(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023057064
(43)【公開日】2023-04-20
(54)【発明の名称】ロドプシンの新規変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20230413BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20230413BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230413BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230413BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230413BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230413BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C07K14/195
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022162218
(22)【出願日】2022-10-07
(31)【優先権主張番号】P 2021165940
(32)【優先日】2021-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、未来社会創造事業、光駆動ＡＴＰ再生系によるＶｍａｘ細胞の創製、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】507219686
【氏名又は名称】静岡県公立大学法人
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(72)【発明者】
【氏名】原 清敬
(72)【発明者】
【氏名】原（弘埜） 陽子
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 創平
(72)【発明者】
【氏名】中野 祥吾
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 良樹
(72)【発明者】
【氏名】川崎 真由
(72)【発明者】
【氏名】松田 史生
(72)【発明者】
【氏名】戸谷 吉博
(72)【発明者】
【氏名】清家 泰介
(72)【発明者】
【氏名】大塚 健介
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065BC48
4B065CA60
4H045AA10
4H045CA11
4H045DA50
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ロドプシンの変異体およびそのタンパク質部分、これらをコードする核酸、これらを含む細胞、並びに当該細胞の培養方法を提供する。
【解決手段】高いプロトン輸送活性を発揮することができる、新しいアミノ酸配列を有する種々の変異ロドプシンを提供する。変異ロドプシンを発現する細胞を光照射条件下において培養する、前記細胞の培養方法も提供する。
【選択図】なし
【解決手段】高いプロトン輸送活性を発揮することができる、新しいアミノ酸配列を有する種々の変異ロドプシンを提供する。変異ロドプシンを発現する細胞を光照射条件下において培養する、前記細胞の培養方法も提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
［Ａ］配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分；
［Ｂ］配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分；または
［Ｃ］配列番号４に記載のアミノ酸配列（ここで３１番目のアミノ酸はＱであり、１２８番目のアミノ酸はＧである）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［Ｂ］配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分；または
［Ｃ］配列番号４に記載のアミノ酸配列（ここで３１番目のアミノ酸はＱであり、１２８番目のアミノ酸はＧである）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
【請求項2】
（１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有し、
配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる；
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる；または
（３）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し、
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる；
ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる；
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる；または
（３）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し、
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる；
ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
【請求項3】
配列番号４、５～７、１０、１１および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載のロドプシンまたはそのタンパク質部分。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質部分をコードする核酸。
【請求項5】
請求項１～３のいずれか一項に記載のロドプシンまたはそのタンパク質部分を含む、細胞。
【請求項6】
請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質部分をコードする核酸を含む、細胞。
【請求項7】
請求項５または６に記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
【請求項8】
培養が、光照射条件下において培養することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
アミノ酸配列または当該アミノ酸配列をコードする核酸配列を同定または選択する方法であって、
（ａ１）配列番号４に記載のアミノ酸配列（ここで３１番目のアミノ酸はＱであり、１２８番目のアミノ酸はＧである）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛配列番号４に記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、
（ｂ１）配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、または
（ｃ１）配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列から、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、方法。
（ａ１）配列番号４に記載のアミノ酸配列（ここで３１番目のアミノ酸はＱであり、１２８番目のアミノ酸はＧである）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛配列番号４に記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、
（ｂ１）配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、または
（ｃ１）配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列から、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、方法。
【請求項10】
アミノ酸配列または当該アミノ酸配列をコードする核酸配列を同定または選択する方法であって、
（ａ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、
（ｂ２）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、上記（１）～（６７）からなる群から選択される１以上の変異を有するアミノ酸配列を有するオプシンから、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、または、
（ｃ２）配列番号１２に記載のアミノ酸配列から、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、方法。
（ａ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、
（ｂ２）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、上記（１）～（６７）からなる群から選択される１以上の変異を有するアミノ酸配列を有するオプシンから、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、または、
（ｃ２）配列番号１２に記載のアミノ酸配列から、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ロドプシンの変異体およびそのタンパク質部分、これらをコードする核酸、これらを含む細胞、並びに当該細胞の培養方法に関する。
【0002】
微生物や細胞、生物を利用した物質生産は、化学物質の生産プロセスにおいて注目を集める１分野である。特許文献１では、ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシン（ｄＲ）をミトコンドリア内膜に発現した酵母が開示されている。
【0003】
特許文献１では、得られた酵母は光依存的にプロトン輸送能を示し、酵母のエネルギー産生を促進し、グルタチオン、トレハロース、およびコハク酸の産生能が向上することが示されている。特許文献２では、デルタロドプシン（ｄＲ）およびマリン・ピコプランクトン由来のプロテオロドプシン（ｐＲ）を発現した大腸菌が開示されている。
【0004】
特許文献２では、得られた大腸菌は光依存的にプロトン輸送能を示し、大腸菌のエネルギー産生を促進し、イソプレノールの産生能が向上することが示されている。特許文献３では、外来性のオプシンを導入された藍藻類などの光独立栄養生物に対してエネルギーを供給し、倍加時間、ＣＯ２固定速度、および／または炭素ベース産物形成の改善の効果をもたらすことが開示されている。非特許文献１では、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞のミトコンドリアにおけるオプシンの発現が、細胞にエネルギーを供給できることが示されている。例えば、これによりロテノンによる呼吸鎖複合体Ｉの阻害によりもたらされる細胞死を抑制し得ることが示されている。細胞へのエネルギー供給は、光駆動性の生物生産に適用されると期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】ＷＯ２０１５／１７０６０９Ａ
【特許文献2】ＷＯ２０２０／０５０１１３Ａ
【特許文献3】ＷＯ２００９／０６２１９０Ａ
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．， ３：１６３５， ２０１３
【発明の概要】
【0007】
本発明は、外来性のオプシンおよび当該ロドプシンを発現した細胞を提供する。本発明はまた、当該細胞を培養する方法を提供する。
【0008】
本発明者らは、ロドプシンをコードする遺伝子に改変を加えて、新しいアミノ酸配列を有する種々のロドプシンを得た。本発明はこのような発明に基づくものである。
【0009】
本発明によれば、例えば、以下の発明が提供される。
［１］（１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有し、
配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる；
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる；または
（３）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し、
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる；
ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
｛ここで、タンパク質部分とは、オールトランスレチナールと結合していない形態のオプシンであり得、以下同様である。｝
［２］配列番号４、５～７、１０～１３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する、上記［１］に記載のロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３］上記［１］または［２］に記載のタンパク質部分をコードする核酸。
［４］上記［１］または［２］に記載のロドプシンまたはそのタンパク質部分を含む、細胞。
［５］上記［１］または［２］に記載のタンパク質部分をコードする核酸を含む、細胞｛好ましくは、上記［１］または［２］に記載のロドプシンまたはタンパク質部分をさらに含んでいてもよい｝。
［６］上記［４］または［５］に記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
［７］培養が、光照射条件下において培養することを含む、上記［６］に記載の方法。
［１］（１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有し、
配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる；
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる；または
（３）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し、
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる；
ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
｛ここで、タンパク質部分とは、オールトランスレチナールと結合していない形態のオプシンであり得、以下同様である。｝
［２］配列番号４、５～７、１０～１３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する、上記［１］に記載のロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３］上記［１］または［２］に記載のタンパク質部分をコードする核酸。
［４］上記［１］または［２］に記載のロドプシンまたはそのタンパク質部分を含む、細胞。
［５］上記［１］または［２］に記載のタンパク質部分をコードする核酸を含む、細胞｛好ましくは、上記［１］または［２］に記載のロドプシンまたはタンパク質部分をさらに含んでいてもよい｝。
［６］上記［４］または［５］に記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
［７］培養が、光照射条件下において培養することを含む、上記［６］に記載の方法。
【0010】
［８］配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［９］上記［８］に記載のロドプシンまたはそのタンパク質部分であって、
配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸がＱであり、１２８番目のアミノ酸がＩである；
配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸がＡであり、１２８番目のアミノ酸がＧである；または
配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸がＱであり、１２８番目のアミノ酸がＧである、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１０］配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１１］配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１２］配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１３］配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１４］配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１５］配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１６］配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１７］配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１８］（Ａ）配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛好ましくは、配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有し、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分；
（Ｂ）配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛好ましくは、配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分；または
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列（ここで３１番目のアミノ酸はＱであり、１２８番目のアミノ酸はＧである）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛好ましくは、上記アミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１９］配列番号８のアミノ酸配列を有し、配列番号８のアミノ酸配列において、下記（１）～（６２）からなる群から選択される１以上の変異を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［２０］上記［８］～［１９］のいずれかに記載のタンパク質部分をコードする核酸。
［２１］上記［８］～［１９］のいずれかに記載のロドプシンまたはそのタンパク質部分を含む、細胞。
［２２］上記［８］～［１９］のいずれかに記載のタンパク質部分をコードする核酸を含む、細胞｛好ましくは、上記［８］～［１９］のいずれかに記載のロドプシンまたはそのタンパク質部分をさらに含んでいてもよい｝。
［２３］上記［２１］または［２２］に記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
［２４］培養が、光照射条件下において培養することを含む、上記［２３］に記載の方法。
［２５］アミノ酸配列または当該アミノ酸配列をコードする核酸配列を同定または選択する方法であって、
（ａ１）配列番号４に記載のアミノ酸配列（ここで３１番目のアミノ酸はＱであり、１２８番目のアミノ酸はＧである）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛好ましくは、上記アミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列を提供することと、当該アミノ酸配列を有するオプシン（またはドロプシン）から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシン（またはロドプシン）よりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、
（ｂ１）配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛好ましくは、配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列を提供することと、当該アミノ酸配列を有するオプシン（またはドロプシン）から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシン（またはロドプシン）よりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、または
（ｃ１）配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛好ましくは、配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列を提供することと、当該アミノ酸配列を有するオプシン（またはドロプシン）から、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するオプシン（またはロドプシン）よりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、方法。
［２６］アミノ酸配列または当該アミノ酸配列をコードする核酸配列を同定または選択する方法であって、
（ａ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列を提供することと、当該アミノ酸配列を有するオプシン（またはドロプシン）から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシン（またはロドプシン）よりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、
（ｂ２）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、下記（１）～（６７）からなる群から選択される１以上の変異を有するアミノ酸配列を提供することと、当該アミノ酸配列を有するオプシン（またはドロプシン）から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシン（またはロドプシン）よりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、または、
（ｃ２）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を提供することと、当該アミノ酸配列を有するオプシン（またはドロプシン）から、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するオプシン（またはロドプシン）よりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、方法。
［２７］上記［２５］または［２６］に記載の方法により得られたオプシンまたはオプシンをコードする核酸。
［２８］上記［２７］に記載のオプシンまたはオプシンをコードする核酸を含む細胞。
［２９］上記［２８］に記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
［３０］培養が、光照射条件下において培養することを含む、上記［２９］に記載の方法。
［９］上記［８］に記載のロドプシンまたはそのタンパク質部分であって、
配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸がＱであり、１２８番目のアミノ酸がＩである；
配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸がＡであり、１２８番目のアミノ酸がＧである；または
配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸がＱであり、１２８番目のアミノ酸がＧである、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１０］配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１１］配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１２］配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１３］配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１４］配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１５］配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１６］配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１７］配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１８］（Ａ）配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛好ましくは、配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有し、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分；
（Ｂ）配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛好ましくは、配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分；または
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列（ここで３１番目のアミノ酸はＱであり、１２８番目のアミノ酸はＧである）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛好ましくは、上記アミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［１９］配列番号８のアミノ酸配列を有し、配列番号８のアミノ酸配列において、下記（１）～（６２）からなる群から選択される１以上の変異を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができる、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［２０］上記［８］～［１９］のいずれかに記載のタンパク質部分をコードする核酸。
［２１］上記［８］～［１９］のいずれかに記載のロドプシンまたはそのタンパク質部分を含む、細胞。
［２２］上記［８］～［１９］のいずれかに記載のタンパク質部分をコードする核酸を含む、細胞｛好ましくは、上記［８］～［１９］のいずれかに記載のロドプシンまたはそのタンパク質部分をさらに含んでいてもよい｝。
［２３］上記［２１］または［２２］に記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
［２４］培養が、光照射条件下において培養することを含む、上記［２３］に記載の方法。
［２５］アミノ酸配列または当該アミノ酸配列をコードする核酸配列を同定または選択する方法であって、
（ａ１）配列番号４に記載のアミノ酸配列（ここで３１番目のアミノ酸はＱであり、１２８番目のアミノ酸はＧである）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛好ましくは、上記アミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列を提供することと、当該アミノ酸配列を有するオプシン（またはドロプシン）から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシン（またはロドプシン）よりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、
（ｂ１）配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛好ましくは、配列番号５～７、および１３のいずれかに記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列を提供することと、当該アミノ酸配列を有するオプシン（またはドロプシン）から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシン（またはロドプシン）よりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、または
（ｃ１）配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列｛好ましくは、配列番号１０または１１に記載のアミノ酸配列から１から数個のアミノ酸変異（特に、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１以上の変異）を有するアミノ酸配列｝を有するアミノ酸配列を提供することと、当該アミノ酸配列を有するオプシン（またはドロプシン）から、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するオプシン（またはロドプシン）よりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、方法。
［２６］アミノ酸配列または当該アミノ酸配列をコードする核酸配列を同定または選択する方法であって、
（ａ２）配列番号４に記載のアミノ酸配列を提供することと、当該アミノ酸配列を有するオプシン（またはドロプシン）から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシン（またはロドプシン）よりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、
（ｂ２）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、下記（１）～（６７）からなる群から選択される１以上の変異を有するアミノ酸配列を提供することと、当該アミノ酸配列を有するオプシン（またはドロプシン）から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシン（またはロドプシン）よりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、または、
（ｃ２）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を提供することと、当該アミノ酸配列を有するオプシン（またはドロプシン）から、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するオプシン（またはロドプシン）よりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む、方法。
［２７］上記［２５］または［２６］に記載の方法により得られたオプシンまたはオプシンをコードする核酸。
［２８］上記［２７］に記載のオプシンまたはオプシンをコードする核酸を含む細胞。
［２９］上記［２８］に記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
［３０］培養が、光照射条件下において培養することを含む、上記［２９］に記載の方法。
【0011】
［３１］配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸が、Ａ以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３２］配列番号４に記載のアミノ酸配列の１２８番目のアミノ酸が、Ｉ以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３３］配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸が、Ｑであるアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３４］配列番号４に記載のアミノ酸配列の１２８番目のアミノ酸が、Ｇであるアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３５］配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸が、Ａ以外のアミノ酸であり、１２８番目のアミノ酸が、Ｉ以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３６］配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸が、Ｑであり、１２８番目のアミノ酸が、Ｇであるアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３７］上記［３１］～［３６］のいずれか記載のタンパク質部分をコードする核酸。
［３８］上記［３１］～［３６］のいずれか記載のタンパク質部分を含む、細胞。
［３９］上記［３１］～［３６］のいずれか記載のタンパク質部分をコードする核酸を含む、細胞｛好ましくは、上記［３１］～［３６］のいずれか記載のロドプシンまたはタンパク質部分をさらに含んでいてもよい｝。
［４０］上記［３８］または［３９］に記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
［４１］培養が、光照射条件下において培養することを含む、上記［４０］に記載の方法。
［３２］配列番号４に記載のアミノ酸配列の１２８番目のアミノ酸が、Ｉ以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３３］配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸が、Ｑであるアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３４］配列番号４に記載のアミノ酸配列の１２８番目のアミノ酸が、Ｇであるアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３５］配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸が、Ａ以外のアミノ酸であり、１２８番目のアミノ酸が、Ｉ以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３６］配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸が、Ｑであり、１２８番目のアミノ酸が、Ｇであるアミノ酸配列を有する、ロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［３７］上記［３１］～［３６］のいずれか記載のタンパク質部分をコードする核酸。
［３８］上記［３１］～［３６］のいずれか記載のタンパク質部分を含む、細胞。
［３９］上記［３１］～［３６］のいずれか記載のタンパク質部分をコードする核酸を含む、細胞｛好ましくは、上記［３１］～［３６］のいずれか記載のロドプシンまたはタンパク質部分をさらに含んでいてもよい｝。
［４０］上記［３８］または［３９］に記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
［４１］培養が、光照射条件下において培養することを含む、上記［４０］に記載の方法。
【0012】
［５０］レチナール合成系を含む、上記［４］、［５］、［１６］、［１８］、［３８］または［３９］に記載の細胞。
［５１］上記［５０］に記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
［５２］培養が、光照射条件下において培養することを含む、上記［５１］に記載の方法。
［５１］上記［５０］に記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
［５２］培養が、光照射条件下において培養することを含む、上記［５１］に記載の方法。
【0013】
［７０］上記いずれかのロドプシンを細胞膜に有する原核細胞である、上記いずれかの細胞。
［７１］上記いずれかのロドプシンをミトコンドリア内膜に有する真核細胞である、上記いずれかの細胞。
［７２］ミトコンドリア移行シグナルをさらに有する上記いずれかのロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［７３］ミトコンドリア移行シグナルをさらに有する上記いずれかのロドプシンをミトコンドリア内膜に有する真核細胞である、上記いずれかの細胞。
［７４］上記［７０］～［７３］のいずれかに記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
［７５］培養が、光照射条件下において培養することを含む、上記［７４］に記載の方法。
［７１］上記いずれかのロドプシンをミトコンドリア内膜に有する真核細胞である、上記いずれかの細胞。
［７２］ミトコンドリア移行シグナルをさらに有する上記いずれかのロドプシンまたはそのタンパク質部分。
［７３］ミトコンドリア移行シグナルをさらに有する上記いずれかのロドプシンをミトコンドリア内膜に有する真核細胞である、上記いずれかの細胞。
［７４］上記［７０］～［７３］のいずれかに記載の細胞を培養する方法であって、
当該細胞をその培養に適した培養条件下で培養することを含む、方法。
［７５］培養が、光照射条件下において培養することを含む、上記［７４］に記載の方法。
【0014】
［９０］光照射が、２０００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下で行われる、上記いずれかに記載の方法。
［９１］光照射が、１０００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下で行われる、上記いずれかに記載の方法。
［９２］光照射が、５００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下で行われる、上記いずれかに記載の方法。
［９３］光照射が、１００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下で行われる、上記いずれかに記載の方法。
［９１］光照射が、１０００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下で行われる、上記いずれかに記載の方法。
［９２］光照射が、５００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下で行われる、上記いずれかに記載の方法。
［９３］光照射が、１００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下で行われる、上記いずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明の具体的な説明】
【0016】
「ロドプシン」とは、オプシン（Ｏｐｓｉｎ）というタンパク質とレチナール（Ｒｅｔｉｎａｌ）の複合体である。ロドプシンの種類としては、例えばデルタロドプシン（ｄＲ）、バクテリオロドプシン（ｂＲ）およびｂＲ型ロドプシン（例えば、アーキアロドプシン、クルックスロドプシン）、センサリーロドプシンＩ、センサリーロドプシンＩＩ、プロテオロドプシン（ｐＲ）およびｐＲ型ロドプシン、チャンネルロドプシンＩ、チャンネルロドプシンＩＩ、ハロロドプシン、キサントロドプシン、ナトリウムポンプ型ロドプシン、ヘリオロドプシンなどが挙げられる。例えば、デルタロドプシン、バクテリオロドプシン、およびプロテオロドプシンは、原核生物の細胞膜に局在し、明条件（光照射）によりプロトンを原核生物の内部から外部へ汲み出す機能を有する。原核生物においては、細胞膜内外のプロトン濃度勾配は、ＡＴＰ産生に利用され得る。真核生物においては、ミトコンドリア内膜は酸化的リン酸化経路を有し、膜内から膜外にプロトンを輸送してプロトン濃度勾配を形成する。このプロトン濃度勾配は、ＡＴＰ産生に利用される。したがって、真核生物に対しては、ミトコンドリア内膜にオプシンを発現させることによって、プロトン濃度勾配を光依存的に形成させ、ＡＴＰ産生を促進することができる。
【0017】
本明細書では、「オプシン」は、７回膜貫通構造を有する膜タンパク質である。ビタミンＡ誘導体であるレチナールが結合することにより光受容能を獲得する。オプシンの例としては、例えば、表１に記載のオプシンが挙げられる。しかし、これらがすべて異種生物においてプロトン輸送能を奏するわけではない。オプシンとしては、特に限定されないが、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｓｐ．、Ｏｃｔａｄｅｃａｂａｃｔｅｒ ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＳＫＡ３４、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ６６Ａ０３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭｅｄｅＢＡＣ３５Ｃ０６、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＨＦ１０１９Ｐ１９、およびＰｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓからなる群から選択される少なくとも１つの種のオプシンが挙げられる。これらのオプシンは、有意なプロトン輸送能を有する。光依存的にプロトンの濃度勾配を形成させることができるオプシンの機能的変種もオプシンに含まれる。
【0018】
本明細書では、「オプシンをコードする遺伝子」とは、制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結したオプシンをコードする遺伝子である。制御配列は、宿主（遺伝子を導入した細胞）においてオプシンの転写を誘導することができる。オプシンをコードする遺伝子は、宿主に対してコドン最適化がなされていてもよい。宿主によってコドン使用が異なるために特に異種のオプシンを導入する場合には、コドン最適化を行うことが好ましい。オプシンをコードする遺伝子は、宿主における複製に適した複製起点を有する、または有しないベクター（例えば、プラスミド）上に組み込まれ得る。ベクターは、栄養要求性マーカーおよび／または薬剤選択マーカーを有していてもよく、栄養要求性マーカーおよび／または薬剤選択マーカーを有する場合には、当該栄養および／または薬剤でベクターが導入された宿主を選択することができる。制御配列は、構成的プロモーターであっても、誘導性プロモーターであってもよい。オプシンは細胞において発現し、膜内でレチナールと結合するとロドプシンと呼ばれる。ロドプシンを発現しているとは、膜内でレチナールと結合した形態のオプシンを有することを意味する。本明細書では、「ロドプシンをコードする遺伝子」が用いられ得るが、オプシンをコードする遺伝子と同義である。
【0019】
本明細書では、生物は、原核生物と真核生物に大別される。また、生物は、単細胞生物と多細胞生物にも大別される。通常は、原核生物は単細胞であり、真核生物には、単細胞生物であるものと多細胞生物であるものとが存在する。原核生物としては、例えば、細菌、古細菌（アーキア）、ラン藻（シアノバクテリア）および放線菌が挙げられる。具体的には、大腸菌（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、枯草菌（例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、乳酸菌（例えば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ））、酢酸菌（例えば、アセトバクテラセエ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ））、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂａｃｔｅｒｉａ）、メタン生成菌（例えば、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ））、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等が挙げられる。真核生物としては、動物、植物、菌類（真菌類）が挙げられる。真菌類としては、例えば、分裂酵母または出芽酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・フラギリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、サッカロミセス・ルーキシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）などのサッカロミセス属、シゾサッカロミセス・ポンべ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）などのキャンディダ属、キサントフィロマイセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）などのキサントフィロマイセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロイワ（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ハンゼニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、エンドマイセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属などの酵母が挙げられる。中でも、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、キャンディダ属、キサントフィロマイセス属またはピキア属の酵母が好ましく、サッカロミセス属のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属のシゾサッカロミセス・ポンべ（Ｓ． ｐｏｍｂｅ）、キャンディダ属のキャンディダ・ユーティリス（Ｃ． ｕｔｉｌｉｓ）がより好ましく、最も好ましくはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。糸状菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ），トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ），ヒュミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ），アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ），フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ），ブラケスリア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種）、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来細胞、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）由来細胞）、カイコ、線虫、植物細胞、藻類（大型藻類、微細藻類）、植物（例えば、シロイヌナズナ、タバコ）、哺乳類培養細胞（たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト細胞）が挙げられる。細胞は、藻類（大型藻類、微細藻類）であってもよい。細胞または生物は、光合成する細胞または生物（光合成細胞または光合成生物）であってもよいし、光合成しない細胞または生物（非光合成細胞または非光合成生物）であってもよい。オプシンの導入によって、どのような場合でもプロトン濃度勾配形成が促進され、エネルギー産生が促進されるからである。オプシンをコードする遺伝子が導入される生物または細胞を、本明細書では「宿主」と呼ぶことがある。
【0020】
本明細書では、「外来性」は、宿主以外の生物に由来することを意味する。典型的には、制御配列は、外来性であり得る。また、発現させる遺伝子も外来性であり得る。したがって、制御配列に作動可能に連結された遺伝子は、制御配列および当該遺伝子の両方が外来性であり得る。「内因性」は、宿主自体が有するものであることを意味する。
【0021】
本明細書では、「レチナール合成系」とは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からオールトランスレチナール（ＡＴＲ）を合成する多段階経路である。レチナール合成系では、下記［１］～［７］により、ＩＰＰからＡＴＲが合成される。
［１］ＩＰＰは、ＩＰＰδ－イソメラーゼにより、ジメチルアリール二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換される。
［２］ＤＭＡＰＰは、ＦＰＰ合成酵素（ｉｓｐＡ）により、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）に変換される。
［３］ＦＰＰは、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｃｒｔＥ）により、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）に変換される。
［４］ＧＧＰＰは、フィトエン合成酵素（ｃｒｔＢ）により、フィトエンに変換される。
［５］フィトエンは、フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）により、リコペンに変換される。
［６］リコペンは、リコペンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）により、β－カロテンに変換される。
［７］β－カロテンは、１５，１５’－β－カロテンジオキシゲナーゼ（ｂｌｈ）により開裂し、２つのオールトランスレチナール（ＡＴＲ）に変換される。
ＩＰＰは、メバロン酸経路または非メバロン酸経路により産生され得る。
［１］ＩＰＰは、ＩＰＰδ－イソメラーゼにより、ジメチルアリール二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換される。
［２］ＤＭＡＰＰは、ＦＰＰ合成酵素（ｉｓｐＡ）により、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）に変換される。
［３］ＦＰＰは、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｃｒｔＥ）により、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）に変換される。
［４］ＧＧＰＰは、フィトエン合成酵素（ｃｒｔＢ）により、フィトエンに変換される。
［５］フィトエンは、フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）により、リコペンに変換される。
［６］リコペンは、リコペンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）により、β－カロテンに変換される。
［７］β－カロテンは、１５，１５’－β－カロテンジオキシゲナーゼ（ｂｌｈ）により開裂し、２つのオールトランスレチナール（ＡＴＲ）に変換される。
ＩＰＰは、メバロン酸経路または非メバロン酸経路により産生され得る。
【0022】
本明細書では、「レチナール合成系の一連の酵素」とは、上記［１］～［７］の酵素一式をいう。細胞によっては、内在性の酵素を有している場合がある。例えば、大腸菌および酵母は、ＩＰＰδ－イソメラーゼとｉｓｐＡを有している。したがって、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹを大腸菌に追加すると当該大腸菌および酵母はβ－カロテンを合成するようになる。大腸菌および酵母にｂｌｈをさらに追加することによって、当該大腸菌および酵母は、オールトランスレチナールを合成するようになる。このようにレチナール合成系の一連の酵素を有するとは、外来性の酵素と内在性の酵素とを合わせてレチナール合成系の一連の酵素をすべて有することを含む。もちろん、レチナール合成系の一連の酵素のすべてを外来性に供給してもよい。細胞が、いずれの酵素を有するかは、遺伝子の有無を解析することによって、あるいは遺伝子産物を解析することによって当業者であれば適宜決定することができる。ある態様では、宿主は、ＩＰＰδ－イソメラーゼ、ＦＰＰ合成酵素（ｉｓｐＡ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｃｒｔＥ）、フィトエン合成酵素（ｃｒｔＢ）、フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）、リコペンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）、および１５，１５’－β－カロテンジオキシゲナーゼ（ｂｌｈ）からなる群から選択されるすべての酵素を発現している。ある態様では、宿主は、ＩＰＰδ－イソメラーゼ、ＦＰＰ合成酵素（ｉｓｐＡ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｃｒｔＥ）、フィトエン合成酵素（ｃｒｔＢ）、フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）、リコペンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）、および１５，１５’－β－カロテンジオキシゲナーゼ（ｂｌｈ）からなる群から選択される一部、またはすべてをコードする外来性の遺伝子を有する｛但し、宿主が内因性に有する酵素または遺伝子は有しなくてもよい｝。
【0023】
本開示によれば、新規変異を有するロドプシンまたはそのタンパク質部分（すなわちオプシン部分）が提供され得る。本開示によれば、新規変異を有するロドプシンまたはそのタンパク質部分（すなわちオプシン部分）をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）が提供され得る。本開示によればまた、当該核酸を有する細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）が提供され得る。本開示によれば、当該核酸を有する細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）を培養する方法が提供され得る。真核細胞は、新規変異を有するロドプシンまたはそのタンパク質部分（すなわちオプシン部分）をミトコンドリア内膜上に発現していることができる。原核細胞は、新規変異を有するロドプシンまたはそのタンパク質部分（すなわちオプシン部分）を形質膜（すなわち細胞膜）上に発現していることができる。
【0024】
ある態様では、新規変異を有するロドプシンまたはそのタンパク質部分（すなわちオプシン部分）は、配列番号３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。本開示によれば、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮し得るロドプシンまたはそのタンパク質部分が提供され得る。本開示によれば、細胞に発現させたときに、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高い細胞増殖能を付与することができるロドプシンまたはそのタンパク質部分が提供され得る。
【0025】
本開示によれば、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮し得るロドプシンまたはそのタンパク質部分が提供され得る。本開示によれば、細胞に発現させたときに、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高い細胞増殖能を付与することができるロドプシンまたはそのタンパク質部分が提供され得る。
【0026】
本開示によれば、本開示のロドプシン変異体は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し得る。ある態様では、配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸が、Ａではない。ある態様では、配列番号４に記載のアミノ酸配列の１２８番目のアミノ酸が、Ｉではない。ある態様では、配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸がＡではなく、１２８番目のアミノ酸がＩではない。好ましくは、上記ロドプシン変異体は、好ましくは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮し得る。ある態様では、配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸が、Ｑである。ある態様では、配列番号４に記載のアミノ酸配列の１２８番目のアミノ酸が、Ｇである。ある態様では、配列番号４に記載のアミノ酸配列の３１番目のアミノ酸が、Ｑであり、かつ、配列番号４に記載のアミノ酸配列の１２８番目のアミノ酸が、Ｇである。
【0027】
本開示のロドプシン変異体は、ある態様では、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し得る（但し、配列番号３のアミノ酸配列とは異なる配列を有する）。
【0028】
以下本開示の好ましいロドプシン変異体が有する配列の説明が提供される。本開示の好ましいロドプシンは、配列番号８のアミノ酸配列を有し、配列番号８のアミノ酸配列において、下記（１）～（６２）からなる群から選択される１以上の変異を有する（但し、配列番号３のアミノ酸配列とは異なる配列を有する）：
（１）１番目のＸａａは、存在しないまたは天然のアミノ酸であり得、好ましくは存在しない、またはＭであり得る；
（２）３２番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＱ）であり得る；
（３）３４番目のアミノ酸は、ＮまたはＮ以外のアミノ酸（好ましくはＤ）であり得る；
（４）３６番目のアミノ酸は、ＹまたはＹ以外のアミノ酸（好ましくはＦ）であり得る；
（５）４８番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＭ）であり得る；
（６）４９番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（７）５１番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（８）５３番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（９）５７番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＭ）であり得る；
（１０）５９番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１１）６０番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＮまたはＱ）であり得る；
（１２）６３番目のアミノ酸は、ＥまたはＥ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（１３）６４番目のアミノ酸は、ＧまたはＧ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１４）６７番目のアミノ酸は、ＫまたはＫ以外のアミノ酸（好ましくはＲ）であり得る；
（１５）７３番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１６）７９番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（１７）９３番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１８）９７番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＴ）であり得る；
（１９）１０８番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（２０）１１３番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＱ）であり得る；
（２１）１１５番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（２２）１２２番目のアミノ酸は、ＲまたはＲ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（２３）１２４番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（２４）１２５番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＧ）であり得る；
（２５）１２６番目のアミノ酸は、ＫまたはＫ以外のアミノ酸（好ましくはＮまたはＡ）であり得る；
（２６）１２９番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（２７）１３６番目のアミノ酸は、ＭまたはＭ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（２８）１４０番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（２９）１４４番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（３０）１４５番目のアミノ酸は、ＧまたはＧ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（３１）１４８番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（３２）１５１番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（３３）１５５番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＮ）であり得る；
（３４）１５６番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（３５）１５８番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（３６）１６１番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（３７）１６５番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（３８）１６８番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＩまたはＶ）または場合によってはＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（３９）１８０番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＧ）であり得る；
（４０）１８２番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（４１）１８３番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（４２）１８５番目のアミノ酸は、ＤまたはＤ以外のアミノ酸（好ましくはＥ）であり得る；
（４３）１８６番目のアミノ酸は、ＥまたはＥ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（４４）１８８番目のアミノ酸は、ＰまたはＰ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（４５）１８９番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＥ）であり得る；
（４６）１９０番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（４７）１９２番目のアミノ酸は、ＱまたはＱ以外のアミノ酸（好ましくはＫ）であり得る；
（４８）１９５番目のアミノ酸は、ＦまたはＦ以外のアミノ酸（好ましくはＹ）であり得る；
（４９）１９６番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＮ）であり得る；
（５０）１９７番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（５１）２０４番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（５２）２１５番目のアミノ酸は、ＭまたはＭ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（５３）２１９番目のアミノ酸は、ＮまたはＮ以外のアミノ酸（好ましくはＡまたはＴ）であり得る；
（５４）２２３番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＤ）であり得る；
（５５）２２５番目のアミノ酸は、ＥまたはＥ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（５６）２２６番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＴ）であり得る；
（５７）２２９番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（５８）２３３番目のアミノ酸は、ＦまたはＦ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（５９）２３６番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＦ）であり得る；
（６０）２３７番目のアミノ酸は、ＭまたはＭ以外のアミノ酸（好ましくはＬまたはＶ）であり得る；
（６１）２４４番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；および
（６２）２４５番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る。
（１）１番目のＸａａは、存在しないまたは天然のアミノ酸であり得、好ましくは存在しない、またはＭであり得る；
（２）３２番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＱ）であり得る；
（３）３４番目のアミノ酸は、ＮまたはＮ以外のアミノ酸（好ましくはＤ）であり得る；
（４）３６番目のアミノ酸は、ＹまたはＹ以外のアミノ酸（好ましくはＦ）であり得る；
（５）４８番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＭ）であり得る；
（６）４９番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（７）５１番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（８）５３番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（９）５７番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＭ）であり得る；
（１０）５９番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１１）６０番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＮまたはＱ）であり得る；
（１２）６３番目のアミノ酸は、ＥまたはＥ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（１３）６４番目のアミノ酸は、ＧまたはＧ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１４）６７番目のアミノ酸は、ＫまたはＫ以外のアミノ酸（好ましくはＲ）であり得る；
（１５）７３番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１６）７９番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（１７）９３番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１８）９７番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＴ）であり得る；
（１９）１０８番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（２０）１１３番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＱ）であり得る；
（２１）１１５番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（２２）１２２番目のアミノ酸は、ＲまたはＲ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（２３）１２４番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（２４）１２５番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＧ）であり得る；
（２５）１２６番目のアミノ酸は、ＫまたはＫ以外のアミノ酸（好ましくはＮまたはＡ）であり得る；
（２６）１２９番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（２７）１３６番目のアミノ酸は、ＭまたはＭ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（２８）１４０番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（２９）１４４番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（３０）１４５番目のアミノ酸は、ＧまたはＧ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（３１）１４８番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（３２）１５１番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（３３）１５５番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＮ）であり得る；
（３４）１５６番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（３５）１５８番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（３６）１６１番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（３７）１６５番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（３８）１６８番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＩまたはＶ）または場合によってはＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（３９）１８０番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＧ）であり得る；
（４０）１８２番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（４１）１８３番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（４２）１８５番目のアミノ酸は、ＤまたはＤ以外のアミノ酸（好ましくはＥ）であり得る；
（４３）１８６番目のアミノ酸は、ＥまたはＥ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（４４）１８８番目のアミノ酸は、ＰまたはＰ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（４５）１８９番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＥ）であり得る；
（４６）１９０番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（４７）１９２番目のアミノ酸は、ＱまたはＱ以外のアミノ酸（好ましくはＫ）であり得る；
（４８）１９５番目のアミノ酸は、ＦまたはＦ以外のアミノ酸（好ましくはＹ）であり得る；
（４９）１９６番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＮ）であり得る；
（５０）１９７番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（５１）２０４番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（５２）２１５番目のアミノ酸は、ＭまたはＭ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（５３）２１９番目のアミノ酸は、ＮまたはＮ以外のアミノ酸（好ましくはＡまたはＴ）であり得る；
（５４）２２３番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＤ）であり得る；
（５５）２２５番目のアミノ酸は、ＥまたはＥ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（５６）２２６番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＴ）であり得る；
（５７）２２９番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（５８）２３３番目のアミノ酸は、ＦまたはＦ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（５９）２３６番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＦ）であり得る；
（６０）２３７番目のアミノ酸は、ＭまたはＭ以外のアミノ酸（好ましくはＬまたはＶ）であり得る；
（６１）２４４番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；および
（６２）２４５番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る。
【0029】
以下本開示の好ましいロドプシン変異体が有する配列の説明が提供される。本開示の好ましいロドプシンは、配列番号８のアミノ酸配列を有し、配列番号８のアミノ酸配列において、下記（１Ａ）～（６７Ａ）からなる群から選択される１以上の変異を有する（但し、配列番号３のアミノ酸配列とは異なる配列を有する）：
（１Ａ）１番目のＸａａは、存在しないまたは天然のアミノ酸であり得、好ましくは存在しない、またはＭであり得る；
（２Ａ）３２番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＱ）であり得る；
（３Ａ）３４番目のアミノ酸は、ＮまたはＮ以外のアミノ酸（好ましくはＤ）であり得る；
（４Ａ）３６番目のアミノ酸は、ＹまたはＹ以外のアミノ酸（好ましくはＦ）であり得る；
（５Ａ）４３番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（６Ａ）４８番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＭ）であり得る；
（７Ａ）４９番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（８Ａ）５１番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（９Ａ）５３番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（１０Ａ）５７番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＭ）であり得る；
（１１Ａ）５９番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１２Ａ）６０番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＮまたはＱまたはＧ）であり得る；
（１３Ａ）６３番目のアミノ酸は、ＥまたはＥ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（１４Ａ）６４番目のアミノ酸は、ＧまたはＧ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１５Ａ）６７番目のアミノ酸は、ＫまたはＫ以外のアミノ酸（好ましくはＲ）であり得る；
（１６Ａ）７３番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１７Ａ）７９番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（１８Ａ）９３番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１９Ａ）９７番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＴ）であり得る；
（２０Ａ）１０８番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（２１Ａ）１１３番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＱ）であり得る；
（２２Ａ）１１５番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（２３Ａ）１２２番目のアミノ酸は、ＲまたはＲ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（２４Ａ）１２４番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（２５Ａ）１２５番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＧ）であり得る；
（２６Ａ）１２６番目のアミノ酸は、ＫまたはＫ以外のアミノ酸（好ましくはＮまたはＡ）であり得る；
（２７Ａ）１２９番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（２８Ａ）１３６番目のアミノ酸は、ＭまたはＭ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（２９Ａ）１３９番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（３０Ａ）１４０番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（３１Ａ）１４４番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（３２Ａ）１４５番目のアミノ酸は、ＧまたはＧ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（３３Ａ）１４８番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（３４Ａ）１５１番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（３５Ａ）１５５番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＮ）であり得る；
（３６Ａ）１５６番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（３７Ａ）１５７番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＷ）であり得る；
（３８Ａ）１５８番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（３９Ａ）１６１番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（４０Ａ）１６５番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（４１Ａ）１６８番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＩまたはＶ）であり得る；
（４２Ａ）１８０番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＧ）であり得る；
（４３Ａ）１８２番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（４４Ａ）１８３番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（４５Ａ）１８５番目のアミノ酸は、ＤまたはＤ以外のアミノ酸（好ましくはＥ）であり得る；
（４６Ａ）１８６番目のアミノ酸は、ＥまたはＥ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（４７Ａ）１８８番目のアミノ酸は、ＰまたはＰ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（４８Ａ）１８９番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＥ）であり得る；
（４９Ａ）１９０番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（５０Ａ）１９２番目のアミノ酸は、ＱまたはＱ以外のアミノ酸（好ましくはＫ）であり得る；
（５１Ａ）１９５番目のアミノ酸は、ＦまたはＦ以外のアミノ酸（好ましくはＹ）であり得る；
（５２Ａ）１９６番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＮ）であり得る；
（５３Ａ）１９７番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（５４Ａ）２００番目のアミノ酸は、ＷまたはＷ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（５５Ａ）２０４番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（５６Ａ）２１５番目のアミノ酸は、ＭまたはＭ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（５７Ａ）２１９番目のアミノ酸は、ＮまたはＮ以外のアミノ酸（好ましくはＡまたはＴまたはＧ）であり得る；
（５８Ａ）２２３番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＤ）であり得る；
（５９Ａ）２２４番目のアミノ酸は、ＤまたはＤ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（６０Ａ）２２５番目のアミノ酸は、ＥまたはＥ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（６１Ａ）２２６番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＴ）であり得る；
（６２Ａ）２２９番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（６３Ａ）２３３番目のアミノ酸は、ＦまたはＦ以外のアミノ酸（好ましくはＬまたはＶ）であり得る；
（６４Ａ）２３６番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＦ）であり得る；
（６５Ａ）２３７番目のアミノ酸は、ＭまたはＭ以外のアミノ酸（好ましくはＬまたはＶ）であり得る；
（６６Ａ）２４４番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；および
（６７Ａ）２４５番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る。
（１Ａ）１番目のＸａａは、存在しないまたは天然のアミノ酸であり得、好ましくは存在しない、またはＭであり得る；
（２Ａ）３２番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＱ）であり得る；
（３Ａ）３４番目のアミノ酸は、ＮまたはＮ以外のアミノ酸（好ましくはＤ）であり得る；
（４Ａ）３６番目のアミノ酸は、ＹまたはＹ以外のアミノ酸（好ましくはＦ）であり得る；
（５Ａ）４３番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（６Ａ）４８番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＭ）であり得る；
（７Ａ）４９番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（８Ａ）５１番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（９Ａ）５３番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（１０Ａ）５７番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＭ）であり得る；
（１１Ａ）５９番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１２Ａ）６０番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＮまたはＱまたはＧ）であり得る；
（１３Ａ）６３番目のアミノ酸は、ＥまたはＥ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（１４Ａ）６４番目のアミノ酸は、ＧまたはＧ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１５Ａ）６７番目のアミノ酸は、ＫまたはＫ以外のアミノ酸（好ましくはＲ）であり得る；
（１６Ａ）７３番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１７Ａ）７９番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（１８Ａ）９３番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（１９Ａ）９７番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＴ）であり得る；
（２０Ａ）１０８番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（２１Ａ）１１３番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＱ）であり得る；
（２２Ａ）１１５番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（２３Ａ）１２２番目のアミノ酸は、ＲまたはＲ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（２４Ａ）１２４番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（２５Ａ）１２５番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＧ）であり得る；
（２６Ａ）１２６番目のアミノ酸は、ＫまたはＫ以外のアミノ酸（好ましくはＮまたはＡ）であり得る；
（２７Ａ）１２９番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（２８Ａ）１３６番目のアミノ酸は、ＭまたはＭ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（２９Ａ）１３９番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（３０Ａ）１４０番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（３１Ａ）１４４番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＩ）であり得る；
（３２Ａ）１４５番目のアミノ酸は、ＧまたはＧ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（３３Ａ）１４８番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（３４Ａ）１５１番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（３５Ａ）１５５番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＮ）であり得る；
（３６Ａ）１５６番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（３７Ａ）１５７番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＷ）であり得る；
（３８Ａ）１５８番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（３９Ａ）１６１番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（４０Ａ）１６５番目のアミノ酸は、ＬまたはＬ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（４１Ａ）１６８番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＩまたはＶ）であり得る；
（４２Ａ）１８０番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＧ）であり得る；
（４３Ａ）１８２番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（４４Ａ）１８３番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（４５Ａ）１８５番目のアミノ酸は、ＤまたはＤ以外のアミノ酸（好ましくはＥ）であり得る；
（４６Ａ）１８６番目のアミノ酸は、ＥまたはＥ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（４７Ａ）１８８番目のアミノ酸は、ＰまたはＰ以外のアミノ酸（好ましくはＳ）であり得る；
（４８Ａ）１８９番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＥ）であり得る；
（４９Ａ）１９０番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（５０Ａ）１９２番目のアミノ酸は、ＱまたはＱ以外のアミノ酸（好ましくはＫ）であり得る；
（５１Ａ）１９５番目のアミノ酸は、ＦまたはＦ以外のアミノ酸（好ましくはＹ）であり得る；
（５２Ａ）１９６番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＮ）であり得る；
（５３Ａ）１９７番目のアミノ酸は、ＴまたはＴ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（５４Ａ）２００番目のアミノ酸は、ＷまたはＷ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（５５Ａ）２０４番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（５６Ａ）２１５番目のアミノ酸は、ＭまたはＭ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（５７Ａ）２１９番目のアミノ酸は、ＮまたはＮ以外のアミノ酸（好ましくはＡまたはＴまたはＧ）であり得る；
（５８Ａ）２２３番目のアミノ酸は、ＳまたはＳ以外のアミノ酸（好ましくはＤ）であり得る；
（５９Ａ）２２４番目のアミノ酸は、ＤまたはＤ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（６０Ａ）２２５番目のアミノ酸は、ＥまたはＥ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る；
（６１Ａ）２２６番目のアミノ酸は、ＡまたはＡ以外のアミノ酸（好ましくはＴ）であり得る；
（６２Ａ）２２９番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る；
（６３Ａ）２３３番目のアミノ酸は、ＦまたはＦ以外のアミノ酸（好ましくはＬまたはＶ）であり得る；
（６４Ａ）２３６番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＦ）であり得る；
（６５Ａ）２３７番目のアミノ酸は、ＭまたはＭ以外のアミノ酸（好ましくはＬまたはＶ）であり得る；
（６６Ａ）２４４番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；および
（６７Ａ）２４５番目のアミノ酸は、ＩまたはＩ以外のアミノ酸（好ましくはＶ）であり得る。
【0030】
本開示の好ましいロドプシン変異体は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、配列番号８のアミノ酸配列において、上記（１）～（６２）からなる群から選択される２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、または６０以上を有し得る。本開示の好ましいロドプシン変異体は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、配列番号８のアミノ酸配列において、上記（１Ａ）～（６２Ａ）からなる群から選択される２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、または６０以上を有し得る。
【0031】
本発明のある態様では、配列番号４に記載のアミノ酸配列から、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む方法が提供される。
【0032】
本発明のある態様では、配列番号８に記載のアミノ酸配列において、上記（１）～（６２）からなる群から選択される１以上の変異を有するアミノ酸配列を有するオプシンから、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む方法が提供される。本発明のある態様では、配列番号８に記載のアミノ酸配列において、上記（１Ａ）～（６７Ａ）からなる群から選択される１以上の変異を有するアミノ酸配列を有するオプシンから、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む方法が提供される。
【0033】
本発明のある態様では、配列番号１２に記載のアミノ酸配列から、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するオプシンよりも高いプロトン輸送活性を有するオプシンを選択することを含む方法が提供される。
【0034】
本開示の好ましいロドプシン変異体は、例えば、配列番号１２のアミノ酸配列を有する｛但し、配列番号９のアミノ酸配列を有するものを除く｝。本開示の好ましいロドプシン変異体は、例えば、配列番号１２のアミノ酸配列において、
下記（１Ａ）～（３Ａ）からなる群から選択される１以上の変異を有する｛但し、配列番号９のアミノ酸配列を有するものを除く｝：
（１Ａ）１２５番目のアミノ酸は、ＦまたはＦ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（２Ａ）１４２番目のアミノ酸は、ＲまたはＲ以外のアミノ酸（好ましくはＨ）であり得る；および
（３Ａ）２４２番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る。
下記（１Ａ）～（３Ａ）からなる群から選択される１以上の変異を有する｛但し、配列番号９のアミノ酸配列を有するものを除く｝：
（１Ａ）１２５番目のアミノ酸は、ＦまたはＦ以外のアミノ酸（好ましくはＬ）であり得る；
（２Ａ）１４２番目のアミノ酸は、ＲまたはＲ以外のアミノ酸（好ましくはＨ）であり得る；および
（３Ａ）２４２番目のアミノ酸は、ＶまたはＶ以外のアミノ酸（好ましくはＡ）であり得る。
【0035】
本開示の好ましいロドプシン変異体は、配列番号５のアミノ酸配列を有し得る。本開示の好ましいロドプシン変異体は、配列番号６のアミノ酸配列を有し得る。本開示の好ましいロドプシン変異体は、配列番号７のアミノ酸配列を有し得る。
【0036】
本開示のロドプシン変異体は、上記ロドプシン変異体と９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するロドプシンよりも高いプロトン輸送活性を発揮することができるロドプシンおよびそのタンパク質部分が提供され得る。本開示のロドプシン変異体は、上記ロドプシン変異体のアミノ酸配列から、挿入、欠失、置換、付加および削除からなる群から選択される１から数個のアミノ酸変異（好ましくは１つ、２つ、または３つ、より好ましくは、３つ、さらに好ましくは１つ）を有するアミノ酸配列を有し得る。
【0037】
本開示のロドプシン変異体は、好ましくは、シグナル配列との融合タンパク質であり得る。
【0038】
ある好ましい態様では、本開示のロドプシン変異体は、ミトコンドリア局在化シグナルと連結されていてもよい。したがって、本開示によれば、ミトコンドリア局在化シグナルと連結した単離されたオプシン、および当該オプシンをコードする遺伝子が提供される。ある態様では、本開示のロドプシン変異体は、ミトコンドリア局在化シグナルとオプシンとを含み、両者がペプチド結合で直接または間接的に連結された融合タンパク質であり得る。ミトコンドリア局在化シグナルと連結されたオプシンは、真核細胞または真核生物において発現させると、ミトコンドリアに移行する。このようにして、ミトコンドリアで発現するロドプシンを有する真核細胞または真核生物を得ることができる。ミトコンドリアで発現したロドプシンは、ミトコンドリア内膜の内外でプロトン濃度勾配を形成し、ＡＴＰ合成を促進し得る。したがって、ミトコンドリア局在化シグナルと連結されたオプシンは、真核細胞または真核生物において発現させることに適している。ミトコンドリア局在化シグナルとしては、当業者に周知のものを用いることができ、例えば、ＡＬＡ合成酵素であるＨｅｍ１、Ｓ２ペプチド、またはオリゴアルギニン（例えば、オクタアルギニン）、ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ＰＲＸ１、ピルベートデヒドロゲナーゼβサブユニット、ヒートショックタンパクＨＳＰ６０、ＡＴＰ合成酵素のγサブユニット、ＡＴＰ合成酵素のαサブユニット、シトクロムｃ酸化酵素のサブユニット２およびサブユニット４、サブユニット６、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ、ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ １ （ＣＩＴ１）、Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ （ＩＬＶ２）、Ｋｅｔｏ ｌ－ａｃｉｄ ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ、Ｍｉｔｆｉｌｉｎ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ分解酵素（Ｓｕｅ）、などを用いることができる。ミトコンドリア局在化シグナルを有しなくても、ミトコンドリアでオプシンを翻訳させることによっても、オプシンをミトコンドリアに局在させ得る。例えば、トリプトファンのコドンを、ＴＡＡに変更するとこのようなオプシンはミトコンドリアでのみ翻訳され得る。ＴＧＡは、細胞質での翻訳においては終止コドンであり、ミトコンドリアでの翻訳においてはトリプトファンをコードする。ミトコンドリアでの終止コドンとしては、ＴＡＡを用いることができる。したがって、ある態様では、オプシンをコードする遺伝子は、トリプトファンをコードするコドンとしてＴＧＡを含み得る。上記ロドプシン変異体は、形質膜に発現するように原核細胞に発現させることができる。
【0039】
本開示によれば、上記ロドプシン変異体をコードする核酸が提供される。核酸は、例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡであり得る。
【0040】
上記ロドプシン変異体をコードするＤＮＡは、好ましくは、制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結している。制御配列は、宿主（遺伝子を導入した細胞）においてオプシンの転写を誘導することができる。オプシンをコードする遺伝子は、宿主に対してコドン最適化がなされていてもよい。宿主によってコドン使用が異なるために特に異種のオプシンを導入する場合には、コドン最適化を行うことが好ましい。オプシンをコードする遺伝子は、宿主における複製に適した複製起点を有する、または有しないベクター（例えば、プラスミド）上に組み込まれ得る。ベクターは、栄養要求性マーカーおよび／または薬剤選択マーカーを有していてもよく、栄養要求性マーカーおよび／または薬剤選択マーカーを有する場合には、当該栄養および／または薬剤でベクターが導入された宿主を選択することができる。制御配列は、構成的プロモーターであっても、誘導性プロモーターであってもよい。オプシンは細胞において発現し、膜内でレチナールと結合するとロドプシンと呼ばれる。ロドプシンを発現しているとは、膜内でレチナールと結合した形態のオプシンを有することを意味する。
【0041】
制御配列は、例えば、プロモーターである。プロモーターとしては、例えば、クラスＩプロモーター（ｒＲＮＡ前駆体の転写に用いることができる）、クラスＩＩプロモーター（コアプロモーターと上流のプロモーター要素を含み、ｍＲＮＡの転写に用いることができる）、クラスＩＩＩプロモーター（さらにタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩに分類される）などが挙げられる。制御配列は、調節配列とも呼ばれ、動物細胞や植物細胞などの細胞内でｍＲＮＡを転写することができるプロモーターであればよい。例えば、第１の制御配列として、様々なｐｏｌ ＩＩプロモーターを用いることができる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター（ＥＦ１αプロモーター）、ＳＶ４０プロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、β－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢｈプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、プロモーターには、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどのバクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼを駆動するプロモーターや、Ｕ６プロモーターなどのｐｏｌ ＩＩＩプロモーターも含めることができる。Ｔ７プロモーターは環状ＤＮＡからの転写に好ましく用いられ、ＳＰ６プロモーターは直鎖状ＤＮＡからの転写に好ましく用いられる。また、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターとは、プロモーターを駆動するインデューサーの存在下でのみ、プロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導することができるプロモーターである。誘導性プロモーターの中には、プロモーターの活性を抑制する阻害剤の非存在下でのみ、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導できるものがある。誘導性プロモーターには、ヒートショックプロモーターなど、加熱により遺伝子発現を誘導するプロモーターが含まれるが、これに限定されるものではない。また、誘導可能なプロモーターには、薬剤で駆動可能なプロモーターも含まれる。このような薬物誘導可能なプロモーターとしては、例えば、ｃｕｍａｔｅオペレーター配列、ラムダオペレーター配列（例えば、１２×ラムダＯｐ）、テトラサイクリン誘導可能なプロモーターなどが挙げられる。テトラサイクリン誘導性プロモーターとしては、例えば、テトラサイクリンまたはその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）または逆テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）の存在下で遺伝子発現を駆動するプロモーターが挙げられる。テトラサイクリン誘導性プロモーターの例としては、ＴＲＥ３Ｇプロモーターが挙げられる。
【0042】
上記ロドプシン変異体をコードするｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と３’ＵＴＲとを有し得る。ｍＲＮＡは、５’末端にキャップ構造を有し得る。（Ｆｕｒｕｉｃｈｉ Ｙ ＆ Ｍｉｕｒａ Ｋ． Ｎａｔｕｒｅ． １９７５；２５３（５４９０）：３７４－５）。Ｃａｐ構造は、Ｃａｐアナログを用いたＡｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ（ＡＲＣＡ）法によってＣａｐ０構造をｍＲＮＡに付加することができる（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ Ｊ ｅｔ ａｌ． ＲＮＡ． ２００１ Ｏｃｔ；７（１０）：１４８６－９５）。２’－Ｏメチルトランスフェラーゼ処理をさらに実施することにより、ｍＲＮＡのＣａｐ０構造をＣａｐ１構造に変換することができる。これらは、常法により行うことができ、例えば、市販のキット、例えば、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、およびＳｃｒｉｐｔＣａｐ ２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｋｉｔ、またはＴ７ ｍＳｃｒｉｐｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＲ Ｂｒｏｗｎ ＣＯ．， ＬＴＤ）によっても実施することができる。ｍＲＮＡは、ポリＡ鎖を有することができる。ポリＡ鎖の付加は、常法により行うことができ、例えば、Ａ－Ｐｌｕｓ Ｐｏｌｙ（Ａ） Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔａｉｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＡＲ Ｂｒｏｗｎ ＣＯ．， ＬＴＤ）により行うことができる。したがって、ある態様では、ｍＲＮＡは、５’末端にＣａｐ構造を有し、３’末端にポリＡを有し、好ましくはウリジンの少なくとも一部または全部がシュードウリジン（好ましくは、１－メチルシュードウリジン）であるｍＲＮＡであり得る。ｍＲＮＡは、単離されたｍＲＮＡまたは合成されたｍＲＮＡであり得る。
【0043】
本開示によれば、上記ロドプシン変異体をコードする核酸を含む細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）が提供される。細胞は、上記宿主のいずれかであり得る。真核細胞は、新規変異を有するロドプシンまたはそのタンパク質部分（すなわちオプシン部分）をミトコンドリア内膜上に発現していることができる。原核細胞は、新規変異を有するロドプシンまたはそのタンパク質部分（すなわちオプシン部分）を形質膜（すなわち細胞膜）上に発現していることができる。
【0044】
本開示によれば、上記細胞は、当該細胞の培養に適した条件下で培養することができる。本開示によれば、上記細胞は、当該細胞の培養に適した条件下で培養することにより増殖させることができる。細胞の培養に適した条件は、例えば、細胞の培養に適した培地、温度（例えば、室温から３７℃など）、二酸化炭素濃度（例えば、約５％）、酸素濃度（例えば、約１０％～２５％、例えば、約２０％）、時間などの様々なパラメータにより構成され、当業者であれば適宜決定することができる。本開示によれば、上記細胞は、好ましくは、当該細胞の培養に適した条件かつ光照射条件下で培養することができる（それぞれが引用によりその全体が本明細書に取り込まれる、ＷＯ２０１５／１７０６０９Ａ、ＷＯ２０２０／０５０１１３Ａ、ＷＯ２００９／０６２１９０Ａ、およびＨａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．， ３：１６３５， ２０１３参照）。
【0045】
細胞（すなわち、宿主）は、原核生物または真核生物であり得る。宿主はまた、単細胞生物または多細胞生物であり得る。宿主は、微生物であり得る。宿主は、光合成細胞または光合成生物であり得る。宿主は、非光合成細胞または非光合成生物であり得る。宿主はまた、細菌、古細菌（アーキア）、ラン藻（シアノバクテリア）および放線菌からなる群から選択される生物であり得る。宿主はある態様では、大腸菌（例えば、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、枯草菌（例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、乳酸菌（例えば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ））、酢酸菌（例えば、アセトバクテラセア（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ））、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂａｃｔｅｒｉａ）、メタン生成菌（例えば、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ））、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される生物であり得る。宿主はある態様では、動物、植物、および菌類（真菌類）からなる群から選択される生物であり得る。宿主はある態様では、酵母であり得る。宿主はある態様では、分裂酵母または出芽酵母であり得る。宿主はある態様では、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・フラギリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、サッカロミセス・ルーキシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）などのサッカロミセス属、シゾサッカロミセス・ポンべ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス属、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）などのキャンディダ属、キサントフィロマイセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）などのキサントフィロマイセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロイワ（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ハンゼニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、およびエンドマイセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）属からなる群から選択される酵母であり得る。宿主はある態様では、糸状菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ），トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ），ヒュミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ），アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ），フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ），ブラケスリア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種）、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来細胞、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）由来細胞）、線虫、カイコ、植物細胞、藻類（大型藻類、微細藻類）、植物（シロイヌナズナ、タバコ）、および哺乳類培養細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト細胞）からなる群から選択され得る。宿主はまた、藻類（大型藻類、微細藻類）であってもよい。これらの宿主に導入されるオプシンは外来性であり得る。宿主とオプシンは異種でありうる。動物は、非ヒトであり得る。宿主が原核生物の場合には、オプシンは細胞膜上に発現させ得る。宿主が真核生物の場合には、オプシンはミトコンドリア内膜上に発現させ得る。発現させる方法は、当業者に周知の技術を用い得る。
【0046】
宿主は、外来性のオプシンをコードする遺伝子に加えて、レチナール合成系の一連の酵素すべてを有していることができる。これによって、宿主がレチナールを自己合成できる場合、培地へのレチナールの添加量を低減することができる。宿主によるレチナールの合成量が十分である場合、培地にレチナールを添加しなくてもよい。宿主が、レチナール合成系の一連の酵素の一部を有しない場合、宿主が有しない当該酵素をコードする外来性の遺伝子を宿主に導入することができる。宿主が有しない当該酵素をコードする外来性の遺伝子は、制御配列に作動可能に連結されたものであり得、ベクター中の発現カセット内に導入される。宿主が、酵素を有するか否かは、生化学的な分析（例えば、ウェスタンブロット）、遺伝学的な分析（例えば、シークエンシング、またはＰＣＲ）により当業者であれば適宜決定することができる。
【0047】
ロドプシンを発現した宿主は、当該宿主に適した培養条件下で培養することができる。培養条件は、当業者であれば適宜決定することができるであろう。ロドプシンを発現した宿主は、光照射条件下で培養することができる。光照射下で培養することによって、ロドプシンを発現した宿主では、ＡＴＰ合成が促進され、光照射によりエネルギーが供給されることとなる。光照射は、ロドプシンが光を受容する程度の照射であれば特に限定されないが、例えば、０．０１μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以上、０．０２μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以上、０．０３μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以上、０．０４μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以上、または０．０５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以上の強度とすることができる。光照射はまた、０．１μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、０．２μ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍｏｌｍ-2ｓ-1以下、０．３μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、０．４μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、０．５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、０．６μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、０．７μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、０．８μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、０．９μ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍｏｌｍ-2ｓ-1以下、１．０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１．１μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１．２μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１．３μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１．４μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１．５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１．６μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１．７μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１．８μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１．９μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、２μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、３μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、４μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、６μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、７μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、８μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、９μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、２０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、２０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、３０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、６０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、７０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、８０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、９０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１１０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１２０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１３０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１６０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１７０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１８０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１９０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、３００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、４００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、５００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、６００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、７００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、８００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、９００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１０００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、１５００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下、または２０００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2ｓ-1以下であり得る。照射する光は、電球（例えば、白熱電球、ハロゲン電球等）、蛍光灯、高圧放電ランプ、低圧放電ランプ、ＬＥＤ、ＥＬ、化学発光、生物発光および太陽光のいずれでもよく、例えば、３００～８００ｎｍ、４５０～６５０ｎｍ、例えば、５５０ｎｍの波長を含む光を用いることができる。光照射は、連続的に行われてもよく、間欠的に行われてもよい。
【0048】
光照射により宿主にエネルギーが提供されると、宿主は、エネルギー産生のために用いる炭素源の消費量を低減しうる。光照射により宿主にエネルギーが提供されると、宿主は、物質産生に関わる経路（例えば、ペントースリン酸経路等）で炭素源等の原料のより多くを用いることができるようになる。したがって、光照射により宿主は、物質産生に適した状態となる。そのため、宿主に炭素源等の原料を供給することによって、物質生産を好ましく行うことができる。
ロドプシンを発現した微生物は、光照射条件下で低ｐＨ耐性、および／または高温耐性を示し得る。
ロドプシンを発現した微生物は、光照射条件下で低ｐＨ耐性、および／または高温耐性を示し得る。
【0049】
低ｐＨ耐性とは、宿主の能力（増殖能、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力）が低下するｐＨの低い環境下（例えば、ｐＨ５．０未満）において、非照射時と比較して、光照射条件下で、および／またはロドプシンの非発現時と比較して、発現条件下で、増殖能、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力が、高まることを意味する。低ｐＨ耐性とは、例えば、酵母の場合、ｐＨ５．０未満、ｐＨ４．５以下、ｐＨ４．０以下、例えば、ｐＨ３．２～３．７（例えば、ｐＨ３．５）のｐＨ条件下において、増殖能、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力が、非照射条件下および／またはロドプシン非発現条件下での対応する能力よりも高まることを意味する。ロドプシンを発現し、低ｐＨ耐性を備えた宿主は、低ｐＨ条件下においても好ましく培養し得る。低ｐＨ条件下では、他の混入微生物の増殖、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力が抑えられ、宿主を選択的に培養することが可能となり得る。
【0050】
高温耐性とは、宿主の能力（増殖能、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力）が低下する高温環境下において、非照射時と比較して、光照射条件下で、および／またはロドプシンの非発現時と比較して、発現条件下で、増殖能、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力が、高まることを意味する。高温耐性とは、例えば、酵母の場合、３２℃以上、３３℃以上、３４℃以上、例えば、３４℃～３６℃（例えば、３５℃）またはそれ以上の条件下において、増殖能、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力が、非照射条件下および／またはロドプシン非発現条件下での対応する能力よりも高まることを意味する。高温条件下では、他の混入微生物の増殖が抑えられ、宿主を選択的に培養することが可能となり得る。
【0051】
ロドプシンを発現した微生物は、光照射条件下で、低ｐＨ耐性および高温耐性を備え得る。この場合、ロドプシンを発現し、低ｐＨ耐性および高温耐性を備えた宿主は、低ｐＨおよび高温条件下において好ましく培養し得る。低ｐＨおよび高温条件下では、他の混入微生物の増殖、ＡＴＰ合成能、および物質産生能からなる群から選択される１以上の能力が抑えられ、宿主を選択的に培養することが可能となり得る。
【0052】
物質生産は、上記条件下において、ロドプシンを発現する細胞または生物を培養することによって好ましく行われ得る。ロドプシンを発現する細胞または生物は、特定の物質の産生量を増大させるために、当該物質の産生に適した条件下で培養され得る。培養条件は、低ｐＨ条件下および高温条件下のいずれかまたは両方を満たし得る。特定の物質の産生量を増大させるためには、ロドプシンを発現する細胞または生物に対してさらなる改変を加えることが許容される。そのような改変としては、例えば、当該物質の産生経路に関する酵素を変異および／または導入する改変；当該物質の分解に関する酵素の破壊、発現量の低減、活性の欠失や低減；および／または競合する経路に関する酵素の破壊、発現量の低減、および／または活性の欠失や低減が挙げられる。
【0053】
物質生産により、産生される物質としては、例えば有機酸、ペプチド、アミノ酸、タンパク質、ヌクレオシド、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、イソプレノイド類及び脂質などをあげることができる。より具体的には以下があげられる。有機酸としては、酢酸、乳酸、コハク酸、αーケト酸（２－オキソ酸）などをあげることができる。ペプチドとしてはグルタチオン、アラニルグルタミン、γグルタミルバリルグリシンなどをあげることができ、ポリペプチドとしては、ポリリジン、ポリグルタミン酸をあげることができる。アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、グリシン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－バリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－システイン、Ｌ－３－ヒドロキシプロリン、Ｌ－４－ヒドロキシプロリン、５－アミノレブリン酸などをあげることができる。タンパク質としては、ルシフェラーゼ、イノシンキナーゼ、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ５－ｋｉｎａｓｅ （ＥＣ ２．７．２．１１）、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ－５－ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＥＣ １．２．１．４１）、Ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ＥＣ １．５．１．２）、γ－グルタミルシステイン合成酵素（ＥＣ ６．３．２．２）、グルタチオン合成酵素（ＥＣ ６．３．２．３）、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、キシロースレダクターゼ、Ｐ４５０などをあげることができる。ヌクレオシドとしては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸、アデニル酸などをあげることができる。ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸などをあげることができる。糖としては、キシロース、マンノースなどをあげることができ、糖アルコールとしては、キシリトール、マンニトールなどをあげることができ、アルコールとしてはエタノールなどをあげることができる。イソプレノイド類としては、メバロン酸（ＭＶＡ：Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ）、イソプレノール、アスタキサンチン、イソプレン、イソペンテノール、リモネン、ピネン、ファルネセン、ビサボレンなどをあげることができる。脂質としては、プロピオン酸、ヒドロキシプロピオン酸、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）やＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）などをあげることができる。本発明における有用物質では、有機酸では酢酸、ペプチドではグルタチオン、イソプレノイド類ではメバロン酸、イソプレノール、脂質ではヒドロキシプロピオン酸が特に好適である。産生される物質としては、例えば、ＡＴＰ、グルタチオン、イソプレノイドが挙げられる。
【実施例0054】
実施例１：ｄＲのランダム変異
デルタロドプシン（ｄＲ）遺伝子（７５３ｂｐ；配列番号９）に対し、Ｌｅｕｎｇ ＤＷらの方法（Ｌｅｕｎｇ ＤＷ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １（１）：１１-１５）に従い、ｐＣＤＦ－ｄＲのｄＲ遺伝子部分にＤＮＡ １ｋｂあたり２個程度の変異が導入されるエラープローンＰＣＲの条件を設定した。一方、ベクターのインバースＰＣＲは使用したＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｎｅｏ）に添付のマニュアルの推奨条件に従った。増幅したＤＮＡ断片についてＰｕｒｅＬｉｎｋTM ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による精製を行った後、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いてライゲーションを行った。得られたランダム変異を持つｐＣＤＦＤｕｅｔ－ｄＲの変異プラスミドライブラリを用いて、ヒートショック法でＭＧ１６５５株を形質転換した。ＬＢ－ストレプトマイシンプレート培地に塗布し、３７℃で一晩培養して形質転換体を約７０００株得た。プレートの表面に適当な量のｍｉｌｌｉＱ滅菌水を加えて、コロニーを全て混ぜ合わせ形質転換体を含む菌体懸濁液を作製し、等量の５０％グリセロールと混合し、グリセロールストックを作製した。
デルタロドプシン（ｄＲ）遺伝子（７５３ｂｐ；配列番号９）に対し、Ｌｅｕｎｇ ＤＷらの方法（Ｌｅｕｎｇ ＤＷ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １（１）：１１-１５）に従い、ｐＣＤＦ－ｄＲのｄＲ遺伝子部分にＤＮＡ １ｋｂあたり２個程度の変異が導入されるエラープローンＰＣＲの条件を設定した。一方、ベクターのインバースＰＣＲは使用したＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｎｅｏ）に添付のマニュアルの推奨条件に従った。増幅したＤＮＡ断片についてＰｕｒｅＬｉｎｋTM ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による精製を行った後、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いてライゲーションを行った。得られたランダム変異を持つｐＣＤＦＤｕｅｔ－ｄＲの変異プラスミドライブラリを用いて、ヒートショック法でＭＧ１６５５株を形質転換した。ＬＢ－ストレプトマイシンプレート培地に塗布し、３７℃で一晩培養して形質転換体を約７０００株得た。プレートの表面に適当な量のｍｉｌｌｉＱ滅菌水を加えて、コロニーを全て混ぜ合わせ形質転換体を含む菌体懸濁液を作製し、等量の５０％グリセロールと混合し、グリセロールストックを作製した。
【0055】
得られたｄＲのランダム変異株ライブラリのグリセロールストックについて、ＬＢ－ストレプトマイシンプレート培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。出現したシングルコロニーをそれぞれＬＢ－ストレプトマイシン液体培地５ｍＬに植菌し、１５０ｒｐｍで一晩培養を行った。得られた培養液を２００ｍＬフラスコ内のＭ９－ストレプトマイシン選択培地５０ｍＬにＯＤ600＝０．０５となるように植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩前培養した。得られた培養液を新たなＭ９－ストレプトマイシン選択培地５０ｍＬにＯＤ600＝０．０５となるように植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで４時間培養した後、１０μＭオールトランスレチナールと２５μＭ イソプロピルβ－Ｄ－チオガカクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、３７℃、１５０ｒｐｍにて暗所で２４時間培養した。
【0056】
次いで、５０μＥの光照射条件下で耐塩性スクリーニングを行った。具体的には、培養液３０ｍＬについて、６０００ｒｐｍの遠心分離を２分間行い、上澄みを捨てた。プロトンポンプ活性測定用非緩衝液（１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．１ｍＭ ＣａＣｌ2）を２ｍＬ添加し、静かに懸濁を行った。得られた菌体懸濁液について再度６０００ｒｐｍの遠心分離を２分間行い、上澄みを捨てた。菌体ペレットについてＯＤ600＝０．５となるようにプロトンポンプ活性測定用非緩衝液で懸濁した。得られた菌体懸濁液について、等量の５０％グリセロールと混合し、グリセロールストックを作製した。プロトン輸送活性の高い株をさらに濃縮するために、このグリセロールストックから再度同じ方法で２ラウンド目の耐塩性スクリーニングを行った。２ラウンド目の耐塩性スクリーニングを完了した菌体懸濁液についても、等量の５０％グリセロールを混合し、グリセロールストックを作製した。
【0057】
耐塩性スクリーニング完了後の菌体懸濁液について、ＬＢ－ストレプトマイシン選択プレート培地に塗布し、３７℃で一晩培養を行った結果得られたシングルコロニーについて１１０株をランダムに選択し、それぞれ２ｍＬのＬＢ－ストレプトマイシン選択培地に植菌し、１５０ｒｐｍで一晩培養を行った。続いて５ｍＬのＭ９－ストレプトマイシン選択培地にＯＤ600＝０．０５となるように継代し、１５０ｒｐｍで一晩培養を行った。続いて新たな５ｍＬのＭ９－ストレプトマイシン選択培地にＯＤ600＝０．０５となるように継代し、１５０ｒｐｍで４時間培養を行った。その後オールトランスレチナールとＩＰＴＧをそれぞれ終濃度１０μＭ、２５μＭとなるように添加し、１５０ｒｐｍにて暗所で一晩培養を行った。培養液の色を観察し、ｄＲに特徴的なピンク色が特に強い菌体を２１株選抜した。
【0058】
選抜した２１株について、培養を行い、プロトンポンプ活性測定を行った。結果は、天然型を１００とし、変異体の天然体に対するプロトン輸送活性の比（相対プロトン輸送活性）により表す。その結果、図１に示されるように、ＭＧ－Ｅ５９発現株およびＭＧ－Ｅ１０４発現株において、天然型のＭＧ－ｄＲ発現株よりも高いプロトン輸送活性が確認された（図１）。
【0059】
また、これらの菌体について５ｍＬのＬＢ－ストレプトマイシン選択培地に植菌し、得られた菌体についてＬａｂｏ ＰａｓｓTM Ｍｉｎｉ （ＣＯＳＭＯ）を用いたプラスミド抽出を行い、ｄＲ遺伝子部分の配列についてシーケンス解析を行った。シーケンス解析に使用したプライマーの配列を表１に示す。
【0060】
【表1】
【0061】
ＭＧ－Ｅ５９株、ＭＧ－Ｅ１０４株においてはどちらについてもアミノ酸変異が起きたことが確認された。プロトン輸送速度の高かったＭＧ－Ｅ１０４株およびＭＧ－Ｅ５９のｄＲ（それぞれ配列番号１０および１１）において同定された変異をそれぞれ表２に示す。
【0062】
【表2】
【0063】
実施例２：ＯＰ２７の部位特異的変異
ロドプシンＯＰ２７の部位特異的変異体であるＯＰ２７－Ａ３１Ｑ、ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ、ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇ（Ａ３１ＱとＩ１２８Ｇの両方を有する）を（配列番号４｛ここで、Ｘ1はＱであり、および／または、Ｘ2はＧである｝）それぞれ大腸菌に導入した。具体的にはＯＰ２７およびＯＰ２７－Ａ３１Ｑ、ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ、ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇをコードする核酸（ＤＮＡ）をｐＣＤＦ－Ｄｕｅｔ１ベクターに導入し、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７およびｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ、ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ、ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇを作製した。ヒートショック法によりｐＣＤＦ－ＯＰ２７およびｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇを用いて大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株を形質転換した。大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株にｐＣＤＦ－ＯＰ２７を導入した株を「ＯＰ２７発現大腸菌」といい、コントロール株として用いた。また、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇを導入した大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）形質転換体をそれぞれ「ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ発現大腸菌」、「ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ発現大腸菌」、「ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇ発現大腸菌」、あるいは３株まとめて「ＯＰ２７部位特異的変異体発現大腸菌」という。使用直前まで－８０℃でグリセロールストックとして保存した。
ロドプシンＯＰ２７の部位特異的変異体であるＯＰ２７－Ａ３１Ｑ、ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ、ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇ（Ａ３１ＱとＩ１２８Ｇの両方を有する）を（配列番号４｛ここで、Ｘ1はＱであり、および／または、Ｘ2はＧである｝）それぞれ大腸菌に導入した。具体的にはＯＰ２７およびＯＰ２７－Ａ３１Ｑ、ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ、ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇをコードする核酸（ＤＮＡ）をｐＣＤＦ－Ｄｕｅｔ１ベクターに導入し、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７およびｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ、ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ、ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇを作製した。ヒートショック法によりｐＣＤＦ－ＯＰ２７およびｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇを用いて大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株を形質転換した。大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株にｐＣＤＦ－ＯＰ２７を導入した株を「ＯＰ２７発現大腸菌」といい、コントロール株として用いた。また、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇを導入した大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）形質転換体をそれぞれ「ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ発現大腸菌」、「ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ発現大腸菌」、「ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇ発現大腸菌」、あるいは３株まとめて「ＯＰ２７部位特異的変異体発現大腸菌」という。使用直前まで－８０℃でグリセロールストックとして保存した。
【0064】
ロドプシン変異体の発現大腸菌の培養は以下のように行った。ＯＰ２７部位特異的変異体発現大腸菌およびＯＰ２７発現大腸菌をグリセロールストックからＬＢ（ストレプトマイシンを添加）培地プレートに３７℃で１日間静置培養し、出現したコロニーを、３つピックアップしてＬＢ培地５ｍＬ、２００ｒｐｍで３７℃で１６時間、前培養した。ＯＰ２７部位特異的変異体発現大腸菌およびＯＰ２７発現大腸菌をＬＢ培地２０ｍＬに０．４ｍＬを接種し、振とう培養器（ＢＲ－４３ＦＬ、タイテック、日本）内にて、３７℃、２００ｒｐｍにて培養した。ＯＤ600が０．４～１．０になった時点で、培地に１０μＭのオールトランスレチナールおよび１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、３７℃、２００ｒｐｍにて３時間培養した。
【0065】
回収した培養液を５，０００×ｇ、２５℃で１０分間遠心分離してＯＰ２７部位特異的変異体発現大腸菌およびＯＰ２７発現大腸菌を回収した。回収したロドプシン発現大腸菌を１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液で３回洗浄し、ＯＤ600＝２となるように１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液に懸濁した。ロドプシン発現大腸菌懸濁液に対し、バンドパスフィルター（ＰＢＯ５３０－１２０、朝日スペクトラ、日本：５３０±１２０ｎｍ）を装着した３００Ｗハロゲンプロジェクターランプ（ＪＣＤ１００Ｖ－３００Ｗ）を使用して、１００μＥの光を照射した。照射した光強度は、フォトアナライザーＬＡ－１０５（ＮＫシステム、大阪、日本）を用いて測定した。ＯＰ２７部位特異的変異体発現大腸菌およびＯＰ２７発現大腸菌の懸濁液のｐＨ変化の時間経過を、ＰＣに接続したｐＨメーター（Ｆ－７２、堀場、日本）を使用して記録した。ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ発現大腸菌、ＯＰ２７－Ｉ１２８Ｇ発現大腸菌、ＯＰ２７－Ａ３１Ｑ／Ｉ１２８Ｇ発現大腸菌およびＯＰ２７発現大腸菌のプロトン輸送活性は、ｐＨ変化の初期勾配から決定した。また、細胞あたりのプロトン輸送量はプロトン輸送活性を細胞濃度で除して求めた。プロトン輸送活性および細胞あたりのプロトン輸送量の結果を図２に示される通りであった。図２に示されるように、プロトン輸送活性は変異により増大したことが示唆された。
【0066】
実施例３：ＯＰ２７の人工設計
ロドプシンＯＰ２７の人工設計変異体であるＯＰ２７－Ａ１０、ＯＰ２７－Ａ２０、ＯＰ２７－Ａ１１０、およびＯＰ２７－Ａ１７０（それぞれ配列番号５～7、および１３）をそれぞれ大腸菌に導入した。
ロドプシンＯＰ２７の人工設計変異体であるＯＰ２７－Ａ１０、ＯＰ２７－Ａ２０、ＯＰ２７－Ａ１１０、およびＯＰ２７－Ａ１７０（それぞれ配列番号５～7、および１３）をそれぞれ大腸菌に導入した。
【0067】
【化1】
【0068】
具体的にはＯＰ２７およびＯＰ２７－Ａ１０、ＯＰ２７－Ａ２０、ＯＰ２７－Ａ１１０、ＯＰ２７－Ａ１７０をコードする核酸（ＤＮＡ）にＮｄｅＩ／ＫｐｎＩ制限酵素配列を導入し、大腸菌にコドン最適化して人工合成した。この合成ＯＰ２７遺伝子およびＯＰ２７－Ａ１０、ＯＰ２７－Ａ２０、ＯＰ２７－Ａ１１０、ＯＰ２７－Ａ１７０遺伝子をそれぞれｐＣＤＦ－Ｄｕｅｔ１ベクターに導入し、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ１０、ＯＰ２７－Ａ２０、ＯＰ２７－Ａ１１０、およびＯＰ２７－Ａ１７０を作製した。ヒートショック法によりｐＣＤＦ－ＯＰ２７およびｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ１０、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ２０、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ１１０、およびｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ１７０をそれぞれ用いて大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株を形質転換した。大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株にｐＣＤＦ－ＯＰ２７を導入した大腸菌を「ＯＰ２７発現大腸菌」といい、コントロール株として用いた。また、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ１０、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ２０、ｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ１１０、およびｐＣＤＦ－ＯＰ２７－Ａ１７０を導入した大腸菌をそれぞれ「ＯＰ２７－Ａ１０発現大腸菌」、「ＯＰ２７－Ａ２０発現大腸菌」、「ＯＰ２７－Ａ１１０発現大腸菌」、「ＯＰ２７－Ａ１７０発現大腸菌」、あるいは４株まとめて「ＯＰ２７人工設計変異体発現大腸菌」という。使用直前まで－８０℃でグリセロールストックとして保存した。
【0069】
ロドプシン発現大腸菌の培養は以下のように行った。ＯＰ２７発現大腸菌およびＯＰ２７人工設計変異体発現大腸菌をグリセロールストックからＬＢ（ストレプトマイシンを添加）培地プレートに３７℃で１日間静置培養し、出現したコロニーを、３つピックアップしてＬＢ培地５ｍＬ、２００ｒｐｍで３７℃で１６時間、前培養した。ＯＰ２７人工設計変異体発現大腸菌およびＯＰ２７発現大腸菌をМ９培地１０ｍＬに初期ＯＤ600が０．２となるように接種し、振とう培養器（ＢＲ－４３ＦＬ、タイテック、日本）内にて、３７℃、２００ｒｐｍにて暗所で培養した。ＯＤ600が０．６になった時点で培地に、１０μＭのオールトランスレチナールおよび培地には、２０μＭのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドを添加し、３７℃、２００ｒｐｍにて暗所で３時間培養した時点でＬＣ－ＬＥＤ ４５０Ｗ（ＴＡＩＴＥＣ、日本）によって±５０μｍｏｌｍ-2ｓ-1光照射を開始し、引き続き３７℃、２００ｒｐｍで培養を行った。
【0070】
ＯＰ２７人工設計変異体発現大腸菌およびＯＰ２７発現大腸菌を適切な時間培養後に回収した。培養液中の細胞濃度、プロトン輸送活性および細胞内のグルタチオン含有量の測定を行った。各実験条件に対して実験を３回繰り返した。
【0071】
本培養１８時間後、培養液を回収し、適宜希釈してＯＤ600を測定することで細胞濃度を求めた。一方で回収した培養液を５，０００×ｇ、２５℃で１０分間遠心分離してＯＰ２７人工設計変異体発現大腸菌およびＯＰ２７発現大腸菌を回収した。回収したロドプシン発現大腸菌を１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液で３回洗浄し、ＯＤ600＝２となるように１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液に懸濁した。ロドプシン発現大腸菌懸濁液に対し、バンドパスフィルター（ＰＢＯ５３０－１２０、朝日スペクトラ、日本：５３０±１２０ｎｍ）を装着した３００Ｗハロゲンプロジェクターランプ（ＪＣＤ１００Ｖ－３００Ｗ）を使用して、光を照射した。照射した光強度は、フォトアナライザーＬＡ－１０５（ＮＫシステム、大阪、日本）を用いて測定した。ＯＰ２７人工設計変異体発現大腸菌およびＯＰ２７発現大腸菌の懸濁液のｐＨ変化の時間経過を、ＰＣに接続したｐＨメーター（Ｆ－７２、堀場、日本）を使用して記録した。各培養物中の変異体発現大腸菌の相対細胞濃度を求めた。ＯＰ２７－Ａ１０発現大腸菌、ＯＰ２７－Ａ２０発現大腸菌、ＯＰ２７－Ａ１１０発現大腸菌およびＯＰ２７発現大腸菌のプロトン輸送活性は、ｐＨ変化の初期勾配から決定した。結果を図３および図５に示す。図３および図５に示されるように、ＯＰ２７－Ａ１０およびＯＰ２７－Ａ１７０は、細胞増殖能を向上させ、プロトン輸送活性も同時に向上させた。これに対して、ＯＰ２７－Ａ２０およびＯＰ２７－Ａ１１０では、細胞増殖能を向上させたが、プロトン輸送活性は低下していた。
【0072】
サンプリングにより回収した培養液を７，０００×ｇで２分間遠心分離して、細胞を分離した。細胞を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）に懸濁し、細胞破壊装置（Ｓｈａｋｅ Ｍａｓｔｅｒ ＮＥＯ、Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１５００ｒｐｍで１０分間破砕し、１６，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して細胞破砕断片を除去した。細胞抽出液のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度を、Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ、２００９に記載の５、５’－ジチオビス（２－ニトロベンゾン酸）－グルタチオンレダクターゼサイクリングアッセイ法を用いて測定した。また、細胞内グルタチオン含有量はグルタチオン濃度を細胞濃度で除して求めた。結果は、図４および図６に示される通りであった。図４および図６に示されるように、ＯＰ２７－Ａ１０、Ａ２０、Ａ１１０、およびＡ１７０のいずれの株においてもグルタチオン産生能は向上していたが、ＯＰ２７－Ａ１０においてはグルタチオン産生能が顕著に向上していた。ＯＰ２７は、プロトン輸送活性が高い一方で、細胞増殖の抑制効果を有すると考えられる。ＯＰ２７変異体は、プロトン輸送活性を顕著に高めるものは無かったものの、細胞増殖の抑制を解除することによって、（細胞数）×（細胞あたりのプロトン輸送量）の総計が大きくなり、これによりＡＴＰ産生の総量も増大し、物質生産に使用できるエネルギー量を増加させることができたものと考えられる。
【0073】
本明細書で引用された文献は、その全体が引用されることにより本明細書の組込まれる。
【0074】
配列表の説明
配列番号１：プライマー配列
配列番号２：プライマー配列
配列番号３：ＯＰ２７のアミノ酸配列
配列番号４：ＯＰ２７変異体１のアミノ酸配列（３１、１２８）
配列番号５：ＯＰ２７－Ａ１０変異体のアミノ酸配列
配列番号６：ＯＰ２７－Ａ２０変異体のアミノ酸配列
配列番号７：ＯＰ２７－Ａ１１０変異体のアミノ酸配列
配列番号８：ＯＰ２７変異体２のアミノ酸配列（Ａ１０、Ａ２０、Ａ１１０、Ａ１７０）
配列番号９：デルタロドプシン（ｄＲ）のアミノ酸配列
配列番号１０：Ｅ１０４変異体のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｅ５９変異体のアミノ酸配列
配列番号１２：デルタロドプシン変異体のアミノ酸配列（Ｅ１０４、Ｅ５９）
配列番号１３：ＯＰ２７－Ａ１７０変異体のアミノ酸配列
配列番号１：プライマー配列
配列番号２：プライマー配列
配列番号３：ＯＰ２７のアミノ酸配列
配列番号４：ＯＰ２７変異体１のアミノ酸配列（３１、１２８）
配列番号５：ＯＰ２７－Ａ１０変異体のアミノ酸配列
配列番号６：ＯＰ２７－Ａ２０変異体のアミノ酸配列
配列番号７：ＯＰ２７－Ａ１１０変異体のアミノ酸配列
配列番号８：ＯＰ２７変異体２のアミノ酸配列（Ａ１０、Ａ２０、Ａ１１０、Ａ１７０）
配列番号９：デルタロドプシン（ｄＲ）のアミノ酸配列
配列番号１０：Ｅ１０４変異体のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｅ５９変異体のアミノ酸配列
配列番号１２：デルタロドプシン変異体のアミノ酸配列（Ｅ１０４、Ｅ５９）
配列番号１３：ＯＰ２７－Ａ１７０変異体のアミノ酸配列
【0075】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】