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特開2023-40252疾患の検出及び診断のための血液中の循環細胞バイオマーカーの使用並びにそれらを単離する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023040252
(43)【公開日】2023-03-22
(54)【発明の名称】疾患の検出及び診断のための血液中の循環細胞バイオマーカーの使用並びにそれらを単離する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/48 20060101AFI20230314BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20230314BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230314BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230314BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20230314BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230314BHJP
C12Q 1/6841 20180101ALI20230314BHJP
【ＦＩ】
G01N33/48 M
G01N33/68
G01N33/50 P
C07K16/28
C07K16/30
C12Q1/02
C12Q1/6841 Z
【審査請求】有
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023003897
(22)【出願日】2023-01-13
(62)【分割の表示】P 2021107492の分割
【原出願日】2015-08-25
(31)【優先権主張番号】62/041,540
(32)【優先日】2014-08-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/131,051
(32)【優先日】2015-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/138,744
(32)【優先日】2015-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/166,492
(32)【優先日】2015-05-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】514294164
【氏名又は名称】クリエイティブ マイクロテック インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＲＥＡＴＶ ＭＩＣＲＯＴＥＣＨ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】タン， チャ－メイ
(72)【発明者】
【氏名】アダムス， ダニエル
(57)【要約】 （修正有）
【課題】固形腫瘍及びウイルス感染の新しい高感度の細胞バイオマーカーが、血液で同定され、癌腫、肉腫及びウイルスの存在を判定するために、治療応答の迅速な判定、癌の早期検出、癌再発の早期検出のために使用することができ、療法を決定するために使用することができる。
【解決手段】薬物標的マーカーを循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）及び／又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）においてスクリーニングするためのコンパニオン診断方法のためのデータを収集する方法であって、対象からの生物学的試料からＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを収集するステップ、及び前記ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣが薬物標的マーカーを発現又は保有するかどうか判定するステップを含む方法。
【選択図】図１
【解決手段】薬物標的マーカーを循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）及び／又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）においてスクリーニングするためのコンパニオン診断方法のためのデータを収集する方法であって、対象からの生物学的試料からＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを収集するステップ、及び前記ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣが薬物標的マーカーを発現又は保有するかどうか判定するステップを含む方法。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
薬物標的マーカーを循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）及び／又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）においてスクリーニングするためのコンパニオン診断方法のためのデータを収集する方法であって、対象からの生物学的試料からＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを収集するステップ、及び前記ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣが薬物標的マーカーを発現又は保有するかどうか判定するステップを含む方法。
【請求項2】
前記薬物標的マーカーが細胞表面マーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記細胞表面マーカーがＰＤ－Ｌ１である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記薬物標的マーカーがポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記薬物標的マーカーが、遺伝子の突然変異、増幅又は転座である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［背景］
［発明の分野］
[0001]本発明は、他の重要な目標の中でも、対象を固形腫瘍の存在についてスクリーニングするため、癌療法のクールの選択を助けるため、癌治療の有効性をモニタリングするため、並びに対象でウイルス感染を検出及びモニタリングするために、癌スクリーニング、癌再発の早期検出のために使用することができる、血液及び他の体液中のバイオマーカーの発見及び特徴付けに一般に関する。本発明のバイオマーカーは、単独で、又は循環腫瘍細胞、遊離の血漿及び血清ＤＮＡ癌マーカー、癌関連タンパク質マーカー並びに他のバイオマーカーと組み合わせて使用されてもよい。
［関連技術］
［発明の分野］
[0001]本発明は、他の重要な目標の中でも、対象を固形腫瘍の存在についてスクリーニングするため、癌療法のクールの選択を助けるため、癌治療の有効性をモニタリングするため、並びに対象でウイルス感染を検出及びモニタリングするために、癌スクリーニング、癌再発の早期検出のために使用することができる、血液及び他の体液中のバイオマーカーの発見及び特徴付けに一般に関する。本発明のバイオマーカーは、単独で、又は循環腫瘍細胞、遊離の血漿及び血清ＤＮＡ癌マーカー、癌関連タンパク質マーカー並びに他のバイオマーカーと組み合わせて使用されてもよい。
［関連技術］
【0002】
[0002]腫瘍細胞が原発固形腫瘍から離脱するとき、それらは血液又はリンパ循環に侵入し、最終的には血流を去り、他の器官又は組織に入って転移を形成する。癌関連死の９０％は、転移過程によって引き起こされる。最も一般的な転移部位は、肺、肝臓、骨及び脳である。循環中に見出される腫瘍細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と呼ばれる。多くの研究刊行物及び臨床治験は、ＣＴＣが、（ｉ）血流中のＣＴＣの計数を通して予後生存及び癌再発に関する情報を提供すること、並びに（ｉｉ）ＣＴＣでのタンパク質発現レベル、及び遺伝子突然変異及び転座の出現の検査を通した治療情報を提供することにおいて、臨床有用性を有することを示す。しかし、ステージＩＶ癌の患者においてさえ、ＣＴＣは対象で癌の発達及び／又は存在と一貫して関連するとは限らない。
【0003】
[0003]体液中のある特定の細胞型の検出を通して診断することができる医学的状態が癌の他にある。特に、ある特定の医学的状態の兆候又は特徴である細胞は、選択された体液で見出される他の細胞より大きく、及び／又はより柔軟でないことがある。したがって、体液試料からそのようなより大きな及び／又はより柔軟でない細胞を収集することによって、収集された細胞に基づいて医学的状態を診断することが可能なことがある。
【0004】
[0004]医学的状態について対象をスクリーニングするために使用することができる、血液及び他の体液中のバイオマーカーの同定及び特徴付けは、臨床医に追加のツールを提供するだろう。本発明は、上述及び他の重要な目標に関する。
［概要］
［概要］
【0005】
[0005]本発明は、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫及び黒色腫を含む固形腫瘍を有する癌患者の血液で見出される、特異な特性を有するある種の細胞に関し、それを開示する。「循環癌関連マクロファージ様細胞」（ＣＡＭＬ）と命名される細胞が本明細書に記載され、患者における固形腫瘍の存在と関連することが示されている。ＣＡＭＬと関連する５つの形態が特徴付けられ、記載されている（Ａｄａｍｓ、Ｄ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｇｉａｎｔ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．ＰＮＡ ２０１４、１１１（９）：３５１４～３５１９頁及び国際公開第２０１３／１８１５３２号）。本明細書に提示されるデータを通して、ＣＡＭＬは、それらが様々な医学的適用のためのバイオマーカーとして使用することができるという点で、臨床有用性を有することが示されている。精密マイクロフィルターを使用した精密濾過によって上皮起源のステージＩからステージＩＶの癌を有する対象の末梢血で、ＣＡＭＬが一貫して見出されている。癌患者の血液で見出されるさらなるＣＡＭＬ形態が、本明細書で提示される。
【0006】
[0006]ＣＡＭＬに関連する医学適用には、これらに限定されないが、特に、癌の早期検出、癌の再燃又は再発の早期検出、及び癌突然変異の判定において、癌の診断を提供するバイオマーカーとしての細胞の使用が含まれる。ＣＡＭＬは、療法の適当なクールを決定する際にバイオマーカーとして使用することもでき、特に、化学療法及び放射線療法の治療応答の有効性の迅速な判定で細胞を使用することができる。
【0007】
[0007]ＣＡＭＬは、癌マーカーとして独立して、又は、患者の疾患のより完全な理解を提供するために、ＣＴＣ、無細胞ＤＮＡ、タンパク質及び他のバイオマーカーと組み合わせて使用することができる。
【0008】
[0008]より具体的には、第１の実施形態では、本発明は、対象からの生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含む、癌について対象をスクリーニングする方法に関する。特定の態様では、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出されるときは、対象は、中でも、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫又は黒色腫などの固形腫瘍を潜在的に有すると同定される。他の態様では、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出されるときは、対象は、中でも、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫又は黒色腫などの固形腫瘍を有すると同定される。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色などの標準方法によって実行することができる。ＣＡＭＬの有益な属性の１つは、それらがクエンチング及び再染色を受けることができるということであり、したがって、細胞の同じ試料を使用して多数の癌細胞マーカーを分析することができる。したがって、特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色によって、及びその後の追加のマーカーについての同じ細胞の再染色によって実行することもできる。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、生物学的試料中で循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び／又はＣＴＣに結合した白血球（ＷＢＣ）を検出するステップも含む。この実施形態の特定の態様では、対象は、癌を有することが疑われる対象である。この実施形態の特定の態様では、治療決定は、方法の成果に基づいて下される。この実施形態の特定の態様では、対象が固形腫瘍を有すると特定されるときには、方法は、対象に抗癌治療薬を投与するステップをさらに含む。
【0009】
[0009]第２の実施形態では、本発明は、対象における癌を診断するための方法であって、対象からの生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含む方法に関し、ここで、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出されるときは、対象は癌と診断される。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色などの標準方法によって実行することができる。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色によって、及びその後の追加のマーカーについての同じ細胞の再染色によって実行することもできる。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、生物学的試料中でＣＴＣ及び／又はＣＴＣに結合したＷＢＣを検出するステップも含み、ここで、ＣＡＭＬ、ＣＴＣ及びＣＴＣに結合したＷＢＣのうちの１つ又は複数が生物学的試料中で検出されるときは、対象は癌と診断される。この実施形態の特定の態様では、治療決定は、方法の成果に基づいて下される。この実施形態の特定の態様では、対象が癌と診断されるときには、方法は、対象に抗癌治療薬を投与するステップをさらに含む。
【0010】
[0010]第３の実施形態では、本発明は、対象における癌の再発を検出するための方法であって、癌について以前に治療した対象からの生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含む方法に関し、ここで、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出されるときは、癌の再発が検出される。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色などの標準方法によって実行することができる。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色によって、及びその後の追加のマーカーについての同じ細胞の再染色によって実行することもできる。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、生物学的試料中でＣＴＣ及び／又はＣＴＣに結合したＷＢＣを検出するステップも含み、ここで、ＣＡＭＬ、ＣＴＣ及びＣＴＣに結合したＷＢＣのうちの１つ又は複数が生物学的試料中で検出されるときは、癌の再発が検出される。この実施形態の特定の態様では、治療決定は、方法の成果に基づいて下される。この実施形態の特定の態様では、癌の再発が検出されるときには、方法は、対象に抗癌治療薬を投与するステップをさらに含む。
【0011】
[0011]第４の実施形態では、本発明は、対象における癌の診断を確認するための方法であって、癌と診断された対象からの生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含む方法に関し、ここで、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出されるときは、癌の診断が対象で確認される。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、生物学的試料中でＣＴＣ及び／又はＣＴＣに結合したＷＢＣを検出するステップも含み、ここで、ＣＡＭＬ、ＣＴＣ及びＣＴＣに結合したＷＢＣのうちの１つ又は複数が生物学的試料中で検出されるときは、癌の診断が対象で確認される。特定の態様では、最初の癌診断は、マンモグラフィー、ＰＳＡ検査、ＣＡ１２５の存在、ＣＴ、ＭＲＩ又はＰＥＴ画像化によるものである。特定の態様では、対象は、癌を有することが疑われる。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色などの標準方法によって実行することができる。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色によって、及びその後の追加のマーカーについての同じ細胞の再染色によって実行することもできる。この実施形態の特定の態様では、治療決定は、方法の成果に基づいて下される。この実施形態の特定の態様では、癌の診断が対象で確認されるときには、方法は、対象に抗癌治療薬を投与するステップをさらに含む。
【0012】
[0012]本発明の第１から第４の実施形態では、ＣＴＣに結合したＷＢＣを検出することは、ＣＴＣに結合したＷＢＣの数を判定することである。ＣＴＣが循環中に浸透するときは、免疫細胞（Ｔ細胞、白血球のサブタイプ）がＣＴＣに結合することによってそれらを認識することができる。免疫細胞は、ＣＴＣを死滅させることもできる。血液の濾過は、ＣＴＣに結合した白血球（ＷＢＣ）を捕捉することができる。ＣＴＣは分解されることもある。生物学的試料中のＣＴＣに結合したＷＢＣの存在及び／又は数は、このように、固形腫瘍の存在及びさらに固形腫瘍を排除する体の能力の指標である。ある特定の態様では、生物学的試料中でＣＴＣに結合したＷＢＣは、Ｔ細胞である。
【0013】
[0013]第５の実施形態では、本発明は、対象における癌のステージを判定するための方法であって、癌を有する対象からの生物学的試料中のＣＡＭＬを特徴付けるステップを含む方法に関し、ここで、ＣＡＭＬの選択される特性は、対象における癌のステージを示す。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色などの標準方法によって実行することができる。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色によって、及びその後の追加のマーカーについての同じ細胞の再染色によって実行することもできる。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、生体試料でＣＴＣを特徴付けるステップも含み、ここで、ＣＡＭＬ及びＣＴＣの選択される特性は、対象での癌のステージを示す。ある特定の態様では、ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣは、特徴付けの前に生体試料から収集される。この実施形態の特定の態様では、治療決定は、方法の成果に基づいて下される。この実施形態の特定の態様では、方法は、対象における癌のステージを判定した後に、対象に抗癌治療薬を投与するステップをさらに含む。
【0014】
[0014]第６の実施形態では、本発明は、癌治療の効力をモニタリングする方法であって、（ａ）癌治療を受けている対象からの生物学的試料中のＣＡＭＬの１つ又は複数の選択される特性を検査すること、及び（ｂ）治療の前、その間又は完了の後の１つ又は複数の時点で、（ａ）で判定される１つ又は複数の選択される特性の検査値を、同じ対象からの類似の生物学的試料で検査される同じ特性の検査値と比較すること、を含む方法に関し、ここで、１つ又は複数の検査値の変化は、対象での癌治療の効力を示す。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、（ａ）生物学的試料中のＣＴＣの１つ又は複数の選択される特性を検査すること、及び（ｂ）治療の前、その間又は完了の後の１つ又は複数の時点で、（ａ）で判定される１つ又は複数の選択される特性の検査値を、同じ対象からの類似の生物学的試料で検査される同じ特性の検査値と比較するステップも含む。ある特定の態様では、ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣは、特徴付けの前に生物学的試料から収集される。この実施形態の特定の態様では、治療決定は、方法の成果に基づいて下される。
【0015】
[0015]第５及び第６の実施形態では、試料中のＣＡＭＬの選択される特性は、以下からなる群から選択される１つ又は複数の特性である：
（ｉ）ＣＡＭＬの数；
（ｉｉ）ＣＡＭＬの平均サイズ（ＣＡＭＬ細胞のサイズは直径約２０ミクロン～約３００ミクロンの範囲）；
（ｉｉｉ）ＣＡＭＬの核の平均サイズ（ＣＡＭＬは、直径約１４～６４μｍのサイズを有する大きな非定形的核を有する）；
（ｉｖ）ＣＡＭＬの形態学的形状（ＣＡＭＬ形状には、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長方形、２脚形、２本を超える脚形、細い脚形又は無定形が含まれる）；
（ｖ）ＣＤ１４陽性表現型；
（ｖｉ）ＣＤ４５発現の程度；
（ｖｉｉ）ＥｐＣＡＭ発現の程度；
（ｖｉｉｉ）ビメンチン発現の程度；
（ｉｘ）ＰＤ－Ｌ１発現の程度；
（ｘ）単核球ＣＤ１１Ｃマーカー発現の程度；
（ｘｉ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現の程度；
（ｘｉｉ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現の程度；
（ｘｉｉｉ）内皮ＣＤ３１マーカー発現の程度；
（ｘｉｖ）マーカーの位置（ＣＡＭＬでマーカーが出現する位置、例えば、細胞質対核は、異なる時点で変化することがある）；
（ｘｖ）ＣＡＭＬでの、拡散しているか又は空胞及び／若しくは摂取物と会合している、癌と関連した１つ又は複数のマーカーの存在（例えば、上皮癌の場合、マーカーはサイトケラチン８、１８及び１９である）；並びに
（ｘｖｉ）マーカー染色の強度。
（ｉ）ＣＡＭＬの数；
（ｉｉ）ＣＡＭＬの平均サイズ（ＣＡＭＬ細胞のサイズは直径約２０ミクロン～約３００ミクロンの範囲）；
（ｉｉｉ）ＣＡＭＬの核の平均サイズ（ＣＡＭＬは、直径約１４～６４μｍのサイズを有する大きな非定形的核を有する）；
（ｉｖ）ＣＡＭＬの形態学的形状（ＣＡＭＬ形状には、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長方形、２脚形、２本を超える脚形、細い脚形又は無定形が含まれる）；
（ｖ）ＣＤ１４陽性表現型；
（ｖｉ）ＣＤ４５発現の程度；
（ｖｉｉ）ＥｐＣＡＭ発現の程度；
（ｖｉｉｉ）ビメンチン発現の程度；
（ｉｘ）ＰＤ－Ｌ１発現の程度；
（ｘ）単核球ＣＤ１１Ｃマーカー発現の程度；
（ｘｉ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現の程度；
（ｘｉｉ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現の程度；
（ｘｉｉｉ）内皮ＣＤ３１マーカー発現の程度；
（ｘｉｖ）マーカーの位置（ＣＡＭＬでマーカーが出現する位置、例えば、細胞質対核は、異なる時点で変化することがある）；
（ｘｖ）ＣＡＭＬでの、拡散しているか又は空胞及び／若しくは摂取物と会合している、癌と関連した１つ又は複数のマーカーの存在（例えば、上皮癌の場合、マーカーはサイトケラチン８、１８及び１９である）；並びに
（ｘｖｉ）マーカー染色の強度。
【0016】
[0016]第５及び第６の実施形態では、試料中のＣＴＣの選択される特性は、以下からなる群から選択される１つ又は複数の特性である：
（ｉ）ＣＴＣの数；
（ｉｉ）ＣＴＣと結合したＷＢＣの数；
（ｉｉｉ）核の状態；
（ｉｖ）サイトケラチン８発現の程度；
（ｖ）サイトケラチン１８発現の程度；
（ｖｉ）サイトケラチン１９発現の程度；
（ｖｉｉ）ＥｐＣＡＭ発現の程度；
（ｖｉｉｉ）ビメンチン発現の程度；
（ｉｘ）ＰＤ－Ｌ１発現の程度；
（ｘ）ウロプラキン発現の程度；
（ｘｉ）サイトケラチン形態；
（ｘｉｉ）マーカーの位置（ＣＴＣでマーカーが出現する位置、例えば、細胞質対核は、異なる時点で変化することがある）；並びに
（ｘｉｉｉ）マーカー染色の強度。
（ｉ）ＣＴＣの数；
（ｉｉ）ＣＴＣと結合したＷＢＣの数；
（ｉｉｉ）核の状態；
（ｉｖ）サイトケラチン８発現の程度；
（ｖ）サイトケラチン１８発現の程度；
（ｖｉ）サイトケラチン１９発現の程度；
（ｖｉｉ）ＥｐＣＡＭ発現の程度；
（ｖｉｉｉ）ビメンチン発現の程度；
（ｉｘ）ＰＤ－Ｌ１発現の程度；
（ｘ）ウロプラキン発現の程度；
（ｘｉ）サイトケラチン形態；
（ｘｉｉ）マーカーの位置（ＣＴＣでマーカーが出現する位置、例えば、細胞質対核は、異なる時点で変化することがある）；並びに
（ｘｉｉｉ）マーカー染色の強度。
【0017】
[0017]第５及び第６の実施形態では、ＣＡＭＬ、ＣＴＣ及び／又はＣＴＣに結合したＷＢＣの数は、マイクロフィルターを使用して同時に判定される。適するマイクロフィルターは、様々な孔径及び形状を有することができる。一態様では、マイクロフィルターはサイズが約５ミクロン～約１０ミクロンの範囲のサイズの孔を有し、円形、トラック形状、卵形、四角形及び長方形の孔形状を含むことができる。好ましい態様では、マイクロフィルターは精密孔配置及び均一な孔分布を有する。
【0018】
[0018]本発明は、生物学的試料からＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを単離し、単離した細胞を、カメラ、例えば携帯電話カメラ又は白色光顕微鏡又は白色光顕微鏡に取り付けたカメラを使用して数える方法にも関する。したがって、第７の実施形態では、本発明は、生物学的試料におけるＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを検出するための方法であって、対象から生物学的試料を得るステップ、及び試料でＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを検出するステップを含む方法に関し、ここで、検出は、カメラ又は白色光顕微鏡又は白色光顕微鏡に取り付けたカメラによるものである。ある特定の態様では、カメラは携帯電話カメラである。ある特定の態様では、白色光顕微鏡は、１０倍（１０×）以下の倍率を有する。他の態様では、細胞は低費用のフィルターによって生物学的試料から収集され、及び／又は生物学的試料は対象からの手動引き抜きによって、若しくは低費用のポンプによって得られる。さらなる態様では、ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを可視化するために、比色染色が使用される。
【0019】
[0019]本発明はさらに、ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣをコンパニオン診断薬として使用する方法に関する。コンパニオン診断薬は、薬物標的のマーカーの染色を評価することによって薬物を特定の治療に整合させる際に、ＦＩＳＨによって遺伝子増幅又は転座を評価する際に、及び薬物などと関連した特定の遺伝子突然変異のための他の分子アッセイを使用する際に、有益なツールである。癌などの疾患を有する対象の治療である特定の療法が有効かどうか判定する際に、これらの細胞は組織生検の代わりの役目をすることができる。例えば、癌が所与の免疫療法（例えば、抗体）によって認識されるタンパク質を発現するかどうか判定するために、免疫療法のスクリーニングでこれらの細胞を使用することができる。細胞がある特定のポリヌクレオチドを発現するかどうか、又は選択される突然変異が細胞性ＤＮＡに見出されるかどうか判定するために、これらの細胞を検査することもできる。本明細書に記されるように、ＣＡＭＬ及びＣＴＣは、それらが由来する癌と同じ癌マーカーをしばしば発現又は保有する。したがって、第８の実施形態では、本発明は、選択される薬物標的マーカーをＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣにおいてスクリーニングするためのコンパニオン診断方法であって、対象からの生物学的試料からＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを収集するステップ、及びＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣが選択される薬物標的マーカーを発現又は保有するかどうか判定するステップを含む方法に関する。ある特定の態様では、薬物標的マーカーは細胞表面マーカーであり、判定は、例えば、マーカーの染色によるものであり得る。一例として、免疫療法のための細胞表面マーカーとして、ＰＤ－Ｌ１が使用されてもよい。他の態様では、薬物標的マーカーは、ポリヌクレオチドである。さらなる態様では、薬物標的マーカーは遺伝子の突然変異、増幅又は転座であり、判定は、例えば、ＦＩＳＨによるものであり得る。
【0020】
[0020]血液中のウイルスの検出の伝統的方法は、抗体又はウイルス感染細胞の存在に基づく。ＣＡＭＬは免疫細胞の１種であるので、それらは、様々なウイルス感染、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）及びその他多数の検出のための診断薬で使用することもできる。実際、ＣＡＭＬは、活動的ウイルス感染症を有する対象の血液で見出されている。ＣＡＭＬは、ウイルスのデブリ、ウイルスに感染した細胞又はウイルスを含有する細胞性デブリを呑食する。ＣＡＭＬでウイルスのマーカー（複数可）を直接的に染色することができるか、又はウイルスに関連したＣＡＭＬでＤＮＡ若しくはＲＮＡの分子分析を実行することができる。したがって、ＣＡＭＬは、活動的ウイルス感染の検出及び診断を提供するバイオマーカーとして、並びに療法の適当なクールを判定する際に使用することもできる。
【0021】
[0021]さらに、ＨＩＶ及びＨＢＶなどの一部のウイルス感染症は、癌につながることがある。それらの患者の血液で見出されるＣＡＭＬは、ウイルス感染又は癌自体によって引き起こされることがある。癌マーカー又はウイルスのマーカー（複数可）のための染色は、診断情報を提供するために使用されてもよい。これは、ウイルス起因の癌の早期検出のための有益な方法であり得る。
【0022】
[0022]したがって、第９の実施形態では、本発明は、対象におけるウイルス感染を診断するための方法であって、対象から得た生物学的試料からＣＡＭＬを収集するステップ、及び収集したＣＡＭＬをウイルスについてスクリーニングするステップを含む方法に関する。ある特定の態様では、スクリーニングは、ウイルスマーカーについてＣＡＭＬを染色することによるものである。追加のウイルスマーカーについて、同じ細胞を再染色することもできる。さらなる態様では、スクリーニングは、ＣＡＭＬからのＤＮＡ又はＲＮＡの分子分析によるものである。この実施形態の特定の態様では、治療決定は、方法の成果に基づいて下される。この実施形態の特定の態様では、ウイルス感染症が診断されるときには、方法は、対象に抗ウイルス治療薬を投与するステップをさらに含む。
【0023】
[0023]追加の実施形態では、本発明は、ＣＡＭＬの分子分析の方法であって、単一のＣＡＭＬ細胞を得るステップ、及び単一細胞で分子分析を実行するステップを含む方法を含む。単一細胞で実行することができる分子分析の特定のタイプに関して制限はなく、そのような手段には、これらに限定されないが、核酸配列決定、ノーザンブロット分析及びサザンブロット分析が含まれる。
【0024】
[0024]本発明の関連する態様及び実施形態では、生物学的試料は、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織及び尿からなる群から選択される１つ又は複数である。試料は、新鮮な試料又は解凍される低温保存試料であってもよい。好ましい態様では、生物学的試料は、末梢血である。他の態様では、血液は、前肘静脈血、下大静脈血又は頸静脈血である。
【0025】
[0025]本発明の関連する態様及び実施形態では、癌は、固形腫瘍、ステージＩ癌、ステージＩＩ癌、ステージＩＩＩ癌、ステージＩＶ癌、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、結腸直腸癌及び他の固形腫瘍癌のうちの１つ又は複数である。
【0026】
[0026]本発明の関連する態様及び実施形態では、抗癌治療薬は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ワクチン療法、標的療法及び／又は療法の組合せのうちの１つ又は複数であってもよい。
【0027】
[0027]本発明の関連する態様及び実施形態では、ＣＡＭＬは、サイズ排除方法、免疫捕捉、赤血球溶解、白血球消失、ＦＩＣＯＬＬ、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー及びマイクロ流体チップ、又はこれらの組合せからなる群から選択される１つ又は複数の手段を使用して検出及び／又は収集される。特定の態様では、サイズ排除方法は、マイクロフィルターの使用を含む。適するマイクロフィルターは、様々な孔径及び形状を有することができる。ＣＡＭＬだけが検出及び／又は収集されるときは、孔径は約１５ミクロン～約２０ミクロンの範囲内であってもよい。ＣＡＭＬとＣＴＣの両方が検出及び／又は収集されるときは、孔径は約５ミクロン～約１０ミクロンの範囲内であってもよい。大きな方の孔径は、フィルター上の大部分のＷＢＣ汚染を排除する。孔は、円形、レーストラック形、卵形、四角及び長方形の孔形状を有することができる。好ましい態様では、マイクロフィルターは精密孔配置及び均一な孔分布を有する。特定の態様では、ＣＡＭＬは、物理的サイズに基づく選別、流体力学的サイズに基づく選別、グループ分け、トラッピング、免疫捕捉、大細胞の濃縮、又はサイズに基づく小細胞の排除、に基づいてマイクロ流体チップを使用して、検出及び／又は収集される。特定の態様では、ＣＡＭＬは、セルシーブ（ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ）（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して検出及び／又は収集される。
【0028】
[0028]本発明及びその付随する利点の多くのより完全な評価は、付随する図面に関連して考慮するとき、それが以下の詳細な説明を参照してよりよく理解されるので、容易に得られる。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】図１Ａ～１Ｉは、癌患者の血液で見出された循環癌関連マクロファージ様細胞のギャラリーを示す図。併合された色画像は、ＤＡＰＩ（青色）、ＣＫ８、１８と１９（緑色）、ＥｐＣＡＭ（赤色）及びＣＤ４５（バイオレット）によって生成される。
【図41-1】図４１Ａ～４１Ｅは、ビメンチンでＰＤ－Ｌ１の非常に弱い染色を有するＣＡＭＬを示す図（最大Ｓ－Ｎ＝７５）；ＰＤＬ１（最大Ｓ－Ｎ＝１００）；ＣＤ４５は弱い（最大Ｓ－Ｎ＝１４５）明るいＰＤＬ１スポットは１０００である；ＣＤ４５は平滑でない；長さ－７４μｍ。
【0030】
［詳細な説明］
[0071]詳細な構築及びエレメントなどの本記載中で規定される事項は、本発明の包括的理解を助けるために提供されるものに他ならない。したがって、本発明の範囲及び精神を逸脱しない範囲で、本明細書に記載される実施形態の様々な変更及び修正を加えることができることを、当業者は認める。
[0071]詳細な構築及びエレメントなどの本記載中で規定される事項は、本発明の包括的理解を助けるために提供されるものに他ならない。したがって、本発明の範囲及び精神を逸脱しない範囲で、本明細書に記載される実施形態の様々な変更及び修正を加えることができることを、当業者は認める。
【0031】
[0072]癌は世界で最も恐れられている病気であり、全ての国の全ての集団及び民族に影響する。米国だけでも、１２，０００，０００人を超える癌患者がおり、毎年１，７００，０００の新しい癌症例があり、ほぼ６００，０００人の死亡者がいる。世界中で癌による死亡者は毎年約８，０００，０００人であると推定され、そのうち３，０００，０００人は患者が有効な治療を有する先進国で発生する。
【0032】
[0073]（ｉ）特に、肺癌については喫煙者などの危険がある群のために、全ての固形腫瘍の早期検出を提供すること、（ｉｉ）前立腺癌では高いＰＳＡなどの、癌の他の兆候を確認すること、及び／又は（ｉｉｉ）癌再発の早期検出を提供することができるバイオマーカーがあることが理想的である。
【0033】
[0074]腫瘍学者は、新たに診断された癌患者を最も良好に治療する方法を知る必要がある。現行の検査標準は組織生検であり、それは癌サブタイプを判定するために使用されるが、その理由は、治療薬物が特異サブタイプにだけ有効であることが頻繁に起こるからである。生検方法は位置によって異なるが、侵襲的であり、危険を伴う可能性がある。
【0034】
[0075]治療をモニタリングするために、薬物が患者のためにどれくらい良好に作用しているか、用量を調整すべきかどうか、及び疾患が拡散しているか又は薬物に応答しているかどうかについて、腫瘍学者は知る必要がある。これらの疑問に答えるための一般的な方法は、Ｘ線断層撮影（ＣＴ）スキャン及び磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）であり、その両方は高価である。さらに、これらの方法は、腫瘍サイズが知覚できるほどに変わるまで、必要な情報を提供することができない。
【0035】
[0076]癌患者の９０パーセントは、原発腫瘍からでなく、転移から死ぬ。転移過程は、原発癌腫（上皮細胞の固形腫瘍）から自由になって血流に入る腫瘍細胞が関与する。これらの離脱した癌細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）として知られる。ＣＴＣは、療法を判定し、治療をモニタリングし、再発を判定し、生存の予後情報を提供するツールとして有益な潜在能力を有する。しかし、ＣＴＣは、ステージＩＩＩ及びＩＶの癌でさえ血液から一貫して収集することができない。
【0036】
[0077]この開示では、ステージＩ～ＩＶの固形腫瘍患者の血液でより一貫して見出される細胞型が提示される。これらの細胞は原発腫瘍と同じ腫瘍マーカーを含有するマクロファージ様細胞であり、それらは本明細書において循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）と呼ばれる。
【0037】
[0078]ＣＴＣ及びＣＡＭＬは、サイズ排除方法、例えば精密濾過方法によって同じ患者試料から同時に見出すことができる。マイクロフィルターは、全ての赤血球及び白血球の大半を通過させ、ＣＴＣ及びＣＡＭＬなどのより大きな細胞を保持するのに十分大きい孔で形成することができる。サイズ排除方法は、マイクロ流体チップによっても実行されている。
【0038】
[0079]単独で使用されるときにも、ＣＡＭＬは多くの臨床有用性を有する。さらに、診断の感度及び特異性をさらに改善するために、ＣＡＭＬは、他のマーカー、例えばＣＴＣ、血液中の遊離ＤＮＡ及び血液中の遊離タンパク質と組み合わせることができる。これは特にＣＡＭＬ及びＣＴＣにあてはまるが、その理由は、それらを同時に単離し、同定することができるからである。
【0039】
循環腫瘍細胞
[0080]多くの固形腫瘍のＣＴＣは、いくつかのサイトケラチン（ＣＫ）を発現する。ＣＫ８、１８と１９は診断薬で最も一般的に使用されるが、調査はこれらのマーカーに限定する必要はない。固形腫瘍ＣＴＣの表面は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を通常発現する。しかし、この発現は均一でもなく、一貫してもいない。ＣＤ４５は白血球マーカーであるので、ＣＴＣはいかなるＣＤ４５も発現しないはずである。ＣＴＣ及びＣＡＭＬなどの腫瘍関連細胞を同定するアッセイでは、ＣＫ８、１８と１９などの固形腫瘍に関連したマーカーに対する抗体又はＣＤ４５若しくはＤＡＰＩに対する抗体を使用するのに十分である。染色の存在を形態と組み合わせて、病理学的に定義可能なＣＴＣ（ＰＤＣＴＣ）、アポトーシス性ＣＴＣ及びＣＡＭＬを同定することができる（Ａｄａｍｓ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｃａｐｔｕｒｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）ＣＴＣ ｔｅｓｔ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ＰａｒｔＡ ２０１５；８７Ａ：１３７～１４４頁）。
[0080]多くの固形腫瘍のＣＴＣは、いくつかのサイトケラチン（ＣＫ）を発現する。ＣＫ８、１８と１９は診断薬で最も一般的に使用されるが、調査はこれらのマーカーに限定する必要はない。固形腫瘍ＣＴＣの表面は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を通常発現する。しかし、この発現は均一でもなく、一貫してもいない。ＣＤ４５は白血球マーカーであるので、ＣＴＣはいかなるＣＤ４５も発現しないはずである。ＣＴＣ及びＣＡＭＬなどの腫瘍関連細胞を同定するアッセイでは、ＣＫ８、１８と１９などの固形腫瘍に関連したマーカーに対する抗体又はＣＤ４５若しくはＤＡＰＩに対する抗体を使用するのに十分である。染色の存在を形態と組み合わせて、病理学的に定義可能なＣＴＣ（ＰＤＣＴＣ）、アポトーシス性ＣＴＣ及びＣＡＭＬを同定することができる（Ａｄａｍｓ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｃａｐｔｕｒｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）ＣＴＣ ｔｅｓｔ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ＰａｒｔＡ ２０１５；８７Ａ：１３７～１４４頁）。
【0040】
[0081]固形腫瘍のＰＤＣＴＣは、ＣＫ８、１８と１９を発現し、以下の特性によって同定することができる：
ＤＡＰＩによって染色される「癌様」核。核は通常大きく、ドットパターンを有する。例外は、細胞が分裂中であるときである。核は、凝縮されることもある。
ＣＫ８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現；上皮癌からのＣＴＣは、少なくともＣＫ８、１８及び１９を通常発現する。サイトケラチンは、糸状のパターンを有する。
ＣＤ４５発現の欠如。
ＤＡＰＩによって染色される「癌様」核。核は通常大きく、ドットパターンを有する。例外は、細胞が分裂中であるときである。核は、凝縮されることもある。
ＣＫ８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現；上皮癌からのＣＴＣは、少なくともＣＫ８、１８及び１９を通常発現する。サイトケラチンは、糸状のパターンを有する。
ＣＤ４５発現の欠如。
【0041】
[0082]ＣＫ８、１８と１９を発現する癌からのアポトーシス性ＣＴＣは、以下の特性によって同定される：
分解する核。
ＣＫ８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現；サイトケラチンは糸状のパターンではなく、スポットの形で断片化したように見える。
ＣＤ４５発現の欠如。
分解する核。
ＣＫ８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現；サイトケラチンは糸状のパターンではなく、スポットの形で断片化したように見える。
ＣＤ４５発現の欠如。
【0042】
[0083]したがって、サイトケラチンを発現する固形腫瘍の本発明のアポトーシス性ＣＴＣには、以下の特性のうちの１つ、２つ又は３つを有するＣＴＣが含まれる：（ａ）分解する核；（ｂ）サイトケラチン８、１８及び１９のうちの１つ又は複数の発現であって、サイトケラチンはスポットの形で断片化している；並びに（ｃ）ＣＤ４５陰性の表現型。
【0043】
[0084]多くの癌腫、肉腫及び黒色腫の検出は、様々な他のマーカーの同定によってもよい。例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ）及び肉腫からのＣＴＣは、ビメンチンを発現する。膀胱癌からのＣＴＣはウロプラキンを通常発現し、ＣＫ８、１８と１９は弱い。多くの異なる目的のマーカーについて、細胞を染色することが可能である。
【0044】
[0085]本発明のＣＴＣは、以下の特性のうちの１つ又は複数に基づいて特徴付けることもできる：（ｉ）ＣＴＣの数；（ｉｉ）ＣＴＣと結合したＷＢＣの数；（ｉｉｉ）核の状態；（ｉｖ）サイトケラチン８発現の程度；（ｖ）サイトケラチン１８発現の程度；（ｖｉ）サイトケラチン１９発現の程度；（ｖｉｉ）ＥｐＣＡＭ発現の程度；（ｖｉｉｉ）ビメンチン発現の程度；（ｉｘ）ＰＤ－Ｌ１発現の程度；（ｘ）ウロプラキン発現の程度；（ｘｉ）サイトケラチン形態；（ｘｉｉ）マーカーの位置（ＣＴＣでマーカーが出現する位置、例えば、細胞質対核は、異なる時点で変化することがある）；及び（ｘｉｉｉ）マーカー染色の強度。本発明の方法で使用されるＣＴＣ特性の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は全１３であってもよい。
【0045】
循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）
[0086]ＣＡＭＬは、以下の特色のうちの１つ又は複数を有することを特徴とする：
ＣＡＭＬは、大きな非定型核を有する；複数の個々の核をＣＡＭＬで見出すことができるが、拡大した融合核小体が一般的である。ＣＡＭＬ核は、サイズが一般に直径約１０μｍ～約７０μｍの範囲内であり、直径約１４μｍ～約６４μｍがより一般的である。
多くの癌について、ＣＡＭＬは疾患の癌マーカーを発現する。例えば、上皮癌に関連したＣＡＭＬは、ＣＫ８、１８又は１９、ビメンチンなどを発現することができる。マーカーは一般的に拡散しているか、又は空胞及び／若しくは摂取物と会合している。任意のマーカーの染色パターンは、細胞全体にほとんど均一に拡散している。肉腫、神経芽細胞腫及び黒色腫の場合、癌に関連した他のマーカーをＣＫ８、１８、１９の代わりに使用することができる。
ＣＡＭＬは、ＣＤ４５陽性であってもよい。
ＣＡＭＬは大きく、サイズが直径概ね２０ミクロン～概ね３００ミクロンである。
ＣＡＭＬは、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長方形、２脚形、２本を超える脚形、細い脚形又は無定形を含む、多くの異なる形態学的形状で見出される。
ＣＡＭＬは、拡散したサイトケラチンを一般的に有する。
ＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現する場合は、ＥｐＣＡＭは一般的に細胞全体に拡散しているか、又は空胞及び／若しくは摂取物と会合し、細胞全体でほとんど均一であるが、一部の腫瘍はＥｐＣＡＭをほとんど発現しない、又は全く発現しないので全てのＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現するとは限らない。
ＣＡＭＬがマーカーを発現する場合は、マーカーは一般的に細胞全体に拡散しているか、又は空胞及び／若しくは摂取物と会合し、細胞全体でほとんど均一であるが、全てのＣＡＭＬが同じマーカーを同等の強度で発現するとは限らない。
ＣＡＭＬは、腫瘍起源のマーカーに関連したマーカーを発現する；例えば、腫瘍が前立腺癌起源であり、ＰＳＭＡを発現するならば、この患者からのＣＡＭＬもＰＳＭＡを発現する。別の例として、原発腫瘍が膵臓起源であり、ＰＤＸ－１を発現するならば、この患者からのＣＡＭＬもＰＤＸ－１を発現する。原発腫瘍又は癌起源のＣＴＣがＣＸＣＲ－４を発現するならば、患者からのＣＡＭＬもＣＸＣＲ－４を発現する。
原発腫瘍又は癌起源のＣＴＣが薬物標的のバイオマーカーを発現するならば、ＣＡＭＬは薬物標的のマーカーに関連したマーカーを発現する。免疫療法のバイオマーカーの１つの例は、ＰＤ－Ｌ１である。
ＣＡＭＬは、単核球マーカー（例えば、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４）及び内皮マーカー（例えば、ＣＤ１４６、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ３１）を発現する。ＣＡＭＬは、Ｆｃ断片に結合する能力も有する。
[0086]ＣＡＭＬは、以下の特色のうちの１つ又は複数を有することを特徴とする：
ＣＡＭＬは、大きな非定型核を有する；複数の個々の核をＣＡＭＬで見出すことができるが、拡大した融合核小体が一般的である。ＣＡＭＬ核は、サイズが一般に直径約１０μｍ～約７０μｍの範囲内であり、直径約１４μｍ～約６４μｍがより一般的である。
多くの癌について、ＣＡＭＬは疾患の癌マーカーを発現する。例えば、上皮癌に関連したＣＡＭＬは、ＣＫ８、１８又は１９、ビメンチンなどを発現することができる。マーカーは一般的に拡散しているか、又は空胞及び／若しくは摂取物と会合している。任意のマーカーの染色パターンは、細胞全体にほとんど均一に拡散している。肉腫、神経芽細胞腫及び黒色腫の場合、癌に関連した他のマーカーをＣＫ８、１８、１９の代わりに使用することができる。
ＣＡＭＬは、ＣＤ４５陽性であってもよい。
ＣＡＭＬは大きく、サイズが直径概ね２０ミクロン～概ね３００ミクロンである。
ＣＡＭＬは、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長方形、２脚形、２本を超える脚形、細い脚形又は無定形を含む、多くの異なる形態学的形状で見出される。
ＣＡＭＬは、拡散したサイトケラチンを一般的に有する。
ＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現する場合は、ＥｐＣＡＭは一般的に細胞全体に拡散しているか、又は空胞及び／若しくは摂取物と会合し、細胞全体でほとんど均一であるが、一部の腫瘍はＥｐＣＡＭをほとんど発現しない、又は全く発現しないので全てのＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現するとは限らない。
ＣＡＭＬがマーカーを発現する場合は、マーカーは一般的に細胞全体に拡散しているか、又は空胞及び／若しくは摂取物と会合し、細胞全体でほとんど均一であるが、全てのＣＡＭＬが同じマーカーを同等の強度で発現するとは限らない。
ＣＡＭＬは、腫瘍起源のマーカーに関連したマーカーを発現する；例えば、腫瘍が前立腺癌起源であり、ＰＳＭＡを発現するならば、この患者からのＣＡＭＬもＰＳＭＡを発現する。別の例として、原発腫瘍が膵臓起源であり、ＰＤＸ－１を発現するならば、この患者からのＣＡＭＬもＰＤＸ－１を発現する。原発腫瘍又は癌起源のＣＴＣがＣＸＣＲ－４を発現するならば、患者からのＣＡＭＬもＣＸＣＲ－４を発現する。
原発腫瘍又は癌起源のＣＴＣが薬物標的のバイオマーカーを発現するならば、ＣＡＭＬは薬物標的のマーカーに関連したマーカーを発現する。免疫療法のバイオマーカーの１つの例は、ＰＤ－Ｌ１である。
ＣＡＭＬは、単核球マーカー（例えば、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４）及び内皮マーカー（例えば、ＣＤ１４６、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ３１）を発現する。ＣＡＭＬは、Ｆｃ断片に結合する能力も有する。
【0046】
[0087]したがって、本発明のＣＡＭＬには、以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ又は５つを有するＣＡＭＬが含まれる：（ａ）約１４～６４μｍのサイズを有する大きな非定型核；（ｂ）拡散しているか、又は空胞及び／若しくは摂取物と会合している、腫瘍と関連した癌マーカーのうちの１つ又は複数の発現；（ｃ）細胞のサイズは約２０ミクロン～約３００ミクロンの範囲である；（ｄ）形態学的形状は、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長方形、１つ又は複数の脚形、細い脚形及び無定形からなる群から選択される；並びに（ｅ）ＣＤ４５陽性表現型。本発明のＣＡＭＬには、以下の追加の特性のうちの１つ、２つ、３つ又は４つを有するＣＡＭＬも含まれる：（ｆ）ほとんど均一に分布した拡散性のＥｐＣＡＭ又はビメンチンの発現；（ｇ）原発腫瘍の１つ又は複数のマーカーの発現；（ｈ）骨髄性のＣＤ１４マーカーの発現；（ｉ）単核球ＣＤ１１Ｃマーカーの発現；及び（ｊ）内皮ＣＤ１４６、ＣＤ２０２ｂ及びＣＤ３１マーカーの発現。特定の態様では、本発明のＣＡＭＬは、追加の特性（ｆ）～（ｊ）の各々を有する。
【0047】
[0088]本発明のＣＡＭＬは、以下の特性のうちの１つ又は複数に基づいて特徴付けることもできる：（ｉ）ＣＡＭＬの数；（ｉｉ）ＣＡＭＬの平均サイズ（ＣＡＭＬ細胞のサイズは直径約２０ミクロン～約３００ミクロンの範囲）；（ｉｉｉ）ＣＡＭＬの核の平均サイズ（ＣＡＭＬは、直径約１４～６４μｍのサイズを有する大きな非定形的核を有する）；（ｉｖ）ＣＡＭＬの形態学的形状（ＣＡＭＬ形状には、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長方形、２脚形、２本を超える脚形、細い脚形又は無定形が含まれる）；（ｖ）ＣＤ１４陽性表現型；（ｖｉ）ＣＤ４５発現の程度；（ｖｉｉ）ＥｐＣＡＭ発現の程度；（ｖｉｉｉ）ビメンチン発現の程度；（ｉｘ）ＰＤ－Ｌ１発現の程度；（ｘ）単核球ＣＤ１１Ｃマーカー発現の程度；（ｘｉ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現の程度；（ｘｉｉ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現の程度；（ｘｉｉｉ）内皮ＣＤ３１マーカー発現の程度；（ｘｉｖ）マーカーの位置（ＣＡＭＬでマーカーが出現する位置、例えば、細胞質対核は、異なる時点で変化することがある）；（ｘｖ）ＣＡＭＬでの、拡散しているか又は空胞及び／若しくは摂取物と会合している、癌と関連した１つ又は複数のマーカーの存在（例えば、上皮癌の場合、マーカーはサイトケラチン８、１８及び１９である）；並びに（ｘｖｉ）マーカー染色の強度。本発明の方法で使用されるＣＡＭＬ特性の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は全１６であってもよい。
【0048】
[0089]ある特定の状況の下では、Ｈ＆Ｅ又は他の比色染色法によってＣＡＭＬを染色することが最適であり得る。
【0049】
[0090]図１は、別々の前立腺、乳房及び膵臓の患者試料からの異なるＣＡＭＬ形態の多く及びシグナル変動を示すＣＡＭＬのコラージュを含有する（Ａｄａｍｓ，Ｄ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｇｉａｎｔ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．ＰＮＡＳ ２０１４、１１１（９）：３５１４～３５１９頁）：（図１Ａ）膵臓、（図１Ｂ）乳房、（図１Ｃ）乳房、（図１Ｄ）乳房、（図１Ｅ）前立腺、（図１Ｆ）膵臓、（図１Ｇ）膵臓、（図１Ｈ）前立腺及び（図１Ｉ）前立腺。形態変異形の例は、以下の通りである：無定形（図１Ａ）、長方形（図１Ｂ及び１Ｇ）、紡錘形（図１Ｃ、１Ｆ、１Ｉ、３、５、６）、円形（図１Ｄ）及びオタマジャクシ形（図１Ｅと１Ｈ）。色差は、ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン及びＣＤ４５に対する抗体反応からの様々な程度のタンパク質発現から起こる。
【0050】
[0091]図２～１３は、ＤＡＰＩ、ＣＤ１０、ビメンチン及びＣＤ４５で染色したＣＡＭＬを示し、ここで、（図２Ａ）フレームは、併合された顕微鏡画像ＤＡＰＩ（青色）、ＣＤ１０（緑色）、ビメンチン（赤色）及びＣＤ４５（バイオレット）を示し、（図２Ｂ）フレームは、併合された顕微鏡画像ＤＡＰＩ（白色）、ＣＤ１０（緑色）、ビメンチン（赤色）及びＣＤ４５（バイオレット）を示し、（図２Ｃ）フレームはＤＡＰＩ（白色）を示し、（図２Ｄ）フレームはＣＤ１０（白色）を示し、（図２Ｅ）フレームはビメンチン（白色）を示し、（図２Ｆ）フレームはＣＤ４５（白色）を示す。核が白色のフレーム（図２Ｂ）は、一部の細胞のためにより優れた画質を提供する。それらの細胞は、上の段落に記載されるＣＡＭＬの性質を保有する。細胞の供与源が腎臓癌患者であるので、染色法の選択が選択された。
【0051】
[0092]図２Ａ～２Ｆは、上脚の端で呑食されたＤＮＡ物質を示す。図３Ａ～３Ｆは、細胞を呑食する過程のＣＡＭＬを示し、ここで、ＤＮＡ物質は既にＣＡＭＬ中にあり、一部の分解された細胞質は部分的になおＣＡＭＬの外側にある。図４Ａ～４Ｆは、分解された細胞物質を呑食する過程のＣＡＭＬを示す。これは、ビメンチンチャネルで最も可視的である。図５Ａ～５Ｆは、ＣＡＭＬを４つの呑食されたＣＤ４５陽性白血球と共に示す。図６Ａ～６Ｆは、ＣＡＭＬを２つの呑食されたＣＤ４５陽性白血球と共に示す。図７Ａ～７Ｆは、分裂過程のＣＡＭＬを示すと考えられる。図８Ａ～８Ｆは、その２つの細胞が同じ起源に由来している可能性があることを示唆している、２つの類似の並んでいるＣＡＭＬを示す。図９Ａ～９Ｆは、２つの類似の並んでいるＣＡＭＬの別の例を示す。
【0052】
[0093]図１０～１２は、図１で特定されなかったＣＡＭＬの追加の形態を示す。図１０Ａ～１０Ｆは、細胞の左側に２つの小さい脚を有するＣＡＭＬを示す。図１１Ａ～１１Ｆは、同じ側に２つの脚を有するＣＡＭＬを示す。図１２Ａ～１２Ｆは、核の右側に１つの脚及び左側に２つの脚を有するＣＡＭＬを示す。図１３Ａ～１３Ｆは、非常に細い脚及び大きな単一の核を有するＣＡＭＬを示す。図１４Ａ～１４Ｆは、ＨＳＶ－２ウイルス感染患者で見出されたＣＡＭＬを示す。
【0053】
ＣＴＣに対する体の免疫応答－ＣＴＣに結合したＴ細胞
[0094]腫瘍細胞が血流に入るとき、ＣＴＣはＴ細胞によって攻撃されるはずであり、腫瘍細胞の死をもたらす。これが起こるとき、１つ又は複数のＴ細胞がＣＴＣに結合し、ＣＴＣの死及びＣＴＣの最終的な分解が生じる。Ｔ細胞は、白血球のサブタイプである。ＣＤ４５マーカーはＷＢＣを染色し、Ｔ細胞に特異的でない。Ｔ細胞は、核の形態によって、顆粒球と区別することができる。Ｔ細胞は、概ね丸くて８ミクロンより小さい単一の核を有する。血液の濾過は、ＣＴＣに結合した白血球（ＷＢＣ）を捕捉することができる。血液中のＣＴＣに結合したＷＢＣの存在は、固形腫瘍の存在及び固形腫瘍を排除する体の能力の指標でもある。したがって、ＣＴＣに結合したＴ細胞の数の判定は、診断薬で使用することができる。
[0094]腫瘍細胞が血流に入るとき、ＣＴＣはＴ細胞によって攻撃されるはずであり、腫瘍細胞の死をもたらす。これが起こるとき、１つ又は複数のＴ細胞がＣＴＣに結合し、ＣＴＣの死及びＣＴＣの最終的な分解が生じる。Ｔ細胞は、白血球のサブタイプである。ＣＤ４５マーカーはＷＢＣを染色し、Ｔ細胞に特異的でない。Ｔ細胞は、核の形態によって、顆粒球と区別することができる。Ｔ細胞は、概ね丸くて８ミクロンより小さい単一の核を有する。血液の濾過は、ＣＴＣに結合した白血球（ＷＢＣ）を捕捉することができる。血液中のＣＴＣに結合したＷＢＣの存在は、固形腫瘍の存在及び固形腫瘍を排除する体の能力の指標でもある。したがって、ＣＴＣに結合したＴ細胞の数の判定は、診断薬で使用することができる。
【0054】
[0095]腫瘍細胞及びＴ細胞のマーカーは、それらが接触するときに２つの細胞の間で交換されることがある。図１５～１８は、乳癌患者の血液で見出されたＣＴＣに結合したＷＢＣを示す。乳癌患者のために使用されるマーカーは、ＤＡＰＩ、ＣＫ８、１８と１９、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５である。図１５～１６は、ＣＴＣがアポトーシス性であり、ＣＫ８、１８及び１９がスポットに分解したことを示す。図１８は、ＣＫ及びＥｐＣＡＭの両マーカーを失い、細胞質がなく大きく分解されたＣＴＣを示す。ＷＢＣ及びＣＴＣの核が図１６に示すように互いの方へ引かれることがしばしば観察される。
【0055】
[0096]図１９～２１は、膀胱癌患者の血液で見出されたＣＴＣに結合したＷＢＣを示す。膀胱癌患者のために使用されるマーカーは、ＤＡＰＩ、ＣＫ８、１８と１９、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５である。図１９Ｅでは、ＥｐＣＡＭはスポットに分解される。ＷＢＣ（図１９Ａでマークされている）及びＣＴＣの細胞質は、ＷＢＣの周囲でＥｐＣＡＭと併合する過程にある。ＷＢＣは、ＣＤ４５をなお発現する。図２０Ａ～２０Ｆは、ＷＢＣに結合している比較的なおインタクトなＣＴＣを示す。図２１Ａ～２１Ｆは細胞質なしの裸のＣＴＣ核を示し、ＷＢＣ（図２１Ａでマークされている）はＣＤ４５をなお発現しているが、ＣＴＣに結合していないＷＢＣ（図２１Ａでマークされていない）よりかなり弱い。
【0056】
[0097]図２２～２８は、腎臓癌患者の血液で見出されたＣＴＣに結合したＷＢＣを示す。これらの患者試料のために使用されるマーカーは、ＤＡＰＩ、ＣＤ１０、ビメンチン及びＣＤ４５である。図２２Ａ～２２Ｆは、ビメンチンの発現が高い、間葉性腎臓癌からのＣＴＣを示す。それは、ＷＢＣにタイトに結合している。図２３～２８は、図２２に示すものより低いレベルのビメンチンを発現している非間葉性腎臓癌患者の血液で見出された、ＣＴＣに結合したＷＢＣを示す。ＷＢＣ及びＣＴＣの核及び細胞質は、お互いの方へ引かれる。ＣＤ１０、ビメンチン及びＣＤ４５マーカーの全ては、ＷＢＣがＣＴＣに結合した後に非常に弱くなる。細胞質の量が減少し、最終的に全く失われることがある。
【0057】
癌患者の血液でのＣＴＣ及びＣＡＭＬの頻度
[0098]ＰＤＣＴＣは、癌の初期ではめったに見出されない。ＰＤＣＴＣがステージＩＩＩ及びＩＶの乳房及び前立腺の癌患者でより頻繁に見出されるとしても、それらはほとんどの他の固形腫瘍では低い頻度で見ることができる。一例として、１０５人の癌患者（乳癌（ｎ＝３４）、前立腺癌（ｎ＝２５）、膵臓癌（ｎ＝３９）及び肺癌（ｎ＝７））、及び３０人の健康対照を分析した。図２９は、健康対照の血液で、ＰＤＣＴＣ及びＣＡＭＬを見出すことができなかったことを示す。対照的に、ＣＡＭＬは１０５人の癌患者のうちの９８人で見出された。ＰＤＣＴＣ及びＣＡＭＬを有する患者の百分率は、それぞれ、５３％及び９３％である。１０５人の癌患者についての癌のステージは、以下の通りだった：ステージＩ（ｎ＝４６）、ステージＩＩ（ｎ＝１８）、ステージＩＩＩ（ｎ＝１１）、及びステージＩＶ（ｎ＝３０）。図３０は、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのＣＡＭＬを有する患者の百分率が、それぞれ８７％、１００％、９１％及び９７％であることを示す。ＣＡＭＬは、ＰＤＣＴＣより一般的であることが見出された。１２個の異なる固形腫瘍からの患者試料を分析した：乳房、前立腺、膵臓、肺、結腸直腸、子宮、神経芽細胞腫、食道、腎臓、膀胱、肉腫及び卵巣。それらの全ての種類の癌で、ＣＡＭＬが見出された（データは示さず）。
[0098]ＰＤＣＴＣは、癌の初期ではめったに見出されない。ＰＤＣＴＣがステージＩＩＩ及びＩＶの乳房及び前立腺の癌患者でより頻繁に見出されるとしても、それらはほとんどの他の固形腫瘍では低い頻度で見ることができる。一例として、１０５人の癌患者（乳癌（ｎ＝３４）、前立腺癌（ｎ＝２５）、膵臓癌（ｎ＝３９）及び肺癌（ｎ＝７））、及び３０人の健康対照を分析した。図２９は、健康対照の血液で、ＰＤＣＴＣ及びＣＡＭＬを見出すことができなかったことを示す。対照的に、ＣＡＭＬは１０５人の癌患者のうちの９８人で見出された。ＰＤＣＴＣ及びＣＡＭＬを有する患者の百分率は、それぞれ、５３％及び９３％である。１０５人の癌患者についての癌のステージは、以下の通りだった：ステージＩ（ｎ＝４６）、ステージＩＩ（ｎ＝１８）、ステージＩＩＩ（ｎ＝１１）、及びステージＩＶ（ｎ＝３０）。図３０は、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのＣＡＭＬを有する患者の百分率が、それぞれ８７％、１００％、９１％及び９７％であることを示す。ＣＡＭＬは、ＰＤＣＴＣより一般的であることが見出された。１２個の異なる固形腫瘍からの患者試料を分析した：乳房、前立腺、膵臓、肺、結腸直腸、子宮、神経芽細胞腫、食道、腎臓、膀胱、肉腫及び卵巣。それらの全ての種類の癌で、ＣＡＭＬが見出された（データは示さず）。
【0058】
ＣＡＭＬの数は、療法に基づいて異なる
[0099]上記の１０５人の患者のうち、４４人の患者は療法を受けず、１２人は標的療法を受け、４９人は化学療法を受けた。療法の完了後に患者でＣＡＭＬを検出するために、追跡調査スクリーニングを実行した。図３１に示すように、ＣＡＭＬの数は、療法のタイプに依存すると考えられる。化学療法を受ける患者でのＣＡＭＬの数は、療法を受けないか又は標的療法を受ける患者でのＣＡＭＬの数よりかなり多い。
[0099]上記の１０５人の患者のうち、４４人の患者は療法を受けず、１２人は標的療法を受け、４９人は化学療法を受けた。療法の完了後に患者でＣＡＭＬを検出するために、追跡調査スクリーニングを実行した。図３１に示すように、ＣＡＭＬの数は、療法のタイプに依存すると考えられる。化学療法を受ける患者でのＣＡＭＬの数は、療法を受けないか又は標的療法を受ける患者でのＣＡＭＬの数よりかなり多い。
【0059】
ステージング及び疾患進行とのＣＡＭＬの数の関係
[00100]化学療法を受ける患者でのＣＡＭＬの数は、治療前臨床評価の時点の癌ステージと弱く関連するにすぎず（図３２）、病理学的確認の後のステージと高い相関がある（図３３Ａ）。化学療法を受ける患者の場合、ＣＡＭＬの数は、最終病理学的確認と指数関数的に相関していた：ステージＩ（３．２）、ステージＩＩ（７．１）、ステージＩＩＩ（１４．６）、ステージＩＶ（３５．１）；Ｒ２＝０．９９。
[00100]化学療法を受ける患者でのＣＡＭＬの数は、治療前臨床評価の時点の癌ステージと弱く関連するにすぎず（図３２）、病理学的確認の後のステージと高い相関がある（図３３Ａ）。化学療法を受ける患者の場合、ＣＡＭＬの数は、最終病理学的確認と指数関数的に相関していた：ステージＩ（３．２）、ステージＩＩ（７．１）、ステージＩＩＩ（１４．６）、ステージＩＶ（３５．１）；Ｒ２＝０．９９。
【0060】
[00101]図３３Ｂは、異なるステージ毎にサイズに基づいてＣＡＭＬの数を分類する。後期ステージでのＣＡＭＬは、より大きなサイズのより多くのＣＡＭＬを有する。
【0061】
乳癌スクリーニング
[00102]ＣＡＭＬは固形腫瘍の全てのステージで高い百分率で見出すことができるので、癌スクリーニングマーカーとしてのＣＡＭＬを、乳癌について評価した。マンモグラフィーが異常と判断された４１人の対象について、二重盲検前向き試験を実行した。二重盲検試験を実行した：（ｉ）ＣＡＭＬについて試験するために、７．５ｍＬの末梢血試料を取り、（ｉｉ）コア針生検による組織診断を実行した。マンモグラフィーはこの群で亜集団を区別できなかったが、ＣＡＭＬの存在は９０％の感度及び７２％の特異性で良性と悪性の乳房疾患を区別した（データは示さず）。
[00102]ＣＡＭＬは固形腫瘍の全てのステージで高い百分率で見出すことができるので、癌スクリーニングマーカーとしてのＣＡＭＬを、乳癌について評価した。マンモグラフィーが異常と判断された４１人の対象について、二重盲検前向き試験を実行した。二重盲検試験を実行した：（ｉ）ＣＡＭＬについて試験するために、７．５ｍＬの末梢血試料を取り、（ｉｉ）コア針生検による組織診断を実行した。マンモグラフィーはこの群で亜集団を区別できなかったが、ＣＡＭＬの存在は９０％の感度及び７２％の特異性で良性と悪性の乳房疾患を区別した（データは示さず）。
【0062】
抗体染色及び単離細胞の再染色
[00103]一般的な蛍光顕微鏡は、予想外の蛍光チャネルへの蛍光放出のブリードスルーを最小にするために、４つ又は５つの蛍光チャネルを通常使用する。１つのチャネルは、核を画像化するためにＤＡＰＩによって取られる。しばしば、３つを超えるマーカーを評価する必要性がある。これらの欠点を考慮して、本開示で開示される方法の各々と併用することができる、同じ細胞の上の最高概ね１２個の異なるマーカーの分析を可能にする方法が開発された。濾過及びマーカーの第１セットによるフィルター上の細胞の染色の工程の後に、目的の細胞が同定され、画像化される。同じ細胞の上のより多くのマーカーを評価するために、クエンチング／ストリッピング工程が再染色技術の前に開発された。同じ細胞の再画像化を可能にするために、これは細胞が同じ位置にとどまることを必要とした。これは、数回繰り返すことができる。図３４の最上列は、標準のＣＴＣ染色法：ＤＡＰＩ、ＣＫ８、１８、１９、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５によるＣＡＭＬ Ａを示す。第２の列は、クエンチングの後の同じ細胞の再染色を示し、目的のマーカー：ＰＤ－Ｌ１、ＣＣＲ及びＰＤ－１のために再染色した。図３４の第３の列は、標準のＣＴＣ染色法によるＣＡＭＬ Ｂを示す。第４の列は、目的のマーカー：ＰＤ－Ｌ１、ＣＣＲ及びＰＤ－１のための、クエンチングの後の同じＣＡＭＬ Ｂの再染色を示す。この再染色方法は、マイクロフィルターの上に固定された細胞に特に適する。それらの位置は、異なるマーカーを評価するためにそれらを再画像化することができるように固定される。フィルター上のＣＴＣ及び他の細胞も、この技術を使用して再染色することができる。この再染色方法は、癌タイプ、コンパニオン診断薬、療法応答、癌スクリーニング及び様々な研究用途を分析するために非常に有益である。
[00103]一般的な蛍光顕微鏡は、予想外の蛍光チャネルへの蛍光放出のブリードスルーを最小にするために、４つ又は５つの蛍光チャネルを通常使用する。１つのチャネルは、核を画像化するためにＤＡＰＩによって取られる。しばしば、３つを超えるマーカーを評価する必要性がある。これらの欠点を考慮して、本開示で開示される方法の各々と併用することができる、同じ細胞の上の最高概ね１２個の異なるマーカーの分析を可能にする方法が開発された。濾過及びマーカーの第１セットによるフィルター上の細胞の染色の工程の後に、目的の細胞が同定され、画像化される。同じ細胞の上のより多くのマーカーを評価するために、クエンチング／ストリッピング工程が再染色技術の前に開発された。同じ細胞の再画像化を可能にするために、これは細胞が同じ位置にとどまることを必要とした。これは、数回繰り返すことができる。図３４の最上列は、標準のＣＴＣ染色法：ＤＡＰＩ、ＣＫ８、１８、１９、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５によるＣＡＭＬ Ａを示す。第２の列は、クエンチングの後の同じ細胞の再染色を示し、目的のマーカー：ＰＤ－Ｌ１、ＣＣＲ及びＰＤ－１のために再染色した。図３４の第３の列は、標準のＣＴＣ染色法によるＣＡＭＬ Ｂを示す。第４の列は、目的のマーカー：ＰＤ－Ｌ１、ＣＣＲ及びＰＤ－１のための、クエンチングの後の同じＣＡＭＬ Ｂの再染色を示す。この再染色方法は、マイクロフィルターの上に固定された細胞に特に適する。それらの位置は、異なるマーカーを評価するためにそれらを再画像化することができるように固定される。フィルター上のＣＴＣ及び他の細胞も、この技術を使用して再染色することができる。この再染色方法は、癌タイプ、コンパニオン診断薬、療法応答、癌スクリーニング及び様々な研究用途を分析するために非常に有益である。
【0063】
ＣＡＭＬ及びＣＴＣを使用する単一細胞分子アッセイ
[00104]様々なＰＣＲアッセイ、マイクロアレイ、ＦＩＳＨアッセイ及び配列決定によって、遺伝子の突然変異、転座及び増幅のために癌細分類を判定するために、ＣＡＭＬ及びＣＴＣの分子分析を潜在的に使用することができる。単一細胞分子分析は一般的になっており、ＣＡＭＬの単一細胞分析は特に興味深い。一部のアッセイは、エラーを低減するために１つを超える核及び／又は細胞を必要とする。したがって本発明は、単一のＣＡＭＬ細胞を得て単一細胞で分子分析を実行する、単一のＣＡＭＬ細胞の分子分析の方法を含む。単一細胞で実行することができる分子分析の特定のタイプに関して制限はなく、そのような手段には、これらに限定されないが、核酸配列決定、ノーザンブロット分析及びサザンブロット分析が含まれる。
[00104]様々なＰＣＲアッセイ、マイクロアレイ、ＦＩＳＨアッセイ及び配列決定によって、遺伝子の突然変異、転座及び増幅のために癌細分類を判定するために、ＣＡＭＬ及びＣＴＣの分子分析を潜在的に使用することができる。単一細胞分子分析は一般的になっており、ＣＡＭＬの単一細胞分析は特に興味深い。一部のアッセイは、エラーを低減するために１つを超える核及び／又は細胞を必要とする。したがって本発明は、単一のＣＡＭＬ細胞を得て単一細胞で分子分析を実行する、単一のＣＡＭＬ細胞の分子分析の方法を含む。単一細胞で実行することができる分子分析の特定のタイプに関して制限はなく、そのような手段には、これらに限定されないが、核酸配列決定、ノーザンブロット分析及びサザンブロット分析が含まれる。
【0064】
[00105]精密濾過デバイスを使用してＣＴＣ及びＣＡＭＬを収集する方法が、記載される。本出願において、再染色目的のために細胞がフィルターの上にとどまる必要性とは逆に、細胞がフィルターから容易に除去されることが所望される。細胞の除去を可能にする重要な工程は、細胞が粘着するのを防止するためにフィルターをコーティングすること、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用してコーティングすることである。細胞接着を防止する他のコーティングも、適用可能である。試料はフィルターを通過し、孔より大きな細胞が収集される。目的の細胞を収集するための、２つの方法がある。方法１：フィルターホルダーからフィルターを外し、細胞を上にしてシャーレ又はガラススライドに置き、ＰＢＳなどの適当な液体で覆う；マイクロマニピュレーターを使用して細胞をフィルターから直接的に採取することができる。方法２：細胞がフィルター上にあるホルダーの底にＰＢＳを充填したシリンジを取り付け、フィルターから細胞を逆洗する。遠心分離及び上清の除去によって細胞を濃縮することができる。顕微鏡の下で可視化を可能にするために、細胞を染色する必要がある。染色法の１つの非限定的な選択は、蛍光挿入色素である。別の例は、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４５及び／又は他のマーカーなどの細胞表面マーカーについて染色することである。マイクロマニピュレーター又は器具、例えばＣｅｌｌＣｏｌｅｃｔｏｒ及び他の器具などの、シャーレから目的の細胞を採取するための様々な方法がある。
【0065】
コンパニオン診断
[00106]患者に処方される特定の薬物を判定するコンパニオン診断のための組織の供与源として、ＣＡＭＬを使用することができる。現在、コンパニオン診断は、薬物標的のマーカーについて染色するために、ＦＩＳＨアッセイを実行するために、ＰＣＲ、マイクロアレイ、配列決定などによって遺伝子の突然変異、増幅又は転座を探すために他の分子アッセイを実行するために、組織生検を利用する。組織生検を利用する従来のコンパニオン診断の例は、ＨＥＲ２増幅のためのＦＩＳＨ、ＡＬＫ転座のためのＦＩＳＨ、組織中のＰＤ－Ｌ１、組織中のＡＲ及びＥＲなどである。広範な薬物を評価するために、十分な組織がない又は全く組織がないことがある。ＣＴＣ及びＣＡＭＬは、繰り返し収集すること、及び組織生検の代わりに使用することができる。さらに、複数の薬物の効力を評価するために、同じ試料を繰り返し再染色することができる。
[00106]患者に処方される特定の薬物を判定するコンパニオン診断のための組織の供与源として、ＣＡＭＬを使用することができる。現在、コンパニオン診断は、薬物標的のマーカーについて染色するために、ＦＩＳＨアッセイを実行するために、ＰＣＲ、マイクロアレイ、配列決定などによって遺伝子の突然変異、増幅又は転座を探すために他の分子アッセイを実行するために、組織生検を利用する。組織生検を利用する従来のコンパニオン診断の例は、ＨＥＲ２増幅のためのＦＩＳＨ、ＡＬＫ転座のためのＦＩＳＨ、組織中のＰＤ－Ｌ１、組織中のＡＲ及びＥＲなどである。広範な薬物を評価するために、十分な組織がない又は全く組織がないことがある。ＣＴＣ及びＣＡＭＬは、繰り返し収集すること、及び組織生検の代わりに使用することができる。さらに、複数の薬物の効力を評価するために、同じ試料を繰り返し再染色することができる。
【0066】
治療応答のモニタリング
[00107]液体細胞生検は、患者で治療応答をモニタリングするための、最小限に侵襲的な方法を提供する。癌治療の効力をモニタリングするために、以下を含むアプローチを採択することができる：
（ａ）同じ対象からのＣＡＭＬ及びＣＴＣの数の変化を治療後の異なる時点でモニタリングすること；
（ｂ）ＣＡＭＬ及びＣＴＣのサイズの変化を異なる時点でモニタリングすること；
（ｃ）ＣＡＭＬ及びＣＴＣでマーカーの強度の変化を異なる時点でモニタリングすること；並びに
（ｄ）ＣＡＭＬ及びＣＴＣで、細胞質対核のマーカーの位置の変化を異なる時点でモニタリングすること。
[00107]液体細胞生検は、患者で治療応答をモニタリングするための、最小限に侵襲的な方法を提供する。癌治療の効力をモニタリングするために、以下を含むアプローチを採択することができる：
（ａ）同じ対象からのＣＡＭＬ及びＣＴＣの数の変化を治療後の異なる時点でモニタリングすること；
（ｂ）ＣＡＭＬ及びＣＴＣのサイズの変化を異なる時点でモニタリングすること；
（ｃ）ＣＡＭＬ及びＣＴＣでマーカーの強度の変化を異なる時点でモニタリングすること；並びに
（ｄ）ＣＡＭＬ及びＣＴＣで、細胞質対核のマーカーの位置の変化を異なる時点でモニタリングすること。
【0067】
[00108]化学療法に関する１つの例として、図３１は、化学療法治療の直後に化学療法応答体はＣＡＭＬの増加を示すようであることを示す。対照的に、標的療法からのＣＡＭＬの数は、無処置対照を超える増加を示さなかった。
【0068】
[00109]第２の例、放射線療法では、図３５の上列は、放射線療法の前の、ＤＡＰＩ、ＰＤ－Ｌ１、ＲＡＤ５０及びＰＤ－１のために染色した肺癌患者からのＣＡＭＬを示す。一番下の２列は、同様にＤＡＰＩ、ＰＤ－Ｌ１、ＲＡＤ５０及びＰＤ－１のために染色した放射線療法後の２つの異なるＣＡＭＬを示す。ＲＡＤ５０は、核のＤＮＡ傷害部位に移動している。
【0069】
[00110]ＲＡＤ５０のこの変化は、ＣＴＣでも見られる。第３の例は、放射線療法の有効性を検討するために、再染色を組み合わせる。図３６の上列は、標準のＣＴＣ染色法：ＤＡＰＩ、ＣＫ８、１８、１９、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５を使用した、放射線治療後の肺癌患者からのＣＴＣのクラスタを示す。一番下の列は、放射線療法及び免疫応答に関するマーカー：ＰＤ－Ｌ１、ＲＡＤ５０及びＰＤ－１のためのクエンチング及び再染色の後の、同じＣＴＣクラスタを示す。
【0070】
[00111]第４の例は、免疫療法に関する。体が腫瘍を死滅させることを可能にする免疫療法は、多くの種類の癌に対して印象的な結果を示している。免疫療法薬物の例は、腫瘍細胞の表面のＰＤ－Ｌ１に対する抗体である。免疫療法薬物の別の試料は、キラーＴ細胞の表面のＰＤ－１に対する抗体である。両タイプの免疫療法薬物は、キラーＴ細胞が腫瘍細胞を一部の患者で死滅させることを可能にする。図３７は、概ね２～３週間離れた４つの期間で収集されたＣＡＭＬの数の例を示す。ＰＤ－１の治療は、液体細胞生検のために血液試料を提供した後のＴ１及びＴ３日目であった。治療後のＣＡＭＬの数の低下は、おそらく、患者が治療に応答していないことの指標である。ＣＡＭＬはサイズでも減少するので、図３８は、ＣＡＭＬのサイズの対応する範囲を示す。この情報は、治療の結果として血液中に腫瘍デブリの減少があり得ることを示唆し、その患者が治療に応答していない可能性を示唆する。図３９は、非常に明るいＰＤ－Ｌ１を示しているＴ１の前のＣＡＭＬである。バックグラウンドノイズを超えるＰＤ－Ｌ１のシグナルは、バックグラウンドノイズの約８倍である。図４０は、治療の直前に収集されたＴ１時のＣＡＭＬである。ＰＤ－Ｌ１シグナルは、ここでは弱い。バックグラウンドノイズを超えるＰＤ－Ｌ１のシグナルは、バックグラウンドノイズの２倍未満であり、潜在的な劣る応答を示している。図４１は、Ｔ３時のＣＡＭＬである。ＰＤ－Ｌ１シグナルは、ここでは非常に弱い。バックグラウンドノイズを超えるＰＤ－Ｌ１のシグナルは、バックグラウンドノイズの１倍未満である。これは、ＰＤ－Ｌ１などの薬物標的の減少の指標である。
【0071】
[00112]第５の例は、手術の奏効のモニタリングに関する。Ａｄａｍｓら（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｇｉａｎｔ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．ＰＮＡＳ ２０１４、１１１（９）：３５１４～３５１９頁）による論文の図Ｓ５は、手術がＣＡＭＬの数を低減することを示した。患者の血液中のＣＡＭＬの連続した存在は、癌が完全に根絶されていない可能性があることを示している可能性がある。
【0072】
ＣＡＭＬ及びＣＴＣの捕捉
[00113]体液中に存在する他の細胞より大きな及び／又はより柔軟でない細胞は、体液を濾過することによって収集することができる。例えば、状態の指標となる標的細胞、例えばＣＡＭＬ及びＣＴＣは、標的細胞が通過するためには小さすぎるが、他の細胞が通過するのに十分に大きい開口部を有するフィルターに体液を通すことによって収集することができる。収集されると、標的細胞の任意の数の分析を実行することができる。そのような分析には、例えば、マーカーの発現を同定、計数、特徴付けること、分子分析を得ること、及び／又は収集した細胞を培養することが含まれてもよい。
[00113]体液中に存在する他の細胞より大きな及び／又はより柔軟でない細胞は、体液を濾過することによって収集することができる。例えば、状態の指標となる標的細胞、例えばＣＡＭＬ及びＣＴＣは、標的細胞が通過するためには小さすぎるが、他の細胞が通過するのに十分に大きい開口部を有するフィルターに体液を通すことによって収集することができる。収集されると、標的細胞の任意の数の分析を実行することができる。そのような分析には、例えば、マーカーの発現を同定、計数、特徴付けること、分子分析を得ること、及び／又は収集した細胞を培養することが含まれてもよい。
【0073】
[00114]ＣＡＭＬ、病理学的に定義可能なＣＴＣ及びアポトーシス性ＣＴＣは、赤血球及びほとんどの白血球より大きい。精密孔径及び孔分布を有する精密マイクロフィルターを使用することは、これらの細胞のために高い捕捉効率及び低い標準偏差を提供することが示されている。セルシーブ（商標）マイクロフィルター（Ｃｒｅａｔｖ ＭｉｃｒｏＴｅｃｈ）は、精密マイクロフィルターの１つの例である。セルシーブ（商標）マイクロフィルターは透明、非蛍光性であり、それらを顕微鏡画像化分析にとって理想的にしている。７～８ミクロンの孔径は、全ての赤血球及び白血球の９９．９９％を排除した。均一な孔径及び分布を生むマイクロフィルターを製作する方法は、国際公開第２０１１／１３９４４５及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／６６３９０に記載され、その両方は参照により完全に本明細書に組み込まれる。トラックエッチング方法によって作製されるマイクロフィルターは、重なり合って効果的に大きな孔をもたらすことができる、ランダムに位置する孔を有する。それらは、一部のＣＡＭＬ及びＣＴＣを失う可能性がある。
【0074】
[00115]精密濾過の他に、多くの他の方法がＣＴＣの捕捉のために存在し、いくつかはＣＡＭＬを捕捉するために採択することもできる。それらは、以下のカテゴリーに一般に分類される：
ＣＡＭＬは血液細胞の大半と比較して大きいので、多くのサイズに基づく方法がＣＡＭＬを捕捉するために適する。７～８ミクロン孔のマイクロフィルターが、ＣＡＭＬ及びＣＴＣの同時捕捉に理想的である。ＣＴＣではなくＣＡＭＬだけが目的であれば、孔径はより大きく、概ね１５～２０ミクロンまでとなってもよい。大きな方の孔径は、フィルター上の大部分のＷＢＣ汚染を排除する。
免疫捕捉は、強磁性流体、磁気ビーズ、マイクロ流体チップなどを、ＣＡＭＬの選択又は他の細胞の排除のための抗体でコーティングして使用する。
ＣＡＭＬを収集するために、赤血球溶解を使用することもできる。その結果としての試料量は、複数のガラススライドの上へのプレーティングを必要とする。
白血球消失。
ＦＩＣＯＬＬ。
電気泳動。
誘電泳動。
フローサイトメトリー。
様々な生物学的及び物理的原理を利用して、サイズによって大細胞を選別、選択、群分け、捕獲、濃縮する又は小細胞を排除するマイクロ流体チップ技術も適する。
ＣＡＭＬは血液細胞の大半と比較して大きいので、多くのサイズに基づく方法がＣＡＭＬを捕捉するために適する。７～８ミクロン孔のマイクロフィルターが、ＣＡＭＬ及びＣＴＣの同時捕捉に理想的である。ＣＴＣではなくＣＡＭＬだけが目的であれば、孔径はより大きく、概ね１５～２０ミクロンまでとなってもよい。大きな方の孔径は、フィルター上の大部分のＷＢＣ汚染を排除する。
免疫捕捉は、強磁性流体、磁気ビーズ、マイクロ流体チップなどを、ＣＡＭＬの選択又は他の細胞の排除のための抗体でコーティングして使用する。
ＣＡＭＬを収集するために、赤血球溶解を使用することもできる。その結果としての試料量は、複数のガラススライドの上へのプレーティングを必要とする。
白血球消失。
ＦＩＣＯＬＬ。
電気泳動。
誘電泳動。
フローサイトメトリー。
様々な生物学的及び物理的原理を利用して、サイズによって大細胞を選別、選択、群分け、捕獲、濃縮する又は小細胞を排除するマイクロ流体チップ技術も適する。
【0075】
[00116]濾過は、ＣＴＣに結合したＷＢＣを特定する最良の方法である。ＷＢＣ及びＣＴＣの両方はそれらのマーカーを失い、細胞質を失うので、免疫捕捉及びフローサイトメトリーはそれらを単離するのにより適していない方法である。
【0076】
[00117]本発明の関連する態様及び実施形態では、ＣＴＣ及びＣＴＣに結合したＷＢＣは、単独で、又はＣＡＭＬの検出と併せて検出することができる。そのような検出は同時の又は逐次的な検出であってもよく、同じ又は異なる手段を利用することができる。例えば、両方の細胞型を選択する孔径を有するマイクロフィルターを使用する同時検出を、使用することができる。適するマイクロフィルターは、様々な孔径及び形状を有することができる。径が約７～８ミクロンの孔を有するマイクロフィルターが許容され、円形、長方形及びレーストラック状の孔形状を含む。ポリマーマイクロフィルターが使用されるとき、径が約７～８ミクロンの円形孔を有するマイクロフィルターが特に最適である。好ましい態様では、マイクロフィルターは精密孔配置及び均一な孔分布を有する。
【0077】
低価格でのＣＡＭＬ単離及び同定
[00118]生体試料からＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを単離し、単離した細胞を、カメラ、例えば携帯電話カメラを使用して数える方法は、本発明の実施形態である。マーカー染色及び可視化を通したＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣの詳細な分析のために必要とされる装置及び試薬が利用できない状況で、カメラ、例えば携帯電話のそれらを利用する方法を使用することができる。比色染色に基づいてＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを数える能力は、一部の適用に十分であり得る。コミュニティの資源が欠乏している場合、癌は後期のステージで診断される傾向があり、それは、限られた治療オプション及び鈍い成果を意味する。試料中のＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣの数に基づいて低費用の診断を提供する方法は、以下の概念のうちの１つ又は複数を採択することができる。
（ｉ）孔径約１５～２０ミクロンの低費用フィルターを利用する。
（ｉｉ）手動引き抜き又は低費用ポンプによって血液試料を濾過する。
（ｉｉｉ）ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを可視化するために、比色染色を使用する。
（ｉｖ）携帯型の小さいレンズがある、又はない携帯電話カメラ又は１０×以下の倍率の様々な白色光顕微鏡を使用して細胞を画像化する。
[00118]生体試料からＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを単離し、単離した細胞を、カメラ、例えば携帯電話カメラを使用して数える方法は、本発明の実施形態である。マーカー染色及び可視化を通したＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣの詳細な分析のために必要とされる装置及び試薬が利用できない状況で、カメラ、例えば携帯電話のそれらを利用する方法を使用することができる。比色染色に基づいてＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを数える能力は、一部の適用に十分であり得る。コミュニティの資源が欠乏している場合、癌は後期のステージで診断される傾向があり、それは、限られた治療オプション及び鈍い成果を意味する。試料中のＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣの数に基づいて低費用の診断を提供する方法は、以下の概念のうちの１つ又は複数を採択することができる。
（ｉ）孔径約１５～２０ミクロンの低費用フィルターを利用する。
（ｉｉ）手動引き抜き又は低費用ポンプによって血液試料を濾過する。
（ｉｉｉ）ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを可視化するために、比色染色を使用する。
（ｉｖ）携帯型の小さいレンズがある、又はない携帯電話カメラ又は１０×以下の倍率の様々な白色光顕微鏡を使用して細胞を画像化する。
【0078】
[00119]フィルターの大きな孔径は、ＷＢＣ汚染を低減する。手動引き抜きは、費用を低減する。比色染色法は、低費用である。細胞の大きなサイズにより、携帯電話カメラはＣＡＭＬを可視化することができる。
［発明の実施形態］
［発明の実施形態］
【0079】
[00120]上で示唆されるように、本明細書に記載されるＣＡＭＬ及びＣＴＣの特異な特性は、癌などの疾患をスクリーニング及び診断する方法、治療をモニタリングする方法、疾患進行及び再発をモニタリングする方法を含む臨床方法で使用するためにそれらを好適にする。
【0080】
[00121]したがって本発明は、第１の実施形態では、対象からの生体試料でＣＡＭＬを検出するステップを含む、癌について対象をスクリーニングする方法に関する。特定の態様では、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出されるときは、対象は、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫又は他の固形腫瘍を潜在的に有すると同定される。他の態様では、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出されるときは、対象は、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫又は他の固形腫瘍を有すると同定される。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、生物学的試料中で循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び腫瘍細胞に結合したＴ細胞を検出するステップも含む。この第１の実施形態の特定の態様では、対象は、癌を有することが疑われる対象である。
【0081】
[00122]ＣＡＭＬ、ＣＴＣ又は腫瘍細胞に結合したＴ細胞が見出された後、染色によって、及び一部の場合には腫瘍タイプと関連したマーカーでこれらの細胞を再染色することによって、腫瘍タイプを同定することができる可能性がある。米国癌研究所腫瘍マーカーＦａｃｔＳｈｅｅｔは、多くの癌マーカーを掲載する（「ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔ／ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ／ｔｕｍｏｒ－ｍａｒｋｅｒｓ」及び「ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ａｂｏｕｔ－ｃａｎｃｅｒ／ｄｉａｇｎｏｓｉｓ－ｓｔａｇｉｎｇ／ｄｉａｇｎｏｓｉｓ／ｔｕｍｏｒ－ｍａｒｋｅｒｓ－ａｃｔ－ｓｈｅｅｔ＃ｑ５」で終わるＵＲＬを有するＮＣＩウェブサイトを参照）。癌マーカーは、このリストに限定されない。癌タイプの最初の指標を提供するためにＣＡＭＬ及びＣＴＣを染色するために、下に掲載したマーカーの少数例を使用することができる：
ＢＲＡＦ突然変異Ｖ６００Ｅ：癌タイプ：皮膚黒色腫及び結腸直腸癌
ＣＡ１５－３／ＣＡ２７．２９：癌タイプ：乳癌
ＣＡ１９－９：癌タイプ：膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌及び胃癌
ＣＡ－１２５：癌タイプ：卵巣癌
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）：癌タイプ：結腸直腸癌及び乳癌
サイトケラチン断片２１－１：肺癌
エストロゲン受容体（ＥＲ）／プロゲステロン受容体（ＰＲ）：癌タイプ：乳癌
ＨＥ４：癌タイプ：卵巣癌
ＨＥＲ２／ｎｅｕ：癌タイプ：乳癌、胃癌及び食道癌
キット：癌タイプ：消化管間質腫瘍及び粘膜黒色腫
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びＰＳＭＡ：癌タイプ：前立腺癌
サイログロブリン：癌タイプ：甲状腺癌
５－タンパク質サイン（Ｏｖａ１）：癌タイプ：卵巣癌
マーカーの選択は、このリストに限定されない。
ＢＲＡＦ突然変異Ｖ６００Ｅ：癌タイプ：皮膚黒色腫及び結腸直腸癌
ＣＡ１５－３／ＣＡ２７．２９：癌タイプ：乳癌
ＣＡ１９－９：癌タイプ：膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌及び胃癌
ＣＡ－１２５：癌タイプ：卵巣癌
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）：癌タイプ：結腸直腸癌及び乳癌
サイトケラチン断片２１－１：肺癌
エストロゲン受容体（ＥＲ）／プロゲステロン受容体（ＰＲ）：癌タイプ：乳癌
ＨＥ４：癌タイプ：卵巣癌
ＨＥＲ２／ｎｅｕ：癌タイプ：乳癌、胃癌及び食道癌
キット：癌タイプ：消化管間質腫瘍及び粘膜黒色腫
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びＰＳＭＡ：癌タイプ：前立腺癌
サイログロブリン：癌タイプ：甲状腺癌
５－タンパク質サイン（Ｏｖａ１）：癌タイプ：卵巣癌
マーカーの選択は、このリストに限定されない。
【0082】
[00123]１つの癌タイプを同定するために、１つのマーカーが一部の癌タイプにとって十分であり得る。男性の場合、前立腺、結腸直腸及び肺癌などの同じ血液試料で１つを超える癌タイプについてスクリーニングするために、目的のＣＡＭＬ及びＣＴＣを同定した後に、それらの癌タイプに特異的な癌マーカーによるＣＡＭＬ及びＣＴＣの再染色が必要とされる。以下は、精密濾過方法を使用した、最大４種類の上皮癌の癌スクリーニングのためのＣＡＭＬ及びＣＴＣの分析の例示である：
血液を収集する。
マイクロフィルターでＣＴＣ及びＣＡＭＬを単離する。
ＤＡＰＩ、ＣＫ８、１８、１９、ＣＤ１４／ＣＤ４５によって細胞を染色し、１つの癌タイプのために１つのマーカーで染色する。
蛍光顕微鏡を使用して細胞を画像化して、ＣＡＭＬ及びＣＴＣを同定する。
ＣＡＭＬ及びＣＴＣの蛍光色素をクエンチングする。
ＤＡＰＩ及び目的の３つの追加のマーカーで細胞を再染色する。
以前に画像化した同じＣＴＣ及びＣＡＭＬで新しいマーカーを再画像化する。
マーカーに基づいて癌タイプを判定する。
血液を収集する。
マイクロフィルターでＣＴＣ及びＣＡＭＬを単離する。
ＤＡＰＩ、ＣＫ８、１８、１９、ＣＤ１４／ＣＤ４５によって細胞を染色し、１つの癌タイプのために１つのマーカーで染色する。
蛍光顕微鏡を使用して細胞を画像化して、ＣＡＭＬ及びＣＴＣを同定する。
ＣＡＭＬ及びＣＴＣの蛍光色素をクエンチングする。
ＤＡＰＩ及び目的の３つの追加のマーカーで細胞を再染色する。
以前に画像化した同じＣＴＣ及びＣＡＭＬで新しいマーカーを再画像化する。
マーカーに基づいて癌タイプを判定する。
【0083】
[00124]肺のためのＣＴスキャンは、サイズが４ｍｍと小さい通常でない所見を示すことができる。それは、今では、肺癌のための推奨されたスクリーニング方法である。最初の所見が肺癌であることを立証するために、組織生検が必要である。肺のための組織生検は非常に難しく、それは望ましくない影響を引き起こす高いリスクと関連する。関連する肺癌マーカー、例えばサイトケラチン断片２１－１及び他のマーカーを有するＣＡＭＬの存在は、肺癌の判定に向けた非侵襲的手段を提供するために使用することができる。
【0084】
[00125]ＢＲＡＣ１及びＢＲＡＣ２突然変異を有する人々については、彼らは、乳房及び／又は卵巣の癌にかかる確率が高い。卵巣癌についてはＣＡ１２５、Ｏｖａ１、並びに乳癌についてはＣＥＡ、ＣＡ１５－３／ＣＡ２７．２９、ＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２のマーカーを含む、ＣＡＭＬのための血液検査を実行することができる。
【0085】
[00126]男性のトップ４の癌タイプについてスクリーニングするために、マーカーの選択の１つの可能なセットは、前立腺癌についてはＰＳＭＡ、結腸直腸癌についてはＣＥＡ、肺癌についてはサイトケラチン断片２１－１及び膵臓癌についてはＰＤＸ－１であってもよい。
【0086】
[00127]手法及びマーカーは、ＣＡＭＬ及びＣＴＣ単離方法、顕微鏡、目的の癌タイプなどによって異なることがある。要約すると、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫及び黒色腫のカテゴリーで１つの特異癌、２、３の癌又は任意の固形腫瘍についてスクリーニングすることが可能である。マーカーは、ここに記載されるものに限定する必要はない。
【0087】
[00128]第２の実施形態では、本発明は、対象における癌を診断するための方法であって、対象からの生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含む方法に関し、ここで、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出されるときは、対象は癌と診断される。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色などの標準方法によって実行することができる。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色によって、及びその後の追加のマーカーについての同じ細胞の再染色によって実行することもできる。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、生物学的試料中でＣＴＣを検出するステップも含み、ここで、ＣＡＭＬ及びＣＴＣが生物学的試料中で検出されるときは、対象は癌と診断される。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、生物学的試料中でＷＢＣに結合したＣＴＣを検出するステップ及び／又はＷＢＣに結合したアポトーシス性ＣＴＣを検出するステップも含み、ここで、ＷＢＣに結合したＣＴＣ及び／又はＷＢＣに結合したアポトーシス性ＣＴＣが生物学的試料中で検出されるときは、対象は癌と診断される。
【0088】
[00129]第３の実施形態では、本発明は、対象における癌の再発を検出するための方法であって、癌について以前に治療した対象からの生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含む方法に関し、ここで、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出されるときは、癌の再発が検出される。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色などの標準方法によって実行することができる。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色によって、及びその後の追加のマーカーについての同じ細胞の再染色によって実行することもできる。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、生物学的試料中でＣＴＣ及び／又はＣＴＣに結合したＷＢＣを検出するステップも含み、ここで、ＣＡＭＬ、ＣＴＣ及びＣＴＣに結合したＷＢＣが生物学的試料中で検出されるときは、癌の再発が検出される。特定の癌の再発を同定するために、染色法は寛解中の癌と関連したマーカーを特に含むべきである。
【0089】
[00130]第４の実施形態では、本発明は、対象で癌の診断を確認するための方法であって、癌と診断された対象からの生物学的試料中でＣＡＭＬを検出するステップを含む方法に関し、ここで、ＣＡＭＬが生物学的試料中で検出されるときは、癌の診断が対象で確認される。ほとんどの患者で、組織生検による侵襲的確認を回避することができる。ＣＡＭＬが存在するときだけ、組織生検が必要だろう。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、生物学的試料中でＣＴＣ及び／又はＣＴＣに結合したＷＢＣを検出するステップも含み、ここで、ＣＡＭＬ、ＣＴＣ及びＣＴＣに結合したＷＢＣのうちの１つ又は複数が生物学的試料中で検出されるときは、癌の診断が対象で確認される。特定の態様では、最初の癌診断は、マンモグラフィー、ＰＳＡ検査、ＣＡ１２５の存在、ＣＴ、ＭＲＩ又はＰＥＴ画像化によるものである。特定の態様では、対象は、癌を有することが疑われる。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色などの標準方法によって実行することができる。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色によって、及びその後の追加のマーカーについての同じ細胞の再染色によって実行することもできる。
【0090】
[00131]第５の実施形態では、本発明は、対象における癌のステージを判定するための方法であって、癌を有する対象からの生物学的試料中のＣＡＭＬを特徴付けるステップを含む方法に関し、ここで、ＣＡＭＬの選択される特性は、対象での癌のステージを示す。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色などの標準方法によって実行することができる。特定のタイプの癌の同定は、癌マーカーの染色によって、及びその後の追加のマーカーについての同じ細胞の再染色によって実行することもできる。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、生物学的試料中のＣＴＣを特徴付けるステップも含み、ここで、ＣＡＭＬ及びＣＴＣの選択される特性は、対象での癌のステージを示す。ある特定の態様では、ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣは、特徴付けの前に生物学的試料から収集される。ステージＩＩＩ及びＩＶの癌でのＣＡＭＬの数は、７．５ｍｌの量の末梢血試料で一般的に５以上である。直径によるサイズが４０ミクロンより大きなＣＡＭＬの百分率は、ステージＩＩＩ患者では約７０％であり、ステージＩＶ患者では約８０％である。
【0091】
[00132]第６の実施形態では、本発明は、癌治療の効力をモニタリングするための方法であって、（ａ）癌治療を受けている対象からの生物学的試料中のＣＡＭＬの１つ又は複数の選択される特性を検査するステップ、及び（ｂ）治療の前、その間又は完了の後の１つ又は複数の時点で、（ａ）で判定される１つ又は複数の選択される特性の検査値を、同じ対象からの類似の生物学的試料で検査される同じ特性の検査値と比較するステップを含む方法に関し、ここで、１つ又は複数の検査値の変化は、対象での癌治療の効力を示す。ある特定の態様では、この実施形態によって包含される方法は、（ａ）生物学的試料中のＣＴＣの１つ又は複数の選択される特性を検査すること、及び（ｂ）治療の前、その間又は完了の後の１つ又は複数の時点で、（ａ）で判定される１つ又は複数の選択される特性の検査値を、同じ対象からの類似の生物学的試料で検査される同じ特性の検査値と比較するステップも含む。ある特定の態様では、ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣは、特徴付けの前に生物学的試料から収集される。
【0092】
[00133]ある特定の態様では、ＣＡＭＬの選択される特性は、以下のうちの１つ又は複数である：（ｉ）治療後の異なる時点での同じ対象からのＣＡＭＬの数の変化；（ｉｉ）異なる時点でのＣＡＭＬの平均サイズの変化；（ｉｉｉ）異なる時点でのＣＡＭＬにおけるマーカーの強度の変化；及び（ｉｖ）ＣＡＭＬにおける核から細胞質又はその逆へのマーカーの位置の変化。
【0093】
[00134]ある特定の態様では、ＣＴＣの選択される特性は、以下のうちの１つ又は複数である：（ｉ）治療後の異なる時点での生物学的試料中のＣＴＣの数の変化；（ｉｉ）異なる時点でのＣＴＣにおけるマーカーの強度の変化；（ｉｉｉ）核から細胞質又はその逆へのマーカーの位置の変化；（ｉｖ）生物学的試料中のＣＴＣに結合したＷＢＣの数の変化；及び（ｖ）治療後の異なる時点での生物学的試料中のＣＴＣに結合したＷＢＣの数の変化。
【0094】
[00135]ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣ及び／又はＣＴＣに結合したＷＢＣの数の変化が治療的効力の指標となり、その場合、変化は、ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣ及び／又はＣＴＣに結合したＷＢＣの数の増加又は減少であってもよいことを、当業者は理解する。ＣＡＭＬ、ＣＴＣ及びＷＢＣに結合したＣＴＣに関して集められる情報は、互いとは無関係に使用されてもよい。ＣＡＭＬ、ＣＴＣ及びＷＢＣに結合したＣＴＣに関して集められる情報は、一緒に使用することもできる。
【0095】
[00136]ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣのサイズの変化が治療的効力の指標となることができ、その場合、サイズの変化は、ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣ及び／又はＣＴＣに結合したＷＢＣのサイズの増加又は減少であってもよいことを、当業者は理解する。ＣＡＭＬ及びＣＴＣに関して集められる情報は、独立して、又は一緒に使用することができる。
【0096】
[00137]ＣＡＭＬを追跡する能力は、壊死及び化学療法又は放射線療法への応答を日常的にモニタリングする新規機会を提供する。化学療法が効いていない場合は、ＣＡＭＬ数は増加しない。これは、ＣＴＣ検出と並行して使用することができる。治療が効いている場合は、病理学的に定義可能なＣＴＣの数は減少し、アポトーシス性ＣＴＣの数は増加する。しかし、ＣＴＣは必ずしも検出されるとは限らない。ＣＴＣがＣＡＭＬと同時に検出される場合は、感度及び特異性が改善されることがある。多くの癌について、多数の化学療法剤がある。患者が１つのタイプの化学療法に応答していない場合は、患者は別のものに速やかに変えることができる。
【0097】
[00138]本発明は、生物学的試料からＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを単離し、単離した細胞を、カメラ、例えば携帯電話カメラ又は白色光顕微鏡又は白色光顕微鏡に取り付けたカメラを使用して数える方法にも関する。したがって、第７の実施形態では、本発明は、生物学的試料におけるＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを検出するための方法であって、対象から生物学的試料を得るステップ、及び試料でＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを検出するステップを含む方法に関し、検出は、カメラ、白色光顕微鏡又は白色光顕微鏡に取り付けたカメラによるものである。ある特定の態様では、カメラは携帯電話カメラである。ある特定の態様では、白色光顕微鏡は、１０×以下の倍率を有する。他の態様では、細胞は低費用のフィルターによって生物学的試料から収集され、及び／又は生物学的試料は対象からの手動引き抜きによって、若しくは低費用のポンプによって得られる。さらなる態様では、ＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを可視化するために、比色染色が使用される。
【0098】
[00139]第８の実施形態では、本発明は、選択される薬物標的マーカーをＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣにおいてスクリーニングするためのコンパニオン診断方法であって、対象からの生物学的試料からＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣを収集するステップ、及びＣＡＭＬ及び／又はＣＴＣが選択される薬物標的マーカーを発現又は保有するかどうか判定するステップを含む方法に関する。ある特定の態様では、薬物標的マーカーは細胞表面マーカーであり、判定は、例えば、マーカーの染色によるものであり得る。一例として、免疫療法のための細胞表面マーカーとして、ＰＤ－Ｌ１が使用されてもよい。他の態様では、薬物標的マーカーは、ポリヌクレオチドである。さらなる態様では、薬物標的マーカーは遺伝子の突然変異、増幅又は転座であり、判定は、例えば、ＦＩＳＨによるものであり得る。
【0099】
[00140]第９の実施形態では、本発明は、対象におけるウイルス感染を診断するための方法であって、対象から得た生物学的試料からＣＡＭＬを収集するステップ、及び収集したＣＡＭＬをウイルスについてスクリーニングするステップを含む方法に関する。ある特定の態様では、スクリーニングは、ウイルスマーカーについてＣＡＭＬを染色することによるものである。さらなる態様では、スクリーニングは、ＣＡＭＬからのＤＮＡ又はＲＮＡの分子分析によるものである。
【0100】
[00141]ウイルスの検出の伝統的方法は、血液中の抗体又はウイルス粒子の存在に基づく。ＣＡＭＬはウイルスのデブリ、ウイルス感染細胞、及びウイルスを含有する細胞片を呑食するので、この方法でのＣＡＭＬの使用は、ウイルス感染を検出し、診断する際の有益なツールを提供することができる。これらの方法を用いて診断することができるウイルス感染の供与源は、これらに限定されないが、例えば、中でも、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）が含まれる。
【0101】
[00142]ＨＩＶ及びＨＢＶなどの一部のウイルス感染症は、癌につながることがある。そのような感染症を有する対象の血液で見出されるＣＡＭＬは、ウイルス感染又は癌自体によって引き起こされることがある。癌マーカー又はウイルスマーカーの染色は、診断情報を提供するために使用されてもよい。これは、ウイルス起因の癌の早期検出のための有益な方法であり得る。
【0102】
[00143]本発明の関連する態様及び実施形態では、療法は、ワクチン接種、化学療法、放射線療法、免疫療法、標的化療法及びこれらの組合せを含む。
【0103】
[00144]本発明の関連する態様及び実施形態では、生物学的試料は、ＣＴＣ、ＣＴＣに結合したＷＢＣ及び／又はＣＡＭＬを含有することが疑われるいかなるものであってもよい。ある特定の態様では、生物学的試料は、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織及び尿からなる群から選択される１つ又は複数である。試料は、新鮮な試料又は解凍される低温保存試料であってもよい。好ましい態様では、生物学的試料は、末梢血である。他の態様では、血液は、前肘静脈血、下大静脈血又は頸静脈血である。
【0104】
[00145]循環単球は、リンパ節、骨髄、ほとんどの器官を含む体の任意の組織コンパートメントに入る能力を有し、脳血液関門さえ通過する。したがって、ＣＡＭＬの検出は血液に限定されず、細胞は、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、ほとんどの器官及び尿で見出すこともできる。
【0105】
[00146]本発明の関連する態様及び実施形態では、癌は、固形腫瘍、ステージＩ癌、ステージＩＩ癌、ステージＩＩＩ癌、ステージＩＶ癌、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、結腸直腸癌及び他の固形腫瘍癌のうちの１つ又は複数である。本発明の方法が癌の特定の型にもタイプにも限定されず、様々な癌に関連してそれらを実施することができることを、当業者は理解する。
【0106】
[00147]ＣＡＭＬは癌のステージＩ及びＩＩで見出すことができるので、ＣＡＭＬは、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫及び黒色腫の早期検出のためのスクリーニングとして使用することができる。癌腫は、特に乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌及び他の癌のリスクが高い患者にとっての、上皮起源の癌である。癌のタイプの特異性は、マイクロフィルターの上で捕捉される同じ細胞での、様々な癌部位特異的マーカーの再染色によって判定することができる。一部の例は、（ｉ）前立腺癌を特異的に同定するためのＰＳＭＡに対する抗体の使用、（ｉｉ）肺癌を特異的に同定するためのＰＤＸ－１に対する抗体の使用、（ｉｉｉ）卵巣癌のためのＣＡ１２５に対する抗体、及び（ｉｖ）神経膠腫を同定するためのクロロトキシンである。
【0107】
[00148]同様に、癌が寛解中のときに癌の早期再発を判定するために、ＣＡＭＬを使用することができる。現在、ＣＴ、ＭＲＩ及びＰＥＴ画像化が患者の腫瘍をモニタリングするために使用されているが、差に注目するために腫瘍のサイズがかなり変化することを必要とする。したがって、かすかなサイズの変化だけが起こるときには、患者は治療を開始するにあたって貴重な時間を浪費する可能性がある。ＣＡＭＬは、単独で又はＣＴＣと組み合わせて、癌の再発の早期検出を提供することができる。ＣＡＭＬ及びＣＴＣの非侵襲的血液検査は、ＣＴ、ＭＲＩ及びＰＥＴ画像化より費用面でかなり低い。
【0108】
[00149]癌細分類又は遺伝子の突然変異、転座若しくは増幅を判定するために、ＣＡＭＬを潜在的に使用することもできる。各ＣＡＭＬに、いくつかの癌性の核がある。したがって、遺伝子突然変異、遺伝子欠損及び遺伝子転座のための核の分子分析は、治療を判定するための情報を提供することができる。ある特定の遺伝子突然変異、転座又は増幅を特異的に標的にする薬物がある。ＣＡＭＬは、分子分析のために、ＣＴＣと一緒に、又はそれと並行して使用することができる。
【0109】
[00150]本発明の関連する態様及び実施形態では、生物学的試料の量は、試料の供与源及び／又はアイデンティティに基づいて異なる。しかし、末梢血の場合、血液の量は、約０．５ｍｌ～約５０ｍｌ、約１ｍｌ～約４０ｍｌ、約２ｍｌ～約３０ｍｌ、約３ｍｌ～約２５ｍｌ、約４ｍｌ～約２０ｍｌ、約５ｍｌ～約１５ｍｌ、約６ｍｌ～約１０ｍｌ又は約７ｍｌ～約８ｍｌの範囲内であってもよい。適する量は、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０ｍｌも含む。ＣＴＣの検出のために一般的に使用される血液量は、７．５ｍＬである。より大きな血液量はより多くの感度及び一貫性を提供するが、３．５ｍＬなどのより小さい量で十分であり得る。多くのＣＴＣ検出方法のためには、様々な理由のために、より大きな血液量は実際的でない。しかし、ＣＴＣ及び／又はＣＡＭＬを捕捉するための血液の精密濾過は、試料サイズを増加させるためにより多くの柔軟性を可能にする。１６０，０００個の孔を有するセルシーブ（商標）マイクロフィルターを使用して、５０ｍＬの血液量のスクリーニングに成功を収めたことが示されている。ＣＡＭＬを捕捉するのに適する血液量は、７．５ｍｌであろう。
【0110】
[00151]本発明の関連する態様及び実施形態では、抗癌治療薬は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ワクチン療法、標的療法及び／又は療法の組合せのうちの１つ又は複数であってもよい。
【0111】
[00152]本発明の関連する態様及び実施形態では、ＣＡＭＬは、サイズ排除方法、免疫捕捉、赤血球溶解、白血球消失、ＦＩＣＯＬＬ、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー及びマイクロ流体チップ、又はこれらの組合せからなる群から選択される１つ又は複数の手段を使用して検出及び／又は収集される。特定の態様では、サイズ排除方法は、マイクロフィルターの使用を含む。適するマイクロフィルターは、様々な孔径及び形状を有することができる。ＣＡＭＬだけが検出及び／又は収集されるときは、孔径は約１５ミクロン～約２０ミクロンの範囲内であってもよい。ＣＡＭＬとＣＴＣの両方が検出及び／又は収集されるときは、孔径は、約５ミクロン～約１０ミクロン、好ましくは７～８ミクロンの範囲内であってもよい。大きな方の孔径は、フィルター上の大部分のＷＢＣ汚染を排除する。孔は、円形、レーストラック形、卵形、四角及び長方形の孔形状を有することができる。好ましい態様では、マイクロフィルターは精密孔配置及び均一な孔分布を有する。特定の態様では、ＣＡＭＬは、物理的サイズに基づく選別、流体力学的サイズに基づく選別、グループ分け、トラッピング、免疫捕捉、大細胞の濃縮、又はサイズに基づく小細胞の排除に基づくマイクロ流体チップを使用して、検出及び／又は収集される。特定の態様では、ＣＡＭＬは、セルシーブ（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して検出及び／又は収集される。
【0112】
[00153]本明細書に報告される結果は、ＣＡＭＬが癌存在の確固とした指標を提供するという考えを裏付ける。ＣＡＭＬの有用性の感度及び特異性は、ＣＴＣ及びＷＢＣに結合したＣＴＣの同時検出と組み合わせてさらに改善することができる。癌スクリーニングは、徴候も症状もないが、前症候的又は無認識症候的疾患を有する個体で、無認識疾患を同定するために集団で使用される戦略である。このように、スクリーニング検査はそれらが見かけ上健康な者で実行されるという点で、若干特異である。スクリーニング検査は、診断検査でない。診断検査は、その疾患を有することが疑われる個体で疾患の存在を確認又は判定するために実行される手法である。ＣＡＭＬは、他のスクリーニング技術、例えばマンモグラフィー、ＰＳＡ検査、ＣＡ１２５の存在、ＣＴ、ＭＲＩ又はＰＥＴ画像化を確認するために、追加の非侵襲的診断を提供する癌診断として使用することができる。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33A】
【図33B】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39-1】
【図39-2】
【図40-1】
【図40-2】
【図41-1】
【図41-2】
【図42】
【外国語明細書】