特開 2023-57968 ヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023057968

(43)【公開日】2023-04-24

(54)【発明の名称】ヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/52 20060101AFI20230417BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230417BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20230417BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230417BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20230417BHJP

【ＦＩ】

C12N15/52 Z

C12P21/02 C ZNA

C12N15/31

C12N1/21

C12N1/20 B

【審査請求】未請求

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021167756

(22)【出願日】2021-10-12

(71)【出願人】

【識別番号】390033145

【氏名又は名称】焼津水産化学工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000800

【氏名又は名称】弁理士法人創成国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】木野 邦器

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA10

4B065AA26X

4B065AA26Y

4B065AA41Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA41

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】ヒドロキシプロリル－グリシンを効率的に製造する方法を提供する。
【解決手段】Ｌ－アミノ酸リガーゼを導入した微生物を用いてヒドロキシプロリル－グリシンを得ることを特徴とするヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法である。Ｌ－アミノ酸リガーゼとしては、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の野生型又は変異型のＴａｂＳであってよい。また、微生物としては、ペプチダーゼ欠損株であってよい。また、微生物を高浸透圧条件下において用いるようにしてよい。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｌ－アミノ酸リガーゼを導入した微生物を用いてヒドロキシプロリル－グリシンを得ることを特徴とするヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法。

【請求項2】

前記Ｌ－アミノ酸リガーゼは、ヒドロキシプロリン及びグリシンを基質として利用するものである、請求項１記載のヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法。

【請求項3】

前記Ｌ－アミノ酸リガーゼは、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の野生型又は変異型のＴａｂＳである、請求項１記載のヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法。

【請求項4】

前記Ｌ－アミノ酸リガーゼは、野生型ＴａｂＳのアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸残基が、ヒドロキシプロリル－グリシン合成能を損なわない範囲で置換された変異型ＴａｂＳである、請求項３記載のヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法。

【請求項5】

前記製造方法は、菌体反応法又は発酵法によるものである、請求項１～４のいずれか１項に記載のヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法。

【請求項6】

前記製造方法は、前記微生物に少なくともヒドロキシプロリン及びグリシンを作用させてヒドロキシプロリル－グリシンを得るものである、請求項１～５のいずれか１項に記載のヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法。

【請求項7】

前記微生物がペプチダーゼ欠損株である、請求項１～６のいずれか１項に記載のヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法。

【請求項8】

前記ペプチダーゼ欠損株は、大腸菌ＰｅｐＤ欠損株である、請求項７に記載のヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法。

【請求項9】

前記微生物を高浸透圧条件下において用いる、請求項１～８のいずれか１項に記載のヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法。

【請求項10】

前記高浸透圧条件は、ＫＣｌ及び／又はＮａＣｌの添加によるものである、請求項９記載のヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれかの製造方法に用いられる微生物であって、外来Ｌ－アミノ酸リガーゼを導入した形質転換体。

【請求項12】

前記微生物は、大腸菌である、請求項１１記載の形質転換体。

【請求項13】

前記大腸菌は、ＰｅｐＤ欠損株である、請求項１２記載の形質転換体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

動物の主要構成タンパク質であるコラーゲンは、生体内において細胞と細胞の隙間を埋めている「細胞外マトリックス」成分として、水に不溶の繊維状や膜状の構造体を形成している。コラーゲンやコラーゲンを熱変性して水溶性にしたゼラチンは、古くから接着剤（いわゆる膠）として利用されているほか、写真乳剤、製紙、染色、食品、化粧品、医薬品等の幅広い分野で利用されている。また、コラーゲンの加水分解物であるコラーゲンペプチドは、高分子のコラーゲンに比べて水への溶解度が高く低粘度であり、生体内への吸収性が高く、様々な生理効果が期待できることから、機能性素材として飲食品や化粧品分野で盛んに利用されるようになっている。

【0003】

コラーゲンのアミノ酸配列は、アミノ酸配列中でグリシン（Ｇｌｙ）が３残基ごとに繰り返すＧｌｙ－Ｘａａ－Ｙａａの構造を有しており、ＸａａとＹａａとしては、それぞれプロリン（Ｐｒо）とヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）が多いということが知られている（非特許文献１参照）。

【0004】

コラーゲン素材を摂取したとき血中で検出される低分子として、ヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）やプロリル－ヒドロキシプロリン（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ）などのジペプチドが報告されている（非特許文献２、３）。これらのジペプチドについては、コラーゲンゲル上で線維芽細胞の増殖を促進することが示されており（非特許文献２）、コラーゲンの合成を促進し、真皮を再生することにより創傷の治癒や健康な皮膚の維持に寄与するものと考えられている。また、高リン食誘導性硬組織障害モデルマウスに投与することで、骨密度の改善効果が得られたという報告もある（非特許文献４)。

【0005】

一方、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来のＬ－アミノ酸リガーゼであるＴａｂＳは、無保護のアミノ酸同士を基質（プロリンとグリシン）にして、選択的にプロリル－グリシン（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）を合成する酵素であることが報告されている（非特許文献５）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】奥山健二、川口辰也、「コラーゲンの分子構造・高次構造」高分子論文集、2000 Apr Vol.67, No.4, Pages 229-47.

【非特許文献2】Iwai K., Hasegawa T., Taguchi Y., Morimatsu F., Sato K., Nakamura Y., Higashi A., Kido Y., Nakabo Y. and Ohtsuki K.,「Identification of food-derived collagen peptides in human blood after oral ingestion of gelatin hydrolysates」J Agric Food Chem. 2005 Aug 10; 53(16): Pages 6531-6.

【非特許文献3】Shigemura Y., Akaba S., Kawashima E., Park E.Y., Nakamura Y. and Sato K.,「Identification of a novel food-derived collagen peptide, hydroxyprolyl-glycine, in human peripheral blood by pre-column derivatisation with phenyl isothiocyanate」Food Chemistry 2011 Dec 1; 129(3): Pages 1019-24.

【非特許文献4】関 勇哉「コラーゲンジペプチド（Pro-Hyp、Hyp-Gly）によるマウス骨代謝に対する効果」明海大学大学院歯学研究科博士学位論文甲第２９８号、2014年3月22日学位授与

【非特許文献5】Kino H., Nakajima S., Arai T., and Kino K.,「Effective production of Pro-Gly by mutagenesis of L-amino acid ligase」J Biosci Bioeng. 2016 Aug; 122(2): Pages 155-9.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

コラーゲン由来のジペプチドを安価に大量生産できれば、機能性食品や医薬品としての応用が可能となる。

【0008】

本発明の目的は、ヒドロキシプロリル－グリシンを効率的に製造する方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らが鋭意研究したところ、Ｌ－アミノ酸リガーゼを外来的に導入した微生物を用いることで、原料コストのかかるＡＴＰを添加せずにヒドロキシプロリル－グリシンが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0010】

すなわち、本発明は、その第１の観点では、Ｌ－アミノ酸リガーゼを導入した微生物を用いてヒドロキシプロリル－グリシンを得ることを特徴とするヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法を提供するものである。

【0011】

上記第１の観点に係る本発明の製造方法によれば、Ｌ－アミノ酸リガーゼを導入した微生物を用いるので、その微生物のＡＴＰ供給系により生じるＡＴＰを利用してジペプチド合成反応を完遂させることができる。これにより原料コストのかかるＡＴＰの外部添加を必要とせず、コラーゲンを構成するジペプチドであるヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）を高効率かつ低コストに製造することができる。

【0012】

本発明により提供されるヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法において、前記Ｌ－アミノ酸リガーゼは、ヒドロキシプロリン及びグリシンを基質として利用するものであってよい。

【0013】

また、前記Ｌ－アミノ酸リガーゼは、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の野生型又は変異型のＴａｂＳであってよい。

【0014】

また、前記Ｌ－アミノ酸リガーゼは、野生型ＴａｂＳのアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸残基が、ヒドロキシプロリル－グリシン合成能を損なわない範囲で置換された変異型ＴａｂＳであってよい。

【0015】

また、本発明により提供されるヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法は、菌体反応法又は発酵法によるものであってよい。

【0016】

また、本発明により提供されるヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法は、前記微生物に少なくともヒドロキシプロリン及びグリシンを作用させてヒドロキシプロリル－グリシンを得るものであってよい。

【0017】

また、前記微生物がペプチダーゼ欠損株であってよい。この場合、前記ペプチダーゼ欠損株は、大腸菌ＰｅｐＤ欠損株であってよい。

【0018】

また、前記微生物を高浸透圧条件下において用いるようにしてよい。この場合、前記高浸透圧条件は、ＫＣｌ及び／又はＮａＣｌの添加によるものであってよい。

【0019】

一方、本発明の第２の観点によれば、本発明は、上記の製造方法に用いられる微生物であって、外来Ｌ－アミノ酸リガーゼを導入した形質転換体を提供するものである。

【0020】

上記第２の観点に係る本発明の形質転換体によれば、ヒドロキシプロリル－グリシンの製造に好適に用いられる。

【0021】

本発明により提供される形質転換体において、前記微生物は、大腸菌であってよい。この場合、前記大腸菌は、ＰｅｐＤ欠損株であってよい。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】試験例１において、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の野生型又は変異型のＴａｂＳを含有する精製酵素溶液を用いて酵素反応を行い、反応後の反応液中のヒドロキシプロリル－グリシン濃度を調べた結果を示す図表である。

【図2】試験例４において、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の変異型ＴａｂＳ（Ｓ８５Ｔ／Ｈ２９４Ｄ）を導入した大腸菌を用いて菌体反応を行い、反応後の反応液をＨＰＬＣ分析にかけた結果を示すクロマトグラムである。

【図3】試験例５において、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の変異型ＴａｂＳ（Ｓ８５Ｔ／Ｈ２９４Ｄ）を導入した大腸菌を用いた菌体反応を行う際の、反応液中のＫＣｌ濃度の影響を調べた結果を示す図表である。

【図4】試験例６において、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の変異型ＴａｂＳ（Ｓ８５Ｔ／Ｈ２９４Ｄ）を導入した大腸菌を用いた菌体反応を行う際の、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）とプロリン（Ｐｒｏ）の分解性、及びジペプチド合成への利用率を調べた結果を示す図表である。

【図5】試験例７において、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の変異型ＴａｂＳ（Ｓ８５Ｔ／Ｈ２９４Ｄ）を導入した大腸菌を用いた菌体反応を行う際、反応液中のグリシン（Ｇｌｙ）の添加濃度を２倍（２５ｍＭ）にした条件で反応を行った結果を示す図表である。

【図6】試験例８において、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の変異型ＴａｂＳ（Ｓ８５Ｔ／Ｈ２９４Ｄ）を導入した大腸菌を用いた菌体反応を行う際、反応液中のグリシン（Ｇｌｙ）の添加濃度を２倍（２５ｍＭ）又は４倍（５０ｍＭ）にし、菌体濃度を２倍（２０ｍｇ／ｍＬ）にした条件で反応を行った結果を示す図表である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明は、Ｌ－アミノ酸リガーゼを導入した微生物を用いてヒドロキシプロリル－グリシンを得る、ヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法を提供するものである。以下、ヒドロキシプロリル－グリシンのことを「Ｈｙｐ－Ｇｌｙ」ないし「ＯＧ」と表記する場合がある。なお、本明細書において、ヒドロキシプロリンは「ｔｒａｎｓ－４－Ｌ－ヒドロキシプロリン」であってよい。

【0024】

本発明に用いるＬ－アミノ酸リガーゼとしては、ヒドロキシプロリル－グリシン合成能を有する酵素であればよく、特に限定されないが、例えば、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来のＬ－アミノ酸リガーゼであるＴａｂＳなどを好ましく例示することができる。この場合、野生型のＴａｂＳのアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸残基が、ヒドロキシプロリル－グリシン合成能を損なわない範囲で置換された変異型ＴａｂＳであってもよい。

【0025】

なお、本明細書においては、アミノ酸やアミノ酸配列は、当業者に周知慣用のアミノ酸の３文字又は１文字による表記法で記述される場合がある。また、アミノ酸は、Ｌ体、Ｄ体、それらの混合やラセミ体であってよく、特にことわりのない限りＬ体であってよい。また、変異型タンパク質を表す場合、当業者に周知慣用の表記法である野生型タンパク質の変異が導入されるアミノ酸の１文字表記、変異位置を表す数字、及び、変異されたアミノ酸の１文字表記、例えば「Ｓ８５Ｔ」などによって記述される場合がある。

【0026】

上記シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）に由来するＬ－アミノ酸リガーゼであって、本発明に使用し得るＬ－アミノ酸リガーゼとしては、限定されないが、例えば以下に示すものが挙げられる。
（ｉ）シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の野生型ＴａｂＳのアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ５４８１５３に掲載のアミノ酸配列：配列番号１）を含むタンパク質
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、ヒドロキシプロリル－グリシン合成能を有するタンパク質
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ヒドロキシプロリル－グリシン合成能を有するタンパク質

【0027】

また別の態様において、本発明に使用し得る、上記シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）に由来するＬ－アミノ酸リガーゼとしては、例えば、
配列番号１のＮ末端から８５番目のセリン（Ｓ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、スレオニン（Ｔ）による置換、及び／又は
配列番号１のＮ末端から２９４番目のヒスチジン（Ｈ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、アスパラギン酸（Ｄ）による置換、を含むタンパク質が挙げられる。

【0028】

ヒドロキシプロリル－グリシン合成能を有するタンパク質であるかどうかの評価は、下記の反応式で表される通常のＬ－アミノ酸リガーゼ（Ｌａｌ）活性における評価と同様にして行うことができる。

【0029】

【化1】

【0030】

すなわち、基質としてヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）とグリシン（Ｇｌｙ）を縮合させ、α位カルボキシ基でペプチド結合させる活性、なかでもヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）とグリシン（Ｇｌｙ）をＮ末端側からその順で結合させてジペプチド（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）を得る活性を評価することができる。具体的には、限定されないが、例えば、被験タンパク質と、基質であるアミノ酸と、ＡＴＰとを含む、例えばｐＨ５～１１の緩衝液中で、例えば２０～５０℃の所定の温度で、例えば２～１５０時間の所定の時間インキュベーションし、インキュベーションによって産生するジペプチドの量若しくは濃度の増加、基質であるアミノ酸の量若しくは濃度の減少、ＡＴＰの量若しくは濃度の減少、ＡＤＰの量若しくは濃度の増加、又は無機リン酸の量若しくは濃度の増加の中の少なくとも１つを指標として、例えば、高速液体クロマトグラフィー等を用いて測定することができる。

【0031】

本発明に用いる微生物としては、原核生物及び真核生物のいずれであってもよく、特に限定されないが、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、コリネバクテリウム属細菌、バチルス属細菌、シュードモナス属細菌などの微生物が挙げられ、なかでも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が最も好ましく例示される。

【0032】

本発明の限定されない任意の態様においては、上記微生物はペプチダーゼ欠損株であってよい。これによれば、後述の実施例で示されるように、目的ジペプチドであるヒドロキシプロリル－グリシンの分解が抑制され、これにより合成効率が向上する。

【0033】

任意の微生物におけるペプチダーゼ欠損株の造成は、当業者に周知慣用の手段によればよい。例えば、特許第４５９３４７６号公報などに記載の方法により、任意の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてそのペプチダーゼ欠損株を造成することができる。欠損させるペプチダーゼとしては、ＰｅｐＤ、ＰｅｐＮ、ＰｅｐＡ、ＰｅｐＢなどが挙げられ、なかでもＰｅｐＤが最も好ましく例示される。

【0034】

本発明においては、上記したＬ－アミノ酸リガーゼを、上記した微生物に導入したうえで用いる。

【0035】

微生物へのＬ－アミノ酸リガーゼの導入は、その微生物の菌体内でＬ－アミノ酸リガーゼの酵素が働くようにすることができればよく、特に限定されないが、例えば、外来遺伝子を発現させるためのＤＮＡベクターを用いて、これにＬ－アミノ酸リガーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んだうえ、微生物の菌体内に導入して、そのベクター上のＤＮＡ配列情報に基づき、目的とするＬ－アミノ酸リガーゼを発現するようにすることなどが挙げられる。以下に、より詳細に説明する。ただし、微生物へのＬ－アミノ酸リガーゼの導入の形態は、以下に説明する特定の方法に限られるものではない。

【0036】

当業者に周知慣用の遺伝子クローニング手段により、所望のＬ－アミノ酸－リガーゼをコードする組換えＤＮＡを取得することができる。例えば、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）からは、Ｌ－アミノ酸－リガーゼであるＴａｂＳをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡを得ることができる。ＴａｂＳや異種生物間ホモログを産生する生物体としては、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）以外にも、Ｇｉｂｂｓｉｅｌｌａ ｑｕｅｒｃｉｎｅｃａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓの他、植物や動物でも報告されているが、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）が最も好ましい。

【0037】

取得した組換えＤＮＡには、必要に応じて、そのＤＮＡがコードしているアミノ酸配列の任意のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されてなる変異を導入するためのヌクレオチド変異を導入することができる。具体的には、当業者には周知の様々な変異導入法を用いて、例えば、取得した組換えＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ増幅や各種ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応に基づき、任意箇所に変異を導入することができる。部位特異的変異導入法は、例えば、ＰＣＲ法やアニーリング法等（村松ら編、「改訂第４版 新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２－８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社、米国）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アジレント テクノロジー社、米国）等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。

【0038】

取得した組換えＤＮＡを用いて、外来遺伝子を発現させるためのＤＮＡベクターに組み込んだうえ、そのベクターが菌体内に導入されてなる宿主株、すなわち形質転換体を造成することができる。ベクターへのＤＮＡの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４－１１．１１）。

【0039】

上記したＤＮＡベクターとしては、例えば、宿主株として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いる場合、ｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもノバジェン社製）、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０（キアゲン社製）、ｐＥＴ－３（ノバジェン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（－）（ストラタジーン社製）等を挙げることができる。

【0040】

上記したベクターについて、外来遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の宿主で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅ．ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また宿主としてバチルス属に属する微生物を用いる場合、バチルス サチルスで機能するＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を用いることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。

【0041】

上記した組換えＤＮＡを挿入したベクターの宿主への導入は、限定されないが、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム媒介トランスフェクション（リポフェクション）、接合、天然の形質転換、エレクトロポレーション及び当業者に公知のその他の方法を含む様々な方法によって行うことができる。また、商業的に利用可能なＤＮＡベクター導入試薬を入手し、これを利用してもよい［参考文献：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ３ Ｖｏｌｓ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．］。

【0042】

本発明において、ヒドロキシプロリル－グリシンの製造は、例えば、上記のようにして造成し得る、Ｌ－アミノ酸リガーゼが導入された微生物を用いて、その反応系には、基質としてヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）やグリシン（Ｇｌｙ）に、更に、必要に応じて糖質、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を存在せしめて、該微生物が生物活動のために備わるＡＴＰ供給系を利用することにより、所望とするイミダゾールジペプチドを製造するものである。これにより、ＡＴＰの添加を含まない、又は、モル数換算で製造されるイミダゾールジペプチド量よりも少ないＡＴＰ量の添加によって、所望とするヒドロキシプロリル－グリシンを製造することができる。

【0043】

ＡＴＰ供給系における基質の例としては、使用する微生物が利用してＡＴＰを産生できればよく、特に限定されない。具体的には、炭水化物、脂質等が挙げられる。炭水化物の例としては、糖質（糖類・単糖・二糖）、三糖（オリゴ糖）及び糖アルコール（グリセロールなど）などが挙げられる。好ましくは、グルコース及びグリセロールを挙げることができる。また、脂質の例としては、パルミチン酸、ステアリン酸などの脂肪酸が挙げられる。

【0044】

なお、このように目的とする製造物が微生物を用いて製造されるとき、限定されないが当業者には菌体反応法又は発酵法などと理解することができる。すなわち、「菌体反応法」とは、微生物を利用して目的とする製造物を製造するための方法であって、増殖が休止又は静止した状態にある微生物の内部の酵素活性を利用する方法である。よって、増殖又は生育のための培地成分の添加は不要である。また、「発酵法」とは、増殖又は生育状態にある微生物を使用して、目的とする製造物を製造する方法である。この場合、微生物の増殖又は生育のための培地成分の添加が必要である。以下に、より詳細に説明する。ただし、微生物と基質との反応の形態は、以下に説明する特定の方法に限られるものではない。

【0045】

ヒドロキシプロリル－グリシンを製造するには、例えば、上記したＬ－アミノ酸リガーゼが導入された微生物を用いて、ＡＴＰ供給系のための基質としての例えば糖質の共存下、該酵素のアミノ酸基質であるヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）及びグリシン（Ｇｌｙ）を、緩衝液中で、若しくは、緩衝液を用いずに適宜ｐＨを調整しながら菌体反応を行う、又は、微生物の増殖又は生育のための培地中で培養する。この反応後の、緩衝液や緩衝剤を含まない反応液、又は、培養後の培養液には、上記したＬ－アミノ酸リガーゼにより合成されたヒドロキシプロリル－グリシンが含まれる。よって、所望する場合には、これらから当業者に周知慣用の単離あるいは回収の手段による処理を経て、純度や濃度の高められたヒドロキシプロリル－グリシンを得ることが可能である。単離あるいは回収の手段としては、例えば、活性炭、イオン交換樹脂、分取ＨＰＬＣ、逆浸透膜、限外ろ過膜等を用いる方法、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、合成吸着樹脂などが挙げられる。

【0046】

上記菌体反応を行うための緩衝液としては、例えば、当業者に周知慣用の緩衝液である、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などを使用することができる。また、反応液又は培養培地のｐＨを調整しない、あるいは適宜にｐＨ調整剤を添加して調整することにより、緩衝液を使用することなく、ヒドロキシプロリル－グリシンを得ることも可能である。

【0047】

一方、上記微生物の培養を行うための培養培地に含まれる成分として、炭素源としては、一般に微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類などが挙げられる。

【0048】

また、上記培養培地に含まれる成分として、窒素源としては、一般に微生物が資化し得るものであればよく、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、及びその消化物などが挙られる。

【0049】

また、上記培養培地に含まれる成分として、無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミンなどが挙げられる。

【0050】

また、培養は、通常、通気撹拌、振とう等の好気条件下で行うことができる。培養温度は、上記したＬ－アミノ酸リガーゼが導入された微生物が増殖又は生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても使用した微生物が増殖又は生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸又はアルカリを添加して行うことができる。

【0051】

なお、反応液あるいは培養培地に添加する糖質の例としては、代表的にはグルコースであり、グルコースの添加量としては０．００１～３ｍｏｌ／Ｌの濃度であり、好ましくは０．００５～２ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．０１～１ｍｏｌ／Ｌである。また、ｐＨ条件としてはｐＨ５～１１であり、好ましくはｐＨ６～１０である。また、温度条件としては２０～４５℃であり、好ましくは２５～４０℃であり、反応又は培養時間としては２～７２時間であり、好ましくは６～３６時間である。

【0052】

本発明の限定されない任意の態様においては、高浸透圧条件により、アミノ酸基質としてヒドロキシプロリンやグリシン、特にはヒドロキシプロリンの微生物の菌体内への取り込みを亢進させることができる。このような高浸透圧条件は、使用する微生物を、例えば、ＫＣｌ、ＮａＣｌ等の塩により高塩濃度の環境下におくことでなし得る。その濃度範囲としては、５０～８００ｍＭであり、好ましくは１００～７００ｍＭであり、より好ましくは３００～６００ｍＭである。

【0053】

一方、本発明は、他の観点では、上記に説明したヒドロキシプロリル－グリシンの製造方法に用いられる微生物であって、外来Ｌ－アミノ酸リガーゼを導入した形質転換体を提供するものである。この場合、その微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってよく、該大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）はＰｅｐＤ欠損株であってよい。

【0054】

後述する実施例で示されるように、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、ないしは、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から８５番目のセリン（Ｓ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、スレオニン（Ｔ）による置換、及び／又は、配列番号１のＮ末端から２９４番目のヒスチジン（Ｈ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、アスパラギン酸（Ｄ）による置換、を含むタンパク質は、ＡＴＰを添加したインビトロ反応系で、ヒドロキシプロリン及びグリシンを基質としてヒドロキシプロリル－グリシンを合成する活性を有する。そのような合成活性を有する酵素を微生物の菌体内に導入した形質転換体によれば、その微生物のＡＴＰ供給系を利用したヒドロキシプロリル－グリシンの製造を有効に実施することが可能となる。

【実施例0055】

以下に実施例を挙げて本発明について更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

【0056】

〔１．材料・方法〕
ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）の調製、ＰＣＲ、塩基配列決定、形質転換、ＨＰＬＣ分析等は、当業者に周知慣用の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２０１２）等を参照することができる。

【0057】

〔２．ＴａｂＳ発現ベクターの造成〕
大腸菌を宿主にしたタンパク質発現用プラスミドベクターであるｐＥＴベクターの所定箇所に、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の野生型ＴａｂＳをコードするＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ５４８１５３に掲載のＤＮＡ配列：配列番号２）を組み込んだ。また、これを鋳型として、部位特異的変異導入キット（商品名「Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、米国）を用いて目的の変異を導入した。

【0058】

【表1】

【0059】

具体的には、野生型ＴａｂＳの８５番目のセリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）に置換した変異型１、２９４番目のヒスチジン（Ｈ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換した変異型２、８５番目のセリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）に置換し、２９４番目のヒスチジン（Ｈ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換した変異型３を得た（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．１２２ Ｎｏ．２，１５５－１５９, ２０１６）。

【0060】

〔３．形質転換体の造成〕
発現ベクターによる大腸菌宿主の形質転換を行った。具体的には、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＰｅｐＤ野生型、又はＰｅｐＤ欠損株）のコンピテントセルと、野生型又は変異型ＴａｂＳの発現ベクターとを共に、４２℃で熱処理した。その後、培養液のうちの２００μＬをカナマイシン１００μｇ／ｍＬ含有ＬＢ寒天培地に塗布し、終夜培養した。その後、寒天培地に生えたコロニー（形質転換体）をカナマイシン３０μｇ／ｍＬ含有ＬＢ培地３ｍＬに植菌し、３７℃で５時間培養した。

【0061】

〔４．大腸菌形質転換体からのＴａｂＳの発現誘導及び精製〕
上記３．で得られた形質転換体の培養液２ｍＬをカナマイシン１００μｇ／ｍＬ含有ＬＢ培地２００ｍＬに植菌し、ＯＤ６００の値が０．８に到達した時点でＩＰＴＧ(イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド：終濃度１００μＭ）を添加して、発現ベクターからの発現誘導を行った。

【0062】

ＩＰＴＧの添加から１８時間後、培養液を遠心分離（５，０００×ｇ、１０分、４oＣ）して集菌して、沈殿を生理食塩水にて洗菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔａｒｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて菌体破砕を行って、菌体破砕液を得た。その後、該菌体破砕液を遠心分離（７，０００×ｇ、３０分、４℃）し、無細胞抽出液を得た。

【0063】

得られた無細胞抽出液から精製酵素溶液を調製した。具体的には、ＧＥヘルスケア社製のＮｉアフィニティーカラムであるＨｉｓＧｒａｖｉＴｒａｐ及びＰＤ－１０カラムで精製し、精製酵素溶液を得た。なお精製時、Ｂｉｎｇｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ、ＮａＣｌ ５００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ １０ｍＭ ｉｎ ＭｉｌｌｉＱ ａｔ ｐＨ８．０）及びＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ、ＮａＣｌ ５００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ５００ｍＭ ｉｎ ＭｉｌｌｉＱ ａｔ ｐＨ８．０）を用いた。

【0064】

〔５．ＨＰＬＣ分析〕
ヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）等の定量は、常法に従い、ＨＰＬＣ分析により行った。以下にはその分析条件を示す。なお、ＨＰＬＣ分析の際には、供試試料をＮ^α－（５－Ｆｌｕｏｒｏ－２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｌ－ａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ（ＦＤＡＡ）と反応させて、アミノ酸又はペプチドのＮ末端側を誘導体化させ、その吸収波長を用いて検出した。

【0065】

＜分析条件＞
・使用機器：ＨＩＴＡＣＨＩ Ｌ－７０００ シリーズ（株式会社日立製作所、東京）
・使用カラム：ＷＨ－Ｃ１８Ａ（４×１５０ｍｍ）（株式会社日立ハイテクノロジーズ、東京）
・サンプル注入量：１０μＬ
・流速：０．５ｍＬ／分
・カラム温度：４０℃
・ＵＶ検出波長：３４０ｎｍ

【0066】

【表2】

【0067】

【表3】

【0068】

［試験例１］
シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来のＬ－アミノ酸リガーゼであるＴａｂＳやその部位特異的変異導入体にヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）を合成する活性があるかどうかを調べた。

【0069】

そのため、上記４．で得られた精製酵素溶液を用いて、表４に示す反応液を調製して、温度３７℃、ｐＨ７．０～１０．０の条件で２０時間反応を行った。その後、反応液１０μＬに対して、Ｎ^α－（５－Ｆｌｕｏｒｏ－２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｌ－ａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ（ＦＤＡＡ）を０．５％（ｗ／ｖ）含有するアセトン溶液を５０μＬ加えて（ｐＨ１０）、４０℃、１時間反応させ、アミノ酸又はペプチドのＮ末端側を誘導体化した。上記５．によるＨＰＬＣ分析の結果を、反応液中に含まれるヒドロキシプロリル－グリシンの濃度（ｍＭ）として算出した。

【0070】

【表4】

【0071】

その結果、図１に示されるように、Ｓ８５Ｔ変異又はＨ２９４Ｄ変異を導入した変異型ＴａｂＳでは、野生型と比較してＯＧ合成量がおよそ２倍程度に高められた。更に、Ｓ８５Ｔ／Ｈ２９４Ｄの二重変異を導入した変異型ＴａｂＳでは、野生型と比較して約４．５倍と高い収率でＯＧの合成に成功した。このとき反応液中に９．２８ｍＭのＯＧが確認され、対基質モル変換収率としては７４．８％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。

【0072】

［試験例２］
試験例１によれば、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来のＬ－アミノ酸リガーゼであるＴａｂＳやその部位特異的変異導入体には、ヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）を合成する活性があることが明らかとなった。そこで、当該酵素をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込んで、これを宿主大腸菌に導入してなる形質転換体により、ヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）の合成が可能ではないかと考えられた。

【0073】

その目的のため、まず、宿主大腸菌のペプチダーゼ活性の影響について調べた。具体的には、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、又は、分解に関与するペプチダーゼと予想されるＰｅｐＤの遺伝子を欠損している大腸菌ＰｅｐＤ欠損株（ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｐｅｐＤ株）を用いて、その大腸菌を１００ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁させ、これにヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）の標品（Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ社製）を５ｍＭとなるよう添加して、３０℃、２０時間反応させた（反応液量３００μＬ／１．５ｍＬマイクロチューブ）。反応後、上清を回収して、試験例１と同様にしてＦＤＡＡによる誘導体化の処理を行ったうえ、上記５．によるＨＰＬＣ分析を行った。結果は、反応液に添加したヒドロキシプロリル－グリシンの標品の量に対する残存率として算出した。

【0074】

【表5】

【0075】

その結果、表５に示されるように、ＯＧ分解に関与するペプチダーゼと予想されたＰｅｐＤを保持した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株では、添加したＯＧがすべて分解されて、検出できなかった。これに対して、大腸菌ＰｅｐＤ欠損株（ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｐｅｐＤ株）によれば、ＯＧ残存率は９１．６％となり、その分解が大幅に抑制された。

【0076】

以上から、大腸菌におけるＯＧの主要な分解酵素はＰｅｐＤであると考えられた。

【0077】

［試験例３］
試験例１によれば、シュードモナス シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来のＬ－アミノ酸リガーゼであるＴａｂＳやその部位特異的変異導入体には、ヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）を合成する活性があることが明らかとなった。また、試験例２によれば、宿主大腸菌のＰｅｐＤ欠損株により、菌体反応系において合成されるヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）の分解が抑えられると考えられた。

【0078】

そこで、大腸菌ＰｅｐＤ欠損株（ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｐｅｐＤ株）を宿主とし、Ｓ８５Ｔ／Ｈ２９４Ｄの二重変異を導入した変異型ＴａｂＳを発現するｐＥＴベクターを、上記３．の方法で導入して形質転換体を造成し、得られた形質転換体を用いて菌体反応によるヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）の合成を試みた。

【0079】

具体的には、表６に示す組成で反応液を調製し、３０℃、２２時間、インキュベートしながら反応させた（反応液量１０００μＬ／３ｍＬ容試験管）。その際、Ｌ－プロリンを基質としたＰｒｏ－Ｇｌｙ合成についても比較検討のため同様に実施した。反応後、上清を回収して、試験例１と同様にしてＦＤＡＡによる誘導体化を行ったうえ、上記５．によるＨＰＬＣ分析を行った。

【0080】

【表6】

【0081】

その結果、使用した基質（ヒドロキシプロリン又はプロリン）のそれぞれに対応するジペプチド、ヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）及びプロリル－グリシン（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）が確認された。ただし、合成量としては、Ｐｒｏ－Ｇｌｙでは十分に確認されたものの、目的とするＯＧについては微量にとどまるものであった。

【0082】

［試験例４］
試験例３によれば、菌体反応系において、宿主大腸菌による分解を抑制しただけではヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）の合成量に乏しいことが明らかになった。一方、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ合成は確認されたことから、合成量の乏しさはＨｙｐ－Ｇｌｙに特異的な現象であり、例えば、膜酵素を介した基質ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の取り込みや生成したヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）の排出に課題があると考えられた。

【0083】

そこで、高浸透圧条件による大腸菌の膜構造の脆弱化により、菌体反応系によるヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）の合成効率を向上させることができるかどうかを検討した。具体的には、表７に示すとおり、反応液中に３００ｍＭの濃度でＫＣｌやＮａＣｌを添加した条件で反応を実施した。

【0084】

【表7】

【0085】

図２には、１．０ｍＭ標品溶液、ＫＣｌあるいはＮａＣｌを添加した反応液、塩無添加の反応液の計４種類のクロマトグラムを示す。

【0086】

図２に示されるように、３００ｍＭの濃度のＫＣｌあるいはＮａＣｌの塩添加系において、菌体内へのヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の取り込みの指標であるＨｙｐ消費量が増加し（Ｈｙｐのピーク高の低下）、塩無添加に比較してＯＧの合成により効率的に活用されたことがわかる。

【0087】

［試験例５］
試験例４によれば、菌体反応系への３００ｍＭ濃度の塩添加が、ヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）の合成量を増加させるのに有効であった。そこで、表８に示す反応液組成により、菌体反応系におけるＫＣｌの濃度の影響を検討した。

【0088】

【表8】

【0089】

その結果、図３に示されるように、ＫＣｌの添加濃度が４００ｍＭのときＯＧ合成量が極大を示し、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）に対する対基質モル変換収率が３０．３％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。

【0090】

［試験例６］
大腸菌にはプロリン（Ｐｒｏ）の分解を触媒するプロリンデヒドロゲナーゼ（ＰｕｔＡ）が存在しているが、大腸菌由来ＰｕｔＡの精製酵素を用いた反応では、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）はプロリン（Ｐｒｏ）と比較して分解を受けにくいことが報告されている(Ｒｉｃｈａｒｄ Ｓ．， ｅｔ aｌ．， １９８７：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ２５３ （１７）, ５９９７－６００１)。そこで、菌体反応系における基質としてはどうか、それぞれを比較した。具体的には、表９に示す反応液組成で、菌体反応系によるヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）及びプロリル－グリシン（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）の合成を行い、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）とプロリン（Ｐｒｏ）の分解性、及びジペプチド合成への利用率を検証した。

【0091】

【表9】

【0092】

図４には、反応液に添加したヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）とプロリン（Ｐｒｏ）とが、それぞれヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）やプロリル－グリシン（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）に変換される割合、並びに合成に用いられず菌体外に残存した割合を示した。

【0093】

その結果、図４に示されるように、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を基質とする反応系では、ＯＧに変換した量と菌体外に残存した量との合計量が、基質として添加した量に対して大きな差がみられなかった。一方、プロリン（Ｐｒｏ）を基質とする反応系では、菌体外にほとんど残存しておらず、図中「Ｏｔｈｅｒｓ」で示される分解ロスが顕著であった。

【0094】

以上から、大腸菌由来ＰｕｔＡの精製酵素を用いた反応と同様に、菌体反応系においてもヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）がプロリン（Ｐｒｏ）に比べてＰｕｔＡによる分解を受けにくく、ＯＧへの効率的な変換が可能であることが明らかとなった。

【0095】

［試験例７］
試験例６によれば、宿主大腸菌におけるヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）に対する分解性の低さはヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）の合成に有利であることが示された。一方、もう１つの基質であるグリシン（Ｇｌｙ）は、大腸菌に存在するグリシン開裂系（Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｙｓｔｅｍ）によって分解されることが報告されている。したがって、菌体反応系におけるＨｙｐ－Ｇｌｙ合成においては、グリシン（Ｇｌｙ）供給が律速であり、その律速性を緩和することによって合成効率が向上する可能性があると考えられた。

【0096】

そこで、グリシン（Ｇｌｙ）供給の律速性の確認とともに、その律速性の緩和を試みた。具体的には、表１０に示すとおり、反応液中のグリシン（Ｇｌｙ）の添加濃度を２倍（２５ｍＭ）にした条件で反応を行った。

【0097】

【表10】

【0098】

図５には、反応液に添加した１２．５ｍＭ、２５ｍＭのグリシン（Ｇｌｙ）がそれぞれＯＧに変換される割合と、ＯＧ合成に用いられず菌体外に残存した割合を示す。

【0099】

図５に示されるように、反応液に添加したグリシン（Ｇｌｙ）がそれぞれＯＧに変換される割合は、グリシン（Ｇｌｙ）の添加濃度に関係なく同等であったが、菌体外の残存率には顕著な差がみられた。すなわち、グリシン（Ｇｌｙ）の添加濃度を２５ｍＭとした条件では、１２．５ｍＭの条件に比べ菌体外の残存率が顕著に増加し、図中「Ｏｔｈｅｒｓ」で示される分解ロスが大幅に低下した。このことから、当該濃度条件下では、菌体反応系におけるグリシン（Ｇｌｙ）供給の律速性が緩和されており、それは大腸菌によるグリシン（Ｇｌｙ）分解が抑制あるいは阻害されることによるものであることが示唆された。

【0100】

［試験例８］
試験例７によれば、基質となるグリシン（Ｇｌｙ）の添加濃度を高めることで、ヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）の合成効率の向上が期待できるものと考えられた。また、触媒となる菌体量増加によっても合成効率の向上が期待できるものと考えられた。

【0101】

そこで、ヒドロキシプロリル－グリシン（Ｈｙｐ－Ｇｌｙ）の合成効率の更なる向上を目指して、グリシン（Ｇｌｙ）の添加濃度を２倍（２５ｍＭ）又は４倍（５０ｍＭ）とし、菌体濃度を２倍（２０ｍｇ／ｍＬ）とした条件において反応を行った。

【0102】

【表11】

【0103】

その結果、図６に示されるように、グリシン（Ｇｌｙ）の添加濃度を１２．５ｍＭから２５ｍＭに増加させ、菌体濃度を１０ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬに増加させた条件では、ＯＧ合成量の大幅な増加がみられた。また、グリシン（Ｇｌｙ）の添加濃度を５０ｍＭに増加した条件では、ＯＧ合成量の更なる増加がみられ、基質であるヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）に対する対基質モル変換収率としては７７．９％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を達成することができた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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