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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023004952
(43)【公開日】2023-01-17
(54)【発明の名称】ＭＩＣタグによる空間配列決定
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20230110BHJP
C12Q 1/6816 20180101ALI20230110BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230110BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230110BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6816 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022101003
(22)【出願日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】21181309
(32)【優先日】2021-06-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】520094891
【氏名又は名称】ミルテニー バイオテック ベー．フェー． ウント コー． カー・ゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．Ｖ． ＆ Ｃｏ． ＫＧ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ－Ｅｂｅｒｔ－Ｓｔｒａｓｓｅ ６８， ５１４２９ Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(72)【発明者】
【氏名】ハインリヒ シュピーカー
(72)【発明者】
【氏名】ザンドラ ハルプフェルト
(72)【発明者】
【氏名】トーマス ロートマン
(72)【発明者】
【氏名】アンドレアス ボズィオ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA20
4B063QQ02
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4B063QS39
(57)【要約】 （修正有）
【課題】組織の領域または組織内の個々の細胞におけるｍＲＮＡの分布を決定する方法提供する。
【解決手段】サンプル中のＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の少なくとも一部の空間位置および配列情報を得るための方法であって、ａ．ブリッジオリゴヌクレオチドに部分的にハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチドに結合可能なギャップ領域が形成される、第１の検出プローブオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程と、ｂ．サンプル中のＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の空間情報を決定するバーコードオリゴヌクレオチドで、ギャップ領域を部分的に充填する工程と、ｃ．第２の検出プローブオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて、環状テンプレートを形成する工程と、ｄ．環状テンプレートを、複数のコンカテマーを含むロロニー内でローリングサークル増幅可能なポリメラーゼにより増幅する工程と、ｅ．ロロニーのヌクレオチド配列を決定する工程とを含む、方法である。
【選択図】なし
【解決手段】サンプル中のＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の少なくとも一部の空間位置および配列情報を得るための方法であって、ａ．ブリッジオリゴヌクレオチドに部分的にハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチドに結合可能なギャップ領域が形成される、第１の検出プローブオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程と、ｂ．サンプル中のＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の空間情報を決定するバーコードオリゴヌクレオチドで、ギャップ領域を部分的に充填する工程と、ｃ．第２の検出プローブオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて、環状テンプレートを形成する工程と、ｄ．環状テンプレートを、複数のコンカテマーを含むロロニー内でローリングサークル増幅可能なポリメラーゼにより増幅する工程と、ｅ．ロロニーのヌクレオチド配列を決定する工程とを含む、方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中のＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖（（００６））の少なくとも一部の空間位置および配列情報を得るための方法であって、
ａ．５～１００個のヌクレオチドを含むブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチドに結合可能なギャップ領域（２０６）が形成される、５０～１０００個のヌクレオチドを含む第１の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４）を、その３’および／または５’末端で、少なくとも１つの前記ＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の相補的部分にハイブリダイズさせる工程と、
ｂ．４～２０個のヌクレオチドを含み、前記サンプル中の前記ＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の前記空間情報を決定する、１～１６個のバーコードオリゴヌクレオチドで、前記ギャップ領域（２０６）を部分的に充填する工程と、
ｃ．５０～１０００個のヌクレオチドを含む第２の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４’）を、その３’および／または５’末端で、同じまたはｃＤＮＡ鎖の前記相補的部分に部分的にハイブリダイズさせかつそれぞれの他端で前記ブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズさせて、環状テンプレートを形成する工程と、
ｄ．前記環状テンプレートを、複数のコンカテマーを含むロロニー内でローリングサークル増幅可能なポリメラーゼにより増幅する工程と、
ｅ．前記ロロニーのヌクレオチド配列を決定する工程と
を含む、方法。
ａ．５～１００個のヌクレオチドを含むブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチドに結合可能なギャップ領域（２０６）が形成される、５０～１０００個のヌクレオチドを含む第１の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４）を、その３’および／または５’末端で、少なくとも１つの前記ＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の相補的部分にハイブリダイズさせる工程と、
ｂ．４～２０個のヌクレオチドを含み、前記サンプル中の前記ＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の前記空間情報を決定する、１～１６個のバーコードオリゴヌクレオチドで、前記ギャップ領域（２０６）を部分的に充填する工程と、
ｃ．５０～１０００個のヌクレオチドを含む第２の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４’）を、その３’および／または５’末端で、同じまたはｃＤＮＡ鎖の前記相補的部分に部分的にハイブリダイズさせかつそれぞれの他端で前記ブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズさせて、環状テンプレートを形成する工程と、
ｄ．前記環状テンプレートを、複数のコンカテマーを含むロロニー内でローリングサークル増幅可能なポリメラーゼにより増幅する工程と、
ｅ．前記ロロニーのヌクレオチド配列を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項2】
サンプル中のＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖（（００６））の少なくとも一部の空間位置および配列情報を得るための方法であって、
ｆ．それぞれ５０～１０００個のヌクレオチドを含む第１のオリゴヌクレオチド（２０４）および第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）を含み、これらが５～１００個のヌクレオチドを含む部分的にハイブリダイズされたブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）により連結され、前記第１のオリゴヌクレオチド（２０４）と前記第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）との間にブリッジギャップ領域（２０６）が形成される、検出プローブオリゴヌクレオチドの３’および５’末端を、前記少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の前記相補的部分にハイブリダイズさせる工程と、
ｇ．４～２０個のヌクレオチドを含み、前記サンプル中の前記ＲＮＡまたはｃＤＮＡの前記空間情報を決定する、１～１６個のバーコードオリゴヌクレオチドで、前記ブリッジギャップ領域（２０６）を充填して、環状テンプレートを形成する工程と、
ｈ．前記環状テンプレートを、複数のコンカテマーを含むロロニー内でローリングサークル増幅可能なポリメラーゼにより増幅する工程と、
ｉ．前記ロロニーの前記ヌクレオチド配列を決定する工程と
を含む、方法。
ｆ．それぞれ５０～１０００個のヌクレオチドを含む第１のオリゴヌクレオチド（２０４）および第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）を含み、これらが５～１００個のヌクレオチドを含む部分的にハイブリダイズされたブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）により連結され、前記第１のオリゴヌクレオチド（２０４）と前記第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）との間にブリッジギャップ領域（２０６）が形成される、検出プローブオリゴヌクレオチドの３’および５’末端を、前記少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の前記相補的部分にハイブリダイズさせる工程と、
ｇ．４～２０個のヌクレオチドを含み、前記サンプル中の前記ＲＮＡまたはｃＤＮＡの前記空間情報を決定する、１～１６個のバーコードオリゴヌクレオチドで、前記ブリッジギャップ領域（２０６）を充填して、環状テンプレートを形成する工程と、
ｈ．前記環状テンプレートを、複数のコンカテマーを含むロロニー内でローリングサークル増幅可能なポリメラーゼにより増幅する工程と、
ｉ．前記ロロニーの前記ヌクレオチド配列を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項3】
前記検出プローブオリゴヌクレオチドが、それぞれ５０～１０００個のヌクレオチドを含む第１の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４）および第２の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４）を、それぞれの３’および５’末端で、前記少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の相補的部分にハイブリダイズさせ、続いて、前記第１（２０４）と第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）とを、前記ブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズさせて連結させることにより、前記少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズされることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項4】
前記検出プローブオリゴヌクレオチドが、
第１のオリゴヌクレオチド（２０４）を第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）にライゲーションし、ついで、得られたオリゴヌクレオチドを前記少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の前記相補的部分にハイブリダイズさせ、続いて、前記得られたオリゴヌクレオチドの未結合末端を前記ブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズさせて連結させる
ことにより、前記少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズされることを特徴とする、請求項２記載の方法。
第１のオリゴヌクレオチド（２０４）を第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）にライゲーションし、ついで、得られたオリゴヌクレオチドを前記少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の前記相補的部分にハイブリダイズさせ、続いて、前記得られたオリゴヌクレオチドの未結合末端を前記ブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズさせて連結させる
ことにより、前記少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズされることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項5】
前記検出プローブオリゴヌクレオチドが前記少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の前記相補的部分にハイブリダイズされ、これにより、前記検出プローブオリゴヌクレオチドの前記第１のオリゴヌクレオチド（２０４）と前記第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）との間に１～１５０個のヌクレオチドのギャップ（２０７’）が形成されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項6】
前記ギャップ（２０７’）が前記少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の隣接部分に相補的なヌクレオチドで充填され、これにより、第１の標的配列（２０７）が得られることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項7】
前記少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズされた前記第１および／または第２のオリゴヌクレオチドの一部を使用して、第２の標的配列を得ることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項8】
前記サンプル中の前記環状テンプレートの前記空間情報が、前記第１および／または第２の標的配列に連結されることを特徴とする、請求項６または７記載の方法。
【請求項9】
前記ブリッジギャップ領域（２０６）が、ハイブリダイズ後に光で前記光開裂性保護基を除去して、同じかまたは異なる光開裂性保護基を含むバーコードオリゴヌクレオチドを前記ブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）の相補的部分にハイブリダイズさせることにより、少なくとも部分的に充填されることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項10】
前記環状テンプレートが、ローリングサークル増幅ポリメラーゼについてのプライミング部位として、バーコードオリゴヌクレオチドのうちの１つに相補的なプライマーオリゴヌクレオチドを提供する（ハイブリダイズさせる）ことにより選択的に増殖されることを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項11】
前記サンプルが、表面に固定され、透過処理されることを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項12】
前記サンプルが組織として提供され、一本鎖環状テンプレートが、前記サンプルから単離され、ローリングサークル増幅によりｅｘ ｓｉｔｕで複製されることを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項13】
前記サンプルが組織として提供され、一本鎖環状テンプレートが、ローリングサークル増幅により前記組織上に複製されることを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、空間配列決定の技術に関する。その目的は、組織の領域または組織内の個々の細胞におけるｍＲＮＡの分布を決定することである。
【0002】
空間配列決定は、細胞のｍＲＮＡ含量をその組織状況との関係で直接配列決定することが可能な方法の総称である。これらの方法は、一方では、一種の高度に多重化された蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイにおける、細胞のｍＲＮＡ発現プロファイルの分析に役立ちうる。
【0003】
他方で、ｉｎ ｓｉｔｕ配列決定により、特異的なｍＲＮＡ結合プローブを使用して、ｍＲＮＡ配列情報の読み出しも可能である場合がある。このプローブは、特定のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列の予め決められた部分のコピーを塞ぐことができる（“Gap-fill padlock probes”, Ke et al., Nature Methods 2013, doi:10.1038/nmeth.2563）。ｉｎ ｓｉｔｕ配列決定法は全てシグナル増幅工程を必要とし、これは、ほとんどの場合、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ結合プローブの環化および後続のローリングサークル増幅（ＲＣＡ）により行われ、プローブ配列の複数のコピーを含むＤＮＡ分子、いわゆるナノボール、ロロニーまたはローリングサークル増幅産物（ＲＣＰ）を生成する。これらは、ｎｍまたはμｍスケールのサイズを有する大きな分子であるため、１つの細胞内で形成することができるロロニーの数は、この細胞のサイズにより厳密に制限される。
【0004】
さらに、細胞内のロロニーの密度が高すぎる場合、配列決定手法の光学的検出工程の間の単一のｍＲＮＡシグナルの識別が非常に損なわれる。このことは、技術の主な欠点であるため、これを回避すべく、種々の技術、例えば、より小さなロロニーの設計または組織－ヒドロゲル複合体の生成および除去が開発されている（Asp et al., BioEssays 2020, DOI: 10.1002/bies.201900221）。しかしながら、これらの方法は、ｉｎ ｓｉｔｕ配列決定の固有の空間的限界を依然として完全には回避できない。
【0005】
別のアプローチでは、ｉｎ ｓｉｔｕシグナル増幅を回避する。ｉｎ ｓｉｔｕ捕捉は、組織からのｍＲＮＡ分子の、バーコード化プライマーのスポットで被覆された表面への移動によるものであり、配列決定されたｍＲＮＡが抽出された特定の組織領域へのｅｘ ｓｉｔｕ獲得配列情報のバックトラッキングが可能となる。それにもかかわらず、この方法も、ＲＮＡ捕捉効率が制限されており、バーコード化捕捉スポットの比較的大きなサイズに起因して分解能が不十分である（単一細胞分析ができない）ため、制限されている（Asp et al., BioEssays 2020, DOI:10.1002/bies.201900221）。
【0006】
発明の概要
本発明は、光学的方法を使用して、遺伝子コードを配列に挿入する方法に関する。このコードを、コード化が実行された位置を探索するために使用することができる。本明細書における目的は、ｉｎ ｓｉｔｕで測定可能なｍＲＮＡ配列の数および発現動態に関する既存のｉｎ ｓｉｔｕ配列決定法の限界をほとんど克服することである。光学的コード化は、１μｍの範囲の分解能と、各細胞が典型的なサイズの組織切片においてそれ自体のコードを受容するのに十分なコードの可変性とを有することができる。
本発明は、光学的方法を使用して、遺伝子コードを配列に挿入する方法に関する。このコードを、コード化が実行された位置を探索するために使用することができる。本明細書における目的は、ｉｎ ｓｉｔｕで測定可能なｍＲＮＡ配列の数および発現動態に関する既存のｉｎ ｓｉｔｕ配列決定法の限界をほとんど克服することである。光学的コード化は、１μｍの範囲の分解能と、各細胞が典型的なサイズの組織切片においてそれ自体のコードを受容するのに十分なコードの可変性とを有することができる。
【0007】
さらに、特異的なｍＲＮＡ結合プローブの光学的コード化およびこれらのプローブ内に封入されたｍＲＮＡ領域の逆転写媒介「コピー」を行うことができる。このため、この方法を、ｍＲＮＡの分布をプロファイリング（単一の細胞の発現プロファイリング）するだけでなく、特定のｍＲＮＡ切片の配列情報を決定（例えば、一塩基多型、ＳＮＰ；単一の細胞の配列決定）するためにも使用することができる。
【0008】
本明細書に開示する方法の基本方式は、細胞中に存在するｍＲＮＡへのパッドロックプローブの結合に基づいている。これらを、以下、ＭＩＣタグプローブ（Mismatch Cell Tagging（ミスマッチ細胞タグ）またはMismatch Code Tagging（ミスマッチコードタグ））と称するものとする。
【0009】
提案されたＭＩＣタグワークフローを、図１に示す：サンプル調製、組織染色および画像化（透過、蛍光）の後に、セグメント化またはクラスター分析および構造化照明のためのマスクの計算が続いて行われる。ＭＩＣタグプローブは、細胞内の特定のｍＲＮＡ分子に結合し、これにより、逆転写酵素媒介ギャップ充填（ｍＲＮＡ配列のＭＩＣタグプローブへのコピー）およびＭＩＣタグコードの周期的組み込み、ＭＩＣタグプローブのローリングサークル増幅、ＭＩＣタグコードの配列決定が可能となる。ギャップ充填により得られた配列およびＭＩＣタグコードは、画像に注釈付けされる。バイオインフォマティクス分析およびその結果と最初のサンプルソースとの関係により、ワークフローが完了する。
【0010】
ＭＩＣタグプローブをｍＲＮＡに提供することが、本発明の本質的な部分であり、２つの一般的な変形例により達成することができる。
【0011】
本発明の第１の目的は、サンプル中のＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖（００６）の少なくとも一部の空間位置および配列情報を得るための方法であって、
ａ．５～１００個のヌクレオチドを含むブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチドに結合可能なギャップ領域（２０６）が形成される、５０～１０００個のヌクレオチドを含む第１の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４）を、その３’および／または５’末端で、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の相補的部分にハイブリダイズさせる工程と、
ｂ．４～２０個のヌクレオチドを含み、サンプル中のＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の空間情報を決定する、１～１６個のバーコードオリゴヌクレオチドで、ギャップ領域（２０６）を部分的に充填する工程と、
ｃ．５０～１０００個のヌクレオチドを含む第２の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４’）を、その３’および／または５’末端で、同じまたはｃＤＮＡ鎖の相補的部分に部分的にハイブリダイズさせかつそれぞれの他端でブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズさせて、環状テンプレートを形成する工程と、
ｄ．環状テンプレートを、複数のコンカテマーを含むロロニー内でローリングサークル増幅可能なポリメラーゼにより増幅する工程と、
ｅ．ロロニーのヌクレオチド配列を決定する工程と
を含む、方法である。
ａ．５～１００個のヌクレオチドを含むブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチドに結合可能なギャップ領域（２０６）が形成される、５０～１０００個のヌクレオチドを含む第１の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４）を、その３’および／または５’末端で、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の相補的部分にハイブリダイズさせる工程と、
ｂ．４～２０個のヌクレオチドを含み、サンプル中のＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の空間情報を決定する、１～１６個のバーコードオリゴヌクレオチドで、ギャップ領域（２０６）を部分的に充填する工程と、
ｃ．５０～１０００個のヌクレオチドを含む第２の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４’）を、その３’および／または５’末端で、同じまたはｃＤＮＡ鎖の相補的部分に部分的にハイブリダイズさせかつそれぞれの他端でブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズさせて、環状テンプレートを形成する工程と、
ｄ．環状テンプレートを、複数のコンカテマーを含むロロニー内でローリングサークル増幅可能なポリメラーゼにより増幅する工程と、
ｅ．ロロニーのヌクレオチド配列を決定する工程と
を含む、方法である。
【0012】
ＭＩＣタグプローブは、部分的に相補的に結合した「ブリッジ」（図２におけるブリッジオリゴヌクレオチド（２０５））により連結された、前述の特異的なｍＲＮＡ結合部位のうちの１つをそれぞれ含む２つのプローブ（２０４，２０４’）からなることができる。このブリッジプライマーの配列は、全てのＭＩＣタグプローブについて同じである場合がある。プローブ上のその結合領域に対するブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）の親和性および結合効率を、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）をブリッジオリゴマー配列に組み込むことにより向上させることができる。
【0013】
本発明の第２の目的は、サンプル中のＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖（（００６））の少なくとも一部の空間位置および配列情報を得るための方法であって、
ｆ．それぞれ５０～１０００個のヌクレオチドを含む第１のオリゴヌクレオチド（２０４）および第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）を含み、これらが５～１００個のヌクレオチドを含む部分的にハイブリダイズされたブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）により連結され、第１のオリゴヌクレオチド（２０４）と第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）との間にブリッジギャップ領域（２０６）が形成される、検出プローブオリゴヌクレオチドの３’および５’末端を、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の相補的部分にハイブリダイズさせる工程と、
ｇ．４～２０個のヌクレオチドを含み、サンプル中のＲＮＡまたはｃＤＮＡの空間情報を決定する、１～１６個のバーコードオリゴヌクレオチドで、ブリッジギャップ領域（２０６）を充填して、環状テンプレートを形成する工程と、
ｈ．環状テンプレートを、複数のコンカテマーを含むロロニー内でローリングサークル増幅可能なポリメラーゼにより増幅する工程と、
ｉ．ロロニーのヌクレオチド配列を決定する工程と
を含む、方法である。
ｆ．それぞれ５０～１０００個のヌクレオチドを含む第１のオリゴヌクレオチド（２０４）および第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）を含み、これらが５～１００個のヌクレオチドを含む部分的にハイブリダイズされたブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）により連結され、第１のオリゴヌクレオチド（２０４）と第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）との間にブリッジギャップ領域（２０６）が形成される、検出プローブオリゴヌクレオチドの３’および５’末端を、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の相補的部分にハイブリダイズさせる工程と、
ｇ．４～２０個のヌクレオチドを含み、サンプル中のＲＮＡまたはｃＤＮＡの空間情報を決定する、１～１６個のバーコードオリゴヌクレオチドで、ブリッジギャップ領域（２０６）を充填して、環状テンプレートを形成する工程と、
ｈ．環状テンプレートを、複数のコンカテマーを含むロロニー内でローリングサークル増幅可能なポリメラーゼにより増幅する工程と、
ｉ．ロロニーのヌクレオチド配列を決定する工程と
を含む、方法である。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＭＩＣタグワークフローを示す図である。サンプル調製、組織染色および画像化。
【図2】パッドロック形成およびＭＩＣタグプローブのギャップ充填の変形例を示す図である。
【図3】ＭＩＣタグコード化を示す図である。
【図4】ギャップ充填、コード化およびブリッジプライマー除去後のＭＩＣタグプローブを示す図である。
【図5】ＭＩＣタグロロニーの配列決定を示す図である。
【図6】ＭＩＣタグコードのための加速された配列決定手法を示す図である。
【図7】ＭＩＣタグプローブの並列コード化変形例を示す図である。
【図8】固有分子識別子（ＵＭＩ）のＭＩＣタグプローブ配列への組み込みを示す図である。
【図9】プライマー制御ＭＩＣタグコード化を示す図である。
【0015】
発明を実施するための形態
以下において、検出プローブオリゴヌクレオチドは、「ＭＩＣタグプローブ」と称され、ブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）は、複数の「ＭＩＣタグディジット」またはより短く「ディジット」を含有し、ギャップ領域（２０６）は、「ＭＩＣタグスニップス」またはより短く「スニップス」と称されるバーコードオリゴヌクレオチドで充填される。
以下において、検出プローブオリゴヌクレオチドは、「ＭＩＣタグプローブ」と称され、ブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）は、複数の「ＭＩＣタグディジット」またはより短く「ディジット」を含有し、ギャップ領域（２０６）は、「ＭＩＣタグスニップス」またはより短く「スニップス」と称されるバーコードオリゴヌクレオチドで充填される。
【0016】
【0017】
図２Ａに、パッドロックを示す。検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４）は、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖（００５）の相補的部分（００６）に結合する結合領域（２０３）を有する。検出プローブオリゴヌクレオチドは、部分的にハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチドに結合可能なギャップ領域（２０６）を形成するブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）を備える。
【0018】
図２Ｂに、パッドロックの一般的な概念および形状を示す。第１（２０４）および第２（２０４’）の検出プローブオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖（００５）の相補的部分（００６）および（００６’）に結合する結合領域（２０３）および（２０３’）を有する。最終的な検出プローブオリゴヌクレオチドは、第１（２０４）および第２（２０４’）の検出プローブオリゴヌクレオチドを、ブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズさせることにより生成される。ここで、オリゴヌクレオチドに結合可能なギャップ領域（２０６）が形成される。
【0019】
図２Ｂに示されている実施形態の第１の変形例では、検出プローブオリゴヌクレオチドは、それぞれ５０～１０００個のヌクレオチドを含む第１の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４）および第２の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４’）を、それぞれの３’および５’末端で、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の相補的部分にハイブリダイズさせ、続いて、第１（２０４）と第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）とを、ブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズさせて連結させることにより、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズされる。
【0020】
図２Ｂに示されている実施形態の第２の変形例では、検出プローブオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチド（２０４）を第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）（部分２０３および２０３’）にライゲーションし、ついで、得られたオリゴヌクレオチドを少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の相補的部分にハイブリダイズさせ、続いて、得られたオリゴヌクレオチドの非結合末端をブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズさせて連結することにより、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズされる。
【0021】
図２Ａに示された変形例では、検出プローブオリゴヌクレオチドならびに／または少なくとも１つのＲＮＡもしくはｃＤＮＡにハイブリダイズされた第１および／もしくは第２のオリゴヌクレオチドの一部が、第２の標的配列を得るために使用される。
【0022】
図２Ａに示されている実施形態とは異なり、図２Ｂに示されている実施形態は、ｍＲＮＡ（００５）にハイブリダイズされると、第１のオリゴヌクレオチド（２０４）と第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）との間にギャップ（２０７’）を備える。
【0023】
この変形例は図２Ｃに示されており、ここで、検出プローブオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の相補的部分にハイブリダイズされ、これにより、検出プローブオリゴヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチド（２０４）と第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）との間に１～１５０個のヌクレオチドのギャップ（２０７’）が形成される。
【0024】
ついで、ギャップ（２０７’）を、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖の隣接部分に相補的なヌクレオチドで逆転写酵素（２０８）により充填して、第１の標的配列（２０７）を得ることができる。ついで、第１のオリゴヌクレオチド（２０４）および第２のオリゴヌクレオチド（２０４’）の最終ライゲーションを、ＤＮＡリガーゼ（２０９）により行う。
【0025】
図２Ｄに、その第１の目的に係る本発明の方法を示す。本明細書において、第１の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４）は、その３’および／または５’末端（２０３）で、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖（００５）の相補的部分（（００６））にハイブリダイズされる。第１の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４）を、ブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）と共に予め提供し、ｍＲＮＡ鎖（００５）にハイブリダイズさせることができる。
【0026】
代替的には、第１の検出プローブオリゴヌクレオチド（２０４）が、最初に、少なくとも１つのＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖（００５）の相補的部分（（００６））にハイブリダイズされ、ついで、ブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）に部分的にハイブリダイズされる。
【0027】
両方の場合において、オリゴヌクレオチドに結合可能なギャップ領域（２０６）が形成される。
【0028】
すなわち、図２（Ａ）は、１つのｍＲＮＡ結合部位を有するＭＩＣタグプローブを示し、図２（Ｂ）は、２つの直接に隣接するｍＲＮＡ領域にハイブリダイズされた２つのｍＲＮＡ結合部位を有するＭＩＣタグプローブを示し、図２（Ｃ）は、ＭＩＣタグプローブギャップの充填を示す。ＭＩＣタグプローブが、特異的なｍＲＮＡ種の２つの直接に隣接しないｍＲＮＡ領域に結合した後、ギャップ充填のためのｃＤＮＡ合成が、逆転写酵素により行われる。ＤＮＡリガーゼにより、鎖が連結される。
【0029】
この種の一本鎖ＤＮＡプローブは、ｍＲＮＡの２つの隣接領域または近接するが直接に隣接しない２つの領域とハイブリダイズする２つの特異的なｍＲＮＡ結合領域を含有する。ついで、プローブ結合が近接するが直接に隣接しない２つの領域で生じた際に生成されたギャップを、逆転写酵素により、封入されたｍＲＮＡに相補的な配列で「充填」（「ギャップ充填」）することができる。
【0030】
続いて、プローブは、後続のローリングサークル増幅を可能にするＤＮＡリガーゼ（図２における２０９）により環化される。
【0031】
下記のプロセス工程において、ギャップ領域（２０６）は段階的に充填され、相補的配列（ＭＩＣタグスニップス）の断片を、各工程において、相補的ＭＩＣタグディジットに挿入し、これを光で固定する。例えば、合成プロセスによる配列決定に使用される環状化学とは対照的に、一実施形態では、単一のデオキシヌクレオチドが挿入されず、小さなオリゴヌクレオチド（ＭＩＣタグスニップス）が挿入される。
【0032】
したがって、ブリッジギャップ領域（２０６）を、ハイブリダイズ後に光で光開裂性保護基を除去して、同じかまたは異なる光開裂性保護基を含むバーコードオリゴヌクレオチドをブリッジオリゴヌクレオチド（２０５）の相補的部分にハイブリダイズさせることにより、少なくとも部分的に充填することができる。
【0033】
ミスマッチング
ＭＩＣタグスニップス（バーコードオリゴヌクレオチド）は、その長さに応じて、対応するＭＩＣタグディジットと１つ以上のミスマッチを有することができるが、ブリッジオリゴヌクレオチドの（ほぼ）相補的部分に依然として特異的に結合するのに十分な配列長を有するべきである。
ＭＩＣタグスニップス（バーコードオリゴヌクレオチド）は、その長さに応じて、対応するＭＩＣタグディジットと１つ以上のミスマッチを有することができるが、ブリッジオリゴヌクレオチドの（ほぼ）相補的部分に依然として特異的に結合するのに十分な配列長を有するべきである。
【0034】
「ミスマッチ」という用語は、少なくとも１つの非相補的ヌクレオチドを有するバーコードオリゴヌクレオチドを指す。
【0035】
ＭＩＣタグスニップスは、好ましい比率のＭＩＣタグスニップス：ミスマッチ＝１０：１ｂｐを有する１つまたは２つのミスマッチを含有することができる。ミスマッチバージョンに加えて、ＭＩＣタグスニップスは、別の変形例として機能するマッチングコードも含有することができる。
【0036】
その関連するＭＩＣタグディジットとの特異的ハイブリダイゼーションを確実にするために、スニップスは、他のディジットを結合することができないように設計される必要がある。スニップスにおけるミスマッチの代替として、ブリッジプライマーも、スニップスミスマッチに相補的な位置にユニバーサル塩基を含有するように設計することができる。
【0037】
これらのＭＩＣタグスニップスのアニーリングは周期的プロセス内で行われ、このアニーリングは、各周期において、空間的に構造化された別の光パターンで組織サンプルを処理することにより、組織サンプルの構造化照明によってトリガされる。「構造化照明」および「空間的に構造化された光パターン」は、サンプルの一部または選択された領域のみを照明することを指す。例えば、図１に、画像化１００に供される組織ドナー００１から得られた（場合により、染色された）組織切片００２を示す。この画像化１００により、セグメント化またはクラスター分析、すなわち、本発明の方法によりさらに調査されるべきサンプルの部分の選択が可能となる。このようなセグメント化／クラスタリング／選択により、構造化照明および／または空間的に構造化された光パターンのためのマスクの計算が可能となる。
【0038】
本発明の方法における更なる下流では、構造化照明および／または空間的に構造化された光パターンのために得られた情報が、ＭＩＣタグコード生成のための光処理（１０２）の間に利用される。これにより、パッドロックプローブ２０１の環化が可能となり、最終的に、ＲＣＡ後に、ロロニー２０２の形成が可能となる。構造化照明の助けを借りて、サンプル２０２の選択された領域／細胞のみが、ロロニーの次世代配列決定（１００）および配列分析（１０１）に供される。
【0039】
ＭＩＣタグスニップスの結合動力学は、光開裂性基が除去されない場合、例えば温度を上昇させることによりスニップスを分離し洗い流すことができるように調節される。露光が行われた場合、ブリッジオリゴヌクレオチド内のその対応するＭＩＣタグディジットとハイブリダイズされたＭＩＣタグスニップスが、プローブ内に固定される。光開裂性基がパターン化照明により分離され、この部位でのリガーゼ反応が可能となるためである。最後に、ＭＩＣタグスニップスの個々の組み合わせにより、組織切片内または細胞内でさえ、ＭＩＣタグプローブの位置をコード化するＭＩＣタグコードが決定される。
【0040】
ＭＩＣタグコード化のプロセスを、図３に示す：４つの特異的ギャップ充填オリゴのうちの１つが、結合し、ギャップ充填されたＭＩＣタグプローブに加えられる。このオリゴは、塩基ミスマッチを全く有さないか、１つまたは２つの塩基ミスマッチを有するかのいずれかである。このスキームにより、１６種類のミスマッチプローブを、各ＭＩＣタグディジットについて設計することができる。これらのミスマッチプローブは、４つのＭＩＣタグディジット結合領域（Ｉ～ＩＶ）のうちの１つに結合する。単一細胞を照明することにより、光開裂が誘引され、ＤＮＡリガーゼによるＭＩＣタグスニップスの組み込みが可能となる。
【0041】
標的鎖の逆転写酵素によるギャップ充填が既に行われたＭＩＣタグプローブから出発して、ＭＩＣタグスニップスは、幾つかのスニップスからなるコードが書き込まれるまで、周期的なプロセスで構築される。図３に示された例では、スニップスの変動性は１６であり、これを、２つのミスマッチおよびブリッジ内の４つの結合領域（ＭＩＣタグディジット）により達成することができる。したがって、６５５３６種類の値を有することができるコードを書き込むには、４×１６サイクルが必要となる。
【0042】
コード化が完了した後、全てのＭＩＣタグプローブ、すなわち環状テンプレートが、組織サンプルから単離される、すなわち除去される。ブリッジオリゴヌクレオチドを、例えば熱誘引二本鎖融解により、環状テンプレートから分離することができる。代替的な変形例において、ブリッジオリゴヌクレオチドは、ローリングサークル増幅を誘引するためのプライマー配列を備え、このため、環状テンプレート／ＭＩＣタグプローブ上に残存することができる。
【0043】
図４に、ＭＩＣタグスニップス（２１７）を担持する単離されたＭＩＣタグプローブを示す。ＭＩＣタグスニップス（２１７）は、そのｍＲＮＡ鎖を起源とする組織構造、細胞または細胞内領域からの情報を提供する。加えて、ＭＩＣタグプローブのｍＲＮＡ結合部位（（００６）、（００６’））間のギャップ充填（２０７）によるｃＤＮＡ合成により、標的とするｍＲＮＡの最終的な突然変異またはＳＮＰ（一塩基多型）に関する情報が含められる（図４、２０７）。
【0044】
原則として、この方法は、同時に検査されるｍＲＮＡの種類の数に関して限定されるものではなく、個々のｍＲＮＡ発現レベルに関して限定されるものではない。その結果、ハウスキーピング遺伝子としての高レベルの発現者がそのプロセスを損なうことはないであろう。同時に個々に検査される細胞数は、選択されたコード長により制限される。この制限は、シーケンサの能力およびスループットのみである。
【0045】
配列決定
本発明の方法における１つの工程は、ロロニーのヌクレオチドの配列を決定することに向けられる、すなわち、ＭＩＣタグプローブ上にコード化された情報が配列決定により読み出される。配列決定のための１つの方法は、sequencing by synthesis法（ＳＢＳ）であってよい。読み出しシグナルを増加させるために、ＭＩＣタグプローブ配列の増幅を行うことができる。クローン増幅のための１つの方法は、単離されたＭＩＣタグプローブのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）であってよい。この増幅は、ロロニーに対する配列決定プロセスを開始する前に行われる。
本発明の方法における１つの工程は、ロロニーのヌクレオチドの配列を決定することに向けられる、すなわち、ＭＩＣタグプローブ上にコード化された情報が配列決定により読み出される。配列決定のための１つの方法は、sequencing by synthesis法（ＳＢＳ）であってよい。読み出しシグナルを増加させるために、ＭＩＣタグプローブ配列の増幅を行うことができる。クローン増幅のための１つの方法は、単離されたＭＩＣタグプローブのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）であってよい。この増幅は、ロロニーに対する配列決定プロセスを開始する前に行われる。
【0046】
図５に、ＭＩＣタグロロニーの配列決定を示す。２つの配列決定プライマーにより、ギャップ充填ｃＤＮＡ配列（２１８，２１８’）およびＭＩＣタグコード（２１９，２１９’）の連続配列決定が導かれる。
【0047】
本発明の変形例では、ＭＩＣタグコードの配列を、標的遺伝子の配列（ギャップ充填配列）とは別個に読み取ることができる。これを、配列決定手法を２つの異なる配列決定プライマーによる２つのランに分割することにより実現することができる。
【0048】
ＭＩＣタグコード配列決定の加速
ＭＩＣタグスニップスの配列決定を、ミスマッチ領域の前後のマッチングコードが４つの塩基のうちの３つ（例えば、Ｇ、Ｔ、Ｃ）の配列のみからなる場合、加速させることができる。下記の配列において、Ｍは、塩基Ｇ、Ａ、Ｃのうちの１つについてのプレースホルダであり、Ｘは、ミスマッチングコードについてのプレースホルダである。
ＭＩＣタグスニップスの配列決定を、ミスマッチ領域の前後のマッチングコードが４つの塩基のうちの３つ（例えば、Ｇ、Ｔ、Ｃ）の配列のみからなる場合、加速させることができる。下記の配列において、Ｍは、塩基Ｇ、Ａ、Ｃのうちの１つについてのプレースホルダであり、Ｘは、ミスマッチングコードについてのプレースホルダである。
【0049】
ＭＭＭＭＭＴＸＸＭＭＭＭＭ（ＭＩＣタグスニップス、Ｍ＝｛Ｇ，Ａ，Ｃ｝およびＸ＝｛Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃ｝
【0050】
合成による配列決定に適用される環状化学物の文脈において、組み込まれたヌクレオチドは、通常、塩基特異的フルオロフォアおよびターミネーター（本明細書において、Ａ＊、Ｇ＊、Ｃ＊、Ｔ＊で示される）で修飾され、これにより、その位置が読み取られるまで、更なるポリメラーゼ媒介鎖伸長がブロックされる。上記で与えられた変形例におけるＭＩＣタグスニップスを読み取る場合、色素およびターミネーターを含まないヌクレオチドＴ、Ｇ、ＣとＡ＊との混合物を適用することができる。ついで、これらは、Ｔが生じるまで組み込まれ、常にミスマッチに先行し、Ａ＊を組み込むことにより更なる伸長が妨げられる。
【0051】
ついで、配列のミスマッチ部分を、ターミネーターおよび蛍光色素で修飾されたヌクレオチドの混合物を使用することにより検出することができる。ついで、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ａ＊混合物を再度添加し、鎖伸長を、次のＭＩＣタグスニップスにおける次のミスマッチ位置の前にある次のＴまで進行させる。
【0052】
これにより、本質的に、ＭＩＣタグコード中のミスマッチ位置を配列決定するために必要なサイクル数を減少させることができる。この戦略を使用して、周期的組み込みのデフェージングが回避され、補正される。読み取られるべき第１のＭＩＣタグスニップス配列を、配列決定プライマーがミスマッチ配列の直前に結合し、このため、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ａ＊による最初のパディングの必要性を排除するようにも設計することができる。
【0053】
本発明のこの変形例を、図６に示す。この場合、例えば２つの連続するミスマッチが、ＭＩＣタグスニップスに存在する。図６に、ＭＩＣタグコードのための加速配列決定手法を示す。特異的配列決定プライマーにより誘導されて、ターミネーター（Ｔ＊、Ｃ＊、Ｇ＊、Ａ＊）で蛍光標識されたヌクレオチドが、３サイクルで添加されて、合成アプローチによる配列決定におけるミスマッチ検出が可能となる。次の工程では、非標識および非終結ヌクレオチド（Ｔ、Ｃ、Ｇ）およびターミネーター（Ａ＊）で蛍光標識されたＡが添加され、鎖がＤＮＡポリメラーゼにより充填される。Ａ＊の結合により、この工程が停止する。次のミスマッチ位置に到達したことを示すためである。再度、ターミネーター（Ｔ＊、Ｃ＊、Ｇ＊、Ａ＊）で蛍光標識されたヌクレオチドが、３サイクルで添加されて、合成アプローチによる配列決定におけるミスマッチ検出が可能となる。このアプローチは、ＭＩＣタグコード全体が配列決定され、ミスマッチ領域を除いて、その配列内にチミジンを含まない特別に設計されたＭＩＣタグスニップスが必要となるまで繰り返される。
【0054】
この変形例では、例として、下記の配列が利用される。
【0055】
配列番号１：配列決定プライマー２２１の３’末端：５’－．．．ＴＧＡＴＣＡＴＧ－３’（１０ヌクレオチド未満、配列表なし）
配列番号２：第１のＭＩＣタグスニップス（ミスマッチヌクレオチド２２４を有する）：３’－ＧＣＴＡＧＴＡＣＴＣＧＡＧＣＣ－５’
配列番号３：第２のＭＩＣタグスニップス（ミスマッチヌクレオチド２２４’を有する）：３’－ＧＣＡＡＣＧＧＣＣＴＡＧＣＣＴＧ－５’
配列番号４：第３のＭＩＣタグスニップスの３’末端：３’－ＣＧＣＡＡＡＧＧＣＴ．．．－５’
配列番号５：（標識ヌクレオチド２２２を使用する）合成手法による配列決定において生成された相補的配列の５’末端：５’－．．．ＴＧＡＴＣＡＴＧＡＧＣＴＣＧＧＣＧＴＴＧＣＣＧＧＡＴＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＴＣＣＧＡ．．．－３’
配列番号２：第１のＭＩＣタグスニップス（ミスマッチヌクレオチド２２４を有する）：３’－ＧＣＴＡＧＴＡＣＴＣＧＡＧＣＣ－５’
配列番号３：第２のＭＩＣタグスニップス（ミスマッチヌクレオチド２２４’を有する）：３’－ＧＣＡＡＣＧＧＣＣＴＡＧＣＣＴＧ－５’
配列番号４：第３のＭＩＣタグスニップスの３’末端：３’－ＣＧＣＡＡＡＧＧＣＴ．．．－５’
配列番号５：（標識ヌクレオチド２２２を使用する）合成手法による配列決定において生成された相補的配列の５’末端：５’－．．．ＴＧＡＴＣＡＴＧＡＧＣＴＣＧＧＣＧＴＴＧＣＣＧＧＡＴＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＴＣＣＧＡ．．．－３’
【0056】
種々のＭＩＣタグコード
ＭＩＣタグコードを、種々のＭＩＣタグスニップスの組み合わせにより生成することができる。本明細書において、スニップスの変動性Ｎは、異なるスニップスの数を表す。好ましくは、異なるスニップスの数は、Ｎ＝２、４または１６である。ＭＩＣタグディジットの数Ｍ（結合領域の数）は、１～３２の範囲にありうる。ついで、ＭＩＣタグコードの総変動性は、ＮＭである。コードの書き込みに必要なサイクル数は、Ｎ×Ｍである。
ＭＩＣタグコードを、種々のＭＩＣタグスニップスの組み合わせにより生成することができる。本明細書において、スニップスの変動性Ｎは、異なるスニップスの数を表す。好ましくは、異なるスニップスの数は、Ｎ＝２、４または１６である。ＭＩＣタグディジットの数Ｍ（結合領域の数）は、１～３２の範囲にありうる。ついで、ＭＩＣタグコードの総変動性は、ＮＭである。コードの書き込みに必要なサイクル数は、Ｎ×Ｍである。
【0057】
コード生成の加速
ＭＩＣタグディジット（結合部位）それぞれに（Ｎ－１）種類のＭＩＣタグスニップスを組み込んだ後、最後の種類のＭＩＣタグスニップスを、光を適用することなく組み込むことができる。最初のＮ－１ステップ内で既に照明された領域の相補的実体に関連するためである。これを、光開裂性基を有さないスニップスを提供することにより利用することができる。ついで、この非光開裂性スニップスを、次のＭＩＣタグディジットのための第１の（光開裂性）ＭＩＣタグスニップスと共に提供することができる。これを１回のサイクルとしてカウントすると、必要なサイクルがＮ×Ｍ－Ｍ＋１＝（Ｎ－１）×Ｍ＋１に減少する。最後のサイクルにおいて、光を適用することなく、ＭＩＣタグコードが完了するであろう。この方法は、Ｎ＝２の場合に特に有用であり、この場合、Ｎ×Ｍ－Ｍ＋１＝Ｍ＋１となる。
ＭＩＣタグディジット（結合部位）それぞれに（Ｎ－１）種類のＭＩＣタグスニップスを組み込んだ後、最後の種類のＭＩＣタグスニップスを、光を適用することなく組み込むことができる。最初のＮ－１ステップ内で既に照明された領域の相補的実体に関連するためである。これを、光開裂性基を有さないスニップスを提供することにより利用することができる。ついで、この非光開裂性スニップスを、次のＭＩＣタグディジットのための第１の（光開裂性）ＭＩＣタグスニップスと共に提供することができる。これを１回のサイクルとしてカウントすると、必要なサイクルがＮ×Ｍ－Ｍ＋１＝（Ｎ－１）×Ｍ＋１に減少する。最後のサイクルにおいて、光を適用することなく、ＭＩＣタグコードが完了するであろう。この方法は、Ｎ＝２の場合に特に有用であり、この場合、Ｎ×Ｍ－Ｍ＋１＝Ｍ＋１となる。
【0058】
下記の表に、本発明の方法の変形例の例およびＭＩＣタグコード化に必要なサイクル数に対するその効果を示す。
【0059】
【表1】
【0060】
エラー処理
ＭＩＣタグコードが書き込まれると、ＭＩＣタグスニップスが組み込まれたときに、エラーが発生する場合がある。ＭＩＣタグスニップスのうちの１つが挿入されない場合、プローブは環化されず、ＲＣＡを起こすことができず、続いての配列決定情報が生成されないであろう。
ＭＩＣタグコードが書き込まれると、ＭＩＣタグスニップスが組み込まれたときに、エラーが発生する場合がある。ＭＩＣタグスニップスのうちの１つが挿入されない場合、プローブは環化されず、ＲＣＡを起こすことができず、続いての配列決定情報が生成されないであろう。
【0061】
誤ったＭＩＣタグスニップスが挿入された場合、コードは正しい細胞を示さないであろう。この制限は、先のセクションで概説されたコード生成の加速が適用されない場合にのみ有効である。
【0062】
すなわち、ＭＩＣタグスニップスが挿入されない場合、パッドロックは形成されず、期間内に配列決定に供されないであろう。その限りにおいて、本発明の方法は、組み込みエラー処理を有する。
【0063】
加えて、他の誤り訂正方法を含ませることも意味がある場合がある。例えば、２つ目の同一コードを異なる位置でブリッジに同時に挿入することができ、その結果、コードを内部的に検証することができる。また、コード長を長くし、冗長化による誤り訂正を付加することも可能である。
【0064】
この変形例において、ブリッジオリゴヌクレオチドは、同じＭＩＣタグスニップスについて少なくとも２つの同一の結合領域を含有し、これらは、特異的結合反応を確実にするために同時にアクセス可能である。この場合も、１つのＭＩＣタグスニップスが正しく挿入されなければ、各パッドロックが形成されず、配列決定に供されないであろう。
【0065】
この点に関して、図７に、並列に同一に記載された２つの同一領域を有するＭＩＣタグプローブを示す。この場合、両方のコードが同一である箇所にそれらの配列のみを割り当てることが可能である。これにより、特に、異なるサンプル領域間で非常に異なるｍＲＮＡ発現プロファイルを有するサンプルにおいて、そのコントラストが不正確なコードにより平準化されることが防止される。
【0066】
遺伝コードの読み出しには、読み出しエラーの問題がある。これらのエラーは、ＭＩＣタグコードおよびｍＲＮＡ配列において生じうる。したがって、ＲＣＡにより産生された鎖を酵素的に切断し、配列決定のために再度ＲＣＡにより各鎖から複数の鎖を生成することが有用でありうる。ついで、エラー訂正をＭＩＣタグコードとｍＲＮＡ配列との両方に行うことができるように、ＭＩＣタグプローブ中に固有分子識別子（ＵＭＩ）を含ませることが有用である。この変形例は、固有分子識別子（ＵＭＩ）２２６をＭＩＣタグプローブ配列に組み込んだ状態で、図８に示されている。ＵＭＩを、ロロニーの酵素消化後に元のＭＩＣタグプローブを特定するために使用することができる。
【0067】
代替的なコード化アプローチ
提案されたＭＩＣタグ手法に加えて、代替的な方法を、ｉｎ ｓｉｔｕでＭＩＣタグプローブにコードを書き込むために使用することができる。これまでに記載したＭＩＣタグ手法の１つの変形例を、図９に示す。本明細書において、リガーゼ媒介ＭＩＣタグスニップスの組み込みを、予め組み込まれる必要がある追加のプライマーにより制御することができる。ＭＩＣタグスニップスとして、これらのプライマーは、特定の波長光を有する照明により除去される光不安定性基を有し、この光不安定性基により、ＤＮＡリガーゼによる鎖へのその後続の組み込みが可能となる。光不安定性基に場合により結合されたフルオロフォアの放出を検出することができ、内部対照として使用することができる。
提案されたＭＩＣタグ手法に加えて、代替的な方法を、ｉｎ ｓｉｔｕでＭＩＣタグプローブにコードを書き込むために使用することができる。これまでに記載したＭＩＣタグ手法の１つの変形例を、図９に示す。本明細書において、リガーゼ媒介ＭＩＣタグスニップスの組み込みを、予め組み込まれる必要がある追加のプライマーにより制御することができる。ＭＩＣタグスニップスとして、これらのプライマーは、特定の波長光を有する照明により除去される光不安定性基を有し、この光不安定性基により、ＤＮＡリガーゼによる鎖へのその後続の組み込みが可能となる。光不安定性基に場合により結合されたフルオロフォアの放出を検出することができ、内部対照として使用することができる。
【0068】
図９で言及された追加のプライマーの代わりに、光開裂性基を有する単一のヌクレオチドを使用することができる。プライマーおよびブリッジプローブの相補鎖とハイブリダイズし、ＤＮＡリガーゼによりプローブに組み込まれるＭＩＣタグスニップスとは対照的に、ヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼにより組み込まれる必要がある。
【0069】
図９に、プライマー制御されたＭＩＣタグコード化を伴う本発明の変形例を示す。本明細書において、光不安定性基で修飾されたプライマーは、第１のＭＩＣタグディジットに隣接する一本鎖領域にハイブリダイズされる。光により、プライマーに結合された光不安定性基の開裂が誘引される。プライマーは、ＤＮＡリガーゼにより鎖に組み込まれ、ついで、第１のスニップスが添加され、第１のディジットとハイブリダイズする。この工程は、ディジットＩ位置における全ての異なるスニップスが組み込まれるまで繰り返される。ここで、第１の工程は、ディジットＩＩにおける異なる種類のスニップスＩＩの組み込みを調製するために繰り返される。複数のサイクル後、ＭＩＣタグコードが完了し、ＭＩＣタグプローブが最終的にライゲーションされる。
【符号の説明】
【0070】
図面の用語集
生物、組織および組織内容物
００１ 組織ドナー
００２ 染色組織切片
００３ 細胞
００４ 細胞核
００５ ｍＲＮＡ
００６ ｍＲＮＡ上のＭＩＣタグプローブ結合部位
技術的手法
１００ 画像化
１０１ セグメント化またはクラスター分析、構造化照明のためのマスクの計算
１０２ ＭＩＣタグコード生成のための光処理
１０３ ロロニーの次世代配列決定
１０４ 配列分析
１０５ 周期的バーコード化
試薬および生成物
２００ ｃＤＮＡギャップ充填および個々のコード化前のＭＩＣタグプローブ
２０１ ｃＤＮＡギャップ充填および個々のコード化後のＭＩＣタグプローブ
２０２ ロロニーまたはローリングサークル増幅産物（ＲＣＰ）
２０３ 特異的なｍＲＮＡ結合部位
２０４ ＭＩＣタグプローブ骨格
２０５ ＭＩＣタグプローブ骨格末端にハイブリダイズしたブリッジオリゴヌクレオチド
２０６ ＭＩＣタグプローブ骨格にブリッジオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより形成されたギャップ
２０７ ｃＤＮＡ（またはｃＤＮＡのギャップ、２０７’）
２０８ 逆転写酵素
２０９ ＤＮＡリガーゼ
２１０ ギャップ充填後のＭＩＣタグプローブ
２１１ ＭＩＣタグディジット（Ｉ～ＩＶ）を有するブリッジプライマー
２１２ 光不安定性保護基を有するオリゴヌクレオチドまたはＭＩＣタグスニップス
２１３ ＭＩＣタグスニップスから光不安定性保護基を開裂させる集束光
２１４ 開裂型光不安定性保護基
２１５ 光不安定性保護基を含まないＭＩＣタグスニップス
２１６ ＭＩＣタグプローブに組み込まれたＭＩＣタグスニップス
２１７ ＭＩＣタグコード
２１８ 配列決定プライマー結合部位
２１９ ｍＲＮＡ結合部位およびｃＤＮＡの配列決定手法
２２０ ＭＩＣタグコードの配列決定手法
２２１ 配列決定プライマー
２２２ （光不安定性）保護基を有するヌクレオチド
２２３ ヌクレオチド
２２４ ＭＩＣタグコード中の可変ヌクレオチド（「ミスマッチ」）
２２５ ＤＮＡリガーゼ活性を支持するスプリントオリゴヌクレオチド
２２６ 固有分子識別子（ＵＭＩ）
２２７ 制限部位
２２８ 制限酵素
生物、組織および組織内容物
００１ 組織ドナー
００２ 染色組織切片
００３ 細胞
００４ 細胞核
００５ ｍＲＮＡ
００６ ｍＲＮＡ上のＭＩＣタグプローブ結合部位
技術的手法
１００ 画像化
１０１ セグメント化またはクラスター分析、構造化照明のためのマスクの計算
１０２ ＭＩＣタグコード生成のための光処理
１０３ ロロニーの次世代配列決定
１０４ 配列分析
１０５ 周期的バーコード化
試薬および生成物
２００ ｃＤＮＡギャップ充填および個々のコード化前のＭＩＣタグプローブ
２０１ ｃＤＮＡギャップ充填および個々のコード化後のＭＩＣタグプローブ
２０２ ロロニーまたはローリングサークル増幅産物（ＲＣＰ）
２０３ 特異的なｍＲＮＡ結合部位
２０４ ＭＩＣタグプローブ骨格
２０５ ＭＩＣタグプローブ骨格末端にハイブリダイズしたブリッジオリゴヌクレオチド
２０６ ＭＩＣタグプローブ骨格にブリッジオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより形成されたギャップ
２０７ ｃＤＮＡ（またはｃＤＮＡのギャップ、２０７’）
２０８ 逆転写酵素
２０９ ＤＮＡリガーゼ
２１０ ギャップ充填後のＭＩＣタグプローブ
２１１ ＭＩＣタグディジット（Ｉ～ＩＶ）を有するブリッジプライマー
２１２ 光不安定性保護基を有するオリゴヌクレオチドまたはＭＩＣタグスニップス
２１３ ＭＩＣタグスニップスから光不安定性保護基を開裂させる集束光
２１４ 開裂型光不安定性保護基
２１５ 光不安定性保護基を含まないＭＩＣタグスニップス
２１６ ＭＩＣタグプローブに組み込まれたＭＩＣタグスニップス
２１７ ＭＩＣタグコード
２１８ 配列決定プライマー結合部位
２１９ ｍＲＮＡ結合部位およびｃＤＮＡの配列決定手法
２２０ ＭＩＣタグコードの配列決定手法
２２１ 配列決定プライマー
２２２ （光不安定性）保護基を有するヌクレオチド
２２３ ヌクレオチド
２２４ ＭＩＣタグコード中の可変ヌクレオチド（「ミスマッチ」）
２２５ ＤＮＡリガーゼ活性を支持するスプリントオリゴヌクレオチド
２２６ 固有分子識別子（ＵＭＩ）
２２７ 制限部位
２２８ 制限酵素
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【外国語明細書】