▶ ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023052057
(43)【公開日】2023-04-11
(54)【発明の名称】リンパ系疾患の診断及び治療のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20230404BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20230404BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALI20230404BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230404BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230404BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230404BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230404BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20230404BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230404BHJP
A61K 31/436 20060101ALI20230404BHJP
A61K 31/4709 20060101ALI20230404BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20230404BHJP
A61K 31/4184 20060101ALI20230404BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20230404BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20230404BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6827 Z ZNA
C12Q1/6883 Z
C12N15/12
C12M1/34 Z
C12M1/00 A
A61K45/00
A61P7/00
A61P43/00 121
A61K31/436
A61K31/4709
A61K31/519
A61K31/4184
A61K45/06
A61K38/21
A61P43/00 105
【審査請求】有
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022206535
(22)【出願日】2022-12-23
(62)【分割の表示】P 2019511562の分割
【原出願日】2017-08-30
(31)【優先権主張番号】62/382,147
(32)【優先日】2016-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】301040958
【氏名又は名称】ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＨＩＬＤＲＥＮ’Ｓ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＯＦ ＰＨＩＬＡＤＥＬＰＨＩＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ハゥコーナルソン， ホーコン
(72)【発明者】
【氏名】リー， トン
(72)【発明者】
【氏名】ティエン， リーフォン
(72)【発明者】
【氏名】グェン， ケニー
(72)【発明者】
【氏名】スレイマン， パトリック
(57)【要約】 （修正有）
【課題】リンパ異常の診断及び治療のための組成物及び方法を提供する。
【解決手段】ヒト患者におけるリンパ異常を診断することを補助するための方法であって、患者から得た生物学的試料においてＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数における一塩基変異（ＳＮＶ）を検出することを含み、前記ＳＮＶの存在は、リンパ異常を示す、方法である。
【選択図】なし
【解決手段】ヒト患者におけるリンパ異常を診断することを補助するための方法であって、患者から得た生物学的試料においてＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数における一塩基変異（ＳＮＶ）を検出することを含み、前記ＳＮＶの存在は、リンパ異常を示す、方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト患者におけるリンパ異常を診断するための方法であって、
ａ）患者から核酸を含む生物学的試料を得ること；
ｂ）
ｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するか、又は
ｉｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数においてＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するか
どうかを決定するために核酸をアッセイすること；並びに
ｃ）ｉ）若しくはｉｉ）のＳＮＶが存在する場合、患者をリンパ異常と診断すること
を含む、方法。
ａ）患者から核酸を含む生物学的試料を得ること；
ｂ）
ｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するか、又は
ｉｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数においてＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するか
どうかを決定するために核酸をアッセイすること；並びに
ｃ）ｉ）若しくはｉｉ）のＳＮＶが存在する場合、患者をリンパ異常と診断すること
を含む、方法。
【請求項2】
ヒト患者におけるリンパ異常を診断するための方法であって、
ａ）ヒト患者から遺伝子型配列情報を得ること；
ｂ）
ｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するか、又は
ｉｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数においてＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するか
どうかを決定するために核酸をアッセイすること；並びに
ｃ）ｉ）若しくはｉｉ）のＳＮＶが存在する場合、患者をリンパ異常と診断すること
を含む、方法。
ａ）ヒト患者から遺伝子型配列情報を得ること；
ｂ）
ｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するか、又は
ｉｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数においてＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するか
どうかを決定するために核酸をアッセイすること；並びに
ｃ）ｉ）若しくはｉｉ）のＳＮＶが存在する場合、患者をリンパ異常と診断すること
を含む、方法。
【請求項3】
ヒト患者におけるリンパ異常を治療するための方法であって、
ａ）患者から核酸を含む生物学的試料を得ること；
ｂ）
ｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するか、又は
ｉｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数においてＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するか
どうかを決定するために核酸をアッセイすること；並びに
ｃ）ｉ）若しくはｉｉ）のうちの１つ又は複数のＳＮＶを有すると同定された患者に前記リンパ異常の治療に適した１又は複数の薬剤を投与し、それによってリンパ異常を治療すること
を含む、方法。
ａ）患者から核酸を含む生物学的試料を得ること；
ｂ）
ｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するか、又は
ｉｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数においてＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するか
どうかを決定するために核酸をアッセイすること；並びに
ｃ）ｉ）若しくはｉｉ）のうちの１つ又は複数のＳＮＶを有すると同定された患者に前記リンパ異常の治療に適した１又は複数の薬剤を投与し、それによってリンパ異常を治療すること
を含む、方法。
【請求項4】
ヒト患者におけるリンパ異常を治療するための方法であって、
ａ）ヒト患者から遺伝子型配列情報を得ること；
ｂ）
ｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するか、又は
ｉｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数においてＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するか
どうかを決定するために核酸をアッセイすること；並びに
ｃ）ｉ）若しくはｉｉ）のうちの１つ又は複数のＳＮＶを有すると同定された患者に、リンパ異常の治療に適した１又は複数の薬剤を単独で又は組み合わせて投与し、それによってリンパ異常を治療すること
を含む、方法。
ａ）ヒト患者から遺伝子型配列情報を得ること；
ｂ）
ｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するか、又は
ｉｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数においてＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するか
どうかを決定するために核酸をアッセイすること；並びに
ｃ）ｉ）若しくはｉｉ）のうちの１つ又は複数のＳＮＶを有すると同定された患者に、リンパ異常の治療に適した１又は複数の薬剤を単独で又は組み合わせて投与し、それによってリンパ異常を治療すること
を含む、方法。
【請求項5】
前記リンパ異常の治療に適した前記薬剤が、１又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、１又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、及び前記いずれの阻害剤の１つ又は複数の組み合わせの群から選択される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項6】
前記１若しくは複数の薬剤又は１若しくは複数の阻害剤が、表１及び／又は２に記載される、請求項３から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
ＳＮＶが、
ａ）ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ；
ｂ）ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ；
ｃ）ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ；
ｄ）ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ；
ｅ）ＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐ、及び
ｆ） ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）又はｅ）の前記ＳＮＶの１つ又は複数と連鎖不平衡にあるＳＮＶ
から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
ａ）ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ；
ｂ）ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ；
ｃ）ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ；
ｄ）ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ；
ｅ）ＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐ、及び
ｆ） ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）又はｅ）の前記ＳＮＶの１つ又は複数と連鎖不平衡にあるＳＮＶ
から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
ヒト患者におけるリンパ異常を治療するための方法であって、１又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、１又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、及び前記いずれの阻害剤の１つ又は複数の組み合わせから選択される薬剤の有効量を投与し、それによってリンパ異常を治療することを含む、方法。
【請求項9】
リンパ異常が、リンパ管の異常な形成及び／又は組織の異常増殖によって特徴付けられる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
リンパ異常がリンパ管腫症（ＬＡＭ）である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
リンパ異常がリンパ管腫症（ＧＬＡ）である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
リンパ異常が、心膜滲出液、胸膜滲出液又は腹膜滲出液を含む乳び性滲出液によって特徴付けられる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
生物学的試料における検出後にＳＮＶを同定する報告を作成することをさらに含む、請求項１又は請求項３に記載の方法。
【請求項14】
該方法において同定されたＳＮＶに基づいて、リンパ異常に対して提案された治療（１つ又は複数）を見極める報告を作成することをさらに含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記リンパ異常を治療するために適した１又は複数の薬剤の有効量を、診断された患者に投与することをさらに含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項16】
前記薬剤が、１又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、１又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、及び前記いずれの阻害剤の１つ又は複数の組み合わせから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記薬剤又は前記阻害剤が表１及び２に列挙されている、請求項１５又は請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
ＰＩ３Ｋシグナル伝達を阻害する少なくとも１の薬剤が投与される、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達を阻害する少なくとも１の薬剤が投与される、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
ｍＴＯＲシグナル伝達を阻害する少なくとも１の薬剤が投与される、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
ラパマイシンが投与される、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
ＢＥＺ－２３５（ダクトリシブ）が投与される、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
薬剤が、１００μＭ未満、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
薬剤が、ｍＴＯＲシグナル伝達を阻害し、かつ付加的な生物学的活性を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項25】
付加的な生物学的活性が、ＰＩ３Ｋの阻害、ＦＫ５０６結合タンパク質の阻害、ＤＮＡ－ＰＫの阻害、ｐ１１０の阻害、又はｐ７０Ｓ６Ｋの阻害である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
患者がＥＰＨＢ４においてＳＮＶを有しない、請求項１から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
患者がＰＩＫ３Ｒ４においてＳＮＶを有しない、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
患者がＰＩＫ３Ｒ６においてＳＮＶを有しない、請求項１から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
患者がｍＴＯＲにおいてＳＮＶを有しない、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
患者がＡＲＡＦにおいてＳＮＶを有しない、請求項１から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
患者が、以下のＳＮＶ：
ａ）ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ；
ｂ）ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ；
ｃ）ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ；
ｄ）ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ；及び
ｅ）ＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐ
の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つを任意の組み合わせで有する、請求項１から３０のいずれか１項に記載の方法。
ａ）ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ；
ｂ）ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ；
ｃ）ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ；
ｄ）ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ；及び
ｅ）ＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐ
の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つを任意の組み合わせで有する、請求項１から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
患者が、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において、前記ＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶを有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
治療が、全身化学療法、インターフェロンアルファ、放射線療法、及び／又は外科手術を施すことをさらに含む、請求項１から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
１又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、１又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、及び前記いずれの阻害剤のうちの１つ又は複数の組み合わせから選択される１又は複数の薬剤を投与し、それによってリンパ構造を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長させることを含む、ＥＰＨＢ４におけるＳＮＶ ｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ又は前記ＳＮＶと連鎖不均衡にあるＳＮＶを有する患者におけるリンパ異常を治療するための方法。
【請求項35】
前記薬剤が表１及び２に列挙されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
１又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、１又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、及び前記いずれの阻害剤のうちの１つ又は複数の組み合わせから選択される１又は複数の薬剤を投与し、それによってリンパ構造を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長させることを含む、ＰＩＫ３Ｒ４におけるＳＮＶ ｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ又は前記ＳＮＶと連鎖不均衡にあるＳＮＶを有する患者におけるリンパ異常を治療するための方法。
【請求項37】
前記薬剤が表１及び２に列挙されている、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
１又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、１又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、及び前記いずれの阻害剤のうちの１つ又は複数の組み合わせから選択される１又は複数の薬剤を投与し、それによってリンパ構造を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長させることを含む、ＰＩＫ３Ｒ６におけるＳＮＶ ｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ又は前記ＳＮＶと連鎖不均衡にあるＳＮＶを有する患者におけるリンパ異常を治療するための方法。
【請求項39】
前記薬剤が表１及び２に列挙されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
１又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、１又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、及び前記いずれの阻害剤のうちの１つ又は複数の組み合わせから選択される１又は複数の薬剤を投与し、それによってリンパ構造を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長させることを含む、ｍＴＯＲにおけるＳＮＶ ｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ又は前記ＳＮＶと連鎖不均衡にあるＳＮＶを有する患者におけるリンパ異常を治療するための方法。
【請求項41】
前記薬剤が表１及び２に列挙されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
１又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、１又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、及び前記いずれの阻害剤のうちの１つ又は複数の組み合わせから選択される１又は複数の薬剤を投与し、それによってリンパ構造を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長させることを含む、ＡＲＡＦにおけるＳＮＶ ｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐ又は前記ＳＮＶと連鎖不均衡にあるＳＮＶを有する患者におけるリンパ異常を治療するための方法。
【請求項43】
前記薬剤が表１及び２に列挙されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ若しくは複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するか、又は前記ＳＮＶと連鎖不均衡にあるＳＮＶが存在するかどうかを決定するために核酸をアッセイする工程が、ポリヌクレオチド試料を分析して、特異的ハイブリダイゼーションの検出、対立遺伝子サイズの測定、制限断片長多型分析、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション分析、一塩基プライマー伸長反応、及び増幅されたポリヌクレオチドの配列決定からなる群から選択される方法を実施することによって前記ＳＮＶの存在を決定する工程をさらに含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項45】
生物学的試料がＤＮＡを含む、請求項１から４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
生物学的試料がＲＮＡを含む、請求項１から４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記ＳＮＶ（１つ又は複数）を含む核酸が、ヒト患者の単離された細胞から得られる、請求項１から４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
ａ）ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ；
ｂ）ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ；
ｃ）ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ；
ｄ）ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ；及び
ｅ）ＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐ
から選択されるＳＮＶを有する核酸をコードする、単離されたベクター。
ｂ）ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ；
ｃ）ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ；
ｄ）ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ；及び
ｅ）ＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐ
から選択されるＳＮＶを有する核酸をコードする、単離されたベクター。
【請求項49】
請求項４８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項50】
請求項４９に記載の細胞を含むトランスジェニック動物。
【請求項51】
マウス又はゼブラフィッシュである、請求項５０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項52】
ａ）請求項１から５１のいずれか１項に記載されるような少なくとも１つのＳＮＶ又は前記ＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶを含む少なくとも１の核酸を発現する細胞を提供すること、
ｂ）ａ）のＳＮＶに対応する同種野生型配列を発現する細胞を提供すること；
ｃ）ａ）及びｂ）の細胞を、試験剤と接触させること；並びに
ｄ）前記薬剤が、工程ｂ）のものと比較して、工程ａ）の細胞の細胞シグナル伝達を変化させるかどうかを分析すること
を含む、細胞シグナル伝達を変化させる薬剤を同定するための方法。
ｂ）ａ）のＳＮＶに対応する同種野生型配列を発現する細胞を提供すること；
ｃ）ａ）及びｂ）の細胞を、試験剤と接触させること；並びに
ｄ）前記薬剤が、工程ｂ）のものと比較して、工程ａ）の細胞の細胞シグナル伝達を変化させるかどうかを分析すること
を含む、細胞シグナル伝達を変化させる薬剤を同定するための方法。
【請求項53】
前記薬剤がＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤である、請求項４２に記載の方法。
【請求項54】
前記ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤が、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ－１０４０）、ピマセルチブ（ＡＳ－７０３０２６）、ＴＡＫ－７３３、ＡＺＤ８３３０、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ－１６２、ＡＲＲＹ－４３８１６２）、ＳＬ－３２７、レファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９、Ｂａｙ ８６－９７６６）、及びコビメチニブ（ＧＤＣ－０９７３、ＲＧ７４２０）から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記阻害剤がセルメチニブである、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤の投与をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項57】
薬剤の組み合わせが投与され、前記組み合わせが、
ａ）リダフォロリムスとトラメチニブ；
ｂ）リダフォロリムスとセルメチニブ又はコビメチニブ；
ｃ）ＢＥＺ２３５とセルメチニブ；
ｄ）オミパリシブとセルメチニブ又はトラメチニブ；
ｅ）エベロリムスとトラメチニブ又はセルメチニブ；
ｆ）シロリムスとリダフォロリムスとセルメチニブ；
ｇ）シロリムスとリダフォロリムスとトラメチニブ；
ｈ）トルキニブとトラメチニブ；
ｉ）ＢＥＺ２３５とトルキニブとトラメチニブ；及び
ｊ）シロリムスとゲダトリシブとトラメチニブ
からなる群から選択される、請求項３又は請求項４に記載の方法。
ａ）リダフォロリムスとトラメチニブ；
ｂ）リダフォロリムスとセルメチニブ又はコビメチニブ；
ｃ）ＢＥＺ２３５とセルメチニブ；
ｄ）オミパリシブとセルメチニブ又はトラメチニブ；
ｅ）エベロリムスとトラメチニブ又はセルメチニブ；
ｆ）シロリムスとリダフォロリムスとセルメチニブ；
ｇ）シロリムスとリダフォロリムスとトラメチニブ；
ｈ）トルキニブとトラメチニブ；
ｉ）ＢＥＺ２３５とトルキニブとトラメチニブ；及び
ｊ）シロリムスとゲダトリシブとトラメチニブ
からなる群から選択される、請求項３又は請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、２０１６年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／３８２１４７号の優先権を主張し、その内容全体は出典明示により本明細書に援用される。
本出願は、２０１６年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／３８２１４７号の優先権を主張し、その内容全体は出典明示により本明細書に援用される。
【0002】
発明の分野
本発明は、リンパ系の遺伝学、個別化医療、及び奇形の分野に関する。より具体的には、本発明は、リンパ管腫症（Lymphangiomatosis）及び他のリンパ管腫症（generalized lymphatic anomalies）（ＧＬＡ）に関連する症状を改善するための新しい遺伝的標的及び治療的処置計画を提供する。
本発明は、リンパ系の遺伝学、個別化医療、及び奇形の分野に関する。より具体的には、本発明は、リンパ管腫症（Lymphangiomatosis）及び他のリンパ管腫症（generalized lymphatic anomalies）（ＧＬＡ）に関連する症状を改善するための新しい遺伝的標的及び治療的処置計画を提供する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
本発明が属する最新技術を説明するために、本明細書を通していくつかの刊行物及び特許文書が引用されている。これらの引用のそれぞれは、あたかも完全に記載されているかのように、出典明示により本明細書に援用される。
本発明が属する最新技術を説明するために、本明細書を通していくつかの刊行物及び特許文書が引用されている。これらの引用のそれぞれは、あたかも完全に記載されているかのように、出典明示により本明細書に援用される。
【0004】
リンパ系は体液の循環を維持し、身体を病気から守り、小腸の脂肪を吸収するのに重要な役割を果たす（１）。複雑なリンパ管の異常は、リンパ管の異常な形成と組織の異常増殖によって特徴付けられる。患者は、重篤な肺疾患を引き起こし得る重複する症状をしばしば呈する（２、３）。リンパ異常の例には、リンパ管腫症（ＧＬＡ）、リンパ管拡張症、及び乳び性滲出液（心膜、胸膜又は腹膜）が含まれる。診断における重要な課題のために、複雑なリンパ異常の研究は分類と命名法の不一致によって妨げられてきた（３－６）。複雑なリンパ異常の分子遺伝学的病因はあまり理解されていないが、リンパ系の先天性奇形は、根底にある遺伝的病因に関連しているように見える（７－９）。実際、生殖細胞系突然変異及び体細胞突然変異の両方が、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ及びＲａｓ／ＭＡＰＫ経路に収束する遺伝子において同定されている（１、８）。
【0005】
ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ及びＲａｓ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路の破壊又は異常は、成熟リンパ管ネットワークの構築中の正常な拡大及びリモデリングを損なうことが示されており、このような破壊はリンパ管疾患に関連している。哺乳類ラパマイシン標的タンパク質複合体１（ｍＴＯＲＣ１）活性の上昇をもたらす、ＡＫＴ１及びＰＩＫ３ＣＡの機能獲得型突然変異が、プロテウス症候群（ＯＭＩＭ １７６９２０）、ＣＬＯＶＥＳ症候群（ＯＭＩＭ ６１２９１８）及びクリッペル・トレノネー・ウェーバー症候群（ＯＭＩＭ １４９０００）などの症候群の一部を構成するリンパ管奇形の患者で確認された（９－１１）。ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＰＴＰＮ１１、ＳＯＳ１及びＲＡＳＡ１の突然変異は、ＲＡＳ経路活性の調節不全をもたらし、ヌーナン症候群（ＯＭＩＭ １６３９５０）、コステロ症候群（ＯＭＩＭ ２１８０４０）、心臓・顔・皮膚症候群（ＯＭＩＭ １１５１５０）及び毛細血管奇形－動静脈奇形（ＣＭ－ＡＶＭ）症候群（ＯＭＩＭ ６０８３５４）においてリンパ浮腫又はリンパ管拡張症を引き起こす（１２－１７）。
【0006】
これらの理解にもかかわらず、リンパ管腫症／リンパ管拡張症（ＬＡＭ）、リンパ管腫症（ＧＬＡ）、乳び性滲出液などのリンパ管疾患及びリンパ異常を有する患者の同定に使用するための遺伝的バイオマーカーが欠如しており、これらの疾患に関連する遺伝的マーカーを標的とする治療薬も同様である。
【発明の概要】
【0007】
発明の概要
３世代家族のうち６人がＧＬＡを含むリンパ異常、及び重大な静脈うっ血に罹患したため、その家族のメンバーを、新規生殖細胞系列突然変異を探索するためにエクソーム配列決定（ＥＳ）を使用して分析した。ＥＰＨＢ４のヘテロ接合生殖細胞系列突然変異が同定された。ゼブラフィッシュにおけるＥＰＨＢ４ノックダウン研究は、ＥＰＨＢ４がリンパ管の発達と分岐、ｍＴＯＲシグナル伝達を含むプロセスに役割を果たしていることを確認した。
３世代家族のうち６人がＧＬＡを含むリンパ異常、及び重大な静脈うっ血に罹患したため、その家族のメンバーを、新規生殖細胞系列突然変異を探索するためにエクソーム配列決定（ＥＳ）を使用して分析した。ＥＰＨＢ４のヘテロ接合生殖細胞系列突然変異が同定された。ゼブラフィッシュにおけるＥＰＨＢ４ノックダウン研究は、ＥＰＨＢ４がリンパ管の発達と分岐、ｍＴＯＲシグナル伝達を含むプロセスに役割を果たしていることを確認した。
【0008】
ＧＬＡ又はリンパ管拡張症と診断された１３家族のコホートが、そのすべてが乳び性滲出液を有する少なくとも１人の家族のメンバーを有しており、配列決定された。ＰＩ３Ｋ複合体の調節サブユニットをコードするＰＩＫ３Ｒ６におけるホモ接合変異体、ＭＴＯＲにおけるヘテロ接合突然変異、ＰＩＫ３Ｒ４におけるヘテロ接合突然変異、及びｍＴＯＲ経路の相互作用因子であるＲａｓ／ＭＡＰＫ経路に関与するＡＲＡＦにおける反復性新規機能獲得型突然変異が同定された。
【0009】
したがって、本発明の一実施態様において、ヒト患者におけるリンパ異常を診断するための方法が提供される。例示的な方法は、患者から核酸を含む生物学的試料を得ること、ｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するか、又はｉｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数においてＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するかどうかを決定するために核酸をアッセイすること；及びｉ）又はｉｉ）のＳＮＶが存在する場合、患者をリンパ異常と診断することを含む。別の態様において、ヒト患者におけるリンパ異常を診断するための方法は、ヒト患者から遺伝子型配列情報を得ること、ｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するか、又はｉｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数においてＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するかどうかを決定するために核酸をアッセイすること；及びｉ）又はｉｉ）のＳＮＶが存在する場合、患者をリンパ異常と診断することを伴う。
【0010】
本発明はまた、ヒト患者におけるリンパ異常を治療するための方法を提供する。例示的な方法は、患者から核酸を含む生物学的試料を得ること；ｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＡＮＶ）が存在するか、又はｉｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数においてＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するかどうかを決定するために核酸をアッセイすること；及びｉ）又はｉｉ）のうちの１つ又は複数のＳＮＶを有すると同定された患者に前記リンパ異常の治療に適した１つ又は複数の薬剤を投与し、それによってリンパ異常を治療することを含む。この方法の代替の実施態様において、遺伝子型情報は患者から得られ、ｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するか、又はｉｉ）ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数においてＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するかどうかを決定するためにアッセイされ；及びｉ）又はｉｉ）のうちの１つ又は複数のＳＮＶを有すると同定された患者に前記リンパ異常の治療に適した１つ又は複数の薬剤を投与し、それによってリンパ異常を治療する。この方法の代替の実施態様において、遺伝子型情報は患者から得られる。
【0011】
特定の実施態様において、リンパ異常は、リンパ管の異常な形成及び／又は組織の異常増殖によって特徴付けられる。他の実施態様において、リンパ異常は、リンパ管腫症（ＬＡＭ）である。別の実施態様において、リンパ異常は、リンパ管腫症（ＧＬＡ）である。リンパ異常は、心膜滲出液、胸膜滲出液、又は腹膜滲出液を含む乳び性滲出液によって特徴付けることができる。
【0012】
診断方法は、生物学的試料における検出後にＳＮＶを同定する報告を作成することをさらに含み得る。上記の治療方法は、その方法において同定されたＳＮＶに基づいて、リンパ異常に対して提案された治療（１つ又は複数）を見極める報告を作成することをさらに含むことができる。
【0013】
さらに別の実施態様において、本明細書に記載の診断方法は、前記リンパ異常を治療するために適した１つ又は複数の薬剤の有効量を、診断された患者に投与することをさらに含むことができる。
【0014】
治療方法の特定の実施態様において、１つ又は複数のリンパ異常関連ＳＮＶを保有する患者に投与される薬剤は、１つ又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１つ又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、及び前記阻害剤のうちのいずれかの１つ又は複数の組み合わせから選択される。他の実施態様において、薬剤又は前記阻害剤は表１及び２に記載される。いくつかの実施態様において、薬剤がｍＴｏｒ阻害剤であるとき、ラパマイシン及び／又はＢＥＺ－２３５（ダクトリシブ）が投与される。特定の実施態様において、１つ又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１つ又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、及び／又は１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤は、１００μＭ未満、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【0015】
本発明の別の態様において、ｍＴＯＲシグナル伝達を阻害する薬剤はまた、付加的な生物学的活性を有する。これらには、限定されないが、ＰＩ３Ｋの阻害、ＦＫ５０６結合タンパク質の阻害、ＤＮＡ－ＰＫの阻害、ｐ１１０の阻害、又はｐ７０Ｓ６Ｋの阻害が挙げられる。いくつかの実施態様において、患者は、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのそれぞれにおいて、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのＳＮＶを有する。いくつかの実施態様において、患者はＥＰＨＢ４においてＳＮＶを有しない。いくつかの実施態様において、患者はＰＩＫ３Ｒ４においてＳＮＶを有しない。いくつかの実施態様において、患者はＰＩＫ３Ｒ６においてＳＮＶを有しない。いくつかの実施態様において、患者はｍＴＯＲにおいてＳＮＶを有しない。いくつかの実施態様において、患者はＡＲＡＦにおいてＳＮＶを有しない。
【0016】
いくつかの実施態様において、表１及び２に記載された薬剤は組み合わせて使用される。これらの組み合わせは、限定されないが、ａ）リダフォロリムス（Ｒｉｄａｆｏｒｏｌｉｍｕｓ）及びトラメチニブ（Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）；ｂ）リダフォロリムス及びセルメチニブ（Ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ）又はコビメチニブ（Ｃｏｂｉｍｅｔｉｎｉｂ）；ｃ）ＢＥＺ２３５及びセルメチニブ；ｄ）オミパリシブ（Ｏｍｉｐａｌｉｓｉｂ）及びセルメチニブ又はトラメチニブ；ｅ）エベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）及びトラメチニブ又はセルメチニブ；ｆ）シロリムス（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、リダフォロリムス及びセルメチニブ；ｇ）シロリムス、リダフォロリムス及びトラメチニブ；ｈ）トルキニブ（Ｔｏｒｋｉｎｉｂ）及びトラメチニブ；ｉ）ＢＥＺ２３５、トルキニブ及びトラメチニブ；並びにｊ）シロリムス及びゲダトリシブ（Ｇｅｄａｔｏｌｉｓｉｂ）及びトラメチニブが挙げられる。他の実施態様において、治療は、全身化学療法、インターフェロンアルファ、放射線療法、及び／又は手術を施すことをさらに含む。
【0017】
いくつかの実施態様において、ＳＮＶは、ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ；ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ；ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ；ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ；及びＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐから選択される。
【0018】
いくつかの実施態様において、診断方法は、ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃの検出を含む。いくつかの実施態様において、診断方法は、１つ又は複数のｍＴｏｒ阻害剤、１つ又は複数のＰＩ３Ｋ阻害剤、及び１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤から選択される１つ又は複数の薬剤により前記患者を治療することをさらに含む。他の実施態様において、薬剤は表１－２から選択され、それによってリンパ構造の１つ又は複数を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長する。
【0019】
いくつかの実施態様において、診断方法はＥＰＨＢ４におけるｃ２３３４＋１Ｇ＞Ｃを検出すること、並びに少なくとも１つ又は複数のｍＴｏｒ阻害剤、１つ又は複数のＰＩ３Ｋ阻害剤、及び１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独で又は組み合わせて投与することを含む。他の実施態様において、薬剤は表１－２から選択され、それによってリンパ管構造の１つ又は複数を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長する。
【0020】
いくつかの実施態様において、診断方法は、ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇの検出を含む。いくつかの実施態様において、診断方法は、１つ又は複数のｍＴｏｒ阻害剤、１つ又は複数のＰＩ３Ｋ阻害剤、及び１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独で又は組み合わせて用いて前記患者を治療することをさらに含む。他の実施態様において、薬剤は表１－２から選択され、それによってリンパ構造の１つ又は複数を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長する。
【0021】
いくつかの実施態様において、診断方法は、ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇを検出すること、並びに１つ又は複数のｍＴｏｒ阻害剤、１つ又は複数のＰＩ３Ｋ阻害剤、及び１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独で又は組み合わせて投与することを含む。他の実施態様において、投与のために少なくとも１つの薬剤が表１－２から選択され、それによってリンパ管構造の１つ又は複数を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長する。
【0022】
いくつかの実施態様において、診断方法は、ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔの検出を含む。いくつかの実施態様において、診断方法は、１つ又は複数のｍＴｏｒ阻害剤、１つ又は複数のＰＩ３Ｋ阻害剤、及び１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独で又は組み合わせて用いて前記患者を治療することをさらに含む。他の実施態様において、表１－２からの薬剤が選択され、それによってリンパ構造の１つ又は複数を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長する。
【0023】
いくつかの実施態様において、診断方法は、ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔを検出すること、並びに１つ又は複数のｍＴｏｒ阻害剤、１つ又は複数のＰＩ３Ｋ阻害剤、及び１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独で又は組み合わせて投与することを含む。いくつかの実施態様において、表１－２からの少なくとも１つの薬剤が投与され、それによってリンパ管構造の１つ又は複数を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長する。
【0024】
いくつかの実施態様において、診断方法は、ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌの検出を含む。いくつかの実施態様において、診断方法は、１つ又は複数のｍＴｏｒ阻害剤、１つ又は複数のＰＩ３Ｋ阻害剤、及び１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独で又は組み合わせて用いて前記患者を治療することをさらに含む。他の実施態様において、表１－２からの薬剤が投与され、それによってリンパ構造の１つ又は複数を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長する。
【0025】
いくつかの実施態様において、診断方法は、ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌを検出すること、並びにｍＴｏｒ阻害剤、１つ又は複数のＰＩ３Ｋ阻害剤、及び１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独で又は組み合わせて投与することを含む。他の実施態様において、表１－２からの少なくとも１つの薬剤が投与され、それによってリンパ管構造の１つ又は複数を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長する。
【0026】
いくつかの実施態様において、診断方法は、ＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐの検出を含む。いくつかの実施態様において、診断方法は、１つ又は複数のｍＴｏｒ阻害剤、１つ又は複数のＰＩ３Ｋ阻害剤、及び１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独で又は組み合わせて用いて前記患者を治療することをさらに含む。いくつかの実施態様において、表１－２からの薬剤が投与され、それによってリンパ構造の１つ又は複数を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長する。
【0027】
いくつかの実施態様において、診断方法は、ＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐを検出すること、並びに１つ又は複数のｍＴｏｒ阻害剤、１つ又は複数のＰＩ３Ｋ阻害剤、及び１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独で又は組み合わせて投与することを含む。いくつかの実施態様において、表１－２からの少なくとも１つの薬剤が投与され、それによってリンパ管構造の１つ又は複数を改善し、乳び性胸膜滲出液を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用の漸減を可能にし、又は生存期間を延長する。ＡＲＡＦにおいてＳＮＶを有する対象において、薬剤はＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤である。治療に適したＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤は、限定されないが、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ－１０４０）、ピマセルチブ（Ｐｉｍａｓｅｒｔｉｂ）（ＡＳ－７０３０２６）、ＴＡＫ－７３３、ＡＺＤ８３３０、ビニメチニブ（Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ）（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ－１６２、ＡＲＲＹ－４３８１６２）、ＳＬ－３２７、レファメチニブ（Ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂ）（ＲＤＥＡ１１９、Ｂａｙ ８６－９７６６）、及びコビメチニブ（ＧＤＣ－０９７３、ＲＧ７４２０）が挙げられる。
【0028】
いくつかの実施態様において、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異体（ＳＮＶ）が存在するかどうかを決定するために核酸をアッセイする工程は、特異的ハイブリダイゼーションの検出、対立遺伝子サイズの測定、制限断片長多型分析、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション分析、一塩基プライマー伸長反応、及び増幅されたポリヌクレオチドの配列決定からなる群から選択されるプロセスを実行することによって前記ＳＮＶの存在を決定するために、ポリヌクレオチド試料を分析する工程をさらに含む。
【0029】
いくつかの実施態様において、生物学的試料はＤＮＡを含む。
【0030】
いくつかの実施態様において、生物学的試料はＲＮＡを含む。
【0031】
いくつかの実施態様において、前記ＳＮＶ（１つ又は複数）を含む核酸は、ヒト患者の単離された細胞から得られる。
【0032】
いくつかの実施態様において、単離されたベクターはＳＮＶを有する核酸をコードし、ここでＳＮＶは、ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ；ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ；ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ；ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ；及びＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐから選択される。
【0033】
いくつかの実施態様において、宿主細胞は、ＳＮＶを有する核酸をコードする単離されたベクターを含む。いくつかの実施態様において、トランスジェニック動物は、宿主細胞を含む。いくつかの実施態様において、トランスジェニック動物は、マウス又はゼブラフィッシュである。
【0034】
いくつかの実施態様において、薬剤の効果をスクリーニングする方法は、宿主細胞又はトランスジェニック動物を、１つ又は複数のｍＴｏｒ阻害剤、１つ又は複数のＰＩ３Ｋ阻害剤、及び１つ又は複数のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独で又は組み合わせて接触させること、又は表１－２からの薬剤と接触させることを含む。いくつかの実施態様において、スクリーニングされる薬剤の効果は、ゼブラフィッシュにおける尾部レスキュー（caudal rescue）又は分岐レスキュー（branching rescue）である。いくつかの実施態様において、スクリーニングされる薬剤の効果は、ｍＴＯＲのリン酸化である。
【0035】
いくつかの実施態様において、細胞シグナル伝達を変化させる薬剤を同定する方法は、上記のように少なくとも１つのＳＮＶを含む少なくとも１つの核酸を発現する細胞を提供すること、ＳＮＶを欠く同種野生型配列を発現する細胞を提供すること；両方の細胞集団を試験薬剤と接触させること；及び前記薬剤が、前記ＳＮＶを欠く細胞と比較して、ＳＮＶを含む核酸を保有する細胞の細胞シグナル伝達を変化させるかどうかを分析することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】家族－１の血統及びＥＰＨＢ４突然変異の同時分離パターン。白丸は罹患していない女性を示し、白四角は罹患していない男性を示す；ベタ塗り図形は罹患した対象を示す。ＥＰＨＢ４遺伝子型が、ＤＮＡが試験に利用可能であった各対象についての記号の下に示されている。
【図2】血管発達においてＥＰＨＢ４が果たす役割の概略図。
【図3A-3B】ＥＰＨＢ４突然変異は不活性ＥＰＨＢ４キナーゼへと導く。図３Ａにおいて、２９３Ｔ細胞を、野生型ＥＰＨＢ４単独、突然変異体ＥＰＨＢ４単独、又は野生型と突然変異体の示された比率の混合物で一過性にトランスフェクトした。溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ホスホチロシン（ｐＴｙｒ、上）又はＥＰＨＢ４（下）についてブロットした。図３Ｂでは、Ａ３７５細胞を、野生型ＥＰＨＢ４、突然変異体ＥＰＨＢ４でトランスフェクトし、又はトランスフェクトしないままにした。コントロールとして、プレート結合エフリンＢ２ Ｆｃ又はヒトＩｇＧ１のいずれかにより細胞を刺激した。細胞を溶解し、トランスフェクトしたタンパク質を免疫沈降させた。免疫沈降物を、ホスホチロシン（上）又はＥＰＨＢ４（中）についてブロットした。同等の発現を実証するために、全細胞溶解物をＥＰＨＢ４についてブロットした（下）。
【図4】２ｄｐｆ（受精後の日数（days post-fertilization））にて、エクソン１３モルホリノを異なるローディング濃度で使用したゼブラフィッシュにおけるＥＰＨＢ４のｃＤＮＡノックダウンを示すゲル。エクソン１３は２１６塩基対を有する。Ｃ＝コントロール（モルホリノなし）。
【図5A-5D】ｅｐｈｂ４ａノックダウンは、体節間血管系において、ｍＴＯＲシグナル伝達依存性の、尾部血管叢及び誤って導かれる血管の拡大を誘導する。モルホリノが媒介するｅｐｈｂ４ａのノックダウン（図５Ｂ）は、コントロール（図５Ａ）と比較して２．５ｄｐｆで尾部血管系の拡大及び融合を誘導する（矢頭）。図５Ｃは、４ｄｐｆで、ゼブラフィッシュ血管系が背腹方向に突出した体節間血管（矢印）並びにより細いリンパ管（矢頭）からなることを示す。リンパ管脊索傍線（lymphatic parachordal line）は、体幹に沿って水平に走り（下向き矢頭）、一方、セグメント間のリンパ管は下向きに突出する（上向き矢頭）。図５Ｄは、ｅｐｈｂ４ａノックダウンが、血管（矢印）及びリンパ管（矢頭）に似ている誤って導かれる血管を誘導することを示す。（図５Ｃ及び５Ｄは、２つの隣接する共焦点スキャンから合併されている）。
【図5E-5H】図５Ｅは、２．５ｄｐｆでｅｐｈｂ４ａモルホリノを注入した幼虫の５２％に尾部神経叢の欠陥が検出され、４日目に誤分岐（mis-branching）血管系が４６％で存在することを示す。ラパマイシンは、２．５ｄｐｆ（図５Ｆ）及び４ｄｐｆ（図５Ｇ）において欠陥のある動物の数を有意に減らすことができる。図５Ｈは、ＢＥＺ－２３５が４日目に同様に分岐欠陥をレスキューすることを示す。
【図6A-6D】ｐｉｋ３ｒ６ノックダウンは、ｍＴＯＲシグナル伝達依存性の誤分岐体節間血管を誘導する。図６Ａ（コントロール）及び６Ｂ（ｐｉｋ３ｒ６モルホリノ）は、ｐｉｋ３ｒ６のモルホリノ媒介ノックダウンが、血管（矢印）及びリンパ管（矢頭）に似ている血管の誤分岐を誘導することを示す（パネルは２つの隣接する共焦点スキャンから併合されている）。体幹血管の欠陥は、エクソン４（図６Ｃ）及びエクソン１３（図６Ｄ）を標的とするモルホリノによって誘導され得る。
【図7A-7D】モルホリノ媒介ｐｉｋ３ｒ４ノックダウンは、誤って導かれる体節間血管を誘導するコントロール注入幼虫は、４ｄｐｆで正常な血管構造を示し（図７Ａ）、一方、ｐｉｋ３ｒ４ノックダウンは、血管（矢頭）又はリンパ管（矢印）に似ている血管における誤分岐を誘導する（図７Ｂ－７Ｃ）。図７Ｄは、欠陥は、コントロール注入幼虫のわずか５％で検出されたが、ｐｉｋ３ｒ４モルホリノ注入幼虫の１６％に検出されたことを示す。
【図8A-8B】過活動性のｍＴＯＲＣ１は誤分岐表現型に寄与し、ｍＴＯＲ阻害剤は表現型をレスキューする。図８Ａは、ＰＩＫ３Ｒ６モルホリノ又はコントロールモルホリノのいずれかにより処置し、ラパマイシン若しくはＢＥＺ２３５により未処置であるか又は処置したゼブラフィッシュ幼虫からの溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ホスホ－ｍＴＯＲ Ｓ２４４８又はホスホ－ｐ７０Ｓ６Ｋ Ｔ３８９についてブロットした。ベータアクチンのブロッティングをローディングコントロールとして使用した。図８Ｂは、ＥＰＨＢ４モルホリノ又はコントロールモルホリノのいずれかで処置し、ラパマイシンで未処置又は処置したゼブラフィッシュ幼虫からの溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ホスホ－ｍＴＯＲ Ｓ２４４８又はホスホ－ｐ７０Ｓ６Ｋ Ｔ３８９についてブロットした。ベータアクチンのブロッティングをローディングコントロールとして使用した。
【図9】遺伝子編集による野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＥＰＨＢ４突然変異体細胞のウエスタンブロッティング分析。ＥＰＨＢ４スプライス改変突然変異を含む細胞は、野生型細胞よりも高いＰ－ｐ７０Ｓ６Ｋレベルを示した。ベータアクチンのブロッティングをローディングコントロールとして使用した。
【図10】ｍＴＯＲ Ｐ２２７３Ｌ突然変異体は、タンパク質キナーゼ活性の増加を示す。フラッグタグベクター、野生型ｍＴＯＲ及びＰ２２７３Ｌ－ｍＴＯＲ突然変異体でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞のウエスタンブロッティング分析。活性化は、ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化の増加によって反映されている。ｅ．ｖ．＝空のベクター。ベータアクチンのブロッティングをローディングコントロールとして使用した。
【図11A】ＡＲＡＦ Ｓ２１４Ｐ突然変異は、ＭＡＰＫ活性を増加させ、ゼブラフィッシュにおけるヒトＡＲＡＦ突然変異体の過剰発現は、血管系の欠陥をもたらした。（図１１Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物を、ＦＬＡＧタグ付き野生型ＡＲＡＦ又はＳ２１４Ｐ－ＡＲＡＦ突然変異体でトランスフェクトした。免疫沈降は抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）抗体を使用して行い、続いて指示された抗体を使用してウエスタンブロットを行った。細胞溶解物のアリコートをウエスタンブロットにより分析した。活性化は、１４－３－３タンパク質との結合の障害によるＥＲＫのリン酸化の増加によって反映された。
【図11B】（図１１Ｂ）Ｔｏｌ２ゲートウェイキットを使用して、Ｔｇ（ｆｌｉ１：ＡＲＡＦ－Ｖ２ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ）系統を作製した。簡潔には、ヒトＳ２１４Ｐ突然変異体又は野生型ＡＲＡＦ ｃＤＮＡに、ｆｉｌ１プロモーターを有するＴｏｌ２コンストラクトを含むトランスポゾンドナープラスミドを注入した。一過性モザイク発現は、自己触媒的Ｖ２ａタンパク質切断部位によってＡＲＡＦに連結されたｍＣｈｅｒｒｙによって視覚化された。
【図11E-11J】（図１１Ｅ）拡大した尾部血管の欠陥は、２ｄｐｆで、ヒトＡＲＡＦ Ｓ２１４Ｐのトランスジェニック発現の２１％において検出されたが、野生型では検出されなかった（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（図１１Ｆ及び図１１Ｇ）ｍＴＯＲＣ１阻害剤ラパマイシン（図１１Ｆ）とＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲＣ１の両方を標的とするＢＥＺ２３５（図１１Ｇ）は、一過性トランスジェニックゼブラフィッシュに対して治療効果を示さなかった（ｎ．ｓ．、有意ではない）。（図１１Ｈ、図１１Ｉ、及び図１１Ｊ）ＭＥＫ阻害薬、Ｕ０１２６（図１１Ｈ、＊＊Ｐ＜０．０１）、コビメチニブ（図１１Ｉ、＊＊Ｐ＜０．０１）及びセルメチニブ（図１１Ｊ、＊＊＊Ｐ＜０．００１）は、２ｄｐｆで尾部血管系の拡大及び融合を有する幼虫の数が有意に減少した。
【図11K-11L】（図１１Ｌ及び図１１Ｋ）ゼブラフィッシュにおけるヒトＡＲＡＦ Ｓ２１４Ｐのトランスジェニック発現は、正常な背側／腹側血管形成に深刻な影響を与えることが見出され（図１１Ｌ）、一方野生型ＡＲＡＦ発現は影響がなかった（図１１Ｋ）。
【図12】ＬＧＡ関連突然変異Ａ－ＲａｆＳ２１４Ｐは、内皮細胞の遊走特性を損なった。細胞遊走を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーを使用して測定した。Ａ－Ｒａｆ ｗｔ又はＡ－Ｒａｆ－Ｓ２１４Ｐを発現するＨｙ９２６細胞（３００μｌ、２×１０５細胞／ｍｌ）をＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートの上部チャンバーに播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ４００μｌを下部チャンバーに添加した。次にプレートを、３７℃で、５％ＣＯ２を含むインキュベーターに２４時間入れた。インキュベーション後、上部チャンバーに残っている細胞を注意深く取り除き、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜を４％ＰＦＡで固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色した。クリスタルバイオレットの量は、１％のＳＤＳ溶液による処理の後に光学濃度により決定した。データは、セルメチニブが血管新生を部分的に回復させる可能性があることを示唆している。
【0037】
配列の概要
以下の配列番号表は、本出願において使用される配列に関する情報を提供する。
以下の配列番号表は、本出願において使用される配列に関する情報を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0038】
三世代家族から得られたＤＮＡ試料の全エクソーム配列決定（３世代はリンパ異常に罹患している）が、これまで説明されていなかったこの希少疾患の遺伝的根拠を同定するために行われた。家族の常染色体優性遺伝モデルと一致するすべてのミスセンス、ナンセンス、スプライス改変、及びコーディング挿入欠失変異を調べた。同義の変異体、０．５％を超えるマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を有する変異体、及び以前にコントロールにおいて同定された変異体を除外するために、結果をフィルタリングした。関連候補をさらに分析した。結果として、ＥＰＨＢ４遺伝子内のスプライス部位変異をもたらす一塩基対置換、ｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃが原因変異として同定された。リンパ異常と診断された追加の患者からの試料が分析され、追加の疾患原因ＳＮＶ－ ＰＩＫ３Ｒ３におけるミスセンス突然変異、ＰＩＫ３Ｒ６におけるスプライシング突然変異、ＭＴＯＲにおけるミスセンス突然変異、及びＡＲＡＦにおける保存されたリン酸化部位の突然変異が同定された。
【0039】
これらの新規なリンパ異常関連ＳＮＶは、ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ、ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ、ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ、ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ、及びＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐである。ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ、ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ、ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ、ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ、及びＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４ＰのＳＮＶは、本出願において、「リンパ異常関連ＳＮＶ」又は「リンパ異常関連突然変異」と称され得る。
【0040】
したがって、本開示は、リンパ異常を診断するための方法を包含し、ここで、患者が、陰性コントロールと比較して、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３Ｒ６、及びｍＴＯＲにおいて少なくとも１つのＳＮＶを有する場合、又はＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦにおける少なくとも１つのＳＮＶと連鎖不平衡にある少なくとも１つのＳＮＶを有する場合、患者はリンパ異常と診断される。本開示はまた、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤、少なくとも１つのＰＩＫ３Ｋ阻害剤、及び／又は少なくとも１つのＭＥＫ阻害剤（例えば、表１－２に記載される少なくとも１つの薬剤）を用いて、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３Ｒ６、及びｍＴＯＲにおいて少なくとも１つのＳＮＶを有する患者におけるリンパ異常を治療するための方法を包含する。
【0041】
ここで本発明の特定の実施態様について詳細に言及され、その実施例は添付の図面に示される。本発明は、図示された実施態様と併せて説明されるが、それは本発明をそれらの実施態様に限定することを意図するものではないことが理解されよう。それどころか、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得るすべての代替物、修正物、及び等価物を網羅することを意図している。
【0042】
本教示を詳細に説明する前に、本開示は特定の組成物又はプロセス工程に限定されず、そのため変化し得ることを理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つのコンジュゲート」への言及は複数のコンジュゲートを含み、「１つの細胞」への言及は複数の細胞などを含む。
【0043】
わずかで実体のない逸脱が本明細書における本教示の範囲内であるように、本開示において論じられている温度、濃度、時間などの前に、暗黙の「約」があることが理解されよう。また、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（contain）」、「含む（contains）」、「含む（containing）」、「含む（include）」、「含む（includes）」、及び「含む（including）」の使用は、限定を意図するものではない。前述の一般的な説明及び詳細な説明は両方とも、例示的かつ説明的なものにすぎず、教示を限定するものではないことを理解されたい。
【0044】
上記の明細書に特に記載のない限り、様々な構成要素を「含む」と記載する本明細書中の実施態様はまた、記載された構成要素「からなる」又は「から本質的になる」と考えられ；様々な構成要素「からなる」と記載する本明細書中の実施態様はまた、記載された構成要素「を含む」又は「から本質的になる」と考えられ；かつ様々な構成要素「から本質的になる」と記載する本明細書中の実施態様はまた、記載された構成要素「からなる」又は「を含む」と考えられる（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。
【0045】
本明細書において使用される節の見出しは、構成上の目的のためであり、いかなる方法でも所望の主題を限定するものとして解釈されるべきではない。出典明示により本明細書に援用される何れの文献も本明細書中に定義される任意の用語と矛盾する場合、本明細書が優先する。本教示は様々な実施態様と併せて説明されているが、本教示がそのような実施態様に限定されることを意図するものではない。それどころか、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替物、修正物、及び等価物を包含する。
【0046】
さらに、「からなる群から選択される」化合物は、２つ以上の化合物の混合物（すなわち、組み合わせ）を含む、以下の一覧にある１つ又は複数の化合物を指す。本発明によれば、単離された、又は生物学的に純粋な分子は、その天然の環境から取り出された化合物である。したがって、「単離された」及び「生物学的に純粋な」は、化合物が精製されている程度を必ずしも反映しない。本発明の単離された化合物は、その天然の供給源から得ることができ、実験室での合成技術を使用して製造することができ、あるいは任意のそのような化学合成経路により製造することができる。
【0047】
「リンパ異常」は、リンパ管の異常形成及び組織の異常増殖を特徴とする疾患又は障害を指す。リンパ異常の非限定的な例には、「リンパ管腫症（Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｍａｔｏｓｉｓ）」又は「リンパ管拡張症（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）」（本明細書ではまとめてＬＡＭと呼ばれる）、リンパ管腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｍａｓ）、リンパ管腫症（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ａｎｏｍａｌｙ）（ＧＬＡ）、及び乳び性滲出液、全身性リンパ管腫（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｍａ）、全身性嚢胞性血管腫症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｃｙｓｔｉｃ ａｎｇｉｏｍａｔｏｓｉｓ）、多発性リンパ管拡張症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｙｍｐｈａｎｇｉｅｃｔａｓｉａｓ）、全身性リンパ管奇形（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、びまん性リンパ管奇形（ｄｉｆｆｕｓｅ ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、カポジフォームＬＡＭ及びゴーハム・スタウト病（ＧＳＤ）、進行性骨溶解を特徴とするリンパ管起源のまれな血管障害が含まれる。
【0048】
臨床的には、リンパ管腫はいくつかの型に分類される。これらには、（１）シンプレックスが含まれ、これは毛細血管サイズの、薄壁のリンパ管で構成されている。このタイプは、通常、皮膚に影響を与える（限局性リンパ管腫）；（２）嚢胞性リンパ管腫（又は嚢腫）：これは、若い頃、一般的に首や腋窩に見られるように、数ミリメートルから数センチメートルの範囲の大きさになり得る；（３）海綿体：このタイプは、しばしば線維性外膜コートを伴う、拡張型リンパ管からなる。これは、通常、胸部、腹部、及び骨の臓器に影響を与えるタイプである。これらのリンパ管腫のそれぞれが、本発明に包含される。
【0049】
「一塩基変異（ＳＮＶ）」は、その位置に通常の塩基とは異なる一塩基が存在するゲノムＤＮＡ中の位置を指す。ＳＮＶは頻度情報を提供しないものの、ＳＮＶは、ＳＮＰが一般的に、ある頻度で起こる（例えば、ある集団のある割合を超える割合で起こる）ＳＮＶを指すことを除いて、ＳＮＰと類似している。何百万というＳＮＶがヒトゲノムに登録されている。いくつかのＳＮＶは疾患の原因であるが、一方、他のＳＮＶはゲノムにおける正常な変異である。
【0050】
「リンパ異常関連ＳＮＶ又は特異的マーカー」は、リンパ異常を発症する危険性の増加と関連するＳＮＶであり、この疾患を患っていない患者には見いだされない。そのようなマーカーは、限定されないが、核酸、それによってコードされるタンパク質、又は他の小分子を挙げることができる。
【0051】
本明細書において使用される「遺伝子改変」という用語は、１つ又は複数の核酸分子の野生型又は参照配列からの変化を指す。遺伝子改変には、限定されないが、ＳＮＶ及びＳＮＰ、コピー数多型（ＣＮＶ）、既知配列の核酸分子からの少なくとも１つのヌクレオチドの塩基対置換、付加、及び欠失が挙げられる。
【0052】
「連鎖」は、遺伝子、対立遺伝子、遺伝子座又は遺伝的マーカーが、同じ染色体上のそれらの位置の結果として、一緒に遺伝する傾向を表し、２つの遺伝子、対立遺伝子、遺伝子座、又は遺伝的マーカーの間の組換え率（組換え割合、又はθとも呼ばれる）によって測定される。２つの遺伝子座が染色体上で物理的に近くにあるほど、組換え割合は低くなる。通常、疾患原因遺伝子内の多型部位を、疾患との連鎖に関して試験すると、組換え割合はゼロとなり、疾患とその疾患原因遺伝子とが、常に一緒に受け継がれることを示す。まれな事例では、ある遺伝子が非常に大きなゲノムセグメントに及んでいる場合、その遺伝子の一方の末端の多型部位と、他方の末端の病因的突然変異との間で組換えを観察する可能性もあり得る。しかしながら、病因的突然変異が疾患との連鎖に関して試験されている多型である場合、組換えは観察されないであろう。
【0053】
「センチモルガン」は、２つの遺伝子マーカー、対立遺伝子、遺伝子、又は遺伝子座の間の連鎖を表す遺伝的距離の単位であり、任意の減数分裂事象に関して２つのマーカー又は遺伝子座の間の組換えの確率１％に相当する。
【0054】
「連鎖不平衡」又は「対立遺伝子相関」は、集団内の任意の特定の対立遺伝子の頻度に関して、染色体上の位置が近傍にある、特定の対立遺伝子、遺伝子座、遺伝子、又は遺伝子マーカーと、ある特定の対立遺伝子、遺伝子座、遺伝子、又は遺伝子マーカーとに、偶然に予想されるよりも高い頻度での優先的な相関性があることを意味する。
【0055】
本明細書において使用される「固体マトリックス」という用語は、ビーズ、微小粒子、マイクロアレイ、微量滴定ウェル若しくは試験管の表面、ディップスティック、又はフィルタなど、任意の形式を指す。マトリックスの材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デキストラン又はアガロースであり得る。固体マトリックスは、核酸が溶液中でマトリックスから除去できないようにその上に固定化された核酸を含むことができる。
【0056】
本明細書において使用される「標的核酸」は、複合核酸混合物中に存在する核酸の既定の領域を指し、ここで、既定の野生型領域は、少なくとも１つの既知のヌクレオチド変異を含み、この変異はリンパ異常と関連している場合もあればしていない場合もある。核酸分子は、ｃＤＮＡクローニング若しくはサブトラクティブハイブリダイゼーションによって天然源から単離され得るか、又は手作業で合成され得る。核酸分子は、トリエステル合成法によって手作業で合成され得るか、又は自動ＤＮＡ合成装置を使用して合成され得る。
【0057】
本発明において使用される核酸に関して、「単離核酸」という用語は、ＤＮＡに適用される場合、ＤＮＡ分子が由来する生物体の天然に存在するゲノムにおいてそのＤＮＡ分子が直接連続している（５’方向及び３’方向に）配列から分離された、ＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離核酸」は、ベクター、例えば、プラスミドベクター若しくはウイルスベクターに挿入されているか、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている、ＤＮＡ分子を含み得る。「単離核酸分子」はまた、ｃＤＮＡ分子を含み得る。ベクターに挿入された単離核酸分子はまた、本明細書において、組換え核酸分子と称されることもある。
【0058】
ＲＮＡ分子に関して、「単離核酸」という用語は、主として、上記に定義された単離ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を指す。あるいは、この用語は、あるＲＮＡ分子がその天然の状態で関連しているであろうＲＮＡ分子（すなわち、細胞若しくは組織中の）から十分に分離されており、結果として、「実質的に純粋な」形態で存在する、ＲＮＡ分子を指し得る。
【0059】
核酸に関する「濃縮（enriched）」という用語の使用は、目的の細胞又は溶液中に存在する全ＤＮＡ又は全ＲＮＡのうち、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列が、正常な細胞又は配列が得られた細胞においてよりも、有意に高い割合（２－５倍）を占めることを意味する。これは、ある人物が、存在する他のＤＮＡ若しくはＲＮＡの量を優先的に低減することによって、又は特定のＤＮＡ配列若しくはＲＮＡ配列の量を優先的に増大することによって、又はこれら２つの組合せによって、引き起こすことができる。しかしながら、「濃縮」は他のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列が存在しないことを示すものではなく、単に目的の配列の相対量が有意に増大していることに留意されたい。
【0060】
一部の目的では、ヌクレオチド配列が精製された形態であることも有利である。核酸に関する「精製された」という用語は、絶対的な純度（均一な調製物など）を必要とするものではなく、配列が、天然の環境よりも相対的に純粋であるという指標を表している。
【0061】
「相補的」という用語は、２つのヌクレオチドが互いに複数の良好な相互作用を形成し得ることを指す。例えば、アデニンはチミンに対して相補的であるが、これは、これらが２つの水素結合を形成し得るためである。同様に、グアニンとシトシンは、３つの水素結合を形成できるため、相補的である。したがって、核酸配列が以下の塩基配列：チミン、アデニン、グアニン、及びシトシンを含む場合、この核酸分子の「相補体」は、チミンの場所にアデニン、アデニンの場所にチミン、グアニンの場所にシトシン、及びシトシンの場所にグアニンを含む分子であろう。相補体は、親核酸分子と最適な相互作用を形成する核酸配列を含むため、そのような相補体は、親分子に高い親和性で結合することができる。
【0062】
一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当技術分野で一般的に使用される所定の条件下において、そのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な（「実質的に相補的な」と称されることもある）配列の２つの一本鎖ヌクレオチド分子間における結合を指す。具体的には、この用語は、オリゴヌクレオチドと、本発明の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションを指すが、オリゴヌクレオチドと非相補的な配列の一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションは実質的に除外される。例えば、特異的ハイブリダイゼーションは、ある配列が、任意のリンパ異常特異的マーカー核酸にハイブリダイズするが、他のヌクレオチドにはハイブリダイズしないことを指し得る。そのようなマーカーは、例えば、本明細書に含まれる表に示されるリンパ異常特異的マーカーを含む。様々な相補性の一本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする適切な条件は当技術分野において周知である。
【0063】
例えば、指定された配列相同性の核酸分子間でのハイブリダイゼーションを達成するのに必要なストリンジェンシー条件を計算するための一般的な式を、以下に記載する(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)：
Ｔｍ＝８１．５"Ｃ＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－０．６３（％ホルムアミド）－６００／二重鎖の塩基数
Ｔｍ＝８１．５"Ｃ＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－０．６３（％ホルムアミド）－６００／二重鎖の塩基数
【0064】
上記の式の例として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］、５０％ホルムアミド、ＧＣ含量４２％、及び平均プローブサイズ２００塩基を使用すると、Ｔｍは５７℃となる。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、相同性が１％減少するごとに１－１．５℃低下する。したがって、約７５％を上回る配列同一性を有する標的は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用すると観察されるであろう。ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェンシーは、主として、溶液の塩濃度及び温度に依存する。一般に、プローブとその標的とのアニーリング率を最大化するために、ハイブリダイゼーションは、通常、そのハイブリッドの計算されたＴｍよりも２０－２５℃低い、塩及び温度条件で行われる。洗浄条件は、標的に対するプローブの同一性の度合いにとって可能な限りストリンジェントであるべきである。一般に、洗浄条件は、ハイブリッドのＴｍよりもおよそ１２－２０℃低くなるように選択される。本発明の核酸に関しては、中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃におけるハイブリダイゼーション、並びに２×ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ中において５５℃で１５分間の洗浄として定義される。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃におけるハイブリダイゼーション、並びに１×ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ中において６５℃で１５分間の洗浄として定義される。非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃におけるハイブリダイゼーション、並びに０．１×ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ中において６５℃で１５分間の洗浄として定義される。
【0065】
本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを２つ以上、好ましくは３つを上回って含む、核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの厳密なサイズは、様々な要因に依存し、オリゴヌクレオチドの具体的な用途及び使用に依存するであろう。プローブ及びプライマーを含め、オリゴヌクレオチドは、３ヌクレオチドから核酸分子の完全長までの任意の長さであってよく、３からポリヌクレオチドの完全長までの連続する核酸のうちの可能な数すべてを明示的に含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である。
【0066】
本明細書において使用される「プローブ」という用語は、精製された制限酵素消化物のように天然に存在するか、又は合成で生成されたかに関係なく、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はＲＮＡ若しくはＤＮＡのいずれかである核酸を指し、これは、プローブに相補的な配列を有する核酸とアニーリングするか又は特異的にハイブリダイズすることができる。プローブは、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよい。プローブの厳密な長さは、温度、プローブ源、及び方法の用途を含む、多数の要因に依存するであろう。例えば、診断用途のために、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブ（特定の場合において、ｄｂＳＮＰデータベースにおいて利用可能な一塩基多型に関連する特定のｒｓ番号に関連する核酸）は、典型的には１５－２５、１５－３５、２０－５０、又は１００以上のヌクレオチドを含むが、ただしＳＮＶの部位がプローブに含まれるならば、それはより少ないヌクレオチドを含み得る。本明細書におけるプローブは、特定の標的核酸配列の様々な鎖に相補的となるように選択される。これは、プローブが、所定の条件セット下において、そのそれぞれの標的鎖に「特異的にハイブリダイズする」か又はアニーリングすることができるように、十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プローブ配列は、必ずしも標的の厳密な相補的配列を反映するものではない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片が、プローブの５’末端又は３’末端に結合し、プローブ配列の残りの部分が標的鎖に相補的であってもよい。あるいは、非相補的塩基又はより長い配列が、プローブに散在していてもよいが、ただし、プローブ配列が、標的核酸の配列と特異的にアニーリングするのに十分な相補性を有することを条件とする。
【0067】
本明細書において使用される「プライマー」という用語は、適切な環境におかれたときに、鋳型依存的核酸合成の開始剤として機能的に作用することができる、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか、一本鎖又は二本鎖のいずれか、生物系に由来するか、制限酵素消化によって生成されたか、又は合成で産生されたかのいずれのオリゴヌクレオチドを指す。適切な核酸鋳型、核酸の好適なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、好適な補助因子及び条件、例えば、好適な温度及びｐＨが提示されると、プライマーは、ポリメラーゼの作用又は同様の活性によるヌクレオチドの付加によってその３’末端が伸長されて、プライマー伸長産物を得ることができる。プライマーは、具体的な条件及び用途要件に応じて、長さが多様であり得る。例えば、診断用途では、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的に、１５－２５、１５－３５、１０－４０又はそれ以上のヌクレオチド長である。プライマーは、所望される伸長産物の合成を開始するために、すなわち、ポリメラーゼ又は同様の酵素による合成の開始に使用するのに適した並列位置にプライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するのに十分な様式で、所望される鋳型鎖とアニーリングすることができるように、所望される鋳型に対して十分な相補性のものでなければならない。プライマー配列が、所望される鋳型の厳密な相補体を表すことは、必須ではない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、それ以外は相補的なプライマーの５’末端に付加されてもよい。あるいは、非相補的塩基が、オリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在していてもよいが、ただし、プライマー配列が、伸長産物の合成のための鋳型－プライマー複合体を機能的に提供するのに十分な、所望される鋳型鎖の配列との相補性を有することを条件とする。
【0068】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、米国特許第４６８３１９５号、同第４８００１９５号、及び同第４９６５１８８号に記載されており、これらの全開示が、本明細書に参照により援用される。
【0069】
「ｓｉＲＮＡ」は、標的とされる遺伝子の配列との相同性を有する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を提供することによる、配列特異的転写後遺伝子サイレンシング又は遺伝子ノックダウンのためのＲＮＡ干渉プロセスに関与する分子を指す。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、インビトロで合成され得るか、又はリボヌクレアーゼＩＩＩ切断によってより長いｄｓＲＮＡから生成され得、配列特異的ｍＲＮＡ分解の媒介因子である。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び従来的なＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して化学的に合成される。ｓｉＲＮＡは、２つの別個の相補的ＲＮＡ分子として合成することもでき、又は２つの相補的な領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成することもできる。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の供給業者としては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡの一部）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖａ．、ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）、及びＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）が挙げられる。リンパ管腫症のｍＲＮＡを阻害するための具体的なｓｉＲＮＡコンストラクトは、例えば、１５－３５ヌクレオチド長であり得、より典型的には約２１ヌクレオチド長であり得る。
【0070】
「ベクター」という用語は、細胞に感染させるか、トランスフェクトするか、又は形質転換することができ、独立して又は宿主細胞のゲノム内で複製することができる、一本鎖又は二本鎖の環状核酸分子を指す。環状二本鎖核酸分子を、切断し、それによって制限酵素で処理して線状化することができる。各種のベクター、制限酵素、及び制限酵素によって標的とされるヌクレオチド配列に関する情報は、当業者であれば容易に入手可能であり、これらとしては、任意のレプリコン、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、又はウイルスが挙げられ、別の遺伝子配列又はエレメント（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）がこれらに結合して、結合した配列又はエレメントの複製物がもたらされ得る。本発明の核酸分子は、ベクターを制限酵素で切断することによって、又は２つの部分を一緒にライゲーションすることによって、ベクターに挿入され得る。重複又は欠失を含む遺伝子領域をクローニングする際、当業者であれば、罹患領域の上流及び下流にある好適な長さ（例えば、５０－１００以上のヌクレオチド）の隣接する配列が、クローニングプロセスに利用されることを十分に認識している。そのようなベクターは、例えば、そのような改変がコードされるタンパク質に対して有する影響を研究するための細胞株において、有用性を有するであろう。
【0071】
当業者であれば、発現コンストラクトを原核生物体又は真核生物体に形質転換、トランスフェクション、又は形質導入するのを容易にするための多数の技術が利用可能である。「形質転換」、「トランスフェクション」、及び「形質導入」という用語は、核酸及び／又は発現コンストラクトを細胞又は宿主生物体に挿入する方法を指す。これらの方法には、宿主細胞外膜又は細胞壁に目的の核酸分子が透過するように、高濃度の塩、電界、又は界面活性剤で細胞を処理すること、マイクロインジェクション、ＰＥＧ－融合などの様々な技術が含まれる。
【0072】
「プロモーターエレメント」という用語は、適切な細胞内に入ると、転写因子及び／又はポリメラーゼ結合、並びに続いてベクターＤＮＡの部分のｍＲＮＡへの転写を促進することができる、ベクターに組み込まれているヌクレオチド配列を説明する。一実施態様において、本発明のプロモーターエレメントは、リンパ異常特異的マーカー核酸分子の５’末端よりも前にあり、結果として、その後のものがｍＲＮＡに転写される。次いで、宿主細胞の機序により、ｍＲＮＡがポリペプチドに翻訳される。次いで、宿主細胞の機序により、ｍＲＮＡがポリペプチドに翻訳される。プロモーターエレメントは、目的のコード領域の構成的又は誘導的発現を駆動し得る。
【0073】
当業者であれば、核酸ベクターが、プロモーターエレメント及びリンパ異常特異的マーカーコード核酸以外の核酸エレメントを含み得ることを理解するであろう。これらの他の核酸エレメントとしては、限定されないが、複製開始点、リボソーム結合部位、薬物耐性酵素又はアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、及び分泌シグナル、局在化シグナル、又はポリペプチド精製に有用なシグナルをコードする核酸配列が挙げられる。
【0074】
「レプリコン」は、主にそれ自体の制御下において複製することができる、任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、プラスチド、ファージ、又はウイルスである。レプリコンは、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【0075】
「発現オペロン」は、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧ又はＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、終結因子などの転写及び翻訳制御配列を有し得、宿主細胞又は生物体においてポリペプチドコード配列の発現を促進する、核酸断片を指す。
【0076】
本明細書に使用されるとき、「レポーター」、「レポーター系」、「レポーター遺伝子」、又は「レポーター遺伝子産物」という用語は、核酸が、発現されるとレポーターシグナルを生じる産物をコードする遺伝子を含み、これを、例えば、生物アッセイ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は比色法、蛍光法、化学発光法、若しくは他の方法によって容易に測定することができる、動作可能な遺伝子系を意味するものとする。核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、線形又は環状、一本鎖又は二本鎖、アンチセンス極性又はセンス極性のいずれであってもよく、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御エレメントに動作可能に連結されている。必要とされる制御エレメントは、レポーター系の性質、及びレポーター遺伝子がＤＮＡの形態であるかＲＮＡの形態であるかに応じて多様であるが、限定することなく、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグナルなどのエレメントを挙げることができる。
【0077】
導入された核酸は、レシピエント細胞又は生物体の核酸に組み込まれる（共有結合で連結される）場合もあれば、そうでない場合もある。例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、及び哺乳動物細胞において、導入された核酸は、エピソームエレメント又はプラスミドなどの独立したレプリコンとして、維持されてもよい。あるいは、導入された核酸は、レシピエント細胞又は生物体の核酸に組み込まれ、その細胞又は生物体において安定に維持され、さらに、レシピエント細胞又は生物体の子孫細胞又は生物体に継代されるか受け継がれてもよい。最終的には、導入された核酸は、レシピエント細胞又は宿主生物体に一過性に存在するだけであってもよい。
【0078】
「選択可能なマーカー遺伝子」という用語は、発現されると、形質転換された細胞に、選択可能な表現型、例えば抗生物質耐性を与える、遺伝子を指す。
【0079】
「動作可能に連結された」という用語は、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現を達成できるように、ＤＮＡ分子内でコード配列に対して適切な位置にあることを意味する。この同じ定義は、発現ベクターにおける転写ユニット及び他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）の配置に適用される。
【0080】
「組換え生物体」又は「トランスジェニック生物体」という用語は、新しい組み合わせの遺伝子又は核酸分子を有する生物体を指す。新しい組み合わせの遺伝子又は核酸分子は、当業者であれば利用できる多様な核酸操作技術を使用して、生物体に導入することができる。「生物体」という用語は、少なくとも１つの細胞を含む任意の生命体に関する。生物体は、１つの真核細胞ほどに単純であってもよく、哺乳動物のように複雑であってもよい。したがって、「組換え生物体」という語句は、組換え細胞、並びに真核生物体及び原核生物体を包含する。トランスジェニック生物体の例には、ゼブラフィッシュ又はマウスが含まれる。
【0081】
「単離されたタンパク質」又は「単離され精製されたタンパク質」という用語が、本明細書において時に使用される。この用語は、主として、本発明の単離核酸分子の発現によって産生されたタンパク質を指す。あるいは、この用語は、あるタンパク質が、天然に関連しているであろう他のタンパク質から、「実質的に純粋な」形態で存在するように、十分に分離されていることを指し得る。「単離された」とは、他の化合物若しくは物質との人工的混合物若しくは合成混合物を除外することを意味するものでも、基本的な活性を妨害しない不純物の存在、例えば、不完全な精製、安定剤の添加、又は例えば免疫原性調製物若しくは薬学的に許容される調製物への調合に起因して存在し得る不純物の存在を除外することを意味するものでもない。
【0082】
「特異的結合対」は、互いに対して特定の特異性を有し、通常の条件下において、他の分子よりも優先的に互いに結合する、特異的結合メンバー（ｓｂｍ）及び結合パートナー（ｂｐ）を含む。特異的結合対の例としては、抗原と抗体、リガンドと受容体、及び相補的なヌクレオチド配列がある。当業者であれば、他の多数の例を把握している。さらに、「特異的結合対」という用語はまた、特異的結合メンバー及び結合パートナーのうちの一方又は両方が、より大きな分子の一部を成す場合にも適用可能である。特異的結合対が核酸配列を含む実施態様において、それらは、アッセイの条件下において互いにハイブリダイズする長さ、好ましくは、１０ヌクレオチド長より長い、より好ましくは１５又は２０ヌクレオチド長より長いものであろう。
【0083】
「試料」又は「患者試料」又は「生物学的試料」は、一般に、特定の分子、好ましくはリンパ異常特異的マーカー分子、例えば、下記に提供される表に示されるマーカーに関して試験することができる試料を指す。試料としては、限定されないが、細胞、体液、例えば、血液、血清、血漿、尿、リンパ液、唾液、涙、胸膜液などが挙げられる。
【0084】
「遺伝子型配列情報」とは、一般的には、対象のＤＮＡ又はＲＮＡの配列に関するあらゆる情報を意味する。遺伝子型配列情報は、全ゲノム、全エクソーム配列決定、エクソーム配列決定、又は対象のゲノム内の目的の領域の標的配列決定を含む。遺伝子型配列情報はまた、本明細書においてリンパ異常と関連していることが見いだされたものなどの特定のＳＮＶの存在又は非存在に関するデータの生成を含み得る。さらに、遺伝子型配列情報は、１つ又は複数のリンパ異常関連ＳＮＶの存在及び／又は発現を検出するためのプローブの使用を含むであろう。遺伝子型配列情報を得るためにプローブをどのように使用することができるかの例には、限定されないが、（１）インサイチューハイブリダイゼーション；（２）サザンハイブリダイゼーション（３）ノーザンハイブリダイゼーション；及び（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの各種増幅反応が挙げられる。
【0085】
「薬剤」及び「試験化合物」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子、又は生物学的物質、例えば、細菌、植物、真菌、若しくは動物（特に哺乳動物）の細胞若しくは組織などから作製された抽出物を指す。生体高分子としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド／ＤＮＡ複合体、及び本明細書に記載のＳＮＶを含む核酸又はそれらによってコードされるタンパク質の活性を調節する能力を呈する任意の核酸に基づく分子が挙げられる。例示的な薬剤としては、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤、少なくとも１つのＰＩＫ３Ｋ阻害剤、及び／又は少なくとも１つのＭＥＫ阻害剤が挙げられる。例示的な薬剤はまた、表１－２に記載のものを含む。薬剤は、本明細書において後述されるスクリーニングアッセイを含め、可能性のある生物活性に関して評価される。
【0086】
本明細書において使用される「治療」には、ヒトを含む哺乳動物における疾患のための治療薬の投与又は適用が含まれ、疾患若しくは疾患の進行を阻害すること、疾患若しくはその増悪を抑制若しくは遅延させること、その進行を阻止すること、疾患を部分的若しくは完全に軽減すること、疾患の発症を予防すること、又は疾患の症状の再発を予防することが含まれる。治療例としては、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤、少なくとも１つのＰＩＫ３Ｋ阻害剤、及び／又は少なくとも１つのＭＥＫ阻害剤（例えば、表１－２に記載された少なくとも１つの薬剤）を有効量で投与することが含まれる。
【0087】
「阻害（inhibition）」又は「阻害する（inhibit）」という用語は、任意の事象（タンパク質リガンド結合など）の減少若しくは休止、又は表現型の特徴の減少若しくは休止、又はその特性の発生率、程度、若しくは可能性の減少若しくは休止を指す。「減少させる」又は「阻害する」とは、参照と比較して、活性、機能、及び／又は量を減少させる（decrease）、減少させる（reduce）又は抑止する（arrest）ことである。阻害又は減少は完全である必要はない。例えば、特定の実施態様において、「減少させる」又は「阻害する」とは、２０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を指す。別の実施態様において、「減少させる」又は「阻害する」とは、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を指す。さらに別の実施態様において、「減少させる」又は「阻害する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を指す。
【0088】
「阻害剤」という用語は、特定の化学反応、シグナル伝達経路若しくは他のプロセスを減速する又は妨げる、あるいは特定の反応物、触媒、又は酵素の活性を低下させる物質を指す。
【0089】
「患者」及び「対象」という用語は、ヒトを含む哺乳動物を意味するために互換的に使用される。
【0090】
「ｍＴＯＲ」という用語は、ｍＴＯＲによってコードされている哺乳類ラパマイシン標的タンパク質を指す。ｍＴＯＲは他のタンパク質と複合体を形成して重要な細胞機能を可能にし得る。「ｍＴＯＲＣ」という用語は、ラパマイシン標的タンパク質複合体１（mechanistic target to rapamycin complex 1）としても知られる哺乳類ラパマイシン標的タンパク質複合体１（mammalian target of rapamycin complex 1）を指し、これはタンパク質の翻訳を活性化するように機能するタンパク質複合体である。例えば、ｍＴＯＲＣ１は、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲの調節関連タンパク質（Ｒａｐｔｏｒ）、哺乳類致死性ＳＥＣ１３タンパク質８（mammalian lethal with SEC13 protein 8）（ＭＬＳＴ８）、ＰＲＡＳ４０、及びＤＥＰＴＯＲを含む。別の例では、ｍＴＯＲＣ２複合体は、ｍＴＯＲ、ラパマイシン非感受性ｍＴＯＲコンパニオン（rapamycin-insensitive companion of mTOR）（ＲＩＣＴＯＲ）、ＧβＬ、哺乳類ストレス活性化プロテインキナーゼ相互作用タンパク質１（mammalian stress-activated protein kinase interacting protein 1）（ｍＳＩＮ１）、Ｐｒｏｔｏｒ １／２、ＤＥＰＴＯＲ、ＴＴＩ１、及びＴＥＬ２を含む。ｍＴＯＲを含む任意のタンパク質複合体は、本明細書においてはｍＴＯＲＣと称され得る。「ｍＴＯＲシグナル伝達」という用語は、これらのタンパク質と複合体を形成して相互作用することが知られている他のタンパク質と共に、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、及びＭＴＯＲＣ２の活性を指すであろう。
【0091】
「ｍＴＯＲＣ阻害剤」という用語は、ホスファチジルイノシトール－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）関連キナーゼ（ＰＩＫＫ）のファミリーに属するセリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼであるラパマイシン標的タンパク質（mechanistic target of rapamycin）（ｍＴＯＲ）を阻害する薬剤のクラスを指す。ｍＴＯＲは、２つのタンパク質複合体、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２を介して形成及びシグナル伝達することによって細胞の代謝、増殖、及び増殖を調節する。最も確立されたｍＴＯＲ阻害剤はいわゆるラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）（ラパマイシン及びその類似体）である。いくつかのラパログが、表１と２に記載されている。
【0092】
「ＰＩＫ３Ｋ」又は「ＰＩ３Ｋ」という用語は、ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスリン酸３－キナーゼ（ホスファチジルイノシチド３－キナーゼ、ホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ、ＰＩ３－キナーゼ、ＰＩ（３）Ｋ、ＰＩ－３Ｋとも呼ばれる）を指すために本明細書では互換的に用いられる。ＰＩ３Ｋは、細胞増殖、増殖、分化、運動性、生存及び細胞内輸送などの細胞機能に関与する酵素のファミリーであり、これらはさらにがんに関与している。ＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）のイノシトール環の３位ヒドロキシル基をリン酸化することができる細胞内酵素を調節するシグナルトランスデューサー酵素である。
【0093】
「ＰＩＫ３Ｋ阻害剤」又は「ＰＩ３Ｋ阻害剤」という用語は、増殖制御、代謝及び翻訳開始などの多くの細胞機能のための重要なシグナル伝達経路である、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の一部である１つ又は複数のホスホイノシチド３－キナーゼ酵素を阻害することによって機能する一群の薬剤を指す。この経路内には多くの構成成分があり、それらの阻害は腫瘍抑制をもたらし得る。これらの抗がん剤は、標的療法の例である。ＰＩ３Ｋの多くの異なるクラス及びアイソフォームがある。クラス１のＰＩ３Ｋは、ｐ１１０として知られる触媒サブユニットを有し、４つのタイプ（アイソフォーム）－ｐ１１０アルファ、ｐ１１０ベータ、ｐ１１０ガンマ及びｐ１１０デルタがある。
【0094】
「ＭＥＫ」という用語は、細胞の表面上の受容体から細胞の核内のＤＮＡにシグナルを伝達する、細胞内のタンパク質の鎖を含むＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路（Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫ経路としても知られる）を指す。シグナル伝達分子が細胞表面の受容体に結合するとシグナルが開始し、核内のＤＮＡがタンパク質を発現して細胞分裂などの細胞に何らかの変化を生じるとシグナルが終了する。この経路には、ＭＡＰＫ（元々はＥＲＫ、細胞外シグナル制御キナーゼと呼ばれるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ）を含む多くのタンパク質が含まれ、それらは「オン」又は「オフ」スイッチとして作用する隣接タンパク質にリン酸基を付加することによって情報交換する。
【0095】
「ＭＥＫ阻害剤」又は「ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤」という用語は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、及び／又はＥＲＫを阻害する薬剤を指す。それらは、一部のがんにおいてしばしば過活動性であるＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に影響を与えるために使用することができる。「細胞内シグナル伝達」という用語は、ｍＴＯＲシグナル伝達、並びに細胞の恒常性又は活性を支配する任意の他のシグナル伝達経路プロセスを含むであろう。
【0096】
リンパ異常を有する患者の診断
いくつかの実施態様において、リンパ異常を有する患者は、患者から得られた生物学的試料から遺伝子型配列情報を得た後にＳＮＶの存在に基づいて診断される。いくつかの実施態様において、リンパ異常を有する患者は、患者から得られた生物学的試料から遺伝子型配列情報を得た後で、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦから選択される遺伝子における１つ又は複数のＳＮＶ、又はリンパ異常に関連するＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦから選択される遺伝子におけるＳＮＶと連鎖不均衡にあるＳＮＶの存在の検出に基づいて診断される。いくつかの実施態様において、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦから選択される遺伝子におけるこの１つ又は複数のＳＮＶは、ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ；ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ；ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ；ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ；又はＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐから選択される。
いくつかの実施態様において、リンパ異常を有する患者は、患者から得られた生物学的試料から遺伝子型配列情報を得た後にＳＮＶの存在に基づいて診断される。いくつかの実施態様において、リンパ異常を有する患者は、患者から得られた生物学的試料から遺伝子型配列情報を得た後で、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦから選択される遺伝子における１つ又は複数のＳＮＶ、又はリンパ異常に関連するＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦから選択される遺伝子におけるＳＮＶと連鎖不均衡にあるＳＮＶの存在の検出に基づいて診断される。いくつかの実施態様において、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦから選択される遺伝子におけるこの１つ又は複数のＳＮＶは、ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ；ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ；ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ；ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ；又はＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐから選択される。
【0097】
いくつかの実施態様において、特定の対象に存在するＳＮＶを同定する報告は実験データから生成され得る。いくつかの実施態様において、リンパ異常に対して提案された治療（１つ又は複数）を見極める報告は、遺伝子型配列情報を使用して同定されたＳＮＶに関するデータに基づいて生成され得る。
【0098】
いくつかの実施態様において、患者から得られた生物学的試料から遺伝子型配列情報を得た後で、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦから選択される遺伝子における１つ又は複数のＳＮＶ、又はＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦから選択される遺伝子におけるＳＮＶと連鎖不均衡にあるＳＮＶの存在の検出に基づいた診断は、その患者に対する治療の選択を導く。いくつかの実施態様において、患者から得られた生物学的試料から遺伝子型配列情報を得た後で、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦから選択される遺伝子における１つ又は複数のＳＮＶ、又はＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦから選択される遺伝子におけるＳＮＶと連鎖不均衡にあるＳＮＶの存在の検出に基づいた診断は、その患者に対する治療の選択を導いたり、影響を与えたりしない。
【0099】
いくつかの実施態様において、リンパ異常の診断は、臨床症状、スキャン結果、及び／又は家族歴にのみ基づいて行われる。いくつかの実施態様において、リンパ異常の診断は遺伝子配列情報の検査なしに行われる。いくつかの実施態様において、リンパ異常の診断は、遺伝子配列情報とともに臨床症状に基づいて行われる。
【0100】
本発明に開示されたリンパ異常関連ＳＮＶは、リンパ異常を診断するために多くの方法で使用することができる。
【0101】
例えば、リンパ異常関連ＳＮＶを含む核酸は、リンパ異常特異的マーカーの存在及び／又は発現を検出するためのプローブとして使用され得る。リンパ異常関連マーカー核酸をそのようなアッセイのためのプローブとして利用することができる方法には、限定されないが、（１）インサイチューハイブリダイゼーション；（２）サザンハイブリダイゼーション（３）ノーザンハイブリダイゼーション；及び（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの各種増幅反応が挙げられる。
【0102】
さらに、リンパ異常関連ＳＮＶ、又はそれによってコードされるタンパク質を検出するためのアッセイは、体液（血液、尿、血清、胃洗浄液を含む）、あらゆる種類の細胞（脳細胞、白血球、単核球など）又は体組織を含むがこれらに限定されない任意の種類の生物学的試料に対して行われ得る。
【0103】
リンパ異常の検出と診断を目的として、リンパ異常関連ＳＮＶを含む核酸、それを発現するベクター、リンパ異常関連ＳＮＶを含むマーカータンパク質及び抗リンパ異常特異的マーカー抗体を使用して、体組織、細胞、又は体液中のリンパ異常関連ＳＮＶを検出し、リンパ異常関連ＳＮＶを含むマーカータンパク質の発現を変化させることができる。
【0104】
リンパ異常関連ＳＮＶに基づいて、リンパ異常を検出及び／又は診断するための方法が包含される。この方法は、リンパ異常関連ＳＮＶを検出することを含み得、試料中のリンパ異常関連ＳＮＶを含む核酸は、試料中に存在する他の配列と比較して鋳型の量を増加させるために、例えばＰＣＲを使用して最初に増幅されるであろう。これにより、標的配列が試料中に存在する場合、標的配列を高い感度で検出することが可能になる。この初期工程は、当技術分野でますます重要になってきている高感度アレイ技術を使用することによって回避することができる。
【0105】
あるいは、新しい検出技術がこの制限を克服することができ、わずか１μｇの総ＲＮＡを含む少量の試料の分析を可能にする。従来の蛍光技術とは対照的に、共鳴光散乱（ＲＬＳ）技術を使用して、複数の読み取りにより、ビオチン標識ハイブリダイズ標的及び抗ビオチン抗体を使用して少量のｍＲＮＡを検出することができる。ＰＣＲ増幅に対する別の代替法は、信号対雑音比を増大させ、バックグラウンド干渉を減少させるための平面導波路技術（ＰＷＧ）を含む。両方の技術が、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から市販されている。
【0106】
したがって、前述の技術のいずれかを使用して、リンパ異常関連ＳＮＶマーカーの発現を検出又は定量し、それに応じて、リンパ異常又はその発症の危険性を診断することができる。
【0107】
リンパ異常を有する患者の治療
本明細書に記載のリンパ異常関連ＳＮＶが、リンパ異常表現型を調節する際に果たす役割の解明は、リンパ異常の治療に有用な、既存の治療法の再利用、及び新しい治療法の開発を促進する。いくつかの実施態様において、本発明は、１つ又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１つ又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、及び／又は１つ又は複数のＭＥＫ阻害剤（例えば、表１－２のうちの１つ又は複数の薬剤）をリンパ異常を有する患者に投与することを含む。
本明細書に記載のリンパ異常関連ＳＮＶが、リンパ異常表現型を調節する際に果たす役割の解明は、リンパ異常の治療に有用な、既存の治療法の再利用、及び新しい治療法の開発を促進する。いくつかの実施態様において、本発明は、１つ又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１つ又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、及び／又は１つ又は複数のＭＥＫ阻害剤（例えば、表１－２のうちの１つ又は複数の薬剤）をリンパ異常を有する患者に投与することを含む。
【0108】
いくつかの実施態様において、治療を受けるリンパ異常を有する患者は、リンパ異常の症状と家族歴陽性に基づいて診断されている。いくつかの実施態様において、単純フィルムラジオグラフィ、骨スキャン、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴イメージング、及びリンパシンチグラフィーなどの様々なスキャン技術が、リンパ異常を診断するための臨床症状とともに使用される。いくつかの実施態様において、生検は、リンパ異常を診断するために行われる。いくつかの実施態様において、リンパ異常は、リンパ管の異常増殖に基づいて診断される。いくつかの実施態様において、リンパ異常は、リンパ管の異常形成に基づいて診断される。いくつかの実施態様において、リンパ異常は、心膜滲出液、胸膜滲出液、又は腹膜滲出液を含む乳び性滲出液に基づいて診断される。
【0109】
いくつかの実施態様において、治療を受けるリンパ異常を有する患者は、本明細書に記載の診断方法に従って診断されている。
【0110】
いくつかの実施態様において、１つ又は複数のｍＴＯＲ阻害剤、１つ又は複数のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、及び／又は１つ又は複数のＭＥＫ阻害剤（例えば、表１－２のうちの１つ又は複数の薬剤）は、リンパ異常を治療するための医薬の調製に有用である。１つ又は複数の薬剤が、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の材料と共に製剤化することができる。そのような材料は無毒性であるべきであり、かつ活性成分の有効性を妨げるべきではない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚若しくは皮下、経鼻、エアロゾル化、筋肉内、及び腹腔内経路に依存し得る。リンパ異常関連突然変異を含むインビトロ系又はトランスジェニック生物体を使用して、ヒトの治療のための特定の薬剤を選択することができる。
【0111】
治療に有用な薬剤には、限定されないが、表１及び２の薬剤が挙げられる。いくつかの薬剤は表１と２の両方に記載されているが、薬剤が両方の表に記載されていないという事実には意味がない。
【0112】
表２は、リンパ異常を治療するために単独で、又は表１若しくは表２のいずれかの薬剤と組み合わせて使用できる薬剤を提供する。
【0113】
リンパ異常を有する個体を治療するため、又は疾患の徴候若しくは症状を軽減するために、本明細書に開示される遺伝子を標的とする適切な薬剤を組み合わせて投与して、患者に治療上の利益を提供することができる。そのような薬剤は、有効量で投与されるべきである。
【0114】
ひとたび遺伝的変化（１つ又は複数）が同定されると、次いで治療は、変化した遺伝子によって影響を受ける生物学的経路及びシグナル伝達経路を調節するように考案される。例えば、ｍＴＯＲ阻害剤は、単独で又は追加のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用することができる。同様に、ＰＩＫ３Ｋ阻害剤は、単独で、又は上記のＰＩＫ３Ｋ阻害剤のいずれかと組み合わせて使用することができる。ＭＡＰＫ（ＭＥＫ１／ＭＥＫ２）及びＥＲＫ経路を阻害することが望ましい場合には、ＭＥＫ阻害剤を単独で又は他のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤と組み合わせて使用することができる。特定の実施態様において、治療は、ＰＩＫ３Ｋ阻害剤と一緒にｍＴＯＲ阻害剤を投与することを必要とする。他の実施態様において、患者に治療上の利益を提供するために、ｍＴＯＲ及びＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤が組み合わされる。別のアプローチにおいて、疾患の症状を改善するために、ＰＩＫ３Ｋ及びＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤が組み合わされる。本明細書に記載の特定のＡＲＡＦ機能獲得型突然変異について、有効な治療は、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の投与を含む。上記の組み合わせ治療法は相加的様式で作用することができる。他の実施態様において、組み合わせた薬剤は相乗的に作用して症状を軽減する。
【0115】
第１に、生物学的試料及び／又は遺伝子型判定情報を患者から入手することができる。次いで、試料中に存在する核酸から集められた遺伝情報は、例えば、リンパ異常関連ＳＮＶの存在又は非存在について評価されるであろう。リンパ異常の危険性又は疾患の存在を示すこれらの突然変異の存在は、影響を受ける遺伝子の同時同定とともに、どの治療剤が適切であるかについての指導を臨床医に提供する。１つ又は複数の総治療用量（２つ以上の標的を調節する場合）は、単回用量として対象に投与することができ、又は複数回／別々の用量をより長期間にわたって投与する分割治療プロトコルを使用して投与することができ、例えば、１日投与量の投与を可能にするために１日の期間にわたって、又は所望の期間にわたって用量を投与するためにより長い期間にわたって投与することができる。当業者は、対象において有効量を得るために必要とされるリンパ異常薬剤の量は、対象の年齢、体重及び一般的健康状態、並びに投与経路及び施される治療の数を含む多くの要因に依存することを知っているであろう。これらの要因を考慮して、当業者は、リンパ異常を有する個体を治療するための有効量を得るように特定の用量を調整するであろう。
【0116】
リンパ異常治療剤（１つ又は複数）の有効量は、投与方法、及び治療されている個体の体重に依存するであろう。本明細書に記載の投与量は、一般に、平均的な成人のためのものであるが、子供の治療のために調整することができる。用量は一般に約０．００１ｍｇから約１０００ｍｇの範囲であろう。
【0117】
特にリンパ異常、より重篤な形態の疾患に罹患している個体において、リンパ異常治療剤の投与は、例えば、そのような疾患を治療するための従来の薬剤と組み合わせて投与される場合に特に有用であり得る。当業者は、リンパ異常治療剤（１つ又は複数）を単独で又は組み合わせて投与するであろう、そして肺、腸、甲状腺、若しくは炎症機能の判定、放射線学的若しくは免疫学的アッセイ、又は指示されている場合は、組織病理学的方法などの日常的な方法を使用してそのような治療の有効性をモニターするであろう。リンパ異常の治療のための他の薬剤は、疾患の基礎となる症状を緩和するために、全身化学療法、インターフェロンα療法、放射線療法、又は手術が含まれる。
【0118】
薬学的調製物（pharmaceutical preparation）の投与は、好ましくは「有効量」であり、これは個体に対して利益を示すのに十分である。この量は、患者におけるリンパ異常の症状の重症度を予防、軽減（alleviate）、寛解（abate）、又は他の方法で軽減する。有効量のｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩＫ３Ｋ阻害剤、及び／又はＭＥＫ阻害剤（例えば、表１－２からの薬剤）による、リンパ異常を有する患者の治療は、リンパ構造の改善、乳び性胸膜滲出液の減少、呼吸機能の改善、併用薬の使用の漸減、又は生存期間の延長をもたらす可能性がある。
【0119】
薬学的調製物は、投与の容易さ及び投与量の均一性のために投与量単位形態で処方される。投与量単位形態は、本明細書で使用される場合、治療を受けている患者に適した薬学的調製物の物理的に別個の単位を指す。各投与量は、選択された薬学的担体と共に所望の効果を生じるように計算された量の活性成分を含むべきである。適切な投与量単位を決定するための手順は当業者に周知である。
【0120】
投与量単位は、患者の体重に基づいて比例的に増加又は減少させることができる。特定の病理学的状態の緩和のための適切な濃度は、当技術分野で周知のように、投与量濃度曲線計算によって決定され得る。
【0121】
本発明の方法に有用な薬学的組成物は、非経口的に、経口用の固体及び液体製剤で、皮下、皮内、筋肉内、舌下、局所的、耳介（ＯＴＩＣ）、口腔内、結膜、皮膚、歯、電気浸透を介して、子宮頸管内、副鼻腔又は気管を介して、腸内、硬膜外、浸潤を介して、間質内、腹腔内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、滑液嚢内、心臓内、軟骨内、尾内、海綿体内、腔内、脳内、皮内、リンパ管内、心膜内、腹腔内、経鼻、経皮、呼吸器、眼、座薬、エアロゾル、局所又は他の既知の投与経路において全身投与することができる。リンパ異常を治療するために有用な薬剤に加えて、薬学的組成物は薬学的に許容される担体、及び薬物投与を増強し、促進することが知られている他の成分を含有してもよい。したがって、そのような組成物は、アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム及び水酸化マグネシウムの水性懸濁液、及び／又は生理食塩水などの他の薬学的に許容される担体などの他の成分を任意選択的に含み得る。ナノ粒子、リポソーム、再シールされた赤血球、及び免疫学に基づくシステムなどの他の可能な製剤もまた、本発明の方法に従って患者に適切な薬剤を送達／投与するために使用され得る。そのような薬剤を送達するためのナノ粒子の使用、並びに使用され得る細胞膜透過性ペプチド担体は、Crombez et al., Biochemical Society Transactions v35:p44 (2007)に記載されている。
【0122】
リンパ異常を治療するために有用な薬剤（１つ又は複数）の投与は、リンパ異常関連ＳＮＶマーカー発現を首尾よく検出又は定量化し、それに応じてリンパ異常又はその発症の危険性を診断した後に行うことができる。リンパ異常関連ＳＮＶマーカー発現を検出又は定量化することは、治療に使用される特定の薬剤の選択を導き得る。リンパ異常関連ＳＮＶマーカー発現を検出又は定量化することは、特定の治療が特定の対象には適切ではないことを示し得る。
【0123】
他の実施態様において、リンパ異常の治療は疾患の臨床診断に基づいて行われてもよく、治療は遺伝子配列情報の検出又は定量化なしで開始されてもよい。他の実施態様において、リンパ異常の治療は疾患の臨床診断に基づいて行われてもよく、治療はリンパ異常関連ＳＮＶマーカー発現の検出又は定量化なしで開始されてもよい。
【0124】
他の実施態様において、リンパ異常の治療は疾患の臨床診断に基づいて行われてもよく、治療はリンパ異常関連ＳＮＶマーカー発現がコントロールと変わらない場合に開始されてもよい。
【0125】
いくつかの実施態様において、治療は、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、又はＡＲＡＦにおいてＳＮＶを有しない患者に施される。
【0126】
いくつかの実施態様において、表１－２からの２つ以上の薬剤が投与される。いくつかの実施態様において、表１－２からの３つ以上の薬剤が投与される。
【0127】
いくつかの実施態様において、投与される薬剤（１つ又は複数）は、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、及びｍＴＯＲＣ２の阻害プロファイルを有する。ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、及びｍＴＯＲＣ２の活性は、「ｍＴＯＲシグナル伝達」と称され得る。ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、及びｍＴＯＲＣ２の阻害は、ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害と称され得る。いくつかの実施態様において、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、又はｍＴＯＲＣ２の阻害プロファイルを有するこの薬剤（１つ又は複数）は、表１－２に含まれないが、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、又はｍＴＯＲＣ２の阻害のインビトロ又は無細胞プロファイルを有する。いくつか実施態様において、ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ｍＴＯＲＣ１阻害剤、又はｍＴＯＲＣ２阻害剤は、１００μＭ未満、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【0128】
いくつか実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、他の標的よりもｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、及び／又はｍＴＯＲＣ２の阻害に対して選択的である。いくつか実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、他の標的よりもｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、及び／又はｍＴＯＲＣ２の阻害に対して選択的でない。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、及び／又はｍＴＯＲＣ２を阻害し、また他の測定可能な生物学的効果を有する。
【0129】
いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）はＡＴＰ競合的ｍＴＯＲ阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）はＡＴＰ競合的ではないｍＴＯＲ阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤は二重ｍＴＯＲＣ１／Ｃ２阻害剤である。
【0130】
いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、又はｍＴＯＲＣ２の阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、又はｍＴＯＲＣ２を阻害しないＰＩ３Ｋの阻害剤である。いくつか実施態様において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、１００μＭ未満、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【0131】
いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ＦＫＢ１２の遺伝子産物であるペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼの阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤は、ＦＫ５０６結合の阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼ又はＦＫＢ１２の遺伝子産物、及びｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、又はｍＴＯＲＣ２の阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、又はｍＴＯＲＣ２を阻害しない、ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼ又はＦＫＢ１２の遺伝子産物の阻害剤である。いくつか実施態様において、ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼ又はＦＫＢ１２の遺伝子産物の阻害剤は、１００μＭ未満、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【0132】
いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ＤＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）の阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ＤＮＡ－ＰＫ及びｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、又はｍＴＯＲＣ２の阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、又はｍＴＯＲＣ２を阻害しないＤＮＡ－ＰＫの阻害剤である。いくつか実施態様において、ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、１００μＭ未満、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【0133】
いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ｐ１１０としても知られる、ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスリン酸３－キナーゼの阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ｐ１１０の１つ又は複数のサブユニット（α、β、γ、δなど）の阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ｐ１１０及びｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、又はｍＴＯＲＣ２の阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、又はｍＴＯＲＣ２を阻害しないｐ１１０の阻害剤である。いくつか実施態様において、ｐ１１０の阻害剤は、１００μＭ未満、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【0134】
いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、Ｐ７０Ｓ６キナーゼ（Ｐ７０Ｓ６Ｋ）の阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、Ｐ７０Ｓ６Ｋ及びｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、又はｍＴＯＲＣ２の阻害剤である。いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲＣ１、又はｍＴＯＲＣ２を阻害しないＰ７０Ｓ６Ｋの阻害剤である。いくつか実施態様において、Ｐ７０Ｓ６Ｋの阻害剤は、１００μＭ未満、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【0135】
いくつか実施態様において、阻害剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素ＭＥＫ１及び／又はＭＥＫ２を阻害するＭＥＫ１／２阻害剤である。それらは、一部のがん及び他の障害においてしばしば過活動性であるＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に影響を与えるために使用することができる。
【0136】
いくつかの実施態様において、薬剤（１つ又は複数）は、ラパマイシン又はＢＥＺ－２３５（ダクトリシブ）である。ｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシンは、シロリムスとしても知られている。ダクトリシブ又はＮＶＰ－ＢＥＺ２３５としても知られるＢＥＺ－２３５は、ｐ１１０、ＰＩ３Ｋ、及びｍＴＯＲに対して既知の活性を有する化合物である。
【0137】
いくつかの実施態様において、治療方法において投与される薬剤は、ラパマイシン（シロリムス）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＡＺＤ８０５５、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９、ＮＳＣ ６８３８６４）、ＫＵ－００６３７９４、ＭＨＹ１４８５、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、Ｄａｃｔｏｌｉｓｉｂ）、ＰＩ－１０３、トルキニブ（ＰＰ２４２）、タクロリムス（ＦＫ５０６）、リダフォロリムス（デフォロリムス、ＭＫ－８６６９）、ＩＮＫ １２８（ＭＬＮ０１２８）、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）、トリン１、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ＯＳＩ－０２７、ＰＦ－０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０、ＲＧ７４２２）、ＧＳＫ１０５９６１５、ゲダトリシブ（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）、ＷＹＥ－３５４、ＡＺＤ２０１４、トリン２、ＷＹＥ－１２５１３２（ＷＹＥ－１３２）、ＰＰ１２１、ＷＹＥ－６８７、ＣＨ５１３２７９９、ＷＡＹ－６００、ＥＴＰ－４６４６４、ＧＤＣ－０３４９、ＸＬ３８８、ゾタロリムス（ＡＢＴ－５７８）、タクロリムス（ＦＫ５０６）、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）、パロミド５２９（Ｐ５２９）、及びクリソファン酸から選択される。
【0138】
いくつかの実施態様において、投与される薬剤は、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ－１０４０）、ピマセルチブ（ＡＳ－７０３０２６）、ＴＡＫ－７３３、ＡＺＤ８３３０、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ－１６２、ＡＲＲＹ－４３８１６２）、ＳＬ－３２７、レファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９、Ｂａｙ ８６－９７６６）、及びコビメチニブ（ＧＤＣ－０９７３、ＲＧ７４２０）から選択されるＭＥＫ阻害剤である。
【0139】
上記の薬剤の組み合わせは、リンパ異常の治療のための有効性を有するはずである。以下の組み合わせは、ＬＡＭを治療するために相加的又は相乗的に作用し得る。特定の実施態様において、投与のための組み合わせは、１）リダフォロリムス及びトラメチニブ；２）リダフォロリムス及びセルメチニブ又はコビメチニブ；３）ＢＥＺ２３５及びセルメチニブ；４）オミパリシブ及びセルメチニブ又はトラメチニブ；５）エベロリムス及びトラメチニブ又はセルメチニブ；６）シロリムス、リダフォロリムス及びセルメチニブ；７）シロリムス、リダフォロリムス及びトラメチニブ；８）トルキニブ及びトラメチニブ；９）ＢＥＺ２３５、トルキニブ及びトラメチニブ；並びに１０）シロリムス及びゲダトリシブ及びトラメチニブから選択される。
【0140】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載された薬剤による治療は、全身化学療法、インターフェロンアルファ、放射線療法、及び／又は手術のうちの１つ又は複数と組み合わせて使用される。
【0141】
有用な治療用薬剤を同定する方法
本明細書で同定されたＳＮＶはリンパ異常の病因と関連しているので、そのようなＳＮＶを含む遺伝子及びそれらがコードする産物の活性を調節する薬剤を同定するための方法により、この状態の治療のために有効な治療剤の生成がもたらされるはずである。
本明細書で同定されたＳＮＶはリンパ異常の病因と関連しているので、そのようなＳＮＶを含む遺伝子及びそれらがコードする産物の活性を調節する薬剤を同定するための方法により、この状態の治療のために有効な治療剤の生成がもたらされるはずである。
【0142】
本明細書に記載の染色体領域は、それらの活性を調節する治療剤の合理的設計のための適切な標的を提供するタンパク質コード領域を含む。これらの領域に対応する小ペプチド分子は、コードされたタンパク質の活性を効果的に調節する治療剤の設計において有利に使用され得る。
【0143】
分子モデリングは、機能に必要な立体構造又は重要なアミノ酸残基に基づいて、ＳＮＶを含む核酸によってコードされるタンパク質の活性部位に結合する能力を有する特異的な有機分子の同定を容易にするはずである。コンビナトリアルケミストリーのアプローチを使用して、最大の活性を有する分子を同定することができ、次いで、これらの分子の繰り返しが、さらなるサイクルのスクリーニングに展開されるであろう。特定の実施態様において、候補薬物を、合成化合物又は天然化合物の大きなライブラリーからスクリーニングすることができる。１つの例は、ヒトによって使用することができるＦＤＡに認可された化合物ライブラリーである。加えて、化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ、Ｃｏｒｎｗａｌｌ、ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＡＫｏｓ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ａｍｂｉｎｔｅｒ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ａｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ａｕｒｏｒａ（Ｇｒａｚ、Ａｕｓｔｒｉａ）、ＢｉｏＦｏｃｕｓ ＤＰＩ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｂｉｏｎｅｔ（Ｃａｍｅｌｆｏｒｄ、ＵＫ）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ、（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＣｈｅｍＤｉｖ、（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｌｏｃｋ Ｌｔ、（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、ＣｈｅｍＳｔａｒ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｌｔｄ（Ｏｂｎｉｎｓｋ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ｅｎａｍｉｎｅ（Ｋｉｅｖ、Ｕｋｒａｉｎｅ）、Ｅｖｏｔｅｃ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｉｎｄｏｆｉｎｅ（Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ、ＮＪ）、Ｉｎｔｅｒｂｉｏｓｃｒｅｅｎ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ｌｉｆｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．（Ｏｒａｎｇｅ、ＣＴ）、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｔｄ．（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ｏｔａｖａ、（Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ）、ＰｈａｒｍＥｘ Ｌｔｄ．（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｍｏｎｍｏｕｔｈ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＮＪ）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（Ｃｅｎｔｅｒ Ｏｓｓｉｐｅｅ、ＮＨ）、Ｓｐｅｃｓ（Ｄｅｌｆｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＴｉｍＴｅｃ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｎｏｒｔｈ Ｙｏｒｋ ＯＮ）、ＵｋｒＯｒｇＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｋｉｅｖ、Ｕｋｒａｉｎｅ）、Ｖｉｔａｓ－Ｍ、（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、Ｚｅｌｉｎｓｋｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）、及びＢｉｃｏｌｌ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）を含むがこれらに限定されない、多数の企業から市販されている。
【0144】
細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物、及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、市販されているか、又は当技術分野において周知の方法によって容易に調製することができる。動物、細菌、真菌、葉及び樹皮を含む植物源、並びに海洋試料などの天然源から単離された化合物を、潜在的に有用な医薬品の存在についての候補としてアッセイすることができることが提案されている。スクリーニングされるべき医薬品は、化学的組成物又は人工化合物に由来するか又はそれらから合成されてもよいことが理解されよう。いくつかの市販ライブラリーを、スクリーニングに使用することができる。
【0145】
薬物スクリーニングアッセイに用いられるポリペプチド又は断片は、溶液中で遊離しているか、固体支持体又は細胞内に固定されているかのいずれであってもよい。薬物スクリーニングの１つの方法は、ポリペプチド又は断片を発現する組換えポリヌクレオチドが安定に形質転換されている真核生物宿主細胞又は原核生物宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイにおいて、利用する。このような細胞は、生きた状態又は固定された形式のいずれかで、標準的な結合アッセイに使用することができる。例えば、ポリペプチド若しくは断片と試験されている薬剤との間における複合体の形成を決定してもよく、又はポリペプチド若しくは断片と既知の基質との間における複合体の形成が、試験されている薬剤によって妨害される程度を試験してもよい。
【0146】
薬物スクリーニングのためのさらなる技術は、機能していないか又は改変されたリンパ異常関連遺伝子を有する、宿主真核細胞株、細胞（内皮細胞など）又は動物モデル全体（例えば、トランスジェニックマウス又はゼブラフィッシュ）の使用を伴う。いくつかの実施態様において、トランスジェニック生物体は、ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ；ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ；ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ；ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ；又は及びＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐの突然変異を有する細胞を含む。これらの宿主細胞株、細胞又はトランスジェニック動物は、ポリペプチドレベルで欠損している。宿主細胞株又は細胞を、薬物化合物の存在下において増殖させる。例えば、ゼブラフィッシュモデルでは、尾部及び又はＤ／Ｖ血管構造のレスキューを評価することができる。さらに、宿主細胞株におけるｍＴＯＲによるリン酸化の誘導を評価することができる。
【0147】
薬物スクリーニングの例示的な方法は、表１－２に記載された薬剤などの、細胞シグナル伝達を変化させる薬剤を同定するための方法であろう。この方法は、少なくとも１つのリンパ異常関連ＳＮＶを含む少なくとも１つの核酸を発現する細胞を提供すること；リンパ異常関連ＳＮＶに対応する同種野生型配列を発現する細胞を提供すること；少なくとも１つのリンパ異常関連ＳＮＶを発現する細胞及び同種野生型配列を発現する細胞を試験剤と接触させること；及び前記薬剤が細胞シグナル伝達を変化させるかどうかを分析することを含むであろう。
【0148】
本発明のリンパ異常関連ＳＮＶ又はその機能的断片を発現する宿主細胞は、潜在的化合物又は薬剤をリンパ異常の発症を調節する能力についてスクリーニングするためのシステムを提供する。したがって、一実施態様において、本発明の核酸分子を使用して、リンパ異常及び異常な血管形成に関連する異常なｍＴＯＲシグナル伝達の態様を調節する薬剤を同定するためのアッセイにおける使用のための組換え細胞株が作製され得る。ＳＮＶを含む核酸によってコードされるタンパク質の機能を調節することができる化合物についてスクリーニングする方法もまた本明細書に提供される。
【0149】
別のアプローチは、ＳＮＶを含む核酸によってコードされるポリペプチドの断片をファージ表面に発現するように操作されたファージディスプレイライブラリーの使用を伴う。このようなライブラリーを、次いで、コンビナトリアルケミカルライブラリーと、発現されたペプチドと化合物ライブラリーの構成成分との間の結合親和性を検出することができる条件下において、接触させる。米国特許第６０５７０９８号及び第５９６５４５６号は、そのようなアッセイを実施するための方法及び装置を提供している。
【0150】
別の実施態様において、リンパ異常関連改変核酸の利用可能性は、本発明の改変核酸を保有する実験用マウスの系統の産生を可能にする。これらのリンパ異常関連改変核酸は、ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ；ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ；ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ；ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ；及び／又はＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐであり得る。本発明のリンパ異常関連突然変異を発現するトランスジェニックマウスは、突然変異核酸によってコードされるタンパク質の、リンパ異常への発症及び進行における役割を調べるためのモデル系を提供する。実験用マウスに導入遺伝子を導入する方法は、当業者に知られている。３つの一般的な方法としては、１．初期胚に目的の外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを組み込むこと；２．ＤＮＡを新たな受精卵の前核に注入すること；及び３．遺伝子操作した胚性幹細胞を初期胚に組み込むことが挙げられる。上記のトランスジェニックマウスの産生により、標的タンパク質がリンパ異常表現型に関連する様々な過程において果たす役割の分子的解明が促進されるであろう。そのようなマウスは、全動物モデルにおいて推定上の治療薬を研究するためのインビボスクリーニングツールを提供するものであり、本発明に包含される。
【0151】
「動物」という用語は、ヒトを除き、すべての脊椎動物を含んで本明細書において使用される。これにはまた、胚段階及び胎児段階を含む、すべての発達段階における個々の動物も含まれる。「トランスジェニック動物」は、細胞以下のレベルで入念な遺伝子操作によって、例えば、標的化された組換え又はマイクロインジェクション、又は組換えウイルスでの感染によって、直接的又は間接的に、遺伝情報が改変又は受容された１つ又は複数の細胞を含む任意の動物である。「トランスジェニック動物」という用語は、古典的な異種交配又はインビトロでの受精を包含することを意味するのではなく、むしろ、１つ又は複数の細胞が組換えＤＮＡ分子によって改変されているか、又はそれを受容した、動物を包含することを意味する。この分子は、定義された遺伝子座を特異的に標的とし得るか、染色体内にランダムに組み込まれ得るか、又は染色体外でＤＮＡを複製し得る。「生殖細胞株トランスジェニック動物」という用語は、遺伝子改変又は遺伝情報が、生殖細胞株に導入されており、それによって、遺伝情報を子孫に伝える能力を付与したトランスジェニック動物を指す。そのような子孫が、実際に、その改変又は遺伝情報のうちの一部又はすべてを有する場合、それらも、トランスジェニック動物である。
【0152】
遺伝情報の改変は、レシピエントが属する動物種にとって外来のものであり得るか、若しくは特定の個々のレシピエントにとってのみ外来であり得るか、又はレシピエントが既に有している遺伝情報であり得る。最後の事例では、改変又は導入された遺伝子は、本来の遺伝子とは異なって発現され得る。そのような改変されたか又は外来の遺伝情報は、改変されたリンパ異常関連ヌクレオチド配列の導入を含むであろう。
【0153】
標的遺伝子を改変するために使用されるＤＮＡは、ゲノム源からの単離、単離したｍＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの調製、直接合成、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、様々な技術によって得ることができる。
【0154】
導入遺伝子を導入するための標的細胞の一種は胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、インビトロで培養された着床前の胚から得ることができる（Evans et al., (1981) Nature 292:154-156; Bradley et al., (1984) Nature 309:255-258; Gossler et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83:9065-9069）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクション又はレトロウイルス媒介型形質導入などの標準的な技術によって、ＥＳ細胞に効率的に導入することができる。結果として得られた形質転換ＥＳ細胞を、次いで、非ヒト動物に由来する胚盤胞と合わせることができる。導入されたＥＳ細胞が、次いで、胚にコロニー形成し、結果として得られるキメラ動物の生殖系列に寄与する。
【0155】
個々の遺伝子及びそれらの発現産物の寄与を決定する問題に対する１つのアプローチは、単離された、突然変異を含むリンパ異常関連遺伝子を、分化全能性ＥＳ細胞（上記のものなど）において野生型遺伝子を選択的に不活性化するための挿入カセットとして使用し、次いで、トランスジェニックマウスを生成することである。遺伝子標的化トランスジェニックマウスの生成において遺伝子標的化ＥＳ細胞を使用することは、説明されており、他の箇所で考察されている（Frohman et al., (1989) Cell 56:145-147; Bradley et al., (1992) Bio/Technology 10:534-539）。
【0156】
標的化相同組換えを使用して特定の変化を染色体対立遺伝子に挿入することによって、任意の遺伝子領域を不活性化するか又は所望される突然変異に改変するための技術が、利用可能である。しかしながら、ほぼ１００％の頻度で生じる相同的染色体外組換えと比較して、相同的プラスミド－染色体組換えは、当初、１０－６から１０－３の頻度でしか検出されないことが報告されていた。非相同的プラスミド－染色体の相互作用は、同等の相同的挿入よりも１０５倍から１０２倍高いレベルでより頻繁に生じる。
【0157】
マウスＥＳ細胞におけるこの低い割合の標的化組換えに対処するために、まれな相同組換え体を検出又は選択するための様々な戦略が開発されている。相同的改変事象を検出するための１つのアプローチでは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、相同的挿入のための形質転換体細胞のプールをスクリーニングし、続いて個々のクローンをスクリーニングする。あるいは、相同的挿入が生じた場合にのみ活性となるマーカー遺伝子を構築し、これらの組換え体を直接選択することができる、陽性遺伝子選択アプローチが開発されている。改変の直接的な選択が存在しない遺伝子のために開発された陽性－陰性選択（ＰＮＳ）法が、相同的組換え体を選択するために開発された最も強力なアプローチのうちの１つである。ＰＮＳ法は、マーカー遺伝子がそれ自体のプロモーターを有するため、高いレベルで発現されない遺伝子を標的とするのにより効率的である。非相同的組換え体は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）遺伝子を使用し、ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）又は（１－（２－デオキシ－２－フルオロ－Ｂ－Ｄアラビノフルラノシル）－５－ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）などの効果的なヘルペス薬により非相同的挿入に対して選択を行うことによって、選択される。この対抗選択によって、生存している形質転換体中の相同的組換え体の数が増大し得る。変異リンパ異常関連核酸を標的化挿入カセットとして用いることで、例えば、ＥＰＨＢ４核酸によってコードされるポリペプチドに免疫学的に特異的な抗体に対する免疫反応性の獲得によって可視化されるように、挿入の成功を検出するための手段が得られ、所望される遺伝子型を有するＥＳ細胞のスクリーニング／選択が容易となる。
【0158】
本明細書に使用されるとき、ノックイン動物とは、内因性マウス遺伝子が、例えば、本発明のヒトリンパ異常関連遺伝子と置き換えられているものである。このようなノックイン動物は、リンパ異常の発症を研究するための理想的なモデル系を提供する。
【0159】
本明細書に使用されるとき、変異リンパ異常関連核酸、その断片、又はリンパ異常関連融合タンパク質の発現は、リンパ異常関連核酸のすべて又は一部分をコードする核酸配列が、特定の組織又は細胞型においてコードされるタンパク質の発現を誘導する制御配列（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）に動作可能に連結されているベクターを使用して、「組織特異的様式」又は「細胞型特異的様式」で標的とすることができる。このような制御エレメントは、インビトロ及びインビボの両方の用途に有利に使用され得る。組織特異的タンパク質を誘導するためのプロモーターは、当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。あるいは、導入遺伝子は、組織特異的又は「全身」様式で機能し得る誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
【0160】
本発明のリンパ異常関連突然変異体をコードする核酸配列は、トランスジェニック動物における発現のために、様々な異なるプロモーター配列に動作可能に連結され得る。そのようなプロモーターには、限定されないが、ハムスター又はマウスのＴｈｙ－１プロモーターなどのプリオン遺伝子プロモーター；ＰＧＫプロモーター；又は所望の細胞型における導入遺伝子の発現のためのＣＭＶプロモーターが挙げられる。
【0161】
本発明のトランスジェニックマウスの使用方法もまた、本明細書に提供される。変異リンパ異常関連核酸を含む核酸又はそのコードされたタンパク質が導入されているトランスジェニックマウスは、例えば、治療剤をスクリーニングしてリンパ異常の発症を調節することができるものを同定するためのスクリーニング方法を開発するのに有用である。
【0162】
検出製品及びキット
リンパ異常ＳＮＶを検出するのに有用である組成物又は製品が包含される。例えば、リンパ異常関連ＳＮＶを含む核酸、それを発現するベクター、リンパ異常関連ＳＮＶを含むマーカータンパク質、及び抗リンパ異常特異的マーカー抗体は、ＳＮＶである、ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ、ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ、ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ、ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ、又はＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐを検出することができる製品である。ＳＮＶである、ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ、ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ、ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ、又はＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐを検出するのに十分な長さ及び特徴を有する核酸プローブもまた包含される。検出製品は、それらが検出できるように標識され得る。
リンパ異常ＳＮＶを検出するのに有用である組成物又は製品が包含される。例えば、リンパ異常関連ＳＮＶを含む核酸、それを発現するベクター、リンパ異常関連ＳＮＶを含むマーカータンパク質、及び抗リンパ異常特異的マーカー抗体は、ＳＮＶである、ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ、ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ、ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ、ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ、又はＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐを検出することができる製品である。ＳＮＶである、ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞ＰＩＫ３Ｒ４におけるｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇ、ＰＩＫ３Ｒ６におけるｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔ、ｍＴＯＲにおけるｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ、又はＡＲＡＦにおけるｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐを検出するのに十分な長さ及び特徴を有する核酸プローブもまた包含される。検出製品は、それらが検出できるように標識され得る。
【0163】
リンパ異常関連ＳＮＶを検出するのに有用な任意の製品をキットに組み込むことができる。リンパ異常を治療するのに有用な任意の製品をキットに組み込むことができる。そのような検出製品及び治療用製品を含むキットが包含される。キットは、１つ又は複数のリンパ異常関連ＳＮＶ特異的マーカーポリヌクレオチド又は固体支持体上に固定化されたそのようなマーカーの１つ若しくは集合、遺伝子チップ、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、ラベル、マーカー、レポーター、薬学的に許容される担体、生理学的に許容される担体、使用説明書、容器、投与用容器、アッセイ基質、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【0164】
以下の実施例は、本発明のある特定の実施態様を例示するために提供される。これらは、決して本発明を制限することを意図するものではない。
【実施例0165】
実施例Ｉ
ＬＡＭ／ＧＬＡの遺伝的根拠を同定するために、異型のリンパ異常に罹患した６人の個体を含む３世代の家族からの家族メンバーから得られたＤＮＡ試料に対して全エクソーム配列決定（ＥＳ）を行った。罹患した家族メンバーは、リンパ管疾患との組み合わせでの著しい静脈うっ血を含む様々なリンパ異常を示した。図１に示すように、血統は常染色体優性遺伝モデルを実証した。
ＬＡＭ／ＧＬＡの遺伝的根拠を同定するために、異型のリンパ異常に罹患した６人の個体を含む３世代の家族からの家族メンバーから得られたＤＮＡ試料に対して全エクソーム配列決定（ＥＳ）を行った。罹患した家族メンバーは、リンパ管疾患との組み合わせでの著しい静脈うっ血を含む様々なリンパ異常を示した。図１に示すように、血統は常染色体優性遺伝モデルを実証した。
【0166】
家族１の発端者は２４歳の男性であり、主に右側の乳び性滲出液として現れる複雑なリンパ管疾患の生涯にわたる病歴を有している。肺リンパ管腫症の診断は、生後４ヶ月の開胸肺生検における組織病理学的証拠によって以前に確認されていた。リンパ管造影では正常なリンパ管弁は認められなかった。リンパ液の逆流が見いだされ、これは、肺への（からではなく）流れの疑いを含んでいた。脊髄周囲の後腹膜及び肺にリンパ管の増殖があった。リンパ管は機能不全であり、リンパ節にガドリニウムを注射した後の流れは異常であった。気道周囲の腫れやリンパ管、気管支周囲のリンパ管を示唆する両側性の気管支周囲樹のＴ２強調があった。以前に乳び胸があった右肺底部での線維化の証拠もまた見いだされた。彼の家族歴は、彼の母親、母親の叔父と叔母、並びに母親の祖父におけるリンパ管の欠陥のために注目に値する。罹患した家族全員に静脈の変化があるが、一部の家族メンバーにおいて様々な程度のリンパ管の関与がある。
【0167】
発端者（すなわち、罹患した個体）及び健常な姉妹、両親、罹患していない母方の叔母、並びに最も有効なベースラインデータを提供した罹患した母方の祖父に対してエクソーム配列決定を行った。家族の常染色体優性遺伝モデルと一致するすべてのミスセンス、ナンセンス、スプライス改変、及びコーディング挿入欠失変異を調べた。同義の変異体、０．５％を超えるマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を有する変異体、及び以前にコントロールにおいて同定された変異体を除外するために、社内のエクソームバリアントデータベースにより、結果をフィルタリングした。関連する候補は手作業のキュレーションで進められた。
【0168】
結果として、ＥＰＨＢ４遺伝子内のスプライス部位変異をもたらす一塩基対置換、ｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃが原因変異として同定された。表現型による突然変異の同時分離は、サンガー配列決定によって確認され、これは、６人の罹患した個体におけるヘテロ接合スプライシング変異体の存在及び７人の罹患していない家族メンバーにおける突然変異の非存在を実証した。図１の単一のアスタリスクは、この原因となる突然変異について陽性と試験されたことを示し、二重のアスタリスクは突然変異について陰性と試験された個体を示す。
【0169】
ＥＰＨＢ４はリンパ管集合管の弁に発現しており、発端者における罹患した個体は、弁の欠損又は機能不全を示唆する逆流を示すリンパ管造影を有している。ｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ突然変異は、１０００ゲノムプロジェクト、ＣＯＳＭＩＣ、ＥＳＰ６５００ＳＩ及びＥｘＡＣ ６１，０００エクソームｖ０．３リリースには存在しなかった。リード発端者から得られた皮膚生検を用いたＲＮＡ－ｓｅｑは、ＥＰＨＢ４スプライス改変突然変異がイントロンの介在１２ｂｐの保持を引き起こし、プロテインキナーゼドメインの高度に保存された触媒ループにおける非フレームシフト４アミノ酸挿入をもたらす隠れたスプライスドナーを作り出すことを示し、これは標準的なサンガー配列決定法によっても確認された（データは示さず）。ＲＴ－ＰＣＲにより、発端者及び母親から作製されたＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）に２つのバンドが確認され、非罹患コントロールからの皮膚は野生型ＥＰＨＢ４の発現レベルが高いことが示された（データは示さず）。健常な家族メンバー及び患者由来のＬＣＬにおけるＥＰＨＢ４のタンパク質イムノブロットは、すべての試料において予測サイズのバンド（１２０ｋＤ）を示し、コントロールにおいてより顕著なバンドを示した（データは示さず）。
【0170】
ＥＰＨＢ４は、受容体チロシンキナーゼであり、特異的リガンドとしてエフリンＢ２（ＥＦＮＢ２）を認識するエフリンＢ型受容体４をコードする。ＥＦＮＢ２／ＥＰＨＢ４経路は、静脈及びリンパ系細胞の運命決定に影響を与えることが以前に示されている。図２は、動脈表現型、静脈表現型及びリンパ管表現型を生じさせるシグナル伝達経路の概略図を提供し、静脈表現型の発達におけるＥＰＨＢ４の役割を強調する。
【0171】
実施例ＩＩ
１０の追加の家族を配列決定して、３つの追加の疾患原因遺伝子を同定した。一つ目はホスホイノシチド－３－キナーゼ調節サブユニット４（ＰＩＫ３Ｒ４）のミスセンス突然変異、二つ目はホスホイノシチド－３－キナーゼ調節サブユニット６（ＰＩＫ３Ｒ６）のホモ接合スプライシング突然変異、三つ目はｍＴＯＲのミスセンス突然変異であった。ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ＭＴＯＲ、及びＥＰＨＢ４ａは、それらが同じ生理学的ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路に収束するという点で関連している。したがって、この経路は、リンパ異常の治療に有効性を有し得る治療薬にとって理想的な標的を提供する。
１０の追加の家族を配列決定して、３つの追加の疾患原因遺伝子を同定した。一つ目はホスホイノシチド－３－キナーゼ調節サブユニット４（ＰＩＫ３Ｒ４）のミスセンス突然変異、二つ目はホスホイノシチド－３－キナーゼ調節サブユニット６（ＰＩＫ３Ｒ６）のホモ接合スプライシング突然変異、三つ目はｍＴＯＲのミスセンス突然変異であった。ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ＭＴＯＲ、及びＥＰＨＢ４ａは、それらが同じ生理学的ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路に収束するという点で関連している。したがって、この経路は、リンパ異常の治療に有効性を有し得る治療薬にとって理想的な標的を提供する。
【0172】
表３は、これらのデータの要約を提供する。ＥＰＨＢ４のｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃに上記の突然変異を有する家族を家族－１と命名した。家族２については、エクソン配列決定により、両親がヘテロ接合体である発端者のＰＩＫ３Ｒ６においてホモ接合変異体、ｃ．１３９３－７Ｃ＞Ｔが明らかとなった。ＰＩＫ３Ｒ６は、触媒サブユニットｐ１１０と対合してクラスＩＢ ＰＩ３Ｋ複合体を形成する調節サブユニット（ｐ８４）をコードする。家族３及び４については、ＭＴＯＲにおいて非常にまれなミスセンス突然変異、ｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌ、及びＰＩＲ３Ｒ４において新規ミスセンス突然変異、ｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇがそれぞれ同定された。家族５及び６において、保存されたリン酸化部位において反復性ＡＲＡＦ突然変異、ｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐが同定され、これは推定上、残基Ｓ２１４のリン酸化がＡ－ＲＡＦ癌原遺伝子（ＡＲＡＦ）の調節に関与しているので、機能獲得をもたらすであろう。遺伝様式は、表３に記載のように、常染色体優性（ＡＤ）又は常染色体劣性（ＡＲ）として特徴付けられた。
【0173】
実施例ＩＩＩ
４つの同定されたヒト突然変異のインビボでのゼブラフィッシュ研究は、それらがリンパ異常に関連があることを確認した。
４つの同定されたヒト突然変異のインビボでのゼブラフィッシュ研究は、それらがリンパ異常に関連があることを確認した。
【0174】
ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ突然変異が遺伝子産物の触媒活性に影響を与えるかどうかを決定するために、ＥＰＨＢ４の野生型及び突然変異体型を含む発現コンストラクトを作製した。ＥＰＨＢ４コード配列を含むプラスミドは、ＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（カタログ番号ＭＨＳ６２７８－２０２８３３４４６、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）から入手した。発見された１２塩基対の挿入は、プライマー配列番号１及び配列番号２を使用してＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ ＩＩ突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて行われた。コード配列を、順方向プライマー配列番号３及び逆方向プライマー配列番号４を使用してＰＣＲによって増幅し、ｐＢａｂｅ＋ＣＭＶ ＰｕｒｏのＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位に連結した。順方向プライマー配列番号５及び逆方向プライマー配列番号６を使用して、Ｑ５突然変異誘発キット（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いてシグナルペプチドに続いてコード配列にＦＬＡＧタグを挿入した。すべての配列は、サンガー配列決定により確認された。
【0175】
ＨＥＫ２３９Ｔ細胞及びＡ３７５メラノーマ細胞株は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手した。製造者のプロトコルに従って、３μｇのＤＮＡ及び９μｌのトランスフェクション試薬を用いて、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してトランスフェクションを行った。エフリン－Ｂ２－Ｆｃでトランスフェクトした細胞を刺激するために、６ウェルプレート（組織培養処理していない、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍＬのエフリン－Ｂ２－Ｆｃ（カタログ番号７３９７－ＥＢ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はヒト骨髄腫血漿由来のＩｇＧ１、カッパ（カタログ番号Ｉ５１５４、Ｓｉｇｍａ）のいずれかで一晩３７℃でコーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで４℃で３０分間ブロックし、再びＰＢＳで洗浄した。トランスフェクトした細胞を、ＤＭＥＭ中の１０ｍＭのＥＤＴＡを使用してそれらのプレートから取り出し、洗浄し、無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁し、被覆プレートに添加した。プレートを１５分間４℃に置き、２０分間で３７℃に移した後、細胞を溶解した。指示される場合は、ＦＬＡＧ免疫沈降（ＩＰ）を、Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（カタログ番号Ａ２２２０、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して行った。ＩＰ及び溶解物をＮｕＰＡＧＥ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上で泳動し、抗ホスホチロシン－４Ｇ１０－ビオチン（カタログ番号１６－１０３、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ Ｍａ）及び抗ＥＰＨＢ４（カタログ番号ＡＦ３０３８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いてブロットした。
【0176】
２９３Ｔ細胞への野生型ＥＰＨＢ４のトランスフェクションは、タンパク質の構成的チロシンリン酸化をもたらした（図３Ａ、上部パネルにリン酸化Ｔｙｒ（ｐＴｙｒ）及び下部パネルに総ＥＰＨＢ４）。対照的に、劇的に少ないチロシンリン酸化が、変異体のトランスフェクションで検出された。胎児水腫におけるＥＰＨＢ４の異なる突然変異について前に記載したように、野生型と突然変異体タンパク質の混合物のトランスフェクションは、トランスフェクトされた突然変異体タンパク質の量にほぼ比例して、リン酸化の減少をもたらした。Martin-Almedina S, et al. J Clin Invest 126:3080-3088 (2016)を参照。Ａ３７５メラノーマ細胞株への突然変異体ＥＰＨＢ４のトランスフェクション（図３Ｂ）は、野生型ＥＰＨＢ４のトランスフェクションと比較してはるかに少ない構成的リン酸化をもたらした（ＦＬＡＧ免疫沈降又は全細胞溶解物後のＥＰＨＢ４に対するｐＴｙｒブロットによるシグナルを比較）。ＥＰＨＢ４のリガンドであるエフリンＢ２でトランスフェクトした細胞を刺激すると、野生型ＥＰＨＢ４のリン酸化の誘導をもたらしたが、突然変異体ＥＰＨＢ４のリン酸化は誘導されなかった（データは示さず）。これらの結果は、スプライス改変突然変異によって引き起こされる４つのアミノ酸挿入が突然変異体ＥＰＨＢ４のキナーゼ活性に重大な影響を及ぼすこと、及び突然変異体の存在が野生型タンパク質のリン酸化に影響を及ぼし得ることを示唆する。
【0177】
ＥＰＨＢ４変異体の機能的影響を評価するために、ｔｇ（ｆｌｉ１：ＧＦＰ）株を使用することによって患者において同定されたのと同じエクソン１３のスプライスジャンクションを阻害する、ゼブラフィッシュにおけるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、ｍＲＮＡノックダウンアプローチを行った。エクソン１３を標的とするモルホリノ配列はＣＧＡＧＡＧＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴ（配列番号１５）であり、０．８ｍＭの濃度で使用した。ｐｉｋ３ｒ６ ｅｘ４ ｄｅｌについては、用いた濃度は０．２５ｍＭであり、ｐｉｋ３ｒ６ ｅｘ１３ ｄｅｌについては、濃度は０．５ｍＭであった。ＲＴ－ＰＣＲ分析は、～６６％の効率的なノックダウンを示した（図４）。
【0178】
受精後２．５日（ｄｐｆ）での血管の融合及び尾部血管叢の一般的な拡大（図５Ａのコントロールを図５Ｂのモルホリノ処置と比較）は、図５Ｅにおいて定量化され（「尾部欠陥」として表示）、モルホリノ注入幼虫の約５２％において観察された（２２５匹の動物を用いた４つの実験、Ｐ＜０．０００６）。さらに、受精後４日目（ｄｐｆ）に体節間血管の側方異常及び過剰分岐が、注入幼虫の約４６％で観察された（図５Ｃ［コントロール］及び図５Ｄ［モルホリノ処置］）。図５Ｅは定量化を示す（「誤分岐」と表示、６つの実験、２５９匹の動物、Ｐ＜３．９Ｅ－０８）。形態学及び側方分岐は、これらの異常な分岐がリンパ管の特徴を有することを示している。モルファント（ＭＯ）由来のｅｐｈｂ４ａ ｃＤＮＡの増幅は、１３番目のエクソンを特異的に標的とすることが、小さい又はより大きい挿入のいずれかを伴う異常なスプライシングをもたらすことを明らかにした。サンガー配列決定は、小さい方のバンドが３０ｂｐのインフレーム挿入（ＶＮＴＡＬＶＬＳＩＬをコードする）である一方、大きい方のバンドはエクソン１３と１４の間のイントロンの保持に起因するものであり、おそらく未成熟終止コドンをもたらすことを示した。
【0179】
モルホリノデータを検証するために、もともとサンガー研究所によってｔｉｌｌｉｎｇアプローチを用いて発見された点突然変異ｅｐｈｂ４ａｓａ１１４３１を保有する突然変異株（Kettleborough RN, et al., Nature 496:494-497 (2013)を参照）を取得した。しかしながら、ｔｇ（ｆｌｉ１：ＧＦＰ）バックグラウンドを有する突然変異キャリアの近交系間交配種は、尾部神経叢における欠陥又は体節間血管の誤分岐を示さなかった。潜在的に、ゼブラフィッシュの２番目のｅｐｈｂ４遺伝子、ｅｐｈｂ４ｂは、ｅｐｈｂ４ａの完全な欠如を補うことができた。実際に、エクソン１３スプライスジャンクションを標的とするｅｐｈｂ４ｂモルホリノの注入は、受精後５４時間（ｈｐｆ）で尾部神経叢の融合及び拡大をもたらした。より高濃度では、これらの幼虫の約７０％もまた４ｄｐｆで誤分岐を発症した（データは示さず）。重要なことに、これらの表現型は、モルホリノが野生型幼虫においてｅｐｈｂ４ｂのみを標的とする場合には誘導されなかった（データは示さず）。
【0180】
ｍＴＯＲＣ１がリンパ管発達のための重要なシグナル伝達経路であることが示唆されている（Sun et al., Nature 496:494-497 (2015)を参照のこと）。したがって、ＥＰＨＢ４のエクソン１３の同じスプライスジャンクションを阻害するために、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されたゼブラフィッシュを、ｍＴＯＲＣ１阻害剤ラパマイシン（１μＭ）及びＢＥＺ－２３５（１００ｎＭ）で処理した。２４ｈｐｆから５６ｈｐｆのラパマイシンによる処置は、図５Ｆに示すように、４４％（コントロール、処置なし）から２９％（６つの実験、３２１匹の動物、Ｐ＜０．０１）の尾部血管叢における欠陥の有意なレスキューを示した。ラパマイシンはまた、２．５ｄｐｆから４ｄｐｆで処置したときに、体節間血管の誤分岐をレスキューした（４７％［コントロール、治療なし］対２０％）（図５Ｇ、６つの実験、１３６匹の動物、Ｐ＜０．００００７）。ＢＥＺ－２３５はまた、４５％（コントロール）から１５％へと誤分岐をレスキューした（図５Ｈ、２つの実験、４１匹の動物、Ｐ＜０．０３７）。
【0181】
したがって、ゼブラフィッシュからのデータはリンパ系の適切な発達におけるＥＰＨＢ４の役割を確認した。これらのデータは、ｃ．２３３４＋１Ｇ＞ＣなどのＥＰＨＢ４の突然変異が、ヒト患者の血統に見られるようなリンパ異常の表現型を予測することを支持している。
【0182】
次に、ｐｉｋ３ｒ６に対する２つのモルホリノ株を開発した。両方とも１つはエクソン４に、他方はエクソン１３においてスプライスドナー部位を標的とし、患者において同定されたのと同じオルソログ領域をカバーした。これらのモルホリノのいずれも尾部血管叢にて表現型を誘導しなかったが、両方とも体節間血管の重篤な誤分岐を引き起こした。エクソン４の欠失（図６Ｂ）は、エクソン１３の欠失よりもより重篤な表現型を引き起こす。（図６Ａ－図６Ｄ、ｅｘ４：注入されたモルホリノの５５％、７つの実験、２１０匹の動物、Ｐ＜１．１３Ｅ－０７；ｅｘ１３：４７％、３つの実験、７０匹の動物、Ｐ＜０．００１６）。
【0183】
さらに、ラパマイシン及びＢＥＺ－２３５も、ｐｉｋ３ｒ６エクソン４モルホリノによって誘導される誤分岐表現型を阻害し得るかどうかを調べた。実際に、両薬物は、それらが血管正常化をもたらす機能的プロセスを逆転させることができることを示した。ラパマイシンは、異常分岐を有する動物の数を４７％から２１％に減少させ（図６Ｅ、４つの実験、１９０匹の動物、Ｐ＜０．００３）、ＢＥＺ－２３５は誤分岐動物を５６％から２３％に減少させた（図６Ｆ、４つの実験、１０３匹の動物、Ｐ＜０．００８）。
【0184】
ｐｉｋ３ｒ４がゼブラフィッシュのリンパ管発達に影響を与えるかどうかを調べるために、モルホリノをエクソン３のスプライスジャンクション部位に対して設計した。５％の誤分岐を有するコントロールと比較して、モルホリノは、注入された幼虫の１６％に誤分岐を誘導し、これが体節間血管又はリンパ管に影響を及ぼした（形態及び血管の位置によって評価される）（図７Ａ－７Ｄ；２つの実験；１９８匹の動物；Ｐ＜０．０５）。
【0185】
ＰＩＫ３Ｒ６及びＥＰＨＢ４モルホリノによって引き起こされる生化学的効果を決定するために、複数のゼブラフィッシュ幼虫を４．５から５ｄｐｆの間で溶解させ、溶解物をウエスタンブロットによってｍＴＯＲＣ１シグナル伝達について分析した。４．５－５ｄｐｆのゼブラフィッシュ幼虫の体幹切片を、プロテアーゼ阻害剤（完全プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した放射性免疫沈降法（ＲＩＰＡ）緩衝液中で溶解した。ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて泳動させたＮｕＰＡＧＥ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上で、約５マイクログラムのタンパク質を分離した。以下の抗体を使用してウエスタンブロッティングを行った：ｐ－ｐ７０ Ｓ６キナーゼＴ３８９（カタログ番号９２０５Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、ホスホ－ｍＴＯＲ Ｓｅｒ２４４８（カタログ番号５５３６Ｐ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＨＩＦ１（カタログ番号ＬＳ－Ｃ２８７２０３、ＬＳＢｉｏ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、ベータアクチン（カタログ番号ＡＣ－１５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）。
【0186】
ＰＩＫ３Ｒ６（図８Ａ）及びＥＰＨＢ４ ＭＯ（図８Ｂ）は両方とも、ｍＴＯＲ及びその下流標的ｐ７０Ｓ６Ｋの両方のリン酸化によって検出されるように、活性化ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達を示した。いずれのモルホリノによるｍＴＯＲＣ１の活性化も、ラパマイシンによる発育期の幼虫の処理によって阻害された。ＰＩＫ３Ｒ６モルホリノによる活性化は、ＢＥＺ２３５、二重ＰＩ－３－キナーゼ及びｍＴＯＲ阻害剤によっても阻害された。さらに、ＥＰＨＢ４突然変異の細胞モデルをＣＲＩＳＰＲを使用して開発した。ＥＰＨＢ４ ｃＤＮＡのエクソン１２から１４領域をＰＣＲにより増幅し、直接配列決定してノックインを確認した。ＥＰＨＢ４遺伝子座に対する特異的な標的配列（ｇＲＮＡ－ＥＰＨＢ４）を含むｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏベクターを、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を用いて、製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬を使用して２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ｓｓＯＤＮは、ＥＰＨＢ４突然変異及びそれぞれ４又は３の同義又は非コードの変化を再現するためのゲノム配列に対する一塩基ミスマッチを含む。ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）Ｖ２．０はＡｄｄｇｅｎｅから購入した（プラスミドＩＤ番号６２９８８）。この研究で使用されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ＥＰＨＢ４については配列番号７）は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のすぐ上流に存在し、ＭＩＴからのｇＲＮＡデザイナーを使用して設計された（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）。ｇＲＮＡアセンブリのために、以下の配列（ｈＥＰＨＢ４－Ｆ＝配列番号８、ｈＥＰＨＢ４－Ｒ＝配列番号９、ｈＰＩＫ３Ｒ６－Ｆ＝配列番号１０、ｈＰＩＫ３Ｒ６－Ｒ＝配列番号１１）を有する各標的部位について一対の合成オリゴをアニールし、ＢｂｓＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）制限酵素部位を使用してｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏにペーストした。合成されたｓｓＯＤＮ（１８０塩基、配列番号１２）はＩＤＴから購入した。
【0187】
ＣＲＩＳＰＲ試薬のトランスフェクション後、ＥＰＨＢ４スプライス改変突然変異を有する遺伝子編集細胞のウエスタンブロット分析は、野生型細胞と比較してｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｐ－ｐ７０Ｓ６Ｋ）のリン酸化のより高いレベルを示した（図９）。
【0188】
野生型又は変異型のｍＴＯＲ ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞において、ｍＴＯＲの発現が有意に増加することも見出された。Ｎ末端にＦＬＡＧタグを有するヒト野生型ｍＴＯＲｃＤＮＡ（ＩＤ番号２６６０３）を含む哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３－ＦＬＡＧ ｍＴＯＲ ｗｔ）をＡｄｄｇｅｎｅから入手した。野生型ｍＴＯＲ ｃＤＮＡを保有するこの発現ベクターを使用して、製造業者の指示に従ってＱ５部位特異的突然変異誘発キット（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いてＰ２２７３Ｌ ｍＴＯＲ突然変異体を生成した。プライマーは、鋳型特異的変異原性プライマー設計プログラムを使用して設計された。プライマー配列は配列番号１３及び配列番号１４であった。
【0189】
ＨｅＬａ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃で増殖させた。ＨｅＬａ細胞を、製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）に従って、空のベクター（ｅ．ｖ．）、野生型（ｗｔ）又はＰ２２７３Ｌ変異体ｍＴＯＲ発現ベクターで一過性にトランスフェクトした。培地はトランスフェクションの２４時間後に交換した。トランスフェクションの３６－４８時間後、細胞を氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのβ－グリセロリン酸、１０％グリセロール（ｗ／ｖ）、１％のＮＰ－４０（ｗ／ｖ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＮａＶＯ４、溶解緩衝液１ｍＬ当たり２０μｌのＥＤＴＡフリータンパク質阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む、新たに調製した氷冷細胞溶解緩衝液を使用して氷上で溶解した。細胞溶解物を、１．５ｍＬの微量遠心管に集め、ボルテックスにより破砕し、氷上で５分間インキュベートした。次いで細胞溶解物を４℃で５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を回収し、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を使用して測定した。この細胞溶解物をウエスタンブロッティングに使用した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に転写した１０－３０μｇの細胞溶解物を使用してウエスタンブロッティングを行った。膜を５％スキムミルク／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）を用いて室温で１時間ブロックし、次いで膜を分子量に基づいてスライスした。膜を、抗ＥＰＨＢ４、抗ホスホ－ｐ７０Ｓ６Ｋ（カタログ番号９２３４、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、抗ＦＬＡＧ（カタログ番号２９７２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ ＭＡ）、又は抗βアクチン（カタログ番号ｓｃ－１６１６Ｒ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体を含む一次抗体と共に室温（ＲＴ）で１時間又は４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴにより４回洗浄した後、ブロットをそれぞれのＨＲＰ結合抗ウサギ又は抗マウス二次抗体（カタログ番号ｓｃ－２００４及びｃ－２００５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴにより洗浄した後、膜上のタンパク質バンドを増強化学発光（ＥＣＬ）反応試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて検出し、Ｘ線フィルムに露光した。
【0190】
ｍＴＯＲ突然変異体、Ｐ２２７３Ｌは、野生型ｍＴＯＲ又は空ベクター（ｅ．ｖ．）と比較して、ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化（Ｐ－ｐ７０Ｓ６Ｋ）の増加をもたらし（図１０）、シグナル伝達の増強を示し、機能獲得型突然変異と一致する。
【0191】
ＡＲＡＦ ｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐ突然変異を評価するための実験は、実施例ＩＩに記載されているように行われた。ヒトＡＲＡＦ野生型又はＳ２１４Ｐ突然変異体を発現する内皮細胞を作製し、５％ＦＢＳ培地中で漸増用量のＥＲＫ阻害剤（１ー１００ｎｍ）と共にインキュベートした。これらの細胞株を使用して、ＡＲＡＦ Ｓ２１４Ｐ突然変異は血管新生を損ない、内皮細胞の遊走能力を低下させることが決定された（図１１Ａ及び１２を参照）。
【0192】
ゼブラフィッシュにおけるヒトＡＲＡＦ野生型又はＳ２１４Ｐ突然変異体のトランスジェニックモザイク発現を調べた（１１Ｂ－Ｌ）。ヒトＡＲＡＦの発現は拡大した尾部血管を誘導し、その拡大した尾部血管の欠陥は、２ｄｐｆで、ヒトＡＲＡＦ Ｓ２１４Ｐのトランスジェニック発現の２１％において検出されたが、野生型では検出されなかった（＊＊＊Ｐ＜０．００１）（図１１Ｃ－Ｅ）。部分的なレスキューは、ＭＥＫ阻害剤（例えば、Ｕ０１２６、コビメチニブを生理的海水中１－１０μＭ、及びセルメチニブを生理的海水中５０－１００μＭ）で処理した後の管形成及び遊走において検出される。図１１Ｆ－Ｌ及び図１２を参照のこと。ＥＰＨＢ４野生型、ＥＰＨＢ４－Ｄｅｘ１３突然変異体、又はＥＰＨＢ４－１２ｂｐ挿入変異体を発現する内皮細胞も作製した。Ｅｐｈｂ４突然変異は、これらの細胞株の管形成を損なうようには見えなかった（データは示さず）。
【0193】
実施例ＩＶ
ＥＲＫ阻害剤によるＡＲＡＦ突然変異を有する患者の治療：
胸部のドレーンと焼灼を行うために複数の手術を必要とした重篤なＧＬＡを有する１２歳の男性が、上記のＡＲＡＦ突然変異を有することが判明した。彼は以前６ヶ月間ラパマイシンで治療されたことがあるが何の効果もなく、手術を必要とする進行性乳びを有し続けた。彼はその後複数の胸部手術を必要とし、ＡＲＡＦ突然変異が確認されＥＲＫ阻害剤による治療が承認されたときには、万策が尽きていた。その後、彼はトラメチニブ（子供で承認された唯一のＭＥＫ阻害剤であり、セルメチニブとコビメチニブの効果に匹敵する効果がある）を１日１ｍｇで開始し、応答のために１か月続けた。以前に重篤な拘束性肺疾患を示した彼の肺機能検査は、トラメチニブによる１ヵ月の治療を開始した後には全体的に４５％（ＦＶＣ、ＦＥＶ１）改善した。手首の周りの多少の乾燥肌を除いて、彼にはトラメチニブ治療による副作用はなかった。彼はまた、トラメチニブ治療後には体調が良く、息切れも少なく、よりよく食べていた。治療後、彼は止まることなく階段を上ることができ、屋外でバスケットボールができたが、どちらも以前には不可能であった。治療後、彼の酸素脈は正常であり、最低値は朝に記録され（９５％）、彼は酸素なしで過ごした。彼のＣＴ胸部スキャンは２ヵ月の治療後も本質的に変化がなく、彼の疾患は進行していなかったことを示唆している（肺機能検査はＸ線撮影による測定よりも治療に対する応答の測定においてはるかに敏感である）。まとめると、これは、トラメチニブがＧＬＡ疾患の進行を停止させたという証拠であり（例えば、肺機能及び酸素飽和度の改善、並びに補給酸素に対する要件の緩和）、ＥＲＫ阻害剤治療は、ＧＬＡ及びＡＲＡＦ突然変異を有する患者にとって、かつ潜在的にはＥＲＫ機能に影響を及ぼす突然変異を有する患者にとって有益であり得ることを示唆している。
ＥＲＫ阻害剤によるＡＲＡＦ突然変異を有する患者の治療：
胸部のドレーンと焼灼を行うために複数の手術を必要とした重篤なＧＬＡを有する１２歳の男性が、上記のＡＲＡＦ突然変異を有することが判明した。彼は以前６ヶ月間ラパマイシンで治療されたことがあるが何の効果もなく、手術を必要とする進行性乳びを有し続けた。彼はその後複数の胸部手術を必要とし、ＡＲＡＦ突然変異が確認されＥＲＫ阻害剤による治療が承認されたときには、万策が尽きていた。その後、彼はトラメチニブ（子供で承認された唯一のＭＥＫ阻害剤であり、セルメチニブとコビメチニブの効果に匹敵する効果がある）を１日１ｍｇで開始し、応答のために１か月続けた。以前に重篤な拘束性肺疾患を示した彼の肺機能検査は、トラメチニブによる１ヵ月の治療を開始した後には全体的に４５％（ＦＶＣ、ＦＥＶ１）改善した。手首の周りの多少の乾燥肌を除いて、彼にはトラメチニブ治療による副作用はなかった。彼はまた、トラメチニブ治療後には体調が良く、息切れも少なく、よりよく食べていた。治療後、彼は止まることなく階段を上ることができ、屋外でバスケットボールができたが、どちらも以前には不可能であった。治療後、彼の酸素脈は正常であり、最低値は朝に記録され（９５％）、彼は酸素なしで過ごした。彼のＣＴ胸部スキャンは２ヵ月の治療後も本質的に変化がなく、彼の疾患は進行していなかったことを示唆している（肺機能検査はＸ線撮影による測定よりも治療に対する応答の測定においてはるかに敏感である）。まとめると、これは、トラメチニブがＧＬＡ疾患の進行を停止させたという証拠であり（例えば、肺機能及び酸素飽和度の改善、並びに補給酸素に対する要件の緩和）、ＥＲＫ阻害剤治療は、ＧＬＡ及びＡＲＡＦ突然変異を有する患者にとって、かつ潜在的にはＥＲＫ機能に影響を及ぼす突然変異を有する患者にとって有益であり得ることを示唆している。
【0194】
このように、本出願に提示されたデータは、ＧＬＡ及び静脈うっ血を含む複雑なリンパ異常を有する６人の患者において初めて確認され、ｍＴＯＲＣ１活性の増加をもたらした、ＥＰＨＢ４における新規のスプライス改変突然変異を同定する。ＥＰＨＢ４におけるこのｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃ突然変異は、フォワードシグナル伝達におけるリン酸化に関与するプロテインキナーゼドメインにおける非フレームシフト挿入をもたらす。
【0195】
機能的データは両方とも、突然変異ＥＰＨＢ４におけるｃ．２３３４＋１Ｇ＞Ｃの病原性を検証し、その挿入がＥＰＨＢ４タンパク質のリン酸化状態を減少させることを示している。ゼブラフィッシュにおけるスプライシング改変ＥＰＨＢ４突然変異のモデル化は、リンパ管の発達における管の誤分岐及び変形をもたらし、血管とリンパ管の両方の分化欠陥の可能性を示し、家族－１の患者の症状を模倣している。際だったことに、ｍＴＯＲシグナル伝達を阻害する薬物はこの誤分岐表現型をレスキューすることができた。
【0196】
さらに、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路に収束する、ＰＩＫ３Ｒ６、ＭＴＯＲ及びＰＩＫ３Ｒ４における複数の生殖細胞系列変異及び機能的データは、これらの突然変異がゼブラフィッシュの尾部欠陥と誤分岐を引き起こす能力を支持している。したがって、本明細書に提示された裏付けとなる証拠は、ＰＩＫ３Ｒ６、ＭＴＯＲ及びＰＩＫ３Ｒ４における突然変異もリンパ管新生過程において重複しない役割を果たすことを強く示唆している。
【0197】
反復性ＡＲＡＦ突然変異も、機能獲得効果が推定される保存されたリン酸化部位に見いだされた。ＡＲＡＦ活性化は、次にリングフィンガー及びＦＹ３様ドメインを含むＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＲＦＦＬ）を上方制御し、細胞の増殖促進と遊走促進を導く持続的なＰＫＣ活性化を達成するために、ｍＴＯＲＣ２の成分及びプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化の抑制因子であるプロリンリッチ５様（ＰＲＲ５Ｌ）のポリユビキチン化及び不安定化をもたらす。したがって、リンパ異常の発症において原因となる役割を有するＡＲＡＦにおける突然変異の基本メカニズムもある。注目すべきことに、ＡＲＡＦにおいて突然変異を有する患者のＥＲＫ阻害剤による治療は、疾患の症状を首尾良く改善した。
【0198】
参考文献
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12. Revencu N, Boon LM, Mendola A, Cordisco MR, Dubois J, Clapuyt P, Hammer F, Amor DJ, Irvine AD, Baselga E, Dompmartin A, Syed S, Martin-Santiago A, Ades L, Collins F, Smith J, Sandaradura S, Barrio VR, Burrows PE, Blei F, Cozzolino M, Brunetti-Pierri N, Vicente A, Abramowicz M, Desir J, Vilain C, Chung WK, Wilson A, Gardiner CA, Dwight Y, Lord DJ, Fishman L, Cytrynbaum C, Chamlin S, Ghali F, Gilaberte Y, Joss S, Boente Mdel C, Leaute-Labreze C, Delrue MA, Bayliss S, Martorell L, Gonzalez-Ensenat MA, Mazereeuw-Hautier J, O’Donnell B, Bessis D, Pyeritz RE, Salhi A, Tan OT, Wargon O, Mulliken JB, Vikkula M 2013 RASA1 mutations and associated phenotypes in 68 families with capillary malformation-arteriovenous malformation.Hum Mutat 34:1632-1641
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16. Joyce S, Gordon K, Brice G, Ostergaard P, Nagaraja R, Short J, Moore S, Mortimer P, Mansour S 2016 The lymphatic phenotype in Noonan and Cardiofaciocutaneous syndrome.Eur J Hum Genet 24:690-696
17. Morcaldi G, Bellini T, Rossi C, Maghnie M, Boccardo F, Bonioli E, Bellini C 2015 Lymphodysplasia and Kras Mutation: A Case Report and Literature Review.Lymphology 48:121-127
18. Makinen T, Adams RH, Bailey J, Lu Q, Ziemiecki A, Alitalo K, Klein R, Wilkinson GA 2005 PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature.Genes Dev 19:397-410
19. Kume T 2010 Specification of arterial, venous, and lymphatic endothelial cells during embryonic development.Histol Histopathol 25:637-646
20. Hashimoto T, Tsuneki M, Foster TR, Santana JM, Bai H, Wang M, Hu H, Hanisch JJ, Dardik A 2016 Membrane-mediated regulation of vascular identity.Birth Defects Res C Embryo Today 108:65-84
21. Martin-Almedina S, Martinez-Corral I, Holdhus R, Vicente A, Fotiou E, Lin S, Petersen K, Simpson MA, Hoischen A, Gilissen C, Jeffery H, Atton G, Karapouliou C, Brice G, Gordon K, Wiseman JW, Wedin M, Rockson SG, Jeffery S, Mortimer PS, Snyder MP, Berland S, Mansour S, Makinen T, Ostergaard P 2016 EPHB4 kinase-inactivating mutations cause autosomal dominant lymphatic-related hydrops fetalis.J Clin Invest 126:3080-3088
22. Kettleborough RN, Busch-Nentwich EM, Harvey SA, Dooley CM, de Bruijn E, van Eeden F, Sealy I, White RJ, Herd C, Nijman IJ, Fenyes F, Mehroke S, Scahill C, Gibbons R, Wali N, Carruthers S, Hall A, Yen J, Cuppen E, Stemple DL 2013 A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function.Nature 496:494-497
23. Sun S, Chen S, Liu F, Wu H, McHugh J, Bergin IL, Gupta A, Adams D, Guan JL 2015 Constitutive Activation of mTORC1 in Endothelial Cells Leads to the Development and Progression of Lymphangiosarcoma through VEGF Autocrine Signaling.Cancer Cell 28:758-772.
【0199】
本発明の好ましい実施態様のいくつかを上に記載し、具体的に例示したが、本発明がそのような実施態様に限定されることを意図するものではない。以下の特許請求の範囲に記載のとおり、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、様々な修正がなされ得る。
【図1】
【図2】
【図3A-3B】
【図4】
【図5A-5D】
【図5E-5H】
【図6A-6D】
【図6E-6F】
【図7A-7D】
【図8A-8B】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C-11D】
【図11E-11J】
【図11K-11L】
【図12】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-01-23
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト患者におけるリンパ異常を診断することを補助するための方法であって、
ａ）患者から得た生物学的試料においてＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数における一塩基変異（ＳＮＶ）を検出することを含み、
ＥＰＨＢ４におけるＳＮＶは、ＥＰＨＢ４遺伝子内のスプライス部位変異を含み、
ＰＩＫ３Ｒ４におけるＳＮＶは、ｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇを含み、
ＰＩＫ３Ｒ６におけるＳＮＶは、ＰＩＫ３Ｒ６遺伝子内のスプライス部位変異を含み、
ｍＴＯＲにおけるＳＮＶは、ｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌを含み、
ＡＲＡＦにおけるＳＮＶは、ＡＲＡＦにおける保存されたリン酸化部位の変異を含み、
前記ＳＮＶの存在は、リンパ異常を示す、方法。
ａ）患者から得た生物学的試料においてＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数における一塩基変異（ＳＮＶ）を検出することを含み、
ＥＰＨＢ４におけるＳＮＶは、ＥＰＨＢ４遺伝子内のスプライス部位変異を含み、
ＰＩＫ３Ｒ４におけるＳＮＶは、ｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇを含み、
ＰＩＫ３Ｒ６におけるＳＮＶは、ＰＩＫ３Ｒ６遺伝子内のスプライス部位変異を含み、
ｍＴＯＲにおけるＳＮＶは、ｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌを含み、
ＡＲＡＦにおけるＳＮＶは、ＡＲＡＦにおける保存されたリン酸化部位の変異を含み、
前記ＳＮＶの存在は、リンパ異常を示す、方法。
【請求項2】
ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩＫ３Ｋ阻害剤、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、及び前記いずれの阻害剤の１つ又は複数の組み合わせからなる群より選択される剤を含む、ヒト患者におけるリンパ異常の治療における使用のための組成物であって、
前記患者は、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異（ＳＮＶ）を有し、
ＥＰＨＢ４におけるＳＮＶは、ＥＰＨＢ４遺伝子内のスプライス部位変異を含み、
ＰＩＫ３Ｒ４におけるＳＮＶは、ｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇを含み、
ＰＩＫ３Ｒ６におけるＳＮＶは、ＰＩＫ３Ｒ６遺伝子内のスプライス部位変異を含み、
ｍＴＯＲにおけるＳＮＶは、ｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌを含み、
ＡＲＡＦにおけるＳＮＶは、ＡＲＡＦにおける保存されたリン酸化部位の変異を含む、
組成物。
前記患者は、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数において一塩基変異（ＳＮＶ）を有し、
ＥＰＨＢ４におけるＳＮＶは、ＥＰＨＢ４遺伝子内のスプライス部位変異を含み、
ＰＩＫ３Ｒ４におけるＳＮＶは、ｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇを含み、
ＰＩＫ３Ｒ６におけるＳＮＶは、ＰＩＫ３Ｒ６遺伝子内のスプライス部位変異を含み、
ｍＴＯＲにおけるＳＮＶは、ｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌを含み、
ＡＲＡＦにおけるＳＮＶは、ＡＲＡＦにおける保存されたリン酸化部位の変異を含む、
組成物。
【請求項3】
リンパ異常が、リンパ管の異常な形成及び／又は組織の異常増殖によって特徴付けられる、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
リンパ異常がリンパ管腫症（ＬＡＭ）である、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項5】
リンパ異常がリンパ管腫症（ＧＬＡ）である、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項6】
リンパ異常が、心膜滲出液、胸膜滲出液又は腹膜滲出液を含む乳び性滲出液によって特徴付けられる、請求項２から５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
前記１つ又は複数の阻害剤が、エベロリムス、ＡＺＤ８０５５、テムシロリムス、ＫＵ－００６３７９４、ＭＨＹ１４８５、ＢＥＺ２３５、ＰＩ－１０３、トルキニブ、タクロリムス、セルメチニブ、ＰＤ０３２５９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、ピマセルチブ（ＡＳ－７０３０２６）、ＡＺＤ８３３０、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ－１６２、ＡＲＲＹ－４３８１６２）、ＳＬ－３２７、レファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９、ＢＡＹ ８６－９７６６）、コビメチニブ（ＧＤＣ－０９７３、ＲＧ７４２０）、リダフォロリムス、ＩＮＫ １２８、ボクスタリシブ、トリン１、オミパリシブ、ＯＳＩ－０２７、ＰＦ－０４６９１５０２、アピトリシブ、ＧＳＫ１０５９６１５、ゲダトリシブ、ＷＹＥ－３５４、ＡＺＤ２０１４、トリン２、ＷＹＥ－１２５１３２、ＰＰ１２１、ＷＹＥ－６８７、ＣＨ５１３２７９９、ＷＡＹ－６００、ＥＴＰ－４６４６４、ＧＤＣ－０３４９、ＸＬ３８８、ゾタロリムス、ＢＧＴ２２６、パロミド５２９、クリソファン酸、ＴＡＫ－７３３及びＰＤ１８４３５２（ＣＩ－１０４０）からなる群より選択される、請求項２から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
生物学的試料は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記いずれの阻害剤の１つ又は複数の組み合わせが、
ａ）リダフォロリムスとトラメチニブ；
ｂ）リダフォロリムスとセルメチニブ又はコビメチニブ；
ｃ）ＢＥＺ２３５とセルメチニブ；
ｄ）オミパリシブとセルメチニブ又はトラメチニブ；
ｅ）エベロリムスとトラメチニブ又はセルメチニブ；
ｆ）シロリムスとリダフォロリムスとセルメチニブ；
ｇ）シロリムスとリダフォロリムスとトラメチニブ；
ｈ）トルキニブとトラメチニブ；
ｉ）ＢＥＺ２３５とトルキニブとトラメチニブ；及び
ｊ）シロリムスとゲダトリシブとトラメチニブ
からなる群より選択される、請求項２～７のいずれか一項に記載の組成物。
ａ）リダフォロリムスとトラメチニブ；
ｂ）リダフォロリムスとセルメチニブ又はコビメチニブ；
ｃ）ＢＥＺ２３５とセルメチニブ；
ｄ）オミパリシブとセルメチニブ又はトラメチニブ；
ｅ）エベロリムスとトラメチニブ又はセルメチニブ；
ｆ）シロリムスとリダフォロリムスとセルメチニブ；
ｇ）シロリムスとリダフォロリムスとトラメチニブ；
ｈ）トルキニブとトラメチニブ；
ｉ）ＢＥＺ２３５とトルキニブとトラメチニブ；及び
ｊ）シロリムスとゲダトリシブとトラメチニブ
からなる群より選択される、請求項２～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
ヒト患者におけるリンパ異常の診断のためのキットであって、
前記患者からの生物学的試料において、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数における一塩基変異（ＳＮＶ）を検出するための核酸を含み、
ＥＰＨＢ４におけるＳＮＶは、ＥＰＨＢ４遺伝子内のスプライス部位変異を含み、
ＰＩＫ３Ｒ４におけるＳＮＶは、ｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇを含み、
ＰＩＫ３Ｒ６におけるＳＮＶは、ＰＩＫ３Ｒ６遺伝子内のスプライス部位変異を含み、
ｍＴＯＲにおけるＳＮＶは、ｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌを含み、
ＡＲＡＦにおけるＳＮＶは、ＡＲＡＦにおける保存されたリン酸化部位の変異を含み、
前記ＳＮＶの存在は、リンパ異常を示す、
キット。
前記患者からの生物学的試料において、ＥＰＨＢ４、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ６、ｍＴＯＲ、及びＡＲＡＦのうちの１つ又は複数における一塩基変異（ＳＮＶ）を検出するための核酸を含み、
ＥＰＨＢ４におけるＳＮＶは、ＥＰＨＢ４遺伝子内のスプライス部位変異を含み、
ＰＩＫ３Ｒ４におけるＳＮＶは、ｃ．３４８１Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｓ１１６１Ｇを含み、
ＰＩＫ３Ｒ６におけるＳＮＶは、ＰＩＫ３Ｒ６遺伝子内のスプライス部位変異を含み、
ｍＴＯＲにおけるＳＮＶは、ｃ．６８１８Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｐ２２７３Ｌを含み、
ＡＲＡＦにおけるＳＮＶは、ＡＲＡＦにおける保存されたリン酸化部位の変異を含み、
前記ＳＮＶの存在は、リンパ異常を示す、
キット。
【外国語明細書】