特開 2023-53935 サイトカイン産生誘導能を高めるための乳酸菌の培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023053935

(43)【公開日】2023-04-13

(54)【発明の名称】サイトカイン産生誘導能を高めるための乳酸菌の培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20230406BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20230406BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230406BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

C12N1/00 G

C12P21/02 K

C12P21/02 L

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022158599

(22)【出願日】2022-09-30

(31)【優先権主張番号】P 2021162791

(32)【優先日】2021-10-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】598096991

【氏名又は名称】学校法人東京農業大学

(71)【出願人】

【識別番号】000208086

【氏名又は名称】大洋香料株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(72)【発明者】

【氏名】野本 康二

(72)【発明者】

【氏名】細田 浩司

(72)【発明者】

【氏名】宮本 乃理子

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AG02

4B064AG03

4B064AG07

4B064CA02

4B064CC03

4B064CD13

4B064DA01

4B064DA10

4B065AA30X

4B065AC14

4B065BA21

4B065BB12

4B065CA24

4B065CA41

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】食品素材で構成された乳酸菌用の培地を用いて、複雑な製造設備を必要としない条件下、高い収率で乳酸菌が得られ、かつ免疫調節作用を効率的に高める培養方法を提供する。
【解決手段】グルタミン酸又はグルタミン酸塩を０．２％以上含む培地で培養することを特徴とするサイトカイン産生誘導能を高めた乳酸菌の製造方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

グルタミン酸又はグルタミン酸塩を０．２％以上含む培地で培養することを特徴とするサイトカイン産生誘導能を高めた乳酸菌の製造方法。

【請求項2】

サイトカインが炎症性サイトカインまたは抗炎症性サイトカインである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

サイトカインがＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項4】

グルタミン酸又はグルタミン酸塩を０．２～６％含む培地で培養することを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項5】

グルタミン酸又はグルタミン酸塩を１～６％含む培地で培養することを特徴とする請求項４に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳酸菌発酵技術の分野に属し、乳酸菌の液体培養系における新規培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

乳酸菌は古くからチーズ、ヨーグルト、漬物といった乳酸発酵食品として広く食されてきた。このような乳酸発酵食品は独特の風味を有し好まれているが、近年では嗜好品としてだけではなく、様々な機能性が期待されている。

【0003】

なかでも、アレルギー症状の緩和や上気道感染症の予防、症状軽減などといった免疫調節の効果、特に自然免疫に及ぼす作用には注目されてきた。例えば、乳酸菌が樹状細胞やマクロファージといった抗原提示細胞を刺激することで産生されたインターロイキン１２（ＩＬ－１２）がＩｇＥ抑制を介して、アレルギー症状を緩和することが報告されている（非特許文献１）。このとき、抗原提示細胞への刺激には乳酸菌の細胞壁や細胞表面の多糖などが関与することが明らかとなっている（非特許文献２、３）。

【0004】

一方で、乳酸菌の培養に用いられる培地としては、食品素材として使用できない試薬を含むため、直接食品用途に使用できないものの、主にＭＲＳ（ｄｅＭａｎ Ｒｏｇｏｓａ Ｓｈａｒｐｅ）培地が全ての乳酸菌の発育を促すため、研究用途でよく用いられている。

【0005】

このＭＲＳ培地を改変して、乳酸菌のもつ免疫調節効果を高める方法については、これまでも様々な研究がされてきた。例えば、ＭＲＳ培地に塩化ナトリウムを加えて培養したラクトバチルス・サケイはＩＬ－１２産生誘導能が高くなること（非特許文献４）、ＭＲＳ培地から肉エキスを抜いて培養したラクトバチルス・ガッセリはＩＬ－１２産生誘導能が高くなること（非特許文献５）、および、ＭＲＳ培地を用いて中和培養したあと、培養後期において静置培養した乳酸菌はＩＬ－１２産生誘導能が高くなることが報告されている（特許文献１）。上述の方法にて、免疫調節作用を高められる理由としては、じっくりストレスをかけた培養による乳酸菌細胞壁の肥厚などが推測されている。

【0006】

ただし、中間原料としての乳酸菌は、複雑な製造設備を必要とせずに、乳酸菌を効率よく増やすことが望まれるが、上述のように乳酸菌にストレスをかけることは相反することになる。

【0007】

なお、ＩＬ－１２はサイトカインの１つであり、サイトカインとして、ＩＬ－１２などの炎症性サイトカイン、ＩＬ－１０などの抗炎症性サイトカインが知られている。ＩＬ－１０とＩＬ－１２は重要な免疫調節の役割を果たすことが報告されている（非特許文献６）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２０１４－１３１５０４号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Int Arch Allergy Immunol., 1998, Apr；115(4), 278-287

【非特許文献2】Langmuir., 2015, Feb；31(4), 1489-1495

【非特許文献3】J Dairy Sci., 2006、Sep；89(9), 3306-3317

【非特許文献4】ミルクサイエンス、2019、1号、68巻、37-43

【非特許文献5】Lett Appl Microbiol., 2011, Aug；53(2), 210-216

【非特許文献6】F1000Research., 2015, Dec, 1465

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の課題は、食品素材で構成された乳酸菌用の培地を用いて、複雑な製造設備を必要としない条件下、高い収率で乳酸菌が得られ、かつ免疫調節作用を効率的に高める培養方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、通常の培地に酵母エキス等から持ち込まれる量ひいては乳酸菌が生育に必要とする以上のグルタミン酸またはグルタミン酸塩を含む培地で培養することで、乳酸菌の免疫賦活効果を高められることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。

【0012】

即ち、前記課題を解決する手段は、下記のとおりである。
［１］グルタミン酸又はグルタミン酸塩を０．２％以上含む培地で培養することを特徴とするサイトカイン産生誘導能を高めた乳酸菌の製造方法。
［２］サイトカインが炎症性サイトカインまたは抗炎症性サイトカインである、［１］に記載の製造方法
［３］サイトカインがＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６またはそれらの組み合わせである、［１］に記載の製造方法。
［４］グルタミン酸又はグルタミン酸塩を０．２～６％含む培地で培養することを特徴とする［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］グルタミン酸又はグルタミン酸塩を１～６％含む培地で培養することを特徴とする［４］に記載の製造方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、連続式ｐＨ中和装置のような複雑な設備を必要とせず、通常の培地よりも乳酸菌数が多くなる、ひいては乳酸菌に高いストレスをかけない条件下で乳酸菌の免疫賦活効果を高めることができる。より具体的には、通常の培地に比べて約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２倍以上、約２．５倍以上、約３倍以上高めることができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＦＬ－６６４株（以下、ＦＬ－６６４）をＭＲＳと食品用（ＦＧ）培地で培養したときのｐＨ（Ａ）と生菌数（Ｂ）の経時変化を示す。

【図2】図２は、ＭＲＳ、あるいはＦＧ培地で培養したＦＬ－６６４でマウス脾臓細胞を２４時間刺激したときに培地上清に含まれるＩＬ－１２（ｐ４０）量を乳酸菌添加量依存的に示す。ｐ＜０．０１（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ ｍｅｔｈｏｄ）

【図3】図３は、ＭＲＳ、あるいはＦＧ培地で培養したＦＬ－６６４でマウス脾臓細胞を２４時間刺激したときに培地上清に含まれるＩＬ－１０量を乳酸菌添加量依存的に示す。

【図4】図４は、ＭＲＳ、あるいはＦＧ培地で培養したＦＬ－６６４でマウス脾臓細胞を２４時間刺激したときに培地上清に含まれるＴＮＦ－α量を乳酸菌添加量依存的に示す。ｐ＜０．０１（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ ｍｅｔｈｏｄ）

【図5】図５は、ＭＲＳ、あるいはＦＧ培地で培養したＦＬ－６６４でマウス脾臓細胞を２４時間刺激したときに培地上清に含まれるＩＬ－６量を乳酸菌添加量依存的に示す。ｐ＜０．０１（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ ｍｅｔｈｏｄ）

【図6】図６は、ＭＲＳ、あるいはＦＧ培地で培養したＦＬ－６６４でマウス脾臓細胞を刺激したときに培地上清に含まれるＩＬ－１２（ｐ４０）量を経時的に示す。ｐ＜０．０１（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｍｅｔｈｏｄ）

【図7】図７は、種々のグルタミン酸濃度にて培養したＦＬ－６６４でマウス脾臓細胞を２４時間刺激したときに培地上清に含まれるＩＬ－１２（ｐ４０）量を示す。＊＊：ｐ＜０．０１（ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｗｉｌｌｉａｍａｓ ｍｅｔｈｏｄ）。

【図8】図８は、グルタミン酸濃度を変えて培養した乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイＮＢＲＣ１５８８９株（以下ＮＢＲＣ１５８８９）でマウス脾臓細胞を２４時間刺激した時に培地上清に含まれるＩＬ－１２（ｐ４０）量を示す。＊＊：ｐ＜０．０１（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0016】

本開示に係る発酵処理に使用される乳酸菌としては、サイトカインの産生誘導能を有するものであれば特に限定されないが、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・パニス、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・プランタラム・サブスピーシーズ・プランタラム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・クンキー、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ストレプトコッカス・サーモフィラスなどが挙げられ、特にラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・パラカゼイが好ましい。当業者はこれらから選ばれる１種以上を使用することができる。

【0017】

乳酸菌の菌株としては、ラクトバチルス・プランタラムとしては、ラクトバチルス・プランタラムＦＬ－６６４等が挙げられる。また、ラクトバチルス・パラカゼイとしてはラクトバチルス・パラカゼイＮＢＲＣ１５８８９等が挙げられる。また、ラクトバチルス・ロイテリとしては、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１０８１、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１０８４等の菌株が挙げられる。また、ラクトバチルス・パニスとしてはラクトバチルス・パニスＪＣＭ１１０５３等が挙げられる。ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスとしては、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＪＣＭ１００２等が挙げられ、ラクトバチルス・アシドフィラスとしては、ラクトバチルス・アシドフィラスＪＣＭ１０３４等の菌株が挙げられる。ラクトバチルス・ブレビスとしてはラクトバチルス・ブレビスＪＣＭ１０６１等の菌株が挙げられ、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイとしては、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＪＣＭ１１０９等が挙げられる。ラクトバチルス・ガセリとしては、ラクトバチルス・ガセリＪＣＭ１１３１等の菌株が挙げられ、ラクトバチルス・プランタラム・サブスピーシーズ・プランタラムとしてはラクトバチルス・プランタラム・サブスピーシーズ・プランタラムＪＣＭ１１４９等の菌株が挙げられる。ラクトバチルス・ファーメンタムとしては、ラクトバチルス・ファーメンタムＪＣＭ１１７３等の菌株が挙げられ、ラクトバチルス・クンキーとしては、ラクトバチルス・クンキーＪＣＭ１６１７３等の菌株が挙げられる。ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスとしては、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５等が挙げられ、ラクトバチルス・ヘルベティカスとしては、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＬ－６５株等が、ストレプトコッカス・サーモフィラスとしては、ストレプトコッカス・サーモフィラスＦＬ－１７６株等が挙げられる。以上の菌株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターなど国内外の公的微生物保存機関から分譲を受けることが可能である。

【0018】

本開示におけるサイトカインは特に限定されず、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、ケモカイン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、より具体的にエリスロポエチン、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５、ＩＬ－２７、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－βなどが挙げられる。より具体的な例として、本開示におけるサイトカインはＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６またはそれらの組み合わせである。

【0019】

サイトカインのうち、ＩＬ－１２をはじめＴＮＦ-α、ＩＬ－６、ＩＦＮ-γなどは炎症性サイトカイン、ＩＬ－１０をはじめ、ＩＬ－４などは抗炎症性サイトカインの役割がある代表的なサイトカインであり、生体の免疫維持・向上等にはそのバランスが重要と言われている。本開示においては、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０の増加が確認されたことから、炎症、抗炎症の双方において調節作用が期待できる。

【0020】

本開示で使用する乳酸菌発酵の培地に用いられるグルタミン酸は、単独で添加することも、酵母エキスのように他のアミノ酸と混合されたものを添加することもできる。また、グルタミン酸の他に、アスパラギン酸のような他の酸性アミノ酸、グルタミン酸ナトリウムやグルタミン酸カリウムなどのグルタミン酸塩を添加することもできる。グルタミン酸又はグルタミン酸塩の配合量は、約０．２％以上、例えば約０．５％以上、好ましくは約１～約１０％、より好ましくは約１．５～約８％、さらに好ましく約２～約６％、またはこれらの間の任意の数となるように配合することが可能である。具体的なグルタミン酸の配合量は、例えば、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５および６％である。

【0021】

本開示で使用する乳酸菌発酵の培地には、ｐＨ調整、および香料添加などを行うことも可能である。ｐＨ調整の範囲、および使用する物質は特に限定されず、水酸化ナトリウムおよび炭酸カリウム、クエン酸三ナトリウム等の無機塩の他、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、および酢酸等の有機酸を使用し、乳酸菌発酵に適したｐＨ帯に調整することができる。使用する香料の種類や量も特に限定されず、必要な風味に合わせて調整することができる。

【0022】

上記のｐＨ調整にはリン酸水素２カリウム－クエン酸のような緩衝液を用いることもできる。ｐＨ調整剤の濃度は、原料、使用微生物、発酵温度、および目的とする風味などによって適宜選択することができ、通常は１０～１００ｍＭ、好ましくは２０～５０ｍＭまたはこれらの間の任意の数であるが、これらの濃度に限定されない。

【0023】

培地には、一部の乳酸菌が生育に必要とするＬ－システイン、マンガン、およびオレイン酸等の栄養素を添加することも可能である。これらはそのまま用いることも、これらを含有する食品を添加することも可能である。

【0024】

上記のなかで特にマンガンは、マンガン単独で添加することはできないが、マンガン酵母やマンガン含有酵母エキスといった形態で添加することもできる。マンガン含有酵母エキスの濃度は、原料、使用微生物、発酵温度、および目的とする風味などによって適宜選択することができ、通常は０．００２～０．２％、好ましくは０．０２％～０．２％またはこれらの間の任意の数であるが、これらの濃度に限定されない。

【0025】

本開示における発酵処理時間は、原料、使用微生物、発酵温度、および目的とする風味などにより適宜選択することができ、通常は約８時間～約１０８時間、好ましくは約１２時間～約９６時間、より好ましくは約１６時間～約７２時間またはこれらの間の任意の数であるが、これらの時間に限定されない。具体的な発酵時間は、例えば、約８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４８、６０、７２、８４、９６、および１０８時間である。

【0026】

本開示における発酵処理温度は、原料、使用微生物、発酵時間、および目的とする風味などにより適宜選択することができ、通常は約２０～約４５℃、好ましくは約２５～約４３℃、より好ましくは約３０～約４０℃またはこれらの間の任意の数であるが、これらの温度に限定されない。具体的な発酵時間は、例えば、約２０、２５、３０、３５、３７、４０、４３、および４５℃である。

【0027】

本開示における発酵処理開始時のｐＨは、原料、使用微生物、発酵温度、および目的とする風味などにより適宜選択することができ、通常は約ｐＨ３～９、好ましくは約ｐＨ４～８、より好ましくは約ｐＨ５～７またはこれらの間の任意の数であるが、これらのｐＨに限定されない。具体的なｐＨは、例えば、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、および９．０である。

【0028】

本明細書において「約」とは記載の数値の±１０％、好ましくは±５％の範囲を意味する。

【0029】

以下、本開示に係る実施例を説明するが、本開示の技術的範囲はこの説明に限定されるものではない。

【実施例0030】

＜ｐＨの分析＞
以下の実施例、比較例のｐＨは、卓上ｐＨメーターＬＡＱＵＡ（株式会社堀場製作所）を用いて分析を行った。

【0031】

＜乳酸菌数の測定＞
以下の実施例、比較例サンプルの乳酸菌生菌数は、ＢＣＰ加プレートカウントアガール（日水製薬株式会社）を用いて、メーカーの指定通りに測定した。また、死菌も含めた乳酸菌全菌数は、衛生試験法・注解（日本薬学会編、ｐ８３－８４（２０１５））を参考にＤＡＰＩ染色法にて行った。細胞に対する乳酸菌数添加量は全菌数にて決定した。

【0032】

＜乳酸菌スターターの調製例＞
ＭＲＳ培地（メルク社）をメーカー指定通りに調製し、３０℃に温度調整した。次いで、温度調整後の培養基にＦＬ－６６４株０．０５％を接種して生菌数１．０×１０^５～１．０×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ程度とし、３０℃で２０時間培養した。その後、発酵物を遠心分離して菌体を回収し、更に同量の滅菌生理食塩水にて懸濁し再度遠心分離して菌体を洗浄した。最終的に得られた菌体を滅菌生理食塩水にて再度懸濁し、生菌数１．０×１０^８～２．０×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ程度に調整したものをＦＬ－６６４スターターとした。

【0033】

前記ＦＬ－６６４スターター調製例から、接種する乳酸菌をラクトバチルス・パラカゼイＮＢＲＣ１５８８９に置き換え、その他は同様の工程を取ることで、ＮＢＲＣ１５８８９スターターを調製した。

【0034】

＜実施例１－１：食品グレード（ＦＧ）培地での乳酸菌の培養例＞
Ｌ－グルタミン酸ナトリウム（三菱商事ライフサイエンス株式会社）２％、ハイマルトースＭ７０－７５Ｃ（日本コーンスターチ株式会社）３％、酵母エキスＳＬ－Ｗ（三菱商事ライフサイエンス株式会社）０．６％、イーストリッチマンガン（オリエンタル酵母工業株式会社）０．０６％、リン酸水素二カリウム０．４３５％（米山化学工業株式会社）、液体クエン酸０．０７５％（扶桑化学工業株式会社）、水９２．８３％を混合し、食品グレード（ＦＧ）培地とした。混合した培地を９０℃で１５分間殺菌し、その後３０℃まで冷却した。殺菌後の培地に、上記で調製したＦＬ－６６４スターターを１％接種し、３０℃で２４時間発酵させた。発酵の停止は８０℃で５分間加熱することで行い、得られた発酵物を実施例１－１とした。

【0035】

＜比較例１－１：ＭＲＳ培地での乳酸菌の培養例＞
ＭＲＳ培地をメーカー指定通りに調製し、その後３０℃まで冷却した。殺菌後の培地に、上記で調製したＦＬ－６６４スターターを１％接種し、３０℃で２４時間発酵させた。発酵の停止は８０℃で５分間加熱することで行い、得られた発酵物を比較例１－１とした。

【0036】

前記の実施例１－１、比較例１－１についてｐＨと生菌数の経時変化を観察した。結果を図１（Ａ）、（Ｂ）に示す。

【0037】

ＦＧ培地では、１２～４８時間の観察中に継続して高い生菌数を保っていた。連続式中和装置などの特別な設備を必要とせず、ＭＲＳ培地と比較しても高い収率で乳酸菌が培養出来ていることがわかる。安定した比較を行うために、以下の試験は定常期である培養開始２４時間での比較を行っていくこととした。

【0038】

＜細胞刺激に用いる乳酸菌の調製例＞
実施例１－１、比較例１－１のように培養した乳酸菌をＤ－ＰＢＳで洗浄して、パインデックス＃１００（松谷化学工業株式会社）等のデキストリンを賦型剤として加え、凍結乾燥した。細胞刺激を行う際には、凍結乾燥した乳酸菌をＤ－ＰＢＳで遠心洗浄した後、適宜希釈した。

【0039】

＜マウス脾臓細胞の準備＞
１２週齢まで飼育したＢＡＬＢ／ｃ雄マウスは揮発性麻酔薬イソフルランの吸入麻酔下での心臓採血によって安楽死させた。取り出した脾臓は赤血球を取り除き、ＨＢＳＳ培地（ナカライテスク株式会社）で遠心洗浄した。洗浄した脾臓細胞は２．５×１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，Ｌｏｔ． Ｎｏ． ＡＥ２８２０９３１５）を含む、ＲＰＭＩに懸濁して準備した。

【0040】

＜初代マウス脾臓細胞に対する刺激活性評価＞
前記の実施例１－１、比較例１－１について、初代マウス脾臓細胞に対する刺激活性を、乳酸菌数の条件を振って調べた。細胞数：乳酸菌数＝１：０．５～５になるように３７℃・５％ＣＯ_２条件下で２４時間刺激を行い、ＩＬ－１２（Ｐ４０）、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６産生量を測定した。結果を図２～５に示す。

【0041】

ＦＧ培地で培養した乳酸菌を刺激に用いると、添加量依存的にＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６産生量が多くなった。これにより、サイトカインの産生誘導能が高められることが確認された。

【0042】

＜初代マウス脾臓細胞に対する刺激活性の経時変化＞
前記の実施例１－１、比較例１－１について、初代マウス脾臓細胞に対する刺激活性の経時変化を調べた。細胞数：乳酸菌数＝１：５になるように３７℃・５％ＣＯ_２条件下で３～７２時間刺激を行い、ＩＬ－１２（ｐ４０）産生量を測定した。結果を図６に示す。ＦＧ培地ではＩＬ－１２産生量を測定した。結果を図６に示す。

【0043】

ＩＬ－１２（ｐ４０）が産生される１２～７２時間のどの時間帯においても、ＦＧ培地で培養した乳酸菌を刺激に用いた方がＩＬ－１２（ｐ４０）産生量が多くなった。

【0044】

市販ＭＲＳ培地に含まれるＬ－グルタミン酸濃度をＨＰＬＣで測定したところ、約０．０２％含まれていたことから、Ｌ－グルタミン酸濃度違いによる初代マウス脾臓細胞に対する刺激活性を検証した。

【0045】

＜実施例２－１～２－６、比較例２－１：Ｌ－グルタミン酸濃度違いによる検証＞
前記の実施例１－１のうち、ハイマルトースＭ７０－７５Ｃをグルコース２．４％に、Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを０．０２～６％、培養時間を２４時間とし、その他は同様の工程を取ることでＬ－グルタミン酸ナトリウムが０．２～６％の実施例２－１～２－６、Ｌ－グルタミン酸ナトリウムが０．０２％の比較例２－１を調製した。

【0046】

前記の実施例２－１～２－６、比較例２－１について、初代マウス脾臓細胞に対する刺激活性を検証した。結果を図７に示す。

【0047】

培地へのＬ－グルタミン酸ナトリウム添加量依存的にＩＬ－１２（ｐ４０）産生量は多くなり、ＭＲＳ培地と同等の０．０２％添加と比較して、６％添加では１．６倍産生誘導能が高くなった。

【0048】

＜実施例３－１、比較例３－１：乳酸菌種の違いによる検証＞
スターターＦＬ－６６４をＮＢＲＣ１５８８９に置き換え、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム２％又は０．０２％とし、その他は同様の工程を取ることでＬ－グルタミン酸ナトリウム２％の実施例３－１、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム０．０２％の比較例３－１を調製した。

【0049】

前記の実施例３－１、比較例３－１について、初代マウス脾臓細胞に対する刺激活性を調べた。細胞数：乳酸菌数＝１：５になるように３７℃・５％ＣＯ_２条件下で２４時間刺激を行い、ＩＬ－１２産生量を測定した。結果を図８に示す。

【0050】

２％添加時に０．０２％添加時よりもＩＬ－１２産生量は多くなった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】