知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ミルテニー バイオテック ベー．フェー． ウント コー． カー・ゲーの特許一覧
特開2023-48150異なった形で切断可能なリンカーを有する標識プローブならびにＤＮＡおよびＲＮＡ分子の解読におけるそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023048150
(43)【公開日】2023-04-06
(54)【発明の名称】異なった形で切断可能なリンカーを有する標識プローブならびにＤＮＡおよびＲＮＡ分子の解読におけるそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6813 20180101AFI20230330BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20230330BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230330BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230330BHJP
C40B 40/06 20060101ALN20230330BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6813 Z
C12Q1/6876 Z
C12Q1/6869 Z
C12N15/11 Z
C40B40/06
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022152661
(22)【出願日】2022-09-26
(31)【優先権主張番号】21199038
(32)【優先日】2021-09-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】520094891
【氏名又は名称】ミルテニー バイオテック ベー．フェー． ウント コー． カー・ゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．Ｖ． ＆ Ｃｏ． ＫＧ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ－Ｅｂｅｒｔ－Ｓｔｒａｓｓｅ ６８， ５１４２９ Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(72)【発明者】
【氏名】モング サノ
(72)【発明者】
【氏名】ミシェル ペルボス
(72)【発明者】
【氏名】ロバート ピナード
(72)【発明者】
【氏名】シャオ－ペイ グアン
(72)【発明者】
【氏名】サメハ ソリマン
(72)【発明者】
【氏名】エミリー ニール
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR43
4B063QR48
4B063QR55
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ハイブリダイゼーション及び脱ハイブリダイゼーションラウンドの繰返しを最小限に抑えて標的ＤＮＡ及びＲＮＡ分子を解読するための迅速かつハイスループットのプロセスを提供する。
【解決手段】ａ）特定の構造と配列を有するプローブのライブラリー、及び切断可能なリンカー群を含み、ｂ）ハイブリダイズしていないプローブを除去すると共に、ハイブリダイズしたプローブをフルオロフォアによって第１の画像として検出し、ｃ）ハイブリダイズしたプローブからリンカー群を順次切断・除去すると共に、残りのハイブリダイズしたプローブを第２の画像として検出し、ｄ）第１及び第２の画像を比較して、除去されたフルオロフォアを検出する、そして、ｅ）除去されたフルオロフォアに関連するプローブの配列情報によって標的配列の配列情報の一部を得ること、ｆ）リンカーの全ての群が切断されるまで工程ｃ）を繰り返すこと、によって標的配列を検出する。
【選択図】なし
【解決手段】ａ）特定の構造と配列を有するプローブのライブラリー、及び切断可能なリンカー群を含み、ｂ）ハイブリダイズしていないプローブを除去すると共に、ハイブリダイズしたプローブをフルオロフォアによって第１の画像として検出し、ｃ）ハイブリダイズしたプローブからリンカー群を順次切断・除去すると共に、残りのハイブリダイズしたプローブを第２の画像として検出し、ｄ）第１及び第２の画像を比較して、除去されたフルオロフォアを検出する、そして、ｅ）除去されたフルオロフォアに関連するプローブの配列情報によって標的配列の配列情報の一部を得ること、ｆ）リンカーの全ての群が切断されるまで工程ｃ）を繰り返すこと、によって標的配列を検出する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）一般式（Ｉ）
Ｐ－（ＣＬ－Ｄ）ｘ （Ｉ）
［式中、Ｐ：少なくとも１０個のヌクレオチドまたはアミノ酸を有するプローブ
ＣＬ：切断可能なリンカー
Ｄ：蛍光色素
Ｘ：１～５の整数である］
を有するプローブのライブラリーをＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列にハイブリダイズさせること、ここで、前記ライブラリーが、ヌクレオチドまたはアミノ酸の異なる配列を有するプローブＰおよび異なる手段で切断可能な異なる群の切断可能なリンカーＣＬを含み、
ｂ）ハイブリダイズしていないプローブを除去するとともに、ハイブリダイズした前記プローブを第１の画像でフルオロフォアＤによって検出すること、
ｃ）前記ハイブリダイズしたプローブから化学リンカーＣＬの各群を異なる手段によって順次切断し、このようにして切断された前記フルオロフォアＤを除去するとともに、残りの前記ハイブリダイズしたプローブを第２の画像でそれらのフルオロフォアＤによって検出すること、
ｄ）前記第１および第２の画像を比較することによって、除去された前記フルオロフォアＤを検出すること、
ｅ）前記除去されたフルオロフォアＤに関連する前記プローブＰの配列情報によって前記標的配列の配列情報の一部を得ること、
ｆ）化学リンカーＣＬの全ての群が切断されるまで、工程ｃ）を繰り返すこと
によってＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列を検出するための方法。
Ｐ－（ＣＬ－Ｄ）ｘ （Ｉ）
［式中、Ｐ：少なくとも１０個のヌクレオチドまたはアミノ酸を有するプローブ
ＣＬ：切断可能なリンカー
Ｄ：蛍光色素
Ｘ：１～５の整数である］
を有するプローブのライブラリーをＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列にハイブリダイズさせること、ここで、前記ライブラリーが、ヌクレオチドまたはアミノ酸の異なる配列を有するプローブＰおよび異なる手段で切断可能な異なる群の切断可能なリンカーＣＬを含み、
ｂ）ハイブリダイズしていないプローブを除去するとともに、ハイブリダイズした前記プローブを第１の画像でフルオロフォアＤによって検出すること、
ｃ）前記ハイブリダイズしたプローブから化学リンカーＣＬの各群を異なる手段によって順次切断し、このようにして切断された前記フルオロフォアＤを除去するとともに、残りの前記ハイブリダイズしたプローブを第２の画像でそれらのフルオロフォアＤによって検出すること、
ｄ）前記第１および第２の画像を比較することによって、除去された前記フルオロフォアＤを検出すること、
ｅ）前記除去されたフルオロフォアＤに関連する前記プローブＰの配列情報によって前記標的配列の配列情報の一部を得ること、
ｆ）化学リンカーＣＬの全ての群が切断されるまで、工程ｃ）を繰り返すこと
によってＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列を検出するための方法。
【請求項2】
工程ｆ）の後に前記プローブＰを前記ＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列から脱ハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記ＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列の前記配列情報が得られるまで、工程ａ）～ｆ）を繰り返すことを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項4】
前記切断可能なリンカーＣＬが、化学的、光化学的または酵素的な手段によって切断可能であることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項5】
前記切断可能なリンカーＣＬが、多糖、タンパク質、ペプチド、デプシペプチド、ポリエステル、核酸およびそれらの誘導体からなる群から選択される酵素的に切断可能なリンカーであることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項6】
前記多糖が、デキストラン、プルラン、イヌリン、アミロース、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、グルコマンナン、ペクチン、キトサンおよびキチンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項7】
前記切断可能なリンカーＣＬが、ジスルフィドリンカー（－ＳＳ－、（ａ））、オキシメチレンジスルフィド（－ＯＣＨ２ＳＳＣＲ１Ｒ２－、（ｂ））、オキシメチンアジド（－ＣＲ１，Ｒ２ＯＣＨ（Ｎ３）Ｒ３，Ｒ４）－、（ｃ））、アゾアレーン（－ＡｒＮ＝ＮＡｒ－、（ｄ））、ニトロベンジル誘導体（ｅ）、アリル誘導体（ｆ）、チオカルバメート（ｇ）からなる群から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、独立してＨ、メチル、エチル、プロピル、ｔ－ブチル、Ｃ５～Ｃ１０アルキル、アルケン、アルキン、ヒドロキシル、ハロゲン、アミン、アミド、カルボキシレート、ポリエチレングリコールであり得ることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項8】
前記ライブラリーが、２つの異なる光化学活性化放射線、２つの異なる酵素、２つの異なる化学物質、１つの光化学活性化放射線および１つの酵素、１つの光化学活性化放射線および１つの化学物質、１つの酵素および１つの化学物質からなる群から選択される２つの異なる手段によって切断可能である切断可能なリンカーＣＬの少なくとも２つの異なる群を有するプローブを含むことを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の背景
本発明は、切断可能なリンカー（ＣＬ）を介して蛍光標識またはタグにコンジュゲートした標識ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせることによってＤＮＡおよびＲＮＡ分子を解読する新たな方法に関する。異なるリンカーによって標識にコンジュゲートしたＤＮＡプローブのライブラリーは、異なる条件および予測可能な様式で選択的に切断することができる。
本発明は、切断可能なリンカー（ＣＬ）を介して蛍光標識またはタグにコンジュゲートした標識ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせることによってＤＮＡおよびＲＮＡ分子を解読する新たな方法に関する。異なるリンカーによって標識にコンジュゲートしたＤＮＡプローブのライブラリーは、異なる条件および予測可能な様式で選択的に切断することができる。
【0002】
標識プローブは、近代生物学および医学において多くの用途を有する。例えば、標識ＤＮＡプローブは、ハイブリダイゼーションによるＤＮＡまたはＲＮＡの特定の標的配列の検出に使用される。これらは、数例を挙げると、ＤＮＡマイクロアレイ技術、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の特定の配列のｉｎ ｓｉｔｕ検出（例えばＦＩＳＨ）、およびライゲーションによるＤＮＡシークエンシングの基礎となる。同様に、標識抗体が特定の抗原標的の検出に使用される。
【0003】
従来、蛍光レポーター単位を有する標識ＤＮＡプローブは、安定したリンカーを介してプローブに付着する。かかる標識プローブを使用する場合、プローブは、より高い温度、低塩、ホルムアミドの使用、高ｐＨ等の脱ハイブリダイゼーション条件下でのみ除去することができる。複数の標的をプローブするには、この方法は、複数ラウンドのハイブリダイゼーションおよび脱ハイブリダイゼーション工程を必要とする。どちらの工程にも比較的時間がかかる。通例、各工程にはプローブの複雑さおよび長さに応じて３０分～一晩の反応が必要とされる。
【0004】
さらに、これらの工程を行うために用いられる比較的厳しい条件が核酸標的、および標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が固定された基質、例えば組織、表面コーティング等に損傷を与える恐れがある。したがって、行うことができるハイブリダイゼーション－脱ハイブリダイゼーション工程の反復サイクルの回数が制限される可能性がある。この場合、スループットは、使用する色素の数、ならびに用いられるハイブリダイゼーションおよび脱ハイブリダイゼーション工程のラウンド数によって異なる。どちらも制限要因となり得る。同じ問題が、抗体、細胞性炭水化物およびペプチド等の他の生体分子の検出にも依然として見られる。
【0005】
したがって、本発明の目的は、ハイブリダイゼーションおよび脱ハイブリダイゼーションラウンドの繰返しを最小限に抑えて標的ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を解読するための迅速かつハイスループットのプロセスを提供することである。
【0006】
ハイブリダイゼーションによるＲＮＡシークエンシング（ＳＢＳ）技術における現行の技術水準は、切断不可能なリンカーを有する標識ＤＮＡプローブの使用および／または無差別に切断可能なジスルフィドリンカーの使用を伴う。したがって、現行の方法では、解読のスループットを向上させるための段階的な切断および連続的な切断工程によるパターン生成は可能ではない。これらの方法は、蛍光レポーターを標的から除去するために脱ハイブリダイゼーションまたは一段階切断のみに依存する。したがって、当然ながらスループットおよび用途が限られる。これらの方法は、脱ハイブリダイゼーション工程を用いた処理の繰返しによる組織の分解のために、ｉｎ ｓｉｔｕシークエンシングおよび空間トランスクリプトミクス研究に使用される場合等に或る特定の表面化学物質またはマトリックスに適合しない可能性がある。
【0007】
例えば、国際公開第２０１５０５４０５０号には、プローブが切断されるが、各切断工程が同じように行われる、複数の標的をプロービングするための方法が開示されている。したがって、切断工程は、異なるプローブの区別には使用されない。
【0008】
発明の概要
標識プローブのライブラリーが、プローブと標識との間の異なる切断可能なリンカーで構成される場合、標識分子の連続的な除去を予測可能かつ制御可能な様式で達成することができることが見出された。
標識プローブのライブラリーが、プローブと標識との間の異なる切断可能なリンカーで構成される場合、標識分子の連続的な除去を予測可能かつ制御可能な様式で達成することができることが見出された。
【0009】
したがって、本発明の目的は、
ａ）一般式（Ｉ）
Ｐ－（ＣＬ－Ｄ）ｘ （Ｉ）
［式中、Ｐ：少なくとも１０個のヌクレオチドまたはアミノ酸を有するプローブ
ＣＬ：切断可能なリンカー
Ｄ：蛍光色素
Ｘ：１～５の整数である］
を有するプローブのライブラリーをＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列にハイブリダイズさせることであって、ライブラリーが、ヌクレオチドまたはアミノ酸の異なる配列を有するプローブＰおよび異なる手段で切断可能な異なる群の切断可能なリンカーＣＬを含む、ハイブリダイズさせること、
ｂ）ハイブリダイズしていないプローブを除去するとともに、ハイブリダイズしたプローブを第１の画像でフルオロフォアＤによって検出すること、
ｃ）ハイブリダイズしたプローブから化学リンカーＣＬの各群を異なる手段によって順次切断し、このようにして切断されたフルオロフォアＤを除去するとともに、残りのハイブリダイズしたプローブを第２の画像でそれらのフルオロフォアＤによって検出すること、
ｄ）第１および第２の画像を比較することによって、除去されたフルオロフォアＤを検出すること、
ｅ）除去されたフルオロフォアＤに関連するプローブＰの配列情報によって標的配列の配列情報の一部を得ること、
ｆ）化学リンカーＣＬの全ての群が切断されるまで、工程ｃ）を繰り返すこと
によってＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列を検出するための方法である。
ａ）一般式（Ｉ）
Ｐ－（ＣＬ－Ｄ）ｘ （Ｉ）
［式中、Ｐ：少なくとも１０個のヌクレオチドまたはアミノ酸を有するプローブ
ＣＬ：切断可能なリンカー
Ｄ：蛍光色素
Ｘ：１～５の整数である］
を有するプローブのライブラリーをＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列にハイブリダイズさせることであって、ライブラリーが、ヌクレオチドまたはアミノ酸の異なる配列を有するプローブＰおよび異なる手段で切断可能な異なる群の切断可能なリンカーＣＬを含む、ハイブリダイズさせること、
ｂ）ハイブリダイズしていないプローブを除去するとともに、ハイブリダイズしたプローブを第１の画像でフルオロフォアＤによって検出すること、
ｃ）ハイブリダイズしたプローブから化学リンカーＣＬの各群を異なる手段によって順次切断し、このようにして切断されたフルオロフォアＤを除去するとともに、残りのハイブリダイズしたプローブを第２の画像でそれらのフルオロフォアＤによって検出すること、
ｄ）第１および第２の画像を比較することによって、除去されたフルオロフォアＤを検出すること、
ｅ）除去されたフルオロフォアＤに関連するプローブＰの配列情報によって標的配列の配列情報の一部を得ること、
ｆ）化学リンカーＣＬの全ての群が切断されるまで、工程ｃ）を繰り返すこと
によってＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列を検出するための方法である。
【0010】
本発明の方法の重要な特徴は、化学的、光化学的、電気化学的および／または酵素的な手段によって異なる条件で迅速な切断を可能にする切断可能なリンカー（ＣＬ）のセットまたは群を介してレポーター分子またはタグが付着している標識プローブのライブラリーの使用である。切断化学がＤＮＡプローブの脱ハイブリダイズよりもはるかに速いため、この方法は、本質的により迅速なＲＮＡまたはＤＮＡ標的の解読方法である。
【0011】
標識の連続的な除去により、個々の切断工程の前後の蛍光シグネチャーを比較することで標的配列を解明することができる。この方法の主な利点は、ハイブリダイゼーションの各ラウンドでより多くのＤＮＡおよびＲＮＡ標的を解読する能力である。また、ハイブリダイゼーションの反復サイクルと連続的な切断工程との組合せ、および新たなプローブのセットを用いた再ハイブリダイゼーションによって、多数の標的遺伝子を解読することができる。
【0012】
この新たなクラスのＤＮＡプローブは、異なった形で切断可能なリンカー（differentially cleavable linker）－ＤＮＡプローブ：ＤＣＬ－ＤＮＡプローブと称される。本発明の方法では、ＤＣＬ－ＤＮＡプローブのライブラリーを標的への配列特異的結合のためにハイブリダイズさせる。最初の蛍光画像化後に、サンプルを異なる切断試薬で順に処理する。切断処理の各ラウンド後に更なる蛍光画像を撮影する。或る特定の蛍光シグナルが消滅する切断工程の前後の蛍光シグナルの変化から標的配列を解読する。従来の方法では、検出することができる標的の数は、蛍光色素の数によって決まる。本発明の方法では、異なる切断可能なリンカーへのカップリングおよび切断試薬に対するそれらの応答差により、個々の色素の各々から複数の標的を検出することができる。この新たな方法を用いた場合、従来のハイブリダイゼーション方法と比較して極めて多くの標的を限られた色素数で検出することができた。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】異なって切断可能なリンカーを介して３つの異なる色素（青色、黄色および赤色）のみで標識したＤＮＡバーコードを用いた単一事象のハイブリダイゼーションによって９つのＲＮＡ標的をどのように検出することができるかを概略的に示す図である。従来技術の方法では、３つの色素によって３つの標的しか区別することができない。この新たな方法では、ＲＮＡ１、ＲＮＡ２およびＲＮＡ３は同じ青色チャネルで蛍光を発するが、切断試薬に対する応答によって互いに区別される。ＲＮＡ２およびＲＮＡ３の蛍光は、それぞれ切断試薬１および２で処理した場合に消滅する。一方、ＲＮＡ１は、切断不可能なリンカー（ＮＣ）によって色素にカップリングしているため影響を受けなかった。同様に、他のＲＮＡ標的（ＲＮＡ４～９）を黄色および赤色のチャネルで検出することができる。
【図2a】ＤＣＬ－ＤＮＡプローブの一般構造を示す図である。ＣＬ＝切断可能なリンカー、ＥｎＣＬ＝酵素的に切断可能なリンカー。Ｄ／Ｔ＝蛍光色素または分子タグ。
【図2b】幾つかの切断可能な官能基、例えばジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）、オキシメチレンジスルフィド（－ＯＣＨ２－ＳＳ－）、アジドメチン（azidomethine）（－ＯＣＨ－Ｎ３－）、アゾアレーン（－ＡｒＮ＝ＮＡｒ－）、ジアール（－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－）、光切断可能なニトロベンジルおよび酵素的に切断可能なリンカーを示す図である。
【図2c】切断可能なリンカーを有するＤＣＬ－ＤＮＡプローブの幾つかの代表的な構造を示す図である。異なる切断可能なリンカーを介して単一の蛍光色素によって複数のＤＮＡプローブをどのように標識することができるかも示す。
【図3】図３（Ａ）は、様々な切断可能なリンカーを組み合わせ、１つ以上の標識によって標識することで作製することができる、異なった形で切断可能な連結した標識ＤＮＡプローブのライブラリーセット（ＤＣＬ－ＤＮＡプローブセット）の概略図であり、図３（Ｂ）は、幾つかの代表的な概略構造を示す図である。
【図4】３つの蛍光色素のみを用いたＤＣＬ－ＤＮＡプローブでの一段階ハイブリダイゼーションによって２４個の標的をどのように検出することができるかを示す図である。従来の方法では、３つの色素で標識されたＤＮＡプローブによって、３個の標的しかプローブすることができず、２４個の標的をプローブすることはできない。
【図5】標的の更なる配列を解読するＤＮＡプローブハイブリダイゼーション方法後に使用され得る２つの可逆的ヌクレオチドターミネーターの部分構造を示す図である。ハイブリダイゼーションと合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）化学との組合せにより、標的配列検出のスループットを劇的に向上させることができる。この図では、ＣＬは切断可能なリンカーを表し、３’－ＯＨキャッピング基は－ＣＨ２ＳＳＭｅおよび－ＣＨ２Ｎ３である。
【図6】４つの蛍光色素で標識されたＤＮＡプローブを用いた４色の様式で単一事象のハイブリダイゼーションによって３つのＤＮＡまたはＲＮＡ標的をどのように解読することができるかを示す図である。標的－１は、結合した全てのプローブが切断不可能なリンカー（ＮＣ）で連結したＤＮＡプローブであるため、３つの異なる切断条件で蛍光シグナルを保持する。標的－２および標的－３は、切断工程時に３つの色素を順次失うが（３つのプローブがＣＬ連結し、１つがＮＣ連結した標識ＤＮＡプローブである）、切断試薬での処理後に異なるパターンとなる。この色パターンから３つ全ての標的を特定することができる。この図ではＢ＝青色色素、Ｇ＝緑色色素、Ｙ＝黄色色素、Ｒ＝赤色色素である。
【図7】標識ＤＣＬ－ＤＮＡプローブおよび切断不可能な標識ＤＮＡプローブとタグとの組合せを単一事象のハイブリダイゼーションによる複数の標的の解読にどのように用いることができるかを示す図である。標的－１では、切断工程時に１つを除く全ての蛍光色素が除去され、そのプロービングは、他の蛍光シグネチャーの再出現を引き起こさない。一方、標的－２および標的－３の蛍光色素は、切断試薬での処理後に除去されるが（全てのプローブがＤＣＬ－ＤＮＡプローブである）、タグのプロービング後に蛍光シグネチャーが異なる様式で再出現する。標的－２は緑色および赤色で再出現し、標的－３は黄色および赤色で再出現する。様々な組合せ、ならびに切断可能な、切断不可能なおよびタグで標識したＤＮＡプローブを用いることで多数の標的遺伝子を解読することができた。この図ではＢ＝青色色素、Ｇ＝緑色色素、Ｙ＝黄色色素、Ｒ＝赤色色素である。
【図8】ホスフィンおよびチオールベースの切断試薬（例えばＤＭＰＳ）によって効果的に切断することができるオキシメチレンジスルフィド（－ＯＣＨ２ＳＳ－）リンカーを有するＤＣＬ－ＤＮＡプローブの合成のための化学反応工程を示す図である。
【図9】切断可能なアジドメチン（－ＯＣＨ－Ｎ３－）リンカーを有するＤＣＬ－ＤＮＡプローブの合成のための化学反応工程を示す図である。
【図10】本発明の方法に適したプローブを示す図である。
【図11】本発明の一般的なワークフローを示す図である。
【図12】染色結果を示す図である。
【図13】染色結果を示す図である。
【0014】
詳細な説明
ｓｅｑ－ＦＩＳＨ、ＭＥＲＳＩＳＨ法等のＤＮＡおよびＲＮＡ標的を解読する従来技術の方法では、蛍光標識ＤＮＡバーコードを用いることで最大ＦＮ個の標的をシークエンシングすることができ、ここでＦ＝フルオロフォアの数、Ｎ＝ハイブリダイゼーション工程の回数である。４つのフルオロフォアおよび５ラウンドのハイブリダイゼーションでは、４５＝１０２４個の標的しか検出することができない。
ｓｅｑ－ＦＩＳＨ、ＭＥＲＳＩＳＨ法等のＤＮＡおよびＲＮＡ標的を解読する従来技術の方法では、蛍光標識ＤＮＡバーコードを用いることで最大ＦＮ個の標的をシークエンシングすることができ、ここでＦ＝フルオロフォアの数、Ｎ＝ハイブリダイゼーション工程の回数である。４つのフルオロフォアおよび５ラウンドのハイブリダイゼーションでは、４５＝１０２４個の標的しか検出することができない。
【0015】
一方、本発明の方法では、同じ数の蛍光色素と４つの順次切断可能なリンカー（ＣＬ）を有するＤＣＬ－ＤＮＡプローブのライブラリーとを用いて、潜在的に（Ｆ×ＣＬ）Ｎ＝（４×４）５＝１０４８５７６個の標的を検出することができ、ここでＦ＝フルオロフォアの数、Ｎ＝ハイブリダイゼーション工程の回数、ＣＬ＝異なって切断可能なリンカーの数である。
【0016】
それだけでなく、ＤＣＬ－ＤＮＡプローブは、同じまたは異なる条件下で除去することができる単一または複数の蛍光レポーターを担持することができる。さらに、ＤＣＬ－ＤＮＡプローブは、二次相互作用によってプローブすることができるタグ付きＤＮＡプローブ、例えばビオチン、ハプテンまたは抗原標識等と組み合わせて使用してもよい。この組合せの数を考えると、検出可能な標的の数が劇的に増加し得る。さらに、任意に脱ハイブリダイゼーション工程を必要とするまたは必要としない、このハイブリダイゼーション方法は、解読プロセスを加速することができた。
【0017】
さらに、ハイブリダイゼーションおよび連続的な切断を含む本発明の方法におけるラウンドにより、検出および再ハイブリダイゼーション工程は複数のプローブをカバーし、この方法の解読力を指数関数的に増大させる。この方法は、他の従来の方法とは異なり、極めて多くのＤＮＡおよびＲＮＡ標的をシークエンシングすることができる。
【0018】
具体例は、ＲＮＡ転写産物のシークエンシングのための蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）方法および空間トランスクリプトミクス研究への使用であるが、これに限定されない。また、同じ切断可能なリンカーをマルチオミクス用途のためにタンパク質、抗体、抗原、炭水化物等の他の生体分子の検出に使用することができる。
【0019】
本発明は、最小限のハイブリダイゼーション工程を用いて核酸配列を検出する、より迅速な方法を提供する。サンプルをハイブリダイゼーション後、また各切断反応後に順に画像化して標的の差分パターンを生成し、これを核酸標的の解読に使用することができる。一般的なスキームを図１に示す。ここで、複数のＲＮＡ標的を同じ色のプローブとハイブリダイズさせるが（３つの青色：ＲＮＡ１～３、３つの赤色：ＲＮＡ４～６、３つの黄色：ＲＮＡ７～９）、異なる切断可能なリンカーを用いる。ＲＮＡ１、ＲＮＡ２およびＲＮＡ３は、同じ青色色素を有するが、異なる切断試薬に対して異なって応答する。ＲＮＡ１は同じ状態を保つが、ＲＮＡ２およびＲＮＡ３は、切断処理の異なる段階で消滅する。他のＲＮＡ標的についても同様である。切断試薬に対する応答により、同じ色素を有するにもかかわらず、これらのＲＮＡ標的を読み取ることができる。異なって切断可能なリンカーがなければ、３つの色素について９つの標的ではなく、３つのＲＮＡ標的しか解読することができない。
【0020】
現行の技術水準では、４色の標識ＤＮＡプローブを使用する場合、単一事象のハイブリダイゼーションでは、複数の色素の組合せを使用しても１６の解読可能性しか得ることができない：４色全てで１コード、３色で４コード、２色で６、１色で４、最後に無色で１。
【0021】
一方、４色および４つの異なって切断可能なリンカー、本ＤＣＬ－ＤＮＡプローブシステムを用いると、可能な全てのプローブを組み合わせた単一事象のハイブリダイゼーションと、その後の４回の選択的切断工程および分子プロービングとにより、解読能が１６（上記）から５００を超える可能性にまで上昇し得る。
【0022】
図２に、異なった形で切断可能なリンカーを有する標識ＤＮＡプローブ（ＤＣＬ－ＤＮＡプローブ）の概略図を示す。また、切断可能なリンカーの幾つかの代表的な構造（図２ｂ）、および多様なリンカーのセットを用いて単一の蛍光色素から標識ＤＮＡプローブのセットを作製するために切断可能なリンカーを使用することができる方法（図２ｃ）を示す。
【0023】
図３に、限定されるものではないが、切断可能（ＣＬ）、切断不可能（ＮＣ）、分子タグ（Ｔ）、およびＤＮＡ骨格上の複数のレポーターによる標識化の様々な組合せを用いてＤＣＬ－ＤＮＡプローブの大規模なライブラリーセットを構築することができる方法の一例を示す。
【0024】
図４に、僅か４つの色素を用いて単一のハイブリダイゼーション事象により２０個を超える標的をどのように読み取ることができるかを示す。従来技術の方法では、単一色素で標識されたプローブを用いて４つの色素から４つの標的しか検出することができない。一方、異なって切断可能なリンカーを用いることで、各色素によって複数の標的を検出することができる。この図では、標的５～８は、同じ青色色素標識によって標識されるが、異なる切断試薬に対する異なる応答によって区別される（この場合、色素は異なる切断条件で消滅する）。したがって、本発明は、各蛍光色素を複数の識別可能な色素に増やすのを助ける。例えば、７つの異なって切断可能なリンカーを使用することで、単一の青色色素を用いて７つの異なる標的を区別することができる。
【0025】
本発明による方法では、工程ｆ）の後にプローブＰをＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列から任意に脱ハイブリダイズする。
【0026】
さらに、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列の配列情報が得られるまで工程ａ）～ｆ）を繰り返すことができる。ＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の標的配列の配列情報の取得は、完全な（全部、１００％の）配列情報だけでなく、部分的な情報を含む。プローブの選択、すなわちプローブのヌクレオチドまたはタンパク質の選択によって情報量、ひいては方法の速度を制御することができる。情報の取得は、１０～１００％の範囲であり得るが、（９０～１００％のように）概ね完全な配列分析が好ましい。
【0027】
切断可能なリンカーを用いる本発明のハイブリダイゼーションベースの方法は、合成によるシークエンシング化学（ＳＢＳ化学）とさらに組み合わせることができる。ＳＢＳ化学は、ＤＣＬ－ＤＮＡプローブで読み取り、蛍光色素を切断した後に開始することができる。この場合、ＤＮＡプローブを標的から除去する必要なしにシークエンシングプライマーとして使用することができる。ＳＢＳ化学は、切断可能なリンカーを介して蛍光色素標識を有する可逆終端（reversibly terminating）ヌクレオチドの使用に依存する。ＤＣＬ－ＤＮＡプローブと組み合わせて使用することができる２つの代表的な可逆終端ヌクレオチドを図５に示す。ここで、ＣＬは蛍光色素を核酸塩基に連結する化学的に切断可能なリンカーを表し、３’－ＯＨ上のキャッピング基は、好ましくは－ＣＨ２ＳＳＭｅまたは－ＣＨ２Ｎ３である。切断可能なリンカーは、ＤＣＬリンカーと同じであっても、または異なっていてもよい。
【0028】
ＤＣＬ－ＤＮＡプローブは、切断不可能なレポーター基を有し、分子タグが付着したＤＮＡプローブとともに使用することもできる。タグは、二次相互作用による標的のプロービングを可能にする。この状況では、切断不可能な標識ＤＮＡプローブは、特定の標的配列を読み取るためだけでなく、内部対照としても使用することができる。タグは例えばビオチン、ジギトゲニン、抗原、ハプテン等であり得る。
【0029】
ＤＮＡプローブは、同じ切断可能なリンカーまたは異なる切断可能なリンカーを有する単一または複数の蛍光色素を含み得る。蛍光色素およびタグの組合せを含んでいてもよい。タグは、標識ストレプトアビジンとの相互作用によって検出されるＤＮＡ－ビオチンプローブ等のように二次相互作用によってプローブすることができる。
【0030】
「異なって切断可能なリンカー」、「異なる群のリンカー」、「多様なリンカー」という用語は、交換可能であり、制御可能かつ予測可能な様式で順に標識を除去することを可能にする異なる条件下で切断可能なリンカーのセットを指す。
【0031】
「異なる手段で切断可能である切断可能なリンカーＣＬ」という用語は、第１の方法で切断可能であるが、第２の方法では切断可能でない切断可能なリンカーＣＬを指す。切断のための異なる手段または方法により、標的を染色する異なる群のプローブの画像を順次撮影することが可能となる。
【0032】
本発明の方法では、切断可能なリンカーＣＬを切断する化学的、光化学的または酵素的な手段を用いることができる。例えば、ライブラリーは、２つの異なる光化学活性化放射線、２つの異なる酵素、２つの異なる化学物質、１つの光化学活性化放射線および１つの酵素、１つの光化学活性化放射線および１つの化学物質、１つの酵素および１つの化学物質からなる群から選択される２つの異なる手段によって切断可能である切断可能なリンカーＣＬの少なくとも２つの異なる群を有するプローブを含む。
【0033】
当然ながら、切断可能なリンカーＣＬは、本発明の要旨を逸脱することなく、３つ、４つまたは５つの異なる手段で切断可能であってもよい。例えば、２つの異なる酵素および２つの異なる化学物質、または４つの異なる化学物質を利用して４つの異なる脱染色画像を得ることが可能である。
【0034】
切断可能なリンカーＣＬは、例えば以下の式ａ）～ｇ）に示すように、ジスルフィドリンカー（－ＳＳ－、（ａ））、オキシメチレンジスルフィド（－ＯＣＨ２ＳＳＣＲ１Ｒ２－、（ｂ））、オキシメチンアジド（－ＣＲ１，Ｒ２ＯＣＨ（Ｎ３）Ｒ３，Ｒ４）－、（ｃ））、アゾアレーン（－ＡｒＮ＝ＮＡｒ－、（ｄ））、ニトロベンジル誘導体（ｅ）、アリル誘導体（ｆ）、チオカルバメート（ｇ）からなる群から選択することができ、ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立してＨ、メチル、エチル、プロピル、ｔ－ブチル、Ｃ５～Ｃ１０アルキル、アルケン、アルキン、ヒドロキシル、ハロゲン、アミン、アミド、カルボキシレート、ポリエチレングリコールであり得る。
【0035】
【化1】
【0036】
切断反応／化学は、切断可能なリンカー（ＣＬ）によって決まり、必要に応じて以下から選ぶことができる。
【0037】
ジスルフィドリンカーは、他のリンカーを無傷に保ったままチオールまたはホスフィンで処理することによって選択的に切断することができる。
【0038】
オキシメチンアジド（－ＯＣＨ（Ｎ３）－）は、アゾアレーン、光切断可能なまたは他の酵素的に切断可能なリンカーの存在下で、ホスフィン（例えばＴＣＥＰ）で処理した場合に選択的に切断することができる。
【0039】
代替的には、ＴＣＥＰを用いてジスルフィドおよびオキシメチンアジドリンカーの両方を切断することができる。さらに、アゾアレーンリンカーは、水溶液バッファー中の極めて穏やかな試薬である亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２ＳＯ４）で選択的に切断することができる。
【0040】
切断試薬は、チオール（例えばジチオスレイトール－ＤＴＴ、ジメルカプトプロパンスルホネート－ＤＭＰＳ等）、ホスフィン（例えばＴＣＥＰ、ＴＨＰＰ等）、穏やかな還元剤（例えばＮａ２Ｓ２Ｏ４）、特定の波長の光、電位、酵素（例えばペプチダーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、ホスファターゼ、プロテイナーゼ等）であり得る。
【0041】
酵素的に切断可能なリンカーは、ペプチダーゼのような特定の酵素によって切断または消化することができる任意の分子であり得る。例えば、多糖、タンパク質、ペプチド、デプシペプチド、ポリエステル、核酸およびそれらの誘導体が酵素的に分解可能なリンカーとして好適である。好適な多糖は、例えばデキストラン、プルラン、イヌリン、アミロース、セルロース、ヘミセルロース、例えばキシランもしくはグルコマンナン、ペクチン、キトサンまたはキチンである。これらを誘導体化して、リンカーの共有または非共有結合の官能基を得ることができる。酵素的に分解可能なリンカーとして使用されるタンパク質、ペプチドおよびデプシペプチドは、アミノ酸の側鎖官能基を介して官能基化することができる。酵素的に分解可能なリンカーとして使用されるポリエステル、ポリアクリルアミドおよびポリエステルアミドは、側鎖官能基をもたらすコモノマーを用いて合成するか、またはその後に官能基化することができる。分岐ポリエステルの場合、官能基化はカルボキシル、アミンまたはヒドロキシル末端基を介したものであり得る。ポリマー鎖の重合後の官能基化は、例えば不飽和結合への付加、すなわちチオレン反応によるものであっても、またはアジドアルキンもしくはテトラジンアルキンクリック反応によって、またはラジカル反応による官能基の導入によって行ってもよい。
【0042】
酵素的に分解可能なリンカーは、適切な酵素の添加によって分解される。切断試薬としての酵素の選択は、酵素的に分解可能なリンカーの化学的性質によって決定され、１つの酵素であっても、または異なる酵素の混合物であってもよい。かかる酵素はヒドロラーゼ、リアーゼ、レダクターゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ等であり得る。好ましい酵素は、グリコシダーゼ、デキストラナーゼ、プルラナーゼ、アミラーゼ、イヌリナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、キトサナーゼ、キチナーゼ、プロテイナーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、ピロホスファターゼ、リパーゼ、ホスファターゼおよびヌクレアーゼからなる群から選択することができる。
【0043】
本発明の方法は、２つ以上のプローブが特定の標的に結合するマルチプローブハイブリダイゼーション法とともに用いることができる。図６に、４つの蛍光色素で標識されたＤＮＡプローブを用いた４色の様式で、単一事象のハイブリダイゼーションおよび連続的な切断および画像化工程によって３つのＤＮＡ標的をどのように解読することができるかを示す。特定の遺伝子の呼び出しは、切断試薬に対する蛍光応答から、また最初の画像と切断試薬への曝露による後続の工程の蛍光の画像とを比較することによって得られる。標的－１は、全てが切断不可能なリンカー（ＮＣ）に連結したＤＮＡプローブであるため、３つの異なる切断条件で蛍光シグナルを保持する。標的－２および標的－３は、切断反応時に３つの色素を順次失うが、異なるパターンである。
【0044】
本発明の別の態様では、ＤＮＡプローブは、２つ以上の蛍光色素もしくはタグ、またはそれらの組合せを含み得る（図７）。この構成は、対象の色素を選択的に切断し、その後の工程でタグとの二次相互作用によって標的をプローブすることを可能にする。かかる組合せの使用を図７に示す。図７には、ＤＣＬと切断不可能な（ＮＣ）タグに連結した標識ＤＮＡプローブとを含む混合物でプローブすることによって３つの異なる標的をどのように区別することができるかを示す。３つの標的は、切断およびタグの分子プロービングに異なって応答する。標的－１は、切断試薬処理の際に１つを除く全ての蛍光シグナルを失い、分子プロービングに応答しない。一方、標的２および標的３は、全ての蛍光シグネチャーを失い、その後の付着したタグのプロービングに異なって応答した。様々な組合せと、切断可能な、切断不可能なおよびタグで標識したＤＮＡプローブとを用いることで、多数の標的遺伝子を解読することができた。
【0045】
本発明の別の態様では、蛍光色素を除去した後、プローブＤＮＡの遊離３’－ＯＨを、標識された可逆終端ヌクレオチドを用いた合成化学によって単一塩基伸長および付加的なシークエンシングの実行に用いることができる。可逆的ターミネーターヌクレオチドは、単一塩基伸長によって相補鎖合成を停止するが、３’－ＯＨキャッピング基を除去した後にさらに伸長させることができる。可逆終端ヌクレオチドは、図５に示す一般構造を有するメチルメチレンジスルフィド（－ＣＨ２ＳＳＭｅ）またはアジドメチル（－ＣＨ２Ｎ３）で３’－ＯＨキャッピングすることができる。これらのヌクレオチドは、ＤＮＡプローブ設計と同様にＤＣＬリンカーを含んでいてもよい。これらは独立して、またはＤＣＬ－プローブと組み合わせて使用することができる。
【0046】
本発明の別の態様では、ハイブリダイゼーションは、それぞれ特定の標的を有する異なるプローブの使用を含み、多色蛍光測定を伴う。各ハイブリダイゼーション事象に切断および画像工程の２回以上のサイクルを含んでいても、また各サイクル間に任意の脱ハイブリダイゼーション工程を有するハイブリダイゼーション－画像化－切断－画像化および再ハイブリダイゼーションサイクルの１回以上の工程を含んでいてもよい。二次相互作用によるプロービングの１回以上の工程を含んでいてもよく、ビオチン－ストレプトアビジン、ＤＩＧ－抗ＤＩＧ相互作用およびその後の画像化が２つの具体例であるが、これらに限定されない。
【0047】
プローブ、標識およびタグ
プローブは、通常の天然または非天然のＤＮＡまたはＲＮＡおよびそれらの修飾類似体であってもよく、すなわち天然または非天然のヌクレオチドからなる。プローブはタンパク質であってもよく、すなわち天然または非天然のアミノ酸からなる。ＤＮＡプローブは、より良好な二重鎖安定性をもたらすロック核酸であり得る。これらは３’もしくは５’末端に修飾を有していても、またはアミノ修飾を有するｄＵＴＰのように主骨格上の塩基のいずれかに修飾があってもよい。標識は蛍光分子（ローダミン色素（Ｒ６Ｇ、ＲＯＸ）、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５）、Ａｌｅｘａ色素、ＡＴＴＯ色素等）であっても、またはエネルギー移動色素もしくはクエンチャーであってもよい。分子タグはビオチン、ハプテン、抗原、ＤＩＧ、フルオレセイン、ニトロフェニル等、または二次相互作用（例えば蛍光標識を伴うビオチン－ＳＴＶ、抗体－抗原、ＤＩＧ－抗ＤＩＧ相互作用）によって特定される任意の修飾であり得る。ＤＣＬリンカーは、プロービングタンパク質上にあってもよい。
プローブは、通常の天然または非天然のＤＮＡまたはＲＮＡおよびそれらの修飾類似体であってもよく、すなわち天然または非天然のヌクレオチドからなる。プローブはタンパク質であってもよく、すなわち天然または非天然のアミノ酸からなる。ＤＮＡプローブは、より良好な二重鎖安定性をもたらすロック核酸であり得る。これらは３’もしくは５’末端に修飾を有していても、またはアミノ修飾を有するｄＵＴＰのように主骨格上の塩基のいずれかに修飾があってもよい。標識は蛍光分子（ローダミン色素（Ｒ６Ｇ、ＲＯＸ）、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５）、Ａｌｅｘａ色素、ＡＴＴＯ色素等）であっても、またはエネルギー移動色素もしくはクエンチャーであってもよい。分子タグはビオチン、ハプテン、抗原、ＤＩＧ、フルオレセイン、ニトロフェニル等、または二次相互作用（例えば蛍光標識を伴うビオチン－ＳＴＶ、抗体－抗原、ＤＩＧ－抗ＤＩＧ相互作用）によって特定される任意の修飾であり得る。ＤＣＬリンカーは、プロービングタンパク質上にあってもよい。
【0048】
標的配列および方法
標的配列はＤＮＡであっても、またはｍＲＮＡを含むＲＮＡであってもよい。これを蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または連続ＦＩＳＨ（ｓｅｑＦＩＳＨ）法に用いることができる。解読は、ビーズ上のクローン増幅されたＤＮＡクローン、表面結合したローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）産物もしくは組織、または単一分子、または空間分解された単一細胞に対するものであり得る。これらをｉｎ ｓｉｔｕまたはｅｘ ｓｉｔｕシークエンシングに用いることができる。解読方法は、解読能を高めるために複数ラウンドのハイブリダイゼーション工程を含んでいてもよい。解読方法は、標識ＤＮＡプローブの混合物を用いたハイブリダイゼーションに続く画像化、連続的な切断工程および画像化、ならびに二次相互作用による分子タグのプロービングを含み得る。標的はタンパク質、ペプチド、炭水化物、抗体および他の生体分子とすることができる。
標的配列はＤＮＡであっても、またはｍＲＮＡを含むＲＮＡであってもよい。これを蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または連続ＦＩＳＨ（ｓｅｑＦＩＳＨ）法に用いることができる。解読は、ビーズ上のクローン増幅されたＤＮＡクローン、表面結合したローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）産物もしくは組織、または単一分子、または空間分解された単一細胞に対するものであり得る。これらをｉｎ ｓｉｔｕまたはｅｘ ｓｉｔｕシークエンシングに用いることができる。解読方法は、解読能を高めるために複数ラウンドのハイブリダイゼーション工程を含んでいてもよい。解読方法は、標識ＤＮＡプローブの混合物を用いたハイブリダイゼーションに続く画像化、連続的な切断工程および画像化、ならびに二次相互作用による分子タグのプロービングを含み得る。標的はタンパク質、ペプチド、炭水化物、抗体および他の生体分子とすることができる。
【0049】
蛍光色素
好適な蛍光色素は蛍光技術、例えばフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法の技術分野で知られているものである。例えば、蛍光色素は、フルオレセインのようなキサンテン色素、またはローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素、カスケード色素、高分子色素、ピロメテン色素、アクリジン色素、オキサジアゾール色素、カルボピロニン色素、ベンゾピリリウム色素、フルオレン色素、またはＲｕ、Ｅｕ、Ｐｔ錯体等の有機金属錯体である。単一分子実体の他、有機小分子色素のクラスター、蛍光オリゴマーまたは蛍光ポリマー、例えばポリフルオレンも蛍光部分として使用することができる。さらに、蛍光色素は、フィコビリタンパク質等のタンパク質ベースのもの、量子ドット等のナノ粒子、アップコンバージョンナノ粒子、金ナノ粒子、染料ポリマーナノ粒子であってもよい。
好適な蛍光色素は蛍光技術、例えばフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法の技術分野で知られているものである。例えば、蛍光色素は、フルオレセインのようなキサンテン色素、またはローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素、カスケード色素、高分子色素、ピロメテン色素、アクリジン色素、オキサジアゾール色素、カルボピロニン色素、ベンゾピリリウム色素、フルオレン色素、またはＲｕ、Ｅｕ、Ｐｔ錯体等の有機金属錯体である。単一分子実体の他、有機小分子色素のクラスター、蛍光オリゴマーまたは蛍光ポリマー、例えばポリフルオレンも蛍光部分として使用することができる。さらに、蛍光色素は、フィコビリタンパク質等のタンパク質ベースのもの、量子ドット等のナノ粒子、アップコンバージョンナノ粒子、金ナノ粒子、染料ポリマーナノ粒子であってもよい。
【0050】
実施例
ｍＲＮＡシークエンシングへのＤＣＬ－ＤＮＡプローブの使用について概念実証を確立するために、複数のプローブのセットを合成した。一方はチオールで切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーであり、他方はホスフィンで切断可能なアジドメチルリンカーである。それらの合成は多段階の反応および精製を要する。切断可能なリンカーを初めに作製し、次いでアミノ修飾ＤＮＡプローブとコンジュゲートする。最終工程では、切断可能なリンカーのアミノ末端を用いてリンカーを蛍光色素によって標識した。
ｍＲＮＡシークエンシングへのＤＣＬ－ＤＮＡプローブの使用について概念実証を確立するために、複数のプローブのセットを合成した。一方はチオールで切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーであり、他方はホスフィンで切断可能なアジドメチルリンカーである。それらの合成は多段階の反応および精製を要する。切断可能なリンカーを初めに作製し、次いでアミノ修飾ＤＮＡプローブとコンジュゲートする。最終工程では、切断可能なリンカーのアミノ末端を用いてリンカーを蛍光色素によって標識した。
【0051】
切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを有するＤＣＬ－ＤＮＡプローブ（５）の合成
合成工程を図８に示す。ヌクレオチド類似体（Mong Marmaらの米国特許第１０，３０１，３４６号明細書、２０１６年）およびジスルフィドリンカーを有するヌクレオチド類似体を合成する方法（Mong Marmaらの米国特許第１０，３３６，７８５号明細書、２０１６年）の米国特許に記載されているように活性化リンカー２を得た。合成は以下の工程を含む（図８）：
（ａ）リンカーの導入およびＦｍｏｃ基の脱保護：
アミノ修飾ＤＮＡバーコード（ＢＣ－ＮＨ２、１）（約７００ｎｍｏｌ、供給元IDT DNA）を１．４ｍＬのＤＩ水に溶解し、５０ｍＬファルコンチューブに移した。これに０．３ｍＬの０．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を添加し、塩基濃度を約０．１ｍＭとした。別の２．０ｍＬ遠心分離管で約６ｍｇの活性化リンカー（ＮＨＳ－ＡＲＡ－Ｆｍｏｃリンカー、化合物２）を０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した。次いで、これをＢＣ－ＮＨ２溶液に添加し、室温で４５分間撹拌した。再び同量を０．５ｍＬのＤＭＦで添加し、さらに４５分間撹拌した。
合成工程を図８に示す。ヌクレオチド類似体（Mong Marmaらの米国特許第１０，３０１，３４６号明細書、２０１６年）およびジスルフィドリンカーを有するヌクレオチド類似体を合成する方法（Mong Marmaらの米国特許第１０，３３６，７８５号明細書、２０１６年）の米国特許に記載されているように活性化リンカー２を得た。合成は以下の工程を含む（図８）：
（ａ）リンカーの導入およびＦｍｏｃ基の脱保護：
アミノ修飾ＤＮＡバーコード（ＢＣ－ＮＨ２、１）（約７００ｎｍｏｌ、供給元IDT DNA）を１．４ｍＬのＤＩ水に溶解し、５０ｍＬファルコンチューブに移した。これに０．３ｍＬの０．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を添加し、塩基濃度を約０．１ｍＭとした。別の２．０ｍＬ遠心分離管で約６ｍｇの活性化リンカー（ＮＨＳ－ＡＲＡ－Ｆｍｏｃリンカー、化合物２）を０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した。次いで、これをＢＣ－ＮＨ２溶液に添加し、室温で４５分間撹拌した。再び同量を０．５ｍＬのＤＭＦで添加し、さらに４５分間撹拌した。
【0052】
次いで、これを２．０ｍＬのＤＩ水の添加によってクエンチした。混合物を続いて０．３ｍＬのピペリジンで２０分間処理した。生成物を即座にｐｒｅｐ－ＨＰＬＣ（Ｘ－ｂｒｉｄｇｅ、１９×２５０ｍｍカラム、方法：０～３分は１００％のＡ、続いて４０分にわたって４０％のＢ、その後５０分まで均一勾配）によって精製した。標的生成物は通常、約４３分で溶出した。標的画分を凍結乾燥し、固体生成物を１．０ｍＬのＤＩ水に懸濁し、濃度を２６０ｎｍでＵＶによって決定して、１６０ｎｍｏｌの化合物４（１．０ｍＬ×０．１６０ｍＭ）を得た。
【0053】
（ｂ）蛍光色素による標識化：
先の工程から得られたＢＣ－ＡＲＡ－ＮＨ２（化合物４）をＮａ２ＨＰＯ４塩で処理し（更なる希釈を回避するために塩を直接溶解した）、０．１ｍＭの最終濃度とした。次いで、これを２００ｕＬのＤＩ水（ＡＦ５３２－ＮＨＳ等の低極性色素については＋１００ｕＬのＤＭＦ）中の約１０当量のＮＨＳ色素で処理した。混合物を３０分間撹拌した後、即座にｐｒｅｐ－ＨＰＬＣ（Ｘ－ｂｒｉｄｇｅ、１９×２５０ｍｍカラム、方法：０～３分は１００％のＡ、続いて４０分にわたって４０％のＢ、その後５０分まで均一勾配）によって精製した。標的生成物５は約４０分で溶出した。次いで、標的画分を凍結乾燥し、最終生成物を１．０ｍＬのＲＮＡフリー水に溶解し、ＵＶスペクトル（色素の特性に基づく）によって濃度を決定した。次いで、生成物の濃度を調整し、０．１ｍＭのストック溶液を調製した。
先の工程から得られたＢＣ－ＡＲＡ－ＮＨ２（化合物４）をＮａ２ＨＰＯ４塩で処理し（更なる希釈を回避するために塩を直接溶解した）、０．１ｍＭの最終濃度とした。次いで、これを２００ｕＬのＤＩ水（ＡＦ５３２－ＮＨＳ等の低極性色素については＋１００ｕＬのＤＭＦ）中の約１０当量のＮＨＳ色素で処理した。混合物を３０分間撹拌した後、即座にｐｒｅｐ－ＨＰＬＣ（Ｘ－ｂｒｉｄｇｅ、１９×２５０ｍｍカラム、方法：０～３分は１００％のＡ、続いて４０分にわたって４０％のＢ、その後５０分まで均一勾配）によって精製した。標的生成物５は約４０分で溶出した。次いで、標的画分を凍結乾燥し、最終生成物を１．０ｍＬのＲＮＡフリー水に溶解し、ＵＶスペクトル（色素の特性に基づく）によって濃度を決定した。次いで、生成物の濃度を調整し、０．１ｍＭのストック溶液を調製した。
【0054】
切断可能なオキシメチンアジドリンカーを有するＤＣＬ－ＤＮＡプローブ（１１）の合成：切断可能なオキシアジドメチンリンカーを有するＤＣＬ－ＤＮＡプローブの合成は、図９に示すように市販の化合物６から開始する。以下の工程が含まれる：
（ａ）Ｆｍｏｃ保護リンカーの合成（７）
（ａ）リンカーの活性化（９）
（ｂ）アミノ修飾ＤＮＡプローブへのカップリング（１０）
（ｃ）蛍光色素へのカップリング（１１）
（ａ）Ｆｍｏｃ保護リンカーの合成（７）
（ａ）リンカーの活性化（９）
（ｂ）アミノ修飾ＤＮＡプローブへのカップリング（１０）
（ｃ）蛍光色素へのカップリング（１１）
【0055】
Ｆｍｏｃ保護リンカーの合成プロセス（７）およびＤＮＡプローブへのカップリングのためのリンカーの活性化（９）を以下に説明する。リンカーとＤＮＡプローブとのカップリング反応（１０）および標識プローブを作製するための最終的な標識化反応（１１）は、上記のオキシメチレンジスルフィドと同様に行った。
【0056】
無水ＤＭＦ（１２ｍＬ）中のＦｍｏｃ－ＮＨＳ（７６０ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ、１．２当量）および化合物６（７３４ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ、１当量）の溶液にＤＩＰＥＡ（０．６６ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、これをＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｍ ＨＣｌ（２０ｍＬ）でクエンチした。水層を分離し、ＥｔＯＡＣ（３×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（５×２０ｍＬ）およびブライン（飽和、２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ Ｓｉｌｉｃａ ２４ｇ Ｇｏｌｄ；勾配：ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０～３０％）、３５ｍＬ／分）によって精製して、所望の生成物７を白色の固体として得た（４８８ｍｇ、４４％）。次に、無水ＤＭＦ（８．３ｍＬ）中の化合物７（４８８ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ、１当量）の溶液にＤＩＰＥＡ（０．２２ｍＬ、１．３ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＤＳＣ（３１８ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、これを減圧下で濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ Ｓｉｌｉｃａ ２４ｇ Ｇｏｌｄ；勾配：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３０～１００％）、３５ｍＬ／分）によって精製して、所望の生成物８をシロップとして得た（４０８ｍｇ、７２％）。
【0057】
染色実験
４つの転写産物を標的とするプローブを６つの独自のハイブリダイゼーションドメインで設計した。プローブのうち２つが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートしたアジドリンカー（－ＯＣＨＮ３－）を有するオリゴヌクレオチドまたはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２にコンジュゲートしたジスルフィドリンカー（－ＯＣＨ２－ＳＳ－）を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする配列を含んでいた（図１Ａ）。対照とするために、プローブのうち２つは、２つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする２つの異なる結合領域を含むものであった（図１Ａ）。一方のプローブは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７を含むジスルフィドリンカーを有するオリゴヌクレオチドおよび切断不可能なＡｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ５３２を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする配列を含んでいた。他方のプローブは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２を含むアジドリンカーを有するオリゴヌクレオチドおよび切断不可能なＡｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ６４７を含むオリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイズする配列を含んでいた。ハイブリダイゼーションドメインにわたって２つの独立したフルオロフォアを有することで、この技術を複数の蛍光波長で評価することができた。
４つの転写産物を標的とするプローブを６つの独自のハイブリダイゼーションドメインで設計した。プローブのうち２つが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートしたアジドリンカー（－ＯＣＨＮ３－）を有するオリゴヌクレオチドまたはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２にコンジュゲートしたジスルフィドリンカー（－ＯＣＨ２－ＳＳ－）を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする配列を含んでいた（図１Ａ）。対照とするために、プローブのうち２つは、２つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする２つの異なる結合領域を含むものであった（図１Ａ）。一方のプローブは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７を含むジスルフィドリンカーを有するオリゴヌクレオチドおよび切断不可能なＡｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ５３２を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする配列を含んでいた。他方のプローブは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２を含むアジドリンカーを有するオリゴヌクレオチドおよび切断不可能なＡｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ６４７を含むオリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイズする配列を含んでいた。ハイブリダイゼーションドメインにわたって２つの独立したフルオロフォアを有することで、この技術を複数の蛍光波長で評価することができた。
【0058】
使用したプローブは、図１０による構造を有していた。
【0059】
次いで、プローブをＦＦＰＥマウス脳切片上でハイブリダイズさせ、続いてローリングサークル増幅を行ってロロニー、すなわちＤＮＡナノボールを生成し、シグナルをｉｎ ｓｉｔｕで検出するための増幅を行った（図１１）。６つ全ての相補的プローブ、すなわち読み出しプローブを、ロロニーを生成した後に同時にハイブリダイズさせた。
【0060】
次に、一連の連続的な化学的切断工程を行った。最初の切断工程では、ジスルフィドリンカーを含むオリゴヌクレオチドを選択的に切断するナトリウム２，３－ジメルカプトプロパンスルホネート一水和物（ＤＭＰＳ）を利用した。図１２に、アジドリンカーを介してオリゴヌクレオチドに付着したフルオロフォアを選択的に除去するためにＤＭＰＳを用いる２回の連続切断ラウンドの１回目を示す。どの点がラウンド間で除去されたシグナルを有するかを決定するのに十分なコントラストをもたらすために、全ての画像を擬似着色する（pseudocolored）。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２波長では、ＤＭＰＳによって切断された点は、マージ画像において黄色に見える（黄色の矢印）。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７波長では、ＤＭＰＳによって切断された点は、マージ画像において紫色に見える。ＤＭＰＳ切断によって影響を受けなかった対象は、両方の波長でマージ画像において白色に見える。
【0061】
これに続いて、アジドリンカーを含むオリゴヌクレオチドを切断するためにトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を用いた第２の切断を行った。図１３に、ジスルフィドリンカーを介してオリゴヌクレオチドに付着したフルオロフォアを選択的に除去するためにＴＣＥＰを用いる２回の連続切断ラウンドの２回目を示す。どの点がラウンド間で除去されたシグナルを有するかを決定するのに十分なコントラストをもたらすために、全ての画像を擬似着色する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２波長では、ＴＣＥＰによって切断された点は、マージ画像において紫色に見える（黄色の矢印）。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７波長では、ＴＣＥＰによって切断された点は、マージ画像において青色に見える。ＴＣＥＰ切断後には、切断不可能なオリゴヌクレオチドのみが検出可能なままであり、両方の波長でマージ画像において白色に見える。
【0062】
両方の切断ラウンドの後、切断不可能な点のみが残った。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【外国語明細書】