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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023050779
(43)【公開日】2023-04-11
(54)【発明の名称】修飾ベクターの作製方法、及びベクターの修飾方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20230404BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/864 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021161058
(22)【出願日】2021-09-30
(71)【出願人】
【識別番号】000000941
【氏名又は名称】株式会社カネカ
(71)【出願人】
【識別番号】505246789
【氏名又は名称】学校法人自治医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】前田 博文
(72)【発明者】
【氏名】佐々木 隆英
(72)【発明者】
【氏名】大成 果乃子
(72)【発明者】
【氏名】北野 光昭
(72)【発明者】
【氏名】水上 浩明
(72)【発明者】
【氏名】卜部 匡司
(57)【要約】
【課題】ベクターを改変や前処理することなく、ガラクトサミン構造を有するリガンドを簡便に導入することができる、生体内において肝臓選択的輸送が可能な、修飾ベクターの作製方法及びベクターの修飾方法、並びに、これらにより得られた、生体内で適度な血中安定性を示す修飾ベクター、及びその用途としての生体内肝臓選択的輸送体及び血中濃度安定化剤を提供すること。
【解決手段】ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含み、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、修飾ベクターの作製方法、及びベクターの修飾方法である。
【選択図】なし
【解決手段】ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含み、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、修飾ベクターの作製方法、及びベクターの修飾方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ベクターにおける官能基に、
前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、
前記官能基（Ｂ）に、
前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、
を含み、
前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、修飾ベクターの作製方法。
前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、
前記官能基（Ｂ）に、
前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、
を含み、
前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、修飾ベクターの作製方法。
【請求項2】
前記ガラクトサミン構造が、Ｎ－アセチルガラクトサミン構造である、請求項１に記載の作製方法。
【請求項3】
前記ベクターにおける官能基が、アミノ基、グアニジノ基、水酸基、カルボキシル基、及びインドール基のいずれかである、請求項１又は２に記載の作製方法。
【請求項4】
前記ベクターにおける官能基が、リジン残基、アルギニン残基、チロシン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基における官能基である、請求項１から３のいずれかに記載の作製方法。
【請求項5】
前記官能基（Ａ）が、スクシンイミジル基である、請求項１から４のいずれかに記載の作製方法。
【請求項6】
前記官能基（Ｂ）が、アジド基、アルキニル基、アルケニル基、カルボニル基、ホスフィン基、テトラジン基、ヒドラジン基、及びヒドロキシルアミン基のいずれかである、請求項１から５のいずれかに記載の作製方法。
【請求項7】
前記リンカー化合物の重量平均分子量が５０００以下である、請求項１から６のいずれかに記載の作製方法。
【請求項8】
前記リンカー化合物が、ポリエチレングリコール基を有する、請求項１から７のいずれかに記載の作製方法。
【請求項9】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１から８のいずれかに記載の作製方法。
【請求項10】
前記ベクターにおける官能基が、前記アデノ随伴ウイルスベクターのカプシドを構成する官能基である、請求項９に記載の作製方法。
【請求項11】
前記ベクターにおける官能基がアミノ基であり、前記官能基（Ａ）がスクシンイミジル基であり、前記官能基（Ｂ）又は（Ｃ）がアジド基及び／又はアルキニル基であり、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有する、請求項１から１０のいずれかに記載の作製方法。
【請求項12】
前記ベクターにおける官能基がリジン残基における官能基であり、前記官能基（Ｂ）又は（Ｃ）がアジド基及び／又はアルキニル基であり、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有する、請求項１から１１のいずれかに記載の作製方法。
【請求項13】
前記修飾ベクターの血中安定性が、修飾前と比較して高い、請求項１から１２のいずれかに記載の作製方法。
【請求項14】
ベクターにおける官能基に、
前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、
前記官能基（Ｂ）に、
前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、
を含み、
前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、ベクターの修飾方法。
前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、
前記官能基（Ｂ）に、
前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、
を含み、
前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、ベクターの修飾方法。
【請求項15】
修飾されたベクターの血中安定性が、修飾前と比較して高い、請求項１４に記載のベクターの修飾方法。
【請求項16】
ガラクトサミン構造を含むリガンド部を有し、
リンカーを介して、前記リガンド部と、ベクターと、が結合しており、
前記リンカーは、アミド結合により前記ベクターと結合していることを特徴とする修飾ベクター。
リンカーを介して、前記リガンド部と、ベクターと、が結合しており、
前記リンカーは、アミド結合により前記ベクターと結合していることを特徴とする修飾ベクター。
【請求項17】
請求項１６に記載の修飾ベクターを含むことを特徴とする、肝臓選択的輸送体。
【請求項18】
請求項１６に記載の修飾ベクターを含むことを特徴とする、血中濃度安定化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、修飾ベクターの作製方法、及びベクターの修飾方法に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療には、ベクターが広く使われているが、ベクターの生体内における標的組織への移行性が十分ではないことなどが課題である。
この課題を解決する方法として、ベクターを構成するタンパク質の改変などが行われているが、生体内で薬効を示すための十分な効果が得られていない。
この課題を解決する方法として、ベクターを構成するタンパク質の改変などが行われているが、生体内で薬効を示すための十分な効果が得られていない。
【0003】
そこで、近年、ベクターを化学修飾し、ベクターに機能を高めるためのリガンドを導入する方法が開発されてきたが（非特許文献１、特許文献１など）、この方法では、ベクター上の官能基と結合させる部位と機能を高めるためのリガンドとが一体型の試薬が使用されているため、入手できる試薬には制限があり、有効な方法とは言い難い。
【0004】
また他の方法として、２ステップで化学修飾する方法が報告されているが（特許文献２など）が、この方法は、システイン残基を利用する方法であり、化学修飾前に還元処理でシステイン残基を遊離させる必要があるため、簡便な方法とは言い難い。またこの還元処理によって、ベクターが分解している可能性がある。
【0005】
更に他の方法としては、ベクターを改変してシステイン残基を変異導入した後に化学修飾する方法が報告されているが（非特許文献２など）、変異導入の手間がかかるため、簡便な方法とは言い難い。
【0006】
一方、ベクターにガラクトサミン構造を有するリガンドを１ステップで導入する方法が報告されているが、リガンド調製に煩雑で多くのステップが必要であるため、産業上有効な方法とは言い難い。また、ガラクトサミン構造を有するリガンドは、肝臓に発現するアシアロ糖タンパク質受容体と結合することが知られているが、ガラクトサミン構造を化学修飾したベクターの生体内における肝臓選択的輸送機能は示されていない（特許文献１や非特許文献３など）。本発明の技術分野では、試験管内でのデータのみで結論付けることは十分ではなく、生体内のデータにより確認することが重要であり、さらに、生体内でのデータは必ずしも試験管内でのデータと一致しない。
また、肝臓選択的輸送を達成するためには、適度な血中安定性を実現することが重要であると考えられるが、これまでに、生体内で適度な血中安定性を示す修飾ベクターは報告されていない。
また、肝臓選択的輸送を達成するためには、適度な血中安定性を実現することが重要であると考えられるが、これまでに、生体内で適度な血中安定性を示す修飾ベクターは報告されていない。
【0007】
したがって、ベクターを改変や前処理することなく、ガラクトサミン構造を有するリガンドを簡便に導入することができる、生体内において肝臓選択的輸送が可能な、修飾ベクターの作製方法及びベクターの修飾方法、並びに、これらにより得られた、生体内で適度な血中安定性を示す修飾ベクターは全く知られておらず、これらの提供が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開第２０２１／００５２１０号
【特許文献2】欧州特許出願公開第３４６１８３６号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ２００５ ９２：２４－３４
【非特許文献2】ｓｍａｌｌ ２０１３ ９ ３：４２１－４２９
【非特許文献3】Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ． ２０２０ １１：１１２２－１１３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ベクターを改変や前処理することなく、ガラクトサミン構造を有するリガンドを簡便に導入することができる、生体内において肝臓選択的輸送が可能な、修飾ベクターの作製方法及びベクターの修飾方法、並びに、これらにより得られた、生体内で適度な血中安定性を示す修飾ベクター、及びその用途としての生体内肝臓選択的輸送体及び血中濃度安定化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含み、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有する方法により、ベクターを改変や前処理することなく、ガラクトサミン構造を有するリガンドを簡便に導入することができる、生体内において肝臓選択的輸送が可能な、修飾ベクターの作製方法及びベクターの修飾方法、並びに、これらにより得られた、生体内で適度な血中安定性を示す修飾ベクター、及びその用途としての生体内肝臓選択的輸送体及び血中濃度安定化剤が提供できることを知見した。
【0012】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下のとおりである。即ち、
＜１＞ ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含み、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、修飾ベクターの作製方法である。
＜２＞ ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含み、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、ベクターの修飾方法である。
＜３＞ ガラクトサミン構造を含むリガンド部を有し、リンカーを介して、前記リガンド部と、ベクターと、が結合しており、前記リンカーは、アミド結合により前記ベクターと結合していることを特徴とする修飾ベクターである。
＜４＞ 前記＜３＞に記載の修飾ベクターを含むことを特徴とする、肝臓選択的輸送体である。
＜５＞ 前記＜３＞に記載の修飾ベクターを含むことを特徴とする、血中濃度安定化剤である。
＜１＞ ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含み、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、修飾ベクターの作製方法である。
＜２＞ ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含み、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、ベクターの修飾方法である。
＜３＞ ガラクトサミン構造を含むリガンド部を有し、リンカーを介して、前記リガンド部と、ベクターと、が結合しており、前記リンカーは、アミド結合により前記ベクターと結合していることを特徴とする修飾ベクターである。
＜４＞ 前記＜３＞に記載の修飾ベクターを含むことを特徴とする、肝臓選択的輸送体である。
＜５＞ 前記＜３＞に記載の修飾ベクターを含むことを特徴とする、血中濃度安定化剤である。
【発明の効果】
【0013】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ベクターを改変や前処理することなく、ガラクトサミン構造を有するリガンドを簡便に導入することができる、生体内において肝臓選択的輸送が可能な、修飾ベクターの作製方法及びベクターの修飾方法、並びに、これらにより得られた、生体内で適度な血中安定性を示す修飾ベクター、及びその用途としての生体内肝臓選択的輸送体及び血中濃度安定化剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
（修飾ベクターの作製方法）
前記修飾ベクターの作製方法は、ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる第１の工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる第２の工程と、を含み、さらにその他の工程を有することができる。
前記修飾ベクターの作製方法は、ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる第１の工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる第２の工程と、を含み、さらにその他の工程を有することができる。
【0016】
前記第１の工程と、前記第２の工程を行う順番としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、リンカー化合物に結合可能な多様なリガンドを簡便にベクターに導入することができ、リガンドの選択肢が広がる点から、前記第１の工程の後に、前記第２の工程を行うことが好ましい。
【0017】
＜第１の工程＞
前記第１の工程は、ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程である。
前記第１の工程は、ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程である。
【0018】
－ベクター－
前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、コスミドベクター、フォスミドベクターなどが挙げられる。
これらの中でも、遺伝子治療に広く使用されている点で、ウイルスベクターが好ましい。
前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、コスミドベクター、フォスミドベクターなどが挙げられる。
これらの中でも、遺伝子治療に広く使用されている点で、ウイルスベクターが好ましい。
【0019】
前記ウイルスベクターとして用いられるウイルスとしては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、パピローマウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスなどが挙げられる。
これらの中でも、病原性が低い点で、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が好ましい。
これらの中でも、病原性が低い点で、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が好ましい。
【0020】
前記ウイルスベクターとして用いられるＡＡＶの血清型としてはＡＡＶ１（１型ＡＡＶ）、ＡＡＶ２（２型ＡＡＶ）、ＡＡＶ３（３型ＡＡＶ）、ＡＡＶ４（４型ＡＡＶ）、ＡＡＶ５（５型ＡＡＶ）、ＡＡＶ６（６型ＡＡＶ）、ＡＡＶ７（７型ＡＡＶ）、ＡＡＶ８（８型ＡＡＶ）、ＡＡＶ９（９型ＡＡＶ）、ＡＡＶ１０（１０型ＡＡＶ）、ＡＡＶ１１（１１型ＡＡＶ）、ＡＡＶ１２（１２型ＡＡＶ）、ＡＡＶ１３（１３型ＡＡＶ）、ＡＡＶ１４（１４型ＡＡＶ）、及びこれらの改変体などが挙げられるが、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記改変体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、標的細胞の組織特異性（感染する細胞の指向性）向上などのため、遺伝子組み換えにより（野生型ＡＡＶを）改変させたＡＡＶなどが挙げられる。
前記改変体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、標的細胞の組織特異性（感染する細胞の指向性）向上などのため、遺伝子組み換えにより（野生型ＡＡＶを）改変させたＡＡＶなどが挙げられる。
【0021】
－－ベクターにおける官能基－－
前記ベクターにおける官能基としては、前記ベクターと前記リンカー化合物との反応性の点から、アミノ基が好ましい。
前記ベクターにおける官能基は、前記ベクターと前記リンカー化合物との反応性の点から、リジン残基における官能基が好ましく、リジン残基におけるアミノ基がより好ましい。
前記ベクターにおける官能基としては、前記ベクターと前記リンカー化合物との反応性の点から、アミノ基が好ましい。
前記ベクターにおける官能基は、前記ベクターと前記リンカー化合物との反応性の点から、リジン残基における官能基が好ましく、リジン残基におけるアミノ基がより好ましい。
【0022】
前記ベクターにおける官能基は、前記ベクター１単体あたり、１つであってもよく、複数であってもよい。
前記ベクター１単体は、前記ベクターが複数のサブユニットから構成される場合は、その集合体や集合体からなる粒子及び粒子状の物質をいう。
前記ベクターが、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である場合は、前記ベクター１単体は、主にＶＰ１とＶＰ２とＶＰ３のモノマーから構成されている。ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の比率は、セロタイプや製造方法によって異なる可能性があるが、例えば５：５：５０の比率で構成された６０程度のサブユニットからなることが知られている。
前記ベクターが、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である場合は、前記ベクターにおける官能基が、前記アデノ随伴ウイルスのカプシドを構成する官能基であることが好ましい。
前記ベクター１単体は、前記ベクターが複数のサブユニットから構成される場合は、その集合体や集合体からなる粒子及び粒子状の物質をいう。
前記ベクターが、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である場合は、前記ベクター１単体は、主にＶＰ１とＶＰ２とＶＰ３のモノマーから構成されている。ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の比率は、セロタイプや製造方法によって異なる可能性があるが、例えば５：５：５０の比率で構成された６０程度のサブユニットからなることが知られている。
前記ベクターが、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である場合は、前記ベクターにおける官能基が、前記アデノ随伴ウイルスのカプシドを構成する官能基であることが好ましい。
【0023】
前記カプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３などから構成される。
【0024】
－リンカー化合物－
前記リンカー化合物は、前記ベクターにおける官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、前記リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有し、さらに連結部（Ｄ）を有することができる。
前記連結部（Ｄ）を有さない場合は、前記ベクターにおける官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、前記リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、が直接結合し、前記連結部（Ｄ）を有する場合は、前記連結部（Ｄ）の一端に前記ベクターにおける官能基と結合可能な官能基（Ａ）が結合し、前記連結部（Ｄ）の他端に前記リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）が結合する態様が好ましい。
前記リンカー化合物は、前記ベクターにおける官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、前記リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有し、さらに連結部（Ｄ）を有することができる。
前記連結部（Ｄ）を有さない場合は、前記ベクターにおける官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、前記リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、が直接結合し、前記連結部（Ｄ）を有する場合は、前記連結部（Ｄ）の一端に前記ベクターにおける官能基と結合可能な官能基（Ａ）が結合し、前記連結部（Ｄ）の他端に前記リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）が結合する態様が好ましい。
【0025】
－－ベクターにおける官能基と結合可能な官能基（Ａ）－－
前記ベクターにおける官能基と結合可能な官能基（Ａ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スクシンイミジル基、イソシアネート基、アミノメトキシエチル基、シクロヘキセンスルホンアミド基、カルボニル基、アルデヒド基、不飽和カルボニル基、ジアゾニウムテレフタレート、ハロゲン原子、マレイミジル基、フタルイミジル基、ジアゾベンゼン基、不飽和ニトリル基、アレニル基、脱離基、などが挙げられる。
前記ベクターにおける官能基と結合可能な官能基（Ａ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スクシンイミジル基、イソシアネート基、アミノメトキシエチル基、シクロヘキセンスルホンアミド基、カルボニル基、アルデヒド基、不飽和カルボニル基、ジアゾニウムテレフタレート、ハロゲン原子、マレイミジル基、フタルイミジル基、ジアゾベンゼン基、不飽和ニトリル基、アレニル基、脱離基、などが挙げられる。
【0026】
前記脱離基としては、ＯＳＯ２Ｒ’若しくはＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２（Ｒ’は炭素数１～６のアルキル基；炭素数４～１０のアリール基を表し、ここでの炭素数１～６のアルキル基としては直鎖状又は分岐状のアルキル基、中でもメチル基；エチル基；（ｎ－，ｉ－）プロピル基；（ｎ－，ｉ－，ｔ－）ブチル基が好適な例として挙げられ、また炭素数４～１０のアリール基とは、例えばフェニル基；（２－，３－，４－）トリル基；（１－，２－）ナフチル基；２－ピロリル基；２－フリル基；３－チエニル基；２－ピリジル基の５若しくは６員の単環若しくは縮合環からなる芳香族炭化水素基若しくは複素環基をいい、例えばメタンスルホニル基、トルエンスルホニル基、などが挙げられる。
これらの中でも、反応性の点で、スクシンイミジル基が好ましい。
前記官能基（Ａ）は、前記リンカー化合物１分子あたり、１つであってもよく、複数であってもよい。
これらの中でも、反応性の点で、スクシンイミジル基が好ましい。
前記官能基（Ａ）は、前記リンカー化合物１分子あたり、１つであってもよく、複数であってもよい。
【0027】
－－リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）－－
前記リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アジド基、アルキニル基、アルケニル基、カルボニル基、ホスフィン基、テトラジン基、ヒドラジン基、及びヒドロキシルアミン基などが挙げられる。
これらの中でも、反応性の点で、アルキニル基、又はアジド基が好ましく、アルキニル基がより好ましい。
前記官能基（Ｂ）は、前記リンカー化合物１分子あたり、１つであってもよく、複数であってもよい。複数の場合は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、アジド基及びアルキニル基などが挙げられる。
前記リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アジド基、アルキニル基、アルケニル基、カルボニル基、ホスフィン基、テトラジン基、ヒドラジン基、及びヒドロキシルアミン基などが挙げられる。
これらの中でも、反応性の点で、アルキニル基、又はアジド基が好ましく、アルキニル基がより好ましい。
前記官能基（Ｂ）は、前記リンカー化合物１分子あたり、１つであってもよく、複数であってもよい。複数の場合は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、アジド基及びアルキニル基などが挙げられる。
【0028】
－－連結部（Ｄ）－－
前記連結部（Ｄ）は、前記官能基（Ａ）と前記官能基（Ｂ）とを連結することができ、前記官能基（Ａ）、前記官能基（Ｂ）、及び前記リガンド化合物と反応しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記連結部（Ｄ）は、前記官能基（Ａ）と前記官能基（Ｂ）とを連結することができ、前記官能基（Ａ）、前記官能基（Ｂ）、及び前記リガンド化合物と反応しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0029】
前記連結部（Ｄ）は、直鎖構造であってもよいし、分岐構造であってもよいが、前記直鎖構造が好ましい。
前記連結部（Ｄ）は、親水性であってもよいし、疎水性であってもよいし、両親媒性であってもよいが、前記親水性が好ましい。
前記連結部（Ｄ）の長さは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記連結部（Ｄ）を構成する炭素原子の数などによって調節することができる。
前記連結部（Ｄ）は、親水性であってもよいし、疎水性であってもよいし、両親媒性であってもよいが、前記親水性が好ましい。
前記連結部（Ｄ）の長さは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記連結部（Ｄ）を構成する炭素原子の数などによって調節することができる。
【0030】
前記連結部（Ｄ）の化学構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルキレン基を有する構造、カルボニル基を有する構造、エーテル結合を有する構造、カルボン酸エステル結合を有する構造、これらの組合せなどが挙げられる。
前記エーテル結合を有する構造は、鎖状（例えばエチレングリコールなどの直鎖、例えばプロピレングリコールなどの分岐鎖）であってもよいし、環状（テトラヒドロピラン、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサンなどを含む構造）あってもよい。
前記エーテル結合を有する構造は、鎖状（例えばエチレングリコールなどの直鎖、例えばプロピレングリコールなどの分岐鎖）であってもよいし、環状（テトラヒドロピラン、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサンなどを含む構造）あってもよい。
【0031】
前記連結部（Ｄ）の具体例としては、アルキレン基、アルキレンオキシ基、ポリ（アルキレンオキシ）基、エステル基、アミド基、ケトン基、これらの組合せなどが挙げられる。
前記アルキレン基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、炭素数１～２０のアルキレン基が好ましく、炭素数１～１０のアルキレン基がより好ましく、炭素数１～４のアルキレン基がさらに好ましい。
前記アルキレンオキシ基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、炭素数１～１００のアルキレンオキシ基が好ましく、炭素数４～１００のアルキレンオキシ基がより好ましく、炭素数５～５０のアルキレンオキシ基がさらに好ましい。
前記ポリ（アルキレンオキシ）基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、炭素数１～１００のポリ（アルキレンオキシ）基が好ましく、炭素数５～５０のポリ（アルキレンオキシ）基がより好ましく、炭素数６～４０のポリ（アルキレンオキシ）基がさらに好ましい。
前記ポリ（アルキレンオキシ）基におけるアルキレンオキサイド単位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイドが好ましく、エチレンオキサイドがより好ましい。
前記アルキレン基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、炭素数１～２０のアルキレン基が好ましく、炭素数１～１０のアルキレン基がより好ましく、炭素数１～４のアルキレン基がさらに好ましい。
前記アルキレンオキシ基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、炭素数１～１００のアルキレンオキシ基が好ましく、炭素数４～１００のアルキレンオキシ基がより好ましく、炭素数５～５０のアルキレンオキシ基がさらに好ましい。
前記ポリ（アルキレンオキシ）基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、炭素数１～１００のポリ（アルキレンオキシ）基が好ましく、炭素数５～５０のポリ（アルキレンオキシ）基がより好ましく、炭素数６～４０のポリ（アルキレンオキシ）基がさらに好ましい。
前記ポリ（アルキレンオキシ）基におけるアルキレンオキサイド単位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイドが好ましく、エチレンオキサイドがより好ましい。
【0032】
前記連結部（Ｄ）は、血中安定性を向上させる点から、ポリエチレングリコール基が付加されたものであってもよい。
前記連結部（Ｄ）における、前記ポリエチレングリコール基の平均繰り返し数の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ベクターと前記リンカー化合物との反応性や、血中安定性の点から、１以上が好ましく、３以上がより好ましく、５以上がさらに好ましい。
前記連結部（Ｄ）における、前記ポリエチレングリコール基の平均繰り返し数の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ベクターと前記リンカー化合物との反応性の点から、１００以下が好ましく、７０以下がより好ましく、５０以下がさらに好ましい。
前記連結部（Ｄ）における、前記ポリエチレングリコール基の平均繰り返し数の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ベクターと前記リンカー化合物との反応性や、血中安定性の点から、１以上が好ましく、３以上がより好ましく、５以上がさらに好ましい。
前記連結部（Ｄ）における、前記ポリエチレングリコール基の平均繰り返し数の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ベクターと前記リンカー化合物との反応性の点から、１００以下が好ましく、７０以下がより好ましく、５０以下がさらに好ましい。
【0033】
前記リンカー化合物の重量平均分子量の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ベクターと前記リンカー化合物との反応性の点から、１００以上が好ましく、２００以上がより好ましく、３００以上がさらに好ましい。
前記リンカー化合物の重量平均分子量の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ベクターと前記リンカー化合物との反応性の点から、１０，０００以下が好ましく、８，０００以下がより好ましく、５，０００以下がさらに好ましい。
前記リンカー化合物の重量平均分子量の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ベクターと前記リンカー化合物との反応性の点から、１０，０００以下が好ましく、８，０００以下がより好ましく、５，０００以下がさらに好ましい。
【0034】
前記リンカー化合物の具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－ヘキサン酸，１１，１２－ジデヒドロ－ε－オキソ－，２，５－ジオキソ－３－スルホ－１－ピロリジニルエステル，ナトリウム塩：ＤＩＢＥＮＺ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎｅ－５（６Ｈ）－ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ， １１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ－ε－ｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－３－ｓｕｌｆｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ ｅｓｔｅｒ， ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、４，７，１０，１３，１６－ペンタオキサ－２０－アザトリコサノ酸， ２３－（１１，１２－ジデヒドロジベンズ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－１９，２３－ジオキソ－，２，５－ジオキソ－１－ピロリジニルエステル：４，７，１０，１３，１６－Ｐｅｎｔａｏｘａ－２０－ａｚａｔｒｉｃｏｓａｎｏｉｃ ａｃｉｄ， ２３－（１１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｄｉｂｅｎｚ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎ－５（６Ｈ）－ｙｌ）－１９，２３－ｄｉｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ ｅｓｔｅｒなどが挙げられる。
【0035】
－ベクターにおける官能基への前記官能基（Ａ）の結合－
前記ベクターにおける官能基への前記官能基（Ａ）の結合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記リンカー化合物と前記ベクターとを含む溶液を混合し反応させる方法、前記リガンド化合物が結合した前記リンカー化合物と前記ベクターとを含む溶液を混合し反応させる方法などが挙げられる。これらの方法の後、グリシン溶液を加えて、さらに反応させる方法であってもよい。
前記ベクターにおける官能基への前記官能基（Ａ）の結合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記リンカー化合物と前記ベクターとを含む溶液を混合し反応させる方法、前記リガンド化合物が結合した前記リンカー化合物と前記ベクターとを含む溶液を混合し反応させる方法などが挙げられる。これらの方法の後、グリシン溶液を加えて、さらに反応させる方法であってもよい。
【0036】
前記溶液の溶媒としては、水系溶媒でも有機溶媒でもよく、水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒でもよい。
前記水系溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）バッファー、リン酸バッファー、蒸留水などが挙げられる。
前記ＨＥＰＥＳバッファー、又はリン酸バッファーのｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨ４以上ｐＨ１２以下が好ましく、ｐＨ５以上ｐＨ１１以下がより好ましく、ｐＨ６以上ｐＨ１０以下がさらに好ましく、ｐＨ７以上ｐＨ９以下が特に好ましい。
前記有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、水と相溶性であることが好ましい。例えば、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール性溶媒、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン等のエーテル系溶媒、ジメチルスルホキシド等の硫黄系溶媒、ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒などが挙げられる。
前記水系溶媒と前記有機溶媒の混合比としては、特に制限はなく、不溶性の成分が顕著に生じなければよい。
前記水系溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）バッファー、リン酸バッファー、蒸留水などが挙げられる。
前記ＨＥＰＥＳバッファー、又はリン酸バッファーのｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨ４以上ｐＨ１２以下が好ましく、ｐＨ５以上ｐＨ１１以下がより好ましく、ｐＨ６以上ｐＨ１０以下がさらに好ましく、ｐＨ７以上ｐＨ９以下が特に好ましい。
前記有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、水と相溶性であることが好ましい。例えば、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール性溶媒、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン等のエーテル系溶媒、ジメチルスルホキシド等の硫黄系溶媒、ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒などが挙げられる。
前記水系溶媒と前記有機溶媒の混合比としては、特に制限はなく、不溶性の成分が顕著に生じなければよい。
【0037】
前記リンカー化合物の終濃度（グリシン溶液添加前）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１μＭ以上２００ｍＭ以下が好ましく、０．５μＭ以上１００ｍＭ以下がより好ましく、５μＭ以上８０ｍＭ以下がさらに好ましく、１０μＭ以上５０ｍＭ以下が特に好ましい。
【0038】
前記ベクターの力価としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１×１０４ｖｇ／μＬ以上１×１０１００ｖｇ／μＬ以下が好ましく、１×１０５ｖｇ／μＬ以上５×１０８０ｖｇ／μＬ以下がより好ましく、１×１０６ｖｇ／μＬ以上１×１０５０ｖｇ／μＬ以下がさらに好ましい。
【0039】
前記グリシン溶液の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１μＭ以上２０Ｍ以下が好ましく、０．５μＭ以上１０Ｍ以下がより好ましく、５μＭ以上５Ｍ以下がさらに好ましく、１０μＭ以上４Ｍ以下が特に好ましい。
【0040】
前記反応の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０℃以上７０℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましい。
前記グリシン溶液添加前の反応の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５分間以上１２０時間以下が好ましく、３０分間以上９６時間以下がより好ましく、１時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
前記グリシン溶液添加後の反応の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５分間以上１２０時間以下が好ましく、３０分間以上９６時間以下がより好ましく、１時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
前記グリシン溶液添加前の反応の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５分間以上１２０時間以下が好ましく、３０分間以上９６時間以下がより好ましく、１時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
前記グリシン溶液添加後の反応の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５分間以上１２０時間以下が好ましく、３０分間以上９６時間以下がより好ましく、１時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
【0041】
前記ベクターと前記リンカー化合物との結合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アミド結合による結合が好ましい。
【0042】
＜第２の工程＞
前記第２の工程は、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程である。
前記第２の工程は、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程である。
【0043】
－リガンド化合物－
前記リガンド化合物は、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）と、リガンド部と、を有し、さらに連結部（Ｅ）を有することができる。
前記連結部（Ｅ）を有さない場合は、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）と、前記リガンド部と、が直接結合し、前記連結部（Ｅ）を有する場合は、前記連結部（Ｅ）の一端に前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）が結合し、前記連結部（Ｅ）の他端に前記リガンド部が結合する態様が好ましい。
前記リガンド化合物は、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）と、リガンド部と、を有し、さらに連結部（Ｅ）を有することができる。
前記連結部（Ｅ）を有さない場合は、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）と、前記リガンド部と、が直接結合し、前記連結部（Ｅ）を有する場合は、前記連結部（Ｅ）の一端に前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）が結合し、前記連結部（Ｅ）の他端に前記リガンド部が結合する態様が好ましい。
【0044】
－－官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）－－
前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記官能基（Ｂ）がアジド基の場合はホスフィン基、又はアルキニル基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がアルキニル基の場合はアジド基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がアルケニル基の場合はテトラジン基、又はアルケニル基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がカルボニル基の場合はヒドラジン基、又はヒドロキシルアミン基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がホスフィン基の場合はアジド基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がテトラジン基の場合はアルケニル基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がヒドラジン基の場合はカルボニル基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がヒドロキシルアミン基の場合はカルボニル基好ましい。
前記官能基（Ｃ）は、前記リガンド化合物１分子あたり、１つであってもよく、複数であってもよい。複数の場合は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アジド基及びアルキニル基などが挙げられる。
前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記官能基（Ｂ）がアジド基の場合はホスフィン基、又はアルキニル基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がアルキニル基の場合はアジド基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がアルケニル基の場合はテトラジン基、又はアルケニル基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がカルボニル基の場合はヒドラジン基、又はヒドロキシルアミン基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がホスフィン基の場合はアジド基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がテトラジン基の場合はアルケニル基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がヒドラジン基の場合はカルボニル基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がヒドロキシルアミン基の場合はカルボニル基好ましい。
前記官能基（Ｃ）は、前記リガンド化合物１分子あたり、１つであってもよく、複数であってもよい。複数の場合は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アジド基及びアルキニル基などが挙げられる。
【0045】
－－リガンド部－－
前記リガンド化合物におけるリガンド部とは、生物における組織や細胞やタンパク質等と親和性等を有する、あるいは親和性を利用してラベル化する物質であり、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ラベル化とは、ベクターに膜透過性・標的細胞特異性などの機能を付加することであり、前記機能を付加するとは、修飾することを意味する。広義の意味ではリンカーの導入もその他の機能物質を導入しやすくなる足場機能を付加している点で修飾しているといえる。
前記リガンド化合物におけるリガンド部とは、生物における組織や細胞やタンパク質等と親和性等を有する、あるいは親和性を利用してラベル化する物質であり、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ラベル化とは、ベクターに膜透過性・標的細胞特異性などの機能を付加することであり、前記機能を付加するとは、修飾することを意味する。広義の意味ではリンカーの導入もその他の機能物質を導入しやすくなる足場機能を付加している点で修飾しているといえる。
【0046】
前記リガンド部としては、ガラクトサミン構造を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、さらにその他の構造を有することができる。
【0047】
前記ガラクトサミン構造は、ガラクトサミン残基（官能基）であって、ガラクトサミン分子そのものではない。
また、前記ガラクトサミン構造は、ポリエチレングリコール基や保護基が付加されたものであってもよい。
さらに、ガラクトサミン構造は、炭素原子やヘテロ原子を有する多環状の構造であってもよい。ここでいうヘテロ原子とは、炭素原子以外の原子であり、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、セレン原子、ケイ素原子等を挙げることができる。
また、前記ガラクトサミン構造は、ポリエチレングリコール基や保護基が付加されたものであってもよい。
さらに、ガラクトサミン構造は、炭素原子やヘテロ原子を有する多環状の構造であってもよい。ここでいうヘテロ原子とは、炭素原子以外の原子であり、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、セレン原子、ケイ素原子等を挙げることができる。
【0048】
前記ガラクトサミン構造における、前記ポリエチレングリコール基の平均繰り返し数の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、反応性の点から、１以上が好ましく、２以上がより好ましく、３以上がさらに好ましい。
前記ガラクトサミン構造における、前記ポリエチレングリコール基の平均繰り返し数の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、反応性の点から、１００以下が好ましく、７０以下がより好ましく、５０以下がさらに好ましい。
前記ガラクトサミン構造における、前記ポリエチレングリコール基の平均繰り返し数の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、反応性の点から、１００以下が好ましく、７０以下がより好ましく、５０以下がさらに好ましい。
【0049】
前記保護基とは、糖化合物に含まれる水酸基やアミノ基を保護する置換基であり、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水酸基の保護基としてはアシル基やカーボネート基やカルバメート基や環状のアセタール基やエーテル基などが挙げられる。前記アシル基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセチル基、フェニルアセチル基、ハロゲン化アセチル基、メトキシアセチル基、フェノキシアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基などが挙げられる。前記カーボネート基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｔ－ブチルカーボネート基、ベンジルカーボネート基などが挙げられる。前記カルバメート基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フェニルカルバメート基などが挙げられる。前記環状のアセタール基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メチレンアセタール基、エチリデンアセタール基、アセトナイド基、ベンジリデンアセタール基などが挙げられる。前記エーテル基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ベンジルエーテル基などが挙げられる。
例えば、アミノ基の保護基としてはアシル基やカルバメート基などが挙げられる。前記アシル基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセチル基、フェニルアセチル基、ハロゲン化アセチル基、メトキシアセチル基、フェノキシアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基などが挙げられる。前記カルバメート基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、９－フルオレニルメチルカルバメート基、フェニルカルバメート基、ｔ－ブチルカルバメート基などが挙げられる。
これらの保護基の中で、低毒性や入手性の点から、アセチル基が好ましい。
例えば、アミノ基の保護基としてはアシル基やカルバメート基などが挙げられる。前記アシル基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセチル基、フェニルアセチル基、ハロゲン化アセチル基、メトキシアセチル基、フェノキシアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基などが挙げられる。前記カルバメート基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、９－フルオレニルメチルカルバメート基、フェニルカルバメート基、ｔ－ブチルカルバメート基などが挙げられる。
これらの保護基の中で、低毒性や入手性の点から、アセチル基が好ましい。
【0050】
前記ガラクトサミン構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｎ－アセチルガラクトサミン構造が好ましい。
【0051】
－－連結部（Ｅ）－－
前記連結部（Ｅ）は、前記官能基（Ｃ）と前記リガンド部とを連結することができ、前記リンカー化合物、及び前記官能基（Ｃ）、リガンド部と反応しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記連結部（Ｅ）の構造、及び具体例は、前述のリンカー化合物における連結部（Ｄ）と同様である。
前記連結部（Ｅ）は、前記官能基（Ｃ）と前記リガンド部とを連結することができ、前記リンカー化合物、及び前記官能基（Ｃ）、リガンド部と反応しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記連結部（Ｅ）の構造、及び具体例は、前述のリンカー化合物における連結部（Ｄ）と同様である。
【0052】
前記リガンド化合物の重量平均分子量の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、反応性と血中安定性を高める効果の点から、２００以上が好ましく、２５０以上がより好ましい。
前記リガンド化合物の重量平均分子量の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、反応性と感染性の点から、５００，０００以下が好ましく、３００，０００以下がより好ましく、２００，０００以下がさらに好ましく、１００，０００以下がよりさらに好ましく、１０，０００以下が特に好ましい。
前記リガンド化合物の重量平均分子量の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、反応性と感染性の点から、５００，０００以下が好ましく、３００，０００以下がより好ましく、２００，０００以下がさらに好ましく、１００，０００以下がよりさらに好ましく、１０，０００以下が特に好ましい。
【0053】
前記リガンド化合物の具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２－アジドエチル２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド：２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ ２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅなどが挙げられる。
【0054】
－官能基（Ｂ）への官能基（Ｃ）の結合－
前記官能基（Ｂ）への官能基（Ｃ）の結合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ベクターにおける官能基への前記官能基（Ａ）の結合で得られた反応物と前記リガンド化合物とを含む溶液を混合し、反応させる方法、前記リンカー化合物と前記リガンド化合物とを含む溶液を混合し、反応させる方法などが挙げられる。
前記官能基（Ｂ）への官能基（Ｃ）の結合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ベクターにおける官能基への前記官能基（Ａ）の結合で得られた反応物と前記リガンド化合物とを含む溶液を混合し、反応させる方法、前記リンカー化合物と前記リガンド化合物とを含む溶液を混合し、反応させる方法などが挙げられる。
【0055】
前記溶液の溶媒としては、水系溶媒でも有機溶媒でもよく、水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒でもよい。
前記水系溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨＥＰＥＳバッファー、リン酸バッファー、蒸留水などが挙げられる。
前記ＨＥＰＥＳバッファー、又はリン酸バッファーのｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨ１以上ｐＨ１２以下が好ましく、ｐＨ２以上ｐＨ１２以下がより好ましく、ｐＨ３以上ｐＨ１１以下がさらに好ましく、ｐＨ４以上ｐＨ１０以下が特に好ましい。
前記有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、水と相溶性であることが好ましい。例えば、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール性溶媒、テトラヒドロフラン、１，４ジオキサン等のエーテル系溶媒、ジメチルスルホキシド等の硫黄系溶媒、ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒などが挙げられる。
前記水系溶媒と前記有機溶媒の混合比としては、特に制限はなく、不溶性の成分が顕著に生じなければよい。
前記水系溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨＥＰＥＳバッファー、リン酸バッファー、蒸留水などが挙げられる。
前記ＨＥＰＥＳバッファー、又はリン酸バッファーのｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨ１以上ｐＨ１２以下が好ましく、ｐＨ２以上ｐＨ１２以下がより好ましく、ｐＨ３以上ｐＨ１１以下がさらに好ましく、ｐＨ４以上ｐＨ１０以下が特に好ましい。
前記有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、水と相溶性であることが好ましい。例えば、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール性溶媒、テトラヒドロフラン、１，４ジオキサン等のエーテル系溶媒、ジメチルスルホキシド等の硫黄系溶媒、ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒などが挙げられる。
前記水系溶媒と前記有機溶媒の混合比としては、特に制限はなく、不溶性の成分が顕著に生じなければよい。
【0056】
前記リガンド化合物の終濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０１ｍＭ以上１００ｍＭ以下が好ましく、０．１ｍＭ以上８０ｍＭ以下がより好ましく、０．２ｍＭ以上５０ｍＭ以下がさらに好ましい。
【0057】
前記反応の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０℃以上７０℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましい。
前記反応の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５分間以上１２０時間以下が好ましく、３０分間以上９６時間以下がより好ましく、１時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
前記反応の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５分間以上１２０時間以下が好ましく、３０分間以上９６時間以下がより好ましく、１時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
【0058】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ベクターの調製工程、ベクターの精製工程、還元工程、修飾ベクターの精製工程などが挙げられる。
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ベクターの調製工程、ベクターの精製工程、還元工程、修飾ベクターの精製工程などが挙げられる。
【0059】
－ベクターの調製工程－
前記ベクターの調製工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養細胞などに、ベクターをコードする遺伝子をトランスフェクトし、細胞溶解液、又は細胞上清からベクターを調製する方法などが挙げられる。
前記ベクターの調製工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養細胞などに、ベクターをコードする遺伝子をトランスフェクトし、細胞溶解液、又は細胞上清からベクターを調製する方法などが挙げられる。
【0060】
－ベクターの精製工程－
前記ベクターの精製工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販のキットを用いて精製する方法、細胞溶解液を陽イオンカラムクロマトグラフィー、及び陰イオンカラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー、フィルター、限外ろ過膜を用いて精製する方法などが挙げられる。
前記ベクターの精製工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販のキットを用いて精製する方法、細胞溶解液を陽イオンカラムクロマトグラフィー、及び陰イオンカラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー、フィルター、限外ろ過膜を用いて精製する方法などが挙げられる。
【0061】
－還元工程－
前記還元工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ベクターにおける官能基に、前記リンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程の後、若しくは前記官能基（Ｂ）に、前記ガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程の後の反応液に、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤を加える工程、又は、精製工程後の修飾ベクターに、ＤＴＴなどの還元剤を加える工程などが挙げられる。
前記還元工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ベクターにおける官能基に、前記リンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程の後、若しくは前記官能基（Ｂ）に、前記ガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程の後の反応液に、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤を加える工程、又は、精製工程後の修飾ベクターに、ＤＴＴなどの還元剤を加える工程などが挙げられる。
【0062】
－修飾ベクターの精製工程－
前記修飾ベクターの精製工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、及び陰イオンカラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー、フィルター、限外ろ過膜を用いて精製する方法などが挙げられる。修飾反応の第１の工程と第２の工程の間で精製してもよく、第２の工程の後で精製してもよい。
前記修飾ベクターの精製工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、及び陰イオンカラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー、フィルター、限外ろ過膜を用いて精製する方法などが挙げられる。修飾反応の第１の工程と第２の工程の間で精製してもよく、第２の工程の後で精製してもよい。
【0063】
＜修飾ベクター＞
前記修飾ベクターは、ガラクトサミン構造を含むリガンド部を有し、リンカーを介して、前記リガンド部と、ベクターと、が結合しており、前記リンカーは、アミド結合により前記ベクターと結合している。
前記修飾ベクターは、前記修飾ベクターの作製方法により得られる。
前記修飾ベクターは、ガラクトサミン構造を含むリガンド部を有し、リンカーを介して、前記リガンド部と、ベクターと、が結合しており、前記リンカーは、アミド結合により前記ベクターと結合している。
前記修飾ベクターは、前記修飾ベクターの作製方法により得られる。
【0064】
前記リガンド部、及び前記ベクターは、上述のとおりである。
前記リンカーは、前記ベクターに、前記リンカー化合物を結合し、さらにリガンド化合物を結合した際に生じる、前記リンカー化合物由来の構造を有する。
前記リンカーは、前記ベクターに、前記リンカー化合物を結合し、さらにリガンド化合物を結合した際に生じる、前記リンカー化合物由来の構造を有する。
【0065】
前記修飾ベクターの血中安定性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、肝臓選択的輸送効果を向上させる点から、修飾前のベクターの血中安定性と比較して高いことが好ましく、２倍以上であることがより好ましく、３倍以上であることがさらに好ましく、５倍以上であることが特に好ましい。
また、肝臓選択的輸送効果を向上させる点から、修飾前のベクターの血中安定性と比較して、１，０００，０００倍以下であることが好ましく、５００，０００倍以下であることがより好ましく、１００，０００倍以下であることがさらに好ましい。
また、肝臓選択的輸送効果を向上させる点から、修飾前のベクターの血中安定性と比較して、１，０００，０００倍以下であることが好ましく、５００，０００倍以下であることがより好ましく、１００，０００倍以下であることがさらに好ましい。
【0066】
前記血中安定性は、８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｘ）マウスに、修飾前のベクター、又は修飾ベクターを、４×１０１３ｖｇ／１０ｍＬ／ｋｇ Ｂ．Ｗ．の用量で、尾静脈内投与し、４時間後に、ヘパリン含有ヘマトクリット採血管（ヘマトロン７０４１－０２）及び採血針を用いて、尾より微量採血後（１０μＬ以上）、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（６９５０４、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＤＮＡを５０μＬの水に溶解して抽出し、採取した血液に含まれる目的タンパク質をコードする核酸配列（目的遺伝子）のベクターゲノム数を、下記のとおり、定量ＰＣＲ法（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ３、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法）により測定することで決定する。
前記定量ＰＣＲには、１２．５μＬのＰｏｗｅｒＵｐ（商標） ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、０．１２５μＬのフォワードプライマー（５０μＭ、配列番号１）、０．１２５μＬのリバースプライマー（５０μＭ、配列番号２）、１１．２５μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水、及び１０～１０４倍まで連続希釈した１μＬの標準品又は１μＬのＤＮＡ抽出サンプルからなる試料（合計２５μＬ）を用いる。
上記試料に対してＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、９４℃／１５秒（熱変性）、６０℃／３０秒（アニーリング）、７２℃／３０秒（伸長反応）を３０サイクル繰り返すことによりＰＣＲ反応を行う。
前記ベクターが、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである場合は、上記標準品は、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（０．６７μｇ／μＬ、ＴＥ溶液、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）をＰｖｕＩＩ（タカラバイオ株式会社）で３７℃、２時間消化して直線化したものを使用する。
前記定量ＰＣＲには、１２．５μＬのＰｏｗｅｒＵｐ（商標） ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、０．１２５μＬのフォワードプライマー（５０μＭ、配列番号１）、０．１２５μＬのリバースプライマー（５０μＭ、配列番号２）、１１．２５μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水、及び１０～１０４倍まで連続希釈した１μＬの標準品又は１μＬのＤＮＡ抽出サンプルからなる試料（合計２５μＬ）を用いる。
上記試料に対してＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、９４℃／１５秒（熱変性）、６０℃／３０秒（アニーリング）、７２℃／３０秒（伸長反応）を３０サイクル繰り返すことによりＰＣＲ反応を行う。
前記ベクターが、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである場合は、上記標準品は、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（０．６７μｇ／μＬ、ＴＥ溶液、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）をＰｖｕＩＩ（タカラバイオ株式会社）で３７℃、２時間消化して直線化したものを使用する。
【0067】
（ベクターの修飾方法）
前記ベクターの修飾方法は、ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる第１の工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる第２の工程と、を含み、さらにその他の工程を有することができる。
前記ベクターの修飾方法は、ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる第１の工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる第２の工程と、を含み、さらにその他の工程を有することができる。
【0068】
ベクターの修飾方法における、前記第１の工程、前記第２の工程、及び前記その他の工程並びに前記修飾ベクターは、前記修飾ベクターの作製方法における記載のとおりである。
【0069】
（肝臓選択的輸送体）
前記肝臓選択的輸送体は、前記修飾ベクターを含み、さらにその他の成分を含むことができる。
前記修飾ベクターは、上述のとおりである。
前記肝臓選択的輸送体は、前記修飾ベクターを含み、さらにその他の成分を含むことができる。
前記修飾ベクターは、上述のとおりである。
【0070】
その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、流動化剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤などが挙げられる。これらは、１種単独でも２種以上混合して使用してもよい。
【0071】
（血中濃度安定化剤）
前記血中濃度安定化剤は、前記修飾ベクターを含み、さらにその他の成分を含むことができる。
前記修飾ベクターは、上述のとおりである。
前記血中濃度安定化剤は、前記修飾ベクターを含み、さらにその他の成分を含むことができる。
前記修飾ベクターは、上述のとおりである。
【0072】
その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、流動化剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤などが挙げられる。これらは、１種単独でも２種以上混合して使用してもよい。
【実施例0073】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【0074】
＜参考例１：ＡＡＶ２の作製＞
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ社）に、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の培地溶液（１ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍＬ）と、蛍光タンパク質ＧＦＰのｐＡＡＶ２（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）をＶＥＮＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＱ４３９５５．１）が発現するように改変したｐＡＡＶ２（１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍＬ、ベクタープラスミド）とｐＲＣ－ｍｉ３４２（１ｍｇ／ｍＬ、１．７５ｍＬ、パッケージングプラスミド、タカラバイオ株式会社）とｐＨｅｌｐｅｒ（１ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍＬ、ヘルパープラスミド、タカラバイオ株式会社）の培地溶液と、をトランスフェクションし、３７℃で８％ＣＯ２下で４日間培養することでＡＡＶ２を産生させた。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸：Ｅｔｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を加えて細胞を剥離した後、遠心分離して細胞ペレットと遠心上清を回収した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ社）に、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の培地溶液（１ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍＬ）と、蛍光タンパク質ＧＦＰのｐＡＡＶ２（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）をＶＥＮＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＱ４３９５５．１）が発現するように改変したｐＡＡＶ２（１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍＬ、ベクタープラスミド）とｐＲＣ－ｍｉ３４２（１ｍｇ／ｍＬ、１．７５ｍＬ、パッケージングプラスミド、タカラバイオ株式会社）とｐＨｅｌｐｅｒ（１ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍＬ、ヘルパープラスミド、タカラバイオ株式会社）の培地溶液と、をトランスフェクションし、３７℃で８％ＣＯ２下で４日間培養することでＡＡＶ２を産生させた。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸：Ｅｔｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を加えて細胞を剥離した後、遠心分離して細胞ペレットと遠心上清を回収した。
【0075】
＜参考例２：ＡＡＶ２の精製＞
参考例１で得られた遠心上清に、４０ｗｔ％のＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）と２．５ＭのＮａＣｌ水溶液の混合液を加えた後に４℃で１６時間静置した。遠心分離後、沈殿層を０．１ｖ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｔ８７８７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）含有ダルベッコＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、１Ｍ ＭｇＣｌ２水溶液、更にエンドヌクレアーゼで処理した。ＥＤＴＡで反応を停止した後に遠心分離して上清１を回収した。
また、参考例１で得られた細胞ペレットを０．１ｖ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｔ８７８７ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）含有ダルベッコＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、１Ｍ ＭｇＣｌ２水溶液、更にエンドヌクレアーゼで処理した。ＥＤＴＡで反応を停止した後に遠心分離して上清２を回収した。得られた上清１と上清２を混合して、陽イオンカラムクロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と陰イオンカラムクロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で精製し、濃縮後、ＡＡＶ２溶液を得た。
参考例１で得られた遠心上清に、４０ｗｔ％のＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）と２．５ＭのＮａＣｌ水溶液の混合液を加えた後に４℃で１６時間静置した。遠心分離後、沈殿層を０．１ｖ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｔ８７８７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）含有ダルベッコＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、１Ｍ ＭｇＣｌ２水溶液、更にエンドヌクレアーゼで処理した。ＥＤＴＡで反応を停止した後に遠心分離して上清１を回収した。
また、参考例１で得られた細胞ペレットを０．１ｖ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｔ８７８７ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）含有ダルベッコＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、１Ｍ ＭｇＣｌ２水溶液、更にエンドヌクレアーゼで処理した。ＥＤＴＡで反応を停止した後に遠心分離して上清２を回収した。得られた上清１と上清２を混合して、陽イオンカラムクロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と陰イオンカラムクロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で精製し、濃縮後、ＡＡＶ２溶液を得た。
【0076】
得られたＡＡＶ２について、下記のとおり、フォワードプライマー（配列番号１）及びリバースプライマー（配列番号２）を用いて、定量ＰＣＲ法（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ３、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法）により力価測定した結果、４．７×１０１０ｖｇ／μＬ（１．１５ｍＬ）であった。
前記定量ＰＣＲには、１２．５μＬのＰｏｗｅｒＵｐ（商標） ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａ２５７４２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、０．１２５μＬのフォワードプライマー（５０μＭ、配列番号１）、０．１２５μＬのリバースプライマー（５０μＭ、配列番号２）、１１．２５μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水、及び１０～１０４倍まで連続希釈した１μＬの標準品又は１０００倍希釈した１μＬのサンプルからなる試料（合計２５μＬ）を用いた。
上記試料に対してＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、９４℃／１５秒（熱変性）、６０℃／３０秒（アニーリング）、７２℃／３０秒（伸長反応）を３０サイクル繰り返すことによりＰＣＲ反応を行った。
上記標準品は、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（０．６７μｇ／μＬ、ＴＥ溶液、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）をＰｖｕＩＩ（１２４３Ａ、タカラバイオ株式会社）で３７℃、２時間消化して直線化することにより作製した。
前記定量ＰＣＲには、１２．５μＬのＰｏｗｅｒＵｐ（商標） ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａ２５７４２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、０．１２５μＬのフォワードプライマー（５０μＭ、配列番号１）、０．１２５μＬのリバースプライマー（５０μＭ、配列番号２）、１１．２５μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水、及び１０～１０４倍まで連続希釈した１μＬの標準品又は１０００倍希釈した１μＬのサンプルからなる試料（合計２５μＬ）を用いた。
上記試料に対してＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、９４℃／１５秒（熱変性）、６０℃／３０秒（アニーリング）、７２℃／３０秒（伸長反応）を３０サイクル繰り返すことによりＰＣＲ反応を行った。
上記標準品は、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（０．６７μｇ／μＬ、ＴＥ溶液、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）をＰｖｕＩＩ（１２４３Ａ、タカラバイオ株式会社）で３７℃、２時間消化して直線化することにより作製した。
【0077】
また、得られたＡＡＶ２をＭｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｉｅｎｃｅ社）を用いてタンパク定量したところ、２７１μｇ／ｍＬ（１．１５ｍＬ）であった。
【0078】
＜実施例１：ＡＡＶ２の修飾１＞
（１－１ ＨＥＰＥＳバッファーの調製）
１ＭのＨＥＰＥＳ（ｇｉｂｃｏ社）水溶液を水で希釈し、１ＭのＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ８．３の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ水溶液（ＨＥＰＥＳバッファー）を調製した。
（１－１ ＨＥＰＥＳバッファーの調製）
１ＭのＨＥＰＥＳ（ｇｉｂｃｏ社）水溶液を水で希釈し、１ＭのＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ８．３の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ水溶液（ＨＥＰＥＳバッファー）を調製した。
【0079】
（１－２ ＡＡＶ２溶液の調製）
参考例２と同様の方法で得られたＡＡＶ２溶液を、前記ＨＥＰＥＳバッファーを用いて６０μｇ／ｍＬに希釈した。
参考例２と同様の方法で得られたＡＡＶ２溶液を、前記ＨＥＰＥＳバッファーを用いて６０μｇ／ｍＬに希釈した。
【0080】
（１－３ 反応試薬１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅの調製）
前記ＨＥＰＥＳバッファーを用いて、１．２ｍＭのジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－ヘキサン酸，１１，１２－ジデヒドロ－ε－オキソ－，２，５－ジオキソ－３－スルホ－１－ピロリジニルエステル，ナトリウム塩：ＤＩＢＥＮＺ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎｅ－５（６Ｈ）－ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ，１１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ－ε－ｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－３－ｓｕｌｆｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ ｅｓｔｅｒ，ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ社）溶液である反応試薬１Ａを調製した。さらに、希釈し、反応試薬１Ｂである１．０ｍＭ、反応試薬１Ｃである０．８ｍＭ、反応試薬１Ｄである０．６ｍＭ、反応試薬１Ｅである０．４ｍＭのジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－ヘキサン酸，１１，１２－ジデヒドロ－ε－オキソ－，２，５－ジオキソ－３－スルホ－１－ピロリジニルエステル，ナトリウム塩、：ＤＩＢＥＮＺ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎｅ－５（６Ｈ）－ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ，１１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ－ε－ｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－３－ｓｕｌｆｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ ｅｓｔｅｒ，ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ溶液を調製した。
前記ＨＥＰＥＳバッファーを用いて、１．２ｍＭのジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－ヘキサン酸，１１，１２－ジデヒドロ－ε－オキソ－，２，５－ジオキソ－３－スルホ－１－ピロリジニルエステル，ナトリウム塩：ＤＩＢＥＮＺ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎｅ－５（６Ｈ）－ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ，１１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ－ε－ｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－３－ｓｕｌｆｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ ｅｓｔｅｒ，ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ社）溶液である反応試薬１Ａを調製した。さらに、希釈し、反応試薬１Ｂである１．０ｍＭ、反応試薬１Ｃである０．８ｍＭ、反応試薬１Ｄである０．６ｍＭ、反応試薬１Ｅである０．４ｍＭのジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－ヘキサン酸，１１，１２－ジデヒドロ－ε－オキソ－，２，５－ジオキソ－３－スルホ－１－ピロリジニルエステル，ナトリウム塩、：ＤＩＢＥＮＺ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎｅ－５（６Ｈ）－ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ，１１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ－ε－ｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－３－ｓｕｌｆｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ ｅｓｔｅｒ，ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ溶液を調製した。
【0081】
（１－４ 反応試薬２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅの調製）
前記ＨＥＰＥＳバッファーを用いて、２．４ｍＭの２－アジドエチル２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド：２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ ２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液である反応試薬２Ａを調製した。さらに、希釈して、反応試薬２Ｂである２．０ｍＭ、反応試薬２Ｃである１．６ｍＭ、反応試薬２Ｄである１．２ｍＭ、反応試薬２Ｅである０．８ｍＭの２－アジドエチル２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド：２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ ２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ溶液を調製した。
前記ＨＥＰＥＳバッファーを用いて、２．４ｍＭの２－アジドエチル２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド：２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ ２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液である反応試薬２Ａを調製した。さらに、希釈して、反応試薬２Ｂである２．０ｍＭ、反応試薬２Ｃである１．６ｍＭ、反応試薬２Ｄである１．２ｍＭ、反応試薬２Ｅである０．８ｍＭの２－アジドエチル２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド：２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ ２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ溶液を調製した。
【0082】
（１－５ 第１の工程）
上記の方法で調製した、２．２５ｍＬの反応試薬１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅと０．２５ｍＬの精製ＡＡＶ２溶液（６０μｇ／ｍＬ）をそれぞれ混合し、３７℃のインキュベーター中で１６時間反応させた。さらに、前記ＨＥＰＥＳバッファーで調製した、５００μＬの２Ｍグリシン溶液（Ｗａｋｏ社）を加えて、３７℃のインキュベーター中で７時間反応させることで、第１工程生成物３Ａ、第１工程生成物３Ｂ、第１工程生成物３Ｃ、第１工程生成物３Ｄ、第１工程生成物３Ｅを得た。
上記の方法で調製した、２．２５ｍＬの反応試薬１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅと０．２５ｍＬの精製ＡＡＶ２溶液（６０μｇ／ｍＬ）をそれぞれ混合し、３７℃のインキュベーター中で１６時間反応させた。さらに、前記ＨＥＰＥＳバッファーで調製した、５００μＬの２Ｍグリシン溶液（Ｗａｋｏ社）を加えて、３７℃のインキュベーター中で７時間反応させることで、第１工程生成物３Ａ、第１工程生成物３Ｂ、第１工程生成物３Ｃ、第１工程生成物３Ｄ、第１工程生成物３Ｅを得た。
【0083】
（１－６ 第２の工程）
上記の方法で調製した、３ｍＬの反応試薬２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅと、１．５ｍＬの前記第１工程生成物（３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ）の反応溶液をそれぞれ混合し、３７℃のインキュベーター中で１６時間反応させることで、修飾ベクター４Ａ、修飾ベクター４Ｂ、修飾ベクター４Ｃ、修飾ベクター４Ｄ、修飾ベクター４Ｅを得た。
反応液をＤＴＴ（ジチオトレイトール：ＤＩＴＨＩＯＴＨＲＥＩＴＯＬ）含有サンプルバッファーで還元した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ社）を行い、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で反応の進捗を確認した。
銀染色の結果を図１に示した。未修飾のＶＰ１のバンドが約８２ｋＤａで、反応後が約９２ｋＤａであり、化合物が１０ｋＤａ分、付加されたことが分かった。
上記の方法で調製した、３ｍＬの反応試薬２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅと、１．５ｍＬの前記第１工程生成物（３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ）の反応溶液をそれぞれ混合し、３７℃のインキュベーター中で１６時間反応させることで、修飾ベクター４Ａ、修飾ベクター４Ｂ、修飾ベクター４Ｃ、修飾ベクター４Ｄ、修飾ベクター４Ｅを得た。
反応液をＤＴＴ（ジチオトレイトール：ＤＩＴＨＩＯＴＨＲＥＩＴＯＬ）含有サンプルバッファーで還元した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ社）を行い、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で反応の進捗を確認した。
銀染色の結果を図１に示した。未修飾のＶＰ１のバンドが約８２ｋＤａで、反応後が約９２ｋＤａであり、化合物が１０ｋＤａ分、付加されたことが分かった。
【0084】
図１のレーン１はマーカー、レーン２は未修飾のＡＡＶ２（野生型のＡＡＶ２）、レーン３は修飾ベクター４Ａ、レーン４は修飾ベクター４Ｂ、レーン５は修飾ベクター４Ｃ、レーン６は修飾ベクター４Ｄ、レーン７は修飾ベクター４Ｅである。
【0085】
（１－７ 修飾ベクターの精製）
反応試薬１及び２との反応により得られた修飾ＡＡＶ２について、遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ－１００キロ、Ｍｅｒｃｋ社）を用いて遠心濃縮を５回繰り返し、最終的に５０ｍＭ ポロキサマー１８８含有ＨＥＰＥＳバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ポロキサマー１８８含有）にバッファー置換することで精製した。
精製後に、プライマー１（配列番号１）及びプライマー２（配列番号２）を用いて、定量ＰＣＲ法（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法）により力価測定した。
定量ＰＣＲは、参考例２と同様にして行った。
結果を表１に示した。
反応試薬１及び２との反応により得られた修飾ＡＡＶ２について、遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ－１００キロ、Ｍｅｒｃｋ社）を用いて遠心濃縮を５回繰り返し、最終的に５０ｍＭ ポロキサマー１８８含有ＨＥＰＥＳバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ポロキサマー１８８含有）にバッファー置換することで精製した。
精製後に、プライマー１（配列番号１）及びプライマー２（配列番号２）を用いて、定量ＰＣＲ法（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法）により力価測定した。
定量ＰＣＲは、参考例２と同様にして行った。
結果を表１に示した。
【0086】
【表1】
【0087】
＜実施例２：ＡＡＶ２の修飾２＞
（２－１ ＡＡＶ２溶液の調製）
参考例２と同様の方法で得られたＡＡＶ２溶液を実施例１と同様にしてＨＥＰＥＳバッファーを用いて６０μｇ／ｍＬに希釈した。
（２－１ ＡＡＶ２溶液の調製）
参考例２と同様の方法で得られたＡＡＶ２溶液を実施例１と同様にしてＨＥＰＥＳバッファーを用いて６０μｇ／ｍＬに希釈した。
【0088】
（２－２ 反応試薬１Ｆの調製）
実施例１と同様にしてＨＥＰＥＳバッファーを用いて、０．６ｍＭのジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－ヘキサン酸，１１，１２－ジデヒドロ－ε－オキソ－，２，５－ジオキソ－３－スルホ－１－ピロリジニルエステル，ナトリウム塩：ＤＩＢＥＮＺ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎｅ－５（６Ｈ）－ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ， １１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ－ε－ｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－３－ｓｕｌｆｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ ｅｓｔｅｒ，ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ社）溶液である反応試薬１Ｆを調製した。
実施例１と同様にしてＨＥＰＥＳバッファーを用いて、０．６ｍＭのジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－ヘキサン酸，１１，１２－ジデヒドロ－ε－オキソ－，２，５－ジオキソ－３－スルホ－１－ピロリジニルエステル，ナトリウム塩：ＤＩＢＥＮＺ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎｅ－５（６Ｈ）－ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ， １１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ－ε－ｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－３－ｓｕｌｆｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ ｅｓｔｅｒ，ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ社）溶液である反応試薬１Ｆを調製した。
【0089】
（２－３ 反応試薬２Ｆの調製）
実施例１と同様にしてＨＥＰＥＳバッファーを用いて、１．２ｍＭの２－アジドエチル２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド：２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ ２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液である反応試薬２Ｆを調製した。
実施例１と同様にしてＨＥＰＥＳバッファーを用いて、１．２ｍＭの２－アジドエチル２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド：２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ ２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液である反応試薬２Ｆを調製した。
【0090】
（２－４ 第１の工程）
上記の方法で調製した、２．２５ｍＬの反応試薬１Ｆと０．２５ｍＬの精製ＡＡＶ２溶液（６０μｇ／ｍＬ）を混合し、３７℃のインキュベーター中で１７時間反応させた。さらに、実施例１と同様にしてＨＥＰＥＳバッファーで調製した２Ｍのグリシン溶液（Ｗａｋｏ社）を０．５ｍＬ加えて、３７℃のインキュベーター中で６時間反応させることで、第１工程生成物３Ｆを得た。
上記の方法で調製した、２．２５ｍＬの反応試薬１Ｆと０．２５ｍＬの精製ＡＡＶ２溶液（６０μｇ／ｍＬ）を混合し、３７℃のインキュベーター中で１７時間反応させた。さらに、実施例１と同様にしてＨＥＰＥＳバッファーで調製した２Ｍのグリシン溶液（Ｗａｋｏ社）を０．５ｍＬ加えて、３７℃のインキュベーター中で６時間反応させることで、第１工程生成物３Ｆを得た。
【0091】
（２－５ 第２の工程）
上記の方法で調製した、３ｍＬの反応試薬２Ｆと、１．５ｍＬの前記第１工程生成物３Ｆの反応溶液を混合し、３７℃のインキュベーター中で１７時間反応させることで、修飾ベクター４Ｆを得た。
反応液をＤＴＴ（ジチオトレイトール：ＤＩＴＨＩＯＴＨＲＥＩＴＯＬ）含有サンプルバッファーで還元した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ社）を行い、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で反応の進捗を確認した。
銀染色の結果を図２に示した。未修飾のＶＰ１のバンドが約８２ｋＤａで、第１工程生成物のＶＰ１のバンドが約８８ｋＤａで、第２工程反応後が約９２ｋＤａであり、化合物が１０ｋＤａ分、付加されたことが分かった。
上記の方法で調製した、３ｍＬの反応試薬２Ｆと、１．５ｍＬの前記第１工程生成物３Ｆの反応溶液を混合し、３７℃のインキュベーター中で１７時間反応させることで、修飾ベクター４Ｆを得た。
反応液をＤＴＴ（ジチオトレイトール：ＤＩＴＨＩＯＴＨＲＥＩＴＯＬ）含有サンプルバッファーで還元した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ社）を行い、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で反応の進捗を確認した。
銀染色の結果を図２に示した。未修飾のＶＰ１のバンドが約８２ｋＤａで、第１工程生成物のＶＰ１のバンドが約８８ｋＤａで、第２工程反応後が約９２ｋＤａであり、化合物が１０ｋＤａ分、付加されたことが分かった。
【0092】
図２のレーン１はマーカー、レーン２は未修飾のＡＡＶ２（野生型のＡＡＶ２）、レーン３は第１工程生成物３Ｆ、レーン４は修飾ベクター４Ｆである。
【0093】
（２－６ 修飾ベクターの精製）
反応試薬１及び２との反応により得られた修飾ＡＡＶ２について、遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ－１００キロ、Ｍｅｒｃｋ社）を用いて遠心濃縮を５回繰り返し、最終的に０．０１％ポロキサマー１８８含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅにバッファー置換することで精製した。
精製後に、プライマー１（配列番号１）及びプライマー２（配列番号２）を用いて、定量ＰＣＲ法（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法）により力価測定した。
定量ＰＣＲは、参考例２と同様にして行った。
結果を表２に示した。
反応試薬１及び２との反応により得られた修飾ＡＡＶ２について、遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ－１００キロ、Ｍｅｒｃｋ社）を用いて遠心濃縮を５回繰り返し、最終的に０．０１％ポロキサマー１８８含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅにバッファー置換することで精製した。
精製後に、プライマー１（配列番号１）及びプライマー２（配列番号２）を用いて、定量ＰＣＲ法（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法）により力価測定した。
定量ＰＣＲは、参考例２と同様にして行った。
結果を表２に示した。
【0094】
【表2】
【0095】
＜実施例３：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価＞
（３－１ プレートの準備：１日目）
細胞を９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）、製品番号３５３０７２）に１００μＬ／ウェルで播種した。
肝臓細胞株である、ＨｕＨ７細胞（ＪＣＲＢ ０４０３、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）は、３ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、腎臓細胞株である、２ｖ６．１１細胞（ＡＴＣＣ由来、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋１０％ＦＣＳ）は、５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種した。
（３－１ プレートの準備：１日目）
細胞を９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）、製品番号３５３０７２）に１００μＬ／ウェルで播種した。
肝臓細胞株である、ＨｕＨ７細胞（ＪＣＲＢ ０４０３、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）は、３ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、腎臓細胞株である、２ｖ６．１１細胞（ＡＴＣＣ由来、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋１０％ＦＣＳ）は、５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種した。
【0096】
（３－２ 感染：２日目）
１日目に準備したプレートに細胞が良好に成育していることを確認後、ベクター液、コントロール液（各細胞に使用している培地）を、各濃度３ウェルずつ、２０μＬ／ウェルで添加した。
ベクター液としては、実施例１で作製した、修飾ベクター４Ａ（１．２ｍＭ）、修飾ベクター４Ｂ（１．０ｍＭ）、修飾ベクター４Ｃ（０．８ｍＭ）、修飾ベクター４Ｄ（０．６ｍＭ）、修飾ベクター４Ｅ（０．４ｍＭ）を、各細胞培養に使用している培地を用いて、３ｘ１０４ｖｇ／ｃｅｌｌｓ、１ｘ１０５ｖｇ／ｃｅｌｌｓとなるよう調整したものを使用した。コントロール液としては、参考例２と同様の方法で得られたＡＡＶ２（未修飾ＡＡＶ２ベクター）を、各細胞培養に使用している培地を用いて、３ｘ１０４ｖｇ／ｃｅｌｌｓ、１ｘ１０５ｖｇ／ｃｅｌｌｓとなるよう調整したものを使用した。
１日目に準備したプレートに細胞が良好に成育していることを確認後、ベクター液、コントロール液（各細胞に使用している培地）を、各濃度３ウェルずつ、２０μＬ／ウェルで添加した。
ベクター液としては、実施例１で作製した、修飾ベクター４Ａ（１．２ｍＭ）、修飾ベクター４Ｂ（１．０ｍＭ）、修飾ベクター４Ｃ（０．８ｍＭ）、修飾ベクター４Ｄ（０．６ｍＭ）、修飾ベクター４Ｅ（０．４ｍＭ）を、各細胞培養に使用している培地を用いて、３ｘ１０４ｖｇ／ｃｅｌｌｓ、１ｘ１０５ｖｇ／ｃｅｌｌｓとなるよう調整したものを使用した。コントロール液としては、参考例２と同様の方法で得られたＡＡＶ２（未修飾ＡＡＶ２ベクター）を、各細胞培養に使用している培地を用いて、３ｘ１０４ｖｇ／ｃｅｌｌｓ、１ｘ１０５ｖｇ／ｃｅｌｌｓとなるよう調整したものを使用した。
【0097】
（３－３ 発現状況の確認及び定量：５日目）
（３－３－１）
顕微鏡を用いて通常光で細胞の状態を確認した後、蛍光モードで発現状況を確認した。
（３－３－２）
蛍光の定量は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ（Ｌａｂ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。
ＦＬフィルター（Ｅｘ ４８５ｎｍ Ｅｍ ５３８ｎｍ）を使用した。
（３－３－３：測定値のグラフ化）
コントロール（ベクターなし）の測定値をバックグラウンドとして、各サンプルの測定値から引いたものを各サンプルの蛍光強度とした。
ＨｕＨ７細胞に感染させたときの蛍光強度（アセント強度）を図３に示し、２ｖ６．１１細胞に感染させたときの蛍光強度（アセント強度）を図４に示した。
図３及び４の各修飾ベクター又は未修飾ベクターのバーにおいて、左側が３ｘ１０４ｖｇ／ｃｅｌｌｓとなるよう調整したものを使用したときの結果であり、右側が１ｘ１０５ｖｇ／ｃｅｌｌｓとなるよう調整したものを使用したときの結果である。
（３－３－１）
顕微鏡を用いて通常光で細胞の状態を確認した後、蛍光モードで発現状況を確認した。
（３－３－２）
蛍光の定量は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ（Ｌａｂ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。
ＦＬフィルター（Ｅｘ ４８５ｎｍ Ｅｍ ５３８ｎｍ）を使用した。
（３－３－３：測定値のグラフ化）
コントロール（ベクターなし）の測定値をバックグラウンドとして、各サンプルの測定値から引いたものを各サンプルの蛍光強度とした。
ＨｕＨ７細胞に感染させたときの蛍光強度（アセント強度）を図３に示し、２ｖ６．１１細胞に感染させたときの蛍光強度（アセント強度）を図４に示した。
図３及び４の各修飾ベクター又は未修飾ベクターのバーにおいて、左側が３ｘ１０４ｖｇ／ｃｅｌｌｓとなるよう調整したものを使用したときの結果であり、右側が１ｘ１０５ｖｇ／ｃｅｌｌｓとなるよう調整したものを使用したときの結果である。
【0098】
＜実施例４：Ｉｎ ｖｉｖｏ評価＞
（４－１ 被験物質の投与）
被験物質群（Ｇ１、Ｇ２）として、８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｘ）マウス（オリエンタル酵母工業株式会社経由）に、被験物質（参考例２と同様の方法で得られたＡＡＶ２（未修飾ＡＡＶ２ベクター）：Ｇ１、又は実施例と同様の方法で得られた修飾ベクター４Ｄ：Ｇ２）を、４×１０１３ｖｇ／１０ｍＬ／ｋｇ Ｂ．Ｗ． （１匹あたりのＡＡＶ投与量≒１×１０１２ｖｇ／ｍｏｕｓｅ）の用量で、尾静脈内投与した（ｎ＝３）。
バッファーコントロール群（Ｇ０）として、８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｘ）マウス（オリエンタル酵母工業株式会社経由）に、２５０μＬのＰＢＳ（１６２－１８５４７ 富士フイルム和光純薬株式会社製）を尾静脈内投与した（ｎ＝３）。
上記の被験物質は、投与液調製時に濃度を再測定した。濃度調製後は、４℃で保存した。
（４－１ 被験物質の投与）
被験物質群（Ｇ１、Ｇ２）として、８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｘ）マウス（オリエンタル酵母工業株式会社経由）に、被験物質（参考例２と同様の方法で得られたＡＡＶ２（未修飾ＡＡＶ２ベクター）：Ｇ１、又は実施例と同様の方法で得られた修飾ベクター４Ｄ：Ｇ２）を、４×１０１３ｖｇ／１０ｍＬ／ｋｇ Ｂ．Ｗ． （１匹あたりのＡＡＶ投与量≒１×１０１２ｖｇ／ｍｏｕｓｅ）の用量で、尾静脈内投与した（ｎ＝３）。
バッファーコントロール群（Ｇ０）として、８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｘ）マウス（オリエンタル酵母工業株式会社経由）に、２５０μＬのＰＢＳ（１６２－１８５４７ 富士フイルム和光純薬株式会社製）を尾静脈内投与した（ｎ＝３）。
上記の被験物質は、投与液調製時に濃度を再測定した。濃度調製後は、４℃で保存した。
【0099】
（４－２ 被験物質の血中濃度の測定）
被験物質の投与から４及び２４時間後に、ヘパリン含有ヘマトクリット採血管（ヘマトロン７０４１－０２）及び採血針を用いて、尾より微量採血（１０μＬ以上）後、１．５ｍＬチューブに移し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（６９５０４、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＤＮＡを５０μＬの水に溶解して抽出し、採取した血液に含まれるＡＡＶ濃度を、プライマー１（配列番号１）及びプライマー２（配列番号２）を用いて、定量ＰＣＲ法（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法）により測定した。
定量ＰＣＲは、「１０～１０４倍まで連続希釈した１μＬの標準品又は１０００倍希釈した１μＬのサンプル」を「１０～１０４倍まで連続希釈した１μＬの標準品又は１μＬのＤＮＡ抽出サンプル」に代えた以外は、参考例２と同様にして行った。
結果を図５に示した。
被験物質の投与から４及び２４時間後に、ヘパリン含有ヘマトクリット採血管（ヘマトロン７０４１－０２）及び採血針を用いて、尾より微量採血（１０μＬ以上）後、１．５ｍＬチューブに移し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（６９５０４、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＤＮＡを５０μＬの水に溶解して抽出し、採取した血液に含まれるＡＡＶ濃度を、プライマー１（配列番号１）及びプライマー２（配列番号２）を用いて、定量ＰＣＲ法（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法）により測定した。
定量ＰＣＲは、「１０～１０４倍まで連続希釈した１μＬの標準品又は１０００倍希釈した１μＬのサンプル」を「１０～１０４倍まで連続希釈した１μＬの標準品又は１μＬのＤＮＡ抽出サンプル」に代えた以外は、参考例２と同様にして行った。
結果を図５に示した。
【0100】
図５の結果より、被験物質の投与から４時間後の血中ＡＡＶ濃度は、修飾ベクター投与群（Ｇ２）において、未修飾ＡＡＶ２ベクター投与群（Ｇ１）の約１０倍であり、本発明の修飾ベクターは、適度な血中安定性を示すことが分かった。
バッファーコントロール群（Ｇ０）の血中ＡＡＶ濃度は、測定限界以下であった。
バッファーコントロール群（Ｇ０）の血中ＡＡＶ濃度は、測定限界以下であった。
【0101】
（４－３ マウスの解剖）
被験物質の投与後２１日目に、イソフルラン（ファイザー株式会社）吸入麻酔下でマウスを開腹及び開胸し、０．１％のヘパリンナトリウム注（エイワイファーマ株式会社）含有ＰＢＳ ３０ｍＬを心尖部から注入し、灌流を行った。その後、出血ポイントである肝臓末端を切開して放血死させ、脳・肝臓・腎臓を摘出した。
被験物質の投与後２１日目に、イソフルラン（ファイザー株式会社）吸入麻酔下でマウスを開腹及び開胸し、０．１％のヘパリンナトリウム注（エイワイファーマ株式会社）含有ＰＢＳ ３０ｍＬを心尖部から注入し、灌流を行った。その後、出血ポイントである肝臓末端を切開して放血死させ、脳・肝臓・腎臓を摘出した。
【0102】
（４－４ マウス臓器（肝臓・脳・腎臓）の凍結ブロック作製）
採取組織を細切後、４％パラホルムアルデヒド溶液（０９１５４－８５、ナカライテスク株式会社）に一晩固定させた後、３０％スクロース（０００－６９５０５、キシダ化学株式会社）溶液で合計２日間浸漬させた。
その後、Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（４５８３、サクラファインテックジャパン株式会社）を用いて、組織を液体窒素で急速凍結することで凍結ブロックを作製した。
採取組織を細切後、４％パラホルムアルデヒド溶液（０９１５４－８５、ナカライテスク株式会社）に一晩固定させた後、３０％スクロース（０００－６９５０５、キシダ化学株式会社）溶液で合計２日間浸漬させた。
その後、Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（４５８３、サクラファインテックジャパン株式会社）を用いて、組織を液体窒素で急速凍結することで凍結ブロックを作製した。
【0103】
（４－５ 蛍光免疫組織染色 Ｆｒｅｅ ｆｌｏａｔｉｎｇ法）
クリオスタット（ＭＩＣＲＯＭ ＨＭ５０５Ｅ）を用いて凍結ブロックから凍結組織切片（肝臓：２０μｍ、脳：４０μｍ、腎臓：２０μｍ）を作製し、ＰＢＳで満たした２４ｗｅｌｌ組織培養用マイクロプレートの各ｗｅｌｌに個体毎の切片を添加した。
ＰＢＳＸ（０．３％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｔ８７８７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）含有ＰＢＳ）で２回洗浄（１０分）し、０．５ｍＬの０．２％ＢＳＡ溶液（ウシ血清アルブミン：Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（Ａ９６４７－１００Ｇ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）含有ＰＢＳＸ）で６０分ブロッキング処理し、０．５ｍＬの一次抗体溶液（１０００倍希釈抗ＧＦＰ抗体（ａｂ１３９７０、Ａｂｃａｍ）含有０．２％ＢＳＡ溶液）に４℃で一晩反応させた。
クリオスタット（ＭＩＣＲＯＭ ＨＭ５０５Ｅ）を用いて凍結ブロックから凍結組織切片（肝臓：２０μｍ、脳：４０μｍ、腎臓：２０μｍ）を作製し、ＰＢＳで満たした２４ｗｅｌｌ組織培養用マイクロプレートの各ｗｅｌｌに個体毎の切片を添加した。
ＰＢＳＸ（０．３％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｔ８７８７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）含有ＰＢＳ）で２回洗浄（１０分）し、０．５ｍＬの０．２％ＢＳＡ溶液（ウシ血清アルブミン：Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（Ａ９６４７－１００Ｇ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）含有ＰＢＳＸ）で６０分ブロッキング処理し、０．５ｍＬの一次抗体溶液（１０００倍希釈抗ＧＦＰ抗体（ａｂ１３９７０、Ａｂｃａｍ）含有０．２％ＢＳＡ溶液）に４℃で一晩反応させた。
【0104】
その後、ＰＢＳＸで洗浄（１０分）を３回行い、０．５ｍＬの二次抗体溶液（１０００倍希釈Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７ ｇｏａｔ 抗ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ａ－２１４４９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）含有０．２％ＢＳＡ溶液）に室温で３時間反応させた。
【0105】
その後、ＰＢＳで１０分間洗浄し、０．５ｍＬのＤＡＰＩ溶液（１０００倍希釈ＤＡＰＩ（３４０－０７９７１、株式会社 同仁化学研究所）含有ＰＢＳ）に室温で１０分間反応させた。ＰＢＳで１０分間洗浄後、蛍光用封入材（Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｌａｓｓ、Ｐ３６９８４ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、回収した切片をスライドガラスに封入した。
【0106】
（４－６ 切片の画像解析）
共焦点定量イメージサイトメーター（ＣＱ１、横川電機株式会社）を用いて、封入後のスライドガラス標本を撮影した。
結果を図６Ａ（肝臓における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 低倍）、図６Ｂ（肝臓における、抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 低倍）、図６Ｃ（肝臓における、ＤＡＰＩ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ発現細胞、及び抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 低倍）、図６Ｄ（肝臓における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 高倍）、図６Ｅ（肝臓における、抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 高倍）、図６Ｆ（肝臓における、ＤＡＰＩ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ発現細胞、及び抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 高倍）、図７Ａ（脳における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 低倍）、図７Ｂ（脳における、抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 低倍）、図７Ｃ（脳における、ＤＡＰＩ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ発現細胞、及び抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 低倍）、図７Ｄ（脳における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 高倍）、図７Ｅ（脳における、抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 高倍）、図７Ｆ（脳における、ＤＡＰＩ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ発現細胞、及び抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 高倍）、図８Ａ（腎臓における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 低倍）、図８Ｂ（腎臓における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 低倍）、図８Ｃ（腎臓における、ＤＡＰＩ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ発現細胞、及び抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 低倍）、図８Ｄ（腎臓における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 高倍）、図８Ｅ（腎臓における、抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 高倍）、図８Ｆ（腎臓における、ＤＡＰＩ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ発現細胞、及び抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 高倍）に示した。
前記低倍は１０倍での撮影であり、前記高倍は２０倍での撮影である。
共焦点定量イメージサイトメーター（ＣＱ１、横川電機株式会社）を用いて、封入後のスライドガラス標本を撮影した。
結果を図６Ａ（肝臓における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 低倍）、図６Ｂ（肝臓における、抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 低倍）、図６Ｃ（肝臓における、ＤＡＰＩ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ発現細胞、及び抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 低倍）、図６Ｄ（肝臓における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 高倍）、図６Ｅ（肝臓における、抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 高倍）、図６Ｆ（肝臓における、ＤＡＰＩ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ発現細胞、及び抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 高倍）、図７Ａ（脳における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 低倍）、図７Ｂ（脳における、抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 低倍）、図７Ｃ（脳における、ＤＡＰＩ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ発現細胞、及び抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 低倍）、図７Ｄ（脳における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 高倍）、図７Ｅ（脳における、抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 高倍）、図７Ｆ（脳における、ＤＡＰＩ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ発現細胞、及び抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 高倍）、図８Ａ（腎臓における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 低倍）、図８Ｂ（腎臓における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 低倍）、図８Ｃ（腎臓における、ＤＡＰＩ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ発現細胞、及び抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 低倍）、図８Ｄ（腎臓における、Ｖｅｎｕｓ発現細胞 高倍）、図８Ｅ（腎臓における、抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 高倍）、図８Ｆ（腎臓における、ＤＡＰＩ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ発現細胞、及び抗ＧＦＰ抗体陽性細胞 高倍）に示した。
前記低倍は１０倍での撮影であり、前記高倍は２０倍での撮影である。
【0107】
画像解析ソフトウェアであるＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， ｖｅｒ．１．５３）を用い、各蛍光免疫組織染色像におけるＶｅｎｕｓ発現割合 （緑色）及び抗ＧＦＰ抗体陽性割合（赤色）を測定（組織面積に対する各蛍光色の面積が占める割合）し、ＡＡＶによる遺伝子導入の程度を数値化した。
結果を図９Ａ（肝臓 Ｖｅｎｕｓ発現割合）、図９Ｂ（肝臓 抗ＧＦＰ抗体陽性割合）、図１０Ａ（脳 Ｖｅｎｕｓ発現割合）、図１０Ｂ（脳 抗ＧＦＰ抗体陽性割合）、図１１Ａ（腎臓 Ｖｅｎｕｓ発現割合）、図１１Ｂ（腎臓 抗ＧＦＰ抗体陽性割合）に示した。
結果を図９Ａ（肝臓 Ｖｅｎｕｓ発現割合）、図９Ｂ（肝臓 抗ＧＦＰ抗体陽性割合）、図１０Ａ（脳 Ｖｅｎｕｓ発現割合）、図１０Ｂ（脳 抗ＧＦＰ抗体陽性割合）、図１１Ａ（腎臓 Ｖｅｎｕｓ発現割合）、図１１Ｂ（腎臓 抗ＧＦＰ抗体陽性割合）に示した。
【0108】
【0109】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含み、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、修飾ベクターの作製方法である。
＜２＞ 前記ガラクトサミン構造が、Ｎ－アセチルガラクトサミン構造である、前記＜１＞に記載の作製方法である。
＜３＞ 前記ベクターにおける官能基が、アミノ基、グアニジノ基、水酸基、カルボキシル基、及びインドール基のいずれかである、前記＜１＞又は＜２＞に記載の作製方法である。
＜４＞ 前記ベクターにおける官能基が、リジン残基、アルギニン残基、チロシン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基における官能基である、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の作製方法。
＜５＞ 前記官能基（Ａ）が、スクシンイミジル基である、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜６＞ 前記官能基（Ｂ）が、アジド基、アルキニル基、アルケニル基、カルボニル基、ホスフィン基、テトラジン基、ヒドラジン基、及びヒドロキシルアミン基のいずれかである、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜７＞ 前記リンカー化合物の重量平均分子量が５０００以下である、前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜８＞ 前記リンカー化合物が、ポリエチレングリコール基を有する、前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜９＞ 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜１０＞ 前記ベクターにおける官能基が、前記アデノ随伴ウイルスベクターのカプシドを構成する官能基である、前記＜９＞に記載の作製方法である。
＜１１＞ 前記ベクターにおける官能基がアミノ基であり、前記官能基（Ａ）がスクシンイミジル基であり、前記官能基（Ｂ）又は（Ｃ）がアジド基及び／又はアルキニル基であり、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有する、前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜１２＞ 前記ベクターにおける官能基がリジン残基における官能基であり、前記官能基（Ｂ）又は（Ｃ）がアジド基及び／又はアルキニル基であり、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有する、前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜１３＞ 前記修飾ベクターの血中安定性が、修飾前と比較して高い、前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜１４＞ ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含み、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、ベクターの修飾方法である。
＜１５＞ 修飾されたベクターの血中安定性が、修飾前と比較して高い、前記＜１４＞に記載のベクターの修飾方法である。
＜１６＞ ガラクトサミン構造を含むリガンド部を有し、リンカーを介して、前記リガンド部と、ベクターと、が結合しており、前記リンカーは、アミド結合により前記ベクターと結合していることを特徴とする修飾ベクターである。
＜１７＞ 前記＜１６＞に記載の修飾ベクターを含むことを特徴とする、肝臓選択的輸送体である。
＜１８＞ 前記＜１６＞に記載の修飾ベクターを含むことを特徴とする、血中濃度安定化剤である。
＜１＞ ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含み、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、修飾ベクターの作製方法である。
＜２＞ 前記ガラクトサミン構造が、Ｎ－アセチルガラクトサミン構造である、前記＜１＞に記載の作製方法である。
＜３＞ 前記ベクターにおける官能基が、アミノ基、グアニジノ基、水酸基、カルボキシル基、及びインドール基のいずれかである、前記＜１＞又は＜２＞に記載の作製方法である。
＜４＞ 前記ベクターにおける官能基が、リジン残基、アルギニン残基、チロシン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基における官能基である、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の作製方法。
＜５＞ 前記官能基（Ａ）が、スクシンイミジル基である、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜６＞ 前記官能基（Ｂ）が、アジド基、アルキニル基、アルケニル基、カルボニル基、ホスフィン基、テトラジン基、ヒドラジン基、及びヒドロキシルアミン基のいずれかである、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜７＞ 前記リンカー化合物の重量平均分子量が５０００以下である、前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜８＞ 前記リンカー化合物が、ポリエチレングリコール基を有する、前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜９＞ 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜１０＞ 前記ベクターにおける官能基が、前記アデノ随伴ウイルスベクターのカプシドを構成する官能基である、前記＜９＞に記載の作製方法である。
＜１１＞ 前記ベクターにおける官能基がアミノ基であり、前記官能基（Ａ）がスクシンイミジル基であり、前記官能基（Ｂ）又は（Ｃ）がアジド基及び／又はアルキニル基であり、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有する、前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜１２＞ 前記ベクターにおける官能基がリジン残基における官能基であり、前記官能基（Ｂ）又は（Ｃ）がアジド基及び／又はアルキニル基であり、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有する、前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜１３＞ 前記修飾ベクターの血中安定性が、修飾前と比較して高い、前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の作製方法である。
＜１４＞ ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有する前記リガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含み、前記リガンド化合物が、ガラクトサミン構造を有することを特徴とする、ベクターの修飾方法である。
＜１５＞ 修飾されたベクターの血中安定性が、修飾前と比較して高い、前記＜１４＞に記載のベクターの修飾方法である。
＜１６＞ ガラクトサミン構造を含むリガンド部を有し、リンカーを介して、前記リガンド部と、ベクターと、が結合しており、前記リンカーは、アミド結合により前記ベクターと結合していることを特徴とする修飾ベクターである。
＜１７＞ 前記＜１６＞に記載の修飾ベクターを含むことを特徴とする、肝臓選択的輸送体である。
＜１８＞ 前記＜１６＞に記載の修飾ベクターを含むことを特徴とする、血中濃度安定化剤である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【配列表】