特開 2023-52647 標的治療免疫調節のためのＭＨＣクラスＩｂ分子及びペプチドの組合せ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023052647

(43)【公開日】2023-04-11

(54)【発明の名称】標的治療免疫調節のためのＭＨＣクラスＩｂ分子及びペプチドの組合せ

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20230404BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20230404BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230404BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230404BHJP

   C07K 14/74 20060101ALI20230404BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230404BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230404BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230404BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230404BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230404BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20230404BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230404BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 H

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P37/02

A61P37/08

A61P37/06

A61P25/00

A61P19/02

A61P17/00

A61P1/04

A61P27/02

A61P9/00

A61P7/00

A61P17/06

A61P3/10

A61K48/00

C07K14/74 ZNA

C12N15/12

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/00 C

C12N15/63 Z

【審査請求】有

【請求項の数】18

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023010057

(22)【出願日】2023-01-26

(62)【分割の表示】P 2020515282の分割

【原出願日】2018-05-18

(31)【優先権主張番号】17172444.6

(32)【優先日】2017-05-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】519417621

【氏名又は名称】ブリュッテル， ヴァレンティン

(71)【出願人】

【識別番号】510232393

【氏名又は名称】ユリウス・マクシミリアンス－ウニヴェルジテート・ヴュルツブルク

【氏名又は名称原語表記】Ｊｕｌｉｕｓ Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(72)【発明者】

【氏名】ブリュッテル， ヴァレンティン

(72)【発明者】

【氏名】ヴィシュフーセン，ヨルク

(57)【要約】

【課題】
本発明は、ＭＨＣクラスＩｂ分子としても知られる、非古典的主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の特定のペプチドとの組合せによる、治療的使用に関する。
【解決手段】
本発明は、より具体的には、非古典的ＭＨＣクラスＩｂ分子の１又はそれ以上のドメインを含むタンパク質との組合せ、又はＭＨＣクラスＩｂ分子とその受容体との相互作用を妨げる分子との組合せによる、特定のペプチドの標的免疫調節作用に関する。本発明はまた、当該タンパク質の産生方法、当該タンパク質を含む医薬組成物、並びに、がん及び感染症を含む抗原特異的免疫反応が有益であるか、又は自己免疫疾患、器官／組織拒絶、医薬化合物に対する免疫反応又は生殖障害を含む抗原特異的免疫反応が有害な、病状の治療のためのその使用に関する。さらに、本発明はまた、抗原特異的寛容誘導中のＭＨＣクラスＩｂ分子に対する新規な作用機序を解明したものであるため、抗原特異的免疫寛容の誘導が望まれるが、それがこのメカニズムにより生理学的に阻害される場合に、当該メカニズムを阻害する方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）単離ヒトＭＨＣクラスＩｂ分子、又はペプチド抗原をＴ細胞に提示しうる単離ポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドは、ヒトＭＨＣクラスＩｂ分子の［α］３ドメイン又はヒトＭＨＣクラスＩｂ分子の［α］３ドメインの誘導体を含み、前記誘導体はＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合することができ、
ｂ）前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドにより提示されるペプチド抗原、
を含む、医薬組成物。

【請求項2】

前記ａ）のペプチド抗原を提示しうるポリペプチドを含み、かつ、前記ポリペプチドが、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端に、ＭＨＣクラスＩａ分子の［α］１ドメイン及び［α］２ドメイン、その後に、前記［α］３ドメイン又は前記誘導体をその順序で含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するか、又は、
前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか又は少なくとも９２％の同一性を有するか、又は、
前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか又は少なくとも９４％の同一性を有するか、又は、
前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか又は少なくとも９６％の同一性を有するか、又は、
前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか又は少なくとも９８％の同一性を有するか、又は、
前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９９％の同一性を有するか、又は、
前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又は前記ａ）のペプチド抗原を提示しうるポリペプチドが、表面プラズモン共鳴分光法による測定で４０μＭ未満の親和定数ＫｄでＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうるか、又は、
前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又は前記ａ）のペプチド抗原を提示しうるポリペプチドが、表面プラズモン共鳴分光法による測定で２０μＭ未満の親和定数ＫｄでＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる、か、又は、
前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又は前記ａ）のペプチド抗原を提示しうるポリペプチドが、表面プラズモン共鳴分光法による測定で１０μＭ未満の親和定数ＫｄでＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

さらに、配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、又は９５％、又は９８％同一である配列、を含むポリペプチドドメインを含むか、又は前記ポリペプチドドメインは、好ましくは、前記ａ）のペプチド抗原を提示しうるポリペプチドに含まれる；及び／又は、
前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又は前記ａ）のペプチド抗原を提示しうる前記ポリペプチドが、さらに、１又はそれ以上のリンカー配列、又は、（ＧＧＧＳ）ｎリンカー配列を含むか、又は
前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又は前記ａ）のペプチド抗原を提示しうるポリペプチドが、二量体又は多量体である；及び／あるいは、
前記ペプチド抗原の長さが、７～１１アミノ酸長、又は、８～１０アミノ酸長である、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子を含み、かつ、前記ＭＨＣクラスＩｂ分子がＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ又はＨＬＡ－Ｇであり、又は、前記ＭＨＣクラスＩｂ分子は、ヒトＭＨＣクラスＩｂ分子である、請求項１及び３～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記ｂ）のペプチド抗原が、前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドと共有結合するか、又は、
前記ｂ）のペプチド抗原及び前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドがペプチド結合を介して共有結合し、かつ、単一のポリペプチド鎖の部分である、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

ペプチド抗原を提示しうる単離組換えポリペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端に、以下に、
ｉ）前記組換えポリペプチドにより提示されるペプチド抗原；
ｉｉ）場合によっては、第１のリンカー配列；
ｉｉｉ）場合によっては、ヒトβ２－マイクログロブリンの配列、又は配列番号６で表されるヒトβ２－マイクログロブリンのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、を含むヒトポリペプチドドメインの配列；
ｉｖ）場合によっては、第２のリンカー配列；
ｖ）場合によっては、ＭＨＣ分子の［α］１ドメイン；
ｖｉ）場合によっては、ＭＨＣ分子の［α］２ドメイン；
ｖｉｉ）ＭＨＣクラスＩｂ分子の［α］３ドメイン、又はＭＨＣクラスＩｂ分子の［α］３ドメインのＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる誘導体；かつ、
ｖｉｉｉ）場合によっては、プロテアーゼ切断部位；かつ、
ｉｘ）場合によっては、アフィニティータグ；
をその順序で含む、組換えポリペプチド。

【請求項9】

前記ｖ）の前記［α］１ドメイン及び前記ｖｉ）の［α］２ドメインが、ＭＨＣクラスＩａ分子由来である、請求項８に記載の組換えポリペプチド。

【請求項10】

前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するか、又は、
前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９２％の同一性を有するか、又は、
前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９４％の同一性を有するか、又は、
前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９６％の同一性を有するか、又は、
前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９８％の同一性を有するか、又は、
前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９９％の同一性を有するか、又は、
前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一である、請求項８又は９に記載の組換えポリペプチド。

【請求項11】

前記ポリペプチドが、表面プラズモン共鳴による測定で４０μＭ未満の親和定数ＫｄでＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうるか、又は、
前記ポリペプチドが、表面プラズモン共鳴による測定で２０μＭ未満の親和定数ＫｄでＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうるか、又は、
前記ポリペプチドが、表面プラズモン共鳴による測定で１０μＭ未満の親和定数ＫｄでＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる、請求項８～１０のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項12】

前記ポリペプチドが二量体又は多量体である；及び／又は、
前記ｉ）のペプチド抗原配列の長さが７～１１アミノ酸長、又は８～１０アミノ酸長である；及び／又は、
前記ｉ）～ｖｉｉ）を全て含むか、又は、前記ｖｉｉｉ）～ｉｘ）を含まず、又は前記ｉ）～ｉｘ）を全て含み；及び／又は、
さらに、Ｎ末端分泌シグナルペプチド配列を含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項13】

医薬に用いるための、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の単離組換えポリペプチド。

【請求項14】

被験体におけるペプチド抗原特異的免疫調節のための方法に用いる、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の単離組換えポリペプチドであって、前記免疫調節は、前記医薬組成物又は前記組換えポリペプチドに含まれる前記ペプチド抗原に特異的であり、場合によっては、
前記免疫調節のための方法が、前記医薬組成物又は前記組換えポリペプチドに含まれる前記ペプチド抗原に対する免疫学的寛容を誘導する、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項８～１２のいずれか一項に記載の単離組換えポリペプチド。

【請求項15】

免疫調節のための方法が、免疫寛容を誘導する方法、免疫自己免疫疾患の抑制のための方法、アレルギーの抑制のための方法、生物学的製剤に対する免疫反応の抑制のための方法、胚性抗原に対する免疫反応の抑制のための方法、又は移植された細胞、組織若しくは器官に対する免疫反応、を抑制する方法であり、ここで、
前記自己免疫疾患が複数の器官、ホルモン産生器官、神経、関節、皮膚、胃腸系、眼、血液成分又は血管に影響を及ぼす、
請求項１３又は１４に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。

【請求項16】

前記方法が、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、強皮症、視神経脊髄炎又は１型糖尿病の免疫応答を抑制する方法である、請求項１４に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。

【請求項17】

組換え宿主細胞を、前記核酸分子を発現させうる条件下で培養し、産生したポリペプチドを回収することを含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドの製造方法であって、ここで、前記組換え宿主細胞は、請求項８～１２のいずれか一項に記載の単離組換えポリペプチドをコードする核酸分子を含み、場合によっては、前記核酸はベクターである、製造方法。

【請求項18】

Ａ）ペプチド抗原に対する免疫学的寛容を誘導する方法が、さらに、ペプチド薬物の治療を含み、前記ペプチド抗原が：１）前記ペプチド薬物と同一であるか、又は２）前記ペプチド薬物の断片であるか、又は３）前記ペプチド薬物に対する免疫学的寛容を誘導しうる前記ペプチド薬物の断片の誘導体であり、ここで、前記ペプチド薬物は、前記ペプチド薬物そのものの形態で投与されるか、若しくは、前記ペプチド薬物をコードする遺伝子による遺伝子治療により投与されるか；又は、
Ｂ）ペプチド抗原に対する免疫学的寛容を誘導する方法が、さらに、タンパク質薬物の治療を含み、前記ペプチド抗原が１）前記タンパク質薬物の断片であるか、又は２）前記タンパク質薬物に対する免疫学的寛容を誘導しうる前記タンパク質薬物の断片の誘導体であり；ここで、前記ペプチド薬物は、前記ペプチド薬物そのものの形態で投与されるか、若しくは、前記ペプチド薬物をコードする遺伝子による遺伝子治療により投与される；
請求項１４に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ペプチド抗原と組合せた非古典的ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子（ＭＨＣクラスＩｂ分子ともいう）の治療上の使用に関する。本発明は、より具体的には、非古典的ＭＨＣクラスＩｂ分子の１又はそれ以上のドメインを含むタンパク質と併用する、又は、ＭＨＣクラスＩｂ分子のその受容体への結合を阻害する分子と併用する、ペプチド抗原に関する。本発明はまた、当該タンパク質の産生方法、当該タンパク質を含む医薬組成物、並びに、がん及び感染症を含む抗原特異的免疫反応が有益であるか、又は自己免疫疾患、器官／組織拒絶、医薬化合物に対する免疫反応又は生殖障害を含む抗原特異的免疫反応が有害な、病状の治療のためのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原には、クラスＩ抗原（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、クラスＩＩ抗原（ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲ）、クラスＩＩＩ抗原の３種類が知られている。クラスＩ抗原としては、従来型／古典型ＭＨＣ Ｉａ抗原、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ、並びに非古典的ＭＨＣ Ｉｂ抗原であるＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ及びＨＬＡ－Ｇがあげられる。クラスＩ抗原は３つの球状ドメイン（［α］１、［α］２及び［α］３）を含む。ＭＨＣ Ｉ複合体は、さらに、β２－マイクログロブリンと、［α］１ドメイン及び［α］２ドメインを含むペプチド結合溝に結合した提示されたペプチドとを含む。このように、ペプチド添加された従来のＭＨＣ Ｉａ分子は、提示細胞の溶解をもたらす可能性があるペプチド特異的Ｔ細胞媒介免疫応答を開始しうる。このメカニズムはワクチン接種戦略に不可欠であり、特定の抗原に対する免疫反応を誘導するために、より短い又は長いペプチド（非特許文献１）、抗原をコードする核酸（非特許文献２）、タンパク質、又はしばしば弱毒化生物が開発され、臨床的に用いられている。抗原としては、ウイルス性、細菌性、又は腫瘍関連抗原があげられてよい。

【0003】

ほとんどのヒト組織で発現する従来型のＭＨＣ Ｉａ分子とは異なり、ＨＬＡ－Ｇ等の非古典的なＭＨＣ Ｉｂ抗原は著しく限定された組織でしか発現を示さない。生理学的に、高レベルのＨＬＡ－Ｇは、正常なヒト胎盤の絨毛外栄養膜により発現され、母体の免疫系から胎児を保護する免疫調節剤として機能する可能性が高い（母親による拒絶反応の欠如）。この仮説に従って、従前の研究では、ＨＬＡ－Ｇタンパク質は増殖性Ｔリンパ球細胞応答、細胞傷害性Ｔリンパ球媒介細胞溶解、及びＮＫ細胞媒介細胞溶解等の同種応答を阻害しうることが示されてきた（非特許文献３；非特許文献４）。

【0004】

ＨＬＡ－Ｇ遺伝子の配列が記載されており（例えば、非特許文献５及び６）、４３９６塩基対を含む。この遺伝子は、８のエクソン、７のイントロン及び３’非翻訳末端から構成され、これは各々エクソン１：シグナル配列、エクソン２：［α］１細胞外ドメイン、エクソン３：［α］２細胞外ドメイン、エクソン４：［α］３細胞外ドメイン、エクソン５：膜貫通領域、エクソン６：細胞質ドメインＩ、エクソン７：細胞質ドメインＩＩ（非翻訳）、エクソン８：細胞質ドメインＩＩＩ（非翻訳）及び３’非翻訳領域に対応する。ＨＬＡ－Ｇの７つのアイソフォームが同定されており、そのうち４つは膜結合型（ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３及びＨＬＡ－Ｇ４）、３つは可溶性（ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６及びＨＬＡ－Ｇ７）である（例えば、非特許文献７参照）。成熟ＨＬＡ－Ｇ１タンパク質アイソフォームは、３つの外部ドメイン（α１－α３）、膜貫通領域及び細胞質ドメインを含み、成熟ＨＬＡ－Ｇ５タンパク質アイソフォームは、３つの外部ドメイン（α１－α３）及びイントロン４がコードする短い配列を含むが、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインはない。全ての可溶性ＨＬＡ－Ｇアイソフォームには膜貫通ドメインと細胞質ドメインがなく、膜結合型アイソフォームの切断によっても産生される。

【0005】

ＨＬＡ－Ｇは、Ｋｉｒ２ＤＬ４、ＩＬＴ２（ＬＩＬＲＢ１）及びＩＬＴ４（ＬＩＬＲＢ２、非特許文献８）等の特異的受容体とペプチド非依存的に相互作用する。Ｔ細胞に対するＨＬＡ－Ｇの最も顕著な免疫抑制作用には、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４が介在する。当該受容体は、ＨＬＡ－Ｇに含まれる［α］－３ドメイン及びＨＬＡ－Ｆ（非特許文献９）等の他のＭＨＣクラスＩｂ分子と相互作用するため、代表的なＭＨＣクラスＩｂ分子ＨＬＡ－Ｇで観察される［α］－３ドメイン依存性の効果は、代替するＭＨＣクラスＩｂ分子によって誘導されうる。

【0006】

さらに、ＭＨＣクラスＩｂ分子は、それらの［α］１及び［α］２ドメインを介してペプチドを提示することが知られている。当該ペプチドは、通常、８～１０個のアミノ酸からなり、特定のアンカー残基を含有する（非特許文献１０、非特許文献１１）。しかしながら、本発明者らの知る限り、ヒトＭＨＣクラスＩｂ分子と同種のＴ細胞受容体とのペプチド特異的相互作用は、まだ研究されていない。同様に、動物モデルの明確なデータはない。Ｓｗａｎｓｏｎらは、マウスＭＨＣ Ｉｂ分子がペプチド特異的免疫応答を誘導する可能性を示唆し（非特許文献１２）、Ｗａｎｇらは、マウスＱａ２分子によるペプチド特異的免疫応答の抑制について報告する。（非特許文献１３）。しかしながら、ヒトとマウスのＭＨＣ Ｉｂ分子は著しく異なる（非特許文献１４）。ＨＬＡ－Ｇ及びＱａ－２は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ参照配列Ｑ５ＲＪ８５（Ｑ５ＲＪ８５＿ＨＵＭＡＮ）及びＰ７９５６８（Ｐ７９５６８＿ＭＯＵＳＥ）のプロテインブラストを用いて解析した配列同一性のわずか６７％しか共有していないため、Ｑａ－２から導かれた結論は細心の注意を払って取り扱わなければならず、ヒトＨＬＡ－Ｇには適用できるか否かの予測はできない。基礎科学及び前臨床研究におけるＨＬＡ－Ｇ機能の研究に適するマウスモデルを特定する著しい困難性が、最近総説論文（非特許文献１５）に概説されている。

【0007】

すでに利用可能なデータに基づいて、ＨＬＡ－Ｇタンパク質は、同種又は異種の臓器（器官）／組織移植における移植片拒絶反応の治療に用いうることが提唱されている。ＨＬＡ－Ｇタンパク質はまた、血液悪性腫瘍（特許文献１）、炎症性疾患（特許文献２）、及びより一般的には免疫関連疾患の治療にも提案されている。さらに、ＨＬＡ－Ｇは、しばしばヒト腫瘍により発現され（非特許文献１６）、腫瘍微小環境において非特異的に免疫応答を抑制する免疫抑制性免疫チェックポイント分子のように機能すると考えられている（非特許文献１７）。しかし、これらの研究のうち、ＨＬＡ－Ｇに提示されたペプチドを分析したものはない。その結果、提示されたペプチドが観察されたＭＨＣクラスＩｂ介在効果を誘導しうるか否かという疑問は提起されてこなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】欧州特許出願公開第１０５４６８８号明細書

【特許文献2】欧州特許出願公開第１１８９６２７号明細書

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１１ Ｓｅｐ；１７（５）：３４３－３５０

【非特許文献2】Ｒｅｓｔｉｆｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００ Ｊａｎ；７（２）：８９－９２

【非特許文献3】Ｒｏｕａｓ－Ｆｒｅｉｓｓ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９７，９４，５２４９－５２５４

【非特許文献4】Ｒｏｕａｓ－Ｆｒｅｉｓｓ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ １９９９，ｖｏｌ９，３

【非特許文献5】Ｇｅｒａｇｈｔｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，９１４５－９１４９

【非特許文献6】Ｅｌｌｉｓ； ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９０，１４４，７３１－７３５

【非特許文献7】Ｃａｒｏｓｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００８，ｖｏｌ．１１１，ｐ４８６２

【非特許文献8】Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００５ Ｍａｒ１；１０２（９）：３３６０－５

【非特許文献9】Ｌｅｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００．３０：３５５２－３５６１

【非特許文献10】Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．１９９６ Ｍａｒ１；６（３）：３０５－１４

【非特許文献11】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１９９５ Ｎｏｖ；３（５）：５９１－６００

【非特許文献12】Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉｂ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｏｎｆｅｒｓ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ＪＥＭ ２００８

【非特許文献13】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．３６０６４，３１．Ｏｃｔ．２０１６

【非特許文献14】Ｐｒａｔｈｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１４ Ａｐｒ－Ｊｕｎ；２０（２）：１２９－１４１

【非特許文献15】Ｎｇｕｙｅｎ－Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６

【非特許文献16】Ｃａｒｏｓｅｌｌａ ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｍａｒ；２９（３）：１２５－３２

【非特許文献17】Ｃａｒｏｓｅｌｌａ ＥＤ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１２７：３３－１４４

【発明の概要】

【発明を解決しようとする課題】

【0010】

ヒトＭＨＣクラスＩｂ分子を研究する全てのマウスモデルに固有の限界を考慮すると、生体内でＭＨＣクラスＩｂ依存性機能を予測しうる機構を理解するためには、当該分子のヒトＴ細胞への作用をインビトロで探索する必要がある。抗原特異的免疫応答との関連では、細胞傷害性Ｔ細胞及び寛容原性Ｔ細胞の調節が重要である。細胞傷害性ＣＤ８＋エフェクタＴ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬｓ）及び調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はいずれもＭＨＣ分子上に提示された抗原ペプチドを検出しうるが、ＣＴＬはそれらの同種抗原を発現する細胞を破壊でき、一方、調節性Ｔ細胞は、特にそれらの同種抗原が各組織により提示された場合に、組織防御的である（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００９ ＰＮＡＳ ｖｏｌ．１０６ ｎｏ．４５，１９０７８－８３）。重要なことは、抗原特異的調節性Ｔ細胞が標的組織中の同種抗原により活性化されると、バイスタンダー効果を発揮し、他の抗原に対する免疫応答を抑制しうることである。従って、ＣＴＬは、がん患者に有益でありうるが（Ｇａｊｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，１０１４－１０２２，２０１３）、自己免疫疾患では有害である。免疫応答を抑制するＴｒｅｇ細胞の機能はその反対である。Ｔｒｅｇの不十分な活性又は機能は、マウスで重度の自己免疫疾患を引き起こし、ヒトの自己免疫疾患にも関連している可能性がある（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（６）：２２５０－２２６０）。したがって、細胞傷害性Ｔ細胞の阻害（又は阻害解除）及びＴｒｅｇの誘導（又は阻害）のための戦略が必要である。

【0011】

現在の臨床診療では、病理学的免疫応答により引き起こされる疾患（例えば、自己免疫疾患）は、通常、標的抗原とは無関係に免疫応答を抑制する治療薬で治療されるが、これは、重篤で、しばしば用量を制限する副作用を誘発し、日和見感染のリスクが高まる。従って、当該疾患の治療のための手段及び使用が改善される必要がある。その結果、当技術分野では、より標的化された抗原特異的な手段による免疫系の治療的調節のための改良された手段及び用途が必要とされている。

【0012】

一方、がんを含む、特定の抗原に対する免疫応答が望まれる疾患の治療のための手段及び使用も改善される必要である。例えば、がん免疫療法について報告されているワクチン接種アプローチの多くは、がんにより発揮される免疫抑制メカニズムのために効果がないことが示されている。従って、がんを含む当該疾患の治療のための手段及び使用も改善される必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者らは驚くべきことに、ＨＬＡ－Ｇ等のヒトＭＨＣクラスＩｂ分子には、提示されたペプチド抗原に対して抗原特異的寛容の誘導能があることを見出した。従って、抗原ペプチド特異的免疫応答を誘導する古典的なヒトＭＨＣクラスＩａ分子の構造及び配列は同様であるが、本発明によれば、ＭＨＣクラスＩｂ分子を有利に用いることができ、抗原特異的に免疫応答を抑制しうる。特定の抗原に対する免疫応答の抗原特異的抑制は、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を除去するか、又は、自己免疫攻撃を受けやすい組織で発現する各々の自己抗原又は他の標的抗原のいずれかを認識する抗原特異的調節性Ｔ細胞を誘導することにより誘導しうる。上記によれば、本発明者らは、例示的なヒトＭＨＣクラスＩｂ分子を用いて、（図１に例示的に示すように）細胞傷害性エフェクタＴ細胞を除去することができ、（図７に例示的に示すように）寛容性調節Ｔ細胞を抗原ペプチド特異的に誘導しうることを示した。非限定的な実施形態では、当該効果は、特定のペプチド抗原を膜結合ＭＨＣクラスＩｂ分子又は可溶性ＭＨＣクラスＩｂ分子のいずれかと組合せることで達成しうる。一方、抗原特異的免疫応答の誘導が望まれる状況では、ＭＨＣクラスＩｂ関連免疫寛容を破壊する必要がある。本発明者らは、ヒトＭＨＣ Ｉｂ分子の当該受容体への結合を遮断する薬剤を介してこれを達成しうることを見出した。

【0014】

従って、本発明によれば、ＭＨＣクラスＩｂ分子と組み合わされたペプチドは、有利には、抗原特異的又は組織特異的な免疫応答を抑制するために用いられうる。標的抗原によらず免疫応答を抑制する多くの従来の治療薬では、その特異性の欠如により重度で用量制限的な副作用が誘発され、日和見感染のリスクが高まるため、それらと比較すると、これは有意な利点である。

【0015】

さらに、本発明者らは、驚くべきことに、本発明による免疫応答の抑制のために、天然に存在するＭＨＣクラスＩｂ分子以外の分子、特に、ＭＨＣクラスＩｂ分子の少なくとも１つのドメイン、好ましくは、ＭＨＣクラスＩｂ分子の少なくとも［α］３ドメインのみを含むポリペプチドを用いうることを見出した。図７及び図８に例示するように、可変クラスＩａ分子の［α］１及び［α］２ドメインは、ヒトＭＨＣクラスＩｂ分子の［α］３ドメインと生産的に組合せることができ、それにより当該抗原により提示されるペプチドに対する免疫応答が抑制される。

【0016】

従って、本発明によれば、例えば、ＭＨＣクラスＩｂ分子の免疫抑制性［α］３ドメインを、例えば、ＭＨＣクラスＩ［α］１及び２ドメインにより提示される標的抗原と組合せて用いることは、多くの自己免疫疾患において有益であろう。

【0017】

一方、本発明者らの新たな驚くべき知見は、ＭＨＣクラスＩｂ分子により誘導される抗原特異的免疫応答の抑制が、ＭＨＣクラスＩｂ分子の受容体への結合を妨げる薬剤により回復されうることも示す。従って、本発明によれば、ＭＨＣクラスＩｂ分子に対する抗体（図２に例示）又はＩＬＴ２及びＩＬＴ４を含むそれらの受容体（図１に例示）等の阻害剤は、有利には、特定の抗原に対する免疫応答が望まれる疾患の治療に用いうる。これらには、胃がん、胃腸間質がん、頭頸部がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰部がん、膣がん、尿路上皮がん、精巣がん、大腸がん、膵臓がん、皮膚がん及び肉腫（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｉｃａｌｇｅｎｏｍｅ．ｋｒｉｂｂ．ｒｅ．ｋｒ／ＧＥＮＴ／ｓｅａｒｃｈ／ｖｉｅｗ＿ｒｅｓｕｌｔ．ｐｈｐを参照）等のがん、並びにトリパノソーマ症（例えば、Ｇｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１６ Ｎｏｖ．１；６３（９）：１１８９－１１９７を参照）、サイトメガロウイルス感染（例えば、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１９９７ Ａｕｇ；（２）：２７３－８２を参照）、ＨＴＬＶ－１感染（例えば、Ｃｉｌｉａｏ Ａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１６ Ｏｃｔ；９７（１０）：２７４２－２７５２を参照）、Ｃ型肝炎感染（例えば、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ．２０１６ Ａｐｒ ２６；２２：１３９８－４０２を参照）、又は熱帯熱マラリア感染（例えば、Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｇｅｎｅｔ Ｅｖｏｌ．２０１３ Ｊｕｎ；１６：２６３－９参照）を含むが、感染症はこれらに限定されない。

【0018】

選択された抗原に対する特異的免疫応答を最初に誘導する必要がある状況では、ペプチド若しくはタンパク質、若しくは弱毒化病原体、又はタンパク質をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡを含むワクチンが、当技術分野で通常用いられる。しかし、当該ワクチン接種は、反応を誘発できないか、望ましくない耐性を誘発する場合すらある（非特許文献１）。腫瘍細胞（非特許文献１６）及びウイルス感染細胞（Ｒｉｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；５：５９２）は、ＭＨＣクラスＩｂ分子上のＨＬＡ－Ｇ抗原提示等のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現することから、ＭＨＣクラスＩｂ分子の提示はこの障害の原因となりうる。従って、本発明によれば、ＭＨＣクラスＩｂ分子の受容体への結合を特異的に遮断する薬剤を用いて、特異的抗原性タンパク質又はペプチドを用いてペプチド特異的又はタンパク質特異的免疫応答を誘導する治療の有効性を高めることができる。これには、外部から与えられたワクチンに基づく治療を含むが、死にかけている腫瘍細胞から放出された抗原性物質が、放射線療法又は化学療法等の抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導しうる治療にも拡張することができる（例えば、当該治療については、Ｚｉｔｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８，５９－７３，Ｊａｎｕａｒｙ ２００８を参照）。一方、生物学的製剤による治療又は遺伝子治療で誘発される望ましくないワクチン接種効果は、抗薬物抗体の発生を防止するためにＭＨＣクラスＩｂベースの構築物を添加することにより相殺されうる。

【0019】

したがって、本発明は、以下の好ましい実施形態に関する。
（１）ａ）ヒトＭＨＣクラスＩｂ分子、又はペプチド抗原をＴ細胞に提示しうるポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドがヒトＭＨＣクラスＩｂ分子の［α］３ドメイン、又は、ヒトＭＨＣクラスＩｂ分子の［α］３ドメインのＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる誘導体を含み；
ｂ）前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドにより提示されるペプチド抗原；
を含む、医薬組成物。
（２）前記ａ）のペプチド抗原を提示しうるポリペプチドを含み、かつ、前記ポリペプチドが、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端に、ＭＨＣクラスＩａ分子の［α］１ドメイン及び［α］２ドメイン、その後に、前記［α］３ドメイン又は前記誘導体をその順序で含む、（１）に記載の医薬組成物。
（３）前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する、（１）又は（２）に記載の医薬組成物。
（４）前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか又は少なくとも９２％の同一性を有する、（３）に記載の医薬組成物。
（５）前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか又は少なくとも９４％の同一性を有する、（３）に記載の医薬組成物。
（６）前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか又は少なくとも９６％の同一性を有する、（３）に記載の医薬組成物。
（７）前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか又は少なくとも９８％の同一性を有する、（３）に記載の医薬組成物。
（８）前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９９％の同一性を有する、（３）に記載の医薬組成物。
（９）前記ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに含まれる前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一である、（３）に記載の医薬組成物。
（１０）前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又は前記ａ）のペプチド抗原を提示しうるポリペプチドが、表面プラズモン共鳴分光法による測定で４０μＭ未満の親和定数ＫｄでＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる、上記のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（１１）前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又は前記ａ）のペプチド抗原を提示しうるポリペプチドが、表面プラズモン共鳴分光法による測定で２０μＭ未満の親和定数ＫｄでＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる、上記のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（１２）前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又は前記ａ）のペプチド抗原を提示しうるポリペプチドが、表面プラズモン共鳴分光法による測定で１０μＭ未満の親和定数ＫｄでＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる、上記のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（１３）前記医薬組成物が、さらに、配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％同一である配列、を含むポリペプチドドメインを含み、かつ、ここで前記ポリペプチドドメインは、好ましくは、前記ａ）のペプチド抗原を提示しうるポリペプチドに含まれる、上記のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（１４）前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又は前記ａ）のペプチド抗原を提示しうる前記ポリペプチドが、さらに、１又はそれ以上のリンカー配列、好ましくは（ＧＧＧＳ）ｎリンカー配列を含む、上記のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（１５）前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又は前記ａ）のペプチド抗原を提示しうるポリペプチドが、二量体又は多量体である、上記のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（１６）前記ペプチド抗原の長さが、７～１１アミノ酸長、好ましくは８～１０アミノ酸長である、上記のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（１７）前記医薬組成物が、前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子を含み、かつ、前記ＭＨＣクラスＩｂ分子がＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ又はＨＬＡ－Ｇである、（１）及び（３）～（１６）のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（１８）前記ＭＨＣクラスＩｂ分子がＨＬＡ－Ｇである、（１７）に記載の医薬組成物。
（１９）前記ＭＨＣクラスＩｂ分子がヒトＭＨＣクラスＩｂ分子である、（１７）又は（１８）に記載の医薬組成物。
（２０）前記ｂ）のペプチド抗原が、前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドと共有結合している、上記のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（２１）前記ｂ）のペプチド抗原及び前記ａ）のＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドがペプチド結合を介して共有結合し、かつ、単一のポリペプチド鎖の部分である、（２０）に記載の医薬組成物。
（２２）ペプチド抗原を提示しうる組換えポリペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）前記組換えポリペプチドにより提示されるペプチド抗原；
ｉｉ）場合によっては、第１のリンカー配列；
ｉｉｉ）場合によっては、ヒトβ２－マイクログロブリンの配列、又は配列番号６で表されるヒトβ２－マイクログロブリンのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、を含むヒトポリペプチドドメインの配列；
ｉｖ）場合によっては、第２のリンカー配列；
ｖ）場合によっては、ＭＨＣ分子の［α］１ドメイン；
ｖｉ）場合によっては、ＭＨＣ分子の［α］２ドメイン；
ｖｉｉ）ＭＨＣクラスＩｂ分子の［α］３ドメイン、又はＭＨＣクラスＩｂ分子の［α］３ドメインのＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる誘導体；かつ、
ｖｉｉｉ）場合によっては、プロテアーゼ切断部位；
ｉｘ）場合によっては、アフィニティータグ；
をその順序で含む、組換えポリペプチド。
（２３）前記ｖ）の前記［α］１ドメイン及び前記ｖｉ）の［α］２ドメインが、ＭＨＣクラスＩａ分子由来である、（２２）に記載の組換えポリペプチド。
（２４）前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する、（２２）又は（２３）に記載の組換えポリペプチド。
（２５）前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９２％の同一性を有する、（２４）に記載の組換えポリペプチド。
（２６）前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９４％の同一性を有する、（２４）に記載の組換えポリペプチド。
（２７）前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９６％の同一性を有する、（２４）に記載の組換えポリペプチド。
（２８）前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９８％の同一性を有する、（２４）に記載の組換えポリペプチド。
（２９）前記［α］３ドメイン又は誘導体のアミノ酸配列が、配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９９％の同一性を有する、（２４）に記載の組換えポリペプチド。
（３０）前記［α］３ドメインのアミノ酸配列が配列番号１１の［α］３ドメインのアミノ酸配列と同一である、（２４）に記載の組換えポリペプチド。
（３１）前記ポリペプチドが、表面プラズモン共鳴による測定で４０μＭ未満の親和定数ＫｄでＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる、上記のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
（３２）前記ポリペプチドが、表面プラズモン共鳴による測定で２０μＭ未満の親和定数ＫｄでＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる、上記のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
（３３）前記ポリペプチドが、表面プラズモン共鳴による測定で１０μＭ未満の親和定数ＫｄでＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる、上記のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
（３４）前記ポリペプチドが二量体又は多量体である、上記のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
（３５）前記ｉ）のペプチド抗原配列の長さが７～１１アミノ酸長、好ましくは８～１０アミノ酸長である、上記のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
（３６）前記ｉ）～ｖｉｉ）を全て含むが、好ましくは前記ｖｉｉｉ）～ｉｘ）を含まない、上記のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
（３７）前記ｉ）～ｉｘ）を全て含む、（２２）～（３５）のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
（３８）さらに、Ｎ末端分泌シグナルペプチド配列を含む、上記のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
（３９）医薬に用いる、（１）～（２１）のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は（２２）～（３８）のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
（４０）被験体に対するペプチド抗原特異的免疫調節の方法に用いる、（１）～（２１）のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は（２２）～（３８）のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドであって、前記免疫調節は、前記医薬組成物又は前記組換えポリペプチドに含まれる前記ペプチド抗原に特異的である、医薬組成物又は組み換えポリペプチド。
（４１）前記免疫調節の方法が、前記医薬組成物又は前記組換えポリペプチドに含まれる前記ペプチド抗原に対する免疫学的寛容を誘導する、（４０）に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。
（４２）免疫調節の方法が、免疫自己免疫疾患、アレルギー、生物学的製剤に対する免疫反応、胚性抗原に対する免疫反応、又は移植された細胞、組織若しくは器官に対する免疫反応、を抑制する方法である、（４０）又は（４１）に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。
（４３）免疫調節の方法が免疫寛容を誘導する方法であり、ここで、前記自己免疫疾患が複数の器官、ホルモン産生器官、神経、関節、皮膚、胃腸系、眼、血液成分又は血管に影響を及ぼす、（４２）に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。
（４４）前記方法が、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、強皮症、視神経脊髄炎又は１型糖尿病の免疫応答を抑制する方法である、（４１）に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。
（４５）（２２）～（３８）のいずれか一項に記載のポリペプチド又は（１）～（２１）のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくはＭＨＣクラスＩｂ分子をコードする核酸。
（４６）前記核酸がベクターである、（４５）に記載の核酸。
（４７）（４５）又は（４６）に記載の核酸を含む医薬組成物。
（４８）（４５）又は（４６）に記載の核酸分子又はベクターを含む組換え宿主細胞。
（４９）（４８）に記載の組換え宿主細胞を、前記核酸分子を発現させうる条件下で培養し、産生されたポリペプチドを回収することを含む、（２２）～（３８）のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造方法。
（５０）ａ１）抗原性タンパク質若しくはペプチド抗原、又は前記抗原性タンパク質若しくはペプチド抗原をコードする核酸、又は前記抗原性タンパク質若しくはペプチド抗原を含む弱毒化生物；又は、
ａ２）前記ａ１）のペプチド抗原を提示する細胞；及び、
ｂ）ＭＨＣクラスＩｂ分子とその受容体の結合を遮断しうる薬剤、
の組合せであって、
ヒト被験体の前記抗原性タンパク質又はペプチド抗原に対する免疫応答を誘導する方法で用いる、組合せ。
（５１）前記薬剤が、前記ヒトＭＨＣクラスＩｂ分子及び／又はその受容体に結合しうる、（５０）に記載の組合せ。
（５２）前記薬剤がＨＬＡ－Ｇに結合しうる、上記のいずれか一項に記載の組合せ。
（５３）前記薬剤が、ＨＬＡ－Ｇに結合しうる抗体、好ましくはモノクローナル抗体である、（５０）～（５２）のいずれか一項に記載の組合せ。
（５４）前記薬剤がＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる、上記のいずれか一項に記載の組合せ。
（５５）前記薬剤が、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４に結合しうる抗体、好ましくはモノクローナル抗体である、上記のいずれかに記載の組合せ。
（５６）前記薬剤が、抗体のＦｃドメイン又はその断片を含む、上記のいずれか一項に記載の組合せ。
（５７）前記薬剤がＭＨＣクラスＩｂ分子の［α］３ドメインを含む、上記のいずれか一項に記載の組合せ。
（５８）前記薬剤が、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４受容体の１又はそれ以上の細胞外ドメイン、好ましくは、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４受容体の少なくとも２のＮ末端細胞外ドメインを含み、かつ、ここで、前記薬剤が、より好ましくは、可溶性ＩＬＴ２又はＩＬＴ４受容体を含む、上記のいずれかに記載の組合せ。
（５９）前記薬剤が、前記抗原性タンパク質若しくはペプチド抗原、又は前記抗原性タンパク質若しくはペプチド抗原をコードする前記核酸、又は前記抗原性タンパク質若しくはペプチド抗原を含む前記弱毒化生物と同時、それ以前、又はそれ以後に、投与される、上記のいずれか一項に記載の組合せ。
（６０）前記組合せが、ａ）抗原性タンパク質又はペプチド抗原；及び、ｂ）前記ＭＨＣクラスＩｂ分子とその受容体の結合を遮断しうる薬剤の組合せである、上記のいずれか一項に記載の組合せ。
（６１）前記組合せが、ａ）抗原性タンパク質又はペプチド抗原をコードする核酸；及び、ｂ）前記ＭＨＣクラスＩｂ分子とその受容体の結合を遮断しうる薬剤の組合せである、（５０）～（５９）のいずれか一項に記載の組合せ。
（６２）前記組合せが、ａ）抗原性タンパク質又はペプチド抗原を含む弱毒化生物；及び、ｂ）前記ＭＨＣクラスＩｂ分子とその受容体の結合を遮断しうる薬剤の組合せである、（５０）～（５９）のいずれか一項に記載の組合せ。
（６３）前記抗原性タンパク質又はペプチド抗原を含む前記弱毒化生物が弱毒化ウイルスである、（６２）に記載の組合せ。
（６４）前記ａ）の抗原性タンパク質又はペプチド抗原が、腫瘍抗原又は前記腫瘍抗原と少なくとも７７％同一であり、前記抗原に対する交差防御を誘導しうる抗原である、（５０）～（６２）のいずれか一項に記載の組合せ。
（６５）前記方法が、Ｔ細胞ベースの免疫療法のための方法である、上記のいずれか一項に記載の組合せ。
（６６）前記抗原性タンパク質又はペプチド抗原が病原性の微生物又はウイルスにおいて検出可能である、（５０）～（６３）及び（６５）のいずれか一項に記載の組合せ。
（６７）前記方法が、感染症又は悪性疾患の治療又は予防の方法である、上記のいずれか一項に記載の組合せ。
（６８）前記疾患ががんであり、ペプチド抗原が腫瘍抗原である、（６７）に記載の組合せ。
（６９）前記がんが、メラノーマ、腎がん、卵巣がん、結腸直腸がん、乳がん、胃がん、膵管腺がん、前立腺がん、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、及び肺がんからなる群より選択される、（６８）に記載の組合せ。
（７０）前記組合せが１の医薬組成物中に存在する、上記のいずれか一項に記載の組合せ。
（７１）前記抗原性タンパク質又はペプチド抗原に対する前記免疫応答が、前記抗原性タンパク質又はペプチド抗原に特異的である、上記のいずれか一項に記載の組合せ。
（７２）ヒト被験体に対するがんの治療方法で用いられる、（５０）～（６２）のいずれか一項に記載のＭＨＣクラスＩｂ分子とその受容体との結合を遮断しうる薬剤であって、前記方法が、前記がんの細胞からがん抗原の放出をもたらす治療を含む、薬剤。
（７３）前記がん抗原の放出をもたらす治療が、化学療法又は放射線療法である、（７２）に記載の薬剤。
（７４）ペプチド抗原に対する免疫学的寛容を誘導する方法が、さらに、ペプチド薬物の治療を含み、前記ペプチド抗原が：１）前記ペプチド薬物と同一であるか、又は２）前記ペプチド薬物の断片であるか、又は３）前記ペプチド薬物に対する免疫学的寛容を誘導しうる前記ペプチド薬物の断片の誘導体である、（４１）に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。
（７５）ペプチド抗原に対する免疫学的寛容を誘導する方法が、さらに、タンパク質薬物の治療を含み、前記ペプチド抗原が１）前記タンパク質薬物の断片であるか、又は２）前記タンパク質薬物に対する免疫学的寛容を誘導しうる前記タンパク質薬物の断片の誘導体である、（４１）に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。
（７６）前記ペプチド薬物は、前記ペプチド薬物そのものの形態で投与される、（７４）に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。
（７７）前記タンパク質薬物は、タンパク質薬物そのものの形態で投与される、（７５）に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。
（７８）前記ペプチド薬物は、前記ペプチド薬物をコードする遺伝子による遺伝子治療により投与される、（７４）に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。
（７９）前記タンパク質薬物は、前記タンパク質薬物をコードする遺伝子による遺伝子治療により投与される、（７５）に記載の医薬組成物又は組換えポリペプチド。

【0020】

本発明は、いかなる哺乳動物被験体、好ましくはヒト被験体に用いられてよい。

【0021】

好ましくは、ＭＨＣクラスＩｂ又はＩＬＴ２／４に対する遮断剤を用いた免疫刺激性Ｔ細胞指向性治療の上記組合せが用いられるべき適応症としては、腫瘍滲出液、血液試料、生検、又は悪性細胞又は非悪性細胞の他の手段において、ポリメラーゼ連鎖反応、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光、免疫組織化学、及びその他の方法（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｎｏｖ；６１（１１）：１１７７－９５の記載）により、ＨＬＡ－Ｇ又は他のＭＨＣクラスＩｂ分子のレベルの上昇が検出可能である、ウイルス感染及び腫瘍があげられる。ＨＬＡ－Ｇは多くの組織では発現されないが、少量でも著しく強力であるため、他の点ではＨＬＡ－Ｇ欠損組織での検出可能なレベルの発現、又は基礎（ｂａｓａｌ）ＨＬＡ－Ｇ発現を示す組織での生理学的レベルを５０％上回るレベルの発現は、本発明によれば好ましい上昇レベルと考えられる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】特定のペプチドが添加されたＭＨＣ Ｉｂ分子を発現する細胞は、提示されたペプチドに特異的なＣＴＬを選択的に除去することを示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）モデル抗原ＳＴＥＡＰ１（ＣＤ８ｓｔ）を認識するＨＬＡ－Ａ２制限ＣＤ８＋エフェクタＴ細胞は、その同種ペプチドが、非古典的ＭＨＣクラス１ｂ分子ＨＬＡ－Ｇの高発現を示す腫瘍細胞株ＪＥＧ－３上に提示されるが、古典的ＭＨＣクラス１ａ分子はほとんど検出されない場合、選択的に除去されうる。ＳＴＥＡＰ１は、本明細書では一般に「ＳＴＥＡＰ」、「ｓｔｅａｐ」、又は「ｓｔ」と記載されることに留意されたい。これらの用語は同義で用いられ、互換性がある。抗原ＰＲＡＭＥ（ＣＤ８ｐｒ）に特異的な共培養ＣＤ８＋エフェクタＴ細胞は影響を受けない。（Ｃ）ＳＴＥＡＰ１特異的Ｔ細胞に同種ペプチドを添加しても、ＪＥＧ－３を発現するＨＬＡ－Ｇ腫瘍細胞は、このプロセスでは除去されない。これは、腫瘍又は感染細胞により発現されたＭＨＣ Ｉｂ分子が、これらの細胞を、通常はペプチドベースのワクチン接種戦略の主要なエフェクタである抗原特異的Ｔ細胞による標的化に対して耐性にする可能性があることを示す。（Ｄ）ＨＬＡ－Ｇに提示されたＳＴＥＡＰ１ペプチドによるＳＴＥＡＰ１特異的Ｔ細胞におけるアポトーシスの誘導は、Ｔ細胞上に発現されるＨＬＡ－Ｇ相互作用パートナーＩＬＴ－２に対する中和抗体により強力に減弱されうる。

【図2】特定のペプチドが添加されたＭＨＣ Ｉｂ分子は、抗原及びＨＬＡ－Ｇ依存的に同種ＣＴＬの細胞毒性能を損なうことを示す図である。ＳＴＥＡＰ１又はＰＲＡＭＥ各々に特異的なＨＬＡ－Ａ２制限Ｔ細胞クローンを混合し、対照（＋）又はＳＴＥＡＰ１ペプチド添加（ｓｔ）ＪＥＧ－３細胞で前処理した。示される場合には、中和抗ヒトＨＬＡ－Ｇ抗体（クローン８７Ｇ）を１０μｇ／ｍｌで添加した。１６時間後、ルシフェラーゼ発現ナイーブ（灰色バー）又はＨＬＡ－Ａ２＋ ＵＡＣＣ－２５７を添加したＳＴＥＡＰ１－ペプチド（黒色バー）メラノーマ細胞に対するＳＴＥＡＰ１特異的Ｔ細胞の細胞毒性能を２：１の比で試験した。８時間後、Ｄ－ルシフェリンを添加し、生体光生存率アッセイ（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５ Ｆｅｂ；２９７（１－２）：３９－５２）を用いて、標的細胞の生存率をルミノメーターで測定した。ＨＬＡ－Ｇ発現ＪＥＧ－３にＳＴＥＡＰ１ペプチドを添加した場合、ＳＴＥＡＰ１特異的ＣＴＬの溶解能を９０％以上低下させたが、ナイーブＪＥＧ－３細胞でおこった阻害は有意ではなかった。この効果は、部分的に中和するＨＬＡ－Ｇ抗体の存在により有意に減弱されうるため、ペプチド添加ＨＬＡ－Ｇを用いて選択された抗原に対するＴ細胞媒介性免疫反応を阻害しうると結論できる。本発明によれば、この効果は、さらなるＭＨＣクラスＩｂ分子に拡張しうる。一方、本発明による抗原特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答の誘導は、ＭＨＣ Ｉｂを遮断する薬剤により達成しうる。

【図3】特定のペプチドと組み合わされたＭＨＣ Ｉｂ分子は同種ＣＴＬを阻害するが、他の抗原に対する免疫応答はほとんど影響を受けないことを示す図である。ＳＴＥＡＰ１に特異的なＨＬＡ－Ａ２制限Ｔ細胞クローン、ＨＬＡ－Ａ２－ＳＴＥＡＰ１及びＨＬＡ－Ａ２－ＰＲＡＭＥに特異的ＰＲＡＭＥ Ｔ細胞クローンを混合し、未処理（ｃｔｒｌ）又は対照（ＪＥＧ－３）又はＳＴＥＡＰ１ペプチド添加（ＪＥＧ－３ｓｔ）ＪＥＧ－３細胞で前処理した。８時間後、ルシフェラーゼ発現ＰＲＡＭＥ－ペプチド（濃灰色バー）又はＨＬＡ－Ａ２＋ＵＡＣＣ－２５７メラノーマ細胞を発現するＳＴＥＡＰ１－ペプチド添加ルシフェラーゼ（薄灰色バー）に対する両Ｔ細胞クローンのペプチド特異的細胞毒性能を１：１の比で試験した。ＳＴＥＡＰ１－ペプチド添加ＪＥＧ－３細胞による前処理は、ＳＴＥＡＰ１ペプチド特異的Ｔ細胞介在免疫応答を約５０％阻害したが、ＰＲＡＭＥ特異的免疫反応はナイーブ又はＳＴＥＡＰ１－ペプチド添加ＪＥＧ－３細胞によりほとんど変化しなかった。

【図4】治療抗原特異的免疫調節の達成に適するペプチド添加可溶性ＭＨＣ Ｉｂ分子を示す図である。提示されたペプチド抗原は点球体で示し、ＨＬＡ－Ｇα１－３ドメインは薄灰色で、β２－マイクログロブリンドメインは濃灰色で示す。抗原ペプチドとβ２－マイクログロブリン分子とを連結する任意のリンカーを灰色棒状で示し、場合によっては存在してよいジスルフィドトラップを黒球体で示す。この図は非特許文献８及びＨａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１０ Ｏｃｔ；３１（１０）：３６３－９に開示されているＰｙｍｏｌを用いて作成された。

【図5】治療用ペプチド特異的免疫調節に適した単鎖ＭＨＣ Ｉｂ分子をコードするベクターベースの構築物の例を示す図である。ＨＬＡ－Ｇ１及びＨＬＡ－Ｇ５は各々、３つの［α］ドメイン（ここでは黒）、非共有結合的に結合したβ２－マイクログロブリンサブユニット（ここでは濃灰色）、及びＨＬＡ－Ｇ上に提示された抗原ペプチド（短い黒矢印）からなる。ＨＬＡ－Ｇ１は、膜貫通ドメインと短い細胞内鎖をさらに含む（ここには表示せず）。本明細書に示すように、［α］－３ドメインは、免疫細胞上の受容体ＩＬＴ２（Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ｊｕｌｙ ２２；１００（１５）：８８５６－８８６１を参照のこと）及びＩＬＴ４（Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００６ Ｏｃｔ ３１；１０３（４４）：１６４１２－７を参照のこと）に結合しうる。生理学的には、これらの配列は非共有結合的に結合したＭＨＣクラス１複合体を形成する。２つのタンパク質タグ（ｍｙｃ及びＨｉｓ（６ｘ））が導入され、Ｘａ因子の切断による後の除去が可能になり、複合体ＭＨＣ Ｉｂ分子の精製が簡素化された。さらに、抗原ペプチド、β２－マイクログロブリン及びＭＨＣ Ｉｂ［α］鎖を連結して安定性を高めることができる。ベクターマップはＳｎａｐｇｅｎｅ Ｖｉｅｗｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて作成した。

【図6】可溶性ペプチドＨＬＡ－Ｇ／ペプチド－ＭＨＣ Ｉｂ複合体を樹状細胞（ＤＣ－１０）と組み合わせて、提示された標的抗原を認識するＣＤ８＋エフェクタＴ細胞を選択的に除去しうることを示す図である。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ４及びＩＬ１０（ＤＣ－１０）の存在下で単球から樹状細胞を作製した後、可溶性ペプチドＭＨＣ Ｉｂ構築物を含む細胞培養上清を４時間添加した。提示されたＭｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ１（ｄｔＧｍｅｌＡ）ペプチド又はＳＴＥＡＰ１（ｄｔＧｓｔｅａｐ）ペプチドを含むジスルフィドトラップ安定化単鎖ＨＬＡ－Ｇ５構築物を用いた。これらの構築物がＤＣ－１０細胞に結合することは、以前に確認されていた。次いで、添加されたＤＣ－１０細胞を洗浄し、対照ＣＴＬ（ＰＲＡＭＥ特異的、ＣＤ８ｐｒ）又は標的ＣＴＬ（ＳＴＥＡＰ１特異的、ＣＤ８ｓｔ）と１：１の比で４８時間共培養した。これらのデータは、可溶性ＭＨＣ Ｉｂ－ペプチド構築物を添加された樹状細胞が同種Ｔ細胞クローンをほぼ完全に枯渇させるが、非同種ＣＴＬは影響を受けないことを示唆する。

【図7】ペプチド添加ＭＨＣ Ｉｂ複合体は提示されたペプチドを認識するヒト抗原特異的調節性Ｔ細胞を誘導することを示す図である。Ａ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を様々な健常ドナーから採取し、Ｍｅｌａｎ‐Ａ／ＭＡＲＴ１（ＭＡＲＴ１）ペプチド又はＳＴＥＡＰ１（ＳＴＥＡＰ）ペプチドを添加した照射ＪＥＧ‐３細胞と共に、５％ｈＡＢ血清、５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ２（Ｔｒｅｇ培地）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で１４日間共培養した。７日目に、ＰＢＭＣを新鮮な培地に移し、照射し、ペプチド添加ＪＥＧ－３細胞を再度添加した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ２）由来のＴｒｅｇ拡張ビーズを陽性対照として用いた。得られた細胞を、ヒトＣＤ４及びＣＤ２５に対する抗体、ＨＬＡ－Ａ２ ＳＴＥＡＰ１ペプチドデキストラマー（ＳＴＥＡＰ１ ｄｅｘ）で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＳＴＥＡＰ１添加ＪＥＧ－３細胞が存在した場合には、ＣＤ４＋ ＣＤ２５高Ｔｒｅｇ集団内のＳＴＥＡＰ１特異的細胞の有意な濃縮が観察された。Ｂ）図６に記載のように、Ｍｅｌａｎ－Ａ（ｄｔＧｍｅｌＡ）ペプチド又はＳＴＥＡＰ１（ｄｔＧｓｔｅａｐ）ペプチドを提示するジスルフィドトラップ単鎖ＨＬＡ－Ｇ構築物をウェル当たり４×１０^５個のＤＣ－１０細胞に添加し、その後、同じドナー由来の４×１０^６個のＰＢＬを添加し、細胞をＴｒｅｇ培地中で７日間培養した。次いで、４×１０^５と同一量のＤＣ－１０を各ウェルに添加した。合計１４日後、メランＡ特異的ＩＬ－１０産生Ｔｒｅｇ細胞をフローサイトメトリーにより定量した。メランＡ特異的Ｔｒｅｇの数は、対照分子（ＳＴＥＡＰ１）又は未処理ＰＢＬと比較して、ＰＢＬが単鎖Ｍｅｌａｎ Ａ ＨＬＡ‐Ｇ分子を添加したＤＣ‐１０と共培養された条件で大幅に増加した。

【図8】ヒトＭＨＣ Ｉｂα３ドメインをＤＣと組合せて含む単鎖ペプチドＭＨＣ構築物は、提示されたペプチドに特異的なマウスＴｒｅｇ細胞を誘導することを示す図である。マウスＤＣ（ｍＤＣ）は、マウスＧＭ－ＣＳＦ遺伝子をトランスフェクトしたＡｇ８６５３骨髄腫細胞由来の１０％ ＧＭ－ＣＳＦ含有上清を添加した完全ＲＰＭＩ－１６４０中で、骨髄由来細胞を７日間培養して生成した。ｍＤＣに、対照ＣＨＯ上清（ＣＨＯ／ｃｔｒｌ）又はヒトＨＬＡ－Ｇα３ドメインを含む単鎖ペプチドＭＨＣ分子とマウスＨ－２Ｋｂα１及び２ドメイン（Ｈ２Ｋｂ）により提示されるオボアルブミンペプチドをコードするプラスミドをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清を添加した。マウスＨ－２Ｋｂα１及び２ドメインの代わりにヒトＨＬＡ－Ａ２α１及び２ドメイン（Ａ２Ｇ）を含む同様の構築物を対照として含めた。構築物の発現は、上清のウエスタンブロット法により確認した。Ａ及びＢ：Ｈ－２Ｋｂ呈示ＯＶＡペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を認識するトランスジェニックＴ細胞受容体のみを発現するＯＴ１マウス由来の脾細胞を、Ｔｒｅｇ許容培地（完全ＲＰＭＩ，５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２，５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－β１）中で、添加したｍＤＣと２．５：１の比で１４日間培養した。

【発明を実施するための形態】

【0023】

定義と一般技術
以下に別途定義されない限り、本発明で用いられる用語は、当業者に知られているそれらの共通の意味に従って理解されるものとする。本明細書で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0024】

本発明によるポリペプチド及びＭＨＣ分子を含む、本発明による全てのタンパク質は、当技術分野で公知の方法により産生されうる。当該方法には、組換えタンパク質の製造方法が含まれる。本発明によるポリペプチド及びＭＨＣ分子を含む本発明によるタンパク質は、場合によっては分泌シグナルペプチド配列を含むことを意味することが理解されるであろう。同様に、本発明によるタンパク質は、例えば精製を容易にするためのアフィニティータグ、及び場合によっては、例えばプロテアーゼ切断によるタグの除去を容易にするための当該タグとタンパク質との間のプロテアーゼ切断部位を含むことも意味する。
同様に、本発明によるポリペプチド及びＭＨＣ分子を含む本発明によるタンパク質は、各々のプロペプチドを含むことが理解されるであろう。
本発明のポリペプチド及びＭＨＣ分子は、それらの可溶性形態又は膜結合形態でありうることも理解されるであろう。

【0025】

本発明によれば、ＭＨＣ分子は、好ましくはヒトＭＨＣ分子である。
本発明により用いられるＭＨＣ分子、本発明のポリペプチド、及び本発明による抗体を含む、本発明のタンパク質及びポリペプチドは、好ましくは単離される。
本発明により用いられるＭＨＣ分子、本発明のポリペプチド、及び本発明による抗体を含む、本発明のタンパク質及びポリペプチドは、好ましくは組換え体である。

【0026】

本発明のペプチド抗原に結合し、提示しうるポリペプチドの調製方法は理解されるであろう。例えば、［α］１及び［α］２ドメイン等のペプチド抗原結合ドメインは知られており、当該ドメインを修飾しうる。本発明のポリペプチド及びＭＨＣ分子への結合するペプチド抗原の結合能は、ＭＨＣペプチド溶出及びその後の質量分析及びインシリコバイオインフォマティック予測等の探索的方法、並びにＭＨＣペプチド多量体結合法及び刺激アッセイ等の確認的方法を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の技術で決定しうる。
本発明で用いられるペプチド抗原に関して、本明細書に記載されたこれらのペプチド抗原のいかなる長さ（例えば、「７～１１アミノ酸長」）も、ペプチド抗原自体の長さを意味することが理解されるであろう。従って、本明細書に記載されたペプチド抗原の長さは、考えられるリンカー配列からの追加のアミノ酸等のペプチド抗原の部分ではない追加アミノ酸により付与される長さを含まない。

【0027】

本明細書中で用いられる、用語「自己免疫疾患」は、当業者に公知のその共通の意味により、特定の自己免疫疾患には限定されない。本発明の全ての実施形態では、自己免疫疾患は、好ましくは、ペプチド自己抗原に対する自己免疫反応を含む自己免疫疾患である。

【0028】

本発明の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、場合によっては用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ）」で置換されてよい。

【0029】

〔方法及び技術〕
一般に、本明細書に別段の定義がない限り、本発明で用いられる方法（例えば、クローニング方法又は抗体に関する方法）は、当該分野で公知の方法、例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．”，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら（“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．”Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９２）、並びにＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８８）に記載される。

【0030】

各々の標的タンパク質に対する抗体の結合等のタンパク質－タンパク質結合は、当技術分野で公知の方法で評価しうる。各々の標的タンパク質に対する抗体の結合等のタンパク質－タンパク質結合は、好ましくは、表面プラズモン共鳴分光法による測定で評価される。
例えば、本発明によるＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドの、それらのＩＬＴ２及びＩＬＴ４を含む受容体への結合は、好ましくは、表面プラズモン共鳴スペクトル測定により評価される。より好ましくは、本発明によるＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドのそれらの受容体への結合は、２５℃での表面プラズモン共鳴分光法による測定で評価される。当該表面プラズモン共鳴分光法測定ための適切な条件は、Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００３ Ｊｕｌｙ２２；１００（１５）：８８５６－８８６１により記載されている。

【0031】

本発明の配列のシークエンスアラインメントは、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１５．ｐ．４０３－４１０．；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．：（１９９７）Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２を参照）を用いて実施される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる、本発明によるペプチド抗原に適した短ペプチドのシークエンスアラインメントの適切なパラメータは、当技術分野で公知である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いるソフトウェアツールはほとんど、短い入力シークエンスに対するシークエンスアラインメントのパラメータを自動的に調整する。一実施形態では、以下のパラメータ：最大標的配列１０；ワードサイズ３；ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス；ギャップコスト：存在１１，拡張１；条件付き構成スコア行列の調整；が用いられる。従って、配列に関して用いられる用語「同一性」又は「同一性」等は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いることにより得られる同一性値を指すことが好ましい。

【0032】

〔本発明の組成物の調製〕
本発明による組成物は、医薬組成物の調製のための公知の標準に従って調製される。
例えば、組成物は、適切に保存及び投与されうるように調製されるが、それは例えば、担体、賦形剤及び／又は安定剤等の医薬的に許容される成分を用いることによる。
当該医薬的に許容される成分は、医薬組成物を患者に投与するときに用いられる量で毒性とはならない。医薬組成物に添加される医薬上許容される成分は、当該組成物中に存在する活性成分の化学的性質、医薬組成物の特定の用途及び投与経路に依存しうる。
一般に、本発明に関連して用いられる医薬的に許容される成分は、当技術分野で利用可能な知識、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｄ．ＡＲ Ｇｅｎｎａｒｏ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＰＡ，ＵＳＡから入手可能な知識に従って用いられる。

【0033】

〔発明のペプチド抗原〕
上記で特定されたペプチド抗原を含む、本発明で用いうるペプチド抗原は、ＭＨＣ分子上への提示能以外には特に限定されない。ＭＨＣ分子上に提示されうるペプチドは、当技術分野において公知の方法で作製しうる（例えば、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｂａｃｈｏｒ，Ｓｔｅｖａｎｏｖｉc．ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９９ Ｎｏｖ；５０（３－４）：２１３－９；Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１６ Ｄｅｃ １；１２６（１２）：４６９０－４７０１；ａｎｄ Ｒｏｃｋ，Ｒｅｉｔｓ，Ｎｅｅｆｊｅｓ．Ｐｒｅｓｅｎｔ Ｙｏｕｒｓｅｌｆ！ Ｂｙ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６ Ｎｏｖ；３７（１１）：７２４－７３７）。
ペプチド抗原は、一般に当技術分野において公知である。一般に、本発明のペプチド抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質に結合しうる。当業者であれば、本発明のペプチドを提示しうるＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドの各々について、当該ＭＨＣクラスＩｂ分子又はポリペプチドに結合しうるペプチド抗原が好ましく用いられることを理解しうるであろう。これらのペプチド抗原は、当技術分野で公知の方法に基づいて選択されうる。

【0034】

本発明のＭＨＣクラスＩｂ分子又はペプチド抗原結合能を有するポリペプチドへのペプチド抗原の結合は、当技術分野で公知の方法、例えば、以下の方法：
－Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｂａｃｈｏｒ，Ｓｔｅｖａｎｏｖｉc．ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９９ Ｎｏｖ；５０（３－４）：２１３－９；
－Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１６ Ｄｅｃ １；１２６（１２）：４６９０－４７０１；かつ、
－Ｒｏｃｋ，Ｒｅｉｔｓ，Ｎｅｅｆｊｅｓ．Ｐｒｅｓｅｎｔ Ｙｏｕｒｓｅｌｆ！Ｂｙ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６ Ｎｏｖ；３７（１１）：７２４－７３７；
で評価しうる。
そのような方法としては、実験的方法及びペプチド抗原結合の予測方法があげられる。
ペプチド抗原をＭＨＣクラスＩ分子に固定し、ペプチド抗原のＭＨＣクラスＩ分子への結合を確実にするアンカー残基が、当技術分野で公知である。
本発明の全ての実施形態の好ましい態様では、本発明により用いられるペプチド抗原は、ＭＨＣクラスＩ分子に対して予測される位置に、いかなるアンカー残基又は好ましいアミノ酸残基をも含む。
このような予測は、好ましくは、以下の刊行物のいずれかに記載されている方法で行いうる。
－Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ， ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ： ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）５０：２１３－２１９；
－ Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ（２００３）１２：１００７－１０１７；
－ Ｎｅｅｆｊｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１ Ｎｏｖ １１；１１（１２）：８２３－３６；
－ 非特許文献１０；
－ 非特許文献１１；
－ Ｄｅｓａｉ＆Ｋｕｌｋａｒｎｉ－Ｋａｌｅ，Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；１１８４：３３３－６４。

【0035】

本発明の全ての実施形態の好ましい態様では、ペプチド抗原はヒトタンパク質由来である。
あるいは、本発明のペプチド抗原の非アンカーアミノ酸残基は、ヒトタンパク質由来のペプチド抗原の対応するアミノ酸残基と同一であってもよく、又は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有してもよい。あるいは、本発明のペプチド抗原の非アンカーアミノ酸残基は、ヒトタンパク質由来のペプチド抗原の対応するアミノ酸残基に関して、保存的置換、好ましくは２以下の保存的置換、より好ましくは１の保存的置換を含んでよい。好ましい態様では、前記ヒトタンパク質は、病理的免疫反応の影響を受ける組織又は細胞で発現するタンパク質である。

【0036】

本発明のペプチド抗原は、天然に存在するペプチド又は天然に存在しないペプチドでありうる。本発明のペプチド抗原は、好ましくは、天然に存在するアミノ酸からなる。しかしながら、修飾アミノ酸等の天然に存在しないアミノ酸を用いうる。例えば、一実施形態では、本発明により用いられるペプチド抗原は、ペプチド模倣物でありうる。
本発明のペプチド抗原を含むペプチド抗原の合成方法は、当技術分野で周知である。

【0037】

〔配列〕
本出願において記載される好ましいアミノ酸配列は、以下の配列から独立して選択されうる。当該配列はＮ末端からＣ末端の順序で表され、１文字のアミノ酸コードで表される。
リーダーペプチド：例

【0038】

【化1】

（配列番号１）
ペプチド抗原：ＭＨＣクラスＩ［α］１及び２ドメインに対応するいかなるＭＨＣクラスＩペプチド、例えば、

【0039】

【化2】

（配列番号２）又は

【0040】

【化3】

（Ｏｖａ）（配列番号３）

リンカー１（ジスルフィドトラップ安定化）：例

【0041】

【化4】

（配列番号４）又は

【0042】

【化5】

（配列番号５）
例えば、ヒト又は他の種に由来するβ２－マイクログロブリン：

【0043】

【化6】

（配列番号６、ヒトβ３マイクログロブリン）
例えば、リンカー２

【0044】

【化7】

（配列番号７）

選択された抗原ペプチドを提示するのに適した、ヒトＨＬＡ－Ｇ又は他のＭＨＣクラスＩ［α］１及び２ドメインのいずれか由来の［α］１及び２ドメインであって、Ｙ８４は、ＤＴ変異体でＣでありうる。

【0045】

【化8】

（配列番号８）
例、マウスＨ２Ｋｂ［α］１及び２ドメイン（Ｙ８４Ｃ）

【0046】

【化9】

（配列番号９）
又は：ヒトＨＬＡ－Ａ２［α］１及び２ドメイン

【0047】

【化10】

（配列番号１０）
ヒトＨＬＡ－Ｇ ［α］３ドメイン（又は、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４受容体と相互作用するＨＬＡ－Ｆ等のいかなるＭＨＣ Ｉｂ［α］３ドメイン）であって、例えば、

【0048】

【化11】

（配列番号１１；ＨＬＡ－Ｇ［α］３の配列）。上記の配列のうち、以下で下線で示したアミノ酸は、ＩＬＴ２又はＩＬＴ４受容体相互作用に関連していることに注意。

【0049】

【化12】

第Ｘａ因子制限部位：

【0050】

【化13】

（配列番号１２）
Ｍｙｃタグ：

【0051】

【化14】

（配列番号１３）
追加配列：ＮＳＡＶＤ
Ｈｉｓタグ：ＨＨＨＨＨＨ＊（配列番号１４）。

【0052】

本発明の成熟全長タンパク質の例：
ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｔｒａｐ＿Ｏｖａ＿Ｌｉｎｋｅｒ１＿ｈｕｍａｎｂｅｔａ２ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ＿Ｌｉｎｋｅｒ２＿Ｈ２Ｋｂａｌｐｈａ１＆２＿ＨＬＡ－Ｇａｌｐｈａ３＿ＸａＳｉｔｅ＿ｍｙｃ＆ｈｉｓＴＡＧ
（ｄｔＨ２Ｇｏｖａ）

【0053】

【化15】

（配列番号１５）
上記全長タンパク質のペプチド抗原（ここでは、「ＳＩＩＮＦＥＫＬ」）の配列は、本発明によるいかなるペプチド抗原配列によっても置換されうることに留意されたい。

【0054】

【化16】

（配列番号１６）
上記の全長タンパク質のペプチド抗原（ここでは、ＭＬＡＶＦＬＰＩＶ）の配列は、本発明によるいかなるペプチド抗原配列によっても置換されうることに留意されたい。

【0055】

受容体ＩＬＴ２（ＬＩＬＲＢ１としても知られる）及びＩＬＴ４（ＬＩＬＲＢ２としても知られる）は、当技術分野で公知である。本発明による当該受容体の好ましい配列は、以下の通りである：

【0056】

【化17】

（配列番号１７）

【0057】

【化18】

（配列番号１８）
本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに例示される。

【0058】

〔一般的注釈〕
全ての工程は滅菌条件下で行われ、保護容器は層流フード下でのみ開放した。特に明記しない限り、細胞は常に３５０×ｇで５分間遠心分離した。全ての生細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２、及び＞９５％湿度のインキュベーター中に維持した。３７℃に設定した水浴を用いて、細胞に添加する培地、ＰＢＳ又は他の溶液を予め加温した。細胞計数にはノイバウアーチャンバーを用いた。統計解析にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓＴ検定を用いて、ｐ値が０．０５未満の場合を有意とした。

【実施例0059】

特定のペプチドが添加されたＭＨＣ Ｉｂ分子を発現する細胞は、提示されたペプチドに特異的なＣＴＬを選択的に除去する。
〔材料及び方法〕
ＪＥＧ－３は、高レベルのＨＬＡ－Ｇを高レベルに発現するものの、古典的ＭＨＣクラスＩ分子をほとんど発現しない、ヒト絨毛がん細胞株である（Ｒｉｎｋｅ ｄｅ Ｗｉｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０ Ｆｅｂ １；１４４（３）：１０８０－７）。ＪＥＧ－３細胞を、１０％ウシ胎仔血清、０．５％ピルビン酸ナトリウム溶液（１００ｍＭ）及び１％ペニシリン（１０ｋＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ）溶液を含む完全ＲＰＭＩ１６４０培地（「完全ＲＰＭＩ」）で培養した。３×１０^５個のＪＥＧ－３細胞を、１２ウェルプレートに１ｍｌの完全ＲＰＭＩで播種した。

【0060】

示されている場合は、ＳＴＥＡＰ１（２９２．２Ｌ－９ｍｅｒ、ＭＬＡＶＦＬＰＩＶ）ペプチド（５μｇ／μｌ）又はＰＲＡＭＥ（４３５－９ｍｅｒ、ＮＬＴＨＶＬＹＰＶ）ペプチド（５μｇ／μｌ）を含む１μｌのストック溶液を添加した。翌日、ＪＥＧ－３細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３００μｌのＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ添加培地（５％ヒト血清型ＡＢ血清、２５～５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５）を各ウェルに添加した。

【0061】

クローンＨＬＡ－Ａ＊０２（ＨＬＡ－Ａ２）制限下のＳＴＥＡＰ１（ｓｔ）ペプチド又はＰＲＡＭＥ（ｐｒ）ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＳＴＥＡＰ１－／ＰＲＡＭＥ「特異的」）を、Ｗｏｅｌｆｌ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１４ Ａｐｒ；９（４）：９５０－６６に従って作製した。ＳＴＥＡＰ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造業者の指示に従って細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０で染色し、上記完全ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁する。３００μｌの培地中の１．５×１０^５個の細胞を、ペプチド添加ＪＥＧ－３とともに各ウェルに添加する。同様に、未染色のＰＲＡＭＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をペレット化し、再懸濁し、各ウェルに添加した。Ｄに示す実験では、抗ＩＬＴ－２抗体（クローンＨＰ－Ｆ１）又はアイソタイプ対照抗体を最終濃度１０μｇ／ｍｌまで添加した。

【0062】

１６時間後、細胞を収集し、製造業者の指示に従って５μＭ ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。次いで、非付着性細胞を収集し、抗ヒトＣＤ８（ＰＥ／Ｃｙ７、クローンＲＰＡ－Ｔ８）及び抗ヒトＣＤ４（ＰＥ／Ｄｙｅ６４７、クローンＭＥＭ－２４１）抗体の１：１００希釈液で、氷上で３０分間染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＣＴＬはＣＤ８＋ＣＤ４－であるので、ＣＤ４染色は、潜在的なＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性細胞及び自己蛍光細胞を排除しえた。総細胞数は、μｌ当たりの細胞数に基づいて決定した。接着性ＪＥＧ‐３細胞の生存をクリスタルバイオレットアッセイで定量した。

【0063】

〔結果〕Ａ）ＪＥＧ‐３細胞非存在対照条件又はＨＬＡ‐Ｇ＋ＤＭＳＯ処理した対照ＪＥＧ‐３細胞の対照条件において、アポトーシスが検出されたカスパーゼ３／７＋ｅＦｌｕｏｒ６７０ＰＲＡＭＥ特異的又はｅＦｌｕｏｒ６７０＋ＳＴＥＡＰ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は５％未満であった。対照的に、ＳＴＥＡＰ１添加ＪＥＧ－３細胞との共培養後、ＳＴＥＡＰ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９０％以上が消失又はアポトーシスを示したが、ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞に対する有意な影響は観察されなかった。ＳＴＥＡＰ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、明るいｅＦｌｕｏｒ６７０染色により、ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞から容易に識別しえた。このドットプロットは、３つの実験のうちの１つの代表的な結果である。Ｂ）３つの独立した実験の統計学的解析から、これらの効果は著しく有意であり、ＳＴＥＡＰ１特異的Ｔ細胞は、同種ペプチドを添加したＨＬＡ－Ｇ＋ＪＥＧ－３細胞との共培養で選択的に除去できることが示された。Ｃ）Ｊ ＥＧ－３細胞の生存は、共培養されたＴ細胞により認識されるペプチドが添加されても減少しない。Ｄ）同じ条件下で、ＨＬＡ－Ｇ受容体を阻害する抗体ＩＬＴ２を添加すると、ＳＴＥＡＰ１特異的Ｔ細胞の標的細胞からの消失が部分的に抑制された。

【0064】

〔結論〕この実験は、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、その同種抗原を提示するＪＥＧ‐３細胞等のヒトＭＨＣ Ｉｂ＋細胞と接触すると、選択的に除去されうることを示す。これは驚くべきことである。なぜなら、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞に同種ペプチドを提示するＭＨＣ Ｉａ＋標的細胞は、通常、Ｔ細胞が生存する間に除去されるからである。ＭＨＣ Ｉａ＋標的とは対照的に、ＪＥＧ－３細胞へペプチドを添加しても、生存率は低下しなかったことから、ＭＨＣ Ｉｂ分子の機能はＭＨＣ Ｉａ分子の機能とは相反する可能性があることが示唆される。さらに、ＭＨＣ Ｉｂ分子とその受容体であるＩＬＴ２は、ＩＬＴ２ブロッキング抗体等の相互作用を遮断する薬剤により達成される当該効果を阻害することで示すように、当該効果を協働して達成する。従って、本発明によれば、当該遮断剤を用いて、ＭＨＣ Ｉｂ分子の存在下でペプチド特異的免疫応答の誘導を促進しうる。

【実施例0065】

特定のペプチドが添加されたＭＨＣ Ｉｂ分子を用いると、抗原特異的方法で同種ＣＴＬの潜在的な細胞毒性を阻害しうる。
〔材料及び方法〕 １×１０^６個のＪＥＧ－３細胞を未処理か、又は、６ウェルプレートに、１ｍｌの完全ＲＰＭＩ１６４０のＳＴＥＡＰ１ペプチド（「ｓｔ」、実施例１参照）で添加した。５×１０^５ ＳＴＥＡＰ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、５×１０^５ ＰＲＡＭＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクタ）と混合し、これらを未処理のままか又はＪＥＧ－３と共培養した。１０μｇ／ｍｌの中和抗ヒトＨＬＡ－Ｇ抗体（クローン８７Ｇ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ドイツ）を、指示された場所に添加した。翌日、ＨＬＡ－Ａ２＋ ＵＡＣＣ－２５７メラノーマ細胞（標的）を発現するホタルルシフェラーゼを、アキュターゼ溶液（ＰＡＡ ドイツ）を用いて分離し、ＳＴＥＡＰ１ペプチド（５μｇ／ｍｌ、「ｓｔ ｌｏａｄｅｄ」）又は同量のＤＭＳＯ（「ｕｎｌｏａｄｅｄ」）を３７℃のシェーカー上で４時間洗浄し、次いで、ウェル当たり１×１０^４個のＵＡＣＣ細胞を白色の丸底９６ウェルプレートに播種した。次いで、非接着性混合Ｔ細胞を収集し、４×１０^４個の初期Ｔ細胞（各々２×１０^４個）の同等物及びホタルＤ－ルシフェリン（ＰＪＫドイツ、最終濃度１４０μｇ／ｍｌ）を添加した。８時間後に標的細胞の生存をルミノメーターで測定した（方法の詳細はＢｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５ Ｆｅｂ；２９７（１－２）：３９－５２）。

【0066】

〔結果〕ＨＬＡ‐Ｇ＋ＪＥＧ‐３細胞のペプチド抗原の提示は、この特異的ペプチド抗原をＭＨＣ‐Ｉｂ依存的に認識するＣＤ８＋ Ｔ細胞クローンの細胞毒性能を阻害した。記載の設定では、ＳＴＥＡＰ１特異的対照ＣＴＬ又はＨＬＡ－Ｇ＋ＪＥＧ－３細胞で前処理したＣＴＬは、同種ペプチドを添加した全標的細胞の約９０％を溶解したが、ナイーブ標的細胞は除去されなかった。対照的に、ＪＥＧ－３細胞及び同種ペプチドによる前処理により、抗原提示標的細胞をほぼ完全に保護された。ＨＬＡ－Ｇ依存性効果（８７Ｇ）を部分的に遮断できる抗体は、このペプチド特異的免疫抑制効果を部分的に逆転させた。これは、ペプチド添加ＭＨＣクラスＩｂ分子が、臨床環境において提示された抗原に対する望ましくない細胞傷害性（自己）免疫反応も抑制しうることを意味する。

【0067】

さらに、ペプチドと（例えば、放射線、化学療法又はペプチドワクチン接種レジメンを介して）接触するＭＨＣ Ｉｂ陽性腫瘍細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が介在する抗腫瘍免疫応答を特異的に抑制する可能性がある。しかし、この効果はＭＨＣ Ｉｂ分子とその受容体との相互作用を阻害する薬剤で阻止されうる。