特開 2023-38844 血管網の製造方法、及び血管網の製造装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023038844

(43)【公開日】2023-03-17

(54)【発明の名称】血管網の製造方法、及び血管網の製造装置

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20230310BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20230310BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12M3/00 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021145770

(22)【出願日】2021-09-07

(71)【出願人】

【識別番号】000106760

【氏名又は名称】ＣＫＤ株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】591173198

【氏名又は名称】学校法人東京女子医科大学

(71)【出願人】

【識別番号】899000068

【氏名又は名称】学校法人早稲田大学

(74)【代理人】

【識別番号】100121821

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 強

(74)【代理人】

【識別番号】100125575

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 洋

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 仁也

(72)【発明者】

【氏名】堀 邦聡

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 雅

(72)【発明者】

【氏名】畠山 肇

(72)【発明者】

【氏名】清水 達也

(72)【発明者】

【氏名】坂口 勝久

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029BB11

4B029CC02

4B029DG08

4B029GA02

4B029GB05

4B065AA90X

4B065BC41

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】血管細胞を培養する効率が低下することを抑制しつつ、使用する血管細胞の量を減少させることのできる血管網の製造方法を提供する。
【解決手段】ハウジング（３０）の上部に棒状部材（５０）を横方向から通す第１工程と、ハウジングに棒状部材よりも下の第１所定位置まで、血管細胞を含まない第１ゲル溶液を入れる第２工程と、第１ゲル溶液をゲル化させて第１ゲル層（ＣＧ１）を形成する第３工程と、ハウジングにおいて第１ゲル層の上に棒状部材よりも上の第２所定位置まで、血管細胞を含む第２ゲル溶液を入れる第４工程と、第２ゲル溶液をゲル化させて第２ゲル層（ＣＧ２）を形成する第５工程と、第２ゲル層から棒状部材を横方向へ所定長さ引き抜いて、引き抜いた後の空間により所定流路を形成する第６工程と、所定流路に培養液を灌流させて血管細胞を培養する第７工程と、を含む血管網の製造方法。
【選択図】 図１３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

内部に液体を貯留可能なハウジングの上部に棒状部材を横方向から通す第１工程と、
前記ハウジングに前記棒状部材よりも下の第１所定位置まで、血管細胞を含まない第１ゲル溶液を入れる第２工程と、
前記第１ゲル溶液をゲル化させて第１ゲル層を形成する第３工程と、
前記ハウジングにおいて前記第１ゲル層の上に前記棒状部材よりも上の第２所定位置まで、血管細胞を含む第２ゲル溶液を入れる第４工程と、
前記第２ゲル溶液をゲル化させて第２ゲル層を形成する第５工程と、
前記第２ゲル層から前記棒状部材を横方向へ所定長さ引き抜いて、引き抜いた後の空間により所定流路を形成する第６工程と、
前記所定流路に培養液を灌流させて前記血管細胞を培養する第７工程と、
を含む血管網の製造方法。

【請求項2】

前記第６工程において、前記所定長さは、前記ハウジングの内部に前記棒状部材の一部が残る長さであり、
前記第６工程と前記第７工程との間において、前記血管細胞を含む液を前記所定流路の前記棒状部材と反対側の端部から注入する注入工程を含む、請求項１に記載の血管網の製造方法。

【請求項3】

前記注入工程と前記第７工程との間において、前記第１ゲル層及び前記第２ゲル層を培養液に浸漬させた状態で前記ハウジングから前記棒状部材を完全に抜き去る抜去工程を含む、請求項２に記載の血管網の製造方法。

【請求項4】

前記ハウジング及び前記棒状部材を滅菌していない状態で前記第１工程を実行し、
前記ハウジング及び前記棒状部材を滅菌した状態で前記第２工程を実行する、請求項１～３のいずれか１項に記載の血管網の製造方法。

【請求項5】

内部に液体を貯留可能なハウジングと、
前記ハウジングにおいて上下方向の中央よりも上の部分に横方向から通された棒状部材と、
前記ハウジングと前記棒状部材とを前記棒状部材の長手方向に相対移動可能とする移動機構と、
を備える血管網の製造装置。

【請求項6】

前記棒状部材を複数備え、
前記移動機構は、前記ハウジングと複数の前記棒状部材とを前記棒状部材の長手方向に同時に相対移動可能とする、請求項５に記載の血管網の製造装置。

【請求項7】

前記移動機構は、前記ハウジングの内部に前記棒状部材の一部が残る状態において、前記ハウジングと前記棒状部材との相対移動を停止可能とする、請求項５又は６に記載の血管網の製造装置。

【請求項8】

前記相対移動を停止した状態で、前記ハウジングにおいて内部に前記棒状部材の一部が残る側の第１端部よりも、前記第１端部と反対側の第２端部を高い位置で保持する保持部材を備える、請求項７に記載の血管網の製造装置。

【請求項9】

前記ハウジングにおいて内部に前記棒状部材の一部が残る側と反対側の端部に取り付けられ、前記ハウジングの内部に培養液を導入する流路が形成された導入部材を備え、
前記ハウジング及び前記導入部材には、互いに対向する部分と反対側の部分に上側ほど幅が狭くなる傾斜部が形成されている、請求項５～８のいずれか１項に記載の血管網の製造装置。

【請求項10】

前記ハウジングと前記導入部材との間に、前記培養液を貯留可能な貯留空間が形成される、請求項９に記載の血管網の製造装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血管網を製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、培養容器の内部に棒状部材を通し、血管細胞を含むコラーゲンゲルを培養容器内に充填した後に棒状部材を抜き去り、コラーゲンゲル全体を培地に浸漬させ、棒状部材を抜き去った後の空間（空洞流路）に培地を灌流させることにより、血管網を製造する方法がある（特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】ＷＯ２０２１／０６６１９６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

ところで、特許文献１に記載の血管網の製造方法では、空洞流路に培地を灌流させてコラーゲンゲル中の血管細胞を培養することにより、空洞流路に主血管を形成するとともに主血管の周辺に毛細血管を形成している。このため、コラーゲンゲルにおいて空洞流路から離れた部分に含まれる血管細胞は主血管及び毛細血管の形成に寄与せず、使用する血管細胞の量が多くなる。

【0005】

本発明は、こうした課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、血管細胞を培養する効率が低下することを抑制しつつ、使用する血管細胞の量を減少させることのできる血管網の製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記課題を解決するための第１の手段は、血管網の製造方法であって、
内部に液体を貯留可能なハウジングの上部に棒状部材を横方向から通す第１工程と、
前記ハウジングに前記棒状部材よりも下の第１所定位置まで、血管細胞を含まない第１ゲル溶液を入れる第２工程と、
前記第１ゲル溶液をゲル化させて第１ゲル層を形成する第３工程と、
前記ハウジングにおいて前記第１ゲル層の上に前記棒状部材よりも上の第２所定位置まで、血管細胞を含む第２ゲル溶液を入れる第４工程と、
前記第２ゲル溶液をゲル化させて第２ゲル層を形成する第５工程と、
前記第２ゲル層から前記棒状部材を横方向へ所定長さ引き抜いて、引き抜いた後の空間により所定流路を形成する第６工程と、
前記所定流路に培養液を灌流させて前記血管細胞を培養する第７工程と、
を含む。

【0007】

上記工程によれば、第１工程において、内部に液体を貯留可能なハウジングの上部に棒状部材が横方向から通される。第２工程において、前記ハウジングに前記棒状部材よりも下の第１所定位置まで、血管細胞を含まない第１ゲル溶液が入れられる。第１ゲル溶液は血管細胞を含まないため、使用する血管細胞の量を減少させることができる。

【0008】

第３工程において、前記第１ゲル溶液がゲル化されて第１ゲル層が形成される。第４工程において、前記ハウジングにおいて前記第１ゲル層の上に前記棒状部材よりも上の第２所定位置まで、血管細胞を含む第２ゲル溶液が入れられる。第５工程において、前記第２ゲル溶液がゲル化されて第２ゲル層が形成される。このため、第１ゲル層の上において、棒状部材を覆うように第２ゲル層を形成することができる。そして、第６工程において、前記第２ゲル層から前記棒状部材が横方向へ所定長さ引き抜かれ、引き抜かれた後の空間により所定流路が形成される。第７工程において、前記所定流路に培養液が灌流されて前記血管細胞が培養される。

【0009】

ここで、ハウジングの内部において所定流路よりも下の部分には、血管細胞を含まない第１ゲル層が形成されている。このため、血管網の形成に寄与しにくい部分では、血管細胞を減少させることができる。一方、ハウジングの内部において所定流路を含む部分には、血管細胞を含む第２ゲル層が形成されている。このため、血管網の形成に寄与する部分には、血管細胞を含ませることができる。したがって、血管細胞を培養する効率が低下することを抑制しつつ、使用する血管細胞の量を減少させることができる。

【0010】

なお、形成された血管網の上に細胞シートを載せて培養する場合に、主血管よりも上に形成された血管網が細胞シートと連通し、主血管よりも下に形成された血管網は細胞シートと連通しにくい。このため、主血管よりも下の部分の血管網が少なかったとしても、血管網の上に載せた細胞シートを培養する際に支障をきたさない。

【0011】

第２の手段では、前記第６工程において、前記所定長さは、前記ハウジングの内部に前記棒状部材の一部が残る長さであり、前記第６工程と前記第７工程との間において、前記血管細胞を含む液を前記所定流路の前記棒状部材と反対側の端部から注入する注入工程を含む。

【0012】

上記工程によれば、前記第６工程において、前記所定長さは、前記ハウジングの内部に前記棒状部材の一部が残る長さである。このため、第６工程を終えた後において、所定流路の一方の端部は棒状部材により閉塞された状態になる。そして、前記第６工程と前記第７工程との間の注入工程において、前記血管細胞を含む液が、前記所定流路の前記棒状部材と反対側の端部から注入される。このため、前記所定流路の前記棒状部材と反対側の端部から注入された血管細胞を含む液は、棒状部材により閉塞された所定流路の端部から排出されず、所定流路の内面から第２ゲル層へ浸透する。このとき、血管細胞は所定流路の内面に留まるため、所定流路の内面に血管細胞を効率的に付着させることができる。したがって、主血管を形成する効率を向上させることができ、使用する血管細胞の量を減少させることができる。

【0013】

第３の手段では、前記注入工程と前記第７工程との間において、前記第１ゲル層及び前記第２ゲル層を培養液に浸漬させた状態で前記ハウジングから前記棒状部材を完全に抜き去る抜去工程を含む。こうした工程によれば、前記ハウジングの内部に残った前記棒状部材の一部をハウジングから抜き去った時に、第２ゲル層において棒状部材の一部が存在していた部分に培養液を浸入させることができる。このため、所定流路に気泡が入ることを抑制することができ、所定流路の内面と培養液との接触を良好にすることができる。したがって、血管細胞を培養する効率が低下することを抑制することができる。

【0014】

第４の手段では、前記ハウジング及び前記棒状部材を滅菌していない状態で前記第１工程を実行し、前記ハウジング及び前記棒状部材を滅菌した状態で前記第２工程を実行する。こうした工程によれば、クリーンベンチ（無菌室）での無菌操作の工程を減らすことができ、コンタミネーションのリスクを低減できる。

【0015】

第５の手段は、血管網の製造装置であって、
内部に液体を貯留可能なハウジングと、
前記ハウジングにおいて上下方向の中央よりも上の部分に横方向から通された棒状部材と、
前記ハウジングと前記棒状部材とを前記棒状部材の長手方向に相対移動可能とする移動機構と、
を備える。

【0016】

上記構成によれば、ハウジングにおいて上下方向の中央よりも下の部分に、血管細胞を含まない第１ゲル溶液を入れることができる。第１ゲル溶液は血管細胞を含まないため、使用する血管細胞の量を減少させることができる。

【0017】

続いて、第１ゲル溶液をゲル化させて第１ゲル層を形成することができる。その後、ハウジングにおいて第１ゲル層の上に棒状部材よりも上の位置まで、血管細胞を含む第２ゲル溶液を入れることができる。第２ゲル溶液をゲル化させて第２ゲル層を形成することができる。このため、第１ゲル層の上において、棒状部材を覆うように第２ゲル層を形成することができる。

【0018】

続いて、移動機構によって前記ハウジングと前記棒状部材とを前記棒状部材の長手方向に相対移動させることにより、第２ゲル層から棒状部材が引き抜かれた後の空間により所定流路を形成することができる。その後、所定流路に培養液を灌流させて血管細胞を培養することができる。

【0019】

ここで、ハウジングの内部において所定流路よりも下の部分には、血管細胞を含まない第１ゲル層が形成される。このため、血管網の形成に寄与しにくい部分では、血管細胞を減少させることができる。一方、ハウジングの内部において所定流路を含む部分には、血管細胞を含む第２ゲル層が形成される。このため、血管網の形成に寄与する部分には、血管細胞を含ませることができる。したがって、血管細胞を培養する効率が低下することを抑制しつつ、使用する血管細胞の量を減少させることができる。

【0020】

第６の手段では、前記棒状部材を複数備え、前記移動機構は、前記ハウジングと複数の前記棒状部材とを前記棒状部材の長手方向に同時に相対移動可能とする。こうした構成によれば、移動機構によって前記ハウジングと複数の前記棒状部材とを前記棒状部材の長手方向に同時に相対移動させることにより、第２ゲル層に複数の所定流路を同時に形成することができる。したがって、第２ゲル層に複数の所定流路を、安定して効率的に形成することができる。さらに、第１ゲル層及び第２ゲル層を培養液に浸漬させた状態においても、前記ハウジングと複数の前記棒状部材とを前記棒状部材の長手方向に同時に相対移動させることができるため、所定流路に気泡が入ることを抑制することができる。

【0021】

第７の手段では、前記移動機構は、前記ハウジングの内部に前記棒状部材の一部が残る状態において、前記ハウジングと前記棒状部材との相対移動を停止可能とする。こうした構成によれば、前記ハウジングの内部に前記棒状部材の一部が残る状態において前記ハウジングと前記棒状部材との相対移動を停止した時に、所定流路の一方の端部は棒状部材により閉塞された状態になる。そして、血管細胞を含む培養液を、所定流路の棒状部材と反対側の端部から注入することができる。このため、所定流路の棒状部材と反対側の端部から注入された培養液は、棒状部材により閉塞された所定流路の端部から排出されず、所定流路の内面から第２ゲル層へ浸透する。このとき、血管細胞は所定流路の内面に留まるため、所定流路の内面に血管細胞を効率的に付着させることができる。したがって、主血管を形成する効率を向上させることができ、使用する血管細胞の量を減少させることができる。

【0022】

第８の手段では、前記相対移動を停止した状態で、前記ハウジングにおいて内部に前記棒状部材の一部が残る側の第１端部よりも、前記第１端部と反対側の第２端部を高い位置で保持する保持部材を備える。このため、血管細胞を含む液を、所定流路の棒状部材と反対側の端部から注入する際に、作業者は所定流路の位置を視認しやすくなる。

【0023】

第９の手段では、前記ハウジングにおいて内部に前記棒状部材の一部が残る側と反対側の端部に取り付けられ、前記ハウジングの内部に培養液を導入する流路が形成された導入部材を備え、前記ハウジング及び前記導入部材には、互いに対向する部分と反対側の部分に上側ほど幅が狭くなる傾斜部が形成されている。

【0024】

上記構成によれば、血管網の製造装置は、前記ハウジングにおいて内部に前記棒状部材の一部が残る側と反対側の端部に取り付けられ、前記ハウジングの内部に培養液を導入する流路が形成された導入部材を備えている。このため、ハウジングに導入部材を取り付けることにより、導入部材を介してハウジングの内部、すなわち上記所定流路に培養液を導入することができる。

【0025】

ここで、ハウジングに導入部材を取り付ける際に、作業者が培養液に触れると培養液を汚染するおそれがある。この点、前記ハウジング及び前記導入部材には、互いに対向する部分と反対側の部分に上側ほど幅が狭くなる傾斜部が形成されている。このため、ハウジングに形成された傾斜部と導入部材に形成された傾斜部とを挟むように、上から下へ冶具を押し当てることにより、ハウジングと導入部材とを近づけることができる。したがって、作業者が培養液に触れずにハウジングに導入部材を取り付けることができ、培養液を汚染することを抑制することができる。

【0026】

第１０の手段では、前記ハウジングと前記導入部材との間に、前記培養液を貯留可能な貯留空間が形成される。こうした構成によれば、貯留空間から上記所定流路へ培養液を供給することができ、所定流路に気泡や汚染物質が入ることを抑制することができる。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】血管網の製造装置の斜視図。

【図2】ベースの斜視図。

【図3】ハウジングの斜視図。

【図4】ワイヤの斜視図。

【図5】ハウジングの下部を示す斜視図。

【図6】キャップの斜視図。

【図7】キャップの斜視図。

【図8】ハウジングを準備する工程を示す模式図。

【図9】ワイヤを通す工程を示す模式図。

【図10】第１コラーゲン溶液を入れる工程を示す模式図。

【図11】第１コラーゲン層を形成する工程を示す模式図。

【図12】第２コラーゲン溶液を入れる工程を示す模式図。

【図13】第２コラーゲン層を形成する工程を示す模式図。

【図14】所定流路を形成する工程を示す模式図。

【図15】ワイヤを途中まで抜く工程を示す斜視図。

【図16】所定流路にＨＵＶＥＣ液を注入する工程を示す模式図。

【図17】ハウジングを傾けた状態を示す斜視図。

【図18】ワイヤを抜き去る工程を示す模式図。

【図19】取付部にキャップを取り付ける工程を示す模式図。

【図20】冶具により取付部にキャップを挿入する状態を示す斜視図。

【図21】取付部にキャップを取り付けた状態を示す斜視図。

【図22】貯留空間を示す模式図。

【図23】保持部材の変更例を示す斜視図。

【図24】ハウジングを傾けた状態を示す斜視図。

【発明を実施するための形態】

【0028】

以下、血管網を製造する血管網の製造装置１００に具現化した一実施形態について、図面を参照して説明する。

【0029】

図１に示すように、血管網の製造装置１００は、ベース１０、ハウジング３０、ワイヤ５０等を備えている。同図では、血管網の製造装置１００がディッシュＤ内に配置された状態を示している。ディッシュＤは、血管網（細胞）の培養で使用される一般的な容器である。ディッシュＤは、有底円筒状に形成されている。

【0030】

図２に示すように、ベース１０は、矩形板状に形成されている。ベース１０は、上面（一面）が平面（平坦）に形成された矩形板状の底部１１を備えている。

【0031】

底部１１の短手方向の両端には、底部１１から突出した突条１２，１３がそれぞれ設けられている。突条１２，１３は、底部１１の短手方向の両端に沿って延びている。突条１２と突条１３との間隔は一定である。突条１２，１３の長手方向の中間部において突条１２，１３の上部（底部１１と反対側の端部）には、それぞれ押さえ部１４，１５が設けられている。押さえ部１４，１５は、底部１１の短手方向の内側へ突出しており、底部１１と押さえ部１４，１５との間に配置された部材が上（底部１１から離れる方向）へ移動することを規制する。

【0032】

底部１１の長手方向の一端部には、ワイヤ受け部２０が設けられている。ワイヤ受け部２０には、ワイヤ５０（棒状部材）を嵌めることが可能な複数の溝２１が形成されている。複数の溝２１は、底部１１の長手方向に延びている。複数の溝２１は、上方（底部１１から離れる方向）が開口している。

【0033】

底部１１の長手方向の他端部には、スペーサ２４，２５が設けられている。スペーサ２４，２５は、底部１１の短手方向の両端部にそれぞれ設けられている。スペーサ２４，２５は、ベース１０をディッシュＤ内に配置した場合に、ベース１０とディッシュＤとの隙間をなくす（小さくする）ことのできる寸法に形成されている。

【0034】

底部１１のスペーサ２４，２５側の端部には、上方（底部１１から離れる方向）へ突出する突起２６，２７が設けられている。突起２６，２７においてワイヤ受け部２０側の部分には、上側（底部１１から離れる側）ほど幅が狭くなる傾斜部２６ａ，２７ａがそれぞれ形成されている。突起２６，２７においてワイヤ受け部２０と反対側の部分には、傾斜部は形成されていない。すなわち、突起２６，２７においてワイヤ受け部２０と反対側の面は、スペーサ２４，２５の上面に対してそれぞれ垂直になっている。なお、突起２６，２７は、それぞれスペーサ２４，２５から上方へ突出するように設けられていてもよい。

【0035】

図３は、ハウジング３０の斜視図である。ハウジング３０は、底板部３１、貯留部３３、及び取付部４０等を備えている。

【0036】

底板部３１は、矩形板状に形成されている。底板部３１の短手方向の幅は、ベース１０の突条１２と突条１３との間隔よりも狭く、押さえ部１４と押さえ部１５との間隔よりも広くなっている。底板部３１の厚さは、底部１１と押さえ部１４，１５との間隔よりも薄くなっている。このため、底部１１と押さえ部１４，１５との間に底板部３１を挿入することができる。そして、ベース１０に対して底部１１の長手方向（ワイヤ５０の長手方向）に底板部３１をスライド（ベース１０と底板部３１とを底部１１の長手方向に相対移動）可能となっている。なお、突条１２，１３、押さえ部１４，１５、及び底板部３１により、移動機構が構成されている。

【0037】

貯留部３３は、底板部３１から上方（底板部３１から離れる方向）へ四角筒状に延びている。これにより、貯留部３３は、液体を貯留可能となっている。貯留部３３の上部（上下方向の中央よりも上の部分）には、ワイヤ５０を挿入することが可能な複数の貫通孔３５，３６（図３では貫通孔３５のみ図示）が形成されている。貫通孔３５，３６は、貯留部３３において対向する壁部３３ａ，３３ｂにそれぞれ形成され、底板部３１の長手方向に延びている。貫通孔３５，３６は、筒状の保持部３７，３８にそれぞれ連通している。保持部３７，３８は、貯留部３３の内部において壁部３３ａ，３３ｂから底板部３１の長手方向にそれぞれ延びている。

【0038】

ベース１０の底部１１と押さえ部１４，１５との間にハウジング３０の底板部３１を挿入した状態において、ワイヤ受け部２０の複数の溝２１、貯留部３３の貫通孔３５，３６、及び保持部３７，３８に、直線状のワイヤ５０を挿入可能となっている（図１参照）。図４に示すように、ワイヤ５０の端部には、ストッパ５１が設けられている。ストッパ５１は、ワイヤ受け部２０に当接して、ワイヤ５０がワイヤ受け部２０よりも貯留部３３側へ移動することを規制する。

【0039】

取付部４０は、貫通孔３５，３６が形成された壁部３３ａ，３３ｂ（第１端部３０ａ側の壁部３３ａ及び第２端部３０ｂ側の壁部３３ｂ）のうち第２端部３０ｂ側の壁部３３ｂに設けられている。図８に示すように、取付部４０の内部には、後述するキャップ６０を嵌合可能な凹部４１が形成されている。凹部４１は、長円柱状に形成されている。凹部４１の底部４１ａは、貫通孔３６及び保持部３８を介して貯留部３３と連通している。底板部３１の短手方向において取付部４０の両端部には、それぞれ係合部４３，４４が形成されている。係合部４３，４４において壁部３３ａ側の部分には、上側（底板部３１から離れる側）ほど幅が狭くなる傾斜部４３ａ，４４ａがそれぞれ形成されている。係合部４３，４４において壁部３３ａと反対側の部分には、傾斜部は形成されていない。すなわち、係合部４３，４４において壁部３３ａと反対側の面は、底板部３１の上面に対して垂直になっている。

【0040】

図５は、ハウジング３０の下部を示す斜視図である。底板部３１において短手方向の両端部且つ係合部４３，４４の下方（底板部３１の長手方向の一端部）には、それぞれ溝４５，４６が形成されている。溝４５，４６は、ベース１０の突起２６，２７にそれぞれ係合可能となっている。

【0041】

図６，７は、キャップ６０の斜視図である。キャップ６０（導入部材）は、本体６１、挿入部６２、ポート部６６、及び係合部６８，６９等を備えている。

【0042】

本体６１は、矩形板状に形成されている。本体６１の一方の面から挿入部６２が突出しており、他方の面からポート部６６が突出している。挿入部６２は、長円柱状に形成されており、取付部４０の凹部４１に嵌合可能となっている。取付部４０と挿入部６２との間は、シール部材によりシールされる。キャップ６０には、挿入部６２、本体６１、及びポート部６６を貫通する流路６７が形成されている。流路６７は、挿入部６２の内部において挿入部６２の長径方向に広がっている。

【0043】

本体６１の長手方向（挿入部６２の長径方向）において本体６１の両端部には、それぞれ係合部６８，６９が形成されている。係合部６８，６９においてポート部６６側（挿入部６２と反対側）の部分には、上側（本体６１の短手方向の一方側）ほど幅が狭くなる傾斜部６８ａ，６９ａがそれぞれ形成されている。係合部６８，６９において挿入部６２側（ポート部６６と反対側）の部分には、傾斜部は形成されていない。すなわち、係合部６８，６９において挿入部６２側の面は、本体６１の面と平行になっている。

【0044】

次に、血管網を製造する手順（血管網の製造方法）について説明する。以下の手順は、上記血管網の製造装置１００を使用して作業者により実行される。

【0045】

まず、図８に示すように、クリーンベンチ（無菌室）内に滅菌したハウジング３０を準備する。

【0046】

続いて、図９に示すように、ハウジング３０の全ての貫通孔３５，３６、及び全ての保持部３７，３８にワイヤ５０をそれぞれ通す。すなわち、内部に液体を貯留可能なハウジング３０の上部（上下方向の中央よりも上の部分）にワイヤ５０を横方向から通す（第１工程）。詳しくは、図１に示すように、ディッシュＤ内にベース１０を置き、ベース１０にハウジング３０を取り付けた状態において、ワイヤ受け部２０の各溝２１に上方から各ワイヤ５０を嵌合させる。そして、ハウジング３０に対して各ワイヤ５０を横方向へ移動させて、ハウジング３０の各貫通孔３５，３６、及び各保持部３７，３８にワイヤ５０を通す。このとき、ベース１０の底部１１と押さえ部１４，１５との間にハウジング３０の底板部３１が挿入されており、ハウジング３０は最もワイヤ受け部２０側へ移動した状態になっている。

【0047】

続いて、図１０に示すように、ハウジング３０の貯留部３３にワイヤ５０の直下の位置（ワイヤ５０よりも下の第１所定位置）まで、血管細胞を含まない第１コラーゲン溶液ＣＬ１を入れる（第２工程）。第１コラーゲン溶液ＣＬ１（第１ゲル溶液）は、例えばコラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、培養液（培地）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）溶液、培養液の緩衝剤、蒸留水等を含み、血管細胞を含まない。なお、第１ゲル溶液として、コラーゲンを含む溶液に限らず、生分解性ポリマーを含む溶液を採用することができる。生分解性ポリマーとして、フィブリン、ゼラチン、多糖類、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、キチン、キトサン等の単独、若しくは２種以上の混合物を採用することができる。

【0048】

続いて、図１１に示すように、例えば第１コラーゲン溶液ＣＬ１を３７［℃］で４５［ｍｉｎ］インキュベート（保温）する。これにより、第１コラーゲン溶液ＣＬ１をゲル化（硬化）させて、第１コラーゲン層ＣＧ１（第１ゲル層）を形成する（第３工程）。

【0049】

続いて、図１２に示すように、ハウジング３０の貯留部３３に上端まで（ワイヤ５０よりも上の第２所定位置）まで、血管細胞を含む第２コラーゲン溶液ＣＬ２を入れる（第４工程）。すなわち、ハウジング３０の貯留部３３において第１コラーゲン層ＣＧ１の上にワイヤ５０及び保持部３７，３８が浸漬するまで、血管細胞を含む第２コラーゲン溶液ＣＬ２を入れる。第２コラーゲン溶液ＣＬ２（第２ゲル溶液）は、例えばコラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、培養液（培地）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）溶液、培養液の緩衝剤、トロンビン溶液、フィブリノゲン溶液、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）液、蒸留水等を含む。なお、第２ゲル溶液として、コラーゲン及び血管細胞を含む溶液に限らず、生分解性ポリマー及び血管細胞を含む溶液を採用することができる。生分解性ポリマーとして、フィブリン、ゼラチン、多糖類、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、キチン、キトサン等の単独、若しくは２種以上の混合物を採用することができる。

【0050】

続いて、図１３に示すように、例えば第２コラーゲン溶液ＣＬ２を３７［℃］で４５［ｍｉｎ］インキュベート（培養）する。これにより、第２コラーゲン溶液ＣＬ２をゲル化（硬化）させて、第２コラーゲン層ＣＧ２（第２ゲル層）を形成する（第５工程）。

【0051】

続いて、図１４に示すように、ハウジング３０をディッシュＤに入れて培養液Ｍに浸漬させ、第２コラーゲン層ＣＧ２（ハウジング３０）からワイヤ５０を途中まで（横方向へ所定長さ）引き抜く。すなわち、所定長さは、ハウジング３０の内部にワイヤ５０の一部が残る長さである。そして、第２コラーゲン層ＣＧ２からワイヤ５０を引き抜いた空間により、培養液Ｍの所定流路Ｐを形成する（第６工程）。詳しくは、図１５に示すように、ハウジング３０をワイヤ受け部２０から離すようにベース１０に対してスライドさせる。このとき、突条１２，１３によりハウジング３０の底板部３１がガイドされるとともに、押さえ部１４，１５により底板部３１から離れる方向への底板部３１の移動が規制される。これにより、ワイヤ５０に平行にハウジング３０が移動され、全て（８本）のワイヤ５０とハウジング３０とがワイヤ５０の長手方向に同時に相対移動される。そして、突起２６，２７（図１参照）の傾斜部２６ａ，２７ａを、底板部３１におけるワイヤ受け部２０と反対側の端部が乗り越えて、突起２６，２７に底板部３１の溝４５，４６（図５参照）がそれぞれ係合する。すなわち、ハウジング３０の内部にワイヤ５０の一部が残る状態において、ハウジング３０とワイヤ５０との相対移動が停止可能（ハウジング３０とワイヤ５０とを係止可能）となっている。

【0052】

続いて、図１６に示すように、ハウジング３０を傾けて注射器７０により各所定流路ＰにＨＵＶＥＣ液（血管細胞を含む液）を注入する（注入工程）。詳しくは、図１７に示すように、ベース１０の下へ冶具Ｇ１（保持部材）を入れてハウジング３０における取付部４０側の端部を持ち上げる。すなわち、冶具Ｇ１は、ハウジング３０において内部にワイヤ５０の一部が残る側の第１端部３０ａよりも、第１端部３０ａと反対側の第２端部３０ｂを高い位置で保持する。このとき、ベース１０におけるワイヤ受け部２０側の端部がディッシュＤの側壁に当接し、冶具Ｇ１におけるワイヤ受け部２０と反対側の端部がディッシュＤの側壁に当接する。これにより、取付部４０の貫通孔３６が作業者に見える状態で、ベース１０及びハウジング３０が保持される。作業者は、取付部４０の各貫通孔３６に注射器７０の針７１を挿入して、各所定流路ＰにＨＵＶＥＣ液を注入する。すなわち、ＨＵＶＥＣ液を所定流路Ｐのワイヤ５０と反対側の端部から注入する。

【0053】

続いて、図１８に示すように、ハウジング３０を培養液Ｍに浸漬させた状態で、ハウジング３０からワイヤ５０を完全に抜き去る（抜去工程）。詳しくは、ハウジング３０をワイヤ受け部２０からさらに離すようにベース１０に対してスライドさせて、ベース１０からハウジング３０を取り外す。

【0054】

続いて、図１９に示すように、培養液Ｍ中において取付部４０にキャップ６０を取り付ける。詳しくは、ハウジング３０の取付部４０にキャップ６０の挿入部６２を対向させるように配置する。そして、図２０に示すように、ハウジング３０の傾斜部４３ａ，４４ａ及びキャップ６０の傾斜部６８ａ，６９ａを冶具Ｇ２の切欠部Ｋにより挟むように、冶具Ｇ２を下方へ移動させる。これにより、冶具Ｇ２を下方へ移動させる力が、取付部４０とキャップ６０とを近づける力に変換される。このとき、培養液Ｍには冶具Ｇ２のみが接触し、作業者の手袋等は培養液Ｍに接触しない。そして、図２１に示すように、取付部４０へのキャップ６０の取り付けを完了する。

【0055】

このとき、図２２に示すように、取付部４０とキャップ６０の本体６１とが当接した状態となる。そして、ハウジング３０の取付部４０とキャップ６０の挿入部６２との間に、培養液Ｍを貯留可能な貯留空間Ｓが形成される。その後、培養液Ｍからハウジング３０及びキャップ６０を取り出し、灌流培養装置に取り付ける。そして、キャップ６０の流路６７から培養液Ｍを流入させることにより、第２コラーゲン層ＣＧ２の所定流路Ｐに培養液Ｍを灌流させてＨＵＶＥＣを培養する（第７工程）。これにより、ＨＵＶＥＣを成長させて主血管及び毛細血管（血管網）を製造する。

【0056】

血管網が製造された後、血管網の上に種々の細胞シートを載せて培養することにより、機能的な種々の細胞組織を製造することができる。

【0057】

以上詳述した本実施形態は、以下の利点を有する。

【0058】

・第１工程において、内部に液体を貯留可能なハウジング３０の上部にワイヤ５０が横方向から通される。第２工程において、ハウジング３０にワイヤ５０よりも下の第１所定位置まで、血管細胞を含まない第１コラーゲン溶液ＣＬ１が入れられる。第１コラーゲン溶液ＣＬ１は血管細胞を含まないため、使用する血管細胞の量を減少させることができる。

【0059】

・ハウジング３０の内部において所定流路Ｐよりも下の部分には、血管細胞を含まない第１コラーゲン層ＣＧ１が形成されている。このため、血管網の形成に寄与しにくい部分では、血管細胞を減少させることができる。一方、ハウジング３０の内部において所定流路Ｐを含む部分には、血管細胞を含む第２コラーゲン層ＣＧ２が形成されている。このため、血管網の形成に寄与する部分には、血管細胞を含ませることができる。したがって、血管細胞を培養する効率が低下することを抑制しつつ、使用する血管細胞の量を減少させることができる。

【0060】

・形成された血管網の上に細胞シートを載せて培養する場合に、主血管（所定流路Ｐ）よりも上に形成された毛細血管（血管網）が細胞シートと連通し、主血管よりも下に形成された血管網は細胞シートと連通しにくい。このため、主血管よりも下の部分の血管網が少なかったとしても、血管網の上に載せた細胞シートを培養する際に支障をきたさない。

【0061】

・第６工程において、所定長さは、ハウジング３０の内部にワイヤ５０の一部が残る長さである。移動機構は、ハウジング３０の内部にワイヤ５０の一部が残る状態において、ハウジング３０とワイヤ５０との相対移動を停止可能とする。このため、第６工程を終えた後において、所定流路Ｐの一方の端部はワイヤ５０により閉塞された状態になる。そして、第６工程と第７工程との間の注入工程において、ＨＵＶＥＣ液が、所定流路Ｐのワイヤ５０と反対側の端部から注入される。このため、所定流路Ｐのワイヤ５０と反対側の端部から注入されたＨＵＶＥＣ液は、ワイヤ５０により閉塞された所定流路Ｐの端部から排出されず、所定流路Ｐの内面から第２コラーゲン層ＣＧ２へ浸透する。このとき、血管細胞は所定流路Ｐの内面に留まるため、所定流路Ｐの内面に血管細胞を効率的に付着させることができる。したがって、主血管を形成する効率を向上させることができ、使用する血管細胞の量を減少させることができる。

【0062】

・移動機構は、ハウジング３０の内部にワイヤ５０の一部が残る状態において、ハウジング３０とワイヤ５０とを保持（係止）することができる。このため、ワイヤ５０が第２コラーゲン層ＣＧ２内で動くことを抑制することができ、所定流路Ｐが損傷することを抑制することができる。

【0063】

・注入工程と第７工程との間において、第１コラーゲン層ＣＧ１及び第２コラーゲン層ＣＧ２を培養液Ｍに浸漬させた状態でハウジング３０からワイヤ５０を完全に抜き去る抜去工程を含む。こうした工程によれば、ハウジング３０の内部に残ったワイヤ５０の一部をハウジング３０から抜き去った時に、第２コラーゲン層ＣＧ２においてワイヤ５０の一部が存在していた部分に培養液Ｍを浸入させることができる。このため、所定流路Ｐに気泡が入ることを抑制することができ、所定流路Ｐの内面と培養液Ｍとの接触を良好にすることができる。したがって、血管細胞を培養する効率が低下することを抑制することができる。

【0064】

・ワイヤ５０を複数備え、移動機構は、ハウジング３０と複数のワイヤ５０とをワイヤ５０の長手方向に同時に相対移動可能とする。こうした構成によれば、移動機構によってハウジング３０と複数のワイヤ５０とをワイヤ５０の長手方向に同時に相対移動させることにより、第２コラーゲン層ＣＧ２に複数の所定流路Ｐを同時に形成することができる。したがって、第２コラーゲン層ＣＧ２に複数の所定流路Ｐを、安定して効率的に形成することができる。さらに、第１コラーゲン層ＣＧ１及び第２コラーゲン層ＣＧ２を培養液Ｍに浸漬させた状態においても、ハウジング３０と複数のワイヤ５０とをワイヤ５０の長手方向に同時に相対移動させることができるため、所定流路Ｐに気泡が入ることを抑制することができる。しかも、ベース１０の突条１２，１３によりガイドされたハウジング３０をスライドさせればよいため、作業者による作業が容易である。

【0065】

・相対移動を停止した状態で、ハウジング３０において内部にワイヤ５０の一部が残る側の第１端部３０ａよりも、第１端部３０ａと反対側の第２端部３０ｂを高い位置で保持する冶具Ｇ１を備える。このため、ＨＵＶＥＣ液を、所定流路Ｐのワイヤ５０と反対側の端部から注入する際に、作業者は所定流路Ｐの位置を視認しやすくなる。さらに、作業者は、ＨＵＶＥＣ液を所定流路Ｐに注入する際にハウジング３０を保持する必要がないため、注入作業を容易に実行することができる。

【0066】

・ハウジング３０において内部にワイヤ５０の一部が残る側と反対側の端部に取り付けられ、ハウジング３０の内部に培養液Ｍを導入する流路６７が形成されたキャップ６０を、血管網の製造装置１００は備えている。このため、ハウジング３０にキャップ６０を取り付けることにより、キャップ６０を介してハウジング３０の内部、すなわち上記所定流路Ｐに培養液Ｍを導入することができる。

【0067】

・ハウジング３０にキャップ６０を取り付ける際に、作業者が培養液Ｍに触れると培養液Ｍを汚染するおそれがある。この点、ハウジング３０及びキャップ６０には、互いに対向する部分と反対側の部分に上側ほど幅が狭くなる傾斜部４３ａ，４４ａ，６８ａ，６９ａが形成されている。このため、ハウジング３０に形成された傾斜部４３ａ，４４ａとキャップ６０に形成された傾斜部６８ａ，６９ａとを挟むように、上から下へ冶具Ｇ２を押し当てることにより、ハウジング３０とキャップ６０とを近づけることができる。したがって、作業者が培養液Ｍに触れずにハウジング３０にキャップ６０を取り付けることができ、培養液Ｍを汚染することを抑制することができる。

【0068】

・ハウジング３０とキャップ６０との間に、培養液Ｍを貯留可能な貯留空間Ｓが形成される。こうした構成によれば、貯留空間Ｓから上記所定流路Ｐへ培養液Ｍを供給することができ、ハウジング３０及びキャップ６０を灌流培養装置に取り付ける際に、所定流路Ｐに気泡や汚染物質が入ることを抑制することができる。さらに、気泡が発生した場合に、気泡を貯留空間Ｓに留めることができる。

【0069】

・第２コラーゲン層ＣＧ２は、ＨＵＶＥＣを培養する際に収縮する。ここで、第２コラーゲン層ＣＧ２は第１コラーゲン層ＣＧ１と密着しているため、第２コラーゲン層ＣＧ２が収縮しようとする力を第１コラーゲン層ＣＧ１で緩和することができる。したがって、第２コラーゲン層ＣＧ２が薄い場合であっても、第２コラーゲン層ＣＧ２が収縮することを抑制することができ、血管網の成長を促進することができる。

【0070】

なお、上記実施形態を、以下のように変更して実施することもできる。上記実施形態と同一の部分については、同一の符号を付すことにより説明を省略する。

【0071】

・図２３は、保持部材の変更例を示す斜視図である。ベース１０においてワイヤ受け部２０と反対側の端部に、回転式のスタンド８０が取り付けられている。スタンド８０（保持部材）は、矩形板状に形成されており、ベース１０においてワイヤ受け部２０と反対側の端部に回転自在に取り付けられている。上記第１工程から上記第６工程まで、スタンド８０は折り畳まれた状態になっている。上記注入工程において、取付部４０をピンセット等により持ち上げることにより、ベース１０とスタンド８０とを離れた状態とする。そして、図２４に示すように、さらにスタンド８０を回転させて、スタンド８０によりベース１０を保持する。すなわち、スタンド８０は、ハウジング３０において内部にワイヤ５０の一部が残る側の第１端部３０ａよりも、第１端部３０ａと反対側の第２端部３０ｂを高い位置で保持する。このとき、ベース１０におけるワイヤ受け部２０側の端部がディッシュＤの側壁に当接し、スタンド８０における取付部４０と反対側の端部がディッシュＤの側壁に当接する。これにより、取付部４０の貫通孔３６が作業者に見える状態で、ベース１０及びハウジング３０が保持される。こうした構成によれば、取付部４０をピンセット等により持ち上げてスタンド８０を回転させることにより、容易にベース１０及びハウジング３０を保持することができる。

【0072】

・取付部４０にキャップ６０を取り付けた状態において、ハウジング３０の取付部４０とキャップ６０の挿入部６２との間に、培養液Ｍを貯留可能な貯留空間Ｓが形成されていなくてもよい。

【0073】

・ハウジング３０の傾斜部４３ａ，４４ａとキャップ６０の傾斜部６８ａ，６９ａとを省略することもできる。

【0074】

・ワイヤ５０は、８本よりも多くても少なくてもよく、１本であってもよい。

【0075】

・クリーンベンチ（無菌室）外で、図９に示すように、ハウジング３０の全ての貫通孔３５，３６、及び全ての保持部３７，３８にワイヤ５０をそれぞれ通してもよい（第１工程）。すなわち、ハウジング３０及びワイヤ５０を滅菌していない状態で第１工程を実行してもよい。そして、ハウジング３０及びワイヤ５０を滅菌した後に、ハウジング３０の貯留部３３にワイヤ５０の直下の位置（ワイヤ５０よりも下の第１所定位置）まで、血管細胞を含まない第１コラーゲン溶液ＣＬ１（第１ゲル溶液）を入れてもよい（第２工程）。すなわち、ハウジング３０及びワイヤ５０を滅菌した状態で第２工程を実行してもよい。こうした工程によれば、クリーンベンチ（無菌室）での無菌操作の工程を減らすことができ、コンタミネーションのリスクを低減できる。

【0076】

・抜去工程において、ハウジング３０を培養液Ｍに浸漬させていない状態で、ハウジング３０からワイヤ５０を完全に抜き去ることもできる。

【0077】

・第６工程において、ハウジング３０をディッシュＤに入れて培養液Ｍに浸漬させ、第２コラーゲン層ＣＧ２（ハウジング３０）からワイヤ５０を完全に（横方向へ所定長さ）引き抜くこともできる。その場合は、第６工程が抜去工程に相当する。

【0078】

なお、上記の各変更例を組み合わせて実施することもできる。

【符号の説明】

【0079】

１０…ベース、２０…ワイヤ受け部、３０…ハウジング、３３…貯留部、３５…貫通孔、３６…貫通孔、３７…保持部、３８…保持部、４０…取付部、５０…ワイヤ、６０…キャップ（導入部材）、７０…注射器、１００…血管網の製造装置、ＣＧ１…第１コラーゲン層、ＣＧ２…第２コラーゲン層、ＣＬ１…第１コラーゲン溶液、ＣＬ２…第２コラーゲン溶液、Ｄ…ディッシュ、Ｍ…培養液、Ｐ…所定流路。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】