特開 2023-52399 微小液滴処理装置およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023052399

(43)【公開日】2023-04-11

(54)【発明の名称】微小液滴処理装置およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20230404BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20230404BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20230404BHJP

   G01N 21/03 20060101ALI20230404BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12M1/34 B

G01N37/00 101

G01N21/03 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023004068

(22)【出願日】2023-01-13

(62)【分割の表示】P 2021517886の分割

【原出願日】2019-05-10

(31)【優先権主張番号】201810581405.7

(32)【優先日】2018-06-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(71)【出願人】

【識別番号】520481323

【氏名又は名称】洛▲陽▼▲華▼清天木生物科技有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110000578

【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】王立言

(72)【発明者】

【氏名】段保峰

(72)【発明者】

【氏名】郭肖▲傑▼

(57)【要約】      （修正有）

【課題】微生物のマイクロボリューム、ハイスループット、長期連続培養、リアルタイムのオンライン検出を実現でき、しかも成長性能と特性に基づいて微生物の選択と育種を実現できる微小液的処理装置の提供。
【解決手段】油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩ４１と、微小液滴処理装置に水相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩＩ４２とを少なくとも含む微小液滴処理装置に、水相および油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システム；基板と、基板内に形成された管路と、第１の検出ウィンドウと、第２の検出ウィンドウとを含むマイクロ流体チップシステム４６；温度センサーと、温度制御部材とを含む温度制御システム；レーザー光源と光電センサーとを含む液滴識別システム；光ファイバーと、分光計と、ハロゲン光源とを含む液滴検出システム；および、装置における各システムを制御するための制御システム４５を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

微小液滴処理装置に油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩと、微小液滴処理装置に水相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩＩとを少なくとも含む、微小液滴処理装置に水相および油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システム；
基板と、基板内に形成された管路と、第１の検出ウィンドウと、第２の検出ウィンドウとを含む、マイクロ流体チップシステム；
温度センサーと、温度制御部材とを含む、温度制御システム；
レーザー光源と、光電センサーとを含む、液滴識別システム；
光ファイバー分光計と、ハロゲン光源とを含む、液滴検出システム；および
微小液的処理装置における各システムを制御するための制御システム
を含む、微小液滴処理装置。

【請求項2】

前記液滴識別システムは、光電センサーとレーザー光源により、マイクロ流体チップシステムの第１の検出ウィンドウを通過する水相のサンプル液滴を識別し；
前記液滴検出システムは、光ファイバー分光計とハロゲン光源により、マイクロ流体チップシステムの第２の検出ウィンドウを通過する水相のサンプル液滴のスペクトルシグナルを検出する、
請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記サンプル注入システムは、それぞれ少なくとも２つのサンプル注入システムＩと１つのサンプル注入システムＩＩとを含む、
請求項１または２に記載の装置。

【請求項4】

前記サンプル注入システムは、３つのサンプル注入システムＩと、３つのサンプル注入システムＩＩとを含む、
請求項３に記載の装置。

【請求項5】

前記サンプル注入システムＩは、液体容器と、動力源と、を含み、
前記サンプル注入システムＩＩは、液体容器と、動力源と、緩衝用ボトルとを含み、
前記動力源は、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプおよび／またはプランジャーポンプであり、好ましくはシリンジポンプであり、
前記液体容器は、注入するサンプル溶液と非相容且つ非圧縮性の液体を収容し、
前記動力源は、前記液体を駆動して輸入管路を経由して緩衝用ボトルに送り込み、
前記緩衝用ボトルは前記サンプル溶液を収容し、動力源により駆動されると、前記液体は輸入管路を経由して緩衝用ボトルに入り、これによって輸出管路を経由してサンプル溶液を前記マイクロ流体チップシステムに押し込み、前記液体容器、動力源、および緩衝用ボトルは毛管路を介して連通している、
請求項３または４に記載の装置。

【請求項6】

マイクロ流体チップシステムは、
基板；および
前記基板内に形成された第１の管路、第２の管路、および第３の管路、
前記第１の管路上に形成された透明領域である、第１の検出ウィンドウと第２の検出ウィンドウ、および
第１の管路、第２の管路、および第３の管路に密閉連通している毛管路
を含み、
前記第１の管路は、その両端にそれぞれ第１の接続ポートと第２の接続ポートを含み、
前記第２の管路は、その一端に第３の接続ポートを含み、他端が第１の管路と連通し、
前記第３の管路は、その一端に第４の接続ポートを含み、他端が第１の管路と連通し、
第１の管路と第２の管路との第１の連通部は、第３の管路と第１の管路との第２の連通部の液滴移動方向の上流に位置し、第１の連通部と第２の連通部との間の距離は、５００μｍ～２０００μｍ、好ましくは７５０μｍ～１８００μｍ、好ましくは１０００μｍ～１５００μｍである、
請求項１～５のいずれか一項に記載の装置。

【請求項7】

前記第１の管路は、第１の連通部の上流において、第１の管路ａ、第１の管路ｂ、第１の管路ｃ、および第１の管路ｄに分岐しており、
第１の検出ウィンドウと第２の検出ウィンドウは、第１の管路ａ上に形成され、
第１の管路ａ、第１の管路ｂ、第１の管路ｃ、および第１の管路ｄがその上の第１の接続ポートと第２の接続ポートを介して毛管路に密閉接続され、
第２の管路および第３の管路が第３の接続ポートと第４の接続ポートを介して毛管路に密閉接続される、
請求項６に記載の装置。

【請求項8】

前記基板と第１の管路、第２の管路、および第３の管路は、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体（ＡＢＳ）からなる群より選ばれるいずれか一種または多種で形成され、好ましくはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で形成され、
前記毛管路は硬質チューブであり、より好ましくは、前記毛管路は、ポリテトラフルオロエチレンチューブ（ＰＴＦＥチューブ）、パーフルオロプロピルパーフルオロビニルエーテルとポリテトラフルオロエチレンの共重合体チューブ（ＰＦＡチューブ）、ポリエーテルエーテルケトンチューブ（ＰＥＥＫチューブ）、ポリカーボネートチューブ（ＰＣチューブ）、ポリスチレンチューブ（ＰＳチューブ）からなる群より選ばれるいずれか１つであり、
さらに好ましくは、第１の管路、第２の管路、第３の管路、および前記毛管路の断面積は、２．５×１０^－３ｍｍ^２～４ｍｍ^２、好ましくは０．０１～３ｍｍ^２、より好ましくは０．１～２．５ｍｍ^２、さらに好ましくは０．２５～１ｍｍ^２である、
請求項６または７に記載の装置。

【請求項9】

サンプル注入システムとマイクロ流体チップシステムは、毛管路と接続ポートを介して接続され、密閉された閉ループ制御構造を形成している、請求項１～８のいずれか一項に記載の装置。

【請求項10】

サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、液滴識別システム、および液滴検出システムはすべて１つの箱内に設けられており、
前記箱内の温度は、温度制御システムによって制御され、
さらに好ましくは、前記箱内の温度は１０℃～５０℃の範囲内に制御され、温度変動範囲は±０．５℃の範囲内に制御される、
請求項１に記載の装置。

【請求項11】

前記箱はさらに滅菌装置を含み、好ましくは滅菌装置は紫外線ランプである、請求項１０に記載の装置。

【請求項12】

前記制御システムは、コントローラーと、ＰＣディスプレイ制御システムとを含み、
前記コントローラーは、サンプル注入システム、温度制御システム、液滴識別システム、および液滴検出システムにそれぞれ接続され、制御システムのデジタル回路を介して制御し、
前記ＰＣディスプレイ制御システムは、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシ
ステム、温度制御システム、液滴識別システム、液滴検出システムの情報を表示、保存、および分析する、
請求項１～１１のいずれか一項に記載の装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイクロ流体技術分野に属し、特に微小液滴処理装置およびその使用方法に関する。具体的には、当該微小液滴処理装置は、微生物液滴培養装置であることができる。

【背景技術】

【0002】

マイクロ流体チップ技術は、生物学的、化学的、医学的分析などのプロセスにおけるサンプルの調製、反応、分離、および検出等に広範に使用されており、急速に発展しているフロンティア技術と研究の最も活発な分野の一つである。サンプル溶液を処理するマイクロ流体チップは、滅菌とサンプル注入の安定性に対する要求が高い。マイクロ流体チップのサンプル注入は、例えば、ｐＬ－ｎＬ／ｓレベルなど、低速である必要があり、液滴マイクロ流体は、サンプル注入の安定性に対する要求がより高く、わずかな変動でも液滴の安定性と均一性に影響を与える。

【0003】

従来の微生物選択と育種では、通常、プレートコーティング培養を使用して単一のコロニーを取得してから、振とうフラスコスケールの発酵培養により検証する。一般的な微生物は、予備選別と再選別などのプロセスを経て生産ニーズを満たしていることを確認するまで、通常、数ヶ月から数年かかり、この選択と育種方法の場合、選別サイクルが長くなる。そして、従来の選択と育種法、振とうフラスコレベルの発酵培養および評価プロセスを採用するには、十分な人員、実験スペース、および培養スペースが必要であり、スクリーニング効率はバッチあたり１０^１～２にしか達せないため、スクリーニングスループットが低くなる。さらに、突然変異誘発スクリーニングの成功は、スクリーニングの数と密接に関係しており、標的形質変異体を取得するには、大量のスクリーニングサンプルが必要であり、研究開発人員の作業負荷が非常に大きい。最後に、従来の選択と育種方法は、固体培養または大量の液体培養に基づいたものであるため、培養と検出のための材料と資源が大量に消費され、実験コストが高くなる。

【0004】

上記の問題を解決するために、マイクロプレート培養およびスクリーニング技術、およびマイクロ流体技術が開発された。マイクロプレートスクリーニング技術は、培養システムを振とうフラスコレベルの５０～１００ミリリットルから、数ミリリットル乃至数十マイクロリットルに減らし、２４、４８、９６、３８４、１５３６などの複数のサンプルの同時培養を実現でき、対応する自動監視装置と組み合わせて、特定のプロセスパラメータのオンライン監視を実現することができる。マイクロプレートのスクリーニング効率を高めるために、マルチウェルプレートシステムを巡って、自動モノクローナル選別装置、自動滅菌培地調製装置、自動培地分配システム、および自動細菌プレート希釈器などを含む専門の支援装置が開発され、作業効率が大幅に向上した。

【0005】

マイクロ流体技術は、２０世紀９０年代に分析化学の分野で開発された。この技術は、マイクロ管路ネットワーク構造に基づき、微量サンプルの調製、サンプル注入、反応、分離、および検出を一体化したマイクロ分析実験装置である。マイクロ流体技術は非常に高い効率を持ち、構造が小さいため、一度に数百の微生物培養ユニットをチップ上に集成しやすく、大量の培地を節約できる。ソフトウェアによって操作を統合すると、チップ上で実験プロセス操作全体をシミュレーションすることができる。

【0006】

特許文献ＣＮ１０３９８３７９４Ａは、２０１４年にマイクロ流体チップを開示した。このマイクロ流体チップは、検出ウィンドウ（検出孔）、電極、分岐構造を有するチャネル、液体注入プール（または液体注入ポート）、完成品プール（または液体排出ポート）
、廃液プール（または廃液ポート）などを含む。液体注入プール（または液体注入ポート）、完成品プール（または液体排出ポート）、および廃液プール（または廃液ポート）はそれぞれチャネルに物理的に接続され、検出ウィンドウ（または検出孔）はチャネルの近くに位置し、電極は分岐部に近いチャネルの両側に固定されている。これにより、液滴の位置の識別、液滴の体積の制御、液滴の単一サンプルのセグメンテーション、液滴内の複数のサンプルの分離、および液滴パラメータの選択の、マイクロ流体における５つの重要な問題を構造上で解決し、マイクロ流体技術の材料担体を実現した。しかしながら、検出機能を実現できず、微生物液滴の培養とスクリーニングをオンラインで制御することもできなかった。

【0007】

特許文献ＣＮ１０４００７０９１Ａは、２０１４年に、液滴マイクロ流体チップに基づくハイスループット検出システムを開示した。このシステムは主に、液滴マイクロ流体チップシステム、光路システム、データ採集分析システムを含む。液滴マイクロ流体チップシステムは、検出対象の微生物を包埋して独立した単一液滴微小反応チャンバーを形成し、単一液滴微小反応チャンバー内の微生物サンプルのレーザー誘起蛍光検出シグナルの送信を光路システムを介して行い、データ採集分析システムは、採集されたシグナルをコンピュータシステムを介して検出分析し、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、サッカロマイセス・セレビシエなど、さまざまな種類の工業用微生物の生産に関連する標的酵素と代謝産物の高効率スクリーニングを実現できたが、微生物のオンライン培養を実現できなかった。

【0008】

微生物の選択と育種は特別な生物学的プロセスであるため、まず播種して培養し、そして検出と評価を行う必要があり、最後に標的微生物を選択することができる。したがって、従来の播種、振とうフラスコ培養、および従来の検出を取って代わり、微生物のマイクロボリューム、ハイスループット、長期連続培養、リアルタイムのオンライン検出を実現でき、しかも成長性能と特性に基づいて微生物の選択と育種を実現できる装置が必要とされている。

【発明の概要】

【0009】

上記の問題を解決するために、本発明は、微生物液滴の培養に使用することができる微小液滴処理装置を提供する。この装置は、マイクロ流体チップを介して、微生物を含む、０．５～１０μＬの体積を持つ数百の微小液滴を搭載し、継続的なオンライン培養、検出、および選別を通して、微生物の選択と育種を完成することを実現できる。

【0010】

本発明の目的は、次の技術構成によって実現される。
１、微小液滴処理装置に油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩと、微小液滴処理装置に水相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩＩとを少なくとも含む、微小液滴処理装置に水相および油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システム；
基板と、基板内に形成された管路と、第１の検出ウィンドウと、第２の検出ウィンドウとを含む、マイクロ流体チップシステム；
温度センサーと、温度制御部材とを含む、温度制御システム；
レーザー光源と、光電センサーとを含む、液滴識別システム；
光ファイバー分光計と、ハロゲン光源とを含む、液滴検出システム；および
微小液滴処理装置における各システムを制御するための制御システム
を含む、微小液滴処理装置。
２、前記液滴識別システムは、光電センサーとレーザー光源を使用して、マイクロ流体チップシステムの第１の検出ウィンドウを通過した水相のサンプル液滴を識別し；
前記液滴検出システムは、光ファイバー分光計とハロゲン光源を使用して、マイクロ流体チップシステムの第２の検出ウィンドウを通過した水相のサンプル液滴のスペクトルシ
グナルを検出する、
項１に記載の装置。
３、前記サンプル注入システムは、それぞれ少なくとも２つのサンプル注入システムＩと１つのサンプル注入システムＩＩとを含む、
項１または２に記載の装置。
４、前記サンプル注入システムは、３つのサンプル注入システムＩと、３つのサンプル注入システムＩＩとを含む、
項３に記載の装置。
５、前記サンプル注入システムＩは、液体容器と、動力源と、を含み、
前記サンプル注入システムＩＩは、液体容器と、動力源と、緩衝用ボトルとを含み、
前記動力源は、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプおよび／またはプランジャーポンプであり、好ましくはシリンジポンプであり、
前記液体容器は、注入するサンプル溶液と非相溶且つ非圧縮性の液体を収容し、
前記動力源は、前記液体を駆動して輸入管路を経由して緩衝用ボトルに送り込み、
前記緩衝用ボトルは前記サンプル溶液を収容し、動力源により駆動されると、前記液体は輸入管路を経由して緩衝用ボトルに入り、これによって輸出管路を経由してサンプル溶液を前記マイクロ流体チップシステムに押し込み、前記液体容器、動力源、および緩衝用ボトルは毛管路を介して連通している、
項３または４に記載の装置。
６、マイクロ流体チップシステムは、
基板；および
前記基板内に形成された第１の管路、第２の管路、および第３の管路、
前記第１の管路上に形成された透明領域である、第１の検出ウィンドウと第２の検出ウィンドウ、および
第１の管路、第２の管路、および第３の管路に密閉連通している毛管路
を含み、
前記第１の管路は、その両端にそれぞれ第１の接続ポートと第２の接続ポートを含み、
前記第２の管路は、その一端に第３の接続ポートを含み、他端が第１の管路と連通し、
前記第３の管路は、その一端に第４の接続ポートを含み、他端が第１の管路と連通し、
第１の管路と第２の管路との第１の連通部は、第３の管路と第１の管路との第２の連通部の液滴移動方向の上流に位置し、第１の連通部と第２の連通部との間の距離は、５００μｍ～２０００μｍ、好ましくは７５０μｍ～１８００μｍ、好ましくは１０００μｍ～１５００μｍである、
項１～５のいずれか一項に記載の装置。
７、前記第１の管路は、第１の連通部の上流において、第１の管路ａ、第１の管路ｂ、第１の管路ｃ、および第１の管路ｄに分岐し、
第１の検出ウィンドウと第２の検出ウィンドウは、第１の管路ａ上に形成され、
第１の管路ａ、第１の管路ｂ、第１の管路ｃ、および第１の管路ｄがその上の第１の接続ポートと第２の接続ポートを介して毛管路に密閉接続され、
第２の管路および第３の管路がそれぞれ第３の接続ポートと第４の接続ポートを介して毛管路に密閉接続される、
項６に記載の装置。
８、前記基板と第１の管路、第２の管路、および第３の管路は、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体（ＡＢＳ）からなる群より選ばれるいずれか一種または多種で形成され、好ましくはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で形成され、
前記毛管路は硬質チューブであり、より好ましくは、前記毛管路は、ポリテトラフルオロエチレンチューブ（ＰＴＦＥチューブ）、パーフルオロプロピルパーフルオロビニルエーテルとポリテトラフルオロエチレンの共重合体チューブ（ＰＦＡチューブ）、ポリエー
テルエーテルケトンチューブ（ＰＥＥＫチューブ）、ポリカーボネートチューブ（ＰＣチューブ）、ポリスチレンチューブ（ＰＳチューブ）からなる群より選ばれるいずれか１つであり、
さらに好ましくは、第１の管路、第２の管路、第３の管路、および前記毛管路の断面積は、２．５×１０^－３ｍｍ^２～４ｍｍ^２、好ましくは０．０１～３ｍｍ^２、より好ましくは０．１～２．５ｍｍ^２、さらに好ましくは０．２５～１ｍｍ^２である、
項６または７に記載の装置。
９、サンプル注入システムとマイクロ流体チップシステムは、毛管路と接続ポートを介して密閉された閉ループ制御構造を形成する、請求項１～８のいずれか一項に記載の装置。
１０、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、液滴識別システム、および液滴検出システムはすべて１つの箱内に設けられており、
前記箱内の温度は、温度制御システムによって制御され、
さらに好ましくは、前記箱内の温度は１０℃～５０℃の範囲内に制御され、温度変動範囲は±０．５℃の範囲内に制御される、
項１に記載の装置。
１１、前記箱はさらに滅菌装置を含み、好ましくは滅菌装置は紫外線ランプである、項１０に記載の装置。
１２、前記制御システムは、コントローラーと、ＰＣディスプレイ制御システムとを含み、
前記コントローラーは、サンプル注入システム、温度制御システム、液滴識別システム、および液滴検出システムにそれぞれ接続され、制御システムのデジタル回路を介して制御し、
前記ＰＣディスプレイ制御システムは、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、温度制御システム、液滴識別システム、液滴検出システムの情報を表示、保存、および分析する、
項１～１１のいずれか一項に記載の装置。

【0011】

本発明は、
油相のサンプルを注入するサンプル注入システムＩと、水相のサンプルを注入するサンプル注入システムＩＩとからなるサンプル注入システム；
基板と、基板上に形成されたマイクロチャネルと、検出ウィンドウとからなるマイクロ流体チップシステム；
マイクロ流体チップに接続された管路からなる培養システム；
温度センサーと、温度制御部材とからなる温度制御システム；
光ファイバー分光計と、光電センサーと、レーザー光源と、ハロゲン光源とを含む、液滴識別および検出システム；および
サンプル注入システム、温度制御システム、および検出システムにそれぞれ接続され、デジタル回路を制御するコントローラーと、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、温度制御システム、および検出システムの情報を表示、保存、および分析するＰＣディスプレイ制御システムとを含む、制御システム
を含む、微小液滴処理装置であって、
前記光電センサーは、レーザー光源と組み合わせて使用され、マイクロ流体チップシステムの第１の検出ウィンドウで微小液滴の状態を識別し、前記光ファイバー分光計は、ハロゲン光源と組み合わせて使用され、マイクロ流体チップシステムの第２の検出ウィンドウで収容された微小液滴のサンプルを検出する、微小液滴処理装置に係る。

【0012】

前記サンプル注入システムは、それぞれ少なくとも２つの油相サンプル注入システムと１つの水相サンプル注入システムとを含む；前記サンプル注入システムは、複数の油相サンプル注入システムと、複数の水相サンプル注入システムとを含んでもよい；前記サンプ
ル注入動力源は、圧力ポンプまたはシリンジポンプである；
マイクロ流体チップシステムは、微小液滴の生成、分割、融合、検出、および分離などの操作を実現できる；
培養システムは、軟質の中空管路で構成され、管路の一端はチップのマイクロチャネルに接続され、管路の他端は、チップのマイクロチャネルに接続されてもよいし、動力装置に直接に接続されてもよい；前記装置内の微小液滴は、チップから管路へ、または管路からチップへ流れることができる；前記培養システムの管路は、ガス透過性であってもよいし、ガス不透過性であってもよい；前記培養システムで使用される管路の内径は０．１～２ｍｍである；
微生物を含む微小液滴を培養した後、チップ上で定量的な分割を行うことができ、分割された微小液滴は新しい微小液滴と融合することができ、融合してなる新しい微小液滴を培養し続けることができる；前記分割および融合プロセス、その前または後に、微小液滴を検出することができる；
サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、培養システム、および付属の動力装置は、管路、接続ポートなどを介して接続され、密閉された無菌構造を形成する；
サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、および培養システムは、いずれも温度制御可能な箱内に配置され、箱内の温度は、温度制御システムによって制御される；前記温度制御システムは、温度センサーと温度制御部材で構成される；前記温度制御部材の温度は高くとも５０℃、低くとも１０℃に達することができ、温度変動範囲は±０．５℃の範囲内に制御される。

【0013】

前記温度制御箱は滅菌装置を含み、前記滅菌装置は紫外線ランプである。

【0014】

下記のステップを含む、微生物液滴培養装置の使用方法：
１）装置の電源をオンにし、ＰＣディスプレイ制御システムをオンにする；
２）装置の管路を排気させ、温度制御システムをオンにし、５～３０分間予熱する；
３）ＰＣディスプレイ制御システムを使用して、管路液体、光ファイバー分光計、および光電センサーを初期化する；
４）機能モードを選択し、例えば、マイクロ流体チップシステムでの液滴生成、液滴分割と融合、液滴培養、液滴選別などのプログラムを選択し、装置パラメータを設定して操作を起動する；
５）標的の液滴を取得し、データをエクスポートする。

【0015】

本発明では、微生物の培養は最大９０日間連続培養することができる。

【0016】

本発明の技術的効果は以下の通りである：
サンプル注入システムとマイクロ流体チップシステムにより、微小液滴処理装置において、１個あたりの体積が０．５～１０μＬである、１～５００個の微小液滴を生成することを制御でき、このような微小液滴処理装置を使用する場合、振とうフラスコやディープウェルプレートの場合よりもスループットがはるかに多く、培地の消費が少ない；制御システムは、新鮮な培地の定期的且つ定量的な交換、および化学的因子の追加を実現でき、種子液を採取する従来の継代培養よりもはるかに便利であり、時間と労力を節約できる。検出システムにより、各微小液滴中の微生物の成長をリアルタイムでオンラインで検出することができ、従来のサンプリング検出よりもはるかに便利であり、中断のない培養を真に実現できる；また、インテリジェントにスクリーニングし、スクリーニング特性を設定し、適切な株を自動的にスクリーニングし、効率を向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明の微小液滴処理装置の機能概略図である。

【図2】本発明の微小液滴処理装置の一実施形態の斜視図である。

【図3】本発明の微小液滴処理装置で使用されるマイクロ流体チップの機能概略図である。

【図4】本発明の微小液滴処理装置で使用されるマイクロ流体チップシステムの概略図である。

【図5】微小液滴の定量的分割および融合に使用される、本発明のマイクロ流体チップの機能の構造概略図である。

【図6】本発明のマイクロ流体チップシステムと、微小液滴処理装置に係る動力源およびバルブとの接続の構造概略図である。

【図7】本発明のサンプル注入システムＩの概略図である。

【図8】本発明の微小液滴処理装置で使用される場合のチップシステムと、動力源およびバルブとの接続を示す概略図である。

【図9】本発明の微小液滴温度制御ディスプレイの温度変化図である。

【図10】本発明の微生物液滴培養装置によって測定された大腸菌の４６時間成長曲線図である。

【0018】

符号の説明：
１（１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ） 第１の管路；２ 第２の管路；３ 第３の管路；４ 基板；５ 電極；６ 電極；７ 孔；８ 孔；１１（１１’、１１’’、１１’’’） 第１の接続ポート；１２ 第２の接続ポート；２１ 第３の接続ポート；３１ 第４の接続ポート；１３ 第１の連通部；１４ 第２の連通部；１５ 分岐部；
４１ サンプル注入システムＩ；４２ サンプル注入システムＩＩ；４３ 温度制御システム；４４ 検出システム（液滴識別システムと液滴検出システムを含む）；４５ 制御システム；４６ マイクロ流体チップシステム；４７ 容器ボトルａ；４８ サンプル注入動力源ａ；４９ 容器ボトルｂ；５０ サンプル注入動力源ｂ；５１ 容器ボトルｃ；５２ ＥＰチューブ；５３ 金属浴；５４ 温度コントローラー；５５ レーザー光源；５６ 光電センサー；５７ 光ファイバー；５８ 分光計；５９ ハロゲン光源；６０
オイルボトル；６１ サンプル注入緩衝用ボトル；６２ 廃液ボトル；６３ シリンジポンプ；６４ 冷却ファン；６５ 回転バルブ；６６ 紫外線ランプ；６７ 温度プローブ；６８ 照明ランプ。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明の具体的な実施形態を、添付の図面を参照してより詳細に説明する。本発明の具体的な実施形態が図面に示されているが、本発明は様々な形態で実施することができ、本明細書に記載の実施形態によって限定されるべきではないことを理解されたい。これらの実施形態は、本発明をよりよく理解できるように、しかも本発明の範囲を当業者に完全に伝えるために提供されるものである。

【0020】

なお、明細書および請求の範囲では、特定のコンポーネントを指すために特定の用語が使用されている。同じコンポーネントを指すために異なる用語を使用する場合があることを、当業者は理解できるのであろう。本明細書および請求の範囲は、コンポーネントを区別する方法として、用語の違いを使用せず、コンポーネントの機能の違いを区別付けの基準として使用する。明細書および請求の範囲全般で言及されている「含有する」または「含む」はオープンな用語であり、「含むがこれらに限定されない」と解釈されるべきである。本明細書の以下の説明は、本発明を実施するための好ましい実施形態であるが、その説明は、明細書の一般原則を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の保護範囲は、添付の請求の範囲によって定義されるものと見なされる。

【0021】

本発明の実施例に対する理解を容易にするために、いくつかの具体的な実施形態を例として、図面と併せてさらに説明し、それぞれの図面は、本発明の実施形態に対する限定を
構成しない。

【0022】

図１および図２に示されるように、本発明は、微小液滴処理装置に油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩと、微小液滴処理装置に水相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩＩとを少なくとも含む、微小液滴処理装置に水相および油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システム；基板と、基板内に形成された管路と、第１の検出ウィンドウと、第２の検出ウィンドウとを含む、マイクロ流体チップシステム；温度センサーと、温度制御部材とを含む、温度制御システム；レーザー光源と、光電センサーとを含む、液滴識別システム；光ファイバー分光計と、ハロゲン光源とを含む、液滴検出システム；および微小液的処理装置における各システムを制御するための制御システムを含む、微小液滴処理装置に係る。

【0023】

具体的には、図１に示すように、本発明の微生物液滴培養装置は、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、温度制御システム、検出システム（液滴識別システムと液滴検出システムであってもいい）、および制御システムを含む。

【0024】

サンプル注入システムは、サンプル注入システムＩとサンプル注入システムＩＩとからなり、前記サンプル注入システムＩは油相のサンプルを注入し、サンプル注入システムＩＩは水相のサンプルを注入する；前記サンプル注入システムＩは、容器ボトルａ、サンプル注入動力源ａ、および相互接続された導管を含む；サンプル注入システムＩＩは、容器ボトルｂ、サンプル注入動力源ｂ、容器ボトルｃ、および相互接続された導管を含む；前記サンプル注入システムＩＩの容器ボトルｂは、容器ボトルｃの中の液体と非相容および非反応性、且つ非圧縮性の液体を収容し、前記サンプル注入動力源ａは、容器ボトルａの中の液体を駆動して導管を経由して安定して制御可能にマイクロ流体チップシステムに送り込む；容器ボトルｃの底部は、注入される生体サンプルを収容し、サンプル注入動力源ｂにより駆動されると、容器ボトルｂの中の液体は導管を経由して容器ボトルｃに入って液圧が上昇し、これによって容器ボトルｃの底部の生体サンプルは安定して制御可能にマイクロ流体チップに入る；前記動力装置はサンプル注入動力源であり、圧力ポンプまたはシリンジポンプであることが好ましい。

【0025】

本発明の装置において、サンプル注入システムは、それぞれ少なくとも２つのサンプル注入システムＩ（本発明において油相サンプル注入システムと呼ばれることもある）と１つのサンプル注入システムＩＩ（本発明において水相サンプル注入システムと呼ばれることもある）とを含み、サンプル注入システムＩＩは、液体容器と、動力源と、緩衝用ボトルとを含む；前記サンプル注入システムＩは、油相容器と、動力源とを含み、動力源は、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプおよび／またはプランジャーポンプであり、好ましくはシリンジポンプであり、液体容器は、注入するサンプル溶液と非相容且つ非圧縮性の液体を収容し、動力源は、前記液体を駆動して輸入管路を経由して緩衝用ボトルに送り込み、緩衝用ボトルは前記サンプル溶液を収容し、動力源により駆動されると、前記液体は輸入管路を経由して緩衝用ボトルに入り、これによって輸出管路を経由してサンプル溶液を前記マイクロ流体チップシステムに押し込み、前記液体容器、動力源、および緩衝用ボトルは毛管路を介して連通し、前記油相容器は媒体油を収容する。

【0026】

一つの具体的な実施形態では、本発明の装置のサンプル注入システムは、３つのサンプル注入システムＩと、３つのサンプル注入システムＩＩとを含む。

【0027】

サンプル注入システムＩＩの一例は図７に示される。図７から分かるように、サンプル注入システムＩＩは、前記サンプル溶液と非相容且つ非圧縮性の液圧液体を収容する液体容器７１（例えば、上記容器ボトルｂ）を含み、液体容器７１は液圧液体輸出管路を介して動力源７２に接続され、動力源７２は前記液圧液体を駆動して、輸入管路７３を経由し
て緩衝用ボトル７４に押し込む。図７に示す具体的な実施形態では、選択された液圧液体の密度はサンプル溶液の密度より低く、緩衝用ボトル７４（例えば、容器ボトルｃ）の上部は液圧液体を収容し、底部はサンプル溶液を収容する。輸入管路７３は緩衝用ボトル７４の口に接続され、輸出管路７５は緩衝用ボトル７４の底部に接続される。動力源７２が駆動する時、前記液体は輸入管路７３を経由して緩衝用ボトル７４に入り、これによってサンプル溶液を輸出管路７５を経由してマイクロ流体チップシステム７６に押し込む。ここで、液圧液体は油相であってもよく、輸出管路や輸入管路などはいずれも、後述する本発明の毛管路を採用することができる。

【0028】

一つの具体的な実施形態では、上記の液体容器は、剛性材料からなり、サンプル注入の過程において液体容器の可撓性変化を避けることができる。前記剛性材料は、プラスチック材料または金属材料である。前記プラスチック材料は、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＡＢＳ（アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ＰＳ（ポリスチレン）からなる群より選ばれるいずれか一つまたは複数であり、前記金属材料は、金属単体、金属酸化物、または金属合金であってもよく、前記金属材料は、鉄、アルミニウム、銅、酸化鉄、酸化アルミニウム、および酸化銅からなる群より選ばれるいずれか一つまたは複数であり、また、鉄、アルミニウム、銅、酸化鉄、酸化アルミニウム、および酸化銅からなる群より選ばれるいずれか一つまたは複数で形成された合金、または他の材料と一緒に形成された合金であってもよい。

【0029】

マイクロ流体チップシステムは、基板、基板上に形成されたマイクロチャネル、第１の検出ウィンドウ、および第２の検出ウィンドウで構成され、マイクロ流体チップシステムとサンプル注入システムは、管路を介して密閉された無菌構造を形成する。

【0030】

図３と図４はそれぞれ、本発明で使用されるマイクロ流体チップシステムの機能概略図と具体的な構造図の例を示す。図３は、本発明のマイクロ流体チップの構造概略図を示し、マイクロ流体チップは、少なくとも基板４、および基板内に形成された第１の管路１、第２の管路２、および第３の管路３を含む。

【0031】

具体的には、本発明のマイクロ流体チップにおいて、前記基板内に形成された第１の管路、第２の管路、および第３の管路は、基板の内部に形成された第１の管路、第２の管路、および第３の管路を指す。

【0032】

前記基板４はマイクロ流体チップ基板であり、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体（ＡＢＳ）で形成され、第１の管路１、第２の管路２、および第３の管路３は、基板４の内部に形成され、本発明の一つの具体的な実施形態では、基板と管路は一体彫刻成形される。

【0033】

本実施形態では、前記管路の材料は、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体（ＡＢＳ）からなる群より選ばれるいずれか一つであり、好ましくは、構成材料がポリメチルメタクリレートである。前記管路の断面形状は限定されず、円形、長方形、楕円形など、成形および液滴の流れにて適合する任意の形状であってもよい。前記管路の断面積の範囲は、２．５×１０^－３ｍｍ^２～４ｍｍ^２、好ましくは０．０１～３ｍｍ^２、より好ましくは０．１～２．５ｍｍ^２、さらに好ましくは０．２５～１ｍｍ^２である。さらに好ましくは、前記第１の管路、第２の管路、および第３の管路の断面積が同じである。当業者は、チップ基板のサイズ、培養、検出および選別される液滴の要求に従って、管路の太さを合理的に設定することができる。

【0034】

一つの具体的な実施形態では、本発明の管路の断面は正方形であり、辺の長さは０．５～２ｍｍの範囲である。

【0035】

一つの具体的な実施形態では、前記第１の管路、第２の管路、および第３の管路の断面積は、互いに同じであっても異なっていてもよい。第１の管路、第２の管路、および第３の管路の直径が変化してもよく、つまり、第１の管路、第２の管路、および第３の管路の断面積は一定ではない。本発明において、第１の管路、第２の管路、および第３の管路の断面積の範囲が上記の制限を満たせばよい。

【0036】

図３に示すように、基板４内には第１の管路１、第２の管路２、および第３の管路３が形成される。前記第１の管路１は、その両端にそれぞれ第１の接続ポート１１と第２の接続ポート１２を含む。第１の管路１は、切断および融合する前に、分割される液滴ａおよび融合される液滴ｂを収容し、切断および融合する時、第１の管路１は、第２の部分の液滴ａと新しい液滴ｃを収容することができる。第２の管路２は、その一端に第３の接続ポート２１を含み、他端が第１の管路１と連通する。第２の管路２は、切断された第１の部分の液滴ａ１を収容する。第３の管路３は、その一端に第４の接続ポート３１を含み、他端が第１の管路１と連通する。第３の管路３は、切断された第２の部分の液滴ａ２を収容する。第１の管路１と第２の管路２との第１の連通部１３は、第３の管路３と第１の管路１との第２の連通部１４の液滴移動方向の上流に位置し、第１の連通部１３と第２の連通部１４との間の距離は、５００μｍ～２０００μｍ、好ましくは７５０μｍ～１８００μｍ、好ましくは１０００μｍ～１５００μｍである。

【0037】

第１の連通部１３と第２の連通部１４との間の距離は、液滴のサイズおよび管路の断面積に関係している。本発明では、前記距離は、５００μｍ～２０００μｍ、好ましくは７５０μｍ～１８００μｍ、好ましくは１０００μｍ～１５００μｍである。具体的には、前記距離は、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、１１００μｍ、１２００μｍ、１３００μｍ、１４００μｍ、１６００μｍ、１７００μｍ、１９００μｍであってもよい。

【0038】

本発明のチップは、第１の管路１上に形成された第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０とをさらに含む。第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０は、その位置でチップ管路内に移動する微小液滴を監視および検出することができる限り、検出ウィンドウの具体的な形式には制限はない。チップと管路自身が透明な材料で形成されている場合、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０は第１の管路１上の２つの検出サイトとなる。チップと管路の材料が透明ではない場合、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０として、管路自体に２つの透明な部位を形成する必要がある。

【0039】

一つの具体的な実施形態では、形成される第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０のサイズには具体的な制限はない。２つの検出ウィンドウは第１の管路上の一つの領域であるため、管路上のこの領域の長さとして、例えば、２００μｍ～１ｍｍであってもよく、好ましくは５００μｍ～１ｍｍであり、このような長さの検出ウィンドウを使用すると、管路内に移動する微小液滴をより効果的且つ正確に監視および検出することができる。

【0040】

チップ使用時、微小液滴がチップ内に輸送される場合、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０をそれぞれ液滴識別サイトと液滴検出サイトとして使用することができる。例えば、液滴識別サイトはレーザーシステムに基づいて、液滴が当該検出ウィンドウを通過するかどうかを検出することができ、液滴検出サイトは、分光システムを通じて、当該検出ウィンドウを通過する液滴のスペクトル情報を検出することができる。

【0041】

第１の管路１、第２の管路２、および第３の管路３は、チップ基板４の内部に形成され、前記第１の管路の第１の接続ポート１１と第２の接続ポート１２、第２の管路の第３の接続ポート２１、第３の管路の第４の接続ポート３１は、いずれも基板４の縁に位置する。

【0042】

勿論、当業者が完全に理解できるように、図３は本発明に係るチップの一例を例示的に示しただけであり、当業者に知られている任意の方法を使用してチップ内の各構成要素を構築することができる。

【0043】

具体的には、本発明のチップは、微小液滴の分割および融合操作を実現するために使用することができる。また、図３は、切断される液滴ａと、融合される液滴ｂが、切断および融合するために、第１の接続ポート１１から第１の管路１に入るときの接続構造を示している。

【0044】

一つの具体的な実施形態では、例えば、第１の管路１は、第１の接続ポート１１と毛管路を介してチップ外部の第１の動力源と連通し、第１の管路１は、第２の接続ポート１２と毛管路を介してチップ外部の第１のバルブと連通し、第２の管路２は、第３の接続ポート２１と毛管路を介してそれぞれチップ外部の第２の動力源およびチップ外部の第２のバルブと連通し、第３の管路３は、第４の接続ポート３１と毛管路を介してチップ外部の第３のバルブと連通する。本実施形態では、毛管路の一端は、基板の縁にある第１の管路、第２の管路、および第３の管路の接続ポートに挿入されて接続され、もう一端は動力源とバルブと連通する。具体的な連通方式を図６に示す。

【0045】

本発明では、動力源を使用することにより、高精度で安定した脈動のない液体輸送を実現することができる。本発明の具体的な実施形態では、第１の動力源と第２の動力源はそれぞれ独立して、シリンジポンプ、圧力ポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプおよび／またはプランジャーポンプから選ばれるいずれか一つであり、好ましくは、第１の動力源と第２の動力源はシリンジポンプである。本発明において、動力源の範囲の大きさに制限はなく、当業者は、注入するサンプルの数に応じて、適切な範囲を有するシリンジポンプ、圧力ポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプおよび／またはプランジャーポンプを選択することができる。

【0046】

本発明において、バルブの使用、およびバルブの開閉により各密閉された管路内の圧力を変え、圧力の変化により各管路内の液滴の流れ方向を制御する。本発明において、第１のバルブ、第２のバルブ、および第３のバルブはそれぞれ独立して、ソレノイドバルブ、ロータリーバルブ、ロッカーバルブ、およびピンチオフバルブからなる群より選ばれるいずれか一つである。好ましくは、第１のバルブ、第２のバルブ、および第３のバルブはロータリーバルブである。

【0047】

一部の具体的な実施形態では、当業者は、バルブを他の形態の機構または構成要素で置き換えることもできることを理解できる。例えば、その開閉により、密閉された管路内の圧力を変えることができる限り、動力源としてのシリンジポンプをバルブとして使用することもできる。

【0048】

本発明において、第１の管路、第２の管路、および第３の管路は、異なるタイプの管路を示すためにのみ使用され、管路の数を制限することを目的としていない。第１の管路は、複数の第１の管路であってもよく、第２の管路は、複数の第２の管路であってもよく、第３の管路は、複数の第３の管路であってもよい。

【0049】

本発明において、第１のバルブ、第２のバルブ、および第３のバルブは、異なる役割を果たすバルブを示すためにのみ使用され、バルブの数を制限することを目的としていない。第１のバルブは、複数の第１のバルブであってもよく、第２のバルブは、複数の第２のバルブであってもよく、第３のバルブは、複数の第３のバルブであってもよい。

【0050】

本発明において、第１の動力源および第２の動力源は、異なる役割を果たす動力源を示すためにのみ使用され、動力源の数を制限することを目的としていない。第１の動力源は、複数の第１の動力源であってもよく、第２の動力源は、複数の第２の動力源であってもよい。

【0051】

本発明のチップを使用する場合、チップを、下記の毛管路を介して動力源とバルブに接続することができる。本発明の具体的な実施形態では、以下に記載するように、毛管路の断面積は、２．５×１０^－３ｍｍ^２～４ｍｍ^２、好ましくは０．０１～３ｍｍ^２、より好ましくは０．１～２．５ｍｍ^２、さらに好ましくは０．２５～１ｍｍ^２である。

【0052】

前記管路の接続ポートは毛管路に接続され、接続箇所をシールしてから、毛管路を介して動力源および／またはバルブと連通する。動力源の圧力を安定して伝導させるために、前記毛管路は硬質チューブであり、管路には可撓性の変化はない。より好ましくは、前記毛管路は、ポリテトラフルオロエチレンチューブ（ＰＴＦＥチューブ）、パーフルオロプロピルパーフルオロビニルエーテルとポリテトラフルオロエチレンの共重合体チューブ（ＰＦＡチューブ）、ポリエーテルエーテルケトンチューブ（ＰＥＥＫチューブ）、ポリカーボネートチューブ（ＰＣチューブ）、ポリスチレンチューブ（ＰＳチューブ）からなる群より選ばれるいずれか１つである。

【0053】

本発明の一つの具体的な実施形態では、第１の管路は、第１の接続ポートと毛管路を介して第１の動力源と連通し、第１の動力源が駆動すると、第１の管路の第１の接続ポートを介して管路内に圧力を発生させ、これによって液滴ａまたは液滴ｂを第１の接続ポートを介して第１の管路内に押し込み、管路内の液滴の移動を制御して液滴を培養する。

【0054】

第２の管路は、第３の接続ポートと毛管路を介して第２のバルブと連通し、第１の動力源が駆動して第２のバルブのみが開かれると、第１の管路内の液滴ａが第２の管路内へ流れるように制御することができる。第３の管路は、第４の接続ポートと毛管路を介して第３のバルブと連通し、第１の動力源が駆動して第３のバルブのみが開かれると、第１の管路内の液滴ａが第３の管路へ流れるように制御することができる。第２のバルブと第３のバルブを交互に開くことにより、液滴ａの切断を完成することができる。

【0055】

第２の管路は、第３の接続ポートと毛管路を介して第２の動力源と連通し、第２の動力源が駆動すると、第２の管路の第３の接続ポートを介して管路内に圧力を発生させ、これによって、融合される液滴ａ１を、第１の管路と第２の管路との第１の連通部に留まっている液滴ｂへ押し込み、液滴の融合を完成する。

【0056】

第１の管路は、第２の接続ポートと毛管路を介して第１のバルブと連通し、第１の動力源が駆動して第１のバルブのみが開かれると、融合された液体ｃを第２の接続ポートから押し出すことができる。

【0057】

チップ基板内の第１の管路は、例えば、分割される液滴ａと融合される液滴ｂを収容するために使用される。前記分割される液滴ａと融合される液滴ｂの液滴体積は、０．５～１０μｌ、好ましくは０．６～８μｌ、より好ましくは０．７～７μｌ、さらに好ましくは０．８～６μｌ、さらに好ましくは０．９～５μｌ、さらに好ましくは１～３μｌである。

【0058】

本発明の一つの実施形態では、図４に示すように、前記チップ基板上に２つの孔（７と８）があり、前記孔（７と８）は、第１の管路１と第２の管路２との第１の連通部１３の近くにあり、その位置は固定されていなく、第２の管路２の両側、または第１の管路１の両側にそれぞれ配置されることができる。前記孔（７と８）は、前記第１の管路１と第２の管路２との第１の連通部１３との間の距離は、０．１ｍｍ～１ｃｍ、好ましくは０．３ｍｍ～５ｍｍであり、より好ましくは０．５ｍｍ～２ｍｍである。前記孔（７と８）は、別途に設置された融合電極の正極と負極を収容するために使用され、当業者は、チップのデザインの要求に従って上記範囲内で孔（７と８）の位置を決めることができる。前記融合電極に印加される電圧の周波数は０～２００００Ｈｚ、好ましくは１０００～１００００Ｈｚであり、前記電極電圧は１～５０００Ｖ、好ましくは５００～１０００Ｖである。前記融合電極を電源に接続すると、第１の連通部にある液滴に作用する電界が発生し、この電界は、交流電界または恒常電界のいずれかである。電極に印加される電圧は１～５０００Ｖ、好ましくは５００～１０００Ｖである。このような電界を印加することにより、融合される液滴ａ１と、第１の管路１と第２の管路２との第１の連通部１３に留まっている液滴ｂとの融合をさらに促進することができる。

【0059】

また、本発明では、孔（７と８）の具体的な形状及び孔のサイズに対して、別途設置された融合電極を収容するために使用できる限り、特に制限はない。融合電極は通常、正極と負極を含む。

【0060】

当業者による実施の過程において、本発明の原理によって、異なる液体の切断融合のためにチップ上に複数の第１の管路、第２の管路、および第３の管路を設けることもできるし、第１の管路の第１の接続ポート、第２の管路の第３の接続ポートを複数に増やしてそれぞれ異なる動力源に接続し、分割される異なるタイプの液滴ａと融合される異なるタイプの液滴ｂを第１の管路内に押し込むこともできる。

【0061】

複数の第１の管路１と複数の第２の管路２を使用することにより、異なるタイプの分割される液滴ａと融合される液滴ｂを第１の管路１または第２の管路２内に押し込むことができる。当業者は、液滴の切断および融合の要求に従って、本発明に記載の切断融合装置の接続原理を使用して、対応する液滴切断と融合装置を設計することができる。同様に、上記の第１の管路１ａ、第１の管路１ｂ、および第１の管路１ｃ、第２の管路２ａ、第２の管路２ｂ、および第２の管路ａｃは、例示的なものに過ぎず、第１の管路１はｎ個の異なる分岐管路で構成でき、第２の管路はｍ個の異なる分岐管路で構成できる。ここで、ｎとｍは同じでも異なっていてもよく、ｎとｍはそれぞれ、１～２０から選ばれる整数であってもよい。

【0062】

同様に、分割される液滴ａａ、分割される液滴ａｂ、分割される液滴ａｃ、融合される液滴ｂａ、融合される液滴ｂｂ、および融合される液滴ｂｃも例示的なものである。ｎ個の第１の管路とｍ個の第２の管路に基づいて、分割されるｎ個の異なる液滴ａ、および融合されるｍ個の異なる液滴ｂのサンプル注入に使用できる。

【0063】

さらに、ｍ個の第１の管路１とｎ個の第２の管路２に対しても、ｍ個の第１の動力源とｎ個の第２の動力源を使用してそれぞれ異なる液滴を制御して押すことができる。勿論、設計が合理的であれば、その中の一部の動力源を合併して、それぞれ分割されるｎ個の異なる液滴ａ、および融合されるｍ個の異なる液滴ｂを押すことも考えられる。

【0064】

本発明の一つの具体的な実施形態では、本発明は、マイクロ流体チップに係り、図４に示すように、基板４内には、第１の管路１ａ、第１の管路１ｂ、第１の管路１ｃ、第１の管路１ｄ、第２の管路２、および第３の管路３が形成されている。前記第１の管路１ａは
、その両端にそれぞれ第１の接続ポート１１と第２の接続ポート１２を含む。第１の管路１ｂは、その一端に第１の接続ポート１１’を含み、他端が、分岐部１５で第１の管路１ａと合流する。第１の管路１ｃは、その一端に第１の接続ポート１１’’を含み、他端が、分岐部１５で第１の管路１ａと合流する。第１の管路１ｄは、その一端に第１の接続ポート１１’’’を含み、他端が、分岐部１５で第１の管路１ａと合流する。第２の管路２は、その一端に第３の接続ポート２１を含み、他端が第１の管路１と連通し、第２の管路２は、切断された第１の部分の液滴ａ１を収容するために使用される。第３の管路３は、その一端に第４の接続ポート３１を含み、他端が第１の管路１と連通し、第３の管路３は、切断された第２の部分の液滴ａ２を収容するために使用される。第１の管路１と第２の管路２との第１の連通部１３は、第３の管路３と第１の管路１との第２の連通部１４の液滴移動方向の上流に位置し、第１の連通部１３と第２の連通部１４との間の距離は、５００μｍ～２０００μｍ、好ましくは７５０μｍ～１８００μｍ、好ましくは１０００μｍ～１５００μｍである。

【0065】

さらに、分岐部１５は、第１の連通部１３の上流に位置し、分岐部１５と第１の連通部１３との間の距離は、５００μｍ～５０００μｍ、好ましくは１０００μｍ～３０００μｍ、好ましくは２０００μｍ～３０００μｍである。

【0066】

上記の具体的な実施形態では、図４に示すように、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０は第１の管路１ａ上に形成される。

【0067】

図４に示すように、第１の接続ポート１１’、１１’’、１１’’’、第３の接続ポート２１、および第４の接続ポート３１は、油相と水相のサンプル注入を実現するために、それぞれ異なる動力源とバルブに接続することができる。ここで、水相と油相のサンプル注入システムを切り替えることができる。例えば、チップを起動したばかりの場合、油相サンプル注入システムが上記接続ポートに接続され、チップ内部に媒体油を充填する。微生物液滴の注入を開始する時、一部のサンプル注入システムは、例えば、培養のための微生物液滴、反応のための酵素反応システム、および培養のための新鮮な培地、化学的因子、基質反応液など、水相サンプルを注入することができる。

【0068】

本発明の一つの具体的な実施形態では、例えば、油相サンプル注入システムが第１の接続ポート１１’に接続され、水相サンプル注入システムが第１の接続ポート１１’’に接続され、水相サンプル注入システムが第１の接続ポート１１’’’に接続され、水相サンプル注入システムが第３の接続ポート２１に接続され、バルブシステムが第４の接続ポート３１に接続される。

【0069】

本発明のチップおよび／チップシステムの使用中、例えば、第１の接続ポート１１’に接続されている油相サンプル注入システムはチップに油相サンプルを注入し、それと共に、第１の接続ポート１１’’に接続されている水相サンプル注入システムは、必要に応じて、所定のサンプル注入時間で水相サンプルをパルス注入し、それによって第１の管路１ｂと第１の管路１ｃとの連通部に油中水の微小液滴を形成し、例えば、図４と図８を参照できるように、細菌溶液の播種に使用される新鮮な培地または酵素反応のための基質溶液を形成する。

【0070】

動力源は、上記形成された微小液滴を右へ押し続けて第１の管路１ｄと第１の管路１ｂとの連通部に移動させ、そして、微小液滴を押すことを止めて、第１の接続ポート１１’’’に接続されている動力源は別の水相溶液（例えば、添加のためのある化学的因子溶液、または反応のための、別の基質を含む溶液）を、第１の管路１ｄと第１の管路１ｂに留まっている微小液滴に押し込み、上記の融合される液滴ｂを形成する。具体的には、この融合される液滴ｂは、ある化学的因子が添加された新鮮な培地、または異なる反応基質（
またはマトリックス）を組み合わせた反応物溶液であることができる。

【0071】

チップを使用し始める場合、図４に示す第１の管路１ｂ内に油相（例えば、媒体として使用される鉱物油）が収容され、第２の管路２内には、播種される細菌液または反応する酵素溶液などの水相が収容される。油中水の液滴、すなわち、分割される液滴ａ、例えば、播種される菌液、または反応物と反応する酵素溶液は、第１の管路１ａと第２の管路２との第１の連通部１３で形成される。

【0072】

チップおよび／またはチップシステムを使用し始めると、まず、分割される液滴ａが形成され、次にそれが第１の管路で培養され、次いで、切断と融合を実現できる本発明の上記構造を使用して融合される液滴ｂを形成し、そして、切断および融合により、分割される液滴ａと切断および融合して新しい液滴ｃを形成する。また、第２の管路２は水相を収容し始め、菌液がすべて油中水の液滴を形成した後、油相を補充し、第２の管路はチップの操作中において上記の第２の管路として切断と融合を行う。

【0073】

よって、上述のように、本発明の図３と図６は、切断および融合のための基本的なチップ構造を示し、図４と図８は、本発明のチップおよび／またはチップシステムの一つの具体的な実施形態を示す。当業者が理解できるように、図４に示すチップにおいて、その部分構造が図３の構造と同じであり、その動力源とバルブの構造は、図６に示す構造により実現できる場合、液滴の融合と切断を実現でき、図４に示すチップを使用して操作する場合、チップ内でまず媒体油により囲まれた、切断される液滴ａを形成するか、媒体油によりかこまれた、融合される液滴ｂを形成するか、いずれも図３と図６に示す基本的な構造により実現できる。実現された後、図４に示すチップは、図３と図６に示す基本的な構造を使用して、媒体油に囲まれる新しい液滴ｃを形成することができる。上記のプロセスを繰り返すことにより、数個から数百個の新しい液滴ｃを形成することができる。

【0074】

勿論、サンプル注入システムとバルブシステムは、上述のようなサンプル注入口と密閉的に接続された毛管路を介して接続される。上述のように、サンプル注入システムは通常、主に、注入される液体を収容するための容器、サンプル注入のための管路と動力源を含む。動力源は上述のように、シリンジポンプ、圧力ポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプおよび／またはプランジャーポンプからなる群より選ばれるいずれか一つであり、好ましくはシリンジポンプである。バルブも上述のように、ソレノイドバルブ、ロータリーバルブ、ロッカーバルブ、およびピンチオフバルブからなる群より選ばれるいずれか一つであり、好ましくはロータリーバルブである。

【0075】

当業者が理解できるように、第１の接続ポート１１’、１１’’、１１’’’、および第３の接続ポート２１、第４の接続ポート３１に接続された上記のサンプル注入システムとバルブは例に過ぎない。チップの状態に応じて、これらのサンプル注入システムとバルブの関係を置き換えることができる。

【0076】

本発明では、マイクロ流体チップに接続された毛管路から構成される培養システムが装置内にあると考えることもできる。例えば、図４に示す本発明のチップでは、第１の接続ポート１１は毛管路を介して第１の培養管路に接続され、第２の接続ポート１２は毛管路を介して第２の培養管路に接続される。第１の培養管路と第２の培養管路は、毛管路で構成されてもよく、培養や反応システムが培養時間および反応時間に対する要求に従って第１の培養管路と第２の培養管路の長さを設計することができる。

【0077】

それと共に、本発明のチップに接続された動力源などを制御することにより、チップ内を流れる微小液滴の方向を逆転することができる。上述のように、形成された数個から数百個の新しい液滴ｃを第１の培養管路内で培養することができ、必要に応じて、動力源の
制御により微小液滴の移動方向を逆にすることができ、これによって、管路内の微小液滴の往復運動を実現することができる。

【0078】

図４に示すように、一つの具体的な実施形態では、本発明のチップ上の第１の管路１ａの上に、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０が設けられており、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０についての説明は、上記の通りである。

【0079】

また、第１の管路１ａ上の、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０との間の距離は、管路内を流れる微小液滴の識別および検出がそれぞれ実現できる限り、特に限定はない。例えば、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０との間の距離（管路に沿った距離を例として）は、１ｃｍ～１０ｃｍであってもよく、好ましくは３ｃｍ～５ｃｍである。第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０は、それぞれ微小液滴の識別ウィンドウと微小液滴の検出ウィンドウとして使用することができる。

【0080】

一つの具体的な実施形態では、第１の検出ウィンドウ９は、微小液滴の識別ウィンドウとして使用され、第２の検出ウィンドウ１０は、微小液滴の光学検出ウィンドウとして使用される。

【0081】

上述のように、微小液滴の識別は、チップの外部に設置されるレーザーシステム（例えば、本発明の微小液滴処理装置上に設置される）と協力して実現できる。レーザーシステムが持続的にレーザーを発射して第１の検出ウィンドウ９に照射する時、微小液滴が第１の検出ウィンドウ９を通過すると、レーザービームは一時的にブロックされ、外部の記録システムはレーザービームの変化を記録することができる。

【0082】

微小液滴の検出は、チップの外部に設置される分光システム（例えば、本発明の微小液滴処理装置上に設置される）と協力して実現できる。例えば、分光検出器を設けて、第２の検出ウィンドウ１０を通過する微小液滴の吸光度を検出することができる。この吸光度は、例えば、微生物培養システムの微生物の成長の程度を反映でき、または、色の変化を伴う反応系の色変化を反映することができる。

【0083】

図５は、本発明のマイクロ流体チップシステムの概略図であり、図５には、チップの基板外部の管路は毛管路を示す。図４に示す構造と同様に、前記第１の管路は、第１の連通部の上流において、第１の管路ａ、第１の管路ｂ、第１の管路ｃ、および第１の管路ｄに分岐し、第１の検出ウィンドウと第２の検出ウィンドウが、第１の管路ａ上に形成され、第１の管路ａ、第１の管路ｂ、第１の管路ｃ、および第１の管路ｄがその上の第１の接続ポートと第２の接続ポートを介して毛管路に密閉接続され、第２の管路および第３の管路は第３の接続ポートと第４の接続ポートを介して毛管路に密閉接続される。

【0084】

第１の管路、第２の管路、第３の管路、および前記毛管路の断面積は、２．５×１０^－３ｍｍ^２～４ｍｍ^２、好ましくは０．０１～３ｍｍ^２、より好ましくは０．１～２．５ｍｍ^２、さらに好ましくは０．２５～１ｍｍ^２であり、さらに好ましくは、前記第１の管路、第２の管路、および第３の管路の断面積が同じである。第１の管路、第２の管路、および第３の管路に密閉接続された毛管路の密閉接続部は、前記基板内部に位置する。

【0085】

本発明では、上記密閉接続には特に限定はなく、例えば、チップ構造の設計後、彫刻機で加工し、次にチップ基板をホットプレスによってプレスし、毛管路をチップの側面の深い孔内に形成させ、接着剤を注入して密閉接合する。

【0086】

本発明のチップシステムにおける毛管路は硬質チューブであり、より好ましくは、前記毛管路は、ポリテトラフルオロエチレンチューブ（ＰＴＦＥチューブ）、パーフルオロプ
ロピルパーフルオロビニルエーテルとポリテトラフルオロエチレンの共重合体チューブ（ＰＦＡチューブ）、ポリエーテルエーテルケトンチューブ（ＰＥＥＫチューブ）、ポリカーボネートチューブ（ＰＣチューブ）、ポリスチレンチューブ（ＰＳチューブ）からなる群より選ばれるいずれか１つである。

【0087】

さらに、温度制御システムは、温度センサーと温度制御部材を含む。前記温度制御部材は、昇温部材と降温部材とをさらに含み、前記昇温部材は温度コントローラーと金属浴を含み、容器ボトルおよび／または液圧緩衝用ボトルは金属浴に入れられ、温度コントローラーにはファンが付けられている。

【0088】

本発明の一つの具体的な実施形態では、前記昇温部材は、温度コントローラーと金属浴を含み、容器ボトルおよび／または液圧緩衝用ボトルは金属浴に入れられ、温度コントローラーにはファンが付けられている。前記温度制御システムには、設備の動作環境の温度を低め、さらに微生物培養の温度を低めるための降温装置であるファンが配置されている。

【0089】

本発明の一つの具体的な実施形態では、前記昇温および降温部材はさらに、排水温度制御システムを含むことができる。排水温度制御システムとしての排水温度制御板は、微小液滴処理装置に設けられ、排水温度制御板の給水口と排水口は、外部の恒温水浴装置に連通し、恒温水浴装置の恒温原理により排水温度制御板の温度を制御し、システムの昇温恒温制御を行い、これによって装置内の温度を調節する効果を収める。

【0090】

温度センサーは、本発明の培養システムの温度をオンラインで測定することができる。制御システムのホストコンピュータソフトウェアを介して温度制御スイッチをオンにすると、回路基板プログラムは温度制御機能をオンにしてファンをオンにし、温度が検出された後、段階的に加熱し始める。温度が目標値に達したことが検出されると、一部のパラメータを自動的に調整し、ファンの自動制御機能をオンにし、温度センサーと組み合わせて機能し、温度を目標値である（１０～５０）℃±０．２℃の範囲内に保つ。４０℃で測定した温度を図９に示す。

【0091】

本発明は、１～５００の微小液滴、好ましくは５～４００の微小液滴、好ましくは１０～３００の微小液滴、好ましくは２０～２００の微小液滴の生成を制御でき、各微小液滴の体積は０．５～１０μＬであり、振とうフラスコやディープウェルプレートの場合よりもスループットがはるかに多く、培地の消費が少ない；新鮮な培地の定期的且つ定量的な交換、および化学的因子の追加を実現でき、種子液を抽出する従来の継代培養よりもはるかに便利であり、時間と労力を節約できる；各微小液滴中の微生物の成長をリアルタイムでオンラインで検出することができ、従来のサンプリング検出よりもはるかに便利であり、中断のない培養を真に実現できる；また、インテリジェントにスクリーニングし、スクリーニング特性を設定し、適切な株を自動的にスクリーニングし、効率を向上させることができる。

【0092】

さらに、液滴識別システムは、レーザー光源と光電センサーとを含み、液滴検出システムは、光ファイバー分光計とハロゲン光源とを含む。

【0093】

なお、前記液滴識別システムは、光電センサーとレーザー光源を使用して、マイクロ流体チップシステムの第１の検出ウィンドウを通過する水相のサンプル液滴を識別し、前記液滴検出システムは、光ファイバー分光計とハロゲン光源を使用して、マイクロ流体チップシステムの第２の検出ウィンドウを通過する水相のサンプル液滴のスペクトルシグナルを検出する。

【0094】

本発明の一つの実施形態では、図２に示すように、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、温度制御システム、液滴識別システム、および液滴検出システムはすべて１つの箱内に設けられており、温度制御システム内の昇温および降温部材として、エアヒーターとファンが使用され、エアヒーターとファンはいずれも箱内に設置されている。本発明のもう一つの実施形態（図示されていない）では、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、液滴識別システム、および液滴検出システムはすべて１つの箱内に設けられており、温度制御システムにおける昇温および降温部材として、排水温度制御システムとファンが使用され、排水温度制御板は箱内に設置され、排水温度制御板の給水口と排水口はそれぞれ外部の恒温水浴装置と連通し、外部の恒温水浴装置を介して排水温度制御板の温度を制御し、これによって箱内の温度を調節する。ファンは箱内に設置され、装置の動作環境の温度を低める。

【0095】

前記箱内の温度は、温度制御システムによって制御され、さらに好ましくは、前記箱内の温度は１０℃～５０℃の範囲内に制御され、温度変動範囲は±０．５℃の範囲内に制御される。前記箱はさらに滅菌装置を含み、好ましくは滅菌装置は紫外線ランプである。

【0096】

本発明の装置において、制御システムは、微小液滴処理装置内の各システムを制御する。

【0097】

前記制御システムは、コントローラーと、ＰＣディスプレイ制御システムとを含む。前記コントローラーは、サンプル注入システム、温度制御システム、液滴識別システム、および液滴検出システムにそれぞれ接続され、制御システムのデジタル回路を介して制御する。前記ＰＣディスプレイ制御システムは、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、温度制御システム、液滴識別システム、液滴検出システムの情報を表示、保存、および分析する。
実施例

【0098】

実施例１
第１の管路、第２の管路、および第３の管路は、チップ基板内に形成された管路であり、チップ基板のサイズは３ｃｍ＊５ｃｍ＊４ｍｍ（長さ＊幅＊厚さ）であり、チップ基板の材料はＰＭＭＡであり、チップ基板内に形成された第１の管路、第２の管路、および第３の管路は、断面が正方形である管路であり、その断面積は１ｍｍ^２（一辺の長さが１ｍｍ）である。第１の管路はそれぞれ第２の管路と第３の管路に連通し、第１の管路と第２の管路との第１の連通部は、第１の管路と第３の管路との第２の連通部の上流にあり、第１の連通部と第２の連通部との間の距離は１．５ｍｍである。管路内に媒体油が充満した。

【0099】

第１の管路の第１の接続ポートには、シリンジポンプＡが接続され、第２の接続ポートには第１のロータリーバルブが接続され、第２の管路の第３の接続ポートには、シリンジポンプＢと第２のロータリーバルブが接続され、第３の管路の第４の接続ポートには、第３のロータリーバルブが接続され、管路とシリンジポンプおよびロータリーバルブは、毛管路を介して接続され、毛管路の内径は１．０ｍｍであり、材料はポリテトラフルオロエチレンである。

【0100】

本実施例では、使用されたシリンジポンプＡとシリンジポンプＢはいずれも工業用シリンジポンプであり、シリンジポンプに付いたバルブは３ポートバルブである。第１のバルブ、第２のバルブ、および第３のバルブはいずれも高圧２ポートバルブである。

【0101】

シリンジポンプＡをオンにし、第１のロータリーバルブを開き、２μｌ体積の分割される液滴ａと２μｌ体積の融合される液滴ｂを第１の管路内に押し込んだ。液滴ａと液滴ｂ
は管路内の油性媒体油相により中断された。本実施例では、分割される液滴は、大腸菌ＢＬ２１を含有する微生物培養液であり、液滴ｂは新鮮なＬＢ培地である。媒体油相は鉱物油である。

【0102】

第１のロータリーバルブを閉じて、第２のロータリーバルブを開き、シリンジポンプＡを駆動し続けて、液滴ａを押して第１の管路と第２の管路との第１の連通部に移動させた。ａの７０％は液滴ａ１であり、つまり、約１．４ミリリットルが第２の管路に入った。この時、第２のロータリーバルブを閉じて、第３のロータリーバルブを開き、シリンジポンプＡを駆動し続けて、液滴ａの残りの３０％、すなわち、約０．６ミリリットルの液滴ａ２がすべて第３の管路に入り、最終的に液滴ａは、液滴ａ１と液滴ａ２との２つの部分に切断された。液滴ａ１は第２の管路内に保持され、液滴ａ２は第３の管路に入り、第３のロータリーバルブを閉じて、液滴の分割を完成した。液滴ａの分割は主に、液滴ａの底面が管路Ａと平行になるように液滴ａを切断し、中間間隔の油相の量を減らしてから、切断された液滴ａの一部の溶液を、融合される液滴ｂに定量的に注入し、これによって注入量の高精度を実現する。液滴ａは管路内の油相によって切断されたため、液滴ｂの一端と第１の管路のチャネルが揃っているようになり、その後の正確な定量サンプル注入の基礎を築く。

【0103】

第１のロータリーバルブを開き、シリンジポンプＡを駆動し続けて、液滴ｂを押して第２の管路と第１の管路との接合部に移動させた後、押すことを止めて、シリンジポンプＢを駆動して液滴ａの部分（ａ１）を液滴ｂに定量的に押し込んで新しい液滴ｃを形成した。

【0104】

シリンジポンプＡをオンにし、新しい液滴ｃを押して前方に移動させ、残りの液滴ａ１部分はＢチャネルに留まり、液滴ａと液滴ｂとの定量的物質交換が完了した。

【0105】

大腸菌ＢＬ２１を含有する複数の培養液を新鮮なＬＢ培地に播種するように、上記のステップを繰り返した。

【0106】

実施例２
図４に示すように、実施例１と同じ材料を使用してマイクロ流体チップを形成した。実施例２では、基板の長さは７．５ｃｍであり、幅は５ｃｍである。

【0107】

また、実施例２において、サンプル注入システムの構成は、図８に示すように、マイクロ流体チップには、３つのサンプル注入システムＩおよび３つのサンプル注入システムＩＩが接続されており、動力源およびバルブは、実施例１と同じ方法が採用された。

【0108】

実施例２では、チップを使用する前に、サンプル注入システムＩはチップを油相で満たし、そして、第２の管路２に接続されたサンプル注入システムＩＩが滅菌の状態下で第２の管路２に播種用の細菌液を注入することにより、第１の連通部１３に油中水の微小液滴を形成した。サンプル注入が完了した後、第２の管路は再び油相で満たされた。次に、サンプル注入システムＩの動力源の作用により、第１の連通部１３で形成された油中水の微小液滴は、第１の管路１ａ内を往復し、液滴中の細菌培養が行われ、培養後に、分割される液滴ａとなった。第１の検出ウィンドウ９は、液滴識別サイトとして、液滴を識別するサイトとなり、第２の検出ウィンドウ１０は、細菌濃度のＯＤ検出のための液滴検出サイトとなった。

【0109】

そして、サンプル注入システムＩを介して第１の接続ポート１１’から油相をチップに導入し、サンプル注入システムＩＩによって、必要に応じて第１の接続ポート１１’’を介してサンプル注入時間帯を制御し、これによって、水相の培地を断続的にチップに注入
して、第１の管路１ｂと第１の管路１ｃとの連通部で油中水の培地液滴を形成した。次のステップを選択できる。すなわち、微小液滴が右へ移動して第１の管路１ｄと第１の管路１ｂとの連通部までに移動した後、微小液滴を押すのを止めて、第１の接続ポート１１’’’に接続されたサンプル注入システムＩＩは、塩化ナトリウム溶液を、第１の管路１ｂと第１の管路１ｄに留まっている培地液滴（培地中の培地因子の濃度を変える）に押し込み、融合される液滴ｂを形成し、第１の管路に入らせ、分割される液滴ａの左側に位置させ、第１の管路１ａにおいて、液体を押して第１の接続ポート１１から第２の接続ポート１２へと移動させた。

【0110】

分割される液滴ａおよび融合される液滴ｂに対して、上記実施例１における分割および融合のプロセスを繰り返した。すべての液滴の分割および融合を完成した後、微生物の新しい液滴培養を再び行い、第２の検出ウィンドウ１０を介して液滴のＯＤ値を再び検出することができる。

【0111】

実施例３
実施例３では、図２に示すように、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、培養システム、温度制御システム、液滴識別システム、および液滴検出システムは、いずれも一つの箱内に配置されている。図２に示す設置方法により、実施例２のマイクロ流体チップシステムを使用して、液滴分割、融合、および微生物の新しい液滴培養を実現した。

【0112】

その中で、サンプル注入システムは、図８に示すように、３つのサンプル注入システムＩ、３つのサンプル注入システムＩＩ、バルブ、および廃液ボトルを含み、サンプル注入システムＩは、動力ポンプと油相ボトルとからなり、サンプル注入システムＩＩは、動力ポンプ、油相ボトル、およびサンプル注入緩衝用ボトルからなり、サンプル注入システムＩに使用された油相ボトルに収容された油相媒体は、サンプル注入システムＩＩの油相ボトルに収容された油相媒体と同じである。具体的な実施形態では、油相ボトルを共有することができる。本実施例では、図２に示すように、３つのサンプル注入システムＩと３つのサンプル注入システムＩＩは、油相媒体を収容するためのオイルボトル６０を共有し、３つのサンプル注入緩衝用ボトル６１はそれぞれ、水相の細菌液、培地、および添加のための化学的因子を収容する。６つのシリンジポンプ６３は、サンプル注入システムの動力源であり、６つのシリンジポンプ６３はいずれもオイルボトル６０に接続され、その中の３つのシリンジポンプは、オイルボトル６０の油相媒体をマイクロ流体チップシステム４６に押し込み、図８に示す３つのサンプル注入システムＩを形成した。他の３つのシリンジポンプは、オイルボトル６０の油相媒体をそれぞれ３つのサンプル注入緩衝用ボトル６１に押し込み、油相媒体の液体圧力によってサンプル注入緩衝用ボトル６１内の水相液体をマイクロ流体チップシステム４６に押し込んで、図８に示す３つのサンプル注入システムＩＩを形成した。シリンジポンプ６３、オイルボトル６０、サンプル注入緩衝用ボトル６１、ロータリーバルブ６５、廃液ボトル６２、およびマイクロ流体チップシステム４６は、実施例２の接続方式に従って、毛管路（図示されていない）を介して接続されている。上記のサンプル注入システムおよびバルブの制御の協力により、培養される細菌液はマイクロ流体チップシステム４６内で分割および融合されて複数の油中水の微生物液滴を形成し、シリンジポンプ６３の作用下でマイクロ流体チップシステム４６の管路内で往復して培養された。

【0113】

温度制御システムは、昇温部材、降温部材、および温度制御部材を含む。図２に示すように、昇温部材は、エアヒーター５４と金属浴５３を含み、サンプル注入緩衝用ボトル６１は金属浴５３内に放置され、エアヒーター５４は加熱ファンを介して、装置の箱内の微生物の培養環境を加熱する。降温部材は、それぞれ装置の動作環境の温度降下および微生物の培養環境の温度降下のための２つのファン６４を含み、温度プローブ６７は、箱内の
微生物の培養環境の温度を測定し、装置の制御システムにフィードバックし、これによって昇温部材と降温部材の動作を制御し、マイクロ流体チップ内の液滴を昇温加熱および恒温制御する。本実施例では、温度制御曲線は図９に示される。

【0114】

液滴識別システムは、レーザー光源５５と光電センサー５６とを含む。図２に示すように、レーザー光源５５は、マイクロ流体チップシステム４６の第１の検出ウィンドウを照射し、第１の検出ウィンドウを通過する水相サンプル液滴を識別し、光電センサー５６を介して液滴の位置情報を装置の制御デバイスに送り返す。

【0115】

液滴検出システムは、光ファイバー５７、分光計５８、およびハロゲン光源５９を含む。図２に示すように、光ファイバー５７は、マイクロ流体チップシステム４６の第２の検出ウィンドウに合わせ、分光計５８を介して、マイクロ流体チップシステムの第２の検出ウィンドウを通過する水相サンプル液滴のスペクトルシグナルを検出する。

【0116】

検出システムでは、光電センサー５６とレーザー光源とを組み合わせて使用して、マイクロ流体チップシステム４６の第１の検出ウィンドウで微小液滴の状態を識別し、これによって液滴の往復と培養を制御することができる。前記光ファイバー５７、分光計５８、およびハロゲン光源５９を組み合わせて使用して、マイクロ流体チップシステム４６の第２の検出ウィンドウで、収容された微小液滴中のサンプルを検出する。ＥＰチューブ５２は、培養された微生物の液滴を収容し、紫外線ランプ６６は、装置内の微生物の培養環境を滅菌することができる。

【0117】

微生物培養のステップは次の通りである：
１）機器は紫外線ランプをオンにして３０分間滅菌した；
２）装置管路を排気させ、温度制御システムをオンにして、３０分間予熱した；
３）播種した細菌液（上述のように、大腸菌ＢＬ２１）１ｍＬを１つのサンプル注入緩衝用ボトルに加え、真空脱気箱に入れて３０分間脱気処理をし、培養用の新鮮な培地（ＬＢ培地）を１つのサンプル注入緩衝用ボトルに入れて、添加用の化学的因子、すなわちアスコルビン酸溶液をもう１つのサンプル注入緩衝用ボトルに入れた；
４）チップをブラケットに取り付け、サンプル注入緩衝用ボトルおよびオイルボトルの入口に接続した；
５）機器ソフトウェアを開き、「成長曲線」測定モードを選択し、基本パラメータを、検出サイクル０．５時間、液滴数１００、検出波長６２０ｎｍのように設定した；
６）実行ボタンをクリックした；
７）４６時間実行した後、データを取得し、結果を図１０に示す。

【0118】

本発明は、正確な温度制御を実現し、結果の信頼性を高くし、微生物を円滑に成長させることができ、最大９０日間の連続培養を実現することができる。
産業上の利用可能性

【0119】

本発明の全自動ハイスループット微生物液滴培養装置および使用方法は、ハイスループット微生物培養の分野で製造および使用することができる。

【0120】

本発明の実施形態について、添付の図面を組み合わせて説明したが、本発明は、上記の具体的な実施形態および応用分野に限定されない。上記の具体的な実施形態は単に例示的、指導的であり、限定的ではない。本明細書の教示の下で、当業者は本発明の特許請求の範囲の保護範囲から逸脱することなく、多くの形態をすることができ、それらはすべて本発明の保護範囲内である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【手続補正書】

【提出日】2023-02-10

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

微小液滴処理装置に油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩと、微小液滴処理装置に水相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩＩとを少なくとも含む、微小液滴処理装置に水相および油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システム；
基板と、基板内に形成された管路と、第１の検出ウィンドウと、第２の検出ウィンドウとを含む、マイクロ流体チップシステム；
温度センサーと、温度制御部材とを含む、温度制御システム；
レーザー光源と、光電センサーとを含む、液滴識別システム；
光ファイバー分光計と、ハロゲン光源とを含む、液滴検出システム；および
微小液的処理装置における各システムを制御するための制御システム
を含む、微小液滴処理装置。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイクロ流体技術分野に属し、特に微小液滴処理装置およびその使用方法に関する。具体的には、当該微小液滴処理装置は、微生物液滴培養装置であることができる。

【背景技術】

【0002】

マイクロ流体チップ技術は、生物学的、化学的、医学的分析などのプロセスにおけるサンプルの調製、反応、分離、および検出等に広範に使用されており、急速に発展しているフロンティア技術と研究の最も活発な分野の一つである。サンプル溶液を処理するマイクロ流体チップは、滅菌とサンプル注入の安定性に対する要求が高い。マイクロ流体チップのサンプル注入は、例えば、ｐＬ－ｎＬ／ｓレベルなど、低速である必要があり、液滴マイクロ流体は、サンプル注入の安定性に対する要求がより高く、わずかな変動でも液滴の安定性と均一性に影響を与える。

【0003】

従来の微生物選択と育種では、通常、プレートコーティング培養を使用して単一のコロニーを取得してから、振とうフラスコスケールの発酵培養により検証する。一般的な微生物は、予備選別と再選別などのプロセスを経て生産ニーズを満たしていることを確認するまで、通常、数ヶ月から数年かかり、この選択と育種方法の場合、選別サイクルが長くなる。そして、従来の選択と育種法、振とうフラスコレベルの発酵培養および評価プロセスを採用するには、十分な人員、実験スペース、および培養スペースが必要であり、スクリーニング効率はバッチあたり１０^１～２にしか達せないため、スクリーニングスループットが低くなる。さらに、突然変異誘発スクリーニングの成功は、スクリーニングの数と密接に関係しており、標的形質変異体を取得するには、大量のスクリーニングサンプルが必要であり、研究開発人員の作業負荷が非常に大きい。最後に、従来の選択と育種方法は、固体培養または大量の液体培養に基づいたものであるため、培養と検出のための材料と資源が大量に消費され、実験コストが高くなる。

【0004】

上記の問題を解決するために、マイクロプレート培養およびスクリーニング技術、およびマイクロ流体技術が開発された。マイクロプレートスクリーニング技術は、培養システムを振とうフラスコレベルの５０～１００ミリリットルから、数ミリリットル乃至数十マイクロリットルに減らし、２４、４８、９６、３８４、１５３６などの複数のサンプルの同時培養を実現でき、対応する自動監視装置と組み合わせて、特定のプロセスパラメータのオンライン監視を実現することができる。マイクロプレートのスクリーニング効率を高めるために、マルチウェルプレートシステムを巡って、自動モノクローナル選別装置、自動滅菌培地調製装置、自動培地分配システム、および自動細菌プレート希釈器などを含む専門の支援装置が開発され、作業効率が大幅に向上した。

【0005】

マイクロ流体技術は、２０世紀９０年代に分析化学の分野で開発された。この技術は、マイクロ管路ネットワーク構造に基づき、微量サンプルの調製、サンプル注入、反応、分離、および検出を一体化したマイクロ分析実験装置である。マイクロ流体技術は非常に高い効率を持ち、構造が小さいため、一度に数百の微生物培養ユニットをチップ上に集成しやすく、大量の培地を節約できる。ソフトウェアによって操作を統合すると、チップ上で実験プロセス操作全体をシミュレーションすることができる。

【0006】

特許文献ＣＮ１０３９８３７９４Ａは、２０１４年にマイクロ流体チップを開示した。このマイクロ流体チップは、検出ウィンドウ（検出孔）、電極、分岐構造を有するチャネル、液体注入プール（または液体注入ポート）、完成品プール（または液体排出ポート）、廃液プール（または廃液ポート）などを含む。液体注入プール（または液体注入ポート）、完成品プール（または液体排出ポート）、および廃液プール（または廃液ポート）はそれぞれチャネルに物理的に接続され、検出ウィンドウ（または検出孔）はチャネルの近くに位置し、電極は分岐部に近いチャネルの両側に固定されている。これにより、液滴の位置の識別、液滴の体積の制御、液滴の単一サンプルのセグメンテーション、液滴内の複数のサンプルの分離、および液滴パラメータの選択の、マイクロ流体における５つの重要な問題を構造上で解決し、マイクロ流体技術の材料担体を実現した。しかしながら、検出機能を実現できず、微生物液滴の培養とスクリーニングをオンラインで制御することもできなかった。

【0007】

特許文献ＣＮ１０４００７０９１Ａは、２０１４年に、液滴マイクロ流体チップに基づくハイスループット検出システムを開示した。このシステムは主に、液滴マイクロ流体チップシステム、光路システム、データ採集分析システムを含む。液滴マイクロ流体チップシステムは、検出対象の微生物を包埋して独立した単一液滴微小反応チャンバーを形成し、単一液滴微小反応チャンバー内の微生物サンプルのレーザー誘起蛍光検出シグナルの送信を光路システムを介して行い、データ採集分析システムは、採集されたシグナルをコンピュータシステムを介して検出分析し、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、サッカロマイセス・セレビシエなど、さまざまな種類の工業用微生物の生産に関連する標的酵素と代謝産物の高効率スクリーニングを実現できたが、微生物のオンライン培養を実現できなかった。

【0008】

微生物の選択と育種は特別な生物学的プロセスであるため、まず播種して培養し、そして検出と評価を行う必要があり、最後に標的微生物を選択することができる。したがって、従来の播種、振とうフラスコ培養、および従来の検出を取って代わり、微生物のマイクロボリューム、ハイスループット、長期連続培養、リアルタイムのオンライン検出を実現でき、しかも成長性能と特性に基づいて微生物の選択と育種を実現できる装置が必要とされている。

【発明の概要】

【0009】

上記の問題を解決するために、本発明は、微生物液滴の培養に使用することができる微小液滴処理装置を提供する。この装置は、マイクロ流体チップを介して、微生物を含む、０．５～１０μＬの体積を持つ数百の微小液滴を搭載し、継続的なオンライン培養、検出、および選別を通して、微生物の選択と育種を完成することを実現できる。

【0010】

本発明の目的は、次の技術構成によって実現される。
１、微小液滴処理装置に油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩと、微小液滴処理装置に水相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩＩとを少なくとも含む、微小液滴処理装置に水相および油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システム；
基板と、基板内に形成された管路と、第１の検出ウィンドウと、第２の検出ウィンドウとを含む、マイクロ流体チップシステム；
温度センサーと、温度制御部材とを含む、温度制御システム；
レーザー光源と、光電センサーとを含む、液滴識別システム；
光ファイバー分光計と、ハロゲン光源とを含む、液滴検出システム；および
微小液滴処理装置における各システムを制御するための制御システム
を含む、微小液滴処理装置。
２、前記液滴識別システムは、光電センサーとレーザー光源を使用して、マイクロ流体チップシステムの第１の検出ウィンドウを通過した水相のサンプル液滴を識別し；
前記液滴検出システムは、光ファイバー分光計とハロゲン光源を使用して、マイクロ流体チップシステムの第２の検出ウィンドウを通過した水相のサンプル液滴のスペクトルシグナルを検出する、
項１に記載の装置。
３、前記サンプル注入システムは、それぞれ少なくとも２つのサンプル注入システムＩと１つのサンプル注入システムＩＩとを含む、
項１または２に記載の装置。
４、前記サンプル注入システムは、３つのサンプル注入システムＩと、３つのサンプル注入システムＩＩとを含む、
項３に記載の装置。
５、前記サンプル注入システムＩは、液体容器と、動力源と、を含み、
前記サンプル注入システムＩＩは、液体容器と、動力源と、緩衝用ボトルとを含み、
前記動力源は、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプおよび／またはプランジャーポンプであり、好ましくはシリンジポンプであり、
前記液体容器は、注入するサンプル溶液と非相溶且つ非圧縮性の液体を収容し、
前記動力源は、前記液体を駆動して輸入管路を経由して緩衝用ボトルに送り込み、
前記緩衝用ボトルは前記サンプル溶液を収容し、動力源により駆動されると、前記液体は輸入管路を経由して緩衝用ボトルに入り、これによって輸出管路を経由してサンプル溶液を前記マイクロ流体チップシステムに押し込み、前記液体容器、動力源、および緩衝用ボトルは毛管路を介して連通している、
項３または４に記載の装置。
６、マイクロ流体チップシステムは、
基板；および
前記基板内に形成された第１の管路、第２の管路、および第３の管路、
前記第１の管路上に形成された透明領域である、第１の検出ウィンドウと第２の検出ウィンドウ、および
第１の管路、第２の管路、および第３の管路に密閉連通している毛管路
を含み、
前記第１の管路は、その両端にそれぞれ第１の接続ポートと第２の接続ポートを含み、
前記第２の管路は、その一端に第３の接続ポートを含み、他端が第１の管路と連通し、
前記第３の管路は、その一端に第４の接続ポートを含み、他端が第１の管路と連通し、
第１の管路と第２の管路との第１の連通部は、第３の管路と第１の管路との第２の連通部の液滴移動方向の上流に位置し、第１の連通部と第２の連通部との間の距離は、５００μｍ～２０００μｍ、好ましくは７５０μｍ～１８００μｍ、好ましくは１０００μｍ～１５００μｍである、
項１～５のいずれか一項に記載の装置。
７、前記第１の管路は、第１の連通部の上流において、第１の管路ａ、第１の管路ｂ、第１の管路ｃ、および第１の管路ｄに分岐し、
第１の検出ウィンドウと第２の検出ウィンドウは、第１の管路ａ上に形成され、
第１の管路ａ、第１の管路ｂ、第１の管路ｃ、および第１の管路ｄがその上の第１の接続ポートと第２の接続ポートを介して毛管路に密閉接続され、
第２の管路および第３の管路がそれぞれ第３の接続ポートと第４の接続ポートを介して毛管路に密閉接続される、
項６に記載の装置。
８、前記基板と第１の管路、第２の管路、および第３の管路は、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体（ＡＢＳ）からなる群より選ばれるいずれか一種または多種で形成され、好ましくはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で形成され、
前記毛管路は硬質チューブであり、より好ましくは、前記毛管路は、ポリテトラフルオロエチレンチューブ（ＰＴＦＥチューブ）、パーフルオロプロピルパーフルオロビニルエーテルとポリテトラフルオロエチレンの共重合体チューブ（ＰＦＡチューブ）、ポリエーテルエーテルケトンチューブ（ＰＥＥＫチューブ）、ポリカーボネートチューブ（ＰＣチューブ）、ポリスチレンチューブ（ＰＳチューブ）からなる群より選ばれるいずれか１つであり、
さらに好ましくは、第１の管路、第２の管路、第３の管路、および前記毛管路の断面積は、２．５×１０^－３ｍｍ^２～４ｍｍ^２、好ましくは０．０１～３ｍｍ^２、より好ましくは０．１～２．５ｍｍ^２、さらに好ましくは０．２５～１ｍｍ^２である、
項６または７に記載の装置。
９、サンプル注入システムとマイクロ流体チップシステムは、毛管路と接続ポートを介して密閉された閉ループ制御構造を形成する、請求項１～８のいずれか一項に記載の装置。
１０、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、液滴識別システム、および液滴検出システムはすべて１つの箱内に設けられており、
前記箱内の温度は、温度制御システムによって制御され、
さらに好ましくは、前記箱内の温度は１０℃～５０℃の範囲内に制御され、温度変動範囲は±０．５℃の範囲内に制御される、
項１に記載の装置。
１１、前記箱はさらに滅菌装置を含み、好ましくは滅菌装置は紫外線ランプである、項１０に記載の装置。
１２、前記制御システムは、コントローラーと、ＰＣディスプレイ制御システムとを含み、
前記コントローラーは、サンプル注入システム、温度制御システム、液滴識別システム、および液滴検出システムにそれぞれ接続され、制御システムのデジタル回路を介して制御し、
前記ＰＣディスプレイ制御システムは、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、温度制御システム、液滴識別システム、液滴検出システムの情報を表示、保存、および分析する、
項１～１１のいずれか一項に記載の装置。

【0011】

本発明は、
油相のサンプルを注入するサンプル注入システムＩと、水相のサンプルを注入するサンプル注入システムＩＩとからなるサンプル注入システム；
基板と、基板上に形成されたマイクロチャネルと、検出ウィンドウとからなるマイクロ流体チップシステム；
マイクロ流体チップに接続された管路からなる培養システム；
温度センサーと、温度制御部材とからなる温度制御システム；
光ファイバー分光計と、光電センサーと、レーザー光源と、ハロゲン光源とを含む、液滴識別および検出システム；および
サンプル注入システム、温度制御システム、および検出システムにそれぞれ接続され、デジタル回路を制御するコントローラーと、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、温度制御システム、および検出システムの情報を表示、保存、および分析するＰＣディスプレイ制御システムとを含む、制御システム
を含む、微小液滴処理装置であって、
前記光電センサーは、レーザー光源と組み合わせて使用され、マイクロ流体チップシステムの第１の検出ウィンドウで微小液滴の状態を識別し、前記光ファイバー分光計は、ハロゲン光源と組み合わせて使用され、マイクロ流体チップシステムの第２の検出ウィンドウで収容された微小液滴のサンプルを検出する、微小液滴処理装置に係る。

【0012】

前記サンプル注入システムは、それぞれ少なくとも２つの油相サンプル注入システムと１つの水相サンプル注入システムとを含む；前記サンプル注入システムは、複数の油相サンプル注入システムと、複数の水相サンプル注入システムとを含んでもよい；前記サンプル注入動力源は、圧力ポンプまたはシリンジポンプである；
マイクロ流体チップシステムは、微小液滴の生成、分割、融合、検出、および分離などの操作を実現できる；
培養システムは、軟質の中空管路で構成され、管路の一端はチップのマイクロチャネルに接続され、管路の他端は、チップのマイクロチャネルに接続されてもよいし、動力装置に直接に接続されてもよい；前記装置内の微小液滴は、チップから管路へ、または管路からチップへ流れることができる；前記培養システムの管路は、ガス透過性であってもよいし、ガス不透過性であってもよい；前記培養システムで使用される管路の内径は０．１～２ｍｍである；
微生物を含む微小液滴を培養した後、チップ上で定量的な分割を行うことができ、分割された微小液滴は新しい微小液滴と融合することができ、融合してなる新しい微小液滴を培養し続けることができる；前記分割および融合プロセス、その前または後に、微小液滴を検出することができる；
サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、培養システム、および付属の動力装置は、管路、接続ポートなどを介して接続され、密閉された無菌構造を形成する；
サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、および培養システムは、いずれも温度制御可能な箱内に配置され、箱内の温度は、温度制御システムによって制御される；前記温度制御システムは、温度センサーと温度制御部材で構成される；前記温度制御部材の温度は高くとも５０℃、低くとも１０℃に達することができ、温度変動範囲は±０．５℃の範囲内に制御される。

【0013】

前記温度制御箱は滅菌装置を含み、前記滅菌装置は紫外線ランプである。

【0014】

下記のステップを含む、微生物液滴培養装置の使用方法：
１）装置の電源をオンにし、ＰＣディスプレイ制御システムをオンにする；
２）装置の管路を排気させ、温度制御システムをオンにし、５～３０分間予熱する；
３）ＰＣディスプレイ制御システムを使用して、管路液体、光ファイバー分光計、および光電センサーを初期化する；
４）機能モードを選択し、例えば、マイクロ流体チップシステムでの液滴生成、液滴分割と融合、液滴培養、液滴選別などのプログラムを選択し、装置パラメータを設定して操作を起動する；
５）標的の液滴を取得し、データをエクスポートする。

【0015】

本発明では、微生物の培養は最大９０日間連続培養することができる。

【0016】

本発明の技術的効果は以下の通りである：
サンプル注入システムとマイクロ流体チップシステムにより、微小液滴処理装置において、１個あたりの体積が０．５～１０μＬである、１～５００個の微小液滴を生成することを制御でき、このような微小液滴処理装置を使用する場合、振とうフラスコやディープウェルプレートの場合よりもスループットがはるかに多く、培地の消費が少ない；制御システムは、新鮮な培地の定期的且つ定量的な交換、および化学的因子の追加を実現でき、種子液を採取する従来の継代培養よりもはるかに便利であり、時間と労力を節約できる。検出システムにより、各微小液滴中の微生物の成長をリアルタイムでオンラインで検出することができ、従来のサンプリング検出よりもはるかに便利であり、中断のない培養を真に実現できる；また、インテリジェントにスクリーニングし、スクリーニング特性を設定し、適切な株を自動的にスクリーニングし、効率を向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明の微小液滴処理装置の機能概略図である。

【図2】本発明の微小液滴処理装置の一実施形態の斜視図である。

【図3】本発明の微小液滴処理装置で使用されるマイクロ流体チップの機能概略図である。

【図4】本発明の微小液滴処理装置で使用されるマイクロ流体チップシステムの概略図である。

【図5】微小液滴の定量的分割および融合に使用される、本発明のマイクロ流体チップの機能の構造概略図である。

【図6】本発明のマイクロ流体チップシステムと、微小液滴処理装置に係る動力源およびバルブとの接続の構造概略図である。

【図7】本発明のサンプル注入システムＩの概略図である。

【図8】本発明の微小液滴処理装置で使用される場合のチップシステムと、動力源およびバルブとの接続を示す概略図である。

【図9】本発明の微小液滴温度制御ディスプレイの温度変化図である。

【図10】本発明の微生物液滴培養装置によって測定された大腸菌の４６時間成長曲線図である。

【0018】

符号の説明：
１（１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ） 第１の管路；２ 第２の管路；３ 第３の管路；４ 基板；５ 電極；６ 電極；７ 孔；８ 孔；１１（１１’、１１’’、１１’’’） 第１の接続ポート；１２ 第２の接続ポート；２１ 第３の接続ポート；３１ 第４の接続ポート；１３ 第１の連通部；１４ 第２の連通部；１５ 分岐部；
４１ サンプル注入システムＩ；４２ サンプル注入システムＩＩ；４３ 温度制御システム；４４ 検出システム（液滴識別システムと液滴検出システムを含む）；４５ 制御システム；４６ マイクロ流体チップシステム；４７ 容器ボトルａ；４８ サンプル注入動力源ａ；４９ 容器ボトルｂ；５０ サンプル注入動力源ｂ；５１ 容器ボトルｃ；５２ ＥＰチューブ；５３ 金属浴；５４ 温度コントローラー；５５ レーザー光源；５６ 光電センサー；５７ 光ファイバー；５８ 分光計；５９ ハロゲン光源；６０
オイルボトル；６１ サンプル注入緩衝用ボトル；６２ 廃液ボトル；６３ シリンジポンプ；６４ 冷却ファン；６５ 回転バルブ；６６ 紫外線ランプ；６７ 温度プローブ；６８ 照明ランプ。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明の具体的な実施形態を、添付の図面を参照してより詳細に説明する。本発明の具体的な実施形態が図面に示されているが、本発明は様々な形態で実施することができ、本明細書に記載の実施形態によって限定されるべきではないことを理解されたい。これらの実施形態は、本発明をよりよく理解できるように、しかも本発明の範囲を当業者に完全に伝えるために提供されるものである。

【0020】

なお、明細書および請求の範囲では、特定のコンポーネントを指すために特定の用語が使用されている。同じコンポーネントを指すために異なる用語を使用する場合があることを、当業者は理解できるのであろう。本明細書および請求の範囲は、コンポーネントを区別する方法として、用語の違いを使用せず、コンポーネントの機能の違いを区別付けの基準として使用する。明細書および請求の範囲全般で言及されている「含有する」または「含む」はオープンな用語であり、「含むがこれらに限定されない」と解釈されるべきである。本明細書の以下の説明は、本発明を実施するための好ましい実施形態であるが、その説明は、明細書の一般原則を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の保護範囲は、添付の請求の範囲によって定義されるものと見なされる。

【0021】

本発明の実施例に対する理解を容易にするために、いくつかの具体的な実施形態を例として、図面と併せてさらに説明し、それぞれの図面は、本発明の実施形態に対する限定を構成しない。

【0022】

図１および図２に示されるように、本発明は、微小液滴処理装置に油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩと、微小液滴処理装置に水相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩＩとを少なくとも含む、微小液滴処理装置に水相および油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システム；基板と、基板内に形成された管路と、第１の検出ウィンドウと、第２の検出ウィンドウとを含む、マイクロ流体チップシステム；温度センサーと、温度制御部材とを含む、温度制御システム；レーザー光源と、光電センサーとを含む、液滴識別システム；光ファイバー分光計と、ハロゲン光源とを含む、液滴検出システム；および微小液的処理装置における各システムを制御するための制御システムを含む、微小液滴処理装置に係る。

【0023】

具体的には、図１に示すように、本発明の微生物液滴培養装置は、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、温度制御システム、検出システム（液滴識別システムと液滴検出システムであってもいい）、および制御システムを含む。

【0024】

サンプル注入システムは、サンプル注入システムＩとサンプル注入システムＩＩとからなり、前記サンプル注入システムＩは油相のサンプルを注入し、サンプル注入システムＩＩは水相のサンプルを注入する；前記サンプル注入システムＩは、容器ボトルａ、サンプル注入動力源ａ、および相互接続された導管を含む；サンプル注入システムＩＩは、容器ボトルｂ、サンプル注入動力源ｂ、容器ボトルｃ、および相互接続された導管を含む；前記サンプル注入システムＩＩの容器ボトルｂは、容器ボトルｃの中の液体と非相容および非反応性、且つ非圧縮性の液体を収容し、前記サンプル注入動力源ａは、容器ボトルａの中の液体を駆動して導管を経由して安定して制御可能にマイクロ流体チップシステムに送り込む；容器ボトルｃの底部は、注入される生体サンプルを収容し、サンプル注入動力源ｂにより駆動されると、容器ボトルｂの中の液体は導管を経由して容器ボトルｃに入って液圧が上昇し、これによって容器ボトルｃの底部の生体サンプルは安定して制御可能にマイクロ流体チップに入る；前記動力装置はサンプル注入動力源であり、圧力ポンプまたはシリンジポンプであることが好ましい。

【0025】

本発明の装置において、サンプル注入システムは、それぞれ少なくとも２つのサンプル注入システムＩ（本発明において油相サンプル注入システムと呼ばれることもある）と１つのサンプル注入システムＩＩ（本発明において水相サンプル注入システムと呼ばれることもある）とを含み、サンプル注入システムＩＩは、液体容器と、動力源と、緩衝用ボトルとを含む；前記サンプル注入システムＩは、油相容器と、動力源とを含み、動力源は、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプおよび／またはプランジャーポンプであり、好ましくはシリンジポンプであり、液体容器は、注入するサンプル溶液と非相容且つ非圧縮性の液体を収容し、動力源は、前記液体を駆動して輸入管路を経由して緩衝用ボトルに送り込み、緩衝用ボトルは前記サンプル溶液を収容し、動力源により駆動されると、前記液体は輸入管路を経由して緩衝用ボトルに入り、これによって輸出管路を経由してサンプル溶液を前記マイクロ流体チップシステムに押し込み、前記液体容器、動力源、および緩衝用ボトルは毛管路を介して連通し、前記油相容器は媒体油を収容する。

【0026】

一つの具体的な実施形態では、本発明の装置のサンプル注入システムは、３つのサンプル注入システムＩと、３つのサンプル注入システムＩＩとを含む。

【0027】

サンプル注入システムＩＩの一例は図７に示される。図７から分かるように、サンプル注入システムＩＩは、前記サンプル溶液と非相容且つ非圧縮性の液圧液体を収容する液体容器７１（例えば、上記容器ボトルｂ）を含み、液体容器７１は液圧液体輸出管路を介して動力源７２に接続され、動力源７２は前記液圧液体を駆動して、輸入管路７３を経由して緩衝用ボトル７４に押し込む。図７に示す具体的な実施形態では、選択された液圧液体の密度はサンプル溶液の密度より低く、緩衝用ボトル７４（例えば、容器ボトルｃ）の上部は液圧液体を収容し、底部はサンプル溶液を収容する。輸入管路７３は緩衝用ボトル７４の口に接続され、輸出管路７５は緩衝用ボトル７４の底部に接続される。動力源７２が駆動する時、前記液体は輸入管路７３を経由して緩衝用ボトル７４に入り、これによってサンプル溶液を輸出管路７５を経由してマイクロ流体チップシステム７６に押し込む。ここで、液圧液体は油相であってもよく、輸出管路や輸入管路などはいずれも、後述する本発明の毛管路を採用することができる。

【0028】

一つの具体的な実施形態では、上記の液体容器は、剛性材料からなり、サンプル注入の過程において液体容器の可撓性変化を避けることができる。前記剛性材料は、プラスチック材料または金属材料である。前記プラスチック材料は、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＡＢＳ（アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ＰＳ（ポリスチレン）からなる群より選ばれるいずれか一つまたは複数であり、前記金属材料は、金属単体、金属酸化物、または金属合金であってもよく、前記金属材料は、鉄、アルミニウム、銅、酸化鉄、酸化アルミニウム、および酸化銅からなる群より選ばれるいずれか一つまたは複数であり、また、鉄、アルミニウム、銅、酸化鉄、酸化アルミニウム、および酸化銅からなる群より選ばれるいずれか一つまたは複数で形成された合金、または他の材料と一緒に形成された合金であってもよい。

【0029】

マイクロ流体チップシステムは、基板、基板上に形成されたマイクロチャネル、第１の検出ウィンドウ、および第２の検出ウィンドウで構成され、マイクロ流体チップシステムとサンプル注入システムは、管路を介して密閉された無菌構造を形成する。

【0030】

図３と図４はそれぞれ、本発明で使用されるマイクロ流体チップシステムの機能概略図と具体的な構造図の例を示す。図３は、本発明のマイクロ流体チップの構造概略図を示し、マイクロ流体チップは、少なくとも基板４、および基板内に形成された第１の管路１、第２の管路２、および第３の管路３を含む。

【0031】

具体的には、本発明のマイクロ流体チップにおいて、前記基板内に形成された第１の管路、第２の管路、および第３の管路は、基板の内部に形成された第１の管路、第２の管路、および第３の管路を指す。

【0032】

前記基板４はマイクロ流体チップ基板であり、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体（ＡＢＳ）で形成され、第１の管路１、第２の管路２、および第３の管路３は、基板４の内部に形成され、本発明の一つの具体的な実施形態では、基板と管路は一体彫刻成形される。

【0033】

本実施形態では、前記管路の材料は、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体（ＡＢＳ）からなる群より選ばれるいずれか一つであり、好ましくは、構成材料がポリメチルメタクリレートである。前記管路の断面形状は限定されず、円形、長方形、楕円形など、成形および液滴の流れにて適合する任意の形状であってもよい。前記管路の断面積の範囲は、２．５×１０^－３ｍｍ^２～４ｍｍ^２、好ましくは０．０１～３ｍｍ^２、より好ましくは０．１～２．５ｍｍ^２、さらに好ましくは０．２５～１ｍｍ^２である。さらに好ましくは、前記第１の管路、第２の管路、および第３の管路の断面積が同じである。当業者は、チップ基板のサイズ、培養、検出および選別される液滴の要求に従って、管路の太さを合理的に設定することができる。

【0034】

一つの具体的な実施形態では、本発明の管路の断面は正方形であり、辺の長さは０．５～２ｍｍの範囲である。

【0035】

一つの具体的な実施形態では、前記第１の管路、第２の管路、および第３の管路の断面積は、互いに同じであっても異なっていてもよい。第１の管路、第２の管路、および第３の管路の直径が変化してもよく、つまり、第１の管路、第２の管路、および第３の管路の断面積は一定ではない。本発明において、第１の管路、第２の管路、および第３の管路の断面積の範囲が上記の制限を満たせばよい。

【0036】

図３に示すように、基板４内には第１の管路１、第２の管路２、および第３の管路３が形成される。前記第１の管路１は、その両端にそれぞれ第１の接続ポート１１と第２の接続ポート１２を含む。第１の管路１は、切断および融合する前に、分割される液滴ａおよび融合される液滴ｂを収容し、切断および融合する時、第１の管路１は、第２の部分の液滴ａと新しい液滴ｃを収容することができる。第２の管路２は、その一端に第３の接続ポート２１を含み、他端が第１の管路１と連通する。第２の管路２は、切断された第１の部分の液滴ａ１を収容する。第３の管路３は、その一端に第４の接続ポート３１を含み、他端が第１の管路１と連通する。第３の管路３は、切断された第２の部分の液滴ａ２を収容する。第１の管路１と第２の管路２との第１の連通部１３は、第３の管路３と第１の管路１との第２の連通部１４の液滴移動方向の上流に位置し、第１の連通部１３と第２の連通部１４との間の距離は、５００μｍ～２０００μｍ、好ましくは７５０μｍ～１８００μｍ、好ましくは１０００μｍ～１５００μｍである。

【0037】

第１の連通部１３と第２の連通部１４との間の距離は、液滴のサイズおよび管路の断面積に関係している。本発明では、前記距離は、５００μｍ～２０００μｍ、好ましくは７５０μｍ～１８００μｍ、好ましくは１０００μｍ～１５００μｍである。具体的には、前記距離は、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、１１００μｍ、１２００μｍ、１３００μｍ、１４００μｍ、１６００μｍ、１７００μｍ、１９００μｍであってもよい。

【0038】

本発明のチップは、第１の管路１上に形成された第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０とをさらに含む。第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０は、その位置でチップ管路内に移動する微小液滴を監視および検出することができる限り、検出ウィンドウの具体的な形式には制限はない。チップと管路自身が透明な材料で形成されている場合、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０は第１の管路１上の２つの検出サイトとなる。チップと管路の材料が透明ではない場合、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０として、管路自体に２つの透明な部位を形成する必要がある。

【0039】

一つの具体的な実施形態では、形成される第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０のサイズには具体的な制限はない。２つの検出ウィンドウは第１の管路上の一つの領域であるため、管路上のこの領域の長さとして、例えば、２００μｍ～１ｍｍであってもよく、好ましくは５００μｍ～１ｍｍであり、このような長さの検出ウィンドウを使用すると、管路内に移動する微小液滴をより効果的且つ正確に監視および検出することができる。

【0040】

チップ使用時、微小液滴がチップ内に輸送される場合、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０をそれぞれ液滴識別サイトと液滴検出サイトとして使用することができる。例えば、液滴識別サイトはレーザーシステムに基づいて、液滴が当該検出ウィンドウを通過するかどうかを検出することができ、液滴検出サイトは、分光システムを通じて、当該検出ウィンドウを通過する液滴のスペクトル情報を検出することができる。

【0041】

第１の管路１、第２の管路２、および第３の管路３は、チップ基板４の内部に形成され、前記第１の管路の第１の接続ポート１１と第２の接続ポート１２、第２の管路の第３の接続ポート２１、第３の管路の第４の接続ポート３１は、いずれも基板４の縁に位置する。

【0042】

勿論、当業者が完全に理解できるように、図３は本発明に係るチップの一例を例示的に示しただけであり、当業者に知られている任意の方法を使用してチップ内の各構成要素を構築することができる。

【0043】

具体的には、本発明のチップは、微小液滴の分割および融合操作を実現するために使用することができる。また、図３は、切断される液滴ａと、融合される液滴ｂが、切断および融合するために、第１の接続ポート１１から第１の管路１に入るときの接続構造を示している。

【0044】

一つの具体的な実施形態では、例えば、第１の管路１は、第１の接続ポート１１と毛管路を介してチップ外部の第１の動力源と連通し、第１の管路１は、第２の接続ポート１２と毛管路を介してチップ外部の第１のバルブと連通し、第２の管路２は、第３の接続ポート２１と毛管路を介してそれぞれチップ外部の第２の動力源およびチップ外部の第２のバルブと連通し、第３の管路３は、第４の接続ポート３１と毛管路を介してチップ外部の第３のバルブと連通する。本実施形態では、毛管路の一端は、基板の縁にある第１の管路、第２の管路、および第３の管路の接続ポートに挿入されて接続され、もう一端は動力源とバルブと連通する。具体的な連通方式を図６に示す。

【0045】

本発明では、動力源を使用することにより、高精度で安定した脈動のない液体輸送を実現することができる。本発明の具体的な実施形態では、第１の動力源と第２の動力源はそれぞれ独立して、シリンジポンプ、圧力ポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプおよび／またはプランジャーポンプから選ばれるいずれか一つであり、好ましくは、第１の動力源と第２の動力源はシリンジポンプである。本発明において、動力源の範囲の大きさに制限はなく、当業者は、注入するサンプルの数に応じて、適切な範囲を有するシリンジポンプ、圧力ポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプおよび／またはプランジャーポンプを選択することができる。

【0046】

本発明において、バルブの使用、およびバルブの開閉により各密閉された管路内の圧力を変え、圧力の変化により各管路内の液滴の流れ方向を制御する。本発明において、第１のバルブ、第２のバルブ、および第３のバルブはそれぞれ独立して、ソレノイドバルブ、ロータリーバルブ、ロッカーバルブ、およびピンチオフバルブからなる群より選ばれるいずれか一つである。好ましくは、第１のバルブ、第２のバルブ、および第３のバルブはロータリーバルブである。

【0047】

一部の具体的な実施形態では、当業者は、バルブを他の形態の機構または構成要素で置き換えることもできることを理解できる。例えば、その開閉により、密閉された管路内の圧力を変えることができる限り、動力源としてのシリンジポンプをバルブとして使用することもできる。

【0048】

本発明において、第１の管路、第２の管路、および第３の管路は、異なるタイプの管路を示すためにのみ使用され、管路の数を制限することを目的としていない。第１の管路は、複数の第１の管路であってもよく、第２の管路は、複数の第２の管路であってもよく、第３の管路は、複数の第３の管路であってもよい。

【0049】

本発明において、第１のバルブ、第２のバルブ、および第３のバルブは、異なる役割を果たすバルブを示すためにのみ使用され、バルブの数を制限することを目的としていない。第１のバルブは、複数の第１のバルブであってもよく、第２のバルブは、複数の第２のバルブであってもよく、第３のバルブは、複数の第３のバルブであってもよい。

【0050】

本発明において、第１の動力源および第２の動力源は、異なる役割を果たす動力源を示すためにのみ使用され、動力源の数を制限することを目的としていない。第１の動力源は、複数の第１の動力源であってもよく、第２の動力源は、複数の第２の動力源であってもよい。

【0051】

本発明のチップを使用する場合、チップを、下記の毛管路を介して動力源とバルブに接続することができる。本発明の具体的な実施形態では、以下に記載するように、毛管路の断面積は、２．５×１０^－３ｍｍ^２～４ｍｍ^２、好ましくは０．０１～３ｍｍ^２、より好ましくは０．１～２．５ｍｍ^２、さらに好ましくは０．２５～１ｍｍ^２である。

【0052】

前記管路の接続ポートは毛管路に接続され、接続箇所をシールしてから、毛管路を介して動力源および／またはバルブと連通する。動力源の圧力を安定して伝導させるために、前記毛管路は硬質チューブであり、管路には可撓性の変化はない。より好ましくは、前記毛管路は、ポリテトラフルオロエチレンチューブ（ＰＴＦＥチューブ）、パーフルオロプロピルパーフルオロビニルエーテルとポリテトラフルオロエチレンの共重合体チューブ（ＰＦＡチューブ）、ポリエーテルエーテルケトンチューブ（ＰＥＥＫチューブ）、ポリカーボネートチューブ（ＰＣチューブ）、ポリスチレンチューブ（ＰＳチューブ）からなる群より選ばれるいずれか１つである。

【0053】

本発明の一つの具体的な実施形態では、第１の管路は、第１の接続ポートと毛管路を介して第１の動力源と連通し、第１の動力源が駆動すると、第１の管路の第１の接続ポートを介して管路内に圧力を発生させ、これによって液滴ａまたは液滴ｂを第１の接続ポートを介して第１の管路内に押し込み、管路内の液滴の移動を制御して液滴を培養する。

【0054】

第２の管路は、第３の接続ポートと毛管路を介して第２のバルブと連通し、第１の動力源が駆動して第２のバルブのみが開かれると、第１の管路内の液滴ａが第２の管路内へ流れるように制御することができる。第３の管路は、第４の接続ポートと毛管路を介して第３のバルブと連通し、第１の動力源が駆動して第３のバルブのみが開かれると、第１の管路内の液滴ａが第３の管路へ流れるように制御することができる。第２のバルブと第３のバルブを交互に開くことにより、液滴ａの切断を完成することができる。

【0055】

第２の管路は、第３の接続ポートと毛管路を介して第２の動力源と連通し、第２の動力源が駆動すると、第２の管路の第３の接続ポートを介して管路内に圧力を発生させ、これによって、融合される液滴ａ１を、第１の管路と第２の管路との第１の連通部に留まっている液滴ｂへ押し込み、液滴の融合を完成する。

【0056】

第１の管路は、第２の接続ポートと毛管路を介して第１のバルブと連通し、第１の動力源が駆動して第１のバルブのみが開かれると、融合された液体ｃを第２の接続ポートから押し出すことができる。

【0057】

チップ基板内の第１の管路は、例えば、分割される液滴ａと融合される液滴ｂを収容するために使用される。前記分割される液滴ａと融合される液滴ｂの液滴体積は、０．５～１０μｌ、好ましくは０．６～８μｌ、より好ましくは０．７～７μｌ、さらに好ましくは０．８～６μｌ、さらに好ましくは０．９～５μｌ、さらに好ましくは１～３μｌである。

【0058】

本発明の一つの実施形態では、図４に示すように、前記チップ基板上に２つの孔（７と８）があり、前記孔（７と８）は、第１の管路１と第２の管路２との第１の連通部１３の近くにあり、その位置は固定されていなく、第２の管路２の両側、または第１の管路１の両側にそれぞれ配置されることができる。前記孔（７と８）は、前記第１の管路１と第２の管路２との第１の連通部１３との間の距離は、０．１ｍｍ～１ｃｍ、好ましくは０．３ｍｍ～５ｍｍであり、より好ましくは０．５ｍｍ～２ｍｍである。前記孔（７と８）は、別途に設置された融合電極の正極と負極を収容するために使用され、当業者は、チップのデザインの要求に従って上記範囲内で孔（７と８）の位置を決めることができる。前記融合電極に印加される電圧の周波数は０～２００００Ｈｚ、好ましくは１０００～１００００Ｈｚであり、前記電極電圧は１～５０００Ｖ、好ましくは５００～１０００Ｖである。前記融合電極を電源に接続すると、第１の連通部にある液滴に作用する電界が発生し、この電界は、交流電界または恒常電界のいずれかである。電極に印加される電圧は１～５０００Ｖ、好ましくは５００～１０００Ｖである。このような電界を印加することにより、融合される液滴ａ１と、第１の管路１と第２の管路２との第１の連通部１３に留まっている液滴ｂとの融合をさらに促進することができる。

【0059】

また、本発明では、孔（７と８）の具体的な形状及び孔のサイズに対して、別途設置された融合電極を収容するために使用できる限り、特に制限はない。融合電極は通常、正極と負極を含む。

【0060】

当業者による実施の過程において、本発明の原理によって、異なる液体の切断融合のためにチップ上に複数の第１の管路、第２の管路、および第３の管路を設けることもできるし、第１の管路の第１の接続ポート、第２の管路の第３の接続ポートを複数に増やしてそれぞれ異なる動力源に接続し、分割される異なるタイプの液滴ａと融合される異なるタイプの液滴ｂを第１の管路内に押し込むこともできる。

【0061】

複数の第１の管路１と複数の第２の管路２を使用することにより、異なるタイプの分割される液滴ａと融合される液滴ｂを第１の管路１または第２の管路２内に押し込むことができる。当業者は、液滴の切断および融合の要求に従って、本発明に記載の切断融合装置の接続原理を使用して、対応する液滴切断と融合装置を設計することができる。同様に、上記の第１の管路１ａ、第１の管路１ｂ、および第１の管路１ｃ、第２の管路２ａ、第２の管路２ｂ、および第２の管路ａｃは、例示的なものに過ぎず、第１の管路１はｎ個の異なる分岐管路で構成でき、第２の管路はｍ個の異なる分岐管路で構成できる。ここで、ｎとｍは同じでも異なっていてもよく、ｎとｍはそれぞれ、１～２０から選ばれる整数であってもよい。

【0062】

同様に、分割される液滴ａａ、分割される液滴ａｂ、分割される液滴ａｃ、融合される液滴ｂａ、融合される液滴ｂｂ、および融合される液滴ｂｃも例示的なものである。ｎ個の第１の管路とｍ個の第２の管路に基づいて、分割されるｎ個の異なる液滴ａ、および融合されるｍ個の異なる液滴ｂのサンプル注入に使用できる。

【0063】

さらに、ｍ個の第１の管路１とｎ個の第２の管路２に対しても、ｍ個の第１の動力源とｎ個の第２の動力源を使用してそれぞれ異なる液滴を制御して押すことができる。勿論、設計が合理的であれば、その中の一部の動力源を合併して、それぞれ分割されるｎ個の異なる液滴ａ、および融合されるｍ個の異なる液滴ｂを押すことも考えられる。

【0064】

本発明の一つの具体的な実施形態では、本発明は、マイクロ流体チップに係り、図４に示すように、基板４内には、第１の管路１ａ、第１の管路１ｂ、第１の管路１ｃ、第１の管路１ｄ、第２の管路２、および第３の管路３が形成されている。前記第１の管路１ａは、その両端にそれぞれ第１の接続ポート１１と第２の接続ポート１２を含む。第１の管路１ｂは、その一端に第１の接続ポート１１’を含み、他端が、分岐部１５で第１の管路１ａと合流する。第１の管路１ｃは、その一端に第１の接続ポート１１’’を含み、他端が、分岐部１５で第１の管路１ａと合流する。第１の管路１ｄは、その一端に第１の接続ポート１１’’’を含み、他端が、分岐部１５で第１の管路１ａと合流する。第２の管路２は、その一端に第３の接続ポート２１を含み、他端が第１の管路１と連通し、第２の管路２は、切断された第１の部分の液滴ａ１を収容するために使用される。第３の管路３は、その一端に第４の接続ポート３１を含み、他端が第１の管路１と連通し、第３の管路３は、切断された第２の部分の液滴ａ２を収容するために使用される。第１の管路１と第２の管路２との第１の連通部１３は、第３の管路３と第１の管路１との第２の連通部１４の液滴移動方向の上流に位置し、第１の連通部１３と第２の連通部１４との間の距離は、５００μｍ～２０００μｍ、好ましくは７５０μｍ～１８００μｍ、好ましくは１０００μｍ～１５００μｍである。

【0065】

さらに、分岐部１５は、第１の連通部１３の上流に位置し、分岐部１５と第１の連通部１３との間の距離は、５００μｍ～５０００μｍ、好ましくは１０００μｍ～３０００μｍ、好ましくは２０００μｍ～３０００μｍである。

【0066】

上記の具体的な実施形態では、図４に示すように、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０は第１の管路１ａ上に形成される。

【0067】

図４に示すように、第１の接続ポート１１’、１１’’、１１’’’、第３の接続ポート２１、および第４の接続ポート３１は、油相と水相のサンプル注入を実現するために、それぞれ異なる動力源とバルブに接続することができる。ここで、水相と油相のサンプル注入システムを切り替えることができる。例えば、チップを起動したばかりの場合、油相サンプル注入システムが上記接続ポートに接続され、チップ内部に媒体油を充填する。微生物液滴の注入を開始する時、一部のサンプル注入システムは、例えば、培養のための微生物液滴、反応のための酵素反応システム、および培養のための新鮮な培地、化学的因子、基質反応液など、水相サンプルを注入することができる。

【0068】

本発明の一つの具体的な実施形態では、例えば、油相サンプル注入システムが第１の接続ポート１１’に接続され、水相サンプル注入システムが第１の接続ポート１１’’に接続され、水相サンプル注入システムが第１の接続ポート１１’’’に接続され、水相サンプル注入システムが第３の接続ポート２１に接続され、バルブシステムが第４の接続ポート３１に接続される。

【0069】

本発明のチップおよび／チップシステムの使用中、例えば、第１の接続ポート１１’に接続されている油相サンプル注入システムはチップに油相サンプルを注入し、それと共に、第１の接続ポート１１’’に接続されている水相サンプル注入システムは、必要に応じて、所定のサンプル注入時間で水相サンプルをパルス注入し、それによって第１の管路１ｂと第１の管路１ｃとの連通部に油中水の微小液滴を形成し、例えば、図４と図８を参照できるように、細菌溶液の播種に使用される新鮮な培地または酵素反応のための基質溶液を形成する。

【0070】

動力源は、上記形成された微小液滴を右へ押し続けて第１の管路１ｄと第１の管路１ｂとの連通部に移動させ、そして、微小液滴を押すことを止めて、第１の接続ポート１１’’’に接続されている動力源は別の水相溶液（例えば、添加のためのある化学的因子溶液、または反応のための、別の基質を含む溶液）を、第１の管路１ｄと第１の管路１ｂに留まっている微小液滴に押し込み、上記の融合される液滴ｂを形成する。具体的には、この融合される液滴ｂは、ある化学的因子が添加された新鮮な培地、または異なる反応基質（またはマトリックス）を組み合わせた反応物溶液であることができる。

【0071】

チップを使用し始める場合、図４に示す第１の管路１ｂ内に油相（例えば、媒体として使用される鉱物油）が収容され、第２の管路２内には、播種される細菌液または反応する酵素溶液などの水相が収容される。油中水の液滴、すなわち、分割される液滴ａ、例えば、播種される菌液、または反応物と反応する酵素溶液は、第１の管路１ａと第２の管路２との第１の連通部１３で形成される。

【0072】

チップおよび／またはチップシステムを使用し始めると、まず、分割される液滴ａが形成され、次にそれが第１の管路で培養され、次いで、切断と融合を実現できる本発明の上記構造を使用して融合される液滴ｂを形成し、そして、切断および融合により、分割される液滴ａと切断および融合して新しい液滴ｃを形成する。また、第２の管路２は水相を収容し始め、菌液がすべて油中水の液滴を形成した後、油相を補充し、第２の管路はチップの操作中において上記の第２の管路として切断と融合を行う。

【0073】

よって、上述のように、本発明の図３と図６は、切断および融合のための基本的なチップ構造を示し、図４と図８は、本発明のチップおよび／またはチップシステムの一つの具体的な実施形態を示す。当業者が理解できるように、図４に示すチップにおいて、その部分構造が図３の構造と同じであり、その動力源とバルブの構造は、図６に示す構造により実現できる場合、液滴の融合と切断を実現でき、図４に示すチップを使用して操作する場合、チップ内でまず媒体油により囲まれた、切断される液滴ａを形成するか、媒体油によりかこまれた、融合される液滴ｂを形成するか、いずれも図３と図６に示す基本的な構造により実現できる。実現された後、図４に示すチップは、図３と図６に示す基本的な構造を使用して、媒体油に囲まれる新しい液滴ｃを形成することができる。上記のプロセスを繰り返すことにより、数個から数百個の新しい液滴ｃを形成することができる。

【0074】

勿論、サンプル注入システムとバルブシステムは、上述のようなサンプル注入口と密閉的に接続された毛管路を介して接続される。上述のように、サンプル注入システムは通常、主に、注入される液体を収容するための容器、サンプル注入のための管路と動力源を含む。動力源は上述のように、シリンジポンプ、圧力ポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプおよび／またはプランジャーポンプからなる群より選ばれるいずれか一つであり、好ましくはシリンジポンプである。バルブも上述のように、ソレノイドバルブ、ロータリーバルブ、ロッカーバルブ、およびピンチオフバルブからなる群より選ばれるいずれか一つであり、好ましくはロータリーバルブである。

【0075】

当業者が理解できるように、第１の接続ポート１１’、１１’’、１１’’’、および第３の接続ポート２１、第４の接続ポート３１に接続された上記のサンプル注入システムとバルブは例に過ぎない。チップの状態に応じて、これらのサンプル注入システムとバルブの関係を置き換えることができる。

【0076】

本発明では、マイクロ流体チップに接続された毛管路から構成される培養システムが装置内にあると考えることもできる。例えば、図４に示す本発明のチップでは、第１の接続ポート１１は毛管路を介して第１の培養管路に接続され、第２の接続ポート１２は毛管路を介して第２の培養管路に接続される。第１の培養管路と第２の培養管路は、毛管路で構成されてもよく、培養や反応システムが培養時間および反応時間に対する要求に従って第１の培養管路と第２の培養管路の長さを設計することができる。

【0077】

それと共に、本発明のチップに接続された動力源などを制御することにより、チップ内を流れる微小液滴の方向を逆転することができる。上述のように、形成された数個から数百個の新しい液滴ｃを第１の培養管路内で培養することができ、必要に応じて、動力源の制御により微小液滴の移動方向を逆にすることができ、これによって、管路内の微小液滴の往復運動を実現することができる。

【0078】

図４に示すように、一つの具体的な実施形態では、本発明のチップ上の第１の管路１ａの上に、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０が設けられており、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０についての説明は、上記の通りである。

【0079】

また、第１の管路１ａ上の、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０との間の距離は、管路内を流れる微小液滴の識別および検出がそれぞれ実現できる限り、特に限定はない。例えば、第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０との間の距離（管路に沿った距離を例として）は、１ｃｍ～１０ｃｍであってもよく、好ましくは３ｃｍ～５ｃｍである。第１の検出ウィンドウ９と第２の検出ウィンドウ１０は、それぞれ微小液滴の識別ウィンドウと微小液滴の検出ウィンドウとして使用することができる。

【0080】

一つの具体的な実施形態では、第１の検出ウィンドウ９は、微小液滴の識別ウィンドウとして使用され、第２の検出ウィンドウ１０は、微小液滴の光学検出ウィンドウとして使用される。

【0081】

上述のように、微小液滴の識別は、チップの外部に設置されるレーザーシステム（例えば、本発明の微小液滴処理装置上に設置される）と協力して実現できる。レーザーシステムが持続的にレーザーを発射して第１の検出ウィンドウ９に照射する時、微小液滴が第１の検出ウィンドウ９を通過すると、レーザービームは一時的にブロックされ、外部の記録システムはレーザービームの変化を記録することができる。

【0082】

微小液滴の検出は、チップの外部に設置される分光システム（例えば、本発明の微小液滴処理装置上に設置される）と協力して実現できる。例えば、分光検出器を設けて、第２の検出ウィンドウ１０を通過する微小液滴の吸光度を検出することができる。この吸光度は、例えば、微生物培養システムの微生物の成長の程度を反映でき、または、色の変化を伴う反応系の色変化を反映することができる。

【0083】

図５は、本発明のマイクロ流体チップシステムの概略図であり、図５には、チップの基板外部の管路は毛管路を示す。図４に示す構造と同様に、前記第１の管路は、第１の連通部の上流において、第１の管路ａ、第１の管路ｂ、第１の管路ｃ、および第１の管路ｄに分岐し、第１の検出ウィンドウと第２の検出ウィンドウが、第１の管路ａ上に形成され、第１の管路ａ、第１の管路ｂ、第１の管路ｃ、および第１の管路ｄがその上の第１の接続ポートと第２の接続ポートを介して毛管路に密閉接続され、第２の管路および第３の管路は第３の接続ポートと第４の接続ポートを介して毛管路に密閉接続される。

【0084】

第１の管路、第２の管路、第３の管路、および前記毛管路の断面積は、２．５×１０^－３ｍｍ^２～４ｍｍ^２、好ましくは０．０１～３ｍｍ^２、より好ましくは０．１～２．５ｍｍ^２、さらに好ましくは０．２５～１ｍｍ^２であり、さらに好ましくは、前記第１の管路、第２の管路、および第３の管路の断面積が同じである。第１の管路、第２の管路、および第３の管路に密閉接続された毛管路の密閉接続部は、前記基板内部に位置する。

【0085】

本発明では、上記密閉接続には特に限定はなく、例えば、チップ構造の設計後、彫刻機で加工し、次にチップ基板をホットプレスによってプレスし、毛管路をチップの側面の深い孔内に形成させ、接着剤を注入して密閉接合する。

【0086】

本発明のチップシステムにおける毛管路は硬質チューブであり、より好ましくは、前記毛管路は、ポリテトラフルオロエチレンチューブ（ＰＴＦＥチューブ）、パーフルオロプロピルパーフルオロビニルエーテルとポリテトラフルオロエチレンの共重合体チューブ（ＰＦＡチューブ）、ポリエーテルエーテルケトンチューブ（ＰＥＥＫチューブ）、ポリカーボネートチューブ（ＰＣチューブ）、ポリスチレンチューブ（ＰＳチューブ）からなる群より選ばれるいずれか１つである。

【0087】

さらに、温度制御システムは、温度センサーと温度制御部材を含む。前記温度制御部材は、昇温部材と降温部材とをさらに含み、前記昇温部材は温度コントローラーと金属浴を含み、容器ボトルおよび／または液圧緩衝用ボトルは金属浴に入れられ、温度コントローラーにはファンが付けられている。

【0088】

本発明の一つの具体的な実施形態では、前記昇温部材は、温度コントローラーと金属浴を含み、容器ボトルおよび／または液圧緩衝用ボトルは金属浴に入れられ、温度コントローラーにはファンが付けられている。前記温度制御システムには、設備の動作環境の温度を低め、さらに微生物培養の温度を低めるための降温装置であるファンが配置されている。

【0089】

本発明の一つの具体的な実施形態では、前記昇温および降温部材はさらに、排水温度制御システムを含むことができる。排水温度制御システムとしての排水温度制御板は、微小液滴処理装置に設けられ、排水温度制御板の給水口と排水口は、外部の恒温水浴装置に連通し、恒温水浴装置の恒温原理により排水温度制御板の温度を制御し、システムの昇温恒温制御を行い、これによって装置内の温度を調節する効果を収める。

【0090】

温度センサーは、本発明の培養システムの温度をオンラインで測定することができる。制御システムのホストコンピュータソフトウェアを介して温度制御スイッチをオンにすると、回路基板プログラムは温度制御機能をオンにしてファンをオンにし、温度が検出された後、段階的に加熱し始める。温度が目標値に達したことが検出されると、一部のパラメータを自動的に調整し、ファンの自動制御機能をオンにし、温度センサーと組み合わせて機能し、温度を目標値である（１０～５０）℃±０．２℃の範囲内に保つ。４０℃で測定した温度を図９に示す。

【0091】

本発明は、１～５００の微小液滴、好ましくは５～４００の微小液滴、好ましくは１０～３００の微小液滴、好ましくは２０～２００の微小液滴の生成を制御でき、各微小液滴の体積は０．５～１０μＬであり、振とうフラスコやディープウェルプレートの場合よりもスループットがはるかに多く、培地の消費が少ない；新鮮な培地の定期的且つ定量的な交換、および化学的因子の追加を実現でき、種子液を抽出する従来の継代培養よりもはるかに便利であり、時間と労力を節約できる；各微小液滴中の微生物の成長をリアルタイムでオンラインで検出することができ、従来のサンプリング検出よりもはるかに便利であり、中断のない培養を真に実現できる；また、インテリジェントにスクリーニングし、スクリーニング特性を設定し、適切な株を自動的にスクリーニングし、効率を向上させることができる。

【0092】

さらに、液滴識別システムは、レーザー光源と光電センサーとを含み、液滴検出システムは、光ファイバー分光計とハロゲン光源とを含む。

【0093】

なお、前記液滴識別システムは、光電センサーとレーザー光源を使用して、マイクロ流体チップシステムの第１の検出ウィンドウを通過する水相のサンプル液滴を識別し、前記液滴検出システムは、光ファイバー分光計とハロゲン光源を使用して、マイクロ流体チップシステムの第２の検出ウィンドウを通過する水相のサンプル液滴のスペクトルシグナルを検出する。

【0094】

本発明の一つの実施形態では、図２に示すように、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、温度制御システム、液滴識別システム、および液滴検出システムはすべて１つの箱内に設けられており、温度制御システム内の昇温および降温部材として、エアヒーターとファンが使用され、エアヒーターとファンはいずれも箱内に設置されている。本発明のもう一つの実施形態（図示されていない）では、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、液滴識別システム、および液滴検出システムはすべて１つの箱内に設けられており、温度制御システムにおける昇温および降温部材として、排水温度制御システムとファンが使用され、排水温度制御板は箱内に設置され、排水温度制御板の給水口と排水口はそれぞれ外部の恒温水浴装置と連通し、外部の恒温水浴装置を介して排水温度制御板の温度を制御し、これによって箱内の温度を調節する。ファンは箱内に設置され、装置の動作環境の温度を低める。

【0095】

前記箱内の温度は、温度制御システムによって制御され、さらに好ましくは、前記箱内の温度は１０℃～５０℃の範囲内に制御され、温度変動範囲は±０．５℃の範囲内に制御される。前記箱はさらに滅菌装置を含み、好ましくは滅菌装置は紫外線ランプである。

【0096】

本発明の装置において、制御システムは、微小液滴処理装置内の各システムを制御する。

【0097】

前記制御システムは、コントローラーと、ＰＣディスプレイ制御システムとを含む。前記コントローラーは、サンプル注入システム、温度制御システム、液滴識別システム、および液滴検出システムにそれぞれ接続され、制御システムのデジタル回路を介して制御する。前記ＰＣディスプレイ制御システムは、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、温度制御システム、液滴識別システム、液滴検出システムの情報を表示、保存、および分析する。
実施例

【0098】

実施例１
第１の管路、第２の管路、および第３の管路は、チップ基板内に形成された管路であり、チップ基板のサイズは３ｃｍ＊５ｃｍ＊４ｍｍ（長さ＊幅＊厚さ）であり、チップ基板の材料はＰＭＭＡであり、チップ基板内に形成された第１の管路、第２の管路、および第３の管路は、断面が正方形である管路であり、その断面積は１ｍｍ^２（一辺の長さが１ｍｍ）である。第１の管路はそれぞれ第２の管路と第３の管路に連通し、第１の管路と第２の管路との第１の連通部は、第１の管路と第３の管路との第２の連通部の上流にあり、第１の連通部と第２の連通部との間の距離は１．５ｍｍである。管路内に媒体油が充満した。

【0099】

第１の管路の第１の接続ポートには、シリンジポンプＡが接続され、第２の接続ポートには第１のロータリーバルブが接続され、第２の管路の第３の接続ポートには、シリンジポンプＢと第２のロータリーバルブが接続され、第３の管路の第４の接続ポートには、第３のロータリーバルブが接続され、管路とシリンジポンプおよびロータリーバルブは、毛管路を介して接続され、毛管路の内径は１．０ｍｍであり、材料はポリテトラフルオロエチレンである。

【0100】

本実施例では、使用されたシリンジポンプＡとシリンジポンプＢはいずれも工業用シリンジポンプであり、シリンジポンプに付いたバルブは３ポートバルブである。第１のバルブ、第２のバルブ、および第３のバルブはいずれも高圧２ポートバルブである。

【0101】

シリンジポンプＡをオンにし、第１のロータリーバルブを開き、２μｌ体積の分割される液滴ａと２μｌ体積の融合される液滴ｂを第１の管路内に押し込んだ。液滴ａと液滴ｂは管路内の油性媒体油相により中断された。本実施例では、分割される液滴は、大腸菌ＢＬ２１を含有する微生物培養液であり、液滴ｂは新鮮なＬＢ培地である。媒体油相は鉱物油である。

【0102】

第１のロータリーバルブを閉じて、第２のロータリーバルブを開き、シリンジポンプＡを駆動し続けて、液滴ａを押して第１の管路と第２の管路との第１の連通部に移動させた。ａの７０％は液滴ａ１であり、つまり、約１．４ミリリットルが第２の管路に入った。この時、第２のロータリーバルブを閉じて、第３のロータリーバルブを開き、シリンジポンプＡを駆動し続けて、液滴ａの残りの３０％、すなわち、約０．６ミリリットルの液滴ａ２がすべて第３の管路に入り、最終的に液滴ａは、液滴ａ１と液滴ａ２との２つの部分に切断された。液滴ａ１は第２の管路内に保持され、液滴ａ２は第３の管路に入り、第３のロータリーバルブを閉じて、液滴の分割を完成した。液滴ａの分割は主に、液滴ａの底面が管路Ａと平行になるように液滴ａを切断し、中間間隔の油相の量を減らしてから、切断された液滴ａの一部の溶液を、融合される液滴ｂに定量的に注入し、これによって注入量の高精度を実現する。液滴ａは管路内の油相によって切断されたため、液滴ｂの一端と第１の管路のチャネルが揃っているようになり、その後の正確な定量サンプル注入の基礎を築く。

【0103】

第１のロータリーバルブを開き、シリンジポンプＡを駆動し続けて、液滴ｂを押して第２の管路と第１の管路との接合部に移動させた後、押すことを止めて、シリンジポンプＢを駆動して液滴ａの部分（ａ１）を液滴ｂに定量的に押し込んで新しい液滴ｃを形成した。

【0104】

シリンジポンプＡをオンにし、新しい液滴ｃを押して前方に移動させ、残りの液滴ａ１部分はＢチャネルに留まり、液滴ａと液滴ｂとの定量的物質交換が完了した。

【0105】

大腸菌ＢＬ２１を含有する複数の培養液を新鮮なＬＢ培地に播種するように、上記のステップを繰り返した。

【0106】

実施例２
図４に示すように、実施例１と同じ材料を使用してマイクロ流体チップを形成した。実施例２では、基板の長さは７．５ｃｍであり、幅は５ｃｍである。

【0107】

また、実施例２において、サンプル注入システムの構成は、図８に示すように、マイクロ流体チップには、３つのサンプル注入システムＩおよび３つのサンプル注入システムＩＩが接続されており、動力源およびバルブは、実施例１と同じ方法が採用された。

【0108】

実施例２では、チップを使用する前に、サンプル注入システムＩはチップを油相で満たし、そして、第２の管路２に接続されたサンプル注入システムＩＩが滅菌の状態下で第２の管路２に播種用の細菌液を注入することにより、第１の連通部１３に油中水の微小液滴を形成した。サンプル注入が完了した後、第２の管路は再び油相で満たされた。次に、サンプル注入システムＩの動力源の作用により、第１の連通部１３で形成された油中水の微小液滴は、第１の管路１ａ内を往復し、液滴中の細菌培養が行われ、培養後に、分割される液滴ａとなった。第１の検出ウィンドウ９は、液滴識別サイトとして、液滴を識別するサイトとなり、第２の検出ウィンドウ１０は、細菌濃度のＯＤ検出のための液滴検出サイトとなった。

【0109】

そして、サンプル注入システムＩを介して第１の接続ポート１１’から油相をチップに導入し、サンプル注入システムＩＩによって、必要に応じて第１の接続ポート１１’’を介してサンプル注入時間帯を制御し、これによって、水相の培地を断続的にチップに注入して、第１の管路１ｂと第１の管路１ｃとの連通部で油中水の培地液滴を形成した。次のステップを選択できる。すなわち、微小液滴が右へ移動して第１の管路１ｄと第１の管路１ｂとの連通部までに移動した後、微小液滴を押すのを止めて、第１の接続ポート１１’’’に接続されたサンプル注入システムＩＩは、塩化ナトリウム溶液を、第１の管路１ｂと第１の管路１ｄに留まっている培地液滴（培地中の培地因子の濃度を変える）に押し込み、融合される液滴ｂを形成し、第１の管路に入らせ、分割される液滴ａの左側に位置させ、第１の管路１ａにおいて、液体を押して第１の接続ポート１１から第２の接続ポート１２へと移動させた。

【0110】

分割される液滴ａおよび融合される液滴ｂに対して、上記実施例１における分割および融合のプロセスを繰り返した。すべての液滴の分割および融合を完成した後、微生物の新しい液滴培養を再び行い、第２の検出ウィンドウ１０を介して液滴のＯＤ値を再び検出することができる。

【0111】

実施例３
実施例３では、図２に示すように、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、培養システム、温度制御システム、液滴識別システム、および液滴検出システムは、いずれも一つの箱内に配置されている。図２に示す設置方法により、実施例２のマイクロ流体チップシステムを使用して、液滴分割、融合、および微生物の新しい液滴培養を実現した。

【0112】

その中で、サンプル注入システムは、図８に示すように、３つのサンプル注入システムＩ、３つのサンプル注入システムＩＩ、バルブ、および廃液ボトルを含み、サンプル注入システムＩは、動力ポンプと油相ボトルとからなり、サンプル注入システムＩＩは、動力ポンプ、油相ボトル、およびサンプル注入緩衝用ボトルからなり、サンプル注入システムＩに使用された油相ボトルに収容された油相媒体は、サンプル注入システムＩＩの油相ボトルに収容された油相媒体と同じである。具体的な実施形態では、油相ボトルを共有することができる。本実施例では、図２に示すように、３つのサンプル注入システムＩと３つのサンプル注入システムＩＩは、油相媒体を収容するためのオイルボトル６０を共有し、３つのサンプル注入緩衝用ボトル６１はそれぞれ、水相の細菌液、培地、および添加のための化学的因子を収容する。６つのシリンジポンプ６３は、サンプル注入システムの動力源であり、６つのシリンジポンプ６３はいずれもオイルボトル６０に接続され、その中の３つのシリンジポンプは、オイルボトル６０の油相媒体をマイクロ流体チップシステム４６に押し込み、図８に示す３つのサンプル注入システムＩを形成した。他の３つのシリンジポンプは、オイルボトル６０の油相媒体をそれぞれ３つのサンプル注入緩衝用ボトル６１に押し込み、油相媒体の液体圧力によってサンプル注入緩衝用ボトル６１内の水相液体をマイクロ流体チップシステム４６に押し込んで、図８に示す３つのサンプル注入システムＩＩを形成した。シリンジポンプ６３、オイルボトル６０、サンプル注入緩衝用ボトル６１、ロータリーバルブ６５、廃液ボトル６２、およびマイクロ流体チップシステム４６は、実施例２の接続方式に従って、毛管路（図示されていない）を介して接続されている。上記のサンプル注入システムおよびバルブの制御の協力により、培養される細菌液はマイクロ流体チップシステム４６内で分割および融合されて複数の油中水の微生物液滴を形成し、シリンジポンプ６３の作用下でマイクロ流体チップシステム４６の管路内で往復して培養された。

【0113】

温度制御システムは、昇温部材、降温部材、および温度制御部材を含む。図２に示すように、昇温部材は、エアヒーター５４と金属浴５３を含み、サンプル注入緩衝用ボトル６１は金属浴５３内に放置され、エアヒーター５４は加熱ファンを介して、装置の箱内の微生物の培養環境を加熱する。降温部材は、それぞれ装置の動作環境の温度降下および微生物の培養環境の温度降下のための２つのファン６４を含み、温度プローブ６７は、箱内の微生物の培養環境の温度を測定し、装置の制御システムにフィードバックし、これによって昇温部材と降温部材の動作を制御し、マイクロ流体チップ内の液滴を昇温加熱および恒温制御する。本実施例では、温度制御曲線は図９に示される。

【0114】

液滴識別システムは、レーザー光源５５と光電センサー５６とを含む。図２に示すように、レーザー光源５５は、マイクロ流体チップシステム４６の第１の検出ウィンドウを照射し、第１の検出ウィンドウを通過する水相サンプル液滴を識別し、光電センサー５６を介して液滴の位置情報を装置の制御デバイスに送り返す。

【0115】

液滴検出システムは、光ファイバー５７、分光計５８、およびハロゲン光源５９を含む。図２に示すように、光ファイバー５７は、マイクロ流体チップシステム４６の第２の検出ウィンドウに合わせ、分光計５８を介して、マイクロ流体チップシステムの第２の検出ウィンドウを通過する水相サンプル液滴のスペクトルシグナルを検出する。

【0116】

検出システムでは、光電センサー５６とレーザー光源とを組み合わせて使用して、マイクロ流体チップシステム４６の第１の検出ウィンドウで微小液滴の状態を識別し、これによって液滴の往復と培養を制御することができる。前記光ファイバー５７、分光計５８、およびハロゲン光源５９を組み合わせて使用して、マイクロ流体チップシステム４６の第２の検出ウィンドウで、収容された微小液滴中のサンプルを検出する。ＥＰチューブ５２は、培養された微生物の液滴を収容し、紫外線ランプ６６は、装置内の微生物の培養環境を滅菌することができる。

【0117】

微生物培養のステップは次の通りである：
１）機器は紫外線ランプをオンにして３０分間滅菌した；
２）装置管路を排気させ、温度制御システムをオンにして、３０分間予熱した；
３）播種した細菌液（上述のように、大腸菌ＢＬ２１）１ｍＬを１つのサンプル注入緩衝用ボトルに加え、真空脱気箱に入れて３０分間脱気処理をし、培養用の新鮮な培地（ＬＢ培地）を１つのサンプル注入緩衝用ボトルに入れて、添加用の化学的因子、すなわちアスコルビン酸溶液をもう１つのサンプル注入緩衝用ボトルに入れた；
４）チップをブラケットに取り付け、サンプル注入緩衝用ボトルおよびオイルボトルの入口に接続した；
５）機器ソフトウェアを開き、「成長曲線」測定モードを選択し、基本パラメータを、検出サイクル０．５時間、液滴数１００、検出波長６２０ｎｍのように設定した；
６）実行ボタンをクリックした；
７）４６時間実行した後、データを取得し、結果を図１０に示す。

【0118】

本発明は、正確な温度制御を実現し、結果の信頼性を高くし、微生物を円滑に成長させることができ、最大９０日間の連続培養を実現することができる。
産業上の利用可能性

【0119】

本発明の全自動ハイスループット微生物液滴培養装置および使用方法は、ハイスループット微生物培養の分野で製造および使用することができる。

【0120】

本発明の実施形態について、添付の図面を組み合わせて説明したが、本発明は、上記の具体的な実施形態および応用分野に限定されない。上記の具体的な実施形態は単に例示的、指導的であり、限定的ではない。本明細書の教示の下で、当業者は本発明の特許請求の範囲の保護範囲から逸脱することなく、多くの形態をすることができ、それらはすべて本発明の保護範囲内である。

【0121】

（１）
微小液滴処理装置に油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩと、微小液滴処理装置に水相のサンプルを注入するためのサンプル注入システムＩＩとを少なくとも含む、微小液滴処理装置に水相および油相のサンプルを注入するためのサンプル注入システム；
基板と、基板内に形成された管路と、第１の検出ウィンドウと、第２の検出ウィンドウとを含む、マイクロ流体チップシステム；
温度センサーと、温度制御部材とを含む、温度制御システム；
レーザー光源と、光電センサーとを含む、液滴識別システム；
光ファイバー分光計と、ハロゲン光源とを含む、液滴検出システム；および
微小液的処理装置における各システムを制御するための制御システム
を含む、微小液滴処理装置。
（２）
前記液滴識別システムは、光電センサーとレーザー光源により、マイクロ流体チップシステムの第１の検出ウィンドウを通過する水相のサンプル液滴を識別し；
前記液滴検出システムは、光ファイバー分光計とハロゲン光源により、マイクロ流体チップシステムの第２の検出ウィンドウを通過する水相のサンプル液滴のスペクトルシグナルを検出する、
（１）に記載の装置。
（３）
前記サンプル注入システムは、それぞれ少なくとも２つのサンプル注入システムＩと１つのサンプル注入システムＩＩとを含む、
（１）または（２）に記載の装置。
（４）
前記サンプル注入システムは、３つのサンプル注入システムＩと、３つのサンプル注入システムＩＩとを含む、
（３）に記載の装置。
（５）
前記サンプル注入システムＩは、液体容器と、動力源と、を含み、
前記サンプル注入システムＩＩは、液体容器と、動力源と、緩衝用ボトルとを含み、
前記動力源は、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプおよび／またはプランジャーポンプであり、好ましくはシリンジポンプであり、
前記液体容器は、注入するサンプル溶液と非相容且つ非圧縮性の液体を収容し、
前記動力源は、前記液体を駆動して輸入管路を経由して緩衝用ボトルに送り込み、
前記緩衝用ボトルは前記サンプル溶液を収容し、動力源により駆動されると、前記液体は輸入管路を経由して緩衝用ボトルに入り、これによって輸出管路を経由してサンプル溶液を前記マイクロ流体チップシステムに押し込み、前記液体容器、動力源、および緩衝用ボトルは毛管路を介して連通している、
（３）または（４）に記載の装置。
（６）
マイクロ流体チップシステムは、
基板；および
前記基板内に形成された第１の管路、第２の管路、および第３の管路、
前記第１の管路上に形成された透明領域である、第１の検出ウィンドウと第２の検出ウィンドウ、および
第１の管路、第２の管路、および第３の管路に密閉連通している毛管路
を含み、
前記第１の管路は、その両端にそれぞれ第１の接続ポートと第２の接続ポートを含み、
前記第２の管路は、その一端に第３の接続ポートを含み、他端が第１の管路と連通し、
前記第３の管路は、その一端に第４の接続ポートを含み、他端が第１の管路と連通し、
第１の管路と第２の管路との第１の連通部は、第３の管路と第１の管路との第２の連通部の液滴移動方向の上流に位置し、第１の連通部と第２の連通部との間の距離は、５００μｍ～２０００μｍ、好ましくは７５０μｍ～１８００μｍ、好ましくは１０００μｍ～１５００μｍである、
（１）～（５）のいずれか一項に記載の装置。
（７）
前記第１の管路は、第１の連通部の上流において、第１の管路ａ、第１の管路ｂ、第１の管路ｃ、および第１の管路ｄに分岐しており、
第１の検出ウィンドウと第２の検出ウィンドウは、第１の管路ａ上に形成され、
第１の管路ａ、第１の管路ｂ、第１の管路ｃ、および第１の管路ｄがその上の第１の接続ポートと第２の接続ポートを介して毛管路に密閉接続され、
第２の管路および第３の管路が第３の接続ポートと第４の接続ポートを介して毛管路に密閉接続される、
（６）に記載の装置。
（８）
前記基板と第１の管路、第２の管路、および第３の管路は、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体（ＡＢＳ）からなる群より選ばれるいずれか一種または多種で形成され、好ましくはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で形成され、
前記毛管路は硬質チューブであり、より好ましくは、前記毛管路は、ポリテトラフルオロエチレンチューブ（ＰＴＦＥチューブ）、パーフルオロプロピルパーフルオロビニルエーテルとポリテトラフルオロエチレンの共重合体チューブ（ＰＦＡチューブ）、ポリエーテルエーテルケトンチューブ（ＰＥＥＫチューブ）、ポリカーボネートチューブ（ＰＣチューブ）、ポリスチレンチューブ（ＰＳチューブ）からなる群より選ばれるいずれか１つであり、
さらに好ましくは、第１の管路、第２の管路、第３の管路、および前記毛管路の断面積は、２．５×１０ ^－３ ｍｍ ^２ ～４ｍｍ ^２ 、好ましくは０．０１～３ｍｍ ^２ 、より好ましくは０．１～２．５ｍｍ ^２ 、さらに好ましくは０．２５～１ｍｍ ^２ である、
（６）または（７）に記載の装置。
（９）
サンプル注入システムとマイクロ流体チップシステムは、毛管路と接続ポートを介して接続され、密閉された閉ループ制御構造を形成している、（１）～（８）のいずれか一項に記載の装置。
（１０）
サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、液滴識別システム、および液滴検出システムはすべて１つの箱内に設けられており、
前記箱内の温度は、温度制御システムによって制御され、
さらに好ましくは、前記箱内の温度は１０℃～５０℃の範囲内に制御され、温度変動範囲は±０．５℃の範囲内に制御される、
（１）に記載の装置。
（１１）
前記箱はさらに滅菌装置を含み、好ましくは滅菌装置は紫外線ランプである、（１０）に記載の装置。
（１２）
前記制御システムは、コントローラーと、ＰＣディスプレイ制御システムとを含み、
前記コントローラーは、サンプル注入システム、温度制御システム、液滴識別システム、および液滴検出システムにそれぞれ接続され、制御システムのデジタル回路を介して制御し、
前記ＰＣディスプレイ制御システムは、サンプル注入システム、マイクロ流体チップシステム、温度制御システム、液滴識別システム、液滴検出システムの情報を表示、保存、および分析する、
（１）～（１１）のいずれか一項に記載の装置。