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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023038883
(43)【公開日】2023-03-17
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/70 20060101AFI20230310BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20230310BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/70 ZNA
C12Q1/686 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021185124
(22)【出願日】2021-11-12
(31)【優先権主張番号】P 2021145458
(32)【優先日】2021-09-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構「新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業」「病理学的アプローチによる先天性感染症・原因不明感染症診断法の開発」補助事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】591222245
【氏名又は名称】国立感染症研究所長
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】桑野 哲矢
(72)【発明者】
【氏名】高田 直人
(72)【発明者】
【氏名】深川 聡子
(72)【発明者】
【氏名】井上 高良
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 忠樹
(72)【発明者】
【氏名】俣野 哲朗
(72)【発明者】
【氏名】立川 愛
(72)【発明者】
【氏名】菅野 隆行
(72)【発明者】
【氏名】飛梅 実
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ03
4B063QQ10
4B063QQ28
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR79
4B063QS24
4B063QS25
4B063QX01
(57)【要約】
【課題】皮膚表上脂質を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法を提供する。
【解決手段】被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
【選択図】なし
【解決手段】被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
【請求項2】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム情報を検出する、請求項１記載の方法。
【請求項3】
被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の検出方法。
【請求項4】
さらに、ＩＦＩ６、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３、ＩＲＦ７、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＨＬＡ－Ｂ及びＥＧＲ１から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物、Ｂ２Ｍタンパク質及びＣＲＰタンパク質から選ばれる１種以上の分子の発現レベルを測定する、請求項３記載の検出方法。
【請求項5】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している被験者又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがある被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＩＦＩ６、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３、ＩＲＦ７、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＨＬＡ－Ｂ及びＥＧＲ１から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物、Ｂ２Ｍタンパク質及びＣＲＰタンパク質から選ばれる１種以上の分子の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症確認の検出方法。
【請求項6】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している被験者又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがある被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１及びＩＦＩＴＭ３から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症度の検出方法。
【請求項7】
ＩＦＮ応答関連遺伝子又はその発現産物の発現レベルがｍＲＮＡの発現量の測定である、請求項４～６のいずれか１項記載の方法。
【請求項8】
ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬を含有する、請求項１又は２記載の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
【請求項9】
ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬、所望によりさらにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、請求項３又は４記載の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症検出キット。
【請求項10】
ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、請求項５記載の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症確認検出キット。
【請求項11】
ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、請求項６記載の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症度検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、皮膚表上脂質を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳコロナウイルス－２（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）やＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と同様ベータコロナウイルス属に属し、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となるＳＡＲＳ関連コロナウイルスである。２０１９年に中国湖北省武漢市付近で発生が初めて確認され、その後、ＣＯＶＩＤ－１９の世界的流行（パンデミック）を引き起こしている。
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスで、自律複製することはできず、ヒトの粘膜細胞等に付着し、入り込んで増殖することが知られている。増殖したウイルスは、感染者の飛沫と共に放出され、他の人がそのウイルスを口や鼻から吸い込むことで感染する（飛沫感染）。
また、感染者の手を介してウイルスが付着した物を他の人が触り、その手で口や鼻等を触ることで粘膜からウイルスが入り込む接触感染によっても感染が広がっていくと考えられている。
また、感染者の手を介してウイルスが付着した物を他の人が触り、その手で口や鼻等を触ることで粘膜からウイルスが入り込む接触感染によっても感染が広がっていくと考えられている。
【0004】
感染者は味覚や嗅覚の異常、頭痛、発熱、咳や呼吸困難感といった症状を呈することがわかっている。中には無症状の感染者も存在し、このことがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染拡大を防ぐ難しさの要因の一つになっている。特に、基礎疾患を有する人や高齢者への感染を防ぐために、ＰＣＲ検査をはじめとする検査数や検査体制の拡充が求められている。
【0005】
現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を調べる方法には、ＰＣＲ検査を含む遺伝子検査をはじめ、抗原検査や抗体検査が挙げられる。遺伝子検査の中で最も汎用されているＰＣＲ検査は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用することで、ウイルス由来の遺伝子配列を１００～１０００万倍以上に増幅することができる極めて高感度な分析手法である。ＰＣＲ反応により得られる増幅曲線の有無で陽性または陰性を判定することができる。
【0006】
現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＰＣＲ検査等の遺伝子検査には、検体として鼻咽頭ぬぐい液や唾液が使用できることが確認されている。患者の鼻咽頭からスワブで検体を採取する際に、くしゃみ等による医療従事者への飛沫感染のリスクが問題となることから、発症から９日以内に限られるものの、飛沫感染のリスクが低い唾液を検体とする遺伝子検査が保険適用となっている。
【0007】
一方、生体試料中のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の解析によりヒトの生体内の生理状態を調べる技術が開発されている。生体由来の核酸は、血液等の体液、分泌物、組織等から抽出することができるが、最近、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）に含まれるＲＮＡを生体の解析用の試料として用いること、ＳＳＬから表皮、汗腺、毛包及び皮脂腺のマーカー遺伝子が検出できることが報告されている（特許文献１）。
これまでに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、感染者の肺胞、気管支、痰、鼻腔、咽頭、糞便で検出され、血液や尿では殆ど検出さないことが報告されているが、皮膚表面から検出できることは全く報告がない。
これまでに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、感染者の肺胞、気管支、痰、鼻腔、咽頭、糞便で検出され、血液や尿では殆ど検出さないことが報告されているが、皮膚表面から検出できることは全く報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開公報第２０１８／００８３１９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、皮膚表上脂質を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認されたＣＯＶＩＤ－１９患者から採取したＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出でき、ＳＳＬがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出ための検体となり得ることを見出した。
【0011】
すなわち、本発明は、以下の１）～８）に係るものである。
１）被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
２）被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の検出方法。
３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している被験者又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがある被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＩＦＩ６、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３、ＩＲＦ７、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＨＬＡ－Ｂ及びＥＧＲ１から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物、Ｂ２Ｍタンパク質及びＣＲＰタンパク質から選ばれる１種以上の分子の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症確認の検出方法。
４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している被験者又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがある被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１及びＩＦＩＴＭ３から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症度の検出方法。
５）ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬を含有する、１）の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
６）ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬、所望によりさらにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、２）の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症検出キット。
７）ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、３）の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症確認検出キット。
８）ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、４）の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症度検出キット。
１）被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
２）被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の検出方法。
３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している被験者又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがある被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＩＦＩ６、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３、ＩＲＦ７、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＨＬＡ－Ｂ及びＥＧＲ１から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物、Ｂ２Ｍタンパク質及びＣＲＰタンパク質から選ばれる１種以上の分子の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症確認の検出方法。
４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している被験者又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがある被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１及びＩＦＩＴＭ３から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症度の検出方法。
５）ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬を含有する、１）の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
６）ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬、所望によりさらにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、２）の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症検出キット。
７）ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、３）の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症確認検出キット。
８）ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、４）の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症度検出キット。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、皮膚表上脂質の採取によって、被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出できると共に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって変化する生体分子を検出することができ、簡便且つ非侵襲的に、確度の高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】健常者（ＨＬ）とＣＯＶＩＤ－１９患者（ＣＯＶＩＤ－１９）の顔由来ＳＳＬ中のＨＬＡ－Ｂ、Ｂ２Ｍ及びＣＲＰのタンパク発現量。
【図2】ＳＳＬ中ＣＲＰ量と血中ＣＲＰ濃度との相関関係。
【図3】ＣＯＶＩＤ－１９患者重症度別のＩＦＮ応答関連遺伝子の発現量。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【0015】
本発明において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ-ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【0016】
本発明において「遺伝子」と云う用語は、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。
また、当該「遺伝子」は特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、これらの同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体をコードする核酸が包含される。
また、当該「遺伝子」は特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、これらの同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体をコードする核酸が包含される。
【0017】
本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」とは、ＣＯＶＩＤ－１９の原因となる、ＳＡＲＳコロナウイルス２（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）を指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、全長２９．９ ｋｂの一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであり、そのゲノム配列はＧＩＳＡＩＤ（Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｌｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ）に登録されている。
【0018】
本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出」には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する他、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子を検出することを含み、遺伝子の検出にはゲノム情報、好ましくは全ゲノム情報の検出が包含される。したがって、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の検出が含まれる。
【0019】
本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がヒトに感染することによって発症する気道感染症、すなわちＣＯＶＩＤ－１９を指す。一般的な症状として、頭痛、嗅覚や味覚の消失、鼻詰まり（鼻閉）及び鼻漏、咳、筋肉痛、咽頭痛、発熱、下痢、呼吸困難が挙げられる。多くの場合、無症状または風邪様症状を伴う軽症で自然治癒するが、重症では急性呼吸窮迫症候群や敗血症、多臓器不全を伴う。
【0020】
本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の検出」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の存在又は不存在を明らかにすることを意味する。なお、「検出」という用語は、検査、測定、判定、評価又は評価支援という用語で言い換えることもできる。なお、本発明において「検出」という用語は、医師による判定や評価を含むものではない。
【0021】
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の検出方法は、被験者から採取されたＳＳＬについて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む。
ここで、ＳＳＬを採取する被験者としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を必要とするヒトであれば限定されないが、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染が疑われるヒト、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているヒトが挙げられる。
ここで、ＳＳＬを採取する被験者としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を必要とするヒトであれば限定されないが、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染が疑われるヒト、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているヒトが挙げられる。
【0022】
「ＳＳＬ」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。尚、ＳＳＬには、皮膚細胞で発現した被験者由来のＲＮＡが含まれている（前記特許文献１参照）。また本発明において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、体表の表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺等の組織を含む領域の総称である。
【0023】
被験者の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、等が挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、特に限定されず、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられる。好ましくは、皮脂の分泌が多い部位、例えば顔の皮膚が挙げられるが、体幹（例えば体幹部前面、脇、背中）の皮膚でも良い。
【0024】
被験者から採取されたＳＳＬは一定期間保存されてもよい。採取されたＳＳＬは、含有するＲＮＡの分解を極力抑えるために、採取後できるだけ速やかに低温条件で保存することが好ましい。本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－２０±２０℃～－８０±２０℃、より好ましくは－２０±１０℃～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±２０℃～－４０±２０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃～－４０±１０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃、さらに好ましくは－２０±５℃である。該ＲＮＡ含有ＳＳＬの該低温条件での保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。
【0025】
ＳＳＬに含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、具体的にはウイルスＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物が測定される。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。
【0026】
該逆転写には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＲＮＡ配列を標的としたプライマーを用いる。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が好ましく用いられる。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整するのが好ましい。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整するのが好ましい。
【0027】
ｃＤＮＡを検出・測定する方法としては、ＰＣＲ法の他、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法や、ハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法（シーケンシング）、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができるが、操作の簡便性及び利便性から核酸増幅法を用いるのが好ましい。中でも汎用性の高いＰＣＲ法が好ましく、ＲＮＡから逆転写反応（ＲＴ）によりｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲ法に供するＲＴ－ＰＣＲ法がより好ましい。
【0028】
ＲＴ－ＰＣＲ法は、ＲＴとＰＣＲを分けて行う２－ｓｔｅｐ法と、逆転写酵素をあらかじめ反応系に混合することで、ＲＴとＰＣＲを同一反応液中で行うＯｎｅ－ｓｔｅｐＲＴ－ＰＣＲ法があるが、本発明においてはいずれの方法を用いてもよい。また、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅と定量を同時に実施するリアルタイムＰＣＲ法、さらには、ＲＴを組み合わせたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法やリアルタイムＯｎｅ－ｓｔｅｐＲＴ－ＰＣＲ法を採用することもできる。リアルタイムＯｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲの例として、ＱＩＡＧＥＮ社のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ等が好ましく用いられる。また、リアルタイムＰＣＲ法においては、複数の標的配列を同時に増幅できる様に、異なる蛍光色素で標識したオリゴＤＮＡタイプのプローブとプライマーのセットを複数混在させるマルチプレックスリアルタイムＰＣＲ法を採用することもできる。
【0029】
リアルタイムＰＣＲ法では、通常ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。蛍光検出方法には、インターカレーター性蛍光色素を用いる方法及び蛍光標識プローブを用いる方法がある。インターカレーター性蛍光色素としては、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉが使用されるが、これに限定されるわけではない。インターカレーター性蛍光色素は、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができる。
蛍光標識プローブとしては、ＴａｑＭａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブ等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端が蛍光色素で、また３’末端がクエンチャー物質で修飾されたオリゴヌクレオチドである。ＴａｑＭａｎプローブは、ＰＣＲのアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。その後の伸長反応ステップで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる蛍光の発生の抑制が解除されて蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。前記蛍光色素としては、ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに限定されない。前記クエンチャーとしては、ＴＡＭＲＡ（登録商標）及びＭＧＢが挙げられるが、これらに限定されない。２種類以上のＤＮＡ標的配列を区別して検出するためには、それぞれ異なる蛍光色素を結合させた２種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ（例えばＴａｑＭａｎプローブ）を用いてＰＣＲを行う。
蛍光標識プローブとしては、ＴａｑＭａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブ等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端が蛍光色素で、また３’末端がクエンチャー物質で修飾されたオリゴヌクレオチドである。ＴａｑＭａｎプローブは、ＰＣＲのアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。その後の伸長反応ステップで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる蛍光の発生の抑制が解除されて蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。前記蛍光色素としては、ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに限定されない。前記クエンチャーとしては、ＴＡＭＲＡ（登録商標）及びＭＧＢが挙げられるが、これらに限定されない。２種類以上のＤＮＡ標的配列を区別して検出するためには、それぞれ異なる蛍光色素を結合させた２種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ（例えばＴａｑＭａｎプローブ）を用いてＰＣＲを行う。
【0030】
ＲＴ－ＰＣＲ法における逆転写反応の反応温度条件、及びＰＣＲ条件（温度、時間及びサイクル数）の設定は、使用するプライマーに応じて、適宜設定することができる。例えば、ＱＩＡＧＥＮ社のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔを用いたＯｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎプローブ法）では、５０℃で３０分間、９５℃で１５分間反応の後、９５℃で１５秒間、６０℃で６０秒間を４５サイクル反応させる。
【0031】
ＰＣＲ法を行う場合のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の標的遺伝子（増幅対象となる標的箇所）は、検出の感度や特異度を考慮して適宜選択されるが、主として、ヌクレオカプシド（Ｎ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、スパイクタンパク（Ｓ）、非構造タンパク質をコードするＯＲＦ１ａｂやその一部のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）の各領域に対する遺伝子から選択することができる。例えば、Ｎタンパク質の２ヶ所の領域に対する遺伝子を標的とすること等が行われている。
【0032】
また、ウイルス由来の核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマーや、ウイルス由来の核酸に特異的に結合するプローブは、当該標的遺伝子を構成する塩基配列に基づいて設計された一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、ウイルス由来の核酸を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、ウイルス由来の核酸を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
【0033】
ＰＣＲ産物の確認は、電気泳動、融解曲線法、各種プローブ法（Ｑプローブ、スコーピオンプローブ、ハイブリプローブ等）で検出、識別することができる。
リアルタイム測定によれば、使用する蛍光色素に対応した蛍光フィルターを用いてＲＴ－ＰＣＲ産物の増幅曲線をモニターすることにより確認できる。ＰＣＲサイクル数に応じて蛍光強度が増加する場合には、検体における分析対象のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在が陽性であると判定され、一方、ＰＣＲにおいて蛍光強度が増加しない場合は陰性であると判定される。
リアルタイム測定によれば、使用する蛍光色素に対応した蛍光フィルターを用いてＲＴ－ＰＣＲ産物の増幅曲線をモニターすることにより確認できる。ＰＣＲサイクル数に応じて蛍光強度が増加する場合には、検体における分析対象のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在が陽性であると判定され、一方、ＰＣＲにおいて蛍光強度が増加しない場合は陰性であると判定される。
【0034】
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム情報を検出する場合は、増幅されたＰＣＲ産物から次世代シーケンサーを用いて、ウイルスゲノム全長に由来する配列を取得することによりゲノム解析が行われる。例えば、マルチプレックスＰＣＲ法によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム領域を特異的に増幅し、次世代シーケンサーを用いて、ゲノム全長の配列を取得することが行われる。
【0035】
斯くして、被験者から採取されたＳＳＬを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することができ、これにより、被験者のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を検出することができる。後述する実施例に示すとおり、ＳＳＬを用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、唾液を検体として用いた場合の結果とは必ずしも一致しないが、唾液検体では検出されずＳＳＬのみで検出される症例があることから、本発明の方法は、唾液検体によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出法を補完できると云える。
【0036】
また、後述する実施例に示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認されたＣＯＶＩＤ－１９患者について、ＳＳＬ中のＲＮＡ発現解析を行ったところ、健常者に比べＣＯＶＩＤ－１９患者でＩＦＩ６、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３、ＩＲＦ７、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＨＬＡ－Ｂ及びＥＧＲ１の９個のＩＦＮ応答関連遺伝子の発現上昇が認められた。ＣＯＶＩＤ－１９患者の血液でＩＦＮ応答関連遺伝子の発現が上昇することは既に報告されており（Science. 2020 Aug 7;369(6504):718-724.）、ＳＳＬ中においても同様の変化が捉えられる。さらに、タンパクの発現解析ではＨＬＡ－Ｂに加え、Ｂ２Ｍ（Ｂｅｔａ－２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の発現が健常人と比べて大幅に上昇し、また、ＣＯＶＩＤ－１９患者で発現が上昇することが知られているＣＲＰ（Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）（Science. 2020 Aug 7;369(6504):718-724）の上昇も認められる。
【0037】
したがって、ＳＳＬ中の上記ＩＦＮ応答関連の９遺伝子若しくはその発現産物、Ｂ２Ｍタンパク質及びＣＲＰタンパク質から選ばれる分子は、ＳＳＬ中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を確認するためのマーカー分子（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染確認マーカー）として有用である。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出と併せて、被験者から採取されたＳＳＬについて当該マーカー分子の発現レベルを測定することにより、より確度の高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の検出が可能となる。また、当該マーカー分子を用いることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているヒト、或いはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがあるヒト、例えばＰＣＲ検査における偽陰性者、偽陽性者等に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の程度や感染の可能性に関するより詳細な情報を提供することができる。
【0038】
さらに、ＣＯＶＩＤ－１９患者重症度別のＳＳＬにおける遺伝子発現解析において、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３の発現は、健常者に比べ軽症患者で発現が高く、その程度は中等症患者よりも高いことが明らかとなった。
したがって、ＳＳＬ中のＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３の３遺伝子若しくはその発現産物は、ＳＳＬ中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の重症度を判別するためのマーカー分子としても有用である。したがって、被験者から採取されたＳＳＬについて当該マーカー分子の発現レベルを測定することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の軽症患者と中等症患者の検出が可能となる。
したがって、ＳＳＬ中のＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３の３遺伝子若しくはその発現産物は、ＳＳＬ中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の重症度を判別するためのマーカー分子としても有用である。したがって、被験者から採取されたＳＳＬについて当該マーカー分子の発現レベルを測定することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の軽症患者と中等症患者の検出が可能となる。
【0039】
本発明のＩＦＮ応答関連遺伝子は、ＩＦＩ６（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２５３７）、ＩＳＧ１５（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９６３６）、ＩＦＩＴＭ１（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：８５１９）、ＩＦＩＴＭ３（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０４１０）、ＩＲＦ７（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：３６６５）、ＭＸ１（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：４５９９）、ＩＦＩＴ１（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：３４３４）、ＨＬＡ－Ｂ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：３１０６）、ＥＧＲ１（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１９５８）の９遺伝子である。
また、上記のＩＦＮ応答関連遺伝子に加え、当該各遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有し且つ同一の機能を有する遺伝子は本発明のマーカー分子に包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３の条件にて検索をした場合、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましく９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性があることを意味する。
また、上記のＩＦＮ応答関連遺伝子に加え、当該各遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有し且つ同一の機能を有する遺伝子は本発明のマーカー分子に包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３の条件にて検索をした場合、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましく９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性があることを意味する。
【0040】
ＩＦＮ応答関連遺伝子の「発現産物」とは、遺伝子の転写産物及び翻訳産物を包含する概念である。「転写産物」とは、遺伝子（ＤＮＡ）から転写されて生じるＲＮＡであり、「翻訳産物」とは、ＲＮＡに基づき翻訳合成される、遺伝子にコードされたタンパク質を意味する。
【0041】
また、本発明において、Ｂ２Ｍタンパク質とはＢｅｔａ－２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ６１７６９）を指し、ＣＲＰタンパク質とはＣ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０２７４１）を指す。
【0042】
斯かるマーカー分子の発現レベルを測定するための測定対象としては、ＲＮＡから人工的に合成されたｃＤＮＡ、ＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、ＲＮＡにコードされるタンパク質の他、そのタンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子等であってもよい。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。また、発現レベルとは、遺伝子又はその発現産物であるタンパク質の発現量や活性を包括的に意味する。
【0043】
遺伝子の発現レベルの測定としては、好ましい態様として、ＳＳＬに含まれるＲＮＡの発現レベルが測定され、具体的にはＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物が測定される。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出、ｃＤＮへの変換、ｃＤＮＡ又はその増幅産物の測定については、前述した方法と同様に行うことができる。ｃＤＮＡ又はその増幅産物の測定は、ＰＣＲ法の他に、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法（シーケンシング）、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出、ｃＤＮへの変換、ｃＤＮＡ又はその増幅産物の測定については、前述した方法と同様に行うことができる。ｃＤＮＡ又はその増幅産物の測定は、ＰＣＲ法の他に、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法（シーケンシング）、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。
【0044】
ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用して標的である遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出することにより測定する方法が挙げられる。
【0045】
ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的である遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、支持体に本発明の標的遺伝子由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の標的遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の標的遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
【0046】
シーケンシングによって標的である遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、次世代シーケンサー（例えばＩｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が用いて解析することが挙げられる。シーケンシングで作成されたリードの数（リードカウント）に基づいて、ＲＮＡ発現を定量することができる。
【0047】
また、Ｂ２Ｍタンパク質、ＣＲＰタンパク質、ＩＦＮ応答関連遺伝子の翻訳産物（タンパク質）を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。また、タンパク質、ＲＮＡ又はＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、１－ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２－ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）を用いることができる。
例えば、測定対象がタンパク質である場合は、当該タンパク質に対する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のタンパク質を検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
尚、上記タンパク質に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。
例えば、測定対象がタンパク質である場合は、当該タンパク質に対する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のタンパク質を検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
尚、上記タンパク質に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。
【0048】
斯くして、被験者から採取されたＳＳＬ中の本発明のマーカー分子の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染確認や重症度が検出される。感染確認や重症度の検出は、具体的には、測定されたマーカー分子の発現レベルを対照レベルと比較することによって行われる。
シーケンシングにより複数の遺伝子の発現レベルの解析を行う場合は、上記したように、発現量のデータであるリードカウント値、該リードカウント値をサンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値、当該ＲＰＭ値を底２の対数値に変換した値（Ｌｏｇ２ＲＰＭ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値）、あるいはＤＥＳｅｑ２を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ｃｏｕｎｔ＋１）値）を指標として用いるのが好ましい。また、ＲＮＡ－ｓｅｑの定量値として一般的な、ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ （ＦＰＫＭ）、ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ （ＲＰＫＭ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ （ＴＰＭ）等によって算出される値であってもよい。マイクロアレイ法によって得られるシグナル値、及びその補正値であってもよい。また、ＲＴ－ＰＣＲ等により標的である特定の遺伝子のみ発現レベルの解析を行う場合には、対象遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とする相対的な発現量に変換（相対定量）して解析する方法、又は標的遺伝子の領域を含むプラスミドを用いて絶対的なコピー数を定量（絶対定量）して解析する方法が好ましい。デジタルＰＣＲ法によって得られるコピー数であってもよい。
ここで、「対照レベル」とは、例えば、健常人におけるマーカー分子の発現レベルが挙げられる。健常人の発現レベルは、健常人集団から測定したマーカー分子の発現レベルの統計値（例えば平均値等）であってもよい。感染確認又は重症度検出の目的によっては、軽症ＣＯＶＩＤ－１９患者におけるマーカー分子の発現レベルを「対照レベル」としても良い。
シーケンシングにより複数の遺伝子の発現レベルの解析を行う場合は、上記したように、発現量のデータであるリードカウント値、該リードカウント値をサンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値、当該ＲＰＭ値を底２の対数値に変換した値（Ｌｏｇ２ＲＰＭ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値）、あるいはＤＥＳｅｑ２を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ｃｏｕｎｔ＋１）値）を指標として用いるのが好ましい。また、ＲＮＡ－ｓｅｑの定量値として一般的な、ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ （ＦＰＫＭ）、ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ （ＲＰＫＭ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ （ＴＰＭ）等によって算出される値であってもよい。マイクロアレイ法によって得られるシグナル値、及びその補正値であってもよい。また、ＲＴ－ＰＣＲ等により標的である特定の遺伝子のみ発現レベルの解析を行う場合には、対象遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とする相対的な発現量に変換（相対定量）して解析する方法、又は標的遺伝子の領域を含むプラスミドを用いて絶対的なコピー数を定量（絶対定量）して解析する方法が好ましい。デジタルＰＣＲ法によって得られるコピー数であってもよい。
ここで、「対照レベル」とは、例えば、健常人におけるマーカー分子の発現レベルが挙げられる。健常人の発現レベルは、健常人集団から測定したマーカー分子の発現レベルの統計値（例えば平均値等）であってもよい。感染確認又は重症度検出の目的によっては、軽症ＣＯＶＩＤ－１９患者におけるマーカー分子の発現レベルを「対照レベル」としても良い。
【0049】
また、本発明のマーカー分子を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染確認又は重症度の検出は、マーカー分子の発現レベルの上昇／減少により行うこともできる。この場合は、被験者由来のＳＳＬにおけるマーカー分子の発現レベルが、マーカー分子のカットオフ値（参照値）と比較される。
カットオフ値は、種々の統計解析手法により求めることができる。例えば、ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ、受信者動作特性曲線）解析に基づく値（例えば、Ｙｏｕｄｅｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ、ＲＯＣ曲線における左上隅座標（０，１）からの距離値等）が例示される。
ＲＯＣ曲線は、縦軸を陽性患者において陽性の結果がでる確率（真陽性率（ＴＰＦ：Ｔｒｕｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）、感度）、横軸を陰性患者において陰性の結果がでる確率（特異度）を１から減算した値（偽陽性率（ＦＰＦ：Ｆａｌｓｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ））とし、測定結果のどの値を所見ありと判断するかの閾値、つまりカットオフポイント（ｃｕｔｏｆｆ ｐｏｉｎｔ）を媒介変数として変化させてプロットしていくことで作成される。
作成したＲＯＣ曲線から、どのカットオフポイントをカットオフ値として採用するかは、感染確認や重症度の検出の位置づけ、その他種々の条件より決定すればよい。通常、カットオフポイントを偽陽性率の低い点に採ると、陰性患者で陽性となる者は減るものの、逆に陽性患者を多数除いてしまう結果、感度が低くなる。反対に感度を高めると陰性患者における偽陽性率が高くなる。
一般に感度、特異度をともに高める（１に近づくようにする）ために、カットオフ値は、ＲＯＣ曲線上で点（０，１）に最も近い点を与える値や、「真陽性（感度）」－「偽陽性（１－特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ）に設定される。
カットオフ値は、種々の統計解析手法により求めることができる。例えば、ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ、受信者動作特性曲線）解析に基づく値（例えば、Ｙｏｕｄｅｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ、ＲＯＣ曲線における左上隅座標（０，１）からの距離値等）が例示される。
ＲＯＣ曲線は、縦軸を陽性患者において陽性の結果がでる確率（真陽性率（ＴＰＦ：Ｔｒｕｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）、感度）、横軸を陰性患者において陰性の結果がでる確率（特異度）を１から減算した値（偽陽性率（ＦＰＦ：Ｆａｌｓｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ））とし、測定結果のどの値を所見ありと判断するかの閾値、つまりカットオフポイント（ｃｕｔｏｆｆ ｐｏｉｎｔ）を媒介変数として変化させてプロットしていくことで作成される。
作成したＲＯＣ曲線から、どのカットオフポイントをカットオフ値として採用するかは、感染確認や重症度の検出の位置づけ、その他種々の条件より決定すればよい。通常、カットオフポイントを偽陽性率の低い点に採ると、陰性患者で陽性となる者は減るものの、逆に陽性患者を多数除いてしまう結果、感度が低くなる。反対に感度を高めると陰性患者における偽陽性率が高くなる。
一般に感度、特異度をともに高める（１に近づくようにする）ために、カットオフ値は、ＲＯＣ曲線上で点（０，１）に最も近い点を与える値や、「真陽性（感度）」－「偽陽性（１－特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ）に設定される。
【0050】
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための検出キットは、ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬を含有するものである。
また、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を検出するための検出用キットは、ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬、さらに所望によりマーカー分子の発現レベルを測定するための試薬を含有するものである。
また、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症確認又は重症度の検出用キットは、ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからマーカー分子の発現レベルを測定するための試薬を含有するものである。
また、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を検出するための検出用キットは、ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬、さらに所望によりマーカー分子の発現レベルを測定するための試薬を含有するものである。
また、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症確認又は重症度の検出用キットは、ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからマーカー分子の発現レベルを測定するための試薬を含有するものである。
【0051】
ここで、ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬としては、例えば、ＳＳＬを採取するための脂取りフィルム、採取したＳＳＬを保存するための試薬、保存用の容器等が挙げられる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬、マーカー分子の発現レベルを測定するための試薬としては、例えば採取したＳＳＬからＲＮＡを抽出・精製するための試薬、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２やマーカー分子に由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー）を含む、核酸増幅又はハイブリダイゼーションのための試薬、マーカー分子（タンパク質）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤、ポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、試験に必要な器具等が挙げられる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬、マーカー分子の発現レベルを測定するための試薬としては、例えば採取したＳＳＬからＲＮＡを抽出・精製するための試薬、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２やマーカー分子に由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー）を含む、核酸増幅又はハイブリダイゼーションのための試薬、マーカー分子（タンパク質）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤、ポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、試験に必要な器具等が挙げられる。
【0052】
本発明の態様及び好ましい実施態様を以下に示す。
＜１＞被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
＜２＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム情報、好ましくは全ゲノム情報を検出する、＜１＞の方法。
＜３＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を検出する、＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の検出方法。
＜５＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出がウイルスＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物が測定される、＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞さらに、被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＩＦＩ６、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３、ＩＲＦ７、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＨＬＡ－Ｂ及びＥＧＲ１から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物、Ｂ２Ｍタンパク質及びＣＲＰタンパク質から選ばれる１種以上の分子の発現レベルを測定する、＜４＞の検出方法。
＜７＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している被験者又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがある被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＩＦＩ６、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３、ＩＲＦ７、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＨＬＡ－Ｂ及びＥＧＲ１から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物、Ｂ２Ｍタンパク質及びＣＲＰタンパク質から選ばれる１種以上の分子の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症確認の検出方法。
＜８＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している被験者又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがある被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１及びＩＦＩＴＭ３から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症度の検出方法。
＜９＞ＩＦＮ応答関連遺伝子又はその発現産物の発現レベルがｍＲＮＡの発現量の測定である、＜６＞～＜８＞のいずれかの方法。
＜１０＞ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬を含有する、＜１＞～＜３＞のいずれかの方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
＜１１＞ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬、所望によりさらにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、＜４＞～＜６＞のいずれかの方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症検出キット。
＜１２＞ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、＜７＞の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症確認検出キット。
＜１３＞ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、＜８＞の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症度検出キット。
＜１＞被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
＜２＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム情報、好ましくは全ゲノム情報を検出する、＜１＞の方法。
＜３＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を検出する、＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の検出方法。
＜５＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出がウイルスＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物が測定される、＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞さらに、被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＩＦＩ６、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３、ＩＲＦ７、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＨＬＡ－Ｂ及びＥＧＲ１から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物、Ｂ２Ｍタンパク質及びＣＲＰタンパク質から選ばれる１種以上の分子の発現レベルを測定する、＜４＞の検出方法。
＜７＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している被験者又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがある被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＩＦＩ６、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３、ＩＲＦ７、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＨＬＡ－Ｂ及びＥＧＲ１から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物、Ｂ２Ｍタンパク質及びＣＲＰタンパク質から選ばれる１種以上の分子の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症確認の検出方法。
＜８＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している被験者又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の疑いがある被験者から採取された皮膚表上脂質について、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１及びＩＦＩＴＭ３から選ばれるＩＦＮ応答関連遺伝子若しくはその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症度の検出方法。
＜９＞ＩＦＮ応答関連遺伝子又はその発現産物の発現レベルがｍＲＮＡの発現量の測定である、＜６＞～＜８＞のいずれかの方法。
＜１０＞ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬を含有する、＜１＞～＜３＞のいずれかの方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
＜１１＞ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬、所望によりさらにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、＜４＞～＜６＞のいずれかの方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症検出キット。
＜１２＞ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、＜７＞の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症確認検出キット。
＜１３＞ＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬、並びにＳＳＬから前記分子の発現レベルを測定するための試薬を含有する、＜８＞の方法に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症度検出キット。
【実施例0053】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ 皮膚表上からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出
１）被験者
日本国内において２０２０年４月～２０２０年１２月の間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された２０歳以上男女で唾液と皮脂の両検体が採取できたＣＯＶＩＤ－１９患者９名を対象とした。
実施例１ 皮膚表上からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出
１）被験者
日本国内において２０２０年４月～２０２０年１２月の間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された２０歳以上男女で唾液と皮脂の両検体が採取できたＣＯＶＩＤ－１９患者９名を対象とした。
【0054】
２）ＳＳＬ及び唾液採取
各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を
用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。皮脂と同日または前日に唾液採取を行った。
各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を
用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。皮脂と同日または前日に唾液採取を行った。
【0055】
３）ＲＮＡ調製
上記２）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。精製済みＲＮＡ溶液１００μＬに３Ｍ酢酸ナトリウム１０μＬとＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）１μＬを添加後、さらに１００％ＥｔＯＨ ２５０μＬを加え、ボルテックスした。－２０℃で３０分間（または－８０℃で１５分間）静置、冷却後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。溶液を除去後、７０％ＥｔＯＨを７００μＬ加え、再度１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。溶液を完全に除去し、チューブのフタを開けて１分間乾燥後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １０μＬで再溶解した。得られたＲＮＡ溶液は－８０℃で保管した。
上記２）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。精製済みＲＮＡ溶液１００μＬに３Ｍ酢酸ナトリウム１０μＬとＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）１μＬを添加後、さらに１００％ＥｔＯＨ ２５０μＬを加え、ボルテックスした。－２０℃で３０分間（または－８０℃で１５分間）静置、冷却後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。溶液を除去後、７０％ＥｔＯＨを７００μＬ加え、再度１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。溶液を完全に除去し、チューブのフタを開けて１分間乾燥後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １０μＬで再溶解した。得られたＲＮＡ溶液は－８０℃で保管した。
【0056】
４）ウイルスＲＮＡ定量
国立感染症研究所「病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ Ｖｅｒ．２．９．１」記載の方法に従って、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）及び表１のプライマーを用いたウイルスＲＮＡ検出を実施した。
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｘ（２０１９－ｎＣｏＶ）（ＸＡ０１４２，ＴＡＫＡＲＡ）を用いて１０５ｃｏｐｉｅｓ／μＬを最も濃い濃度として５倍希釈９段階のスタンダード溶液を調製した。あぶらとりフィルム１枚から得た１０μＬ ＲＮＡのうち１μＬを５倍希釈し、ウイルスＲＮＡ検出に用いた（ｄｕｐｌｉｃａｔｅのため元溶液は計２μＬ使用）。７５００ ｆａｓｔ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で反応系２０μＬ（表２）、下記条件：［５０℃ ｆｏｒ ３０ｍｉｎ］→［９５℃ ｆｏｒ １５ｍｉｎ］→４５ ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ［９５℃ ｆｏｒ １５ｓｅｃ、６０℃ ｆｏｒ ６０ｓｅｃ］にてＲＴ－ＰＣＲを実施した。唾液検体から得られたＲＮＡも同様にウイルスＲＮＡ検出を行った。
国立感染症研究所「病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ Ｖｅｒ．２．９．１」記載の方法に従って、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）及び表１のプライマーを用いたウイルスＲＮＡ検出を実施した。
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｘ（２０１９－ｎＣｏＶ）（ＸＡ０１４２，ＴＡＫＡＲＡ）を用いて１０５ｃｏｐｉｅｓ／μＬを最も濃い濃度として５倍希釈９段階のスタンダード溶液を調製した。あぶらとりフィルム１枚から得た１０μＬ ＲＮＡのうち１μＬを５倍希釈し、ウイルスＲＮＡ検出に用いた（ｄｕｐｌｉｃａｔｅのため元溶液は計２μＬ使用）。７５００ ｆａｓｔ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で反応系２０μＬ（表２）、下記条件：［５０℃ ｆｏｒ ３０ｍｉｎ］→［９５℃ ｆｏｒ １５ｍｉｎ］→４５ ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ［９５℃ ｆｏｒ １５ｓｅｃ、６０℃ ｆｏｒ ６０ｓｅｃ］にてＲＴ－ＰＣＲを実施した。唾液検体から得られたＲＮＡも同様にウイルスＲＮＡ検出を行った。
【0057】
【表1】
【0058】
【表2】
【0059】
５）結果
唾液１３検体中８検体で、皮脂１４検体中８検体で陽性反応が認められた。皮脂で検出されず唾液のみで検出されたものが４例、唾液で検出されず皮脂のみで検出されたものが３例であった（表３）。このことから皮脂検体によるウイルスＲＮＡ検出法と唾液検体によるウイルスＲＮＡ検出法は相互に補完できる可能性が示唆された。
唾液１３検体中８検体で、皮脂１４検体中８検体で陽性反応が認められた。皮脂で検出されず唾液のみで検出されたものが４例、唾液で検出されず皮脂のみで検出されたものが３例であった（表３）。このことから皮脂検体によるウイルスＲＮＡ検出法と唾液検体によるウイルスＲＮＡ検出法は相互に補完できる可能性が示唆された。
【0060】
【表3】
【0061】
実施例２ 皮膚表上検体からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム解析
１）被験者
日本国内において２０２０年４月～２０２０年１２月の間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された２０歳以上男女で皮脂からウイルスＲＮＡが検出されたＣＯＶＩＤ－１９患者６名８検体（２名は２タイムポイント）を対象とした。
１）被験者
日本国内において２０２０年４月～２０２０年１２月の間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された２０歳以上男女で皮脂からウイルスＲＮＡが検出されたＣＯＶＩＤ－１９患者６名８検体（２名は２タイムポイント）を対象とした。
【0062】
２）ＳＳＬ及び唾液採取
各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を
用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。皮脂と同日または前日に唾液採取を行った。
各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を
用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。皮脂と同日または前日に唾液採取を行った。
【0063】
３）ＲＮＡ調製
上記２）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。精製済みＲＮＡ溶液１００μＬに３Ｍ酢酸ナトリウム１０μＬとＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）１μＬを添加後、さらに１００％ ＥｔＯＨ ２５０μＬを加え、ボルテックスした。－２０℃で３０分間（または－８０℃で１５分間）静置、冷却後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。溶液を除去後、７０％ ＥｔＯＨを７００μＬ加え、再度１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。溶液を完全に除去し、チューブのフタを開けて１分間乾燥後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １０μＬで再溶解した。得られたＲＮＡ溶液は－８０℃で保管した。
上記２）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。精製済みＲＮＡ溶液１００μＬに３Ｍ酢酸ナトリウム１０μＬとＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）１μＬを添加後、さらに１００％ ＥｔＯＨ ２５０μＬを加え、ボルテックスした。－２０℃で３０分間（または－８０℃で１５分間）静置、冷却後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。溶液を除去後、７０％ ＥｔＯＨを７００μＬ加え、再度１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。溶液を完全に除去し、チューブのフタを開けて１分間乾燥後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １０μＬで再溶解した。得られたＲＮＡ溶液は－８０℃で保管した。
【0064】
４）ウイルスゲノム解析
国立感染症研究所実施のプロトコルに準拠したマルチプレックスＰＣＲ法（Ａ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｏｆ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ＡＲＴＩＣ Ｎｅｔｗｏｒｋ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｋｅｎｔａｒｏ Ｉｔｏｋａｗａ， Ｔｓｕｙｏｓｈｉ Ｓｅｋｉｚｕｋａ， Ｍａｓａｎｏｒｉ Ｈａｓｈｉｎｏ， Ｒｉｎａ Ｔａｎａｋａ， Ｍａｋｏｔｏ Ｋｕｒｏｄａ． ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０ Ｍａｒｃｈ １０．）にてウイルスゲノム領域を特異的に増幅し、次世代シーケンサーＭｉＳｅｑを用いて、ウイルスゲノム全長に由来する配列を取得した。具体的には検体ＲＮＡ溶液をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて逆転写し、マルチプレックスＰＣＲによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム領域を増幅したＤＮＡアンプリコンを得た。次に、ＱＩＡｓｅｑ ＦＸ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡアンプリコンの断片化、平滑末端処理及びＡ突出末端の付与、アダプター付与を行い、シーケンスライブラリーとした。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてライブラリーの品質確認をした。調製したライブラリーをＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３を用いてシーケンスを実施した。得られたシーケンスデータは解析ツールＯＮＥ ＣＯＤＥＸを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照配列（ＭＮ９０８９４７）へのマッピングを実施した。
国立感染症研究所実施のプロトコルに準拠したマルチプレックスＰＣＲ法（Ａ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｏｆ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ＡＲＴＩＣ Ｎｅｔｗｏｒｋ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｋｅｎｔａｒｏ Ｉｔｏｋａｗａ， Ｔｓｕｙｏｓｈｉ Ｓｅｋｉｚｕｋａ， Ｍａｓａｎｏｒｉ Ｈａｓｈｉｎｏ， Ｒｉｎａ Ｔａｎａｋａ， Ｍａｋｏｔｏ Ｋｕｒｏｄａ． ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０ Ｍａｒｃｈ １０．）にてウイルスゲノム領域を特異的に増幅し、次世代シーケンサーＭｉＳｅｑを用いて、ウイルスゲノム全長に由来する配列を取得した。具体的には検体ＲＮＡ溶液をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて逆転写し、マルチプレックスＰＣＲによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム領域を増幅したＤＮＡアンプリコンを得た。次に、ＱＩＡｓｅｑ ＦＸ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡアンプリコンの断片化、平滑末端処理及びＡ突出末端の付与、アダプター付与を行い、シーケンスライブラリーとした。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてライブラリーの品質確認をした。調製したライブラリーをＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３を用いてシーケンスを実施した。得られたシーケンスデータは解析ツールＯＮＥ ＣＯＤＥＸを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照配列（ＭＮ９０８９４７）へのマッピングを実施した。
【0065】
５）結果
８検体中６検体でライブラリー品質基準を満たし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照配列のほぼ全域（９９％以上）を網羅するＭｅａｎ ｄｅｐｔｈ ２０００ ｘ以上のシーケンスデータが得られた。ＳＳＬ検体からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム解析が十分可能であると示された（表４）。
８検体中６検体でライブラリー品質基準を満たし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照配列のほぼ全域（９９％以上）を網羅するＭｅａｎ ｄｅｐｔｈ ２０００ ｘ以上のシーケンスデータが得られた。ＳＳＬ検体からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム解析が十分可能であると示された（表４）。
【0066】
【表4】
【0067】
実施例３ ＣＯＶＩＤ－１９患者のＳＳＬにおける遺伝子発現解析
１）被験者
日本国内において２０２０年４月～２０２０年１２月の間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された２０歳以上男女のＣＯＶＩＤ－１９患者１４名を対象とした。なお、２０１９年に実施した２０歳以上の健常男性１８名のＳＳＬ－ＲＮＡをコントロールとした。
１）被験者
日本国内において２０２０年４月～２０２０年１２月の間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された２０歳以上男女のＣＯＶＩＤ－１９患者１４名を対象とした。なお、２０１９年に実施した２０歳以上の健常男性１８名のＳＳＬ－ＲＮＡをコントロールとした。
【0068】
２）ＳＳＬ採取
各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。
各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。
【0069】
３）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
上記２）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。精製済みＲＮＡ溶液１００μＬに３Ｍ酢酸ナトリウム１０μＬとＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）１μＬを添加後、さらに１００％ＥｔＯＨ ２５０μＬを加え、ボルテックスした。－２０℃で３０分間（または－８０℃で１５分間）静置、冷却後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。溶液を除去後、７０％ＥｔＯＨを７００μＬ加え、再度１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。溶液を完全に除去し、チューブのフタを開けて１分間乾燥後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １０μＬで再溶解した。得られたＲＮＡ溶液は－８０℃で保管した。
抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。
上記２）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。精製済みＲＮＡ溶液１００μＬに３Ｍ酢酸ナトリウム１０μＬとＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）１μＬを添加後、さらに１００％ＥｔＯＨ ２５０μＬを加え、ボルテックスした。－２０℃で３０分間（または－８０℃で１５分間）静置、冷却後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。溶液を除去後、７０％ＥｔＯＨを７００μＬ加え、再度１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。溶液を完全に除去し、チューブのフタを開けて１分間乾燥後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １０μＬで再溶解した。得られたＲＮＡ溶液は－８０℃で保管した。
抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。
【0070】
４）データ解析
得られたリードカウントデータはＲを用いて解析を行った。Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔのターゲットとなっている２０８０２遺伝子のうち検出された遺伝子数の割合が２０％未満のサンプルを低品質サンプルとして解析から除外した。基準をクリアしたサンプルについて得られたシーケンスデータから９０％以上のサンプルで検出された遺伝子についてＤＥＳｅｑ２におけるｓｉｚｅ ｆａｃｔｏｒによる正規化を行い、発現変動遺伝子の抽出（Ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ（ＦＤＲ）＜０．０５， ｜Ｌｏｇ２ＦＣ｜＞２）を行った。
得られたリードカウントデータはＲを用いて解析を行った。Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔのターゲットとなっている２０８０２遺伝子のうち検出された遺伝子数の割合が２０％未満のサンプルを低品質サンプルとして解析から除外した。基準をクリアしたサンプルについて得られたシーケンスデータから９０％以上のサンプルで検出された遺伝子についてＤＥＳｅｑ２におけるｓｉｚｅ ｆａｃｔｏｒによる正規化を行い、発現変動遺伝子の抽出（Ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ（ＦＤＲ）＜０．０５， ｜Ｌｏｇ２ＦＣ｜＞２）を行った。
【0071】
５）結果
健常者に比べＣＯＶＩＤ－１９患者で発現上昇する遺伝子として６７種、発現低下する遺伝子として２０種同定された。ＣＯＶＩＤ－１９で上昇する遺伝子にはＩＦＮ応答に関連するＩＦＩ６、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３、ＩＲＦ７、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＨＬＡ－Ｂ、ＥＧＲ１の９遺伝子が含まれており、ウイルス応答が検知できることが明らかとなった。
健常者に比べＣＯＶＩＤ－１９患者で発現上昇する遺伝子として６７種、発現低下する遺伝子として２０種同定された。ＣＯＶＩＤ－１９で上昇する遺伝子にはＩＦＮ応答に関連するＩＦＩ６、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３、ＩＲＦ７、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＨＬＡ－Ｂ、ＥＧＲ１の９遺伝子が含まれており、ウイルス応答が検知できることが明らかとなった。
【0072】
【表5】
【0073】
実施例４ ＣＯＶＩＤ－１９患者のＳＳＬにおけるタンパク質発現解析
１）被験者
日本国内において２０２０年４月～２０２０年１２月の間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された２０歳以上男女のＣＯＶＩＤ－１９患者１８名を対象とした。なお、２０１９年に実施した２０歳以上の健常男性１８名のＳＳＬ－ＲＮＡをコントロールとした。
１）被験者
日本国内において２０２０年４月～２０２０年１２月の間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された２０歳以上男女のＣＯＶＩＤ－１９患者１８名を対象とした。なお、２０１９年に実施した２０歳以上の健常男性１８名のＳＳＬ－ＲＮＡをコントロールとした。
【0074】
２）ＳＳＬ採取
各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。
各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。
【0075】
３）タンパク調製
上記１）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてタンパク質沈殿物を得た。得られたタンパク質沈殿物より、ＥａｓｙＰｅｐ Ｍｉｎｉ ＭＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、付属のプロトコルに準じてタンパク質を可溶化液で溶解後、トリプシン消化した。得られた消化液を減圧乾燥（３５℃）した後、０．１％ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ、２％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅを含む水溶液にて溶解させ、ペプチド溶液を調製した。ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のプロトコルに従い、マイクロプレートリーダーを用いて溶液中のペプチド濃度を測定した。ペプチド溶液の濃度を一定に調整して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によりタンパク定量値を算出した。
上記１）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてタンパク質沈殿物を得た。得られたタンパク質沈殿物より、ＥａｓｙＰｅｐ Ｍｉｎｉ ＭＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、付属のプロトコルに準じてタンパク質を可溶化液で溶解後、トリプシン消化した。得られた消化液を減圧乾燥（３５℃）した後、０．１％ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ、２％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅを含む水溶液にて溶解させ、ペプチド溶液を調製した。ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のプロトコルに従い、マイクロプレートリーダーを用いて溶液中のペプチド濃度を測定した。ペプチド溶液の濃度を一定に調整して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によりタンパク定量値を算出した。
【0076】
４）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析及びデータ解析
上記２）で得られたサンプルペプチド溶液を下記表６の条件にてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
上記２）で得られたサンプルペプチド溶液を下記表６の条件にてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
【0077】
【表6】
【0078】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にて得られたスペクトルデータの解析には、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ｖｅｒ．２．２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。タンパク質同定には参照データベースをＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ、ＴａｘｏｎｏｍｙをＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓと設定し、Ｍａｓｃｏｔ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検索した。検索では、ＥｎｚｙｍｅをＴｒｙｐｓｉｎとし、Ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅを２、Ｄｙｎａｍｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓをＯｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍ）、Ａｃｅｔｙｌ（Ｎ－ｔｅｒｍ）、Ａｃｅｔｙｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ－ｔｅｒｍ）、Ｓｔａｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓを Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（Ｃ）に設定した。Ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ（ＦＤＲ）ｐ＜０．０１を満たすペプチドを検索の対象とした。同定したタンパク質についてプリカーサーイオンをベースとしたラベルフリー定量解析（ＬＦＱ，Ｌａｂｅｌ Ｆｒｅｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を行った。ペプチド由来のプリカーサーイオンのピーク強度によりタンパク質存在量を算出し、ピーク強度が検出限界以下であれば欠損値とした。実験的な偏りを補正するためタンパク質存在量をＴｏｔａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｍｏｕｎｔ法にてノーマライズし、Ｓｕｍｍｅｄ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ Ｂａｓｅｄ法にてタンパク質存在比を算出した。群間の存在差異の有意性を示すｐ値の算出には、ＡＮＯＶＡ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｂａｓｅｄ，ｔ検定）を用いた。同定されたタンパク質のうち、Ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ（ＦＤＲ）が０．１以上であるタンパク質は解析から除外した。
【0079】
５）結果
健常者に比べＣＯＶＩＤ－１９患者で発現変動するタンパク（ＦＤＲ＜０．０５）を１３４種同定でき、その中で、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉを構成するＨＬＡ－Ｂ（Ｑ３１６１２）がＣＯＶＩＤ－１９患者で５．９倍上昇、Ｂ２Ｍ（Ｂｅｔａ－２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ， Ｐ６１７６９）がＣＯＶＩＤ－１９患者で２１．５倍上昇することが明らかとなった。また、健常者で検出されず、ＣＯＶＩＤ－１９患者でのみ検出されるタンパクとして、ＣＲＰ（Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐ０２７４１）を同定した（健常者で０／１８名、ＣＯＶＩＤ－１９患者で８／１８名検出）。さらに、ＳＳＬ中ＣＲＰ量は血中のＣＲＰ濃度と正相関（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ｒ＝０．９２）することが明らかとなった。健常者及びＣＯＶＩＤ－１９患者の顔由来ＳＳＬ中ＨＬＡ－Ｂ、Ｂ２Ｍ、ＣＲＰタンパク存在量（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）のプロットを図１に、ＳＳＬ中ＣＲＰ量と血中ＣＲＰ濃度との相関関係を図２に示した。
健常者に比べＣＯＶＩＤ－１９患者で発現変動するタンパク（ＦＤＲ＜０．０５）を１３４種同定でき、その中で、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉを構成するＨＬＡ－Ｂ（Ｑ３１６１２）がＣＯＶＩＤ－１９患者で５．９倍上昇、Ｂ２Ｍ（Ｂｅｔａ－２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ， Ｐ６１７６９）がＣＯＶＩＤ－１９患者で２１．５倍上昇することが明らかとなった。また、健常者で検出されず、ＣＯＶＩＤ－１９患者でのみ検出されるタンパクとして、ＣＲＰ（Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐ０２７４１）を同定した（健常者で０／１８名、ＣＯＶＩＤ－１９患者で８／１８名検出）。さらに、ＳＳＬ中ＣＲＰ量は血中のＣＲＰ濃度と正相関（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ｒ＝０．９２）することが明らかとなった。健常者及びＣＯＶＩＤ－１９患者の顔由来ＳＳＬ中ＨＬＡ－Ｂ、Ｂ２Ｍ、ＣＲＰタンパク存在量（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）のプロットを図１に、ＳＳＬ中ＣＲＰ量と血中ＣＲＰ濃度との相関関係を図２に示した。
【0080】
実施例５ 皮膚表上からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出（顔と体幹部比較）
１）被験者
日本国内において２０２０年１２月～２０２１年４月の間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された２０歳以上男女で唾液と皮脂の両検体が採取できたＣＯＶＩＤ－１９患者１５名を対象とした。
１）被験者
日本国内において２０２０年１２月～２０２１年４月の間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された２０歳以上男女で唾液と皮脂の両検体が採取できたＣＯＶＩＤ－１９患者１５名を対象とした。
【0081】
２）ＳＳＬ及び唾液採取
各被験者の全顔および体幹部（体幹部前面＋脇）からそれぞれあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）１枚を用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。
各被験者の全顔および体幹部（体幹部前面＋脇）からそれぞれあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）１枚を用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。
【0082】
３）ＲＮＡ調製・ウイルスＲＮＡ定量
実施例１と同様にして、ＲＮＡを調製し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を定量した。
実施例１と同様にして、ＲＮＡを調製し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を定量した。
【0083】
４）結果
顔皮脂１５検体中９検体で、体幹部皮脂１５検体中４検体で陽性反応が認められた（表７）。皮脂の多い顔以外でも、ウイルスＲＮＡの検出が可能であることが明らかとなった。
顔皮脂１５検体中９検体で、体幹部皮脂１５検体中４検体で陽性反応が認められた（表７）。皮脂の多い顔以外でも、ウイルスＲＮＡの検出が可能であることが明らかとなった。
【0084】
【表7】
【0085】
実施例６ ＣＯＶＩＤ－１９患者重症度別のＳＳＬにおける遺伝子発現解析
１）被験者
日本国内において２０２０年４月～２０２１年４月の間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された２０歳以上男女のＣＯＶＩＤ－１９軽症患者１５名、中等症患者１４名を対象とし、入院後初回の採取皮脂を検体として用いた。なお、２０１９年に実施した２０歳以上の健常男性１８名をコントロールとした。
１）被験者
日本国内において２０２０年４月～２０２１年４月の間にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された２０歳以上男女のＣＯＶＩＤ－１９軽症患者１５名、中等症患者１４名を対象とし、入院後初回の採取皮脂を検体として用いた。なお、２０１９年に実施した２０歳以上の健常男性１８名をコントロールとした。
【0086】
２）ＳＳＬ採取
各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。
各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて皮脂を回収後、該あぶら取りフィルムをバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃にて保存した。
【0087】
３）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
上記２）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、実施例３と同様にＲＮＡを調製し、シーケンシングを行った。
上記２）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、実施例３と同様にＲＮＡを調製し、シーケンシングを行った。
【0088】
４）データ解析
得られたリードカウントデータはＲを用いて解析を行った。Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔのターゲットとなっている２０８０２遺伝子のうち検出された遺伝子数の割合が２０％未満のサンプルを低品質サンプルとして解析から除外した。基準をクリアしたサンプルについて得られたシーケンスデータから９０％以上のサンプルで検出された遺伝子についてＤＥＳｅｑ２におけるｓｉｚｅ ｆａｃｔｏｒによる正規化を行った。その後、健常群、軽症群、中等症群のＩＦＮ刺激遺伝子発現量についてＴｕｋｅｙ-Ｋｒａｍｅｒの多重比較検定を行った。
得られたリードカウントデータはＲを用いて解析を行った。Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔのターゲットとなっている２０８０２遺伝子のうち検出された遺伝子数の割合が２０％未満のサンプルを低品質サンプルとして解析から除外した。基準をクリアしたサンプルについて得られたシーケンスデータから９０％以上のサンプルで検出された遺伝子についてＤＥＳｅｑ２におけるｓｉｚｅ ｆａｃｔｏｒによる正規化を行った。その後、健常群、軽症群、中等症群のＩＦＮ刺激遺伝子発現量についてＴｕｋｅｙ-Ｋｒａｍｅｒの多重比較検定を行った。
【0089】
５）結果
ＩＦＮ応答に関係するＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３はいずれも健常に比べ軽症で発現高く、さらに軽症に比べ中等症で発現が低いことが明らかとなった。これら抗ウイルスに関与するＩＦＮ関連遺伝子の応答性で重症度を予測できる可能性が示された（図３）。
ＩＦＮ応答に関係するＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ３はいずれも健常に比べ軽症で発現高く、さらに軽症に比べ中等症で発現が低いことが明らかとなった。これら抗ウイルスに関与するＩＦＮ関連遺伝子の応答性で重症度を予測できる可能性が示された（図３）。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】