特開 2023-40912 細胞回収方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023040912

(43)【公開日】2023-03-23

(54)【発明の名称】細胞回収方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/02 20060101AFI20230315BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20230315BHJP

   C12M 3/00 20060101ALN20230315BHJP

【ＦＩ】

C12N1/02

C12M1/00 C

C12M3/00 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021148107

(22)【出願日】2021-09-10

(71)【出願人】

【識別番号】000002059

【氏名又は名称】シンフォニアテクノロジー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001841

【氏名又は名称】弁理士法人ＡＴＥＮ

(72)【発明者】

【氏名】堀井 大地

(72)【発明者】

【氏名】竹内 晴紀

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA01

4B029AA27

4B029BB11

4B029CC02

4B029DF01

4B029DG08

4B065AA90X

4B065BD14

(57)【要約】

【課題】培養された細胞を剥離液によって培養容器から剥離させて回収する際、細胞の損傷を抑制しつつ、コストの増大を抑える。
【解決手段】細胞１３を回収する細胞回収方法は、培地移動工程と、剥離液供給工程と、混合工程とを備える。細胞１３が培養された後、培地移動工程においては、培養容器６内の使用済み培地１１が回収容器５に移動させられる。培地移動工程の後、剥離液供給工程においては、細胞１３を培養容器６の内面９から剥離させるための剥離液１２Ａが培養容器に供給される。剥離液供給工程の後、混合工程においては、剥離液１２Ａと使用済み培地１１とが混合させられる。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

液状の培地が入れられた培養容器の中で培養され、前記培養容器の内面に付着した細胞を回収する細胞回収方法であって、
前記細胞を培養した後、前記培養容器内の使用済み培地を所定の貯留部に移動させる培地移動工程と、
前記培地移動工程の後に、前記細胞を前記培養容器の前記内面から剥離させるための剥離液を前記培養容器に供給する剥離液供給工程と、
前記剥離液供給工程の後に、前記剥離液の少なくとも一部と前記使用済み培地とを混合させる混合工程と、を備えることを特徴とする細胞回収方法。

【請求項2】

前記貯留部は、前記細胞を回収するための回収容器を有するものであり、
前記混合工程において、前記剥離液と前記細胞とが混じった懸濁液を前記培養容器から前記回収容器に移動させることを特徴とする請求項１に記載の細胞回収方法。

【請求項3】

前記貯留部は、所定の第１貯留部と、前記第１貯留部とは別の第２貯留部と、を有するものであり、
前記培地移動工程は、
前記使用済み培地の一部である第１使用済み培地を前記培養容器から前記第１貯留部に移動させる第１培地移動工程と、
前記使用済み培地のうち、前記第１使用済み培地とは別の一部である第２使用済み培地を前記培養容器から前記第２貯留部に移動させる第２培地移動工程と、を有し、
前記混合工程において、前記剥離液と前記細胞とが混じった懸濁液を前記培養容器から前記第１貯留部に移動させ、
前記混合工程の後に、前記第２使用済み培地を前記第２貯留部から前記培養容器に移動させる戻し工程、を備えることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞回収方法。

【請求項4】

前記剥離液供給工程と前記混合工程との間に、
前記細胞が前記培養容器の前記内面から完全に剥離する前に、前記剥離液を前記培養容器から排出する剥離液排出工程と、
前記剥離液排出工程の後に、前記培養容器に前記剥離液の一部が残った状態で所定時間待機する待機工程と、を備え、
前記混合工程において、前記使用済み培地を前記貯留部から前記培養容器に移動させることを特徴とする請求項１に記載の細胞回収方法。

【請求項5】

前記貯留部は、前記細胞を回収するための回収容器を有するものであり、
前記回収容器が配置されている空間の温度を、前記培養容器が配置されている空間の温度よりも低く維持することを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の細胞回収方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液状の培地が入れられた容器内で培養され、当該容器の内面に付着している細胞を回収する細胞回収方法に関する。

【背景技術】

【0002】

液状の培地が入れられた培養容器内で細胞を培養すると、一般的に、細胞は培養容器の内面に付着した状態で増殖する。このため、培養された細胞を回収する際には、細胞を培養容器の内面から剥離させる必要がある。そのために、まず、一般的に、使用済みの培地が培養容器から排出される。その後、例えば非特許文献１に記載されているように、剥離液を培養容器に供給することにより、細胞を培養容器の内面から剥離させることができる。なお、細胞は、剥離液に長時間浸漬されると、剥離液によって損傷させられるおそれがある。そこで、剥離液と細胞とが混じった懸濁液を新鮮な培地と混合させることにより、剥離液による反応が停止させられる（つまり、剥離液が不活性化される）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Corning Incorporated，“Corning HYPERStack Cell Culture Vessel Closed System“，［online］，２０１６年（平成２８年），Corning Incorporated，［令和３年７月２７日検索］，インターネット＜URL：https://www.corning.com/catalog/cls/documents/selection-guides/CLS-AN-364%20DL%20HYPERStack%20User%20Guide.pdf＞

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

近年、大規模な設備によって大量の細胞を培養することが検討されている。大量の細胞を回収する必要が生じた場合、上述したように新鮮な培地を用いて剥離液を不活性化させる方法では、新鮮な培地を大量に消費することとなる。このため、コストが非常に大きくなるおそれがある。

【0005】

本発明の目的は、培養された細胞を剥離液によって培養容器から剥離させて回収する際、細胞の損傷を抑制しつつ、コストの増大を抑えることである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

第１の発明の細胞回収方法は、液状の培地が入れられた培養容器の中で培養され、前記培養容器の内面に付着した細胞を回収する細胞回収方法であって、前記細胞を培養した後、前記培養容器内の使用済み培地を所定の貯留部に移動させる培地移動工程と、前記培地移動工程の後に、前記細胞を前記培養容器の前記内面から剥離させるための剥離液を前記培養容器に供給する剥離液供給工程と、前記剥離液供給工程の後に、前記剥離液の少なくとも一部と前記使用済み培地とを混合させる混合工程と、を備えることを特徴とする。

【0007】

細胞が剥離液に長時間浸漬されると、細胞が損傷するおそれがある。本発明では、細胞を培養するために使用された使用済み培地によって、剥離液を少なくとも希釈できる。また、使用済み培地に剥離液を不活性化させる成分が含まれていれば、剥離液を不活性化させることもできる。このように、新鮮な培地を用いなくても、剥離液による細胞の損傷を抑制できる。したがって、培養された細胞を剥離液によって培養容器から剥離させて回収する際、細胞の損傷を抑制しつつ、コストの増大を抑えることができる。

【0008】

第２の発明の細胞回収方法は、前記第１の発明において、前記貯留部は、前記細胞を回収するための回収容器を有するものであり、前記混合工程において、前記剥離液と前記細胞とが混じった懸濁液を前記培養容器から前記回収容器に移動させることを特徴とする。

【0009】

混合工程において、貯留部から培養容器に使用済み培地を移動させても良いが、この場合、使用済み培地と細胞との懸濁液を回収するために、培養容器から回収容器に当該懸濁液を移動させる工程がさらに必要となる。本発明では、混合工程が、細胞を回収容器に移動させる工程（すなわち、回収工程）を兼ねている。したがって、工程数の増加を抑制できる。

【0010】

第３の発明の細胞回収方法は、前記第１又は第２の発明において、前記貯留部は、所定の第１貯留部と、前記第１貯留部とは別の第２貯留部と、を有するものであり、前記培地移動工程は、前記使用済み培地の一部である第１使用済み培地を前記培養容器から前記第１貯留部に移動させる第１培地移動工程と、前記使用済み培地のうち、前記第１使用済み培地とは別の一部である第２使用済み培地を前記培養容器から前記第２貯留部に移動させる第２培地移動工程と、を有し、前記混合工程において、前記剥離液と前記細胞とが混じった懸濁液を前記培養容器から前記第１貯留部に移動させ、前記混合工程の後に、前記第２使用済み培地を前記第２貯留部から前記培養容器に移動させる戻し工程、を備えることを特徴とする。

【0011】

混合工程において懸濁液を第１貯留部に移動させるとき、培養された細胞の一部が培養容器に残留する可能性がある。本発明では、培養容器に残留した一部の細胞を、戻し工程において培養容器に戻された第２使用済み培地と混合させることができる。これにより、当該一部の細胞を第２使用済み培地とともに回収できる。したがって、コストの増大を抑えつつ、細胞の回収率を向上させることができる。

【0012】

第４の発明の細胞回収方法は、前記第１の発明において、前記剥離液供給工程と前記混合工程との間に、前記細胞が前記培養容器の前記内面から完全に剥離する前に、前記剥離液を前記培養容器から排出する剥離液排出工程と、前記剥離液排出工程の後に、前記培養容器に前記剥離液の一部が残った状態で所定時間待機する待機工程と、を備え、前記混合工程において、前記使用済み培地を前記貯留部から前記培養容器に移動させることを特徴とする。

【0013】

細胞が培養容器の内面から完全に剥離するよりも前に剥離液を培養容器から排出したとき、一般的に、細胞及びわずかな剥離液が培養容器に残留する。このような状態で所定時間待機することによって、剥離液による細胞の損傷を極力抑制しつつ、細胞を培養容器の内面から完全に剥離させることができる。さらに、混合工程において使用済み培地を培養容器に移動させることにより、細胞を培養容器内の使用済み培地内に浮遊させることができる。したがって、例えば細胞が剥離液によって損傷されやすいものであっても、細胞の損傷を極力抑制しつつ細胞を回収できる。

【0014】

第５の発明の細胞回収方法は、前記第１～第４のいずれかの発明において、前記貯留部は、前記細胞を回収するための回収容器を有するものであり、前記回収容器が配置されている空間の温度を、前記培養容器が配置されている空間の温度よりも低く維持することを特徴とする。

【0015】

一般的に、細胞は、温かい場所では活性化して変質してしまうおそれがある。この点、本発明では、回収容器の内部の温度を培養容器の内部の温度よりも低く維持することができる。したがって、回収容器の内部の温度が高い場合と比べて、回収容器内に回収された細胞の変質を抑制し、細胞を長時間保存できる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】第１実施形態に係る細胞回収方法を実施するための細胞培養システムを示す模式図である。

【図2】細胞回収方法の手順を示すフローチャートである。

【図3】（ａ）、（ｂ）は、細胞回収方法の手順の一部を示す説明図である。

【図4】（ａ）、（ｂ）は、細胞回収方法の手順の一部を示す説明図である。

【図5】第１実施形態の変形例に係る細胞培養システムを示す模式図である。

【図6】細胞回収方法の手順を示すフローチャートである。

【図7】（ａ）、（ｂ）は、細胞回収方法の手順の一部を示す説明図である。

【図8】（ａ）、（ｂ）は、細胞回収方法の手順の一部を示す説明図である。

【図9】（ａ）、（ｂ）は、細胞回収方法の手順の一部を示す説明図である。

【図10】別の変形例に係る細胞回収方法の手順を示すフローチャートである。

【図11】第２実施形態に係る細胞培養システムを示す模式図である。

【図12】細胞回収方法の手順を示すフローチャートである。

【図13】（ａ）、（ｂ）は、細胞回収方法の手順の一部を示す説明図である。

【図14】（ａ）、（ｂ）は、細胞回収方法の手順の一部を示す説明図である。

【図15】（ａ）、（ｂ）は、細胞回収方法の手順の一部を示す説明図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

＜第１実施形態＞
次に、本発明の第１実施形態について説明する。なお、単に説明の便宜上、図１の紙面上下方向を上下方向（重力の作用する鉛直方向）とする。

【0018】

（細胞培養システムの概略）
第１実施形態に係る細胞回収方法を実施するための細胞培養システム１の概略について、図１を参照しつつ説明する。図１は、細胞培養システム１を示す模式的な正面図である。なお、図１には、後述する細胞１３の培養が完了し、当該細胞１３が収穫される（回収される）直前の状態の細胞培養システム１が示されている。

【0019】

図１に示すように、細胞培養システム１は、低温エリアを構成する冷蔵庫２と、培養エリアを構成するインキュベータ３とを備える。冷蔵庫２は、各種試薬の成分の変化を抑制しつつ当該試薬を貯蔵するための装置である。インキュベータ３は、後述する細胞１３を培養するための装置である。培養される細胞１３の種類として、例えば間葉系幹細胞（ＭＳＣ）或いは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等を挙げることができるが、これには限られない。

【0020】

冷蔵庫２は、低温エリアの温度を約４℃に維持可能に構成されている。これにより、冷蔵庫２内で、各種試薬の成分の変化を抑制しつつ当該試薬を貯蔵することができる。冷蔵庫２は、低温エリアの温度を約４℃以外の温度に調節可能に構成されていても良い。冷蔵庫２は、開閉可能な不図示のドアを有する。冷蔵庫２内には、少なくとも、剥離液貯蔵容器４と回収容器５（本発明の貯留部）とが収容されている。剥離液貯蔵容器４は、後述する剥離液１２を貯蔵するための容器である。回収容器５は、培養された細胞１３を回収するための容器である。その他にも、冷蔵庫２内には、例えば、細胞１３の培養に用いられる液状の培地（不図示）を貯蔵する容器（不図示）等が収容されていても良い。

【0021】

インキュベータ３は、例えば、培養エリアの温度を約３７℃に維持可能に構成されている。これにより、インキュベータ３内で細胞１３を培養することができる。インキュベータ３は、培養エリアの温度を約３７℃以外の温度に調節可能に構成されていても良い。インキュベータ３は、開閉可能な不図示のドアを有する。インキュベータ３内には、少なくとも、培養容器６と剥離液バッファ容器７とが収容されている。培養容器６は、細胞１３を培養するための容器である。細胞１３が培養され終わったとき、培養容器６内には液状の使用済み培地１１が収容されており、使用済み培地１１内で細胞１３が十分に増殖している。細胞１３は、一般的に、培養容器６の内面９（より具体的には、底面）に付着した状態で増殖する。剥離液バッファ容器７は、培養された細胞１３を培養容器６の内面９から剥離させるための剥離液１２を温めるための容器である。その他にも、インキュベータ３内には、例えば、培地（不図示）を温めるための容器（不図示）等が収容されていても良い。つまり、例えば、インキュベータ３内には、後述の変形例において使用される培地バッファ容器２１（図７参照）が収容されていても良い。但し、ここでは詳細な説明を省略する。

【0022】

少なくとも、剥離液貯蔵容器４、回収容器５、培養容器６及び剥離液バッファ容器７は、例えば複数のチューブを有する配管８によって互いに接続されている。細胞培養システム１において使用される液体又は懸濁液（液体と固体との混合物）は、配管８を経由して、上述した複数の容器のうちある任意の容器から別の任意の容器へ送られる（移動させられる）ことが可能となっている。配管８の途中部には、例えば、不図示の複数のバルブ及び１以上のポンプが設けられている。また、例えば、剥離液バッファ容器７には、不図示の加圧装置が接続されている。複数のバルブを適切に開閉した状態でポンプ又は加圧装置を作動させることにより、所定の液体又は懸濁液が所定の容器へ送られる。バルブ、ポンプ及び加圧装置は、オペレータによって操作されても良い。或いは、バルブ、ポンプ及び加圧装置を制御する不図示の制御装置が設けられていても良い。制御装置が、オペレータの代わりにバルブ、ポンプ及び加圧装置を制御して、液体又は懸濁液を移動させても良い。

【0023】

次に、培地について説明する。本実施形態では、細胞１３を培養するために液状の培地（培養液）が用いられる。培地は、細胞１３が増殖するための栄養素を有する。栄養素には、例えば、無機塩と、糖類と、アミノ酸と、ビタミン等が含まれる。培地の種類として、例えば、動物由来の血清（例えば、ウシ由来血清）を含む血清培地を採用することができるが、これには限られない。培地として、例えば、ヒト由来成分が含まれ且つヒト以外の動物由来成分が含まれないゼノフリー培地が用いられても良い。或いは、培地として、例えば、動物由来成分が含まれないアニマルフリー培地が用いられても良い。細胞１３の培養が完了した後の培地は、使用済み培地１１となる。

【0024】

次に、剥離液１２について説明する。剥離液１２は、培養容器６の内面９に付着した細胞１３を内面９から剥離させるための細胞剥離酵素を含む液体である。細胞剥離酵素の種類として、例えば公知のトリプシンを採用することができるが、これには限られない。剥離液１２は、トリプシン以外の細胞剥離酵素を含んでいても良い。或いは、剥離液１２は、必ずしも細胞剥離酵素を含んでいなくても良く、細胞１３を培養容器６の内面９から剥離させる機能を有していれば良い。例えば、剥離液１２は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含んでいても良い。

【0025】

ここで、培養された細胞１３を収穫する（回収する）ための従来の手順として、例えば以下のような手順が考えられる。すなわち、培養容器６から使用済み培地１１が排出されると、細胞１３が培養容器６の内面９に付着した状態で残る。その後、剥離液１２が培養容器６に供給される。なお、細胞１３は、剥離液１２に長時間浸漬されていると、剥離液１２によって損傷させられるおそれがある。そこで、例えば、回収容器５に新鮮な培地（不図示）が予め入れられている。適切なタイミングで、剥離液１２と細胞１３とが混じった懸濁液が回収容器５へ送られる。これにより、懸濁液と新鮮な培地とが混合される。一般的に、新鮮な培地には細胞剥離酵素を不活性化させる物質が含まれている。例えば、血清培地には無機塩（カルシウム及びマグネシウム等）が含まれている。また、例えば、細胞剥離酵素であるトリプシンは、カルシウム及びマグネシウムによって不活性化される。このように、培地によって剥離液１２が不活性化される。したがって、剥離液１２による細胞１３の損傷を抑制しつつ、細胞１３が回収される。

【0026】

ここで、近年、大規模な設備によって大量の細胞１３を培養することが検討されている。大量の細胞１３を回収する必要が生じた場合、上述したように新鮮な培地を用いて剥離液１２を不活性化させる方法では、新鮮な培地を大量に消費することとなる。このため、コストが非常に大きくなるおそれがある。そこで、細胞１３の損傷を抑制しつつ、コストの増大を抑えるために、第１実施形態では以下の手順で細胞１３が回収される。

【0027】

細胞培養システム１において細胞１３を回収する細胞回収方法の手順について、図２のフローチャート及び図３（ａ）～図４（ｂ）の模式図を参照しつつ説明する。以下では、説明の便宜上、オペレータが作業を行うものとする。オペレータは、上述したバルブ、ポンプ及び加圧装置（不図示）を操作して、各種液体或いは懸濁液をある容器から別の容器へ送る（移動させる）。オペレータの代わりに、不図示の制御装置がバルブ、ポンプ及び加圧装置を制御しても良い。

【0028】

まず、細胞１３の培養が完了した後（培養容器６内の細胞１３が十分に増殖した後）、オペレータは、剥離液１２を剥離液貯蔵容器４から剥離液バッファ容器７へ送る（Ｓ１０１）。例えば図３（ａ）に示すように、剥離液貯蔵容器４内の剥離液１２の一部（剥離液１２Ａ）が剥離液バッファ容器７へ送られても良い。剥離液１２Ａは、インキュベータ３内で温められる。剥離液１２の別の一部（剥離液１２Ｂ）は、剥離液貯蔵容器４に残る。

【0029】

次に、オペレータは、使用済み培地１１を培養容器６から回収容器５へ送る（Ｓ１０２。培地移動工程。図３（ｂ）参照）。回収容器５が配置された空間（低温エリア）の温度は、培養容器６が配置された空間（培養エリア）の温度よりも低く維持されている。したがって、使用済み培地１１は、冷蔵庫２内で冷やされる。細胞１３は、内面９に付着した状態で培養容器６内に残る。

【0030】

次に、オペレータは、温まった剥離液１２Ａを剥離液バッファ容器７から培養容器６へ送る（Ｓ１０３。剥離液供給工程）。その後、所定時間待つことにより、剥離液１２Ａによって、細胞１３が培養容器６の内面９から剥離させられる。これにより、剥離液１２Ａと細胞１３とが混じって懸濁液１４（図４（ａ）参照）となる。

【0031】

最後に、オペレータは、懸濁液１４を培養容器６から回収容器５へ送る（Ｓ１０４。混合工程）。これにより、懸濁液１４（剥離液１２Ａ及び細胞１３）と使用済み培地１１とが混合され、懸濁液１５（図４（ｂ）参照）となる。したがって、使用済み培地１１によって剥離液１２Ａが希釈される。さらに、本願発明者は以下の事実を見出した。すなわち、使用済み培地１１において、無機塩以外の栄養素の大部分は細胞１３に吸収されてほとんど残っていないが、無機塩は使用済み培地１１内にある程度残る。このため、当該無機塩によって剥離液１２Ａを不活性化することができる。これにより、使用済み培地１１によって、細胞１３が剥離液１２Ａによって損傷することを効果的に抑制できる。

【0032】

さらにその後、懸濁液１５を例えば不図示の遠心分離機によって細胞１３とその他の物質とに分離することにより（濃縮工程）、細胞１３を収穫することができる。

【0033】

以上のように、細胞１３を培養するために使用された使用済み培地１１によって、剥離液１２Ａを少なくとも希釈できる。また、使用済み培地１１に剥離液１２Ａを不活性化させる成分が含まれていれば、剥離液１２Ａを不活性化させることもできる。このように、新鮮な培地を用いなくても、剥離液１２Ａによる細胞の損傷を抑制できる。したがって、培養された細胞１３を剥離液１２Ａによって培養容器６から剥離させて回収する際、細胞１３の損傷を抑制しつつ、コストの増大を抑えることができる。

【0034】

また、混合工程において、剥離液１２Ａと細胞１３とが混じった懸濁液１４が、培養容器６から回収容器５に移動させられる。つまり、混合工程が、細胞１３を回収容器５に移動させる工程（すなわち、回収工程）を兼ねている。したがって、混合工程において回収容器５から培養容器６に使用済み培地１１を移動させる場合と比べて、工程数の増加を抑制できる。

【0035】

また、冷蔵庫２内に収容された回収容器５の内部の温度を、インキュベータ３内に収容された培養容器６の内部の温度よりも低く維持することができる。したがって、回収容器５の内部の温度が高い場合と比べて、回収容器５内に回収された細胞１３の変質を抑制し、細胞１３を長時間保存できる。

【0036】

次に、上記第１実施形態に変更を加えた変形例について説明する。但し、第１実施形態と同様の構成を有するものについては、同じ符号を付して適宜その説明を省略する。

【0037】

（１）第１実施形態においては、培地移動工程において使用済み培地１１が全て培養容器６から回収容器５へ送られるものとした。しかしながら、これには限られない。以下、具体的に説明する。例えば図５に示すように、細胞培養システム１ａは、上述した剥離液貯蔵容器４、回収容器５（本発明の第１貯留部）、培養容器６及び剥離液バッファ容器７に加え、培地バッファ容器２１（本発明の第２貯留部）を備えていても良い。培地バッファ容器２１は、例えばインキュベータ３内に収容されている。剥離液貯蔵容器４、回収容器５、培養容器６、剥離液バッファ容器７及び培地バッファ容器２１は、配管８ａによって互いに接続されている。

【0038】

細胞培養システム１ａにおける細胞回収方法の手順について、図６のフローチャート及び図７（ａ）～図９（ｂ）の模式図を参照しつつ説明する。まず、細胞１３の培養が完了した後、オペレータは、剥離液１２Ａを剥離液貯蔵容器４から剥離液バッファ容器７へ送る（Ｓ２０１。図７（ａ）参照）。次に、オペレータは、培地移動工程の一部として、使用済み培地１１の一部（使用済み培地１１Ａ。本発明の第１使用済み培地）を培養容器６から回収容器５へ送る（Ｓ２０２。第１培地移動工程。図７（ｂ）参照）。さらに、オペレータは、培地移動工程の一部として、残りの使用済み培地１１Ｂ（本発明の第２使用済み培地）を培養容器６から培地バッファ容器２１へ送る（Ｓ２０３。第２培地移動工程。図７（ｂ）参照）。使用済み培地１１Ｂは、使用済み培地１１のうち、使用済み培地１１Ａとは別の一部である。なお、Ｓ２０２とＳ２０３の順番は入れ替わっても良い。その後、オペレータは、温まった剥離液１２Ａを剥離液バッファ容器７から培養容器６へ送る（Ｓ２０４。剥離液供給工程）。その後、所定時間待つことにより、剥離液１２Ａによって、細胞１３が培養容器６の内面９から剥離させられる。これにより、剥離液１２Ａと細胞１３とが混じって懸濁液２２（図８（ａ）参照）となる。その後、オペレータは、懸濁液２２を培養容器６から回収容器５へ送る（Ｓ２０５。混合工程）。これにより、懸濁液２２（剥離液１２Ａ及び細胞１３）と使用済み培地１１Ａとが混合され、懸濁液２３（図８（ｂ）参照）となる。ここで、Ｓ２０５の工程において懸濁液２２内の全ての細胞１３が培養容器６から流れ出ることが最も好ましいが、実際には、一部の細胞１３が流れ出ずに培養容器６に残ってしまう可能性がある（図８（ａ）、（ｂ）の細胞１３Ａを参照）。そこで、次に、オペレータは、使用済み培地１１Ｂを培地バッファ容器２１から培養容器６へ送る（Ｓ２０６。戻し工程）。これにより、細胞１３Ａと使用済み培地１１Ｂとを混合させて懸濁液２４（図９（ａ）参照）とし、懸濁液２４に含まれる細胞１３Ａを回収することが可能となる。最後に、オペレータは、懸濁液２４を培養容器６から回収容器５へ送る（Ｓ２０７）。これにより、懸濁液２３と懸濁液２４とが混合されて、懸濁液２５（図９（ｂ）参照）となる。以上のようにして、培養容器６に残留した一部の細胞１３Ａを、戻し工程において培養容器６に戻された使用済み培地１１Ｂと混合させることができる。これにより、細胞１３Ａを使用済み培地１１Ｂとともに回収できる。したがって、コストの増大を抑えつつ、細胞１３の回収率を向上させることができる。

【0039】

（２）前記までの実施形態においては、混合工程において、剥離液１２Ａと細胞１３との懸濁液（懸濁液１４又は懸濁液２２）が培養容器６から回収容器５へ送られるものとした。しかしながら、これには限られない。オペレータは、混合工程において、使用済み培地１１を回収容器５から培養容器６へ送っても良い。このような作業によって剥離液１２Ａを希釈及び不活性化できる。なお、この場合、細胞１３を回収するために、細胞１３が含まれた懸濁液（不図示）を最終的に培養容器６から回収容器５へ送る必要があるので、工程数は多くなる。

【0040】

（３）図５に示された構成における別の変形例として、細胞培養システム１ａにおいて、第１実施形態で示した手順（上述したＳ１０１～Ｓ１０４）と類似する以下の手順で細胞回収方法が実施されても良い。以下、図１０のフローチャートを参照しつつ説明する。オペレータは、Ｓ１０１の工程を実行した後、Ｓ１０２（使用済み培地１１を培養容器６から回収容器５へ送る工程）の代わりに、例えば、使用済み培地１１の全てを培養容器６から培地バッファ容器２１へ送る工程（Ｓ１０２Ａ）を実行しても良い。この場合、培地バッファ容器２１が本発明の貯留部に相当する。さらに、オペレータは、Ｓ１０３の工程を実行した後、Ｓ１０４（懸濁液１４を培養容器６から回収容器５へ送る工程）の代わりに、使用済み培地１１を培地バッファ容器２１から培養容器６に戻す工程（Ｓ１０４Ａ。本発明の混合工程に相当）を実行しても良い。その後、オペレータは、培養容器６内の懸濁液（不図示）の全てを回収容器５へ送る工程（Ｓ１０５Ａ）を実行しても良い。

【0041】

或いは、当該変形例において、オペレータは、Ｓ１０４Ａの工程の代わりに、懸濁液１４を培養容器６から培地バッファ容器２１へ送る工程（本発明の混合工程に相当）を実行しても良い。その後、オペレータは、Ｓ１０５Ａの工程の代わりに、培地バッファ容器２１内の懸濁液（不図示）の全てを回収容器５へ送る工程を実行しても良い。

【0042】

＜第２実施形態＞
次に、本発明の第２実施形態について説明する。但し、第１実施形態と同様の構成を有するものについては、同じ符号を付して適宜その説明を省略する。

【0043】

第１実施形態においては、混合工程において、培養容器６へ送られた剥離液１２Ａの全てと、使用済み培地１１とが混合されるものとした。第２実施形態においては、後述する混合工程において、剥離液１２Ａの一部と使用済み培地１１とが混合される。つまり、第１実施形態及び第２実施形態の両方を考慮すると、混合工程において、剥離液１２Ａの少なくとも一部と使用済み培地１１とが混合される。

【0044】

例えば、一般的に、上述したｉＰＳＣは、上述したＭＳＣと比べて剥離液１２によって損傷されやすい。このため、ｉＰＳＣを回収する際には、後述する細胞回収方法が特に有効である。図１１に示すように、細胞培養システム１ｂは、上述した剥離液貯蔵容器４、回収容器５、培養容器６、剥離液バッファ容器７及び培地バッファ容器２１に加え、室温エリア３１に配置された排液容器３２を有する。剥離液貯蔵容器４、回収容器５、培養容器６、剥離液バッファ容器７、培地バッファ容器２１及び排液容器３２は、配管８ｂによって互いに接続されている。

【0045】

細胞培養システム１ｂにおける細胞回収方法の手順について、図１２のフローチャート及び図１３（ａ）～図１５（ｂ）の模式図を参照しつつ説明する。

【0046】

まず、細胞１３の培養が完了した後、オペレータは、剥離液１２Ａを剥離液貯蔵容器４から剥離液バッファ容器７へ送る（Ｓ３０１。図１３（ａ）参照）。次に、オペレータは、使用済み培地１１を培養容器６から培地バッファ容器２１へ送る（Ｓ３０２。培地移動工程。図１３（ｂ）参照）。第２実施形態においては、培地バッファ容器２１が本発明の貯留部に相当する。次に、オペレータは、温まった剥離液１２Ａを剥離液バッファ容器７から培養容器６へ送る（Ｓ３０３。剥離液供給工程。図１４（ａ）参照）。

【0047】

そして、オペレータは、ある程度の時間待機した後、細胞１３が培養容器６の内面９から完全に剥離するよりも前に、剥離液１２Ａを培養容器６から排出して排液容器３２へ送る（Ｓ３０４。剥離液排出工程。図１４（ｂ）参照）。このとき、細胞１３は、培養容器６の内面９に付着しているため、剥離液１２Ａとともに排出されずに培養容器６内に残留する。また、培養容器６内には、剥離液１２Ａの一部が、例えば細胞１３に付着した状態で残留する。その後、オペレータは所定時間待機する（Ｓ３０５。待機工程）。これにより、培養容器６内にわずかに残った一部の剥離液１２Ａによって、細胞１３を培養容器６の内面９から完全に剥離させることができる。このような方法においては、細胞１３が培養容器６の内面９から完全に剥離するまで剥離液１２Ａに浸漬される場合と比べて、剥離液１２Ａによる細胞１３の損傷を極力抑制できる。次に、オペレータは、使用済み培地１１を培地バッファ容器２１から培養容器６へ送る（Ｓ３０６。混合工程）。このように、剥離液供給工程と混合工程との間に、剥離液排出工程と待機工程とが設けられている。

【0048】

混合工程において使用済み培地１１を培養容器６に移動させることにより、細胞１３を培養容器６内の使用済み培地１１内に浮遊させることができる。これにより、使用済み培地１１と細胞１３とが混じって懸濁液３３になる（図１５（ａ）参照）。また、培養容器６内に残留した一部の剥離液１２Ａが使用済み培地１１と混合されるので、使用済み培地１１によって当該一部の剥離液１２Ａを希釈及び不活性化できる。最後に、オペレータは、懸濁液３３を培養容器６から回収容器５へ送る（Ｓ３０７。図１５（ｂ）参照）。以上のようにして、例えば細胞１３が剥離液１２Ａによって損傷されやすいものであっても、細胞１３の損傷を極力抑制しつつ細胞１３を回収できる。

【0049】

次に、上記第２実施形態に変更を加えた変形例について説明する。但し、第２実施形態と同様の構成を有するものについては、同じ符号を付して適宜その説明を省略する。

【0050】

（１）第２実施形態において、混合工程において使用済み培地１１の全てが培地バッファ容器２１から培養容器６へ送られるものとした。しかしながら、これには限られない。例えば、混合工程において培地バッファ容器２１から培養容器６へ使用済み培地１１の一部を送り、その後、当該一部の使用済み培地１１と細胞１３との懸濁液（不図示）を培養容器６から回収容器５へ送っても良い。その後、さらに、残りの使用済み培地１１を培地バッファ容器２１から培養容器６へ送っても良い。その後、当該残りの使用済み培地１１と、培養容器６に残りうる細胞１３の一部との懸濁液（不図示）を培養容器６から回収容器５へ送っても良い。

【0051】

次に、上記第１実施形態及び第２実施形態に共通の変形例について説明する。但し、第１実施形態又は第２実施形態と同様の構成を有するものについては、同じ符号を付して適宜その説明を省略する。

【0052】

（１）第１実施形態及び第２実施形態において、細胞１３の回収時に剥離液１２Ａが剥離液バッファ容器７に送られて温められるものとした。しかしながら、これには限られない。例えば、細胞１３の培養中に（細胞１３の回収が開始されるよりも前のタイミングで）、剥離液１２が予め温められていても良い。

【0053】

（２）第１実施形態及び第２実施形態において、回収容器５が冷蔵庫２内に収容されているものとした。しかしながら、これには限られない。例えば、回収容器５に送られた細胞１３が速やかに濃縮工程を経て収穫されるならば、回収容器５は別の場所に配置されていても良い。この場合、回収容器５は、例えば、インキュベータ３内に収容されていても良い。或いは、回収容器５は、冷蔵庫２及びインキュベータ３の外側の空間（例えば室温エリア３１）に配置されていても良い。

【0054】

（３）使用済み培地１１には、剥離液１２を不活性化させるための成分が必ずしも含まれていなくても良い。すなわち、細胞１３を培養容器６の内面９から剥離させるために使用された剥離液１２の少なくとも一部を単に希釈するために、使用済み培地１１が用いられても良い。このような場合でも、新鮮な培地を使わずに、剥離液１２による細胞１３の損傷を抑制できる。

【符号の説明】

【0055】

５ 回収容器（貯留部、第１貯留部）
６ 培養容器
９ 内面
１１ 使用済み培地
１１Ａ 使用済み培地（第１使用済み培地）
１１Ｂ 使用済み培地（第２使用済み培地）
１２ 剥離液
１３ 細胞
２１ 培地バッファ容器（第２貯留部）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】