特開 2023-52506 養子Ｔ細胞療法のためのセントラルメモリーＴ細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023052506

(43)【公開日】2023-04-11

(54)【発明の名称】養子Ｔ細胞療法のためのセントラルメモリーＴ細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20230404BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230404BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230404BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230404BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230404BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230404BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20230404BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20230404BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

A61P35/00

A61P37/04

A61K35/17

A61K39/395 L

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N5/0783

【審査請求】有

【請求項の数】16

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023006410

(22)【出願日】2023-01-19

(62)【分割の表示】P 2020093109の分割

【原出願日】2015-09-21

(31)【優先権主張番号】62/053,068

(32)【優先日】2014-09-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】598004424

【氏名又は名称】シティ・オブ・ホープ

【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100091214

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 進介

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン，クリスティン イー

(72)【発明者】

【氏名】フォーマン，スティーブン ジェイ

(57)【要約】

【課題】
キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を備える遺伝子組換えＴ細胞の集団を調製する方法に関する。
【解決手段】
キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を、少なくとも５０％がセントラルメモリーＴ細胞であり、（ｉ）セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１０％がＣＤ４＋であり、かつ、（ｉｉ）セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１０％がＣＤ８＋である、ヒトＴ細胞の集団に導入することを含む、キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を備える遺伝子組換えＴ細胞の集団を調製する方法に関する。
【選択図】 図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を、少なくとも５０％がセントラルメモリーＴ細胞であり、（ｉ）前記セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１０％がＣＤ４＋であり、かつ、（ｉｉ）前記セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１０％がＣＤ８＋である、ヒトＴ細胞の集団に導入することを含む、キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を備える遺伝子組換えＴ細胞の集団を調製する方法。

【請求項2】

ヒトＴ細胞の集団は、ＣＤ２５、ＣＤ１４及びＣＤ４５Ｒａを発現するＴ細胞が枯渇されている、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

さらに、遺伝子組換えＴ細胞集団をＣＤ３及び／又はＣＤ２８と接触させて、活性化及び増殖を刺激することを含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

さらに、遺伝子組換えＴ細胞集団を増殖することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

遺伝子組換えＴ細胞集団を増殖することは、細胞をＩＬ－２及びＩＬ－１５の一方又は両方に曝露することを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－であり、かつ、前記セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１５％はＣＤ４＋であり、かつ、前記セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１５％はＣＤ８＋である、請求項１記載の方法。

【請求項7】

前記セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－であり、かつ、前記セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも２０％はＣＤ４＋であり、かつ、前記セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも２０％はＣＤ８＋である、請求項１記載の方法。

【請求項8】

ＣＤ６２Ｌを発現するＴ細胞が富化され、かつ、キメラ抗原受容体をコードする核酸分子で形質導入されたヒトＴ細胞の集団であって、前記形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも５０％は、セントラルメモリーＴ細胞であり、前記形質導入されたセントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１０％はＣＤ４＋であり、かつ前記形質導入されたセントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１０％はＣＤ８＋であり、かつ、
前記ヒトＴ細胞の集団ではＣＤ２５、ＣＤ１４及びＣＤ４５Ｒａを発現するＴ細胞が枯渇している、ヒトＴ細胞の集団。

【請求項9】

前記セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１５％はＣＤ４＋であり、かつ、前記セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１５％はＣＤ８＋である、請求項８に記載のヒトＴ細胞の集団。

【請求項10】

前記形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋又はＣＤ６２Ｌ＋である、請求項８に記載のヒトＴ細胞の集団。

【請求項11】

前記形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－であり、少なくとも１０％はＣＤ４＋であり、かつ、少なくとも１０％はＣＤ８＋である、キメラ抗原受容体をコードする核酸分子で形質導入されたヒトＴ細胞の集団。

【請求項12】

ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－である細胞の少なくとも１０％がまたＣＤ４＋であり、前記ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－である細胞の少なくとも１０％がまたＣＤ８＋である、請求項１１に記載のヒトＴ細胞の集団。

【請求項13】

ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－である細胞の少なくとも１５％がまたＣＤ４＋であり、前記ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－である細胞の少なくとも１５％がまたＣＤ８＋である、請求項１１に記載のヒトＴ細胞の集団。

【請求項14】

請求項８～１３のいずれか一項に記載のヒトＴ細胞の集団を含む、医薬組成物。

【請求項15】

ヒトＴ細胞の集団は患者の自己由来である、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

ヒトＴ細胞の集団は患者に対して同種異系である、請求項１４に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

改変Ｔ細胞を用いる治療を含む、腫瘍特異的Ｔ細胞に基づく免疫療法が、抗腫瘍治療について研究されている。当該療法に用いられるＴ細胞には、十分長期間、インビボで活性を維持しないものがある。Ｔ細胞の腫瘍特異性は比較的低い場合がある。したがって、当業界には、抗腫瘍作用がより長期にわたる腫瘍特異的がん治療の需要がある。

【背景技術】

【0002】

ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原特異的な腫瘍集団を特異的に認識するように改変することができるので、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が改変されたＴ細胞を利用する養子（ａｄｏｐｔｉｖｅ）Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、ＭＧの再発率を低下させる安全かつ有効な方法を提供することができ（非特許文献１～５）、かつ、Ｔ細胞は脳実質を通過して標的に移動し、浸潤性悪性細胞を死滅させることができる（非特許文献６～９）。前臨床試験は、ＩＬ１３Ｒα２標的化ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、幹様及び分化した神経膠腫細胞に対して強力な主要組織適合複合体（ＭＨＣ）非依存性のＩＬ１３Ｒα２特異的細胞溶解活性を示し、かつ、インビボで確立された神経膠腫異種移植の退縮を誘発することを実証した（非特許文献４及び１０）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０：９５６３０４

【非特許文献2】Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６：４７４

【非特許文献3】Ｓａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０：９７２

【非特許文献4】Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １８：２１９９

【非特許文献5】Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２１：６２９

【非特許文献6】Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６：４８９２

【非特許文献7】Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９：３３３２

【非特許文献8】Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６：４８９２

【非特許文献9】Ｙａｇｈｏｕｂｉ ２００９ Ｎａｔ Ｃｌｉｎ ＰＲａｃｔ Ｏｎｃｏｌ ６：５３

【非特許文献10】Ｋａｈｌｏｎ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４：９１６０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本明細書には、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）を含む細胞集団が記載される。細胞集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞をともに含む。細胞集団中の細胞は、細胞外ドメイン（例えば、選択された標的に結合するｓｃＦｖ）、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ヒトＣＤ３複合体のζ鎖由来のシグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ）及び１つ以上の共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、を含む細胞内ドメイン）を含むキメラ膜貫通免疫受容体（キメラ抗原レセプター又は「ＣＡＲ」）を発現するのに有用である。細胞外ドメインは、Ｔ細胞の表面に発現されたときにＣＡＲがＴ細胞活性を細胞外ドメインによって認識される標的を発現する細胞に指向させることができる。細胞内領域にＣＤ３ζと直列の４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン等の共刺激ドメインを含めることにより、Ｔ細胞は共刺激シグナルを受け取ることができる。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本明細書に記載のＴｃｍ細胞、例えば患者特異的、自己由来（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）又は同種異系の（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）Ｔｃｍ細胞は、所望のＣＡＲを発現するように改変することができ、改変された細胞はＡＣＴで増殖され、用いることができる。ＴＣＭ細胞の集団はＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌであり、かつ、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞を含む。
ある実施形態では、ヒトＴ細胞の集団は、キメラ抗原レセプターを発現するベクターを含み；
ヒトセントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）の集団は、少なくとも１０％のＣＤ４＋細胞及び少なくとも１０％のＣＤ８＋細胞（例えば、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％はＴｃｍ細胞であり；
Ｔｃｍ細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ４＋であり、かつ、Ｔｃｍ細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ８＋細胞である）を含む。

【0006】

また、患者のがんを治療する方法であって、
キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入された自己由来又は同種異系のヒトＴ細胞の集団（例えば、Ｔｃｍ細胞を含む自己又は同種異系のＴ細胞、例えば細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴｃｍ細胞であり；Ｔｃｍ細胞の少なくともの１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ４＋であり、かつ、Ｔｃｍ細胞の少なくともの１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ８＋細胞である）を投与することを含む、
方法が記載される。

【0007】

本明細書において、形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも５０％がセントラルメモリーＴ細胞であるキメラ抗原レセプターを発現するベクターで形質導入されたヒトＴ細胞の集団が記載される。ある実施形態では、形質導入された細胞のセントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１０％がＣＤ４＋であり；
形質導入されたセントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１０％がＣＤ８＋であり；
セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１５％がＣＤ４＋であり、かつ、少なくとも１５％がＣＤ８＋であり；かつ、
形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも５０％がＣＤ４＋／ＣＤ８＋／ＣＤ６２Ｌ＋である。

【0008】

本明細書にはまた、キメラ抗原受容体を発現するベクターで形質導入されたヒトＴ細胞の集団が記載される。ここで、形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも５０％がＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－であり、細胞の少なくとも１０％がＣＤ４＋であり、かつ、細胞の少なくとも１０％がＣＤ４＋である。様々な実施形態では、ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－である細胞の少なくとも１０％もまたＣＤ４＋であり、ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－である細胞の少なくとも１０％もまたＣＤ８＋であり；かつ、
ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－である細胞の少なくとも１５％もまたＣＤ４＋であり、ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－である細胞の少なくとも１５％もまたＣＤ４＋である。

【0009】

がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書中に記載されるセントラルメモリーＴ細胞を含む医薬組成物を投与することを含む方法もまた記載される。Ｔ細胞は、患者に対して自己由来であってもよいし、患者に対して同種異系であってもよい。

【0010】

セントラルメモリーＴ細胞の集団を調製するための方法であって、
ヒト被験体からＴ細胞の集団を得ることと；
枯渇したＴ細胞の集団を調製するため、ＣＤ２５を発現する細胞、ＣＤ１４を発現する細胞、及びＣＤ４５＋を発現する細胞について、前記Ｔ細胞の集団を枯渇させることと；
ＣＤ６２Ｌを発現する細胞について前記枯渇したＴ細胞集団を富化することであって、それによりセントラルメモリーＴ細胞の集団を調製することと；
を含み、当該方法は、ＣＤ４を発現する細胞について細胞集団を枯渇させる工程を含まず、ＣＤ８＋を発現する細胞の細胞集団を枯渇させる工程を含まない、方法もまた記載される。ある実施形態では、
セントラルメモリーＴ細胞の集団における細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％）が、ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－であり、細胞の少なくとも１０％がＣＤ４＋であり、かつ細胞の少なくとも１０％がＣＤ４＋であり；
セントラルメモリーＴ細胞の集団における細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％）が、ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－であり、細胞の少なくとも１５％がＣＤ４＋であり、かつ細胞の少なくとも１５％がＣＤ４＋であり；
セントラルメモリーＴ細胞の集団における細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５Ｒａ－であり、細胞の少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、４０％又は５０％）がＣＤ４＋であり、かつ細胞の少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、４０％又は５０％）がＣＤ４＋である。当該方法は、（例えば、セントラルメモリーＴ細胞の集団をＣＤ３及び／又はＣＤ２８と接触させることによって）
セントラルメモリーＴ細胞の集団を刺激することをさらに含むことができ；
遺伝子改変されたセントラルメモリーＴ細胞の集団を作製するために組換えタンパク質を発現するベクターで細胞を形質導入することを含むことができ；
遺伝子改変されたセントラルメモリーＴ細胞の集団を増殖させること（例えば、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の一方又は両方に細胞を曝露することによって、遺伝子改変されたセントラルメモリーＴ細胞の集団を拡大すること）を含むことができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

図面の説明

【図1】ＩＬ１３Ｒα２特異的ヒトＩＬ１３変異体（ｈｕＩＬ－１３（Ｅ１３Ｙ））、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃスペーサー（ｈｕγ４Ｆｃ）、ヒトＣＤ３ζ鎖の細胞質（ｈｕＣＤ３ζｃｙｔ）部分から構成される、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）－ゼータカインＣＡＲ（左）の概略図である。また、ＩｇＧ４スペーサーのＣＨ２ドメインに位置する２つの点突然変異Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑ（赤で示されている）を除いてＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）－ゼータカインと同じＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ、及び共刺激４－１ＢＢ細胞質ドメイン（４－１ＢＢ細胞）の添加も示されている。

【図2】Ａ～Ｃは、オープンリーディングフレームの特定のベクターを示す。Ａは、２６７０ヌクレオチドＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ－Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ構築物のｃＤＮＡオープンリーディングフレームの図であり、ここで、ＩＬ１３Ｒα２特異的リガンドＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）、ＩｇＧ４（ＥＱ）Ｆｃヒンジ、ＣＤ４膜貫通、４－１ＢＢ細胞質シグナル伝達、３つのグリシンリンカー、及びＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ ＣＡＲのＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、並びにＴ２Ａリボソームスキップ及び切断型ＣＤ１９配列が示されている。ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ及びＣＤ１９ｔの表面発現を駆動するヒトＧＭ－ＣＳＦ受容体α及びＣＤ１９シグナル配列もまた示される。Ｂは、宿主ゲノムに組み込まれるであろう長い末端反復（「Ｒ」で示される）が隣接(flanked)配列の図である。Ｃは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７プラスミドのマップである。

【図3】ｐＨＩＶ７の構築を示す。

【図4】ｐＨＩＶ７の要素を示す。

【図5】ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭの生産スキームを示す。

【図6】Ａ～Ｃは、表面トランスジーン及びＴ細胞マーカー発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭ ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１は、抗ＩＬ１３－ＰＥ及び抗ＣＤ８－ＦＩＴＣで同時染色して、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋及びＣＤ４＋（すなわちＣＤ８陰性）ＣＡＲ＋細胞（Ａ）を検出するか、 抗ＣＤ１９－ＰＥ及び抗ＣＤ４－ＦＩＴＣで、ＣＤ４＋ＣＤ１９ｔ＋及びＣＤ８＋（すなわちＣＤ４陰性）ＣＡＲ＋細胞（Ｂ）を検出する。蛍光色素共役抗ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ２８（灰色ヒストグラム）又はアイソタイプ対照（黒色ヒストグラム）で染色したＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭ ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１（Ｃ）。すべての場合において、生存可能なリンパ球に基づく比率（ＤＡＰＩ陰性）はアイソタイプより上に染色された。

【図7】Ａ及びＢは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ＋ＴＣＭのＩＬ１３Ｒα２特異的エフェクター機能のインビトロ機能的特徴付けを示す。ＩＬ１９（ＥＱ）ＢＢＺ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭ ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１を、ＣＤ１９ｔ発現に基づく１０：１のＥ：Ｔ比を用いた６時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいてエフェクターとして用いた。ＩＬ１３Ｒα２陽性腫瘍標的は、ＩＬ１３Ｒα２（Ｋ５６２－ＩＬ１３Ｒα２）及び一次神経膠腫系統ＰＢＴ０３０－２を発現するように改変されたＫ５６２であり、ＩＬ１３Ｒα２陰性腫瘍標的対照はＫ５６２親系統であった（Ａ）。ＩＬ１３Ｒα２陽性及び陰性の標的との１０：１のＥ：Ｔ比での一晩の同時培養後、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭ ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１を抗原依存性サイトカイン産生について評価した。サイトカインレベルは、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ＰｒｏヒトサイトカインＴＨ１／ＴＨ２アッセイキットを用いて測定し、ＩＮＦ－γを報告した（Ｂ）。

【図8】Ａ～Ｃは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭの養子移植後の確立された神経膠腫腫瘍異種移植片の退行を実証する研究の結果を示す。ＥＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ＋ＰＢＴ０３０－２腫瘍細胞（１×１０^５）を、ＮＳＧマウスの右前脳に定位固定した。５日目に、マウスは、２×１０^６ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭ（１．１×１０^６ＣＡＲ＋；ｎ＝６）、２×１０^６モック（ｍｏｃｋ）ＴＣＭ（ＣＡＲなし、ｎ＝６）又はＰＢＳ（ｎ＝６）のいずれかを受けた。各群の代表的なマウスは、Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅを用いて相対的な腫瘍負荷を示した（Ａ）。ｆｆＬｕｃフラックス（光子／秒）の定量化は、モック形質導入ＴＣＭ及びＰＢＳと比較してＩＬ１３ＢＱζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭが腫瘍退縮を誘導することを示す（＃ｐ＜０．０２、＊ｐ＜０．００１、反復測定ＡＮＯＶＡ）（Ｂ）。カプランマイヤー生存曲線（ｎ＝６／グループ）は、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭで処置したマウスの有意に改善した生存率（ｐ＝０．０００８；対数ランク検定）を示す（Ｃ）。

【図9】Ａ～Ｃは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺＴＣＭ及びＩＬ１３－ゼータカインＣＴＬクローンの抗腫瘍効果を比較する研究の結果を示す。ＥＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ＋ＰＢＴ０３０－２ＴＳｓ（１×１０^５）をＮＳＧマウスの右前脳内に定位固定的に移植した。８日目に、マウスは、１．６×１０^６モックＴＣＭ（ＣＡＲなし）か、１．０×１０^６ＣＡＲ＋ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴＣＭ（１．６×１０^６総Ｔ細胞、６３％ＣＡＲ）か、１．０×１０^６ＩＬ１３－ゼータカインＣＤ８＋ＣＴＬ ｃｌ．２Ｄ７（クローナルＣＡＲ＋）か、処置なしのいずれかを受けた（１群当たりｎ＝６）。各グループの代表的なマウスは、Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅを用いて相対的な腫瘍負荷を示した（Ａ）。経時的なｆｆＬｕｃフラックス（光子／秒）の自然対数の線形回帰線であり、Ｐ値は、時間ごとの相互作用比較である（Ｂ）。ＩＬ１３－ゼータカインＣＤ８＋ＣＴＬ ｃｌ．２Ｄ７と比較してＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴＣＭで処置したマウスについて、カプランマイヤー生存分析（１群あたりｎ＝６）が有意に改善された生存を示した（ｐ＝０．０２；対数ランク検定）（Ｃ）。

【図10】Ａ～Ｃは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴＣＭ及びＩＬ１３－ゼータカインＣＴＬクローンの抗腫瘍効果を比較する研究の結果を示す。ＥＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ＋ＰＢＴ０３０－２ ＴＳｓ（１×１０^５）をＮＳＧマウスの右前脳内に定位固定的に移植した。８日目に、マウスは、１．３×１０^６モックＴＣＭ（ＣＡＲなし；ｎ＝６），１．０，０．３か、０．１×１０^６ＣＡＲ＋ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴＣＭ（７８％ＣＡＲ＋；ｎ＝６），１．０，０．３か、０．１×１０^６ ＩＬ１３－ゼータカインＣＤ８＋ＣＴＬ ｃｌ．２Ｄ７（クローナルＣＡＲ＋；ｎ＝６～７）か、処置なしのいずれかを受けた（ｎ＝５）。各グループの代表的なマウスのＸｅｎｏｇｅｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅは、相対的な腫瘍負荷を示した（Ａ）。ｆｆＬｕｃフラックス（光子／秒）の自然対数の線形回帰線は、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴＣＭは、第１世代のＩＬ１３－ゼータカインＣＴＬ ｃｌ．２Ｄ７、モック（ｍｏｃｋ）ＴＣＭ及び腫瘍のみと比較して優れた腫瘍退縮を達成することが示されている（Ｂ）。腫瘍注射後２７日の群あたりの平均フラックスは、０．１×１０^６ ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴＣＭ用量が、ＩＬ１３－ゼータカインＣＤ８＋ＣＴＬ ｃｌ． ２Ｄ７の１０倍高い１．０×１０^６用量よりも優れていることを実証する（ｐ＝０．０４３；ウェルチ２試料ｔ－検定）（Ｃ）。

【図11】図１１は、ＩＬ１３－ゼータカインＣＴＬクローンと比較して改善された持続性を示すＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴｃｍディスプレイを実証する研究の結果を示す。ＣＤ３免疫組織化学は、Ｔ細胞注入の７日後の腫瘍部位におけるＴ細胞持続性を評価する。有意な数のＴ細胞がＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴｃｍについて検出される（上のパネル）。対照的に、生存可能なＣＤ３＋ＩＬ１３－ゼータカインＴ細胞はごくわずかしか検出されない（下のパネル）。

【図12】Ａ～Ｄは、大きな確立された腫瘍についてのＣＡＲ＋Ｔ細胞送達（ｉ．ｃ．対ｉ．ｖ．）の経路を比較する実験の結果を示す。ＥＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ＋ＰＢＴ０３０－２ ＴＳｓ（１×１０^５）をＮＳＧマウスの右前脳内に移植した。１９及び２６日目に、マウスに５×１０^６ＣＡＲ＋ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋Ｔｃｍ（１１．８×１０^６全細胞；ｎ＝４）か、又はモックＴｃｍ（１１．８×１０^６細胞；ｎ＝４）のいずれかを、尾静脈を介してｉ．ｖ．注入した。あるいは、１９日目、２２日目、２６日目及び２９日目に、マウスに、１×１０^６ＣＡＲ＋ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋Ｔｃｍ（２．４×１０^６個の全細胞；ｎ＝４）か、又はモックＴｃｍ（２．４×１０^６細胞；ｎ＝５）のいずれかを、ｉ．ｃ．注入した。経時的な平均ｆｆＬｕｃフラックス（光子／秒）は、ｉ．ｃ．送達されたＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴｃｍは、１９日目の腫瘍の腫瘍退行を媒介する。比較すると、ｉ．ｖ．送達されたＴ細胞は、未処理又はモックＴｃｍ対照と比較して腫瘍負荷の減少を示さなかった（Ａ）。カプランマイヤー生存曲線は、ｉ．ｖ．投与したＣＡＲ＋Ｔｃｍで処置したマウスと比較して、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺＴｃｍでｉ．ｃ．処置したマウスの生存率の改善を示す（ｐ＝０．０００３対数ランク検定）（Ｂ）。ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺＴｃｍでｉ．ｖ．処置したマウス（Ｃ）対ｉ．ｃ．処置したマウス（Ｄ）の代表的なＨ＆Ｅ及びＣＤ３ ＩＨＣ。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ｉ．ｃ．処置した群においてのみ検出され、ｉ．ｖ．処置したマウスの場合、腫瘍又は周囲の脳実質においてＣＤ３＋細胞は検出されなかった。

【図13】Ａ及びＢは、腫瘍内（ｉ．ｃ．ｔ）か、又は脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）のいずれかの頭蓋内に注入されたＣＡＲ＋Ｔ細胞が、反対側の半球上の腫瘍に移動することができることを示す研究結果を示す図である。ＥＧＦＰ－ｆｆＬｕｃ＋ ＰＢＴ０３０－２ ＴＳｓ（１×１０^５）をＮＳＧマウスの左右の前脳部に定位移植した。６日目に、マウスに、１．０×１０^６ ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋Ｔｃｍを、右腫瘍部位において、ｉ．ｃ．注入した（１．６×１０^６全細胞；６３％ＣＡＲ；ｎ＝４）。多巣性神経膠腫実験モデルの模式図（Ａ）。ＣＤ３ ＩＨＣは、左右の腫瘍部位の両方に浸潤するＴ細胞を示す（Ｂ）。

【図14】ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋のアミノ酸配列を示す（配列番号１０）。

【図15】ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢζ［ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢζＴ２Ａ－ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７； ｐＦ０２６３０］（配列番号１２）及びＣＤ１９Ｒｏｐ＿ｅｐＨＩＶ７（ｐＪ０１６８３）（配列番号１３）の配列比較を示す。黄色の強調表示は、ＧＭＣＳＦシグナル配列（ＩＬ１３ｏｐ）を含むＩＬ１３最適化コドン領域を示す。強調表示は、ＩｇＧ４最適化コドン領域（ＩｇＧ４ｏｐ［Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ］）を示す。強調表示は、ＩｇＧ４ヒンジ領域（Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑ）内の予想される２つのアミノ酸変化を示す。強調表示は、ＣＤ４膜貫通型の最適化コドン領域を示す。強調表示は４１ＢＢ細胞質シグナル伝達領域（４１ＢＢ ｃｙｔｏ）を示す。灰強調表示は、３つのグリシンリンカー（ｇ３）を示す。灰色の強調表示は、ＣＤ３ゼータ最適化コドン領域（ｚｅｔａ ｏｐ）を示す。強調表示はＴ２Ａ配列（Ｔ２Ａ）を示す。強調表示は、切断型ＣＤ１９配列（ＣＤ１９ｔ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

詳細な説明
ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞（「ＴＣＭ ＣＤ４＋／ＣＤ８＋」細胞集団）を含むＴＣＭ細胞集団を以下に記載する。ＴＣＭ ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞集団の細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化され、かつ、遺伝子改変細胞を作製するため、例えばＣＡＲの発現を指示するＳＩＮレンチウイルスベクターで形質導入することができる。活性化／遺伝子改変された細胞は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５で、インビトロで増殖させることができ、かつ、その後用いるか、又は凍結保存した後で用いることができる。ＩＬ１３Ｒα２を標的とするＣＡＲを発現するためのＴＣＭ ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞集団の使用の例を記載する。

【0013】

以下の実施例で用いられるＣＡＲは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζと称される。このＣＡＲは、様々な重要な機能(features)を含み、ＩＬ１３α２への結合の特異性を改善するアミノ酸改変があるＩＬ１３α２リガンド；有益な共刺激を提供するためのＣＤ３ζと直列のＣＤ１３７（４－１ＢＢ）のドメイン；Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）による結合を低下させるようにＣＨ２領域（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）内の２つの部位で変異したＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。このＣＡＲ及び他のものは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後にＴ２Ａリボソームスキップ配列、及び細胞質シグナル伝達テイルが欠失している切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）が続くベクター（アミノ酸３２３で切断された）を用いて作製することができる。この配置により、ＣＤ１９ｔの同時発現で、遺伝子改変細胞を正確に測定することができ、かつ、遺伝子改変細胞をポジティブに選択しうる不活性で非免疫原性の表面マーカー、並びに、細胞の効率的な細胞追跡及び／又は、養子移植後のインビボでの治療用Ｔ細胞のイメージングを提供する。ＣＤ１９ｔの共発現は、臨床的に利用可能な抗体及び／又は治療細胞を選択的に除去するため、それによって自殺スイッチとして機能する免疫毒試薬を用いて、インビボでの形質導入細胞の免疫学的標的化用マーカーを提供する。

【0014】

神経膠腫（グリオーマ)は、ＩＬ１３受容体、及び特に高親和性ＩＬ１３受容体を発現する。しかし、ＩＬ１３受容体とは異なり、神経膠腫細胞は、ＩＬ４Ｒβ又はγｃ４４の必要条件とは無関係にＩＬ１３に結合することができるユニークなＩＬ１３Ｒα２鎖を過剰発現する。そのホモログＩＬ４と同様に、ＩＬ１３にはＣＮＳの外側に多面的(pleotropic)免疫調節活性がある。ＩＬ１３及びＩＬ４はともに、Ｂリンパ球によるＩｇＥ産生を刺激し、かつ、マクロファージによる前炎症性サイトカイン産生を抑制する。

【0015】

放射性標識ＩＬ１３でのオートラジオグラフィーを用いた詳細な研究は、研究されたほとんどすべての悪性神経膠腫組織で富化されているＩＬ１３結合を示した。この結合は、腫瘍セクション内で及び単一細胞分析において極めて均一である。しかしながら、ＩＬ１３Ｒα２ｍＲＮＡに特異的な分子プローブ分析は、正常な脳要素による神経膠腫特異的受容体の発現を検出せず、かつ、放射性標識ＩＬ１３によるオートラジオグラフィーも、正常なＣＮＳにおける特異的ＩＬ１３結合を検出できなかった。これらの研究は、共有されたＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４β／γｃ受容体が正常なＣＮＳにおいて検出可能に発現されないことを示唆する。したがって、ＩＬ１３Ｒα２は、神経膠腫の極めて特異的な細胞表面標的であり、かつ、神経膠腫の治療のために設計されたＣＡＲのための適当な標的である。

【0016】

しかし、広く発現されるＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４β／γｃ受容体複合体へのＩＬ１３ベースの治療分子の結合は、ＣＮＳ外側の正常組織に対する望ましくない毒性を媒介する可能性があるため、これらの薬剤の全身投与が制限される。天然グルタミン酸に対するチロシンのアミノ酸１３におけるＩＬ１３アルファヘリックスＡにおけるアミノ酸置換は、ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４β／γｃ受容体に対するＩＬ１３の親和性を選択的に低下させる。しかしながら、この変異体（ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）という）のＩＬ１３Ｒα２への結合は、野生型ＩＬ１３と比較して高まった。したがって、この最小限に改変されたＩＬ１３類似体は、グリオーマ細胞に対するＩＬ１３の特異性及び親和性を同時に高める。したがって、本明細書に記載されるＣＡＲは、アミノ酸１３に変異（ＥからＹ又はＥから何かほかのアミノ酸、例えばＫ又はＲ又はＬ又はＶなど）を含むＩＬ１３を含む（Ｄｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５：３１４３ｓのナンバリングによる）。しかしながら、天然の配列であるＩＬ１３も用いることができ、及び特に、改変Ｔ細胞を腫瘍塊に直接注射する等の局所的に投与する場合に有用でありうる。

【0017】

本明細書中に記載されるＣＡＲは、当技術分野で公知のいかなる手段によって産生され得るが、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて産生される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当該分野で公知の標準的な分子クローニング技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマーアシストライゲーション、部位特異的突然変異誘発など）によって調製され、完全なコード配列に組み立てることができる。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、適当な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、及び最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株を形質転換するために用いられる。

【実施例0018】

ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲの構築及び構造
有用なＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲの構造を以下に記載する。コドン最適化ＣＡＲ配列は、Ｆｃレセプター媒介認識モデルを大きく低下させる２つの突然変異（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）を含むＩｇＧ４ＦｃスペーサーであるＩＬ１３Ｒα１への潜在的結合を低下させるために、単一部位で突然変異した膜結合（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｔｅｔｈｅｒｅｄ）ＩＬ１３リガンド（Ｅ１３Ｙ）、ＣＤ４膜貫通ドメイン、共刺激４－１ＢＢ細胞質シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。Ｔ２Ａリボソームスキップ配列は、このＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ配列を、不活性で非免疫原性の細胞表面検出／選択マーカーであるＣＤ１９ｔから分離する。このＴ２Ａ結合は、単一の転写産物からのＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ及びＣＤ１９ｔの両方の座標発現をもたらす。図１Ａは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ－Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ構築物をコードする２６７０ヌクレオチドのオープンリーディングフレームの概略図である。この図では、ＩＬ１３Ｒα２特異的リガンドＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）、ＩｇＧ４（ＥＱ）Ｆｃ、ＣＤ４膜貫通、４－１ＢＢ細胞質シグナル伝達、３－グリシンリンカー及びＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺＣＡＲのＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、並びにＴ２Ａリボソームスキップ及びＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺＣＡＲの切断型ＣＤ１９配列は、すべて示されている。ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺＣＡＲ及びＣＤ１９ｔの表面発現を駆動するヒトＧＭ－ＣＳＦ受容体α及びＣＤ１９シグナル配列も示される。したがって、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ－Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ構築物は、ＩＬ１３Ｒα２特異的ヒンジ最適化、共刺激性キメラ免疫レセプター配列（ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺという）、リボソームスキップＴ２Ａ配列及びＣＤ１９ｔ配列を含む。

【0019】

ヒトＧＭ－ＣＳＦ受容体αリーダーペプチドとＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）リガンド５Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７Ｑ改変ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ（二重変異がＦｃＲ認識を妨害する）、ＣＤ４膜貫通、４－１ＢＢ細胞質シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン配列との融合によりＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ配列を生成した。この配列は、コドン最適化の後に新規にデノボ合成された。Ｔ２Ａ配列は、Ｔ２Ａ含有プラスミドの消化から得た。ＣＤ１９ｔ配列は、リーダーペプチド配列にまたがるものから、ＣＤ１９含有プラスミドの膜貫通成分（すなわち、塩基対１～９７２）まで得られた。全３つの断片、１）ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ、２）Ｔ２Ａ、及び３）ＣＤ１９ｔを、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターの多重クローニング部位にクローン化した。適当な細胞にトランスフェクトされると、ベクターは図１Ｂに模式的に示された配列を宿主細胞ゲノムに組み込む。図１Ｃは、９５１５塩基対ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７プラスミドそれ自体の模式図を提供する。

【0020】

図２に概略的に示すように、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ ＣＡＲは、いくつかの重要な点において、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）Ｒ－ゼータカインというすでに報告されたＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲとは異なる（非特許文献４）。ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）－ゼータカインは、示されるように、ＩＬ１３Ｒα２特異的ヒトＩＬ１３ムテイン（ｈｕＩＬ－１３（Ｅ１３Ｙ））、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃスペーサー（ｈｕγ４Ｆｃ）、ヒトＣＤ４膜貫通（ｈｕＣＤ４ ｔｍ）及びヒトＣＤ３ζ鎖細胞質ｈｕＣＤ３ζｃｙｔ）部分から構成される。対照的に、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ）には、ＩｇＧ４スペーサーのＣＨ２ドメインに位置する２つの点変異、Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑ、及び共刺激４－１ＢＢ細胞質ドメイン（４－１ＢＢ細胞）がある。対照的に、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ）には、ＩｇＧ４スペーサーのＣＨ２ドメインに位置する２つの点変異、Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑ、及び共刺激４－１ＢＢ細胞質ドメイン（４－１ＢＢ細胞）がある。

【実施例0021】

ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲの発現に用いられるｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｐＨＩＶ７プラスミドは、臨床ベクターＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７がシティオブホープ（ＣＯＨ）のＴ細胞治療研究研究所（ＴＣＴＲＬ）で得られた親プラスミドである。ＣＡＲの発現に用いたｅｐＨＩＶ７ベクターは、ｐＨＩＶ７ベクターから作製した。重要なことに、このベクターは、ヒトＥＦ１プロモーターを用いてＣＡＲの発現を駆動する。ベクターの５’及び３’配列はいずれも以前にＨＸＢｃ２プロウイルスから派生したように、ｐｖ６５３ＲＳＮ由来であった。ポリプリントラクトフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙからのＨＩＶ－１株ｐＮＬ４－３由来であった。ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列はすでに報告されている。

【0022】

ｐＨＩＶ７の構築を図３に概略的に示す。簡潔には、介在するＳＬ３－ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）があるｇａｇ－ｐｏｌプラス５’及び３’長末端反復配列（ＬＴＲ）由来６５３ｂｐを含むｐｖ６５３ＲＳＮは、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。：工程１では、５’ＬＴＲからｒｅｖ－応答エレメント（ＲＲＥ）の配列がｐ５‘ＨＩＶ－１ ５１となり、次に５’ＬＴＲがＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去することによって改変され、最初にＣＭＶエンハンサーに連結し、次にＳＶ４０複製起点に連結した（ｐ５‘ＨＩＶ－２）。工程２では、３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングして、ｐ３’ＨＩＶ－１を作製した後、３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターにおける４００ｂｐの欠失を行い、ＨＩＶ Ｕ３中のシス調節エレメントを除去し、ｐ３’ＨＩＶ－２を形成した。工程３では、ｐ５’ＨＩＶ－３及びｐ３’ＨＩＶ－２から単離した断片をライゲーションしてｐＨＩＶ－３を作製した。工程４では、ｐ３’ＨＩＶ－３を生成するために余分な上流のＨＩＶ配列を除去することによりｐ３’ＨＩＶ－２をさらに修飾し、ｐ３’ＨＩＶ－３にＷＰＲＥを含む６００ｂｐのＢａｍＨＩ－ＳａｌＩ断片を添加してｐ３’ＨＩＶ－４を作製した。工程５では、ｐＨＩＶ－３ ＲＲＥをＰＣＲによりサイズを減少させ、ｐＨＩＶ－３（示さず）由来５’断片に、及びｐ３’ＨＩＶ－４ライゲーションして、ｐＨＩＶ－６を作製した。工程６では、ＨＩＶ－１ ｐＮＬ４－３（５５）由来のｃＰＰＴ ＤＮＡフラップ配列を含む１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ－ＢａｍＨＩ断片をｐＮＬ４－３から増幅し、ｐＨＩＶ６のＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列の間に配置してｐＨＩＶ－７を作製した。この親プラスミドｐＨＩＶ７－ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）を用いて、４－プラスミド系を用いて親ベクターをパッケージングした。

【0023】

ウイルスゲノムをベクターに効率的にパッケージングするためには、パッケージングシグナル、ｐｓｉΨが必要である。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の輸送及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳類細胞におけるレンチウイルスベクターの形質導入効率を高めることが実証された。

【0024】

ウイルスベクターの産生に必要なヘルパー機能は、３つの別個のプラスミドに分割され、組換えによる複製コンピテントレンチウイルスの生成の確率を低下させる。：
１）ｐＣｇｐは、ウイルスベクターアセンブリに必要なｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする。
２）ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージングのためにウイルスゲノムの輸送を助けるためにＲＲＥ配列に作用するＲｅｖタンパク質をコードする。
３）ｐＣＭＶ－Ｇは、ウイルスベクターの感染性のために必要とされる水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする。

【0025】

ｐＨＩＶ７にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性の領域は、
ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列中に位置する約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；
３種全てのヘルパープラスミド中のＣＭＶプロモーター配列；及び
ヘルパープラスミドｐＣｇｐ中のＲＲＥ配列
を含む。多数の組換え事象が必要であるため、これらの領域の相同性に起因して複製コンピテント組換えウイルスが生成される可能性は極めて低い。さらに、得られたいずれの組換え体にも、レンチウイルス複製に必要な機能的ＬＴＲ及びｔａｔ配列はないであろう。

【0026】

ＣＭＶプロモーターをＥＦ１α－ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦ１ｐ）で置換し、新しいプラスミドをｅｐＨＩＶ７と命名した（図４）。ＥＦ１ｐは５６３ｂｐを有し、ＣＭＶプロモーターを切除した後、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを用いてｅｐＨＩＶ７に導入した。

【0027】

野生型ウイルスの病原性に必要であり、標的細胞の生産的感染に必要なｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖが削除されたレンチウイルスゲノムをこの系から除いた。さらに、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ－Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７ベクター構築物はインタクトな３’ＬＴＲプロモーターを含有しないので、標的細胞における発現及び逆転写ＤＮＡプロウイルスゲノムには不活性ＬＴＲがある。この設計の結果、ＨＩＶ－１由来配列はプロウイルスから転写されず、治療配列のみが各プロモーターから発現される。ＳＩＮベクターにおいてＬＴＲプロモーター活性を除去すると、宿主遺伝子が意図せず活性化されうることを有意に低下させることが期待される（５６）。表４は、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ－Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７に存在する種々のレギュレーター要素をまとめたものである。

【0028】

表４： ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢＺ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７の機能的要素

【表1】