特開 2023-40247 ＣＤ２０結合単一ドメイン抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023040247

(43)【公開日】2023-03-22

(54)【発明の名称】ＣＤ２０結合単一ドメイン抗体

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20230314BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20230314BHJP

   A61K 33/24 20190101ALI20230314BHJP

   A61K 33/243 20190101ALI20230314BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20230314BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20230314BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20230314BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230314BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230314BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 3/02 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20230314BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230314BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230314BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230314BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20230314BHJP

【ＦＩ】

A61K47/68

A61K31/704 ZNA

A61K33/24

A61K33/243

A61K38/19

A61K38/20

A61K38/21

A61K39/395 T

A61K45/00

A61K45/06

A61P35/00

A61P35/02

A61P1/00

A61P1/04

A61P1/16

A61P1/18

A61P3/02

A61P3/10

A61P7/04

A61P7/06

A61P9/10

A61P11/00

A61P11/06

A61P13/12

A61P17/00

A61P17/04

A61P19/02

A61P19/08

A61P21/00

A61P25/00

A61P29/00

A61P31/00

A61P31/18

A61P31/22

A61P37/02

A61P37/08

A61P43/00 121

C07K16/28

C12N15/13

C12P21/08

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023003750

(22)【出願日】2023-01-13

(62)【分割の表示】P 2018545490の分割

【原出願日】2017-03-07

(31)【優先権主張番号】16158962.7

(32)【優先日】2016-03-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】16166206.9

(32)【優先日】2016-04-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】518275408

【氏名又は名称】ブイアイビー ブイゼットダブリュー

(71)【出願人】

【識別番号】516003702

【氏名又は名称】ユニバーシテイト ヘント

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】タベルニエル，ジャン

(72)【発明者】

【氏名】カウウェルズ，アンジェ

(72)【発明者】

【氏名】ファン デル ハイデン，ホセ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】がん等のＣＤ２０陽性細胞に結合し、細胞の死をもたらす、ＣＤ２０結合剤を提供する。
【解決手段】３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含む少なくとも１つの標的化部分を含むＣＤ２０結合剤であって、３つの相補性決定領域は、それぞれ、特定の配列群のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤ２０結合剤を提供する。一実施形態では、標的化部分は、単一ドメイン抗体（ＶＨＨまたはナノボディ）である。いくつかの実施形態では、これらのＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０に結合するが、ＣＤ２０を機能的に調節する（例えば、部分的または完全に中和する）ことはない。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０陽性細胞に結合し、結果としてＣＤ２０陽性細胞の死をもたらす。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本出願の明細書または図面に記載される発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、部分的に、ＣＤ２０に結合する結合剤（例えば、これに限定するものではないが、ＶＨＨなどの抗体）および治療剤としてのそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＤ２０は、Ｂリンパ球の表面上に発現される膜貫通タンパク質である。これは、ＣＤ２０の発現が消失する段階である、前駆Ｂ期初期から形質細胞への最終分化までのＢリンパ球の発生中に発現する。また、ＣＤ２０は、悪性Ｂ細胞上にも発現する。特に、ＣＤ２０は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）細胞の９０％以上およびＢ型慢性リンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）細胞の９５％以上で発現する。

【0003】

ＣＤ２０に向けられた抗体は、Ｂ細胞由来白血病およびリンパ腫の治療に使用される。具体的には、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）は、ＣＤ２０に対して向けられている、遺伝子操作されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。リツキシマブは現在、再発性または難治性の濾胞性リンパ腫の治療薬として承認されている。リツキシマブを毎週注入することで、結果として全体的な奏功率が４８％となったことが報告されている。しかし、多くの患者はリツキシマブ治療に反応しない。さらに、応答する患者は、多くの場合リツキシマブに対する耐性が発現し、最終的には再発する。さらに、リツキシマブは、正常なＣＤ２０陽性細胞を非特異的に死滅させ、これにより有意な毒性および副作用が生じると考えられている。

【0004】

従って、副作用を最小限に抑えながら高い特異性でＣＤ２０発現悪性細胞に結合することができる治療上有効なＣＤ２０結合剤が必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

様々な態様において、本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合する少なくとも１つの標的化部分を有するＣＤ２０結合剤に関する。一実施形態では、標的化部分は、単一ドメイン抗体（ＶＨＨまたはナノボディ）である。いくつかの実施形態では、これらのＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０に結合するが、ＣＤ２０を機能的に調節する（例えば、部分的または完全に中和する）ことはない。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０陽性細胞に結合し、結果としてＣＤ２０陽性細胞の死をもたらす。

【0006】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、修飾され得るシグナル伝達剤、例えばこれらに限定するものではないがインターフェロン、インターロイキン、および腫瘍壊死因子をさらに含む。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、目的の他の標的（例えば、抗原、受容体）に結合する追加の標的化部分を含む。一実施形態では、目的の他の標的（例えば、抗原、受容体）が腫瘍細胞上に存在する。別の実施形態では、目的の他の標的（例えば、抗原、受容体）が免疫細胞上に存在する。

【0007】

様々な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０を発現する細胞を含む様々な疾患または障害の治療での使用が見出されている。いくつかの実施形態では、このような疾患または障害としては、癌、感染症、免疫障害、ならびに他の疾患および障害が挙げられる。様々な実施形態では、本発明は、様々な治療方法を包含する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】陽性コロニーのペリプラズム抽出物を用いた細胞ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。ヒストグラムの各セットについて、第１の棒グラフはＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＤ２０であり、第２の棒グラフはＣＨＯ－Ｋ１である。クローンは、陰性対照の親細胞で得られたシグナルより少なくとも２倍高いトランスフェクトされた細胞でシグナルを与える場合には、特異的であると考えられる。さらに、シグナルの相対強度は、ナノボディの相対的な品質を反映しない場合がある。なぜなら、これらの実験では、粗製ペリプラズム抽出物が使用され、ＥＬＩＳＡシグナルの差は、親和性、実際の収量などの品質よりもむしろ、ＶＨＨの使用量などの因子に関連し得るためによる。

【図2】ヒトＣＤ２０に特異的な１７の異なるＶＨＨのヌクレオチド配列を示す図である。ＶＨＨは、２ＨＣＤ１６、２ＨＣＤ１７、２ＨＣＤ２２、２ＨＣＤ２５、２ＨＣＤ３５、２ＨＣＤ４０、２ＨＣＤ４２、２ＨＣＤ４３、２ＨＣＤ５９、２ＨＣＤ６８、２ＨＣＤ７３、２ＨＣＤ７８、２ＨＣＤ８１、２ＨＣＤ８８、Ｒ３ＣＤ７、Ｒ３ＣＤ１８、Ｒ３ＣＤ１０５である。ギャップは、配列を整列させるために導入された。

【図3】ヒトＣＤ２０に特異的な１７の異なるＶＨＨのアミノ酸配列を示す図である。ＶＨＨは、２ＨＣＤ１６、２ＨＣＤ１７、２ＨＣＤ２２、２ＨＣＤ２５、２ＨＣＤ３５、２ＨＣＤ４０、２ＨＣＤ４２、２ＨＣＤ４３、２ＨＣＤ５９、２ＨＣＤ６８、２ＨＣＤ７３、２ＨＣＤ７８、２ＨＣＤ８１、２ＨＣＤ８８、Ｒ３ＣＤ７、Ｒ３ＣＤ１８、Ｒ３ＣＤ１０５である。相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）には、下線が引かれ、Ｋａｂａｔに従って定義される。ペプチドＡＡＡ配列は、ＶＨＨ配列をＨＡタグ（太字で示す）およびＨｉｓ６タグ（カルボキシ末端）に連結するリンカーである。ギャップは、配列を整列させるために導入された。

【図4】陽性コロニーのペリプラズム抽出物を用いた細胞ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。ヒストグラムの各セットについて、第１の棒グラフはＣＨＯ－Ｋ１－ｍＣＤ２０であり、第２の棒グラフはＣＨＯ－Ｋ１である。クローンは、陰性対照の親細胞で得られたシグナルより少なくとも２倍高いトランスフェクトされた細胞でシグナルを与える場合には、特異的であると考えられる。さらに、シグナルの相対強度は、ＶＨＨの相対的な品質を反映しない場合がある。なぜなら、これらの実験では、粗製ペリプラズム抽出物が使用され、ＥＬＩＳＡシグナルの差は、親和性、実際の収量などの品質よりもむしろ、ＶＨＨの使用量などの因子に関連し得るためによる。本図で使用されているナノボディは、ラクダ科のＶＨＨに相当する。

【図5】ビオチン化マウスＣＤ２０ペプチドでスクリーニングした陽性コロニーのペリプラズム抽出物を用いた細胞ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。ヒストグラムの各セットについて、第１の棒グラフはＣＨＯ－Ｋ１－ｍＣＤ２０であり、第２の棒グラフはＣＨＯ－Ｋ１である。クローンは、陰性対照の親細胞で得られたシグナルより少なくとも２倍高いトランスフェクトされた細胞でシグナルを与える場合には、特異的であると考えられる。さらに、シグナルの相対強度は、ＶＨＨの相対的な品質を反映しない場合がある。なぜなら、これらの実験では、粗製ペリプラズム抽出物が使用され、ＥＬＩＳＡシグナルの差は、親和性、実際の収量などの品質よりもむしろ、ＶＨＨの使用量などの因子に関連し得るためによる。本図で使用されているナノボディは、ラクダ科のＶＨＨに相当する。

【図6】マウスＣＤ２０に特異的な２１の異なるＶＨＨのヌクレオチド配列を示す図である。ＶＨＨは、Ｒ２ＭＵＣ２１、Ｒ２ＭＵＣ３６、Ｒ２ＭＵＣ７０、Ｒ２ＭＵＣ８５、Ｒ３ＭＵＣ１７、Ｒ３ＭＵＣ２２、Ｒ３ＭＵＣ５６、Ｒ３ＭＵＣ５７、Ｒ３ＭＵＣ５８、Ｒ３ＭＵＣ６６、Ｒ３ＭＵＣ７５、２ＭＣ２０、２ＭＣ３８、２ＭＣ３９、２ＭＣ４２、２ＭＣ５１、２ＭＣ５２、２ＭＣ５７、２ＭＣ８２、Ｒ３ＭＣＤ２２、Ｒ３ＭＣＤ１３７である。ギャップは、配列を整列させるために導入された。

【図7】マウスＣＤ２０に特異的な２１の異なるＶＨＨのアミノ酸配列を示す図である。ＶＨＨは、Ｒ２ＭＵＣ２１、Ｒ２ＭＵＣ３６、Ｒ２ＭＵＣ７０、Ｒ２ＭＵＣ８５、Ｒ３ＭＵＣ１７、Ｒ３ＭＵＣ２２、Ｒ３ＭＵＣ５６、Ｒ３ＭＵＣ５７、Ｒ３ＭＵＣ５８、Ｒ３ＭＵＣ６６、Ｒ３ＭＵＣ７５、２ＭＣ２０、２ＭＣ３８、２ＭＣ３９、２ＭＣ４２、２ＭＣ５１、２ＭＣ５２、２ＭＣ５７、２ＭＣ８２、Ｒ３ＭＣＤ２２、Ｒ３ＭＣＤ１３７である。相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）には、下線が引かれ、Ｋａｂａｔに従って定義される。ペプチドＡＡＡ配列は、ＶＨＨ配列をＨＡタグ（太字で示す）およびＨｉｓ６タグ（カルボキシ末端）に連結するリンカーである。ギャップは、配列を整列させるために導入された。

【図8】選択された抗ヒトＣＤ２０ ＶＨＨの結合データを示す図である。左のピークは、トランスフェクトされていない親のＣＨＯ－Ｋ１を表す。中央のピークはマウスＣＤ２０発現ＣＨＯ－Ｋ１を表し、右のピークはヒトＣＤ２０発現ＣＨＯ－Ｋ１を表す。

【図9】選択された抗マウスＣＤ２０ ＶＨＨの結合データを示す図である。左のピークは、トランスフェクトされていない親のＣＨＯ－Ｋ１を表す。中央のピークはヒトＣＤ２０発現ＣＨＯ－Ｋ１を表し、右のピークはマウスＣＤ２０発現ＣＨＯ－Ｋ１を表す。

【図10】Ａ２０リンパ腫モデルにおけるキメラＣＤ２０ ＶＨＨのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍能を示す図である。ｈＣＤ２０ＮｂはヒトＣＤ２０に対する２ＨＣＤ２５ ＶＨＨを指し、ｍＣＤ２０ ＮｂはマウスＣＤ２０に対する２ＭＣ５７ ＶＨＨを指す。ｍＩＦＮは野生型マウスＩＦＮを指す。ＡｃＴＡｆｅｒｏｎは突然変異体Ｑ１２４Ｒインターフェロンを指す。Ｎｂはナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）の略語であり、本明細書ではＶＨＨに相当するものとして使用される。

【図11】Ｂ１６メラノーマモデルにおけるキメラＣＤ２０ ＶＨＨのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍能を示す図である。ｈＣＤ２０ＮｂはヒトＣＤ２０に対する２ＨＣＤ２５ ＶＨＨを指し、ｍＣＤ２０ ＮｂはマウスＣＤ２０に対する２ＭＣ５７ ＶＨＨを指す。ｍＩＦＮは野生型マウスＩＦＮを指す。ＡｃＴＡｆｅｒｏｎは突然変異体Ｑ１２４Ｒインターフェロンを指す。Ｎｂはナノボディの略語であり、本明細書ではＶＨＨに相当するものとして使用される。

【図12】図１１に示すＢ１６メラノーマモデルにおけるキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍効果が、生命を脅かす副作用を同時に引き起こさないことを示す図である。Ｎｂはナノボディの略語であり、本明細書ではＶＨＨに相当するものとして使用される。

【図13】キメラＣＤ２０ ＶＨＨが部分的Ｂ細胞枯渇を誘導することを示す図である。

【図13-2】キメラＣＤ２０ ＶＨＨが部分的Ｂ細胞枯渇を誘導することを示す図である。

【図14】ドキソルビシン（ｄｏｘ）と組み合わせたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍能を示す図である。Ｎｂはナノボディの略語であり、本明細書ではＶＨＨに相当するものとして使用される。

【図15】図１４に示すドキソルビシンと組み合わせたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍能が、生命を脅かす副作用を同時に引き起こさないことを示す図である。

【図15-2】図１４に示すドキソルビシンと組み合わせたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍能が、生命を脅かす副作用を同時に引き起こさないことを示す図である。

【図15-3】図１４に示すドキソルビシンと組み合わせたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍能が、生命を脅かす副作用を同時に引き起こさないことを示す図である。

【図16】腫瘍壊死因子と組み合わせたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍能を示す図である。Ｎｂはナノボディの略語であり、本明細書ではＶＨＨに相当するものとして使用される。

【図17】図１６に示すような腫瘍壊死因子と組み合わせたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍能が、生命を脅かす副作用を同時に引き起こさないことを示す図である。Ｎｂはナノボディの略語であり、本明細書ではＶＨＨに相当するものとして使用される。

【図17-2】図１６に示すような腫瘍壊死因子と組み合わせたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍能が、生命を脅かす副作用を同時に引き起こさないことを示す図である。Ｎｂはナノボディの略語であり、本明細書ではＶＨＨに相当するものとして使用される。

【図17-3】図１６に示すような腫瘍壊死因子と組み合わせたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍能が、生命を脅かす副作用を同時に引き起こさないことを示す図である。Ｎｂはナノボディの略語であり、本明細書ではＶＨＨに相当するものとして使用される。

【図18】抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨと組み合わせたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍能を示す図である。Ｎｂはナノボディの略語であり、本明細書ではＶＨＨに相当するものとして使用される。

【図19】抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨおよびＴｒｅｇ細胞枯渇と組み合わせたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍能を示す図である。

【図20】Ｂ１６メラノーマモデルにおける全身投与されたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍能を示す図である。Ｎｂはナノボディの略語であり、本明細書ではＶＨＨに相当するものとして使用される。

【図21】突然変異体インターフェロン（すなわち、ｈＣＤ２０－ＡｃＴａ）に融合したキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍効果が、Ｂ細胞枯渇を必要としないことを示す図である。

【図22】突然変異体インターフェロン（すなわち、ｈＣＤ２０－ＡｃＴａ）に融合したキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍効果が、Ｂ細胞枯渇を必要としないことを示す図である。

【図23】実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの有効性を示す図である。

【図23-2】実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの有効性を示す図である。

【図24】抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨと組み合わせたＩＦＮα２に融合したキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍効果を示す図である。実験は実施例４に描写したように行った。パネルＡは、キメラＣＤ２０ ＶＨＨ（すなわち、ＡｃＴａｆｅｒｏｎ：突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨ）および抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨを用いた併用療法が強力な抗腫瘍活性を呈し、３８日目（または投薬後２３日目）までに腫瘍の再発を伴わないことを実証することによって、図１８に示すデータを補うものである。パネルＢは、野生型ＩＦＮでの処置と比較して、有意な体重減少がなく、併用療法では耐容性が良好であることを示す。Ｎｂはナノボディの略語であり、本明細書ではＶＨＨに相当するものとして使用される。

【図24-2】抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨと組み合わせたＩＦＮα２に融合したキメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍効果を示す図である。実験は実施例４に描写したように行った。パネルＡは、キメラＣＤ２０ ＶＨＨ（すなわち、ＡｃＴａｆｅｒｏｎ：突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨ）および抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨを用いた併用療法が強力な抗腫瘍活性を呈し、３８日目（または投薬後２３日目）までに腫瘍の再発を伴わないことを実証することによって、図１８に示すデータを補うものである。パネルＢは、野生型ＩＦＮでの処置と比較して、有意な体重減少がなく、併用療法では耐容性が良好であることを示す。Ｎｂはナノボディの略語であり、本明細書ではＶＨＨに相当するものとして使用される。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本出願は、部分的には、ＣＤ２０を認識してＣＤ２０に結合する剤（例えば、非限定的例として、ＶＨＨまたはナノボディなどの抗体）の発見に基づく。様々な実施形態では、これらのＣＤ２０結合剤はＣＤ２０に結合するが、ＣＤ２０を機能的に調節することはない。様々な実施形態では、これらのＣＤ２０結合剤は、治療作用（例えば、腫瘍または腫瘍微小環境）を必要とする部位に免疫細胞を結合させ、直接的に、または間接的に動員させ得る。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤はＣＤ２０陽性細胞に結合し、結果としてこのような細胞の死をもたらす。本出願は、ＣＤ２０結合剤を含む医薬組成物、および様々な疾患の治療におけるそれらの使用を提供する。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、本明細書に記載されているような修飾型シグナル伝達剤を有するキメラタンパク質の一部である。

【0010】

ＣＤ２０結合剤
様々な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０に特異的に結合することができるタンパク質ベースの剤である。様々な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０を中和することなく、ＣＤ２０に特異的に結合できるタンパク質ベースの剤である。ＣＤ２０は、膜貫通４－Ａ（ＭＳ４Ａ）ファミリーの非グリコシル化メンバーである。これはマウスおよびヒトの両方においてＢ細胞特異的分化抗原として機能する（Ｓｔａｓｈｅｎｋｏら、１９８０年；Ｏｅｔｔｇｅｎら、１９８３年；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、２００１年）。特に、ヒトＣＤ２０ ｃＤＮＡは、４つの疎水性膜貫通ドメイン、２つの細胞外ループおよび細胞内Ｎ－およびＣ－末端領域からなる膜貫通タンパク質をコードする（Ｅｉｎｆｉｅｌｄら、１９８８年）。

【0011】

様々な実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０上に存在するエピトープを認識する抗原認識ドメインを有する標的化部分を含む。一実施形態では、抗原認識ドメインは、ＣＤ２０上に存在する１つ以上の線状エピトープを認識する。本明細書中で使用される場合、線状エピトープは、ＣＤ２０上に存在する任意の連続アミノ酸配列を指す。別の実施形態では、抗原認識ドメインは、ＣＤ２０上に存在する１つ以上の立体配座エピトープを認識する。本明細書中で使用される場合、立体配座エピトープは、抗原認識ドメインによって認識され得る特徴および／または形状および／または三次構造を有する三次元表面を形成するアミノ酸（不連続であってもよい）の１つ以上のセクションを指す。

【0012】

様々な実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０（例えば、ヒトＣＤ２０）の全長および／または成熟形態および／またはアイソフォームおよび／またはスプライス多様体および／または断片および／または任意の他の天然に存在するか、または合成の類似体、多様体、または突然変異体に結合し得る。様々な実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、単量体、二量体、三量体、四量体、ヘテロ二量体、多量体および会合形態など、任意の形態のＣＤ２０（例えば、ヒトＣＤ２０）に結合し得る。一実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０の単量体型に結合する。別の実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０の二量体型に結合する。別の実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０の四量体型に結合する。さらなる実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、単量体、二量体または三量体のいずれかであり得るリン酸化形態のＣＤ２０に結合する。

【0013】

一実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、ヒトＣＤ２０上に存在する１つ以上のエピトープを認識する抗原認識ドメインを有する標的化部分を含む。一実施形態では、ヒトＣＤ２０は、以下のアミノ酸配列を含む：
ＭＴＴＰＲＮＳＶＮＧＴＦＰＡＥＰＭＫＧＰＩＡＭＱＳＧＰＫＰＬＦＲＲＭＳＳＬＶＧＰＴＱＳＦＦＭＲＥＳＫＴＬＧＡＶＱＩＭＮＧＬＦＨＩＡＬＧＧＬＬＭＩＰＡＧＩＹＡＰＩＣＶＴＶＷＹＰＬＷＧＧＩＭＹＩＩＳＧＳＬＬＡＡＴＥＫＮＳＲＫＣＬＶＫＧＫＭＩＭＮＳＬＳＬＦＡＡＩＳＧＭＩＬＳＩＭＤＩＬＮＩＫＩＳＨＦＬＫＭＥＳＬＮＦＩＲＡＨＴＰＹＩＮＩＹＮＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＹＳＩＱＳＬＦＬＧＩＬＳＶＭＬＩＦＡＦＦＱＥＬＶＩＡＧＩＶＥＮＥＷＫＲＴＣＳＲＰＫＳＮＩＶＬＬＳＡＥＥＫＫＥＱＴＩＥＩＫＥＥＶＶＧＬＴＥＴＳＳＱＰＫＮＥＥＤＩＥＩＩＰＩＱＥＥＥＥＥＥＴＥＴＮＦＰＥＰＰＱＤＱＥＳＳＰＩＥＮＤＳＳＰ。

【0014】

様々な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、特異的結合が可能な標的化部分を含む。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、抗体またはその誘導体などの抗原認識ドメインを有する標的化部分を含む。一実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、抗体である標的化部分を含む。様々な実施形態では、抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む完全長多量体タンパク質である。各重鎖は、１つの可変領域（例えばＶ_Ｈ）および少なくとも３つの定常領域（例えばＣＨ_１、ＣＨ_２およびＣＨ_３）を含み、各軽鎖は１つの可変領域（Ｖ_Ｌ）および１つの定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む。可変領域は、抗体の特異性を決定する。各可変領域は、４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）によって隣接された相補性決定領域（ＣＤＲ）としても公知である３つの超可変領域を含む。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲは、抗体結合特異性に寄与する。いくつかの実施形態では、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、抗体誘導体またはフォーマットである標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、標的化部分を含み、標的化部分は、単一ドメイン抗体、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ重鎖のみの抗体（ＶＮＡＲ）、マイクロタンパク質（システインノットタンパク質、ノッティン）、ＤＡＲＰｉｎ；テトラネクチン；アフィボディー；アフィマー、トランスボディー；アンティカリン；アドネクチン；アフィリン；マイクロボディー；ペプチドアプタマー；オルタラーゼ（ａｌｔｅｒａｓｅ）、プラスチック抗体；フィロマー（ｐｈｙｌｏｍｅｒ）；ストラドボディ（ｓｔｒａｄｏｂｏｄｙ）；マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）；エビボディ（ｅｖｉｂｏｄｙ）；フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アルマジロリピートタンパク質、クニッツ型ドメイン、アビマー、アトリマー、プロボディ、免疫抗体、トリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）、トロイボディ（ｔｒｏｙｂｏｄｙ）；ペプボディ（ｐｅｐｂｏｄｙ）；ｖａｃｃｉｂｏｄｙ、ＵｎｉＢｏｄｙ；ＤｕｏＢｏｄｙ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ペプチド模倣分子、または合成分子である。これらは、米国特許、または米国特許公開第７，４１７，１３０号、第２００４／１３２０９４号、第５，８３１，０１２号、第２００４／０２３３３４号、第７，２５０，２９７号、第６，８１８，４１８号、第２００４／２０９２４３号、第７，８３８，６２９号、第７，１８６，５２４号、第６，００４，７４６号、第５，４７５，０９６号、第２００４／１４６９３８号、第２００４／１５７２０９号、第６，９９４，９８２号、第６，７９４，１４４号、第２０１０／２３９６３３号、第７，８０３，９０７号、第２０１０／１１９４４６、および／または第７，１６６，６９７号に記載されており、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓｔｏｒｚ ＭＡｂｓ．２０１１ Ｍａｙ－Ｊｕｎ；３（３）：３１０－３１７も参照されたい。

【0016】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、ＶＨＨなどの単一ドメイン抗体である標的化部分を含む。ＶＨＨは、例えば、ラクダ科動物、サメなどのＶＨＨ抗体を産生する生物から誘導され得るか、またはＶＨＨは、設計されたＶＨＨであってもよい。ＶＨＨは、天然に存在する重鎖抗体の独特の構造的および機能的特性を含む抗体由来治療用タンパク質である。ＶＨＨ技術は、軽鎖を欠くラクダ科動物由来の完全に機能的な抗体をベースにしている。これらの重鎖抗体は、単一可変ドメイン（Ｖ_ＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。ＶＨＨは、ＮＡＮＯＢＯＤＩＥＳの商標で市販されている。一実施形態では、ＣＤ２０結合剤はナノボディを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）である。

【0017】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、４つの「フレームワーク（ＦＲ）」領域および３つの「相補性決定領域（ＣＤＲ）」を有する単一のアミノ酸鎖を含むＶＨＨである標的化部分を含む。本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、ＣＤＲ間に位置する可変ドメイン内の領域を指す。本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗原性標的に特異的に結合することができるアミノ酸配列を含むＶＨＨ中の可変領域を指す。

【0018】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、少なくとも１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む可変ドメインを有するＶＨＨを含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１配列は、以下から選択される：
ＧＲＴＦＳＲＱＳＭＧ（配列番号３５）；
ＧＲＴＦＳＧＱＳＭＧ（配列番号３６）；
ＧＲＴＦＳＳＹＡＭＧ（配列番号３７）；
ＧＲＴＦＳＳＹＮＭＧ（配列番号３８）；
ＧＲＴＦＳＮＹＮＭＧ（配列番号３９）；
ＧＲＴＦＳＮＳＮＭＧ（配列番号４０）；
ＧＲＳＦＳＳＶＮＭＧ（配列番号４１）；
ＧＲＴＦＳＭＧ（配列番号４２）；
ＧＲＴＶＧＳＹＳＭＧ（配列番号４３）；
ＲＦＴＬＤＹＹＡＩＧ（配列番号４４）；
ＧＦＴＬＤＹＹＡＩＧ（配列番号４５）；
ＧＲＤＦＡＴＹＳＭＡ（配列番号１０６）；
ＧＲＤＦＡＴＹＳＭＴ（配列番号１０７）；
ＧＲＤＦＳＴＹＳＭＧ（配列番号１０８）；
ＧＲＴＦＮＴＹＳＭＧ（配列番号１０９）；
ＧＲＴＦＳＴＹＳＭＧ（配列番号１１０）；
ＧＲＤＦＳＴＹＳＭＧ（配列番号１１１）；
ＧＮＴＦＤＴＲＡＭＧ（配列番号１１２）；
ＧＲＴＲＤＡＮＡＭＧ（配列番号１１３）；または
ＧＳＴＦＳＩＫＡＭＧ（配列番号１１４）。

【0020】

いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２配列は、以下から選択される：
ＶＩＴＷＳＧＧＳＰＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号４６）；
ＶＩＴＷＳＧＧＳＰＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４７）；
ＶＩＳＷＳＧＧＳＰＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４８）；
ＡＩＤＷＳＧＧＳＰＹＹＡＡＳＶＲＧ（配列番号４９）；
ＶＩＤＷＳＧＧＳＰＹＹＴＤＳＶＲＧ（配列番号５０）；
ＡＩＴＹＳＧＧＳＰＹＹＡＳＳＶＲＧ（配列番号５１）；
ＡＶＩＷＳＧＡＳＰＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５２）；
ＡＶＴＷＳＧＡＳＰＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５３）；
ＡＶＴＲＳＧＡＳＰＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５４）；
ＣＩＳＳＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５５）；
ＴＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１５）；
ＳＩＳＷＳＧＱＲＳＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１６）；
ＩＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１７）；
ＡＩＳＲＳＳＦＮＴＹＹＳＤＳＶＴＧ（配列番号１１８）；
ＡＩＳＷＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１９）；
ＡＦＩＳＧＲＧＳＴＫＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２０）；または
ＧＦＩＳＧＲＧＳＡＫＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２１）。

【0021】

いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３配列は、以下から選択される：
ＰＶＳＹＧＳＱＷＬＡＤＹ（配列番号５６）；
ＰＶＳＹＧＳＳＷＬＡＤＹ（配列番号５７）；
ＰＬＳＹＧＳＴＷＬＡＤＹ（配列番号５８）；
ＧＶＳＦＧＳＲＷＬＳＤＹ（配列番号５９）；
ＧＶＳＹＧＳＲＷＬＧＤＹ（配列番号６０）；
ＮＰＴＹＧＳＤＷＮＡＥＮ（配列番号６１）；
ＮＰＴＹＳＧＧＷＨＡＥＹ（配列番号６２）；
ＥＲＴＷＶＳＮＹＹＣＳＧＤＧＤＧＹＤＹＤ（配列番号６３）；
ＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳ（配列番号１２２）；
ＧＫＹＧＭＫＷＲＤＧＡＤＹ（配列番号１２３）；
ＤＲＳＩＥＶＱＩＡＤＹＤＹ（配列番号１２４）；
ＶＬＰＴＧＧＧＳＡＭＤＹ（配列番号１２５）；または
ＶＬＴＴＧＧＧＳＡＭＤＹ（配列番号１２６）。

【0022】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0023】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0024】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0025】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0026】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0027】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0028】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0029】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0030】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0031】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0032】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0033】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0034】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0035】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0036】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0037】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0038】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0039】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0040】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0041】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0042】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0043】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0044】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0045】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

【0046】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、以下の配列から選択されるアミノ酸配列を含む：
２ＨＣＤ１６：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＲＱＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＴＷＳＧＧＳＰＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＶＳＹＧＳＱＷＬＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１８）
２ＨＣＤ２２：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＲＱＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＴＷＳＧＧＳＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＶＳＹＧＳＱＷＬＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１９）
２ＨＣＤ３５：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＧＱＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＴＷＳＧＧＳＰＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＨＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＶＳＹＧＳＱＷＬＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２０）
２ＨＣＤ４２：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＴＷＳＧＧＳＰＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＶＳＹＧＳＱＷＬＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２１）
２ＨＣＤ７３：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＲＱＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＥＥＲＥＦＶＡＶＩＴＷＳＧＧＳＰＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＶＳＹＧＳＱＷＬＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２２）
２ＨＣＤ８１：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＮＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＳＷＳＧＧＳＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＶＳＹＧＳＳＷＬＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２３）
Ｒ３ＣＤ１０５：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＮＹＮＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＤＷＳＧＧＳＰＹＹＡＡＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＬＳＹＧＳＴＷＬＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２４）
Ｒ３ＣＤ１８：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＮＳＮＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＤＷＳＧＧＳＰＹＹＴＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＲＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＶＳＦＧＳＲＷＬＳＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２５）
Ｒ３ＣＤ７：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＳＦＳＳＶＮＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＤＷＳＧＧＳＰＹＹＴＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＶＳＹＧＳＲＷＬＧＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２６）
２ＨＣＤ２５：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＡＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＹＳＧＧＳＰＹＹＡＳＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＮＰＴＹＧＳＤＷＮＡＥＮＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２７）
２ＨＣＤ７８：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＹＳＧＧＳＰＹＹＡＳＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＮＰＴＹＧＳＤＷＮＡＥＮＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２８）
２ＨＣＤ１７：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＶＧＳＹＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＶＩＷＳＧＡＳＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＮＰＴＹＳＧＧＷＨＡＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２９）
２ＨＣＤ４０：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＶＧＳＹＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＶＴＷＳＧＡＳＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＮＰＴＹＳＧＧＷＨＡＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号３０）
２ＨＣＤ８８：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＶＧＳＹＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＶＴＷＳＧＡＳＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＮＰＴＹＳＧＧＷＨＡＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号３１）
２ＨＣＤ５９：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＥＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＶＧＳＹＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＶＴＲＳＧＡＳＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＮＰＴＹＳＧＧＷＨＡＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号３２）
２ＨＣＤ６８：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＲＦＴＬＤＹＹＡＩＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＶＴＷＳＧＡＳＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＮＰＴＹＳＧＧＷＨＡＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号３３）
２ＨＣＤ４３：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＬＤＹＹＡＩＧＷＬＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＳＣＩＳＳＳＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＬＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＥＲＴＷＶＳＮＹＹＣＳＧＤＧＤＧＹＤＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号３４）
２ＭＣ５７：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＤＦＡＴＹＳＭＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＳＶＡＴＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＭＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号８５）
Ｒ２ＭＵＣ７０：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＤＦＡＴＹＳＭＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＳＶＡＴＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号８６）
Ｒ３ＭＵＣ１７：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＰＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＤＦＡＴＹＳＭＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＳＶＡＴＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号８７）
Ｒ３ＭＵＣ５６：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＤＦＡＴＹＳＭＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＳＶＡＴＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号８８）
Ｒ３ＭＵＣ５７：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＤＦＡＴＹＳＭＡＷＦＲＱＡＰＧＥＥＲＥＳＶＡＴＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号８９）
Ｒ３ＭＵＣ５８：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＤＦＡＴＹＳＭＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＳＶＡＴＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号９０）
Ｒ２ＭＵＣ８５：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＴＳＧＲＤＦＡＴＹＳＭＡＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＳＶＡＴＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号９１）
Ｒ３ＭＵＣ６６：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＤＦＡＴＹＳＭＴＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＳＶＡＴＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号９２）
Ｒ２ＭＵＣ２１：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＤＦＳＴＹＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＳＶＡＴＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号９３）
２ＭＣ５２：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＦＮＴＹＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳＩＳＷＳＧＱＲＳＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号９４）
Ｒ３ＭＵＣ２２：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＴＹＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＩＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号９５）。
Ｒ３ＭＵＣ７５：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＤＦＳＴＹＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＳＶＡＴＩＳＷＳＧＱＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＲＴＷＧＥＦＰＰＴＱＹＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号９６）。
２ＭＣ３９：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＡＱＡＧＮＳＬＲＩＳＣＶＡＳＧＮＴＦＤＴＲＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＲＳＳＦＮＴＹＹＳＤＳＶＴＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＫＹＧＭＫＷＲＤＧＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号９７）。
２ＭＣ５１：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＡＱＡＧＮＳＬＲＩＳＣＶＡＳＧＮＴＦＤＴＲＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＲＳＳＦＮＴＹＹＳＤＳＶＴＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＡＧＫＹＧＭＫＷＲＤＧＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号９８）。
２ＭＣ３８：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＥＳＬＲＩＳＣＶＡＳＧＮＴＦＤＴＲＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＲＳＳＦＮＴＹＹＳＤＳＶＴＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＡＧＫＹＧＭＫＷＲＤＧＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号９９）。
２ＭＣ８２：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＡＱＥＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＮＴＦＤＴＲＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＲＳＳＦＮＴＹＹＳＤＳＶＴＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＭＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＫＹＧＭＫＷＲＤＧＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１００）。
２ＭＣ２０：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＮＴＦＤＴＲＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＲＳＳＦＮＴＹＹＳＤＳＶＴＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＫＹＧＭＫＷＲＤＧＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０１）。
２ＭＣ４２：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＴＬＴＬＳＣＶＡＳＧＮＴＦＤＴＲＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＥＥＲＥＦＶＡＡＩＳＲＳＳＦＮＴＹＹＳＤＳＶＴＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＫＹＧＭＫＷＲＤＧＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０２）。
Ｒ２ＭＵＣ３６：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＥＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＲＤＡＮＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＡＩＳＷＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＶＭＨＴＶＹＬＳＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＲＳＩＥＶＱＩＡＤＹＤＹＷＧＲＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０３）。
Ｒ３ＭＣＤ１３７：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＳＩＫＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＦＩＳＧＲＧＳＴＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＡＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＤＳＬＥＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＩＶＬＰＴＧＧＧＳＡＭＤＹＷＧＥＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０４）。
Ｒ３ＭＣＤ２２：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＶＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＳＩＫＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＤＬＶＡＧＦＩＳＧＲＧＳＡＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＡＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＩＶＬＴＴＧＧＧＳＡＭＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０５）。

【0047】

様々な実施形態では、本出願は、本明細書に記載の用途のＣＤ２０結合剤の任意の天然に存在するか、または合成の類似体、変異体、多様体、対立遺伝子、相同体およびオーソログ（本明細書ではまとめて「類似体」と称する）の使用を意図する。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤のアミノ酸配列は、アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体、または他の非古典的アミノ酸をさらに含む。

【0048】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１８～３４または８５～１０５のいずれか１つと少なくとも６０％同一である配列を含む標的化部分を含む。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１８～３４または８５～１０５のいずれか１つとリンカー配列、ＨＡタグおよび／またはＨＩＳ_６タグを引いたものと少なくとも６０％同一である配列を含む標的化部分を含む。例えば、ＣＤ２０結合剤は、配列番号２～８７と、少なくとも６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である（例えば、配列番号１８～３４または８５～１０５のいずれか１つに対して、約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、約９９％、または約１００％同一である）配列を含む標的化部分を含んでもよい。

【0049】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１８～３４または８５～１０５に関して１つ以上のアミノ酸突然変異を有するアミノ酸配列を含む標的化部分を含む。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、配列番号１８～３４または８５～１０５に対して、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個、または１５個、または２０個のアミノ酸突然変異を含む標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸突然変異は、置換、挿入、欠失および切断から独立して選択され得る。

【0050】

いくつかの実施形態では、アミノ酸突然変異はアミノ酸置換であり、保存的および／または非保存的置換を含み得る。

【0051】

「保存的置換」は、例えば、極性、電荷、サイズ、溶解度、疎水性、親水性、および／または関与するアミノ酸残基の両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。２０種の天然に存在するアミノ酸は、以下の６つの標準アミノ酸群に分類することができる：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0052】

本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、上記の６つの標準アミノ酸群の同じ群内に列挙された別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのように修飾されたポリペプチドにおいて１つの負電荷を保持する。さらに、グリシンおよびプロリンは、α－ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換され得る。

【0053】

本明細書で使用されるように、「非保存的置換」は、上記の６つの標準アミノ酸群（１）～（６）の異なる群に列挙された別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。

【0054】

様々な実施形態では、置換は、非古典的アミノ酸（例えば、セレノシステイン、ピロリジン、Ｎ－ホルミルメチオニンβ－アラニン、ＧＡＢＡおよびδ－アミノレブリン酸、４－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的なアミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸、γ－Ａｂｕ、ε－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシム、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロアミノ酸、βメチルアミノ酸、Ｃα－メチルアミノ酸、Ｎα－メチルアミノ酸などのデザインされたアミノ酸（ｄｅｓｉｇｎｅｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、および一般にアミノ酸類似体）が挙げられ得る。

【0055】

様々な実施形態では、アミノ酸突然変異は、標的化部分のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３領域）に存在し得る。別の実施形態では、アミノ酸の変化は、標的化部分のフレームワーク領域（ＦＲ）、例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４領域に存在し得る。

【0056】

アミノ酸配列の修飾は、当該技術分野における任意の公知の技術、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲに基づく突然変異誘発を使用して達成され得る。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，１９８９年、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８９年に記載されている。

【0057】

様々な実施形態では、突然変異は、本発明のＣＤ２０結合剤の、ＣＤ２０に特異的に結合する能力を実質的に低下させることはない。様々な実施形態では、突然変異は、ＣＤ２０を中和することなく、本発明のＣＤ２０結合剤の、ＣＤ２０に特異的に結合する能力を実質的に低下させることはない。

【0058】

様々な実施形態では、ヒトＣＤ２０の完全長、および／または成熟形態、および／またはアイソフォーム、および／またはスプライス多様体、および／または断片、および／または単量体、および／または二量体、および／または四量体形態、および／または任意の他の天然に存在するか、または合成の類似体、多様体または突然変異体（単量体および／または二量体および／または四量体形態など）に対する本出願のＣＤ２０結合剤の結合親和性は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって記述され得る。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、約１ｕＭ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、または約５ｎＭ、または約４．５ｎＭ、または約１ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する、ヒトＣＤ２０の完全長、および／または成熟形態、および／またはアイソフォーム、および／またはスプライス多様体、および／または断片、および／または任意の他の天然に存在するか、または合成の類似体、多様体または変異体（単量体、および／または二量体、および／または四量体形態など）に結合する標的化部分を含む。

【0059】

様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、目的の抗原、すなわちＣＤ２０に結合するが機能的に調節することはない標的化部分を含む。例えば、様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤の標的化部分は、単に抗原を標的とするが、抗原が有する生物学的効果を実質的に機能的に調節する（例えば、実質的に阻害する、低下させる、または中和する）ことはない。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤の標的化部分は、その生物学的活性にとって重要な抗原部位から物理的に分離したエピトープ（例えば、抗原の活性部位）に結合する。

【0060】

顕著な機能の調節を伴うことのないこのような結合により、本出願の様々な実施形態での使用が見出される。様々な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０陽性細胞に結合し、このような細胞の死を誘導する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、アポトーシスまたは直接的細胞死、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および／または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）のうちの１つ以上によって媒介される細胞死を誘導する。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０の結合時に原形質膜内の大きな脂質ミクロドメインまたは「脂質ラフト」へのＣＤ２０の移行を誘導する。このクラスタリングプロセスにより、補体の活性化が高まり、強力な補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を発揮する。他の実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、直接的な細胞死を誘導する。代替的実施形態では、ＣＤ２０結合剤の治療効果は、Ｂ細胞の枯渇に依存することはない。

【0061】

様々な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、エフェクター抗原を介して、必要な部位への活性免疫細胞を直接的に、または間接的に動員するために使用され得る。例えば、様々な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、癌または腫瘍を低減または排除する方法において、免疫細胞を直接的に、または間接的に癌または腫瘍細胞に動員するために使用され得る（例えば、ＣＤ２０結合剤は、抗ＣＤ２０抗原認識ドメインを有する標的化部分、および例えば、樹状細胞上に発現する抗原である、Ｃｌｅｃ９Ａに対して向けられている認識ドメイン（例えば、抗原認識ドメイン）を有する標的化部分を含んでもよい）。これらの実施形態では、ＣＤ２０シグナル伝達は、癌の減少または排除効果の重要な部分である。様々な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を動員することができる。

【0062】

本発明のＣＤ２０結合剤を含む治療剤
シグナル伝達剤とのキメラおよび融合
様々な実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、１種以上のシグナル伝達剤とのキメラまたは融合物の一部である。したがって、本出願は、例えば、ＣＤ２０に対する標的化部分および１種以上のシグナル伝達剤を含むキメラまたは融合タンパク質を提供する。

【0063】

様々な実施形態では、シグナル伝達剤は、その受容体のうちの１つ以上の、親和性または活性が低下するように修飾されており、これにより活性の弱化が可能になり（アゴニズムまたはアンタゴニズムなど）、かつ／またはキメラもしくは融合タンパク質の非特異的シグナル伝達もしくは望ましくない隔離を防ぐことができる。様々な実施形態では、シグナル伝達剤は、その野生型形態でアンタゴニストであり、そのアンタゴニスト作用を弱める１つ以上の突然変異を担持する。様々な実施形態では、シグナル伝達剤は、１つ以上の突然変異のために拮抗的であり、例えば、アゴニストシグナル伝達剤は拮抗的シグナル伝達剤に変換され、このような変換されたシグナル伝達剤は、（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／００７５２０号に記載されているように）、そのアンタゴニスト作用を弱める１つ以上の突然変異を担持している。

【0064】

したがって、様々な実施形態では、シグナル伝達剤は、１つ以上の突然変異を有するシグナル伝達剤の修飾（例えば、突然変異）形態である。様々な実施形態では、修飾（例えば突然変異）することにより、修飾型シグナル伝達剤が、非修飾型または非変異型、すなわち、野生型形態のシグナル伝達剤と比較して（例えば、野生型形態対修飾型形態または変異型形態の同一のシグナル伝達剤と比較して）、低下した結合親和性、低下した内在性活性、および低下した特異的生物活性のうちの１つ以上など、弱化した活性のうちの１つ以上を有し得るようになる。いくつかの実施形態では、結合または親和性を弱化または低下させる突然変異には、結合または活性を実質的に低下または消失させるこれらの突然変異が含まれる。いくつかの実施形態では、結合または親和性を弱化または低下させる突然変異は、結合または活性を実質的に低下または消失させる突然変異とは異なる。結果として、様々な実施形態では、突然変異していない、すなわち野生型シグナル伝達剤に対して（例えば、野生型形態対修飾型形態（例えば突然変異体）における同じシグナル伝達剤と比較して）、突然変異により、シグナル伝達剤の安全性の改善、例えば全身毒性の低下、副作用の減少、およびオフターゲット効果の減少が可能になる。

【0065】

本明細書に記載されているように、剤は、１つ以上の修飾、例えば突然変異により改善された安全性を有し得る。様々な実施形態では、改善された安全性とは、本発明のキメラタンパク質がより低い毒性（例えば、全身性毒性、および／または組織／器官関連毒性）、および／または軽減された、もしくは実質的に排除された副作用、および／または増加した耐容性、軽減もしくは実質的に排除された有害事象、および／または減少したもしくは実質的に排除されたオフターゲット効果、および／または増加した治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）を提供することを意味する。

【0066】

様々な実施形態では、シグナル伝達剤は、その受容体の１つ以上に対するその結合親和性または活性を低下させる１つ以上の突然変異を有するように修飾される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達剤は、受容体に対する結合親和性もしくは活性を実質的に低下もしくは消失させる１つ以上の突然変異を有するように修飾される。いくつかの実施形態では、野生型シグナル伝達剤によってもたらされる活性は、受容体でのアゴニズム（例えば、治療部位における細胞効果の活性化）である。例えば、野生型シグナル伝達剤は、その受容体を活性化することができる。このような実施形態では、突然変異により、結果として、修飾型シグナル伝達剤が受容体において低下または消失させた活性化活性を有するようになる。例えば、突然変異により、結果として、修飾型シグナル伝達剤が、低下された活性化シグナルを標的細胞に送達し得るか、または活性化シグナルを消失させ得る。いくつかの実施形態では、野生型シグナル伝達剤によってもたらされる活性は、受容体での拮抗作用である（例えば、治療部位で細胞効果を遮断するか、または減衰させる）。例えば、野生型シグナル伝達剤は、受容体を拮抗または阻害することができる。これらの実施形態では、突然変異により、結果として、修飾型シグナル伝達剤が、受容体において低下または消失させた拮抗活性を有するようになる。例えば、突然変異により、結果として、修飾型シグナル伝達剤が、低下された抑制シグナルを標的細胞に送達し得るか、または抑制シグナルを消失させ得る。様々な実施形態では、シグナル伝達剤は、１つ以上の突然変異により拮抗性であり、例えば、アゴニストシグナル伝達剤は、（例えば、その全内容が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／００７５２０号に記載されているように）アンタゴニストシグナル伝達剤に変換され、このように変換されたシグナル伝達剤は、任意により、その受容体の１つ以上に対するその結合親和性もしくは活性を低下させるか、またはその受容体のうちの１つ以上に対する結合親和性もしくは活性を実質的に低下もしくは消失させる１つ以上の突然変異も担持する。

【0067】

いくつかの実施形態では、受容体での親和性または活性の低下は、本明細書に記載の標的化部分のうちの１つ以上（例えば、ＣＤ２０に対する標的化部分、または本明細書に記載の任意の他の標的化部分）に付着することによって回復可能である。他の実施形態では、受容体において低下した親和性または活性は、標的化部分のうちの１つ以上の活性によって実質的に回復可能ではない。

【0068】

様々な実施形態では、本出願のキメラタンパク質は、それらのシグナル伝達剤が受容体において、結合親和性または活性を弱めるまたは消失させる突然変異を有するために、オフターゲット効果を低減させる。様々な実施形態では、例えば、野生型シグナル伝達剤と比較して、副作用のこうした減少が観察される。様々な実施形態では、標的化部分（複数可）が実質的な活性化に必要であるが、欠損している／不十分な結合（例えば、制限および／または結合力がない）を補償するため、シグナル伝達剤は、標的細胞上で活性である。様々な実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、治療活性の部位に至るまで実質的に不活性であり、望ましくない副作用を大幅に低減する特異的に標的化された細胞型に対して実質的にその効果を有する。

【0069】

いくつかの実施形態では、シグナル伝達剤は、１つの受容体（すなわち、治療的受容体）の結合または親和性を弱めるかまたは低下させる１つ以上の突然変異、および第２の受容体において結合または活性を実質的に低下または消失させる１つ以上の突然変異を含み得る。このような実施形態では、これらの突然変異は、同じ位置または異なる位置（すなわち、同じ突然変異または複数の突然変異）であり得る。いくつかの実施形態では、１つの受容体において結合および／または活性を低下させる突然変異（複数可）は、別の受容体において実質的に減少または消失する突然変異（複数可）とは異なる。いくつかの実施形態では、１つの受容体において結合および／または活性を低下させる突然変異（複数可）は、別の受容体において実質的に減少または消失する突然変異（複数可）と同じである。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、治療受容体における結合および／または活性を弱化させ、したがってより制御されたオンターゲット治療効果（例えば、相対的な野生型シグナル伝達剤）をより制御することができる突然変異、ならびに別の受容体において結合および／または活性を実質的に低下または消失させ、したがって（例えば、野生型シグナル伝達剤と比較して）副作用を減少させる突然変異を双方とも有する修飾型シグナル伝達剤を有する。

【0070】

いくつかの実施形態では、結合または活性の実質的な低下または消失は、標的化部分（例えば、ＣＤ２０に対する標的化部分または本明細書に記載の任意の他の標的化部分）により、実質的に回復可能ではない。いくつかの実施形態では、結合または活性の実質的な低下または消失は、標的化部分により、回復可能である。様々な実施形態では、第２の受容体における結合または活性を実質的に低下または消失させることはまた、他の受容体によって媒介される有害な作用を防止し得る。代替的にまたは追加として、他の受容体において結合または活性を実質的に低下または消失させることにより、治療作用部位から離れた治療用キメラタンパク質の隔離が減少または排除されるので、治療効果が改善される。例えば、いくつかの実施形態では、このことにより、他の受容体での損失を補償する本発明のキメラタンパク質が高用量である必要がなくなる。このように用量を減少できることにより、副作用の可能性がより低いものとなる。

【0071】

様々な実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、１つ以上の突然変異を含み、この突然変異によりシグナル伝達剤は、低下した、実質的に低下した、もしくは消失した親和性、例えば、結合（例えば、Ｋ_Ｄ）、および／または（例えば、修飾型シグナル伝達剤が、例えば、Ｋ_Ａおよび／またはＥＣ_５０として、計測可能であるその受容体のアゴニストである場合）活性化、および／または（例えば、修飾型シグナル伝達剤が、Ｋ_Ｉおよび／またはＩＣ_５０として、計測可能であるその受容体のアンタゴニストである場合）阻害をその１つ以上の受容体に対して有するようになる。様々な実施形態では、剤の受容体において親和性が低下することで、活性の弱化（アゴニズムまたはアンタゴニズムを含む）が可能になる。このような実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、野生型シグナル伝達剤と比較して、約１％、または約３％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１０％～２０％、約２０％～４０％、約５０％、約４０％～６０％、約６０％～８０％、約８０％～１００％の受容体の親和性を有する。いくつかの実施形態では、結合親和性は、野生型シグナル伝達剤に対して、少なくとも約２倍低い、約３倍低い、約４倍低い、約５倍低い、約６倍低い、約７倍低い、約８倍低い、約９倍低い、少なくとも約１０倍低い、少なくとも約１５倍低い、少なくとも約２０倍低い、少なくとも約２５倍低い、少なくとも約３０倍低い、少なくとも約３５倍低い、少なくとも約４０倍低い、少なくとも約４５倍低い、少なくとも約５０倍低い、少なくとも約１００倍低い、少なくとも約１５０倍低い、または、約１０～５０倍低い、約５０～１００倍低い、約１００～１５０倍低い、約１５０～２００倍低い、２００倍以上低い。

【0072】

キメラタンパク質が１つの受容体における結合を減少させ、第２の受容体における結合を実質的に低下または消失させる突然変異を有する実施形態では、修飾型シグナル伝達剤の１つの受容体の結合親和性の弱化または低下は、他の受容体の親和性の実質的な低下または消失より少ない。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤の１つの受容体の結合親和性の減衰または低下は、他の受容体の親和性の実質的な減少または消失よりも、約１％、または約３％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％少ない。様々な実施形態では、実質的な低下または消失は、減衰または減少よりも結合親和性および／または活性のより大きな低下を指す。

【0073】

様々な実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、シグナル伝達剤の内因性活性を、例えば、野生型シグナル伝達剤と比較して、約７５％、または約７０％、または約６０％、または約５０％、または約４０％、または約３０％、または約２５％、または約２０％、または約１０％、または約５％、または約３％、または約１％まで低下させる１つ以上の突然変異を含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、１つ以上の突然変異を含み、この突然変異により、シグナル伝達剤がその（それらの）受容体（複数可）に対する標的化部分（複数可）の結合親和性が低いその受容体の親和性が低下するようになる。いくつかの実施形態では、この結合親和性の差は、同じ細胞上のシグナル伝達剤／受容体と標的化部分／受容体との間の差である。いくつかの実施形態では、この結合親和性の差により、シグナル伝達剤、例えば突然変異したシグナル伝達剤は、局在化したオンターゲット効果を有し、野生型シグナル伝達剤で観察される副作用の基礎となるオフターゲット効果を最小限に抑えることができるようになる。いくつかの実施形態では、この結合親和性は、少なくとも約２倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約１５倍低く、または少なくとも約２５倍、または少なくとも約５０倍より低く、または少なくとも約１００倍、または少なくとも約１５０倍である。

【0075】

受容体結合活性は、当技術分野で公知の方法を用いて測定することができる。例えば、親和性および／または結合活性は、結合データのＳｃａｔｃｈａｒｄプロット解析およびコンピュータフィッティング（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、１９４９年）によって、またはＢｒｅｃｈｔら（１９９３年）に記載されているとおり（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）フロースルー条件下での反射率干渉分光法によって評価され得る。

【0076】

様々な実施形態では、シグナル伝達剤は、免疫調節剤、例えば、インターロイキン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子のうちの１つ以上である。

【0077】

いくつかの実施形態では、シグナル伝達剤は、インターロイキンまたは修飾されたインターロイキン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、ＩＬ－３６、またはそれらの断片、多様体、類似体またはファミリーメンバーである。インターロイキンは、リンパ球、単球、およびマクロファージによって合成された多機能性サイトカインの群である。既知の機能としては、免疫細胞（例えば、Ｔヘルパー細胞、Ｂ細胞、好酸球およびリンパ球）の増殖、好中球およびＴリンパ球の走化性および／またはインターフェロンの阻害を刺激することが含まれる。インターロイキン活性は、当該分野で公知のアッセイを用いて決定することができる：Ｍａｔｔｈｅｗｓら、ｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｌｅｍｅｎｓら、編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９８７，２２１－２２５頁；およびＯｒｅｎｃｏｌｅ＆Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ（１９８９年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １，１４－２０。

【0078】

いくつかの実施形態では、シグナル伝達剤は、インターフェロンまたはＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型インターフェロンなどのインターフェロンの修飾型である。例示的なインターフェロンとして、例えば、インターフェロン－α１、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１６、１７および２１、インターフェロン－β、およびインターフェロン－γ、インターフェロンκ、インターフェロンξ、インターフェロンτおよびインターフェロンωが挙げられる。

【0079】

いくつかの実施形態では、シグナル伝達剤は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の修飾型、またはＴＮＦファミリーのタンパク質であり、これらに限定するものではないが、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＬＴ－β、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、およびＴＲＡＩＬが挙げられる。

【0080】

本明細書に記載の野生型シグナル伝達剤のアミノ酸配列は、当技術分野で周知である。したがって、様々な実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、本明細書に記載のシグナル伝達剤の既知の野生型アミノ酸配列と、少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性（例えば、約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。

【0081】

様々な実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、本明細書に記載のシグナル伝達剤の任意のアミノ酸配列と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性（例えば、約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。

【0082】

様々な実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、１つ以上のアミノ酸突然変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸突然変異は、置換、挿入、欠失および切断から独立して選択され得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸突然変異はアミノ酸置換であり、本明細書の他の箇所に記載されるように、保存的および／または非保存的置換を含み得る。

【0083】

様々な実施形態では、置換はまた、本明細書の他の箇所に記載される非古典的アミノ酸を含み得る。

【0084】

本明細書に記載されるように、修飾型シグナル伝達剤は、１つ以上の受容体で親和性および／または活性に影響を及ぼす突然変異を担持する。本明細書に記載のとおり、任意のシグナル伝達剤の受容体は、当技術分野で公知である。

【0085】

受容体において低下した親和性および／または活性（例えばアゴニスト作用）をもたらす例示的な突然変異は、国際公開第２０１３／１０７７９１号（例えば、インターフェロンに関する）、国際公開第２０１５／００７５４２号（例えば、インターロイキンに関する）、および国際公開第２０１５／００７９０３号（例えば、ＴＮＦに関する）に見出され、それらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。受容体において低下した親和性および／または活性（例えば、アンタゴニスト作用）をもたらす例示的な突然変異は、国際公開第２０１５／００７５２０号に見出され、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0086】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はインターフェロンαである。このような実施形態では、修飾型ＩＦＮ－α剤は、ＩＦＮ－α／β－１受容体（ＩＦＮＡＲ）、すなわちＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２鎖に対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＦＮ－α剤は、ＩＦＮ－α／β－１受容体（ＩＦＮＡＲ）、すなわちＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２鎖に対して実質的に低下した、または消失した親和性および／または活性を有する。

【0087】

インターフェロンαの突然変異型は、当業者に公知である。例示的な実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、以下のアミノ酸配列を有する対立遺伝子型ＩＦＮ－α２ａである：
ＩＦＮ－α２ａ：
ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＫＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＫＥＤＳＩＬＡＶＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＫＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＦＳＬＳＴＮＬＱＥＳＬＲＳＫＥ（配列番号１２７）

【0088】

例示的な実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、以下の（アミノ酸位置２３においてＩＦＮ－α２ａとは異なる）アミノ酸配列を有する対立遺伝子型ＩＦＮ－α２ｂである。
ＩＦＮ－α２ｂ：
ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＲＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＫＥＤＳＩＬＡＶＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＫＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＦＳＬＳＴＮＬＱＥＳＬＲＳＫＥ（配列番号１２８）

【0089】

いくつかの実施形態では、上記ＩＦＮ－α２突然変異体（ＩＦＮ－α２ａまたはＩＦＮ－α２ｂ）は、アミノ酸位置１４８、１４９および／または１５３などの位置１４４～１５４において１つ以上のアミノ酸で突然変異される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－α２突然変異体は、Ｌ１５３Ａ、Ｒ１４９Ａ、およびＭ１４８Ａから選択される１つ以上の突然変異を含む。このような突然変異体は、例えば、国際公開第２０１３／１０７７９１号およびＰｉｅｈｌｅｒら、（２０００年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７５：４０４２５－３３に記載されており、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0090】

いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－α２突然変異体は、ＩＦＮＡＲ１に対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－α２突然変異体は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０３０６７１号に記載されているように、Ｆ６４Ａ、Ｎ６５Ａ、Ｔ６９Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、およびＹ８９Ａから選択される１つ以上の突然変異を含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－α２突然変異体は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１２４０８６号に記載されているように、Ｋ１３３Ａ、Ｒ１４４Ａ、Ｒ１４９Ａ、およびＬ１５３Ａから選択される１つ以上の突然変異を含む。

【0092】

いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－α２突然変異体は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／００７５２０号および国際公開第２０１０／０３０６７１号に記載されているように、Ｒ１２０ＥおよびＲ１２０Ｅ／Ｋ１２１Ｅから選択される１つ以上の突然変異を含む。このような実施形態では、ＩＦＮ－α２突然変異体は、野生型ＩＦＮ－α２の活性に拮抗する。このような実施形態では、突然変異型ＩＦＮ－α２は、ＩＦＮＡＲ１に対して低下した親和性および／または活性を有し、ＩＦＮＲ２の親和性および／または活性が保持されている。

【0093】

いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－α２突然変異体は、（１）理論に拘束されることを望むものではないが、拮抗作用を生じさせる、Ｒ１２０ＥおよびＲ１２０Ｅ／Ｋ１２１Ｅから選択される１つ以上の突然変異、および、（２）理論に拘束されることを望むものではないが、例えばＩＦＮＡＲ２において弱化効果を可能にする、Ｋ１３３Ａ、Ｒ１４４Ａ、Ｒ１４９Ａ、およびＬ１５３Ａから選択される１つ以上の突然変異を含む。

【0094】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はインターフェロンβである。このような実施形態では、修飾型インターフェロンβ剤は、ＩＦＮ－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）、すなわちＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２鎖に対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型インターフェロンβ剤は、ＩＦＮ－α／β－１受容体（ＩＦＮＡＲ）、すなわちＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２鎖に対して実質的に低下した、または消失した親和性および／または活性を有する。

【0095】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はインターフェロンγである。このような実施形態では、修飾型インターフェロンγ剤は、インターフェロン－ガンマ受容体（ＩＦＮＧＲ）、すなわちＩＦＮＧＲ１およびＩＦＮＧＲ２鎖に対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型インターフェロンγ剤は、インターフェロン－ガンマ受容体（ＩＦＮＧＲ）、すなわちＩＦＮＧＲ１および／またはＩＦＮＧＲ２鎖に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。

【0096】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＴＮＦ－αである。ＴＮＦは、細胞増殖の調節、分化、アポトーシス、腫瘍形成、ウイルス複製、自己免疫、免疫細胞機能および輸送、炎症および敗血症ショックなど、多くの多様な機能を有する多面発現性サイトカインである。これは、標的細胞上の２つの異なる膜受容体ＴＮＦＲ１（ｐ５５）およびＴＮＦＲ２（ｐ７５）に結合する。ＴＮＦＲ１は、非常に幅広い発現パターンを呈するが、ＴＮＦＲ２は、リンパ球、Ｔｒｅｇ、内皮細胞、特定のニューロン、ミクログリア、心筋細胞および間葉幹細胞の特定の集団に優先的に発現する。非常に異なる生物学的経路は、受容体の活性化に応答して活性化されるが、いくつかの重複もある。一般的な規則として、理論に拘束されることを望むものではないが、ＴＮＦＲ１シグナル伝達はアポトーシス（細胞死）の誘導に関連し、ＴＮＦＲ２シグナル伝達は細胞生存シグナルの活性化（例えばＮＦｋＢ経路の活性化）に関連する。ＴＮＦの投与は全身毒性であり、これは主にＴＮＦＲ１の関与に起因する。しかし、ＴＮＦＲ２の活性化は広範囲の活性にも関連しており、ＴＮＦＲ１と同様に、ＴＮＦをベースとした治療法を開発する状況において、ＴＮＦの標的化および活性に対する制御が重要であることに留意すべきである。

【0097】

いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＴＮＦＲ１および／またはＴＮＦＲ２に対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＴＮＦＲ１および／またはＴＮＦＲ２に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。ＴＮＦＲ１はほとんどの組織で発現し、細胞死のシグナル伝達に関与し、その一方で、ＴＮＦＲ２は細胞生存シグナル伝達に関与する。したがって、癌の治療方法に関する実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＴＮＦＲ１に対して低下した親和性および／または活性を有し、かつ／またはＴＮＦＲ２に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。これらの実施形態では、キメラタンパク質は、アポトーシスが望まれる細胞、例えば、腫瘍細胞または腫瘍血管内皮細胞に対して標的化されてもよい。例えば、神経変性疾患の治療のための神経新生における細胞生存を促進する方法に関する実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＴＮＦＲ２に対して低下した親和性および／または活性を有し、および／またはＴＮＦＲ１に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。換言すれば、本発明のキメラタンパク質は、いくつかの実施形態では、死亡シグナルまたは生存シグナルのいずれかを好む、修飾型ＴＮＦ－α剤を含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、ＴＮＦＲ１に対して低下した親和性および／もしくは活性を有する修飾型ＴＮＦ、ならびに／またはＴＮＦＲ２に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する修飾型ＴＮＦを有する。このようなキメラは、いくつかの実施形態では、野生型ＴＮＦおよび／またはＴＮＦＲ１に対して親和性および／または活性の低下を引き起こす突然変異（複数可）のみを担持するキメラと比較して、より強力なアポトーシス誘導物質である。このようなキメラは、いくつかの実施形態では、（例えば、癌の治療において）腫瘍細胞死または腫瘍脈管構造内皮細胞死を誘導する際の使用が見出される。また、いくつかの実施形態では、これらのキメラは、例えば、ＴＮＦＲ２を介したＴ_ｒｅｇ細胞の活性化を回避または低減し、したがってｉｎ ｖｉｖｏでは、ＴＮＦＲ１媒介性の抗腫瘍活性をさらに補助する。

【0099】

いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、ＴＮＦＲ２に対して低下した親和性および／もしくは活性、ならびに／またはＴＮＦＲ１に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する修飾型ＴＮＦを有する。いくつかの実施形態では、こうしたキメラは、いくつかの細胞型において細胞生存のより強力なアクチベータであり、これらは、これに限定するものではないが、神経新生の刺激など、様々な疾患の状況における特異的治療目的であり得る。いくつかの実施形態では、キメラは自己反応性Ｔ細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、キメラはＴ_ｒｅｇ細胞の活性化および細胞傷害性Ｔ細胞の間接的抑制を促進する。

【0100】

いくつかの実施形態では、キメラ（例えば、ＴＮＦＲ２に対して低下した親和性および／または活性を有し、かつ／またはＴＮＦＲ１に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する修飾型ＴＮＦ）は、例えば、ＴＮＦＲ２の活性化および／または回避ＴＮＦＲ１によって自己反応性Ｔ細胞の死滅を引き起こす。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの自己反応性Ｔ細胞は、例えばＮＦｋＢ経路活性／シグナル伝達の変化によってアポトーシス／生存シグナルを変化させる。

【0101】

いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ－２をベースにしたキメラは、様々な心疾患、とりわけ、脱髄形成および神経変性障害、および感染症などの疾患における追加的な治療的用途を有する。

【0102】

一実施形態では、野生型ＴＮＦ－αは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＴＮＦ－α
ＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ。

【0103】

このような実施形態では、修飾型ＴＮＦ－α剤は、１つ以上のアミノ酸位置２９、３１、３２、８４、８５、８６、８７、８８、８９、１４５、１４６、および１４７に突然変異を有し、低下した受容体結合親和性を有する修飾型ＴＮＦ－αを産生する。例えば、米国特許第７，９９３，６３６号を参照されたい（その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0104】

いくつかの実施形態では、修飾型ＴＮＦ－α剤は、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／００７９０３号に記載されているように、１つ以上のアミノ酸位置Ｒ３２、Ｎ３４、Ｑ６７、Ｈ７３、Ｌ７５、Ｔ７７、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｖ９１、Ｉ９７、Ｔ１０５、Ｐ１０６、Ａ１０９、Ｐ１１３、Ｙ１１５、Ｅ１２７、Ｎ１３７、Ｄ１４３、およびＡ１４５に突然変異を有する（ヒトＴＮＦ配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＧ７０３０６、バージョンＢＡＧ７０３０６．１ ＧＩ：１９７６９２６８５による番号付け）。いくつかの実施形態では、修飾型ＴＮＦ－α剤は、Ｒ３２Ｇ、Ｎ３４Ｇ、Ｑ６７Ｇ、Ｈ７３Ｇ、Ｌ７５Ｇ、Ｌ７５Ａ、Ｌ７５Ｓ、Ｔ７７Ａ、Ｓ８６Ｇ、Ｙ８７Ｑ、Ｙ８７Ｌ、Ｙ８７Ａ、Ｙ８７Ｆ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ａ、Ｉ９７Ａ、Ｉ９７Ｑ、Ｉ９７Ｓ、Ｔ１０５Ｇ、Ｐ１０６Ｇ、Ａ１０９Ｙ、Ｐ１１３Ｇ、Ｙ１１５Ｇ、Ｙ１１５Ａ、Ｅ１２７Ｇ、Ｎ１３７Ｇ、Ｄ１４３Ｎ、Ａ１４５Ｇ、およびＡ１４５Ｔから選択される置換突然変異を有する。

【0105】

いくつかの実施形態では、修飾型ＴＮＦ－α剤は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１２４０８６号に記載されているように、Ｎ３９Ｙ、Ｓ１４７Ｙ、およびＹ８７Ｈから選択される１つ以上の突然変異を有する。

【0106】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＴＮＦ－βである。ＴＮＦ－βは、ＬＴ－βとホモ三量体またはヘテロ三量体を形成することができる（ＬＴ－α１β２）。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＴＮＦＲ１、および／またはＴＮＦＲ２、および／またはヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＥＶＭ）、および／またはＬＴ－βＲに対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。

【0107】

一実施形態では、野生型ＴＮＦ－βは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＴＮＦ－β
ＬＰＧＶＧＬＴＰＳＡＡＱＴＡＲＱＨＰＫＭＨＬＡＨＳＮＬＫＰＡＡＨＬＩＧＤＰＳＫＱＮＳＬＬＷＲＡＮＴＤＲＡＦＬＱＤＧＦＳＬＳＮＮＳＬＬＶＰＴＳＧＩＹＦＶＹＳＱＶＶＦＳＧＫＡＹＳＰＫＡＴＳＳＰＬＹＬＡＨＥＶＱＬＦＳＳＱＹＰＦＨＶＰＬＬＳＳＱＫＭＶＹＰＧＬＱＥＰＷＬＨＳＭＹＨＧＡＡＦＱＬＴＱＧＤＱＬＳＴＨＴＤＧＩＰＨＬＶＬＳＰＳＴＶＦＦＧＡＦＡＬ。

【0108】

このような実施形態では、修飾型ＴＮＦ－β剤は、１０６～１１３位置において１つ以上のアミノ酸に突然変異を含み得、これにより、ＴＮＦＲ２に対して低下した受容体結合親和性を有する修飾型ＴＮＦ－β剤が産生される。一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、アミノ酸位置１０６～１１３に１つ以上の置換突然変異を有する。例示的な実施形態では、置換突然変異は、Ｑ１０７Ｅ、Ｑ１０７Ｄ、Ｓ１０６Ｅ、Ｓ１０６Ｄ、Ｑ１０７Ｒ、Ｑ１０７Ｎ、Ｑ１０７Ｅ／Ｓ１０６Ｅ、Ｑ１０７Ｅ／Ｓ１０６Ｄ、Ｑ１０７Ｄ／Ｓ１０６Ｅ、およびＱ１０７Ｄ／Ｓ１０６Ｄから選択される。別の実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、１０６～１１３位置に約１個～約３個のアミノ酸の挿入を有する。

【0109】

いくつかの実施形態では、修飾剤は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／００７９０３号に記載されているように、一本鎖三量体型であり得るＴＮＦファミリーメンバー（例えば、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ）である。

【0110】

いくつかの実施形態では、修飾型剤は、ＴＮＦＲ１において低下した親和性および／または活性、すなわちアンタゴニスト活性（例えば、天然アンタゴニスト活性または１つ以上の突然変異の結果であるアンタゴニスト活性（例えば、その全内容が、本明細書中に参照として組み込まれる国際公開第２０１５／００７５２０号を参照されたい））を有するＴＮＦファミリーメンバー（例えばＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ）である。これらの実施形態では、修飾型剤は、任意により、ＴＮＦＲ２に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性も有するＴＮＦファミリーメンバー（例えば、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ）である。いくつかの実施形態では、修飾型剤は、ＴＮＦＲ２において低下した親和性および／または活性、すなわちアンタゴニスト活性（例えば、天然アンタゴニスト活性または１つ以上の突然変異の結果であるアンタゴニスト活性（例えば、その全内容が、本明細書中に参照として組み込まれる国際公開第２０１５／００７５２０号を参照されたい））を有するＴＮＦファミリーメンバー（例えばＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ）である。これらの実施形態では、修飾型剤は、任意により、ＴＮＦＲ１に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性も有するＴＮＦファミリーメンバー（例えば、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ）である。このような実施形態の構築物は、例えば、細胞特異的様式でＴＮＦ応答を弱める方法において使用される。いくつかの実施形態では、アンタゴニストＴＮＦファミリーメンバー（例えば、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ）は、国際公開第２０１５／００７９０３号に記載される一本鎖三量体型である。

【0111】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＴＲＡＩＬである。いくつかの実施形態では、修飾型ＴＲＡＩＬ剤は、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ－ＲＩ）および／またはＤＲ５（ＴＲＡＩＬ－ＲＩＩ）および／またはＤｃＲ１および／またはＤｃＲ２に対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型ＴＲＡＩＬ剤は、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ－ＲＩ）、および／またはＤＲ５（ＴＲＡＩＬ－ＲＩＩ）、および／またはＤｃＲ１、および／またはＤｃＲ２に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。

【0112】

一実施形態では、野生型ＴＲＡＩＬは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＴＲＡＩＬ
ＭＡＭＭＥＶＱＧＧＰＳＬＧＱＴＣＶＬＩＶＩＦＴＶＬＬＱＳＬＣＶＡＶＴＹＶＹＦＴＮＥＬＫＱＭＱＤＫＹＳＫＳＧＩＡＣＦＬＫＥＤＤＳＹＷＤＰＮＤＥＥＳＭＮＳＰＣＷＱＶＫＷＱＬＲＱＬＶＲＫＭＩＬＲＴＳＥＥＴＩＳＴＶＱＥＫＱＱＮＩＳＰＬＶＲＥＲＧＰＱＲＶＡＡＨＩＴＧＴＲＧＲＳＮＴＬＳＳＰＮＳＫＮＥＫＡＬＧＲＫＩＮＳＷＥＳＳＲＳＧＨＳＦＬＳＮＬＨＬＲＮＧＥＬＶＩＨＥＫＧＦＹＹＩＹＳＱＴＹＦＲＦＱＥＥＩＫＥＮＴＫＮＤＫＱＭＶＱＹＩＹＫＹＴＳＹＰＤＰＩＬＬＭＫＳＡＲＮＳＣＷＳＫＤＡＥＹＧＬＹＳＩＹＱＧＧＩＦＥＬＫＥＮＤＲＩＦＶＳＶＴＮＥＨＬＩＤＭＤＨＥＡＳＦＦＧＡＦＬＶＧ。

【0113】

このような実施形態では、修飾型ＴＲＡＩＬ剤は、アミノ酸位置Ｔ１２７－Ｒ１３２、Ｅ１４４－Ｒ１４９、Ｅ１５５－Ｈ１６１、Ｙ１８９－Ｙ２０９、Ｔ２１４－１２２０、Ｋ２２４－Ａ２２６、Ｗ２３１、Ｅ２３６－Ｌ２３９、Ｅ２４９－Ｋ２５１、Ｔ２６１－Ｈ２６４、およびＨ２７０－Ｅ２７１において突然変異を含み得る（ヒト配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３８０１、バージョン１０ＮＰ＿００３８０１．１、ＧＩ：４５０７５９３に基づく番号付け；上記を参照されたい）。

【0114】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はインターロイキンである。一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＩＬ－１である。一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１αまたはＩＬ－１βである。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１Ｒ１および／またはＩＬ－１ＲＡｃＰに対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１Ｒ１および／またはＩＬ－１ＲＡｃＰに対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１Ｒ２対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１Ｒ２に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の修飾型ＩＬ－１剤は、ＩＬ－１Ｒ２での相互作用を回避し、したがって、治療剤のデコイおよび／またはシンクとしてのその機能を実質的に低下させる。

【0115】

一実施形態では、野生型ＩＬ－１βは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＩＬ－１β（成熟形態、野生型）
ＡＰＶＲＳＬＮＣＴＬＲＤＳＱＱＫＳＬＶＭＳＧＰＹＥＬＫＡＬＨＬＱＧＱＤＭＥＱＱＶＶＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳＡＱＦＰＮＷＹＩＳＴＳＱＡＥＮＭＰＶＦＬＧＧＴＫＧＧＱＤＩＴＤＦＴＭＱＦＶＳＳ。

【0116】

ＩＬ１は、炎症誘発性サイトカインであり、重要な免疫系調節因子である。これはＣＤ４ Ｔ細胞応答の強力な活性化因子であり、Ｔｈ１７細胞の割合を増加させ、ＩＦＮγおよびＩＬ－４産生細胞の拡大を増加させる。ＩＬ－１はまた、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の強力な調節因子であり、抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の拡大、分化、周辺および記憶への移動を促す。ＩＬ－１受容体は、ＩＬ－１Ｒ１およびＩＬ－１Ｒ２を含む。ＩＬ－１Ｒ１への結合およびＩＬ－１Ｒ１を介したシグナル伝達は、ＩＬ－１がその生物学的（および病的）活動の多くを媒介するメカニズムを構成する。ＩＬ－１Ｒ２はデコイ受容体として機能し、これによりＩＬ－１Ｒ１を介する相互作用およびシグナル伝達のＩＬ－１の利用可能性を低下させることができる。

【0117】

いくつかの実施形態では、修飾型ＩＬ－１は、ＩＬ－１Ｒ１に対して低下した親和性および／または活性（例えばアゴニスト活性）を有する。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＬ－１は、ＩＬ－１Ｒ２に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。このような実施形態では、ＩＬ－Ｒ２において回復可能なＩＬ－１／ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達、および治療用キメラの消失の防止、このために、必要とされるＩＬ－１の用量の減少（例えば、ＩＬ－Ｒ１については、野生型または弱化突然変異のみを有するキメラと比較して）が存在する。このような構築物は、例えば、抗癌応答を増やすために免疫系を刺激することを含む、癌の治療方法における使用を見出している。

【0118】

いくつかの実施形態では、修飾型ＩＬ－１は、ＩＬ－１Ｒ１に対して低下した親和性および／または活性（例えば、アンタゴニスト活性、例えば天然アンタゴニスト活性または１つ以上の突然変異の結果であるアンタゴニスト活性、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／００７５２０号を参照されたい）を有する。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＬ－１は、ＩＬ－１Ｒ２に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。このような実施形態では、ＩＬ－Ｒ２において回復可能でないＩＬ－１／ＩＬ－１Ｒ１シグナル伝達、および治療用キメラの消失の防止、このために、必要とされるＩＬ－１の用量の減少（例えば、ＩＬ－Ｒ１については、野生型または弱化突然変異のみを有するキメラと比較して）が存在する。

【0119】

こうした実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、アミノ酸５２～５４の欠失を有し、Ｉ型ＩＬ－１Ｒに対して低下した結合親和性、および低下した生物学的活性を有する修飾型ＩＬ－１βを産生する。例えば、その全内容が、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第１９９４／０００４９１号を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＬ－１βは、Ａ１１７Ｇ／Ｐ１１８Ｇ、Ｒ１２０Ｘ、Ｌ１２２Ａ、Ｔ１２５Ｇ／Ｌ１２６Ｇ、Ｒ１２７Ｇ、Ｑ１３０Ｘ、Ｑ１３１Ｇ、Ｋ１３２Ａ、Ｓ１３７Ｇ／Ｑ１３８Ｙ、Ｌ１４５Ｇ、Ｈ１４６Ｘ、Ｌ１４５Ａ／Ｌ１４７Ａ、Ｑ１４８Ｘ、Ｑ１４８Ｇ／Ｑ１５０Ｇ、Ｑ１５０Ｇ／Ｄ１５１Ａ、Ｍ１５２Ｇ、Ｆ１６２Ａ、Ｆ１６２Ａ／Ｑ１６４Ｅ、Ｆ１６６Ａ、Ｑ１６４Ｅ／Ｅ１６７Ｋ、Ｎ１６９Ｇ／Ｄ１７０Ｇ、Ｉ１７２Ａ、Ｖ１７４Ａ、Ｋ２０８Ｅ、Ｋ２０９Ｘ、Ｋ２０９Ａ／Ｋ２１０Ａ、Ｋ２１９Ｘ、Ｅ２２１Ｘ、Ｅ２２１ Ｓ／Ｎ２２４Ａ、Ｎ２２４Ｓ／Ｋ２２５Ｓ、Ｅ２４４Ｋ、Ｎ２４５Ｑから選択される１つ以上の置換突然変異を有し（Ｘは、アミノ酸の任意の変化（例えば、非保存的変化）であってもよい）、ＩＬ－１Ｒに対して低下した結合を呈する。これらは、例えば、それらの全内容が参照により組み込まれる国際公開第２０１５／００７５４２号および国際公開第２０１５／００７５３６号に記載されているとおりである（ヒトＩＬ－１β配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５６７、バージョンＮＰ－０００５６７．１、ＧＩ：１０８３５１４５に基づく番号付け）。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＬ－１βは、Ｒ１２０Ａ、Ｒ１２０Ｇ、Ｑ１３０Ａ、Ｑ１３０Ｗ、Ｈ１４６Ａ、Ｈ１４６Ｇ、Ｈ１４６Ｅ、Ｈ１４６Ｎ、Ｈ１４６Ｒ、Ｑ１４８Ｅ、Ｑ１４８Ｇ、Ｑ１４８Ｌ、Ｋ２０９Ａ、Ｋ２０９Ｄ、Ｋ２１９Ｓ、Ｋ２１９Ｑ、Ｅ２２１Ｓ、およびＥ２２１Ｋから選択される１つ以上の突然変異を有し得る。

【0120】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＩＬ－２である。このような実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－２Ｒα、および／またはＩＬ－２Ｒβ、および／またはＩＬ－２Ｒγに対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２Ｒγについては、低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－２Ｒαに対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。このような実施形態は、例えば、修飾型ＩＬ－２がＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２Ｒγにおいてアゴニストである場合、癌の治療に関連し得る。例えば、本発明の構築物は、ＩＬ－２受容体βおよびγを有する、活性化が弱化されたＣＤ８^＋Ｔ細胞（抗腫瘍効果を提供し得る）を好み、ＩＬ２受容体α、β、γを有するＴ_ｒｅｇ（免疫抑制性、前腫瘍効果を提供し得る）を好まないことがある。さらに、いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ＲαよりもＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２Ｒγを選択することで、肺水腫などのＩＬ－２の副作用が回避される。また、例えば、ＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２Ｒγにおいて、修飾型ＩＬ－２がアンタゴニスト（例えば、天然のアンタゴニスト作用または１つ以上の突然変異の結果であるアンタゴニスト作用、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／００７５２０号を参照されたい）である場合、ＩＬ－２ベースのキメラは、疾患の治療に有用である。例えば、本発明の構築物は、ＩＬ２受容体βおよびγを有する、抑制が弱化した（したがって、免疫応答を弱める）ＣＤ８^＋Ｔ細胞を好み、ＩＬ２受容体α、βおよびγを有するＴ_ｒｅｇを好まない場合もある。あるいは、いくつかの実施形態では、ＩＬ－２を担持するキメラは、Ｔ_ｒｅｇの活性化、したがって免疫抑制を好み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化を好まない。例えば、これらの構築物では、免疫抑制の有益性を受けるであろう疾患（複数可）の治療での使用が見出されている。

【0121】

いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ならびにＩＬ－２Ｒβおよび／もしくはＩＬ－２Ｒγについては、低下した親和性および／もしくは活性を有し、かつ／またはＩＬ－２Ｒαについては実質的に低下もしくは消失した親和性および／もしくは活性を有する修飾型ＩＬ－２剤に向けられた本明細書に記載の標的化部分を有する。いくつかの実施形態では、これらの構築物は、標的化ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性を提供し、これらは、Ｔ_ｒｅｇ細胞に対して一般に不活性である（または実質的に低下した活性を有する）。いくつかの実施形態では、このような構築物は、野生型ＩＬ－２と比較して、（例えば、理論に拘束されることを望むものではないが、Ｔｒｅｇを刺激しないことによって）向上した免疫刺激効果を有し、かつＩＬ－２に関連する全身毒性を排除または減少させる。

【0122】

一実施形態では、野生型ＩＬ－２は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＩＬ－２（成熟形態、野生型）
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ。

【0123】

このような実施形態では、修飾型ＩＬ－２剤は、アミノ酸Ｌ７２（Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、またはＬ７２Ｋ）、Ｆ４２（Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、またはＦ４２Ｋ）、およびＹ４５（Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、またはＹ４５Ｋ）において１つ以上の突然変異を有する。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの修飾型ＩＬ－２剤は、野生型ＩＬ－２と比較して、高親和性ＩＬ－２受容体に対して、低下した親和性を有し、中程度の親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性を保存していると考えられている。例えば、その全内容が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０２４４１１２号を参照されたい。

【0124】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＩＬ－３である。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、共通ベータ（ベータｃまたはＣＤ１３１）サブユニットと対になるユニークなアルファ鎖を有するヘテロ二量体であるＩＬ－３受容体に対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、共通ベータ（ベータｃまたはＣＤ１３１）サブユニットと対になるユニークなアルファ鎖を有するヘテロ二量体であるＩＬ－３受容体に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。

【0125】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＩＬ－４である。このような実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、１型および／または２型ＩＬ－４受容体に対して低下した親和性および／または活性を有する。このような実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、１型および／または２型ＩＬ－４受容体に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。１型ＩＬ－４受容体は、共通のγ鎖を有するＩＬ－４Ｒαサブユニットから構成され、ＩＬ－４に特異的に結合する。２型ＩＬ－４受容体は、ＩＬ－１３Ｒα１として公知である異なるサブユニットに結合したＩＬ－４Ｒαサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、２型ＩＬ－４受容体に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。

【0126】

一実施形態では、野生型ＩＬ－４は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＩＬ－４（成熟形態、野生型）
ＨＫＣＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＬＴＥＱＫＴＬＣＴＥＬＴＶＴＤＩＦＡＡＳＫＮＴＴＥＫＥＴＦＣＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳＨＨＥＫＤＴＲＣＬＧＡＴＡＱＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＬＡＧＬＮＳＣＰＶＫＥＡＮＱＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫＣＳＳ。

【0127】

このような実施形態では、修飾型ＩＬ－４剤は、アミノ酸Ｒ１２１（Ｒ１２１Ａ、Ｒ１２１Ｄ、Ｒ１２１Ｅ、Ｒ１２１Ｆ、Ｒ１２１Ｈ、Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１２１Ｋ、Ｒ１２１Ｎ、Ｒ１２１Ｐ、Ｒ１２１Ｔ、Ｒ１２１Ｗ）、Ｅ１２２（Ｅ１２２Ｆ）、Ｙ１２４（Ｙ１２４Ａ、Ｙ１２４Ｑ、Ｙ１２４Ｒ、Ｙ１２４Ｓ、Ｙ１２４Ｔ）、およびＳ１２５（Ｓ１２５Ａ）において１つ以上の突然変異を有する。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの修飾型ＩＬ－４剤は、Ｉ型受容体によって媒介される活性を維持するが、他の受容体によって媒介される生物学的活性を有意に低下させると考えられる。例えば、その全内容が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４３３，１５７号を参照されたい。

【0128】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＩＬ－６である。ＩＬ－６は、リガンド結合ＩＬ－６Ｒ鎖（ＣＤ１２６）およびシグナル伝達成分ｇｐ１３０など、細胞表面Ｉ型サイトカイン受容体複合体を介してシグナル伝達する。ＩＬ－６はまた、ＩＬ－６Ｒの細胞外部分である可溶性形態のＩＬ－６Ｒ（ｓＩＬ－６Ｒ）にも結合し得る。ｓＩＬ－６Ｒ／ＩＬ－６複合体は、神経突起伸長およびニューロンの生存に関与していると考えられ、したがって、髄鞘再成による神経再生において重要であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－６Ｒ／ｇｐ１３０および／またはｓＩＬ－６Ｒに対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－６Ｒ／ｇｐ１３０および／またはｓＩＬ－６Ｒに対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。

【0129】

一実施形態では、野生型ＩＬ－６は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＩＬ－６（成熟形態、野生型）
ＡＰＶＰＰＧＥＤＳＫＤＶＡＡＰＨＲＱＰＬＴＳＳＥＲＩＤＫＱＩＲＹＩＬＤＧＩＳＡＬＲＫＥＴＣＮＫＳＮＭＣＥＳＳＫＥＡＬＡＥＮＮＬＮＬＰＫＭＡＥＫＤＧＣＦＱＳＧＦＮＥＥＴＣＬＶＫＩＩＴＧＬＬＥＦＥＶＹＬＥＹＬＱＮＲＦＥＳＳＥＥＱＡＲＡＶＱＭＳＴＫＶＬＩＱＦＬＱＫＫＡＫＮＬＤＡＩＴＴＰＤＰＴＴＮＡＳＬＴＴＫＬＱＡＱＮＱＷＬＱＤＭＴＴＨＬＩＬＲＳＦＫＥＦＬＱＳＳＬＲＡＬＲＱＭ。

【0130】

このような実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、アミノ酸５８、１６０、１６３、１７１または１７７において１つ以上の突然変異を有する。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの修飾型ＩＬ－６剤は、ＩＬ－６Ｒαに対する結合親和性の低下、および生物活性の低下を呈すると考えられている。例えば、その全内容が、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９７／１０３３８号を参照されたい。

【0131】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＩＬ－１０である。このような実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１０受容体－１およびＩＬ－１０受容体－２に対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１０受容体－１およびＩＬ－１０受容体－２に対して実質的に低下した親和性および／または活性を有する。

【0132】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＩＬ－１１である。このような実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１１Ｒαおよび／またはＩＬ－１１Ｒβおよび／またはｇｐ１３０に対して低下した親和性および／または活性を有する。このような実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１１Ｒαおよび／またはＩＬ－１１Ｒβおよび／またはｇｐ１３０に対して、消失しまたは実質的に低下した親和性および／または活性を有する。

【0133】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＩＬ－１２である。このような実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１２Ｒ－β１および／またはＩＬ－１２Ｒ－β２に対して低下した親和性および／または活性を有する。このような実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１２Ｒ－β１および／またはＩＬ－１２Ｒ－β２に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。

【0134】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＩＬ－１３である。このような実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－４受容体（ＩＬ－４Ｒα）およびＩＬ－１３Ｒα１に対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－４受容体（ＩＬ－４Ｒα）またはＩＬ－１３Ｒα１に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。

【0135】

一実施形態では、野生型ＩＬ－１３は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＩＬ－１３（成熟形態、野生型）
ＳＰＧＰＶＰＰＳＴＡＬＲＥＬＩＥＥＬＶＮＩＴＱＮＱＫＡＰＬＣＮＧＳＭＶＷＳＩＮＬＴＡＧＭＹＣＡＡＬＥＳＬＩＮＶＳＧＣＳＡＩＥＫＴＱＲＭＬＳＧＦＣＰＨＫＶＳＡＧＱＦＳＳＬＨＶＲＤＴＫＩＥＶＡＱＦＶＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＲＦＮ。

【0136】

このような実施形態では、修飾型ＩＬ－１３剤は、アミノ酸１３、１６、１７、６６、６９、９９、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１２、１１３、および１１４に１つ以上の突然変異を有する。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの修飾型ＩＬ－１３剤は低下した生物活性を呈すると考えられる。例えば、その全内容が、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００２／０１８４２２号を参照されたい。

【0137】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＩＬ－１８である。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１８Ｒαおよび／またはＩＬ－１８Ｒβに対しては、低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＩＬ－１８Ｒαおよび／またはＩＬ－１８Ｒβに対しては、実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、シグナル伝達に必要なＴＩＲドメインが欠失しているＩＬ－１８ＲαのアイソフォームであるＩＬ－１８ＲαＩＩ型に対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。

【0138】

一実施形態では、野生型ＩＬ－１８は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＩＬ－１８（野生型）
ＭＡＡＥＰＶＥＤＮＣＩＮＦＶＡＭＫＦＩＤＮＴＬＹＦＩＡＥＤＤＥＮＬＥＳＤＹＦＧＫＬＥＳＫＬＳＶＩＲＮＬＮＤＱＶＬＦＩＤＱＧＮＲＰＬＦＥＤＭＴＤＳＤＣＲＤＮＡＰＲＴＩＦＩＩＳＭＹＫＤＳＱＰＲＧＭＡＶＴＩＳＶＫＣＥＫＩＳＴＬＳＣＥＮＫＩＩＳＦＫＥＭＮＰＰＤＮＩＫＤＴＫＳＤＩＩＦＦＱＲＳＶＰＧＨＤＮＫＭＱＦＥＳＳＳＹＥＧＹＦＬＡＣＥＫＥＲＤＬＦＫＬＩＬＫＫＥＤＥＬＧＤＲＳＩＭＦＴＶＱＮＥＤＬ。

【0139】

このような実施形態では、修飾型ＩＬ－１８剤は、これらの全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／００７５４２号に記載のとおり、Ｙ３７－Ｋ４４、Ｒ４９－Ｑ５４、Ｄ５９－Ｒ６３、Ｅ６７－Ｃ７４、Ｒ８０、Ｍ８７－Ａ９７、Ｎ１２７－Ｋ１２９、Ｑ１３９－Ｍ１４９、Ｋ１６５－Ｋ１７１、Ｒ１８３、およびＱ１９０－Ｎ１９１から選択されるアミノ酸、またはアミノ酸領域において、１つ以上の突然変異を含んでもよい（ヒトＩＬ－１８配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＶ３８６９７、バージョンＡＡＶ３８６９７．１、ＧＩ：５４６９６６５０に基づく番号付け）。

【0140】

一実施形態では、修飾型シグナル伝達剤はＩＬ－３３である。このような実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＳＴ－２受容体およびＩＬ－１ＲＡｃＰに対して低下した親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾型シグナル伝達剤は、ＳＴ－２受容体およびＩＬ－１ＲＡｃＰに対して実質的に低下または消失した親和性および／または活性を有する。

【0141】

一実施形態では、野生型ＩＬ－３３は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＫＰＫＭＫＹＳＴＮＫＩＳＴＡＫＷＫＮＴＡＳＫＡＬＣＦＫＬＧＫＳＱＱＫＡＫＥＶＣＰＭＹＦＭＫＬＲＳＧＬＭＩＫＫＥＡＣＹＦＲＲＥＴＴＫＲＰＳＬＫＴＧＲＫＨＫＲＨＬＶＬＡＡＣＱＱＱＳＴＶＥＣＦＡＦＧＩＳＧＶＱＫＹＴＲＡＬＨＤＳＳＩＴＧＩＳＰＩＴＥＹＬＡＳＬＳＴＹＮＤＱＳＩＴＦＡＬＥＤＥＳＹＥＩＹＶＥＤＬＫＫＤＥＫＫＤＫＶＬＬＳＹＹＥＳＱＨＰＳＮＥＳＧＤＧＶＤＧＫＭＬＭＶＴＬＳＰＴＫＤＦＷＬＨＡＮＮＫＥＨＳＶＥＬＨＫＣＥＫＰＬＰＤＱＡＦＦＶＬＨＮＭＨＳＮＣＶＳＦＥＣＫＴＤＰＧＶＦＩＧＶＫＤＮＨＬＡＬＩＫＶＤＳＳＥＮＬＣＴＥＮＩＬＦＫＬＳＥＴ。

【0142】

このような実施形態では、修飾型ＩＬ－３３剤は、その全内容が、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／００７５４２号に記載されるように、Ｉ１１３－Ｙ１２２、Ｓ１２７－Ｅ１３９、Ｅ１４４－Ｄ１５７、Ｙ１６３－Ｍ１８３、Ｅ２００、Ｑ２１５、Ｌ２２０－Ｃ２２７、およびＴ２６０－Ｅ２６９から選択されるアミノ酸またはアミノ酸領域に１つ以上の突然変異を含み得る（ヒト配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２５４２７４、バージョンＮＰ＿２５４２７４．１、ＧＩ：１５５５９２０９に基づく番号付け）。

【0143】

一実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）ＣＤ２０に対する標的化部分、および（ｉｉ）腫瘍細胞に対して向けられている標的化部分を、本明細書に記載の修飾型または突然変異シグナル剤のいずれかと共に有する。一実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍細胞上のＣＤ２０に対する標的化部分およびＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に対する第２の標的化部分を有する。

【0144】

シグナル伝達剤との多重特異性キメラおよび融合物
様々な実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、本明細書に記載の１種以上のシグナル伝達剤、および／または１つ以上の追加の標的化部分とのキメラまたは融合物の一部である。したがって、本出願は、１種以上のシグナル伝達剤およびＣＤ２０に対する標的化部分、および／または１つ以上の追加の標的化部分を含むキメラまたは融合タンパク質を提供する。

【0145】

様々な実施形態では、本出願のキメラタンパク質は、２つの異なる細胞（例えば、シナプスを作製するため）または同じ細胞（例えば、より濃縮されたシグナル伝達剤効果を得るため）を標的とする標的化部分を有する。

【0146】

様々な実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は多重特異性であり、すなわち、ＣＤ２０結合剤は、２つ以上の標的（例えば、抗原、または受容体、またはエピトープ）を認識して結合する認識ドメイン（例えば、抗原認識ドメイン）を有する２つ以上の標的化部分を含む。このような実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、同じ抗原上、または異なる抗原上、または異なる受容体上の２つ以上のエピトープを認識して結合する認識ドメインを有する２つ以上の標的化部分を含み得る。様々な実施形態では、このような多重特異性ＣＤ２０結合剤は、結合力の増大および／または選択性の改善などの有利な特性を呈する。一実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、２つの標的化部分を含み、二重特異性であり、すなわち、同じ抗原上、または異なる抗原、または異なる受容体上の２つのエピトープに結合し、認識する。

【0147】

様々な実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、２つ以上の標的化部分を含み、各標的化部分は、本明細書に記載の抗体または抗体誘導体である。一実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０に対する抗原認識ドメインを含む少なくとも１つのＶＨＨ、および腫瘍抗原または免疫細胞に対する認識ドメインを含む１つの抗体または抗体誘導体を含む。

【0148】

様々な実施形態では、本発明の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、異なる抗原または受容体を標的とする２つ以上の標的化部分を有し、一方の標的化部分は、その抗原または受容体に対して弱化されてもよく、例えば、標的化部分は、低い親和性または結合力でその抗原または受容体に結合する（例えば、その抗原または受容体に対して、他の標的化部分が有する親和性または結合力よりも低い親和性または結合力であり、例えば、結合親和性の差は、約１０倍、または２５倍、または５０倍、または１００倍、または３００倍、または５００倍、または１０００倍、または５０００倍であってもよく、例えば、より低い親和性または結合力では、標的化部分は、中程度～高程度のｎＭ、または低～中程度のμＭの範囲のＫ_Ｄでその抗原または受容体に結合し得、より高い親和性または結合力では、標的化部分は、中程度～高程度のｐＭまたは低～中程度のｎＭの範囲のＫ_Ｄでその抗原または受容体に結合し得る）。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）抗原または受容体に向けられている弱化された標的化部分を含む。これにより、（例えば、他の標的化部分を介して）目的の細胞への標的化を改善し、治療のために標的化されていないものなど、複数のタイプの細胞にわたる影響を防ぐことができる（例えば、これらの実施形態において提供されるものよりも高い親和性で無差別抗原または受容体を結合することによる）。

【0149】

本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、当該分野で公知の方法を用いて構築され得る。例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，０６７，９９１号、米国特許公開第２０１１０２６２３４８号、および国際公開第２００４／０４１８６２号を参照されたい。例示的な実施形態では、２つ以上の標的化部分を含む本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、化学的架橋により、例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４，１５１７－１５２４および、この全内容が参照により組み込まれる欧州特許明細書第２９４７０３号に記載されているとおり、アミノ酸残基を有機誘導体化剤と反応させることにより、構築され得る。別の例示的な実施形態では、２つ以上の標的化部分を含む多重特異性ＣＤ２０結合剤は、遺伝子融合、すなわち個々の標的化部分のポリペプチドを含む単一のポリペプチドを構築することによって構築される。例えば、ＣＤ２０に対する抗原認識ドメインを有する第１のＶＨＨおよび腫瘍抗原に対する認識ドメインを有する第２の抗体または抗体誘導体をコードする単一のポリペプチド構築物を形成することができる。二価または多価ＶＨＨポリペプチド構築物を産生する方法は、国際特許出願第９６／３４１０３号に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。さらなる例示的な実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、リンカーを用いて構築され得る。例えば、ＣＤ２０に対する抗原認識ドメインを有する第１のＶＨＨのカルボキシ末端は、腫瘍抗原に対する認識ドメインを有する第２の抗体または抗体誘導体のアミノ末端に（またはその逆に）連結され得る。使用され得る例示的なリンカーが本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤の成分は、リンカーを使用せずに互いに直接的に連結される。

【0150】

様々な実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、ＣＤ２０および１つ以上の免疫細胞上に見出される１つ以上の抗原を認識してこれらに結合する。これらの結合剤としては、これらに限定するものではないが、巨核球、血小板、赤血球、肥満細胞、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞）、Ｂリンパ球、形質細胞、樹状細胞、またはそのサブセットが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、目的の抗原に特異的に結合し、効果的に直接的に、または間接的に１つ以上の免疫細胞を動員する。例示的な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、免疫細胞（例えば、樹状細胞）を作用部位（例えば、これに限定するものではないが、腫瘍微小環境など）に直接的に、または間接的に動員することができる。

【0151】

様々な実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、癌細胞または腫瘍細胞上に見出されるＣＤ２０および１つ以上の抗原を認識して結合する。これらの実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、癌細胞または腫瘍細胞（すなわち、ＣＤ２０および別の癌抗原または腫瘍抗原）上の２つ以上の抗原に結合することにより、ＣＤ２０陽性癌細胞または腫瘍細胞に対して増強された選択性を有し得る。

【0152】

いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、腫瘍の免疫攻撃のために免疫細胞のバランスをシフトさせることを伴う方法で使用することができるか、またはその使用を見出すことができる。例えば、本発明のＣＤ２０結合剤は、腫瘍（例えば、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗腫瘍マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）、Ｂ細胞、樹状細胞、および腫瘍を保護する細胞とは対照的なもの（例えば、骨髄球由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）；腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、またはそれらのサブセット）を死滅させる、かつ／または抑制することができる細胞のために、臨床的に重要な部位における免疫細胞の割合をシフトさせることができる。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、エフェクターＴ細胞と調節性Ｔ細胞との比を増加させることができる。

【0153】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、癌細胞または腫瘍細胞に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、腫瘍細胞を直接的に、または間接的に動員する。例えば、いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の動員は、腫瘍細胞を死滅させる、かつ／または抑制することができる１つ以上のエフェクター細胞（例えば、本明細書に記載の免疫細胞）に対するものである。

【0154】

腫瘍細胞または癌細胞とは、細胞もしくは組織の制御不能な増殖、ならびに／または身体の器官および系の正常な機能を妨害する、異常に増大した細胞生存率および／もしくはアポトーシスの阻害を指す。例えば、腫瘍細胞としては、良性および悪性の癌、ポリープ、過形成、ならびに休眠腫瘍または微小転移が挙げられる。例示的な腫瘍細胞としては、これらに限定するものではないが、以下の細胞が挙げられる：基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳および中枢神経系の癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸および直腸癌；結合組織癌；消化器系癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌（胃腸癌を含む）；神経膠芽細胞腫；肝癌；肝細胞癌；上皮内新生物；腎癌；喉頭癌；白血病；肝癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌）；メラノーマ；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（口唇、舌、口、および咽頭）；卵巣癌；膵癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系癌；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮細胞癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮または子宮内膜癌；泌尿器系癌；外陰部癌；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）など）；小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性／濾胞性ＮＨＬ；中悪性びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性小非切断細胞ＮＨＬ； 巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ならびにワルデンストレームマクログロブリン血症 ；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；他の癌腫および肉腫；および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）ならびにファコマトーシスに伴う異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）、ならびにメイグス症候群。

【0155】

腫瘍細胞、または癌細胞には、これに限定されるものではないが、癌腫、例えば様々なサブタイプ、例えば、腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、および移行上皮癌など）、肉腫（例えば、骨および軟部組織など）、白血病（例えば、急性骨髄性、急性リンパ芽球性、慢性骨髄性、慢性リンパ球性、ヘアリー細胞など）、リンパ腫および骨髄腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、軽鎖、非分泌型、ＭＧＵＳ、および形質細胞腫など）、ならびに中枢神経系の癌（例えば、脳（例えば神経膠腫（例えば、星状細胞腫、乏突起膠腫、および上衣腫）、髄膜腫、下垂体腺腫、神経腫など、ならびに脊髄腫瘍（例えば、髄膜腫および神経線維腫）が挙げられる。

【0156】

特定の実施形態では、癌または腫瘍細胞は、以下の細胞などの白血病細胞またはリンパ腫細胞を指す：Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、リンパ球優勢なサブタイプのホジキンリンパ腫、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、低程度、中程度および高程度ＦＬなどの濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、および未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）。

【0157】

例示的な腫瘍抗原としては、これらに限定するものではないが、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）－００１７－１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびその免疫原性エピトープＣＡＰ－１およびＣＡＰ－２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）およびその免疫原性エピトープＰＳＡ－１、ＰＳＡ－２、およびＰＳＡ－３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３－ゼータ鎖、ＭＡＧＥファミリー腫瘍抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２（ＭＡＧＥ－Ｂ２）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３（ＭＡＧＥ－Ｂ３）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４（ＭＡＧＥ－Ｂ４）、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｃ４、ＭＡＧＥ－Ｃ５）、ＧＡＧＥファミリー腫瘍抗原（例えば、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＧＡＧＥ－８、ＧＡＧＥ－９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、ＮＡＧ、ＧｎＴ－Ｖ、ＭＵＭ－１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α－フェトプロテイン、Ｅ－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニンおよびγ－カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００ Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｃｄｃ２７、腺腫様ポリポーシス大腸菌タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネクシン３７、Ｉｇ－イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産物、Ｓｍａｄファミリー腫瘍抗原、ｌｍｐ－１、ＮＡ、ＥＢＶコード化核抗原（ＥＢＮＡ）－１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１ ＣＴ－７、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、ＡＧＳ１６、ＭＵＣ１、ＧＰＮＭＢ、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、およびＰＭＳＡが挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの腫瘍細胞抗原の１つ以上に結合する標的化部分を含む。

【0158】

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、腫瘍細胞上のＣＤ２０および抗原を認識してこれに結合する。いくつかの実施形態では、多特異的ＣＤ２０結合剤は、免疫細胞を直接的に、または間接的に腫瘍細胞または腫瘍微小環境に動員する。

【0159】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、Ｔ細胞に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、Ｔ細胞を直接的に、または間接的に動員する。一実施形態では、抗原認識ドメインはエフェクターＴ細胞に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、例えばいくつかの実施形態では、治療部位（例えば、１つ以上の疾患細胞または治療効果のために調節される細胞を有する座位）に、エフェクターＴ細胞を直接的に、または間接的に動員する。例示的なエフェクターＴ細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、αβＴＣＲ、ＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋、ＣＤ４５ＲＯ^＋）；ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβＴＣＲ、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、ＣＣＲ７^＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ－７Ｒ／ＣＤ１２７^＋）；ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβＴＣＲ、ＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋、ＣＣＲ７^＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＩＬ－７Ｒ／ＣＤ１２７^＋）；エフェクターメモリーＴ細胞（例えば、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ、ＣＤ４４^＋、ＴＣＲ、ＣＤ３^＋、ＩＬ－７Ｒ／ＣＤ１２７^＋、ＩＬ－１５Ｒ^＋、ＣＣＲ７ｌｏｗ）；セントラルメモリーＴ細胞（例えば、ＣＣＲ７^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＤ２７^＋；またはＣＣＲ７ｈｉ、ＣＤ４４^＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＴＣＲ、ＣＤ３^＋、ＩＬ－７Ｒ／ＣＤ１２７^＋、ＩＬ－１５Ｒ^＋）；ＣＤ６２Ｌ^＋エフェクターＴ細胞；初期エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ２７^＋ＣＤ６２Ｌ^－）および後期エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ２７^－ＣＤ６２Ｌ^－）（それぞれ、ＴｅｍＥおよびＴｅｍＬ）などのＣＤ８^＋エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）；ＣＤ１２７（^＋）ＣＤ２５（低／－）エフェクターＴ細胞；ＣＤ１２７（^－）ＣＤ２５（^－）エフェクターＴ細胞；ＣＤ８^＋幹細胞メモリーエフェクター細胞（ＴＳＣＭ）（例えば、ＣＤ４４（低）ＣＤ６２Ｌ（高）ＣＤ１２２（高）ｓｃａ（^＋））；ＴＨ１エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＸＣＲ３^＋、ＣＸＣＲ６^＋およびＣＣＲ５^＋；またはαβＴＣＲ、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、ＩＬ－１２Ｒ^＋、ＩＬ－ＩＦＮγＲ^＋、ＣＸＣＲ３^＋）、ＴＨ２エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＣＲ３^＋、ＣＣＲ４^＋およびＣＣＲ８^＋；またはαβＴＣＲ、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、ＩＬ－４Ｒ^＋、ＩＬ－３３Ｒ^＋、ＣＣＲ４^＋、ＩＬ－１７ＲＢ^＋、ＣＲＴＨ２^＋）；ＴＨ９エフェクターＴ細胞（例えば、αβＴＣＲ、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋）；ＴＨ１７エフェクターＴ細胞（例えば、αβＴＣＲ、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、ＩＬ－２３Ｒ^＋、ＣＣＲ６^＋、ＩＬ－１Ｒ^＋）；ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＣＲ７^＋エフェクターＴ細胞、ＩＣＯＳ^＋エフェクターＴ細胞；ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＣＲ７（^－）エフェクターＴ細胞；ＩＬ－２、ＩＬ－４および／またはＩＦＮ－γを分泌するエフェクターＴ細胞が挙げられる。

【0160】

目的の例示的なＴ細胞抗原には、例えば（適用可能であれば細胞外ドメインを含む）：ＣＤ８、ＣＤ３、ＳＬＡＭＦ４、ＩＬ－２Ｒα、４－１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＩＬ－２Ｒβ、ＡＬＣＡＭ、Ｂ７－１、ＩＬ－４Ｒ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＬ－６Ｒ、ＣＣＲ３、ＩＬ－７Ｒα、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲｌ／ＩＬ－ＳＲＡ、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＩＬ－１０Ｒα、ＣＣＲ７、ＩＬ－ｌ０Ｒβ、ＣＣＲＳ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＣＣＲ９、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＣＤ２、ＩＬ－１３Ｒα１、ＩＬ－１３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＩＬＴ２／ＣＤＳ５ｊ、ＩＬＴ３／ＣＤＳ５ｋ、ＩＬＴ４／ＣＤＳ５ｄ、ＩＬＴ５／ＣＤＳ５ａ、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、ＣＤＳ、インテグリンαＥ／ＣＤ１０３、ＣＤ６、インテグリンαＭ／ＣＤ１１ｂ、ＣＤＳ、インテグリンαＸ／ＣＤ１１ｃ、インテグリンβ２／ＣＤｌＳ、ＫＩＲ／ＣＤ１５Ｓ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＣＤ２Ｓ、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦＳ、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５Ｓｄ、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＬＡＧ－３、ＣＤ４３、ＬＡＩＲ１、ＣＤ４５、ＬＡＩＲ２、ＣＤＳ３、ロイコトリエンＢ４－Ｒ１、ＣＤＳ４／ＳＬＡＭＦ５、ＮＣＡＭ－Ｌ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９７、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＮＴ－４、ＣＤ６９、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、共通γ鎖／ＩＬ－２Ｒγ、オステオポンチン、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＰＤ－１、ＣＲＴＡＭ、ＰＳＧＬ－１、ＣＴＬＡ－４、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸ３ＣＬ１、Ｌ－セレクチン、ＣＸＣＲ３、ＳＩＲＰβ１、ＣＸＣＲ４、ＳＬＡＭ、ＣＸＣＲ６、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ－１、ＤＮＡＭ－１、サイモポイエチン、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、ＴＩＭ－１、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－２、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＩＭ－３、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＴＩＭ－４、ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ＴＩＭ－６、ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、グラニュライシン、ＴＮＦＲＩＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＲＡＩＬＲI／ＴＮＦＲＳＦｌＯＡ、ＩＣＡＭ－１／ＣＤ５４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＩＣＡＭ－２／ＣＤ１０２、ＴＲＡＩＬＲ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＩＦＮ－γＲ１、ＴＲＡＩＬＲ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＩＦＮ－γＲ２、ＴＳＬＰ、ＩＬ－１Ｒ１およびＴＳＬＰＲが挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの例示的なＴ細胞抗原のうちの１つ以上に結合する標的化部分を含む。

【0161】

非限定的な例として、様々な実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、Ｔ細胞、例えばＰＤ－１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３、およびＡ２ａＲのうちの１つ以上などに発現するチェックポイントマーカーに対して向けられる標的化部分を有する。

【0162】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、Ｂ細胞に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、例えばいくつかの実施形態では、治療部位（例えば、１つ以上の疾患細胞または治療効果のために調節される細胞を有する座位）に、Ｂ細胞を直接的に、または間接的に動員する。目的の例示的なＢ細胞抗原としては、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ／ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８９、ＣＤ９８、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１３０、ＣＤ１３８、およびＣＤｗ１５０が挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの例示的Ｂ細胞抗原の１つ以上に結合する標的化部分を含む。

【0163】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、ナチュラルキラー細胞に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、例えばいくつかの実施形態では、治療部位（例えば、１つ以上の疾患細胞または治療効果のために調節される細胞を有する座位）に、ナチュラルキラー細胞を直接的に、または間接的に動員する。例示的な目的のナチュラルキラー細胞抗原としては、例えば、ＴＩＧＩＴ、２Ｂ４／ＳＬＡＭＦ４、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ１５５／ＰＶＲ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＤ９４、ＬＭＩＲ１／ＣＤ３００Ａ、ＣＤ６９、ＬＭＩＲ２／ＣＤ３００ｃ、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＬＭＩＲ３／ＣＤ３００ＬＦ、Ｋｉｒ１α、ＤＮＡＭ－１、ＬＭＩＲ５／ＣＤ３００ＬＢ、Ｆｃ－イプシロンＲＩＩ、ＬＭＩＲ６／ＣＤ３００ＬＥ、Ｆｃ－γＲｌ／ＣＤ６４、ＭＩＣＡ、Ｆｃ－γＲＩＩＢ／ＣＤ３２ｂ、ＭＩＣＢ、Ｆｃ－γＲＩＩＣ／ＣＤ３２ｃ、ＭＵＬＴ－１、Ｆｃ－γＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ、ネクチン－２／ＣＤ１１２、Ｆｃ－γＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ａ、ＦｃＲＨ１／ＩＲＴＡ５、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃＲＨ２／ＩＲＴＡ４、ＮＫＧ２Ｄ、ＦｃＲＨ４／ＩＲＴＡ１、ＮＫｐ３０、ＦｃＲＨ５／ＩＲＴＡ２、ＮＫｐ４４、Ｆｃ－受容体様３／ＣＤ１６－２、ＮＫｐ４６／ＮＣＲ１、ＮＫｐ８０／ＫＬＲＦ１、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、Ｒａｅ－１、Ｒａｅ－１α、Ｒａｅ－１β、Ｒａｅ－１δ、Ｈ６０、Ｒａｅ－１イプシロン、ＩＬＴ２／ＣＤ８５ｊ、Ｒａｅ－１γ、ＩＬＴ３／ＣＤ８５ｋ、ＴＲＥＭ－１、ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ、ＴＲＥＭ－２、ＩＬＴ５／ＣＤ８５ａ、ＴＲＥＭ－３、ＫＩＲ／ＣＤ１５８、ＴＲＥＭＬ１／ＴＬＴ－１、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＵＬＢＰ－１、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＵＬＢＰ－２、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５８ｄ、およびＵＬＢＰ－３が挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの例示的ＮＫ細胞抗原の１つ以上に結合する標的化部分を含む。

【0164】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、マクロファージ／単球に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、例えばいくつかの実施形態では、治療部位（例えば、１つ以上の疾患細胞または治療効果のために調節される細胞を有する座位）に、マクロファージ／単球を直接的に、または間接的に動員する。目的の例示的マクロファージ／単球抗原としては、例えば、ＳＩＲＰ１ａ、Ｂ７－１／ＣＤ８０、ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ、Ｂ７－Ｈ１、ＩＬＴ５／ＣＤ８５ａ、共通β鎖、インテグリンα ４／ＣＤ４９ｄ、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、インテグリンα Ｘ／ＣＤｌｌｃ、ＣＣＬ６／Ｃ１０、インテグリンβ ２／ＣＤ１８、ＣＤ１５５／ＰＶＲ、インテグリンβ ３／ＣＤ６１、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１、ラテキシン、ＣＤ３６／ＳＲ－Ｂ３、ロイコトリエンＢ４ Ｒ１、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＬＩＭＰＩＩＩＳＲ－Ｂ２、ＣＤ４３、ＬＭＩＲ１／ＣＤ３００Ａ、ＣＤ４５、ＬＭＩＲ２／ＣＤ３００ｃ、ＣＤ６８、ＬＭＩＲ３／ＣＤ３００ＬＦ、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＬＭＩＲ５／ＣＤ３００ＬＢ、ＣＤ９７、ＬＭＩＲ６／ＣＤ３００ＬＥ、ＣＤ１６３、ＬＲＰ－１、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＭＡＲＣＯ、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＭＤ－１、ＥＣＦ－Ｌ、ＭＤ－２、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、ＭＧＬ２、エンドグリン／ＣＤ１０５、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、Ｆｃ－γ ＲＩ／ＣＤ６４、オステオポンチン、Ｆｃ－γ ＲＩＩＢ／ＣＤ３２ｂ、ＰＤ－Ｌ２、Ｆｃ－γ ＲＩＩＣ／ＣＤ３２ｃ、Ｓｉｇｌｅｃ－３／ＣＤ３３、Ｆｃ－γ ＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ、ＳＩＧＮＲ１／ＣＤ２０９、Ｆｃ－γ ＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ＳＬＡＭ、ＧＭ－ＣＳＦ Ｒ α、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ－１、ＩＣＡＭ－２／ＣＤ１０２、ＴＬＲ３、ＩＦＮ－γ Ｒｌ、ＴＬＲ４、ＩＦＮ－γＲ２、ＴＲＥＭ－ｌ、ＩＬ－ｌ ＲＩＩ、ＴＲＥＭ－２、ＩＬＴ２／ＣＤ８５ｊ、ＴＲＥＭ－３、ＩＬＴ３／ＣＤ８５ｋ、ＴＲＥＭＬ１／ＴＬＴ－１、２Ｂ４／ＳＬＡＭＦ ４、ＩＬ－１０ Ｒ α、ＡＬＣＡＭ、ＩＬ－１０ Ｒ β、アミノペプチダーゼＮ／ＡＮＰＥＰ、ＩＬＴ２／ＣＤ８５ｊ、共通β鎖、ＩＬＴ３／ＣＤ８５ｋ、Ｃｌｑ Ｒ１／ＣＤ９３、ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ、ＣＣＲ１、ＩＬＴ５／ＣＤ８５ａ、ＣＣＲ２、ＣＤ２０６、インテグリンα ４／ＣＤ４９ｄ、ＣＣＲ５、インテグリンα Ｍ／ＣＤｌｌ ｂ、ＣＣＲ８、インテグリンα Ｘ／ＣＤｌｌｃ、ＣＤ１５５／ＰＶＲ、インテグリンβ ２／ＣＤ１８、ＣＤ１４、インテグリンβ ３／ＣＤ６１、ＣＤ３６／ＳＲ－Ｂ３、ＬＡＩＲ１、ＣＤ４３、ＬＡＩＲ２、ＣＤ４５、ロイコトリエン Ｂ４－Ｒ１、ＣＤ６８、ＬＩＭＰＩＩＩＳＲ－Ｂ２、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＬＭＩＲ１／ＣＤ３００Ａ、ＣＤ９７、ＬＭＩＲ２／ＣＤ３００ｃ、ＣＤ１６３、ＬＭＩＲ３／ＣＤ３００ＬＦ、凝固因子ＩＩＩ／組織因子、ＬＭＩＲ５／ＣＤ３００ＬＢ、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＬＭＩＲ６／ＣＤ３００ＬＥ、ＣＸＣＲ４、ＬＲＰ－１、ＣＸＣＲ６、Ｍ－ＣＳＦ Ｒ、ＤＥＰ－１／ＣＤ１４８、ＭＤ－１、ＤＮＡＭ－１、ＭＤ－２、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、ＭＭＲ、エンドグリン／ＣＤ１０５、ＮＣＡＭ－Ｌ１、Ｆｃ－γ ＲＩ／ＣＤ６４、ＰＳＧＬ－１、Ｆｃ－γ ＲＩＩＩＩＣＤ１６、ＲＰ１０５、Ｇ－ＣＳＦ Ｒ、Ｌ－セレクチン、ＧＭ－ＣＳＦ Ｒ α、Ｓｉｇｌｅｃ－３／ＣＤ３３、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＳＬＡＭ、ＩＣＡＭ－１／ＣＤ５４、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ－１、ＩＣＡＭ－２／ＣＤ１０２、ＴＲＥＭ－ｌ、ＩＬ－６ Ｒ、ＴＲＥＭ－２、ＣＸＣＲｌ／ＩＬ－８ ＲＡ、ＴＲＥＭ－３、およびＴＲＥＭＬｌ／ＴＬＴ－１が挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの例示的マクロファージ／単球抗原の１つ以上に結合する標的化部分を含む。

【0165】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、樹状細胞に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、例えばいくつかの実施形態では、治療部位（例えば、疾患細胞または治療効果のために調節される１つ以上の細胞を有する座位）に、樹状細胞を直接的に、または間接的に動員する。目的の例示的樹状細胞抗原としては、例えば、Ｃｌｅｃ９Ａ、ＸＣＲ１、ＲＡＮＫ、ＣＤ３６／ＳＲＢ３、ＬＯＸ－１／ＳＲ－Ｅ１、ＣＤ６８、ＭＡＲＣＯ、ＣＤ１６３、ＳＲ－Ａ１／ＭＳＲ、ＣＤ５Ｌ、ＳＲＥＣ－１、ＣＬ－Ｐｌ／ＣＯＬＥＣ１２、ＳＲＥＣ－ＩＩ、ＬＩＭＰＩＩＩＳＲＢ２、ＲＰ１０５、ＴＬＲ４、ＴＬＲ１、ＴＬＲ５、ＴＬＲ２、ＴＬＲ６、ＴＬＲ３、ＴＬＲ９、４－ＩＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＩＬ－１２／ＩＬ－２３ ｐ４０、４－アミノ－１，８－ナフタルイミド、ＩＬＴ２／ＣＤ８５ｊ、ＣＣＬ２１／６Ｃｋｉｎｅ、ＩＬＴ３／ＣＤ８５ｋ、８－オキソ－ｄＧ、ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ、８Ｄ６Ａ、ＩＬＴ５／ＣＤ８５ａ、Ａ２Ｂ５、インテグリンα ４／ＣＤ４９ｄ、Ａａｇ、インテグリンβ ２／ＣＤ１８、ＡＭＩＣＡ、ランゲリン、Ｂ７－２／ＣＤ８６、ロイコトリエンＢ４ Ｒｌ、Ｂ７－Ｈ３、ＬＭＩＲ１／ＣＤ３００Ａ、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＬＭＩＲ２／ＣＤ３００ｃ、Ｃｌｑ Ｒ１／ＣＤ９３、ＬＭＩＲ３／ＣＤ３００ＬＦ、ＣＣＲ６、ＬＭＩＲ５／ＣＤ３００ＬＢ ＣＣＲ７、ＬＭＩＲ６／ＣＤ３００ＬＥ、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＭＡＧ／シグレック－４－ａ、ＣＤ４３、ＭＣＡＭ、ＣＤ４５、ＭＤ－１、ＣＤ６８、ＭＤ－２、ＣＤ８３、ＭＤＬ－１／ＣＬＥＣ５Ａ、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＭＭＲ、ＣＤ９７、ＮＣＡＭＬｌ、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、オステオアクチビンＧＰＮＭＢ、Ｃｈｅｒｎ ２３、ＰＤ－Ｌ２、ＣＬＥＣ－１、ＲＰ１０５、ＣＬＥＣ－２、ＣＬＥＣ－８、シグレック－２／ＣＤ２２、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、シグレック－３／ＣＤ３３、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＤＣＥ２０５、シグレック－５、ＤＣ－ＳＩＧＮＲ／ＣＤ２９９、シグレック－６、ＤＣＡＲ、シグレック－７、ＤＣＩＲ／ＣＬＥＣ４Ａ、シグレック－９、ＤＥＣ－２０５、シグレック－１０、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、シグレック－Ｆ、デクチン－２／ＣＬＥＣ６Ａ、ＳＩＧＮＲ１／ＣＤ２０９、ＤＥＰ－１／ＣＤ１４８、ＳＩＧＮＲ４、ＤＬＥＣ、ＳＬＡＭ、エンプリン／ＣＤ１４７、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ－１、Ｆｃ－γ Ｒ１／ＣＤ６４、ＴＬＲ３、Ｆｃ－γ ＲＩＩＢ／ＣＤ３２ｂ、ＴＲＥＭ－１、Ｆｃ－γ ＲＩＩＣ／ＣＤ３２ｃ、ＴＲＥＭ－２、Ｆｃ－γ ＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ、ＴＲＥＭ－３、Ｆｃ－γ ＲＩＩＩ／ＣＤ１６、ＴＲＥＭＬ１／ＴＬＴ－１、ＩＣＡＭ－２／ＣＤ１０２、およびバニロイドＲ１が挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの例示的ＤＣ抗原の１つ以上に結合する標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、Ｃｌｅｃ９Ａに結合する標的化部分を含み、そのようなＣＤ２０結合剤は、例えば多発性硬化症の治療での使用が見出される。

【0166】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、これらに限定するものではないが、巨核球、血小板、赤血球、肥満細胞、好塩基球、好中球、好酸球、またはこれらのサブセットから選択される免疫細胞に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、例えば、いくつかの実施形態では、治療部位（例えば、１つ以上の疾患細胞または治療効果を調節させる細胞を有する座位）に、巨核球、血小板、赤血球、肥満細胞、好塩基球、好中球、好酸球、またはこれらのサブセットを直接的に、または間接的に動員する。

【0167】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、巨核球および／または血小板に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。目的の例示的な巨核球および／または血小板抗原としては、例えばＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩｂ、ｖＷＦ、ＰＦ４およびＴＳＰが挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの例示的巨核球および／または血小板抗原の１つ以上に結合する標的化部分を含む。

【0168】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、赤血球に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。目的の例示的赤血球抗原としては、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１ａ（血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＣＤ４１ｂ（ＧＰＩＩｂ）、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）、ＣＤ１０５、グリコホリンＡ、グリコホリンＣ、ｃ－ｋｉｔ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｈ２（ＭＨＣ－ＩＩ）、およびアカゲザル抗原が挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの例示的赤血球抗原の１つ以上に結合する標的化部分を含む。

【0169】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、肥満細胞に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。目的の例示的な肥満細胞抗原としては、例えば、ＳＣＦＲ／ＣＤ１１７、Ｆｃ_εＲＩ、ＣＤ２、ＣＤ２５、ＣＤ３５、ＣＤ８８、ＣＤ２０３ｃ、Ｃ５Ｒ１、ＣＭＡｌ、ＦＣＥＲｌＡ、ＦＣＥＲ２、ＴＰＳＡＢｌが挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの肥満細胞抗原の１つ以上に結合する標的化部分を含む。

【0170】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、好塩基球に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。目的の例示的な好塩基球抗原としては、例えばＦｃ_εＲＩ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、およびＣＤ１６４が挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの好塩基球抗原の１つ以上に結合する標的化部分を含む。

【0171】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、好中球に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。目的の例示的な好中球抗原としては、例えば、７Ｄ５、ＣＤ１０／ＣＡＬＬＡ、ＣＤ１３、ＣＤ１６（ＦｃＲＩＩＩ）、ＣＤ１８タンパク質（ＬＦＡ－１、ＣＲ３、およびｐ１５０，９５）、ＣＤ４５、ＣＤ６７およびＣＤ１７７が挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの好中球抗原の１つ以上に結合する標的化部分を含む。

【0172】

いくつかの実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、好酸球に関連する標的（例えば、抗原または受容体）に特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。目的の例示的な好酸球抗原には、例えば、ＣＤ３５、ＣＤ４４およびＣＤ６９が挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの好酸球抗原の１つ以上に結合する標的化部分を含む。

【0173】

様々な実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、当業者に公知の適切な抗原または細胞表面マーカーに特異的に結合する認識ドメインを有する標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、抗原または細胞表面マーカーは、組織特異的マーカーである。例示的な組織特異的マーカーとしては、これらに限定するものではないが、ＡＣＥ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤＨ５、ＥＮＧ、ＩＣＡＭ２、ＭＣＡＭ、ＮＯＳ３、ＰＥＣＡＭｌ、ＰＲＯＣＲ、ＳＥＬＥ、ＳＥＬＰ、ＴＥＫ、ＴＨＢＤ、ＶＣＡＭｌ、ＶＷＦなどの内皮細胞表面マーカー；ＡＣＴＡ２、ＭＹＨｌＯ、ＭＹＨｌ１、ＭＹＨ９、ＭＹＯＣＤなどの平滑筋細胞表面マーカー；ＡＬＣＡＭ、ＣＤ３４、ＣＯＬｌＡｌ、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＦＡＰ、ＰＨ－４などの線維芽細胞（間質）細胞表面マーカー；ＣＤｌＤ、Ｋ６ＩＲＳ２、ＫＲＴｌＯ、ＫＲＴ１３、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ４、ＫＲＴ５、ＫＲＴ８、ＭＵＣｌ、ＴＡＣＳＴＤｌなどの上皮細胞表面マーカー；ＣＤ１３、ＴＦＮＡ、アルファ－ｖベータ－３（αＶβ３）、Ｅ－セレクチンなどの新生血管系マーカー；ＡＤＩＰＯＱ、ＦＡＢＰ４、およびＲＥＴＮなどの脂肪細胞表面マーカーが挙げられる。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、これらの抗原の１つ以上に結合する標的化部分を含む。様々な実施形態では、キメラタンパク質の標的化部分は、これらの抗原を有する１つ以上の細胞に結合する。

【0174】

様々な実施形態では、本出願の多重特異性ＣＤ２０結合剤は、チェックポイントマーカー、例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８／ＣＤ８０またはＣＤ８６、ＣＴＬＡ４／ＣＤ８０またはＣＤ８６、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬまたはＢ７ＲＰ１、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３／Ｇａｌ９、およびＡ２ａＲのうちの１つ以上に対して向けられた１つ以上の標的化部分を有する。

【0175】

非限定的な例として、様々な実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、（ｉ）Ｔ細胞、例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、Ｃｄ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３、およびＡ２ａＲうちの１つ以上に発現するチェックポイントマーカーに対して向けられた標的化部分を含み、かつ、（ｉｉ）標的化部分は、本明細書に記載の修飾型（例えば突然変異体）シグナル伝達剤のいずれかと共に癌細胞または腫瘍細胞（例えば、癌または腫瘍細胞上のＣＤ２０）に対して向けられる。

【0176】

非限定的な例として、様々な実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＰＤ－１：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＫＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＦＳＩＨＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＷＳＧＧＩＴＹＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＤＲＡＥＳＳＷＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ、
または上記配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である配列（例えば、上記の配列に対して約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、約９９％、または約１００％同一である配列）に対して向けられる標的化部分を有する。

【0177】

さらなる非限定的な例として、様々な実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤＹＹＡＫＣＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＷＶＳＣＩＳＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＦＣＡＡＲＨＧＧＰＬＴＶＥＹＦＦＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ、
または上記配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である配列（例えば、上記の配列に対して約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、約９９％、または約１００％同一である配列）に対して向けられる標的化部分を有する。

【0178】

リンカーおよび官能基
様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、１つ以上の官能基、残基、または部分を含み得る。様々な実施形態では、１つ以上の官能基、残基、または部分は、本明細書に記載のシグナル伝達剤または標的化部分のいずれかに付着または遺伝子融合される。いくつかの実施形態では、このような官能基、残基または部分は、本出願のＣＤ２０結合剤に１つ以上の所望の特性または機能性を付与する。このような官能基の例およびそれらをＣＤ２０結合剤に導入する技術の例は、当該技術分野において公知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ（１９８０年）を参照されたい。

【0179】

いくつかの実施形態では、官能基、残基、または部分は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体など（例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）またはｍＰＥＧなど）の好適な薬理学的に許容されるポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分が付着することで、半減期を増加させ、かつ／またはＣＤ２０結合タンパク質の免疫原性を低下させる。当該分野で使用されるペグ化など、一般に、例えば、抗体および抗体断片（これに限定されるものではないが、ＶＨＨなどの単一ドメイン抗体を含む）について、任意の好適な形態のペグ化を使用することができる。例えば、Ｃｈａｐｍａｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４，５３１－５４５（２００２年）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓによる、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，４５３－４５６（２００３年）、Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｃｈｅｓｓによる、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．，２，（２００３年）、および国際公開第０４０６０９６５号（それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。タンパク質のペグ化のための様々な試薬も、例えばＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ＵＳＡ）から市販されている。いくつかの実施形態では、部位特異的ペグ化が、特にシステイン残基を介して使用される（例えば、この全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１６、１０、７６１－７７０（２００３年）を参照されたい）。例えば、この目的のために、ＰＥＧは、本出願のＣＤ２０結合剤中に天然に存在するシステイン残基に付着してもよい。いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、ＰＥＧを付着させるために１つ以上のシステイン残基を好適に導入するように修飾されるか、またはＰＥＧを付着させるために１つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列を、ＣＤ２０結合剤のアミノ末端および／またはカルボキシ末端に、当技術分野で公知の技術を用いて、融合させ得る。

【0180】

いくつかの実施形態では、官能基、残基、または部分は、Ｎ－結合またはＯ－結合グリコシル化を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ－結合型またはＯ－結合型グリコシル化は、同時翻訳および／または翻訳後修飾の一部として導入される。

【0181】

いくつかの実施形態では、官能基、残基、または部分は、１つ以上の検出可能な標識または他のシグナル生成基または部分を含む。これらを付着させ、使用し、かつ検出するための好適な標識および技術は、当技術分野において公知であり、これらに限定するものではないが、蛍光標識（フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド、ならびにフルオレサミンおよび蛍光金属、例えばＥｕまたはランタニド系列の他の金属など）、リン光標識、化学発光標識または生物発光標識（ルミナール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム・エステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタンまたはＧＦＰおよびその類似体など）、金属、金属キレートもしくは金属カチオン、またはｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｓｉｔｕでの診断および画像化における使用に特に適している他の金属もしくは金属カチオン、ならびに発色団および酵素（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ－Ｖ－ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α－グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース－ＶＩ－リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼ）などが挙げられる。他の好適な標識は、ＮＭＲまたはＥＳＲ分光法を用いて検出することができる部分を含む。このような標識された本出願のＶＨＨおよびポリペプチドは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の「ｓａｎｄｗｉｃｈアッセイ）など、それ自体が公知のイムノアッセイなど）のために、ならびに特定の標識の選択に依存して、ｉｎ ｖｉｖｏでの診断および画像化の目的で使用されてもよい。

【0182】

いくつかの実施形態では、官能基、残基、または部分は、ＣＤ２０結合剤に付着または遺伝的に融合されたタグを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、単一のタグまたは複数のタグを含み得る。タグは、例えば、ＣＤ２０または腫瘍抗原などの他の目的の抗原に対するＣＤ２０結合剤の結合を阻害または防止することのないペプチド、糖またはＤＮＡ分子である。種々の実施形態では、タグは、少なくとも約３～５アミノ酸長、少なくとも約５～８アミノ酸長、少なくとも約８～１２アミノ酸長、少なくとも約１２～１５アミノ酸長、または少なくとも約１５～２０アミノ酸長である。例示的なタグは、例えば、米国特許公開第２０１３／００５８９６２号に記載されている。いくつかの実施形態では、タグは、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ）タグなどの親和性タグである。一実施形態では、ＣＤ２０結合剤はＨｉｓタグを含む。一実施形態では、ＣＤ２０結合剤はＨＡタグを含む。

【0183】

いくつかの実施形態では、官能基、残基、または部分は、例えば金属または金属カチオンのうちの１つをキレート化するためにキレート基を含む。好適なキレート基としては、例えば、これに限定するものではないが、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。

【0184】

いくつかの実施形態では、官能基、残基、または部分は、ビオチン－（ストレプト）アビジン結合対などの特異的結合対の一部分である官能基を含む。こうした官能基を用いて、結合対の他の半分に結合する、すなわち結合対の形成を介して、本出願のＣＤ２０結合剤を、別のタンパク質、ポリペプチドまたは化合物に連結することができる。例えば、本出願のＣＤ２０結合剤は、ビオチンにコンジュゲートされ、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされた別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体に連結され得る。例えば、このようなコンジュゲートされたＣＤ２０結合剤は、例えば、検出可能なシグナル生成剤がアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされる診断システムにおいて、レポーターとして使用され得る。このような結合対は、例えば、医薬目的に好適である担体などの担体にＣＤ２０結合剤を結合させるために使用されてもよい。１つの非限定的な例は、Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、８，４，２５７（２０００年）によって記載されたリポソーム配合物である。このような結合対はまた、治療活性剤を本出願のＣＤ２０結合剤に連結するために使用され得る。

【0185】

いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、任意により１つ以上のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、各結合領域および／または標的化部分を接続するリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、各シグナル伝達剤および標的化部分を接続する（または、２つ以上の標的化部分であれば、シグナル伝達剤を標的化部分の１つに接続する）リンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーを利用して、本明細書に記載の様々な官能基、残基、または部分をＣＤ２０結合剤に連結することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、結合領域および結合タンパク質の安定性、配向、結合、中和、および／またはクリアランス特性に影響を及ぼすか、またはこれらを低減させることのない単一のアミノ酸または複数のアミノ酸である。様々な実施形態では、リンカーは、ペプチド、タンパク質、糖、または核酸から選択される。

【0186】

いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ２０結合剤は、標的化部分とシグナル伝達剤とを接続するリンカーを含む。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、シグナル伝達剤内にリンカーを含む（例えば、一本鎖ＴＮＦの場合、三量体を生じるために２つのリンカーを含むことができる）。

【0187】

本出願は、種々のリンカー配列の使用を企図している。様々な実施形態では、リンカーは、天然に存在するマルチドメインタンパク質に由来しているか、または例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｉｃｈｉｌｉら（２０１３年），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２２（２）：１５３－１６７，Ｃｈｅｎら、（２０１３年），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されているとおり、経験的リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー設計データベースおよびＣｈｅｎら（２０１３年），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９、およびＣｒａｓｔｏら（２０００年），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３０９－３１２に記載されているものなどのコンピュータプログラムを使用して設計されてもよい。これらはその全内容が参照により本明細書に組み込まれる。様々な実施形態では、リンカーは機能的であり得る。例えば、これらに限定されるものではないが、リンカーは、本発明のＣＤ２０結合剤の折り畳みおよび／もしくは安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、かつ／または生物活性を改善するように機能し得る。

【0188】

いくつかの実施形態では、リンカーはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは約１００アミノ酸長未満である。例えば、リンカーは、約１００、約９５、約９０、約８５、約８０、約７５、約７０、約６５、約６０、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２未満のアミノ酸長であってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１００アミノ酸長を超える。例えば、リンカーは、約１００、約９５、約９０、約８５、約８０、約７５、約７０、約６５、約６０、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２を超えるアミノ酸長であってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは柔軟性である。別の実施形態では、リンカーは剛性である。

【0189】

いくつかの実施形態では、リンカーの長さにより、標的化部分およびシグナル伝達剤のそれらの受容体への効率的な結合が可能になる。例えば、いくつかの実施形態では、リンカーの長さにより、標的化部分のうちの１つおよびシグナル伝達剤の同一細胞上の受容体への効率的な結合、ならびに他の標的化部分の別の細胞への効率的な結合が可能になる。例示的な対の細胞は、本明細書の他の場所で提供される。

【0190】

いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、同じ細胞上の受容体に対する標的化部分のうちの１つおよびシグナル伝達剤の結合部位間の最小距離に少なくとも等しい。いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、同じ細胞上の受容体に対する標的化部分のうちの１つおよびシグナル伝達剤の結合部位間の最小距離の間の少なくとも２倍、３倍、または４倍、または５倍、または１０倍、または２０倍、または２５倍、または５０倍、または１００倍以上である。

【0191】

いくつかの実施形態では、リンカーは２つの標的化部分を互いに接続しており、このリンカーは短い長さを有する。また、リンカーは標的化部分とシグナル伝達剤とを接続しており、このリンカーは２つの標的化部分を連結するリンカーより長い。例えば、２つの標的化部分を接続するリンカーと標的化部分とシグナル伝達剤とを接続するリンカーとのアミノ酸長の差は、約１００個、約９５個、約９０個、約８５個、約８０個、約７５個、約７０個、約６５個、約６０個、約５５個、約５０個、約４５個、約４０個、約３５個、約３０個、約２５個、約２０個、約１９個、約１８個、約１７個、約１６個、約１５個、約１４個、約１３個、約１２個、約１１個、約１０個、約９個、約８個、約７個、約６個、約５個、約４個、約３個、または約２個のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは柔軟性である。別の実施形態では、リンカーは剛性である。

【0192】

一実施形態では、リンカーはＡＡＡである。

【0193】

様々な実施形態では、リンカーは、グリシン残基およびセリン残基（例えば、約３０％または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％または約９５％、または約９７％のグリシンおよびセリン）を実質的に含む。例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎであり、ｎは約１～約８、例えば１、２、３、４、５、６、７または８である。一実施形態では、リンカー配列はＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。追加の例示的リンカーとしては、これらに限定するものではないが、配列ＬＥ、ＧＧＧＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（ｎ＝１～４）、（Ｇｌｙ）_８、（Ｇｌｙ）_６、（ＥＡＡＡＫ）_ｎ（ｎ＝１～３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_ｎＡ（ｎ＝２～５）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）_４Ａ、ＰＡＰＡＰ、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ、および（ＸＰ）_ｎを有するリンカーが挙げられ、Ｘは、任意のアミノ酸、例えばＡｌａ、ＬｙｓまたはＧｌｕを示す。様々な実施形態では、リンカーはＧＧＳである。

【0194】

いくつかの実施形態では、リンカーは、抗体のヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ（サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む））である。様々な実施形態では、リンカーは、抗体のヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ（サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）である。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥクラスの抗体に見られるヒンジ領域は、Ｆａｂ部分が空間内を自由に動くことができる柔軟なスペーサーとして働く。定常領域とは対照的に、ヒンジドメインは構造的に多様であり、免疫グロブリンクラスおよびサブクラスの間で配列および長さが双方とも変化する。例えば、ヒンジ領域の長さおよび柔軟性はＩｇＧサブクラス間で異なる。ＩｇＧ１のヒンジ領域は２１６～２３１個のアミノ酸を含み、この領域は自由な柔軟性であるため、Ｆａｂ断片がそれらの対称軸を中心に回転し、２つの重鎖間ジスルフィド架橋の第１の中心にある球内を移動することができる。ＩｇＧ２はＩｇＧ１よりも短いヒンジを有し、１２個のアミノ酸残基および４個のジスルフィド架橋を有する。ＩｇＧ２のヒンジ領域はグリシン残基を欠き、比較的短く、余分な重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された剛性ポリ－プロリン二重らせんを含む。これらの特性により、ＩｇＧ２分子の柔軟性が制限される。ＩｇＧ３は、独自の拡大ヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）によって他のサブクラスと異なる。この拡大ヒンジ領域には、６２個のアミノ酸（２１個のプロリンおよび１１個のシステインを含む）を含み、柔軟性のないポリ－プロリン二重らせんを形成する。ＩｇＧ３では、Ｆａｂ断片はＦｃ断片から比較的離れており、分子に大きな柔軟性を付与する。また、ＩｇＧ３のヒンジが伸長することにより他のサブクラスと比較してより高い分子量となる。ＩｇＧ４のヒンジ領域はＩｇＧ１のヒンジ領域よりも短く、その柔軟性はＩｇＧ１とＩｇＧ２の中間である。ヒンジ領域の柔軟度は、報告によれば、ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順で低下する。

【0195】

結晶学的研究によれば、免疫グロブリンヒンジ領域は、機能的に、上部ヒンジ領域、コア領域、および下部ヒンジ領域の３つの領域にさらに細分することができる。Ｓｈｉｎら（１９９２年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３０：８７を参照されたい。上部ヒンジ領域は、Ｃ_Ｈ１のカルボキシル末端から、動きを制限するヒンジ内の第１の残基までのアミノ酸を含んでおり、第１のシステイン残基は、一般に２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成する。上部ヒンジ領域の長さは、抗体のセグメントの柔軟性と相関する。コアヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド架橋を含み、下部ヒンジ領域は、Ｃ_Ｈ２ドメインのアミノ末端に結合し、Ｃ_Ｈ２には残基を含む（同書）。野生型ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ配列を含み、ジスルフィド結合形成によって二量体化された場合、結果として、環状オクタペプチドとなり、ピボットとして作用し、これゆえに柔軟性が付与されると考えられている。様々な実施形態では、本発明のリンカーは、任意の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ（サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む））の１つまたは２つまたは３つの上部ヒンジ領域、コア領域、および下部ヒンジ領域を含む。ヒンジ領域はまた、炭水化物を付着させるためのいくつかの構造的に異なるタイプの部位を含む１つ以上のグリコシル化部位を含むことができる。例えば、ＩｇＡ１はヒンジ領域の１７のアミノ酸セグメント内に５つのグリコシル化部位を含み、腸プロテアーゼに対するヒンジ領域ポリペプチドの耐性が付与され、これは分泌免疫グロブリンの有利な特性と考えられる。様々な実施形態では、本出願のリンカーは、１つ以上のグリコシル化部位を含む。様々な実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ４抗体のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインである。

【0196】

所望であれば、本発明のＣＤ２０結合剤は、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインの一方または両方を含む抗体Ｆｃ領域、および任意によりヒンジ領域に連結することができる。例えば、単一ヌクレオチド配列としてＦｃ領域に連結された本発明のＣＤ２０結合剤をコードするベクターは、このようなポリペプチドを調製するために使用され得る。

【0197】

いくつかの実施形態では、リンカーは、ＰＥＧなどの合成リンカーである。

【0198】

様々な実施形態では、リンカーは機能的であり得る。例えば、これらに限定されるものではないが、リンカーは、折り畳みおよび／もしくは安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、かつ／または本発明のＣＤ２０結合剤の生物活性を改善するように機能し得る。別の例では、リンカーは、ＣＤ２０結合剤を特定の細胞型または位置に標的化するように機能し得る。

【0199】

ＣＤ２０結合剤の修飾および産生
様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、ＶＨＨである標的化部分を含む。様々な実施形態では、ＶＨＨは、特定の生物学的供給源または特定の調製方法に限定されない。例えば、ＶＨＨは、一般に、以下によって得ることができる：（１）天然に存在する重鎖抗体のＶ_ＨＨドメインを単離すること；（２）天然に存在するＶ_ＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列を発現させること；（３）天然に存在するＶ_ＨＨドメインを「ヒト化」すること、またはこのようなヒト化Ｖ_ＨＨドメインをコードする核酸を発現させること；（４）任意の動物種、例えばヒトからなどの哺乳種由来の天然に存在するＶＨドメインを「ラクダ化」すること、またはこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸を発現させること；（５）当該分野で記載されているような「ドメイン抗体」または「Ｄａｂ」を「ラクダ化」すること、またはこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸を発現させること；（６）当該分野で公知のタンパク質、ポリペプチドまたは他のアミノ酸配列を調製するための合成または半合成技術を使用すること；（７）当該分野で公知の核酸合成技術を用いてＶＨＨをコードする核酸を調製し、次いでこうして得られた核酸を発現させること；および／または（８）上記の１つ以上の任意の組み合わせ。

【0200】

一実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、ヒトＣＤ２０に対して向けられた天然に存在する重鎖抗体のＶ_ＨＨドメインに対応するＶＨＨを含む。いくつかの実施形態では、このようなＶ_ＨＨ配列は、一般に、ラクダ種をＣＤ２０分子で適切に免疫化することによって（すなわち、ＣＤ２０に対して向けられた免疫応答および／または重鎖抗体を引き起こすように）、好適なラクダ科由来の生物学的サンプル（血液サンプル、またはＢ細胞の任意のサンプルなど）を得ることによって、および任意の好適な公知の技術を使用して、サンプルから出発してＣＤ２０に対して向けられたＶ_ＨＨ配列を生成することによって、生成する、または得ることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０に対して天然に存在するＶ_ＨＨドメインは、ラクダ科動物のＶ_ＨＨ配列のナイーブライブラリから、例えば、ＣＤ２０またはそれらの少なくとも１つの部分、断片、抗原決定基またはそのエピトープを用いて、当該分野で公知である１つ以上のスクリーニング技術で、このようなライブラリをスクリーニングすることにより得ることができる。このようなライブラリおよび技術は、例えば、国際公開第９９３７６８１号、国際公開第０１９０１９０号、国際公開第０３０２５０２０号、および国際公開第０３０３５６９４号に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ナイーブＶ_ＨＨライブラリ由来の改善された合成または半合成ライブラリ、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第００４３５０７号に記載されているランダム突然変異誘発および／またはＣＤＲシャッフリングなどの技術によってナイーブＶ_ＨＨライブラリから得られた、Ｖ_ＨＨライブラリなどを使用してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０に対して向けられたＶ_ＨＨ配列を得るための別の技術は、重鎖抗体を発現することができるトランスジェニック哺乳動物を適切に免疫化すること（すなわち、ＣＤ２０に対して向けられた免疫応答および／または重鎖抗体を引き起こすようにする）、トランスジェニック哺乳動物から好適な生物学的サンプル（例えば、血液サンプル、またはＢ細胞の任意のサンプル）を得ること、次いで任意の好適な公知の技術を用いて、サンプルから出発してＣＤ２０に対して向けられたＶ_ＨＨ配列を生成することを伴う。例えば、この目的のために、重鎖抗体発現マウス、および国際公開第０２０８５９４５号および国際公開第０４０４９７９４号（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているさらなる方法および技術を使用することができる。

【0201】

一実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、「ヒト化された」ＶＨＨ、すなわち、天然に存在するＶ_ＨＨ配列（および特にフレームワーク配列）のアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基をヒト由来の従来の４本鎖抗体由来のＶＨドメイン内における対応する位置（複数可）に存在するアミノ酸残基のうちの１つ以上によって置換することによって「ヒト化された」ＶＨＨを含む。これは、当該分野で公知のヒト化技術を用いて行うことができる。いくつかの実施形態では、考えられるヒト化置換、またはヒト化置換の組み合わせは、例えば、ＶＨＨの配列と天然に存在するヒトＶＨドメインの配列とを比較することによって、当該分野で公知の方法によって決定され得る。いくつかの実施形態では、ヒト化置換は、結果として得られるヒト化ＶＨＨが依然として有利な機能特性を保持するように選択される。一般に、ヒト化の結果として、本出願のＶＨＨは、対応する天然に存在するＶ_ＨＨドメインと比較して、免疫原性の低下などの好ましい特性を依然として保持しながら、より「ヒト様」になり得る。様々な実施形態では、本出願のヒト化ＶＨＨは、当該分野で公知の任意の適切な方法で得ることができ、したがって、天然に存在するＶ_ＨＨドメインを出発物質として含むポリペプチドを用いて得られたポリペプチドに厳密に限定されるものではない。

【0202】

一実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、「ラクダ化された」ＶＨＨ、すなわち、従来の４鎖抗体由来の天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基をラクダ科動物の重鎖抗体のＶ_ＨＨドメイン内の対応する位置（複数可）に存在するアミノ酸残基のうちの１つ以上に置換することによって「ラクダ化された」ＶＨＨを含む。いくつかの実施形態では、このような「ラクダ化」置換は、ＶＨ－ＶＬ界面および／またはいわゆるラクダ科の特徴的な残基で形成され、かつ／または存在するアミノ酸位置に挿入される（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９４０４６７８号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ラクダ化ＶＨＨを生成または設計するための出発物質または出発点として使用されるＶＨ配列は、哺乳動物由来のＶＨ配列、例えばヒトのＶＨ配列、例えばＶＨ３配列である。様々な実施形態では、ラクダ化ＶＨＨは、当該分野で公知の任意の好適な様式で（すなわち、上記の点（１）～（８）に示されるように）得ることができ、従って、厳密には、天然に存在するＶＨドメインを出発物質として含むポリペプチドを用いて得たポリペプチドに限定するものではない。

【0203】

様々な実施形態では、「ヒト化」および「ラクダ化」は双方とも、天然に存在するＶ_ＨＨドメインまたはＶＨドメインをそれぞれコードするヌクレオチド配列を提供し、次いで、当技術分野において公知の様式で、新規ヌクレオチド配列がそれぞれ「ヒト化」または「ラクダ化」ＶＨＨをコードするような方法でヌクレオチド配列中の１つ以上のコドンを変えることによって、実施することができる。次いで、この核酸は、当該分野で公知の様式で発現され、その結果として本出願の所望のＶＨＨが提供され得る。あるいは、それぞれ天然に存在するＶ_ＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列に基づいて、本出願の所望のヒト化またはラクダ化ＶＨＨのアミノ酸配列を設計し、次いで当該分野において公知であるペプチド合成技術を用いてｄｅ ｎｏｖｏで合成することができる。また、それぞれ天然に存在するＶ_ＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に基づいて、所望のヒト化またはラクダ化ＶＨＨをそれぞれコードするヌクレオチド配列を設計し、次いで当該分野において公知の核酸合成技術を用いてｄｅ ｎｏｖｏで合成し、その後、こうして得られた核酸を当該分野において公知の様式で発現させることができ、その結果として、本出願の所望のＶＨＨがもたらされ得る。天然に存在するＶＨ配列またはＶ_ＨＨ配列から出発して、本出願のＶＨＨおよび／またはそれをコードする核酸を得るための他の好適な方法および技術は、当該分野で公知であり、例えば、１つ以上の天然に存在するＶＨ配列（例えば、１つ以上のＦＲ配列および／もしくはＣＤＲ配列）の１つ以上の部分、１つ以上の天然に存在するＶ_ＨＨ配列（例えば、１つ以上のＦＲ配列もしくはＣＤＲ配列）の１つ以上の部分、および／または好適な様式での１つ以上の合成または半合成配列の組み合わせを含んでもよく、これにより本出願のＶＨＨまたはそれをコードするヌクレオチド配列または核酸がもたらされる。

【0204】

本出願のＣＤ２０結合剤の製造方法は、本明細書に記載されている。例えば、本出願のＣＤ２０結合剤をコードするＤＮＡ配列は、当該分野において公知の方法を用いて化学的に合成することができる。合成ＤＮＡ配列は、例えば発現制御配列など、他の適切なヌクレオチド配列にライゲートして、所望のＣＤ２０結合剤をコードする遺伝子発現構築物を産生することができる。したがって、様々な実施形態では、本出願は、本出願のＣＤ２０結合剤をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。

【0205】

本出願のＣＤ２０結合剤をコードする核酸は、発現ベクターに組み込まれ得（ライゲートされる）、トランスフェクション、形質転換または形質導入技術によって宿主細胞に導入され得る。例えば、本出願のＣＤ２０結合剤をコードする核酸は、レトロウイルス形質導入によって宿主細胞に導入することができる。例示的な宿主細胞は、大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、および骨髄腫細胞である。形質転換された宿主細胞は、宿主細胞が本出願のＣＤ２０結合剤をコードする遺伝子を発現できるようにする条件下で増殖させることができる。したがって、様々な実施形態では、本出願は、本出願のＣＤ２０結合剤をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。様々な実施形態では、本出願は、そのような発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。

【0206】

特定の発現および精製条件は、使用される発現系に応じて変化する。例えば、遺伝子を大腸菌で発現させる場合、好適な細菌プロモーター、例えば、ＴｒｐまたはＴａｃ、および原核生物シグナル配列から下流に操作された遺伝子を配置することによって、遺伝子を最初に発現ベクターにクローニングする。別の例では、操作された遺伝子を真核宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞に発現させる場合、例えば、遺伝子は、好適な真核生物プロモーター、分泌シグナル、エンハンサーおよび種々のイントロンを含む発現ベクターに最初に挿入される。遺伝子構築物は、トランスフェクション、形質転換または形質導入技術を用いて宿主細胞に導入することができる。

【0207】

本出願のＣＤ２０結合剤は、タンパク質の発現を可能にする条件下で、ＣＤ２０結合剤をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を増殖させることによって産生され得る。発現後、当技術分野において周知の技術、例えばグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ）タグなどの親和性タグを用いて、またはクロマトグラフィーによりタンパク質を採取および精製することができる。一実施形態では、ＣＤ２０結合剤はＨｉｓタグを含む。一実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、ＨｉｓタグおよびＨｉｓタグの切断を可能にするタンパク質分解部位を含む。

【0208】

したがって、様々な実施形態では、本出願は、本出願のＣＤ２０結合剤をコードする核酸を提供する。様々な実施形態では、本出願は、本出願のＣＤ２０結合剤をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。

【0209】

薬学的に許容される塩および賦形剤
本明細書に記載のＣＤ２０結合剤は、無機酸もしくは有機酸と反応することができる十分に塩基性の官能基、または無機塩基もしくは有機塩基と反応することができるカルボキシル基を有し、薬学的に許容される塩を形成することができる。薬学的に許容される酸付加塩は、当技術分野で周知のように、薬学的に許容される酸から形成される。このような塩としては、例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６，２－１９（１９７７年）およびＴｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ Ｐ．Ｈ．ＳｔａｈｌおよびＣ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（編），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２年に記載されている薬学的に許容される塩が挙げられる。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0210】

非限定的例として、薬学的に許容される塩は、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ショウノウスルホン酸塩、パモン酸塩、フェニル酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アクリル酸塩、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ｏ－アセトキシ安息香酸塩、ナフタレン－２－安息香酸塩、イソ酪酸塩、フェニル酪酸塩、α－ヒドロキシ酪酸塩、ブチン－１，４－ジカルボン酸塩、ヘキシン－１，４－ジカルボン酸塩、カプリン酸塩、カプリル酸塩、けい皮酸塩、グリコール酸塩、ヘプタン酸塩、馬尿酸塩、リンゴ酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、ニコチン酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩（ｔｅｒａｐｈｔｈａｌａｔｅ）、プロピオラート、プロピオナート、フェニルプロピオナート、セバシン酸塩、スベリン酸塩、ｐ－ブロモベンゼンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、エチルスルホン酸塩、２－ヒドロキシエチルスルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、ナフタレン－１，５－スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、および酒石酸塩の塩が挙げられる。

【0211】

用語「薬学的に許容される塩」はまた、酸性官能基（カルボン酸官能基など）および塩基を有する本出願の組成物の塩も指す。好適な塩基には、これらに限定されるものではないが、ナトリウム、カリウムおよびリチウムなどのアルカリ金属の水酸化物；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；アルミニウムおよび亜鉛などの他の金属の水酸化物；非置換またはヒドロキシ置換モノ、ジまたはトリアルキルアミン、ジシクロヘキシルアミンなどのアンモニア、有機アミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ－メチル、Ｎ－エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ－、ビス－またはトリス－（２－ＯＨ－低級アルキルアミン）、例えばモノ－、ビス－またはトリス－（２－ヒドロキシエチル）アミン、２－ヒドロキシ－ｔｅｒｔ－ブチルアミン、またはトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジ－低級アルキル－Ｎ－（ヒドロキシル－低級アルキル）－アミン、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アミンまたはトリ－（２－ヒドロキシエチル）アミン；Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン；およびアルギニン、リジンなどのアミノ酸などが挙げられる。

【0212】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される塩の形態である。

【0213】

医薬組成物および配合物
様々な実施形態では、本出願は、本明細書に記載のＣＤ２０結合剤、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物に関する。本明細書に記載の医薬組成物はいずれも、医薬的に許容される担体またはビヒクルを含む組成物の成分として対象に投与することができる。このような組成物は、適切な投与のための形態を提供するために、好適な量の薬学的に許容される賦形剤を任意により含み得る。

【0214】

様々な実施形態では、医薬賦形剤は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、石油、動物、植物または合成起源のものなど、水および油などの液体であり得る。医薬賦形剤は、例えば、生理食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであり得る。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤を使用することができる。一実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、対象に投与されるときに滅菌される。水は、本明細書に記載の任意の剤が静脈内投与される場合に有用な賦形剤である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体賦形剤として、特に注射可能な溶液に使用することができる。また、好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。本明細書に記載の任意の剤は、所望であれば、少量の湿潤剤、または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。好適な医薬賦形剤の他の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １４４７－１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、第１９版１９９５年）に記載され、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0215】

本出願は、記載された医薬組成物（および／または追加の治療剤）を様々な配合物に含む。本明細書に記載の任意の本発明の医薬組成物（および／または追加の治療剤）は、溶液、懸濁液、乳濁液、滴剤、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル、液体を含むカプセル、ゼラチンカプセル、散剤、徐放性配合物、坐剤、エマルジョン、エアロゾル、スプレー、懸濁液、凍結乾燥粉末、凍結懸濁液、乾燥粉末、または使用に好適な他の任意の形態をとり得る。一実施形態では、組成物はカプセルの形態である。別の実施形態では、組成物は錠剤の形態である。さらに別の実施形態では、医薬組成物は軟質ゲルカプセルの形態で配合される。さらなる実施形態では、医薬組成物は、ゼラチンカプセルの形態で配合される。さらに別の実施形態では、医薬組成物は液体として配合される。

【0216】

必要に応じて、本発明の医薬組成物（および／または追加の剤）はまた、可溶化剤を含むことができる。また、剤は、当該分野で公知の好適なビヒクルまたは送達デバイスを用いて送達され得る。本明細書で概説した併用療法は、単一の送達ビヒクルまたは送達デバイスで同時送達することができる。

【0217】

本出願の本発明の医薬組成物（および／または追加の剤）を含む配合物は、単位剤形で提供するのが好都合であり、薬学分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。このような方法は、一般に、治療剤を、１つ以上の付属成分を構成する担体と関連させるステップを含む。典型的には、配合物は、治療剤を液体担体、細かく分割された固体担体、またはその両方と均一かつ密接に接触させ、次いで、必要に応じて、産物を所望の配合物の剤形状にする（例えば、湿潤または乾燥顆粒、粉末ブレンドなど、続いて当該技術分野で公知の従来の方法を用いて錠剤化する）ことにより、調製する。

【0218】

様々な実施形態では、本明細書に記載の任意の医薬組成物（および／または追加の剤）は、本明細書に記載の投与様式に適合した組成物として日常的な手順に従って配合される。

【0219】

投与経路としては、例えば、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、舌下、鼻内、大脳内、膣内、経皮、直腸、吸入、または局所的が挙げられる。投与は局所または全身であってもよい。いくつかの実施形態では、投与は経口的に行われる。別の実施形態では、投与は、非経口注射による。投与様式は施術者の裁量に任されてもよく、病状の部位に部分的に依存する。ほとんどの場合、投与することで、本明細書に記載された任意の剤の血流への放出をもたらす。

【0220】

一実施形態では、本明細書に記載のＣＤ２０結合剤は、経口投与に適した組成物として日常的な手順に従って配合される。経口送達のための組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、水性もしくは油性懸濁剤、顆粒剤、散剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であり得る。経口投与される組成物は、１つ以上の剤、例えばフルクトース、アスパルテームまたはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、ウィンターグリーン油またはチェリーなどの香味剤；着色剤；および保存剤を含み、薬学的に美味な調製物を提供することができる。さらに、錠剤または丸剤の形態では、組成物をコーティングして胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、これにより長時間にわたり持続的作用をもたらすことができる。浸透圧活性により駆動する本明細書に記載の任意のＣＤ２０結合剤を取り囲む選択的透過性膜も経口投与組成物に適している。これらの後者のプラットフォームでは、カプセルを取り囲む環境からの流体が駆動化合物によって吸収され、それらが膨張し、開口を通して剤または剤組成物を移動させる。これらの送達プラットフォームでは、即時放出配合物のスパイクプロファイルとは対照的に、本質的にゼロ次送達プロファイルを提供することができる。グリセロールモノステアレートまたはグリセロールステアレートなどの時間遅延材料も有用であり得る。経口組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムなどの標準賦形剤を含むことができる。一実施形態では、賦形剤は医薬グレードのものである。懸濁液は、活性化合物に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微晶質セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、トラガカントなど、これらの混合物の懸濁剤を含有してもよい。

【0221】

非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下および関節内注射および注入）に好適な剤形としては、例えば、溶液、懸濁液、分散液、乳液などが挙げられる。これらは、使用直前に滅菌注射用媒体に溶解または懸濁させ得る滅菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造することもできる。これらは、例えば、当技術分野で公知の懸濁剤または分散剤を含み得る。非経口投与に好適な配合物成分としては、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性調節剤が挙げられる。

【0222】

静脈内投与用には、好適な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、製造および貯蔵の条件下で安定であり、微生物に対して保存されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）およびこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。

【0223】

本明細書で提供される組成物は、単独で、または他の好適な成分と組み合わせて、吸入投与される（すなわち、「噴霧される」）エアロゾル配合物にすることができる。エアロゾル配合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な噴射剤に入れることができる。

【0224】

本明細書に記載の任意の本発明の医薬組成物（および／または追加の剤）は、制御放出または徐放放出手段によって、または当業者に周知の送達デバイスによって投与することができる。例としては、これらに限定するものではないが、米国特許第３，８４５，７７０号、同第３，９１６，８９９号、同第３，５３６，８０９号、同第３，５９８，１２３号、同第４，００８，７１９号、同第５，６７４，５３３号、同第５，０５９，５９５号、同第５，５９１，７６７号、同第５，１２０，５４８号、同第５，０７３，５４３号、同第５，６３９，４７６号、同第５，３５４，５５６、および同第５，７３３，５５６号に記載されているものが挙げられ、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。このような剤形は、例えば、ヒドロプロピルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、他のポリマーマトリックス、ゲル、浸透性膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、マイクロスフェア、またはそれらの組み合わせを使用して、１つ以上の有効成分の制御放出または徐放放出をもたらし、様々な割合で所望の放出プロファイルを提供するために有用であり得る。本明細書に記載のものなど、当業者に公知の好適な制御放出配合物または徐放放出配合物は、本明細書に記載の剤の有効成分と共に使用するために容易に選択することができる。したがって、本出願は、これらに限定するものではないが、制御放出または徐放放出に適合した錠剤、カプセル、ゲルキャップおよびカプレットなどの経口投与に適した単一単位剤形を提供する。

【0225】

有効成分の制御放出または徐放放出は、これらに限定するものではないが、ｐＨの変化、温度の変化、適切な波長の光による刺激、酵素の濃度または利用可能性、水の濃度または利用可能性、または他の生理学的条件もしくは化合物などの様々な条件によって刺激され得る。

【0226】

別の実施形態では、制御放出系は、治療すべき標的領域の近傍に配置することができ、このため、全身投与量のほんの一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，第２巻、１１５～１３８頁（１９８４年）を参照されたい）。他の制御放出系Ｌａｎｇｅｒ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３の総説で議論されている）を使用することができる。

【0227】

医薬配合物は、好ましくは無菌である。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥および再構成の前または後にフィルター滅菌を行うことができる。

【0228】

投与および投与量
本出願に従って投与されるＣＤ２０結合剤の実際の用量は、特定の剤形および投与様式に従って変化することは理解されよう。ＣＤ２０結合剤の作用を改変し得る多くの要因（例えば、体重、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、対象の状態、薬物の組合せ、遺伝子配置および反応感受性）は、当業者によって考慮され得る。投与は、最大許容用量内で連続的にまたは１つ以上の別個の用量で行うことができる。所与の一連の条件の最適投与速度は、従来の投与量試験を用いて当業者が確認できる。

【0229】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤の好適な投与量は、対象の体重あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｇ／ｋｇ、対象の体重あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｇ／ｋｇ、対象の体重あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、対象の体重あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり、例えば、約０．０１ｍｇ／体重ｋｇ、約０．０２ｍｇ／体重ｋｇ、約０．０３ｍｇ／体重ｋｇ、約０．０４ｍｇ／体重ｋｇ、約０．０５ｍｇ／体重ｋｇ、約０．０６ｍｇ／体重ｋｇ、約０．０７ｍｇ／体重ｋｇ、約０．０８ｍｇ／体重ｋｇ、約０．０９ｍｇ／体重ｋｇ、約０．１ｍｇ／体重ｋｇ、約０．２ｍｇ／体重ｋｇ、約０．３ｍｇ／体重ｋｇ、約０．４ｍｇ／体重ｋｇ、約０．５ｍｇ／体重ｋｇ、約０．６ｍｇ／体重ｋｇ、約０．７ｍｇ／体重ｋｇ、約０．８ｍｇ／体重ｋｇ、約０．９ｍｇ／体重ｋｇ、約１ｍｇ／体重ｋｇ、約１．１ｍｇ／体重ｋｇ、約１．２ｍｇ／体重ｋｇ、約１．３ｍｇ／体重ｋｇ、約１．４ｍｇ／体重ｋｇ、約１．５ｍｇ／体重ｋｇ、約１．６ｍｇ／体重ｋｇ、約１．７ｍｇ／体重ｋｇ、約１．８ｍｇ／体重ｋｇ、１．９ｍｇ／体重ｋｇ、約２ｍｇ／体重ｋｇ、約３ｍｇ／体重ｋｇ、約４ｍｇ／体重ｋｇ、約５ｍｇ／体重ｋｇ、約６ｍｇ／体重ｋｇ、約７ｍｇ／体重ｋｇ、約８ｍｇ／体重ｋｇ、約９ｍｇ／体重ｋｇ、約１０ｍｇ／体重ｋｇ、約１００ｍｇ／体重ｋｇ、約１ｇ／体重ｋｇ、約１０ｇ／体重ｋｇであり、その間の全ての値および範囲を含む。

【0230】

ＣＤ２０結合剤の個々の用量は、例えば、単位剤形あたり、約０．０１ｍｇ～約１００ｇ、約０．０１ｍｇ～約７５ｇ、約０．０１ｍｇ～約５０ｇ、約０．０１ｍｇ～約２５ｇ、約０．０１ｍｇ～約１０ｇ、約０．０１ｍｇ～約７．５ｇ、約０．０１ｍｇ～約５ｇ、約０．０１ｍｇ～約２．５ｇ、約０．０１ｍｇ～約１ｇ、約０．０１ｍｇ～約１００ｍｇ、約０．１ｍｇ～約１００ｍｇ、約０．１ｍｇ～約９０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約８０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約７０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約６０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約５０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約４０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約３０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約２０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約５ｍｇ、約０．１ｍｇ～約３ｍｇ、約０．１ｍｇ～約１ｍｇ、または約５ｍｇ～約８０ｍｇの有効成分を含む単位剤形で投与され得る。例えば、単位投与形態は、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約５００ｍｇ、約１ｇ、約２．５ｇ、約５ｇ、約１０ｇ、約２５ｇ、約５０ｇ、約７５ｇ、約１００ｇであり得、それらの間の全ての値および範囲を含む。

【0231】

一実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、約０．０１ｍｇ／日～約１００ｇ／日、約０．０１ｍｇ／日～約７５ｇ／日、約０．０１ｍｇ／日～約５０ｇ／日、約０．０１ｍｇ／日～約２５ｇ／日、約０．０１ｍｇ／日～約１０ｇ／日、約０．０１ｍｇ／日～約７．５ｇ／日、約０．０１ｍｇ／日～約５ｇ／日、約０．０１ｍｇ／日～約２．５ｇ／日、約０．０１ｍｇ／日～約１ｇ／日、約０．０１ｍｇ／日～約１００ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約１００ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約９５ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約９０ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約８５ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約８０ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約７５ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約７０ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約６５ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約６０ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約５５ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約５０ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約４５ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約４０ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約３５ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約３０ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約２５ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約２０ｍｇ、約０．１ｍｇ／日～約１５ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ／日～約５ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約３ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日～約１ｍｇ／日、または約５ｍｇ／日～約８０ｍｇ／日の量で投与される。様々な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、１日量約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約５００ｍｇ、約１ｇ、約２．５ｇ、約５ｇ、約７．５ｇ、約１０ｇ、約２５ｇ、約５０ｇ、約７５ｇ、約１００、およびそれらの間の全ての値および範囲を含む量で投与される。

【0232】

本出願の特定の実施形態によれば、ＣＤ２０結合剤を含む医薬組成物は、例えば、１日に１回以上（例えば、１日約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、または約１０回）、１日約１回、１日おきに約１回、３日おきに約１回、１週間に約１回、２週間に約１回、毎月約１回、２ヶ月ごとに約１回、３ヶ月ごとに約１回、６ヶ月ごとに約１回、または１年に約１回、投与され得る。

【0233】

併用療法および追加の治療剤
様々な実施形態では、本出願の医薬組成物は、追加の治療剤（複数可）と併用して共投与される。共投与は、同時または逐次的であり得る。

【0234】

一実施形態では、追加の治療剤および本出願のＣＤ２０結合剤は、対象に同時に投与される。本明細書で使用される場合、用語「同時に」は、追加の治療剤およびＣＤ２０結合剤が、約６０分以下、例えば約３０分以下、約２０分以下、約１０分以下、約５分以下、または約１分以下の時間間隔で投与されることを意味する。追加の治療剤およびＣＤ２０結合剤の投与は、単一の配合物（例えば、追加の治療剤およびＣＤ２０結合剤を含む配合物）または別個の配合物（例えば、追加の治療剤を含む第１の配合物およびＣＤ２０結合剤を含む第２の配合物）を同時に投与することによってもよい。

【0235】

共投与では、それらの投与のタイミングが、追加の治療剤およびＣＤ２０結合剤の薬理学的活性が時間的に重複し、それによって併用治療効果を発揮するようなものである場合、治療剤を同時に投与する必要はない。例えば、追加の治療剤およびＣＤ２０結合剤は、逐次的に投与することができる。本明細書で使用される用語「逐次的」は、追加の治療剤およびＣＤ２０結合剤が約６０分を超える時間離して投与されることを意味する。例えば、追加の治療剤とＣＤ２０結合剤の逐次投与の間の時間は、約６０分超、約２時間超、約５時間超、約１０時間超、約１日超、約２日超、約３日超、約１週間超、または約２週間超、または約１ヶ月超離れていてもよい。最適な投与時間は、投与される追加の治療剤およびＣＤ２０結合剤の代謝、排泄速度および／または薬力学的活性に依存する。追加の治療剤またはＣＤ２０結合剤細胞のいずれかを最初に投与することができる。

【0236】

また、共投与では、同じ投与経路によって治療剤を対象に投与する必要はない。むしろ、各治療剤は、任意の適切な経路、例えば、非経口または非経口的でなく投与することができる。

【0237】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ２０結合剤は、別の治療剤と共投与した場合に相乗的に作用する。このような実施形態では、ＣＤ２０結合剤および追加の治療剤は、単独療法の状況で剤が使用される場合に用いられる用量よりも少ない用量で投与されてもよい。

【0238】

いくつかの実施形態では、本出願は、追加の治療剤としての化学療法剤に関する。例えば、これに限定するものではないが、本発明のＣＤ２０結合剤と化学療法剤のこのような組み合わせは、本明細書の他の箇所に記載されているように、癌の治療での使用が見出される。化学療法剤の例には、これに限定されるものではないが、チオテパおよびシトキサンシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチルオロメラミンなどのエチレンイミンおよびメチルアミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン類（例えば、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙ ｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ－１０６５（そのアドゼネシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体）；クリプトフィシン（例えば、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９およびＣＢ １－ＴＭ１）；エレウテロビン；パンクラティスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコディクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアマイシンガンマＩＩ、およびカリケアマイシンωｌｌ（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．編集Ｅｎｇｌ．，３３：１８３－１８６（１９９４））；ダイネミシンＡなどのダイネミシン；クロドロナートなどのビスホスホナート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、アドリアマイシンドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの抗代謝物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カラステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、エピチオスタノール、メピトステスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン類；ミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎類；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシンおよびアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）などのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫポリサッカリド複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）；レゾキサン；リゾキシン；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（例えば、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアンギジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、タキソールパクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．），アブラキサンＣｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有、パクリタキセルのアルブミン工学ナノ粒子配合物（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，１１１．）、およびタキソテールドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸塩；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ，ＣＰＴ－１１）（５－ＦＵおよびロイコボリンを含むイリノテカンの治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）；細胞増殖を減少させるＰＫＣ－α、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（タルセバ））およびＶＥＧＦ－Ａの阻害剤、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体。さらに、治療方法は、光線力学療法の使用をさらに含むことができる。

【0239】

いくつかの実施形態では、本出願は、ＣＤ２０結合剤および化学療法剤を使用する併用療法に関する。いくつかの実施形態では、本出願は、化学療法剤による治療を受けている患者へのＣＤ２０結合剤の投与に関する。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、これに限定するものではないが、ドキソルビシン、シスプラチン、ダウノルビシン、およびエピルビシンなどのＤＮＡインターカレート剤である。一実施形態では、ＤＮＡインターカレート剤はドキソルビシンである。

【0240】

例示的な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、ドキソルビシンと共投与される場合、相乗的に作用する。例示的な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、腫瘍または癌を治療する際に使用するためにドキソルビシンと共投与される場合、相乗的に作用する。例えば、ＣＤ２０結合剤とドキソルビシンの共投与は、腫瘍もしくは癌を減少もしくは排除するか、または腫瘍もしくは癌の増殖、および／もしくは進行、および／もしくは転移を遅らせるために相乗的に作用し得る。例示的な実施形態では、ＣＤ２０結合剤とドキソルビシンとの組み合わせは、単独療法の状況において単独で使用される剤と比較して、改善された安全性プロファイルを呈し得る。例示的な実施形態では、ＣＤ２０結合剤およびドキソルビシンは、単独療法の状況で剤が使用される場合に用いられる用量よりも少ない用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、突然変異型ＩＦＮαなどの突然変異型インターフェロンを含む。例示的な実施形態では、突然変異型ＩＦＮαは、配列番号１２７または配列番号１２８に関して、置換Ｍ１４８Ａ、Ｒ１４９Ａ、およびＬ１５３Ａなど、位置１４８、１４９および１５３での１つ以上の突然変異を含む。

【0241】

いくつかの実施形態では、本出願は、１つ以上の免疫調節剤、例えば、これに限定するものではないが、免疫チェックポイントを調節する剤との併用療法に関する。様々な実施形態では、免疫調節剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２のうちの１つ以上を標的とする。様々な実施形態では、免疫調節剤はＰＤ－１阻害剤である。様々な実施形態では、免疫調節剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＰＤ－Ｌ２のうちの１つ以上に特異的な抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、これらに限定するものではないが、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８／ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＭＥＲＣＫ）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１、ＣＵＲＥ ＴＥＣＨ）、ＭＫ－３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）などの抗体である。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、ＣＤ１３７またはＣＤ１３７Ｌのうちの１つ以上を標的とする。様々な実施形態では、免疫調節剤は、ＣＤ１３７またはＣＤ１３７Ｌのうちの１つ以上に特異的な抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、これらに限定するものではないが、ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３および抗４－１ＢＢ抗体としても公知である）などの抗体である。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、固形腫瘍、および／またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫、および／または頭頸部癌、および／または多発性骨髄腫の治療のためにウレルマブ（任意により、ニボルマブ、リリルマブおよびウレルマブの１つ以上）と組み合わせられる。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、ＣＴＬＡ－４、ＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ－２、およびＰＰＰ２Ｒ５Ａのうちの１つ以上を標的とする剤である。様々な実施形態では、免疫調節剤は、ＣＴＬＡ－４、ＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ－２、およびＰＰＰ２Ｒ５Ａのうちの１つ以上に特異的な抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、これらに限定するものではないが、イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、Ｙｅｒｖｏｙ、ＢＭＳ）および／またはトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）などの抗体である。いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、メラノーマ、前立腺癌、および肺癌のうちの１つ以上の治療のために、イピリムマブ（任意によりバビツキシマブ）と組み合わせられる。様々な実施形態では、免疫調節剤はＣＤ２０を標的とする。様々な実施形態では、免疫調節剤は、抗体特異的ＣＤ２０である。例えば、いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、これらに限定するものではないが、オファツムマブ（（ＧＥＮＭＡＢ）、オビヌツズマブ（ＧＡＺＹＶＡ）、ＡＭＥ－１３３ｖ（ＡＰＰＬＩＥＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ）、オクレリズマブ（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、ＴＲＵ－０１５（ＴＲＵＢＩＯＮ／ＥＭＥＲＧＥＮＴ）、ベルツズマブ（ＩＭＭＵ－１０６）などの抗体である。一実施形態では、免疫調節剤は、ＯＸ４０を標的とする抗体である。

【0242】

いくつかの実施形態では、本出願は、ＣＤ２０結合剤およびチェックポイント阻害剤を用いる併用療法に関する。いくつかの実施形態では、本出願は、チェックポイント阻害剤による治療を受けている患者へのＣＤ２０結合剤の投与に関する。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、およびＣＴＬＡ－４のうちの１つ以上を標的とする剤である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８／ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＭＥＲＣＫ）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１、ＣＵＲＥ ＴＥＣＨ）、ＭＫ－３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）、イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、Ｙｅｒｖｏｙ、ＢＭＳ）、およびトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）のうちの１つ以上である。一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体である。

【0243】

例示的な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨと共投与される場合、相乗的に作用する。例示的な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、腫瘍または癌を治療する際に使用するために、抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨと共投与される場合、相乗的に作用する。例えば、ＣＤ２０結合剤と抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨの共投与は、腫瘍もしくは癌を減少もしくは排除するか、または腫瘍もしくは癌の増殖、および／もしくは進行、および／もしくは転移を遅らせるために相乗的に作用し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤と抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨとの組み合わせは、単独療法の状況において単独で使用される剤と比較して、改善された安全性プロファイルを呈し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤および抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨは、剤が単独療法の状況で使用される場合に用いられる用量よりも少ない用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、突然変異型ＩＦＮαなどの突然変異型インターフェロンを含む。例示的な実施形態では、突然変異型ＩＦＮαは、配列番号１２７または配列番号１２８に関して、置換Ｍ１４８Ａ、Ｒ１４９Ａ、およびＬ１５３Ａなど、位置１４８、１４９および１５３での１つ以上の突然変異を含む。

【0244】

いくつかの実施形態では、本出願は、Ｔｒｅｇ細胞の枯渇と組み合わせたＣＤ２０結合剤の投与に関する。

【0245】

いくつかの実施形態では、本出願は、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１０７７９号、国際公開第２０１５／００７５３６号、国際公開第２０１５／００７５２０号、国際公開第２０１５／００７５４２号、および国際公開第２０１５／００７９０３号に記載されている１つ以上のキメラ剤との併用療法に関する。

【0246】

これに限定するものではないが、感染症の用途を含むいくつかの実施形態では、本出願は、追加の治療剤としての抗感染薬に関する。いくつかの実施形態では、抗感染剤は、これらに限定するものではないが、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、ファムシクロビル、ホスカルネットなどの抗ウイルス剤である。いくつかの実施形態では、抗感染薬は、これらに限定するものではないが、セファロスポリン抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、およびセフトビプロール）；フルオロキノロン系抗生物質（シプロ、レバキン、フロキシン、テクイン、アベロックス、およびノルフロックス）；テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、およびドキシサイクリン）；ペニシリン抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、およびメチシリン）；モノバクタム系抗生物質（アズトレオナム）；カルバペネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、およびメロペネム）などの抗菌剤である。いくつかの実施形態では、抗感染薬としては、抗マラリア薬（例えば、クロロキン、キニーネ、メフロキン、プリマキン、ドキシサイクリン、アルテメテル／ルメファントリン、アトバコン／プログアニル、およびスルファドキシン／ピリメタミン）、メトロニダゾール、チニダゾール、イベルメクチン、パモ酸ピランテル、およびアルベンダゾールが挙げられる。

【0247】

これに限定されるものではないが、自己免疫用途などのいくつかの実施形態では、追加の治療剤は免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は、ステロイド性抗炎症剤または非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）などの抗炎症剤である。ステロイド、特に副腎皮質ステロイドおよびそれらの合成類似体は、当該分野において周知である。本出願で有用なコルチコステロイドの例としては、これらに限定されるものではないが、ヒドロキシルトリアムシノロン、α－メチルデキサメタゾン、β－メチルベタメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ベタメタゾン安息香酸塩、ベタメタゾンジプロピオン酸塩、ベタメタゾン吉草酸塩、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、ピバル酸フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル（ｆｌｕｃｏｒｔｉｎｅ ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロゾン、フルラドレノロンアセトニド（ｆｌｕｒａｄｒｅｎｏｌｏｎｅ ａｃｅｔｏｎｉｄｅ）、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、β－メタゾンおよびそのエステルの残部、クロロプレドニゾン、クロコルテロン（ｃｌｏｃｏｒｔｅｌｏｎｅ）、クレスシノロン（ｃｌｅｓｃｉｎｏｌｏｎｅ）、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド（ｆｌｕｃｌｏｒｏｎｉｄｅ）、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾンが挙げられる。本開示に使用され得る（ＮＳＡＩＤＳ）としては、これらに限定するものではないが、サリチル酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸メチル、サリチル酸グリコール、サリチルミド（ｓａｌｉｃｙｌｍｉｄｅｓ）、ベンジル－２，５－ジアセトキシ安息香酸、イブプロフェン、フリンダク（ｆｕｌｉｎｄａｃ）、ナプロキセン、ケトプロフェン、エトフェナマート、フェニルブタゾン、およびインドメタシンが挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質（例えば、アザチオプリン、メトトレキサート）、細胞傷害性抗生物質、抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、およびムロモナブ）、抗イムノフィリン（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス）、インターフェロン、オピオイド、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノール酸塩、小型生物剤（例えば、フィンゴリモド、ミリオシン）などの細胞増殖抑制剤であってもよい。追加の抗炎症剤は、例えば、米国特許第４，５３７，７７６号に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0248】

いくつかの実施形態では、本出願は、ＣＤ２０結合剤および免疫抑制剤を使用する併用療法に関する。いくつかの実施形態では、本出願は、免疫抑制剤による治療を受けている患者へのＣＤ２０結合剤の投与に関する。一実施形態では、免疫抑制剤はＴＮＦである。

【0249】

例示的な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、ＴＮＦと共投与される場合、相乗的に作用する。例示的な実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、腫瘍または癌を治療する際に使用するためにＴＮＦと共投与される場合、相乗的に作用する。例えば、ＣＤ２０結合剤とＴＮＦの共投与は、腫瘍もしくは癌を減少もしくは排除するか、または腫瘍もしくは癌の増殖、および／もしくは進行、および／もしくは転移を遅らせるために相乗的に作用し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤とＴＮＦとの組み合わせは、単独療法の状況において単独で使用される剤と比較して、改善された安全性プロファイルを呈し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤およびＴＮＦは、単独療法の状況で剤が使用される場合に用いられる用量よりも少ない用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０結合剤は、突然変異型ＩＦＮαなどの突然変異型インターフェロンを含む。例示的な実施形態では、突然変異型ＩＦＮαは、配列番号１２７または配列番号１２８に関して、置換Ｍ１４８Ａ、Ｒ１４９Ａ、およびＬ１５３Ａなど、位置１４８、１４９および１５３での１つ以上の突然変異を含む。

【0250】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ２０結合剤は、共有結合による付着が組成物の活性を妨げないように、すなわち任意のタイプの分子の組成物への共有結合による付着により修飾された誘導体を含む。例えば、非限定的例としては、誘導体は、とりわけ、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドへの連結、または他のタンパク質などによって修飾された組成物が挙げられる。これらに限定されるものではないが、特定の化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成など、公知の技術によって多数の化学修飾のいずれかを行うことができる。

【0251】

さらに他の実施形態では、本明細書に記載のＣＤ２０結合剤は、細胞傷害剤をさらに含み、例示的実施形態では、毒素、化学療法剤、およびアポトーシスまたは細胞死を引き起こす剤を含む。このような剤は、本明細書に記載の組成物にコンジュゲートすることができる。

【0252】

したがって、本明細書に記載のＣＤ２０結合剤は、化学リンカーなどのエフェクター部分、例えば蛍光色素、酵素、基質、生物発光物質、および化学発光部分などの検出可能な部分、またはストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、細胞毒素および細胞傷害剤などの機能的部分を付加するために、翻訳後に修飾されてもよい。

【0253】

例示的な細胞毒性剤としては、これらに限定されるものではないが、メトトレキサート、アミノプテリン、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）；メクロレタミン、チオエパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、マイトマイシンＣ、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、１－メチルニトロソ尿素、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メクロレタミン、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、シス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチンおよびカルボプラチン（パラプラチン）などのアルキル化剤；ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロンおよびビスアントレンなどのアントラサイクリン類；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ブレオマイシン、カリケアミシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）などの抗生物質；およびビンカアルカロイド、ビンクリスチンおよびビンブラスチンなどの抗有糸分裂剤が挙げられる。他の細胞傷害剤としては、パクリタキセル（タキソール）、リシン、シュードモナス外毒素、ゲムシタビン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｉｎｄｉｏｎｅ）、１－デヒドロテストステロン（１－ｄｅｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、ミトタン（ｍｙｔｏｔａｎｅ）（Ｏ，Ｐ’－（ＤＤＤ））、インターフェロン、およびこれらの細胞毒性剤の混合物が挙げられる。

【0254】

さらなる細胞毒性剤としては、これらに限定されるものではないが、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、カリケアミシン、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＥＧＦＲアンタゴニスト、プラチン、タキソール、イリノテカン、５－フルオロウラシル、ゲムシタビン、ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎｅ）、ステロイド、シクロホスファミド、メルファラン、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）、ムスチン、チロシンキナーゼ阻害剤、性ホルモンアンタゴニスト、選択的アンドロゲン受容体モジュレータ、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、ＰＤＧＦアンタゴニスト、ＴＮＦアンタゴニスト、ＩＬ－１アンタゴニスト、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２）、ＩＬ－１２Ｒアンタゴニスト、毒素結合モノクローナル抗体、腫瘍抗原特異的モノクローナル抗体、アービタックス、アバスチン、ペルツズマブ、抗ＣＤ２０抗体、リツキサン、オクレリズマブ、オファツムマブ、ＤＸＬ６２５、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）またはそれらの任意の組み合わせなどの化学療法剤が挙げられる。リシン、ジフテリア毒素およびシュードモナス毒素などの植物および細菌由来の毒性酵素は、細胞型特異的死滅試薬を生成するために治療剤（例えば、抗体）にコンジュゲートしてもよい（Ｙｏｕｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：５４８３（１９８０年）；Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４５３９（１９８０年）；Ｋｒｏｌｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：５４１９（１９８０年））。他の細胞毒性剤には、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第６，６５３，１０４号によって記述されるとおり、細胞傷害性リボヌクレアーゼが挙げられる。

【0255】

例示的な検出可能な部分としては、これらに限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼがさらに挙げられる。さらなる例示的な蛍光物質としては、これらに限定するものではないが、ローダミン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ウンベリフェロン、ジクロロトリアジニルアミン、フィコエリトリンおよびダンシルクロリドが挙げられる。さらなる例示的な化学発光部分としては、ルミノールが挙げられるが、これに限定されない。さらなる例示的な生物発光物質としては、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0256】

治療方法
本明細書に記載の方法および組成物は、ＣＤ２０陽性細胞を伴う様々な疾患および障害の治療への適用を有する。様々な実施形態では、疾患および障害としては、これらに限定するものではないが、癌、感染症、免疫障害、炎症性疾患または状態、自己免疫疾患および神経学的障害が挙げられる。

【0257】

さらに、本発明の剤のいずれかは、ＣＤ２０陽性細胞が関与する種々の疾患および障害（これらに限定するものではないが、癌、感染症、免疫障害、炎症性疾患または状態、自己免疫疾患および神経学的障害）の治療に使用するため、または治療用医薬品の製造に使用するための剤であってもよい。

【0258】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、形質細胞異常症、慢性リンパ球性白血病、移植治療、ヘアリー細胞白血病、ＩＴＰ、幹細胞移植後のエプスタイン・バーウイルス・リンパ腫、および腎移植など、ＣＤ２０＋細胞の枯渇が治療上有益である疾患の治療のために使用される。他の実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、骨髄腫、自己免疫疾患、移植、移植片対宿主病、Ｂ細胞を伴う感染症、リンパ球増殖症から選択される疾患の治療、ならびにＢ細胞活性および／もしくは体液性免疫の抑制が望ましく抑制されている任意の疾患または状態の治療から選択される疾患の治療のために使用される。特定の実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、骨髄腫、移植、移植片対宿主病、自己免疫疾患、リンパ増殖状態、ならびに体液性免疫、Ｂ細胞機能、および／または増殖の阻害が治療上有益である他の治療の疾患および状態からなる群から選択される疾患の治療に使用される。さらなる実施形態では、本出願のＣＤ２０結合分子は、Ｂ－ＡＬＬ、ヘアリー細胞白血病、多発性骨髄腫、リヒター症候群、獲得した第ＶＩＩＩ因子阻害剤、抗リン脂質症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、水疱性類天疱瘡、寒冷赤血球凝集素症、エバンス症候群、グッドパスチャー症候群、特発性膜性腎症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＭ関連多発性神経障害、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）関連多中心性キャッスルマン病（ＭＣＤ）、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、赤芽球癆、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性免疫複合脈管炎、全身性エリテマトーデス、ＩＩ型混合クリオグロブリン血症、ウェゲナー肉芽腫症、同種移植片拒絶反応、移植後リンパ増殖性疾患、または骨髄移植のための幹細胞のパージの治療のために使用される。

【0259】

いくつかの実施形態では、本出願は、癌の治療または癌を有する患者の治療に関する。本明細書中で使用される場合、癌は、身体の器官および系の正常な機能を妨害する可能性のある、細胞の制御されていないあらゆる増殖を指し、原発性腫瘍および転移性腫瘍の両方を含む。原発性腫瘍または癌が元の位置から移動し、重要な器官に播種すると、最終的には、罹患した器官の機能的劣化により対象の死を招くおそれがある。転移は、原発性腫瘍から身体の他の部分への癌細胞の伝播の結果として、原発性腫瘍の位置とは異なる癌細胞または癌細胞群である。転移は最終的に対象の死を招くおそれがある。例えば、癌としては、良性および悪性の癌、ポリープ、過形成、ならびに休眠腫瘍または微小転移が挙げられる。

【0260】

治療され得る例示的な癌としては、これらに限定するものではないが、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳および中枢神経系の癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸および直腸癌；結合組織癌；消化器系癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌（胃腸癌を含む）；神経膠芽細胞腫；肝癌；肝細胞癌；上皮内新生物；腎癌；喉頭癌；白血病；肝癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌）；メラノーマ；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（口唇、舌、口、および咽頭）；卵巣癌；膵癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系癌；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮細胞癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮または子宮内膜癌；泌尿器系癌；外陰部癌；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）など）；小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性／濾胞性ＮＨＬ；中悪性びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性小非切断細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ならびにワルデンストレームマクログロブリン血症；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；他の癌腫および肉腫；ならびに移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）ならびにファコマトーシスに伴う異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）、ならびにメイグス症候群が挙げられる。

【0261】

いくつかの実施形態では、癌は白血病またはリンパ腫である。例示的な白血病またはリンパ腫としては、これらに限定されるものではないが、Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度および中悪性度の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などの非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）再発性ホジキン病、高悪性度の抵抗性ホジキン病、リンパ球優位型のサブタイプのホジキンリンパ腫、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、低悪性度、中悪性度および高悪性度ＦＬなどの濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、ならびに未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）から選択される白血病またはリンパ腫が挙げられる。

【0262】

様々な実施形態では、本発明の組成物は、例えば炎症性疾患または状態、例えば、炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸器系疾患、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症性ショック、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、炎症性骨盤疾患、疼痛、眼炎症性疾患、セリアック病、リー症候群、グリセロールキナーゼ欠損症、家族性好酸球増多症（ＦＥ）、常染色体劣性痙性運動失調、喉頭炎症性疾患；結核、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、ケイ肺症および他のじん肺症など、１つ以上の免疫障害を治療または予防するために使用される。

【0263】

いくつかの実施形態では、例示的な免疫障害としては、これらに限定されないが、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、血管炎、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経障害、重症筋無力症、真性糖尿病、レイノー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、Ｃ型肝炎関連クリオグロブリン血症性血管炎、慢性限局性脳炎、血友病Ａ、膜性増殖性糸球体腎炎、成人型および若年性皮膚筋炎、成人多発性筋炎、慢性蕁麻疹、原発性胆汁性肝硬変、視神経脊髄炎、グレーブス甲状腺異常疾患、水疱性皮膚疾患、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、チャーグ・ストラウス症候群、喘息、乾癬性関節炎、皮膚炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｔｓ）、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎、ブドウ膜炎、湿疹、アテローム性動脈硬化症、白血球接着不全症、若年発症糖尿病、ライター病、ベーチェット病、溶血性貧血、アトピー性皮膚炎、ウェゲナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性感染性単核球症、ＨＩＶおよびヘルペス関連疾患、全身性硬化症、シェーグレン症候群および糸球体腎炎、皮膚筋炎、ＡＮＣＡ血管炎、再生不良性貧血、自己免疫性貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、赤芽球癆、エバンス症候群、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、固形臓器移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）、ギランバレー症候群、大型血管炎、巨大細胞（高安）動脈炎、中型血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎、デビック病、自己免疫性膵炎、オプソクローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、ＩｇＧ４関連疾患、強皮症、および慢性疲労症候群が挙げられる。

【0264】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、および他のＡＮＣＡ関連血管炎、結節性多発動脈炎、本態性クリオグロブリン血症性血管炎、皮膚白血球破砕性血管炎、川崎病、高安動脈炎、巨大細胞関節炎、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、原発性または単離性大脳血管炎、結節性紅斑、閉塞性血栓性血管炎、血栓性血小板減少性紫斑病（溶血性尿毒症症候群など）、皮膚白血球梗塞性血管炎（例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ワルデンストレームマクログロブリン血症、Ｂ細胞の新生物、リウマチ性関節炎、シェーグレン症候群、または全身性エリテマトーデスに続発）を含む二次血管炎などの血管炎および他の血管疾患を治療するために利用され得る。さらなる例は、結節性紅斑、アレルギー性血管炎、脂肪層炎、ウェーバークリスチャン病、紫斑高グロブリン血症、およびバージャー病である。

【0265】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、接触性皮膚炎、線状ＩｇＡ皮膚病、白斑、壊疽性膿皮症、後天性表皮水疱症、尋常性天疱瘡（瘢痕性類天疱瘡および水疱性類天疱瘡など）、円形脱毛症（全身脱毛症および完全脱毛症など）、疱疹状皮膚炎、多形紅斑、および慢性自己免疫性蕁麻疹（血管運動神経性水腫および蕁麻疹様血管炎など）などの皮膚疾患を治療するために利用され得る。

【0266】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、自己免疫性好中球減少症および赤芽球癆などの免疫介在性血球減少症を治療するために利用され得る。

【0267】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、ＣＮＳ狼瘡、円板状エリテマトーデス、ＣＲＥＳＴ症候群、混合性結合組織疾患、多発性筋炎／皮膚筋炎、封入体筋炎、続発性アミロイドーシス、寒冷グロブリン血症Ｉ型およびＩＩ型、線維筋痛症、リン脂質抗体症候群、続発性血友病、再発性多発軟骨症、サルコイドーシス、スティッフマン症候群、リウマチ熱など、結合組織障害を治療するために使用され得る。さらなる例は、好酸球性筋膜炎である。

【0268】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、強直性脊椎炎、若年性慢性関節炎、成人スティル病およびＳＡＰＨＯ症候群などの関節炎を治療するために利用され得る。さらなる例は、仙腸骨炎（ｓａｃｒｏｉｌｅｉｔｉｓ）、反応性関節炎、スティル病、および痛風である。

【0269】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、再生不良性貧血、原発性溶血性貧血（寒冷アグルチニン症候群など）、ＣＬＬまたは全身性エリテマトーデスに続発する溶血性貧血；ＰＯＥＭＳ症候群、悪性貧血、およびＷａｌｄｅｍｓｔｒｏｍ高グロブリン血症性紫斑などの血液学的障害の治療に利用され得る。さらなる例は顆粒球減少症、自己免疫性好中球減少症、フランクリン病、セリグマン病、μ鎖疾患、胸腺腫およびリンパ腫に続発する腫瘍随伴症候群、第ＶＩＩＩ因子インヒビターの形成である。

【0270】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、内分泌障害、例えば、多腺性内分泌障害およびアジソン病を治療するために利用され得る。さらなる例は、自己免疫性低血糖症、自己免疫性甲状腺機能低下症、自己免疫性インスリン症候群、ド・ケルヴァン甲状腺炎、およびインスリン受容体抗体介在性インスリン抵抗性である。

【0271】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、セリアック病、ホイップル病、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、および原発性硬化性胆管炎などの肝臓－胃腸障害を治療するために利用されてもよい。さらなる例は、自己免疫性胃炎である。

【0272】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、急速進行性糸球体腎炎、溶連菌感染後糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、膜性糸球体腎炎およびクリオグロブリン腎炎などの腎症の治療に利用することができる。さらなる例は、微小変化型疾患である。

【0273】

いくつかの実施形態では、本出願は、神経障害の治療または神経障害を有する患者の治療に関する。例示的な神経障害としては、これに限定されるものではないが、多発性硬化症（ＭＳ；これに限定されるものではないが、良性の多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）、二次性進行性多発性硬化症（ＳＰＭＳ）、進行性再発性多発性硬化症（ＰＲＭＳ）、および原発性進行性多発性硬化症（ＰＰＭＳ））、アルツハイマー病（これに限定されないが、早期発症型アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）、パーキンソン病およびパーキンソニズム（これらに限定するものではないが、特発性パーキンソン病、血管パーキンソニズム、薬物誘発パーキンソニズム、レビー小体病、継承されたパーキンソン病（Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ）、若年性パーキンソン病）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、これらに限定するものではないが、孤発性ＡＬＳ、家族性ＡＬＳ、西太平洋ＡＬＳ、若年性ＡＬＳ、ヒラマヤ病）、自己免疫性神経障害、多発性単神経炎、ランバート・イートン筋萎縮症候群、シデンハム舞踏病、脊髄癆、ギランバレー症候群が挙げられ、さらなる例はミエロパシー／熱帯性痙攣不全麻痺、重症筋無力症、急性炎症性脱髄性多発神経障害、および慢性炎症性脱髄性多発神経障害が挙げられる。

【0274】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、線維化肺胞炎、閉塞性細気管支炎、アレルギー性アスペルギルス症、嚢胞性線維症、レフラー症候群、心筋炎および心膜炎などの心臓および肺障害を治療するために利用され得る。さらなる例は、過敏性肺炎、および肺癌に続発する腫瘍随伴症候群である。

【0275】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、気管支喘息および高ＩｇＥ症候群などのアレルギー疾患を治療するために利用され得る。さらなる例は一過性黒内障である。

【0276】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、特発性脈絡網膜炎などの眼疾患を治療するために利用され得る。

【0277】

いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、同種異系移植片および異種移植片の拒絶などの移植由来障害および移植片対宿主病を治療するために利用され得る。いくつかの実施形態では、本出願のＣＤ２０結合剤は、移植後に利用され得る。

【0278】

いくつかの実施形態では、本出願は、微生物感染および／または慢性感染（例えば、Ｂ細胞の感染）の治療またはそれらの患者に関する。例示的な感染症としては、これらに限定するものではないが、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、結核、骨髄炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エプスタイン・バーウイルスまたはパルボウイルス、Ｔ細胞白血病ウイルス、細菌過増殖症候群、真菌感染または寄生虫感染が挙げられる。

【0279】

キット
本出願はまた、本明細書に記載される任意のＣＤ２０結合剤の投与のためのキット（例えば、追加の治療剤を含むかまたは含まない）を提供する。キットは、本明細書に記載の本発明の医薬組成物のうちの少なくとも１つを含む材料または構成要素の集合体である。したがって、いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを含む。

【0280】

キットに構成されている構成要素の正確な性質は、その意図する目的によって異なる。一実施形態では、キットは、ヒト対象を治療する目的で構成される。

【0281】

使用説明書は、キットに含まれ得る。使用説明書は、典型的には、癌を治療するためのような所望の治療成果を達成するためにキットの構成要素を使用する際に用いられる技術を記述する具体的な表現を含む。任意により、キットには、希釈剤、緩衝液、薬学的に許容される担体、シリンジ、カテーテル、アプリケータ、ピペットまたは測定器具、包帯材料または当業者によって容易に認識されるような他の有用な器具など、他の有用な構成要素も含まれている。

【0282】

キットに組み立てられた材料および構成要素は、その操作性および有用性を保持する任意の便利かつ適切な方法で保管されて、施術者に提供することができる。例えば、構成要素は、室温、冷蔵温度または凍結温度で提供することができる。これらの構成要素は、典型的には好適な包装材料に含まれる。様々な実施形態では、包装材料は、好ましくは滅菌された汚染物質のない環境を提供するために、周知の方法によって構築される。包装材料は、キットおよび／またはその構成要素の内容物および／または目的を示す外部ラベルを有してもよい。

【0283】

定義
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は１つまたは複数を意味することができる。

【0284】

さらに、参照数字表示と関連して使用される用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、その参照数字表示の最大１０％までのプラスまたはマイナスの参照数字表示を意味する。例えば、言語「約５０」は４５～５５の範囲を網羅する。

【0285】

医学的使用に関連して使用される「有効量」は、目的の疾患の病因発生率の測定可能な治療、予防または減少をもたらすのに有効な量である。

【0286】

本明細書中で使用される場合、活性および／または効果の読み値が、有意な量、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、またはそれ以上、少なくとも１００％以下（１００％を含む）など、減少した場合には、剤または刺激の存在下で、そのような調節がない場合に対して、「減少」している。当業者に理解されるように、いくつかの実施形態では、活性は低下し、いくつかの下流の読み値は減少するが、他のものは増加し得る。

【0287】

逆に、活性および／または効果の読み値が、その剤または刺激が存在しない場合に対して、剤または刺激物質の存在下で有意な量だけ、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、またはそれ以上、最大で少なくとも約１００％またはそれ以上まで、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、増加する場合、活性は「増加」している。

【0288】

本明細書で言及されるように、全ての組成百分率は、特に明記しない限り、全組成物の重量による。本明細書で使用されるように、用語「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」およびその変形は、非限定的であり、このため、リスト内の項目の列挙は、この技術の組成物および方法においても有用であり得る他の同様の項目を排除するものではないことを意図している。同様に、用語「ｃａｎ」および「ｍａｙ」およびそれらの変形は、非限定的であり、このため、ある実施形態が特定の要素または特徴を含むことができるか、または含んでいてもよいとの言及は、これらの要素または特徴を含まない本技術の他の実施形態を排除するものではないことを意図している。

【0289】

「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などの用語の同義語である、オープンエンドの用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本発明を記述し請求するために本明細書で使用されるが、本発明またはその実施形態は、代替的用語、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などを用いて代替的に記述され得る。

【0290】

本明細書で使用されるとき、用語「好ましい（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）」および「好ましく（ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ）」は、特定の状況下で特定の利益をもたらす技術の実施形態を指す。しかし、同じまたは他の状況の下で、他の実施形態も好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の言及は、他の実施形態が有用ではないことを意味するものではなく、かつ他の実施形態を技術の範囲から排除することを意図するものではない。

【0291】

治療効果を達成するために必要とされる本明細書に記載の組成物の量は、特定の目的のための従来の手順に従って経験的に決定することができる。一般に、治療目的で治療剤を投与するために、治療剤は薬理学的有効量で投与される。「薬理学的有効量」、「薬理学的有効用量」、「治療有効量」、「有効量」は、所望の生理学的効果を生み出すのに十分な量、または特に障害もしくは疾患を治療するための所望の結果を達成することができる量を指す。本明細書で使用される有効量は、例えば、障害または疾患の症状の発症を遅延させる、障害または疾患の症状の経過を変える（例えば、疾患の症状の進行を遅らせる）、障害または疾患の１つ以上の症状または兆候を軽減または排除する、障害または疾患の症状を逆転させるのに十分な量を含む。治療上の利益には、改善が実現したかどうかに関わらず、根本的な疾患または障害の進行を停止または遅延させることも含まれる。

【0292】

有効量、毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の約５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の約５０％に治療上有効である用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存して変化し得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。いくつかの実施形態では、大きな治療指数を呈する組成物および方法が好ましい。治療有効用量は、例えば、細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイから最初に推定することができる。また、細胞培養または適切な動物モデルにおいて決定された場合、用量は、ＩＣ５０などの循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて配合することができる。記載された組成物の血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。あらゆる特定の投薬量の効果は、好適なバイオアッセイによってモニターすることができる。投薬量は、医師によって決定され、必要に応じて、観察された治療効果に適するように調節され得る。

【0293】

特定の実施形態では、効果は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約９０％の定量可能な変化をもたらす。いくつかの実施形態では、効果は、約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、または約９０％以上の定量可能な変化をもたらす。治療上の利益には、改善が実現したかどうかに関わらず、根本的な疾患または障害の進行を停止または遅延させることも含まれる。

【0294】

本明細書で使用される場合、「治療方法」は、本明細書に記載の疾患または障害を治療するための組成物の使用、および／または本明細書に記載の疾患または障害を治療するための医薬品の製造において使用するための組成物の使用に等しく適用可能である。

【0295】

実施例
実施例１．ヒトＣＤ２０に特異的なＶＨＨの構築および評価
ヒトＣＤ２０遺伝子のクローニング
ヒトＣＤ２０は、フォワードプライマー５’－ＧＡＴＡＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＡＧ（Ｏ－７９５４）、およびリバースプライマー５’－ＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＧＧ（Ｏ－７９５６）を用いてＯｒｆｅｏｍｅ ｖ５．１ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＩＤ１１０５１）から増幅させた。増幅産物をＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで切断し、哺乳動物発現ベクターｐＭｅｔ７にライゲートさせた。このプラスミドは、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションのため、およびヒトＣＤ２０を安定に発現するＣＨＯ－Ｋ１クローンの生成のために使用された。

【0296】

抗原特異的ＶＨＨの単離
ＶＨＨライブラリを構築し、ヒトＣＤ２０を発現する安定にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞上で３回連続してパニング（溶液中）を行った。ＣＤ２０特異的ファージの濃縮を計算するための陰性対照としての役割を果たすために、親（非トランスフェクトＣＨＯ－Ｋ１）細胞に対して平行パニングを行った。抗原特異的ファージの濃縮は、各回のパニング後に、トランスフェクトされた細胞から溶出したファージミド粒子の数を、親細胞から溶出したファージミド粒子の数と比較することによって評価した。これらの実験は、（抗原特異的ファージについて）パニングの第１回目、第２回目、および第３回目の後に、それぞれ約２倍、８倍および４倍ファージ集団が濃縮されたことを示唆した。第２回目のパニングから合計で約９５個のコロニーを無作為に選択し、トランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１への特異的結合について、それらの粗製ペリプラズム抽出物（可溶性ＶＨＨなど）を親細胞と比較して、細胞ＥＬＩＳＡによって分析した。９５個のコロニーのうち６２個のコロニーがこのアッセイで陽性を示した。配列データに基づいて、６２個の陽性コロニーは１４個の異なるＶＨＨを表した（図１、上部パネル）。

【0297】

ＶＨＨライブラリを構築し、上記のとおりヒトＣＤ２０を発現する安定にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞上で３回連続してパニング（溶液中）を行った。ここで、ファージ集団は、３回目のパニング後に約７倍濃縮された（抗原特異的ファージについて）。１回目および２回目のパニングの後には、いかなる濃縮も観察されなかった。３回目のパニングから無作為に採取した約１４２個のコロニーを上記のように細胞ＥＬＩＳＡによって試験し、８個のコロニーが陽性を示した。配列データに基づいて、８個の陽性コロニーは３つの異なるＶＨＨを表した（図１、下部パネル）。３つの異なるＶＨＨは同じグループに属する。ここで特定されたグループは、以前に特定されたグループの１つと同じである。

【0298】

以下の表は、１７個の異なる抗ヒトＣＤ２０ ＶＨＨ遺伝子を表す１７個のクローンの説明を提供する。抗ヒトＣＤ２０ ＶＨＨ配列を含有する組換えファージミドｐＭＥＣＳを保有する大腸菌ＴＧ１を－８０℃で保存した。ベクターｐＭＥＣＳはアンピシリン耐性をコードする。

【表1】

【0299】

要約すると、以下の表に示すように、４つの異なるグループに属する１７個の異なるＶＨＨが同定された。１７個の抗ヒトＣＤ２０ ＶＨＨのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図２および図３に示す。

【表2】

【0300】

組換えｐＭＥＣＳを用いた非サプレッサー株（例えばＷＫ６）の形質転換
ｐＭＥＣＳベクターにクローニングされたＶＨＨ遺伝子は、Ｎ末端にＰｅｌＢシグナル配列、Ｃ末端にＨＡタグおよびＨｉｓ６タグ（ＰｅｌＢリーダー－ＶＨＨ－ＨＡ－Ｈｉｓ６）を含んでいた。ＰｅｌＢリーダー配列は、ＶＨＨを大腸菌のペリプラズム空間に向け、ＨＡおよびＨｉｓ６タグはＶＨＨの精製および検出に使用することができる（例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどで）。

【0301】

ｐＭＥＣＳベクターでは、Ｈｉｓ６タグの後にアンバー停止コドン（ＴＡＧ）が続き、このアンバー停止コドンの後にＭ１３ファージの遺伝子ＩＩＩが続いた。サプレッサー大腸菌株（例えばＴＧ１）では、アンバー停止コドンはグルタミンとして読み取られ、したがってＶＨＨは、パニングのために、ファージコート上のＶＨＨの表示を可能にするファージのプロテインＩＩＩとの融合タンパク質として発現した。非サプレッサー大腸菌株（例えば、ＷＫ６）では、アンバー停止コドンは停止コドンとして読み取られ、したがって、得られたＶＨＨはプロテインＩＩＩに融合しなかった。

【0302】

ｐＭＥＣＳベクターにクローン化されたＶＨＨを発現させ、精製するために、目的のＶＨＨの遺伝子を含むｐＭＥＣＳを調製し、非サプレッサー株（例えば、ＷＫ６）に形質転換させた。得られたクローンのＶＨＨは、ＭＰ０５７プライマー（５’－ＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ－３’）を用いて配列決定し、クローンの同一性を確認した。抗原結合能は、ＥＬＩＳＡまたは任意の他の適切なアッセイによって再試験した。次いで、ＶＨＨ遺伝子を有する組換えｐＭＥＣＳベクターを含む非サプレッサー株（例えば、ＷＫ６）は、本明細書に記載のＶＨＨを発現させ、精製するために使用した。

【0303】

ｐＭＥＣＳからｐＨＥＮ６ｃベクターへのＶＨＨ遺伝子の再クローニング
ｐＭＥＣＳベクターでは、ＶＨＨの保存時にＨｉｓ６タグが切断される（短期間でもあっても、また－２０℃であっても）。このように、ＶＨＨ遺伝子は、Ｈｉｓ６タグが検出に使用された場合などに、ｐＭＥＣＳからｐＨＥＮ６ｃベクターにサブクローニングさせた。

【0304】

ＶＨＨ遺伝子は、鋳型としてＶＨＨ遺伝子を保有する組換えｐＭＥＣＳを含む大腸菌およびプライマーＡ６ＥおよびＰＭＣＦを用いてＰＣＲにより増幅した。プライマーＡ６ＥおよびＰＭＣＦは、それぞれ、フレームワーク１およびフレームワーク４のプライマーである。プライマー配列は以下の通りであった：

【化1】

【0305】

増幅プロトコールは、約３０サイクルのＰＣＲを含み、各サイクルは９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で４５秒間から構成され、続いてＰＣＲ終了時に７２℃で１０分延長する）。約４００ｂｐの断片を増幅させた。

【0306】

ＰＣＲ産物を精製し（例えばＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により）、ＰｓｔＩにより一晩消化した。精製したＰＣＲ産物をＢｓｔＥＩＩ（またはＥｃｏ９１Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））で一晩消化した。消化に使用する温度は変化させた。例えば、酵素の供給者に応じて、５０℃または６０℃でＢｓｔＥＩＩによる消化を行った。

【0307】

ライゲーションのために、ｐＨＥＮ６ｃベクターをＰｓｔＩで３時間消化し、上記のように精製し、次いでＢｓｔＥＩＩで２～３時間消化した。あるいは、Ｅｃｏ９１Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて消化を行った。消化したベクターを、１％アガロースゲル上に流し、ベクターバンドをゲルから切り出して精製した（例えばＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）により）。続いてＰＣＲ断片をベクターにライゲートした。

【0308】

エレクトロコンピテントＷＫ６細胞をライゲーション反応で形質転換し、ＬＢ／寒天／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）／グルコース（１～２％）プレートを用いて形質転換体を選択した。陽性クローンをユニバーサルリバースプライマーおよびユニバーサルフォワードプライマーを用いてＰＣＲによりスクリーニングした。インサートが存在する場合には、約５５０ｂｐの断片を増幅させた。クローンの同一性を確認するために、ユニバーサルリバースプライマーを用いて各ＶＨＨあたり少なくとも２つのクローンを配列決定した。抗原結合能は、ＥＬＩＳＡまたは任意の他の適切なアッセイによって再試験した。

【0309】

上記のプロトコールに従い、ｐＨＥＮ６ｃベクターにクローニングしたＶＨＨ遺伝子を生成した。これは、Ｎ末端にＰｅｌＢシグナル配列を含み、Ｃ末端にＨｉｓ６－ｔａｉｌを含む。ＰｅｌＢリーダー配列はＶＨＨを大腸菌のペリプラズム空間に向け、ＨｉｓタグをＶＨＨの精製および検出に使用した（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどで）。

【0310】

ＶＨＨの発現および精製を行った。具体的には、１日目に、１０～２０ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）＋グルコース（１％）に、新たに形質転換したＷＫ６コロニーを播種した。この前培養物を３７℃で一晩、２００～２５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。２日目に、ＶＨＨを発現させるためにＴＢ培地を使用した。ＴＢ培地は、リットルあたり２．３ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、１６．４ｇのＫ_２ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ、１２ｇのトリプトン（Ｄｕｃｈｅｆａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）、２４ｇのイースト（Ｄｕｃｈｅｆａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）および４ｍｌの１００％グリセロール（Ｄｕｃｈｅｆａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）を含んでいた。

【0311】

１リットルのバッフル付き振盪フラスコに３３０ｍｌのＴＢを充填し、オートクレーブ処理した。ＫＨ_２ＰＯ_４およびＫ_２ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏはオートクレーブ処理しなかった。代わりに、ＫＨ_２ＰＯ_４およびＫ２ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏを調製し、ろ過滅菌し、次いで既にオートクレーブ処理した残りの培地に添加した。前培養物約１ｍｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、２ｍＭのＭｇＣｌ_２および０．１％グルコースを補充した３３０ｍｌのＴＢに添加し、続いて振盪（２００～２５０ｒｐｍ）しながらＯＤ_６００が０．６～０．９に達するまで３７℃で生育させた。ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加してＶＨＨ発現を誘導した。培養物を２８℃で一晩（約１６～１８時間）振盪しながらインキュベートした。一晩誘導した後のＯＤ_６００は通常２５～３０であった。１クローンあたり少なくとも１リットルの培養液（３ボトル）を平均収量１～１５ｍｇ／ｌで調製した。

【0312】

大腸菌のペリプラズムからのＶＨＨの抽出を３日目に行った。使用した溶液は、ＴＥＳ：０．２ＭトリスｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍスクロース、および水中で４倍に希釈したＴＥＳ／４：ＴＥＳを含んでいた。

【0313】

一晩誘導された培養物を８０００ｒｐｍで８分間遠心分離した。１リットルの培養物からの細胞ペレットをピペットで上下させて、１２ｍｌのＴＥＳに再懸濁し、氷上で１時間振盪した。使用した各１２ｍｌのＴＥＳにつき、約１８ｍｌのＴＥＳ／４を添加し、振盪しながらさらに１時間氷上でインキュベートし、続いて４℃、８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペリプラズム空間から抽出されたタンパク質を含む上清を新鮮なファルコンチューブに移した。

【0314】

続いて、以下の溶液を利用するＩＭＡＣによってＶＨＨを精製した：ＨＩＳ－ｓｅｌｅｃｔ（ＳＩＧＭＡ）、ＰＢＳ、および５０ｍＭ ＮａＡｃｅｔａｔｅ ｐＨ ４．６。

【0315】

Ｈｉｓ－ｓｅｌｅｃｔをＰＢＳで平衡化した。具体的には、１リットルの培養液に由来するペリプラズム抽出物１個につき、５０ｍｌのファルコンチューブに１ｍｌの樹脂（約２ｍｌのＨｉｓ－ｓｅｌｅｃｔ溶液）を加えた。ＰＢＳを最終容量５０ｍｌに加え、混合した。遠心分離は２０００ｒｐｍで２分間行い、上清を捨てた。樹脂を上記のようにＰＢＳで２回洗浄した。ペリプラズム抽出物を樹脂に添加し、穏やかに振盪しながら室温で３０分～１時間インキュベートした。サンプルは、底部にフィルターを有するＰＤ－１０カラムに装填し（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｃａｔ．Ｎｏ．１７－０４３５－０１）、５０～１００ｍｌのＰＢＳ（樹脂１ｍｌあたり５０～１００ｍｌのＰＢＳを使用した）で洗浄した。溶出は３回行い、各回、使用する樹脂１ｍｌあたり１ｍｌのＰＢＳ／０．５Ｍイミダゾールで行った（効率的に溶出するために、ビーズを再懸濁し、カラムの底を閉じたまま４℃で一晩放置した）。透析をＰＢＳに対して４℃で一晩（カットオフ３５００ダルトン）行い、イミダゾールを除去した。効率的な透析のために、透析緩衝液（ＰＢＳ）を２～３回交換した。あるいは、イミダゾールによる溶出の代わりに、結合したＶＨＨを１０ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．６で溶出することができた。ＶＨＨを溶出するために５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．６を使用した場合、溶出されたＶＨＨは１ＭトリスｐＨ８．０で直ちに中和され、透析は必要としなかった。

【0316】

タンパク質の量は、溶出したサンプルのＯＤ_２８０測定によって推定した。各クローンの吸光係数は、Ｅｘｐａｓｙプロテオミクスサーバの一次構造解析下でｐｒｏｔＰａｒａｍツールによって決定した。ＶＨＨのさらなる精製は、異なる方法によって達成することができた。例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６０上に装填するための適切な容量（最大４ｍｌ）が得られるまで、４℃、２０００ｒｐｍで遠心分離することによって、サンプルを濃縮することができた（Ｖｉｖａｓｐｉｎ ５０００ ＭＷカットオフ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）。濃縮サンプルを、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６０カラムに装填した。ピーク画分をプールし、定量のためにＯＤ_２８０測定を行った。一般に、ＶＨＨは、１ｍｌ／分で実行すると８５～９５分後に溶出した。濃縮ＶＨＨサンプルのアリコートを約１ｍｇ／ｍｌの濃度にて、－２０℃で保存した。

【0317】

実施例２．マウスＣＤ２０に特異的なＶＨＨの構築および評価
マウスＣＤ２０遺伝子のクローニング
マウスＣＤ２０をＩｍａｇｅｎｅｓ ｃａｔ＃ＩＲＡＶＰ９６８Ｃ１２８０Ｄから購入し、フォワードプライマー５’－ｇａｔａａｇａｔｃｔｃａＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＣＣＴＴＴＣＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣ（Ｏ－７９６２）およびリバースプライマー５’－ＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧ（Ｏ－７９６４）で増幅した。増幅産物をＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで切断し、哺乳動物発現ベクターｐＭｅｔ７にライゲートさせた。このプラスミドは、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションのため、およびマウスＣＤ２０を安定に発現するＣＨＯ－Ｋ１クローンの生成のために使用された。

【0318】

抗原特異的ＶＨＨの単離
ＶＨＨライブラリは、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から構築した。具体的には、ＰＢＬ由来の全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた第１鎖ｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた。このｃＤＮＡを用いて、ＶＨＨをコードする配列をＰＣＲにより増幅し、ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで消化し、ファージミドベクターｐＭＥＣＳのＰｓｔＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングした。約１０^７の独立した形質転換体のＶＨＨライブラリが得られた。約９０％の形質転換体が、正しいインサートサイズのベクターを保持していた。

【0319】

同様に、約１０^８の独立した形質転換体のサイズを有するＶＨＨライブラリを、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から得た。約６５％の形質転換体が、正しいインサートサイズのベクターを保持していた。

【0320】

ライブラリを、マウスＣＤ２０を発現する安定にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞上で３回連続してパニング（溶液中）した。ＣＤ２０特異的ファージの濃縮を計算するための陰性対照としての役割を果たすために、親（非トランスフェクトＣＨＯ－Ｋ１）細胞に対して平行パニングを行った。抗原特異的ファージの濃縮は、各回のパニング後に、トランスフェクトされた細胞から溶出したファージミド粒子の数を、親細胞から溶出したファージミド粒子の数と比較することによって評価した。これらの実験は、（抗原特異的ファージについて）パニングの第１回目、第２回目、および第３回目のそれぞれの後に約２倍、２倍および１０^３倍、ファージ集団が濃縮されたことを示唆した。合計で２８５個のコロニー（各パニングから９５個）を無作為に選択し、トランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１への特異的結合について、それらの粗製ペリプラズム抽出物（可溶性ＶＨＨなど）を親細胞と比較して、細胞ＥＬＩＳＡによって分析した。２８５個のコロニーのうち、１２４個のコロニー（それぞれ第１回目０個、第２回目４０個、および第３回目８４個）がこのアッセイで陽性を示した。配列データに基づいて、１２４個の陽性コロニーは１１個の異なるＶＨＨを表した（図４、上部パネル）。１１個の異なるＶＨＨは２つの異なるグループに属する。

【0321】

ライブラリを、上記のようにマウスＣＤ２０を発現する安定にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞上で２回連続して（溶液中で）パニングした。ここで、ファージ集団は、第１回目および第２回目のパニングの後、それぞれ約２倍および４５倍濃縮された（抗原特異的ファージについて）。ここでは、２回目のパニングから無作為に採取した１９０個のコロニーを上記のように細胞ＥＬＩＳＡによって試験し、１０個のコロニーが陽性を示した。配列データに基づいて、１０個の陽性コロニーは８つの異なるＶＨＨを表した（図４、下部パネル）。８つの異なるＶＨＨは２つの異なるグループに属する。ここで特定されたグループのうちの１つは、上記で特定されたグループの１つと同じグループである。

【0322】

このライブラリを４回連続してパニングに供し、これらは固相コーティングしたビオチン化マウスＣＤ２０ペプチド（３μｇ／ウェル）上で行った。ウェルへのペプチドのコーティングは、ストレプトアビジンによって媒介された。抗原特異的ファージの濃縮は、（ストレプトアビジン媒介性）抗原コーティングブロッキングウェルから溶出されたファージミド粒子の数を、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルから溶出されたファージミド粒子の数と比較して評価し、次いでブロッキングバッファでブロックした。これらの実験は、ファージ集団が３回目のパニング後にのみ抗原特異的ファージについてわずかに濃縮されたことを示唆した。ペプチド上での３回目のパニングから無作為に採取した１９０個のコロニーを、ビオチン化マウスＣＤ２０ペプチドへの特異的結合についてＥＬＩＳＡ（可溶性ＶＨＨを含む粗製ペリプラズム抽出物を用いたＥＬＩＳＡ）により分析した。１９０個のコロニーのうち５個のコロニーがこのアッセイで陽性を示した。配列データに基づいて、５個の陽性コロニーは２つの異なるＶＨＨを表した（図５）。２つの異なるＶＨＨは、細胞パニング／細胞ＥＬＩＳＡによって上記で同定された全ての群と比較して、異なる群ではあるが同じ群に属する。

【0323】

以下の表は、２１個の異なる抗マウスＣＤ２０ ＶＨＨ遺伝子を表す２１個のクローンの説明を提供する。抗マウスＣＤ２０ ＶＨＨ配列を含む組換えファージミドｐＭＥＣＳを保有する大腸菌 ＴＧ１を生成し、－８０℃で保存した。ベクターｐＭＥＣＳはアンピシリン耐性をコードする。

【表3】

【0324】

要約すると、以下の表に示すように、４つの異なるグループに属する２１個の異なるＶＨＨが同定された。２１個の抗マウスＣＤ２０ ＶＨＨのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図６および図７に示す。

【表4】

【0325】

組換えｐＭＥＣＳを用いた非サプレッサー株（例えばＷＫ６）の形質転換
ｐＭＥＣＳベクターにクローニングされたＶＨＨ遺伝子は、Ｎ末端にＰｅｌＢシグナル配列、Ｃ末端にＨＡタグおよびＨｉｓ６タグ（ＰｅｌＢリーダー－ＶＨＨ－ＨＡ－Ｈｉｓ６）を含んでいた。ＰｈｅＢリーダー配列はＶＨＨを大腸菌のペリプラズム空間に向け、ＨＡおよびＨｉｓ６タグをＶＨＨの精製および検出に使用した（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどで）。

【0326】

ｐＭＥＣＳベクターでは、Ｈｉｓ６タグの後にアンバー停止コドン（ＴＡＧ）が続き、このアンバー停止コドンの後にＭ１３ファージの遺伝子ＩＩＩが続いた。サプレッサー大腸菌株（例えばＴＧ１）では、アンバー停止コドンはグルタミンとして読み取られ、したがってＶＨＨは、パニングのために、ファージコート上のＶＨＨの表示を可能にするファージのプロテインＩＩＩとの融合タンパク質として発現した。非サプレッサー大腸菌株（例えば、ＷＫ６）では、アンバー停止コドンは停止コドンとして読み取られ、したがって、得られたＶＨＨはプロテインＩＩＩに融合しなかった。

【0327】

ｐＭＥＣＳベクターにクローン化されたＶＨＨを発現させ、精製するために、目的のＶＨＨの遺伝子を含むｐＭＥＣＳを調製し、非サプレッサー株（例えば、ＷＫ６）に形質転換させた。得られたクローンのＶＨＨは、ＭＰ０５７プライマー（５’－ＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ－３’）を用いて配列決定し、クローンの同一性を確認した。抗原結合能は、ＥＬＩＳＡまたは任意の他の適切なアッセイによって再試験した。ＶＨＨ遺伝子を有する組換えｐＭＥＣＳベクターを含む非サプレッサー株（例えば、ＷＫ６）は、本明細書に記載のＶＨＨを発現させ、精製するために使用した。

【0328】

ｐＭＥＣＳからｐＨＥＮ６ｃベクターへのＶＨＨ遺伝子の再クローニング
ｐＭＥＣＳベクターでは、ＶＨＨの保存時にＨｉｓ６タグが切断された（短期間でもあっても、また－２０℃であっても）。したがって、Ｈｉｓ６タグを検出などに使用する場合は、ＶＨＨ遺伝子をｐＭＥＣＳからｐＨＥＮ６ｃベクターにサブクローニングする方がより良好であった。

【0329】

具体的には、ＶＨＨ遺伝子を鋳型とし、プライマーＡ６ＥおよびＰＭＣＦを保有する組換えｐＭＥＣＳを含む大腸菌を用いて、ＶＨＨ遺伝子を増幅した。プライマーＡ６ＥおよびＰＭＣＦは、それぞれ、フレームワーク１およびフレームワーク４のプライマーである。プライマー配列は以下の通りであった：

【化2】

【0330】

増幅プロトコールは、約３０サイクルのＰＣＲを含み、各サイクルは、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で４５秒を含み、その後ＰＣＲ終了時に７２℃で１０分延長した。約４００ｂｐの断片を増幅させた。

【0331】

ＰＣＲ産物を精製し（例えばＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により）、ＰｓｔＩにより一晩消化した。精製したＰＣＲ産物をＢｓｔＥＩＩ（またはＥｃｏ９１Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））で一晩消化した。消化に使用する温度は変化させた。例えば、酵素の供給者に応じて、５０℃または６０℃でＢｓｔＥＩＩによる消化を行った。

【0332】

ライゲーションのために、ＰＣＲ産物を精製した。ｐＨＥＮ６ｃベクターをＰｓｔＩで３時間消化し、上記のように精製し、次いでＢｓｔＥＩＩで２～３時間消化した。あるいは、Ｅｃｏ９１Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて消化を行った。消化したベクターを、１％アガロースゲル上に流し、ベクターバンドをゲルから切り出して精製した（例えばＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）により）。続いてＰＣＲ断片をベクターにライゲートした。

【0333】

エレクトロコンピテントＷＫ６細胞をライゲーション反応で形質転換し、ＬＢ／寒天／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）／グルコース（１～２％）プレートを用いて形質転換体を選択した。陽性クローンをユニバーサルリバースプライマーおよびユニバーサルフォワードプライマーを用いてＰＣＲによりスクリーニングした。インサートが存在する場合には、約５５０ｂｐの断片を増幅させた。クローンの同一性を確認するために、ユニバーサルリバースプライマーを用いて各ＶＨＨあたり少なくとも２つのクローンを配列決定した。抗原結合能は、ＥＬＩＳＡまたは任意の他の適切なアッセイによって再試験した。

【0334】

上記のプロトコールに従い、ｐＨＥＮ６ｃベクター中にクローニングされたＶＨＨ遺伝子は、Ｎ末端にＰｅｌＢシグナル配列を含み、Ｃ末端にＨｉｓ６－ｔａｉｌを含んでいた。ＰｅｌＢリーダー配列はＶＨＨを大腸菌のペリプラズム空間に向け、ＨｉｓタグをＶＨＨの精製および検出に使用した（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどで）。

【0335】

ＶＨＨの発現および精製を行った。具体的には、１日目に、１０～２０ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）＋グルコース（１％）に、新たに形質転換したＷＫ６コロニーを播種した。この前培養物を３７℃で一晩、２００～２５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。２日目に、ＶＨＨを発現させるためにＴＢ培地を使用した。ＴＢ培地は、リットルあたり２．３ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、１６．４ｇのＫ_２ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ、１２ｇのトリプトン（Ｄｕｃｈｅｆａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）、２４ｇのイースト（Ｄｕｃｈｅｆａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）および４ｍｌの１００％グリセロール（Ｄｕｃｈｅｆａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）を含んでいた。

【0336】

１リットルのバッフル付き振盪フラスコに３３０ｍｌのＴＢを充填し、オートクレーブ処理した。ＫＨ_２ＰＯ_４およびＫ_２ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏはオートクレーブ処理しなかった。代わりに、ＫＨ_２ＰＯ_４およびＫ２ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏを調製し、ろ過滅菌し、次いで既にオートクレーブ処理した残りの培地に添加した。前培養物約１ｍｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、２ｍＭのＭｇＣｌ_２および０．１％グルコースを補充した３３０ｍｌのＴＢに添加し、続いて振盪（２００～２５０ｒｐｍ）しながらＯＤ_６００が０．６～０．９に達するまで３７℃で生育させた。ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加してＶＨＨ発現を誘導した。培養物を２８℃で一晩（約１６～１８時間）振盪しながらインキュベートした。一晩誘導した後のＯＤ_６００は通常２５～３０であった。１クローンあたり少なくとも１リットルの培養液（３ボトル）を平均収量１～１５ｍｇ／ｌで調製した。

【0337】

大腸菌のペリプラズムからのＶＨＨの抽出を３日目に行った。使用した溶液は、ＴＥＳ：０．２ＭトリスｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍスクロース、および水中で４倍に希釈したＴＥＳ／４：ＴＥＳを含んでいた。

【0338】

一晩誘導された培養物を８０００ｒｐｍで８分間遠心分離した。１リットルの培養物からの細胞ペレットをピペットで上下させて、１２ｍｌのＴＥＳに再懸濁し、氷上で１時間振盪した。使用した各１２ｍｌのＴＥＳにつき、約１８ｍｌのＴＥＳ／４を添加し、振盪しながらさらに１時間氷上でインキュベートし、続いて４℃、８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペリプラズム空間から抽出されたタンパク質を含む上清を新鮮なファルコンチューブに移した。

【0339】

続いて、以下の溶液を利用するＩＭＡＣによってＶＨＨを精製した：ＨＩＳ－ｓｅｌｅｃｔ（ＳＩＧＭＡ）、ＰＢＳ、および５０ｍＭ ＮａＡｃｅｔａｔｅ ｐＨ ４．６。

【0340】

Ｈｉｓ－ｓｅｌｅｃｔをＰＢＳで平衡化した。具体的には、１リットルの培養液に由来するペリプラズム抽出物１個につき、５０ｍｌのファルコンチューブに１ｍｌの樹脂（約２ｍｌのＨｉｓ－ｓｅｌｅｃｔ溶液）を加えた。ＰＢＳを最終容量５０ｍｌに加え、混合した。遠心分離は２０００ｒｐｍで２分間行い、上清を捨てた。樹脂を上記のようにＰＢＳで２回洗浄した。ペリプラズム抽出物を樹脂に添加し、穏やかに振盪しながら室温で３０分～１時間インキュベートした。サンプルは、底部にフィルターを有するＰＤ－１０カラムに装填し（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｃａｔ．Ｎｏ．１７－０４３５－０１）、５０～１００ｍｌのＰＢＳ（樹脂１ｍｌあたり５０～１００ｍｌのＰＢＳを使用した）で洗浄した。溶出は３回行い、各回、使用する樹脂１ｍｌあたり１ｍｌのＰＢＳ／０．５Ｍイミダゾールで行った（効率的に溶出するために、ビーズを懸濁し、カラムの底を閉じたまま４℃で一晩放置した）。透析をＰＢＳに対して４℃で一晩（カットオフ３５００ダルトン）行い、イミダゾールを除去した。効率的な透析のために、透析緩衝液（ＰＢＳ）を２～３回交換した。あるいは、イミダゾールによる溶出の代わりに、結合したＶＨＨを１０ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．６で溶出することができた。ＶＨＨを溶出するために５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．６を使用した場合、溶出されたＶＨＨは１ＭトリスｐＨ８．０で直ちに中和され、透析は必要としなかった。

【0341】

タンパク質の量は、溶出サンプルのＯＤ２８０測定によってこの時点で推定することができる。各クローンの吸光係数は、Ｅｘｐａｓｙプロテオミクスサーバの一次構造解析下でｐｒｏｔＰａｒａｍツールによって決定した。ＶＨＨのさらなる精製は、異なる方法によって達成することができる。以下に、これらの方法の１つを示す。

【0342】

タンパク質の量は、溶出したサンプルのＯＤ_２８０測定によって推定した。各クローンの吸光係数は、Ｅｘｐａｓｙプロテオミクスサーバの一次構造解析下でｐｒｏｔＰａｒａｍツールによって決定した。ＶＨＨのさらなる精製は、異なる方法によって達成することができた。例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６０上に装填するための適切な容量（最大４ｍｌ）が得られるまで、４℃、２０００ｒｐｍで遠心分離することによって、サンプルを濃縮することができた（Ｖｉｖａｓｐｉｎ ５０００ ＭＷカットオフ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）。濃縮サンプルを、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６０カラムに装填した。ピーク画分をプールし、定量のためにＯＤ_２８０測定を行った。一般に、ＶＨＨは、１ｍｌ／分で実行すると８５～９５分後に溶出した。濃縮ＶＨＨサンプルのアリコートを約１ｍｇ／ｍｌの濃度にて、－２０℃で保存した。

【0343】

実施例３．ヒトおよび／またはマウスＣＤ２０に特異的なＶＨＨの機能的評価
ＦＡＣＳによって示されたＶＨＨの特異的結合
ヒトまたはマウスＣＤ２０に特異的なＶＨＨの結合活性を決定するために、ＦＡＣＳ分析を行った。具体的には、ＣＨＯ－Ｋ１細胞およびヒトまたはマウスのＣＤ２０を安定に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を、５μｇ／ｍｌの本出願に従って産生されたＶＨＨと共にインキュベートした。二次染色としてモノクローナルＦＩＴＣ標識抗Ｈｉｓ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ＃Ａ０１６２０）を適用した。ＦＡＣＳ分析は、ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。図８に示すように、ヒトＣＤ２０に対するＶＨＨはすべて、ヒトＣＤ２０に対する特異的結合を示した。同様に、マウスＣＤ２０に対するＶＨＨのすべても、マウスＣＤ２０に対する特異的結合を示した（図９）。

【0344】

実施例４．ＣＤ２０ ＶＨＨを含むキメラタンパク質の機能解析
Ａ２０リンパ腫モデルを用いたキメラＣＤ２０ ＶＨＨを用いたｉｎ ｖｉｖｏインターフェロン活性の標的化
マウスにＡ２０細胞（ＣＤ２０＋、およびＩＦＮ感受性マウスリンパ腫細胞株）を皮下接種して腫瘍を誘導した。キメラＣＤ２０ ＶＨＨのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を決定するために、野生型ＩＦＮまたは突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒ（すなわち、ＡｃＴａｆｅｒｏｎ）に融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨ（抗マウスＣＤ２０）によりマウスに病変部近傍処理を施した（腫瘍の端にｓ．ｃ．）。マウスには、野生型ＩＦＮまたは変異型ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合した２ＨＣＤ２５ ＶＨＨ（抗ヒトＣＤ２０）も注射した。図１０に示すように、すべてのＣＤ２０ ＶＨＨは腫瘍サイズを有意に減少させており、キメラ２ＭＣ５７ ＶＨＨが最も強力であった。

【0345】

Ｂ１６メラノーマモデルを用いたキメラＣＤ２０ ＶＨＨによるｉｎ ｖｉｖｏインターフェロン活性の標的化
マウスにＢ１６－ｍＣＤ２０細胞（マウスＣＤ２０を安定に発現するマウスメラノーマ細胞株）を皮下接種して腫瘍を誘導した。キメラＣＤ２０ ＶＨＨのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を決定するために、野生型ＩＦＮまたは突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒ（すなわち、ＡｃＴａｆｅｒｏｎ）に融合された２ＭＣ５７ ＶＨＨ（抗マウスＣＤ２０）によりマウスに病変部近傍処理を施した（腫瘍の端にｓ．ｃ．）。マウスには、野生型ＩＦＮまたは変異型ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合した２ＨＣＤ２５ ＶＨＨ（抗ヒトＣＤ２０）も注射により与えた。対照マウスをＰＢＳで処置した。腫瘍の増殖をモニターした。図１１に示すように、ｍＣＤ２０ＶＨＨは、腫瘍の大きさを有意に減少させた。

【0346】

図１２は、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒ（すなわち、ＡｃＴａｆｅｒｏｎ）に融合されたキメラ２ＭＣ５７ ＶＨＨが、生命を脅かす副作用なしにＢ１６－ｍＣＤ２０メラノーマ細胞を標的としたことを示す。具体的には、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合したキメラ２ＭＣ５７ ＶＨＨで処置したマウスは、体重、ならびに好中球、赤血球および血小板など、血液毒性の徴候のない正常な全血球数を維持した。さらに、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合したキメラ２ＭＣ５７ ＶＨＨを投与した結果、部分的なＢ細胞枯渇をもたらした（図１３）。

【0347】

Ｂ１６メラノーマモデルにおけるキメラＣＤ２０ ＶＨＨおよびドキソルビシンを用いた併用療法
ドキソルビシンおよびキメラ２ＭＣ５７ ＶＨＨを用いた併用療法の抗腫瘍効果を試験した。マウスにＢ１６－ｍＣＤ２０細胞（マウスＣＤ２０を安定に発現するマウスメラノーマ細胞株）を皮下接種して腫瘍を誘導した。続いて、ドキソルビシンの有無にかかわらず、野生型ＩＦＮまたは突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒ（すなわち、ＡｃＴａｆｅｒｏｎ）に融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨ（抗マウスＣＤ２０）を用いて、マウスに病変部近傍処理を施した（腫瘍の端でｓ．ｃ．）。ドキソルビシンは２日おきに３ｍｇ／体重ｋｇで投与された。図１４に示すように、２ＭＣ５７ ＶＨＨをドキソルビシンと組み合わせると、ドキソルビシンは含まずに２ＭＣ５７ ＶＨＨを用いた治療と比較して腫瘍サイズが有意に減少した。

【0348】

突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒと融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨとのドキソルビシンの組み合わせは、特に安全で効果的であるように考えられた。具体的には、ドキソルビシンとの併用療法は、野生型ＩＦＮの投与に伴う罹患率および死亡率を悪化させたが、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒと融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨと組み合わせて使用した場合、体重、生存率およびいくつかの血液パラメータの測定結果（図１５）の進展により評価したときに、いかなる副作用も引き起こすことはなかった。

【0349】

Ｂ１６メラノーマモデルにおけるキメラＣＤ２０ ＶＨＨおよび腫瘍壊死因子を用いる併用療法
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびキメラ２ＭＣ５７ ＶＨＨを用いた併用療法の抗腫瘍効果を試験した。マウスにＢ１６－ｍＣＤ２０細胞（マウスＣＤ２０を安定に発現するマウスメラノーマ細胞株）を皮下接種して腫瘍を誘導した。続いて、ＴＮＦの有無にかかわらず、野生型ＩＦＮまたは突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒ（すなわち、ＡｃＴａｆｅｒｏｎ）に融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨ（抗マウスＣＤ２０）を用いて、マウスに病変部近傍処理を施した（腫瘍の端でｓ．ｃ．）。ＴＮＦは、２日ごとに０．６μｇで投与された。図１６に示すように、２ＭＣ５７ ＶＨＨをＴＮＦと組み合わせると、ＴＮＦを含まずに２ＭＣ５７ ＶＨＨを用いた治療と比較して腫瘍サイズが有意に減少した。

【0350】

突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒと融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨとのＴＮＦの組み合わせは、特に安全で効果的であるように考えられた。具体的には、ＴＮＦとの併用療法は、血小板減少症および／または貧血ならびに野生型ＩＦＮの投与に伴う死亡率を悪化させたが、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒと融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨと組み合わせて使用した場合、体重、生存率およびいくつかの血液パラメータの測定結果（図１７）の進展により評価したときに、いかなる副作用も引き起こすことはなかった。

【0351】

Ｂ１６メラノーマモデルにおけるキメラＣＤ２０ ＶＨＨおよび抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨを用いる併用療法
抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨおよびキメラ２ＭＣ５７ ＶＨＨを用いた併用療法の抗腫瘍効果を試験した。マウスにＢ１６－ｍＣＤ２０細胞（マウスＣＤ２０を安定に発現するマウスメラノーマ細胞株）を皮下接種して腫瘍を誘導した。続いて、抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨの有無にかかわらず、野生型ＩＦＮまたは突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒ（すなわち、ＡｃＴａｆｅｒｏｎ）に融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨ（抗マウスＣＤ２０）を用いて、マウスに病変部近傍処理を施した（腫瘍の端でｓ．ｃ．）。抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨを２日ごとに１２０μｇで投与した。図１８に示されるように、抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨは、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨに対して長期の停滞効果をもたらした。さらに、抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨおよび突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨの組み合わせは、有意な体重減少を引き起こさなかった（図１８）。図２４に示すように、パネルＡは、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒ（すなわち、ＡｃＴａｆｅｒｏｎ）および抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨに融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨを用いた併用治療は、いずれかの剤単独による処置と比較して、３８日目までに腫瘍再発のない強力な抗腫瘍効果を誘発した。図２４のパネルＢは、野生型ＩＦＮ単独による処置と比較して、併用治療では耐容性が良好であり、有意な体重減少を誘導しなかったことをさらに示す。全体として、これらのデータは、キメラ２ＭＣ５７ ＶＨＨおよび抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いた併用療法のための相乗効果を示唆している。Ｂ１６－ｍＣＤ２０メラノーマモデルにおいて、Ｔｒｅｇ枯渇と組み合わせた抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨおよびキメラ２ＭＣ５７ ＶＨＨの抗腫瘍効果を試験した。図１９に示すように、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合させた２ＭＣ５７ ＶＨＨ、抗ＰＤ－Ｌ１ラクダ科ＶＨＨ、およびＴｒｅｇ枯渇を投与する三重の組合せにより、腫瘍サイズがさらに減少した。

【0352】

Ｂ１６メラノーマモデルにおけるキメラＣＤ２０ ＶＨＨの全身投与
Ｂ１６－ｍＣＤ２０メラノーマモデルにおいて、全身投与されたキメラＣＤ２０ ＶＨＨの有効性を試験した。具体的には、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒ（すなわち、ＡｃＴａｆｅｒｏｎ）に融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨ（抗マウスＣＤ２０）、または突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合した２ＨＣＤ２５ ＶＨＨ（抗ヒトＣＤ２０）を静脈内注射によりマウスに与えた。キメラＶＨＨを腫瘍接種後８～１１日目に５，５００ＩＵの用量で静脈内注射した。図２０に示すように、キメラ抗体の全身投与では、キメラ２ＭＣ５７ ＶＨＨがより強力であり、腫瘍増殖の有意な減少をもたらした。

【0353】

キメラＣＤ２０ ＶＨＨの抗腫瘍効果におけるＢ細胞枯渇の役割
マウスにＢ１６－ｈＣＤ２０細胞（ヒトＣＤ２０を安定に発現するマウスメラノーマ細胞株）を移植して腫瘍を誘導した。キメラＣＤ２０ ＶＨＨのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を決定するために、野生型ヒトＩＦＮ、マウスＩＦＮまたは突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒ（すなわち、ＡｃＴａｆｅｒｏｎ）に融合された２ＨＣＤ２５ ＶＨＨ（抗ヒトＣＤ２０）によりマウスに病変部近傍処理を施した（腫瘍の端にｓ．ｃ．）。マウスにはまた、突然変異ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨ（抗マウスＣＤ２０）を与えた。腫瘍の増殖をモニターした。図２１に示すように、マウスＩＦＮまたは突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒのいずれかに融合したキメラ２ＨＣＤ２５ ＶＨＨでは、有意な腫瘍縮小がもたされた。しかし、挿入図に示すように、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合したキメラ２ＨＣＤ２５ ＶＨＨは、リンパ球数を減少させるとは考えられず、このことは、Ｂ細胞枯渇は、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合したキメラ２ＨＣＤ２５ ＶＨＨの抗腫瘍効果にとって必要ではないことを示唆している。

【0354】

同様の研究を、キメラＣＤ２０抗体をマウスの全身ｉｖ投与することにより実施した。以前の結果と一致して、マウスＩＦＮまたは突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒのいずれかに融合したキメラ２ＨＣＤ２５ ＶＨＨは有意な腫瘍縮小をもたらした（図２２）。突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合したキメラ２ＨＣＤ２５ ＶＨＨによりリンパ球数が減少したと考えられない場合（図２１）、Ｂ細胞枯渇が、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合したキメラ２ＨＣＤ２５ ＶＨＨの抗腫瘍効果にとって必要ではないことをこの結果が示唆している。

【0355】

多発性硬化症のマウスモデルにおけるキメラＣＤ２０ ＶＨＨの有効性
確立されたマウス実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いて、多発性硬化症の治療におけるキメラＣＤ２０ ＶＨＨの有効性を試験した。具体的には、マウスに、ＭＯＧの免疫優性エピトープ（ＭＯＧ_{９２－１０６}）に対応するペプチドを投与して、脳の炎症および中枢神経系（ＣＮＳ）脱髄を誘導した。マウスにはまた、ＭＯＧペプチドの投与後にｉｐ注射によって７～２５日目に突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨ（抗マウスＣＤ２０）を与えた。図２３に示すように、突然変異体ＩＦＮα２－Ｑ１２４Ｒに融合した２ＭＣ５７ ＶＨＨ（抗マウスＣＤ２０）は臨床スコアを有意に改善し、疾患および麻痺などの症状の発症および出現を遅延させた。これらの結果をまとめると、本出願のキメラＣＤ２０ ＶＨＨが、多発性硬化症ならびにヒトにおける他のＣＮＳ脱髄疾患の治療において治療効果を有し得ることが示唆された。

【0356】

均等物
本出願は、その特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる変更が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本出願の変形、使用、適応、を網羅することを意図し、本出願が関係する技術分野内で知られているまたは慣例的な実施の範囲内にあるようなこうした本発明の開示からの逸脱を含み、本明細書に記載された本質的特徴および添付の特許請求の範囲内で以下のように適用され得ることが理解されよう。

【0357】

当業者は、日常的な実験のみを用いて、本明細書に具体的に記載された特定の実施形態に対する多数の均等物を認識し、または確認できるであろう。こうした均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【0358】

参照による組み込み
本明細書中で参照されるすべての特許および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0359】

本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書では、本出願が先の出願のためにそのような刊行物に先行する資格がないと認めるものとして解釈されるものではない。

【0360】

本明細書で使用されるように、すべての見出しは、単に構成のためのものであり、いかなる様式でもその開示を限定することを意図するものではない。個々のセクションの内容は、すべてのセクションに等しく適用され得る。

【0361】

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【図1】

【図2】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図15-2】

【図15-3】

【図16】

【図17】

【図17-2】

【図17-3】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図23-2】

【図24】

【図24-2】

【配列表】

2023040247000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-01-31

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

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