q9Y6N9-3、Q9Y6N9-4、Q9Y6N9-5に対して少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片をいう。例示的なハーモニンaポリペプチド（アイソフォーム1）の配列を以下に提供する。
＞sp|Q9Y6N9|USH1C_ヒトハーモニン OS=ホモサピエンス GN=USH1C PE=1 SV=3
＞sp|Q9Y6N9|USH1C_ヒトハーモニン OS=ホモサピエンス GN=USH1C PE=1 SV=3
【0028】
「Ush1Cポリヌクレオチド」とは、ハーモニンポリペプチドをコードする核酸分子をいう。例示的なUsh1CポリヌクレオチドNM_005709の配列を以下に提供する。
【0029】
他の例示的なハーモニン配列を以下に提供する。
ハーモニンB
＞XM 011519832.2 予測：ホモサピエンスUSH1タンパク質ネットワーク成分ハーモニン（USH1C）、転写産物変異体X3、mRNA
ハーモニンB
＞XM 011519832.2 予測：ホモサピエンスUSH1タンパク質ネットワーク成分ハーモニン（USH1C）、転写産物変異体X3、mRNA
【0030】
ハーモニンBポリペプチド
【0031】
ハーモニンC
＞NM 001297764.1 ホモサピエンスUSH1タンパク質ネットワーク成分ハーモニン（USH1C）、転写産物変異体3、mRNA
＞NM 001297764.1 ホモサピエンスUSH1タンパク質ネットワーク成分ハーモニン（USH1C）、転写産物変異体3、mRNA
【0032】
ハーモニンCポリペプチド
【0033】
「Espinプロモーター」とは、蝸牛細胞中で下流ポリヌクレオチドの発現を誘導するのに十分である、NCBI Reference Sequence: NG_015866.1に由来する調節ポリヌクレオチド配列をいう。1つの態様において、Espinプロモーターは、Epsinコード配列の上流の少なくとも約350、500、1000、2000、3000、4000、5000またはそれより多くの塩基対を含む。
【0034】
「プロトカドヘリン15（PCDH15）プロモーター」とは、蝸牛細胞中で下流ポリヌクレオチドの発現を誘導するのに十分である、NCBI Reference Sequence: NG_009191に由来する調節ポリヌクレオチド配列をいう。1つの態様において、PCDH15プロモーターは、PCDH15コード配列の上流の少なくとも約350、500、1000、2000、3000、4000、5000またはそれより多くの塩基対を含む。
【0035】
「タンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプQ（PTPRQ）プロモーター」とは、蝸牛細胞中で下流ポリヌクレオチドの発現を誘導するのに十分である、GenelD: 374462に由来する調節ポリヌクレオチド配列をいう。1つの態様において、PTPRQプロモーターは、PTPRQコード配列の上流の少なくとも約350、500、1000、2000、3000、4000、5000またはそれより多くの塩基対を含む。
【0036】
「脂肪腫HMGIC融合パートナー様5（LHFPL5）プロモーター」（「TMHSプロモーター」とも呼ばれる）とは、蝸牛細胞中で下流ポリヌクレオチドの発現を誘導するのに十分である、NCBI Reference Sequence: GeneID: 222662に由来する調節ポリヌクレオチド配列をいう。1つの態様において、TMHSプロモーターは、PCDH15コード配列の上流に少なくとも約350、500、1000、2000、3000、4000、5000またはより多くの塩基対を含む。
【0037】
「作用物質」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは小さな化合物をいう。
【0038】
「改善する」とは、疾患または障害の発症または進行を低下させる、抑制する、弱める、減らす、阻止する、または安定化することをいう。
【0039】
「変性」とは、本明細書に記載されるものなどの標準的な既知の方法によって検出される、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（増減）をいう。本明細書において使用される変性は、発現レベルの10％の変化、好ましくは発現レベルの25％の変化、より好ましくは40％の変化、もっとも好ましくは50％以上の変化を含む。
【0040】
本開示において、「含む」、「含み」、「含有し」、および「有し」などは、米国特許法においてそれらに与えられる意味を有することができ、「含む」、「含み」などを意味することができ；「から本質的になり」または「から本質的になる」などは、米国特許法において与えられる意味を有し、この用語は開放型であり、記載されるもの以外の存在によって記載されるものの基本的または新規な特徴が変わることがない限り、記載されるもの以外の存在をも許すが、従来技術態様を除外する。
【0041】
「検出する」とは、検出されるべき分析対象物の存在、非存在または量を識別することをいう。
【0042】
「疾患」とは、細胞、組織、または器官の正常な機能を損傷または妨害する任意の状態または障害をいう。疾患の例は、たとえば対象の内耳中に発現する、メカノセンセーショントランスダクションにおいて機能するタンパク質中の機能の損失を特徴とする遺伝子疾患を含む。もう1つの態様において、疾患はアッシャー症候群（たとえばUSH1）または加齢性聴力喪失である。1つの態様において、疾患は、遺伝子異常、たとえばTMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc）の異常と関連する聴覚障害である。
【0043】
「有効量」とは、未処置の患者に対して疾患の症状を改善するために必要な作用物質の量をいう。疾患の治療処置のために本発明を実施するために使用される活性物質の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重および健康状態に依存して異なる。最終的には、主治医または獣医が適切な量および用法・用量を決定する。そのような量が「有効量」と呼ばれる。
【0044】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分をいう。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％を含む。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。
【0045】
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的核酸塩基間の、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合であり得る水素結合をいう。たとえば、アデニンとチミンが、水素結合の形成を通して対を成す相補的核酸塩基である。
【0046】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に高純度の」とは、自然な状態で見いだされたとき通常それに付随する成分を様々な程度に含まない物質をいう。「単離」とは、供給源または周囲からのある程度の分離を指す。
【0047】
「精製」とは、単離よりも高い程度の分離を指す。「精製された」または「生物学的に高純度の」タンパク質は、任意の不純物がタンパク質の生物学的性質に実質的に影響しない、または他の有害な結果を生じさせない程度に十分に、他の物質を含まない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えDNA技術によって産生される場合、細胞物質、ウイルス物質、または培地を実質的に含まないならば、または化学合成される場合、化学的前駆体または他の薬品を含まないならば、精製されている。純度および均一性は通常は、分析化学技術、たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液クロマトグラフィーを使用して測定される。用語「精製された」は、電気泳動ゲル中で核酸またはタンパク質が本質的に1つのバンドしか生じさせないことを指すことができる。修飾、たとえばリン酸化またはグリコシル化に付されることができるタンパク質の場合、様々な修飾によって、別々に精製され得る様々な単離されたタンパク質が生じ得る。
【0048】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然ゲノム中で当該遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸（たとえばDNA）をいう。したがって、この語は、たとえば、ベクターに組み込まれている組換えDNA；自律複製性プラスミドもしくはウイルスに組み込まれている組換えDNA；原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれている組換えDNA；または他の配列から独立した別個の分子（たとえば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたcDNAまたはゲノムもしくcDNA断片）として存在する組換えDNAを含む。加えて、この用語は、DNA分子から転写されるRNA分子およびさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
【0049】
「単離されたポリペプチド」とは、自然にはそれに付随する成分から分離されている本発明のポリペプチドをいう。概して、ポリペプチドは、少なくとも60重量％が、天然においてそれが会合しているタンパク質および天然の有機分子を含まないとき、単離されている。好ましくは、調製物は、少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、もっとも好ましくは少なくとも99％が本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、たとえば、天然の供給源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；または、タンパク質の化学合成によって、得られ得る。純度は、任意の適切な方法、たとえばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって計測することができる。
【0050】
「マーカー」とは、疾患または障害と関連して発現レベルまたは活性の変化を示す任意のタンパク質またはポリヌクレオチドをいう。
【0051】
本明細書において使用される「作用物質を得る」におけるような「得る」は、作用物質を合成する、購入する、または他のやり方で取得することを含む。
【0052】
「プロモーター」とは、下流ポリヌクレオチドの転写を誘導するのに十分なポリヌクレオチドをいう。
【0053】
「減らす」とは、少なくとも10％、25％、50％、75％、または100％の負の変化をいう。
【0054】
「参照」とは、標準または対照条件をいう。
【0055】
「参照配列」とは、配列比較のベースとして使用される規定の配列である。参照配列は、指定された配列のサブセットまたは全体；たとえば完全長cDNAもしくは遺伝子配列のセグメントまたは完全なcDNAもしく遺伝子配列であり得る。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは概して、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、さらに好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸である。核酸の場合、参照核酸配列の長さは概して、少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド、さらに好ましくは約100ヌクレオチドまたは約300ヌクレオチドまたはそれらの周辺もしくは間の任意の整数である。
【0056】
本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内在性核酸配列に対して100％同一である必要はないが、概して実質的な同一性を示す。内在性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは概して、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内在性核酸配列に対して100％同一である必要はないが、概して実質的な同一性を示す。内在性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは概して、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。
【0057】
「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシーの条件下、相補的ポリヌクレオチド配列（たとえば、本明細書に記載される遺伝子）間でまたはその部分の間で二本鎖分子を形成するために対を成すことをいう（たとえば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399；Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照）。
【0058】
たとえば、ストリンジェントな塩濃度は通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満である。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、たとえばホルムアミドの非存在において得ることができ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35％ホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50％ホルムアミドの存在において得ることができる。ストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、もっとも好ましくは少なくとも約42℃の温度を含む。様々なさらなるパラメータ、たとえばハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度およびキャリヤDNAの包含または非包含が当業者に周知である。これら様々な条件を必要に応じて組み合わせることにより、様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウムおよび1％SDS中、30℃で実施される。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミドおよび100μg/ml変性サケ精子DNA（ssDNA）中、37℃で実施される。もっとも好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミドおよび200μg/ml ssDNA中、42℃で実施される。これらの条件に対する有用な変更が当業者には容易に理解されよう。
【0059】
大部分の応用の場合、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もまた、ストリンジェンシーにおいて異なる。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって決めることができる。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を下げることによって、または温度を上げることによって、高めることができる。たとえば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウム未満であり、もっとも好ましくは、約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウム未満であろう。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらに好ましくは少なくとも約68℃を含む。好ましい態様において、洗浄工程は、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中、25℃で実施される。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中、42℃で実施される。より好ましい態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中、68℃で実施される。これらの条件に対するさらなる変更が当業者には容易に理解されよう。ハイブリダイゼーション技術は当業者に周知であり、たとえば、Benton and Davis（Science 196:180, 1977）；Grunstein and Hogness（Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)；Ausubel et al.（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001）；Berger and Kimmel（Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York）およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
【0060】
「実質的に同一」とは、ポリペプチドまたは核酸分子が参照アミノ酸配列（たとえば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか1つ）または核酸配列（たとえば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか1つ）に対して少なくとも50％の同一性を示すことをいう。好ましくは、そのような配列は、比較に使用される配列に対してアミノ酸レベルまたは核酸において少なくとも60％、より好ましくは80％または85％、より好ましくは90％、95％、または99％同一である。
【0061】
配列同一性は一般的に、配列分析ソフトウェア（たとえば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705、BLAST、BESTFIT、GAPまたはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を使用して計測される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失および／または他の修飾にホモロジー度を割り当てることにより、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換は一般的に以下のグループ内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニンおよびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を測定するための例示的手法においてはBLASTプログラムが使用され得、e-3～e-100の間の確率スコアが、密接に関連する配列を示す。
【0062】
「対象」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、たとえばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコをはじめとする哺乳動物をいう。
【0063】
「導入遺伝子」とは、作為的に細胞に挿入され、その細胞から発生する生物のゲノムの一部となる、または、線虫導入遺伝子の場合、遺伝性染色体外アレイの一部となる、DNAの任意のピースをいう。そのような導入遺伝子は、トランスジェニック生物にとって部分的または完全に異種（すなわち外因性）である遺伝子を含み得る、または生物の内在性遺伝子に相同な遺伝子を表し得る。
【0064】
本明細書に提供される範囲は、範囲内の値のすべてのための省略表現であると理解されよう。たとえば、1～50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むことが理解されよう。
【0065】
本明細書において使用される用語「治療する」、「治療」などは、障害および／またはそれに伴う症状を軽減または改善することをいう。障害または状態の治療は、障害、状態またはそれに伴う症状が完全に解消されることを要求しない（除外はされないが）ということが理解されよう。
【0066】
具体的に述べられない、または文脈から明白でない限り、本明細書において使用される用語「または」は包括的であると理解されよう。具体的に述べられない、または文脈から明白でない限り、「1つの」、「ある」、および「その」は単数でも複数でもあるということが理解されよう。
【0067】
具体的に述べられない、または文脈から明白でない限り、本明細書において使用される用語「約」は、当技術分野における通常の許容範囲内、たとえば平均値の2標準偏差内と理解されよう。「約」は、述べられた値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、または0.01％以内と理解することができる。そうでないことが文脈から明白でない限り、本明細書に提供されるすべての数値は用語「約」によって修飾される。
【0068】
本明細書における変数の任意の定義における化学的グループのリストの記載は、任意の1つのグループまたはリストされたグループの組み合わせとしての当該変数の定義を含む。本明細書における変数または局面に関する態様の記載は、任意の1つの態様としての当該態様または任意の他の態様もしくはその部分との組み合わせとしての当該態様を含む。
【0069】
本明細書に提供される任意の組成物または方法は、本明細書に提供される他の組成物および方法のいずれの1つまたは複数と組み合わされることができる。
【0070】
別段の定めがない限り、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、方法および物質組成が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等である方法および材料を方法および物質組成の実施または試験に使用することもできるが、適当な方法および材料が本明細書に記載される。加えて、材料、方法および例は例示でしかなく、限定的であることを意図したものではない。本明細書において挙げられるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
[本発明1001]
Anc80に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するカプシドをコードし、かつ
Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターからなる群より選択される、ハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンcポリペプチドの発現を誘導するプロモーターを含む、
内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター。
[本発明1002]
少なくとも約70％またはより高い効率で内有毛細胞および外有毛細胞に形質導入する、本発明1001の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター。
[本発明1003]
本発明1001の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを含む、細胞。
[本発明1004]
外有毛細胞または内有毛細胞である、本発明1003の細胞。
[本発明1005]
対象の細胞を、本発明1001の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる段階を含む、対象におけるアッシャー症候群を治療する方法。
[本発明1006]
対象の細胞を、本発明1001の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる段階を含む、欠陥遺伝子の野生型形態をアッシャー症候群の対象に導入する方法。
[本発明1007]
対象の細胞を内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる段階を含み、該ベクターが、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターからなる群より選択されるプロモーターを含み、該プロモーターが、ミオシン7a、ハーモニン、カドヘリン23、プロトカドヘリン15、SANS、ならびにカルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2からなる群より選択されるヒトUSH1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を誘導する、対象におけるアッシャー症候群を治療する方法。
[本発明1008]
ヒトポリペプチドが、TMC1、TMC2、ハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンcである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
投与が聴力喪失を好転させる、本発明1007の方法。
[本発明1010]
聴力喪失が、部分的な聴力喪失または完全な聴力消失である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
聴覚機能の回復が、毛束形態の保存および／またはメカノトランスダクションの回復と関連する、本発明1009の方法。
[本発明1001]
Anc80に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するカプシドをコードし、かつ
Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターからなる群より選択される、ハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンcポリペプチドの発現を誘導するプロモーターを含む、
内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター。
[本発明1002]
少なくとも約70％またはより高い効率で内有毛細胞および外有毛細胞に形質導入する、本発明1001の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター。
[本発明1003]
本発明1001の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを含む、細胞。
[本発明1004]
外有毛細胞または内有毛細胞である、本発明1003の細胞。
[本発明1005]
対象の細胞を、本発明1001の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる段階を含む、対象におけるアッシャー症候群を治療する方法。
[本発明1006]
対象の細胞を、本発明1001の内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる段階を含む、欠陥遺伝子の野生型形態をアッシャー症候群の対象に導入する方法。
[本発明1007]
対象の細胞を内耳有毛細胞ターゲッティング合成アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターと接触させる段階を含み、該ベクターが、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターからなる群より選択されるプロモーターを含み、該プロモーターが、ミオシン7a、ハーモニン、カドヘリン23、プロトカドヘリン15、SANS、ならびにカルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2からなる群より選択されるヒトUSH1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を誘導する、対象におけるアッシャー症候群を治療する方法。
[本発明1008]
ヒトポリペプチドが、TMC1、TMC2、ハーモニンa、ハーモニンb、またはハーモニンcである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
投与が聴力喪失を好転させる、本発明1007の方法。
[本発明1010]
聴力喪失が、部分的な聴力喪失または完全な聴力消失である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
聴覚機能の回復が、毛束形態の保存および／またはメカノトランスダクションの回復と関連する、本発明1009の方法。
【図面の簡単な説明】
【0071】
パート1：高効率蝸牛遺伝子導入
【図1-1】図1A～1Gは、一連の顕微鏡写真（A）および6つのグラフ（B～G）を提供する。天然AAV血清型およびAnc80のインビボ蝸牛形質導入。（A）Alexa-546ファロイジン（赤）で対比染色され、eGFP（緑―本明細書を通しては中間および下パネル中の明るい染色として示される）に関して画像化されたマウスコルチ器の共焦点画像。マウスに対し、各パネルの上に示す力価でAAVストック溶液1μLを注入した。スケールバー＝50μm。（B）AAV-eGFP注入蝸牛の基底および頂端におけるeGFP陽性IHCの定量。（C）AAV-eGFP注入蝸牛の基底および頂端におけるeGFP陽性OHCの定量。C57BL/6マウスの一方の耳に注入を実施した：5匹（AAV1）、4匹（AAV2）、2匹（AAV8）、1匹（AAV6）、3匹（Anc80）。（D）eGFP陰性OHC（黒）およびeGFP陽性OHC（緑）からP7（左）で記録された感覚トランスダクション電流の群。毛束を－0.1～1μmの間で0.1μm刻みで偏向させた。垂直スケールバーは200pAを示し；水平スケールバーは20msecを示す。eGFP陰性（黒）およびeGFP陽性（緑）P35 IHCからの電流が右に示されている。垂直スケールバーは100pAを示し；水平スケールバーは20msecを示す。（E）下に示す齢の103のIHCおよびOHCに関してプロットされた感覚トランスダクション電流振幅。eGFP陰性（黒）およびeGFP陽性（緑）からのデータが示されている。各グループ中の細胞の数がグラフに示されている。すべてのマウスに対してP1で注入を実施した。（F）平均値±標準偏差（SD）。4つのAnc80注入耳（緑）および4つの非注入耳（黒）に関してプロットされたABR閾値ならびに注入関連の損傷のせいでeGFP蛍光を示さなかった1つの注入耳（赤）からのデータ。（G）平均値±SD。4つのAnc80注入耳（緑）および4つの非注入耳（黒）ならびにeGFP蛍光を示さない、注入損傷を有する1つの陰性対照耳（赤）に関するDPOAE閾値がプロットされている。B～G中のデータ点の注入力価はAにおけるものと同様である。
【図2】図2A～2Dは、前庭感覚上皮中のAnc80-eGFP形質導入を示す画像である。（A）Anc80-eGFP1μL（1.7×1012GC/mL）を注入されたP1マウスからのマウス卵形嚢。組織をP10で採取し、固定し、Alexa546ファロイジン（赤）で染色し、eGFP（緑）に関して画像化した。eGFP陽性細胞の複数の焦点面の形態学的評価は、検査したすべての試料において、I型細胞のステレオタイプ的フラスコ形態およびII型細胞の円柱形態の形質導入を実証した（図示せず）。スケールバー＝100μm。（B）パネルAに関して記載した同じマウスの半規管後部の稜。スケールバー＝50μm。（C）ヒト卵形嚢の感覚上皮。組織を1010個のGC Anc80.CMV.eGFP.WPREに24時間曝露し、10日間培養し、固定し、Alexa546ファロイジン（赤）で染色し、eGFP蛍光（緑）に関して画像化した。スケールバー＝100μm。（D）Alexa546ファロイジン（赤）およびMyo7A（青）で染色され、Cと同一の条件で形質導入されたeGFP（緑）に関して画像化された卵形嚢中のヒト上皮の高倍率図。オーバーレイパネル中の白い矢印は、選択されたeGFP陽性／Myo7A陽性細胞を示す。スケールバー＝20μm。
【図3】図3A～3Eは、Anc80を用いたマウス蝸牛中の広範な内有毛細胞および外有毛細胞形質導入を示す画像である。（A）P1でAnc80-eGFP1μL（1.7×1012GC/mL）を注入されたマウス蝸牛の頂端部全体の低倍率画像。蝸牛をP10で採取し、Alexa546ファロイジン（赤色）で染色し、eGFP（緑）に関して画像化した。スケールバー＝100μm。（B）P1でAnc80-493 eGFP1μL（1.7×1012GC/mL）を注入された異なるマウス蝸牛からの基底部の高倍率画像。蝸牛をP10で採取し、Alexa546ファロイジン（赤色）で染色し、eGFP（緑）に関して画像化した。スケールバー＝20μm。（C、D）P1～2のC57BL/6マウスの正円窓注入後のすべての血清型に関する等用量での内有毛細胞および外有毛細胞の形質導入効率の定量的比較。C、Dのマウス蝸牛に1.36×1012個のAAV1、AAV2、AAV8およびAnc80を注入し、落射蛍光顕微鏡検査による生細胞画像化および定量のために7～9日で採取した（1グループあたりn＝8）。（E）Anc80有毛細胞形質導入の用量依存性。2つの異なるAnc80-eGFP力価（1.8×1012対1.36×1012GC）に曝露した蝸牛を固定し、Alexa546ファロイジン（赤）で染色し、eGFP（緑）に関して画像化した。スケールバー＝20μm。
【0072】
パート2：遺伝子治療はアッシャー症候群1C型のマウスモデルにおいて聴覚および前庭機能を回復させる
【図5】図5A～5Lは、P8のUsh1c c.216G＞A変異体マウス中のコルチ器の走査電子顕微鏡検査結果を示す画像である。（A～F）P8のc.216GA（n＝3マウス）およびc.216AA（n＝4マウス）変異体マウスにおけるコルチ器の基底、中間および頂端領域を画像化した。OHCおよびIHC毛束はヘテロ接合型マウスにおいては保存されたが、一部の毛束はホモ接合型216AAマウスにおいてはコルチ器に沿って崩壊しているように見えた。（G～L）高倍率画像が、すべてではないが多くのOHC（G～H）およびIHC（I～J）において、断片化され、崩壊した束と階段状配列の崩壊を明らかにした。P8で器官の中央領域で画像化されたOHC毛束の例は、同じ標本中に存在する保存された毛束（K）および崩壊した毛束（L）を示す。星印は保存された毛束を示し；矢じりは崩壊した毛束を示し；矢印は波状のIHC束を示す。スケールバー低倍率：5μm（A～F）：高倍率：2μm（G）、3μm（H）、2μm（I-863 J）および1μm（K、L）。
【図6-1】図6A～6Hは、Ush1c c.216G＞A新生仔変異体マウスの有毛細胞におけるメカノトランスダクションを示す画像である。（A～D）透過性スチリル色素FM1-43を使用して、c.216GAおよびc.216AAマウスの有毛細胞中のオープントランスダクションチャネルの存在を評価した。コルチ器中、P4で、c.216AAマウスの感覚有毛細胞中のFM取り込みは減少した（A～B、中間基底）。IHC FM1-43蛍光は、IHCが異なる焦点面にあるため、よりうす暗く見えることに注目すること。左：DIC、右：FM1-43；スケールバー10μm。卵形嚢中、FM1-43取り込みは、P6ではc.216AA変異体中のストリオーラ外領域に限定され（C；スケールバー50μm）、卵形嚢有毛細胞は、DICによる評価では、概ね正常な束形態を保持した（D；スケールバー10μm）。パネルD上の白線は、ストリオーラ領域（取り込みなし）とストリオーラ外領域（取り込みあり）との境界を画定する。実験を3回繰り返した。（E～H）新生仔c.216GAおよびc.216AAマウスにおいてOHC、IHCおよびVHC中のメカノトランスダクションを評価した（記録されたマウスの数は、それぞれ、OHCの場合、n＝7、6、IHCの場合、n＝2、4およびVHCの場合、n＝2、6であり、細胞の数は棒グラフの上に示されている）。代表的なトランスダクション電流（E）、二次ボルツマン関数に当てはめたそれらの関連する電流／変位プロット（F）および平均ピークトランスダクション電流（G～H）がプロットされている。蝸牛中、P3～P6で、器官の中および中～頂回転で記録を得た。卵形嚢中、P5とP7との間でストリオーラ外およびストリオーラ領域のVHCからトランスダクション電流を記録した（E～F）。DIC下で毛束はよく保存されているように見えたが、c.216AA変異体においては、より小さな平均トランスダクション電流が誘発された（H）。平均ピークトランスダクションは、OHC、IHCおよびVHC中、2つの遺伝子型間で有意に異なっていた（***P＜0.01、一元配置ANOVA）。
【図7】図7A～7Eは、インビトロおよびインビボでアデノ随伴ウイルスベクターに曝露された組織中の蛍光標識ハーモニンの発現および局在化を示す画像である。（A～C）速やかに解体したP0～P1内耳組織をAAV2/1ベクターに24時間曝露し、培養状態で7～8日維持したのち固定し、対比染色し（Alexa Fluorファロイジン、Invitrogen）、Zeiss LSM共焦点顕微鏡で画像化した。多数の感覚有毛細胞が野生型卵形嚢に感染し、EGFPに融合したハーモニンb1の発現が大部分の有毛細胞中で明白であり、特に感覚毛束の頂端に局在化していた（A、スケールバー：10μm-上パネル；5μm-下パネル）。同様に、EGFP::harmonin-b1の発現が、c.216AAおよび野生型マウスのOHCおよびIHC中、不動毛の先端で明白であった（B、スケールバー：10μm；C、スケールバー：3μm）。P1でAAV2/1.CMV.EGFP::harmonin-b1ベクターを注入すると、P60で、左注入耳中のいくつかのIHCおよびOHC中でEGFPシグナルが検出された（D、スケールバー：30μm）。P0でAAV2/1.CMV.tdTomato::harmonin-a1に24時間曝露されたP7器官型培養物中、IHCおよびOHCの細胞体中に外因性tdTomato::harmonin-a1が検出された（E、スケールバー：5μm）。特に感覚細胞の基底で、おそらくはリボンシナプスの近くで、いくつかのハーモニンa1斑点がCTBP2（青；マウス抗CTBP2 1/200、BD bioscience）と共局在化していた。不動毛束中に発現は認められなかった。
【図8】図8A～8Cは、Anc80ハーモニンベクターを注入されたマウスの有毛細胞中のメカノトランスダクションの回復を示す画像である。（A～C）c.216AA非注入対照マウス（n＝8細胞、マウス1匹）およびP1でAAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1を注入されたc.216AAマウス（0.8μL、n＝15細胞、マウス1匹）およびP1でAAV2/Anc80. CMV.harmonin-b1とAAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1との組み合わせを注入されたc.216AAマウス（0.5μl＋0.5μl、n＝7細胞、マウス1匹）のIHC中、メカノトランスダクション電流を記録した。P6で器官型培養物を調製し、P15とP16との間で記録を実施した（9～10DIV）。c.216AAマウスの毛束刺激によって小さなメカノトランスダクション電流を誘導することができたが、ハーモニンb1の発現またはハーモニンa1とb1との二重発現を駆動するベクターを注入されたc.216AAマウスにおいて、より大きな電流が誘発された（A）。各データセットの対応するI/X曲線および二重ボルツマン当てはめ関数。それぞれの最大メカノトランスダクション電流Imax＝102.1pA（c.216AA）；424.3pA（c.216AA＋ハーモニンb1）および341.1pA（c.216AA＋ハーモニンa1＆b1）（B）。平均反応（平均値±S.D.）は、非注入マウスと比べて、ハーモニンb1注入マウスおよびハーモニンa1＋b1注入マウスの場合にトランスダクションの有意な回復（***P＜0.001）を示す。平均トランスダクション電流は、ハーモニンb1注入マウスとc.216GA対照マウスとで有意に異ならなかった（N.S. P＞0.5）。ハーモニンaとハーモニンbとを組み合わせた場合でも、メカノトランスダクションの回復は有意には改善しなかった。（C）一元配置ANOVA。
【図9-1】図9A～9Eは、P1でAAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1を注入されたマウスにおけるABRおよびDPOAE閾値回復を示す画像である。（A）6週齢c.216AA対照マウスおよびハーモニンa1、ハーモニンb1、または2つの組み合わせをコードするベクターをP1でRWMを介して注入されたc.216AAマウスにおける16kHzトーンの場合の代表的なABR反応。ハーモニンb1のみを注入された、またはハーモニンa1およびb1をいっしょに注入されたマウスにおいて、30dB SPLに近い回復したABR閾値が計測された。（B）c.216AA（n＝13）；c.216GA（n＝12）；c.216AA＋ハーモニンa1（n＝12）；c.216AA＋ハーモニンb1（n＝レスキュー19／試験25）；c.216AA＋ハーモニンa1＆b1（n＝レスキュー6／試験11）に関して得られた平均ABR反応。平均値±S.E、連続線。点線：16kHz記録がパネルAに示されているマウスにおける全周波数範囲のABR閾値。（C）c.216AA（n＝13）；c.216GA（n＝12）；c.216AA＋ハーモニンa1（n＝12）；c.216AA＋ハーモニンb1（n＝レスキュー15 DPOAE＜70dB SPL／試験25）；c.216AA＋ハーモニンa1＆b1（n＝レスキュー4 DPOAE＜70dB SPL／試験11）に関して得られた平均DPOAE反応。平均値±S.E、連続線。点線：その記録がパネルAに示されている4匹のマウスの場合のDPOAE閾値。矢印は、閾値が、試験した最大刺激レベルよりも高いことを示す。（D～E）45dB以下の初期ABR閾値を示した8匹のマウスにおいて6週および3月で得られたABRおよびDPOAE反応。8匹のマウスのうち6匹を6ヶ月間飼育し、ABRおよびDPOAEを評価した（点線）。平均値±SE。最初の3ヶ月間、ABRおよびDPOAE閾値シフトは明白であったが、6月齢で、低めの低周波数範囲における聴覚レスキューは依然として顕著であった。
【図10-1】図10A～10Eは、P1でAAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1およびAAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1を注入されたマウスにおける驚愕反応、ロータロッドパフォーマンスおよびオープンフィールド行動回復を示す画像である。（A）6週齢の対照c.216GA、c.216AAおよびc.216AA注入マウスにおいて、ホワイトノイズ刺激に対する驚愕反応を記録した。ハーモニンa1ではなくハーモニンb1を注入されたマウスにおいて部分的な驚愕レスキューが明白であった（データは対照c.216AAマウスと重複する）。平均は±S.Eで示されている。（B）対照c.216GA、c.216AAおよびc.216AA注入マウスにおいて、ロータロッドパフォーマンスを4～6週で記録した。ハーモニンb1およびハーモニンa1/b1を注入されたマウスにおいて完全な回復が認められた。ハーモニンa1単独では回復は認められなかった。平均は±S.Eで示されている。（C～E）6週齢の対照c.216GA、c.216AAおよびc.216AAおよびc.216GA注入マウスにおいてオープンフィールド観察を5分間実施した。2.5分間の代表的なトラックが示されている（B）。c.216AA変異体マウスはフィールド全体を探索し、繰り返し全身を回転させるが、P1でハーモニンa1、ハーモニンb1、または2つのベクターの組み合わせを注入されたc.216AAマウスは、ヘテロ接合型c.216GA対応物または切断型ベクターを注入されたc.216GAマウスに類似する正常な行動を示す。（C）。グラフは、回転数および1分あたりの移動距離に関して平均値±SDを示す。非注入マウスと注入マウスとの間で有意な回復***P＜0.001が認められた。一元配置ANOVAによる統計的解析。
【図11】AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1を注入されたマウスにおけるコルチ器の走査電子顕微鏡検査画像である。P1で注入（RMW注入0.8μl AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1）を受けたc.216GA、c.216AA、およびc.216AAマウスにおいて6週でコルチ器の基底、中間、および頂端領域を画像化した。OHCおよびIHC毛束は、c.216GAマウスにおいては保存されたが、c.216AAマウスにおいてはコルチ器に沿って崩壊しているように見えた。c.216AAマウスにおいて顕著な有毛細胞損失（星印）および毛束崩壊が認められ、器官の基底端における縮退がより顕著であった。c.216AAマウスの毛束は正常な不動毛列を欠いていた。低めの列は収縮しているように見えたが、もっとも高い列はc.216AAマウスにおいて維持されていた（矢印）。有毛細胞損失および束崩壊は、レスキューされたc.216AAマウスにおいても明白であったが、有毛細胞生存率は、器官の基底および中間領域において顕著に高かった。有毛細胞数が棒グラフにまとめられている。合計1824個の細胞がc.216AAマウス（4つの耳）において数えられ、792個がレスキューされたc.216AAマウス（2つの耳）において数えられた。平均値±SE。高倍率画像は、注入を受けたc.216AAマウス（矢印）における、全部ではないが多くの細胞（矢じり）中の階段状配列のレスキューを明らかにする。スケールバー低倍率：5μm；高倍率：1μm。
【図12】図12A～12Lは、P18のUsh1c c.216G＞Aマウスにおける毛束形態の分析をSEMによって示す画像である。（A～C）ヘテロ接合型c.216GAマウスはP18で正常な毛束形態を示した。（D～I）P18のホモ接合型c.216AA変異体マウスの器官に沿って崩壊した毛束が認められた。（J～L）c.216AAマウスにおいてIHC毛束が軽度に崩壊していた。頂点から計測した距離：基底3.5～4mm；中間1.8～2.2mm；頂端0.6～0.8mm。スケールバー低倍率：5μm；高倍率：1μm。
【図13】図13A～13Jは、c.216AA変異体マウスにおけるメカノトランスダクション性質を示す画像である。（A～E）蝸牛の中および中～頂回転からの新生仔OHC中のメカノトランスダクションの分析、P3～P6。～Po＝0.5からの代表的な電流トレースを二重指数関数減衰関数に当てはめて、c.216GAおよびc.216AA変異体における順応を評価した（A）。当てはめを使用して、高速時定数（C）および低速時定数（D）ならびに順応の程度（E）を生成した。10～90％作動範囲は有意に変化しなかった（B）。c.216AAマウスにおける順応の程度は、この散布図に示すヘテロ接合型OHCよりも有意に低かった（E）。（F～J）新生仔IHC中のメカノトランスダクションの分析。10～90％作動範囲値は、c.216AA IHCに対し、c.216GA IHC中で小さかった（G）。c.216AA IHC中のわずかに低い速さおよび有意に小さな程度にもかかわらず、順応は常に存在した（H～J）。統計的解析が各プロットに示されている：*P＜0.05、**P＜0.01および***P＜0.001、一元配置ANOVA。
【図14】図14A～14Cは、P1でのデュアルベクター注入から6週での、c.216AAコルチ器中の蛍光標識ハーモニンaおよびハーモニンb Anc80ベクターの発現を示す画像である。（A～C）AAV2/Anc80.CMV.tdTomato::harmonin-a1（0.5μl；4.11E^12gc/ml）およびAAV2/Anc80.CMV.eGFP::harmonin-b1（0.5μl；2.99E^12gc/ml）のP1同時注入後、6週齢c.216AAマウスにおける基底回転の共焦点画像。全細胞数の69％および74％がそれぞれeGFP（A）およびtdTomato（C）を発現し、65％が両方のマーカーを発現して、同時形質導入の成功を実証した。スケールバー：20μm。
【図15】図15A～15Fは、6週齢対照c.216GAマウスおよび注入を受け、レスキューされたc.216AAマウスにおけるABR反応の分析を示すデータである。（A、D）対照c.216GAおよびレスキューされたc.216AAマウスに関する8および16kHzでのABR反応の例。（B～C、E～F）匹敵しうる閾値を有する6週齢マウスにおける8～11.3および16kHzでの平均ピーク1振幅（B～D）および潜時（C～D）（n＝8 c.216GA、n＝5 c.216AA＋ハーモニンb1 RWM P1）。平均値±S.E。一元配置ANOVA。
【図16A-1】図16A～16Dは、Ush1c c.216G＞Aマウスにおいて発現したハーモニンの変異体形態が有毛細胞または聴覚機能を変化させないことを示す。（A）野生型ハーモニンb1タンパク質と、Ush1c遺伝子のエクソン3中のアカディアンG＞A変異を伴う隠れたスプライシングおよびフレームシフトの結果として分泌される切断型ハーモニンとの間の配列アラインメント。（B）P2～P3野生型マウス、c.216GAおよびc.216AA変異体マウスの聴覚器官からの半定量的RT-PCRが、c.216GAおよびc.216AAマウスにおける野生型（450bp）および切断型（－35bp）ハーモニンの発現を確認させる。（C～D）6週齢c.216GA注入マウスならびに対照c.216GAおよびc.216AAマウスにおいて聴性脳幹反応（ABR、C）および歪成分耳音響放射（DPOAE、D）を計測した。プロットは平均値±S.Eとして示されている。対照216GAマウスに対し、注入を受けたマウスにおいて閾値シフトは認められなかった。
【図17-1】図17A～17Cは、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1を注入された6週齢マウスの内耳中の正しいUsh1cスプライシングの回復を示す画像である。（A）Ush1c.216Aアレルからの正しくスプライシングされた（450bp）および異常な（415bp）mRNAの半定量的RT-PCR定量が、c.216AAレスキューマウス#1および#2の注入耳（I）および反対側耳（C）における正しいUsh1cスプライシングの回復を示す（注入耳からの11.3kHzで35dBのSPL反応）。不十分なABR反応（11.3kHzで90dB SPL）のマウス#3は、正しいmRNA発現の適度な回復を示し、マウス#4（11.3kHzで100dB SPL）は何も示さない。非注入c.216AAマウス（マウス#5、6）においては正しいスプライスフォームは検出されないが、c.216GAマウス（マウス#7、8、9）においては、正しいスプライスフォームおよび切断型スプライスフォームの両方が検出されている。下パネルに示す対応するマウスGapdhは、物質の相対量を確認するために増幅したものである。（B）半定量放射能標識PCR分析は、Ush1c.216AAマウスの注入耳および反対側耳中のAAV-mUsh1cの存在を確認させる。相対レベルのAAV-mUsh1c DNAが存在したが、マウス#3および#4においては低下していた。（C）相対量のAAV-mUsh1cがABR閾値と相関する。11.3および16kHzの場合の分析が示されている。線形回帰が2つの間の高い相関を示す。
【図18】長期的ABR閾値回復が聴覚器官の中間～頂端領域におけるOHC生存率と相関することを示すグラフである。6月齢の3匹の非注入c.216AAおよび5匹の注入c.216AA（P1 RWM注入、0.8μl AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1）の左耳で、死後にコルチ器全体の有毛細胞計数を実施した。インサート：5.6～16kHzの音刺激に対し、マウスの2匹（#1および#2）は試験範囲全体で低いABR反応閾値を示し（≧95dB SPL）、3匹（#3～5）は35～55dB SPLの閾値範囲で反応した。IHCおよびOHC有毛細胞の総数は注入マウスにおいて増加していた。レスキューされた注入マウスと、低いレスキューを示した注入マウスとの比較は、IHCの数は異ならないが、有意な数のOHCがレスキューマウスにおいて認められたことを示す。器官の全長にわたる分析が、この差を器官の中間領域から頂端領域までの有毛細胞生存率の増大として説明づけることができることを示した。
【0073】
パート3：聴力喪失に関与するさらなる変異の遺伝子治療
【図19】図19A～19Dは、P2でAnc80-harmonin::GFP（すなわち、GFPがハーモニンポリペプチドに融合している）1ml（6×1012gc/ml）をRWMを介して注入され、P9で採取され、アクチン（赤；19A）、Myo7a（青；19B）で染色され、GFP（緑；19C）に関して画像化されたUsh1c変異体マウスからの蝸牛の代表的な共焦点画像である。（19A）、（19B）および（19C）の合成画像が（19D）に示されている。
【図20】Ush1c変異体マウス（四角）およびAnc80-Harmonin::GFPベクターを注入されたUsh1c変異体マウス（丸）に関して音周波数の関数としてプロットされたABR閾値を示すグラフである。
【図21】図21A～21Cは、高倍率の非注入蝸牛（21C）に対する、P2でAnc80-KCNQ4 1μl（6×1012gc/ml）をRWMによって注入され、P9で採取され、Alexa 546ファロイジン（赤）およびKCNQ4に対する抗体（緑）で染色されたKCNQ4-/-蝸牛の、低倍率（21A）および高倍率（21B）での代表的な共焦点画像である。
【図22】図22A～22Cは、P10の野生型マウス（22A）、P10のKCNQ4-/-マウス（22B）およびRWMを介してAnc80-KCNQ4（2.4×1013gc/ml）を注入されたP10のKCNQ4-/-マウス（22C）におけるKCNQ4電流を示す一連のグラフである。注入から8日後に蝸牛を採取した。
【図23】Anc80-CMV-Tmc1ベクターを注入されたTmc1-/-組織におけるFM1-43取り込み（FM1-43は機能的Tmclチャネルのみを透過する）の一連の3つの画像である。P2のTmc1-/-マウスに対し、RWMを介してAnc80-CMV-Tmc1ベクター（2.4×1013gc/ml）を注入し、注入から6～7日後に蝸牛を採取した。
【図24】図24Aは、P10の野生型マウス（左）、P10のTmc1-/-マウス（中間）およびRWMを介してP2でAnc80-CMV-Tmc1（2.4×1013gc/ml）を注入されたP10のTmc1-/-マウス（右）のIHCから記録された感覚トランスダクション電流の代表的な群を示す。注入から8日後に蝸牛を採取した。図24Bは、図24Aに示すマウスの回復率のグラフ表示である。図24B中のグラフは、野生型マウス（左）、Tmc1-/-マウス（中間）およびAnc80-CMV-Tmc1を注入されたTmc1-/-マウス（右）における機能細胞の割合を示す。
【図25】歪成分耳音響放射（DPOAE）閾値を、野生型、Tmc1-/-マウスおよびAnc80-CMV-Tmc1を注入されたTmc1-/-マウスの場合の刺激周波数の関数として示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0074】
詳細な説明
本発明は、聴覚および／または前庭機能を含むメカノセンセーションに必要なタンパク質（たとえばTMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7 USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc））を、当該タンパク質のレベルまたは活性の損失または低下を有する対象の内耳の細胞、たとえば蝸牛細胞（たとえば内有毛細胞または外有毛細胞）中に送達し、発現させるための組成物および方法を提供する。
本発明は、聴覚および／または前庭機能を含むメカノセンセーションに必要なタンパク質（たとえばTMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7 USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc））を、当該タンパク質のレベルまたは活性の損失または低下を有する対象の内耳の細胞、たとえば蝸牛細胞（たとえば内有毛細胞または外有毛細胞）中に送達し、発現させるための組成物および方法を提供する。
【0075】
本発明は、少なくとも部分的に、Anc80カプシドをコードする合理的に設計された合成ベクター（「Anc80ベクター」）が蝸牛への効率的な導入遺伝子送達に有用であり；また、このベクターを使用して、アッシャー症候群のマウスモデルの内耳に野生型Ush1cを送達することができるという発見に基づく。正円窓膜注入が、マウスの内有毛細胞および外有毛細胞の非常に効率的な形質導入（従来のアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを上回る実質的な改善）を生じさせた。Anc80正円窓注入は、感覚細胞機能、聴覚および前庭機能、ならびに免疫学的パラメータによって示されるように、良好な忍容性を示した。複雑な聴覚機能の回復のための要件である、Anc80が外有毛細胞を高比率でターゲッティングする能力が、聴覚および平衡障害のための将来の遺伝子療法を可能にし得る。Ush1cをコードするAnc80ベクターを注入されたマウスは、ほぼ野生型レベルまでの、遺伝子およびタンパク質発現の回復、感覚細胞機能の回復、複雑な聴覚機能のレスキュー、ならびに聴覚および平衡行動の回復を実証した。データは、内耳機能の前例のない回復を表し、難聴を治療するための生物学的療法が遺伝性内耳障害の人への応用に適し得ることを示す。
【0076】
アッシャー症候群
ヒトアッシャー症候群（USH）は、盲聾の原因である希な遺伝子疾患である。常染色体劣性形質として遺伝し、米国において16,000～20,000人を冒し、幼児期難聴の3～6％の原因である。アッシャー症候群は、症状の重度にしたがって3つの臨床亜型（USH-1、2、および3）に分類される。USH1が最重症型である。USH1に冒された患者は、先天性の両側性重度感音性聴力喪失、前庭反射消失、および思春期前の網膜色素変性症（網膜の桿体および錐体機能の進行性両側性対称性縮退）を病む。人工内耳を装着しない限り、個体は一般的に発声能力を発達させない。現在、アッシャー患者のための生物学的治療は存在しないが、欠陥遺伝子の野生型形態の早期再導入が疾患の好転を許し得る。
ヒトアッシャー症候群（USH）は、盲聾の原因である希な遺伝子疾患である。常染色体劣性形質として遺伝し、米国において16,000～20,000人を冒し、幼児期難聴の3～6％の原因である。アッシャー症候群は、症状の重度にしたがって3つの臨床亜型（USH-1、2、および3）に分類される。USH1が最重症型である。USH1に冒された患者は、先天性の両側性重度感音性聴力喪失、前庭反射消失、および思春期前の網膜色素変性症（網膜の桿体および錐体機能の進行性両側性対称性縮退）を病む。人工内耳を装着しない限り、個体は一般的に発声能力を発達させない。現在、アッシャー患者のための生物学的治療は存在しないが、欠陥遺伝子の野生型形態の早期再導入が疾患の好転を許し得る。
【0077】
6つのアッシャー遺伝子：MYO7A（ミオシン7a）、USH1C（ハーモニン）、CDH23（カドヘリン23）、PCDH15（プロトカドヘリン15）、SANS（sans）、およびCIB2（カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質2）がUSH1と関連している。これらの遺伝子は、内耳中の毛束形態形成に関与し、インタラクトームの一部であるタンパク質をコードする（たとえば、Mathur & Yang, 2015, Biochim. Biophys. Acta, 1852:406-20を参照）。ハーモニンはUSH1インタラクトームの中心に存在し、そこで他のUsher1タンパク質に結合する。そのPDZ（PSD-59 95/Dlg/ZO-1）相互作用ドメインのために、ハーモニンは、足場タンパク質として機能することが提唱されてきた。インビトロの結合研究により、すべての他の既知のUSH1タンパク質が、USH2タンパク質の2つであるUsherinおよびVLGR1と同様、ハーモニンのPDZドメインに結合することを示した。USH1C遺伝子は28のエクソンからなり、これらのエクソンは、タンパク質のドメイン組成に依存して3つの異なるサブクラス（a、b、およびc）に分類される、ハーモニンの10種のオルタナティブスプライス形態をコードする。3つのアイソフォームは、PDZタンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、コイルドコイル（CC）ドメイン、およびプロリン－セリン－トレオニン（PST）リッチドメインの数において異なる。
【0078】
USH1タンパク質は、多数の細胞外リンクによって相互接続された何百もの不動毛で構成されているメカノセンセーション毛束中の有毛細胞の頂端に局在化している。カドヘリン23およびプロトカドヘリン15は、Usher遺伝子（それぞれUSH1DおよびUSH1E）の産物であり、不動毛の遠位端に位置する感覚糸を形成する。ハーモニンbは、CDH23、PCDH15、Fアクチンおよびそれ自体に結合する。これは、有毛細胞の感覚糸挿入点の近くの不動毛の先端に見られ、そこで、有毛細胞中のトランスダクションおよび順応において機能的役割を演じると考えられている。ハーモニンbは出生後早期に発現するが、その発現は、蝸牛および前庭の両方において出生後30日（P30）ごろに減少する。ハーモニンaもまた、カドヘリン23に結合し、不動毛中に見られる。最近の報告がシナプスにおけるハーモニンaのさらなる役割（Cav1.3 Ca2＋チャネルと会合して、ユビキチン依存性経路を介するチャネル利用可能性を制限する）を明らかにした。
【0079】
アッシャー症候群のいくつかのマウスモデルが過去10年にわたり同定または操作され、そのうちの7つはハーモニンに影響を及ぼす。これらのうち、1つのモデル、Ush1c c.216G＞Aモデルだけが、ヒトアッシャー症候群を特徴づける聴覚および網膜両方の異常を再現する。Ush1c c.216G＞Aは、フランス系アカディア人USH1C患者のコホートにおいて見られるものに類似する点変異のせいで、すべての従来のハーモニンアイソフォームの発現に影響するノックインマウスモデルである。変異は、Ush1c遺伝子のエクソン3の端部に隠れたスプライス部位を導入する。この隠れたスプライス部位の使用が、35bp欠失を有するフレームシフト転写産物を生成し、PDZ、PST、およびCCドメインを欠く重度に切断されたタンパク質の翻訳を生じさせる。ホモ接合型c.216AAノックインマウスは1月齢で重度の聴力喪失をこうむるが、ヘテロ接合型c.216GAマウスは任意の異常な表現型を呈しない。c.216AAマウスにおける蝸牛組織診は、P30で、中および基底回転中、崩壊した毛束、異常な細胞列ならびに内および外両方の有毛細胞の損失を示す。
【0080】
本明細書において、祖先AAVカプシドタンパク質を含有するAAVが、有毛細胞にうまく形質導入し、ハーモニンスプライスフォームの発現および正確な局在化を駆動するということが実証される。さらには、本明細書において、本明細書に記載される、祖先AAVカプシドタンパク質を含有するAAVの出生後早期の正円窓膜注入がホモ接合型c.216AAマウスにおける聴覚および前庭機能をうまく回復させるということが実証される。注入を受けたマウスにおける聴覚機能の回復は、野生型ハーモニンをコードするmRNA発現の回復ならびに毛束形態およびメカノトランスダクションの保存と関連している。本明細書に提供される結果は、本明細書に記載される祖先AAVカプシドタンパク質を含有するAAVを使用する野生型ハーモニンの早期再導入がUSH1Cの治療に有用であり得ることを実証する。
【0081】
TMC1/TMC2
難聴を生じさせる40を超える異なる変異がTMC1において同定されている。これらは、35の劣性変異および5つの優性変異へと細分される。劣性変異の大多数は重度の先天性聴力喪失を生じさせるが（たとえばDFNB7/11）、少数は晩期発症型の中～重度の聴力喪失を生じさせる。優性変異のすべてが、十代半ばに発症する、進行性の聴力喪失を生じさせる（たとえばDFNA36）。特に、本明細書に記載されるAnc80カプシドタンパク質を含むAAVベクターは、非変異体（たとえば野生型）TMC1配列またはTMC2配列を送達し、それによって、聴力喪失（たとえば、さらなる聴力喪失）を予防する、および／または聴覚機能を回復させるために使用することができる。
難聴を生じさせる40を超える異なる変異がTMC1において同定されている。これらは、35の劣性変異および5つの優性変異へと細分される。劣性変異の大多数は重度の先天性聴力喪失を生じさせるが（たとえばDFNB7/11）、少数は晩期発症型の中～重度の聴力喪失を生じさせる。優性変異のすべてが、十代半ばに発症する、進行性の聴力喪失を生じさせる（たとえばDFNA36）。特に、本明細書に記載されるAnc80カプシドタンパク質を含むAAVベクターは、非変異体（たとえば野生型）TMC1配列またはTMC2配列を送達し、それによって、聴力喪失（たとえば、さらなる聴力喪失）を予防する、および／または聴覚機能を回復させるために使用することができる。
【0082】
聴力喪失の治療のための治療戦略
成体哺乳動物蝸牛の感覚細胞は自己修復能力を欠くため、現在の治療戦略（障害のレベルおよび正確な位置に依存する）は、増幅（補聴器）、より良い音声伝達（中耳プロテーゼ／アクティブインプラント）または直接神経刺激（人工内耳）に依存して、聴覚神経を形成し、音響情報を脳へと中継する一次感覚有毛細胞またはらせん神経節ニューロンへの永久的損傷を補償する。これらの手法は変革的であったが、現代生活にとって重要な複雑なヒト聴覚機能の回復においては依然、最適からはほど遠い。特に、主な問題はさらに、限られた周波数感度、不自然な音声知覚および騒がしい環境における限られた語音弁別を含む。
成体哺乳動物蝸牛の感覚細胞は自己修復能力を欠くため、現在の治療戦略（障害のレベルおよび正確な位置に依存する）は、増幅（補聴器）、より良い音声伝達（中耳プロテーゼ／アクティブインプラント）または直接神経刺激（人工内耳）に依存して、聴覚神経を形成し、音響情報を脳へと中継する一次感覚有毛細胞またはらせん神経節ニューロンへの永久的損傷を補償する。これらの手法は変革的であったが、現代生活にとって重要な複雑なヒト聴覚機能の回復においては依然、最適からはほど遠い。特に、主な問題はさらに、限られた周波数感度、不自然な音声知覚および騒がしい環境における限られた語音弁別を含む。
【0083】
蝸牛への治療的遺伝子導入が、加齢性および環境誘発性の聴力喪失から遺伝的な難聴形態に及ぶ現在の標準的治療をさらに改善すると考えられてきた。300を超える遺伝子座が、記載された70を超える原因遺伝子による遺伝性聴力喪失と関連付けられている（Parker & Bitner-Glindzicz, 2015, Arch. Dis. Childhood, 100:271-8）。これらの手法における治療の成功は、蝸牛中のコルチ器（OC）中の関連する治療標的細胞への外因性遺伝子構築物の安全かつ効率的な送達に有意に依存する。
【0084】
OCは、2つのクラスの感覚有毛細胞：音によって運ばれた機械的情報を、ニューロン構造に伝達される電気シグナルへと変換するIHC；および蝸牛反応を増幅し、調整する（複雑な聴覚機能に必要なプロセス）ように働くOHCを含む。内耳中の他の潜在的標的は、らせん神経節ニューロン、らせん板縁の円柱細胞を含み、これらは、隣接する蓋膜または支持細胞（保護機能を有し、早期新生児期までに有毛細胞へと分化転換するように誘発されることができる）の維持に重要である。
【0085】
高カリウム内リンパ液で満たされている蝸牛管への注入が有毛細胞への直接アクセスを提供することができる。しかし、この精巧な流体環境への変更は、蝸牛内電位を乱して、注入関連毒性のリスクを高めるおそれがある。蝸牛管、鼓室階、および前庭階を包囲する外リンパで満たされた空間は、中耳から、前庭窓膜または正円窓膜（RWM）のいずれかを通してアクセスすることができる。内耳に通じる唯一の非骨質開口部であるRWMは、多くの動物モデルにおいて比較的容易にアクセス可能であり、この経路を使用するウイルスベクターの投与は良好に忍容される。ヒトにおいて、人工内耳の配置は慣例的に、RWMに通す外科的電極挿入に依存する。
【0086】
器官型蝸牛外植片およびインビボ内耳注入においてAAV血清型を評価した以前の研究が遺伝性難聴のマウスモデルにおいて部分的にのみ聴力レスキューを生じさせている。予想外に、祖先AAVカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（AVV）が高い効率でOHCに形質導入する。この知見は、従来のAAV血清型を使用する蝸牛遺伝子療法の開発の成功を制限してきた低い形質導入率を克服する。本明細書に記載される祖先AAVカプシドタンパク質を含有するAAVは、IHCおよびOHCならびに遺伝性聴覚および平衡障害によって損なわれる他の様々な内耳細胞型への内耳遺伝子送達のための貴重なプラットフォームを提供する。高い形質導入率を提供することに加え、本明細書に記載される祖先AAVカプシドタンパク質を含有するAAVは、全身注射時、マウスおよび非ヒト霊長類において類似した安全性プロフィールを有することが示され、循環AAVとは抗原性的に異なり、従来のAAVベクターの効能を制限する既存の免疫に関して潜在的な利益を提供する。
【0087】
しかし、細胞、特に内耳内、たとえば蝸牛中の細胞（または蝸牛の細胞もしくは蝸牛細胞）への、TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7 USH1C（たとえばハーモニンa、bまたはc）の1つまたは複数をコードするポリヌクレオチドの発現を誘導する核酸（たとえばAAVベクター、たとえばプロモーター（たとえばCMV、Espin、PCDH15、PTPRQ、TMHS（LHFPL5）を含むANC80ベクター）の高効率送達を可能にする組成物および方法が本明細書に記載される。本明細書において使用される内耳細胞とは、非限定的に、内有毛細胞（IHC）、外有毛細胞（OHC）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、および支持細胞をいう。支持細胞は、興奮性ではない耳の中の細胞、たとえば、有毛細胞またはニューロンではない細胞をいう。支持細胞の一例がシュワン細胞である。
【0088】
本明細書に記載される核酸の1つまたは複数の核酸の内耳細胞への送達は、概して部分的聴力喪失または完全な聴力消失によって定義される、任意の数の遺伝性または後天性聴覚障害を治療するために使用することができる。本明細書に記載される方法は、聴覚障害、たとえば非限定的に、劣性難聴、優性難聴、アッシャー症候群および他の症候群性難聴ならびに外傷または加齢による聴力喪失を治療するために使用することができる。
【0089】
特定の導入遺伝子を保有するウイルスを作製する方法
本明細書に記載されるように、祖先AAVカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（AAV）は、核酸（たとえば、TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7 USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc）の1つまたは複数をコードするポリヌクレオチドをはじめとする導入遺伝子）を内耳細胞に送達する場合に特に効率的であり、特に有効なクラスの祖先AAVカプシドタンパク質は、SEQ ID NO: 1に示される、Anc80と指定された祖先足場カプシドタンパク質によって指定される。Anc80ベクターが、好都合にも内有毛細胞または外有毛細胞の約60％、70％、80％、90％、95％超、または100％に形質導入した内耳有毛細胞ターゲッティングAAVの一例である。Anc80祖先カプシドタンパク質のクラスに入るある特定の祖先カプシドタンパク質がAnc80-0065（SEQ ID NO: 2）であるが、全体として参照により本明細書に組み入れられるWO2015/054653が、Anc80祖先カプシドタンパク質のクラスに入るさらなる祖先カプシドタンパク質をいくつか記載している。
本明細書に記載されるように、祖先AAVカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（AAV）は、核酸（たとえば、TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7 USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc）の1つまたは複数をコードするポリヌクレオチドをはじめとする導入遺伝子）を内耳細胞に送達する場合に特に効率的であり、特に有効なクラスの祖先AAVカプシドタンパク質は、SEQ ID NO: 1に示される、Anc80と指定された祖先足場カプシドタンパク質によって指定される。Anc80ベクターが、好都合にも内有毛細胞または外有毛細胞の約60％、70％、80％、90％、95％超、または100％に形質導入した内耳有毛細胞ターゲッティングAAVの一例である。Anc80祖先カプシドタンパク質のクラスに入るある特定の祖先カプシドタンパク質がAnc80-0065（SEQ ID NO: 2）であるが、全体として参照により本明細書に組み入れられるWO2015/054653が、Anc80祖先カプシドタンパク質のクラスに入るさらなる祖先カプシドタンパク質をいくつか記載している。
【0090】
特定の態様において、アデノ随伴ウイルス（AAV）は、有毛細胞のための天然の、または操作された向性を有する祖先AAVカプシドタンパク質を含有する。いくつかの態様において、ウイルスは、導入遺伝子（たとえば、TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7 USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc）の1つまたは複数をコードするポリヌクレオチド）を対象の内耳に送達する内耳有毛細胞ターゲッティングAAVである。いくつかの態様において、ウイルスは、精製されたカプシドポリペプチドを含むAAVである。いくつかの態様において、ウイルスは人工ウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスは祖先AAV配列を含有する。いくつかの態様において、ウイルスは、AAV2よりも低い血清陽性率を有するAAVである。いくつかの態様において、ウイルスはエクソーム関連AAVである。いくつかの態様において、ウイルスはエクソーム関連AAV1である。いくつかの態様において、ウイルスは、Anc80カプシドタンパク質に対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性または相同性を有するカプシドタンパク質を含む。
【0091】
Anc80カプシドタンパク質を含有する、本明細書に記載されるウイルスは、多様な核酸を内耳細胞に送達するために使用することができる。1つの態様において、TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7 USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc）の1つまたは複数をコードするポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーター（たとえばCMV、Espin、PCDH15、PTPRQ、TMHS（LHFPL5））を含む内耳有毛細胞ターゲッティングAAV（たとえばANC80ベクター）。発現のために細胞に送達される核酸配列はしばしば導入遺伝子と呼ばれる。内耳細胞に送達され、その中で発現することができる代表的な導入遺伝子は、非限定的に、聴覚および／または前庭メカノセンセーションにおいて機能するポリペプチドをコードする導入遺伝子（たとえばTMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7（たとえばハーモニンa、b、またはc））、神経栄養因子をコードする導入遺伝子（たとえばGDNV、BDNF、またはHSP70）、免疫調節タンパク質または抗発癌性転写産物を含む。加えて、内耳細胞に送達され、その中で発現することができる代表的な導入遺伝子はまた、非制限的に、抗体もしくはその断片、アンチセンス、サイレンシングもしくは長鎖非コードRNA種またはゲノム編集システム（たとえば、遺伝子改変ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR（クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート））をコードする導入遺伝子を含む。さらに、内耳細胞に送達され、その中で発現することができる代表的な導入遺伝子は、ACTG1、ADCY1、ATOHI、ATP6V1B1、BDNF、BDP1、BSND、DATSPER2、CABP2、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CHD7、CCDC50、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL9A1、COL9A2、COL11A1、COL11A2、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIAPH1、EDN3、EDNRB、ELMOD3、EMOD3、EPS8、EPS8L2、ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM65B、FOXI1、GIPC3、GJB2、GJB3、GJB6、GPR98、GRHL2、GPSM2、GRXCR1、GRXCR2、HARS2、HGF、HOMER2、HSD17B4、ILDR1、KARS、KCNE1、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KITLG、LARS2、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MCM2、MET、MIR183、MIRN96、MITF、MSRB3、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、NARS2、NDP、NF2、NT3、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PCDH15、PDZD7、PJVK、PNPT1、POLR1D、POLR1C、POU3F4、POU4F3、PRPS1、PTPRQ、RDX、S1PR2、SANS、SEMA3E、SERPINB6、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A4、SLC26A5、SIX1、SIX5、SMAC/DIABLO、SNAI2、SOX10、STRC、SYNE4、TBC1D24、TCOF1、TECTA、TIMM8A、TJP2、TNC、TMC1、TMC2、TMIE、TMEM132E、TMPRSS3、TRPN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、USH2D、VLGR1、WFS1、WHRN、およびXIAと指定された核酸を含む。特定の態様において、導入遺伝子は、MY07A、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7、USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc）の1つまたは複数である。
【0092】
導入遺伝子の発現は、導入遺伝子の天然のプロモーター（すなわち、トランスジェニックコード配列とともに天然に見られるプロモーター）によって、または異種プロモーター（たとえばCMVプロモーター、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーター）によって誘導され得る。たとえば、本明細書に記載される導入遺伝子はいずれも、その天然のプロモーターとともに使用されることができる。または、本明細書に記載される導入遺伝子はいずれも異種プロモーターとともに使用されることができる。本明細書において使用される異種プロモーターとは、その配列の発現を天然において誘導しない（すなわち、自然界においてその配列とともに見られない）プロモーターをいう。本明細書に示される導入遺伝子のいずれかの発現を誘導するために使用することができる代表的な異種プロモーターは、たとえば、CMVプロモーター、CBAプロモーター、CASIプロモーター、Pプロモーター、およびEF-1プロモーター、アルファ9ニコチン受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、Gfi1プロモーター、およびVglut3プロモーターを含む。加えて、上記導入遺伝子の1つの発現を自然に誘導するプロモーター（たとえばKCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、Myo6プロモーター、またはAtoh1プロモーター）を、導入遺伝子の発現を誘導するための異種プロモーターとして使用することができる。他の態様において、プロモーターは、Espinプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーターである。
【0093】
Anc80カプシドタンパク質を含有するウイルス中にパッケージングするための導入遺伝子（たとえばTMC1、TMC2、USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc）、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7）を作製する方法は当技術分野において公知であり、従来の分子生物学および組換え核酸技術を利用する。1つの態様において、Anc80カプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む構築物および適当な逆位末端反復（ITR）が隣接する導入遺伝子を保有する構築物が提供され、これが、導入遺伝子がAnc80カプシドタンパク質内にパッケージングされることを可能にする。
【0094】
導入遺伝子は、たとえば、パッケージング宿主細胞を使用して、Anc80カプシドタンパク質を含有するAAV中にパッケージングすることができる。本明細書に記載される1つまたは複数の構築物を使用して、ウイルス粒子の構成要素（たとえばrep配列、cap配列、逆位末端反復（ITR）配列）を一時的または安定的にパッケージング宿主細胞に導入することができる。本明細書に記載されるウイルスは、少なくともAnc80カプシドタンパク質を含有し；ウイルス粒子の他の構成要素（たとえばrep配列、ITR配列）は祖先配列または現代の配列に基づくことができる。いくつかの例において、たとえば、ウイルス粒子全体が祖先配列に基づくことができる。そのようなウイルスは、慣例的方法を使用して精製することができる。
【0095】
概して、本明細書において使用される「核酸」は、DNAおよびRNAを含むことができ、1つまたは複数のヌクレオチド類似体または骨格修飾を含む核酸をも含むことができる。核酸は、通常はその所期の用途に依存して、一本鎖または二本鎖であることができる。本明細書に記載される方法に使用することができる核酸は、既知の核酸配列と同一であることもできるし、そのような既知の配列とは配列において異なることもできる。単に実例として、核酸（またはコードされるポリペプチド）は、既知の配列に対して少なくとも75％の配列同一性（たとえば、少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性）を有することができる。
【0096】
配列同一性％値を計算する際、2つの配列をアラインメントし、2つの配列の間でのヌクレオチドまたはアミノ酸残基の完全な一致の数を決定する。完全な一致の数をアラインメントされた領域の長さ（すなわち、アラインメントされたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）で割り、100を掛けて、配列同一性％値を求める。アラインメントされた領域の長さが、最短の配列の完全長サイズまでの、一方または両方の配列の部分であることができることが理解されよう。また、1つの配列を、1よりも多い他の配列に対してアラインメントすることができ、したがって、アラインメントされた各領域の間で異なる配列同一性％値を有することができることが理解されよう。
【0097】
配列同一性％値を決定するための2つ以上の配列のアラインメントは、コンピュータプログラムClustalWおよびデフォルトパラメータを使用して実施され、これは、核酸またはポリペプチド配列のアラインメントをその長さ全体で実施することを可能にする（グローバルアラインメント）。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500。ClustalWは、クエリーと1つまたは複数の対象配列との間のベストマッチを計算し、それらをアラインメントして、同一性、類似性、および差が決定されるようにする。配列アラインメントを最大化するために、1つまたは複数の残基のギャップをクエリー配列、対象配列または両方に挿入することができる。核酸配列のペアワイズアラインメントの場合には、デフォルトパラメータを使用し（すなわち、ワードサイズ：2；ウィンドウサイズ：4；スコアリング法：％値；トップダイアゴナルの数：4；およびギャップペナルティ：5）；多重核酸配列のアラインメントの場合には、以下のパラメータ：ギャップ開始ペナルティ：10.0；ギャップ伸長ペナルティ：5.0；およびウエイトトランジション：あり、を使用する。ポリペプチド配列のペアワイズアラインメントの場合には、以下のパラメータ：ワードサイズ：1；ウィンドウサイズ：5；スコアリング法：％値；トップダイアゴナルの数：5およびギャップペナルティ：3、を使用する。ポリペプチド配列の多重アラインメントの場合には、以下のパラメータ：ウエイトマトリックス：BLOSUM（blocks substitution matrix）；ギャップ開始ペナルティ：10.0；ギャップ伸長ペナルティ：0.05；親水性ギャップ：オン；疎水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、ArgおよびLys；ならびに残基特異的ギャップペナルティ：オン、を使用する。ClustalWは、たとえば、World Wide Web上、Baylor College of Medicine Search LauncherウエブサイトまたはEuropean Bioinformatics Instituteウエブサイトで実行することができる。
【0098】
核酸配列に変更を導入することができ、それが、その核酸配列がコード配列である場合には、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列の変更をもたらすことができる。たとえば、変更は、変異誘発（たとえば部位特異的変異誘発、PCR媒介変異誘発）を使用することによって、またはそのような変更を有する核酸分子を化学合成することによって、核酸コード配列に導入することができる。そのような核酸変更は、1つまたは複数のアミノ酸残基における保存的および／または非保存的アミノ酸置換を招くことができる。「保存的アミノ酸置換」とは、1つのアミノ酸残基が、類似する側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されることであり（たとえば、アミノ酸置換の頻度表を提供する、Dayhoffら（1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(Suppl. 3):345-352）を参照）、非保存的置換とは、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有しないアミノ酸残基で置換されることである。
【0099】
核酸は、ベクターまたはプラスミドとも呼ばれ得る構築物内に含めることができる。構築物は、市販されてもいるし、当技術分野において慣例的な組換え技術によって作製することもできる。核酸を含有する構築物は、そのような核酸の発現を誘導および／または調節する発現エレメントを有することができ、また、構築物を維持するための配列（たとえば複製起点、選択マーカー）などの配列を含むこともできる。発現エレメントは、当技術分野において公知であり、たとえば、プロモーター、イントロン、エンハンサー配列、応答エレメントまたは誘導エレメントを含む。
【0100】
医薬組成物
通常は生理学的に適合性の賦形剤中に懸濁した、プロモーター（たとえばCMV、Espin、PCDH15、PTPRQ、TMHS（LHFPL5））と、USH1、MYO7A、USH1C（ハーモニンa、b、c）、CDH23、PCDH15、SANS、およびCIB2の1つまたは複数であるポリヌクレオチドとを含む内耳有毛細胞ターゲッティングAAV（たとえばAnc805ベクター）は、正円窓を通して対象の内耳に注入することにより、対象（たとえばヒトまたは非ヒト哺乳動物）に投与することができる。適当な担体は、多様な緩衝溶液（たとえばリン酸緩衝生理食塩水）、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、および水で調合され得る生理食塩水を含む。内耳有毛細胞ターゲッティングAAVは、細胞に形質導入し、または感染させ、過度な有害作用なしで治療的利益を提供するのに十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供するのに十分な量で投与される。
通常は生理学的に適合性の賦形剤中に懸濁した、プロモーター（たとえばCMV、Espin、PCDH15、PTPRQ、TMHS（LHFPL5））と、USH1、MYO7A、USH1C（ハーモニンa、b、c）、CDH23、PCDH15、SANS、およびCIB2の1つまたは複数であるポリヌクレオチドとを含む内耳有毛細胞ターゲッティングAAV（たとえばAnc805ベクター）は、正円窓を通して対象の内耳に注入することにより、対象（たとえばヒトまたは非ヒト哺乳動物）に投与することができる。適当な担体は、多様な緩衝溶液（たとえばリン酸緩衝生理食塩水）、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、および水で調合され得る生理食塩水を含む。内耳有毛細胞ターゲッティングAAVは、細胞に形質導入し、または感染させ、過度な有害作用なしで治療的利益を提供するのに十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供するのに十分な量で投与される。
【0101】
対象に投与される内耳有毛細胞ターゲッティングAAVの用量は、主に、治療される状態ならびに対象の年齢、体重および健康状態などの要因に依存する。たとえば、ヒト対象に投与される内耳有毛細胞ターゲッティングAAVの治療有効用量は、概して、AAVのゲノムコピー（GC）約1×101～1×1012個（たとえばGC約1×103～1×109個）の濃度を含む溶液約0.1ml～約10mlの範囲である。
【0102】
核酸を内耳細胞に送達する方法
核酸を細胞に送達する方法は概して当技術分野において公知であり、導入遺伝子を含有するウイルス（ウイルス粒子と呼ぶこともできる）をインビボで内耳細胞に送達する方法は本明細書に記載されている。本明細書に記載されるように、約108～約1012個のウイルス粒子を対象に投与することができ、ウイルスは、適当な量（たとえば10μL、50μL、100μL、500μL、または1000μL）の、たとえば人工外リンパ液内に懸濁させることができる。
核酸を細胞に送達する方法は概して当技術分野において公知であり、導入遺伝子を含有するウイルス（ウイルス粒子と呼ぶこともできる）をインビボで内耳細胞に送達する方法は本明細書に記載されている。本明細書に記載されるように、約108～約1012個のウイルス粒子を対象に投与することができ、ウイルスは、適当な量（たとえば10μL、50μL、100μL、500μL、または1000μL）の、たとえば人工外リンパ液内に懸濁させることができる。
【0103】
本明細書に記載される、プロモーター（たとえばCMV、Espin、PCDH15、PTPRQ、TMHS（LHFPL5））と導入遺伝子（たとえばTMC1、TMC2、USH1C（たとえばハーモニンa、b、またはc）、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7）とを含有するウイルスは、任意の数の手段を使用して内耳細胞（たとえば蝸牛中の細胞）に送達することができる。たとえば、本明細書に記載される1つまたは複数の異なるタイプの導入遺伝子を含有するウイルス粒子を含む治療有効量の組成物は、正円窓または卵円窓を通して、概して比較的簡単な（たとえば外来）手順で注入することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載される、導入遺伝子を含有する、または異なるウイルス粒子の1つまたは複数のセットを含有する治療有効数のウイルス粒子を含む組成物（セット中の各粒子は同じタイプの導入遺伝子を含むことができるが、粒子の各セットは他のセットとは異なるタイプの導入遺伝子を含有する）は、外科手術（たとえばコクレオストミーまたはカナロストミー）中に耳内の適切な位置に送達することができる。
【0104】
1つの態様において、プロモーター（たとえばCMV、Espin、PCDH15、PTPRQ、TMHS（LHFPL5））と、USH1、MYO7A、USH1C（ハーモニンa、b、c）、CDH23、PCDH15、SANS、およびCIB2の1つまたは複数であるポリヌクレオチドとを含む内耳有毛細胞ターゲッティングAAV（たとえばAnc80ベクター）は、それを必要とする対象の正円窓を通して注入される。
【0105】
加えて、鼓膜を通過する、および／または正円窓を通る作用物質の移入を容易にする送達ビヒクル（たとえばポリマー）が利用可能であり、任意のそのような送達ビヒクルを、本明細書に記載されるウイルスを送達するために使用することができる。たとえば、Arnold et al., 2005, Audiol. Neurootol., 10:53-63を参照すること。
【0106】
本明細書に記載される組成物および方法は、内耳細胞、たとえば蝸牛細胞への核酸の高効率送達を可能にする。たとえば、本明細書に記載される組成物および方法は、内有毛細胞の少なくとも80％（たとえば少なくとも85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％）への導入遺伝子の送達およびその中での発現または外有毛細胞の少なくとも80％（たとえば少なくとも85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％）への導入遺伝子の送達およびその中での発現を可能にする。
【0107】
本明細書において実証されるように、Anc80カプシドタンパク質を含有するAAVを使用して送達された導入遺伝子の発現は、内有毛細胞（IHC）、外有毛細胞（OHC）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞、および／または前庭神経節ニューロン（たとえばAtoh1、NF2）の再生を生じさせて、聴覚または前庭機能が長期間（たとえば数ヶ月、数年、数十年間、一生涯）回復されるようにすることができる。
【0108】
WO2015/054653に記載されるように、Anc80カプシドタンパク質を含有するAAVは、その血清陽性率および／または従来のAAV（すなわち、Anc80カプシドタンパク質を含有しないAAV）と比較してそれが中和される程度を特徴とすることができる。当技術分野において、血清陽性率とは、血清陽性である（すなわち、特定の病原体または免疫原に曝露されていた）集団中の対象の割合をいうものと理解され、特定の病原体または免疫原に対して抗体を産生する集団中の対象の数を、検査された集団中の個体の総数で割ったものとして計算される。ウイルスの血清陽性率の決定は、当技術分野において慣例的に実施され、一般的に、イムノアッセイを使用して、特定の個体集団からの試料（たとえば血液試料）中の1つまたは複数の抗体の陽性率を決定することを含む。加えて、血清試料中の中和抗体の程度を決定する方法がいくつか利用可能である。たとえば、中和抗体アッセイは、実験試料が、抗体を含まない対照試料に比較して50％以上感染を中和する抗体濃度を含むところの力価を計測する。Fisherら（1997, Nature Med., 3:306-12）およびManningら（1998, Human Gene Ther., 9:477-85）をも参照すること。代表的な従来のAAVは、非限定的に、AAV8（または、AAV8カプシドタンパク質を含むウイルス）および／またはAAV2（または、AAV2カプシドタンパク質を含むウイルス）を含む。
【0109】
キット
本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分（たとえば、プロモーター（たとえばCMV、Espin、PCDH15、PTPRQ、TMHS（LHFPL5））とUSH1、MYO7A、USH1C（ハーモニンa、b、c）、CDH23、PCDH15、SANS、およびCIB2の1つまたは複数であるポリヌクレオチドとを含む内耳有毛細胞ターゲッティングAAV（たとえばAnc80ベクター））の1つまたは複数で満たされた1つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知（ヒトへの投与に関する製造、使用または販売の、当該機関による承認を反映する）が添付されることができる。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分（たとえば、プロモーター（たとえばCMV、Espin、PCDH15、PTPRQ、TMHS（LHFPL5））とUSH1、MYO7A、USH1C（ハーモニンa、b、c）、CDH23、PCDH15、SANS、およびCIB2の1つまたは複数であるポリヌクレオチドとを含む内耳有毛細胞ターゲッティングAAV（たとえばAnc80ベクター））の1つまたは複数で満たされた1つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知（ヒトへの投与に関する製造、使用または販売の、当該機関による承認を反映する）が添付されることができる。
【0110】
本発明はまた、聴覚および／または前庭メカノセンセーションの異常と関連する疾患または障害（またはそれらの症状）の治療または予防のためのキットを提供する。1つの態様において、キットは、プロモーター（たとえばCMV、Espin、PCDH15、PTPRQ、TMHS（LHFPL5））と、USH1、MYO7A、USH1C（ハーモニンa、b、c）、CDH23、PCDH15、SANS、およびCIB2の1つまたは複数であるポリヌクレオチドとをを含む内耳有毛細胞ターゲッティングAAV（たとえばAnc80ベクター）の有効量を単位剤形で、血管新生と関連する疾患または障害もしくはその症状を病む、またはそれを罹患しやすい対象に血管新生阻害化合物を投与するための指示書とともに含み、血管新生阻害化合物の有効量は500mg未満である。好ましい態様において、キットは、血管新生阻害化合物を収容する無菌容器を含み；そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスタパックまたは当技術分野において公知の他の適当な容器であることができる。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔または薬剤を保持するのに適した他の材料でできていることができる。指示書は概して、血管新生と関連する疾患または障害もしくはその症状の治療のための血管新生阻害化合物の使用に関する情報を含み；好ましい態様において、指示書は、以下：血管新生阻害化合物の詳細な説明；血管新生と関連する疾患または障害もしくはその症状の治療のための投与スケジュールおよび投与；注意事項；警告；適応症；カウンタ表示；過量投与情報；副作用；動物薬理学；臨床試験および／または参照の少なくとも1つを含む。指示書は、容器（存在する場合）に直接印刷されてもよいし、容器に貼り付けられるラベルとして提供されてもよいし、容器中に提供される、または容器とともに提供される別個のシート、パンフレット、カードまたはフォルダとして提供されてもよい。
【0111】
当業者の技能の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、生化学および組換えDNA技術を本開示にしたがって使用することができる。そのような技術は文献において十分に説明されている。本発明は、請求の範囲に記載される方法および物質組成の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。
【実施例0112】
実施例1―祖先AAVカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（AAV）は安全かつ効率的な蝸牛遺伝子導入を生じさせる
以下の方法および材料を実施例1において使用した。
ウイルスベクター
CMV駆動eGFP導入遺伝子を含むAAV2/1、2/2、2/6、2/8、2/9およびAAV2/Anc80ならびにウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（WPRE）カセットを、前記のように、Massachusetts Eye and EarのGene Transfer Vector Core（vector.meei.harvard.edu）において調製した。AAV2/Anc80プラスミド試薬はaddgene.comから入手可能である。
以下の方法および材料を実施例1において使用した。
ウイルスベクター
CMV駆動eGFP導入遺伝子を含むAAV2/1、2/2、2/6、2/8、2/9およびAAV2/Anc80ならびにウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（WPRE）カセットを、前記のように、Massachusetts Eye and EarのGene Transfer Vector Core（vector.meei.harvard.edu）において調製した。AAV2/Anc80プラスミド試薬はaddgene.comから入手可能である。
【0113】
動物モデルおよび一般的方法
すべての実験は、ボストン小児病院（プロコトル#12-02-2146）およびInstitutional Biosafety Committee（プロトコル#IBC-P00000447）によって承認されたものである。野生型C57BL/6JおよびCBA/CaJマウスをJackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から入手し、両性別のマウスを推定50／50の比で実験に使用した。インビトロおよびインビボ形質転換アッセイならびに後続のエンドポイントのための実験あたりのグループサイズは、検体へのアクセスおよび技術的実現可能性によって決定した。Anc80形質転換に関して報告された観察結果を、様々なベクターロットを用いる後続の実験において定性的に確認した（検体への特有かつ限られたアクセス性のため、ヒト前庭組織形質転換は除く）。検体への限られたアクセスおよび報告された知見の定性的性質のため、血清型形質転換効率間の統計的解析は実施しなかった。
すべての実験は、ボストン小児病院（プロコトル#12-02-2146）およびInstitutional Biosafety Committee（プロトコル#IBC-P00000447）によって承認されたものである。野生型C57BL/6JおよびCBA/CaJマウスをJackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から入手し、両性別のマウスを推定50／50の比で実験に使用した。インビトロおよびインビボ形質転換アッセイならびに後続のエンドポイントのための実験あたりのグループサイズは、検体へのアクセスおよび技術的実現可能性によって決定した。Anc80形質転換に関して報告された観察結果を、様々なベクターロットを用いる後続の実験において定性的に確認した（検体への特有かつ限られたアクセス性のため、ヒト前庭組織形質転換は除く）。検体への限られたアクセスおよび報告された知見の定性的性質のため、血清型形質転換効率間の統計的解析は実施しなかった。
【0114】
実施例1A―インビボ注入
仔マウス（P0～P2）に対し、斜角研磨したガラスマイクロインジェクションピペットを使用して、正円窓膜（RWM）を介して注入を実施した。P-2000ピペットプラー（Sutter Instrument, Novato, CA）上、ガラス毛管（WPI）からピペットを引き、マイクロピペットベベラ（Sutter Instrument, Novato, CA）を使用して斜角研磨した（先端径約20μm、角度28°）。手術部位（左乳様突起）を覆うために無菌スワブを使用して、鎮痛のためにEMLAクリーム（リドカイン2.5％およびプリロカイン2.5％）を外部から塗布した。術前、加温パッド上で体温を38℃に維持した。仔マウスを、氷／水中で2～3分間、急速な低体温誘導によって麻酔して意識消失させ、手術中、この状態を冷却プラットフォーム上で5～10分間維持した。べタジンでスクラブし、70％エタノールで拭くことを3回繰り返すことにより、手術部位を消毒した。耳後部の切開を実施して透明な耳胞を露出させ、マイクロピペットを手で耳胞およびその上の筋膜に通し、マイクロピペットの先端をRWMに通した。ウイルス約1μLを、1分以内に、5匹（AAV1）、4匹（AAV2）、2匹（AAV8）、1匹（AAV6）、3匹（Anc80）のC57BL/6マウスの左耳だけに手で注入した。質および純度などの特定のベクター調製物に関する因子を制御するために、本明細書に提示される本発明者らの定性的知見を確証する、独立した標本からの異なるベクターロットを用いる後続の試験においてAnc80結果を確認した（データは示さず）。グループごとに非盲検的に注入を実施した。時折、注射針を深く挿入しすぎたり、浅く挿入しすぎたり、誤った角度で挿入したりすることがあった。中耳構造または内耳構造に目に見える損傷があった場合、試料をさらなる分析から除外した。注入の成功率は、注入者の経験レベルに依存して、約50％～約80％の範囲であった。注入後、6-0黒色モノフィラメント縫合糸（Surgical Specialties, Wyomissing, PA）を使用して皮膚切開創を閉じた。その後、仔マウスを38℃の加温パッドに戻して5～10分おき、次いで、飼育のために母マウスに戻した。
仔マウス（P0～P2）に対し、斜角研磨したガラスマイクロインジェクションピペットを使用して、正円窓膜（RWM）を介して注入を実施した。P-2000ピペットプラー（Sutter Instrument, Novato, CA）上、ガラス毛管（WPI）からピペットを引き、マイクロピペットベベラ（Sutter Instrument, Novato, CA）を使用して斜角研磨した（先端径約20μm、角度28°）。手術部位（左乳様突起）を覆うために無菌スワブを使用して、鎮痛のためにEMLAクリーム（リドカイン2.5％およびプリロカイン2.5％）を外部から塗布した。術前、加温パッド上で体温を38℃に維持した。仔マウスを、氷／水中で2～3分間、急速な低体温誘導によって麻酔して意識消失させ、手術中、この状態を冷却プラットフォーム上で5～10分間維持した。べタジンでスクラブし、70％エタノールで拭くことを3回繰り返すことにより、手術部位を消毒した。耳後部の切開を実施して透明な耳胞を露出させ、マイクロピペットを手で耳胞およびその上の筋膜に通し、マイクロピペットの先端をRWMに通した。ウイルス約1μLを、1分以内に、5匹（AAV1）、4匹（AAV2）、2匹（AAV8）、1匹（AAV6）、3匹（Anc80）のC57BL/6マウスの左耳だけに手で注入した。質および純度などの特定のベクター調製物に関する因子を制御するために、本明細書に提示される本発明者らの定性的知見を確証する、独立した標本からの異なるベクターロットを用いる後続の試験においてAnc80結果を確認した（データは示さず）。グループごとに非盲検的に注入を実施した。時折、注射針を深く挿入しすぎたり、浅く挿入しすぎたり、誤った角度で挿入したりすることがあった。中耳構造または内耳構造に目に見える損傷があった場合、試料をさらなる分析から除外した。注入の成功率は、注入者の経験レベルに依存して、約50％～約80％の範囲であった。注入後、6-0黒色モノフィラメント縫合糸（Surgical Specialties, Wyomissing, PA）を使用して皮膚切開創を閉じた。その後、仔マウスを38℃の加温パッドに戻して5～10分おき、次いで、飼育のために母マウスに戻した。
【0115】
以前の報告と一致して、AAV1は中～高効率でIHCに形質導入した（図1A、1B）。これらの実験は、AAV2、6および8が少数のIHCをターゲッティングし、AAV8だけが頂端および基底においておよそ同等の形質転換を実証することを示す（図1B）。また、以前の報告と一致して、試験した従来のAAV血清型すべてでOHC形質導入は最小限であった（＜5％）。しかし、Anc80は、20倍（AAV1の場合）～3倍（AAV2の場合）低い用量で、IHCのほぼ100％およびOHCの約90％に形質導入した（図2A～2C）。落射蛍光顕微鏡検査による生細胞画像化によって観察されたように、すべての血清型で等しく1.36×1012GCの用量における形質転換は、Anc80の場合には実質的なIHCおよびOHC形質転換を生じさせたが、AAV1、2および8の場合にはIHCターゲッティングは最小限であり、OHC中では認められなかった（図8C、8D）。
【0116】
続いて、Anc80形質転換試料を固定し、染色し、共焦点顕微鏡検査によって画像化して、有毛細胞形質転換の用量依存性を明らかにした（図1E）。比類のないOHCターゲッティング（図1C、図3）は、他のAAVに比較して定性的に異なるAnc80の形質転換生物学を示す。類似レベルのAnc80形質転換が、全部で3匹のAnc80注入マウスの蝸牛の基底から頂端までの至る所で見いだされた（図1A、B、C）。蝸牛頂端の低倍率図（図3A）は、注入部位から遠いところで強いeGFP発現を示した。基底の高倍率画像は、100％IHCおよび95％OHC形質転換を明らかにする（図3B）。
【0117】
遺伝性難聴のいくつかの形態は前庭機能不全をも生じさせるため、Anc80は、ヒト前庭器官への遺伝子送達に有用なベクターであり得る。この可能性を調べるために、前庭シュワン細胞腫の切除を受ける成人患者4名からヒト前庭上皮を採取し；前記のように感覚上皮を培養した。AAV形質転換試料の場合、図3Cは、ヒト前庭上皮全体で、有毛細胞および支持細胞の両方における強いeGFP蛍光を明らかにする。図3D中、Myo7Aで対比染色された上皮の高倍率図は、Myo7A陽性有毛細胞の83％（19/23）がeGFP陽性でもあったことを明らかにし、Anc80がマウスおよびヒト両方の有毛細胞を効率的に形質転換することができることを示唆した。
【0118】
実施例1B―有毛細胞電気生理学
蝸牛を切除し、カバーガラスに載せ、63×水浸対物レンズおよび微分干渉コントラストオプティクスを備えたAxio Examiner.A1正立顕微鏡（Carl Zeiss, Oberkochen, Germany）で観察した。MEM（Life Technologies, Carlsbad, CA）のように、137 NaCl、5.8 KCl、10 HEPES、0.7 NaH2PO4、1.3 CaCl2、0.9 MgCl2および5.6 D-グルコース（mM単位）、ビタミン（1：100）およびアミノ酸（1：50）を含有する標準液（pH7.4；約310mOsm/kg）中、室温（22℃～24℃）で電気生理学的記録を実施した。記録電極（3～4MΩ）をR-6ガラス（King Precision Glass, Claremont, CA）から引き、140CsCl、5EGTA-KOH、5HEPES、2.5Na2ATP、3.5MgCl2および0.1CaCl2（mM単位）を含有する細胞内液（pH7.4；約280mOsm/kg）で満たした。ホールセルタイトシール技術を使用して、Axopatch 200B（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用してメカノトランスダクション電流を記録した。有毛細胞を－84mVに維持した。ローパスBesselフィルタによって電流を5kHzでフィルタリングし、12ビット収集ボード（Digidata 1440A、Molecular Devices, Sunnyvale, CA）によって≧20kHzでデジタル化し、pCLAMP10ソフトウェア（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して記録した。LVPZT増幅器（E-500.00、Physik Instrumente, Karlsruhe, Germany）によって駆動されるPICMAチップピエゾアクチュエータ（Physik Instrumente, Karlsruhe, Germany）に取り付けた堅いガラスプローブを使用して、IHCおよびOHCからの毛束を偏向させ、8ポールBesselフィルタ（Model 3384フィルタ、Krohn-Hite Corporation, Brokton, MA）によって40kHzでフィルタリングして、残留ピペット共振を除去した。堅いガラスプローブは、全束記録のために有毛細胞不動毛の列の凹側面に嵌まるように設計されたものであった（OHCの場合には直径3～4μm、IHCの場合には直径4～5μm）。＞P10での全細胞電気生理学記録のために、P5～7で蝸牛組織を解体し、MEM（1×）＋1％FBSを含むGlutaMAXTM-I培地中、37℃、5％CO2で30日間までインキュベートした。
蝸牛を切除し、カバーガラスに載せ、63×水浸対物レンズおよび微分干渉コントラストオプティクスを備えたAxio Examiner.A1正立顕微鏡（Carl Zeiss, Oberkochen, Germany）で観察した。MEM（Life Technologies, Carlsbad, CA）のように、137 NaCl、5.8 KCl、10 HEPES、0.7 NaH2PO4、1.3 CaCl2、0.9 MgCl2および5.6 D-グルコース（mM単位）、ビタミン（1：100）およびアミノ酸（1：50）を含有する標準液（pH7.4；約310mOsm/kg）中、室温（22℃～24℃）で電気生理学的記録を実施した。記録電極（3～4MΩ）をR-6ガラス（King Precision Glass, Claremont, CA）から引き、140CsCl、5EGTA-KOH、5HEPES、2.5Na2ATP、3.5MgCl2および0.1CaCl2（mM単位）を含有する細胞内液（pH7.4；約280mOsm/kg）で満たした。ホールセルタイトシール技術を使用して、Axopatch 200B（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用してメカノトランスダクション電流を記録した。有毛細胞を－84mVに維持した。ローパスBesselフィルタによって電流を5kHzでフィルタリングし、12ビット収集ボード（Digidata 1440A、Molecular Devices, Sunnyvale, CA）によって≧20kHzでデジタル化し、pCLAMP10ソフトウェア（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して記録した。LVPZT増幅器（E-500.00、Physik Instrumente, Karlsruhe, Germany）によって駆動されるPICMAチップピエゾアクチュエータ（Physik Instrumente, Karlsruhe, Germany）に取り付けた堅いガラスプローブを使用して、IHCおよびOHCからの毛束を偏向させ、8ポールBesselフィルタ（Model 3384フィルタ、Krohn-Hite Corporation, Brokton, MA）によって40kHzでフィルタリングして、残留ピペット共振を除去した。堅いガラスプローブは、全束記録のために有毛細胞不動毛の列の凹側面に嵌まるように設計されたものであった（OHCの場合には直径3～4μm、IHCの場合には直径4～5μm）。＞P10での全細胞電気生理学記録のために、P5～7で蝸牛組織を解体し、MEM（1×）＋1％FBSを含むGlutaMAXTM-I培地中、37℃、5％CO2で30日間までインキュベートした。
【0119】
P7のOHCおよびP35のIHCから毛束偏向によって誘発された代表的な電流は、eGFP陽性細胞とeGFP陰性対照細胞との間に振幅、感度、または動態の差がないことを明らかにした（図1D）。Anc80への曝露後、1週齢～5週齢の蝸牛のすべての領域から51のeGFP陽性有毛細胞および52のeGFP陰性有毛細胞を記録した。すべての場合において、反応は野生型から区別不可能であり（図1E）、Anc80形質導入が感覚細胞機能に有害な効果を及ぼさないことを確認させた。
【0120】
実施例1E―聴力検査
前記のように、聴性脳幹反応（ABR）および歪成分耳音響放射（DPOAE）データを収集した。DPOAEは、正しい蝸牛増幅および同調のためのアッセイであり、外有毛細胞の生存可能性の高感度な尺度である。麻酔したマウスにおいて試験した刺激は、5.6、8、11.3、16、22.6および32kHzの周波数で音圧レベル10から90dBまで変化させた。4つのAnc80注入耳および4つの非注入耳ならびに注入損傷を有するeGFP蛍光なしの1つの陰性対照耳をP28～P30で分析した。
前記のように、聴性脳幹反応（ABR）および歪成分耳音響放射（DPOAE）データを収集した。DPOAEは、正しい蝸牛増幅および同調のためのアッセイであり、外有毛細胞の生存可能性の高感度な尺度である。麻酔したマウスにおいて試験した刺激は、5.6、8、11.3、16、22.6および32kHzの周波数で音圧レベル10から90dBまで変化させた。4つのAnc80注入耳および4つの非注入耳ならびに注入損傷を有するeGFP蛍光なしの1つの陰性対照耳をP28～P30で分析した。
【0121】
ABRを誘発するために必要な最小限の音閾値をプロットし（図1F）、注入耳と非注入耳との間で閾値の差がないことを明らかにした。組織学的分析が、4つの注入耳すべてにおいて強いeGFP蛍光を明らかにした（データは示さず）。一例においては、eGFP陽性細胞がなく、ABR閾値が上昇し（図1F）、注入が失敗し、針が蝸牛管を破り、永久的な損傷を加えたおそれがあることを示唆した。Anc80-eGFPによるロバストな外有毛細胞の形質導入にもかかわらず、非注入対照耳と比べ、DPOAE閾値に差は見られなかった（図1G）。したがって、ABRおよびDPOAEからのデータは、RWM注入、Anc80形質導入ならびにIHCおよびOHC中の導入遺伝子発現がすべて聴覚機能にとって安全であることを示す。
【0122】
実施例1F―ロータロッド試験
ロータロッド装置上での平衡行動に関して5匹のC57BL/6マウスを試験した。前庭機能が損傷したマウスは、ロータロッド装置上でのパフォーマンスが良くないことが知られている。以前の研究が、一方の耳のみが障害を有する場合に平衡機能不全を検出する、このロータロッド試験の能力を強調している。3匹のマウスに対し、P1で注入を実施し、P36で試験し、2匹の非注入対照マウスをP79で試験した。以下のロータロッドプロトコルを使用してすべてのマウスを試験した。1日目、マウスを、4RPMで回転するロッド上で5分間の平衡を保つよう、訓練した。2日目、マウスを5回の試行（5分間隔）で試験した。試行ごとに、ロッドを2RPMの開始速度から1RPMずつ加速した。マウスが装置から落ちるまでの時間（秒単位）を記録した。
ロータロッド装置上での平衡行動に関して5匹のC57BL/6マウスを試験した。前庭機能が損傷したマウスは、ロータロッド装置上でのパフォーマンスが良くないことが知られている。以前の研究が、一方の耳のみが障害を有する場合に平衡機能不全を検出する、このロータロッド試験の能力を強調している。3匹のマウスに対し、P1で注入を実施し、P36で試験し、2匹の非注入対照マウスをP79で試験した。以下のロータロッドプロトコルを使用してすべてのマウスを試験した。1日目、マウスを、4RPMで回転するロッド上で5分間の平衡を保つよう、訓練した。2日目、マウスを5回の試行（5分間隔）で試験した。試行ごとに、ロッドを2RPMの開始速度から1RPMずつ加速した。マウスが装置から落ちるまでの時間（秒単位）を記録した。
【0123】
蝸牛の外リンパ液は前庭迷路の外リンパ液と連続しているため、蝸牛RWMを介して注入されたAnc80-eGFPが前庭感覚器官に形質導入するかどうかを評価した。実際、前庭上皮の全組織標本は、卵形嚢（重力および直線的な頭の動きに対して敏感な前庭器官）のI型およびII型有毛細胞ならびに回転性の頭の動きに対して敏感である半規管におけるロバストなeGFP発現を明らかにした（図2A、2B）。したがって、Anc80形質導入が平衡に影響し得るという安全性の懸念に対処するために、前庭発現を確認された注入マウスは、前庭機能に関するロータロッド試験に関し、非注入対照と同程度のパフォーマンスを見せた（図4）。
【0124】
パート2：遺伝子療法はアッシャー症候群1c型のマウスモデルにおいて聴覚および前庭機能を回復させる
実施例2―アッシャー症候群のマウスモデル
以下の方法および材料を実施例2において使用した。
組織標本
電気生理学的研究のために、Ush1c c.216G＞Aヘテロ接合型またはホモ接合型変異体マウスからの卵形嚢およびコルチ器を出生後0～8日（P0～P8）で採取した。出生後の仔マウスを迅速な断頭によって屠殺した。側頭骨を切除し、10mM HEPES（pH7.4）を添加したMEM（Invitrogen, Carlsbad, CA）に浸漬した。前記（53）のように、酵素を使用せずにコルチ器を切り出した。0.1mg/mlのプロテアーゼ（Protease XXIV, Sigma）による10分間の処理ののち、卵形嚢を取り出した。切除した器官を丸いカバーガラスに載せた。事前にカバーガラスに接着しておいた一対の細いガラス繊維を組織の縁に配置して、組織をフラットな位置で安定させた。組織は、すぐに使用するか、1％ウシ胎仔血清の存在下で培養するかのいずれかであった。インビトロでのウイルスベクター感染を伴う実験のために、培養を7～8日間維持し、培地を2～3日ごとに交換した。
実施例2―アッシャー症候群のマウスモデル
以下の方法および材料を実施例2において使用した。
組織標本
電気生理学的研究のために、Ush1c c.216G＞Aヘテロ接合型またはホモ接合型変異体マウスからの卵形嚢およびコルチ器を出生後0～8日（P0～P8）で採取した。出生後の仔マウスを迅速な断頭によって屠殺した。側頭骨を切除し、10mM HEPES（pH7.4）を添加したMEM（Invitrogen, Carlsbad, CA）に浸漬した。前記（53）のように、酵素を使用せずにコルチ器を切り出した。0.1mg/mlのプロテアーゼ（Protease XXIV, Sigma）による10分間の処理ののち、卵形嚢を取り出した。切除した器官を丸いカバーガラスに載せた。事前にカバーガラスに接着しておいた一対の細いガラス繊維を組織の縁に配置して、組織をフラットな位置で安定させた。組織は、すぐに使用するか、1％ウシ胎仔血清の存在下で培養するかのいずれかであった。インビトロでのウイルスベクター感染を伴う実験のために、培養を7～8日間維持し、培地を2～3日ごとに交換した。
【0125】
動物
Ush1c c.216G＞Aノックインマウスをルイジアナ州立大学Health Science Centerから入手した。C57BL6バックグラウンド上のインポートされた株を事前にCdh23（Ahl）変異から育種して、加齢性聴力喪失を生じさせた（48、49）。この研究に使用したすべての手順は、実験動物の管理と使用に関するNIH指針に適合し、ボストン小児病院のInstitutional Animal Care and Use Committees（プロトコル#12-02-2146、#14-03-2659Rおよび#15-01-2878R）によって承認されたものであった。トウクリップ（P8の前）またはイヤーパンチ（P8の後）を使用してマウスの遺伝子型を決定し、前記（32）のようにPCRを実施した。すべての試験に関し、雄雌マウスをほぼ等しい割合で使用した。他の点では無作為化パラダイムは適用しなかった。
Ush1c c.216G＞Aノックインマウスをルイジアナ州立大学Health Science Centerから入手した。C57BL6バックグラウンド上のインポートされた株を事前にCdh23（Ahl）変異から育種して、加齢性聴力喪失を生じさせた（48、49）。この研究に使用したすべての手順は、実験動物の管理と使用に関するNIH指針に適合し、ボストン小児病院のInstitutional Animal Care and Use Committees（プロトコル#12-02-2146、#14-03-2659Rおよび#15-01-2878R）によって承認されたものであった。トウクリップ（P8の前）またはイヤーパンチ（P8の後）を使用してマウスの遺伝子型を決定し、前記（32）のようにPCRを実施した。すべての試験に関し、雄雌マウスをほぼ等しい割合で使用した。他の点では無作為化パラダイムは適用しなかった。
【0126】
ウイルスベクター生成
c.216AA変異体マウスの蝸牛から全RNAを単離し（RNAqueous micro kit, Ambion）、QuantiTect Reverse Transcriptionキット（Qiagen）を使用して逆転写した。Trunc-harmoninのcDNAを、Platinum TaqDNAポリメラーゼHigh Fidelity（Invitrogen）およびプライマー：Trunc-harmonin.F（KpnI）
；Trunc-harmomin.RV（BamHI）
を用いるPCRによって増幅した。387bpのPCR産物を、TAクローニングキット（Invitrogen）によってクローニングし、シーケンシングによって確認した。GFP融合構築物を生成するために、KpnIおよびBamHIを用いて、切断型ハーモニン断片をpEGFP-C1中にサブクローニングした。NheI-XbaI EGFP::trunc-harmonin cDNAをAAVシャトルベクターに導入した。カスタムベクターをAAV2逆位末端反復（ITR）とともにAAV1カプシド中にパッケージングし、その中で、導入遺伝子カセットをCMVプロモーター（AAV2/1.CMV.EGFP::trunc-harmomin.hGH、1.92 E14gc/m、BCH）によって駆動した。
c.216AA変異体マウスの蝸牛から全RNAを単離し（RNAqueous micro kit, Ambion）、QuantiTect Reverse Transcriptionキット（Qiagen）を使用して逆転写した。Trunc-harmoninのcDNAを、Platinum TaqDNAポリメラーゼHigh Fidelity（Invitrogen）およびプライマー：Trunc-harmonin.F（KpnI）
【0127】
ハーモニンa1およびハーモニンb1プラスミドを、Lily ZhengおよびJames Bartles（52）（Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University, Feinberg School of medicine, Chicago,IL）からご厚意で提供されたEGFPタグ付き標識構築物から、本発明者らの研究室において調製した。元々、ハーモニンa1は、マウス腎臓から、ハーモニンb1は、単離されたマウス蝸牛感覚上皮から、それぞれ得られたものであった。本発明者らはさらに、ハーモニンa1構築物を修飾して、そのN末端のEGFPタグをtdTomatoで置換した。蛍光標識された構築物および非標識構築物をAAVベクター中にパッケージングした。ウイルスベクターは、ボストン小児病院のウイルスコア施設およびMassachusetts Eye and Ear InfirmaryのGene Transfer Vector Coreによって生成されたものであった。以下のベクターを生成した：AAV2/1.CMV.tdTomato::harmonin-a1 4.33 10^13gc/ml（BCH）；AAV2/1.CMV.EGFP::harmonin-b1 2.73 564 10^14gc/ml（BCH）；AAV2/1.CMV.EGFP-harmonin-a1：2.81 10^12gc/ml（MEEI）；AAV2/1.CMV.EGFP-trunc-harmonin；1.92 10^14gc/ml（BCH）；AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1：1.93 10^12gc/ml（MEEI）；AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1：1.74 10^12gc/ml（MEEI）；AAV2/Anc80.CMV.trunc-harm.WPRE：9.02 567 10^12gc/ml（MEEI）。インビトロ実験のために、濃縮ベクター10μlを、1％ウシ胎仔血清の存在下、迅速に解体した組織上、MEM添加培地1mlに24時間適用した。その後、培養を10日間維持した。
【0128】
正円窓膜（RWM）注入
ボストン小児病院のInstitutional Animal Care and Use Committees動物プロトコル#15-01-2878Rによって承認されたようにRWM注入を実施した。AAVベクター0.8μl～1ulをP0～P1およびP10～P12の新生仔マウスに注入した。最初に、P0～P1マウスを低体温曝露によって麻酔し、P10～P12マウスをイソフルランによって麻酔した。麻酔中、耳後部切開を実施して耳胞を露出させ、蝸牛を可視化した。マイクロマニピュレータ（Askew et al., 2015）によって制御されるガラスマイクロピペットを用いて、RWMを通して注入を実施した。10分間、注入物質の量をおよそ0.02μl／分に制御した。標準的な術後ケアを適用した。試料サイズを最適化し、分散を減らすために、インビボ実験のための試料サイズを連続的に測定した。
ボストン小児病院のInstitutional Animal Care and Use Committees動物プロトコル#15-01-2878Rによって承認されたようにRWM注入を実施した。AAVベクター0.8μl～1ulをP0～P1およびP10～P12の新生仔マウスに注入した。最初に、P0～P1マウスを低体温曝露によって麻酔し、P10～P12マウスをイソフルランによって麻酔した。麻酔中、耳後部切開を実施して耳胞を露出させ、蝸牛を可視化した。マイクロマニピュレータ（Askew et al., 2015）によって制御されるガラスマイクロピペットを用いて、RWMを通して注入を実施した。10分間、注入物質の量をおよそ0.02μl／分に制御した。標準的な術後ケアを適用した。試料サイズを最適化し、分散を減らすために、インビボ実験のための試料サイズを連続的に測定した。
【0129】
電気生理学的記録
144 NaCl、0.7 NaH2PO4、5.8 KCl、1.3 CaCl2、0.9 MgCl2、5.6 D-グルコースおよび10 HEPES-NaOH（mM単位）を含有する、pH7.4および320mOsmol/kgに調節された標準人工外リンパ液中で記録を実施した。濃縮物（Invitrogen, Carlsbad, CA）からビタミン（1：50）およびアミノ酸（1：100）を添加した。63×水浸対物レンズおよび微分干渉コントラストオプティクスを備えたAxioskop FS正立顕微鏡（Zeiss, Oberkochen, Germany）を使用して、頂端面から有毛細胞を観察した。記録ピペット（3～5MΩ）をホウケイ酸ガラス毛管（Garner Glass, Claremont, CA）から引き、135 KCl、5 EGTA-KOH、10 HEPES、2.5 K2ATP、3.5 MgCl2、0.1 CaCl2（mM単位）を含有するpH7.4の細胞内液で満たした。全細胞電圧固定下、室温で－64mVの保持電位で電流を記録した。Axopatch Multiclamp 700AまたはAxopatch 200A（Molecular Devices, Palo Alto, CA）を使用してデータを取得し、ローパスBesselフィルタによって10kHzでフィルタリングし、12ビット収集ボード（Digidata 1322）ならびにpClamp8.2および10.5（Molecular Devices, Palo Alto, CA）を用いて≧20kHzでデジタル化した。OriginLabソフトウエアによってデータをオフラインで分析した。別段の記載がない限り、平均値±標準偏差として表す。
144 NaCl、0.7 NaH2PO4、5.8 KCl、1.3 CaCl2、0.9 MgCl2、5.6 D-グルコースおよび10 HEPES-NaOH（mM単位）を含有する、pH7.4および320mOsmol/kgに調節された標準人工外リンパ液中で記録を実施した。濃縮物（Invitrogen, Carlsbad, CA）からビタミン（1：50）およびアミノ酸（1：100）を添加した。63×水浸対物レンズおよび微分干渉コントラストオプティクスを備えたAxioskop FS正立顕微鏡（Zeiss, Oberkochen, Germany）を使用して、頂端面から有毛細胞を観察した。記録ピペット（3～5MΩ）をホウケイ酸ガラス毛管（Garner Glass, Claremont, CA）から引き、135 KCl、5 EGTA-KOH、10 HEPES、2.5 K2ATP、3.5 MgCl2、0.1 CaCl2（mM単位）を含有するpH7.4の細胞内液で満たした。全細胞電圧固定下、室温で－64mVの保持電位で電流を記録した。Axopatch Multiclamp 700AまたはAxopatch 200A（Molecular Devices, Palo Alto, CA）を使用してデータを取得し、ローパスBesselフィルタによって10kHzでフィルタリングし、12ビット収集ボード（Digidata 1322）ならびにpClamp8.2および10.5（Molecular Devices, Palo Alto, CA）を用いて≧20kHzでデジタル化した。OriginLabソフトウエアによってデータをオフラインで分析した。別段の記載がない限り、平均値±標準偏差として表す。
【0130】
統計的解析
再現性を保証するために、各時点で、1グループあたり少なくとも3匹のマウスにおいて試験および対照ベクターを評価した。試料サイズは図の凡例に記されている。RWM注入が成功したすべてのマウスを試験分析に含めた。注入が不成功であったマウスは、平均からは除外したが、完全な開示のために、凡例には含めた。閾値＞90dB SPLのABR回復をもって注入成功と判定した。Origin 2016（OriginLab Corporation）を用いて統計的解析を実施した。本文および図の凡例に記すように、データは平均値±標準偏差（S.D）または標準誤差（S.E.M）として表す。一元配置分散分析（ANOVA）を使用して、平均値間の有意差を決定した。
再現性を保証するために、各時点で、1グループあたり少なくとも3匹のマウスにおいて試験および対照ベクターを評価した。試料サイズは図の凡例に記されている。RWM注入が成功したすべてのマウスを試験分析に含めた。注入が不成功であったマウスは、平均からは除外したが、完全な開示のために、凡例には含めた。閾値＞90dB SPLのABR回復をもって注入成功と判定した。Origin 2016（OriginLab Corporation）を用いて統計的解析を実施した。本文および図の凡例に記すように、データは平均値±標準偏差（S.D）または標準誤差（S.E.M）として表す。一元配置分散分析（ANOVA）を使用して、平均値間の有意差を決定した。
【0131】
実施例2A―走査電子顕微鏡検査（SEM）
対照および変異体マウスのコルチ器に沿ってP7、P18および約P42（6週）でSEMを実施した。P18のSEMは、ワシントン大学のDr. Edwin Rubelとの共同で実施した。内耳を、0.1Mリン酸ナトリウム中4％のグルタルアルデヒド中、4℃で一晩固定した。翌日、検体を0.1Mリン酸ナトリウムバッファ（PB）で3回すすぎ、氷槽中、0.1M PB中1％の四酸化オスミウム中で30分間後固定した。次いで、検体を0.1M PBですすぎ、段階的な一連のエタノール：35％、70％、95％および100％（×2）に通して脱水した。試料を臨界点乾燥させ、SEMスタブに取り付け、Au/Pdでスパッタ被覆した。JEOL JSM-840A走査電子顕微鏡を使用してSEMを実施した。類似の調製がDr. GeleocおよびDr. IndzhykulianによってP8および6週期で実施されている。コルチ器外植片を、2mM CaCl2を添加した0.1Mカコジル酸バッファ（Electron Microscopy Sciences）中2.5％のグルタルアルデヒド中、室温で1時間固定した。段階的な一連のアセトン中で検体を脱水し、液体CO2から臨界点乾燥させ、4～5nmの白金（Q150T、Quorum Technologies, United Kingdom）でスパッタ被覆し、電界放出走査電子顕微鏡（S-4800, Hitachi, Japan）で観察した。
対照および変異体マウスのコルチ器に沿ってP7、P18および約P42（6週）でSEMを実施した。P18のSEMは、ワシントン大学のDr. Edwin Rubelとの共同で実施した。内耳を、0.1Mリン酸ナトリウム中4％のグルタルアルデヒド中、4℃で一晩固定した。翌日、検体を0.1Mリン酸ナトリウムバッファ（PB）で3回すすぎ、氷槽中、0.1M PB中1％の四酸化オスミウム中で30分間後固定した。次いで、検体を0.1M PBですすぎ、段階的な一連のエタノール：35％、70％、95％および100％（×2）に通して脱水した。試料を臨界点乾燥させ、SEMスタブに取り付け、Au/Pdでスパッタ被覆した。JEOL JSM-840A走査電子顕微鏡を使用してSEMを実施した。類似の調製がDr. GeleocおよびDr. IndzhykulianによってP8および6週期で実施されている。コルチ器外植片を、2mM CaCl2を添加した0.1Mカコジル酸バッファ（Electron Microscopy Sciences）中2.5％のグルタルアルデヒド中、室温で1時間固定した。段階的な一連のアセトン中で検体を脱水し、液体CO2から臨界点乾燥させ、4～5nmの白金（Q150T、Quorum Technologies, United Kingdom）でスパッタ被覆し、電界放出走査電子顕微鏡（S-4800, Hitachi, Japan）で観察した。
【0132】
ホモ接合型c.216AA変異体マウスは難聴であり、前庭機能不全に特徴的な旋回およびヘッドトッシング行動を示す。Lentzらの以前の研究（34）が、P30で蝸牛基底における顕著な内有毛細胞および外有毛細胞の縮退を記載している。縮退および有毛細胞死は中回転においても認められ、器官の頂端部分は1月齢でより良く保存されていた。有毛細胞縮退は内耳器官の発達中に漸進的に起こると仮定し、より早期での有毛細胞生存を評価するために、P8およびP18でコルチ器に沿ってSEM分析を実施した。ヘテロ接合型c.216GAマウスの外有毛細胞（OHC）および内有毛細胞（IHC）は保存され、それらの束はこれらの齢では正しく配向していた（図5A～5C、5G、5Iおよび図12A～12C、12K）。しかし、分析した両齢で、ホモ接合型c.216AAマウスのコルチ器の全長に沿って崩壊した毛束が明白であった（図12D～12F、12H、12J～12Lおよび図19D～19J、19L）。P8で、IHC束は基底、中間および頂端領域において軽度に崩壊していた（図12D～12F、12J）。数多くのIHC束が波状のパターンおよび軽度の不動毛列崩壊を示した（図12J）。c.216AA変異体マウスの多くのOHCが、良く保存された毛束を有したが（図12H、12K）、断片化され、崩壊した毛束が器官に沿って散在することが明白であった（図12D～12F、12L）。P18で、崩壊はより顕著であったが、有毛細胞の大多数は、以前の報告（35）のようになおも存在していた（図12D～12F）。
【0133】
ハーモニンb1による遺伝子治療を受けたマウスにおける毛束形態を評価するために、6週齢の未処置（または非注入）および処置（または注入）マウスの側頭骨をSEM分析のために調製した。未処置c.216AAマウスは、器官の基底および中間領域で重度の有毛細胞損失を示した（図11）。基底領域において、OHCは、第一の列にはほぼ存在せず、第二および第三の列に散在していた。器官の中間領域においても、第一の列のOHCはほぼ存在しなかった。頂端で、より軽度な表現型が認められた。高倍率SEMはまた、c.216AA変異体マウスの器官の全長に沿って重度に崩壊した毛束を明らかにした。顕著には、6週齢c.216AAマウスにおいて、3列すべての不動毛を有する一般的な階段状構造を保持する毛束は認められなかった。代わりに、c.216AAマウスからの有毛細胞は崩壊した毛束を示し、第一の列、異常な第二の列およびきれいに保存された最高列に沿って収縮した不動毛が見られた。対照的に、ハーモニンb1による処置後のc.216AAマウスにおいては、有毛細胞損失の減少および正常な毛束が認められた。有毛細胞数は、代表的な視野中の毛束の存在または非存在から推定した。データは、注入マウスにおける、器官の基底から頂端までの有毛細胞数の顕著な保存率―基底では40～79％、中間では68～95％および頂端では93～99％―を明らかにした（c.216AAマウスn＝4の耳からの細胞n＝1824およびレスキューされたc.216AAマウスn＝2の耳のから細胞n＝792）。ハーモニンb1注入マウスにおいても異常な毛束は明白であったが、大部分の毛束は、3列の不動毛を有し、それらのヘテロ接合型対照からほとんど区別不可能な形態を示した（図11）。
【0134】
実施例2B―FM1-43画像化
5マイクロモルFM1-43（Invitrogen）を細胞外記録液中に希釈し、組織に10秒間適用し、次いで、細胞外記録液中で3回洗浄して過剰の色素を除去し、エンドサイトーシスによる取り込みを防止した。5分後、水浸20×、40×および63×対物レンズを有するZeiss Axioscope FS plus上、落射蛍光光源、微分干渉コントラストオプティクスおよびFM1-43フィルタセット（Chroma Technologies）を使用して、細胞内FM1-43を画像化した。CCDカメラおよびArgus-20イメージプロセッサ（Hamamatsu）を用い、バックグラウンド蛍光サブトラクションを使用して画像を16ビットで取り込んだ。すべての画像の取得に同じゲインおよびコントラスト設定を維持し、Adobe PhotoshopまたはImage-Jソフトウエアを用いてオフラインで分析した。
5マイクロモルFM1-43（Invitrogen）を細胞外記録液中に希釈し、組織に10秒間適用し、次いで、細胞外記録液中で3回洗浄して過剰の色素を除去し、エンドサイトーシスによる取り込みを防止した。5分後、水浸20×、40×および63×対物レンズを有するZeiss Axioscope FS plus上、落射蛍光光源、微分干渉コントラストオプティクスおよびFM1-43フィルタセット（Chroma Technologies）を使用して、細胞内FM1-43を画像化した。CCDカメラおよびArgus-20イメージプロセッサ（Hamamatsu）を用い、バックグラウンド蛍光サブトラクションを使用して画像を16ビットで取り込んだ。すべての画像の取得に同じゲインおよびコントラスト設定を維持し、Adobe PhotoshopまたはImage-Jソフトウエアを用いてオフラインで分析した。
【0135】
より早期に有毛細胞機能を評価するために、速やかに解体した内耳器官におけるFM1-43取り込みをP4で分析した。短時間（＜10秒）の適用で、FM1-43は、機能的機械感受性チャネルを有する有毛細胞に浸透した（36、37、38）。均一なFM1-43取り込みがc.216GAマウスの有毛細胞中で認められたが（図6A）、c.216AAマウスのOHCの間で取り込みのレベルは異なり、すべてではないがいくつかの細胞が機能的トランスダクションチャネルを保持することを示唆した（図6B）。同様の観察を蝸牛の全長に沿って実施した。周波数特定性の差は認められなかった。FM1-43取り込みはまた、出生後最初の1週間、c.216AAマウスのIHC中で減少した（データ示さず）。また、変異体マウスの卵形嚢有毛細胞においてFM1-43取り込みを評価した。興味深いことに、c.216AA変異体マウスにおいて、P6で、取り込みはストリオーラ外領域に限定され、ストリオーラ領域の有毛細胞が、安静時に開口した機械感受性チャネルを有しないことを示唆した（図6C、6D）。
【0136】
実施例2C―機械的刺激
OHCおよびIHC：400mA ENV400 Amplifier（Piezosystem Jena Germany, 54）によって駆動されるone-524次元PICMAチップピエゾアクチュエータ（Physik Instruments, Waldbronn, Germany）に取り付けた硬質ガラスプローブを介して機械的刺激を伝達した。プローブの先端は、不動毛束にフィットするよう、ファイヤポリッシュ加工（Fire polisher, H602, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL）されたものであった（51）。残留ピペット共振を除去するために、8ポールBesselフィルタ（Khron-Hite, 528 Brockton, MA）によって50kHzでフィルタリングされた電圧ステップを印加することにより、偏向を誘発した。C2400 CCDカメラ（Hamamatsu, Japan）を使用して毛束偏向をモニタした。電圧ステップを使用して、刺激プローブの動きをその静止位置から±2μmで較正した。軸外れの動きの非存在を確認し、プローブ動を較正するために、プローブのビデオ画像を記録した（空間分解能約4nm）。プローブの10～90％立ち上がり時間は約20μsecであった。
OHCおよびIHC：400mA ENV400 Amplifier（Piezosystem Jena Germany, 54）によって駆動されるone-524次元PICMAチップピエゾアクチュエータ（Physik Instruments, Waldbronn, Germany）に取り付けた硬質ガラスプローブを介して機械的刺激を伝達した。プローブの先端は、不動毛束にフィットするよう、ファイヤポリッシュ加工（Fire polisher, H602, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL）されたものであった（51）。残留ピペット共振を除去するために、8ポールBesselフィルタ（Khron-Hite, 528 Brockton, MA）によって50kHzでフィルタリングされた電圧ステップを印加することにより、偏向を誘発した。C2400 CCDカメラ（Hamamatsu, Japan）を使用して毛束偏向をモニタした。電圧ステップを使用して、刺激プローブの動きをその静止位置から±2μmで較正した。軸外れの動きの非存在を確認し、プローブ動を較正するために、プローブのビデオ画像を記録した（空間分解能約4nm）。プローブの10～90％立ち上がり時間は約20μsecであった。
【0137】
VHC：圧電バイモルフ要素に取り付けた硬質ガラスプローブを介して機械的刺激を伝達した。刺激ピペット中への動毛の穏やかな吸引によってカップリングを実施した。直列に取り付けられ、刺激プローブに直結された2つのバイモルフからなる圧電装置に電圧ステップを印加することにより、偏向を誘発した。電圧ステップを、pClamp 8.0ソフトウエアによって制御し、8ポールBesselフィルタによって1kHzでフィルタリングした（Khron-Hite, Brockton, MA）。C2400 CCDカメラ（Hamamatsu, Japan）を使用して毛束偏向をモニタした。実験の前に、刺激プローブの動きをその静止位置近辺（±2μm）に較正した。
【0138】
出生後最初の1週間、聴覚および前庭上皮は、比較的正常な形態を有するものを含め、機械感受性有毛細胞を保持する（図5）。コルチ器において、P3～P6のc.216AAマウスの蝸牛の中および頂回転から、正常に見える束を有する有毛細胞およびより重度に崩壊した毛束を有する有毛細胞から記録を得た。c.216AA変異体において、OHCは機械感受性を保持したが、反応の振幅は170±80pAまで有意に約63％減少した（n＝24；p＜0.001、図6E、6F、6G）。c.216AAマウスにおいて、OHC中で31～292pAの広範な反応振幅が認められた。毛束形態にしたがってデータを分類すると、有意差（p＜0.01）が認められ：重度に崩壊した束を有する変異体有毛細胞中に誘発された電流は、毛束がより保存された変異体細胞中に誘発された電流よりも小さく、それぞれ120±65pA（n＝9）および201±74pA（n＝15）であった。電流振幅の減少にもかかわらず、機械的変位に対する有毛細胞反応は、ヘテロ接合型c.216GAマウスの性質に類似した性質を保持した。二次ボルツマン方程式を使用して刺激反応［I（X）］曲線を当てはめ（図6F）、この当てはめを使用して10～90％作動範囲を決定した（図13B）。c.216GAおよびc.216AAから記録されたOHCの間で作動範囲の有意差は認められなかった（p＝0.054）。同様に、c.216AA変異体マウスのIHCからの毛束は、DIC顕微鏡下では軽度に崩壊しているように見えたが、P6でトランスダクション電流は有意に減少した（図13E、13F、13G）。－64mVの保持電位で、ヘテロ接合型c.216GAのIHC（P6～P7）における最大トランスダクション電流は平均587±96pA（n＝21）であったが、c.216AAのIHC中では316±127pAへと46％減少した（n＝19；p＜0.001）。c.216AA変異体マウスのIHC中で作動範囲の有意な（p＜0.01）減少が計測された（図13G）。
【0139】
また、順応（一定の束偏向の存在下でのトランスダクション電流の低下と定義される）が、c.216AA変異体マウスに存在した。高速および低速成分を決定するために、二重指数関数当てはめを使用して順応動態を分析した。両成分は、c.216AA変異体マウスからのIHCおよびOHC中でより低速であったが、その差は、低速成分に関してのみ有意であった（OHC中でp＜0.05およびIHC中でp＜0.001；図13C、13D、13H、13I）。他方、Popen＝0.5で計測された順応の程度は、c.216GA有毛細胞よりもc.216AAの有毛細胞のOHCおよびIHC中で有意に低かった（図20E、20J；p＜0.001）。合わさって、これらの結果は、機械感受性がc.216AAマウスの内有毛細胞および外有毛細胞において軽度に損なわれ、重要なことに、両細胞型が出生後最初の1週間にわたり生存すること（遺伝子治療および細胞機能回復のための前提条件）を実証する。
【0140】
また、前庭有毛細胞中、c.216AAマウスにおけるメカノトランスダクション電流の減少が認められた。ストリオーラ外領域において、c.216AAの電流は、109±30pA（n＝9、P5～P7）まで有意に減少し（p＜0.001）、対して、c.216GAの電流の場合、231±53pA（n＝8、P6～P7）であった（図6E、6F、6H）。ストリオーラ領域におけるFM1-43取り込みの非存在と一致して、ストリオーラ領域中の有毛細胞からは非常に小さな電流またはゼロ電流しか記録されなかった（6±13pA、n＝6、P5～P7）（以下を参照；図6C、6D）。DIC顕微鏡検査により、卵形嚢毛束は全体的によく保存されているように見えたが、トランスダクション電流は、ストリオーラ外およびストリオーラそれぞれ中の有毛細胞から有意に減少していた、または存在しなかった。したがって、ストリオーラ領域を除くと、これらの結果は、変異体マウスにおいてトランスダクション器官は正しくアセンブルされ、ターゲッティングされるが、機能的複合体の数は新生仔マウスにおいて減少することを示唆する。
【0141】
次に、ハーモニン発現を駆動するAAVベクターに曝露されたc.216AA有毛細胞における機能を評価した。外因性ハーモニンによる機能的レスキューの可能性を高めるために、CMVプロモーターによって駆動されるタグなしハーモニンa1またはハーモニンb1コード配列を、Anc80として知られるAAVカプシド中にパッケージングした（39）。最近、Anc80カプシドは、インビボでIHCの100％およびOHCの80～90％に形質導入することが示された（40）。本発明者らは、ハーモニンbがIHCおよびOHCの両方におけるメカノトランスダクションに必要であり、両細胞型における聴覚機能に必要であると仮定する。AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1（0.8μl、1.9×10^12gc/ml）のRWM注入と、別に、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1（1.7×10^12gc/ml）＋AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1の混合物（0.5μl＋0.5μl）のRWM注入とを実施し、処置から2週後にメカノトランスダクション反応を評価した。蝸牛が骨化する前にP5～P6で組織を抽出し、培養状態で10日間維持した。成熟OHC（＞P10）はエクスビボ記録パラダイムを生き延びないが、P14～P16相当時にロバストな電気生理学的記録がIHCから得られた。結果を図8に提示する。非注入マウスからのIHCは、P16でひどく減少したトランスダクション電流を示したが（79±43pA、n＝8）、AAV処置を受けたマウスにおいては感覚トランスダクションの回復は明白であった。P1でハーモニンb1またはb1とa1との組み合わせを注入されたマウスにおいて有意な回復（***P＜0.001）が認められ、それぞれの平均最大トランスダクション電流は388±66pA（n＝15）および352±28pA（n＝7；図8C）であった。ハーモニンb1による処置後のIHC中のトランスダクション電流振幅は、対照c.216GAマウスとで有意に異ならなかった。回復のレベルは、ハーモニンb1とハーモニンa1の同時注入によって有意に変化しなかった。これらの結果は、早期でのRWM注入による外因性ハーモニンb1の送達が、IHC中のメカノトランスダクションを回復させることができることを示唆する。
【0142】
実施例2D―共焦点画像化
出生後マウスP0～P8から共焦点画像化のための組織を調製するために、4％パラホルムアルデヒド（PFA）による15分間の固定を実施した。0.01％トリトンによる透過処理およびAlexa Fluorファロイジン（Invitrogen、1/200）による対比染色を使用して、アクチンフィラメントを標識した。LSM700 Zeiss共焦点顕微鏡上で画像を得た。比較的高齢のマウス（4～8週齢）において、安楽死処分後に側頭骨を取り出し、4％PFA中に1時間おき、次いで、120mM EDTAによって24～36時間カルシウム除去した。次いで、感覚上皮を切り出し、免疫染色のために上記のように注入を実施した。マウス抗CTBP2（BD Bioscience #612044、1/200）を48時間適用し、Alexa Fluorヤギ抗マウス抗体（1/200）によって4℃で一晩対比染色して、リボンシナプスを標識した。Zeiss LSM 710レーザ共焦点顕微鏡（IDDRC Imaging Core grant P30 HD18655）上で画像を取得し、Zeiss LSMイメージビューワ4.2で加工した。
出生後マウスP0～P8から共焦点画像化のための組織を調製するために、4％パラホルムアルデヒド（PFA）による15分間の固定を実施した。0.01％トリトンによる透過処理およびAlexa Fluorファロイジン（Invitrogen、1/200）による対比染色を使用して、アクチンフィラメントを標識した。LSM700 Zeiss共焦点顕微鏡上で画像を得た。比較的高齢のマウス（4～8週齢）において、安楽死処分後に側頭骨を取り出し、4％PFA中に1時間おき、次いで、120mM EDTAによって24～36時間カルシウム除去した。次いで、感覚上皮を切り出し、免疫染色のために上記のように注入を実施した。マウス抗CTBP2（BD Bioscience #612044、1/200）を48時間適用し、Alexa Fluorヤギ抗マウス抗体（1/200）によって4℃で一晩対比染色して、リボンシナプスを標識した。Zeiss LSM 710レーザ共焦点顕微鏡（IDDRC Imaging Core grant P30 HD18655）上で画像を取得し、Zeiss LSMイメージビューワ4.2で加工した。
【0143】
以前の研究が、感覚有毛細胞中のハーモニンの2つのオルタナティブスプライスフォームの発現を明らかにしている。外因性ハーモニンスプライスフォームの発現を駆動するAAVベクターの能力を評価するために、新生仔c.216AAおよび野生型（C57BL/6J）マウスからの卵形嚢およびコルチ器を、ハーモニンb1のN末端に融合したeGFP（eGFP::harmonin-b1）またはハーモニンa1の181N末端に融合したtdTomato（tdTomato::harmonin-a1）をコードするAAV2/1ベクターに曝露した。ベクターは、P1で、RWM注入（1μl）によってインビトロまたはインビボで適用した。インビトロで適用したとき、ベクターの存在下でP0～P1組織を24時間インキュベートし、培養状態で1週間維持した。共焦点画像は、野生型c.216GAおよびC.216AAマウスの有毛細胞にうまく形質導入されたことを示す（図7A～7C、7E）。VHC（図7A）、IHCおよびOHC（図7B、7C）中の不動毛の先端においてEGFP::harmonin-b1シグナルが明白であった。また、EGFPシグナルは、P1で注入を受けたマウスの蝸牛の基底部分のOHCおよびIHC中でもP60で検出された（図14D）。tdTomato::harmonin-a1は聴覚有毛細胞の基底で検出された（図14E）。リボンシナプスマーカーCTBP2との共染色は、高頻度で、P7のIHC中では共局在化を明らかにしたが（図14E）、P7の卵形嚢においてはそうでなかった（データは示さず）。外因性融合構築物の局在化は、ハーモニンbを感覚糸挿入の近くの不動毛の遠位端へ局在化させ（26、27、28）、ハーモニンaをシナプスへ局在化させた（30、31）先の研究と一致していた。
【0144】
実施例2E―聴性脳幹反応（ABR）および歪成分耳音響放射（DPOAE）
キシラジン（腹腔内5～10mg/kg）およびケタミン（腹腔内60～100mg/kg）で麻酔したマウスからABRおよびDPOAEを記録した。皮下針電極を、a）2つの耳の間で背側から（参照電極）；b）左耳介の後から（記録電極）；およびc）マウスの臀部で背側から（接地電極）皮膚に挿入した。耳介基底部の通路をトリミングして外耳道を露出させた。ABR記録の場合、外耳道および聴覚装置（EPL Acoustic system, MEEI, Boston）に5ミリ秒トーンピップを提示した。反応を増幅し（10,000倍）、フィルタリングし（0.1～3kHz）、PCベースのデータ取得システム（EPL, Cochlear function test suite, MEEI, Boston）のアナログ・デジタルボードによって平均した。音レベルを、音圧レベル0から110dB（デシベルSPL）まで5～10dBステップで上げた。各レベルで、「アーチファクト拒絶」後、512～1024の反応を平均した（刺激の極性を交番させながら）。目視検査によって閾値を決定した。データを分析し、Origin-2015（OriginLab Corporation, MA）を使用してプロットした。別段述べない限り、閾値平均値±標準偏差を提示する。DPOAEの場合、f1およびf2プライマリトーン（f2/f1＝1.2）を提示した（f2は5.6と45.2kHzとの間で半オクターブステップで変化させ、L1－L2＝10dB SPL）。各f2において、L2を10～80dB SPLの間で10dB SPLきざみで変化させた。DPOAE閾値は、ノイズフロアを5dB SPL上回る大きさのDPOAEを誘発するL2レベルとして、平均スペクトルから決定した。平均ノイズフロアレベルは、すべての周波数で0dB SPL未満であった。刺激を、PXI-1042Qシャシ中の24ビットデジタルI-Oカード（National Instruments PXI-4461）によって生成し、SA-1スピーカードライバ（Tucker-Davis Technologies, Inc.）によって増幅し、本発明者らのカスタム音響システム中の2つの静電ドライバ（CUI CDMG15008-03A）から送達した。小さなプローブチューブの端部のエレクトレットマイク（Knowles FG-23329-P07）を使用して外耳道内音圧をモニタした。これらの実験の大部分は、盲検条件下で実施されたものではない。
キシラジン（腹腔内5～10mg/kg）およびケタミン（腹腔内60～100mg/kg）で麻酔したマウスからABRおよびDPOAEを記録した。皮下針電極を、a）2つの耳の間で背側から（参照電極）；b）左耳介の後から（記録電極）；およびc）マウスの臀部で背側から（接地電極）皮膚に挿入した。耳介基底部の通路をトリミングして外耳道を露出させた。ABR記録の場合、外耳道および聴覚装置（EPL Acoustic system, MEEI, Boston）に5ミリ秒トーンピップを提示した。反応を増幅し（10,000倍）、フィルタリングし（0.1～3kHz）、PCベースのデータ取得システム（EPL, Cochlear function test suite, MEEI, Boston）のアナログ・デジタルボードによって平均した。音レベルを、音圧レベル0から110dB（デシベルSPL）まで5～10dBステップで上げた。各レベルで、「アーチファクト拒絶」後、512～1024の反応を平均した（刺激の極性を交番させながら）。目視検査によって閾値を決定した。データを分析し、Origin-2015（OriginLab Corporation, MA）を使用してプロットした。別段述べない限り、閾値平均値±標準偏差を提示する。DPOAEの場合、f1およびf2プライマリトーン（f2/f1＝1.2）を提示した（f2は5.6と45.2kHzとの間で半オクターブステップで変化させ、L1－L2＝10dB SPL）。各f2において、L2を10～80dB SPLの間で10dB SPLきざみで変化させた。DPOAE閾値は、ノイズフロアを5dB SPL上回る大きさのDPOAEを誘発するL2レベルとして、平均スペクトルから決定した。平均ノイズフロアレベルは、すべての周波数で0dB SPL未満であった。刺激を、PXI-1042Qシャシ中の24ビットデジタルI-Oカード（National Instruments PXI-4461）によって生成し、SA-1スピーカードライバ（Tucker-Davis Technologies, Inc.）によって増幅し、本発明者らのカスタム音響システム中の2つの静電ドライバ（CUI CDMG15008-03A）から送達した。小さなプローブチューブの端部のエレクトレットマイク（Knowles FG-23329-P07）を使用して外耳道内音圧をモニタした。これらの実験の大部分は、盲検条件下で実施されたものではない。
【0145】
切断型ハーモニンが正常な聴覚機能を妨げるかどうかを決定するために、切断型タンパク質を過剰発現させるためのAnc80.CMV.trunc-harmベクターを生成した。ベクターを、RWMを介してc.216GAマウスの内耳に注入した。4、6および12週でABRおよびDPOAESを計測すると、注入および非注入c.216GAマウスの間で閾値の差は見られなかった（図16C～16Dに示す6週齢マウスからの記録）。このデータは、注入技術、すなわちベクターのための対照として働き、重要なことに、外因性の切断型ハーモニンが内在性の完全長ハーモニンと競合しないことを立証して、c.216AA有毛細胞中の内在性切断形態が、遺伝子治療ベクターを介して発現する外因性の完全長ハーモニンに干渉する可能性が低いことを暗示する。
【0146】
ハーモニン遺伝子の増強がUsh1cマウスにおける聴覚および平衡機能をレスキューすることができるかどうかを決定するために、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1（0.8μl、1.7×10^12gc/ml）またはAAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1（0.8μl、1.9×10^12gc/ml）のRWM注入をP0～P1で実施し、聴性脳幹反応（ABR）、歪成分耳音響放射（DPOAE）、聴覚性驚愕反射、オープンフィールドおよびロータロッド行動を評価した。c.216AAマウスが深刻な聴力喪失および前庭機能不全をこうむる時期である6週でマウスを評価した。マウスの何匹かは3および6月でさらに試験した。AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1を注入された12匹のマウスのうち、6週で聴覚機能を回復したものはなく（図9A～9C）、ハーモニンa1の外因性発現が聴覚レスキューには不十分であることを示唆した。しかし、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1を注入された25匹のマウスのうち19匹は6週で有意な聴覚機能を回復した。低周波数（5.6～16kHz）で、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1を注入された耳の最良のABR閾値は25～30dB SPLであり、野生型マウスの閾値に著しく類似していた（図16A～16B）。部分的なレスキューが22.6kHzで認められたが、32kHzではほとんどないし全く認められなかった。また、OHC中の機能のレスキューと一致して、DPOAE閾値のレスキューが明白であった（図16C）。刺激8～11.3kHzの場合に＜45dB SPLの聴覚閾値を有したマウスのうち8匹をその後の時期で試験して、レスキューの寿命を評価した。6週から3月まで、約10dB SPLのABR閾値シフトが低周波数範囲で認められ、約30dB SPLのABR閾値シフトが高周波数範囲で認められた（図16D）。類似のシフトがDPOAE閾値にも認められた（図16E）。この時点ののち、ABR閾値およびDPOAEは、最後の試験時点である6月齢まで安定なままであった（図16D～16E）。
【0147】
特に高周波数端でのより完全な聴覚レスキューのためにハーモニンa1およびハーモニンb1の両方が必要であるかどうかを評価するために、AAV2/Anc80.CMV.tdTomato::harmonin-a1（0.5μl；238 4.1E^12gc/ml）およびAAV2/Anc80.CMV.eGFP::harmonin-b1（0.5μl；3.0E^12gc/ml）を同時注入した。両蛍光タグに関して陽性の細胞から明白であるように、有毛細胞の65％がハーモニンa1およびハーモニンb1の両方を発現させた（図14）。蛍光標識されたハーモニンa1は、おそらく過剰発現のせいで、AAV2/Anc80.CMV.tdTomato::harmonin-a1に曝露されたマウスの不動毛中に時おり認められた。非標識ハーモニンa1およびハーモニンb1ベクターを同時注入されたマウスにおけるABRおよびDPOAE閾値（図9）は、ハーモニンb1だけを注入されたマウスのそれに類似し、さらなる改善を提供せず、ハーモニンa1が聴覚機能にとってなくてもよいことを示唆した。重要なことに、データは、ハーモニンb1だけでも、低周波数における聴覚閾値の有意な回復に十分であることを実証する（図9）。
【0148】
レスキューの程度をさらに評価するために、閾値≦45dB SPLのマウスからのABR波形を分析し、8匹の対照c.216GAマウスと、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1を注入された5匹のc.216AAマウスとの間で比較した。8～11.3kHzおよび16kHzでの反応の分析は、正常波1振幅（非有意差、P＞0.2、スチューデントt検定）およびより長いピーク1潜時（P＞0.001）を明らかにして（図15）、シナプスにおける神経伝達の起こり得る遅れを示唆した。多くのマウスにおいて、聴覚レスキューは反対側耳でも認められ、ABR閾値は11.3kHzで20dB SPLの低さであった（ハーモニンb1：平均59.7±5.3dB SPL、n＝15/25；ハーモニンa1＋b1：255平均76.2±10.3dB SPL、n＝4～6）。AAVベクターの反対側耳への拡散は以前にも認められおり（37）、おそらくは、新生仔マウスのクモ膜下腔と連続したままである外リンパ管を介して起こる。
【0149】
本発明者らはまた、後期発育段階での注入が部分的聴覚レスキューをもたらし得るかどうかに興味をもった。AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1（0.8μl）のRWM注入をP10～P12で実施し、聴覚閾値を6週で評価した。P10～P12で注入を受けたマウスはいずれも検出可能なDPOAEを示さず、それらのABR閾値は非注入c.216AA対照マウスとで異ならず（n＝10；データは示さず）、おそらくは、より古い組織中の低いウイルス形質導入効率または後期発育段階におけるコルチ器の縮退のせいで、治療介入の機会が出生後早期に限られ得ることを示唆した。
【0150】
実施例2F―アッシャーマウスモデルにおけるRT-PCR
QuantiTect Revese Transcription Kit（Qiagen）を使用して、P2～P3の野生型、ヘテロ接合型およびホモ接合型Ush1c c.216G＞Aマウスの6つの聴覚器官からcDNAを調製した。完全長（450bp）または切断型ハーモニン（－35bp）をコードするcDNAを以下のプライマーによって増幅した：フォワードプライマー
、リバース
。これらのプライマーは、マウスUsh1c配列に特異的であり、標的配列はUsh1c c.216Aアレルのヒトノックイン部分の領域の外にあるため、内在性Ush1cおよびAAV2由来Ush1cの両方を増幅する。また、治療後6週で採取したマウス組織からDNAおよびRNAレベルを評価した。TRIzol試薬（Life Technologies, Carlsbad, CA）を製造者のプロトコルにしたがって使用して、蝸牛からDNAおよびRNAを単離した。GoScript逆転写システム（Promega, Madison, WI）を使用してRNAを逆転写した。GoTaq Green Master Mix（Promega, Madison, WI）を使用して放射能標識PCRを実施した。ウイルスDNA増幅の場合、マウスUsh1cに特異的なプライマー：
および
を使用した。ホモ接合型Ush1 c.216AAマウスは、エクソン3および4にノックインされたヒトUSH1C c.216A遺伝子を有してマウス配列に取って代わるため（32）、これらのプライマーはウイルスUsh1c DNAだけを増幅する。完全長（450bp）および異常にスプライシングされた／切断型のハーモニン（415bp）のcDNA増幅の場合、上記と同じプライマーを使用した（mUsh1c_Ex2FおよびmUsh1c_Ex5R）。Gapdhプライマーは
および
であった。産物を、6％非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Typhoon 9400ホスホイメージャ（GE Healthcare）を使用して定量した。
QuantiTect Revese Transcription Kit（Qiagen）を使用して、P2～P3の野生型、ヘテロ接合型およびホモ接合型Ush1c c.216G＞Aマウスの6つの聴覚器官からcDNAを調製した。完全長（450bp）または切断型ハーモニン（－35bp）をコードするcDNAを以下のプライマーによって増幅した：フォワードプライマー
【0151】
以前の研究が、切断型ハーモニンが内在性結合パートナーを求めて完全長ハーモニンと競合することによって機能を害し得る可能性を提起していたため（34、35）、本発明者らは、切断型タンパク質の持続的発現が、外因性完全長ハーモニンを発現するベクターを注入されたc.216AAマウスにおける回復を制限し得るかどうかに興味をもった（図16A）。この懸念に対処するために、RT-PCRアッセイを使用して、c.216GAおよびc.216AAマウスにおけるUsh1c転写産物の発現を試験した。以前の報告と一致して、c.216GA蝸牛においては完全長および切断型ハーモニンをコードするUsh1c転写産物が検出され、c.216AA蝸牛においては切断型ハーモニンのみをコードする転写産物が検出された（図16B）。
【0152】
AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1の発現を確認し、ウイルス発現レベルとABR閾値との関係を調査するために、DNAおよびRNAを、注入を受けた蝸牛および反対側蝸牛から単離し、それぞれPCRおよびRT-PCRによって定量した。6週齢のc.216GAマウスならびにAAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1注入（0.8μl；1.93 10^12gc/ml）および非注入c.216AAマウスにおいて発現を評価した。試料は、ABRレスキューが良好な2匹の注入マウス（11.3kHzで閾値≦35dB SPL）およびABRレスキューが不十分な2匹のマウス（11.3kHzで閾値≧90dB SPL）を含むものであった。ハーモニン（図18A）およびAAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1 DNA（図18B）の正しいスプライスフォームをコードするRNAが、注入を受けた蝸牛のすべてにおいて検出され、試験された全マウスの反対側蝸牛においてはより低い程度に検出された。ABRの閾値ならびに発現したDNAおよびRNAの量においてマウス間でばらつきが見られた（図18C）。しかし、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1 DNAレベルと、ハーモニンの正しいスプライスフォームをコードするRNAの量と、ABR閾値レベルとの間に強い相関が見いだされ、これは、ABRデータのばらつきがAAV発現の直接的な結果であり得ることを示唆する。ABR閾値の回復に成功したマウスにおける長期有毛細胞生存を評価するために、5匹のマウスから6月齢で組織を調製し、IHCおよびOHCを計数した（図17）。IHCの数は2つのコホートにおいて異ならなかったが、長期ABRレスキューを示した3匹のマウスには50％以上のOHCが残存していた。OHCの生存は、基底回転を除く器官全体に沿って認められた（図17）。
【0153】
実施例2G―聴覚性驚愕反応
Startle Monitor（Kinder Scientific）を使用して聴覚性驚愕反応（ASR）を計測した。マウスを、圧電／プレキシガラス感知アセンブリに固定された小型の非制限的な立方体プレキシガラス記録チャンバ（27cm×10cm×652 12.5cm）に入れ、60dB SPLバックグラウンドホワイトノイズで5分間順化させた。各セッションは35回の試行からなり、その間、10dB SPL強度が60～120db SPLの範囲である1つのノイズパルスを平均30秒（25～35秒範囲）の試行間隔で印加した。外部ノイズ干渉を制限するために、パルスは、一定の60dB SPLバックグラウンドノイズ上、擬似ランダムな順序で並べた。Startle Monitorシステムが、ピーク驚愕反応（ASR振幅）および刺激からピーク驚愕反応までの時間（ASR潜時）の計算のために、各パルスへの反応を第一N、最大Nおよび反応の最大時間（ms）の計測値へと換算した。ASRはすべて盲検的に実施した。
Startle Monitor（Kinder Scientific）を使用して聴覚性驚愕反応（ASR）を計測した。マウスを、圧電／プレキシガラス感知アセンブリに固定された小型の非制限的な立方体プレキシガラス記録チャンバ（27cm×10cm×652 12.5cm）に入れ、60dB SPLバックグラウンドホワイトノイズで5分間順化させた。各セッションは35回の試行からなり、その間、10dB SPL強度が60～120db SPLの範囲である1つのノイズパルスを平均30秒（25～35秒範囲）の試行間隔で印加した。外部ノイズ干渉を制限するために、パルスは、一定の60dB SPLバックグラウンドノイズ上、擬似ランダムな順序で並べた。Startle Monitorシステムが、ピーク驚愕反応（ASR振幅）および刺激からピーク驚愕反応までの時間（ASR潜時）の計算のために、各パルスへの反応を第一N、最大Nおよび反応の最大時間（ms）の計測値へと換算した。ASRはすべて盲検的に実施した。
【0154】
ABR/DPOAE回復が聴覚機能の行動的に関連する回復を生じさせるかどうかを評価するために、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1を注入されたマウス、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1を注入されたマウスおよび両ベクターを注入されたマウスにおいて聴覚性驚愕反応を計測した。ホワイトノイズに対する驚愕反応の分析は、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1を注入された6週齢マウスおよび両ベクターを同時注入されたマウスにおける反応の部分的レスキューを示した（図10A）。ハーモニンa1のみを投与されたマウスは、非注入c.216AAマウスに類似し、驚愕反応を回復させなかった。
【0155】
実施例2H―前庭評価
オープンフィールドおよびロータロッド平衡試験を使用して前庭機能を評価した。オープンフィールド試験は、薄暗い部屋の中、中心で30ルクスにセットされたオーバヘッドLED照明を備えたサウンドチャンバ内に配置された直径42cmの円形フレームを使用して実施した。マウスを一度に1匹ずつ円形のオープンフィールドの中に配置し、5分間探索させた。Ethovision XTを使用して行動を記録し、追跡して、移動距離および速度の計測を可能にした。オープンフィールド評価はすべて盲検的に実施した。ロータロッドパフォーマンスは、4rpmで回転し始め、0.1rpm s-1の率で加速する密閉ハウジング中、ロッドの上にマウスを配置することを含むものであった。1日目、マウスをロッド上に5分間配置して、機器に慣れさせた。翌日、全部で5回の試行でマウスをロッド上に配置した。試行の間に5分の休憩期間を課した。マウスがハウジングの機器を装備した床に落ちる前に装置上に留まることができた時間の長さをタイマに表示し、各試行後に記録した。
オープンフィールドおよびロータロッド平衡試験を使用して前庭機能を評価した。オープンフィールド試験は、薄暗い部屋の中、中心で30ルクスにセットされたオーバヘッドLED照明を備えたサウンドチャンバ内に配置された直径42cmの円形フレームを使用して実施した。マウスを一度に1匹ずつ円形のオープンフィールドの中に配置し、5分間探索させた。Ethovision XTを使用して行動を記録し、追跡して、移動距離および速度の計測を可能にした。オープンフィールド評価はすべて盲検的に実施した。ロータロッドパフォーマンスは、4rpmで回転し始め、0.1rpm s-1の率で加速する密閉ハウジング中、ロッドの上にマウスを配置することを含むものであった。1日目、マウスをロッド上に5分間配置して、機器に慣れさせた。翌日、全部で5回の試行でマウスをロッド上に配置した。試行の間に5分の休憩期間を課した。マウスがハウジングの機器を装備した床に落ちる前に装置上に留まることができた時間の長さをタイマに表示し、各試行後に記録した。
【0156】
外リンパ腔は蝸牛と前庭迷路との間で連続するため、RWMを介して注入されたAAVベクターは前庭感覚器官にも形質導入し得る。前庭行動を評価するため、マウスをロータロッド上でのパフォーマンスに関して試験した。c.216AAマウスおよびAAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1を注入されたc.216AAマウスにおいて低いロータロッドパフォーマンスが認められたが（落下までの潜期平均＜22秒）、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1を注入されたc.216AAマウスおよびハーモニンa1およびb1ベクターを同時注入されたマウスは、対照c.216GAマウスと一致して、ロータロッド上で60～120秒間平衡機能を維持した（図10B）。
【0157】
また、オープンフィールド行動の回復は、ハーモニンb1を注入されたc.216AAマウスおよびハーモニンa1とb1を二重に注入されたc.216AAマウスにおいても認められた。代表的なオープンフィールド探索トレースが図17Cにプロットされている。c.216GAマウスはフィールドの境界を探索し、最小の全身回転を示したが、c.216AAマウスはチャンバ全体でより多くの活動を示し、回転／分として定量化された全身回転の増加を示した（図10D～10E）。驚くべきことに、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1を注入されたマウスにおいてABRレスキューは認められなかったが、オープンフィールドデータは、対照マウスのレベルまでの前庭機能の回復を実証した。AAV2/Anc80.CMV.trunc-harmoninを注入されたc.216GAマウスの行動は対照c.216GAマウスとは異ならず、ここでもまた、切断型ハーモニンと野生型ハーモニンとの間に干渉がないことを示した（図10C～10E）。
【0158】
実施例3―聴力喪失に関与するさらなる変異のポリヌクレオチド治療
実施例3A―インビボ実験
旋回行動は回避されたが、ハーモニンa1を注入されたマウスはロータロッド試験に不合格であったため、行動アッセイはハーモニンa1による部分的な前庭レスキューを実証した。他方、ハーモニンb1を注入されたマウスは両試験において機能回復を示した（図10）。ストリオーラ領域中の形質導入およびFM1-43取り込みの非存在は、ストリオーラ領域の有毛細胞およびおそらくはI型細胞機能が正しいハーモニン発現に依存することを示す（図6）。
実施例3A―インビボ実験
旋回行動は回避されたが、ハーモニンa1を注入されたマウスはロータロッド試験に不合格であったため、行動アッセイはハーモニンa1による部分的な前庭レスキューを実証した。他方、ハーモニンb1を注入されたマウスは両試験において機能回復を示した（図10）。ストリオーラ領域中の形質導入およびFM1-43取り込みの非存在は、ストリオーラ領域の有毛細胞およびおそらくはI型細胞機能が正しいハーモニン発現に依存することを示す（図6）。
【0159】
聴覚レスキューは、低周波数で顕著であったが、高周波数ではそうではなく（図9）、6週で毛束形態の保存が器官全体に沿って認められた（図11）。高周波数でのレスキューの非存在が、注入によって生じた損傷による可能性は低い。AAVベクターを注入されたc.216GAのいずれにも高周波数聴力喪失は認められなかった（図16C～16D）。蝸牛の全長に沿ったAAVターゲッティングは、説明として基底における形質導入効率の欠如に反論する。1つの可能性は、短いハーモニンcなどの他のハーモニンアイソフォームが蝸牛の基底高周波数端における機能のレスキューに必要になり得ることである。または、蝸牛発育は基底端から始まるため、P0までに、基底高周波数端からの有毛細胞が修復点を超えて成熟したということがあり得る。これが当てはまる場合、胚性介入が、高周波数領域における、より良好なレスキューを可能にし得る。
【0160】
以前に記載されているヘルパーウイルスフリーシステムおよびダブルトランスフェクション法（Grimm et al., 2003, Mol. Ther., 7:839:50）を使用して、修飾CMVプロモーターによって駆動されるマウスTMC1のコード配列を保持するAnc80ベクターを生成した。発現したタンパク質の可視化を可能にするために、トリプルフラグタグ（FLAG）配列をTMCコード配列のC末端に融合した。Anc80-CMV-Tmcベクターを、イオジキサノールステップグラジエント、次いでイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した。力価は、ヒトベータグロビンイントロンエレメントに特異的なプライマーセットを使用する定量的PCRによって計測して、1×1012～1×1013gc/mlの範囲であった。ウイルスアリコートを－80℃で保存し、使用直前に解凍した。
【0161】
ボストン小児病院のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコル（プロトコル#2659、#2146）にしたがって、以下に記すようにマウス（P0～P2）をウイルスベクターのインビボ送達に使用した。C57BL/6J（Jackson Laboratories）またはSwiss Websterマウス系統（Taconic）を野生型対照マウスとして使用し、TMC1変異体アレルを保有するマウス（TMC1Δ/ΔまたはTmc1-/-）は、前述（Kawashima et al., 2011, J. Clin. Invest., 121:4796-809）のようにC57BL/6Jバックグラウンド上にあった。
【0162】
評価のために組織を調製するために、P0～P10の仔マウスから側頭骨を採取した。仔マウスを迅速な断頭によって安楽死させ、10mM HEPES、0.05mg/mlアンピシリンおよび0.01mg/mlシプロフロキサシンを添加したMEM（Invitrogen）中、pH7.40で側頭骨を解体した。膜迷路を解剖スコープ下で単離し、ライスナー膜を剥離させ、蓋膜および血管条を機械的に取り出した。コルチ器培養物を、一端がSylgardによって18mmの丸いカバーガラスに接着された一対の細いガラス繊維の下に平らに固定した。電気生理学的実験のために組織を速やかに使用した。P10を過ぎたマウスの場合、吸入CO2によって安楽死させたのち側頭骨を採取し、蝸牛の全組織標本を生成した。
【0163】
図示されるすべての平均値およびエラーバーは平均値±SDを表す。両側対応ありt検定を使用して、注入耳と非注入耳との間で統計的有意性の比較を実施した。P＜0.05を有意とみなした。
【0164】
実施例3B―ウイルスベクターのインビボ注入
仔マウス（P0～P2）に対し、斜角研磨したガラスマイクロインジェクションピペットを使用して正円窓膜（RWM）を介して注入を実施した。P-2000ピペットプラー（Sutter Instruments）上でガラス毛管からピペットを引き、マイクロピペットベベラ（Sutter Instruments）を使用して斜角研磨した（チップ直径約20μm、角度28°）。手術部位（左乳様突起）を覆うために無菌スワブを使用して、鎮痛のためにEMLAクリーム（リドカイン2.5％およびプリロカイン2.5％）を外部から適用した。術前の30～60分間、37℃の加温パッド上で体温を維持した。
仔マウス（P0～P2）に対し、斜角研磨したガラスマイクロインジェクションピペットを使用して正円窓膜（RWM）を介して注入を実施した。P-2000ピペットプラー（Sutter Instruments）上でガラス毛管からピペットを引き、マイクロピペットベベラ（Sutter Instruments）を使用して斜角研磨した（チップ直径約20μm、角度28°）。手術部位（左乳様突起）を覆うために無菌スワブを使用して、鎮痛のためにEMLAクリーム（リドカイン2.5％およびプリロカイン2.5％）を外部から適用した。術前の30～60分間、37℃の加温パッド上で体温を維持した。
【0165】
仔マウスを、意識がなくなるまで2～3分間の急速な低体温誘導によって麻酔し、手術中、この状態を冷却プラットフォーム上で10～15分間維持した。ベタジンでスクラブし、70％エタノールで拭くことを3回繰り返すことにより、手術部位を消毒した。耳介後部切開を実施して透明な耳胞を露出させ、マイクロマニピュレータ（MP-30、Sutter Instrument Company）によってマイクロピペットを耳胞およびその上の筋膜に通し、マイクロピペットの先端をRWMに通した。
【0166】
空気式マイクロインジェクタ（WPI Nanoliter 2010）を使用して、力価1012～1014gc/mLのウイルス約1μl（ウイルス粒子総数109～1011）を0.1μl／分で左耳だけに注入した。6-0モノフィラメント縫合糸（Ethicon）を使用して皮膚切開部を閉じた。その後、回復のために仔マウスを加温パッドに戻した。
【0167】
実施例3C―免疫蛍光検査
ウイルスベクターによって送達された導入遺伝子の発現の分布を決定するために免疫染色を実施した。そうするために、解体したばかりのコルチ器を、PBS中に希釈した4％パラホルムアルデヒドによって室温で1時間浸漬固定して、免疫染色を実施した。次いで、組織をPBS中で洗浄し、0.01～0.1％Triton X-100で30分間透過処理し、AlexaFluor546ファロイジン（Molecular Probes、1：200希釈）で1時間対比染色して、フィラメント状アクチンを標識した。
ウイルスベクターによって送達された導入遺伝子の発現の分布を決定するために免疫染色を実施した。そうするために、解体したばかりのコルチ器を、PBS中に希釈した4％パラホルムアルデヒドによって室温で1時間浸漬固定して、免疫染色を実施した。次いで、組織をPBS中で洗浄し、0.01～0.1％Triton X-100で30分間透過処理し、AlexaFluor546ファロイジン（Molecular Probes、1：200希釈）で1時間対比染色して、フィラメント状アクチンを標識した。
【0168】
外因的に発現したTMC::FLAG融合タンパク質の局在化のために、2％BSAおよび5％ヤギ正常血清を使用して組織を1時間ブロックし、FLAGモチーフに対する抗体（BD Biosciences、1：200希釈）とともに4℃で一晩インキュベートした。有毛細胞計数のために、組織をヤギ正常血清中で1時間ブロックし、ウサギ抗ミオシンVIIa一次抗体（Proteus Biosciences、1：1000希釈）で4℃で一晩染色し、AlexaFluor488（Life Technologies、1：200希釈）にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体で1時間標識した。試料をVectashield封入剤（Vector Laboratories）によってカバーガラスに封入し、Zeiss LSM700共焦点顕微鏡を使用して10×～63×の倍率で画像化した。
【0169】
図13は、Ush1c変異体マウスへのハーモニンの均一なAnc80送達を実証する免疫蛍光検査結果を示し、図28は、KCNQ4変異体マウス中の細胞へのKCNQ4のAnc80送達を実証する免疫蛍光検査結果を示す。
【0170】
実施例3D―有毛細胞電気生理学
器官型蝸牛培養物を、137mM NaCl、0.7mM NaH2P04、5.8mM KCl、1.3mM CaCl2、0.9mM MgCl2、10mM Hepesおよび5.6mM D-グルコースを含む標準人工外リンパに浸漬した。ビタミン（1：50）およびアミノ酸（1：100）を濃縮物（Invitrogen）から溶液に加え、NaOHを使用して最終pHを7.40（310mosmol/kg）に調節した。記録ピペット（3～5メグオーム）をR6ガラス毛管（King Precision Glass）から引き、135mM CsCl、5mM Hepes、5mM EGTA、2.5mM MgCl2、2.5mM Na2－アデノシン三リン酸および0.1mM CaCl2を含む細胞内溶液（CsOHを使用して最終pHを7.40（285mosmol/kg）に調節した）で満たした。Axopatch 200B増幅器（Molecular Devices）を使用して、室温（22～24℃）で、ホールセルタイトシール電圧クランプ記録を－84mVで実施した。ローパスBesselフィルタによって感覚トランスダクション電流を10kHzでフィルタリングし、16ビット収集ボード（Digidata 1440A）およびpCLAMP10ソフトウェア（Molecular Devices）によって≧20kHzでデジタル化した。OriginPro 8（OriginLab）を使用するオフライン分析のためにデータを保存した。
器官型蝸牛培養物を、137mM NaCl、0.7mM NaH2P04、5.8mM KCl、1.3mM CaCl2、0.9mM MgCl2、10mM Hepesおよび5.6mM D-グルコースを含む標準人工外リンパに浸漬した。ビタミン（1：50）およびアミノ酸（1：100）を濃縮物（Invitrogen）から溶液に加え、NaOHを使用して最終pHを7.40（310mosmol/kg）に調節した。記録ピペット（3～5メグオーム）をR6ガラス毛管（King Precision Glass）から引き、135mM CsCl、5mM Hepes、5mM EGTA、2.5mM MgCl2、2.5mM Na2－アデノシン三リン酸および0.1mM CaCl2を含む細胞内溶液（CsOHを使用して最終pHを7.40（285mosmol/kg）に調節した）で満たした。Axopatch 200B増幅器（Molecular Devices）を使用して、室温（22～24℃）で、ホールセルタイトシール電圧クランプ記録を－84mVで実施した。ローパスBesselフィルタによって感覚トランスダクション電流を10kHzでフィルタリングし、16ビット収集ボード（Digidata 1440A）およびpCLAMP10ソフトウェア（Molecular Devices）によって≧20kHzでデジタル化した。OriginPro 8（OriginLab）を使用するオフライン分析のためにデータを保存した。
【0171】
【0172】
実施例3E―聴性脳幹反応（ABR）
以前に記載されているようにして（Maison et al., 2010, J. Neurosci., 30:6751-62）、ABRの記録を実施した。簡潔にいうと、P25～P30のマウスを、0.9％生理食塩水5ml中に希釈したケタミン50mgおよびキシラジン5mgの腹腔内注射（0.1ml／体重10g）によって麻酔した。ABR実験を防音チャンバ中32℃で実施した。聴覚機能を試験するために、マウスに対し、5.6kHz、8kHz、11.3kHz、16kHz、22.6kHzまたは32kHzの純音刺激を音圧レベル10から115dBまで5dBステップで提示して、再現性のABR波形（ピークI～IV）を誘発する閾値強度を検出した。交番する極性の刺激を使用して、512～1024の反応を収集し、音圧レベルごとに平均した。振幅が15μVよりも大きい波形（ピーク－トラフ）は、「アーチファクト拒絶」機能によって破棄した。ABR試験の開始前に、通常は外耳道の入口を覆い隠す皮膚および軟骨のフラップを解剖用ハサミでトリミングし、外耳道の入口における音圧を個々の試験対象ごとにすべての刺激周波数で較正した。プライマリトーンを生成するための2つの静電型イヤホン（CUI Miniature Dynamics）からなるカスタムプローブチューブスピーカ／マイクアセンブリ（EPL PXI Systems）および外耳道音圧を記録するためのKnowlesミニチュアマイク（Electret Condenser）を通して音響刺激を試験対象の耳に直接印加した。音刺激は、5msトーンバースト（cos2オンセットで0.5ms立ち上がり－立ち下がり、40/sで印加）からなるものであった。耳介（活性電極）、頂点（参照電極）および臀部（接地電極）に挿入された皮下針電極を使用してABR信号を収集した。ABR電位を増幅し（10,000×）、パスフィルタリングし（0.3～10kHz）、カスタムデータ収集ソフトウェア（LabVIEW）を使用してデジタル化した。デジタルI-Oボード（National Instruments）を使用して音刺激および電極電圧を40μs間隔でサンプリングし、オフライン分析のために保存した。閾値は、任意の波（I～IV）を検出し、音強度を増しながら再現することができる最低デシベルレベルとして視覚的に定義した。ABR閾値を各実験グループ内で平均し、統計的解析に使用した。
以前に記載されているようにして（Maison et al., 2010, J. Neurosci., 30:6751-62）、ABRの記録を実施した。簡潔にいうと、P25～P30のマウスを、0.9％生理食塩水5ml中に希釈したケタミン50mgおよびキシラジン5mgの腹腔内注射（0.1ml／体重10g）によって麻酔した。ABR実験を防音チャンバ中32℃で実施した。聴覚機能を試験するために、マウスに対し、5.6kHz、8kHz、11.3kHz、16kHz、22.6kHzまたは32kHzの純音刺激を音圧レベル10から115dBまで5dBステップで提示して、再現性のABR波形（ピークI～IV）を誘発する閾値強度を検出した。交番する極性の刺激を使用して、512～1024の反応を収集し、音圧レベルごとに平均した。振幅が15μVよりも大きい波形（ピーク－トラフ）は、「アーチファクト拒絶」機能によって破棄した。ABR試験の開始前に、通常は外耳道の入口を覆い隠す皮膚および軟骨のフラップを解剖用ハサミでトリミングし、外耳道の入口における音圧を個々の試験対象ごとにすべての刺激周波数で較正した。プライマリトーンを生成するための2つの静電型イヤホン（CUI Miniature Dynamics）からなるカスタムプローブチューブスピーカ／マイクアセンブリ（EPL PXI Systems）および外耳道音圧を記録するためのKnowlesミニチュアマイク（Electret Condenser）を通して音響刺激を試験対象の耳に直接印加した。音刺激は、5msトーンバースト（cos2オンセットで0.5ms立ち上がり－立ち下がり、40/sで印加）からなるものであった。耳介（活性電極）、頂点（参照電極）および臀部（接地電極）に挿入された皮下針電極を使用してABR信号を収集した。ABR電位を増幅し（10,000×）、パスフィルタリングし（0.3～10kHz）、カスタムデータ収集ソフトウェア（LabVIEW）を使用してデジタル化した。デジタルI-Oボード（National Instruments）を使用して音刺激および電極電圧を40μs間隔でサンプリングし、オフライン分析のために保存した。閾値は、任意の波（I～IV）を検出し、音強度を増しながら再現することができる最低デシベルレベルとして視覚的に定義した。ABR閾値を各実験グループ内で平均し、統計的解析に使用した。
【0173】
図20は、ハーモニンをコードし、発現するAnc80ウイルスベクターの送達が、特に低めの周波数（たとえば約5～約22kHz）で、聴覚機能のほぼ完全な回復を提供することができることをグラフで示す。
【0174】
実施例3F―定量的RT-PCR分析
インビボ投与後に蝸牛中に存在するウイルスの量を評価するための実験を実施した。P1のTMC1-/-マウス2匹の左耳に注入を実施した。左右の耳から蝸牛を切除し、P10相当時に3日間、培養状態に維持した。RNAを抽出し、Agilent Bioanalyzer（Agilent Technologies）を使用して質を確認し、以前に記載されているようにして（Kawashima et al., 2011, J. Clin. Invest., 121:4796-809）、SYBR GreenER qPCR試薬（Invitrogen）を用いて、TMC1に特異的な効率的なプライマーセットを用いる定量的RT-PCR分析のためにcDNA中に逆転写した
インビボ投与後に蝸牛中に存在するウイルスの量を評価するための実験を実施した。P1のTMC1-/-マウス2匹の左耳に注入を実施した。左右の耳から蝸牛を切除し、P10相当時に3日間、培養状態に維持した。RNAを抽出し、Agilent Bioanalyzer（Agilent Technologies）を使用して質を確認し、以前に記載されているようにして（Kawashima et al., 2011, J. Clin. Invest., 121:4796-809）、SYBR GreenER qPCR試薬（Invitrogen）を用いて、TMC1に特異的な効率的なプライマーセットを用いる定量的RT-PCR分析のためにcDNA中に逆転写した
【0175】
TMC1の断片を増幅するために、以下のプライマーを使用した：
。発現レベルを、
で増幅されたActb（βアクチンをコードする）のレベルに正規化した。すべてのプライマーは、イントロンを挟むように設計されたものであり、融解曲線分析および陰性対照を使用して確認した。Actbに対するΔΔCT法および注入耳と非注入耳との間の差を使用してデータを分析した。注入耳において、TMC1 mRNA発現は非注入耳よりも12倍高かった。
【0176】
実施例3G―FM1-43標識
以前に記載されているようにして（Gale et al., 2001, J. Neurosci., 21:7013-25；Meyers et al., 2003, J. Neurosci., 23:4054-65およびGeleoc & Holt, 2003, Nat. Neurosci., 10:1019-20）、FM1-43ダイローディング実験を実施した。蝸牛培養物を付着させたカバーガラスを、ガラス底チャンバ上、正立顕微鏡（Zeiss Axioscope FS Plus）の下に配置した。人工外リンパ中に希釈した5μM FM1-43FX（Invitrogen）を10秒間適用し、組織を人工外リンパ中で3回洗浄して、細胞膜の外葉から色素を除去した。5分後、FM1-43フィルタセットと、63×水浸対物レンズを備えた落射蛍光光源とを使用して、細胞内FM1-43を画像化した。上記のように、組織を固定し、免疫蛍光のために処理した。
以前に記載されているようにして（Gale et al., 2001, J. Neurosci., 21:7013-25；Meyers et al., 2003, J. Neurosci., 23:4054-65およびGeleoc & Holt, 2003, Nat. Neurosci., 10:1019-20）、FM1-43ダイローディング実験を実施した。蝸牛培養物を付着させたカバーガラスを、ガラス底チャンバ上、正立顕微鏡（Zeiss Axioscope FS Plus）の下に配置した。人工外リンパ中に希釈した5μM FM1-43FX（Invitrogen）を10秒間適用し、組織を人工外リンパ中で3回洗浄して、細胞膜の外葉から色素を除去した。5分後、FM1-43フィルタセットと、63×水浸対物レンズを備えた落射蛍光光源とを使用して、細胞内FM1-43を画像化した。上記のように、組織を固定し、免疫蛍光のために処理した。
【0177】
図23は、本明細書に記載されるAnc80ウイルスベクターに曝露された細胞によるFM1-43色素の取り込みを示す免疫染色画像であり、図28は、本明細書に記載されるAnc80ウイルスベクターによって送達されたTMC1がTmcl欠損有毛細胞の感覚トランスダクションをインビボで回復させることをグラフで実証する。
【0178】
実施例3H―歪成分耳音響放射（DPOAE）
DPOAEデータは、ABRデータと同じ条件下、ABRデータと同じ記録セッション中に収集した。2f1-f2でのDPOAEの生成のために、周波数比1.2（f2/f1）でプライマリトーンを生成した（f2レベルは各f2/f1対のf1レベルよりも10dB低い音圧レベルであった）。f2レベルを20から80dBまで5dBステップで掃引した。各レベルにおける波形およびスペクトルの平均化を使用して、記録された外耳道音圧の信号対雑音比を高めた。2fl-f2でのDPOAEの振幅を、スペクトル中の近傍点におけるノイズフロアとともに、平均されたスペクトルから抽出した。DPOAE振幅対音レベルのプロットから等反応曲線を補間した。閾値は、0dBでDPOAEを生成するために必要なf2レベルと定義した。
DPOAEデータは、ABRデータと同じ条件下、ABRデータと同じ記録セッション中に収集した。2f1-f2でのDPOAEの生成のために、周波数比1.2（f2/f1）でプライマリトーンを生成した（f2レベルは各f2/f1対のf1レベルよりも10dB低い音圧レベルであった）。f2レベルを20から80dBまで5dBステップで掃引した。各レベルにおける波形およびスペクトルの平均化を使用して、記録された外耳道音圧の信号対雑音比を高めた。2fl-f2でのDPOAEの振幅を、スペクトル中の近傍点におけるノイズフロアとともに、平均されたスペクトルから抽出した。DPOAE振幅対音レベルのプロットから等反応曲線を補間した。閾値は、0dBでDPOAEを生成するために必要なf2レベルと定義した。
【0179】
図25は、本明細書に記載されるAnc80ウイルスベクターを使用して送達されたTMC1が、特に低めの周波数（たとえば約5～約16kHz）で、TMC1-/-マウスにおける外有毛細胞機能をレスキューすることをグラフで実証する。
【0180】
図26は、有毛細胞中のGFP発現に対するプロモーターPcdh15、Myo6、およびKCNQ4の効果を実証する。
【0181】
他の態様
本明細書において、方法および物質組成はいくつかの異なる局面に関連して説明されたが、様々な局面の前記説明は、方法および物質組成を例示することを意図したものであり、方法および物質組成の範囲を限定することを意図したものではないことが理解されよう。他の局面、利点および変形が以下の請求項の範囲内である。
本明細書において、方法および物質組成はいくつかの異なる局面に関連して説明されたが、様々な局面の前記説明は、方法および物質組成を例示することを意図したものであり、方法および物質組成の範囲を限定することを意図したものではないことが理解されよう。他の局面、利点および変形が以下の請求項の範囲内である。
【0182】
本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの記載は、任意の1つの要素またはリストされた要素の組み合わせ（またはサブコンビネーション）としての当該変数の定義を含む。本明細書における態様の記載は、任意の1つの態様としての当該態様または任意の他の態様もしくはその部分との組み合わせとしての当該態様を含む。
【0183】
本明細書において挙げられるすべての特許および刊行物は、各個の特許および刊行物が参照により組み入れられることが明確かつ個別に示される場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【0184】
開示されるものは、開示される方法および組成物のために使用することができる、開示される方法および組成物とともに使用することができる、開示される方法および組成物の調製において使用することができる、または開示される方法および組成物の産物である、方法および組成物である。これらおよび他の物質が本明細書に開示され、これらの方法および組成物の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されるということが理解されよう。すなわち、これらの組成物および方法の各様々な個々のおよび集合的な組み合わせおよび置換への具体的言及が明示的に開示されていないとしても、それぞれは本明細書において具体的に考慮され、記載されている。たとえば、特定の物質組成または特定の方法が開示され、記載され、多数の組成物または方法が述べられているならば、別段の指示がない限り、それらの組成物および方法の各組み合わせおよび置換が具体的に考慮されている。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせが同じく具体的に考慮され、開示されている。
【0185】
配列リスト
Anc80カプシドタンパク質（SEQ ID NO: 1）
X1＝K/R；X2＝A/S；X3＝A/G；X4＝R/K；X5＝E/Q；X6＝T/E；X7＝A/T；X8＝S/N；X9＝Q/E；X10＝S/A；X11＝N/D
Anc80カプシドタンパク質（SEQ ID NO: 1）
【0186】
Anc80-L0065カプシドタンパク質（SEQ ID NO: 2）
【0187】
pAAV-TMC2（SEQ ID NO: 3）
左逆位末端反復（L-ITR）：1～130nt
サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター：206～799nt
シアミンウイルス40（SV40）miscイントロン：831～963nt
TMC1ex1（Transmembrane channel-like 1）：982～3,267nt
WPRE（Post-transcriptional regulatory element from Woodchuck hepatitis virus）：3,268～3,821nt
ウシ成長ホルモン（bGH）ポリAシグナル：3,822～4,086nt
右逆位末端反復（R-ITR）：4,124～4,253nt
左逆位末端反復（L-ITR）：1～130nt
サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター：206～799nt
シアミンウイルス40（SV40）miscイントロン：831～963nt
TMC1ex1（Transmembrane channel-like 1）：982～3,267nt
WPRE（Post-transcriptional regulatory element from Woodchuck hepatitis virus）：3,268～3,821nt
ウシ成長ホルモン（bGH）ポリAシグナル：3,822～4,086nt
右逆位末端反復（R-ITR）：4,124～4,253nt
【0188】
pAAV-TMC1ex2（SEQ ID NO: 4）
L-ITR：1～130
CMVプロモーター：206～799
SV40 miscイントロン：831～963
TMC1ex2：982～3,255
WPRE：3,256～3,809
bGHポリAシグナル：3,810～4,074
R-ITR：4,112～4,241
L-ITR：1～130
CMVプロモーター：206～799
SV40 miscイントロン：831～963
TMC1ex2：982～3,255
WPRE：3,256～3,809
bGHポリAシグナル：3,810～4,074
R-ITR：4,112～4,241
【0189】
pAAV-TMC2（SEQ ID NO: 5）
L-ITR：1～130
CMVプロモーター：206～799
SV40 miscイントロン：831～963
TMC2：981～3,647
WPRE：3,655～4,208
bGHポリAシグナル：4,209～4,473
R-ITR：4,511～4,640
L-ITR：1～130
CMVプロモーター：206～799
SV40 miscイントロン：831～963
TMC2：981～3,647
WPRE：3,655～4,208
bGHポリAシグナル：4,209～4,473
R-ITR：4,511～4,640
【0190】
pAAV-Pmyo6-TMC1ex1（SEQ ID NO: 6）
L-ITR：1～141
ミオシン6（myo6）プロモーター：155～1,396
TMC1ex1：1,425～3,710
bGHポリAシグナル：3,745～4,225
R-ITR：4,262～4,402
L-ITR：1～141
ミオシン6（myo6）プロモーター：155～1,396
TMC1ex1：1,425～3,710
bGHポリAシグナル：3,745～4,225
R-ITR：4,262～4,402
【0191】
pAAV-Pmyo6-TMC1ex1（SEQ ID NO: 7）
L-ITR：1～141
myo6プロモーター：155～1,396
TMC1ex2：1,425～4,439
hGHポリAシグナル：4,474～4,954
R-ITR：4,991～5,131
L-ITR：1～141
myo6プロモーター：155～1,396
TMC1ex2：1,425～4,439
hGHポリAシグナル：4,474～4,954
R-ITR：4,991～5,131
【0192】
pAAV-Pmyo6-TMC2（SEQ ID NO: 8）
L-ITR：1～141
myo6プロモーター：155～1,396
TMC2：1,425～4,091
hGHポリAシグナル：4,126～4,606
R-ITR：4,643～4,783
L-ITR：1～141
myo6プロモーター：155～1,396
TMC2：1,425～4,091
hGHポリAシグナル：4,126～4,606
R-ITR：4,643～4,783
【0193】
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> THE CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION
<120> MATERIALS AND METHODS FOR DELIVERING NUCLEIC ACIDS TO COCHLEAR
AND VESTIBULAR CELLS
<150> US 62/455,197
<151> 2017-02-06
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (168)..(168)
<223> Lys or Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (204)..(204)
<223> Ala or Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (266)..(266)
<223> Ala or Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (311)..(311)
<223> Arg or Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (411)..(411)
<223> Glu or Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (460)..(460)
<223> Thr or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (493)..(493)
<223> Ala or Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (562)..(562)
<223> Ser or Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (576)..(576)
<223> Gln or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (587)..(587)
<223> Ser or Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (609)..(609)
<223> Asn or Asp
<400> 1
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Xaa Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Asn Thr Met Xaa Ala Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Xaa Ser Thr Asn Asp Asn Thr
260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Xaa Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Xaa Phe Ser Tyr Thr Phe
405 410 415
Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg
435 440 445
Thr Gln Thr Thr Ser Gly Thr Ala Gly Asn Arg Xaa Leu Gln Phe Ser
450 455 460
Gln Ala Gly Pro Ser Ser Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Xaa Asn Gln Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Thr His Lys
515 520 525
Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Gln Gly Ala Gly Asn Ser Asn Val Asp Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Xaa Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Xaa
565 570 575
Tyr Gly Thr Val Ala Thr Asn Leu Gln Ser Xaa Asn Thr Ala Pro Ala
580 585 590
Thr Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Xaa Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Asn Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asp Thr Asn Gly Val
705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 2
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 2
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr
260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe
405 410 415
Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg
435 440 445
Thr Gln Thr Thr Ser Gly Thr Ala Gly Asn Arg Thr Leu Gln Phe Ser
450 455 460
Gln Ala Gly Pro Ser Ser Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Thr Asn Gln Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Thr His Lys
515 520 525
Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Gln Gly Ala Gly Asn Ser Asn Val Asp Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Glu
565 570 575
Tyr Gly Thr Val Ala Thr Asn Leu Gln Ser Ala Asn Thr Ala Pro Ala
580 585 590
Thr Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
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Tyr Asn Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asp Thr Asn Gly Val
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Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
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<210> 3
<211> 7064
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 3
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180
aggaagatcg gaattcgccc ttaagctagc tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 240
attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 300
tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 360
aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 420
cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 480
taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 540
gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa 600
tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa 660
tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc 720
cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctgg 780
tttagtgaac cgtcagatcc tgcagaagtt ggtcgtgagg cactgggcag gtaagtatca 840
aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga cagagaagac 900
tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc tttctctcca 960
caggtgtcca ggcggccgcg gatgccaccc aaaaaagtgc aaatccaagt ggaggagaaa 1020
gaagaggata cagaggaaag ctcaagtgaa gaagaagaag ataagctacc cagaagagag 1080
agcttgagac caaagaggaa acggaccaga gatgtcatca atgaggatga cccagaaccg 1140
gagccggagg atgaagaaac aagaaaggca agagaaaaag aaaggcggag gaggctgcgg 1200
agaggagcgg aagaagaaga agaaattgat gaagaggaat tagaacggtt aaaagcactg 1260
ctcgatgaga atagacaaat gatcgctact gtcaaatgta aaccttggaa aatggagaag 1320
aaaattgaag ttctcaagga agcaaagaaa tttgtgagtg agaatgaagg cgctcttggg 1380
aaaggaaagg gaaagaagtg gtttgcattt aagatgatga tggccaagaa atgggcaaaa 1440
ttcctccgag attttgagaa cttcaaagcg gcttgcgtcc catgggaaaa caaaatcaag 1500
gcaattgaaa gtcagtttgg ttcctcagtg gcctcgtact tcctgttcct caggtggatg 1560
tacggcgtca acatggttct ctttgtgttg accttcagcc tcatcatgtt accggagtac 1620
ctctggggtt taccgtacgg cagcttacct aggaaaacag tcccaagagc tgaagaagca 1680
tctgcagcca actttggtgt gttgtatgac ttcaatggcc tggcgcagta ctctgtcctc 1740
ttttatggct attacgacaa taaacgcacg atcggatggc tgaatttccg gctacctctt 1800
tcctacttcc tggtggggat tatgtgcatt ggatacagct tcctggttgt cctcaaagcg 1860
atgaccaaaa atattggtga cgatggtggt ggcgatgaca acactttcaa cttcagctgg 1920
aaggtgttct gtagctggga ctatctgatt ggtaaccctg aaacagccga caacaagttt 1980
aactctatca cgatgaactt taaggaagcc atcatagaag agagagccgc acaggtggag 2040
gagaacatcc acctcatcag atttctgagg tttctcgcta acttcttcgt gttcctcaca 2100
cttggtgcaa gtggatacct catcttttgg gctgtgaagc gatcccagga gttcgcccag 2160
caagatcctg acacccttgg gtggtgggaa aaaaatgaaa tgaacatggt aatgtccctc 2220
ctggggatgt tctgtcccac cctgtttgac ttatttgctg aactggaaga ttaccatcct 2280
ctcattgctc tgaagtggct cctggggcgc atttttgctc ttcttctagg caacttgtat 2340
gtattcattc tcgccttgat ggatgagatt aacaacaaga ttgaagagga gaagcttgtg 2400
aaggccaata ttaccctgtg ggaagccaac atgattaagg cttacaatga atctctctct 2460
gggctctctg ggaacaccac aggagcaccc tttttcgttc atcctgcaga tgtccctcgc 2520
ggtccctgct gggaaacaat ggtggggcag gaattcgtgc gtctcaccgt ttctgacgtc 2580
ctgaccactt acgtcacgat cctcattggc gacttcctca gagcatgttt cgtgaggttc 2640
tgcaattact gctggtgctg ggacttagaa tatggatatc cttcatacac agaattcgac 2700
atcagtggca acgtcctcgc tctgatcttc aaccaaggca tgatctggat gggctccttc 2760
ttcgctccta gcctcccggg catcaacatc ctccgtctcc acacatccat gtatttccag 2820
tgctgggctg tgatgtgctg caatgttccc gaggccaggg tgttcaaagc ttccagatcc 2880
aacaacttct acctcggcat gctgctactc atcctcttcc tgtccaccat gccggtcctg 2940
tacatgatcg tctccctccc gccatctttt gattgtgggc ccttcagtgg taaaaacagg 3000
atgtttgaag tcatcggtga gaccctggaa catgacttcc caagctggat ggcgaagatc 3060
ctgaggcagc tttctaaccc cggccttgtc attgctgtca ttctggtgat ggttctgacc 3120
atctattatc tcaatgctac tgccaagggc cagaaagcag cgaatctgga cctcaaaaag 3180
aagatgaaac agcaagcttt ggagaacaaa atgcgaaaca agaaaatggc agcggctcga 3240
gcagctgcag ctgctggtgg ccagtaagga tccaatcaac ctctggatta caaaatttgt 3300
gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct 3360
ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat 3420
aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg 3480
gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag 3540
ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc 3600
tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg 3660
tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc 3720
gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc 3780
ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgagatc tgcctcgact gtgccttcta 3840
gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 3900
ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 3960
attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 4020
gcaggcatgc tggggactcg agttaagggc gaattcccga taaggatctt cctagagcat 4080
ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta atcattaact acaaggaacc cctagtgatg 4140
gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc 4200
gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagccttaat 4260
taacctaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 4320
caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 4380
cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggga cgcgccctgt 4440
agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc 4500
agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc 4560
tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg 4620
cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga 4680
tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc 4740
caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg 4800
ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt 4860
aacaaaatat taacgtttat aatttcaggt ggcatctttc ggggaaatgt gcgcggaacc 4920
cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 4980
tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 5040
gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 5100
gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 5160
ctcaatagtg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 5220
acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 5280
ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 5340
aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 5400
gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 5460
tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 5520
gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagtaatggt aacaacgttg 5580
cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg 5640
atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt 5700
attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg 5760
ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg 5820
gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg 5880
tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 5940
aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 6000
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tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 6120
ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 6180
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gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 6300
aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 6360
ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 6420
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cggttcctgg ccttttgctg cggttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 6720
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ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 7020
acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc agatttaatt aagg 7064
<210> 4
<211> 7052
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 4
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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polynucleotide
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caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg 6300
ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac 6360
cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 6420
taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 6480
agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 6540
cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg 6600
caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 6660
taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 6720
ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 6780
cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 6840
aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 6900
attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 6960
tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 7020
aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 7080
gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 7140
cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 7200
gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 7260
agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 7320
ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 7380
cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 7440
acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 7500
gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 7560
ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 7620
agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 7680
cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgt 7728
<210> 8
<211> 7380
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 8
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtgcaag aaccctcact ggctgaacta 180
tcttgccagc cccttatttt gttttcatat taacctcttt tttctagtaa aggagatgtt 240
tgctctcaaa tttgcatagg aatgtaatat ttaatttaaa aagatgaccc acatatgacc 300
ttataaggac agtaaaatta aacaaccgga aagataaagc gggccagttg gctcagttct 360
ataaaaccag cccacaagga ttgtcactat tcttaggctt gcgcgggcta catgatgagt 420
tccaggactg cctggttaca gaccgagact ctctcaagag tccagataaa caacaacaaa 480
gggggcgagg tggaaataca ggggctgtaa gaagtaaata tgatatctgc atgggaggct 540
agccagagaa gaaaaaattt tcttccgtgg ttcaatcctc caagggctga acaggaagtt 600
gacgcaggca ggtgaggagc acgagcctag atgggctgcg gtgccaccct taatccccac 660
aagcgagttc ctccgcaatt cgcctgtccc actctcaact tttcttcaac tgactctttg 720
ctgtggtccc tcgctgtggc agtggaaaca actaccactg cgaggtaggg aatgtcatga 780
ggggctacct gcagcccttg gcttgcaggg atgcagggat gcggtcggaa cctgaggccc 840
cgcccttctc ttgccccacg ccattaggcc acgcccctac ccagcactcc ttcaaccacc 900
cccttccccg gcgcctcatg aggtcccgcc cctctcaacc ctagctcttg aggcctcccc 960
ttcacagccg ccccggcgtt ccttgacttg aggccacgtc cctctgctcc ttcattccca 1020
agaccctacg ctttgcgagt cctccctgtc ctgctgccta ggaccccgcc cctctcagcc 1080
cttctgcccc aagaccccgc cccttaggct gttcccgccc actggccaat gaagacccgc 1140
cctttcttta gccgccccgc cccggtccca caaaatcccg cctccggccc cgcctcccgc 1200
ccccttgggc gctccgtagc agtgacgtgc gcaggctggg cactctgcag ggctctctgg 1260
ccggcgggtg gagaccgatc cgggatctgt cccagcagga agcgtatccc ggccgccgtc 1320
gtgctgtcgt ctccggtgct cgctctcggc cgcggtgtcg cgcttgccct tcgcgcccgc 1380
agcccggcag cctctcgagc tcaagcttcg aattcgtcga caggatgagc ccccagttaa 1440
agagcttgga cgaggaaggt gacaagtcag caagaagacc cacaaggaaa caaacctcca 1500
gagctgcatg tccccaagac gggcaccgag cccaatctag ccggaaggat cctgctaagg 1560
gtagcccaag accagggtct tcccggaaga aacagatgga acatggaagc tatcacaagg 1620
ggttgcaggg acagaaacca cgaaaggtgg agaggtctct acaagggagg aagaaggatc 1680
ggagaacttc ccttaaggag cagagagcat ctccaaagaa ggagagggag gctctgagga 1740
aggaggcagg caagcagctg agaaaaccca ggtccacttc cttgggctcc agtgtctcta 1800
ctggagactc cctgtctgag gaggagctgg ctcagatcct ggaacaggta gaagaaaaaa 1860
agaagctcat cactaccgtg aggaacaaac cctggcccat ggcaaagaag ctgagggaac 1920
tcagggaagc ccaagccttt gtggagaagt atgaaggagc cttggggaaa ggcaagggca 1980
aacacctcta cgcctacagg atgatgatgg ctaagaaatg ggtcaagttt aagagggact 2040
ttgataattt caagactcaa tgtattccct gggaaatgaa gatcaaggac attgaaagtc 2100
acttcggttc ttctgtggca tcttacttca tctttctccg atggatgtat ggagttaacc 2160
ttgtcctttt tggcttaata tttggtctag tcatcatccc agaggtgctg atgggcatgc 2220
cctatggaag tatacccaga aagacggtgc ctcgggctga ggaagagcga gccatggact 2280
tctctgtcct ttgggatttt gagggctaca tcaaatattc tgctctcttc tatggctact 2340
acaacaacca gcggaccatt ggatggctga ggtacaggct gcccatggct tactttatgg 2400
tgggggtcag cgtgtttggc tacagcttga tgatcgtcat taggtcgatg gccagcaata 2460
cccagggtag caccagtgag ggggacagtg acagcttcac gttcagcttc aagatgttca 2520
ccagctggga ctacctcatc gggaattcag agacagcaga caacaaatat gtctccatca 2580
ctaccagctt caaggagtct atagtggacg aacaagagag taacaaagaa gggaatatcc 2640
acctgacaag attcctccgc gtcctggcca actttctcat tctctgctgt ctgtgtggaa 2700
gcgggtacct catttacttt gtggtgaaac ggtcccagga gttctccaaa atgcaaaatg 2760
tcagctggta tgaaaggaat gaggtggaga tcgtgatgtc tctgctaggg atgttttgtc 2820
cccctctgtt tgaaaccatc gctgccttgg agaattatca cccacgaact gggctgaagt 2880
ggcagctggg ccgcatcttt gcccttttcc tgggaaacct ctacacgttt ctcctggccc 2940
tcatggacga tgtccacctt aagctttcta atgaggaaaa aatcaagaac atcactcact 3000
ggaccctgtt taactattac aattcctcag gtgggaatga gagtgtgccc cggccaccac 3060
cacaccctgc agatgtgccc agaggttctt gctgggagac agctgtgggc attgagttta 3120
tgaggctcac cgtgtctgac atgctggtaa catacctcac catcttggtc ggagatttcc 3180
tccgagcttg ttttgtccgg ttcatgaatc actgctggtg ttgggacctc gaggctggtt 3240
ttccctcata tgccgagttt gatattagtg gaaatgtgtt gggtttgatc ttcaaccaag 3300
gaatgatctg gatgggctcc ttctatgctc caggactggt gggcatcaat gtcctgcgcc 3360
tgttgacctc catgtacttc cagtgctggg cagtgatgag cagcaacgtt ccccatgagc 3420
gtgtgtttaa agcctcccga tccaacaact tctacatggg cctgctgctg ttggtgctct 3480
tcctcagcct cctgcctgtg gcctacactg tcatgtctct cccaccctcg tttgactgtg 3540
gccccttcag tgggaaaaac agaatgtacg atgtcctcca tgagaccatc gagaacgatt 3600
tccctaagtt cctgggcaag atctttgcgt tccttgccaa cccaggcctg atcattccag 3660
ccatcctgct aatgtttctg gccatttact acctgaactc agtttcaaaa agtctttcca 3720
gagctaatgc ccagctgcga aagaagatcc aagcgctccg tgaagttgag aagaaccata 3780
aatccatcaa gggaaaagcc atagtcacat attcagagga cacaatcaag aacagctcca 3840
aaaatgccac ccagatacat cttactaaag aagagcccac atctcactct tccagccaaa 3900
tccagaccct ggacaagaaa gcgcagggcc cccacacctc cagtactgag ggtggggcct 3960
cgccgtctac ctcctggcac catgttgggt ctcaaccacc gagaggcaga cgagattctg 4020
gccaacccca gtctcagact tatacaggca ggtcaccttc tggaaagaga acccagaggc 4080
ctcacaactg agcggccgct cgagcctaag cttctagaag atctacgggt ggcatccctg 4140
tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct 4200
tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat 4260
ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg 4320
cggggtctat tgggaaccaa gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc 4380
cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc 4440
atgcatgacc aggctcagct aatttttgtt tttttggtag agacggggtt tcaccatatt 4500
ggccaggctg gtctccaact cctaatctca ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt 4560
gctgggatta caggcgtgaa ccactgctcc cttccctgtc cttctgattt tgtaggtaac 4620
cacgtgcgga ccgagcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg 4680
cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc 4740
cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat 4800
tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg 4860
cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 4920
cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 4980
tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 5040
ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat 5100
cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 5160
tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggg ctattctttt gatttataag 5220
ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 5280
cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa ttttatggtg cactctcagt acaatctgct 5340
ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac 5400
gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca 5460
tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac 5520
gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt 5580
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 5640
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 5700
tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 5760
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 5820
gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 5880
aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 5940
gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 6000
ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 6060
gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 6120
gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 6180
atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 6240
ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 6300
cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 6360
cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 6420
gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 6480
cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 6540
cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 6600
taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 6660
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 6720
aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 6780
caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 6840
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 6900
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 6960
cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 7020
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 7080
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 7140
ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 7200
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 7260
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 7320
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 7380
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 9
catctgcagc caactttggt gtgt 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 10
agaggtagcc ggaaattcag ccat 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 11
tgagcgcaag tactctgtgt ggat 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 12
actcatcgta ctcctgcttg ctga 24
<210> 13
<211> 734
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr
245 250 255
Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435 440 445
Gln Thr Thr Ser Gly Thr Ala Gly Asn Arg Thr Leu Gln Phe Ser Gln
450 455 460
Ala Gly Pro Ser Ser Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Thr Asn Gln Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Thr His Lys Asp
515 520 525
Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Gly Ala Gly Asn Ser Asn Val Asp Leu Asp Asn Val Met Ile Thr
545 550 555 560
Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Glu Tyr
565 570 575
Gly Thr Val Ala Thr Asn Leu Gln Ser Ala Asn Thr Ala Pro Ala Thr
580 585 590
Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
610 615 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625 630 635 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645 650 655
Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Glu Leu Gln Lys Glu
675 680 685
Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn
690 695 700
Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser
705 710 715 720
Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730
<210> 14
<211> 760
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Ser Pro Lys Lys Val Gln Ile Lys Val Glu Glu Lys Glu Asp Glu
1 5 10 15
Thr Glu Glu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Asp Lys Leu
20 25 30
Pro Arg Arg Glu Ser Leu Arg Pro Lys Arg Lys Arg Thr Arg Asp Val
35 40 45
Ile Asn Glu Asp Asp Pro Glu Pro Glu Pro Glu Asp Glu Glu Thr Arg
50 55 60
Lys Ala Arg Glu Lys Glu Arg Arg Arg Arg Leu Lys Arg Gly Ala Glu
65 70 75 80
Glu Glu Glu Ile Asp Glu Glu Glu Leu Glu Arg Leu Lys Ala Glu Leu
85 90 95
Asp Glu Lys Arg Gln Ile Ile Ala Thr Val Lys Cys Lys Pro Trp Lys
100 105 110
Met Glu Lys Lys Ile Glu Val Leu Lys Glu Ala Lys Lys Phe Val Ser
115 120 125
Glu Asn Glu Gly Ala Leu Gly Lys Gly Lys Gly Lys Arg Trp Phe Ala
130 135 140
Phe Lys Met Met Met Ala Lys Lys Trp Ala Lys Phe Leu Arg Asp Phe
145 150 155 160
Glu Asn Phe Lys Ala Ala Cys Val Pro Trp Glu Asn Lys Ile Lys Ala
165 170 175
Ile Glu Ser Gln Phe Gly Ser Ser Val Ala Ser Tyr Phe Leu Phe Leu
180 185 190
Arg Trp Met Tyr Gly Val Asn Met Val Leu Phe Ile Leu Thr Phe Ser
195 200 205
Leu Ile Met Leu Pro Glu Tyr Leu Trp Gly Leu Pro Tyr Gly Ser Leu
210 215 220
Pro Arg Lys Thr Val Pro Arg Ala Glu Glu Ala Ser Ala Ala Asn Phe
225 230 235 240
Gly Val Leu Tyr Asp Phe Asn Gly Leu Ala Gln Tyr Ser Val Leu Phe
245 250 255
Tyr Gly Tyr Tyr Asp Asn Lys Arg Thr Ile Gly Trp Met Asn Phe Arg
260 265 270
Leu Pro Leu Ser Tyr Phe Leu Val Gly Ile Met Cys Ile Gly Tyr Ser
275 280 285
Phe Leu Val Val Leu Lys Ala Met Thr Lys Asn Ile Gly Asp Asp Gly
290 295 300
Gly Gly Asp Asp Asn Thr Phe Asn Phe Ser Trp Lys Val Phe Thr Ser
305 310 315 320
Trp Asp Tyr Leu Ile Gly Asn Pro Glu Thr Ala Asp Asn Lys Phe Asn
325 330 335
Ser Ile Thr Met Asn Phe Lys Glu Ala Ile Thr Glu Glu Lys Ala Ala
340 345 350
Gln Val Glu Glu Asn Val His Leu Ile Arg Phe Leu Arg Phe Leu Ala
355 360 365
Asn Phe Phe Val Phe Leu Thr Leu Gly Gly Ser Gly Tyr Leu Ile Phe
370 375 380
Trp Ala Val Lys Arg Ser Gln Glu Phe Ala Gln Gln Asp Pro Asp Thr
385 390 395 400
Leu Gly Trp Trp Glu Lys Asn Glu Met Asn Met Val Met Ser Leu Leu
405 410 415
Gly Met Phe Cys Pro Thr Leu Phe Asp Leu Phe Ala Glu Leu Glu Asp
420 425 430
Tyr His Pro Leu Ile Ala Leu Lys Trp Leu Leu Gly Arg Ile Phe Ala
435 440 445
Leu Leu Leu Gly Asn Leu Tyr Val Phe Ile Leu Ala Leu Met Asp Glu
450 455 460
Ile Asn Asn Lys Ile Glu Glu Glu Lys Leu Val Lys Ala Asn Ile Thr
465 470 475 480
Leu Trp Glu Ala Asn Met Ile Lys Ala Tyr Asn Ala Ser Phe Ser Glu
485 490 495
Asn Ser Thr Gly Pro Pro Phe Phe Val His Pro Ala Asp Val Pro Arg
500 505 510
Gly Pro Cys Trp Glu Thr Met Val Gly Gln Glu Phe Val Arg Leu Thr
515 520 525
Val Ser Asp Val Leu Thr Thr Tyr Val Thr Ile Leu Ile Gly Asp Phe
530 535 540
Leu Arg Ala Cys Phe Val Arg Phe Cys Asn Tyr Cys Trp Cys Trp Asp
545 550 555 560
Leu Glu Tyr Gly Tyr Pro Ser Tyr Thr Glu Phe Asp Ile Ser Gly Asn
565 570 575
Val Leu Ala Leu Ile Phe Asn Gln Gly Met Ile Trp Met Gly Ser Phe
580 585 590
Phe Ala Pro Ser Leu Pro Gly Ile Asn Ile Leu Arg Leu His Thr Ser
595 600 605
Met Tyr Phe Gln Cys Trp Ala Val Met Cys Cys Asn Val Pro Glu Ala
610 615 620
Arg Val Phe Lys Ala Ser Arg Ser Asn Asn Phe Tyr Leu Gly Met Leu
625 630 635 640
Leu Leu Ile Leu Phe Leu Ser Thr Met Pro Val Leu Tyr Met Ile Val
645 650 655
Ser Leu Pro Pro Ser Phe Asp Cys Gly Pro Phe Ser Gly Lys Asn Arg
660 665 670
Met Phe Glu Val Ile Gly Glu Thr Leu Glu His Asp Phe Pro Ser Trp
675 680 685
Met Ala Lys Ile Leu Arg Gln Leu Ser Asn Pro Gly Leu Val Ile Ala
690 695 700
Val Ile Leu Val Met Val Leu Ala Ile Tyr Tyr Leu Asn Ala Thr Ala
705 710 715 720
Lys Gly Gln Lys Ala Ala Asn Leu Asp Leu Lys Lys Lys Met Lys Met
725 730 735
Gln Ala Leu Glu Asn Lys Met Arg Asn Lys Lys Met Ala Ala Ala Arg
740 745 750
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gln
755 760
<210> 15
<211> 3201
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
cagaaactat gagggcagaa cccagcaatc tgtgctttct ttcacaagcc ctccaggagt 60
tgctgaaatt taggaatcat tgccccaaaa agtggccctc ataatgatgc cagatgggat 120
cttactctgt tgcccaggct ggagtgcagt ggtgcgatct cggctctctg caacctccgc 180
ctcccaggtt caagtgattc tcctgcctcg gcctcctgag tagctgggat ttcaggccat 240
gaaagatcac tgttttagtc tgcgtggtgc agtggaacag atagacctcg gtttgaatct 300
cagctctact gtttactaga catgaaatgg ggaaatctaa aatgagatgc cagaagcctc 360
aaaaatggaa aaccccctgt gcttcacatc tgaaaatctc tgctgggggc agcaactttg 420
agcctgtggg gaaggaactg tccacgtgga gtggtctggt gaatgcttaa ggagctgcag 480
aagggaagtc cctctccaaa ctagccagcc actgagacct tctgacagga cacccccagg 540
atgtcaccca aaaaagtaca aatcaaagtg gaggaaaaag aagacgagac tgaggaaagc 600
tcaagtgaag aggaagagga ggtggaagat aagctacctc gaagagagag cttgagacca 660
aagaggaaac ggaccagaga tgttatcaat gaggatgacc cagaacctga accagaggat 720
gaagaaacaa ggaaggcaag agaaaaagag aggaggagga ggctaaagag aggagcagaa 780
gaagaagaaa ttgatgaaga ggaattggaa agattgaagg cagagttaga tgagaaaaga 840
caaataattg ctactgtcaa atgcaaacca tggaagatgg agaagaaaat tgaagttctc 900
aaggaggcaa aaaaatttgt gagtgaaaat gaaggggctc ttgggaaagg aaaaggaaaa 960
cggtggtttg catttaagat gatgatggcc aagaaatggg caaaattcct ccgtgatttt 1020
gagaacttca aagctgcgtg tgtcccatgg gaaaataaaa tcaaggctat tgaaagtcag 1080
tttggctcct cagtggcctc atacttcctc ttcttgagat ggatgtatgg agtcaatatg 1140
gttctcttta tcctgacatt tagcctcatc atgttgccag agtacctctg gggtttgcca 1200
tatggcagtt tacctaggaa aaccgttccc agagccgaag aggcatcggc agcaaacttt 1260
ggtgtgttgt acgacttcaa tggtttggca caatattccg ttctctttta tggctattat 1320
gacaataaac gaacaattgg atggatgaat ttcaggttgc cgctctccta ttttctagtg 1380
gggattatgt gcattggata cagctttctg gttgtcctca aagcaatgac caaaaacatt 1440
ggtgatgatg gaggtggaga tgacaacact ttcaatttca gctggaaggt ctttaccagc 1500
tgggactacc tgatcggcaa tcctgaaaca gcagacaaca aatttaattc tatcacaatg 1560
aactttaagg aagctatcac agaagaaaaa gcagcccaag tagaagaaaa cgtccacttg 1620
atcagattcc tgaggtttct ggctaacttc ttcgtgtttc taacacttgg agggagtgga 1680
tacctcatct tttgggctgt gaagcgatcc caggaatttg cacagcaaga tcctgacacc 1740
cttgggtggt gggaaaaaaa tgaaatgaac atggttatgt ccctcctagg gatgttctgt 1800
ccaacattgt ttgacttatt tgctgaatta gaagactacc atcctctcat cgctttgaaa 1860
tggctactgg gacgcatttt tgctcttctt ttaggcaatt tatacgtatt tattcttgca 1920
ttaatggatg agattaacaa caagattgaa gaggagaagc tagtaaaggc caatattacc 1980
ctttgggaag ccaatatgat caaggcctac aatgcatcat tctctgaaaa tagcactgga 2040
ccaccctttt ttgttcaccc tgcagatgta cctcgaggac cttgctggga aacaatggtg 2100
ggacaggagt ttgtgaggct gacagtctct gatgttctga ccacctacgt cacaatcctc 2160
attggggact ttctaagggc atgttttgtg aggttttgca attattgctg gtgctgggac 2220
ttggagtatg gatatccttc atacaccgaa ttcgacatca gtggcaacgt cctcgctctg 2280
atcttcaacc aaggcatgat ctggatgggc tccttctttg ctcccagcct cccaggcatc 2340
aatatccttc gactccatac atccatgtac ttccagtgct gggccgttat gtgctgcaat 2400
gttcctgagg ccagggtctt caaagcttcc agatcaaata acttctacct gggcatgcta 2460
ctgctcatcc tcttcctgtc cacaatgcct gtcttgtaca tgatcgtgtc cctcccacca 2520
tcttttgatt gtggtccatt cagtggcaaa aatagaatgt ttgaagtcat tggagagacc 2580
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aatctaaact ttattccaag tcagaaactg tttctgcaga gccactctct cccctgctcc 3060
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attttatatg tttcttttgc c 3201
<210> 16
<211> 906
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Ser His Gln Val Lys Gly Leu Lys Glu Glu Ala Arg Gly Gly Val
1 5 10 15
Lys Gly Arg Val Lys Ser Gly Ser Pro His Thr Gly Asp Arg Leu Gly
20 25 30
Arg Arg Ser Ser Ser Lys Arg Ala Leu Lys Ala Glu Gly Thr Pro Gly
35 40 45
Arg Arg Gly Ala Gln Arg Ser Gln Lys Glu Arg Ala Gly Gly Ser Pro
50 55 60
Ser Pro Gly Ser Pro Arg Arg Lys Gln Thr Gly Arg Arg Arg His Arg
65 70 75 80
Glu Glu Leu Gly Glu Gln Glu Arg Gly Glu Ala Glu Arg Thr Cys Glu
85 90 95
Gly Arg Arg Lys Arg Asp Glu Arg Ala Ser Phe Gln Glu Arg Thr Ala
100 105 110
Ala Pro Lys Arg Glu Lys Glu Ile Pro Arg Arg Glu Glu Lys Ser Lys
115 120 125
Arg Gln Lys Lys Pro Arg Ser Ser Ser Leu Ala Ser Ser Ala Ser Gly
130 135 140
Gly Glu Ser Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ala Gln Ile Leu Glu Gln Val
145 150 155 160
Glu Glu Lys Lys Lys Leu Ile Ala Thr Met Arg Ser Lys Pro Trp Pro
165 170 175
Met Ala Lys Lys Leu Thr Glu Leu Arg Glu Ala Gln Glu Phe Val Glu
180 185 190
Lys Tyr Glu Gly Ala Leu Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gln Leu Tyr Ala
195 200 205
Tyr Lys Met Leu Met Ala Lys Lys Trp Val Lys Phe Lys Arg Asp Phe
210 215 220
Asp Asn Phe Lys Thr Gln Cys Ile Pro Trp Glu Met Lys Ile Lys Asp
225 230 235 240
Ile Glu Ser His Phe Gly Ser Ser Val Ala Ser Tyr Phe Ile Phe Leu
245 250 255
Arg Trp Met Tyr Gly Val Asn Leu Val Leu Phe Gly Leu Ile Phe Gly
260 265 270
Leu Val Ile Ile Pro Glu Val Leu Met Gly Met Pro Tyr Gly Ser Ile
275 280 285
Pro Arg Lys Thr Val Pro Arg Ala Glu Glu Glu Lys Ala Met Asp Phe
290 295 300
Ser Val Leu Trp Asp Phe Glu Gly Tyr Ile Lys Tyr Ser Ala Leu Phe
305 310 315 320
Tyr Gly Tyr Tyr Asn Asn Gln Arg Thr Ile Gly Trp Leu Arg Tyr Arg
325 330 335
Leu Pro Met Ala Tyr Phe Met Val Gly Val Ser Val Phe Gly Tyr Ser
340 345 350
Leu Ile Ile Val Ile Arg Ser Met Ala Ser Asn Thr Gln Gly Ser Thr
355 360 365
Gly Glu Gly Glu Ser Asp Asn Phe Thr Phe Ser Phe Lys Met Phe Thr
370 375 380
Ser Trp Asp Tyr Leu Ile Gly Asn Ser Glu Thr Ala Asp Asn Lys Tyr
385 390 395 400
Ala Ser Ile Thr Thr Ser Phe Lys Glu Ser Ile Val Asp Glu Gln Glu
405 410 415
Ser Asn Lys Glu Glu Asn Ile His Leu Thr Arg Phe Leu Arg Val Leu
420 425 430
Ala Asn Phe Leu Ile Ile Cys Cys Leu Cys Gly Ser Gly Tyr Leu Ile
435 440 445
Tyr Phe Val Val Lys Arg Ser Gln Gln Phe Ser Lys Met Gln Asn Val
450 455 460
Ser Trp Tyr Glu Arg Asn Glu Val Glu Ile Val Met Ser Leu Leu Gly
465 470 475 480
Met Phe Cys Pro Pro Leu Phe Glu Thr Ile Ala Ala Leu Glu Asn Tyr
485 490 495
His Pro Arg Thr Gly Leu Lys Trp Gln Leu Gly Arg Ile Phe Ala Leu
500 505 510
Phe Leu Gly Asn Leu Tyr Thr Phe Leu Leu Ala Leu Met Asp Asp Val
515 520 525
His Leu Lys Leu Ala Asn Glu Glu Thr Ile Lys Asn Ile Thr His Trp
530 535 540
Thr Leu Phe Asn Tyr Tyr Asn Ser Ser Gly Trp Asn Glu Ser Val Pro
545 550 555 560
Arg Pro Pro Leu His Pro Ala Asp Val Pro Arg Gly Ser Cys Trp Glu
565 570 575
Thr Ala Val Gly Ile Glu Phe Met Arg Leu Thr Val Ser Asp Met Leu
580 585 590
Val Thr Tyr Ile Thr Ile Leu Leu Gly Asp Phe Leu Arg Ala Cys Phe
595 600 605
Val Arg Phe Met Asn Tyr Cys Trp Cys Trp Asp Leu Glu Ala Gly Phe
610 615 620
Pro Ser Tyr Ala Glu Phe Asp Ile Ser Gly Asn Val Leu Gly Leu Ile
625 630 635 640
Phe Asn Gln Gly Met Ile Trp Met Gly Ser Phe Tyr Ala Pro Gly Leu
645 650 655
Val Gly Ile Asn Val Leu Arg Leu Leu Thr Ser Met Tyr Phe Gln Cys
660 665 670
Trp Ala Val Met Ser Ser Asn Val Pro His Glu Arg Val Phe Lys Ala
675 680 685
Ser Arg Ser Asn Asn Phe Tyr Met Gly Leu Leu Leu Leu Val Leu Phe
690 695 700
Leu Ser Leu Leu Pro Val Ala Tyr Thr Ile Met Ser Leu Pro Pro Ser
705 710 715 720
Phe Asp Cys Gly Pro Phe Ser Gly Lys Asn Arg Met Tyr Asp Val Leu
725 730 735
Gln Glu Thr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Thr Phe Leu Gly Lys Ile Phe
740 745 750
Ala Phe Leu Ala Asn Pro Gly Leu Ile Ile Pro Ala Ile Leu Leu Met
755 760 765
Phe Leu Ala Ile Tyr Tyr Leu Asn Ser Val Ser Lys Ser Leu Ser Arg
770 775 780
Ala Asn Ala Gln Leu Arg Lys Lys Ile Gln Val Leu Arg Glu Val Glu
785 790 795 800
Lys Ser His Lys Ser Val Lys Gly Lys Ala Thr Ala Arg Asp Ser Glu
805 810 815
Asp Thr Pro Lys Ser Ser Ser Lys Asn Ala Thr Gln Leu Gln Leu Thr
820 825 830
Lys Glu Glu Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Gln Ser Gln Ala Met Asp
835 840 845
Lys Lys Ala Gln Gly Pro Gly Thr Ser Asn Ser Ala Ser Arg Thr Thr
850 855 860
Leu Pro Ala Ser Gly His Leu Pro Ile Ser Arg Pro Pro Gly Ile Gly
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Pro Asp Ser Gly His Ala Pro Ser Gln Thr His Pro Trp Arg Ser Ala
885 890 895
Ser Gly Lys Ser Ala Gln Arg Pro Pro His
900 905
<210> 17
<211> 552
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met Asp Arg Lys Val Ala Arg Glu Phe Arg His Lys Val Asp Phe Leu
1 5 10 15
Ile Glu Asn Asp Ala Glu Lys Asp Tyr Leu Tyr Asp Val Leu Arg Met
20 25 30
Tyr His Gln Thr Met Asp Val Ala Val Leu Val Gly Asp Leu Lys Leu
35 40 45
Val Ile Asn Glu Pro Ser Arg Leu Pro Leu Phe Asp Ala Ile Arg Pro
50 55 60
Leu Ile Pro Leu Lys His Gln Val Glu Tyr Asp Gln Leu Thr Pro Arg
65 70 75 80
Arg Ser Arg Lys Leu Lys Glu Val Arg Leu Asp Arg Leu His Pro Glu
85 90 95
Gly Leu Gly Leu Ser Val Arg Gly Gly Leu Glu Phe Gly Cys Gly Leu
100 105 110
Phe Ile Ser His Leu Ile Lys Gly Gly Gln Ala Asp Ser Val Gly Leu
115 120 125
Gln Val Gly Asp Glu Ile Val Arg Ile Asn Gly Tyr Ser Ile Ser Ser
130 135 140
Cys Thr His Glu Glu Val Ile Asn Leu Ile Arg Thr Lys Lys Thr Val
145 150 155 160
Ser Ile Lys Val Arg His Ile Gly Leu Ile Pro Val Lys Ser Ser Pro
165 170 175
Asp Glu Pro Leu Thr Trp Gln Tyr Val Asp Gln Phe Val Ser Glu Ser
180 185 190
Gly Gly Val Arg Gly Ser Leu Gly Ser Pro Gly Asn Arg Glu Asn Lys
195 200 205
Glu Lys Lys Val Phe Ile Ser Leu Val Gly Ser Arg Gly Leu Gly Cys
210 215 220
Ser Ile Ser Ser Gly Pro Ile Gln Lys Pro Gly Ile Phe Ile Ser His
225 230 235 240
Val Lys Pro Gly Ser Leu Ser Ala Glu Val Gly Leu Glu Ile Gly Asp
245 250 255
Gln Ile Val Glu Val Asn Gly Val Asp Phe Ser Asn Leu Asp His Lys
260 265 270
Glu Ala Val Asn Val Leu Lys Ser Ser Arg Ser Leu Thr Ile Ser Ile
275 280 285
Val Ala Ala Ala Gly Arg Glu Leu Phe Met Thr Asp Arg Glu Arg Leu
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Ala Glu Ala Arg Gln Arg Glu Leu Gln Arg Gln Glu Leu Leu Met Gln
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Lys Arg Leu Ala Met Glu Ser Asn Lys Ile Leu Gln Glu Gln Gln Glu
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Met Glu Arg Gln Arg Arg Lys Glu Ile Ala Gln Lys Ala Ala Glu Glu
340 345 350
Asn Glu Arg Tyr Arg Lys Glu Met Glu Gln Ile Val Glu Glu Glu Glu
355 360 365
Lys Phe Lys Lys Gln Trp Glu Glu Asp Trp Gly Ser Lys Glu Gln Leu
370 375 380
Leu Leu Pro Lys Thr Ile Thr Ala Glu Val His Pro Val Pro Leu Arg
385 390 395 400
Lys Pro Lys Tyr Asp Gln Gly Val Glu Pro Glu Leu Glu Pro Ala Asp
405 410 415
Asp Leu Asp Gly Gly Thr Glu Glu Gln Gly Glu Gln Asp Phe Arg Lys
420 425 430
Tyr Glu Glu Gly Phe Asp Pro Tyr Ser Met Phe Thr Pro Glu Gln Ile
435 440 445
Met Gly Lys Asp Val Arg Leu Leu Arg Ile Lys Lys Glu Gly Ser Leu
450 455 460
Asp Leu Ala Leu Glu Gly Gly Val Asp Ser Pro Ile Gly Lys Val Val
465 470 475 480
Val Ser Ala Val Tyr Glu Arg Gly Ala Ala Glu Arg His Gly Gly Ile
485 490 495
Val Lys Gly Asp Glu Ile Met Ala Ile Asn Gly Lys Ile Val Thr Asp
500 505 510
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<210> 18
<211> 2237
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
agctccgagg gcggctggcc cggtcgcggt cgcggctctt tccagctcct ggcagccggg 60
cacccgaagg aacgggtcgt gcaacgacgc agctggacct ggcccagcca tggaccgaaa 120
agtggcccga gaattccggc ataaggtgga ttttctgatt gaaaatgatg cagagaagga 180
ctatctctat gatgtgctgc gaatgtacca ccagaccatg gacgtggccg tgctcgtggg 240
agacctgaag ctggtcatca atgaacccag ccgtctgcct ctgtttgatg ccattcggcc 300
gctgatccca ctgaagcacc aggtggaata tgatcagctg accccccggc gctccaggaa 360
gctgaaggag gtgcgtctgg accgtctgca ccccgaaggc ctcggcctga gtgtgcgtgg 420
tggcctggag tttggctgtg ggctcttcat ctcccacctc atcaaaggcg gtcaggcaga 480
cagcgtcggg ctccaggtag gggacgagat cgtccggatc aatggatatt ccatctcctc 540
ctgtacccat gaggaggtca tcaacctcat tcgaaccaag aaaactgtgt ccatcaaagt 600
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tgtggatcag tttgtgtcgg aatctggggg cgtgcgaggc agcctgggct cccctggaaa 720
tcgggaaaac aaggagaaga aggtcttcat cagcctggta ggctcccgag gccttggctg 780
cagcatttcc agcggcccca tccagaagcc tggcatcttt atcagccatg tgaaacctgg 840
ctccctgtct gctgaggtgg gattggagat aggggaccag attgtcgaag tcaatggcgt 900
cgacttctct aacctggatc acaaggaggc tgtaaatgtg ctgaagagta gccgcagcct 960
gaccatctcc attgtagctg cagctggccg ggagctgttc atgacagacc gggagcggct 1020
ggcagaggcg cggcagcgtg agctgcagcg gcaggagctt ctcatgcaga agcggctggc 1080
gatggagtcc aacaagatcc tccaggagca gcaggagatg gagcggcaaa ggagaaaaga 1140
aattgcccag aaggcagcag aggaaaatga gagataccgg aaggagatgg aacagattgt 1200
agaggaggaa gagaagttta agaagcaatg ggaagaagac tggggctcaa aggaacagct 1260
actcttgcct aaaaccatca ctgctgaggt acacccagta ccccttcgca agccaaagta 1320
tgatcaggga gtggaacctg agctcgagcc cgcagatgac ctggatggag gcacggagga 1380
gcagggagag caggatttcc ggaaatatga ggaaggcttt gacccctact ctatgttcac 1440
cccagagcag atcatgggga aggatgtccg gctcctacgc atcaagaagg agggatcctt 1500
agacctggcc ctggaaggcg gtgtggactc ccccattggg aaggtggtcg tttctgctgt 1560
gtatgagcgg ggagctgctg agcggcatgg tggcattgtg aaaggggacg agatcatggc 1620
aatcaacggc aagattgtga cagactacac cctggctgag gctgaggctg ccctgcagaa 1680
ggcctggaat cagggcgggg actggatcga ccttgtggtt gccgtctgcc ccccaaagga 1740
gtatgacgat gagctgacct tcttctgaag tccaaaaggg gaaaccaaat tcaccgttag 1800
gaaacagtga gctccggccc cacctcgtga acacaaagcc tcggatcagc cttgagagag 1860
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aactcccttt ggccctgaac cagggccaga taaggaacag ctcgggccac tcttctgaag 1980
gccaacgtgg aggaaaggga gcagccagcc atttgggaga agatctcaag gatccagact 2040
ctcattcctt tcctctggcc cagtgaattt ggtctctccc agctctgggg gactccttcc 2100
ttgaacccta ataagacccc actggagtct ctctctctcc atccctctcc tctgccctct 2160
gctctaattg ctgccaggat tgtcactcca aaccttactc tgagctcatt aataaaatag 2220
atttattttc cagctta 2237
<210> 19
<211> 2385
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
agctccgagg gcggctggcc cggtcgcggt cgcggctctt tccagctcct ggcagccggg 60
cacccgaagg aacgggtcgt gcaacgacgc agctggacct ggcccagcca tggaccgaaa 120
agtggcccga gaattccggc ataaggtgga ttttctgatt gaaaatgatg cagagaagga 180
ctatctctat gatgtgctgc gaatgtacca ccagaccatg gacgtggccg tgctcgtggg 240
agacctgaag ctggtcatca atgaacccag ccgtctgcct ctgtttgatg ccattcggcc 300
gctgatccca ctgaagcacc aggtggaata tgatcagctg accccccggc gctccaggaa 360
gctgaaggag gtgcgtctgg accgtctgca ccccgaaggc ctcggcctga gtgtgcgtgg 420
tggcctggag tttggctgtg ggctcttcat ctcccacctc atcaaaggcg gtcaggcaga 480
cagcgtcggg ctccaggtag gggacgagat cgtccggatc aatggatatt ccatctcctc 540
ctgtacccat gaggaggtca tcaacctcat tcgaaccaag aaaactgtgt ccatcaaagt 600
gagacacatc ggcctgatcc ccgtgaaaag ctctcctgat gagcccctca cttggcagta 660
tgtggatcag tttgtgtcgg aatctggggg cgtgcgaggc agcctgggct cccctggaaa 720
tcgggaaaac aaggagaaga aggtcttcat cagcctggta ggctcccgag gccttggctg 780
cagcatttcc agcggcccca tccagaagcc tggcatcttt atcagccatg tgaaacctgg 840
ctccctgtct gctgaggtgg gattggagat aggggaccag attgtcgaag tcaatggcgt 900
cgacttctct aacctggatc acaaggaggc tgtaaatgtg ctgaagagta gccgcagcct 960
gaccatctcc attgtagctg cagctggccg ggagctgttc atgacagacc gggagcggct 1020
ggcagaggcg cggcagcgtg agctgcagcg gcaggagctt ctcatgcaga agcggctggc 1080
gatggagtcc aacaagatcc tccaggagca gcaggagatg gagcggcaaa ggagaaaaga 1140
aattgcccag aaggcagcag aggaaaatga gagataccgg aaggagatgg aacagattgt 1200
agaggaggaa gagaagttta agaagcaatg ggaagaagac tggggctcaa aggaacagct 1260
actcttgcct aaaaccatca ctgctgaggt acacccagta ccccttcgca agccaaagta 1320
tgatcaggga gtggaacctg agctcgagcc cgcagatgac ctggatggag gcacggagga 1380
gcagggagag cagaaaggaa aagataagaa gaaagccaag tatggcagcc tgcaggactt 1440
gagaaagaat aagaaagaac tggagtttga gcaaaagctt tacaaagaga aagaggaaat 1500
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tggtggcatt gtgaaagggg acgagatcat ggcaatcaac ggcaagattg tgacagacta 1800
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cgaccttgtg gttgccgtct gccccccaaa ggagtatgac gatgagctga ccttcttctg 1920
aagtccaaaa ggggaaacca aattcaccgt taggaaacag tgagctccgg ccccacctcg 1980
tgaacacaaa gcctcggatc agccttgaga gaggccacac tacacacacc agatggcatc 2040
cttgggacct gaatctatca cccaggaatc tcaaactccc tttggccctg aaccagggcc 2100
agataaggaa cagctcgggc cactcttctg aaggccaacg tggaggaaag ggagcagcca 2160
gccatttggg agaagatctc aaggatccag actctcattc ctttcctctg gcccagtgaa 2220
tttggtctct cccagctctg ggggactcct tccttgaacc ctaataagac cccactggag 2280
tctctctctc tccatccctc tcctctgccc tctgctctaa ttgctgccag gattgtcact 2340
ccaaacctta ctctgagctc attaataaaa tagatttatt ttcca 2385
<210> 20
<211> 899
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Asp Arg Lys Val Ala Arg Glu Phe Arg His Lys Val Asp Phe Leu
1 5 10 15
Ile Glu Asn Asp Ala Glu Lys Asp Tyr Leu Tyr Asp Val Leu Arg Met
20 25 30
Tyr His Gln Thr Met Asp Val Ala Val Leu Val Gly Asp Leu Lys Leu
35 40 45
Val Ile Asn Glu Pro Ser Arg Leu Pro Leu Phe Asp Ala Ile Arg Pro
50 55 60
Leu Ile Pro Leu Lys His Gln Val Glu Tyr Asp Gln Leu Thr Pro Arg
65 70 75 80
Arg Ser Arg Lys Leu Lys Glu Val Arg Leu Asp Arg Leu His Pro Glu
85 90 95
Gly Leu Gly Leu Ser Val Arg Gly Gly Leu Glu Phe Gly Cys Gly Leu
100 105 110
Phe Ile Ser His Leu Ile Lys Gly Gly Gln Ala Asp Ser Val Gly Leu
115 120 125
Gln Val Gly Asp Glu Ile Val Arg Ile Asn Gly Tyr Ser Ile Ser Ser
130 135 140
Cys Thr His Glu Glu Val Ile Asn Leu Ile Arg Thr Lys Lys Thr Val
145 150 155 160
Ser Ile Lys Val Arg His Ile Gly Leu Ile Pro Val Lys Ser Ser Pro
165 170 175
Asp Glu Pro Leu Thr Trp Gln Tyr Val Asp Gln Phe Val Ser Glu Ser
180 185 190
Gly Gly Val Arg Gly Ser Leu Gly Ser Pro Gly Asn Arg Glu Asn Lys
195 200 205
Glu Lys Lys Val Phe Ile Ser Leu Val Gly Ser Arg Gly Leu Gly Cys
210 215 220
Ser Ile Ser Ser Gly Pro Ile Gln Lys Pro Gly Ile Phe Ile Ser His
225 230 235 240
Val Lys Pro Gly Ser Leu Ser Ala Glu Val Gly Leu Glu Ile Gly Asp
245 250 255
Gln Ile Val Glu Val Asn Gly Val Asp Phe Ser Asn Leu Asp His Lys
260 265 270
Glu Ala Val Asn Val Leu Lys Ser Ser Arg Ser Leu Thr Ile Ser Ile
275 280 285
Val Ala Ala Ala Gly Arg Glu Leu Phe Met Thr Asp Arg Glu Arg Leu
290 295 300
Ala Glu Ala Arg Gln Arg Glu Leu Gln Arg Gln Glu Leu Leu Met Gln
305 310 315 320
Lys Arg Leu Ala Met Glu Ser Asn Lys Ile Leu Gln Glu Gln Gln Glu
325 330 335
Met Glu Arg Gln Arg Arg Lys Glu Ile Ala Gln Lys Ala Ala Glu Glu
340 345 350
Asn Glu Arg Tyr Arg Lys Glu Met Glu Gln Ile Val Glu Glu Glu Glu
355 360 365
Lys Phe Lys Lys Gln Trp Glu Glu Asp Trp Gly Ser Lys Glu Gln Leu
370 375 380
Leu Leu Pro Lys Thr Ile Thr Ala Glu Val His Pro Val Pro Leu Arg
385 390 395 400
Lys Pro Lys Ser Phe Gly Trp Phe Tyr Arg Tyr Asp Gly Lys Phe Pro
405 410 415
Thr Ile Arg Lys Lys Gly Lys Asp Lys Lys Lys Ala Lys Tyr Gly Ser
420 425 430
Leu Gln Asp Leu Arg Lys Asn Lys Lys Glu Leu Glu Phe Glu Gln Lys
435 440 445
Leu Tyr Lys Glu Lys Glu Glu Met Leu Glu Lys Glu Lys Gln Leu Lys
450 455 460
Ile Asn Arg Leu Ala Gln Glu Val Ser Glu Thr Glu Arg Glu Asp Leu
465 470 475 480
Glu Glu Ser Glu Lys Ile Gln Tyr Trp Val Glu Arg Leu Cys Gln Thr
485 490 495
Arg Leu Glu Gln Ile Ser Ser Ala Asp Asn Glu Ile Ser Glu Met Thr
500 505 510
Thr Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Val Ser Pro Leu Ala Pro Pro
515 520 525
Leu Arg Arg Phe Ala Gly Gly Leu His Leu His Thr Thr Asp Leu Asp
530 535 540
Asp Ile Pro Leu Asp Met Phe Tyr Tyr Pro Pro Lys Thr Pro Ser Ala
545 550 555 560
Leu Pro Val Met Pro His Pro Pro Pro Ser Asn Pro Pro His Lys Val
565 570 575
Pro Ala Pro Pro Val Leu Pro Leu Ser Gly His Val Ser Ala Ser Ser
580 585 590
Ser Pro Trp Val Gln Arg Thr Pro Pro Pro Ile Pro Ile Pro Pro Pro
595 600 605
Pro Ser Val Pro Thr Gln Asp Leu Thr Pro Thr Arg Pro Leu Pro Ser
610 615 620
Ala Leu Glu Glu Ala Leu Ser Asn His Pro Phe Arg Thr Gly Asp Thr
625 630 635 640
Gly Asn Pro Val Glu Asp Trp Glu Ala Lys Asn His Ser Gly Lys Pro
645 650 655
Thr Asn Ser Pro Val Pro Glu Gln Ser Phe Pro Pro Thr Pro Lys Thr
660 665 670
Phe Cys Pro Ser Pro Gln Pro Pro Arg Gly Pro Gly Val Ser Thr Ile
675 680 685
Ser Lys Pro Val Met Val His Gln Glu Pro Asn Phe Ile Tyr Arg Pro
690 695 700
Ala Val Lys Ser Glu Val Leu Pro Gln Glu Met Leu Lys Arg Met Val
705 710 715 720
Val Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Gln Asp Phe Arg Lys Tyr Glu Glu Gly
725 730 735
Phe Asp Pro Tyr Ser Met Phe Thr Pro Glu Gln Ile Met Gly Lys Asp
740 745 750
Val Arg Leu Leu Arg Ile Lys Lys Glu Gly Ser Leu Asp Leu Ala Leu
755 760 765
Glu Gly Gly Val Asp Ser Pro Ile Gly Lys Val Val Val Ser Ala Val
770 775 780
Tyr Glu Arg Gly Ala Ala Glu Arg His Gly Gly Ile Val Lys Gly Asp
785 790 795 800
Glu Ile Met Ala Ile Asn Gly Lys Ile Val Thr Asp Tyr Thr Leu Ala
805 810 815
Glu Ala Glu Ala Ala Leu Gln Lys Ala Trp Asn Gln Gly Gly Asp Trp
820 825 830
Ile Asp Leu Val Val Ala Val Cys Pro Pro Lys Glu Tyr Asp Asp Glu
835 840 845
Leu Ala Ser Leu Pro Ser Ser Val Ala Glu Ser Pro Gln Pro Val Arg
850 855 860
Lys Leu Leu Glu Asp Arg Ala Ala Val His Arg His Gly Phe Leu Leu
865 870 875 880
Gln Leu Glu Pro Thr Asp Leu Leu Leu Lys Ser Lys Arg Gly Asn Gln
885 890 895
Ile His Arg
<210> 21
<211> 2180
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
agctccgagg gcggctggcc cggtcgcggt cgcggctctt tccagctcct ggcagccggg 60
cacccgaagg aacgggtcgt gcaacgacgc agctggacct ggcccagcca tggaccgaaa 120
agtggcccga gaattccggc ataaggtgga ttttctgatt gaaaatgatg cagagaagga 180
ctatctctat gatgtgctgc gaatgtacca ccagaccatg gacgtggccg tgctcgtggg 240
agacctgaag ctggtcatca atgaacccag ccgtctgcct ctgtttgatg ccattcggcc 300
gctgatccca ctgaagcacc aggtggaata tgatcagctg accccccggc gctccaggaa 360
gctgaaggag gtgcgtctgg accgtctgca ccccgaaggc ctcggcctga gtgtgcgtgg 420
tggcctggag tttggctgtg ggctcttcat ctcccacctc atcaaaggcg gtcaggcaga 480
cagcgtcggg ctccaggtag gggacgagat cgtccggatc aatggatatt ccatctcctc 540
ctgtacccat gaggaggtca tcaacctcat tcgaaccaag aaaactgtgt ccatcaaagt 600
gagacacatc ggcctgatcc ccgtgaaaag ctctcctgat gagcccctca cttggcagta 660
tgtggatcag tttgtgtcgg aatctggggg cgtgcgaggc agcctgggct cccctggaaa 720
tcgggaaaac aaggagaaga aggtcttcat cagcctggta ggctcccgag gccttggctg 780
cagcatttcc agcggcccca tccagaagcc tggcatcttt atcagccatg tgaaacctgg 840
ctccctgtct gctgaggtgg gattggagat aggggaccag attgtcgaag tcaatggcgt 900
cgacttctct aacctggatc acaaggaggg ccgggagctg ttcatgacag accgggagcg 960
gctggcagag gcgcggcagc gtgagctgca gcggcaggag cttctcatgc agaagcggct 1020
ggcgatggag tccaacaaga tcctccagga gcagcaggag atggagcggc aaaggagaaa 1080
agaaattgcc cagaaggcag cagaggaaaa tgagagatac cggaaggaga tggaacagat 1140
tgtagaggag gaagagaagt ttaagaagca atgggaagaa gactggggct caaaggaaca 1200
gctactcttg cctaaaacca tcactgctga ggtacaccca gtaccccttc gcaagccaaa 1260
gtatgatcag ggagtggaac ctgagctcga gcccgcagat gacctggatg gaggcacgga 1320
ggagcaggga gagcaggatt tccggaaata tgaggaaggc tttgacccct actctatgtt 1380
caccccagag cagatcatgg ggaaggatgt ccggctccta cgcatcaaga aggagggatc 1440
cttagacctg gccctggaag gcggtgtgga ctcccccatt gggaaggtgg tcgtttctgc 1500
tgtgtatgag cggggagctg ctgagcggca tggtggcatt gtgaaagggg acgagatcat 1560
ggcaatcaac ggcaagattg tgacagacta caccctggct gaggctgagg ctgccctgca 1620
gaaggcctgg aatcagggcg gggactggat cgaccttgtg gttgccgtct gccccccaaa 1680
ggagtatgac gatgagctga ccttcttctg aagtccaaaa ggggaaacca aattcaccgt 1740
taggaaacag tgagctccgg ccccacctcg tgaacacaaa gcctcggatc agccttgaga 1800
gaggccacac tacacacacc agatggcatc cttgggacct gaatctatca cccaggaatc 1860
tcaaactccc tttggccctg aaccagggcc agataaggaa cagctcgggc cactcttctg 1920
aaggccaacg tggaggaaag ggagcagcca gccatttggg agaagatctc aaggatccag 1980
actctcattc ctttcctctg gcccagtgaa tttggtctct cccagctctg ggggactcct 2040
tccttgaacc ctaataagac cccactggag tctctctctc tccatccctc tcctctgccc 2100
tctgctctaa ttgctgccag gattgtcact ccaaacctta ctctgagctc attaataaaa 2160
tagatttatt ttccagctta 2180
<210> 22
<211> 533
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Met Asp Arg Lys Val Ala Arg Glu Phe Arg His Lys Val Asp Phe Leu
1 5 10 15
Ile Glu Asn Asp Ala Glu Lys Asp Tyr Leu Tyr Asp Val Leu Arg Met
20 25 30
Tyr His Gln Thr Met Asp Val Ala Val Leu Val Gly Asp Leu Lys Leu
35 40 45
Val Ile Asn Glu Pro Ser Arg Leu Pro Leu Phe Asp Ala Ile Arg Pro
50 55 60
Leu Ile Pro Leu Lys His Gln Val Glu Tyr Asp Gln Leu Thr Pro Arg
65 70 75 80
Arg Ser Arg Lys Leu Lys Glu Val Arg Leu Asp Arg Leu His Pro Glu
85 90 95
Gly Leu Gly Leu Ser Val Arg Gly Gly Leu Glu Phe Gly Cys Gly Leu
100 105 110
Phe Ile Ser His Leu Ile Lys Gly Gly Gln Ala Asp Ser Val Gly Leu
115 120 125
Gln Val Gly Asp Glu Ile Val Arg Ile Asn Gly Tyr Ser Ile Ser Ser
130 135 140
Cys Thr His Glu Glu Val Ile Asn Leu Ile Arg Thr Lys Lys Thr Val
145 150 155 160
Ser Ile Lys Val Arg His Ile Gly Leu Ile Pro Val Lys Ser Ser Pro
165 170 175
Asp Glu Pro Leu Thr Trp Gln Tyr Val Asp Gln Phe Val Ser Glu Ser
180 185 190
Gly Gly Val Arg Gly Ser Leu Gly Ser Pro Gly Asn Arg Glu Asn Lys
195 200 205
Glu Lys Lys Val Phe Ile Ser Leu Val Gly Ser Arg Gly Leu Gly Cys
210 215 220
Ser Ile Ser Ser Gly Pro Ile Gln Lys Pro Gly Ile Phe Ile Ser His
225 230 235 240
Val Lys Pro Gly Ser Leu Ser Ala Glu Val Gly Leu Glu Ile Gly Asp
245 250 255
Gln Ile Val Glu Val Asn Gly Val Asp Phe Ser Asn Leu Asp His Lys
260 265 270
Glu Gly Arg Glu Leu Phe Met Thr Asp Arg Glu Arg Leu Ala Glu Ala
275 280 285
Arg Gln Arg Glu Leu Gln Arg Gln Glu Leu Leu Met Gln Lys Arg Leu
290 295 300
Ala Met Glu Ser Asn Lys Ile Leu Gln Glu Gln Gln Glu Met Glu Arg
305 310 315 320
Gln Arg Arg Lys Glu Ile Ala Gln Lys Ala Ala Glu Glu Asn Glu Arg
325 330 335
Tyr Arg Lys Glu Met Glu Gln Ile Ser Glu Glu Glu Glu Lys Phe Lys
340 345 350
Lys Gln Trp Glu Glu Asp Trp Gly Ser Lys Glu Gln Leu Ile Leu Pro
355 360 365
Lys Thr Ile Thr Ala Glu Val His Pro Val Pro Leu Arg Lys Pro Lys
370 375 380
Tyr Asp Gln Gly Val Glu Pro Glu Leu Glu Pro Ala Asp Asp Leu Asp
385 390 395 400
Gly Gly Thr Glu Glu Gln Gly Glu Gln Asp Phe Arg Lys Tyr Glu Glu
405 410 415
Gly Phe Asp Pro Tyr Ser Met Phe Thr Pro Glu Gln Ile Met Gly Lys
420 425 430
Asp Val Arg Leu Leu Arg Ile Lys Lys Glu Gly Ser Leu Asp Leu Ala
435 440 445
Leu Glu Gly Gly Val Asp Ser Pro Ile Gly Lys Val Val Val Ser Ala
450 455 460
Val Tyr Glu Arg Gly Ala Ala Glu Arg His Gly Gly Ile Val Lys Gly
465 470 475 480
Asp Glu Ile Met Ala Ile Asn Gly Lys Ile Val Thr Asp Tyr Thr Leu
485 490 495
Ala Glu Ala Glu Ala Ala Leu Gln Lys Ala Trp Asn Gln Gly Gly Asp
500 505 510
Trp Ile Asp Leu Val Val Ala Val Cys Pro Pro Lys Glu Tyr Asp Asp
515 520 525
Glu Leu Thr Phe Phe
530
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 23
gaggtaccat ggaccggaag gtggcccgag 30
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 24
caggatccgg acaatttcat cccctac 27
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 25
ctcattgaaa atgacgcaga gaagg 25
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 26
tctcactttg atggacacgg tctt 24
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 27
gaacccaacc gcctgccg 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 28
tgcagacggt ccaagcgt 18
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 29
gtgaggccgg tgctgagtat g 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 30
gccaaagttg tcatggatga c 21
<210> 31
<211> 909
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 31
Met Asp Arg Lys Val Ala Arg Glu Phe Arg His Lys Val Asp Phe Leu
1 5 10 15
Ile Glu Asn Asp Ala Glu Lys Asp Tyr Leu Tyr Asp Val Leu Arg Met
20 25 30
Tyr His Gln Thr Met Asp Val Ala Val Leu Val Gly Asp Leu Lys Leu
35 40 45
Val Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Pro Leu Phe Asp Ala Ile Arg Pro
50 55 60
Leu Ile Pro Leu Lys His Gln Glu Tyr Asp Gln Leu Thr Pro Arg Arg
65 70 75 80
Ser Arg Lys Leu Lys Glu Val Arg Leu Asp Arg Leu His Pro Glu Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Ser Val Arg Gly Gly Leu Glu Phe Gly Cys Gly Leu Phe
100 105 110
Ile Ser His Leu Ile Lys Gly Gly Gln Ala Asp Ser Val Gly Leu Gln
115 120 125
Val Gly Asp Glu Ile Val Arg Ile Asn Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Cys
130 135 140
Thr His Glu Glu Val Ile Asn Leu Ile Arg Thr Lys Lys Thr Val Ser
145 150 155 160
Ile Lys Val Arg His Ile Gly Leu Ile Pro Val Lys Ser Ser Pro Glu
165 170 175
Glu Ser Leu Lys Trp Gln Tyr Val Asp Gln Phe Val Ser Glu Ser Gly
180 185 190
Gly Val Arg Gly Gly Leu Gly Ser Pro Gly Asn Arg Thr Thr Lys Glu
195 200 205
Lys Lys Val Phe Ile Ser Leu Val Gly Ser Arg Gly Leu Gly Cys Ser
210 215 220
Ile Ser Ser Gly Pro Ile Gln Lys Pro Gly Ile Phe Val Ser His Val
225 230 235 240
Lys Pro Gly Ser Leu Ser Ala Glu Val Gly Leu Glu Thr Gly Asp Gln
245 250 255
Ile Val Glu Val Asn Gly Ile Asp Phe Thr Asn Leu Asp His Lys Glu
260 265 270
Ala Val Asn Val Leu Lys Ser Ser Arg Ser Leu Thr Ile Ser Ile Val
275 280 285
Ala Gly Ala Gly Arg Glu Leu Phe Met Thr Asp Arg Glu Arg Leu Glu
290 295 300
Glu Ala Arg Gln Arg Glu Leu Gln Arg Gln Glu Leu Leu Met Gln Lys
305 310 315 320
Arg Leu Ala Met Glu Ser Asn Lys Ile Leu Gln Glu Gln Gln Glu Met
325 330 335
Glu Arg Gln Arg Arg Lys Glu Ile Ala Gln Lys Ala Ala Glu Glu Asn
340 345 350
Glu Arg Tyr Arg Lys Glu Met Glu Gln Ile Ser Glu Glu Glu Glu Lys
355 360 365
Phe Lys Lys Gln Trp Glu Glu Asp Trp Gly Ser Lys Glu Gln Leu Ile
370 375 380
Leu Pro Lys Thr Ile Thr Ala Glu Val His Pro Val Pro Leu Arg Lys
385 390 395 400
Pro Lys Ser Phe Gly Trp Phe Tyr Arg Tyr Asp Gly Lys Phe Pro Thr
405 410 415
Ile Arg Lys Lys Ala Lys Glu Lys Lys Lys Ala Lys Tyr Asp Ser Leu
420 425 430
Gln Asp Leu Arg Lys Asn Lys Lys Glu Leu Glu Phe Glu Gln Lys Leu
435 440 445
Tyr Lys Glu Lys Glu Glu Met Leu Glu Lys Glu Lys Gln Leu Lys Ile
450 455 460
Asn Arg Leu Ala Gln Glu Val Ser Glu Thr Glu Arg Glu Asp Leu Glu
465 470 475 480
Glu Ser Glu Lys Thr Gln Tyr Trp Val Glu Arg Leu Cys Gln Thr Arg
485 490 495
Leu Glu Gln Ile Ser Ser Ala Glu Asn Glu Ile Pro Glu Met Thr Thr
500 505 510
Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Val Ser Pro Leu Ala Pro Pro Leu
515 520 525
Arg Arg Phe Ala Gly Gly Ile His Leu His Thr Thr Asp Leu Asp Asp
530 535 540
Ile Pro Leu Asp Met Phe Tyr Tyr Pro Pro Lys Thr Pro Ser Ala Leu
545 550 555 560
Pro Val Met Pro His Pro Pro Ser Val Asn Ser Pro Ser Lys Val Pro
565 570 575
Ala Pro Pro Val Leu Pro Ser Ser Gly His Val Ser Ser Ser Ser Ser
580 585 590
Pro Trp Val Gln Arg Thr Pro Pro Pro Ile Pro Ile Pro Pro Pro Pro
595 600 605
Ser Ile Pro Thr Gln Asp Leu Thr Pro Thr Arg Pro Leu Pro Ser Ala
610 615 620
Leu Glu Glu Ala Leu Gly Asn His Pro Phe Arg Thr Gly Asp Pro Gly
625 630 635 640
His Pro Ala Asp Asp Trp Glu Ala Asn Thr His Ser Gly Lys Pro Ser
645 650 655
Ser Ser Pro Thr Thr Glu Arg Ser Phe Pro Pro Ala Pro Lys Thr Phe
660 665 670
Cys Pro Ser Pro Gln Pro Pro Arg Gly Pro Gly Val Ser Thr Ile Ser
675 680 685
Lys Pro Val Met Val His Gln Glu His Asn Phe Val Tyr Arg Pro Ala
690 695 700
Val Lys Ser Glu Val Leu Pro Gln Glu Met Leu Lys Arg Met Val Val
705 710 715 720
Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Gln Asp Phe Arg Lys Tyr Glu Glu Gly Phe
725 730 735
Asp Pro Tyr Ser Met Phe Ser Pro Glu Gln Ile Ala Gly Lys Asp Val
740 745 750
Arg Leu Leu Arg Ile Lys Lys Glu Gly Ser Leu Asp Leu Ala Leu Glu
755 760 765
Gly Gly Val Asp Ser Pro Val Gly Lys Val Val Val Ser Ala Val Tyr
770 775 780
Glu Gly Gly Ala Ala Glu Arg His Gly Gly Val Val Lys Gly Asp Glu
785 790 795 800
Ile Met Ala Ile Asn Gly Lys Ile Val Thr Asp Tyr Thr Leu Ala Glu
805 810 815
Ala Glu Ala Ala Leu Gln Lys Ala Trp Asn Gln Gly Gly Asp Trp Ile
820 825 830
Asp Leu Val Val Ala Val Cys Pro Pro Lys Glu Tyr Asp Asp Glu Leu
835 840 845
Ser Ser Leu Pro Ser Ser Ala Ala Glu Ser Pro Gln Leu Ala Arg Lys
850 855 860
Gln Leu Glu Ala Tyr Glu Pro Val Cys Arg His Gly Phe Phe Leu Gln
865 870 875 880
Leu Glu Pro Thr Asn Leu Leu Leu Lys Ser Arg Glu Arg Asn Gln Thr
885 890 895
Asp Pro Ser Trp Arg Pro Ala Ser Ser Ala Pro Ser Pro
900 905
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 32
Met Asp Arg Lys Val Ala Arg Glu Phe Arg His Lys Val Asp Phe Leu
1 5 10 15
Ile Glu Asn Asp Ala Glu Lys Asp Tyr Leu Tyr Asp Val Leu Arg Met
20 25 30
Tyr His Gln Thr Met Asp Val Ala Val Leu Val Gly Asp Leu Lys Leu
35 40 45
Val Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Pro Leu Phe Asp Ala Ile Arg Pro
50 55 60
Leu Ile Pro Leu Lys His Gln Glu Thr Glu Gly Gly Thr Leu Gly Pro
65 70 75 80
Ser Ala Pro Arg Arg Ser Arg Pro Gln Arg Ala Trp Arg Pro Gly Ile
85 90 95
Trp Leu Trp Thr Leu Tyr Leu Pro Pro His Gln Arg Trp Pro Gly Arg
100 105 110
Gln Arg Trp Ala Ser Gly Arg Gly
115 120
SEQUENCE LISTING
<110> THE CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION
<120> MATERIALS AND METHODS FOR DELIVERING NUCLEIC ACIDS TO COCHLEAR
AND VESTIBULAR CELLS
<150> US 62/455,197
<151> 2017-02-06
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (168)..(168)
<223> Lys or Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (204)..(204)
<223> Ala or Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (266)..(266)
<223> Ala or Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (311)..(311)
<223> Arg or Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (411)..(411)
<223> Glu or Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (460)..(460)
<223> Thr or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (493)..(493)
<223> Ala or Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (562)..(562)
<223> Ser or Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (576)..(576)
<223> Gln or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (587)..(587)
<223> Ser or Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (609)..(609)
<223> Asn or Asp
<400> 1
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Xaa Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Asn Thr Met Xaa Ala Gly Gly Gly
195 200 205
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Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Xaa Ser Thr Asn Asp Asn Thr
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 4
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
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polynucleotide
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<210> 7
<211> 7728
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 7
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ggggctacct gcagcccttg gcttgcaggg atgcagggat gcggtcggaa cctgaggccc 840
cgcccttctc ttgccccacg ccattaggcc acgcccctac ccagcactcc ttcaaccacc 900
cccttccccg gcgcctcatg aggtcccgcc cctctcaacc ctagctcttg aggcctcccc 960
ttcacagccg ccccggcgtt ccttgacttg aggccacgtc cctctgctcc ttcattccca 1020
agaccctacg ctttgcgagt cctccctgtc ctgctgccta ggaccccgcc cctctcagcc 1080
cttctgcccc aagaccccgc cccttaggct gttcccgccc actggccaat gaagacccgc 1140
cctttcttta gccgccccgc cccggtccca caaaatcccg cctccggccc cgcctcccgc 1200
ccccttgggc gctccgtagc agtgacgtgc gcaggctggg cactctgcag ggctctctgg 1260
ccggcgggtg gagaccgatc cgggatctgt cccagcagga agcgtatccc ggccgccgtc 1320
gtgctgtcgt ctccggtgct cgctctcggc cgcggtgtcg cgcttgccct tcgcgcccgc 1380
agcccggcag cctctcgagc tcaagcttcg aattcgtcga caggatgagc ccccagttaa 1440
agagcttgga cgaggaaggt gacaagtcag caagaagacc cacaaggaaa caaacctcca 1500
gagctgcatg tccccaagac gggcaccgag cccaatctag ccggaaggat cctgctaagg 1560
gtagcccaag accagggtct tcccggaaga aacagatgga acatggaagc tatcacaagg 1620
ggttgcaggg acagaaacca cgaaaggtgg agaggtctct acaagggagg aagaaggatc 1680
ggagaacttc ccttaaggag cagagagcat ctccaaagaa ggagagggag gctctgagga 1740
aggaggcagg caagcagctg agaaaaccca ggtccacttc cttgggctcc agtgtctcta 1800
ctggagactc cctgtctgag gaggagctgg ctcagatcct ggaacaggta gaagaaaaaa 1860
agaagctcat cactaccgtg aggaacaaac cctggcccat ggcaaagaag ctgagggaac 1920
tcagggaagc ccaagccttt gtggagaagt atgaaggagc cttggggaaa ggcaagggca 1980
aacacctcta cgcctacagg atgatgatgg ctaagaaatg ggtcaagttt aagagggact 2040
ttgataattt caagactcaa tgtattccct gggaaatgaa gatcaaggac attgaaagtc 2100
acttcggttc ttctgtggca tcttacttca tctttctccg atggatgtat ggagttaacc 2160
ttgtcctttt tggcttaata tttggtctag tcatcatccc agaggtgctg atgggcatgc 2220
cctatggaag tatacccaga aagacggtgc ctcgggctga ggaagagcga gccatggact 2280
tctctgtcct ttgggatttt gagggctaca tcaaatattc tgctctcttc tatggctact 2340
acaacaacca gcggaccatt ggatggctga ggtacaggct gcccatggct tactttatgg 2400
tgggggtcag cgtgtttggc tacagcttga tgatcgtcat taggtcgatg gccagcaata 2460
cccagggtag caccagtgag ggggacagtg acagcttcac gttcagcttc aagatgttca 2520
ccagctggga ctacctcatc gggaattcag agacagcaga caacaaatat gtctccatca 2580
ctaccagctt caaggagtct atagtggacg aacaagagag taacaaagaa gggaatatcc 2640
acctgacaag attcctccgc gtcctggcca actttctcat tctctgctgt ctgtgtggaa 2700
gcgggtacct catttacttt gtggtgaaac ggtcccagga gttctccaaa atgcaaaatg 2760
tcagctggta tgaaaggaat gaggtggaga tcgtgatgtc tctgctaggg atgttttgtc 2820
cccctctgtt tgaaaccatc gctgccttgg agaattatca cccacgaact gggctgaagt 2880
ggcagctggg ccgcatcttt gcccttttcc tgggaaacct ctacacgttt ctcctggccc 2940
tcatggacga tgtccacctt aagctttcta atgaggaaaa aatcaagaac atcactcact 3000
ggaccctgtt taactattac aattcctcag gtgggaatga gagtgtgccc cggccaccac 3060
cacaccctgc agatgtgccc agaggttctt gctgggagac agctgtgggc attgagttta 3120
tgaggctcac cgtgtctgac atgctggtaa catacctcac catcttggtc ggagatttcc 3180
tccgagcttg ttttgtccgg ttcatgaatc actgctggtg ttgggacctc gaggctggtt 3240
ttccctcata tgccgagttt gatattagtg gaaatgtgtt gggtttgatc ttcaaccaag 3300
gaatgatctg gatgggctcc ttctatgctc caggactggt gggcatcaat gtcctgcgcc 3360
tgttgacctc catgtacttc cagtgctggg cagtgatgag cagcaacgtt ccccatgagc 3420
gtgtgtttaa agcctcccga tccaacaact tctacatggg cctgctgctg ttggtgctct 3480
tcctcagcct cctgcctgtg gcctacactg tcatgtctct cccaccctcg tttgactgtg 3540
gccccttcag tgggaaaaac agaatgtacg atgtcctcca tgagaccatc gagaacgatt 3600
tccctaagtt cctgggcaag atctttgcgt tccttgccaa cccaggcctg atcattccag 3660
ccatcctgct aatgtttctg gccatttact acctgaactc agtttcaaaa agtctttcca 3720
gagctaatgc ccagctgcga aagaagatcc aagcgctccg tgaagttgag aagaaccata 3780
aatccatcaa gggaaaagcc atagtcacat attcagagga cacaatcaag aacagctcca 3840
aaaatgccac ccagatacat cttactaaag aagagcccac atctcactct tccagccaaa 3900
tccagaccct ggacaagaaa gcgcagggcc cccacacctc cagtactgag ggtggggcct 3960
cgccgtctac ctcctggcac catgttgggt ctcaaccacc gagaggcaga cgagattctg 4020
gccaacccca gtctcagact tatacaggca ggtcaccttc tggaaagaga acccagaggc 4080
ctcacaactg agcggccgct cgagcctaag cttctagaag atctacgggt ggcatccctg 4140
tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct 4200
tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat 4260
ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg 4320
cggggtctat tgggaaccaa gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc 4380
cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc 4440
atgcatgacc aggctcagct aatttttgtt tttttggtag agacggggtt tcaccatatt 4500
ggccaggctg gtctccaact cctaatctca ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt 4560
gctgggatta caggcgtgaa ccactgctcc cttccctgtc cttctgattt tgtaggtaac 4620
cacgtgcgga ccgagcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg 4680
cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc 4740
cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat 4800
tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg 4860
cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 4920
cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 4980
tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 5040
ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat 5100
cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 5160
tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggg ctattctttt gatttataag 5220
ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 5280
cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa ttttatggtg cactctcagt acaatctgct 5340
ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac 5400
gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca 5460
tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac 5520
gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt 5580
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 5640
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 5700
tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 5760
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 5820
gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 5880
aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 5940
gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 6000
ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 6060
gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 6120
gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 6180
atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 6240
ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 6300
cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 6360
cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 6420
gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 6480
cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 6540
cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 6600
taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 6660
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 6720
aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 6780
caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 6840
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 6900
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 6960
cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 7020
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 7080
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 7140
ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 7200
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 7260
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 7320
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 7380
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 9
catctgcagc caactttggt gtgt 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 10
agaggtagcc ggaaattcag ccat 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 11
tgagcgcaag tactctgtgt ggat 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 12
actcatcgta ctcctgcttg ctga 24
<210> 13
<211> 734
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr
245 250 255
Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435 440 445
Gln Thr Thr Ser Gly Thr Ala Gly Asn Arg Thr Leu Gln Phe Ser Gln
450 455 460
Ala Gly Pro Ser Ser Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Thr Asn Gln Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Thr His Lys Asp
515 520 525
Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Gly Ala Gly Asn Ser Asn Val Asp Leu Asp Asn Val Met Ile Thr
545 550 555 560
Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Glu Tyr
565 570 575
Gly Thr Val Ala Thr Asn Leu Gln Ser Ala Asn Thr Ala Pro Ala Thr
580 585 590
Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
610 615 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625 630 635 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645 650 655
Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Glu Leu Gln Lys Glu
675 680 685
Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn
690 695 700
Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser
705 710 715 720
Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730
<210> 14
<211> 760
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Ser Pro Lys Lys Val Gln Ile Lys Val Glu Glu Lys Glu Asp Glu
1 5 10 15
Thr Glu Glu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Asp Lys Leu
20 25 30
Pro Arg Arg Glu Ser Leu Arg Pro Lys Arg Lys Arg Thr Arg Asp Val
35 40 45
Ile Asn Glu Asp Asp Pro Glu Pro Glu Pro Glu Asp Glu Glu Thr Arg
50 55 60
Lys Ala Arg Glu Lys Glu Arg Arg Arg Arg Leu Lys Arg Gly Ala Glu
65 70 75 80
Glu Glu Glu Ile Asp Glu Glu Glu Leu Glu Arg Leu Lys Ala Glu Leu
85 90 95
Asp Glu Lys Arg Gln Ile Ile Ala Thr Val Lys Cys Lys Pro Trp Lys
100 105 110
Met Glu Lys Lys Ile Glu Val Leu Lys Glu Ala Lys Lys Phe Val Ser
115 120 125
Glu Asn Glu Gly Ala Leu Gly Lys Gly Lys Gly Lys Arg Trp Phe Ala
130 135 140
Phe Lys Met Met Met Ala Lys Lys Trp Ala Lys Phe Leu Arg Asp Phe
145 150 155 160
Glu Asn Phe Lys Ala Ala Cys Val Pro Trp Glu Asn Lys Ile Lys Ala
165 170 175
Ile Glu Ser Gln Phe Gly Ser Ser Val Ala Ser Tyr Phe Leu Phe Leu
180 185 190
Arg Trp Met Tyr Gly Val Asn Met Val Leu Phe Ile Leu Thr Phe Ser
195 200 205
Leu Ile Met Leu Pro Glu Tyr Leu Trp Gly Leu Pro Tyr Gly Ser Leu
210 215 220
Pro Arg Lys Thr Val Pro Arg Ala Glu Glu Ala Ser Ala Ala Asn Phe
225 230 235 240
Gly Val Leu Tyr Asp Phe Asn Gly Leu Ala Gln Tyr Ser Val Leu Phe
245 250 255
Tyr Gly Tyr Tyr Asp Asn Lys Arg Thr Ile Gly Trp Met Asn Phe Arg
260 265 270
Leu Pro Leu Ser Tyr Phe Leu Val Gly Ile Met Cys Ile Gly Tyr Ser
275 280 285
Phe Leu Val Val Leu Lys Ala Met Thr Lys Asn Ile Gly Asp Asp Gly
290 295 300
Gly Gly Asp Asp Asn Thr Phe Asn Phe Ser Trp Lys Val Phe Thr Ser
305 310 315 320
Trp Asp Tyr Leu Ile Gly Asn Pro Glu Thr Ala Asp Asn Lys Phe Asn
325 330 335
Ser Ile Thr Met Asn Phe Lys Glu Ala Ile Thr Glu Glu Lys Ala Ala
340 345 350
Gln Val Glu Glu Asn Val His Leu Ile Arg Phe Leu Arg Phe Leu Ala
355 360 365
Asn Phe Phe Val Phe Leu Thr Leu Gly Gly Ser Gly Tyr Leu Ile Phe
370 375 380
Trp Ala Val Lys Arg Ser Gln Glu Phe Ala Gln Gln Asp Pro Asp Thr
385 390 395 400
Leu Gly Trp Trp Glu Lys Asn Glu Met Asn Met Val Met Ser Leu Leu
405 410 415
Gly Met Phe Cys Pro Thr Leu Phe Asp Leu Phe Ala Glu Leu Glu Asp
420 425 430
Tyr His Pro Leu Ile Ala Leu Lys Trp Leu Leu Gly Arg Ile Phe Ala
435 440 445
Leu Leu Leu Gly Asn Leu Tyr Val Phe Ile Leu Ala Leu Met Asp Glu
450 455 460
Ile Asn Asn Lys Ile Glu Glu Glu Lys Leu Val Lys Ala Asn Ile Thr
465 470 475 480
Leu Trp Glu Ala Asn Met Ile Lys Ala Tyr Asn Ala Ser Phe Ser Glu
485 490 495
Asn Ser Thr Gly Pro Pro Phe Phe Val His Pro Ala Asp Val Pro Arg
500 505 510
Gly Pro Cys Trp Glu Thr Met Val Gly Gln Glu Phe Val Arg Leu Thr
515 520 525
Val Ser Asp Val Leu Thr Thr Tyr Val Thr Ile Leu Ile Gly Asp Phe
530 535 540
Leu Arg Ala Cys Phe Val Arg Phe Cys Asn Tyr Cys Trp Cys Trp Asp
545 550 555 560
Leu Glu Tyr Gly Tyr Pro Ser Tyr Thr Glu Phe Asp Ile Ser Gly Asn
565 570 575
Val Leu Ala Leu Ile Phe Asn Gln Gly Met Ile Trp Met Gly Ser Phe
580 585 590
Phe Ala Pro Ser Leu Pro Gly Ile Asn Ile Leu Arg Leu His Thr Ser
595 600 605
Met Tyr Phe Gln Cys Trp Ala Val Met Cys Cys Asn Val Pro Glu Ala
610 615 620
Arg Val Phe Lys Ala Ser Arg Ser Asn Asn Phe Tyr Leu Gly Met Leu
625 630 635 640
Leu Leu Ile Leu Phe Leu Ser Thr Met Pro Val Leu Tyr Met Ile Val
645 650 655
Ser Leu Pro Pro Ser Phe Asp Cys Gly Pro Phe Ser Gly Lys Asn Arg
660 665 670
Met Phe Glu Val Ile Gly Glu Thr Leu Glu His Asp Phe Pro Ser Trp
675 680 685
Met Ala Lys Ile Leu Arg Gln Leu Ser Asn Pro Gly Leu Val Ile Ala
690 695 700
Val Ile Leu Val Met Val Leu Ala Ile Tyr Tyr Leu Asn Ala Thr Ala
705 710 715 720
Lys Gly Gln Lys Ala Ala Asn Leu Asp Leu Lys Lys Lys Met Lys Met
725 730 735
Gln Ala Leu Glu Asn Lys Met Arg Asn Lys Lys Met Ala Ala Ala Arg
740 745 750
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gln
755 760
<210> 15
<211> 3201
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
cagaaactat gagggcagaa cccagcaatc tgtgctttct ttcacaagcc ctccaggagt 60
tgctgaaatt taggaatcat tgccccaaaa agtggccctc ataatgatgc cagatgggat 120
cttactctgt tgcccaggct ggagtgcagt ggtgcgatct cggctctctg caacctccgc 180
ctcccaggtt caagtgattc tcctgcctcg gcctcctgag tagctgggat ttcaggccat 240
gaaagatcac tgttttagtc tgcgtggtgc agtggaacag atagacctcg gtttgaatct 300
cagctctact gtttactaga catgaaatgg ggaaatctaa aatgagatgc cagaagcctc 360
aaaaatggaa aaccccctgt gcttcacatc tgaaaatctc tgctgggggc agcaactttg 420
agcctgtggg gaaggaactg tccacgtgga gtggtctggt gaatgcttaa ggagctgcag 480
aagggaagtc cctctccaaa ctagccagcc actgagacct tctgacagga cacccccagg 540
atgtcaccca aaaaagtaca aatcaaagtg gaggaaaaag aagacgagac tgaggaaagc 600
tcaagtgaag aggaagagga ggtggaagat aagctacctc gaagagagag cttgagacca 660
aagaggaaac ggaccagaga tgttatcaat gaggatgacc cagaacctga accagaggat 720
gaagaaacaa ggaaggcaag agaaaaagag aggaggagga ggctaaagag aggagcagaa 780
gaagaagaaa ttgatgaaga ggaattggaa agattgaagg cagagttaga tgagaaaaga 840
caaataattg ctactgtcaa atgcaaacca tggaagatgg agaagaaaat tgaagttctc 900
aaggaggcaa aaaaatttgt gagtgaaaat gaaggggctc ttgggaaagg aaaaggaaaa 960
cggtggtttg catttaagat gatgatggcc aagaaatggg caaaattcct ccgtgatttt 1020
gagaacttca aagctgcgtg tgtcccatgg gaaaataaaa tcaaggctat tgaaagtcag 1080
tttggctcct cagtggcctc atacttcctc ttcttgagat ggatgtatgg agtcaatatg 1140
gttctcttta tcctgacatt tagcctcatc atgttgccag agtacctctg gggtttgcca 1200
tatggcagtt tacctaggaa aaccgttccc agagccgaag aggcatcggc agcaaacttt 1260
ggtgtgttgt acgacttcaa tggtttggca caatattccg ttctctttta tggctattat 1320
gacaataaac gaacaattgg atggatgaat ttcaggttgc cgctctccta ttttctagtg 1380
gggattatgt gcattggata cagctttctg gttgtcctca aagcaatgac caaaaacatt 1440
ggtgatgatg gaggtggaga tgacaacact ttcaatttca gctggaaggt ctttaccagc 1500
tgggactacc tgatcggcaa tcctgaaaca gcagacaaca aatttaattc tatcacaatg 1560
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atcagattcc tgaggtttct ggctaacttc ttcgtgtttc taacacttgg agggagtgga 1680
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cttgggtggt gggaaaaaaa tgaaatgaac atggttatgt ccctcctagg gatgttctgt 1800
ccaacattgt ttgacttatt tgctgaatta gaagactacc atcctctcat cgctttgaaa 1860
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<210> 16
<211> 906
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Ser His Gln Val Lys Gly Leu Lys Glu Glu Ala Arg Gly Gly Val
1 5 10 15
Lys Gly Arg Val Lys Ser Gly Ser Pro His Thr Gly Asp Arg Leu Gly
20 25 30
Arg Arg Ser Ser Ser Lys Arg Ala Leu Lys Ala Glu Gly Thr Pro Gly
35 40 45
Arg Arg Gly Ala Gln Arg Ser Gln Lys Glu Arg Ala Gly Gly Ser Pro
50 55 60
Ser Pro Gly Ser Pro Arg Arg Lys Gln Thr Gly Arg Arg Arg His Arg
65 70 75 80
Glu Glu Leu Gly Glu Gln Glu Arg Gly Glu Ala Glu Arg Thr Cys Glu
85 90 95
Gly Arg Arg Lys Arg Asp Glu Arg Ala Ser Phe Gln Glu Arg Thr Ala
100 105 110
Ala Pro Lys Arg Glu Lys Glu Ile Pro Arg Arg Glu Glu Lys Ser Lys
115 120 125
Arg Gln Lys Lys Pro Arg Ser Ser Ser Leu Ala Ser Ser Ala Ser Gly
130 135 140
Gly Glu Ser Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ala Gln Ile Leu Glu Gln Val
145 150 155 160
Glu Glu Lys Lys Lys Leu Ile Ala Thr Met Arg Ser Lys Pro Trp Pro
165 170 175
Met Ala Lys Lys Leu Thr Glu Leu Arg Glu Ala Gln Glu Phe Val Glu
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Lys Tyr Glu Gly Ala Leu Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gln Leu Tyr Ala
195 200 205
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Asp Asn Phe Lys Thr Gln Cys Ile Pro Trp Glu Met Lys Ile Lys Asp
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Ile Glu Ser His Phe Gly Ser Ser Val Ala Ser Tyr Phe Ile Phe Leu
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Arg Trp Met Tyr Gly Val Asn Leu Val Leu Phe Gly Leu Ile Phe Gly
260 265 270
Leu Val Ile Ile Pro Glu Val Leu Met Gly Met Pro Tyr Gly Ser Ile
275 280 285
Pro Arg Lys Thr Val Pro Arg Ala Glu Glu Glu Lys Ala Met Asp Phe
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Ser Val Leu Trp Asp Phe Glu Gly Tyr Ile Lys Tyr Ser Ala Leu Phe
305 310 315 320
Tyr Gly Tyr Tyr Asn Asn Gln Arg Thr Ile Gly Trp Leu Arg Tyr Arg
325 330 335
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Leu Ile Ile Val Ile Arg Ser Met Ala Ser Asn Thr Gln Gly Ser Thr
355 360 365
Gly Glu Gly Glu Ser Asp Asn Phe Thr Phe Ser Phe Lys Met Phe Thr
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Ser Trp Asp Tyr Leu Ile Gly Asn Ser Glu Thr Ala Asp Asn Lys Tyr
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405 410 415
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Ala Asn Phe Leu Ile Ile Cys Cys Leu Cys Gly Ser Gly Tyr Leu Ile
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Ser Trp Tyr Glu Arg Asn Glu Val Glu Ile Val Met Ser Leu Leu Gly
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His Pro Arg Thr Gly Leu Lys Trp Gln Leu Gly Arg Ile Phe Ala Leu
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Val Arg Phe Met Asn Tyr Cys Trp Cys Trp Asp Leu Glu Ala Gly Phe
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
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Phe Ile Ser His Leu Ile Lys Gly Gly Gln Ala Asp Ser Val Gly Leu
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Cys Thr His Glu Glu Val Ile Asn Leu Ile Arg Thr Lys Lys Thr Val
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Ser Ile Lys Val Arg His Ile Gly Leu Ile Pro Val Lys Ser Ser Pro
165 170 175
Asp Glu Pro Leu Thr Trp Gln Tyr Val Asp Gln Phe Val Ser Glu Ser
180 185 190
Gly Gly Val Arg Gly Ser Leu Gly Ser Pro Gly Asn Arg Glu Asn Lys
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Glu Lys Lys Val Phe Ile Ser Leu Val Gly Ser Arg Gly Leu Gly Cys
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Ser Ile Ser Ser Gly Pro Ile Gln Lys Pro Gly Ile Phe Ile Ser His
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Val Lys Pro Gly Ser Leu Ser Ala Glu Val Gly Leu Glu Ile Gly Asp
245 250 255
Gln Ile Val Glu Val Asn Gly Val Asp Phe Ser Asn Leu Asp His Lys
260 265 270
Glu Ala Val Asn Val Leu Lys Ser Ser Arg Ser Leu Thr Ile Ser Ile
275 280 285
Val Ala Ala Ala Gly Arg Glu Leu Phe Met Thr Asp Arg Glu Arg Leu
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Lys Arg Leu Ala Met Glu Ser Asn Lys Ile Leu Gln Glu Gln Gln Glu
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Met Glu Arg Gln Arg Arg Lys Glu Ile Ala Gln Lys Ala Ala Glu Glu
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Lys Phe Lys Lys Gln Trp Glu Glu Asp Trp Gly Ser Lys Glu Gln Leu
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Leu Leu Pro Lys Thr Ile Thr Ala Glu Val His Pro Val Pro Leu Arg
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Asp Leu Asp Gly Gly Thr Glu Glu Gln Gly Glu Gln Asp Phe Arg Lys
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Met Gly Lys Asp Val Arg Leu Leu Arg Ile Lys Lys Glu Gly Ser Leu
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Asp Leu Ala Leu Glu Gly Gly Val Asp Ser Pro Ile Gly Lys Val Val
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Val Ser Ala Val Tyr Glu Arg Gly Ala Ala Glu Arg His Gly Gly Ile
485 490 495
Val Lys Gly Asp Glu Ile Met Ala Ile Asn Gly Lys Ile Val Thr Asp
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Gly Gly Asp Trp Ile Asp Leu Val Val Ala Val Cys Pro Pro Lys Glu
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
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gaccatctcc attgtagctg cagctggccg ggagctgttc atgacagacc gggagcggct 1020
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gatggagtcc aacaagatcc tccaggagca gcaggagatg gagcggcaaa ggagaaaaga 1140
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<210> 19
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
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cagcgtcggg ctccaggtag gggacgagat cgtccggatc aatggatatt ccatctcctc 540
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cgaccttgtg gttgccgtct gccccccaaa ggagtatgac gatgagctga ccttcttctg 1920
aagtccaaaa ggggaaacca aattcaccgt taggaaacag tgagctccgg ccccacctcg 1980
tgaacacaaa gcctcggatc agccttgaga gaggccacac tacacacacc agatggcatc 2040
cttgggacct gaatctatca cccaggaatc tcaaactccc tttggccctg aaccagggcc 2100
agataaggaa cagctcgggc cactcttctg aaggccaacg tggaggaaag ggagcagcca 2160
gccatttggg agaagatctc aaggatccag actctcattc ctttcctctg gcccagtgaa 2220
tttggtctct cccagctctg ggggactcct tccttgaacc ctaataagac cccactggag 2280
tctctctctc tccatccctc tcctctgccc tctgctctaa ttgctgccag gattgtcact 2340
ccaaacctta ctctgagctc attaataaaa tagatttatt ttcca 2385
<210> 20
<211> 899
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Asp Arg Lys Val Ala Arg Glu Phe Arg His Lys Val Asp Phe Leu
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Ile Glu Asn Asp Ala Glu Lys Asp Tyr Leu Tyr Asp Val Leu Arg Met
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Tyr His Gln Thr Met Asp Val Ala Val Leu Val Gly Asp Leu Lys Leu
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Leu Ile Pro Leu Lys His Gln Val Glu Tyr Asp Gln Leu Thr Pro Arg
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Arg Ser Arg Lys Leu Lys Glu Val Arg Leu Asp Arg Leu His Pro Glu
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Gly Leu Gly Leu Ser Val Arg Gly Gly Leu Glu Phe Gly Cys Gly Leu
100 105 110
Phe Ile Ser His Leu Ile Lys Gly Gly Gln Ala Asp Ser Val Gly Leu
115 120 125
Gln Val Gly Asp Glu Ile Val Arg Ile Asn Gly Tyr Ser Ile Ser Ser
130 135 140
Cys Thr His Glu Glu Val Ile Asn Leu Ile Arg Thr Lys Lys Thr Val
145 150 155 160
Ser Ile Lys Val Arg His Ile Gly Leu Ile Pro Val Lys Ser Ser Pro
165 170 175
Asp Glu Pro Leu Thr Trp Gln Tyr Val Asp Gln Phe Val Ser Glu Ser
180 185 190
Gly Gly Val Arg Gly Ser Leu Gly Ser Pro Gly Asn Arg Glu Asn Lys
195 200 205
Glu Lys Lys Val Phe Ile Ser Leu Val Gly Ser Arg Gly Leu Gly Cys
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Ser Ile Ser Ser Gly Pro Ile Gln Lys Pro Gly Ile Phe Ile Ser His
225 230 235 240
Val Lys Pro Gly Ser Leu Ser Ala Glu Val Gly Leu Glu Ile Gly Asp
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Ser Pro Trp Val Gln Arg Thr Pro Pro Pro Ile Pro Ile Pro Pro Pro
595 600 605
Pro Ser Val Pro Thr Gln Asp Leu Thr Pro Thr Arg Pro Leu Pro Ser
610 615 620
Ala Leu Glu Glu Ala Leu Ser Asn His Pro Phe Arg Thr Gly Asp Thr
625 630 635 640
Gly Asn Pro Val Glu Asp Trp Glu Ala Lys Asn His Ser Gly Lys Pro
645 650 655
Thr Asn Ser Pro Val Pro Glu Gln Ser Phe Pro Pro Thr Pro Lys Thr
660 665 670
Phe Cys Pro Ser Pro Gln Pro Pro Arg Gly Pro Gly Val Ser Thr Ile
675 680 685
Ser Lys Pro Val Met Val His Gln Glu Pro Asn Phe Ile Tyr Arg Pro
690 695 700
Ala Val Lys Ser Glu Val Leu Pro Gln Glu Met Leu Lys Arg Met Val
705 710 715 720
Val Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Gln Asp Phe Arg Lys Tyr Glu Glu Gly
725 730 735
Phe Asp Pro Tyr Ser Met Phe Thr Pro Glu Gln Ile Met Gly Lys Asp
740 745 750
Val Arg Leu Leu Arg Ile Lys Lys Glu Gly Ser Leu Asp Leu Ala Leu
755 760 765
Glu Gly Gly Val Asp Ser Pro Ile Gly Lys Val Val Val Ser Ala Val
770 775 780
Tyr Glu Arg Gly Ala Ala Glu Arg His Gly Gly Ile Val Lys Gly Asp
785 790 795 800
Glu Ile Met Ala Ile Asn Gly Lys Ile Val Thr Asp Tyr Thr Leu Ala
805 810 815
Glu Ala Glu Ala Ala Leu Gln Lys Ala Trp Asn Gln Gly Gly Asp Trp
820 825 830
Ile Asp Leu Val Val Ala Val Cys Pro Pro Lys Glu Tyr Asp Asp Glu
835 840 845
Leu Ala Ser Leu Pro Ser Ser Val Ala Glu Ser Pro Gln Pro Val Arg
850 855 860
Lys Leu Leu Glu Asp Arg Ala Ala Val His Arg His Gly Phe Leu Leu
865 870 875 880
Gln Leu Glu Pro Thr Asp Leu Leu Leu Lys Ser Lys Arg Gly Asn Gln
885 890 895
Ile His Arg
<210> 21
<211> 2180
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
agctccgagg gcggctggcc cggtcgcggt cgcggctctt tccagctcct ggcagccggg 60
cacccgaagg aacgggtcgt gcaacgacgc agctggacct ggcccagcca tggaccgaaa 120
agtggcccga gaattccggc ataaggtgga ttttctgatt gaaaatgatg cagagaagga 180
ctatctctat gatgtgctgc gaatgtacca ccagaccatg gacgtggccg tgctcgtggg 240
agacctgaag ctggtcatca atgaacccag ccgtctgcct ctgtttgatg ccattcggcc 300
gctgatccca ctgaagcacc aggtggaata tgatcagctg accccccggc gctccaggaa 360
gctgaaggag gtgcgtctgg accgtctgca ccccgaaggc ctcggcctga gtgtgcgtgg 420
tggcctggag tttggctgtg ggctcttcat ctcccacctc atcaaaggcg gtcaggcaga 480
cagcgtcggg ctccaggtag gggacgagat cgtccggatc aatggatatt ccatctcctc 540
ctgtacccat gaggaggtca tcaacctcat tcgaaccaag aaaactgtgt ccatcaaagt 600
gagacacatc ggcctgatcc ccgtgaaaag ctctcctgat gagcccctca cttggcagta 660
tgtggatcag tttgtgtcgg aatctggggg cgtgcgaggc agcctgggct cccctggaaa 720
tcgggaaaac aaggagaaga aggtcttcat cagcctggta ggctcccgag gccttggctg 780
cagcatttcc agcggcccca tccagaagcc tggcatcttt atcagccatg tgaaacctgg 840
ctccctgtct gctgaggtgg gattggagat aggggaccag attgtcgaag tcaatggcgt 900
cgacttctct aacctggatc acaaggaggg ccgggagctg ttcatgacag accgggagcg 960
gctggcagag gcgcggcagc gtgagctgca gcggcaggag cttctcatgc agaagcggct 1020
ggcgatggag tccaacaaga tcctccagga gcagcaggag atggagcggc aaaggagaaa 1080
agaaattgcc cagaaggcag cagaggaaaa tgagagatac cggaaggaga tggaacagat 1140
tgtagaggag gaagagaagt ttaagaagca atgggaagaa gactggggct caaaggaaca 1200
gctactcttg cctaaaacca tcactgctga ggtacaccca gtaccccttc gcaagccaaa 1260
gtatgatcag ggagtggaac ctgagctcga gcccgcagat gacctggatg gaggcacgga 1320
ggagcaggga gagcaggatt tccggaaata tgaggaaggc tttgacccct actctatgtt 1380
caccccagag cagatcatgg ggaaggatgt ccggctccta cgcatcaaga aggagggatc 1440
cttagacctg gccctggaag gcggtgtgga ctcccccatt gggaaggtgg tcgtttctgc 1500
tgtgtatgag cggggagctg ctgagcggca tggtggcatt gtgaaagggg acgagatcat 1560
ggcaatcaac ggcaagattg tgacagacta caccctggct gaggctgagg ctgccctgca 1620
gaaggcctgg aatcagggcg gggactggat cgaccttgtg gttgccgtct gccccccaaa 1680
ggagtatgac gatgagctga ccttcttctg aagtccaaaa ggggaaacca aattcaccgt 1740
taggaaacag tgagctccgg ccccacctcg tgaacacaaa gcctcggatc agccttgaga 1800
gaggccacac tacacacacc agatggcatc cttgggacct gaatctatca cccaggaatc 1860
tcaaactccc tttggccctg aaccagggcc agataaggaa cagctcgggc cactcttctg 1920
aaggccaacg tggaggaaag ggagcagcca gccatttggg agaagatctc aaggatccag 1980
actctcattc ctttcctctg gcccagtgaa tttggtctct cccagctctg ggggactcct 2040
tccttgaacc ctaataagac cccactggag tctctctctc tccatccctc tcctctgccc 2100
tctgctctaa ttgctgccag gattgtcact ccaaacctta ctctgagctc attaataaaa 2160
tagatttatt ttccagctta 2180
<210> 22
<211> 533
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Met Asp Arg Lys Val Ala Arg Glu Phe Arg His Lys Val Asp Phe Leu
1 5 10 15
Ile Glu Asn Asp Ala Glu Lys Asp Tyr Leu Tyr Asp Val Leu Arg Met
20 25 30
Tyr His Gln Thr Met Asp Val Ala Val Leu Val Gly Asp Leu Lys Leu
35 40 45
Val Ile Asn Glu Pro Ser Arg Leu Pro Leu Phe Asp Ala Ile Arg Pro
50 55 60
Leu Ile Pro Leu Lys His Gln Val Glu Tyr Asp Gln Leu Thr Pro Arg
65 70 75 80
Arg Ser Arg Lys Leu Lys Glu Val Arg Leu Asp Arg Leu His Pro Glu
85 90 95
Gly Leu Gly Leu Ser Val Arg Gly Gly Leu Glu Phe Gly Cys Gly Leu
100 105 110
Phe Ile Ser His Leu Ile Lys Gly Gly Gln Ala Asp Ser Val Gly Leu
115 120 125
Gln Val Gly Asp Glu Ile Val Arg Ile Asn Gly Tyr Ser Ile Ser Ser
130 135 140
Cys Thr His Glu Glu Val Ile Asn Leu Ile Arg Thr Lys Lys Thr Val
145 150 155 160
Ser Ile Lys Val Arg His Ile Gly Leu Ile Pro Val Lys Ser Ser Pro
165 170 175
Asp Glu Pro Leu Thr Trp Gln Tyr Val Asp Gln Phe Val Ser Glu Ser
180 185 190
Gly Gly Val Arg Gly Ser Leu Gly Ser Pro Gly Asn Arg Glu Asn Lys
195 200 205
Glu Lys Lys Val Phe Ile Ser Leu Val Gly Ser Arg Gly Leu Gly Cys
210 215 220
Ser Ile Ser Ser Gly Pro Ile Gln Lys Pro Gly Ile Phe Ile Ser His
225 230 235 240
Val Lys Pro Gly Ser Leu Ser Ala Glu Val Gly Leu Glu Ile Gly Asp
245 250 255
Gln Ile Val Glu Val Asn Gly Val Asp Phe Ser Asn Leu Asp His Lys
260 265 270
Glu Gly Arg Glu Leu Phe Met Thr Asp Arg Glu Arg Leu Ala Glu Ala
275 280 285
Arg Gln Arg Glu Leu Gln Arg Gln Glu Leu Leu Met Gln Lys Arg Leu
290 295 300
Ala Met Glu Ser Asn Lys Ile Leu Gln Glu Gln Gln Glu Met Glu Arg
305 310 315 320
Gln Arg Arg Lys Glu Ile Ala Gln Lys Ala Ala Glu Glu Asn Glu Arg
325 330 335
Tyr Arg Lys Glu Met Glu Gln Ile Ser Glu Glu Glu Glu Lys Phe Lys
340 345 350
Lys Gln Trp Glu Glu Asp Trp Gly Ser Lys Glu Gln Leu Ile Leu Pro
355 360 365
Lys Thr Ile Thr Ala Glu Val His Pro Val Pro Leu Arg Lys Pro Lys
370 375 380
Tyr Asp Gln Gly Val Glu Pro Glu Leu Glu Pro Ala Asp Asp Leu Asp
385 390 395 400
Gly Gly Thr Glu Glu Gln Gly Glu Gln Asp Phe Arg Lys Tyr Glu Glu
405 410 415
Gly Phe Asp Pro Tyr Ser Met Phe Thr Pro Glu Gln Ile Met Gly Lys
420 425 430
Asp Val Arg Leu Leu Arg Ile Lys Lys Glu Gly Ser Leu Asp Leu Ala
435 440 445
Leu Glu Gly Gly Val Asp Ser Pro Ile Gly Lys Val Val Val Ser Ala
450 455 460
Val Tyr Glu Arg Gly Ala Ala Glu Arg His Gly Gly Ile Val Lys Gly
465 470 475 480
Asp Glu Ile Met Ala Ile Asn Gly Lys Ile Val Thr Asp Tyr Thr Leu
485 490 495
Ala Glu Ala Glu Ala Ala Leu Gln Lys Ala Trp Asn Gln Gly Gly Asp
500 505 510
Trp Ile Asp Leu Val Val Ala Val Cys Pro Pro Lys Glu Tyr Asp Asp
515 520 525
Glu Leu Thr Phe Phe
530
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 23
gaggtaccat ggaccggaag gtggcccgag 30
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 24
caggatccgg acaatttcat cccctac 27
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 25
ctcattgaaa atgacgcaga gaagg 25
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 26
tctcactttg atggacacgg tctt 24
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 27
gaacccaacc gcctgccg 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 28
tgcagacggt ccaagcgt 18
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 29
gtgaggccgg tgctgagtat g 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 30
gccaaagttg tcatggatga c 21
<210> 31
<211> 909
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 31
Met Asp Arg Lys Val Ala Arg Glu Phe Arg His Lys Val Asp Phe Leu
1 5 10 15
Ile Glu Asn Asp Ala Glu Lys Asp Tyr Leu Tyr Asp Val Leu Arg Met
20 25 30
Tyr His Gln Thr Met Asp Val Ala Val Leu Val Gly Asp Leu Lys Leu
35 40 45
Val Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Pro Leu Phe Asp Ala Ile Arg Pro
50 55 60
Leu Ile Pro Leu Lys His Gln Glu Tyr Asp Gln Leu Thr Pro Arg Arg
65 70 75 80
Ser Arg Lys Leu Lys Glu Val Arg Leu Asp Arg Leu His Pro Glu Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Ser Val Arg Gly Gly Leu Glu Phe Gly Cys Gly Leu Phe
100 105 110
Ile Ser His Leu Ile Lys Gly Gly Gln Ala Asp Ser Val Gly Leu Gln
115 120 125
Val Gly Asp Glu Ile Val Arg Ile Asn Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Cys
130 135 140
Thr His Glu Glu Val Ile Asn Leu Ile Arg Thr Lys Lys Thr Val Ser
145 150 155 160
Ile Lys Val Arg His Ile Gly Leu Ile Pro Val Lys Ser Ser Pro Glu
165 170 175
Glu Ser Leu Lys Trp Gln Tyr Val Asp Gln Phe Val Ser Glu Ser Gly
180 185 190
Gly Val Arg Gly Gly Leu Gly Ser Pro Gly Asn Arg Thr Thr Lys Glu
195 200 205
Lys Lys Val Phe Ile Ser Leu Val Gly Ser Arg Gly Leu Gly Cys Ser
210 215 220
Ile Ser Ser Gly Pro Ile Gln Lys Pro Gly Ile Phe Val Ser His Val
225 230 235 240
Lys Pro Gly Ser Leu Ser Ala Glu Val Gly Leu Glu Thr Gly Asp Gln
245 250 255
Ile Val Glu Val Asn Gly Ile Asp Phe Thr Asn Leu Asp His Lys Glu
260 265 270
Ala Val Asn Val Leu Lys Ser Ser Arg Ser Leu Thr Ile Ser Ile Val
275 280 285
Ala Gly Ala Gly Arg Glu Leu Phe Met Thr Asp Arg Glu Arg Leu Glu
290 295 300
Glu Ala Arg Gln Arg Glu Leu Gln Arg Gln Glu Leu Leu Met Gln Lys
305 310 315 320
Arg Leu Ala Met Glu Ser Asn Lys Ile Leu Gln Glu Gln Gln Glu Met
325 330 335
Glu Arg Gln Arg Arg Lys Glu Ile Ala Gln Lys Ala Ala Glu Glu Asn
340 345 350
Glu Arg Tyr Arg Lys Glu Met Glu Gln Ile Ser Glu Glu Glu Glu Lys
355 360 365
Phe Lys Lys Gln Trp Glu Glu Asp Trp Gly Ser Lys Glu Gln Leu Ile
370 375 380
Leu Pro Lys Thr Ile Thr Ala Glu Val His Pro Val Pro Leu Arg Lys
385 390 395 400
Pro Lys Ser Phe Gly Trp Phe Tyr Arg Tyr Asp Gly Lys Phe Pro Thr
405 410 415
Ile Arg Lys Lys Ala Lys Glu Lys Lys Lys Ala Lys Tyr Asp Ser Leu
420 425 430
Gln Asp Leu Arg Lys Asn Lys Lys Glu Leu Glu Phe Glu Gln Lys Leu
435 440 445
Tyr Lys Glu Lys Glu Glu Met Leu Glu Lys Glu Lys Gln Leu Lys Ile
450 455 460
Asn Arg Leu Ala Gln Glu Val Ser Glu Thr Glu Arg Glu Asp Leu Glu
465 470 475 480
Glu Ser Glu Lys Thr Gln Tyr Trp Val Glu Arg Leu Cys Gln Thr Arg
485 490 495
Leu Glu Gln Ile Ser Ser Ala Glu Asn Glu Ile Pro Glu Met Thr Thr
500 505 510
Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Val Ser Pro Leu Ala Pro Pro Leu
515 520 525
Arg Arg Phe Ala Gly Gly Ile His Leu His Thr Thr Asp Leu Asp Asp
530 535 540
Ile Pro Leu Asp Met Phe Tyr Tyr Pro Pro Lys Thr Pro Ser Ala Leu
545 550 555 560
Pro Val Met Pro His Pro Pro Ser Val Asn Ser Pro Ser Lys Val Pro
565 570 575
Ala Pro Pro Val Leu Pro Ser Ser Gly His Val Ser Ser Ser Ser Ser
580 585 590
Pro Trp Val Gln Arg Thr Pro Pro Pro Ile Pro Ile Pro Pro Pro Pro
595 600 605
Ser Ile Pro Thr Gln Asp Leu Thr Pro Thr Arg Pro Leu Pro Ser Ala
610 615 620
Leu Glu Glu Ala Leu Gly Asn His Pro Phe Arg Thr Gly Asp Pro Gly
625 630 635 640
His Pro Ala Asp Asp Trp Glu Ala Asn Thr His Ser Gly Lys Pro Ser
645 650 655
Ser Ser Pro Thr Thr Glu Arg Ser Phe Pro Pro Ala Pro Lys Thr Phe
660 665 670
Cys Pro Ser Pro Gln Pro Pro Arg Gly Pro Gly Val Ser Thr Ile Ser
675 680 685
Lys Pro Val Met Val His Gln Glu His Asn Phe Val Tyr Arg Pro Ala
690 695 700
Val Lys Ser Glu Val Leu Pro Gln Glu Met Leu Lys Arg Met Val Val
705 710 715 720
Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Gln Asp Phe Arg Lys Tyr Glu Glu Gly Phe
725 730 735
Asp Pro Tyr Ser Met Phe Ser Pro Glu Gln Ile Ala Gly Lys Asp Val
740 745 750
Arg Leu Leu Arg Ile Lys Lys Glu Gly Ser Leu Asp Leu Ala Leu Glu
755 760 765
Gly Gly Val Asp Ser Pro Val Gly Lys Val Val Val Ser Ala Val Tyr
770 775 780
Glu Gly Gly Ala Ala Glu Arg His Gly Gly Val Val Lys Gly Asp Glu
785 790 795 800
Ile Met Ala Ile Asn Gly Lys Ile Val Thr Asp Tyr Thr Leu Ala Glu
805 810 815
Ala Glu Ala Ala Leu Gln Lys Ala Trp Asn Gln Gly Gly Asp Trp Ile
820 825 830
Asp Leu Val Val Ala Val Cys Pro Pro Lys Glu Tyr Asp Asp Glu Leu
835 840 845
Ser Ser Leu Pro Ser Ser Ala Ala Glu Ser Pro Gln Leu Ala Arg Lys
850 855 860
Gln Leu Glu Ala Tyr Glu Pro Val Cys Arg His Gly Phe Phe Leu Gln
865 870 875 880
Leu Glu Pro Thr Asn Leu Leu Leu Lys Ser Arg Glu Arg Asn Gln Thr
885 890 895
Asp Pro Ser Trp Arg Pro Ala Ser Ser Ala Pro Ser Pro
900 905
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 32
Met Asp Arg Lys Val Ala Arg Glu Phe Arg His Lys Val Asp Phe Leu
1 5 10 15
Ile Glu Asn Asp Ala Glu Lys Asp Tyr Leu Tyr Asp Val Leu Arg Met
20 25 30
Tyr His Gln Thr Met Asp Val Ala Val Leu Val Gly Asp Leu Lys Leu
35 40 45
Val Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Pro Leu Phe Asp Ala Ile Arg Pro
50 55 60
Leu Ile Pro Leu Lys His Gln Glu Thr Glu Gly Gly Thr Leu Gly Pro
65 70 75 80
Ser Ala Pro Arg Arg Ser Arg Pro Gln Arg Ala Trp Arg Pro Gly Ile
85 90 95
Trp Leu Trp Thr Leu Tyr Leu Pro Pro His Gln Arg Trp Pro Gly Arg
100 105 110
Gln Arg Trp Ala Ser Gly Arg Gly
115 120
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A-1】
【図16A-2】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図17-1】
【図17-2】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-02-03
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
この出願の明細書に記載された発明。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】