(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023039995
(43)【公開日】2023-03-22
(54)【発明の名称】軟骨細胞の品質保証
(51)【国際特許分類】
A61K 35/32 20150101AFI20230314BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230314BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20230314BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20230314BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230314BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230314BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20230314BHJP
【ＦＩ】
A61K35/32
A61P19/02
A61L27/38 112
C12N5/077
C12Q1/02
C12Q1/686 Z
C12Q1/6851 Z
【審査請求】有
【請求項の数】19
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022199070
(22)【出願日】2022-12-14
(62)【分割の表示】P 2019568219の分割
【原出願日】2018-06-29
(31)【優先権主張番号】1750849-0
(32)【優先日】2017-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(71)【出願人】
【識別番号】519050794
【氏名又は名称】シンテラ エービー
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ルンドグレン アーケランド，エヴィー
(72)【発明者】
【氏名】ケミラスカ マソウミ，カタルジーナ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】高品質を有する軟骨細胞組成物、ならびに軟骨細胞組成物の品質保証および品質管理のための方法を提供する。
【解決手段】軟骨細胞を含む組成物の純度、品質、軟骨細胞同一性の度合い、軟骨細胞の効能、および／または軟骨細胞の表現型の度合いを計測するため、そして高品質の軟骨細胞の集団を単離および濃縮するため、ならびに高品質の軟骨細胞の培養および増大（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）を制御するために用いられる、軟骨細胞上でのインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現に基づく方法に関する。本発明は、軟骨細胞を含む組成物にも関する。
【選択図】図１－１
【解決手段】軟骨細胞を含む組成物の純度、品質、軟骨細胞同一性の度合い、軟骨細胞の効能、および／または軟骨細胞の表現型の度合いを計測するため、そして高品質の軟骨細胞の集団を単離および濃縮するため、ならびに高品質の軟骨細胞の培養および増大（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）を制御するために用いられる、軟骨細胞上でのインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現に基づく方法に関する。本発明は、軟骨細胞を含む組成物にも関する。
【選択図】図１－１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離および培養された軟骨細胞を含む組成物であって、前記組成物は、少なくとも４対１のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する、組成物。
【請求項2】
前記インテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、少なくとも４対１、例えば少なくとも５対１など、少なくとも１０対１など、少なくとも１５対１など、少なくとも２０対１など、少なくとも２５対１など、少なくとも３０対１など、少なくとも３５対１など、少なくとも４０対１など、少なくとも４５対１など、少なくとも５０対１など、少なくとも６０対１など、少なくとも７０対１など、少なくとも８０対１など、少なくとも９０対１など、少なくとも１００対１など、少なくとも１５０対１など、少なくとも２００対１などである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記組成物が、分化された軟骨細胞を含み、前記分化された軟骨細胞が、インテグリンアルファ１０を発現し、インテグリンアルファ１１を実質的に発現せず、かつ／または
前記組成物が、部分的に脱分化された軟骨細胞を含み、前記部分的に脱分化された軟骨細胞が、インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の両方を発現する、請求項１または２に記載の組成物。
前記組成物が、部分的に脱分化された軟骨細胞を含み、前記部分的に脱分化された軟骨細胞が、インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の両方を発現する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記組成物が、軟骨組織調製物、軟骨細胞を含む組織調製物、単層軟骨細胞の細胞培養物、および三次元軟骨細胞の細胞培養物からなる群から選択され、前記三次元軟骨細胞の細胞培養物が、スフェロイド、ペレット、細胞シートまたは足場に培養された軟骨細胞であり、かつ／または
前記組成物が、軟骨組織、軟骨細胞を含む組織、単層軟骨細胞の細胞培養物および三次元軟骨細胞の細胞培養物に由来し、前記三次元軟骨細胞の細胞培養物が、スフェロイド、ペレット、細胞シートまたは足場に培養された軟骨細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
前記組成物が、軟骨組織、軟骨細胞を含む組織、単層軟骨細胞の細胞培養物および三次元軟骨細胞の細胞培養物に由来し、前記三次元軟骨細胞の細胞培養物が、スフェロイド、ペレット、細胞シートまたは足場に培養された軟骨細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記組成物が、混入細胞を実質的に含まず、前記混入細胞が、インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリン１０を発現せず、かつ／または
前記組成物が、全組成物または細胞集団のうち、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、１００％などの軟骨細胞を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
前記組成物が、全組成物または細胞集団のうち、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、１００％などの軟骨細胞を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
前記軟骨細胞が、ＣＥＰ－６８／ＣＲＴＡＣ１、ＧＰ－３９軟骨糖タンパク質、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、コラーゲンＩＩＡ、コラーゲンＩＩＢ、アグレカン、アリザリンレッド（ｎｅｇ）、アルシアンブルー、ＣＲＴＡＣ１、ＣＥＰ－６８、ＣＤ１４６、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ６３およびＳｃａ－１からなる群から選択される二次マーカーをさらに発現する、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
単離および培養された軟骨細胞を含む組成物の品質を決定するための方法であって、前記品質決定が、以下の基準：
・前記軟骨細胞の同一性、
・前記軟骨細胞の分化状態、
・前記軟骨細胞の純度、および
・前記軟骨細胞の効能
のうちの１つまたは複数を含み、
前記方法が、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前記組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルと比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・前記軟骨細胞組成物中の前記軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・前記軟骨細胞組成物中の前記軟骨細胞の分化状態、
・前記軟骨細胞組成物の純度、および／または
・前記軟骨細胞組成物の前記軟骨細胞の効能
の指標であり、それにより高品質の軟骨細胞組成物の指標となる、
方法。
・前記軟骨細胞の同一性、
・前記軟骨細胞の分化状態、
・前記軟骨細胞の純度、および
・前記軟骨細胞の効能
のうちの１つまたは複数を含み、
前記方法が、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前記組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルと比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・前記軟骨細胞組成物中の前記軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・前記軟骨細胞組成物中の前記軟骨細胞の分化状態、
・前記軟骨細胞組成物の純度、および／または
・前記軟骨細胞組成物の前記軟骨細胞の効能
の指標であり、それにより高品質の軟骨細胞組成物の指標となる、
方法。
【請求項8】
高品質の軟骨細胞の集団を単離および培養するための方法であって、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前記組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現を分析するステップと；
ｃ）少なくとも４対１のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞を濃縮し、それにより単離されかつ培養された高品質の軟骨細胞の集団を得るステップと
を含む、方法。
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前記組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現を分析するステップと；
ｃ）少なくとも４対１のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞を濃縮し、それにより単離されかつ培養された高品質の軟骨細胞の集団を得るステップと
を含む、方法。
【請求項9】
高品質の軟骨細胞の集団を製造するための方法であって、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前記組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現を分析するステップと；
ｃ）少なくとも４対１のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞を増大させ（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）、それにより高品質の軟骨細胞の集団を製造するステップと
を含む、方法。
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前記組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現を分析するステップと；
ｃ）少なくとも４対１のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞を増大させ（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）、それにより高品質の軟骨細胞の集団を製造するステップと
を含む、方法。
【請求項10】
前記インテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、少なくとも４対１、例えば少なくとも１０対１など、少なくとも１５対１など、少なくとも２０対１など、少なくとも２５対１など、少なくとも３０対１など、少なくとも３５対１など、少なくとも４０対１など、少なくとも４５対１など、少なくとも５０対１など、少なくとも６０対１など、少なくとも７０対１など、少なくとも８０対１など、少なくとも９０対１など、少なくとも１００対１など、少なくとも１５０対１など、少なくとも２００対１などであり、かつ／または
前記インテグリンアルファ１１の発現が、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大２５％、例えば前記インテグリンアルファ１０の発現の最大２０％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大１５％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大１０％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大５％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大４％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大３％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大２％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大１％などである、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
前記インテグリンアルファ１１の発現が、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大２５％、例えば前記インテグリンアルファ１０の発現の最大２０％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大１５％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大１０％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大５％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大４％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大３％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大２％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大１％などである、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の両方の発現が、部分的に脱分化された軟骨細胞組成物の指標であり、かつ／または
インテグリンアルファ１０の発現および実質的に存在しないインテグリンアルファ１１の発現が、分化された軟骨細胞組成物の指標であり、かつ／または
前記軟骨細胞組成物中の最大２０％の前記細胞が、インテグリンアルファ１１を発現し、インテグリンアルファ１０を実質的に発現しないことが、前記軟骨細胞組成物の純度の指標であり、かつ／または
前記軟骨細胞組成物中の最大２０％、例えば最大１５％など、最大１０％など、最大５％など、最大４％など、最大３％など、最大２％など、最大１％など、最大０．５％などの前記細胞が、インテグリンアルファ１１を発現し、インテグリンアルファ１０を実質的に発現しないことが、前記軟骨細胞組成物の純度の指標であり、かつ／または
インテグリンアルファ１１が、前記軟骨細胞組成物または集団中で実質的に発現されない、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
インテグリンアルファ１０の発現および実質的に存在しないインテグリンアルファ１１の発現が、分化された軟骨細胞組成物の指標であり、かつ／または
前記軟骨細胞組成物中の最大２０％の前記細胞が、インテグリンアルファ１１を発現し、インテグリンアルファ１０を実質的に発現しないことが、前記軟骨細胞組成物の純度の指標であり、かつ／または
前記軟骨細胞組成物中の最大２０％、例えば最大１５％など、最大１０％など、最大５％など、最大４％など、最大３％など、最大２％など、最大１％など、最大０．５％などの前記細胞が、インテグリンアルファ１１を発現し、インテグリンアルファ１０を実質的に発現しないことが、前記軟骨細胞組成物の純度の指標であり、かつ／または
インテグリンアルファ１１が、前記軟骨細胞組成物または集団中で実質的に発現されない、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記候補組成物が、軟骨組織調製物、軟骨細胞を含む組織調製物、単層軟骨細胞の細胞培養物、および三次元軟骨細胞の細胞培養物からなる群から選択され、前記三次元軟骨細胞の細胞培養物が、スフェロイド、ペレット、細胞シートまたは足場に培養された軟骨細胞であり、かつ／または
前記候補組成物が、軟骨組織、軟骨細胞を含む組織、単層軟骨細胞の細胞培養物および三次元軟骨細胞の細胞培養物に由来し、前記三次元軟骨細胞の細胞培養物が、スフェロイド、ペレット、細胞シートまたは足場に培養された軟骨細胞である、請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法。
前記候補組成物が、軟骨組織、軟骨細胞を含む組織、単層軟骨細胞の細胞培養物および三次元軟骨細胞の細胞培養物に由来し、前記三次元軟骨細胞の細胞培養物が、スフェロイド、ペレット、細胞シートまたは足場に培養された軟骨細胞である、請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記発現の分析が、遺伝子発現分析および任意の他の適切な方法からなる群から選択される方法により実行される、請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
ＣＥＰ－６８／ＣＲＴＡＣ１、ＧＰ－３９軟骨糖タンパク質、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、コラーゲンＩＩＡ、コラーゲンＩＩＢ、アグレカン、アリザリンレッド（ｎｅｇ）、アルシアンブルー、ＣＲＴＡＣ１、ＣＥＰ－６８、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ６３、ＣＤ１４６、ＣＤ９０およびＳｃａ－１からなる群から選択される二次マーカーの発現を検出することをさらに含む、請求項７～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記インテグリンアルファ１０発現の分析が、インテグリンアルファ１０のｍＲＮＡ発現を測定することを含み、かつ／または
前記インテグリンアルファ１発現の分析が、インテグリンアルファ１１のｍＲＮＡ発現を測定することを含む、請求項７～１４のいずれか１項に記載の方法。
前記インテグリンアルファ１発現の分析が、インテグリンアルファ１１のｍＲＮＡ発現を測定することを含む、請求項７～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
得られた前記軟骨細胞組成物または集団が、全細胞集団のうち、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、１００％などの軟骨細胞を含む、請求項７～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
得られた前記軟骨細胞組成物または集団が、最大２０％の混入細胞、例えば最大１５％の混入細胞など、最大１０％の混入細胞など、最大５％の混入細胞など、最大４％の混入細胞など、最大３％の混入細胞など、最大２％の混入細胞など、最大１％の混入細胞など、最大０．５％の混入細胞などを含み、前記混入細胞が、インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しない、請求項７～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
インテグリンアルファ１０の発現を誘導する条件下で、軟骨細胞の組成物を育成すること、
インテグリンアルファ１０を発現する細胞を選択すること、および／または
インテグリンアルファ１１を発現する細胞を枯渇させること、をさらに含む、請求項７～１７のいずれか１項に記載の方法。
インテグリンアルファ１０を発現する細胞を選択すること、および／または
インテグリンアルファ１１を発現する細胞を枯渇させること、をさらに含む、請求項７～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
ａ）軟骨細胞組成物を品質保証するための；
ｂ）軟骨細胞組成物の一貫性および／もしくは再現性のモニタリングのための；
ｃ）軟骨細胞組成物の効能を予測するための；
ｄ）軟骨細胞組成物を工程内管理するための；
ｅ）軟骨細胞組成物の増大の工程内管理のための；
ｆ）軟骨細胞組成物の放出テストを実行するための；
ｇ）軟骨細胞組成物の効能アッセイを実行するための；および／または
ｈ）軟骨細胞組成物の臨床転帰の予測のための、
請求項７～１８のいずれか１項に記載の方法の使用。
ｂ）軟骨細胞組成物の一貫性および／もしくは再現性のモニタリングのための；
ｃ）軟骨細胞組成物の効能を予測するための；
ｄ）軟骨細胞組成物を工程内管理するための；
ｅ）軟骨細胞組成物の増大の工程内管理のための；
ｆ）軟骨細胞組成物の放出テストを実行するための；
ｇ）軟骨細胞組成物の効能アッセイを実行するための；および／または
ｈ）軟骨細胞組成物の臨床転帰の予測のための、
請求項７～１８のいずれか１項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、高品質を有する軟骨細胞組成物、ならびに軟骨細胞組成物の品質保証および品質管理のための方法に関する。
本発明は、高品質を有する軟骨細胞組成物、ならびに軟骨細胞組成物の品質保証および品質管理のための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
関節のガラス軟骨への損傷は、傷害後に治癒するための本質的能力を限定する。これは、関節の変性促進と、早期発症型の骨関節炎に導く可能性がある。今日では、天然の関節軟骨を保存して関節形成術を遅らせるという要望が増えつつある。
関節のガラス軟骨への損傷は、傷害後に治癒するための本質的能力を限定する。これは、関節の変性促進と、早期発症型の骨関節炎に導く可能性がある。今日では、天然の関節軟骨を保存して関節形成術を遅らせるという要望が増えつつある。
【0003】
成人の関節軟骨細胞は、発達の最終ポイントとして完全に分化された状態に達した特有の細胞型である。軟骨基質内では、軟骨細胞が軟骨の恒常性を調節し、基質の構成要素を低ターンオーバー状態の平衡に維持する。
【0004】
軟骨細胞は、軟骨内の唯一の細胞型であり、多数の異なるインテグリンを発現する。インテグリンは、細胞－細胞および細胞－基質相互作用を媒介する膜貫通糖タンパク質の大きなファミリーである。このスーパーファミリーの全ての既知メンバーが、アルファ－およびベータ－サブユニットで構成される非共有結合で会合されたヘテロダイマーである。インテグリンアルファ１０ベータ１は、軟骨細胞上の主要なコラーゲン結合インテグリンである。それは、分化された軟骨細胞により、そして軟骨形成分化能を有するＭＳＣにより発現される。その一方でインテグリンアルファ１１ベータ１は、滑膜線維芽細胞をはじめとする線維芽細胞により発現される。部分的に脱分化されて、軟骨コラーゲンＩＩ型の代わりに線維性コラーゲンＩ型を生成し、これにより軟骨細胞調製物の純度および品質を計測する方法を提供し得る、単層培養物中の軟骨細胞によっても、インテグリンアルファ１１ベータ１は発現される。
【0005】
関節軟骨傷害の処置のための軟骨細胞に基づく細胞治療は、ガラス軟骨を修復および再吸収することを目的とした有望な方法である。
【0006】
軟骨細胞に基づく細胞治療の主要な制約は、軟骨基質を酵素により軟骨生検から取り出して軟骨細胞を単離する、という手順に関係する。この手順の間に、滑膜などの非軟骨組織の細胞が、軟骨細胞調製物に混入し（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ． ２００６， Ｓｔｅｂｕｉｌｓ ｅｔ ａｌ． ２００５）、それにより植込みに用いられる軟骨細胞調製物の純度および品質に影響を及ぼす場合がある。加えて軟骨細胞は多くの場合、軟骨基質から単離されると、脱分化する（Ｒａｐｋｏ ｅｔ ａｌ． ２００９）。これにより、コラーゲンＩＩ型からコラーゲンＩ型への合成の切り替えとして検出され得る特殊な軟骨細胞の特性が喪失する。したがって、軟骨細胞品質の品質管理のためのロバストな手順が求められている。
【発明の概要】
【0007】
概要
本発明者らは、細胞表面タンパク質であるインテグリンアルファ１０ベータ１およびインテグリンアルファ１１ベータ１の発現レベルと、単離および培養された軟骨細胞の品質との相関性を見出し、これにより軟骨細胞調製物を定義して、それらを品質保証および／または品質管理する新しい方法を見出した。
本発明者らは、細胞表面タンパク質であるインテグリンアルファ１０ベータ１およびインテグリンアルファ１１ベータ１の発現レベルと、単離および培養された軟骨細胞の品質との相関性を見出し、これにより軟骨細胞調製物を定義して、それらを品質保証および／または品質管理する新しい方法を見出した。
【0008】
本開示は、少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、高品質の軟骨細胞組成物および／または生成物の指標である、という発見に基づく。インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルは、培養条件に応じて変動するが、それらの比は、高品質の軟骨細胞組成物の予測となる。
【0009】
その上、本発明者らはまた、
・インテグリンアルファ１０の発現が軟骨細胞の同一性の指標になり得ること；
・インテグリンアルファ１１を伴うインテグリンアルファ１０の発現が部分的に脱分化された軟骨細胞の指標になり得ること；
・インテグリンアルファ１０の発現、および低いまたは実質的に存在しないインテグリンアルファ１１の発現が分化された軟骨細胞の指標になり得ること；ならびに
・インテグリンアルファ１１の発現、および低いまたは実質的に存在しないインテグリンアルファ１０の発現が高度に脱分化された軟骨細胞、線維芽細胞様細胞および／または混入細胞をはじめとする非軟骨細胞の同一性の指標になり得ること
を見出した。
・インテグリンアルファ１０の発現が軟骨細胞の同一性の指標になり得ること；
・インテグリンアルファ１１を伴うインテグリンアルファ１０の発現が部分的に脱分化された軟骨細胞の指標になり得ること；
・インテグリンアルファ１０の発現、および低いまたは実質的に存在しないインテグリンアルファ１１の発現が分化された軟骨細胞の指標になり得ること；ならびに
・インテグリンアルファ１１の発現、および低いまたは実質的に存在しないインテグリンアルファ１０の発現が高度に脱分化された軟骨細胞、線維芽細胞様細胞および／または混入細胞をはじめとする非軟骨細胞の同一性の指標になり得ること
を見出した。
【0010】
したがって一態様において、本開示は、少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する、軟骨細胞を含む組成物に関する。
【0011】
別の態様において、本開示は、軟骨細胞を含む組成物の品質を計測するための方法であって、該品質計測が、以下の基準：
・軟骨細胞の同一性、
・軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞の純度、および
・軟骨細胞の効能
のうちの１つまたは複数を含み、
該方法が、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標であり、それにより高品質の軟骨細胞組成物の指標となる、
方法に関する。
・軟骨細胞の同一性、
・軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞の純度、および
・軟骨細胞の効能
のうちの１つまたは複数を含み、
該方法が、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標であり、それにより高品質の軟骨細胞組成物の指標となる、
方法に関する。
【0012】
このため本開示は、軟骨細胞組成物を品質保証および品質管理するための方法に関する。
【0013】
さらなる態様において、本開示は、高品質の軟骨細胞の集団を単離するための方法であって、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現を分析するステップと；
ｃ）少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞を濃縮し、こうして高品質の軟骨細胞の単離集団を得るステップと
を含む、方法に関する。
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現を分析するステップと；
ｃ）少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞を濃縮し、こうして高品質の軟骨細胞の単離集団を得るステップと
を含む、方法に関する。
【0014】
さらなる態様において、本開示は、高品質の軟骨細胞の集団を製造するための方法であって、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現を分析するステップと；
ｃ）少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞を増大させ（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）、こうして高品質の軟骨細胞の集団を製造するステップと
を含む、方法に関する。
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現を分析するステップと；
ｃ）少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞を増大させ（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）、こうして高品質の軟骨細胞の集団を製造するステップと
を含む、方法に関する。
【0015】
一態様において、本開示は、インテグリンアルファ１０の発現を誘導することを含む、軟骨細胞を含む組成物の軟骨細胞の効能を最適化するための方法に関係する。
【0016】
一態様において、本開示は、インテグリンアルファ１０の発現を誘導することを含む、軟骨細胞の増殖速度を上昇させる方法に関係する。
【0017】
一態様において、本開示は、少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する、軟骨細胞のインビトロ細胞調製物または細胞培養物に関係する。
【0018】
一態様において、本発明は、
ａ）軟骨細胞組成物を品質保証するための；
ｂ）軟骨細胞組成物の一貫性および／もしくは再現性のモニタリングのための；
ｃ）軟骨細胞組成物および培養物の効能を予測するための；
ｄ）軟骨細胞組成物を工程内管理するための；
ｅ）軟骨細胞組成物の増大の工程内管理のための；
ｆ）軟骨細胞組成物の効能アッセイを実行するための；
ｇ）軟骨細胞組成物の放出テストを実行するための；そして／または
ｈ）臨床転帰および／もしくは軟骨細胞組成物の予測のための、
本明細書に記載された方法の任意の１つの使用に関係する。
ａ）軟骨細胞組成物を品質保証するための；
ｂ）軟骨細胞組成物の一貫性および／もしくは再現性のモニタリングのための；
ｃ）軟骨細胞組成物および培養物の効能を予測するための；
ｄ）軟骨細胞組成物を工程内管理するための；
ｅ）軟骨細胞組成物の増大の工程内管理のための；
ｆ）軟骨細胞組成物の効能アッセイを実行するための；
ｇ）軟骨細胞組成物の放出テストを実行するための；そして／または
ｈ）臨床転帰および／もしくは軟骨細胞組成物の予測のための、
本明細書に記載された方法の任意の１つの使用に関係する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1A】２～６継代の単層で培養された、２つのヒト軟骨細胞調製物８５３および８５４でのアルファ１０ベータ１発現のフローサイトメトリー分析。軟骨細胞を、ヒト血清（ＨＳ）または血小板溶解物（ＰＬ）のいずれかを含み、アスコルビン酸（Ａ）が添加された、または添加されていない培地中で培養した。インテグリン発現は、軟骨細胞をＨＳのみで培養した場合に減少する。
【図1B】２～６継代で、アスコルビン酸（Ａ）が添加された、または添加されていない、ヒト血清（ＨＳ）、血小板溶解物（ＰＬ）中で培養された４つのヒト軟骨細胞調製物８５３、８５４、８７５および８７６のフローサイトメトリー分析。２継代の細胞は、ＨＳのみで培養された。結果は、インテグリンアルファ１０／インテグリンアルファ１１の平均±ＳＥＭ比を示す（ｎ＝２～４）。アスコルビン酸（Ａ）の添加は、アルファ１０／アルファ１１比をアルファ１０に傾くように変動させることに顕著かつ即時の効果を有する。この効果は、ＨＳまたはＰＬの使用に関わらず明白である。
【図2】ヒト血清（ＨＳ）、アスコルビン酸を含むＨＳ（ＨＳＡ）、血小板溶解物（ＰＬ）、またはアスコルビン酸を含むＰＬ（ＰＬＡ）中で培養された軟骨細胞８５３についての３～６継代でコンフルエントに達した細胞培養時間を示す成長速度分析。アスコルビン酸（Ａ）およびＰＬ、特にＡの添加は、軟骨細胞増殖に顕著な効果を有した。
【図3A】ヒト血清（ＨＳ）、アスコルビン酸を含むヒト血清（ＨＳＡ）、またはアスコルビン酸を含む血小板溶解物（ＰＬＡ）中で培養されたヒト軟骨細胞調製物８５３、８５４、８７５および８７６でのアルファ１０ベータ１のフローサイトメトリー分析。インテグリンアルファ１０ベータ１－（アルファ１０）発現を、４つの軟骨細胞調製物の平均±ＳＥＭとして示す。これらの細胞を、図４の分化実験で用いた。
【図3B】ヒト血清（ＨＳ）、アスコルビン酸を含むヒト血清（ＨＳＡ）、またはアスコルビン酸を含む血小板溶解物（ＰＬＡ）中で培養されたヒト軟骨細胞調製物８５３、８５４、８７５および８７６でのＩＴＧＡ１０の遺伝子発現分析。相対的なＩＴＧＡ１０遺伝子発現を、４つの細胞株での平均±ＳＥＭとして示す。ＧＡＰＤＨを、対照用のハウスキーピング遺伝子として用いた。
【図4A】免疫組織化学的検査により分析された軟骨細胞ペレットの組織断片におけるコラーゲンＩＩ発現の評価スコアシステム。コラーゲンＩＩ発現の度合いを、０～５のスケールでスコア付けした。
【図4B】ＨＳ中で増大され、再分化培地ＴＩＤＡの存在下、１～４週間ペレット培養物中で生育された、ヒト軟骨細胞調製物８５３、８５４、８７５および８７６のコラーゲンＩＩ型（Ｃｏｌ２）発現スコアの概要。
【図4C】ＨＳＡ中で増大され、再分化培地ＴＩＤＡの存在下、１～４週間ペレット培養物中で生育された、ヒト軟骨細胞調製物８５３、８５４、８７５および８７６のコラーゲンＩＩ型（Ｃｏｌ２）発現スコアの概要。
【図4D】ＰＬＡ中で増大され、再分化培地ＴＩＤＡの存在下、１～４週間ペレット培養物中で生育された、ヒト軟骨細胞調製物８５３、８５４、８７５および８７６のコラーゲンＩＩ型（Ｃｏｌ２）発現スコアの概要。
【図5】ＨＳ中で単層に培養されたヒト軟骨細胞調製物８５３、８５４、８７５、８７６、８０３、８１１、８１６、８４２および９１４上でのインテグリンアルファ１０ベータ１発現（フローサイトメトリー）と、ペレット培養物中で２週間後のコラーゲンＩＩ型発現（免疫組織化学的検査）の間の相関。ピアソン相関解析から、相関係数（Ｒ２）０．７５の高レベルの相関が実証された。はずれ値と見なされ得る試料９１４を除外すると、０．９３のＲ２が実現される（データは示さない）。
【図6A】ＰＬＡ中で単層に生育され、その後、再分化培地ＴＩＤＡを含むペレット培養物中で２週間生育された、軟骨細胞調製物８７５でのコラーゲンＩＩ、コラーゲンＩおよびインテグリンアルファ１０ベータ１の免疫組織化学的分析。インテグリンアルファ１０ベータ１は、コラーゲンＩＩ型と共存することが見出されたが、コラーゲンＩ型は、インテグリンアルファ１０ベータ１が少量であるか、または存在しない、外部領域内で主に発現された。
【図6B】ＰＬＡ中で単層に培養され、その後、ＴＩＤＡと共にペレット培養物中で２週間培養された、軟骨細胞８７５でのインテグリンアルファ１１ベータ１（Ｂ）、インテグリンアルファ１０ベータ１（Ｃ）、コラーゲンＩＩ（Ｄ）の免疫蛍光染色。核のＤＡＰＩ染色が（Ａ）に示され、異なる染色のマージ画像が（Ｅ）に示される。染色は、共焦点顕微鏡測定により視覚化した。スケールバー５０μｍ。インテグリンアルファ１０ベータ１は、コラーゲンＩＩ型と共存することが見出されたが、インテグリンアルファ１１ベータ１は、コラーゲンＩ型の発現が見出されるペレットの外部領域中で発現される（図６Ａ参照）。
【図7A】線維芽細胞様滑膜細胞（ＨＦＬＳ）、軟骨細胞調製物８７５、ＨＦＬＳ－ＯＡ（骨関節炎患者からの線維芽細胞様細胞）およびヒト鼻軟骨細胞（ＨＮＣ）でのインテグリンアルファ１１ベータ１（Ｘ軸）のフローサイトメトリー分析。結果から、インテグリンアルファ１１ベータ１が線維芽細胞様細胞上で発現されるが、軟骨細胞上では発現されないことが示される。側方散乱（ＳＳＣ－Ａ）が、Ｙ軸上に示される。
【図7B】軟骨細胞と滑膜線維芽細胞様細胞との混合物でのインテグリンアルファ１１ベータ１のフローサイトメトリー分析。ＨＮＣ（ヒト鼻軟骨細胞）の調製物への０、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％ＨＦＬＳ－ＯＡ（骨関節炎患者のヒト線維芽細胞様軟骨細胞）の添加。結果から、インテグリンアルファ１１ベータ１が軟骨細胞調製物中で微量ではあるが線維芽細胞様細胞を検出し得ること、およびインテグリンアルファ１１ベータ１が線維芽細胞様細胞の添加により増加することが、示される。
【図7C】インテグリンアルファ１１ベータ１の発現と、軟骨細胞調製物へのＨＦＬＳ－ＯＡ（骨関節炎患者のヒト線維芽細胞様軟骨細胞）の添加の間の相関。ＨＮＣ（ヒト鼻軟骨細胞）の調製物への０、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、２５％、５０％、および１００％ＨＦＬＳ－ＯＡの添加。これは、インテグリンアルファ１１ベータ１を用いて軟骨細胞調製物中に混入した線維芽細胞様細胞を検出および定量し得ることを実証している。
【図8A】インテグリンアルファ１０（α１０）およびアルファ１１（α１１）の発現を、ペレット培養の前に試料８０３および８１１から単層培養されたヒト軟骨細胞上で分析した。フローサイトメトリー分析から、試料８１１での低いインテグリンα１０／インテグリンα１１比、および試料８０３での高いインテグリンα１０／インテグリンα１１比が示された。
【図8B】ペレット塊中で２および３週間培養された試料８０３および８１１からの軟骨細胞におけるＣｏｌ２生成の組織学的評価。軟骨細胞ペレットからの組織断片を、コラーゲンＩＩ型（Ｃｏｌ２）の発現について分析し、Ｃｏｌ２発現の度合いを、０～５スケールでスコア付けした。結果から、軟骨細胞８１１からのペレット中でのＣｏｌ２の全くない／非常に低い発現、および軟骨細胞８０３からのペレット中のＣｏｌ２の高い発現が示される。
【図9】ヒト軟骨細胞調製物８０３（高い効能、図８参照）および８４２（低い効能）でのインテグリンアルファ１０（Ｘ軸）インテグリンアルファ１１（Ｙ軸）のフローサイトメトリー分析。それぞれインテグリンアルファ１０およびアルファ１１に向けられた２種の抗体組の結合を利用して、抗体の単一染色および二重染色の度合いを実証した。下右の四角は、インテグリンアルファ１０の高い単一発現を示し、上左は、インテグリンアルファ１１の高い単一発現を示し、上右は、インテグリンアルファ１０およびアルファ１１の両方の発現を有する細胞を示す。結果から、軟骨細胞調製物８４２が８０３に比較してより多くの脱分化細胞および非軟骨細胞を有することが示される。
【発明を実施するための形態】
【0020】
詳細な記載
定義
本明細書で用いられる「インテグリンアルファ１０」は、ヘテロダイマータンパク質のインテグリンアルファ１０ベータ１のアルファ１０サブユニット、およびヘテロダイマータンパク質のインテグリンアルファ１０ベータ１を指す。この表記は、アルファ１０サブユニットに結合し、これによりインテグリンアルファ１０ベータ１ヘテロダイマーを形成する、ベータ１サブユニットの存在を除外しない。ヒトインテグリンアルファ１０鎖配列は、公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）／ＥＢＩ Ｄａｔａ Ｂａｎｋアクセション番号ＡＦ０７４０１５として公開されている。
定義
本明細書で用いられる「インテグリンアルファ１０」は、ヘテロダイマータンパク質のインテグリンアルファ１０ベータ１のアルファ１０サブユニット、およびヘテロダイマータンパク質のインテグリンアルファ１０ベータ１を指す。この表記は、アルファ１０サブユニットに結合し、これによりインテグリンアルファ１０ベータ１ヘテロダイマーを形成する、ベータ１サブユニットの存在を除外しない。ヒトインテグリンアルファ１０鎖配列は、公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）／ＥＢＩ Ｄａｔａ Ｂａｎｋアクセション番号ＡＦ０７４０１５として公開されている。
【0021】
本明細書で用いられる「抗インテグリンアルファ１０抗体」は、少なくともインテグリンアルファ１０サブユニットだけでなく、ヘテロダイマータンパク質インテグリンアルファ１０ベータ１も認識および結合することが可能な抗体を指す。これらの抗体は、アルファ１０およびベータ１サブユニットの両方のアミノ酸残基を含む、ヘテロダイマータンパク質インテグリンアルファ１０ベータ１のエピトープを認識する抗体であってもよい。これらの抗体はまた、アルファ１０サブユニットのみのアミノ酸残基を含む、ヘテロダイマータンパク質インテグリンアルファ１０ベータ１のエピトープを認識する抗体であってもよい。
【0022】
本明細書で用いられる「インテグリンアルファ１１」は、ヘテロダイマータンパク質インテグリンアルファ１１ベータ１のアルファ１１サブユニット、およびヘテロダイマータンパク質インテグリンアルファ１１ベータ１を指す。この表記は、アルファ１１サブユニットに結合し、これによりインテグリンアルファ１０ベータ１ヘテロダイマーを形成する、ベータ１サブユニットの存在を除外しない。
【0023】
本明細書で用いられる「抗インテグリンアルファ１１抗体」は、少なくともインテグリンアルファ１１サブユニットだけでなく、ヘテロダイマータンパク質インテグリンアルファ１１ベータ１のインテグリンアルファ１１サブユニットも認識および結合することが可能な抗体を指す。これらの抗体は、アルファ１１およびベータ１サブユニットの両方のアミノ酸残基を含む、ヘテロダイマータンパク質インテグリンアルファ１１ベータ１のエピトープを認識する抗体であってもよい。これらの抗体はまた、アルファ１１サブユニットのみのアミノ酸残基を含む、ヘテロダイマータンパク質インテグリンアルファ１１ベータ１のエピトープを認識する抗体であってもよい。
【0024】
用語「インテグリンアルファ１０／１１」は、インテグリンアルファ１０もしくはインテグリンアルファ１１のいずれか、またはインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の両方を指す。
【0025】
本明細書で用いられる「アスコルビン酸」は、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸セスキマグネシウム塩水和物などのその（Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（（Ｓ）－１，２－ジヒドロキシエチル）フラン－２（５Ｈ）－オン誘導体を包含する。
【0026】
本明細書で用いられる用語「同定すること」は、細胞を特定の細胞型、例えば軟骨細胞または線維芽細胞様細胞として認識する行動を指す。同定することの代わりの用語「検出すること」は、本明細書では同じ意味で用いられる。
【0027】
本明細書で用いられる用語「単離すること」、「選別すること」、「選択すること」および「枯渇させること」は、細胞を特定の細胞型として同定する行動、およびその細胞を同じ細胞型または分化状態に属さない細胞と分別する行動、を指す。
【0028】
本明細書で用いられる用語「組成物」は、軟骨細胞の調製物など、細胞の調製物を指す場合がある。本明細書で用いられる用語「組成物」はまた、軟骨細胞の培養物などの細胞培養物を指す場合がある。軟骨細胞の組成物はまた、軟骨細胞製品であってもよい。軟骨細胞製品の例は、当業者に公知であり、懸濁液中の単離された軟骨細胞、単層で、そしてスフェロイド、ペレット、細胞シートなどの三次元（３Ｄ）培養で培養された軟骨細胞、ならびに足場で培養された軟骨細胞であってもよい。例えば軟骨細胞の足場は、３Ｄヒドロゲル、コラーゲン基質、ヒアルロナン、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）－フィブリン、およびポリ乳酸（ＰＬＡ）を用いて作製されてもよい。
【0029】
本明細書で用いられる用語「効能」または「細胞の効能」は、関連する生物学的機能の定量的尺度と定義されてもよい。効能アッセイは、バッチリリースのための製造工程および最終細胞製品が品質、一貫性および安定性のために綿密に検査されるメカニズムを提供する。
【0030】
インテグリンサブユニットアルファ１０およびアルファ１１の発現の分析
本発明の方法における不可欠なステップは、インテグリンアルファ１０の発現およびインテグリンアルファ１１の発現の検出である。
本発明の方法における不可欠なステップは、インテグリンアルファ１０の発現およびインテグリンアルファ１１の発現の検出である。
【0031】
一実施形態において、該発現の分析は、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降法、ドットブロット、ｑＰＣＲ、免疫アッセイ、免疫蛍光法、免疫組織化学的検査、遺伝子発現分析および任意の他の適切な方法からなる群から選択される方法により実行される。好ましくはインテグリンアルファ１０および／またはアルファ１１の発現の分析は、特異的抗体を用いたフローサイトメトリーにより実行される。マルチカラー分析が、特に簡便であるフローサイトメトリーと共に用いられてもよい。当業者は、個々の例について発現の度合いを計測するための選択の方法を決定するのに充分適任である。
【0032】
インテグリンアルファ１０および／またはアルファ１１の発現を、同じ種の方法を使用して分析することができる。一実施形態において、該インテグリンアルファ１０／１１発現は、対応するタンパク質発現を測定することにより分析される。
【0033】
別の実施形態において、インテグリンアルファ１０／１１の発現は、インテグリンアルファ１０／１１ ｍＲＮＡ発現を測定することにより分析される。特異的タンパク質のｍＲＮＡ発現の検出は、当業者に周知であり、一般には、該当するｍＲＮＡに特異的なＤＮＡまたはＲＮＡプローブで、該プローブが他のｍＲＮＡ分子にハイブリダイズしないハイブリダイゼーション条件下で、ｍＲＮＡをプロービングすることにより実施される。同じく、当業者に自明の異なるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてもよい。
【0034】
一実施形態において、該分析は、インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現の定量的計測を含む。
【0035】
細胞マーカーの発現を検出するための複数の方法が、当業者に公知である。したがって本開示の一実施形態において、細胞によるインテグリンアルファ１０／１１の発現の検出は、免疫アッセイ、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、免疫沈降法、免疫組織化学的検査およびウェスタンブロットからなる群から選択される方法により計測される。さらなる実施形態において、インテグリンアルファ１０／１１の発現は、免疫化学的プロトコル（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ）に記載された方法などの任意の免疫アッセイにより検出される。該検出は、様々な方法、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロット、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）またはフローサイトメトリー法、例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などの当業者に公知の任意の免疫法により、実施されてもよい。
【0036】
幾つかの実施形態において、インテグリンアルファ１０／１１タンパク質の発現は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、またはその断片であり得る、抗インテグリンアルファ１０／１１抗体により検出される。別の実施形態において、該抗体は、非ヒト抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。
【0037】
前述の抗体は、フルオロフォア、酵素または放射性トレーサーもしくは放射性同位体からなる群から選択される検出可能な部分などの検出可能な部分に共有結合されていてもよい。好ましい実施形態において、該抗体は、１種または複数のフルオロフォア（複数可）で標識される。前述のフルオロフォアは、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、およびＢｒｉｌｌｉａｎｔｄｙｅからなる群から選択されてもよい。多くの他のフルオロフォアが用いられてもよく、当業者は、特異的検出方法に従い、用いられる抗体の特徴にも従って、最も適したものを選択するであろう。幾つかの実施形態において、重複のない発光スペクトルを有するフルオロフォアが、抗インテグリンアルファ１０抗体および抗インテグリンアルファ１１抗体に結合される。
【0038】
一実施形態において、前述の抗体は、固相担体、例えば磁気ビーズに付着されている。
【0039】
一実施形態において、前述の抗体は、ビオチンに付着されている。
【0040】
さらに前述の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる群から選択されるアイソタイプを有していてもよい。
【0041】
一実施形態において、該抗体は、
ａ）２００３年２月４日にアクセション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５８３の下、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨに寄託されたハイブリドーマ細胞株により生成されたモノクローナル抗体；または
ｂ）２００３年２月４日にアクセション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５８３の下、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨに寄託されたハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体により結合されたエピトープと同じエピトープに結合するために競合する抗体；または
ｃ）インテグリンアルファ１０鎖の細胞外Ｉ－ドメインに特異的に結合することが可能な、ａ）もしくはｂ）の断片
である。
ａ）２００３年２月４日にアクセション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５８３の下、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨに寄託されたハイブリドーマ細胞株により生成されたモノクローナル抗体；または
ｂ）２００３年２月４日にアクセション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５８３の下、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨに寄託されたハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体により結合されたエピトープと同じエピトープに結合するために競合する抗体；または
ｃ）インテグリンアルファ１０鎖の細胞外Ｉ－ドメインに特異的に結合することが可能な、ａ）もしくはｂ）の断片
である。
【0042】
その上、同定は、インテグリンアルファ１０／１１分子に特異的に結合するタンパク質またはペプチドなどの任意の特異的分子により実施されてもよい。そのようなタンパク質またはペプチドの例は、インテグリンアルファ１０／１１分子に結合した天然リガンドである。そのような天然リガンドは、天然供給源から組換え生成、化学合成、または精製されてもよい。
【0043】
軟骨細胞組成物
本発明者らは、少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を特徴とする軟骨細胞組成物が、高品質の軟骨細胞組成物であることを見出した。
本発明者らは、少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を特徴とする軟骨細胞組成物が、高品質の軟骨細胞組成物であることを見出した。
【0044】
こうして本開示の一態様は、少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する、軟骨細胞を含む組成物に関する。
【0045】
一実施形態において、該インテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比は、少なくとも４対１、例えば少なくとも５対１など、少なくとも１０対１など、少なくとも１５対１など、少なくとも２０対１など、少なくとも２５対１など、少なくとも３０対１など、少なくとも３５対１など、少なくとも４０対１など、少なくとも４５対１など、少なくとも５０対１など、少なくとも６０対１など、少なくとも７０対１など、少なくとも８０対１など、少なくとも９０対１など、少なくとも１００対１など、少なくとも１５０対１など、少なくとも２００対１などである。別の実施形態において、前述のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比は、２００対１未満、例えば１５０対１未満など、１００対１未満など、５０対１未満など、２５対１未満などである。
【0046】
一実施形態において、該インテグリンアルファ１１の発現は、インテグリンアルファ１０発現の最大２５％、例えばインテグリンアルファ１０発現の最大２０％など、インテグリンアルファ１０発現の最大１５％など、インテグリンアルファ１０発現の最大１０％など、インテグリンアルファ１０発現の最大５％など、インテグリンアルファ１０発現の最大４％など、インテグリンアルファ１０発現の最大３％など、インテグリンアルファ１０発現の最大２％など、インテグリンアルファ１０発現の最大１％など、インテグリンアルファ１０発現の最大０．５％などである。
【0047】
さらに別の実施形態において、インテグリンアルファ１１が、実質的に発現されない。
【0048】
一実施形態において、該組成物は、分化された軟骨細胞を含んでいてもよく、前述の分化された軟骨細胞は、インテグリンアルファ１０を発現し、インテグリンアルファ１１を実質的に発現しなくてもよい。
【0049】
本明細書で用いられる「実質的に存在しないインテグリンアルファ１１の発現」は、インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しない細胞、即ちアルファ１１単一の細胞のパーセンテージが、２０％未満であることを意味する。幾つかの実施形態において、インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しない細胞のパーセンテージは、１５％未満、例えば１０％未満など、５％未満など、４％未満など、３％未満など、２％未満など、１％未満など、０．５％未満などである。
【0050】
一実施形態において、該組成物は、部分的に脱分化された軟骨細胞を含んでいてもよく、前述の部分的に脱分化された軟骨細胞は、インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の両方を発現してもよい。部分的に脱分化された軟骨細胞は、より多くの線維芽細胞様細胞に復帰した軟骨細胞である。それらは、育成条件に応じて軟骨細胞に再分化され得てもよい。
【0051】
一実施形態において、軟骨細胞を含む該組成物は、軟骨組織調製物、軟骨細胞を含む組織調製物、単層軟骨細胞の細胞培養物、および三次元（３Ｄ）軟骨細胞の細胞培養物、例えばスフェロイド、ペレットまたは細胞シートからなる群から選択される。
【0052】
一実施形態において、軟骨細胞を含む該組成物は、軟骨組織、組織を含む軟骨細胞、単層軟骨細胞の細胞培養物および三次元軟骨細胞の細胞培養物、例えばスフェロイド、ペレット、細胞シートまたは足場に培養された軟骨細胞に由来する。
【0053】
一実施形態において、軟骨細胞を含む該組成物は、哺乳動物細胞を含んでいてもよい。
【0054】
一実施形態において、軟骨細胞を含む該組成物は、ヒト細胞を含んでいてもよい。
【0055】
一実施形態において、軟骨細胞を含む該組成物は、ウマの細胞を含んでいてもよい。
【0056】
一実施形態において、軟骨細胞を含む該組成物は、イヌの細胞を含んでいてもよい。
【0057】
一実施形態において、インテグリンアルファ１０および／またはインテグリンアルファ１１は、哺乳動物軟骨細胞または線維芽細胞様細胞の細胞表面で発現される。
【0058】
一実施形態において、該インテグリンアルファ１０および／またはインテグリンアルファ１１は、インテグリンベータ１と組み合わせてヘテロダイマーとして発現される。
【0059】
一実施形態において、軟骨細胞を含む該組成物は、混入細胞を実質的に含まなくてもよく、該混入細胞は、インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリン１０を発現しなくてもよく、即ちそれらは、アルファ１１単一の細胞であってもよい。インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しない細胞は、混入細胞、線維芽細胞様細胞または高度に脱分化された細胞であってもよい。インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しない細胞は、非機能性の軟骨細胞であってもよく、つまりそれらは、軟骨細胞組成物の微量成分であってもよい。
【0060】
インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しない細胞の数が少ない程、組成物中の軟骨細胞数が多い、つまり軟骨細胞組成物の純度が高くなる。
【0061】
インテグリンアルファ１０の発現を誘導し、こうして軟骨細胞を再分化させるように、再分化された軟骨細胞の培養条件を最適化することが可能であってもよい。つまり軟骨細胞を含む組成物は、インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しない細胞のパーセンテージが２０％未満の場合に、混入細胞を実質的に含まないと定義されてもよい。幾つかの実施形態において、インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しない細胞のパーセンテージは、１５％未満、例えば１０％未満など、５％未満など、４％未満など、３％未満など、２％未満など、１％未満など、０．５％未満などであってもよい。
【0062】
一実施形態において、軟骨細胞を含む該組成物は、全組成物または細胞集団のうち、少なくとも７０％の軟骨細胞、例えば少なくとも７５％など、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、１００％などの軟骨細胞を含んでいてもよい。
【0063】
一実施形態において、軟骨細胞を含む該組成物は、全組成物または細胞集団のうち、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、１００％などの軟骨細胞を含んでいてもよい。
【0064】
一実施形態において、軟骨細胞を含む該組成物は、ＣＥＰ－６８／ＣＲＴＡＣ１、ＧＰ－３９軟骨糖タンパク質、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、コラーゲンＩＩＡ、コラーゲンＩＩＢ、アグレカン、アリザリンレッド（ｎｅｇ）、アルシアンブルー、ＣＲＴＡＣ１、ＣＥＰ－６８、ＣＤ１４６、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ６３およびＳｃａ－１からなる群から選択される二次マーカーをさらに発現してもよい。
【0065】
本明細書に開示された軟骨細胞組成物は、細胞懸濁液、細胞培養物、細胞単層、または三次元（３Ｄ）足場、例えばスフェロイド、ペレット、細胞シートおよび足場で培養された軟骨細胞として配合されていてもよい。３Ｄ足場の例は、当該技術分野で公知であり、例えば３Ｄヒドロゲル、コラーゲン基質、ヒアルロナン、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）－フィブリンおよびポリ乳酸（ＰＬＡ）、の使用に基づいていてもよい。
【0066】
本明細書に開示された軟骨細胞組成物は、その後、例えば軟骨再生および軟骨修復の領域など、複数の適用例に用いられてもよい。本明細書で開示された軟骨細胞組成物は、自家使用および同種使用の両方に適し得る。
【0067】
純度品質、軟骨細胞同一性の度合い、機能的効能、分化状態および／または軟骨細胞表現型を計測するための方法
一態様において、本開示は、軟骨細胞を含む組成物の品質を計測するための方法であって、該品質計測が、以下の基準：
・軟骨細胞の同一性、
・軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞の純度、および
・軟骨細胞の効能
のうちの１つまたは複数を含み、
該方法が、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標であり、それにより高品質の軟骨細胞組成物の指標となる、
方法に関する。
一態様において、本開示は、軟骨細胞を含む組成物の品質を計測するための方法であって、該品質計測が、以下の基準：
・軟骨細胞の同一性、
・軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞の純度、および
・軟骨細胞の効能
のうちの１つまたは複数を含み、
該方法が、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標であり、それにより高品質の軟骨細胞組成物の指標となる、
方法に関する。
【0068】
一実施形態において、前述の方法は、最大２０％、例えば最大１５％など、最大１０％など、最大５％など、最大４％など、最大３％など、最大２％など、最大１％など、最大０．５％などというアルファ１１を発現してインテグリンアルファ１０を全くまたは実質的に発現しない軟骨細胞組成物中の細胞、即ちアルファ１１単一の細胞が、該軟骨細胞組成物の純度の指標である、インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較することを含んでいてもよい。
【0069】
事実、インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しない細胞（アルファ１１単一の細胞）の数が少ない程、組成物中の軟骨細胞数が多い、つまり軟骨細胞組成物の純度が高くなる。
【0070】
一実施形態において、前述の方法は、インテグリンアルファ１１を伴うインテグリンアルファ１０の発現が部分的に脱分化された軟骨細胞組成物の指標である、インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較することを含んでいてもよい。例えばインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の両方を発現する軟骨細胞は、部分的に脱分化された軟骨細胞であってもよい。
【0071】
一実施形態において、前述の方法は、インテグリンアルファ１０の発現および実質的に存在しないインテグリンアルファ１１の発現が、分化された軟骨細胞組成物の指標であり得る、インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較することを含んでいてもよい。例えばインテグリンアルファ１０を発現してインテグリンアルファ１１を実質的に発現しない軟骨細胞は、分化された軟骨細胞であってもよい。
【0072】
一実施形態において、前述の方法は、インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現の定量的計測を含んでいてもよい。
【0073】
一実施形態において、前述の方法は、インテグリンアルファ１０の発現および実質的に存在しないインテグリンアルファ１１の発現が、分化された軟骨細胞組成物の指標であり得る、インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較することを含んでいてもよい。「実質的に存在しないインテグリンアルファ１１の発現」は、組成物に含まれる細胞の２０％未満がインテグリンアルファ１１を発現してインテグリンアルファ１０を発現しないことを指してもよい。幾つかの実施形態において、インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しない細胞のパーセンテージは、１５％未満、例えば１０％未満など、５％未満など、４％未満など、３％未満など、２％未満など、１％未満など、０．５％未満などである。
【0074】
本発明者らは、軟骨細胞中のインテグリンアルファ１１の発現および実質的に存在しないインテグリンアルファ１０の発現が線維芽細胞様細胞の指標になり得ることも見出した。
【0075】
一実施形態において、前述の方法は、ＣＥＰ－６８／ＣＲＴＡＣ１、ＧＰ－３９軟骨糖タンパク質、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、コラーゲンＩＩＡ、コラーゲンＩＩＢ、アグレカン、アリザリンレッド（ｎｅｇ）、アルシアンブルー、ＣＲＴＡＣ１、ＣＥＰ－６８、ＣＤ１４６、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ６３およびＳｃａ－１からなる群から選択される二次軟骨細胞または線維芽細胞マーカーの発現を検出することをさらに含む。当業者は、個々の例について前述のマーカーの発現を計測するための選択の方法を決定するのに充分適任である。
【0076】
一実施形態において、該方法は、インビトロで実施される。
【0077】
一実施形態において、インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現の分析は、インテグリンアルファ１０の発現を誘導するために最適化された培地中で該細胞を培養した後に実施される。インテグリンアルファ１０発現の誘導は、本明細書内の本開示に記載される。
【0078】
一実施形態において、インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現の分析は、同時に実施される。別の実施形態において、インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現の分析は、別に実施される。例えば実施例４ならびに図７および９で報告されたデータを参照されたい。
【0079】
高品質の軟骨細胞の集団を単離するための方法
一態様において、本発明は、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現を分析するステップと；
ｃ）少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞を選択し、こうして高品質の軟骨細胞の集団を得るステップと
を含む、高品質の軟骨細胞の集団を単離するための方法に関係する。
一態様において、本発明は、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現を分析するステップと；
ｃ）少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞を選択し、こうして高品質の軟骨細胞の集団を得るステップと
を含む、高品質の軟骨細胞の集団を単離するための方法に関係する。
【0080】
一実施形態において、高品質の軟骨細胞の集団は、少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を特徴とする軟骨細胞の集団であってもよい。
【0081】
一実施形態において、前述の方法は、インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現の定量的計測を含んでいてもよい。
【0082】
一実施形態において、該インテグリンアルファ１０および／またはインテグリンアルファ１１は、哺乳動物軟骨細胞および／または線維芽細胞様細胞の細胞表面で発現されてもよい。
【0083】
一実施形態において、高品質の軟骨細胞の前述の得られた単離集団は、軟骨細胞の濃縮および／または精製された集団であってもよい。好ましくは軟骨細胞の前述の得られた単離集団は、前述の集団の軟骨細胞が高いインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有するように濃縮および／または精製されてもよい。一実施形態において、軟骨細胞の得られた単離集団におけるインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比は、少なくとも４対１、例えば少なくとも５対１など、少なくとも１０対１など、少なくとも１５対１など、少なくとも２０対１など、少なくとも２５対１など、少なくとも３０対１など、少なくとも３５対１など、少なくとも４０対１など、少なくとも４５対１など、少なくとも５０対１など、少なくとも６０対１など、少なくとも７０対１など、少なくとも８０対１など、少なくとも９０対１など、少なくとも１００対１など、少なくとも１５０対１など、少なくとも２００対１などである。
【0084】
一実施形態において、該インテグリンアルファ１１の発現は、インテグリンアルファ１０発現の最大２５％、例えばインテグリンアルファ１０発現の最大２０％など、インテグリンアルファ１０発現の最大１５％など、インテグリンアルファ１０発現の最大１０％など、インテグリンアルファ１０発現の最大５％など、インテグリンアルファ１０発現の最大４％など、インテグリンアルファ１０発現の最大３％など、インテグリンアルファ１０発現の最大２％など、インテグリンアルファ１０発現の最大１％など、インテグリンアルファ１０発現の最大０．５％などである。
【0085】
さらに別の実施形態において、インテグリンアルファ１１が、軟骨細胞の得られた単離集団中で実質的に発現されない。
【0086】
一実施形態において、該得られた組成物は、全細胞集団のうち、少なくとも７０％の軟骨細胞、例えば少なくとも７５％など、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、１００％などの軟骨細胞を含んでいてもよい。
【0087】
さらなる一実施形態において、該得られた組成物は、全細胞集団のうち、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、１００％などの軟骨細胞を含んでいてもよい。
【0088】
別の実施形態において、該得られた集団は、混入細胞が実質的に存在しなくてもよい。本明細書に文脈において、混入細胞は、軟骨細胞以外の細胞、例えば線維芽細胞または線維芽細胞様細胞であってもよい。一実施形態において、混入細胞は、インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しない細胞であってもよい。
【0089】
該得られた組成物は、最適条件下で育成された場合に軟骨細胞に再分化され得る、高度に脱分化された軟骨細胞および線維芽細胞様細胞を含んでいてもよい。
【0090】
「実質的に存在しないインテグリンアルファ１１」および「実質的に含まれない混入細胞を」は、本明細書内の本開示で定義されている。
【0091】
一実施形態において、高品質の軟骨細胞の前述の集団は、軟骨細胞のインテグリンアルファ１０濃縮集団であってもよい。前述のインテグリンアルファ１０濃縮集団は、インテグリンアルファ１１を発現する細胞の枯渇を含む方法により得られてもよい。一実施形態において、高品質の軟骨細胞の該集団は、インテグリンアルファ１１を実質的に発現しなくてもよい。
【0092】
前述のインテグリンアルファ１０濃縮集団は、インテグリンアルファ１０を発現する細胞を選択することを含む方法により得られてもよい。インテグリンアルファ１０を発現する細胞は、例えば抗インテグリンアルファ１０抗体を用いることにより、または当業者に公知の他の方法により、本明細書に記載された通り選択されてもよい。
【0093】
前述のインテグリンアルファ１０濃縮集団は、インテグリンアルファ１０発現を誘導する条件下で軟骨細胞の組成物を育成することを含む方法により得られてもよい。そのようなインテグリンアルファ１０を誘導する条件の例は、本開示に見出される。インテグリンアルファ１０を誘導し得る薬剤、ならびにアスコルビン酸および血小板溶解物。
【0094】
一実施形態において、少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞の前述の選択は、インテグリンアルファ１０を発現する軟骨細胞の単離により実施されてもよい。別の実施形態において、前述の選択は、アルファ１１を発現する軟骨細胞の枯渇により実現される。
【0095】
高品質の軟骨細胞の集団の単離は、インテグリンアルファ１０の発現が実質的に存在しない軟骨細胞からの、そして／またはインテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しないまたは実質的に発現しない細胞からの、インテグリンアルファ１０を発現する軟骨細胞の分離のための手順に基づいていてもよい。前述の分離は、例えば抗体コーティング磁気ビーズと、固体基質、例えばプレートに付着された抗体を含む「パンニング」と、を用いた磁気分離、または他の従来の技術を包含してもよい。正確な分離を提供する技術は、当業者に公知の様々な度合いの精巧化、例えば複数のカラーチャネル、光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどを有し得る蛍光活性化セルソーターを含む。
【0096】
抗体またはその断片が、マーカーを検出するのに用いられる場合、それは、固相担体、例えば磁気ビーズに付着されていて、高度に特異的な分離を可能にしてもよい。用いられる特定の分離手順、例えば遠心分離、機械的分離、例えばカラム、膜または磁気分離は、回収される画分の生存性を最大にしなければならない。当業者に知られる異なる有効性の様々な技術が、用いられてもよい。用いられる特定の技術が、分離の効率、方法の細胞傷害性、性能の容易さおよび速度、ならびに精巧化された器具および／または技術的鍛錬の必要性に依存するであろう。
【0097】
一実施形態において、高品質の軟骨細胞の該集団は、軟骨組織調製物、軟骨細胞を含む組織調製物、単層軟骨細胞の細胞培養物、および三次元軟骨細胞の細胞培養物、例えばスフェロイド、ペレット、細胞シートおよび様々な足場で培養された軟骨細胞からなる群から選択される候補組成物から単離される。
【0098】
一実施形態において、高品質の軟骨細胞の該集団は、軟骨組織、軟骨細胞を含む組織、単層軟骨細胞の細胞培養物、および三次元軟骨細胞の細胞培養物、例えばスフェロイド、ペレット、細胞シートおよび様々な足場で培養された軟骨細胞に由来する候補組成物から単離される。
【0099】
一実施形態において、本明細書に記載された方法は、ＣＥＰ－６８／ＣＲＴＡＣ１、ＧＰ－３９軟骨糖タンパク質、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、コラーゲンＩＩＡ、コラーゲンＩＩＢ、アグレカン、アリザリンレッド（ｎｅｇ）、アルシアンブルー、ＣＲＴＡＣ１、ＣＥＰ－６８、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ６３、ＣＤ１４６、ＣＤ９０、およびＳｃａ－１からなる群から選択される二次マーカーの発現を検出することをさらに含んでいてもよい。
【0100】
軟骨細胞におけるインテグリンアルファ１０発現の誘導
本発明者らは、増殖への影響、およびインテグリンアルファ１０発現の誘導への効能を実証した。
本発明者らは、増殖への影響、およびインテグリンアルファ１０発現の誘導への効能を実証した。
【0101】
したがって一態様において、本発明は、インテグリンアルファ１０の発現を誘導することを含む、軟骨細胞を含む組成物の品質および軟骨細胞の効能を最適化するための方法に関係する。一実施形態において、前述の方法は、インテグリンアルファ１１の発現を抑制することをさらに含む。
【0102】
別の態様において、本発明は、インテグリンアルファ１０の発現を誘導することを含む、軟骨細胞の増殖速度を上昇させる方法に関係する。一実施形態において、前述の方法は、インテグリンアルファ１１の発現を抑制することをさらに含む。
【0103】
一実施形態において、インテグリンアルファ１０の発現の誘導は、インテグリンアルファ１０の発現を誘導し得る、そして／またはインテグリンアルファ１１を抑制し得る因子を含む培地中でインテグリンアルファ１０発現細胞を培養することにより実行される。
【0104】
一実施形態において、インテグリンアルファ１０の発現の誘導は、アスコルビン酸および／または血小板溶解物を含む培地中でインテグリンアルファ１０発現細胞を培養することにより実行されてもよい。
【0105】
一実施形態において、こうして得られたインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比は、少なくとも４対１、例えば少なくとも５対１など、少なくとも１０対１など、少なくとも１５対１など、少なくとも２０対１など、少なくとも２５対１など、少なくとも３０対１など、少なくとも３５対１など、少なくとも４０対１など、少なくとも４５対１など、少なくとも５０対１など、少なくとも６０対１など、少なくとも７０対１など、少なくとも８０対１など、少なくとも９０対１など、少なくとも１００対１など、少なくとも１５０対１など、少なくとも２００対１などである。
【0106】
一実施形態において、得られたインテグリンアルファ１１の発現は、得られたインテグリンアルファ１０発現の最大２５％、例えば得られたインテグリンアルファ１０発現の最大２０％など、得られたインテグリンアルファ１０発現の最大１５％など、得られたインテグリンアルファ１０発現の最大１０％など、得られたインテグリンアルファ１０発現の最大５％など、得られたインテグリンアルファ１０発現の最大４％など、得られたインテグリンアルファ１０発現の最大３％など、得られたインテグリンアルファ１０発現の最大２％など、得られたインテグリンアルファ１０発現の最大１％など、得られたインテグリンアルファ１０発現の最大０．５％などである。
【0107】
インテグリンアルファ１０発現細胞が、暴露される培養条件に応じて異なるレベルでインテグリンアルファ１０を発現し得ることは、公知である。こうして、軟骨細胞中のインテグリンアルファ１０発現を誘導する一方法は、例えば培地を交換することによる、培養条件の変更の方法であってもよい。
【0108】
細胞調製物および細胞培養物
一態様において、本発明は、少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞のインビトロ細胞調製物または細胞培養物に関係する。一実施形態において、前述のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比は、少なくとも４、例えば少なくとも１０など、少なくとも１５など、少なくとも２０など、少なくとも２５など、少なくとも３０など、少なくとも３５など、少なくとも４０など、少なくとも４５など、少なくとも５０など、少なくとも６０など、少なくとも７０など、少なくとも８０など、少なくとも９０など、少なくとも１００などであってもよい。別の実施形態において、前述のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比は、２００未満、例えば１５０未満など、１００未満などであってもよい。
一態様において、本発明は、少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞のインビトロ細胞調製物または細胞培養物に関係する。一実施形態において、前述のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比は、少なくとも４、例えば少なくとも１０など、少なくとも１５など、少なくとも２０など、少なくとも２５など、少なくとも３０など、少なくとも３５など、少なくとも４０など、少なくとも４５など、少なくとも５０など、少なくとも６０など、少なくとも７０など、少なくとも８０など、少なくとも９０など、少なくとも１００などであってもよい。別の実施形態において、前述のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比は、２００未満、例えば１５０未満など、１００未満などであってもよい。
【0109】
一態様において、本発明は、該インテグリンアルファ１１の発現が、インテグリンアルファ１０発現の最大２５％、例えばインテグリンアルファ１０発現の最大２０％など、インテグリンアルファ１０発現の最大１５％など、インテグリンアルファ１０発現の最大１０％など、インテグリンアルファ１０発現の最大５％など、インテグリンアルファ１０発現の最大４％など、インテグリンアルファ１０発現の最大３％など、インテグリンアルファ１０発現の最大２％など、インテグリンアルファ１０発現の最大１％など、インテグリンアルファ１０発現の最大０．５％などである、軟骨細胞のインビトロ細胞調製物または細胞培養物に関係する。
【0110】
一実施形態において、本発明は、抗インテグリンアルファ１０抗体および抗インテグリンアルファ１１抗体での細胞調製物／培養物から単離された軟骨細胞のインテグリンアルファ１０濃縮集団に関係する。
【0111】
一実施形態において、軟骨細胞の前述の濃縮集団は、高発現のインテグリンアルファ１０を有する軟骨細胞を選択すること、またはインテグリンアルファ１０発現を誘導すること、により得られてもよい。別の実施形態において、軟骨細胞の前述の濃縮集団は、高度に脱分化された軟骨細胞もしくはインテグリンアルファ１１の発現を有する線維芽細胞の枯渇、またはインテグリンアルファ１１の発現の抑制により得られてもよい。
【0112】
一実施形態において、該濃縮集団は、少なくとも４対１、例えば少なくとも５対１など、少なくとも１０対１など、少なくとも１５対１など、少なくとも２０対１など、少なくとも２５対１など、少なくとも３０対１など、少なくとも３５対１など、少なくとも４０対１など、少なくとも４５対１など、少なくとも５０対１など、少なくとも６０対１など、少なくとも７０対１など、少なくとも８０対１など、少なくとも９０対１など、少なくとも１００対１など、少なくとも１５０対１など、少なくとも２００対１などのインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有していてもよい。
【0113】
一実施形態において、該濃縮集団は、インテグリンアルファ１０発現の最大２５％、例えばインテグリンアルファ１０発現の最大２０％など、インテグリンアルファ１０発現の最大１５％など、インテグリンアルファ１０発現の最大１０％など、インテグリンアルファ１０発現の最大５％など、インテグリンアルファ１０発現の最大４％など、インテグリンアルファ１０発現の最大３％など、インテグリンアルファ１０発現の最大２％など、インテグリンアルファ１０発現の最大１％など、インテグリンアルファ１０発現の最大０．５％などのインテグリンアルファ１１の発現を有していてもよい。
【0114】
記載された方法の使用
一態様において、本発明は、
ａ）軟骨細胞組成物を品質保証するための；
ｂ）軟骨細胞組成物の一貫性および／もしくは再現性のモニタリングのための；
ｃ）軟骨細胞組成物および培養物の効能、つまり機能を予測するための；
ｄ）軟骨細胞組成物を工程内管理するための；
ｅ）軟骨細胞組成物の増大の工程内管理のための；
ｆ）軟骨細胞組成物の放出テストを実行するための；
ｇ）軟骨細胞組成物の効能アッセイを実行するための；そして／または
ｈ）軟骨細胞組成物の臨床転帰の予測のための、
本明細書に記載された方法の任意の１つの使用に関係する。
一態様において、本発明は、
ａ）軟骨細胞組成物を品質保証するための；
ｂ）軟骨細胞組成物の一貫性および／もしくは再現性のモニタリングのための；
ｃ）軟骨細胞組成物および培養物の効能、つまり機能を予測するための；
ｄ）軟骨細胞組成物を工程内管理するための；
ｅ）軟骨細胞組成物の増大の工程内管理のための；
ｆ）軟骨細胞組成物の放出テストを実行するための；
ｇ）軟骨細胞組成物の効能アッセイを実行するための；そして／または
ｈ）軟骨細胞組成物の臨床転帰の予測のための、
本明細書に記載された方法の任意の１つの使用に関係する。
【0115】
こうして一実施形態において、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標である、
軟骨細胞を含む組成物の品質を計測するための方法が、軟骨細胞組成物を品質保証するために用いられてもよい。
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標である、
軟骨細胞を含む組成物の品質を計測するための方法が、軟骨細胞組成物を品質保証するために用いられてもよい。
【0116】
こうして一実施形態において、本開示は、軟骨細胞組成物を品質保証するため、そして／または品質管理するための、軟骨細胞を含む組成物の品質を計測するための方法の使用であって、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標である、
使用に関する。
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標である、
使用に関する。
【0117】
一実施形態において、本開示は、軟骨細胞組成物および／または軟骨細胞組成物の増大の工程内管理のための、軟骨細胞を含む組成物の品質を計測するための方法の使用であって、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標である、
使用に関する。
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標である、
使用に関する。
【0118】
一実施形態において、本開示は、軟骨細胞組成物の放出テストを実施するための、軟骨細胞を含む組成物の品質を計測するための方法の使用であって、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標である、
使用に関する。
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標である、
使用に関する。
【0119】
一実施形態において、本開示は、軟骨細胞組成物の効能アッセイを実施するための、軟骨細胞を含む組成物の品質を計測するための方法の使用であって、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標である、
使用に関する。
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前述の組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルに比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１というインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の分化状態、
・軟骨細胞組成物の純度、および／または
・軟骨細胞組成物の軟骨細胞の効能
の指標である、
使用に関する。
【0120】
実施例
実施例１：アスコルビン酸を添加した、または添加していない、ヒト血清（ＨＳ）または血小板溶解物（ＰＬ）中で培養された軟骨細胞上でのインテグリンアルファ１０ベータ１およびインテグリンアルファ１１ベータ１の発現
４種の異なる調製物８５３、８５４、８７５および８７６からの軟骨細胞を、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）を含み、または含まずに、ＤＭＥＭ中の１０％ＨＳまたはＤＭＥＭ中の５％ＰＬの存在下で培養した。インテグリンアルファ１０ベータ１およびアルファ１１ベータ１発現を、以下のモノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーによる２、３、４および６継代の後に分析した：ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１％ ＦＢＳ、０．１％ ＮａＮ３）に希釈された、フィトエリトリン（ＰＥ）に直接コンジュゲートされたアルファ１０抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ａ６４７（Ｘｉｎｔｅｌａ ＡＢ）に直接コンジュゲートされたアルファ１１抗体が添加された（１μｇ／ｍｌ）。
実施例１：アスコルビン酸を添加した、または添加していない、ヒト血清（ＨＳ）または血小板溶解物（ＰＬ）中で培養された軟骨細胞上でのインテグリンアルファ１０ベータ１およびインテグリンアルファ１１ベータ１の発現
４種の異なる調製物８５３、８５４、８７５および８７６からの軟骨細胞を、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）を含み、または含まずに、ＤＭＥＭ中の１０％ＨＳまたはＤＭＥＭ中の５％ＰＬの存在下で培養した。インテグリンアルファ１０ベータ１およびアルファ１１ベータ１発現を、以下のモノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーによる２、３、４および６継代の後に分析した：ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１％ ＦＢＳ、０．１％ ＮａＮ３）に希釈された、フィトエリトリン（ＰＥ）に直接コンジュゲートされたアルファ１０抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ａ６４７（Ｘｉｎｔｅｌａ ＡＢ）に直接コンジュゲートされたアルファ１１抗体が添加された（１μｇ／ｍｌ）。
【0121】
結論：この分析で、インテグリンアルファ１０ベータ１の表面発現がＨＳのみの存在下で培養された軟骨細胞の継代培養物で減少することが実証された。軟骨細胞が、ＰＬの存在下で培養された場合、インテグリンアルファ１０の表面発現が増加し、６回の継代全てで依然として高度であった。図１Ａは、軟骨細胞調製物８５３および８５４の結果を示す。培地へのアスコルビン酸の添加は、特に後期継代では、ＨＳ培養物中のインテグリンアルファ１０ベータ１の発現を維持し、予測に反して増加もさせたが、ＰＬ中で培養された軟骨細胞ではインテグリンアルファ１０ベータ１の既に高い発現を改変しなかった（図１Ａ）。フローサイトメトリー分析は、予想に反して、培地へのアスコルビン酸の添加がインテグリンアルファ１１ベータ１の発現を減少させ、これによりインテグリンアルファ１０ベータ１／インテグリンアルファ１１ベータ１比を上昇させることを示した。この影響は、軟骨細胞調製物８５３、８５４、８７５および８７５からの結果を要約した図に示された（図１Ｂ）アスコルビン酸の存在下でのＨＳおよびＰＬ培養物の両方で認められた。
【0122】
実施例２：異なる培養条件の成長速度および評価
軟骨細胞の特異的成長速度と、異なる培地との関連性を検討した。この目的のために、調製物８５３からの軟骨細胞を、２継代までのＨＳのみを含有する培地で培養した。２継代の後、細胞をアスコルビン酸の非存在下または存在下、ＨＳまたはＰＬで培養した。細胞が８０％のコンフルエントに達したら、細胞を回収してカウントし、同じ密度で再度播種した。
軟骨細胞の特異的成長速度と、異なる培地との関連性を検討した。この目的のために、調製物８５３からの軟骨細胞を、２継代までのＨＳのみを含有する培地で培養した。２継代の後、細胞をアスコルビン酸の非存在下または存在下、ＨＳまたはＰＬで培養した。細胞が８０％のコンフルエントに達したら、細胞を回収してカウントし、同じ密度で再度播種した。
【0123】
結論：アスコルビン酸およびＰＬは、軟骨細胞の増殖速度を上昇させる。アスコルビン酸の存在下では、アスコルビン酸を欠く培地に比較して、細胞が各継代でより急速に増殖した（図２）。これは、ＨＳを含有する培地およびＰＬを含有する培地の両方で認められた。この影響は、より早期の継代よりも後期の継代（５～６）でより顕著であった。アスコルビン酸の非存在下では、軟骨細胞は、コンフルエントに達するのにより長時間を要した。ＰＬはまた、ＨＳに比較して増殖を増加させた。
【0124】
実施例３．軟骨細胞の品質および効能に及ぼす単層増大の間の異なる培養条件の影響
軟骨細胞の増大の間にインテグリンアルファ１０ベータ１およびアルファ１１ベータ１の発現を変化させることが知られる培養条件が、軟骨細胞の品質および効能（再分化能）に影響を及ぼすか否かを検討するために、以下の実験を実施した。
軟骨細胞の増大の間にインテグリンアルファ１０ベータ１およびアルファ１１ベータ１の発現を変化させることが知られる培養条件が、軟骨細胞の品質および効能（再分化能）に影響を及ぼすか否かを検討するために、以下の実験を実施した。
【0125】
調製物８５３、８５４、８７５および８７６からの軟骨細胞を、ＨＳ、ＨＳＡまたはＰＬＡ中の４種の継代物で培養し、その後、ペレット培養に移行させた。加えて、異なる軟骨細胞培養物の試料を、ペレット培養の開始直前にフローサイトメトリーおよびＱ－ＰＣＲによりインテグリンアルファ１０ベータ１発現について分析した。
【0126】
Ｑ－ＰＣＲ
軟骨細胞のｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ所在）を用いて単離し、ｃＤＮＡを高品質総ＲＮＡ試料から合成し、２つの連続ｑＰＣＲ分析でＧＡＰＤＨにより正規化および検証した。インテグリンアルファ１０のリアルタイムＰＣＲ検出を、遺伝子特異的プライマーおよびＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの遺伝子発現アッセイＨＳ００１７４６２３＿ｍ１、およびＨｓ０２７５８９９１＿ｇ１）を用いて実施し、製造業者の推奨通り運転した。検出システムは、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。インテグリンアルファ１０の発現を、対照ＧＡＰＤＨに対して正規化して、インテグリンアルファ１０の相対的定量値（ＲＱ）を計算した。
軟骨細胞のｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ所在）を用いて単離し、ｃＤＮＡを高品質総ＲＮＡ試料から合成し、２つの連続ｑＰＣＲ分析でＧＡＰＤＨにより正規化および検証した。インテグリンアルファ１０のリアルタイムＰＣＲ検出を、遺伝子特異的プライマーおよびＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの遺伝子発現アッセイＨＳ００１７４６２３＿ｍ１、およびＨｓ０２７５８９９１＿ｇ１）を用いて実施し、製造業者の推奨通り運転した。検出システムは、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。インテグリンアルファ１０の発現を、対照ＧＡＰＤＨに対して正規化して、インテグリンアルファ１０の相対的定量値（ＲＱ）を計算した。
【0127】
ペレット培養
軟骨細胞を、３ｍＭグルタミン、ＨＳ（１０％）またはＰＬ（５％）を含み、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸セスキマグネシウム塩水和物（Ａ）および抗生物質－抗真菌薬を含む、または含まない、培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍのアルファ改変型最小必須培地（アルファ－ＭＥＭ）およびハムＦ１２培地、１：１の割合）中の単層内で培養した。４継代後に、細胞を剥離して遠心分離し、ＴＩＤＡ培地（高グルコースのＤＭＥＭ Ｆ１２（４．５ｇ／Ｌ フェノールレッド不含）、抗生物質－抗真菌薬（１×）、ＴＧＦベータ１（１３ｎｇ／ｍｌ）、インスリン／トランスフェリン／セレン（ＩＴＳ－Ｘ；１×）、デキサメタゾン（１０ｎＭ）、Ａ（５０μｇ／ｍｌ）およびＨＳ（２％））に再懸濁させた。細胞２０００００個を含有する試料を１４ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに移して、細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを形成させた。次に、細胞ペレットを低酸素条件（４％Ｏ２、５％ＣＯ２および９５％湿度）下で１～４週間培養し、その後、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）により分析した。
軟骨細胞を、３ｍＭグルタミン、ＨＳ（１０％）またはＰＬ（５％）を含み、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸セスキマグネシウム塩水和物（Ａ）および抗生物質－抗真菌薬を含む、または含まない、培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍのアルファ改変型最小必須培地（アルファ－ＭＥＭ）およびハムＦ１２培地、１：１の割合）中の単層内で培養した。４継代後に、細胞を剥離して遠心分離し、ＴＩＤＡ培地（高グルコースのＤＭＥＭ Ｆ１２（４．５ｇ／Ｌ フェノールレッド不含）、抗生物質－抗真菌薬（１×）、ＴＧＦベータ１（１３ｎｇ／ｍｌ）、インスリン／トランスフェリン／セレン（ＩＴＳ－Ｘ；１×）、デキサメタゾン（１０ｎＭ）、Ａ（５０μｇ／ｍｌ）およびＨＳ（２％））に再懸濁させた。細胞２０００００個を含有する試料を１４ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに移して、細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを形成させた。次に、細胞ペレットを低酸素条件（４％Ｏ２、５％ＣＯ２および９５％湿度）下で１～４週間培養し、その後、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）により分析した。
【0128】
免疫組織化学的検査
軟骨細胞ペレットをＴｉｓｓｕｅＴｅｋで包埋して、凍結させた。切片をスライドガラス上に採取して、一次モノクローナル抗体（抗コラーゲンＩ、抗コラーゲンＩＩまたは抗アルファ１０インテグリン）で、その後、二次抗体抗マウス－ＨＲＰ（ポリマー、ＤＡＫＯ）で免疫標識した。
軟骨細胞ペレットをＴｉｓｓｕｅＴｅｋで包埋して、凍結させた。切片をスライドガラス上に採取して、一次モノクローナル抗体（抗コラーゲンＩ、抗コラーゲンＩＩまたは抗アルファ１０インテグリン）で、その後、二次抗体抗マウス－ＨＲＰ（ポリマー、ＤＡＫＯ）で免疫標識した。
【0129】
結論（Ｉ）：
単層培養後の結果で実施例２からの知見を確証し、ＰＬおよびアスコルビン酸が、単層培養の軟骨細胞上でＨＳのみに比較してインテグリンアルファ１０の発現を誘導し、インテグリンアルファ１０ベータ１発現を明確に増加させることが示された。フローサイトメトリーデータ（図３Ａ）から、ＰＬおよびＨＳをアスコルビン酸と共に用いた場合にアルファ１０ベータ１の発現を増加させることが示された（図３Ａ）。インテグリンアルファ１０遺伝子転写産物ＩＴＧＡ１０により表される遺伝子発現レベルで、同様の結果が認められた（図３Ｂ）。
単層培養後の結果で実施例２からの知見を確証し、ＰＬおよびアスコルビン酸が、単層培養の軟骨細胞上でＨＳのみに比較してインテグリンアルファ１０の発現を誘導し、インテグリンアルファ１０ベータ１発現を明確に増加させることが示された。フローサイトメトリーデータ（図３Ａ）から、ＰＬおよびＨＳをアスコルビン酸と共に用いた場合にアルファ１０ベータ１の発現を増加させることが示された（図３Ａ）。インテグリンアルファ１０遺伝子転写産物ＩＴＧＡ１０により表される遺伝子発現レベルで、同様の結果が認められた（図３Ｂ）。
【0130】
ペレット培養における軟骨細胞の品質および効能を評価するために、軟骨の特異的コラーゲンＩＩ型の発現の免疫組織化学的分析に基づくスコアリングシステムを確立した。コラーゲンＩＩ型発現の増加を表すスコアは、０～５の公称範囲を有する（図４Ａ）。
【0131】
様々な培養条件（ＨＳ、ＨＳＡおよびＰＬＡ）についてのコラーゲンＩＩ型スコアを、図４に要約している。これらの結果から、細胞をＨＳ中で培養した場合に、異なる軟骨細胞調製物の間でのコラーゲンＩＩ型発現（再分化／効能）の大きな変動が示された（図４Ｂ）。軟骨細胞調製物８５３は、全時間でコラーゲンＩＩ型の低い発現を示したが、８７６は、既に１週間後に若干のコラーゲンＩＩ型発現を、そして３週間後に高い発現を示した。
【0132】
ＨＳＡ（アスコルビン酸を含むＨＳ）中で培養された軟骨細胞は、コラーゲンＩＩ型発現に関連して不均一な挙動を実証した。調製物８７５および８７６からの軟骨細胞は、４週間後に高いコラーゲンＩＩ型発現を示したが、８５３および８５４は、４週間のアッセイの間に高スコアに達しなかった（図４Ｃ）。その一方で、該細胞をＰＬＡ中で培養した場合、全ての軟骨細胞調製物が、均一パターンのコラーゲンＩＩ型発現に従った。コラーゲンＩＩ型の発現は、急速に増加し、４種の軟骨細胞調製物全てで、既に３週間後に最高スコアに達した（図４Ｄ）。
【0133】
ペレット培養（２および３週目）でのコラーゲンＩＩ型発現による判定で、ＨＳ中の単層増大後の軟骨細胞上のインテグリンアルファ１０ベータ１発現と、それらの効能（再分化力）との可能な相関性を検討するために、本発明者らは、ＨＳ中で培養された９種（８０３、８１１、８１６、８４２、８５３、８５４、８７５、８７６および９１４）の個々の調製物からの軟骨細胞でピアソン相関解析を実施した。
【0134】
図５は、単層培養された軟骨細胞でのインテグリンアルファ１０ベータ１発現レベルと、ペレット培養におけるコラーゲンＩＩ型生成能の間で高度の相関性を示している（２週間後に０．７５のＲ２値）。このことから、インテグリンアルファ１０ベータ１が軟骨細胞の品質のマーカーになり、軟骨細胞の効能を予測し得ることが実証される。
【0135】
さらに、ペレット培養（２および３週目）におけるコラーゲンＩＩ型発現による判定で、ＨＳ中の単層増大後の軟骨細胞のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比（アルファ１０／アルファ１１比）と、それらの効能（再分化能）の可能な相関性を検討するために、本発明者らは、低い（８１１）および高い（８０３）再分化能を有する軟骨細胞でのアルファ１０／アルファ１１比を分析した。
【0136】
図８では、低いアルファ１０／アルファ１１比を有する軟骨細胞調製物（８１１）が低い再分化能を有し、高いアルファ１０／アルファ１１比を有する軟骨細胞調製物（８０３）が高い再分化能を有することが実証される。このことから、アルファ１０／アルファ１１比を使用して軟骨細胞の品質を計測し得ること、ならびに軟骨細胞組成物中の軟骨細胞の効能、特に軟骨細胞の同一性および軟骨細胞の分化状態を予測し得ることが実証される。
【0137】
結論（ＩＩ）：結果から、単層培養での軟骨細胞のインテグリンα１０／インテグリンα１１比が次のペレット培養でのＣｏｌ－ＩＩの発現と相関することが示される（図８）。このことから、インテグリンα１０／インテグリンα１１の比を用いて、培養軟骨細胞の再分化力および機能を予測し得ること、ならびに軟骨細胞組成物の軟骨細胞の分化状態および機能的効能を計測し得ることが実証される。
【0138】
実施例４．それぞれインテグリンアルファ１０ベータ１およびインテグリンアルファ１１ベータ１とコラーゲンＩＩおよびＩ型との共存を示すペレット培養
マーカーであるインテグリンアルファ１０ベータ１とインテグリンアルファ１１ベータ１がそれぞれ軟骨および線維性コラーゲンと共存することを実証するために、本発明者らは、ＩＨＣおよび免疫蛍光法によりタンパク質発現パターンを検討した。本発明者らは、アスコルビン酸を含むＰＬ（ＰＬＡ）中、単層で増大された軟骨細胞調製物８７５から発生したペレットを用い、次にＴＩＤＡ分化培地の存在下でペレット培養により２週間培養した。ペレットをＩＨＣ（図６Ａ）および免疫蛍光法（図６Ｂ）により分析して、インテグリンおよびコラーゲンの発現パターンを実証した。
マーカーであるインテグリンアルファ１０ベータ１とインテグリンアルファ１１ベータ１がそれぞれ軟骨および線維性コラーゲンと共存することを実証するために、本発明者らは、ＩＨＣおよび免疫蛍光法によりタンパク質発現パターンを検討した。本発明者らは、アスコルビン酸を含むＰＬ（ＰＬＡ）中、単層で増大された軟骨細胞調製物８７５から発生したペレットを用い、次にＴＩＤＡ分化培地の存在下でペレット培養により２週間培養した。ペレットをＩＨＣ（図６Ａ）および免疫蛍光法（図６Ｂ）により分析して、インテグリンおよびコラーゲンの発現パターンを実証した。
【0139】
免疫蛍光手順
軟骨細胞ペレットをＴｉｓｓｕｅＴｅｋ（Ｓａｋｕｒａ、日本所在）で包埋し、ドライアイスで凍結させた。８μｍ切片（ＭＩＣＲＯＭ ＨＭ ５００ ＯＭクリオスタットで作製）をＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライドガラス上に採取して、他の抗原に対して生成された抗体と混合された一次抗体、およびフルオロフォアコンジュゲート化二次Ａｂ／Ａｂでの免疫標識に用いた。
軟骨細胞ペレットをＴｉｓｓｕｅＴｅｋ（Ｓａｋｕｒａ、日本所在）で包埋し、ドライアイスで凍結させた。８μｍ切片（ＭＩＣＲＯＭ ＨＭ ５００ ＯＭクリオスタットで作製）をＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライドガラス上に採取して、他の抗原に対して生成された抗体と混合された一次抗体、およびフルオロフォアコンジュゲート化二次Ａｂ／Ａｂでの免疫標識に用いた。
【0140】
多重標識のための二次抗体（高親和性精製された、主にＦａｂ２断片）を、ウサギ、マウスもしくはヤギＩｇＧ、またはニワトリＩｇＹに対してロバまたはヤギで作製し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで希釈した。２つのエピトープの同時蛍光可視化のために、一次および二次抗体を混合物として適用する。
【0141】
結論：ＩＨＣ染色から、インテグリンアルファ１０ベータ１がペレットの中央領域内でコラーゲンＩＩ型と明確に共存するが、インテグリンアルファ１０ベータ１が存在しない、または少ないペレットの外側の部分でコラーゲンＩ型が主に見出されることが示される（図６Ａ）。本発明者らは、免疫蛍光法を用いて、インテグリンアルファ１０ベータ１とコラーゲンＩＩ型との明確な共存を確認し、さらにコラーゲンＩ型が高濃度であるペレットの外側部分の細胞にインテグリンアルファ１１ベータ１が主に存在することを確認した（図６Ｂ）。
【0142】
実施例５．軟骨細胞調製物の純度および品質を計測するためのインテグリンアルファ１０ベータ１およびインテグリンアルファ１１ベータ１のフローサイトメトリー分析
軟骨細胞調製物の品質アッセイとして、インテグリンアルファ１０ベータ１およびインテグリンアルファ１１ベータ１の発現を評定して同一性および純度を計測することの実行可能性を評価するために、軟骨細胞と線維芽細胞様滑膜細胞の組み合わせを用いた。異なる量の線維芽細胞様滑膜細胞を軟骨細胞調製物に添加して、インテグリンアルファ１０ベータ１およびアルファ１１ベータ１をフローサイトメトリーにより分析した。健常対象（ＨＦＬＳ）および骨関節炎患者（ＨＦＬＳ－ＯＡ）からの線維芽細胞様滑膜細胞に加え、調製物８７５からの軟骨細胞およびヒト鼻軟骨（ＨＮＣ）からの軟骨細胞を用いた。アッセイの感度を検討するために、増加量の滑膜細胞（ＨＦＬＳ－ＯＡ）を、０．５％～１００％ＨＦＬＳ－ＯＡの範囲内でＨＮＣ細胞に添加した。
軟骨細胞調製物の品質アッセイとして、インテグリンアルファ１０ベータ１およびインテグリンアルファ１１ベータ１の発現を評定して同一性および純度を計測することの実行可能性を評価するために、軟骨細胞と線維芽細胞様滑膜細胞の組み合わせを用いた。異なる量の線維芽細胞様滑膜細胞を軟骨細胞調製物に添加して、インテグリンアルファ１０ベータ１およびアルファ１１ベータ１をフローサイトメトリーにより分析した。健常対象（ＨＦＬＳ）および骨関節炎患者（ＨＦＬＳ－ＯＡ）からの線維芽細胞様滑膜細胞に加え、調製物８７５からの軟骨細胞およびヒト鼻軟骨（ＨＮＣ）からの軟骨細胞を用いた。アッセイの感度を検討するために、増加量の滑膜細胞（ＨＦＬＳ－ＯＡ）を、０．５％～１００％ＨＦＬＳ－ＯＡの範囲内でＨＮＣ細胞に添加した。
【0143】
結論（Ｉ）：フローサイトメトリー分析により、インテグリンアルファ１１ベータ１がＨＦＬＳおよびＨＦＬＳ－ＯＡで高度に発現されるが、調製物８７５またはＨＮＣからの軟骨細胞では高度に発現されないことが実証された（図７Ａ）。
【0144】
アッセイの感度を、ＨＮＣ細胞の調製物中の滑膜細胞（ＨＦＬＳ－ＯＡ）の量を増加させることにより検討した場合（図７Ｂおよび７Ｃ）、該分析は、添加されたＨＦＬＳ－ＯＡのほとんどを捉え、ＨＦＬＳ－ＯＡ細胞の最低量（０．５％）さえも検出することができた（図７Ｃ）。その結果は、ＨＦＬＳを用いた場合と類似していた（データは示さない）。このため、フローサイトメトリーによるインテグリンアルファ１１ベータ１の分析は、軟骨細胞調製物中で潜在的に混入する線維芽細胞、線維芽細胞様細胞、または他のインテグリンアルファ１１ベータ１発現細胞を検出するための効果的方法として働き、軟骨細胞調製物の純度および品質を分析する高感度の方法を提供する。
【0145】
加えて図９に示される通り、ヒト軟骨細胞調製物８０３（高い効能、図８参照）および８４２（低い効能、データは示さない）でのインテグリンアルファ１０（Ｘ軸）、インテグリンアルファ１１（Ｙ軸）のフローサイトメトリー分析を実施した。それぞれインテグリンアルファ１０およびアルファ１１に対する２つの抗体の組み合わせの結合を利用して、該抗体の単一染色および二重染色の度合いを示した。
【0146】
結論（ＩＩ）：このフローサイトメトリー分析から、８０３が主にインテグリンアルファ１０の単一発現を有することが実証され、軟骨細胞の純粋な集団および高度に分化された状態が示される。８４２は、より大きなインテグリンアルファ１１の発現を有し、部分的に脱分化された状態（アルファ１１およびアルファ１０の両方を有する細胞）、および脱分化され、そして／または混入した細胞（アルファ１１のみ）が示される。このことから、インテグリンアルファ１０およびアルファ１１の組み合わせに対する抗体がインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１との比を定義し、軟骨細胞の分化状態および純度を、つまり軟骨細胞組成物の品質を計測し得ることが実証される。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8】
【図9】