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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023040984
(43)【公開日】2023-03-23
(54)【発明の名称】ＲＮＡの編集方法及びＲＮＡを編集するためのキット
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230315BHJP
C07K 14/11 20060101ALI20230315BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20230315BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20230315BHJP
C12N 15/44 20060101ALN20230315BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C07K14/11
C12N9/12 ZNA
C07K19/00
C12N15/44
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022006682
(22)【出願日】2022-01-19
(31)【優先権主張番号】P 2021148146
(32)【優先日】2021-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ウェブサイトの掲載日 ２０２２年１月３日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／ａｂｓ／１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．１ｃ００３３２
(71)【出願人】
【識別番号】504180239
【氏名又は名称】国立大学法人信州大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小笠原 慎治
【テーマコード（参考）】
4B050
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B050CC02
4B050DD20
4B050LL01
4B050LL10
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA01
4H045DA89
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】標的ＲＮＡの任意の位置に任意の塩基配列のＲＮＡを挿入する方法を提供すること。
【解決手段】標的ＲＮＡに対し、
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
該ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（融合ＲｄＲｐ）及び
テンプレートＲＮＡを添加する工程を含む、ＲＮＡの編集方法。
【選択図】なし
【解決手段】標的ＲＮＡに対し、
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
該ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（融合ＲｄＲｐ）及び
テンプレートＲＮＡを添加する工程を含む、ＲＮＡの編集方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的ＲＮＡに対し、
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
該ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（融合ＲｄＲｐ）及び
テンプレートＲＮＡを添加する工程を含む、ＲＮＡの編集方法。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
該ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（融合ＲｄＲｐ）及び
テンプレートＲＮＡを添加する工程を含む、ＲＮＡの編集方法。
【請求項2】
請求項１に記載の方法であって、核タンパク質（ＮＰ）を添加する工程をさらに含み、ＲＮＡの編集がインビトロ又はインビボで行われる、方法。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の方法であって、非構造タンパク質（ＮＳ）及び／又はマトリックスタンパク質（Ｍ）を添加する工程をさらに含み、前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＲｄＲｐ）が、オルソミクソ科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来である、方法。
【請求項4】
ｇＲＮＡと、該ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲｄＲｐと、テンプレートＲＮＡとを標的ＲＮＡと反応させる工程を含む、ＲＮＡの編集方法。
【請求項5】
請求項４に記載の方法であって、前記反応工程が、インビトロ又はインビボで、核タンパク質（ＮＰ）の存在下に行われる、方法。
【請求項6】
請求項４又は５に記載の方法であって、前記反応工程が、非構造タンパク質（ＮＳ）及び／又はマトリックスタンパク質（Ｍ）の存在下に行われ、前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＲｄＲｐ）が、オルソミクソ科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来である、方法。
【請求項7】
前記融合ＲｄＲｐが、Ｃａｐスナッチング機能を有するＲｄＲｐに対し前記タンパク質を融合したものであり、かつ融合前のＲｄＲｐが有しているＣａｐスナッチング機能は融合ＲｄＲｐにおいて抑制されているか又は失われている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質がλｎ、Ｃａｓ１３、Ｌ７Ａｅ、ＭＳ２ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＣＰ）、Ｈｕｍａｎ ｈａｉｒｐｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕ１Ａ（ＴＢＰ６．７）、Ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＬＢＰ）、Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｄｓＲＢＤ）、ｄｓＲＢＤ２、ｄｓＲＢＤ３、ｄｓＲＢＤ４又はｄｓＲＢＤ５である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（融合ＲｄＲｐ）、該融合ＲｄＲｐを発現するベクター又は該融合ＲｄＲｐをコードするｍＲＮＡを含む、標的ＲＮＡを編集するためのキット。
【請求項10】
ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡを発現（転写）するベクター、テンプレートＲＮＡ及びテンプレートＲＮＡを発現（転写）するベクターからなる群より選択される少なくとも一種をさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項11】
請求項９又は１０に記載のキットであって、核タンパク質（ＮＰ）、該ＮＰを発現するベクター又は該ＮＰをコードするｍＲＮＡをさらに含む、標的ＲＮＡをインビトロ又はインビボで編集するためのキット。
【請求項12】
請求項９～１１のいずれか一項に記載のキットであって、該キットが、
非構造タンパク質（ＮＳ）、ＮＳを発現するベクターもしくは該ＮＳをコードするｍＲＮＡ、及び／又は
マトリックスタンパク質（Ｍ）、Ｍを発現するベクターもしくは該ＭをコードするｍＲＮＡ
を含み、前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＲｄＲｐ）が、オルソミクソ科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来である、キット。
非構造タンパク質（ＮＳ）、ＮＳを発現するベクターもしくは該ＮＳをコードするｍＲＮＡ、及び／又は
マトリックスタンパク質（Ｍ）、Ｍを発現するベクターもしくは該ＭをコードするｍＲＮＡ
を含み、前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＲｄＲｐ）が、オルソミクソ科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来である、キット。
【請求項13】
前記融合ＲｄＲｐが、Ｃａｐスナッチング機能を有するＲｄＲｐに対し前記タンパク質を融合したものであり、かつ融合前のＲｄＲｐが有しているＣａｐスナッチング機能は融合ＲｄＲｐにおいて抑制されているか又は失われている、請求項９～１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項14】
前記ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質がλｎ、Ｃａｓ１３、Ｌ７Ａｅ、ＭＳ２ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＣＰ）、Ｈｕｍａｎ ｈａｉｒｐｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕ１Ａ（ＴＢＰ６．７）、Ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＬＢＰ）、Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｄｓＲＢＤ）、ｄｓＲＢＤ２、ｄｓＲＢＤ３、ｄｓＲＢＤ４又はｄｓＲＢＤ５である、請求項９～１３のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＲＮＡの編集方法及びＲＮＡを編集するためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
ＲＮＡ編集はゲノム編集と異なりゲノムＤＮＡの塩基配列を改変することなく遺伝情報を編集できる技術である。この特徴を活かせばリスクの少ない遺伝子治療の実現が期待されるため、ここ数年大きな注目を集めている。しかし、現存のＲＮＡ編集技術は、ADARやAPOBEC1といったRNAの塩基を脱アミノ化する酵素を用い、ＡからＧ（もしくはＣからＵ）へ１塩基を決められた塩基へと編集することしかできない。そのため、遺伝子の点変異が原因のごく限られた遺伝子疾患の治療にしか対応できない。遺伝子の大幅な変異や欠損も含めあらゆる遺伝子疾患を治療できる編集自由度の高いＲＮＡ編集技術が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Nature, Vol 578, 6, February 2020, p25-27
【非特許文献2】Science, 2018, 358, p1019-1027
【非特許文献3】Nat. Biotechnol. 2019, 37, 1059-1069.
【非特許文献4】Nat. Biotechnol. 2019, 37, 133-138.
【非特許文献5】Science, 2019, 365, p382-386.
【非特許文献6】Scientific Reports, 2020. 10:17304
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、標的ＲＮＡの任意の位置に任意の塩基配列のＲＮＡを挿入する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
かかる状況の下、本発明者は、種々の試行錯誤を重ねた結果、標的ＲＮＡに結合するガイドＲＮＡに含まれる特定のモチーフに結合するようＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素を改変し、当該改変したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素とガイドＲＮＡとを用いることにより、標的ＲＮＡを所望の場所から編集し得ることを見出した。本発明はかかる新規の知見に基づくものである。従って、本発明は以下の項を提供する：
【0006】
項１．標的ＲＮＡに対し、
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
該ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（融合ＲｄＲｐ）及び
テンプレートＲＮＡを添加する工程を含む、ＲＮＡの編集方法。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
該ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（融合ＲｄＲｐ）及び
テンプレートＲＮＡを添加する工程を含む、ＲＮＡの編集方法。
【0007】
項２．項１に記載の方法であって、核タンパク質（ＮＰ）を添加する工程をさらに含み、ＲＮＡの編集がインビトロ又はインビボで行われる、方法。
【0008】
項３．項１又は２に記載の方法であって、非構造タンパク質（ＮＳ）及び／又はマトリックスタンパク質（Ｍ）を添加する工程をさらに含み、前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＲｄＲｐ）が、オルソミクソ科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来である、方法。
【0009】
項４．ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を添加する工程をさらに含む、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【0010】
項５．融合ＲｄＲｐの添加が、融合ＲｄＲｐタンパク質の添加、融合ＲｄＲｐを発現するベクターの添加または融合ＲｄＲｐをコードするｍＲＮＡの添加により行われる、項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【0011】
項６．ｇＲＮＡの添加がｇＲＮＡ自体の添加又はｇＲＮＡを発現（転写）するベクターの添加により行われる、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【0012】
項７．テンプレートＲＮＡの添加がテンプレートＲＮＡ自体の添加又はテンプレートＲＮＡを発現（転写）するベクターの添加により行われる、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【0013】
項８．ベクターがプラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター又はバイナリーベクターである、項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【0014】
項９．前記ｇＲＮＡ、前記融合ＲｄＲｐ及びテンプレートＲＮＡが、微生物、植物もしくはその細胞、動物もしくはその細胞に添加される、項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【0015】
項１０．ｇＲＮＡと、該ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲｄＲｐと、テンプレートＲＮＡとを標的ＲＮＡと反応させる工程を含む、ＲＮＡの編集方法。
【0016】
項１１．項１０に記載の方法であって、前記反応工程が、インビトロ又はインビボで、核タンパク質（ＮＰ）の存在下に行われる、方法。
【0017】
項１２．項１０又は１１に記載の方法であって、前記反応工程が、非構造タンパク質（ＮＳ）及び／又はマトリックスタンパク質（Ｍ）の存在下に行われ、前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＲｄＲｐ）が、オルソミクソ科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来である、方法。
【0018】
項１３．前記反応工程がＮＴＰの存在下に行われる、項１０又は１２に記載の方法。
【0019】
項１４．インビトロ又はインビボで行われる、項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【0020】
項１５．標的ＲＮＡが培養細胞中又は試験管中に存在する、項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【0021】
項１６．ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフが、ステムループ構造である、項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【0022】
項１７．ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフが、ＢｏｘＢ配列、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｋ－ｔｕｒｎ（ＢｏｘＣ／Ｄ）配列、ＭＳ２ステムループ配列、Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＨＩＶ ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＴＡＲ）ｈｅａｐｉｎ配列又はＨｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＬＢＰ）結合配列である、項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【0023】
項１８．前記融合ＲｄＲｐが、Ｃａｐスナッチング機能を有するＲｄＲｐに対し前記タンパク質を融合したものであり、かつ融合前のＲｄＲｐが有しているＣａｐスナッチング機能は融合ＲｄＲｐにおいて抑制されているか又は失われている、項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【0024】
項１９．前記融合ＲｄＲｐが、融合前のＲｄＲｐの少なくとも一部を欠損し、及び／又は該融合前のＲｄＲｐに変異を導入しつつ前記タンパク質を融合したものである、項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【0025】
項２０．前記ＲｄＲｐがオルソミクソ科又はブニヤウイルス目のウイルス由来である、項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【0026】
項２１．前記ＲｄＲｐがインフルエンザウイルス、ブニヤウイルス、ハンターンウイルス、シンノンブルウイルス、トゥーラオルソハンタウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ジュグベウイルス、アカバネウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ジャーミストロンウイルス、ラクロスウイルス、Ｌｅａｎｙｅｒウイルス、シュマレンベルクウイルス、Ｓｎｏｗｓｈｏｅ ｈａｒｅウイルス、プンタトロウイルス、リフトバレー熱ウイルス、Ｓａｎｄｆｌｙ ｆｅｖｅｒ ｓｉｃｉｌｉａｎウイルス、Ｔｏｓｃａｎａウイルス、Ｕｕｋｕｎｉｅｍｉウイルス、トマト黄化えそウイルス、ライスストライプテヌイウイルス、トウモロコシストライプテヌイウイルス、Ｔａｃａｒｉｂｅウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、Ｐｉｃｈｉｎｄｅウイルス、ラッサマンマレナウイルス、Ｍａｃｈｕｐｏ ｍａｍｍａｒｅｎａウイルス、重症熱性血小板症候群ウイルス、ブーマラウイルス、アンデスウイルス又はナイロウイルス由来である、項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【0027】
項２２．インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、又はＤ型インフルエンザウイルスである、項２１に記載の方法。
【0028】
項２３．前記ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質がλｎ、Ｃａｓ１３、Ｌ７Ａｅ、ＭＳ２ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＣＰ）、Ｈｕｍａｎ ｈａｉｒｐｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕ１Ａ（ＴＢＰ６．７）、Ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＬＢＰ）、Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｄｓＲＢＤ）、ｄｓＲＢＤ２、ｄｓＲＢＤ３、ｄｓＲＢＤ４又はｄｓＲＢＤ５である、項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【0029】
項２４．前記ｇＲＮＡが、前記標的ＲＮＡにおける編集箇所の近傍に結合する、項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【0030】
項２５．前記融合ＲｄＲｐが、標的ＲＮＡを所定の位置で切断する機能を有する、項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【0031】
項２６．前記融合ＲｄＲｐが、標的ＲＮＡにおける前記切断をした位置を起点にして、テンプレートＲＮＡに対応した伸長反応を行う機能を有する、項２５に記載の方法。
【0032】
項２７．前記所定の位置が標的ＲＮＡにおけるｇＲＮＡが結合する位置の近傍にある、項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【0033】
項２８．前記融合ＲｄＲｐが、ＰＡサブユニット、ＰＢ１サブユニットおよびＰＢ２サブユニットを有する、項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【0034】
項２９．ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（融合ＲｄＲｐ）、該融合ＲｄＲｐを発現するベクター又は該融合ＲｄＲｐをコードするｍＲＮＡを含む、標的ＲＮＡを編集するためのキット。
【0035】
項３０．ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡを発現（転写）するベクター、テンプレートＲＮＡ及びテンプレートＲＮＡを発現（転写）するベクターからなる群より選択される少なくとも一種をさらに含む、項２９に記載のキット。
【0036】
項３１．項２９又は３０に記載のキットであって、核タンパク質（ＮＰ）、該ＮＰを発現するベクター又は該ＮＰをコードするｍＲＮＡをさらに含む、標的ＲＮＡをインビトロ又はインビボで編集するためのキット。
【0037】
項３２．項２９～３１のいずれか一項に記載のキットであって、該キットが、
非構造タンパク質（ＮＳ）、ＮＳを発現するベクターもしくは該ＮＳをコードするｍＲＮＡ、及び／又は
マトリックスタンパク質（Ｍ）、Ｍを発現するベクターもしくは該ＭをコードするｍＲＮＡ
を含み、前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＲｄＲｐ）が、オルソミクソ科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来である、キット。
非構造タンパク質（ＮＳ）、ＮＳを発現するベクターもしくは該ＮＳをコードするｍＲＮＡ、及び／又は
マトリックスタンパク質（Ｍ）、Ｍを発現するベクターもしくは該ＭをコードするｍＲＮＡ
を含み、前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＲｄＲｐ）が、オルソミクソ科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来である、キット。
【0038】
項３３．ＮＴＰをさらに含む、項２９～３２のいずれか一項に記載のキット。
【0039】
項３４．ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフが、ステムループ構造である、項２９～３３のいずれか一項に記載のキット。
【0040】
項３５．ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフが、ＢｏｘＢ配列、ｃｒＲＮＡ、ｋ－ｔｕｒｎ配列、ＭＳ２ステムループ配列、ｄｓＲＮＡ、ＴＡＲ配列又はＳＬＢＰ結合配列である、項２９～３４のいずれか一項に記載のキット。
【0041】
項３６．前記融合ＲｄＲｐが、Ｃａｐスナッチング機能を有するＲｄＲｐに対し前記タンパク質を融合したものであり、かつ融合前のＲｄＲｐが有しているＣａｐスナッチング機能は融合ＲｄＲｐにおいて抑制されているか又は失われている、項２９～３５のいずれか一項に記載のキット。
【0042】
項３７．前記融合ＲｄＲｐが、融合前のＲｄＲｐの少なくとも一部を欠損し、及び／又は該融合前のＲｄＲｐに変異を導入しつつ前記タンパク質を融合したものである、項２９～３６のいずれか一項に記載のキット。
【0043】
項３８．前記ＲｄＲｐがオルソミクソ科又はブニヤウイルス目のウイルス由来である、項２９～３７のいずれか一項に記載のキット。
【0044】
項３９．前記ＲｄＲｐがインフルエンザウイルス、ブニヤウイルス、ハンターンウイルス、シンノンブルウイルス、トゥーラオルソハンタウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ジュグベウイルス、アカバネウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ジャーミストロンウイルス、ラクロスウイルス、Ｌｅａｎｙｅｒウイルス、シュマレンベルクウイルス、Ｓｎｏｗｓｈｏｅ ｈａｒｅウイルス、プンタトロウイルス、リフトバレー熱ウイルス、Ｓａｎｄｆｌｙ ｆｅｖｅｒ ｓｉｃｉｌｉａｎウイルス、Ｔｏｓｃａｎａウイルス、Ｕｕｋｕｎｉｅｍｉウイルス、トマト黄化えそウイルス、ライスストライプテヌイウイルス、トウモロコシストライプテヌイウイルス、Ｔａｃａｒｉｂｅウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、Ｐｉｃｈｉｎｄｅウイルス、ラッサマンマレナウイルス、Ｍａｃｈｕｐｏ ｍａｍｍａｒｅｎａウイルス、重症熱性血小板症候群ウイルス、ブーマラウイルス、アンデスウイルス又はナイロウイルス由来である、項２９～３８のいずれか一項に記載のキット。
【0045】
項４０．インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、又はＤ型インフルエンザウイルスである、項３９に記載のキット。
【0046】
項４１．前記ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質がλｎ、Ｃａｓ１３、Ｌ７Ａｅ、ＭＳ２ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＣＰ）、Ｈｕｍａｎ ｈａｉｒｐｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕ１Ａ（ＴＢＰ６．７）、Ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＬＢＰ）、Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｄｓＲＢＤ）、ｄｓＲＢＤ２、ｄｓＲＢＤ３、ｄｓＲＢＤ４又はｄｓＲＢＤ５である、項２９～４０のいずれか一項に記載のキット。
【0047】
項４２．前記ｇＲＮＡが、前記標的ＲＮＡにおける編集箇所の近傍に結合する、項２９～４１のいずれか一項に記載のキット。
【0048】
項４３．前記融合ＲｄＲｐが、標的ＲＮＡを所定の位置で切断する機能を有する、項２９～４２のいずれか一項に記載のキット。
【0049】
項４４．前記融合ＲｄＲｐが、標的ＲＮＡにおける前記切断をした位置を起点にして、テンプレートＲＮＡに対応した伸長反応を行う機能を有する、項４３に記載のキット。
【0050】
項４５．前記所定の位置が標的ＲＮＡにおけるｇＲＮＡが結合する位置の近傍にある、項２９～４４のいずれか一項に記載のキット。
【0051】
項４６．前記融合ＲｄＲｐが、ＰＡサブユニット、ＰＢ１サブユニットおよびＰＢ２サブユニットを有する、項２９～４５のいずれか一項に記載のキット。
【0052】
項４７．項１～２８のいずれか一項に記載の方法に用いるための、項２９～４６のいずれか一項に記載のキット。
【0053】
項４８．前記ＰＡサブユニット、ＰＢ１サブユニット、ＰＢ２サブユニット、ＮＰ、ＮＳ及びＭからなる群より選択される少なくとも１種におけるアミノ酸配列が、これらのペプチドの天然のアミノ酸配列に対し１又は複数個（例えば、１～６００個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されてなるものである、項２～９、１１～２８のいずれか一項に記載の方法又は項３１～４７のいずれか一項に記載のキット。
【0054】
項４９．前記融合ＲｄＲｐに含まれる前記ＰＡサブユニット、ＰＢ１サブユニット、ＰＢ２サブユニット、ＮＰ、ＮＳ及びＭのアミノ酸配列が変異（アミノ酸の欠失、置換、付加等）を有してもよく、これらのペプチドの天然のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％（好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％）の配列同一性を有する、項２～９、１１～２８のいずれか一項に記載の方法又は項３１～４７のいずれか一項に記載のキット。
【発明の効果】
【0055】
本発明によれば、任意の位置で標的ＲＮＡの塩基配列を、任意の塩基配列に改変する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0056】
【発明を実施するための形態】
【0057】
本発明において、用語「遺伝子」には、特に言及しない限り、タンパク質、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等の一次構造を規定している構造遺伝子だけでなく、プロモーター、オペレーター等の特定の制御機能を有する核酸上の領域も包含される。従って、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。また、「構造遺伝子」には、元のＤＮＡ配列にサイレント変異が施されたサイレントＤＮＡも包含される。また、本発明においては、遺伝子発現に干渉するｓｉＲＮＡ等の核酸分子も「遺伝子」に包含される。
【0058】
本明細書中において、「核酸」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと同義であって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドのいずれであってもよい。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する核酸分子といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する核酸分子（またはヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド）も包括的に意味するものとする。また、これらの核酸分子は環状でも直鎖状であってもよく、また合成及び生物由来のいずれであってもよい。
【0059】
本発明において、「タンパク質（タンパク）」及び「ペプチド」は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含む意味で用いられる。また、本明細書において、「タンパク質」及び「ペプチド」は、特に言及しない限り、糖鎖などによって修飾されているタンパク質及び非修飾のタンパク質の両方を包含するものとする。このことは、タンパク質であることが明記されていないタンパク質についても同様である。また、本発明において用いられるタンパク質（タンパク）、ペプチド等を例示するために、アミノ酸配列を挙げて説明をするが、そうでないことが明示されない限り、各アミノ酸配列は、本発明の効果が得られる範囲で、１個又は複数個のアミノ酸が変異（付加、削除及び／又は置換）されてもよい。
【0060】
ＲＮＡの編集方法
本発明は、標的ＲＮＡに対し、
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
該ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（融合ＲｄＲｐ）及び
テンプレートＲＮＡを添加する工程を含む、ＲＮＡの編集方法
を提供する。
本発明は、標的ＲＮＡに対し、
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
該ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（融合ＲｄＲｐ）及び
テンプレートＲＮＡを添加する工程を含む、ＲＮＡの編集方法
を提供する。
【0061】
標的ＲＮＡとしては特に限定されないが、ガイドＲＮＡが結合しやすいように、一定以上の長さを有するものが好ましい。例えば、標的ＲＮＡの長さとしては、例えば、２０塩基以上、好ましくは４０塩基以上、より好ましくは５０塩基以上のものを用いることができる。また、標的ＲＮＡの長さの上限は特に限定されないが、例えば、１００００塩基以下、８０００塩基以下、３０００塩基以下等のものが挙げられる。後述するように、本発明の典型的な実施形態においては融合ＲｄＲｐが、標的ＲＮＡを所定の位置（例えば、標的ＲＮＡにおけるｇＲＮＡが結合する位置の近傍、より具体的には、例えば、標的ＲＮＡにおけるｇＲＮＡが結合する範囲の３’側の端から２～４０塩基（好ましくは６～２０塩基）離れた位置）で切断する。従って、典型的な実施形態において、標的ＲＮＡは、融合ＲｄＲｐにより認識、切断され得る塩基配列を含む。融合ＲｄＲｐにより認識、切断され得る塩基配列としては、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＲｄＲｐ）のＰＡサブユニットにより切断されうる塩基配列ＡＧ、ＣＧ、ＵＧ、ＧＧ、ＣＡ、ＵＡ、ＧＡ、ＡＡ、ＵＵ、ＣＵ、ＧＵ、ＡＵ等；ＴｏｓｃａｎａウイルスのＲｄＲｐにより切断されうる塩基配列ＧＣ、ＵＣ、ＡＡ、ＧＡ、ＵＵ、ＵＡ，ＣＣ、ＡＵ、ＣＵ等が挙げられる。本発明においては、標的ＲＮＡは、培養細胞中に存在していてもよいし、培養細胞中に存在する以外の態様で試験管中に存在してもよい。また、標的ＲＮＡは、生体内に存在していてもよい。従って、本発明のいくつかの実施形態においては、前記ｇＲＮＡ、前記融合ＲｄＲｐ及びテンプレートＲＮＡは、標的ＲＮＡを含む、微生物、植物もしくはその細胞、動物もしくはその細胞等に添加され得る。また、反応系が溶液系である場合、反応開始時における標的ＲＮＡの量は特に限定されないが、例えば、反応系中の濃度として、１ｐＭ～１ｍＭ、好ましくは１００ｐＭ～１００μＭ、より好ましくは１００ｎＭ～１０μＭ等が挙げられる。
【0062】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）としては、後述する融合ＲｄＲｐが結合するＲＮＡモチーフを有し、かつ標的ＲＮＡに結合するものであれば特に限定されない。ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフとしては、ステムループ構造等が挙げられる。より具体的には、ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフとしては、ＢｏｘＢ配列、ｃｒＲＮＡ、ｋ－ｔｕｒｎ配列、ＭＳ２ステムループ配列、ｄｓＲＮＡ、ＴＡＲ配列又はＳＬＢＰ結合配列等が挙げられる。ｇＲＮＡは、標的ＲＮＡの所望の位置に結合するように、標的ＲＮＡの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが好ましい。かかる実施形態において、標的ＲＮＡの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列の長さは限定されないが、例えば、１０～１００塩基、好ましくは１５～８０塩基、より好ましくは２０～５０塩基の範囲で設計できる。また、ｇＲＮＡ自体の長さは限定されず、例えば、２５塩基以上、好ましくは３０塩基以上、より好ましくは３５塩基以上のものを用いることができる。また、ｇＲＮＡの長さの上限も特に限定されないが、例えば、１１５塩基以下、９５塩基以下、９０塩基以下等のものが挙げられる。ｇＲＮＡの使用量は特に限定されないが、溶液系の場合、反応系中の濃度としては、１ｐＭ～１ｍＭ、好ましくは１００ｐＭ～１００μＭ、より好ましくは１００ｎＭ～１０μＭ等が挙げられる。また、本発明において、反応系にｇＲＮＡを添加する工程は、ｇＲＮＡ自体を添加する方法だけでなく、ｇＲＮＡを発現（転写）するベクターの添加等により行ってもよい。ｇＲＮＡを発現（転写）するベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター等）、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター、バイナリーベクター等が挙げられる。これらのベクターにｇＲＮＡまたはそれをコードするＤＮＡを組み込んだものを使用することができる。
【0063】
また、本工程においてはｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素を用いる。本発明において「ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」を、単に融合ＲｄＲｐと示すことがある。
【0064】
融合ＲｄＲｐに含まれる「ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質」としては、上記ＲＮＡモチーフに特異的に結合するものであれば特に限定されないが、例えば、λｎ、Ｃａｓ１３、Ｌ７Ａｅ、ＭＳ２ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＣＰ）、Ｈｕｍａｎ ｈａｉｒｐｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕ１Ａ（ＴＢＰ６．７）、Ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＬＢＰ）、Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｄｓＲＢＤ）、ｄｓＲＢＤ２、ｄｓＲＢＤ３、ｄｓＲＢＤ４、ｄｓＲＢＤ５等が挙げられる。λｎタンパク質としては、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．Ｍ２９６５３で示されるもの等が挙げられる。より具体的には、λｎタンパク質としては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。λｎタンパク質は、ＢｏｘＢに特異的に結合する。また、λｎタンパク質としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列から１個又は数個（例えば、１～４個、１～２個、１個等）のアミノ酸を付加、削除及び／又は置換してなるアミノ酸配列を有するものであってもよい。Ｃａｓ１３タンパク質としては、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３Ｘ、Ｃａｓ１３Ｙ等が挙げられ、Ｃａｓ１３ｂ等が好ましい。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＷＰ＿０４４０６５２９４で示されるもの等が挙げられる。また、Ｃａｓ１３タンパク質としては、切断活性を不活性化した変異体（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃａｓ１３，ｄＣａｓ１３）であることが好ましい。かかる変異体としては、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するもの等が挙げられる。また、配列番号８で表されるアミノ酸配列から複数個（例えば、１～５００個、１～２００個、１～５０個、１～２０個、１個等）のアミノ酸を付加、削除及び／又は置換してなるアミノ酸配列を有するものであってもよい。Ｃａｓ１３タンパク質は、ｃｒＲＮＡに特異的に結合する。Ｌ７Ａｅタンパク質としては、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＷＰ＿０１０８７８２６７で示されるもの等が挙げられる。また、Ｌ７Ａｅタンパク質は、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するもの、又は配列番号７で表されるアミノ酸配列から１個又複数個（例えば、１～５０個、１～２０個、１～５個、１個等）のアミノ酸を付加、削除及び／又は置換してなるアミノ酸配列を有するものであってもよい。Ｌ７Ａｅタンパク質は、Ｂｏｘ Ｃ／Ｄに特異的に結合する。ＭＣＰタンパク質としては、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＹＰ＿００９６４０１２５で示されるもの等が挙げられる。また、ＭＣＰタンパク質としては、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＹＰ＿００９６４０１２５に示されるＭＣＰタンパク質のアミノ酸配列から１個又複数個（例えば、１～５０個、１～２０個、１～５個、１個等）のアミノ酸を付加、削除及び／又は置換してなるアミノ酸配列を有するものであってもよい。ＭＣＰタンパク質は、ＭＳ２に特異的に結合する。
【0065】
本発明において、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素を単にＲｄＲｐと示すこともある。本発明の典型的な実施形態において、前記融合ＲｄＲｐは、ＲｄＲｐに由来するＰＡサブユニット、ＰＢ１サブユニットおよびＰＢ２サブユニットを有するもの等が挙げられる。本発明において、ＲｄＲｐ及び融合ＲｄＲｐにおけるＰＡサブユニット、ＰＢ１サブユニットおよびＰＢ２サブユニットは、一般のアミノ酸配列として結合していてもよいし、これら３つのサブユニットが非共有結合的に集合し、複合体化していてもよい。また、ＲｄＲｐとしては、オルソミクソ科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ブニヤウイルス等に由来するものが挙げられる。より具体的には、ＲｄＲｐとしては、インフルエンザウイルス、ブニヤウイルス、ハンターンウイルス、シンノンブルウイルス、トゥーラオルソハンタウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ジュグベウイルス、アカバネウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ジャーミストロンウイルス、ラクロスウイルス、Ｌｅａｎｙｅｒウイルス、シュマレンベルクウイルス、Ｓｎｏｗｓｈｏｅ ｈａｒｅウイルス、プンタトロウイルス、リフトバレー熱ウイルス、Ｓａｎｄｆｌｙ ｆｅｖｅｒ ｓｉｃｉｌｉａｎウイルス、Ｔｏｓｃａｎａウイルス、Ｕｕｋｕｎｉｅｍｉウイルス、トマト黄化えそウイルス、ライスストライプテヌイウイルス、トウモロコシストライプテヌイウイルス、Ｔａｃａｒｉｂｅウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、Ｐｉｃｈｉｎｄｅウイルス、ラッサマンマレナウイルス、Ｍａｃｈｕｐｏ ｍａｍｍａｒｅｎａウイルス、重症熱性血小板症候群ウイルス、ブーマラウイルス、アンデスウイルス、ナイロウイルス等のウイルスに由来するものが挙げられる。インフルエンザウイルスとしては、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ｄ型インフルエンザウイルス等が挙げられる。本発明のより具体的な一実施形態において、例えば、インフルエンザウイルスに由来するＲｄＲｐとしては、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＦ３８９１１５で示されるアミノ酸配列（ＰＢ２）、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＦ３８９１１６（ＰＢ１）で示されるアミノ酸配列及びＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＦ３８９１１７（ＰＡ）で示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。インフルエンザウイルスに由来するＲｄＲｐとしては、より具体的には、配列番号２で表されるPAのアミノ酸配列、配列番号３で表されるＰＢ１のアミノ酸配列及び配列番号４で表されるＰＢ２のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、融合ＲｄＲｐに含まれる前記ＰＡサブユニット、ＰＢ１サブユニット、ＰＢ２サブユニットのアミノ酸配列は、変異を有してもよい。例えば、配列番号２で表されるPAのアミノ酸配列のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％（好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは７０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％）の配列同一性を有するものを使用することができる。また、配列番号３で表されるＰＢ１のアミノ酸配列に対しても少なくとも４０％（好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するものを使用することができる。そして配列番号４で表されるＰＢ２のアミノ酸配列に対しても少なくとも４０％（好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するものを使用することができる。その際、配列番号４で表されるＰＢ２のアミノ酸配列における１～２４５位のアミノ酸のアミノ酸配列は保存され（変異を有する場合も、例えば、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有す）ることが好ましい。また別の実施形態において、配列番号４で表されるＰＢ２のアミノ酸配列に対し変異を有する場合、配列番号４で表されるＰＢ２のアミノ酸配列における１～２４５位及び５３７～７５９位のアミノ酸のアミノ酸配列は保存され（変異を有する場合も、例えば、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有す）ることが好ましい。 本発明においては、前記融合ＲｄＲｐが、Ｃａｐスナッチング機能を有するＲｄＲｐに対し前記タンパク質（ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質）を融合したものであることが好ましい。また、好ましい実施形態において、前記融合ＲｄＲｐは、融合前のＲｄＲｐの少なくとも一部（例えば、該融合前のＲｄＲｐが本来有しているＣａｐスナッチング機能を有するサブユニットの少なくとも一部）を欠損し、及び／又は該融合前のＲｄＲｐに変異を導入しつつ前記タンパク質を融合したものである（従って、融合前のＲｄＲｐが本来有しているＣａｐスナッチング機能が、融合ＲｄＲｐにおいて抑制されているか又は失われている）ことが好ましい。融合前のＲｄＲｐが本来有しているＣａｐスナッチング機能が抑制又は失われていることにより、前記タンパク質の機能により標的ＲＮＡの所望の位置に融合ＲｄＲｐを結合させ、それにより、標的ＲＮＡの所望の位置からＲＮＡ編集を行うことができる。
【0066】
「ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質」と「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」とを融合したタンパク質を調製する方法は特に限定されず、例えば、後述する実施例に記載の方法により行うことができる。
【0067】
また、本発明において、反応系に融合ＲｄＲｐを添加する工程は、融合ＲｄＲｐタンパク質を添加する方法だけでなく、融合ＲｄＲｐを発現するベクターの添加、融合ＲｄＲｐをコードするｍＲＮＡの添加等により行ってもよい。融合ＲｄＲｐを発現するベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター等）、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター、バイナリーベクター等が挙げられる。これらのベクターに融合ＲｄＲｐの遺伝子を組み込んだものを使用することができる。反応系への融合ＲｄＲｐを発現するベクターの添加、融合ＲｄＲｐをコードするｍＲＮＡの添加等を行う方法には、宿主細胞等を当該ベクター、当該ｍＲＮＡ等でトランスフェクトし、宿主細胞等に融合ＲｄＲｐを発現させてもよい。宿主細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞等が挙げられる。当該宿主細胞を用いる実施形態において、反応溶液中の当該宿主細胞の量は限定されないが、例えば、０．５～１０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好ましくは１～８ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは２～５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲で適宜設定できる。
【0068】
テンプレートＲＮＡとしては、融合ＲｄＲｐにより切断された標的ＲＮＡの当該切断部位以降に配置したい塩基配列の相補配列を有するものであれば特に限定されない。テンプレートＲＮＡの長さは限定されず、例えば、２０塩基以上、好ましくは３０塩基以上、より好ましくは４０塩基以上のものを用いることができる。また、テンプレートＲＮＡの長さの上限も特に限定されないが、例えば、１００００塩基以下、５０００塩基以下、３０００塩基以下等のものが挙げられる。テンプレートＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写反応で調製することができる。反応開始時における反応系中のテンプレートＲＮＡの量は特に限定されないが、例えば、溶液系の場合、反応系中の濃度として、１ｐＭ～１ｍＭ、好ましくは１００ｐＭ～１００μＭ、より好ましくは１００ｎＭ～１０μＭ等が挙げられる。また、本発明において、反応系にテンプレートＲＮＡを添加する工程は、テンプレートＲＮＡ自体を添加する方法だけでなく、テンプレートＲＮＡを発現（転写）するベクターの添加等により行ってもよい。テンプレートＲＮＡを発現（転写）するベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター等）、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター、バイナリーベクター等が挙げられる。これらのベクターにテンプレートＲＮＡ又はこれをコードするＤＮＡを組み込んだものを使用することができる。
【0069】
本発明の一実施形態において、標的ＲＮＡに対するｇＲＮＡ、融合ＲｄＲｐ及びテンプレートＲＮＡを添加する工程は、培地中（典型的には液体培地中）で行うことが好ましい。培地としては、特に限定されないが、例えば、ＤＭＥＭ培地、ＥＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、各種昆虫細胞用培地培地等を用いることができる。培地のｐＨとしては特に限定されないが、例えば、８～６、好ましくは７．５～６．５の範囲で適宜設定できる。本工程を行う温度も特に限定されないが、例えば、２０～５０℃、好ましくは２５～４０℃の範囲で適宜設定できる。
【0070】
本発明の方法において、標的ＲＮＡに対するｇＲＮＡ、融合ＲｄＲｐ及びテンプレートＲＮＡを添加する工程の後、インキュベーションを行ってもよい。インキュベーションは静置により行ってもよいし、攪拌をしてもよい。インキュベーションを行う場合、その時間は特に限定されないが、例えば、１～１６８時間、好ましくは２～９６時間の範囲で適宜設定できる。インビトロの場合、インキュベーションの時間は、例えば、１０～０．５時間が好ましく、６～２時間がより好ましい。インビボの場合、インキュベーションの時間は、例えば、２００～１０時間が好ましく、１００～２０時間がより好ましい。インキュベーションを行う場合、その温度も特に限定されないが、例えば、２０～５０℃、好ましくは２５～４０℃の範囲で適宜設定できる。
【0071】
本発明の方法により、ｇＲＮＡと、該ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲｄＲｐと、テンプレートＲＮＡと、標的ＲＮＡとの反応が生じる。具体的には、典型的な実施形態において、標的ＲＮＡにｇＲＮＡが結合し、当該ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに結合することにより融合ＲｄＲｐがｇＲＮＡに結合し、そして、融合ＲｄＲｐが標的ＲＮＡを切断した上で、標的ＲＮＡにおける前記切断をした位置を起点にして、テンプレートＲＮＡに対応した伸長反応が生じる。それにより、標的ＲＮＡの所望の位置からテンプレートＲＮＡに対応する塩基配列を有するＲＮＡが伸張されてなるＲＮＡを調製することができる。
【0072】
本発明の方法は、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を添加する工程をさらに含んでいてもよい。本発明の方法において、ＮＴＰは、ＲＮＡ合成の原料等として使用される。
【0073】
本発明の方法は、インビトロ及びインビボのいずれでも行うことができる。本発明において、試験管内に細胞、生体組織（生体から摘出したもの、培養により生成したもの等を含む）等を配置し、当該細胞、生体組織等が有する標的ＲＮＡに対しＲＮＡ編集を行う方法は、インビボに包含される。
【0074】
また、好ましい実施形態において、本発明の方法は、核タンパク質（ＮＰ）を添加する工程をさらに含んでいてもよい。ＮＰとしては、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＦ３８９１１９等で示されるもの等が挙げられる。ＮＰのアミノ酸配列は、変異を有してもよく、例えば、天然のアミノ酸配列に対し１又は複数個（例えば、１～９９個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されてなるものを使用することができる。好ましい実施形態において、例えば、天然のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％（好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するものを使用することができる。また、当該実施形態においては、ＮＰをＲｄＲｐと融合した上でさらにNPを添加する工程をふくんでもよい。当該実施形態においてＮＰの使用量は限定されないが、例えば、溶液系の場合、反応系中の濃度として、１ｐＭ～１ｍＭ、好ましくは１００ｐＭ～１００μＭ、より好ましくは１００ｎＭ～１０μＭ等が挙げられる。ＮＰを用いる実施形態は、インビボでＲＮＡ編集を行う場合に特に好ましい。
【0075】
また、好ましい実施形態において、本発明の方法は、非構造タンパク質（ＮＳ）を添加する工程をさらに含んでいてもよい。ＮＳとしては、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＦ３８９１２２等で示されるもの等が挙げられる。ＮＳのアミノ酸配列は、変異を有してもよく、例えば、天然のアミノ酸配列に対し１又は複数個（例えば、１～９９個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されてなるものを使用することができる。好ましい実施形態において、例えば、天然のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するものを使用することができる。当該実施形態においてＮＳの使用量は限定されないが、例えば、溶液系の場合、反応系中の濃度として、１ｐＭ～１ｍＭ、好ましくは１００ｐＭ～１００μＭ、より好ましくは１００ｎＭ～１０μＭ等が挙げられる。また、好ましい実施形態において、本発明の方法は、マトリックスタンパク質（Ｍ）を添加する工程をさらに含んでいてもよい。マトリックスタンパク質（Ｍ）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＦ３８９１２１等で示されるもの等が挙げられる。マトリックスタンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列は、変異を有してもよく、例えば、天然のアミノ酸配列に対し１又は複数個（例えば、１～９９個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されてなるものを使用することができる。好ましい実施形態において、上記天然のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するものを使用することができる。当該実施形態においてマトリックスタンパク質（Ｍ）の使用量は限定されないが、例えば、溶液系の場合、反応系中の濃度として、１ｐＭ～１ｍＭ、好ましくは１００ｐＭ～１００μＭ、より好ましくは１００ｎＭ～１０μＭ等が挙げられる。これらの実施形態において、非構造タンパク質（ＮＳ）とマトリックスタンパク質（Ｍ）とをそれぞれ単独に使用しても２種類を組み合わせてもよい。本発明のうち非構造タンパク質（ＮＳ）及び／又はマトリックスタンパク質（Ｍ）を用いる実施形態は、前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＲｄＲｐ）が、オルソミクソ科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来である場合に特に好ましい。
【0076】
キット
別の実施形態において、本発明は、ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（融合ＲｄＲｐ）、該融合ＲｄＲｐを発現するベクター又は該融合ＲｄＲｐをコードするｍＲＮＡを含む、標的ＲＮＡを編集するためのキットを提供する。本発明のキットは、前述したＲＮＡの編集方法に用いることができる。ｇＲＮＡ、融合ＲｄＲｐ等の用語の意味するところは、前述の通りである。
別の実施形態において、本発明は、ｇＲＮＡに含まれる所定のＲＮＡモチーフに特異的に結合するタンパク質を融合したＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（融合ＲｄＲｐ）、該融合ＲｄＲｐを発現するベクター又は該融合ＲｄＲｐをコードするｍＲＮＡを含む、標的ＲＮＡを編集するためのキットを提供する。本発明のキットは、前述したＲＮＡの編集方法に用いることができる。ｇＲＮＡ、融合ＲｄＲｐ等の用語の意味するところは、前述の通りである。
【0077】
また、本発明のキットは、ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡを発現（転写）するベクター、テンプレートＲＮＡ及びテンプレートＲＮＡを発現（転写）するベクターからなる群より選択される少なくとも一種をさらに含んでいてもよい。また、本発明のキットは、核タンパク質（ＮＰ）、該ＮＰを発現するベクター又は該ＮＰをコードするｍＲＮＡをさらに含んでいてもよい。核タンパク質（ＮＰ）、該ＮＰを発現するベクター又は該ＮＰをコードするｍＲＮＡを含むキットは、標的ＲＮＡをインビボで編集するために用いる場合、特に好ましい。好ましい実施形態において、本発明のキットは、
非構造タンパク質（ＮＳ）、ＮＳを発現するベクターもしくは該ＮＳをコードするｍＲＮＡ、及び／又は
マトリックスタンパク質（Ｍ）、Ｍを発現するベクターもしくは該ＭをコードするｍＲＮＡ
を含んでもよい。かかる実施形態においては、前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＲｄＲｐ）が、オルソミクソ科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来であることが好ましい。また、本発明のキットはＮＴＰをさらに含んでもよい。本発明のキットは、さらに、シリンジ、反応容器、本発明のキットを使用するための説明書等を備えていてもよい。
非構造タンパク質（ＮＳ）、ＮＳを発現するベクターもしくは該ＮＳをコードするｍＲＮＡ、及び／又は
マトリックスタンパク質（Ｍ）、Ｍを発現するベクターもしくは該ＭをコードするｍＲＮＡ
を含んでもよい。かかる実施形態においては、前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＲｄＲｐ）が、オルソミクソ科ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来であることが好ましい。また、本発明のキットはＮＴＰをさらに含んでもよい。本発明のキットは、さらに、シリンジ、反応容器、本発明のキットを使用するための説明書等を備えていてもよい。
【0078】
以下に実施例及び比較例を用いて本発明の特定の実施形態を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
【実施例0079】
（１）リコンビナントRdRpの作製
A型インフルエンザウイルスのPA, PB1およびPB2をシームレスクローニング法によりpcDNA3ベクターにサブクローニングし、pcDNA3-PA, pcDNA3-PB1およびpcDNA-PB2を作製した。pcDNA-PB2についてはドメインを削除した５種類の変異体を作製した。cap結合ドメインを含む変異体にはF404Aのアミノ酸変異を入れcap結合能を抑制した。また各種PB２のC末端に配列番号５に示すλn配列とTAPタグ配列を付加した。8μgのpcDNA3-PA, 8μgのpcDNA3-PB1および8μgのpcDNA-PB2を2 mLのOptiMEM培地中でトランスフェクション試薬Transporter 5と混合し２０分間室温で静置した後、HEK293T細胞を培養中のDMEM培地（抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）および10% FBS含有）に添加しトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、HEK293T細胞をlysisバッファー (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 25% glycerol and 1 x protease inhibitor cocktail)で溶解しIgG Sepharose 6 Fast Flowを用いRdRpを抽出した。各種PB2変異体のドメイン構造と抽出後の各種RdRpのSDS-PAGE結果を図１に示す。
A型インフルエンザウイルスのPA, PB1およびPB2をシームレスクローニング法によりpcDNA3ベクターにサブクローニングし、pcDNA3-PA, pcDNA3-PB1およびpcDNA-PB2を作製した。pcDNA-PB2についてはドメインを削除した５種類の変異体を作製した。cap結合ドメインを含む変異体にはF404Aのアミノ酸変異を入れcap結合能を抑制した。また各種PB２のC末端に配列番号５に示すλn配列とTAPタグ配列を付加した。8μgのpcDNA3-PA, 8μgのpcDNA3-PB1および8μgのpcDNA-PB2を2 mLのOptiMEM培地中でトランスフェクション試薬Transporter 5と混合し２０分間室温で静置した後、HEK293T細胞を培養中のDMEM培地（抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）および10% FBS含有）に添加しトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、HEK293T細胞をlysisバッファー (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 25% glycerol and 1 x protease inhibitor cocktail)で溶解しIgG Sepharose 6 Fast Flowを用いRdRpを抽出した。各種PB2変異体のドメイン構造と抽出後の各種RdRpのSDS-PAGE結果を図１に示す。
【0080】
（２）in vitroでの切断反応
（１）で作製した各種RdRpを用いin vitroでtarget RNAの切断反応を行った。反応溶液（0.5 μMの蛍光ラベルしたtarget RNA, 0.5 μMのBox B 配列を含むgRNA (もしくは gRNA mut), 0.5 μMのtemplate RNA, 0.1 μMのRdRp, 2 U/μlのRNaseインヒビター）を反応用バッファー(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2,)中で30 ℃、2 時間反応させた。各種RdRpがtarget RNAをAGの後で切断することを確認した。使用したRNAの配列および切断反応後のPAGE結果を図２に示す。
（１）で作製した各種RdRpを用いin vitroでtarget RNAの切断反応を行った。反応溶液（0.5 μMの蛍光ラベルしたtarget RNA, 0.5 μMのBox B 配列を含むgRNA (もしくは gRNA mut), 0.5 μMのtemplate RNA, 0.1 μMのRdRp, 2 U/μlのRNaseインヒビター）を反応用バッファー(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2,)中で30 ℃、2 時間反応させた。各種RdRpがtarget RNAをAGの後で切断することを確認した。使用したRNAの配列および切断反応後のPAGE結果を図２に示す。
【0081】
（３）in vitroでの伸長反応
（１）で作製した各種RdRpを用いin vitroで切断後のtarget RNAに相当するprimer RNAの伸長反応を行った。反応溶液（（0.5 μMの蛍光ラベルしたprimer RNA, 0.5 μMのBox B 配列を含むgRNA (もしくは gRNA mut), 0.5 μMのtemplate RNA, 0.1 μMのRdRp, 2 U/μlのRNaseインヒビター, 1 mM のNTPs）を反応用バッファー(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2,)中で30 ℃、2 時間反応させた。各種RdRpがprimer RNAの3’末端からtemplate RNAを鋳型に新生RNAを伸長することを確認した。使用したRNAの配列および伸長反応後のPAGE結果を図３に示す。
（１）で作製した各種RdRpを用いin vitroで切断後のtarget RNAに相当するprimer RNAの伸長反応を行った。反応溶液（（0.5 μMの蛍光ラベルしたprimer RNA, 0.5 μMのBox B 配列を含むgRNA (もしくは gRNA mut), 0.5 μMのtemplate RNA, 0.1 μMのRdRp, 2 U/μlのRNaseインヒビター, 1 mM のNTPs）を反応用バッファー(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2,)中で30 ℃、2 時間反応させた。各種RdRpがprimer RNAの3’末端からtemplate RNAを鋳型に新生RNAを伸長することを確認した。使用したRNAの配列および伸長反応後のPAGE結果を図３に示す。
【0082】
（４）in vitroでのRNA編集
（１）で作製したPB2(480)変異体を含むRdRpを用いin vitroでtarget RNAの編集を行った。反応溶液（1 μMの蛍光ラベルしたtarget RNA, 1 μMのBox B 配列を含むgRNA (もしくは gRNA mut), 1 μMのtemplate RNA, 0.25 μMのRdRp, 2 U/μlのRNaseインヒビター, 1 mM のNTPs）を反応用バッファー(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2,)中で30 ℃、4 時間反応させた。PB2(480)変異体を含むRdRpがtarget RNAを切断し、切断後の3’末端からtemplate RNAを鋳型に新生RNAを伸長することを確認した。使用したRNAの配列および編集反応後のPAGE結果を図４に示す。
（１）で作製したPB2(480)変異体を含むRdRpを用いin vitroでtarget RNAの編集を行った。反応溶液（1 μMの蛍光ラベルしたtarget RNA, 1 μMのBox B 配列を含むgRNA (もしくは gRNA mut), 1 μMのtemplate RNA, 0.25 μMのRdRp, 2 U/μlのRNaseインヒビター, 1 mM のNTPs）を反応用バッファー(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2,)中で30 ℃、4 時間反応させた。PB2(480)変異体を含むRdRpがtarget RNAを切断し、切断後の3’末端からtemplate RNAを鋳型に新生RNAを伸長することを確認した。使用したRNAの配列および編集反応後のPAGE結果を図４に示す。
【0083】
（５）λn-Box Bの相互作用を利用したin vivo（細胞内）でのRNA編集
青色蛍光タンパク質mCeruleanのmRNAを赤色蛍光タンパク質mScarletのmRNAに書き換えるRNA編集を細胞内で行った。編集が起これば赤色蛍光が観察される（図５）。A型インフルエンザウイルスのNP（配列番号６）をシームレスクローニング法によりpcDNA3ベクターにサブクローニングし、pcDNA3-NPを作製した。Box B配列を含むgRNA配列をシームレスクローニング法によりphU6ベクターのU6プロモーターの下流に挿入し、gRNAを発現するphU6-λn-gRNAを作製した。mScarletをシームレスクローニング法によりpPOLIベクターのRNAポリメラーゼIプロモーターの下流に挿入し、mScarletのRNA（template RNA）を発現するpPOLI-mScarletを作製した。mCeruleanをシームレスクローニング法によりpcDNA3ベクターにサブクローニングし、mCeruleanのmRNA（target RNA）を発現するpcDNA3-mCeruleanを作製した。本実験にはPB2(679)-λn、PB2(679)-λnからcap結合ドメインを削除したPB2(679-dCBD)-λn 1、PB2(679-dCBD)-λn 2、cap結合ドメインをλnに置換したPB2(320-λn-480)、の4種のPB2を用いた（図５のドメイン構造を参照）。PB2(679)-λnにおいてはcapとの結合能を抑制するためE361AおよびF404Aのアミノ酸変異を入れた。各種PB2変異体のプラスミドはシームレスクローニング法で作製した。モル比が以下のようになるよう７種のプラスミド（トータル 4.8 μg）を400 μLのOptiMEM培地中でトランスフェクション試薬と混合した。pcDNA3-PA: 1, pcDNA3-PB1: 1, pcDNA3-PB2: 1, pcDNA3-NP: 1, pcDNA3-mCerulean: 0.25, pPOLI-mScarlet: 1, phU6-λn-gRNA: 40。混合溶液を２０分間室温で静置した後、HEK293T細胞を培養中のDMEM培地（抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）および10% FBS含有）に添加しトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、共焦点レーザー顕微鏡でmScarletの赤色蛍光を観察した。RNA編集が起こり赤色蛍光を発する細胞を確認した。蛍光画像を図５に示す。
青色蛍光タンパク質mCeruleanのmRNAを赤色蛍光タンパク質mScarletのmRNAに書き換えるRNA編集を細胞内で行った。編集が起これば赤色蛍光が観察される（図５）。A型インフルエンザウイルスのNP（配列番号６）をシームレスクローニング法によりpcDNA3ベクターにサブクローニングし、pcDNA3-NPを作製した。Box B配列を含むgRNA配列をシームレスクローニング法によりphU6ベクターのU6プロモーターの下流に挿入し、gRNAを発現するphU6-λn-gRNAを作製した。mScarletをシームレスクローニング法によりpPOLIベクターのRNAポリメラーゼIプロモーターの下流に挿入し、mScarletのRNA（template RNA）を発現するpPOLI-mScarletを作製した。mCeruleanをシームレスクローニング法によりpcDNA3ベクターにサブクローニングし、mCeruleanのmRNA（target RNA）を発現するpcDNA3-mCeruleanを作製した。本実験にはPB2(679)-λn、PB2(679)-λnからcap結合ドメインを削除したPB2(679-dCBD)-λn 1、PB2(679-dCBD)-λn 2、cap結合ドメインをλnに置換したPB2(320-λn-480)、の4種のPB2を用いた（図５のドメイン構造を参照）。PB2(679)-λnにおいてはcapとの結合能を抑制するためE361AおよびF404Aのアミノ酸変異を入れた。各種PB2変異体のプラスミドはシームレスクローニング法で作製した。モル比が以下のようになるよう７種のプラスミド（トータル 4.8 μg）を400 μLのOptiMEM培地中でトランスフェクション試薬と混合した。pcDNA3-PA: 1, pcDNA3-PB1: 1, pcDNA3-PB2: 1, pcDNA3-NP: 1, pcDNA3-mCerulean: 0.25, pPOLI-mScarlet: 1, phU6-λn-gRNA: 40。混合溶液を２０分間室温で静置した後、HEK293T細胞を培養中のDMEM培地（抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）および10% FBS含有）に添加しトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、共焦点レーザー顕微鏡でmScarletの赤色蛍光を観察した。RNA編集が起こり赤色蛍光を発する細胞を確認した。蛍光画像を図５に示す。
【0084】
（６）L7Ae-Box C/Dの相互作用を利用したin vivo（細胞内）でのRNA編集
（５）と同様の青色蛍光タンパク質mCeruleanのmRNAを赤色蛍光タンパク質mScarletのmRNAに書き換えるRNA編集をL7Ae-Box C/Dの相互作用を利用して細胞内で行った。Box C/D配列を含むgRNA配列をシームレスクローニング法によりphU6ベクターのU6プロモーターの下流に挿入し、gRNAを発現するphU6-L7Ae-gRNAを作製した。本実験にはcap結合ドメインをL7Aeに置換したPB2(245-L7Ae-527)、PB2(318-L7Ae-494)の2種のPB2を用いた（図６のドメイン構造を参照）。各種PB2変異体のプラスミドはシームレスクローニング法で作製した。L7Aeのアミノ酸配列を配列番号７に示す。モル比が以下のようになるよう７種のプラスミド（トータル 4.8 μg）を400 μLのOptiMEM培地中でトランスフェクション試薬と混合した。pcDNA3-PA: 1, pcDNA3-PB1: 1, pcDNA3-PB2: 1, pcDNA3-NP: 1, pcDNA3-mCerulean: 0.25, pPOLI-mScarlet: 1, phU6-L7Ae-gRNA: 40。混合溶液を２０分間室温で静置した後、HEK293T細胞を培養中のDMEM培地（抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）および10% FBS含有）に添加しトランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後、共焦点レーザー顕微鏡でmScarletの赤色蛍光を観察した。RNA編集が起こり赤色蛍光を発する細胞を確認した。蛍光画像を図６に示す。
（５）と同様の青色蛍光タンパク質mCeruleanのmRNAを赤色蛍光タンパク質mScarletのmRNAに書き換えるRNA編集をL7Ae-Box C/Dの相互作用を利用して細胞内で行った。Box C/D配列を含むgRNA配列をシームレスクローニング法によりphU6ベクターのU6プロモーターの下流に挿入し、gRNAを発現するphU6-L7Ae-gRNAを作製した。本実験にはcap結合ドメインをL7Aeに置換したPB2(245-L7Ae-527)、PB2(318-L7Ae-494)の2種のPB2を用いた（図６のドメイン構造を参照）。各種PB2変異体のプラスミドはシームレスクローニング法で作製した。L7Aeのアミノ酸配列を配列番号７に示す。モル比が以下のようになるよう７種のプラスミド（トータル 4.8 μg）を400 μLのOptiMEM培地中でトランスフェクション試薬と混合した。pcDNA3-PA: 1, pcDNA3-PB1: 1, pcDNA3-PB2: 1, pcDNA3-NP: 1, pcDNA3-mCerulean: 0.25, pPOLI-mScarlet: 1, phU6-L7Ae-gRNA: 40。混合溶液を２０分間室温で静置した後、HEK293T細胞を培養中のDMEM培地（抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）および10% FBS含有）に添加しトランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後、共焦点レーザー顕微鏡でmScarletの赤色蛍光を観察した。RNA編集が起こり赤色蛍光を発する細胞を確認した。蛍光画像を図６に示す。
【0085】
（７）dCas13b-crRNAの相互作用を利用したin vivo（細胞内）でのRNA編集
（５）と同様の青色蛍光タンパク質mCeruleanのmRNAを赤色蛍光タンパク質mScarletのmRNAに書き換えるRNA編集をdCas13b-crRNAの相互作用を利用して細胞内で行った。crRNA配列を含むgRNA配列をシームレスクローニング法によりphU6ベクターのU6プロモーターの下流に挿入し、gRNAを発現するphU6-crRNAを作製した。本実験にはPB2(679)-dCas13b、PB2(679)-dCas13bからcap結合ドメインを削除したPB2(679-dCBD)-dCas13b 1、PB2(679-dCBD)-dCas13b 2の３種のPB2を用いた（図７のドメイン構造を参照）。PB2(679)-dCas13bにおいてはcapとの結合能を抑制するためE361AおよびF404Aのアミノ酸変異を入れた。各種PB2変異体のプラスミドはシームレスクローニング法で作製した。dCas13b のアミノ酸配列を配列番号８に示す。モル比が以下のようになるよう７種のプラスミド（トータル 4.8 μg）を400 μLのOptiMEM培地中でトランスフェクション試薬と混合した。pcDNA3-PA: 1, pcDNA3-PB1: 1, pcDNA3-PB2: 1, pcDNA3-NP: 1, pcDNA3-mCerulean: 0.25, pPOLI-mScarlet: 1, phU6-crRNA: 40。混合溶液を２０分間室温で静置した後、HEK293T細胞を培養中のDMEM培地（抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）および10% FBS含有）に添加しトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、共焦点レーザー顕微鏡でmScarletの赤色蛍光を観察した。RNA編集が起こり赤色蛍光を発する細胞を確認した。蛍光画像を図７に示す。
（５）と同様の青色蛍光タンパク質mCeruleanのmRNAを赤色蛍光タンパク質mScarletのmRNAに書き換えるRNA編集をdCas13b-crRNAの相互作用を利用して細胞内で行った。crRNA配列を含むgRNA配列をシームレスクローニング法によりphU6ベクターのU6プロモーターの下流に挿入し、gRNAを発現するphU6-crRNAを作製した。本実験にはPB2(679)-dCas13b、PB2(679)-dCas13bからcap結合ドメインを削除したPB2(679-dCBD)-dCas13b 1、PB2(679-dCBD)-dCas13b 2の３種のPB2を用いた（図７のドメイン構造を参照）。PB2(679)-dCas13bにおいてはcapとの結合能を抑制するためE361AおよびF404Aのアミノ酸変異を入れた。各種PB2変異体のプラスミドはシームレスクローニング法で作製した。dCas13b のアミノ酸配列を配列番号８に示す。モル比が以下のようになるよう７種のプラスミド（トータル 4.8 μg）を400 μLのOptiMEM培地中でトランスフェクション試薬と混合した。pcDNA3-PA: 1, pcDNA3-PB1: 1, pcDNA3-PB2: 1, pcDNA3-NP: 1, pcDNA3-mCerulean: 0.25, pPOLI-mScarlet: 1, phU6-crRNA: 40。混合溶液を２０分間室温で静置した後、HEK293T細胞を培養中のDMEM培地（抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）および10% FBS含有）に添加しトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、共焦点レーザー顕微鏡でmScarletの赤色蛍光を観察した。RNA編集が起こり赤色蛍光を発する細胞を確認した。蛍光画像を図７に示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【配列表】