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特開2023-58497ＰＳＥＵＤＯＭＯＮＡＳ ＡＥＲＵＧＩＮＯＳＡに対して使用するためのＤＮＡ抗体構築物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023058497
(43)【公開日】2023-04-25
(54)【発明の名称】ＰＳＥＵＤＯＭＯＮＡＳ ＡＥＲＵＧＩＮＯＳＡに対して使用するためのＤＮＡ抗体構築物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230418BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230418BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230418BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20230418BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20230418BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230418BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230418BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230418BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230418BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/11 Z
C12N15/31
C12N15/85 Z
A61P43/00 111
A61P31/04
A61P43/00 121
A61K48/00
A61K45/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023003954
(22)【出願日】2023-01-13
(62)【分割の表示】P 2019510582の分割
【原出願日】2017-05-05
(31)【優先権主張番号】62/332,363
(32)【優先日】2016-05-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】500429103
【氏名又は名称】ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア
(71)【出願人】
【識別番号】516142001
【氏名又は名称】ザ ウィスター インスティテュート オブ アナトミー アンド バイオロジー
(71)【出願人】
【識別番号】509320254
【氏名又は名称】イノビオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】デイビッド ビー．ウェイナー
(72)【発明者】
【氏名】アミ パテル
(72)【発明者】
【氏名】チエン イェン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染、及び、バイオフィルム形成を、予防、及び／または、治療する改善された治療方法を提供する。
【解決手段】本発明は、１つ以上のＤＮＡモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）をコードする核酸分子に関するものであって、当該核酸分子が、ａ）抗－ＰｃｒＶ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列、または、その断片あるいはホモログ、ｂ）抗－Ｐｓｌ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－αＰｓｌ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列、または、その断片あるいはホモログ、及び、ｃ）二重特異性抗－ＰｃｒＶ抗－Ｐｓｌ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列、または、その断片、もしくは、そのホモログ、の１つ以上を含む。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、１つ以上のＤＮＡモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）をコードする核酸分子に関するものであって、当該核酸分子が、ａ）抗－ＰｃｒＶ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列、または、その断片あるいはホモログ、ｂ）抗－Ｐｓｌ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－αＰｓｌ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列、または、その断片あるいはホモログ、及び、ｃ）二重特異性抗－ＰｃｒＶ抗－Ｐｓｌ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列、または、その断片、もしくは、そのホモログ、の１つ以上を含む。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１つ以上のＤＮＡモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）をコードする核酸分子であって、前記核酸分子が、
ａ）抗－ＰｃｒＶ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列、または、その断片、あるいは、そのホモログ、
ｂ）抗－Ｐｓｌ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－αＰｓｌ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列、または、その断片、あるいは、そのホモログ、及び
ｃ）二重特異性抗－ＰｃｒＶ抗－Ｐｓｌ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列、または、その断片、もしくは、そのホモログ、からなる群から選択される少なくとも１つを含む、前記核酸分子。
ａ）抗－ＰｃｒＶ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列、または、その断片、あるいは、そのホモログ、
ｂ）抗－Ｐｓｌ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－αＰｓｌ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列、または、その断片、あるいは、そのホモログ、及び
ｃ）二重特異性抗－ＰｃｒＶ抗－Ｐｓｌ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列、または、その断片、もしくは、そのホモログ、からなる群から選択される少なくとも１つを含む、前記核酸分子。
【請求項2】
開裂ドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項3】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項4】
ａ）が、
ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び、配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び、配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び、配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び、配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、
ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び、配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び、配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片、
ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び、配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、及び
ｈ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び、配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の断片、からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び、配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び、配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び、配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び、配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、
ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び、配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び、配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片、
ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び、配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、及び
ｈ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び、配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の断片、からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項5】
ｂ）が、
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、
ｅ）配列番号１９のヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｆ）配列番号１９のヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片、
ｇ）配列番号１９のヌクレオチド配列、及び
ｈ）配列番号１９のヌクレオチド配列の断片、からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
ａ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、
ｅ）配列番号１９のヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｆ）配列番号１９のヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片、
ｇ）配列番号１９のヌクレオチド配列、及び
ｈ）配列番号１９のヌクレオチド配列の断片、からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項6】
ｃ）が、
ａ）配列番号１８、及び、配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１８、及び、配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１８、及び、配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号１８、及び、配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、
ｅ）配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｆ）配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片、
ｇ）配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列、及び
ｈ）配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列の断片、からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
ａ）配列番号１８、及び、配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１８、及び、配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１８、及び、配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号１８、及び、配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、
ｅ）配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｆ）配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片、
ｇ）配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列、及び
ｈ）配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列の断片、からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項7】
前記核酸分子が、ＩＲＥＳエレメントをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項8】
前記ＩＲＥＳエレメントが、ウイルスＩＲＥＳ、及び、真核生物ＩＲＥＳからなる群から選択される、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項9】
前記核酸分子が、配列番号２４、及び、配列番号２５からなる群から選択されるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項10】
前記核酸分子が、リボ核酸分子である請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項11】
発現ベクターを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組成物。
【請求項13】
医薬として許容される賦形剤をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
対象の疾患を治療する方法であって、前記対象に対して、請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸分子、または、請求項１２～１３のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項15】
前記疾患が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記対象に対して、抗生物質を投与することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記抗生物質を、核酸分子または組成物の投与後１０日未満で投与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
対象におけるバイオフィルムの形成を予防または治療する方法であって、前記対象に対して、請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸分子、または、請求項１２～１３のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項19】
前記バイオフィルムが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記対象に対して抗生物質を投与することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記抗生物質を、核酸分子または組成物の投与後１０日未満で投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
対象において合成二重特異性抗体を生成するための組成物であって、１つ以上の抗体、または、その断片をコードする１つ以上の核酸分子を含み、前記二重特異性抗体が、第１及び第２の標的に結合する、前記組成物。
【請求項23】
前記第１の標的が、腫瘍関連抗原である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
前記第２の標的が、免疫細胞上の細胞表面マーカーである、請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、２０１６年５月５日に出願された米国仮特許出願第６２／３３２，３６３号の優先権を主張する。
本出願は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、２０１６年５月５日に出願された米国仮特許出願第６２／３３２，３６３号の優先権を主張する。
【0002】
本発明は、抗－ＰｃｒＶ、及び、二重特異性抗－ＰｃｒＶ抗－Ｐｓｌ抗体などの１つ以上の合成抗体、及び、その機能的断片を、インビボで、生成するための組換え核酸配列を含む組成物、及び、当該組成物を投与することで、対象における細菌感染を予防、及び／または、治療する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
多剤耐性（ＭＤＲ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．は、治療が最も困難な病原体の１つである。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．の感染は、嚢胞性線維症を有する個体での急性肺炎、及び、慢性肺炎の主要な原因であり、及び、火傷、または、その他の傷害における最も一般的な感染源であり、敗血症によって死亡に至ることもある。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．は、医療用インプラント、カテーテル、及び、人工関節などの医療装置の表面に付着して、例えば、カテーテルを詰まらせたり、インプラントを物理的に損傷させたりする、などの数々の問題を引き起こす。バイオフィルム形成細菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、高濃度の抗生物質に対して高度な耐性を示す。現在のところ、治療用抗体が、複数の疾患の治療用に承認されている。残念ながら、精製された抗体の製造、及び、送達には法外な費用を要する。さらに、これらの抗体治療は、毎週乃至毎月、改めて投与をしなければならず、このことは、医療用インプラントでのバイオフィルム形成の予防または治療など、慢性疾患の治療での厄介な検討事項となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
したがって、当該技術分野では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染、及び、バイオフィルム形成を、予防、及び／または、治療する改善された治療方法が必要とされている。本発明は、この要望に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
ある実施形態において、本発明は、１つ以上のＤＮＡモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）をコードする核酸分子に関するものであって、当該核酸分子が、ａ）抗－ＰｃｒＶ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列、または、その断片あるいはホモログ、ｂ）抗－Ｐｓｌ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－αＰｓｌ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列、または、その断片あるいはホモログ、及び、ｃ）二重特異性抗－ＰｃｒＶ抗－Ｐｓｌ ＤＭＡｂ（ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ）の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列、または、その断片、もしくは、そのホモログ、の１つ以上を含む。
【0006】
ある実施形態において、当該核酸分子は、開裂ドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【0007】
ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶの可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上、または、その断片、もしくは、そのホモログをコードする核酸分子は、ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び、配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び、配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び、配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、及び、配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び、配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び、配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片、ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び、配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、及び、ｈ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び、配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の断片の１つ以上である。
【0008】
ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｓｌの可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードする核酸分子、または、その断片、もしくは、そのホモログは、ａ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、ｅ）配列番号１９のヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、ｅ）配列番号１９のヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片、ｆ）配列番号１９のヌクレオチド配列、及び、ｇ）配列番号１９のヌクレオチド配列の断片の１つ以上である。
【0009】
ある実施形態において、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡの可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上、または、その断片、もしくは、そのホモログをコードする核酸分子は、ａ）配列番号１８、及び、配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ｂ）配列番号１８、及び、配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ｃ）配列番号１８、及び、配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、ｄ）配列番号１８、及び、配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列、ｅ）配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、ｆ）配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、そのヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片、ｇ）配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列、及び、ｈ）配列番号１７、及び、配列番号１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列の断片の１つ以上である。
【0010】
ある実施形態において、当該核酸分子は、ＩＲＥＳエレメントをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。ある実施形態において、当該ＩＲＥＳエレメントは、ウイルスＩＲＥＳ及び真核生物ＩＲＥＳからなる群から選択される。
【0011】
ある実施形態において、当該核酸分子は、リーダー配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【0012】
ある実施形態において、当該核酸分子は、発現ベクターを含む。
【0013】
ある実施形態において、本発明は、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、ＤＭＡｂ－αＰｓｌ、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡから選択される１つ以上のＤＮＡモノクローナル抗体、または、その断片、または、そのホモログをコードする核酸分子を含む組成物に関する。
【0014】
ある実施形態において、当該組成物は、医薬として許容される賦形剤をさらに含む。
【0015】
ある実施形態において、本発明は、対象における疾患を予防または治療する方法に関するものであって、当該方法は、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、ＤＭＡｂ－αＰｓｌ、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡから選択される１つ以上のＤＮＡモノクローナル抗体、または、その断片、または、そのホモログを含む核酸分子または組成物を、当該対象に対して投与することを含む。
【0016】
ある実施形態において、当該疾患は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染症である。
【0017】
ある実施形態において、当該方法は、抗生物質を当該対象に投与するステップをさらに含む。ある実施形態において、抗生物質を、核酸分子または組成物の投与後１０日未満で投与する。
【0018】
ある実施形態において、本発明は、対象におけるバイオフィルム形成を予防または治療する方法に関するものであって、当該方法は、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、ＤＭＡｂ－αＰｓｌ、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡから選択される１つ以上のＤＮＡモノクローナル抗体、または、その断片、または、そのホモログを含む核酸分子または組成物を、当該対象に対して投与することを含む。
【0019】
ある実施形態において、当該バイオフィルムは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムである。
【0020】
ある実施形態において、当該方法は、抗生物質を対象に対して投与することをさらに含む。ある実施形態において、抗生物質を、核酸分子または組成物の投与後１０日未満で投与する。
【0021】
ある実施形態において、本発明は、１つ以上の抗体をインビボで生成するために二重特異性である１つ以上のＤＮＡモノクローナル抗体をコードする核酸分子を含む組成物に関するものであって、当該核酸分子は、ａ）第１の抗原の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列、または、その断片、もしくは、そのホモログ、及び、ｂ）第２の抗原の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域の１つ以上をコードするヌクレオチド配列、または、その断片、もしくは、そのホモログの１つ以上を含む。
【0022】
ある実施形態において、本発明の二重特異性抗体分子は、あらゆる所望の特異的な２つの結合部位を有し得る。幾つかの実施形態において、当該結合部位の１つは、腫瘍関連抗原に結合することができる。幾つかの実施形態において、当該結合部位の１つは、免疫細胞上の細胞表面マーカーに結合することができる。
【0023】
ある実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、とりわけ、ＣＤ１９／ＣＤ３、ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ、ＴＮＦ／ＩＬ－１７、ＩＬ－１α／ＩＬ１β、ＩＬ－４／ＩＬ－１３、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＧＰ１００／ＣＤ３、ＡＮＧ２／ＶＥＧＦＡ、ＣＤ１９／ＣＤ３２Ｂ、ＴＮＦ／ＩＬ１７Ａ、ＩＬ－１７Ａ／ＩＬ１７Ｅ、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１９／ＣＤ３、ＣＥＡ／ＣＤ３、ＨＥＲ２／ＣＤ３、ＣＤ１２３／ＣＤ３、ＧＰＡ３３／ＣＤ３、ＥＧＲＦ／ＣＤ３、ＰＳＭＡ／ＣＤ３、ＣＤ２８／ＮＧ２、ＣＤ２８／ＣＤ２０、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３、または、ＭＥＴ／ＥＧＦＲを標的とする。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】図１Ａ～図１Ｃを含む図１は、ＤＭＡｂ送達、及び、インビトロ発現を実証する例示的実験の結果を示す。図１Ａは、ＤＭＡｂが、モノクローナル抗体クローンＶ２Ｌ２ＭＤ及びＡＢＣ１２３のＩｇＧ抗体重鎖及び軽鎖をコードし、その結果、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ構築物が得られるようにデザインしてあることを実証している概略図を示す。最適化したＤＭＡｂ構築物を、インビボのＩＭ－ＥＰでマウスに投与すると、筋肉細胞は、モノクローナル抗体を合成するようになる。完全に機能的なＤＭＡｂが、分泌され、そして、全身循環に移行する。図１Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ、または、コントロールのｐＧＸ０００１の１μｇ／ウェルでトランスフェクトされたことを実証する例示的実験の結果を示す。ｉ）上清、及び、ｉｉ）細胞溶解物を、４８時間後に回収した。試料を、ヒトＩｇＧについてアッセイした。図１Ｃは、トランスフェクトされた細胞に由来する細胞溶解物を用いて実施された例示的ウエスタンブロットの結果を示す。１０μｇの全細胞溶解物を各レーンに置き、そして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した後に、ニトロセルロースメンブレン上に移した。このメンブレンを、ＨＲＰに接合したヤギ抗－ヒトＩｇＧ Ｈ＋Ｌ抗体でプローブした。ＥＣＬ化学発光キットを用いて試料を現像し、そして、フィルム上で可視化した。
【図2】図２Ａ～図２Ｄを含む図２は、マウス骨格筋におけるＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡの発現を実証する例示的実験の結果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、または、ＤＭＡｂ－ＢｉＳｐＡ ＤＮＡを有するＤＮＡ注射をＴＡ筋肉内で行い、続いて、インビボ電気穿孔を行った。図２Ａは、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶを受ける細胞の例示的な画像を示す。図２Ｂは、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡを受ける細胞の例示的な画像を示す。図２Ｃは、ｐＧＸ０００１空ベクター主鎖を受ける細胞の例示的な画像を示す。図２Ｄは、ナイーブ筋細胞の例示的な画像を示す。筋肉組織を、ＤＭＡｂ注射の３日後に採取し、ヤギ抗－ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体でプローブし、続いて、抗－ヤギＩｇＧ ＡＦ８８及びＤＡＰＩで検出した。
【図3】図３Ａ～図３Ｆを含む図３は、マウスにおける、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡのインビボでの発現を実証する例示的実験の結果を示す。図３Ａは、ＩＭ－ＥＰで１００μｇのＤＭＡｂ－αＰｃｒＶを投与したＢ６．Ｃｇ－Ｆｏｘｎｌ＜ｎｕ＞／Ｊマウス（ｎ＝５／群）について１２０日間にわたってモニターしたヒトＩｇＧの血清レベルを実証する例示的実験の結果を示す。図３Ｂは、１００μｇ及び３００μｇのＤＭＡｂ－αＰｃｒＶを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０／群）における、７日目の血清レベルを実証する例示的実験の結果を示す。図３Ｃは、１００μｇのＤＭＡｂ－αＰｃｒＶを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０／群）における、７日目のＰｃｒＶタンパク質への血清結合を実証する例示的実験の結果を示す。図３Ｄは、ＩＭ－ＥＰで１００μｇのＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡを投与したＢ６．Ｃｇ－Ｆｏｘｎｌｎｕ／Ｊマウス（ｎ＝５／群）について１２０日間にわたってモニターしたヒトＩｇＧの血清レベルを実証する例示的実験の結果を示す。図３Ｅは、１００μｇ及び３００μｇのＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０／群）における、７日目の血清レベルを実証する例示的実験の結果を示す。図３Ｆは、１００μｇのＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０／群）における、ＰｃｒＶタンパク質に対する７日目の血清結合を実証する例示的実験の結果を示す。
【図4】図４Ａ～図４Ｃを含む図４は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ、及び、マウスＩｇＧ２ａ ＤＭＡｂの薬物動態を実証する例示的実験の結果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＤＭＡｂの１００μｇＤＮＡ注射をＴＡ筋肉内で行い、続いて、インビボ電気穿孔（ｎ＝１０／群）を行った。血清ヒトＩｇＧ１レベルを、ＤＭＡｂを注射して後、２１日間モニターし、そして、ＥＬＩＳＡによって定量した。マウスＩｇＧ２ａレベルを、ＤＭＡｂを注射して後、１０３日間モニターし、ＥＬＩＳＡによって定量した。図４Ａは、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶの薬物動態を実証する例示的実験の結果を示す。図４Ｂは、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡの薬物動態を実証する例示的実験の結果を示す。図４Ｃは、コントロールのＩｇＧ２Ａ ＤＭＡｂでの薬物動態を実証する例示的実験の結果を示す。
【図5】図５Ａ～図５Ｄを含む図５は、致命的肺炎を誘発した後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡによって与えられるインビボでの機能性及び保護作用を実証する例示的実験の結果を示す。図５Ａは、３００μｇのＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ、または、ＡＢＣ１２３ ＩｇＧ（２ｍｇ／ｋｇ）を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清ＩｇＧレベルを実証する例示的実験の結果を示す。ｎ＝５マウス／群。ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡを投与した２匹の動物では、抗細胞傷害活性アッセイの検出限界以下であった。抗体レベルは、接種日の血清でのＤＭＡｂを表している。図５Ｂは、致死量接種の－５日目に、コントロールのＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３（黒丸）、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ（赤丸）、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ（緑丸）を、または、－１日目に、精製したＡＢＣ１２３モノクローナル抗体（紫丸）を接種したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるインビボでの保護作用を実証する例示的実験の結果を示す（データは、２つの独立した実験から得たものであり、ｎ＝８／群／実験、合計ｎ＝１６）。図５Ｃは、異なる用量のＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ、１００μｇ（紫丸）、２００μｇ（緑丸）、３００μｇ（赤丸）、または、ＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３（コントロール）の保護作用を実証する例示的実験の結果を示す。ｎ＝８匹のマウス／群。図５Ｄは、異なる用量のＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡを用いて血清ＤＭＡｂ濃度を実証する例示的実験の結果を示す。ｎ＝８匹のマウス／群。
【図6】図６Ａ～図６Ｄを含む図６は、致命的Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを接種した後のＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡで処置した動物の臓器保護効果を実証する例示的実験の結果を示す。図６Ａは、ＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、ＤＭＡｂ－ＡＢＣ１２３、または、ＡＢＣ１２３ ＩｇＧで処置をした動物における致命的肺炎誘発後の肺、脾臓、及び、腎臓からＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細菌の臓器負荷（ＣＦＵ／ｍＬ）を定量した例示的実験の結果を示す。図６Ｂは、ＤＭＡｂで処置をした後の感染動物における肺重量を実証する例示的実験の結果を示す。図６Ｃは、致命的接種を受けた後にＤＭＡｂで処置をした動物の肺のホモジネートにおける炎症性サイトカイン及びケモカインのレベルを実証する例示的実験の結果を示す。図６Ａ～図６Ｃでは、ｎ＝８匹のマウス／群である。線は平均値を表す。ボックスとウィスカープロットは、すべての点を表示し、棒は、最小値から最大値を示す。図６Ｄは、致命的肺炎誘発の２４時間後の感染動物と比較した、非感染動物におけるＤＭＡｂ及びＡＢＣ１２３ ＩｇＧの血清ＩｇＧレベルを示す例示的実験の結果を示す。
【図7】図７Ａ～図７Ｈを含む図７は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ６０７７（ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ））で感染させてから４８時間後の急性肺炎の組織を実証する例示的実験の結果を示す。図７Ａは、顕著な肺胞浸潤及び出血の合体領域を示している、ＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３を用いた電気穿孔後を実証する例示的実験の結果を示す（倍率１０倍）。図７Ｂは、肺胞が、顕著な好中球浸潤、出血、及び、壊死の領域を有することを実証する例示的実験の結果を示す（差し込み図）。図７Ｃは、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶによる軽度の肺炎、及び、偶発細気管支破片を示す例示的実験の結果を示す（倍率１０倍）。図７Ｄは、混合好中球、及び、マクロファージ集団からなる肺胞浸潤を実証する例示的実験の結果を示す（差し込み図）。図７Ｅは、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ群における軽度の肺胞炎を実証する例示的実験の結果を示す（倍率１０倍）。図７Ｆは、主として、肺胞腔における好中球浸潤、及び、軽度の出血を実証する例示的実験の結果を示す（差し込み図）。図７Ｇは、ＡＢＣ１２３ ＩｇＧコントロールが、中程度の肺胞炎を示すことを実証する例示的実験の結果を示す（倍率１０倍）。図７Ｈは、肺胞腔が、細胞破片と混合された好中球、及び、出血を含んでいることを実証する例示的実験の結果を示す（差し込み図）。５匹のマウス／群から得た代表的なデータ。
【図8】図８は、図８Ａ～図８Ｂを含み、抗生物質投与計画を用いたＤＭＡｂの組み合わせを実証する例示的実験の結果を示す。図８Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、コントロールのＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３（１００μｇ）、生理食塩水＋メロペネム（ＭＥＭ、２．３ｍｇ／ｋｇ）、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ（１００μｇ）、または、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ（１００μｇ）＋ＭＥＭ（２．３ｍｇ／ｋｇ）を注射し、次いで、致死量のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ６０７７を接種したことを実証する例示的実験の結果を示す。ＭＥＭを、致命的接種の１時間後に投与した。感染させて後の１４４時間、動物をモニターした。ｎ＝８匹のマウス／群。図７Ｂは、致命的接種前の動物におけるＤＭＡｂ血清レベルを実証する例示的実験の結果を示す。ｎ＝８匹のマウス／群。線は平均値を表し、誤差棒は標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明は、抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む組成物に関する。当該組成物を、それを必要とする対象に投与し、合成抗体のインビボでの発現および形成を容易にする。
【0026】
特に、組換え核酸配列から発現した重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、合成抗体に組み立てることができる。当該重鎖ポリペプチド及び当該軽鎖ポリペプチドは、抗原に結合することができ、本明細書に記載のようにして組み立てられていない抗体に比べて免疫原性がさらに強く、かつ、抗原に対して免疫応答を惹起、もしくは、誘導することが可能な合成抗体の組み立てができるように、互いに相互作用することができる。
【0027】
さらに、これらの合成抗体は、抗原誘導の免疫応答に応答して産生される抗体よりもさらに速やかに対象内で生成される。当該合成抗体は、広範な抗原に効率的に結合し、中和することができる。当該合成抗体は、疾患を効率的に防御し、及び／または、疾患生存率を改善することもできる。
【0028】
１．定義
特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先となる。本発明の実施または試験において、本明細書に記載したものと同様または同等の方法及び材料を用いることはできるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び、他の引用文献は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する。なお、本明細書で開示した材料、方法、及び、実施例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先となる。本発明の実施または試験において、本明細書に記載したものと同様または同等の方法及び材料を用いることはできるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び、他の引用文献は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する。なお、本明細書で開示した材料、方法、及び、実施例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
【0029】
本明細書で使用する用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「を有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「を含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、及び、その変形は、付加的な行為または構造の可能性を妨げない、制限しない移行句、用語、または、単語であることを意図している。単数形である「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上断りの無い限りは、複数形の意味を持つこともある。本開示は、明示的に記載されているかどうかに関わらず、本明細書に示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、および「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」その他の実施形態も企図する。
【0030】
「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、または、ＩｇＥの抗体、または、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含む、その断片もしくは誘導体、ならびに、その一本鎖抗体、及び、誘導体を意味し得る。当該抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、または、これらの混合物のうち、所望のエピトープ、または、それに由来する配列に対する十分な結合特異性を示すものであり得る。
【0031】
本明細書で互換的に使用する、「抗体断片」または「抗体の断片」は、抗原結合部位または可変領域を含む完全抗体の一部分のことを指す。この部分は、完全抗体のＦｃ領域のある特定の重鎖領域（すなわち、抗体アイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４）を含まない。抗体断片の例として、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１つの軽鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチド、１つの重鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチド、及び、重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチドなどがあるが、これらに限定されない。
【0032】
「抗原」は、宿主内で免疫応答を惹起することが可能なタンパク質のことを指す。抗原は、抗体により認識されて結合され得る。抗原は、体内または外部環境から生じ得る。
【0033】
本明細書で使用する「コード配列」または「コード化核酸」とは、ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）、または、本明細書に記載の抗体をコードする核酸配列を含む核酸分子のことを指し得る。ある実施形態において、コード配列は、抗体をコードするＲＮＡ配列が転写されるＤＮＡ配列を含む。ある実施形態において、コード配列は、抗体をコードするＲＮＡ配列を含む。当該コード配列は、核酸の投与先である個体または哺乳動物の細胞での発現を誘導できるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始及び終止シグナルをさらに含むことができる。当該コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。
【0034】
本明細書で使用する「相補体」または「相補的」とは、ある核酸が、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間に、ワトソン・クリック（例えば、Ａ－Ｔ／Ｕ及びＣ－Ｇ）、または、フーグスティーン塩基対を表わすことを意味し得る。
【0035】
本明細書で使用する「定電流」とは、組織、または、当該組織を規定する細胞が、同組織に送達される電気パルスの持続期間中に受容する、または、経験する電流を定義する。当該電気パルスは、本明細書に記載の電気穿孔装置から送達される。この電流は、電気パルスの寿命期間中、当該組織に定電流量で留まるが、それは、本明細書で提供される電気穿孔装置が、好ましくは、瞬間的フィードバックを有しているフィードバック素子を具備しているからである。当該フィードバック素子は、パルスの持続期間中の組織（または、細胞）の抵抗を測定し、及び、電気穿孔装置に自身の電気エネルギー出力を変化させる（例えば、電圧を上げる）ようにすることができるので、同組織での電流は、電気パルスの間ずっと（マイクロ秒のオーダーで）、及び、パルス間において、一定であり続ける。幾つかの実施形態において、フィードバック素子は、制御器を含む。
【0036】
本明細書で使用する「電流フィードバック」または「フィードバック」は、互換的に使用されており、及び、提供される電気穿孔装置の活発な応答を意味し得るが、これは、電極間の組織の電流を測定することと、電流を一定レベルで維持するために、ＥＰ装置が送達するエネルギー出力を適宜変化させることとを含む。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気処理を開始する前に、使用者が予め設定する。電気穿孔装置内の電気回路が、電極間の組織の電流を連続的にモニターし、そのモニターされた電流（または、組織内の電流）を予め設定された電流と比較し、連続的にエネルギー出力の調整を行なって、モニターされた電流を予め設定されたレベルで維持することができるように、フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔コンポーネント、例えば、制御器によって達成され得る。当該フィードバックループは、瞬時のものであり得るものであり、それは、フィードバックループが、アナログ閉ループフィードバックであるからである。
【0037】
本明細書で使用する「分散電流」とは、本明細書に記載の電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得るものであり、これらのパターンは、電気穿孔される組織のあらゆる領域に対する電気穿孔関連の熱ストレスの発生を最小限に抑えるか、または、好ましくは、消失させる。
【0038】
本明細書で互換的に使用する「電気穿孔」、「電気透過処理」、または「界面動電増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味し得る。こうした微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、及び、水などの生体分子が、細胞膜の片側から他方の側に通過することが可能になる。
【0039】
本明細書で使用する「内因性抗体」とは、体液性免疫応答を誘導するのに有効な量で存在する、抗原を投与されている対象内で生成される抗体のことを指し得る。
【0040】
本明細書で使用する「フィードバック機構」とは、ソフトウェアまたはハードウェア（または、ファームウェア）のいずれかによって実行されるプロセスであって、（エネルギーパルスの送達前、送達中、及び／または、送達後の）所望の組織のインピーダンスを受容し、それを現在値、好ましくは、電流と比較して、送達されるエネルギーパルスを調整して、予め設定された値を達成するプロセスのことを指し得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施され得る。
【0041】
「断片」は、機能、すなわち、所望の標的に結合でき、かつ、全長抗体と同じ意図した効果を有する抗体のポリペプチド断片を意味し得る。抗体の断片は、シグナルペプチド、及び／または、第１位のメチオニンを有していても、欠いていても、いずれの場合にも、Ｎ末端、及び／または、Ｃ末端から少なくとも１つのアミノ酸が欠けている以外は、全長と１００％同一であってもよい。断片は、付加されたあらゆる異種シグナルペプチドを除いて、特定の全長抗体の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。当該断片は、当該抗体に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または、９９％以上同一であり、かつ、同一率を計算する際に含まれないＮ末端メチオニン、または、異種シグナルペプチドをさらに含むポリペプチドの断片を含む。さらに、断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのＮ末端メチオニン、及び／または、シグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニン、及び／または、シグナルペプチドは、抗体の断片に結合し得る。
【0042】
抗体をコードする核酸配列の断片は、シグナルペプチド、及び／または、第１位のメチオニンをコードする配列を有していても、または、欠いていても、いずれの場合にも、５’末端、及び／または、３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドが欠けている以外は、全長と１００％同一とし得る。断片は、付加されたあらゆる異種シグナルペプチドを除いた特定の全長コード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。当該断片は、抗体に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または、９９％以上同一であり、かつ、同一率を計算する際に含まれないＮ末端メチオニン、または、異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに任意に含むポリペプチドをコードする断片を含み得る。さらに、断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのＮ末端メチオニン、及び／または、シグナルペプチドに対するコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニン、及び／または、シグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に結合し得る。
【0043】
本明細書で使用する「遺伝子構築物」とは、抗体などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のことを指す。当該遺伝子構築物は、ＲＮＡ分子から転写されたＤＮＡ分子のことも指す。当該コード配列は、核酸分子の投与先である個体の細胞で発現を誘導できるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと作動可能に連結した、開始及び終止シグナルを含む。本明細書で使用する用語「発現可能な形態」とは、個体の細胞に存在しているときにコード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結した必要な調節要素を含んでいる遺伝子構築物のことを指す。ある実施形態において、遺伝子構築物は、本明細書に記載のＤＮＡ配列から転写されたＲＮＡ配列を含む。例えば、ある実施形態において、当該遺伝子構築物は、本発明の抗体、その変異体、または、その断片をコードする配列を含むＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子を含む。
【0044】
本明細書において、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の関係で使用する「同一」または「同一性」は、当該配列が、指定領域に渡って指定の割合の同一残基を有することを意味し得る。この割合を計算するには、２つの配列を好適に整列させ、指定領域に渡って２つの配列を比較し、双方の配列間で同一残基が発生する位置の数を確定して一致位置の数を得て、一致した位置の個数を指定領域の合計位置数で割り、計算結果に１００を掛けることで、配列同一性のパーセント値を算出し得る。２つの配列の長さが異なるか、あるいは、アライメントにより１つ以上の付着末端が生じて、指定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合には、単一配列の残基を、計算の分母には含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合には、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を同等とみなし得る。同一性は、筆算で求めてもよく、あるいは、ＢＬＡＳＴやＢＬＡＳＴ ２．０等のコンピューター配列アルゴリズムを使用して計算することもできる。
【0045】
本明細書で使用する「インピーダンス」は、フィードバック機構を論ずる際に利用し得るものであり、かつ、オームの法則に従って電流値に変換することができるため、予め設定された電流と比較が可能である。
【0046】
本明細書で使用する「免疫応答」とは、１つ以上の核酸、及び／または、ペプチドの導入に応答して、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系が活性化することを意味し得る。この免疫応答は、細胞性応答または体液性応答、または、その両方であり得る。
【0047】
本明細書で使用する「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖を表現することで、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、表現される一本鎖の相補鎖も包含する。ある核酸の多くの変異体を、所定の核酸として同一目的で使用し得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸、及び、その相補体も含む。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも含む。
【0048】
核酸は、一本鎖または二本鎖とし得るものであり、あるいは、二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部分を含み得る。当該核酸は、ＤＮＡ、双方のゲノム、及び、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ハイブリッドとし得るものであり、当該核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組み合わせを含み得るものであり、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及び、イソグアニンを含む塩基の組み合わせを含み得る。核酸は、化学合成法、または、組換え法により取得し得る。
【0049】
本明細書で使用する「作動可能に連結した」は、遺伝子の発現が、遺伝子と空間的に接続しているプロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。当該プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子において当該プロモーターを制御する遺伝子とプロモーターとの間の距離とほぼ同一とし得る。当該技術分野で周知の通り、プロモーター機能を喪失させずに、この距離の変化に適応し得る。
【0050】
本明細書で使用する「ペプチド」、「タンパク質」、または、「ポリペプチド」とは、アミノ酸の結合配列のことを意味することができ、天然、合成、または、天然及び合成の修飾、あるいは、それらの組み合わせとすることができる。
【0051】
本明細書で使用する「プロモーター」とは、核酸の細胞での発現を、実現し、活性化し、または、増強することのできる合成分子または天然由来分子のことを意味し得る。プロモーターは、発現をさらに増強し、及び／または、空間的発現、及び／または、その一時的発現を改変する目的で、１つ以上の特定の転写調節配列を含み得る。プロモーターは、遠位のエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントを含むこともでき、このものは、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置することができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び、動物を含む起源に由来し得る。プロモーターは、遺伝子成分の発現を調節し得るものであり、発現が起こる細胞、組織、もしくは、臓器、あるいは、発現が起こる発生段階については、恒常的もしくは差次的に、または、例えば、生理的ストレス、病原体、金属イオン、あるいは、誘発剤などの外部刺激に応答して同発現を調節し得る。プロモーターの代表例として、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ-ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、及び、ＣＭＶ ＩＥプロモーターなどがある。
【0052】
「シグナルペプチド」及び「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用されており、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端に結合することができるアミノ酸配列のことを指す。一般的に、シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用するシグナルペプチド／リーダー配列は、好ましくは、タンパク質を産生する細胞からタンパク質を分泌し易くする。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、タンパク質、別名、成熟タンパク質の残余から開裂されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端に結合する。
【0053】
本明細書で使用する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、例えば、核酸の複合混合物において、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が、第２の核酸配列（例えば、標的）とハイブリダイズする際の条件のことを意味し得る。ストリンジェントな条件は配列に依存するため、状況に応じて変化する。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列に対する融点（Ｔｍ）より約５～１０℃低くなるように選択される。このＴｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、及び、核酸濃度下で）標的に対して相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度のことである（この標的配列は、過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０～８．３において、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば、約０．０１～１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または、その他の塩）であり、及び、温度が、短いプローブ（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）では、低くとも約３０℃、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドを超えるもの）では、低くとも約６０℃とし得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加しても実現し得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２～１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の条件を含む。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び、１％ＳＤＳを用いて、４２℃でのインキュベート、あるいは、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳを用いて、６５℃でのインキュベートと、０．２×ＳＳＣ、及び、０．１％ＳＤＳを用いて、６５℃での洗浄を含む。
【0054】
本明細書で互換的に使用する「対象」及び「患者」とは、あらゆる脊椎動物を指すものであって、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、及び、マウス）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、もしくは、アカゲザル、チンパンジーなどのサル）、及び、ヒトなどがあるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、当該対象は、ヒトあるいは非ヒトとし得る。当該対象あるいは患者は、その他の形態の処置を受け得る。
【0055】
本明細書で使用する「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれ以上の個数のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列が、第２の配列の相補体と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％同一であること、あるいは、２つの配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【0056】
本明細書で使用する「実質的に同一」は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１１００個、または、それ以上の個数のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列と第２の配列が、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％同一であること、あるいは、核酸に関して、当該第１の配列が、当該第２の配列の相補体と実質的に相補的であることを意味し得る。
【0057】
本明細書で使用する「合成抗体」とは、本明細書に記載の組み換え核酸配列によってコードされ、そして、対象において生成される抗体のことを指す。
【0058】
本明細書で使用する「処置」または「処置する」は、疾患の予防、抑制、抑圧、または、完全排除の手段を介して、対象を疾患から防御するものと意味することができる。疾患を予防することは、その疾患の発症前に、当該対象に対して、本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑制することは、その疾患の誘導後であって、その疾患の臨床的出現の前に、当該対象に対して、本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑圧することは、その疾患の臨床的出現後に、当該対象に対して、本発明のワクチンを投与することを含む。
【0059】
核酸に関して本明細書で使用する「変異体」は、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部または断片、（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列またはその一部の相補体、（ｉｉｉ）基準核酸またはその相補体と実質的に同一の核酸、または、（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、基準核酸、その相補体、または、それらと実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸のことを意味し得る。
【0060】
ペプチドまたはポリペプチドに関して使用する「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または、保存的置換によってアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持しているものを意味し得る。また、変異体は、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する基準タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を、類似する特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、及び、分布）の別のアミノ酸に置換することは、当該技術分野では、通常は軽微な変化を伴うものと認識されている。こうした軽微な変化は、当該技術分野で理解されているように、アミノ酸の疎水親水度指数を検討することで、部分的に同定できる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水親水度指数は、その疎水性と電荷の考察に基づく。類似の疎水親水度指数を有するアミノ酸は置換可能であり、その後もタンパク質機能を維持する、ことが当該技術分野において公知である。ある態様において、±２の疎水親水度指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物機能を保持したタンパク質となる置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を検討することで、そのペプチドの局所的な最大平均親水性を計算でき、抗原性と免疫原性に対して良好に相関すると報告された有用な尺度となる。本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する米国特許第４，５５４，１０１号。当該技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、例えば、免疫原性などの生物活性を保持したペプチドが得られる。親水性値が互いに±２以内のアミノ酸を用いて、置換を実施できる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。こうした知見と一致して、生物機能に適合するアミノ酸の置換とは、当該アミノ酸の相対的類似性、特に、当該アミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存するものと理解されており、このことは、疎水性、親水性、電荷、大きさ、及び、その他の特性から明らかになる。
【0061】
変異体は、完全遺伝子配列、または、その断片の全長にわたって実質的に同一な核酸配列とし得る。当該核酸配列は、当該遺伝子配列、または、その断片の全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一とし得る。変異体は、アミノ酸配列、または、その断片の全長にわたって実質的に同一なアミノ酸配列とし得る。当該アミノ酸配列は、当該アミノ酸配列、または、その断片の全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一とし得る。
【0062】
本明細書で使用する「ベクター」は、複製開始点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または、酵母人工染色体とし得る。ベクターは、ＤＮＡベクター、または、ＲＮＡベクターとし得る。ベクターは、自己複製過剰染色体ベクター、または、宿主ゲノムに組み込むベクターのいずれかとし得る。
【0063】
本明細書における数値範囲の記載については、同程度の精度で、その間に入る各数を、明示的に企図している。例えば、６～９という範囲の場合、６及び９に加えて、７及び８という数を企図しており、６．０～７．０という範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び、７．０という数を明示的に企図している。
【0064】
２．組成物
本発明は、一部は、哺乳動物細胞においてモノクローナル抗体または二重特異性抗体を産生するために使用するための新規な配列の生成に基づく。ある実施形態において、当該配列は、細菌ベクター、酵母ベクター、及び、ウイルスベクターを含むＤＮＡまたはＲＮＡベクターでの送達のためのものである。本発明は、抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする組み換え核酸配列を含む組成物に関する。当該組成物は、それを必要とする対象に投与された場合、当該対象にて合成抗体の生成をもたらし得る。当該合成抗体は、対象内に存在する標的分子（すなわち、抗原）に結合することができる。そのような結合は、抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸によって抗原の認識をブロックして、抗原に免疫応答を惹起または誘発することができる。
本発明は、一部は、哺乳動物細胞においてモノクローナル抗体または二重特異性抗体を産生するために使用するための新規な配列の生成に基づく。ある実施形態において、当該配列は、細菌ベクター、酵母ベクター、及び、ウイルスベクターを含むＤＮＡまたはＲＮＡベクターでの送達のためのものである。本発明は、抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする組み換え核酸配列を含む組成物に関する。当該組成物は、それを必要とする対象に投与された場合、当該対象にて合成抗体の生成をもたらし得る。当該合成抗体は、対象内に存在する標的分子（すなわち、抗原）に結合することができる。そのような結合は、抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸によって抗原の認識をブロックして、抗原に免疫応答を惹起または誘発することができる。
【0065】
ある実施形態において、当該組成物は、合成抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、当該組成物は、第１の合成抗体をコードする第１のヌクレオチド配列、及び、第２の合成抗体をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。ある実施形態において、当該核酸分子は、開裂ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0066】
ある実施形態において、当該核酸分子は、抗－ＰｃｒＶ抗体（ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ）をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶをコードするヌクレオチド配列は、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶの可変ＶＨまたはＶＬ領域をコードするコドン最適化核酸配列を含む。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶの可変ＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶの可変ＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶの可変ＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列をコードする。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶの可変ＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列をコードする。
【0067】
ある実施形態において、抗－ＰｃｒＶ抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２に記載の可変ＶＨ領域、及び、配列番号４に記載の可変ＶＬ領域をコードする。ある実施形態において、抗－ＰｃｒＶ抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に記載の可変ＶＨ領域、及び、配列番号１６に記載の可変ＶＬ領域をコードする。ある実施形態において、抗－ＰｃｒＶ抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、及び、配列番号１４から選択されるアミノ酸配列をコードする。
【0068】
ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶの可変ＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に記載の配列を含む。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶの可変ＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３に記載の配列を含む。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶの可変ＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶの可変ＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に記載の配列を含む。
【0069】
ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に記載の可変ＶＨ配列、及び、配列番号３に記載の可変ＶＬ配列を含む。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１に記載の可変ＶＨ配列、及び、配列番号１５に記載の可変ＶＬ配列を含む。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び、配列番号１３から選択される配列を含む。
【0070】
ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶをコードするヌクレオチド配列は、リーダー配列をコードする配列に作動可能に連結される。様々な実施形態において、リーダー配列に作動可能に連結した配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び、配列番号１６を、それぞれ、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、及び、配列番号４１に記載している。
【0071】
ある実施形態において、当該核酸分子は、抗－Ｐｓｌ抗体（ＤＭＡｂ－αＰｓｌ）をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｓｌをコードする当該ヌクレオチド配列は、ＤＭＡｂ－αＰｓｌの可変ＶＨ領域、及び、可変ＶＬ領域をコードするコドン最適化核酸配列を含む。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｓｌをコードする当該ヌクレオチド配列は、ＤＭＡｂ－αＰｓｌの可変ＶＨ領域、及び、可変ＶＬ領域をコードするコドン最適化核酸配列を含む。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｓｌをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｓｌをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含む。
【0072】
ある実施形態において、ＤＭＡｂ－αＰｓｌをコードするヌクレオチド配列を、リーダー配列をコードする配列に作動可能に連結する。様々な実施形態において、リーダー配列に作動可能に連結した配列番号１９及び配列番号２０は、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５に記載してある。
【0073】
ある実施形態において、当該核酸分子は、二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、二重特異性抗体は、抗－ＰｃｒＶ、及び、抗－Ｐｓｌ二重特異性抗体（ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ）である。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡをコードする当該ヌクレオチド配列は、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡの可変ＶＨ領域、及び、可変ＶＬ領域をコードするコドン最適化核酸配列を含む。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８及び配列番号２２から選択されるアミノ酸配列をコードする。ある実施形態において、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７及び配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0074】
ある実施形態において、二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を、リーダー配列をコードする配列に作動可能に連結する。様々な実施形態において、リーダー配列に作動可能に連結した配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、及び、配列番号２２を、それぞれ、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４６、及び、配列番号４７に記載している。
【0075】
ある実施形態において、当該核酸分子は、リボヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子を含む。ある実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０から、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、及び、配列番号４７から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、ＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０から、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、及び、配列番号４７から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子から生成された転写物を含む。ある実施形態において、ＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９から、配列番号２１、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、及び、配列番号４６から選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子から生成された転写物を含む。
【0076】
本発明の組成物は、細菌活性に関連するあらゆる疾患、障害、または、病態を、処置、予防、及び／または、防御することができる。特定の実施形態において、当該組成物は、細菌感染症を、処置、予防、及び／または、防御することができる。特定の実施形態において、当該組成物は、細菌バイオフィルム形成を、処置、予防、及び／または、防御することができる。特定の実施形態において、当該組成物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染症を、処置、予防、及び／または、防御することができる。特定の実施形態において、当該組成物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルム形成を、処置、予防、及び／または、防御することができる。特定の実施形態において、当該組成物は、敗血症を、処置、予防、及び／または、予防することができる。
【0077】
合成抗体は、当該組成物を投与した対象における疾患を、処置、予防、及び／または、防御することができる。抗原に結合することで、当該合成抗体は、当該組成物を投与した対象における疾患を、処置、予防、及び／または、防御することができる。当該合成抗体は、当該組成物を投与した対象における疾患生存率を改善することができる。ある実施形態において、当該合成抗体は、当該合成抗体の投与を受けていない同じ疾患を有する対象において予測された生存期間にわたって、当該疾患を有する対象の延命を可能にする。様々な実施形態において、当該合成抗体は、当該組成物の非存在下で予測される生存期間にわたって、当該組成物の投与を受けた当該疾患を有する対象の生存について、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、１００％の改善を示すことができる。ある実施形態において、当該合成抗体は、当該対象における疾患を防御しており、当該合成抗体の投与を受けていない対象において予期される防御を超えるものである。様々な実施形態において、当該合成抗体は、当該組成物の投与を受けた対象の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、１００％において疾患を防御しており、当該組成物の非存在下で予測される防御を超えるものである。
【0078】
当該組成物は、当該対象に当該組成物を投与した後、少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、または、６０時間以内に、その対象にて当該合成抗体を生成することができる。当該組成物は、当該対象に当該組成物を投与した後、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または、１０日以内に、その対象にて当該合成抗体を生成することができる。当該組成物は、当該対象に当該組成物を投与した後、約１時間～約６日、約１時間～約５日、約１時間～約４日、約１時間～約３日、約１時間～約２日、約１時間～約１日、約１時間～約７２時間、約１時間～約６０時間、約１時間～約４８時間、約１時間～約３６時間、約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、または、約１時間～約６時間以内に、その対象にて当該合成抗体を生成することができる。
【0079】
当該組成物は、それを必要とする対象に投与した場合に、抗原の投与を受けて体液性免疫応答を誘発する対象において内因性抗体を生成する場合よりも迅速に、当該対象において当該合成抗体を生成することができる。当該組成物は、抗原の投与を受けて体液性免疫応答を誘発する対象において内因性抗体を生成する少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または、１０日前に、当該合成抗体を生成することができる。
【0080】
本発明の組成物は、安全であるなど、有効な組成物に必要とされる特徴を有しているため、当該組成物は、病気や死亡に至らしめるものではなく、病気を防御し、そして、投与が容易で、副作用もほぼ皆無であり、生物学的に安定で、また、用量当たりのコストも削減する。
【0081】
ａ．二重特異性抗体
本明細書のその他の箇所に記載したように、当該組成物は、組換え核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列は、二重特異性抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該抗体の詳細は、後述する。本発明は、第１の標的に対して特異的に結合する第１の抗原結合部位、及び、第２の標的に対して特異的に結合する第２の抗原結合部位を含み、例えば、生産性、安定性、結合親和性、生物学的活性、特定のＴ細胞への特異的標的、標的効率、及び、低い毒性などの特に有利な性質を有する、新規の二重特異性抗体を提供する。幾つかの例において、二重特異性抗体が存在し、当該二重特異性抗体は、第１の標的に対して高い親和性で結合し、かつ、第２の標的に対しては低い親和性で結合する。その他の例において、二重特異性抗体が存在し、当該二重特異性抗体は、低い親和性で第１の標的に対して、そして、高い親和性で第２の標的に対して結合する。その他の例において、二重特異性抗体が存在し、当該二重特異性抗体は、第１の標的に対して所望の親和性で結合し、及び、第２の標的に対して所望の親和性で結合する。
本明細書のその他の箇所に記載したように、当該組成物は、組換え核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列は、二重特異性抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該抗体の詳細は、後述する。本発明は、第１の標的に対して特異的に結合する第１の抗原結合部位、及び、第２の標的に対して特異的に結合する第２の抗原結合部位を含み、例えば、生産性、安定性、結合親和性、生物学的活性、特定のＴ細胞への特異的標的、標的効率、及び、低い毒性などの特に有利な性質を有する、新規の二重特異性抗体を提供する。幾つかの例において、二重特異性抗体が存在し、当該二重特異性抗体は、第１の標的に対して高い親和性で結合し、かつ、第２の標的に対しては低い親和性で結合する。その他の例において、二重特異性抗体が存在し、当該二重特異性抗体は、低い親和性で第１の標的に対して、そして、高い親和性で第２の標的に対して結合する。その他の例において、二重特異性抗体が存在し、当該二重特異性抗体は、第１の標的に対して所望の親和性で結合し、及び、第２の標的に対して所望の親和性で結合する。
【0082】
ある実施形態において、当該二重特異性抗体は、ａ）第１の抗原に対して特異的に結合する抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖、及び、ｂ）第２の抗原に対して特異的に結合する抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖を含む、二価抗体である。
【0083】
本発明の二重特異性抗体分子は、あらゆる所望の特異性の２つの結合部位を有し得る。幾つかの実施形態において、当該結合部位の一方は、腫瘍関連抗原に結合することができる。幾つかの実施形態において、Ｆａｂ断片に含まれる結合部位は、腫瘍関連表面抗原に特異的な結合部位である。幾つかの実施形態において、一本鎖Ｆｖ断片に含まれる結合部位は、腫瘍関連表面抗原などの腫瘍関連抗原に特異的な結合部位である。
【0084】
本明細書で使用する用語「腫瘍関連表面抗原」は、腫瘍細胞の表面または腫瘍細胞内に存在、あるいは、提示することができる抗原のことを指す。これらの抗原は、細胞表面上に提示することができ、分子の膜貫通部分及び細胞質部分と組み合わされることが多い細胞外部分を有する。これらの抗原は、幾つかの実施形態において、腫瘍細胞のみが提示できるのであって、正常細胞、すなわち、非腫瘍細胞は提示できない。腫瘍抗原は、腫瘍細胞上でのみ発現することができ、または、非腫瘍細胞と比較して、腫瘍特異的変異を表すことができる。このような実施形態において、それぞれの抗原は、腫瘍特異的抗原と称し得る。幾つかの抗原は、腫瘍関連抗原と称される腫瘍細胞と非腫瘍細胞の両方によって提示される。これらの腫瘍関連抗原は、非腫瘍細胞と比較して、腫瘍細胞上で過剰発現することができ、あるいは、非腫瘍組織と比較して、腫瘍組織の構造がコンパクトでないため、腫瘍細胞における抗体結合が可能である。幾つかの実施形態において、当該腫瘍関連表面抗原は、腫瘍の脈管構造上に位置する。
【0085】
腫瘍関連表面抗原を例示すると、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＩＬ３Ｒ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＤＣＰ１、Ｄｅｒｌｉｎ１、テネイシン、フリズルド１－１０、血管抗原ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ１）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＣＤ３０９）、ＰＤＧＦＲ－α（ＣＤ１４０ａ）、ＰＤＧＦＲ－β（ＣＤ１４０ｂ）エンドグリン、ＣＬＥＣ１４、Ｔｅｍｌ－８、及び、Ｔｉｅ２などがある。さらなる例として、Ａ３３、ＣＡＭＰＡＴＨ－１（ＣＤｗ５２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ｄｅ２－７ ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、Ｅｐ－ＣＡＭ、葉酸結合タンパク質、Ｇ２５０、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＩＬ－２受容体、ＩＬ３Ｒ、ＭＣＳＰ（メラノーマ関連細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、及び、ＴＡＧ－７２などがある。腫瘍の細胞外マトリックスに発現する抗原の例として、テネイシン、及び、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）がある。
【0086】
幾つかの実施形態において、本発明の抗体分子の結合部位の１つは、Ｔ細胞特異的受容体分子、及び／または、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子に結合することができる。Ｔ細胞特異的受容体、別名、「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）細胞とは、Ｔ細胞に対して結合することが可能で、そして、さらなるシグナルが存在する場合には、抗原提示細胞またはＡＰＣとも呼ばれているその他の抗原によって提示されたエピトープ／抗原によって活性化され、そして、それらに応答する。当該Ｔ細胞受容体は、天然に存在する免疫グロブリンのＦａｂ断片に似ていることが知られている。一般的に、それらは、α－及びβ－鎖を含む一価であり、幾つかの実施形態において、それらは、γ－鎖及びδ－鎖を含む（上記）。したがって、幾つかの実施形態において、当該ＴＣＲは、ＴＣＲ（α／β）であり、及び、幾つかの実施形態において、ＴＣＲ（γ／δ）である。当該Ｔ細胞受容体は、ＣＤ３ Ｔ細胞共受容体と複合体を形成する。ＣＤ３は、タンパク質複合体であり、４つの異なる鎖から構成される。哺乳動物において、当該複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３６鎖、及び、２つのＣＤ３Ｅ鎖を含む。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られている分子及びζ鎖と会合して、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。したがって、幾つかの実施形態において、Ｔ細胞特異的受容体は、ＣＤ３ Ｔ細胞共受容体である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞特異的受容体は、Ｔ細胞でも発現するタンパク質であるＣＤ２８である。ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化に必要な共刺激シグナルを提供することができる。ＣＤ２８は、Ｔ細胞増殖、及び、生存、サイトカイン産生、及び、Ｔ－ヘルパー２型の発生において重要な役割を果たす。Ｔ細胞特異的受容体のさらに別の例は、ＣＤ１３４、別名、Ｏｘ４０である。ＣＤ１３４／ＯＸ４０は、活性化して２４～７２時間後に発現し、そして、二次共刺激分子を定義するために使用することができる。Ｔ細胞受容体の別の例は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に関する４－１ ＢＢリガンドに結合することができる４－１ ＢＢであり、これにより、Ｔ細胞のための共刺激シグナルが生成する。主にＴ細胞で認められる受容体の別の例は、ＣＤ５であり、Ｂ細胞でも低頻度で認められる。受容体修飾Ｔ細胞機能のさらなる例は、その他の細胞の表面で発現するＦａｓリガンドによるアポトーシスシグナル伝達を媒介するＣＤ９５であり、Ｆａｓ受容体としても知られている。ＣＤ９５は、休止Ｔリンパ球におけるＴＣＲ／ＣＤ３－駆動シグナル伝達経路を調節する、との報告がある。
【0087】
ＮＫ細胞特異的受容体分子の例は、ＣＤ１６、低親和性Ｆｃ受容体、及び、ＮＫＧ２Ｄである。Ｔ細胞、及び、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の双方の表面に存在する受容体分子の例は、ＣＤ２と、ＣＤ２スーパーファミリーのさらなるメンバーである。ＣＤ２は、Ｔ細胞、及び、ＮＫ細胞での共刺激分子として作用することができる。
【0088】
幾つかの実施形態において、当該抗体分子の当該第１の結合部位は、腫瘍関連表面抗原に結合し、及び、当該第２の結合部位は、Ｔ細胞特異的受容体分子、及び／または、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子に結合する。幾つかの実施形態において、当該抗体分子の当該第１の結合部位は、Ａ３３、ＣＡＭＰＡＴＨ－１（ＣＤｗ５２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤＣＰ１、Ｈｅｒ３、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＣＬＥＣ１４、Ｄｅｒｌｉｎ１、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ｄｅ２－７ ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、エンドグリン、Ｅｐ－ＣＡＭ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、葉酸結合タンパク質、Ｇ２５０、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＳＦＩＲ（ＣＤ１１５）、フリズルド１－１０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＩＬ－２受容体、ＩＬ３Ｒ、ＭＣＳＰ（メラノーマ関連細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＴＡＧ－７２、テネイシン、Ｔｅｍｌ－８、Ｔｉｅ２、及び、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ１）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＣＤ３０９）、ＰＤＧＦＲ－α（ＣＤ１４０ａ）、ＰＤＧＦＲ－β（ＣＤ１４０ｂ）の１つと結合し、及び、当該第２の結合部位は、Ｔ細胞特異的受容体分子、及び／または、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子に結合する。幾つかの実施形態において、当該抗体分子の当該第１の結合部位は、腫瘍関連表面抗原に結合し、及び、当該第２の結合部位は、ＣＤ３、当該Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０，４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、及び、ＣＤ９５の１つと結合する。
【0089】
幾つかの実施形態において、当該抗体分子の当該第１の結合部位は、Ｔ細胞特異的受容体分子、及び／または、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子に結合し、及び、当該第２の結合部位は、腫瘍関連表面抗原に結合する。幾つかの実施形態において、当該抗体の当該第１の結合部位は、Ｔ細胞特異的受容体分子、及び／または、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子に結合し、及び、当該第２の結合部位は、Ａ３３、ＣＡＭＰＡＴＨ－１（ＣＤｗ５２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤＣＰ１、Ｈｅｒ３、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＣＬＥＣ１４、Ｄｅｒｌｉｎ１、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ｄｅ２－７ ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、エンドグリン、Ｅｐ－ＣＡＭ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、葉酸結合タンパク質、Ｇ２５０、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、フリズルド１－１０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＩＬ－２受容体、ＩＬ３Ｒ、ＭＣＳＰ（メラノーマ関連細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＴＡＧ－７２、テネイシン、Ｔｅｍｌ－８、Ｔｉｅ２、及び、ＶＥＧＦＲの１つに結合する。幾つかの実施形態において、当該抗体の当該第１の結合部位は、ＣＤ３、当該Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０，４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、及び、ＣＤ９５の１つに結合し、及び、当該第２の結合部位は、腫瘍関連表面抗原に結合する。
【0090】
ある実施形態において、本発明の当該二重特異性抗体は、とりわけ、ＣＤ１９とＣＤ３、ＨＥＲ３とＥＧＦＲ、ＴＮＦとＩＬ－１７、ＩＬ－１αとＩＬ１β、ＩＬ－４とＩＬ－１３、ＨＥＲ２とＨＥＲ３、ＧＰ１００とＣＤ３、ＡＮＧ２とＶＥＧＦＡ、ＣＤ１９とＣＤ３２Ｂ、ＴＮＦとＩＬ１７Ａ、ＩＬ－１７ＡとＩＬ１７Ｅ、ＣＤ３０とＣＤ１６Ａ、ＣＤ１９とＣＤ３、ＣＥＡとＣＤ３、ＨＥＲ２とＣＤ３、ＣＤ１２３とＣＤ３、ＧＰＡ３３とＣＤ３、ＥＧＲＦとＣＤ３、ＰＳＭＡとＣＤ３、ＣＤ２８とＮＧ２、ＣＤ２８とＣＤ２０、ＥｐＣＡＭとＣＤ３、または、ＭＥＴとＥＧＦＲ、を標的とする。
【0091】
ｂ．組換え核酸配列
上記したように、当該組成物は、組換え核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列は、当該抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該抗体の詳細については、後述する。
上記したように、当該組成物は、組換え核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列は、当該抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該抗体の詳細については、後述する。
【0092】
当該組換え核酸配列を、異種核酸配列とすることができる。当該組換え核酸配列は、少なくとも１つの異種核酸配列、または、１つ以上の異種核酸配列を含むことができる。
【0093】
当該組換え核酸配列を、最適化核酸配列とすることができる。そのような最適化は、抗体の免疫原性を増大あるいは変化させることができる。最適化により、転写、及び／または、翻訳も改善することができる。最適化とは、以下の１つ以上を含むことができる。低ＧＣ含量リーダー配列によって、転写を増大させること。ｍＲＮＡ安定性及びコドン最適化。コザック配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ）を追加して、翻訳を増進させる。そして、シグナルペプチドをコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列を追加する。そして、シス作用配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）を可能な限り取り除くこと。
【0094】
ｃ．組換え核酸配列構築物
当該組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素を含むことができ、その詳細については、後述する。
当該組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素を含むことができ、その詳細については、後述する。
【0095】
当該組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ、または、ペプチダーゼ開裂部位をコードする異種核酸配列も含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする異種核酸配列も含むことができる。ＩＲＥＳは、ウイルス性ＩＲＥＳ、または、真核生物ＩＲＥＳのいずれかにし得る。当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含むことができ、各リーダー配列は、シグナルペプチドをコードする。
【0096】
ある実施形態において、シグナルペプチドは、ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＴＨＡ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、シグナルペプチドは、ＭＶＬＱＴＱＶＦＩＳＬＬＬＷＩＳＧＡＹＧ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含む。シグナルペプチドをコードする配列に作動可能に連結された本発明の抗体をコードする例示的なヌクレオチド配列として、配列番号２６～配列番号４７に記載のヌクレオチド配列があるが、これに限定されない。
【0097】
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーター、１つ以上のイントロン、１つ以上の転写終止領域、１つ以上の開始コドン、１つ以上の終止または停止コドン、及び／または、１つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカー、または、タグ配列も含むことができる。当該タグ配列は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグをコードすることができる。
【0098】
（１）重鎖ポリペプチド
当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸を含むことができる。当該重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域、及び／または、少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含むことができる。少なくとも１つの当該定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、定常重鎖領域３（ＣＨ３）、及び／または、ヒンジ領域を含むことができる。
当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸を含むことができる。当該重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域、及び／または、少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含むことができる。少なくとも１つの当該定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、定常重鎖領域３（ＣＨ３）、及び／または、ヒンジ領域を含むことができる。
【0099】
幾つかの実施形態において、当該重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、及び、ＣＨ１領域を含むことができる。他の実施形態において、当該重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及び、ＣＨ３領域を含むことができる。
【0100】
当該重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができる。このＣＤＲセットは、ＶＨ領域の３つの超可変領域を含むことができる。当該重鎖ポリペプチドのＮ－末端から開始して、これらのＣＤＲを、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」と命名する。当該重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３は、当該抗原に対する結合、または、抗原の認識に寄与することができる。
【0101】
（２）軽鎖ポリペプチド
当該組換え核酸配列構築物は、当該軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。当該軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域、及び／または、定常軽鎖（ＣＬ）領域を含むことができる。
当該組換え核酸配列構築物は、当該軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。当該軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域、及び／または、定常軽鎖（ＣＬ）領域を含むことができる。
【0102】
当該軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができる。このＣＤＲセットは、ＶＬ領域の３つの超可変領域を含むことができる。当該軽鎖ポリペプチドのＮ－末端から開始して、これらのＣＤＲを、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」と命名する。当該軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３は、当該抗原に対する結合、または、抗原の認識に寄与することができる。
【0103】
（３）プロテアーゼ開裂部位
当該組換え核酸配列構築物は、当該プロテアーゼ開裂部位をコードする異種核酸配列を含むことができる。当該プロテアーゼ開裂部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって認識することができる。このプロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼとすることができ、例えば、フーリン、エラスターゼ、ＨｔｒＡ、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプシン、及び、ペプシンなどがあるが、これらに限定されない。このプロテアーゼを、フーリンとすることができる。他の実施形態において、このプロテアーゼを、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または、内部ペプチド結合を開裂する（すなわち、Ｎ－末端またはＣ－末端ペプチド結合を開裂しない）あらゆるプロテアーゼとすることができる。
当該組換え核酸配列構築物は、当該プロテアーゼ開裂部位をコードする異種核酸配列を含むことができる。当該プロテアーゼ開裂部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって認識することができる。このプロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼとすることができ、例えば、フーリン、エラスターゼ、ＨｔｒＡ、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプシン、及び、ペプシンなどがあるが、これらに限定されない。このプロテアーゼを、フーリンとすることができる。他の実施形態において、このプロテアーゼを、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または、内部ペプチド結合を開裂する（すなわち、Ｎ－末端またはＣ－末端ペプチド結合を開裂しない）あらゆるプロテアーゼとすることができる。
【0104】
当該プロテアーゼ開裂部位は、開裂の効率を改善または増大する１つ以上のアミノ酸配列を含むことができる。１つ以上の当該アミノ酸配列は、個別のポリペプチドの形成または生成の効率を改善または増大することができる。１つ以上の当該アミノ酸配列は、２Ａペプチド配列を含むことができる。
【0105】
（４）リンカー配列
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカー配列を含むことができる。当該リンカー配列は、本明細書に記載の１つ以上の構成要素を、空間的に分離、または、連結することができる。他の実施形態において、当該リンカー配列は、２つ以上のポリペプチドを空間的に分離、または、連結するアミノ酸配列をコードすることができる。
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカー配列を含むことができる。当該リンカー配列は、本明細書に記載の１つ以上の構成要素を、空間的に分離、または、連結することができる。他の実施形態において、当該リンカー配列は、２つ以上のポリペプチドを空間的に分離、または、連結するアミノ酸配列をコードすることができる。
【0106】
（５）プロモーター
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含むことができる。１つ以上の当該プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、かつ、調節することが可能なあらゆるプロモーターとし得る。かようなプロモーターは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを経由する転写に必要とされるシス作用配列要素である。遺伝子発現の指示に用いられるプロモーターは、特定の用途に依って選択される。当該プロモーターは、その自然環境における転写開始部位から由来しているため、当該組換え核酸配列構築物の当該転写開始からほぼ同じ距離で位置し得る。しかしながら、この距離の変動は、プロモーター機能を喪失せずに、適合し得る。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含むことができる。１つ以上の当該プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、かつ、調節することが可能なあらゆるプロモーターとし得る。かようなプロモーターは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを経由する転写に必要とされるシス作用配列要素である。遺伝子発現の指示に用いられるプロモーターは、特定の用途に依って選択される。当該プロモーターは、その自然環境における転写開始部位から由来しているため、当該組換え核酸配列構築物の当該転写開始からほぼ同じ距離で位置し得る。しかしながら、この距離の変動は、プロモーター機能を喪失せずに、適合し得る。
【0107】
当該プロモーターは、当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列に作動可能に連結され得る。当該プロモーターは、真核細胞での発現に有効であることが示されたプロモーターとし得る。当該コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、及び、ＳＶ４０後期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期プロモーターなど、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、または、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなどとし得る。また、当該プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、ヒトポリヘドリン、または、ヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターとし得る。
【0108】
当該プロモーターは、宿主細胞が何らかの特定の外的刺激に曝された場合にのみ転写を開始する、構成的プロモーター、または、誘導性プロモーターとすることができる。多細胞生物の場合、当該プロモーターを、特定の組織、または、器官、または、発生段階に特異的にすることもできる。また、当該プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、筋肉または皮膚特異的プロモーター、天然または合成のものとし得る。かようなプロモーターの例は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する米国特許出願公開公報第ＵＳ２００４０１７５７２７号に記載されている。
【0109】
当該プロモーターは、エンハンサーと関連することができる。当該エンハンサーは、当該コード配列の上流に位置することができる。当該エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、または、ＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、または、ＥＢＶに由来するウイルスエンハンサーとし得る。ポリヌクレオチド機能増強は、本明細書の一部を構成するものとしてそれぞれの全内容を援用する米国特許第５，５９３，９７２号、第５，９６２，４２８号、及び、第ＷＯ９４／０１６７３７号に記載されている。
【0110】
（６）イントロン
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のイントロンを含むことができる。各イントロンは、機能的スプライスドナー部位、及び、機能的スプライスアクセプター部位を含むことができる。当該イントロンは、スプライシングのエンハンサーを含むことができる。当該イントロンは、効率のよいスプライシングに必要な１つ以上のシグナルを含むことができる。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のイントロンを含むことができる。各イントロンは、機能的スプライスドナー部位、及び、機能的スプライスアクセプター部位を含むことができる。当該イントロンは、スプライシングのエンハンサーを含むことができる。当該イントロンは、効率のよいスプライシングに必要な１つ以上のシグナルを含むことができる。
【0111】
（７）転写終止領域
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の転写終止領域を含むことができる。当該転写終止領域は、効率的な終止を提供するためにコード配列の下流とすることができる。当該転写終止領域は、上記したプロモーターと同じ遺伝子から取得することができ、あるいは、１つ以上の異なる遺伝子から取得することもできる。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の転写終止領域を含むことができる。当該転写終止領域は、効率的な終止を提供するためにコード配列の下流とすることができる。当該転写終止領域は、上記したプロモーターと同じ遺伝子から取得することができ、あるいは、１つ以上の異なる遺伝子から取得することもできる。
【0112】
（８）開始コドン
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の開始コドンを含むことができる。当該開始コドンは、当該コード配列の上流に位置させることができる。当該開始コドンは、当該コード配列と共にインフレームにすることができる。当該開始コドンは、効率的な翻訳開始のために必要な１つ以上のシグナルと関連することができ、例えば、リボソーム結合部位と関連することができるが、これに限定されることはない。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の開始コドンを含むことができる。当該開始コドンは、当該コード配列の上流に位置させることができる。当該開始コドンは、当該コード配列と共にインフレームにすることができる。当該開始コドンは、効率的な翻訳開始のために必要な１つ以上のシグナルと関連することができ、例えば、リボソーム結合部位と関連することができるが、これに限定されることはない。
【0113】
（９）終止コドン
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の終止または停止コドンを含むことができる。当該終止コドンは、当該コード配列の下流とすることができる。当該終止コドンは、当該コード配列と共にインフレームにすることができる。当該終止コドンは、効率的な翻訳終止のために必要な１つ以上のシグナルと関連することができる。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の終止または停止コドンを含むことができる。当該終止コドンは、当該コード配列の下流とすることができる。当該終止コドンは、当該コード配列と共にインフレームにすることができる。当該終止コドンは、効率的な翻訳終止のために必要な１つ以上のシグナルと関連することができる。
【0114】
（１０）ポリアデニル化シグナル
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。当該ポリアデニル化シグナルは、当該転写の効率的なポリアデニル化のために必要な１つ以上のシグナルを含むことができる。当該ポリアデニル化シグナルは、当該コード配列の下流に位置させることができる。当該ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、または、ヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルとし得る。当該ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルとし得る。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。当該ポリアデニル化シグナルは、当該転写の効率的なポリアデニル化のために必要な１つ以上のシグナルを含むことができる。当該ポリアデニル化シグナルは、当該コード配列の下流に位置させることができる。当該ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、または、ヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルとし得る。当該ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルとし得る。
【0115】
（１１）リーダー配列
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含むことができる。当該リーダー配列は、シグナルペプチドをコードすることができる。当該シグナルペプチドを、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドとすることができ、例えば、ＩｇＧシグナルペプチド、及び、ＩｇＥシグナルペプチドなどがあるが、これらに限定されない。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含むことができる。当該リーダー配列は、シグナルペプチドをコードすることができる。当該シグナルペプチドを、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドとすることができ、例えば、ＩｇＧシグナルペプチド、及び、ＩｇＥシグナルペプチドなどがあるが、これらに限定されない。
【0116】
ｄ．組換え核酸配列構築物の配置
上記したように、当該組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができ、当該組換え核酸配列構築物の各々は、１つ以上の構成要素を含むことができる。１つ以上の当該構成要素とは、先に詳述した通りである。１つ以上の当該構成要素が当該組換え核酸配列構築物に含まれる場合、互いにあらゆる順序で配置し得る。幾つかの実施形態において、１つ以上の当該構成要素は、後述するようにして、当該組換え核酸配列構築物に配置することができる。
上記したように、当該組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができ、当該組換え核酸配列構築物の各々は、１つ以上の構成要素を含むことができる。１つ以上の当該構成要素とは、先に詳述した通りである。１つ以上の当該構成要素が当該組換え核酸配列構築物に含まれる場合、互いにあらゆる順序で配置し得る。幾つかの実施形態において、１つ以上の当該構成要素は、後述するようにして、当該組換え核酸配列構築物に配置することができる。
【0117】
（１）配置１
ある配置において、第１の組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができ、かつ、第２の組換え核酸配列構築物は、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。
ある配置において、第１の組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができ、かつ、第２の組換え核酸配列構築物は、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。
【0118】
当該第１の組換え核酸配列構築物は、ベクターに配置することができる。当該第２の組換え核酸配列構築物は、第２のベクター、または、他のベクターに配置することができる。当該組換え核酸配列構築物のベクターへの配置の詳細を、後述する。
【0119】
当該第１の組換え核酸配列構築物は、プロモーター、イントロン、転写終止領域、開始コドン、終止コドン、及び／または、ポリアデニル化シグナルも含むことができる。当該第１の組換え核酸配列構築物は、当該リーダー配列が、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または、５‘）に位置する当該リーダー配列をさらに含むことができる。したがって、当該リーダー配列によってコードされる当該シグナルペプチドは、ペプチド結合によって当該重鎖ポリペプチドに連結することができる。
【0120】
当該第２の組換え核酸配列構築物は、プロモーター、開始コドン、終止コドン、及び、ポリアデニル化シグナルも含むことができる。当該第２の組換え核酸配列構築物は、当該リーダー配列が、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または、５’）に位置する当該リーダー配列をさらに含むことができる。したがって、当該リーダー配列によってコードされる当該シグナルペプチドは、ペプチド結合によって当該軽鎖ポリペプチドに連結することができる。
【0121】
したがって、配置１の一例は、ＶＨ及びＣＨ１を含む当該重鎖ポリペプチドをコードする当該第１のベクター（したがって、第１の組換え核酸配列構築物）、及び、ＶＬ及びＣＬを含む当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該第２のベクター（したがって、第２の組換え核酸配列構築物）を含むことができる。配置１の第２の例は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、及び、ＣＨ３を含む当該重鎖ポリペプチドをコードする当該第１のベクター（したがって、第１の組換え核酸配列構築物）、及び、ＶＬ及びＣＬを含む当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該第２のベクター（したがって、第２の組換え核酸配列構築物）を含むことができる。
【0122】
（２）配置２
第２の配置において、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列は、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または５’）に配置することができる。あるいは、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または５’）に配置することができる。
第２の配置において、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列は、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または５’）に配置することができる。あるいは、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または５’）に配置することができる。
【0123】
当該組換え核酸配列構築物のベクターへの配置の詳細を、後述する。
【0124】
当該組換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ開裂部位、及び／または、リンカー配列をコードする当該異種核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列構築物に含まれる場合、当該プロテアーゼ開裂部位をコードする当該異種核酸配列は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列との間に配置することができる。したがって、当該プロテアーゼ開裂部位は、発現時に、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドを、異なるポリペプチドに分離させる。他の実施形態において、当該リンカー配列が当該組換え核酸配列構築物に含まれる場合、当該リンカー配列は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列との間に配置することができる。
【0125】
当該組換え核酸配列構築物は、プロモーター、イントロン、転写終止領域、開始コドン、終止コドン、及び／または、ポリアデニル化シグナルも含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、第１のプロモーターが、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と会合することができ、かつ、当該第２のプロモーターが、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と会合できるような、２つのプロモーターを含むことができる。さらに他の実施形態において、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列に関連する１つのプロモーターを含むことができる。
【0126】
当該組換え核酸配列構築物は、第１のリーダー配列を、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または、５’）に配置し、かつ、第２のリーダー配列を、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または、５’）に配置している、２つのリーダー配列をさらに含むことができる。したがって、当該第１のリーダー配列によってコードされる第１のシグナルペプチドは、ペプチド結合によって当該重鎖ポリペプチドに連結することができ、かつ、当該第２のリーダー配列によってコードされる第２のシグナルペプチドは、ペプチド結合によって当該軽鎖ポリペプチドに連結することができる。
【0127】
したがって、配置２の一例は、ＶＨ及びＣＨ１を含む当該重鎖ポリペプチド、及び、ＶＬ及びＣＬを含む当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該ベクター（したがって、組換え核酸配列構築物）を含むことができ、当該リンカー配列は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含む。
【0128】
配置２の第２の例は、ＶＨ及びＣＨ１を含む当該重鎖ポリペプチド、及び、ＶＬ及びＣＬを含む当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該ベクター（したがって、組換え核酸配列構築物）を含むことができ、当該プロテアーゼ開裂部位をコードする当該異種核酸配列は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列との間に配置する。
【0129】
配置２の第３の例は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、及び、ＣＨ３を含む当該重鎖ポリペプチド、及び、ＶＬ及びＣＬを含む当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該ベクター（したがって、組換え核酸配列構築物）を含むことができ、当該リンカー配列は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列との間に配置する。
【0130】
配置２の第４の例は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、及び、ＣＨ３を含む当該重鎖ポリペプチド、及び、ＶＬ及びＣＬを含む当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該ベクター（したがって、組換え核酸配列構築物）を含むことができ、当該プロテアーゼ開裂部位をコードする当該異種核酸配列は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列との間に配置する。
【0131】
ｅ．組換え核酸配列構築物からの発現
上記したように、当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素に、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。したがって、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドの発現を促す。
上記したように、当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素に、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。したがって、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドの発現を促す。
【0132】
上記した配置１を用いる場合、当該第１の組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドの発現を促すことができ、かつ、当該第２の組換え核酸配列構築物は、当該軽鎖ポリペプチドの発現を促すことができる。上記した配置２を用いる場合、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドの発現を促す。
【0133】
発現時に、例えば、細胞、生物、または、哺乳動物に限らず、それらおいて、当該重鎖ポリペプチド及び当該軽鎖ポリペプチドから、合成抗体を組み立てることができる。特に、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドは、組み立てることで、当該抗原に結合することが可能な当該合成抗体をもたらすように、互いに相互作用することができる。他の実施形態において、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドは、本明細書に記載したようにして組み立てていない抗体と比較して、免疫原性が強い合成抗体を組み立てられるように、互いに相互作用することができる。さらに別の実施形態において、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドは、当該抗原に対して免疫応答を惹起または誘導することができる合成抗体を組み立てられるように、互いに相互作用することができる。
【0134】
当該組換え核酸配列構築物は、リーダー配列をコードする配列をも含み得る。当該リーダー配列は、当該コード配列の５’とし得る。ある実施形態において、当該Ｎ末端リーダーは、配列番号２４及び配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含む。リーダー配列に作動可能に連結された本発明の例示的な核酸、及び、アミノ酸配列を、配列番号２６～配列番号４７に記載している。
【0135】
ｆ．ベクター
上記した当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のベクターに配置することができる。１つ以上の当該ベクターは、複製起点を含むことができる。１つ以上の当該ベクターを、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または、酵母人工染色体とすることができる。１つ以上の当該ベクターを、自己複製染色体外ベクター、または、宿主ゲノムに組み込まれるベクターとすることができる。
上記した当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のベクターに配置することができる。１つ以上の当該ベクターは、複製起点を含むことができる。１つ以上の当該ベクターを、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または、酵母人工染色体とすることができる。１つ以上の当該ベクターを、自己複製染色体外ベクター、または、宿主ゲノムに組み込まれるベクターとすることができる。
【0136】
ベクターとして、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、組換え「裸のＤＮＡ」ベクターなど、あらゆる形態などあるが、これらに限定されない。「ベクター」は、細胞を、感染、トランスフェクション、一時的または永久的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターを、裸の核酸、または、タンパク質または脂質と複合体を形成した核酸とすることが認識されるであろう。当該ベクターは、ウイルスまたは細菌の核酸、及び／または、タンパク質、及び／または、膜（例えば、細胞膜、ウイルス性脂質エンベロープなど）を任意に含む。ベクターとして、ＤＮＡの断片が付着して複製され得るレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）などがあるが、これらに限定されない。したがって、ベクターとして、ＲＮＡ、自律的自己複製環状または線状ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、プラスミド、ウイルスなど、米国特許第５，２１７，８７９号を参照されたい）などあり、また、発現プラスミドと非発現プラスミドの双方もあるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、当該ベクターは、線状ＤＮＡ、酵素ＤＮＡ、または、合成ＤＮＡを含む。組換え微生物または細胞培養物が、「発現ベクター」を宿しているとの記載がある場合、それは、宿主染色体に取り込まれた、染色体外の環状及び線状ＤＮＡ及びＤＮＡの双方を含む。ベクターが宿主細胞によって維持される場合、当該ベクターは、有糸分裂中に自律的構造として安定に複製されるか、あるいは、宿主のゲノム内に組み込まれ得る。
【0137】
１つ以上の当該ベクターは、異種発現構築物とすることができ、それは、一般的には、標的細胞に特定の遺伝子を導入するために使用されるプラスミドである。当該発現ベクターが細胞内に一旦入ると、当該組換え核酸配列構築物によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドは、当該細胞転写、及び、翻訳機構リボソーム複合体によって産生される。１つ以上の当該ベクターは、大量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、及び、故に、タンパク質を発現することができる。
【0138】
（１）発現ベクター
１つ以上の当該ベクターは、環状プラスミド、または、線状核酸とすることができる。当該環状プラスミド、及び、線状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる。当該組換え核酸配列構築物を含む１つ以上の当該ベクターは、キメラとすることができ、このことは、その構成要素の少なくとも１つが、その他の構成要素の少なくとも１つに関して異種であることを意味している。
１つ以上の当該ベクターは、環状プラスミド、または、線状核酸とすることができる。当該環状プラスミド、及び、線状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる。当該組換え核酸配列構築物を含む１つ以上の当該ベクターは、キメラとすることができ、このことは、その構成要素の少なくとも１つが、その他の構成要素の少なくとも１つに関して異種であることを意味している。
【0139】
（２）プラスミド
１つ以上の当該ベクターを、プラスミドとすることができる。当該プラスミドは、当該組換え核酸配列構築物で細胞をトランスフェクトするために有用であり得る。当該プラスミドは、当該組換え核酸配列構築物を当該対象に導入するために有用であり得る。また、当該プラスミドは、当該プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現に十分に適合し得る調節配列を含み得る。
１つ以上の当該ベクターを、プラスミドとすることができる。当該プラスミドは、当該組換え核酸配列構築物で細胞をトランスフェクトするために有用であり得る。当該プラスミドは、当該組換え核酸配列構築物を当該対象に導入するために有用であり得る。また、当該プラスミドは、当該プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現に十分に適合し得る調節配列を含み得る。
【0140】
当該プラスミドは、当該プラスミドを染色体外で維持し、かつ、細胞内で当該プラスミドの複数のコピーを産生するために、哺乳動物の複製起点をも含み得る。当該プラスミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のｐＶＡＸ、ｐＣＥＰ４、または、ｐＲＥＰ４とすることができ、それらは、エプスタインバーウイルス起点複製、及び、核抗原ＥＢＮＡ－１コード領域を含み得るものであり、組み込みをしなくとも、高コピーエピソーム複製を生じ得る。当該プラスミドの主鎖を、ｐＡＶ０２４２とすることができる。このプラスミドを、複製欠損型アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドとし得る。
【0141】
当該プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質産生のために使用され得る、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とし得る。また、当該プラスミドは、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生のために使用され得る、ｐ ＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とし得る。また、当該プラスミドは、昆虫細胞におけるタンパク質産生のために使用され得る、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のものとし得る。また、当該プラスミドは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞におけるタンパク質産生のために使用され得る、ｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とし得る。
【0142】
（３）ＲＮＡベクター
ある実施形態において、本発明の当該核酸分子は、本発明の抗体をコードするＲＮＡ分子を含む。ある実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０から、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、及び、配列番号４７から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０から、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、及び、配列番号４７から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子が生成した転写物を含む。ある実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９から、配列番号２１、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、及び、配列番号４６から選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子が生成した転写物を含む。したがって、ある実施形態において、本発明は、本発明の１つ以上の抗体をコードするＲＮＡ分子を提供する。当該ＲＮＡは、プラス鎖とし得る。したがって、幾つかの実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、逆転写などの介在性複製ステップを必要とせずに、細胞によって翻訳することができる。本発明に有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７－メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、ＲＮＡのインビボでの翻訳を促すことができる。本発明に有用なＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは、５’三リン酸基を有し得る。キャップされたＲＮＡにおいて、このものは、５’から５’への架橋を介して７－メチルグアノシンに連結され得る。ＲＮＡ分子は、３’ポリＡテールを有し得る。また、ポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を、その３’末端の近傍に有する。本発明に有用なＲＮＡ分子は、一本鎖とし得る。
ある実施形態において、本発明の当該核酸分子は、本発明の抗体をコードするＲＮＡ分子を含む。ある実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０から、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、及び、配列番号４７から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０から、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、及び、配列番号４７から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子が生成した転写物を含む。ある実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９から、配列番号２１、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、及び、配列番号４６から選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子が生成した転写物を含む。したがって、ある実施形態において、本発明は、本発明の１つ以上の抗体をコードするＲＮＡ分子を提供する。当該ＲＮＡは、プラス鎖とし得る。したがって、幾つかの実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、逆転写などの介在性複製ステップを必要とせずに、細胞によって翻訳することができる。本発明に有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７－メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、ＲＮＡのインビボでの翻訳を促すことができる。本発明に有用なＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは、５’三リン酸基を有し得る。キャップされたＲＮＡにおいて、このものは、５’から５’への架橋を介して７－メチルグアノシンに連結され得る。ＲＮＡ分子は、３’ポリＡテールを有し得る。また、ポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を、その３’末端の近傍に有する。本発明に有用なＲＮＡ分子は、一本鎖とし得る。
【0143】
（４）環状及び線状ベクター
１つ以上の当該ベクターを、細胞ゲノムへの組み込みによって標的細胞を形質転換し得るか、あるいは、染色体外に存在し得る環状プラスミド（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）とし得る。当該ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、または、ｐｒｏｖａｘ、または、当該組換え核酸配列構築物によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドを発現することができるあらゆる他の発現ベクターとし得る。
１つ以上の当該ベクターを、細胞ゲノムへの組み込みによって標的細胞を形質転換し得るか、あるいは、染色体外に存在し得る環状プラスミド（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）とし得る。当該ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、または、ｐｒｏｖａｘ、または、当該組換え核酸配列構築物によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドを発現することができるあらゆる他の発現ベクターとし得る。
【0144】
電気穿孔によって対象に対して効率的に送達され、及び、当該組換え核酸配列によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドを発現することができる、線状核酸または線状発現カセット（「ＬＥＣ」）も提供する。このＬＥＣは、あらゆるリン酸主鎖を欠いた線状ＤＮＡとし得る。このＬＥＣは、抗生物質耐性遺伝子、及び／または、リン酸主鎖を含まなくともよい。このＬＥＣは、所望の遺伝子発現と無関係の他の核酸配列を含有していなくともよい。
【0145】
当該ＬＥＣは、線状化することができるあらゆるプラスミドに由来し得る。当該プラスミドは、当該組換え核酸配列構築物によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドを発現することができる。当該プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）、または、ｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）とし得る。当該プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、または、ｐｒｏｖａｘ、または、当該組換え核酸配列構築物によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドを発現することができるあらゆる他の発現ベクターとし得る。
【0146】
当該ＬＥＣを、ｐｃｒＭ２とすることができる。当該ＬＥＣを、ｐｃｒＮＰとすることができる。ｐｃｒＮＰ、及び、ｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）、及び、ｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）から誘導することができる。
【0147】
（５）ウイルスベクター
ある実施形態において、本明細書において、本発明の核酸を細胞に送達することができるウイルスベクターを提供する。当該発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）、及び、その他のウイルス学、及び、分子生物学のマニュアルに記載がされている。ベクターとして有用なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及び、レンチウイルスなどがあるが、これらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び、１つ以上の選択マーカーを含む。（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び、米国特許第６，３２６，１９３号を参照されたい。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類、例えば、ヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及び、アデノ随伴ウイルスなどから誘導することができる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号、及び、第５，５８５，３６２号を参照されたい。
ある実施形態において、本明細書において、本発明の核酸を細胞に送達することができるウイルスベクターを提供する。当該発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）、及び、その他のウイルス学、及び、分子生物学のマニュアルに記載がされている。ベクターとして有用なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及び、レンチウイルスなどがあるが、これらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び、１つ以上の選択マーカーを含む。（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び、米国特許第６，３２６，１９３号を参照されたい。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類、例えば、ヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及び、アデノ随伴ウイルスなどから誘導することができる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号、及び、第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【0148】
（６）ベクターの調製方法
本明細書では、当該組換え核酸配列構築物が配置された１つ以上のベクターを調製する方法を提供する。最後のサブクローニング工程の後に、当該ベクターを用いて、当該技術分野で周知の方法を用いて、大規模発酵タンクに細胞培養物を接種することができる。
本明細書では、当該組換え核酸配列構築物が配置された１つ以上のベクターを調製する方法を提供する。最後のサブクローニング工程の後に、当該ベクターを用いて、当該技術分野で周知の方法を用いて、大規模発酵タンクに細胞培養物を接種することができる。
【0149】
他の実施形態において、最後のサブクローニング工程の後に、当該ベクターは、１つ以上の電気穿孔（ＥＰ）装置と共に使用することができる。このＥＰ装置の詳細は、後述する。
【0150】
１つ以上のベクターは、公知の装置、及び、技術の組み合わせを利用して製剤または製造することができるが、好ましくは、それらを、２００７年５月２３日に出願された許諾対象である同時係属中の米国特許仮出願第６０／９３９，７９２号に記載されたプラスミド製造技術を用いて製造する。幾つかの例において、本明細書に記載のＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤することができる。その製造技術は、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されたものに加えて、２００７年７月３日に発行された許諾対象特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されたものをはじめとする、当業者に概ね公知の様々な装置、及び、プロトコルをも含み、かつ、取り入れている。上記した参照出願及び特許である米国特許出願第６０／９３９，７９２号、及び、米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全内容を援用する。
【0151】
３．抗体
上記したように、当該組換え核酸配列は、抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該抗体は、抗原に結合できるか、あるいは、抗原と反応することができ、その詳細は、後述する。
上記したように、当該組換え核酸配列は、抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該抗体は、抗原に結合できるか、あるいは、抗原と反応することができ、その詳細は、後述する。
【0152】
当該抗体は、重鎖及び軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含んでいてもよく、それぞれは、ＣＤＲに対する支持体をもたらし、互いにＣＤＲの空間関係を規定する、重鎖及び軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットの間に介在する。当該ＣＤＲセットは、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含み得る。重鎖または軽鎖のＮ－末端から開始して、これらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び、「ＣＤＲ３」と命名する。したがって、抗原結合部位は、各々が重鎖及び軽鎖Ｖ領域からなるＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含み得る。
【0153】
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に開裂して、幾つかの断片を生じさせ、その内の２つの（Ｆ（ａｂ）断片）は、それぞれ、無傷抗原結合部位を含む共有結合ヘテロ二量体を含む。当該酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を開裂して、双方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ‘）２断片を含めた幾つかの断片を供することができる。したがって、当該抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２とすることができる。当該Ｆａｂは、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドを含むことができる。当該Ｆａｂの当該重鎖ポリペプチドは、当該ＶＨ領域、及び、当該ＣＨ１領域を含むことができる。当該Ｆａｂの軽鎖は、当該ＶＬ領域、及び、当該ＣＬ領域を含むことができる。
【0154】
当該抗体を、免疫グロブリン（Ｉｇ）とすることができる。当該Ｉｇを、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及び、ＩｇＧとすることができる。当該免疫グロブリンは、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドを含むことができる。当該免疫グロブリンの当該重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及び、ＣＨ３領域を含むことができる。当該免疫グロブリンの当該軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域及びＣＬ領域を含むことができる。
【0155】
当該抗体を、ポリクローナル抗体、または、モノクローナル抗体とすることができる。当該抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または、完全ヒト抗体とすることができる。当該ヒト化抗体を、非ヒト種由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを含む、所望の抗原に結合する非ヒト種由来の抗体とすることができる。
【0156】
当該抗体を、以下に詳述するような二重特異性抗体とすることができる。当該抗体は、以下にさらに詳述するような二機能性抗体とすることができる。
【0157】
上記したように、当該対象に当該組成物を投与すると、当該対象において、当該抗体を生成することができる。当該抗体は、当該対象内で半減期を有し得る。幾つかの実施形態において、当該抗体は、当該対象内でその半減期を延長または短縮するように改変され得る。そのような改変の詳細は、後述する。
【0158】
当該抗体は、その詳細を後述するように、脱フコシル化することができる。
【0159】
当該抗体は、その詳細を後述するように、当該抗原に関連する疾患の抗体依存性増強（ＡＤＥ）を、緩和または防止するように修飾し得る。
【0160】
ａ．二重特異性抗体
当該組換え核酸配列は、二重特異性抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該二重特異性抗体は、２つの抗原、例えば、その詳細を後述する抗原の２つと結合または反応することができる。当該二重特異性抗体は、本明細書に記載の抗体の２つの断片から構成することができ、それにより、当該二重特異性抗体は、２つの所望の標的分子との結合または反応が可能となり、それら標的分子は、その詳細を後述する抗原、受容体に対するリガンドを含むリガンド、受容体上のリガンド結合部位を含む受容体、リガンド－受容体複合体、及び、マーカーを含み得る。
当該組換え核酸配列は、二重特異性抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該二重特異性抗体は、２つの抗原、例えば、その詳細を後述する抗原の２つと結合または反応することができる。当該二重特異性抗体は、本明細書に記載の抗体の２つの断片から構成することができ、それにより、当該二重特異性抗体は、２つの所望の標的分子との結合または反応が可能となり、それら標的分子は、その詳細を後述する抗原、受容体に対するリガンドを含むリガンド、受容体上のリガンド結合部位を含む受容体、リガンド－受容体複合体、及び、マーカーを含み得る。
【0161】
ｂ．二機能性抗体
当該組換え核酸配列は、二機能性抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該二機能性抗体は、後述する抗原と結合するか、または、反応することができる。当該二官能性抗体は、当該抗原の認識及び抗原への結合を超えて、当該抗体に対して付加的な機能性を付与するように改変することもできる。そのような改変として、因子Ｈ、または、その断片へのカップリングを含むことができるが、これらに限定されない。因子Ｈは、補体活性化の可溶性調節因子であり、また、補体媒介性溶解（ＣＭＬ）を介した免疫応答に寄与し得る。
当該組換え核酸配列は、二機能性抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該二機能性抗体は、後述する抗原と結合するか、または、反応することができる。当該二官能性抗体は、当該抗原の認識及び抗原への結合を超えて、当該抗体に対して付加的な機能性を付与するように改変することもできる。そのような改変として、因子Ｈ、または、その断片へのカップリングを含むことができるが、これらに限定されない。因子Ｈは、補体活性化の可溶性調節因子であり、また、補体媒介性溶解（ＣＭＬ）を介した免疫応答に寄与し得る。
【0162】
ｃ．抗体半減期の延長
上記したように、当該抗体を、当該対象における当該抗体の半減期を延長または短縮するように改変し得る。当該改変は、当該対象での当該血清に含まれる当該抗体の当該半減期を延長または短縮し得る。
上記したように、当該抗体を、当該対象における当該抗体の半減期を延長または短縮するように改変し得る。当該改変は、当該対象での当該血清に含まれる当該抗体の当該半減期を延長または短縮し得る。
【0163】
当該改変は、当該抗体の定常領域に存在し得る。当該改変を、当該抗体の定常領域における１つ以上のアミノ酸の置換としてもよく、１つ以上の当該アミノ酸の置換を含有しない抗体の半減期と比較して、当該抗体の当該半減期を延長する。当該改変を、当該抗体のＣＨ２ドメインにおける１つ以上のアミノ酸の置換としてもよく、１つ以上の当該アミノ酸の置換を含有しない抗体の半減期と比較して、当該抗体の当該半減期を延長する。
【0164】
幾つかの実施形態において、当該定常領域における１つ以上の当該アミノ酸の置換として、当該定常領域のメチオニン残基をチロシン残基で置換すること、当該定常領域のセリン残基をスレオニン残基で置換すること、当該定常領域のスレオニン残基をグルタミン酸残基で置換すること、または、それらのあらゆる組み合わせを含み得るものであって、それにより、当該抗体の当該半減期を延長する。
【0165】
他の実施形態において、当該定常領域における１つ以上の当該アミノ酸の置換として、当該ＣＨ２ドメインのメチオニン残基をチロシン残基で置換すること、当該ＣＨ２ドメインのセリン残基をスレオニン残基で置換すること、当該ＣＨ２ドメインのスレオニン残基をグルタミン酸残基で置換すること、または、それらのあらゆる組み合わせを含み得るものであって、それにより、当該抗体の当該半減期を延長する。
【0166】
ｄ．脱フコシル化
当該組換え核酸配列は、フコシル化されていない抗体（すなわち、脱フコシル化抗体、または、非フコシル化抗体）、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。フコシル化は、当該糖フコースの分子への付加、例えば、Ｎ－グリカン、Ｏ－グリカン、及び、糖脂質へのフコースの結合を含む。したがって、脱フコシル化抗体では、フコースは、当該定常領域の当該炭水化物鎖に結合していない。次に、このフコシル化が欠如すると、当該フコシル化抗体と比較して、当該抗体によるＦｃγＲＩＩＩａ結合、及び、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を改善し得る。したがって、幾つかの実施形態において、当該非フコシル化抗体は、フコシル化抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性の増加を示し得る。
当該組換え核酸配列は、フコシル化されていない抗体（すなわち、脱フコシル化抗体、または、非フコシル化抗体）、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。フコシル化は、当該糖フコースの分子への付加、例えば、Ｎ－グリカン、Ｏ－グリカン、及び、糖脂質へのフコースの結合を含む。したがって、脱フコシル化抗体では、フコースは、当該定常領域の当該炭水化物鎖に結合していない。次に、このフコシル化が欠如すると、当該フコシル化抗体と比較して、当該抗体によるＦｃγＲＩＩＩａ結合、及び、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を改善し得る。したがって、幾つかの実施形態において、当該非フコシル化抗体は、フコシル化抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性の増加を示し得る。
【0167】
当該抗体を改変して、当該抗体のフコシル化を予防または阻害し得る。幾つかの実施形態において、そのような改変抗体は、未改変の当該抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性の増加を示し得る。当該改変は、重鎖、軽鎖、または、それらの組み合わせとし得る。当該改変は、当該重鎖における１つ以上のアミノ酸の置換、当該軽鎖における１つ以上のアミノ酸の置換、または、それらの組み合わせとし得る。
【0168】
ｅ．ＡＤＥ応答の低下
当該抗体を改変して、当該抗原に関連する疾患の抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）は抑制または防止するが、当該抗原は依然として中和し得る。
当該抗体を改変して、当該抗原に関連する疾患の抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）は抑制または防止するが、当該抗原は依然として中和し得る。
【0169】
幾つかの実施形態において、当該抗体を改変して、ＦｃｙＲｌａに対する当該抗体の結合を抑制または予防する１つ以上のアミノ酸の置換を含むようにし得る。１つ以上の当該アミノ酸の置換は、当該抗体の当該定常領域に存在し得る。１つ以上の当該アミノ酸の置換は、当該抗体の当該定常領域でのロイシン残基をアラニン残基で置換すること、すなわち、本明細書でＬＡ、ＬＡ変異、または、ＬＡ置換として示した置換を含み得る。１つ以上の当該アミノ酸の置換は、当該抗体の当該定常領域での２つのロイシン残基を、それぞれ、アラニン残基で置換すること、すなわち、本明細書でＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ変異、または、ＬＡＬＡ置換として示した置換を含み得る。当該ＬＡＬＡ置換の存在は、ＦｃｙＲ１ａに対する抗体の結合を予防またはブロックし得るものであって、したがって、当該改変抗体は、当該抗原に関連する疾患のＡＤＥを増強または惹起せずに、当該抗原は依然として中和し得る。
【0170】
４．抗原
当該合成抗体は、その抗原、または、その断片、または、その変異体に関する。当該抗原を、核酸配列、アミノ酸配列、多糖類、または、それらの組み合わせとすることができる。当該核酸配列を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの変異体、それらの断片、または、それらの組み合わせとすることができる。当該アミノ酸配列を、タンパク質、ペプチド、それらの変異体、それらの断片、または、それらの組み合わせとすることができる。当該多糖類を、核酸でコードされた多糖類とすることができる。
当該合成抗体は、その抗原、または、その断片、または、その変異体に関する。当該抗原を、核酸配列、アミノ酸配列、多糖類、または、それらの組み合わせとすることができる。当該核酸配列を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの変異体、それらの断片、または、それらの組み合わせとすることができる。当該アミノ酸配列を、タンパク質、ペプチド、それらの変異体、それらの断片、または、それらの組み合わせとすることができる。当該多糖類を、核酸でコードされた多糖類とすることができる。
【0171】
当該抗原を、細菌由来のものとすることができる。当該抗原を、細菌感染と関連させることができる。ある実施形態において、当該抗原を、細菌毒性因子とすることができる。
【0172】
ある実施形態において、本発明の合成抗体は、２つ以上の抗原を標的とする。ある実施形態において、二重特異性抗体の少なくとも１つの抗原は、本明細書に記載の抗原から選択される。ある実施形態において、２つ以上の抗原は、本明細書に記載の抗原から選択される。
【0173】
ａ．細菌性抗原
当該細菌抗原は、細菌抗原、または、その断片、または、その変異体とすることができる。当該細菌は、以下の門、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｒｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、及び、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａのいずれか１つに由来することができる。
当該細菌抗原は、細菌抗原、または、その断片、または、その変異体とすることができる。当該細菌は、以下の門、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｒｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、及び、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａのいずれか１つに由来することができる。
【0174】
当該細菌を、グラム陽性菌、または、グラム陰性菌とすることができる。当該細菌を、好気性細菌、または、嫌気性細菌とすることができる。当該細菌を、独立栄養細菌、または、従属栄養細菌とすることができる。当該細菌を、中温菌、好中球、好極限性菌、好酸菌、好アルカリ菌、好熱菌、好冷菌、好塩菌、または、好濃菌とすることができる。
【0175】
当該細菌を、炭疽菌、抗生物質耐性細菌、疾患起炎菌、食中毒細菌、感染性細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌、または、破傷風菌とすることができる。当該細菌を、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、または、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅとすることができる。当該細菌を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａとすることができる。
【0176】
（ａ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原
当該細菌抗原を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原、または、その断片、または、その変異体とし得る。当該Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原は、毒性因子に由来することができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに関連する毒性因子として、構造成分、酵素、及び、毒素があるが、これらに限定されない。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ毒性因子は、エキソ多糖類、付着因子、リポ多糖類、ピオシアニン、外毒素Ａ、外毒素Ｓ、細胞毒素、エラスターゼ、アルカリプロテアーゼ、ホスホリパーゼＣ、ラムノリピッド、及び、細菌分泌系の成分の１つである。
当該細菌抗原を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原、または、その断片、または、その変異体とし得る。当該Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原は、毒性因子に由来することができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに関連する毒性因子として、構造成分、酵素、及び、毒素があるが、これらに限定されない。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ毒性因子は、エキソ多糖類、付着因子、リポ多糖類、ピオシアニン、外毒素Ａ、外毒素Ｓ、細胞毒素、エラスターゼ、アルカリプロテアーゼ、ホスホリパーゼＣ、ラムノリピッド、及び、細菌分泌系の成分の１つである。
【0177】
ある実施形態において、抗原は、細胞外多糖類（例えば、アルギン酸塩、Ｐｅｌ、及び、Ｐｓｌ）である。ある実施形態において、抗原は、多糖合成遺伝子座（ｐｓｌ）、そこに含まれる遺伝子（例えば、ｐｓｌＡ、ｐｓｌＢ、ｐｓｌＣ、ｐｓｌＤ、ｐｓｌＥ、ｐｓｌＦ、ｐｓｌＧ、ｐｓｌＨ、ｐｓｌＩ、ｐｓｌＪ、ｐｓｌＫ、ｐｓｌＬ、ｐｓｌＭ、ｐｓｌＮ、及び、ｐｓｌＯ）、そこでコードされるタンパク質または酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホマンノースイソメラーゼ／ＧＤＰ－Ｄ－マンノースピロホスホリラーゼ、トランスポーター、加水分解酵素、ポリメラーゼ、アセチル化酵素、脱水素酵素、及び、トポイソメラーゼ）、または、そこから産生される産物（例えば、Ｐｓｌエキソ多糖類、別名、「Ｐｓｌ」）の１つである。
【0178】
ある実施形態において、抗原は、細菌分泌系の成分である。細菌に関しては、６つの異なるクラスの分泌系（タイプＩからＶＩ）が知られており、そのうち５つ（タイプＩ、ＩＩ、ＩＩ、Ｖ、及び、ＶＩ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むグラム陰性菌であることが知られている。ある実施形態において、抗原は、遺伝子（例えば、ａｐｒ、または、遺伝子を有する）、または、タンパク質（例えば、ＡｐｒＤ、ＡｐｒＥ、ＡｐｒＦ、ＨａｓＤ、ＨａｓＥ、ＨａｓＦ、及び、ＨａｓＲ）、または、Ｉ型分泌系の分泌タンパク質（例えば、ＡｐｒＡ、ＡｐｒＸ、及び、ＨａｓＡｐ）の１つである。ある実施形態において、抗原は、遺伝子（例えば、ｘｃｐＡ／ｐｉｌＤ、ｘｐｈＡ、ｘｑｈＡ、ｘｃｐＰ～Ｑ、及び、ｘｃｐＲ～Ｚ）、または、タンパク質（例えば、ＧｓｐＣ～Ｍ、ＧｓｐＡＢ、ＧｓｐＮ、ＧｓｐＯ、ＧｓｐＳ、ＸｃｐＴ～ＸｃｐＸ、ＦｐｐＡ）、または、ＩＩ型発現系の分泌タンパク質（例えば、ＬａｓＢ、ＬａｓＡ、ＰｌｃＨ、ＰｌｃＮ、ＰｌｃＢ、ＣｂｐＤ、ＴｏｘＡ、ＰｍｐＡ、ＰｒｐＬ、ＬｉｐＡ、ＬｉｐＣ、ＰｈｏＡ、ＰｓＡＰ、ＬａｐＡ）の１つである。ある実施形態において、抗原は、遺伝子（例えば、ｐｓｃ、ｐｃｒ、ｐｏｐ、または、ｅｘｓ遺伝子）、または、タンパク質（例えば、ＰｓｃＣ、ＰｓｃＥ～ＰｓｃＦ、ＰｓｃＪ、ＰｓｃＮ、ＰｓｃＰ、ＰｓｃＷ、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＤ、ＰｃｒＨ、及び、ＰｃｒＶ）、または、ＩＩＩ型発現系の分泌タンパク質（例えば、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＵ、および、ＥｘｏＹ）の１つである。ある実施形態において、抗原は、ＩＩＩ型分泌系の調節因子（例えば、ＥｘｓＡ及びＥｘｓＣ）である。ある実施形態において、抗原は、遺伝子（例えば、ｅｓｔＡ）、または、タンパク質（例えば、ＥｓｔＡ、ＣｕｐＢ３、ＣｕｐＢ５、及び、ＬｅｐＢ）、または、Ｖ型分泌系の分泌タンパク質（例えば、ＥｓｔＡ、ＬｅｐＡ、及び、ＣｕｐＢ５）の１つである。ある実施形態において、抗原は、遺伝子（例えば、ＨＳＩ－Ｉ、ＨＳＩ－ＩＩ、及び、ＨＳＩ－ＩＩＩ遺伝子）、または、タンパク質（例えば、Ｆｈａ１、ＶｇｒＧタンパク質、または、Ｈｃｐタンパク質）、または、ＶＩ型分泌系の分泌タンパク質（Ｈｃｐ１）の１つである。
【0179】
５．組成物の賦形剤及び他の成分
当該組成物は、医薬として許容される賦形剤をさらに含み得る。医薬として許容される当該賦形剤を、ビヒクル、担体、または、希釈剤としての機能的分子とすることができる。医薬として許容される当該賦形剤を、界面活性剤を含むことができる、トランスフェクション促進剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡなどのＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、または、ナノ粒子、または、その他の公知のトランスフェクション促進剤とすることができる。
当該組成物は、医薬として許容される賦形剤をさらに含み得る。医薬として許容される当該賦形剤を、ビヒクル、担体、または、希釈剤としての機能的分子とすることができる。医薬として許容される当該賦形剤を、界面活性剤を含むことができる、トランスフェクション促進剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡなどのＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、または、ナノ粒子、または、その他の公知のトランスフェクション促進剤とすることができる。
【0180】
当該トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩（ＬＧＳ）など、または、脂質である。当該トランスフェクション促進剤は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩であり、かつ、当該ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩は、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で当該組成物に存在し得る。当該トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡなどのＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、及び、スクアレン及びスクアレンなどの小胞を含んでいてもよく、そして、ヒアルロン酸を用いて、当該組成物と共に投与もし得る。当該組成物は、トランスフェクション促進剤、例えば、脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照されたい）などの当該技術分野で周知のその他のリポソームなどのリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、または、ナノ粒子、または、その他の公知のトランスフェクション促進剤も含み得る。当該トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩（ＬＧＳ）など、または、脂質である。当該ワクチンでの当該トランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または、０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【0181】
当該組成物は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、１９９４年４月１日に出願された米国特許出願第０２１，５７９号に記載の遺伝的助長因子をさらに含み得る。
【0182】
当該組成物は、約１ｎｇ～１００ｍｇ、約１μｇ～約１０ｍｇ、または、好ましくは、約０．１μｇ～約１０ｍｇ、または、より好ましくは、約１ｍｇ～約２ｍｇの量のＤＮＡを含む。幾つかの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、約５ｎｇ～約１０００μｇのＤＮＡを含む。幾つかの好ましい実施形態において、組成物は、約１０ｎｇ～約８００μｇのＤＮＡを含むことができる。幾つかの好ましい実施形態において、当該組成物は、約０．１～約５００μｇのＤＮＡを含むことができる。幾つかの好ましい実施形態において、当該組成物は、約１～約３５０μｇのＤＮＡを含むことができる。幾つかの好ましい実施形態において、当該組成物は、約２５～約２５０μｇ、約１００～約２００μｇ、約１ｎｇ～１００ｍｇ、約１μｇ～約１０ｍｇ、約０．１μｇ～約１０ｍｇ、約１ｍｇ～約２ｍｇ、約５ｎｇ～約１０００μｇ、約１０ｎｇ～約８００μｇ、約０．１～約５００μｇ、約１～約３５０μｇ、約２５～約２５０μｇ、約１００～約２００μｇのＤＮＡを含むことができる。
【0183】
当該組成物は、用いられる投与様式にしたがって製剤することができる。注射可能な医薬組成物は、滅菌された発熱物質不含のもの、及び、微粒子不含のものとすることができる。等張性製剤または溶液を用いることができる。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及び、ラクトースがある。当該組成物は、血管収縮剤を含むことができる。当該等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含むことができる。当該組成物は、ゼラチンやアルブミンなどの安定化剤をさらに含むことができる。当該安定剤、ＬＧＳ、または、ポリカチオン、または、ポリアニオンなどは、製剤を、室温または周囲温度で、長時間安定にすることができる。
【0184】
６．合成抗体の生成方法
また、本発明は、合成抗体の生成方法に関する。当該方法は、その詳細を後述する送達方法を用いて、それを必要とする当該対象に対して当該組成物を投与することを含むことができる。したがって、当該組成物を当該対象に投与した際に、当該合成抗体は、対象内またはインビボで生成される。
また、本発明は、合成抗体の生成方法に関する。当該方法は、その詳細を後述する送達方法を用いて、それを必要とする当該対象に対して当該組成物を投与することを含むことができる。したがって、当該組成物を当該対象に投与した際に、当該合成抗体は、対象内またはインビボで生成される。
【0185】
また、当該方法は、当該組成物を、１つ以上の細胞に導入することを含むことができ、したがって、当該合成抗体を、１つ以上の細胞において生成または製造することができる。さらに、当該方法は、当該組成物を、例えば、皮膚、及び、筋肉に限らず、それら組織の１つ以上に対して導入することを含むことができ、したがって、当該合成抗体は、１つ以上の組織において生成または製造することができる。
【0186】
７．抗体の同定方法またはスクリーニング方法
さらに、本発明は、上記した抗原に反応または結合する上記した抗体の同定またはスクリーニングの方法に関する。当該抗体を同定またはスクリーニングする当該方法を、当業者に周知の方法論における抗原に用いて、抗体を同定またはスクリーニングすることができる。そのような手法として、ライブラリ（例えば、ファージディスプレイ）由来の当該抗体の選択、及び、動物の免疫処置、続いて、当該抗体の単離、及び／または、精製があるが、これらに限定されない。
さらに、本発明は、上記した抗原に反応または結合する上記した抗体の同定またはスクリーニングの方法に関する。当該抗体を同定またはスクリーニングする当該方法を、当業者に周知の方法論における抗原に用いて、抗体を同定またはスクリーニングすることができる。そのような手法として、ライブラリ（例えば、ファージディスプレイ）由来の当該抗体の選択、及び、動物の免疫処置、続いて、当該抗体の単離、及び／または、精製があるが、これらに限定されない。
【0187】
８．組成物の送達の方法
また、本発明は、当該組成物を、それを必要とする当該対象に対して送達する方法に関する。当該送達方法は、当該組成物を、当該対象に対して投与することを含む、ことができる。投与としては、インビボ電気穿孔を利用する、及び、同電気穿孔を利用しないＤＮＡ注入、リポソーム介在送達、及び、ナノ粒子促進送達などがあるが、これらに限定されない。
また、本発明は、当該組成物を、それを必要とする当該対象に対して送達する方法に関する。当該送達方法は、当該組成物を、当該対象に対して投与することを含む、ことができる。投与としては、インビボ電気穿孔を利用する、及び、同電気穿孔を利用しないＤＮＡ注入、リポソーム介在送達、及び、ナノ粒子促進送達などがあるが、これらに限定されない。
【0188】
当該組成物の送達を受ける当該哺乳動物を、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、水牛、バイソン、ウシ、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、及び、ニワトリとし得る。
【0189】
当該組成物を、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入、頬側投与、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻内、髄腔内、及び、関節内、または、それらの組み合わせなどの異なる経路で投与し得る。獣医学的使用については、通常の獣医学的実施に従って、当該組成物を、適切に許容しうる製剤として投与し得る。獣医師は、特定の動物に対して最も適切な投与計画、及び、投与経路を、容易に決定することができる。当該組成物を、伝統的なシリンジ、無針注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または、その他の物理的方法、例えば、電気穿孔法（ＥＰ）、「流体力学的方法」、または、超音波によって投与し得る。
【0190】
ａ．電気穿孔
電気穿孔による当該組成物の投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得るものであり、及び、好ましくは、当該エネルギーパルスは、使用者が入力したプリセット電流に近い定電流である。当該電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネント、及び、電極アセンブリ、または、ハンドルアセンブリを含み得る。電気穿孔コンポーネントは、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリーコンポーネント、電源、及び、電源スイッチなどの当該電気穿孔装置の１つ以上の様々な要素を含み、及び、組み込み得る。当該電気穿孔は、インビボ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）、または、Ｅｌｇｅｎエレクトロポレーター（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）を使用して、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にし得る。
電気穿孔による当該組成物の投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得るものであり、及び、好ましくは、当該エネルギーパルスは、使用者が入力したプリセット電流に近い定電流である。当該電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネント、及び、電極アセンブリ、または、ハンドルアセンブリを含み得る。電気穿孔コンポーネントは、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリーコンポーネント、電源、及び、電源スイッチなどの当該電気穿孔装置の１つ以上の様々な要素を含み、及び、組み込み得る。当該電気穿孔は、インビボ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）、または、Ｅｌｇｅｎエレクトロポレーター（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）を使用して、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にし得る。
【0191】
当該電気穿孔コンポーネントは、当該電気穿孔装置の１つの要素として機能し得るものであり、及び、その他の要素は、当該電気穿孔コンポーネントと連絡する別々の要素（または、コンポーネント）である。当該電気穿孔コンポーネントは、当該電気穿孔装置の１つを超える個数の要素として機能し得るものであり、当該電気穿孔コンポーネントとはなおも別の当該電気穿孔装置のその他の要素とも連絡し得る。１つの電気機械的、または、機械的装置の一部として存在する当該電気穿孔装置の要素は、それらの要素が、１つの装置として、または、互いに連絡する別の要素として機能することができるものに限定しなくともよい。当該電気穿孔コンポーネントは、所望の組織内で定電流を生成するエネルギーパルスを送達し得るものであり、及び、フィードバック機構を含む。当該電極アセンブリは、空間的配置内に複数の電極を有する電極アレイを含み得るものであり、当該電極アセンブリは、当該電気穿孔コンポーネントからエネルギーパルスを受け、そして、電極を介して所望の組織に向けて同パルスを送達する。複数の当該電極の少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達期間ではニュートラルであり、及び、所望の組織でのインピーダンスを測定して、そのインピーダンスを、当該電気穿孔コンポーネントに連絡する。当該フィードバック機構は、測定された当該インピーダンスを受けてもよく、また、当該電気穿孔コンポーネントによって送達されたエネルギーパルスを調整して、当該定電流を維持することができる。
【0192】
複数の電極は、分散パターンでエネルギーパルスを送達し得る。複数の当該電極は、プログラムされたシーケンス下の当該電極の制御を介して、当該分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよく、そして、プログラムされたシーケンスは、使用者によって、電気穿孔コンポーネントに入力される。プログラムされた当該シーケンスは、順に送達された複数のパルスを含んでいてもよく、複数の当該パルスの各々のパルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を備えた少なくとも２つの活性電極によって送達されており、複数の当該パルスの次のパルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を備えた少なくとも２つの活性電極の異なる１つによって送達される。
【0193】
当該フィードバック機構は、ハードウェア、または、ソフトウェアのいずれかで実施し得る。当該フィードバック機構は、アナログ閉回路によって実施し得る。当該フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または、１μｓごとに起こるが、好ましくは、実時間フィードバック、または、瞬時（すなわち、応答時間を決定するための入手可能な技術によって決定した実質的な瞬時）である。当該ニュートラル電極で、所望の組織でのインピーダンスを測定してもよく、そして、そのインピーダンスをフィードバック機構に連絡し、次いで、当該フィードバック機構が同インピーダンスに応答してエネルギーパルスを調整し、及び、プリセット電流と同様の値の定電流を維持する。当該フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達期間内に定電流を連続的かつ瞬時的に維持し得る。
【0194】
本発明の組成物の送達を促進しうる電気穿孔装置及び電気穿孔法の例として、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全内容を援用する、Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉ，ｅｔ ａｌ．，の米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，が出願した米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されたものがある。当該組成物の送達を促進するために用い得るその他の電気穿孔装置及び電気穿孔法として、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全内容を援用する、２００６年１０月１７日に出願した米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号、及び、２００７年１０月１０日に出願した同第６０／９７８，９８２号に対して３５ＵＳＣ １１９（ｅ）による利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願した、同時係属中で、かつ、共有にかかる米国特許出願第１１／８７４０７２号で提供されたものがある。
【0195】
Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉ，ｅｔ ａｌ．，の米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュラー電極システム、及び、その使用が記載している。このモジュラー電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクタ、及び、電源を含み得る。使用者は、支持構造上に搭載された複数の針電極を掴み、そして、体内または植物内の選択された組織に同電極をしっかりと挿入することができる。その後、皮下注射針を介して、生体分子を選択された組織へ送達する。プログラム可能な当該定電流パルス制御器を活性化して、定電流の電気パルスを、複数の針電極に印加する。印加された当該定電流電気パルスは、複数の電極間での細胞内への生体分子の導入を促進する。本明細書の一部を構成するものとして米国特許第７，２４５，９６３号の全内容を援用する。
【0196】
Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，が出願した米国特許公開第２００５／００５２６３０号には、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために用い得る電気穿孔装置が記載されている。当該電気穿孔装置は、その操作が、ソフトウェアまたはファームウェアで指定される電気運動装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。このＥＫＤ装置は、ユーザ制御に基づく一列の電極とパルスパラメータ入力との間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、そして、電流波形データの保存と取得を可能にする。当該電気穿孔装置は、針電極、注射針用の中央注入チャネル、及び、取り外し可能なガイドディスクのアレイを有する交換可能な電極ディスクも含む。本明細書の一部を構成するものとして米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全内容を援用する。
【0197】
米国特許第７，２４５，９６３号、及び、米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載された電極アレイ及び方法は、筋肉などの組織だけでなく、その他の組織または臓器にも深く浸透させるように適合し得る。電極アレイの形態によって、注射針（選択された生体分子を送達する）が、標的臓器にも完全に挿入され、そして、電極によって、あらかじめ描かれた領域の標的組織に対して垂直に注射投与される。米国特許第７，２４５，９６３号、及び、米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載された電極は、好ましくは、長さが２０ｍｍで、２１ゲージのものである。
【0198】
加えて、電気穿孔装置、及び、その使用を組み込んだ幾つかの実施形態で予期されるように、以下の特許、１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号、２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、及び、２００５年９月６日発行の米国特許第６，９３９，８６２号に記載された電気穿孔装置が存在する。さらに、様々な装置のいずれかを用いてＤＮＡを送達することに関係している２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号、及び、ＤＮＡ注入の方法に関する２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号に開示された発明を含む特許は、本明細書において企図している。本明細書の一部を構成するものとして上記した全特許の内容を援用する。
【0199】
９．処置の方法
本明細書でさらに提供されるものは、それを必要とする対象において、疾患の処置、疾患に対する防御、及び／または、予防をする方法であり、合成抗体を当該対象内で生成する。当該方法は、当該組成物を当該対象に投与することを含むことができる。当該対象への当該組成物の投与は、上記した送達の方法を用いて行うことができる。
本明細書でさらに提供されるものは、それを必要とする対象において、疾患の処置、疾患に対する防御、及び／または、予防をする方法であり、合成抗体を当該対象内で生成する。当該方法は、当該組成物を当該対象に投与することを含むことができる。当該対象への当該組成物の投与は、上記した送達の方法を用いて行うことができる。
【0200】
特定の実施形態において、本発明は、細菌感染の処置、細菌感染に対する防御、及び／または、予防の方法を提供する。ある実施形態において、当該方法は、細菌バイオフィルムを処理し、細菌バイオフィルムに対する防御、及び／または、防止をする。ある実施形態において、当該方法は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染、または、バイオフィルム形成を処理し、それらに対する防御、及び／または、防止をする。ある実施形態において、当該方法は、創傷へのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの感染を処理し、それらに対する防御、及び／または、防止をする。
【0201】
当該対象内で合成抗体が生成されると、当該合成抗体は、当該抗原と、結合または反応することができる。かかる結合により、当該抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸による抗原の認識をブロックし、そして、当該抗原に対する免疫応答を惹起または誘発し、それにより、当該対象での抗原と関連する疾患を処理、防御、及び／または、予防することができる。
【0202】
当該組成物の用量は、１μｇ～１０ｍｇ有効成分／体重ｋｇ／時間とすることができ、及び、２０μｇ～１０ｍｇ有効成分／体重ｋｇ／時間とすることもできる。当該組成物を、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、または、３１日おきに投与することができる。効果的な処置のための組成物の投与回数を、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または、１０回とすることができる。
【0203】
１０．抗生物質との併用
本発明は、合成抗体と治療用抗生物質との組み合わせを投与することで、それを必要とする対象において、疾患の処置、疾患に対する防御、及び／または、予防をする方法も提供する。
本発明は、合成抗体と治療用抗生物質との組み合わせを投与することで、それを必要とする対象において、疾患の処置、疾患に対する防御、及び／または、予防をする方法も提供する。
【0204】
当該合成抗体、及び、抗生物質薬剤は、当該対象に当該合成抗体と抗生物質薬剤との組み合わせを対象に存在せしめる、あらゆる適切な方法を用いて投与され得る。ある実施形態において、当該方法は、詳細に先述をしたいずれかの方法で、本発明の合成抗体を含む第１の組成物を投与すること、及び、当該合成抗体の投与をして、１日未満、２日未満、３日未満、４日未満、５日未満、６日未満、７日未満、８日未満、９日未満、または、１０日未満の後に、抗生物質を含む第２の組成物を投与することを含み得る。ある実施形態において、当該方法は、詳細に先述をしたいずれかの方法で、本発明の合成抗体を含む第１の組成物を投与すること、及び、当該合成抗体の投与をして、１日が過ぎてから、２日が過ぎてから、３日が過ぎてから、４日が過ぎてから、５日が過ぎてから、６日が過ぎてから、７日が過ぎてから、８日が過ぎてから、９日が過ぎてから、または、１０日が過ぎてから後に、抗生物質を含む第２の組成物を投与することを含み得る。ある実施形態において、当該方法は、抗生物質を含む第１の組成物を投与すること、及び、詳細に先述をしたいずれかの方法で、当該抗生物質の投与をして、１日未満、２日未満、３日未満、４日未満、５日未満、６日未満、７日未満、８日未満、９日未満、または、１０日未満の後に、本発明の合成抗体を含む第２の組成物を投与することを含み得る。ある実施形態において、当該方法は、抗生物質を含む第１の組成物を投与すること、及び、詳細に先述をしたいずれかの方法で、当該抗生物質の投与をして、１日が過ぎてから、２日が過ぎてから、３日が過ぎてから、４日が過ぎてから、５日が過ぎてから、６日が過ぎてから、７日が過ぎてから、８日が過ぎてから、９日が過ぎてから、または、１０日が過ぎてから後に、本発明の合成抗体を含む第２の組成物を投与することを含み得る。ある実施形態において、当該方法は、詳細に先述をしたいずれかの方法で、本発明の合成抗体を含む第１の組成物を投与すること、及び、抗生物質剤を含む第２の組成物を同時に投与することを含み得る。ある実施形態において、当該方法は、詳細に先述をしたいずれかの方法で、本発明の合成抗体を含む第１の組成物を投与すること、及び、抗生物質剤を含む第２の組成物を同時に投与することを含み得る。ある実施形態において、当該方法は、本発明の合成抗体及び抗生物質を含む単一組成物の投与を含み得る。
【0205】
本発明の合成抗体と併用可能な抗生物質として、アミノグリコシド系（例えば、ゲンタマイシン、アミカシン、トブラマイシン）、キノロン系（例えば、シプロフロキサシン、レボフロキサシン）、セファロスポリン系（例えば、セフタジジム、セフェピム、セフピロム、セフトビプロール）、抗緑膿菌ペニシリン系、カルボキシペニシリン系（例えば、カルベニシリン、及び、チカルシリン）、及び、ウレイドペニシリン系（例えば、メズロシリン、アズロシリン、及び、ピペラシリン）、カルバペネム系（例えば、メロペネム、イミペネム、ドリペネム）、ポリミキシン系（例えば、ポリミキシンＢ、及び、コリスチン）、及び、モノバクタム系（例えば、アズトレオナム）などがあるが、これらに限定されない。
【実施例0206】
本発明は、複数の態様を有しており、その具体例を以下に示すが、これらに限定されることはない。
【0207】
１１．実施例
以下の例において、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであって、例示目的のみで記載しているものと理解すべきである。上記した説明、及び、これらの実施例から、当業者であれば、本発明に必須の特徴を確認することができ、また、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に対して様々な変更や改変を加えて、様々な用途や条件に適合させることができる。したがって、本明細書で説明した発明に加えて、本発明に対して様々な改変を加えることが当業者に自明であることは、上記した説明からも明らかである。そのような改変も、特許請求の範囲に属していることも意図をしている。
以下の例において、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであって、例示目的のみで記載しているものと理解すべきである。上記した説明、及び、これらの実施例から、当業者であれば、本発明に必須の特徴を確認することができ、また、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に対して様々な変更や改変を加えて、様々な用途や条件に適合させることができる。したがって、本明細書で説明した発明に加えて、本発明に対して様々な改変を加えることが当業者に自明であることは、上記した説明からも明らかである。そのような改変も、特許請求の範囲に属していることも意図をしている。
【0208】
例１：改変二重特異性ＤＮＡがコードしたＩｇＧ抗体（ＤＭＡｂ）は、致死量のｐｎｅｕｍｏｎｉａを接種したモデルにおけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを防御する
本明細書で示した研究は、インビボでの産生及び活性を目的とした、単一特異性抗－ＰｃｒＶ ＩｇＧ（ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ）、及び、臨床候補二重特異性抗体ＡＢＣ１２３（ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ）をコードする合成ＤＭＡｂの開発と分析を説明している。インビボでのＤＭＡｂ産生は、双方の構築物について、機能的及び防御的な力価を迅速に生み出すことを可能にする。これらのＤＭＡｂは、持続可能であり、また、主要な器官のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａコロニー形成の比較可能な予防に加えて、バイオプロセスで産生したモノクローナル抗体と同等の効力を有することができる。
本明細書で示した研究は、インビボでの産生及び活性を目的とした、単一特異性抗－ＰｃｒＶ ＩｇＧ（ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ）、及び、臨床候補二重特異性抗体ＡＢＣ１２３（ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ）をコードする合成ＤＭＡｂの開発と分析を説明している。インビボでのＤＭＡｂ産生は、双方の構築物について、機能的及び防御的な力価を迅速に生み出すことを可能にする。これらのＤＭＡｂは、持続可能であり、また、主要な器官のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａコロニー形成の比較可能な予防に加えて、バイオプロセスで産生したモノクローナル抗体と同等の効力を有することができる。
【0209】
現在の研究において、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対するモノクローナル抗体は、合成ＤＮＡベクター、ＤＭＡｂでコードされており、そして、骨格筋によってインビボで産生できる、ことを実証している。抗－Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＤＭＡｂは、治療標的に対して効果的に結合し、及び、活動的なＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株に起因する致命的肺炎のマウスモデルにおいて防御的であった。ＤＭＡｂの単回投与は、３～４ヶ月間は一過的に発現し、そして、致命的感染に対する防御は、精製したＩｇＧでマウスを治療した場合に匹敵する。このことは、当該プラスミドが最終的に喪失するまで、ＤＭＡｂを、筋肉から連続的に発現できるので、長期間のモノクローナル抗体投与において著しい進歩である。日常的な投与に加えて、抗－Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＤＭＡｂの別の予見可能な利点は、ＤＭＡｂが抗生物質計画の延長の必要性を減じ得る、慢性疾患または移植機器に関連する再発性感染症を有する高リスク患者のためになるであろう。さらに、ＤＭＡｂは、一般的に使用される抗生物質であるメロペネムと相乗的に機能することも示している。ＤＭＡｂと抗生物質との組み合わせの相乗効果は、この戦略が、抗生物質治療計画を緩和して、それにより、患者への抗生物質の曝露の期間が減少する可能性を示唆している。この付加的活性は、以前の研究（ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６， ２６２ｒａｌ５５）において、タンパク質ＩｇＧで観察されたものと同等である。まとめると、これらの結果は、全長ＩｇＧモノクローナル抗体のＤＮＡ送達が、重篤な細菌感染を予防するため、及び、おそらくは、他の治療適応症のための有望なプラットフォーム戦略であることを示唆している。すべてのバイオプロセスで産生した抗－Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｌ ＩｇＧモノクローナル抗体（抗－Ｐｓｌ、抗－ＰｃｒＶ、及び、ＡＢＣ１２３）が、多様な血清型、多型３分泌表現型（細胞毒性対浸潤性株、それぞれ、ＥｘｏＵ＋、ＥｘｏＳ－、ＥｘｏＵ－、ＥｘｏＳ＋）、及び、複数の感染部位から誘導したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ臨床分離株に対して防御的であることを示している（ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０９， １２７３－１２８７；Ｗａｒｒｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５８，４３８４－４３９１；ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６， ２６２ｒａｌ５５；Ｔｈａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１３，６４０－６４８；Ｚｅｇａｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， ＪＡＭＡ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １３４，３８３－３８９）。
【0210】
当該材料と方法についての説明をする。
【0211】
細胞株及び細菌
【0212】
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。細胞系を、マイコプラズマを含まない状態で維持した。ルーチンテストは、ペンシルベニア大学で行った。全ての細胞を、小さな継代数で維持した。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ角膜炎臨床分離株６０７７（ＰＡ ６０７７）、細胞毒性（ＥｘｏＵ＋）株を、すべての感染実験で使用した。
【0213】
ＤＭＡｂ構築と発現
【0214】
単一特異性抗－Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰｃｒＶタンパク質（クローンＶ２Ｌ２ＭＤ）（Ｗａｒｒｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５８，４３８４－４３９１）、及び、改変した二重特異性抗－ＰＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６，２６．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰｃｒＶ及びＰｓｌの二重特異性、クローンＡＢＣ１２３）（ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６，２６２ｒａ１５５）の配列を得た。ヒトＩｇＧ１重鎖、及び、Ｉｇκ軽鎖の各々のヌクレオチド配列を、マウス及びヒトの双方のバイアスについてコドンを最適化して、哺乳動物細胞における発現を増強した（Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ９４，１９７－２１０；Ｄｅｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５，１０９９１－１１００１）。これらの配列についてＲＮＡ最適化も行って、ｍＲＮＡ安定性の改善とリボソームでの効率的な翻訳とを図り（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１，４８９２－４９０３；Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２，１４９７－１５０３）、タンパク質収量の増大を目指した（Ｆａｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６、ｅｌ７５９６）。次いで、最適化した重鎖及び軽鎖遺伝子を、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター、及び、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡの制御下で、ｐＧＸ０００１ ＤＮＡ発現ベクターに挿入した。
【0215】
双方の遺伝子は、フーリン開裂部位とＰ２Ａペプチドとで分離されたｃｉｓでコードされていた。その結果は、２つのプラスミド、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡであった。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）トランスフェクション試薬を用いて、ＤＭＡｂ ＤＮＡでトランスフェクトした。細胞上清、及び、細胞溶解物を、トランスフェクションの４８時間後に回収し、そして、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び、ウエスタンブロットによって、ヒトＩｇＧ産生についてアッセイした。
【0216】
マウス筋肉組織免疫蛍光
【0217】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、１００μｇのＤＭＡｂを、ＩＭ注射で、ＴＡ筋肉に注射をし、続いて、ＩＭ－ＥＰを注射した。注射をして３日後に、組織を採取し、４％中性緩衝化ホルマリン（ＢＢＣ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｔａｔｅ）に固定し、及び、３０％（ｗ／ｖ）スクロース（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を含む脱イオン水に浸した。次いで、組織を、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，ＣＡ）に包埋し、そして、凍結をした。凍結組織ブロックを、１８μｍの厚さの切片にした。切片にした筋肉を、ブロッキング緩衝液（０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ）、２％（ｖ／ｖ）ロバ血清を含むＰＢＳ）で、３０分間、インキュベートし、パラフィンで覆った。ヤギ抗－ヒトＩｇＧ－Ｆｃ断片抗体（Ａ－８０－１０４Ａ，Ｂｅｔｈｙｌ，Ｔｅｘａｓ）を、インキュベート用緩衝液（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、２％（ｖ／ｖ）ロバ血清、０．３％（ｖ／ｖ）トリトン－Ｘ（Ｓｉｇｍａ）、及び、０．０２５％（ｖ／ｖ）１ｇ／ｍｌアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ）で、１：１００に希釈した。５０μｌの染色溶液を、各切片に添加し、そして、２時間、インキュベートした。切片を、１×ＰＢＳで、５分間、３回、洗浄した。ロバ抗－ヤギＩｇＧ ＡＦ４８８（ａｂｌ５０１２９、Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）を、インキュベート用緩衝液で、１：２００に希釈し、そして、５０μｌを、各切片に添加した。切片を、１時間のインキュベートした後に洗浄し、次いで、ＤＡＰＩ－フルオロマウント（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，ＡＬ）を用いて封入し、そして、カバーをした。
【0218】
ＤＭＡｂ構築物のインビボでの発現を、Ｒｅｔｉｇａ３０００単色カメラ（Ｑｌｍａｇｉｎｇ）を備えたＢＸ５１蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で画像化した。
【0219】
ＥＬＩＳＡ及び抗細胞毒性活性によるヒトＩｇＧの定量
【0220】
９６ウェルの高結合性免疫吸着プレートを、１０μｇ／ｍＬの精製抗－ヒトＩｇＧ－Ｆｃでコーティングし、及び、４℃で、一晩、インキュベートした。翌日、プレートを洗浄し、及び、１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳで、室温で、少なくとも１時間、ブロックをした。試料を連続的に２倍に希釈し、そして、ブロックした当該プレートに移し、次いで、室温で、１時間、インキュベートした。精製ヒトＩｇＧκを、標準として使用した。インキュベートの後に、１：２００００の希釈で、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗－ヒトＩｇＧκ抗体を用いて、試料をプローブした。ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩基質を用いてプレートを発色させ、そして、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止した。ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダーを用いて、ＯＤ４５０ｎｍで、プレートを読み取った。あるいは、Ｖ２Ｌ２ＭＤまたはＡＢＣ１２３に特異的な抗－イディオタイプモノクローナル抗体（０．２Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．４に懸濁した０．０５μｇ／ウェル）を捕捉試薬として使用すること以外は、上記したように、血清からヒトＩｇＧを定量した。精製したＶ２Ｌ２ＭＤまたはＡＢＣ１２３を、標準として使用した。
【0221】
また、３８４ウェルのブラックＭａｘｉＳｏｒｐプレート（１０μｇ／ｍＬヤギ抗－ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）でコーティングしたもの）を用いて、血清のＤＭＡｂも定量した。プレートを洗浄し、そして、ブロッカーカゼインを含むＰＢＳを用いて、室温で、１～２時間ブロックした。ブロッキングをした後に、ＡＢＣ１２３またはＶ２Ｌ２ＭＤを含有する標準液を、プレートで、１：２で連続希釈し、一方で、血清試料を、１：２０、１：４０、１：８０、及び、１：１６０に希釈した。次いで、当該試料を含むプレートを、室温で、１時間、インキュベートした。洗浄した後に、プレートを、１：４０００の希釈で、ロバ抗－ヒトＩｇＧ－ＨＲＰを用いてプローブし、次いで、室温で、１時間、インキュベートした。洗浄した後に、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｒｅａｇｅｎｔを添加して、当該免疫反応を発色させ、及び、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎで蛍光を読み取った。
【0222】
また、ＰＡ６０７７の細胞毒性効果からＡ５４９細胞の保護を測定する、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡによって媒介される抗－細胞毒性活性に基づいて、血清からＤＭＡｂも定量した。マウス血清の当該活性を、Ｖ２Ｌ２ＭＤ ＩｇＧでスパイクしたナイーブマウス血清の標準曲線と比較した。
【0223】
結合ＥＬＩＳＡ
【0224】
９６ウェルプレート免疫吸着プレートを、０．５μｇ／ｍＬのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＰｃｒＶタンパク質で、一晩、コーティングした。翌日、ＤＭＡｂを投与した動物由来の血清試料を連続的に２倍に希釈し、次いで、ブロックをした当該プレートに移した。ＨＲＰに結合した抗－ヒトＩｇＧ Ｈ＋Ｌ抗体を用いて、１：５０００の希釈で、試料をプローブし、そして、ＯＰＤ基質で発色させた。
【0225】
ウエスタンブロット
【0226】
ＤＭＡｂでトランスフェクトした細胞由来の当該細胞溶解物を、細胞溶解緩衝液で回収した。試料を、２０，０００ｒｐｍで遠心分離し、そして、タンパク質画分を含む当該上清を回収した。これらの試料を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを用いて定量し、そして、１０μｇの全溶解物を、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに充填した。当該ゲルを、ｉＢｌｏｔ２システムを用いて、ニトロセルロースメンブレンに移した。このメンブレンを、５％粉末スキムミルク＋０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０でブロックをし、そして、ＨＲＰに接合したロバ抗－ヒトＨ＋Ｌ抗体を用いてプローブした。バンドを、化学発光システムを用いて発色させ、そして、フィルムに可視化した。
【0227】
マウス
【0228】
メスの６～８週齢のＢ６．Ｃｇ－ＦｏｘｎｌｎｕＪ、及び、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）から購入し、そして、ペンシルベニア大学、または、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ， ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａの動物施設に収容した。すべての動物プロトコルは、ＡＬＡＡＣのガイドラインに従っており、ペンシルベニア大学当局、及び、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ ＩＡＣＵＣ委員会の承認を受けた。さらに、Ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆｆｉｃｅ（ＡＣＵＲＯ）によって、ＩＡＣＵＣの監督が行われた。動物たちに対して、ＴＡまたは四重筋に、１００μｇ～３００μｇのＤＭＡｂ－αＰｃｒＶまたはＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡのＩＭ注射を行う３０分～１時間前に、ヒアルロニダーゼ（４００Ｕ／ｍｌ， Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の筋肉内（ＩＭ）予備注射を行い、続いて、電気穿孔ＩＭ－ＥＰをした。投与の後に、ＤＭＡｂの血清レベルをモニターした。
【0229】
致命的肺炎接種
【0230】
接種前の－５日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８／群）に対して、ＩＭ－ＥＰによって、１００μｇまたは３００μｇのＤＭＡｂ－αＰｃｒＶまたはＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡを投与した。無関係のデング熱ウイルスＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３２０を、コントロールとして含めた。第４群の動物に対して、接種前の－１日目に、精製タンパク質ＩｇＧ ＡＢＣ１２３（２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ＩＰ）に注射した。０日目に、動物たちに対して、悪性抗菌耐性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株６０７７の９．７５ｅ５－１．０ｅ６コロニー形成単位（ＣＦＵ）を鼻腔内に接種をした。１６に記載したように、生存に関して、鼻腔内接種の後、６日間、動物たちをモニターした。すなわち、動物たちを、ケタミン及びキシラジンで麻酔し、続いて、０．０５ｍｌの細菌接種物を鼻腔内に投与した。臓器負荷分析については、感染の２４時間後に、ＤＭＡｂで処置した動物から、肺、脾臓、及び、肝臓を摘出し、続いて、細菌ＣＦＵの計数のために、Ｌｕｒｉａ寒天プレートの均質化処理とプレーティングを行った。ＩＬ－１β、ＩＬ－６、及び、ＫＣ／ＧＲＯを、製造業者の指示に従って、マルチプレックスキット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、肺ホモジネートの上清で定量をした。ＤＭＡｂとメロペネム（ＭＥＭ）との併用実験については、感染の４時間後にＭＥＭを皮下投与した。
【0231】
組織病理
【0232】
感染４８時間後に肺を摘出し、そして、短くとも４８時間、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。次いで、固定組織を常法で処理し、そして、パラフィンに包埋し、厚さ３μｍの切片にし、次に、実験条件に対して盲検された病理学者による組織学的評価のために、Ｇｉｌｌのヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【0233】
統計
【0234】
すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェア、または、ＳＰＳＳを用いて行った。２つの独立した割合に対する試料の大きさの計算は、アルファ０．０５、及び、パワー０．９０で計算した。適切なパワーを確保するために、少なくともｎ＝５のマウスが必要であると計算された。必要に応じて、スチューデントのＴ検定、または、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の計算を行った。生存データをＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒの生存曲線で表し、そして、多重比較のための補正が入った対数ランク検定、及び、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、有意性を計算した。ｐ＜０．０５の場合、データは有意であるとみなした。すべてのグラフ内の線は平均値を表し、そして、誤差棒は標準偏差を表す。試料または動物は、分析から除外しなかった。動物実験では無作為化をしなかった。試料及び動物は、各実験を行う前に盲検化しなかった。
【0235】
実験の結果を、以下に説明する。
【0236】
抗－Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＤＮＡ送達モノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）のデザイン、及び、インビトロ発現
【0237】
至適発現のためにＤＮＡ発現ベクター系に改めてコードされる２つの抗－Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａモノクローナル抗体遺伝子は、前述した、致命的Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染に対する強力なインビボでの保護活性に基づいている。当該ヒト免疫グロブリンγ１（ＩｇＧ１）重鎖配列、及び、軽鎖配列（Ｆａｂ及びＦｃ部分）は、ヒト及びマウスのコドンバイアスの両方を考慮して最適化したヌクレオチド、及び、アミノ酸配列であり、そして、ｐＧＸ０００１ ＤＮＡプラスミド主鎖での単一のポリシストロニック単位としてコードされており、その結果、２つの構築物、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡをもたらした（図１Ａ）。当該重鎖及び軽鎖は、単一のｍＲＮＡ転写物として発現され、次いで、ブタのテッショウウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）開裂部位で翻訳後に開裂する。インビボでの最終産物である抗体からＰ２Ａを完全に除去するために、フーリン開裂部位（ＲＧＲＫＲＲＳ；配列番号２３）も含まれていた。
【0238】
全長ヒトＩｇＧ１抗体を発現する各構築物の能力を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のインビトロでのトランスフェクションの後に評価した。４８時間後に、ＤＭＡｂでトランスフェクトした細胞、及び、上清を回収し、そして、全ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを、細胞溶解物、及び、培地で行い、それにより、ＤＭＡｂ ＩｇＧの産生、及び、分泌を確認した（図１Ｂ、パネルｉ及びｉｉ）。ウエスタンブロットを行って、抗体重鎖、及び、軽鎖の両方を発現していることを確認した。二重特異性ＤＭＡｂの重鎖は、２つの可変領域特異性をコードするので、大きな分子量で認められる（図１Ｃ）。ｐＧＸ０００１ ＤＮＡベクターを、陰性コントロールとして使い、及び、精製した抗－ＰｃｒＶ ＩｇＧ１を陽性コントロールとして使った。
【0239】
抗－Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡのマウスでの発現
【0240】
インビトロでの発現を確認した後に、ＤＮＡ送達したＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡのマウスでの発現を調べた。マウス筋肉におけるＤＭＡｂ発現を確認するために、抗－Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ（１００μｇ）、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ（１００μｇ）、コントロールのＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３（１００μｇ）、または、コントロールのｐＧＸ０００１空ベクター（１００μｇ）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、前脛骨筋（ＴＡ）へ筋内注射（ＩＭ）をして投与を行い、続いて、筋肉内電気穿孔（ＩＭ－ＥＰ）を行った。注射の３日後に筋肉組織を採取し、そして、切片を、ヤギ抗－ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体でプローブし、続いて、ＡＦ４８８に接合したロバ抗－ヤギＩｇＧで検出した（図２）。インビボでの発現を確認した後に、さらなる実験を行って、全身循環におけるＤＭＡｂレベルをアッセイした。ヒトＩｇＧ１は、マウス免疫系によって非自己として認識されるので、免疫正常マウスにおいて抗－抗体応答を誘導する。したがって、Ｔ細胞を有しておらず、かつ、非機能性Ｂ細胞を有している免疫正常Ｂ６．Ｃｇ－Ｆｏｘｎｌｎｕ／Ｊ無胸腺マウス（ヌード）で発現を評価した。抗－Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ（１００μｇ）、または、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ（１００μｇ）を、ヌードマウス（ｎ＝５／群）のＴＡまたは大腿四頭筋（ｑｕａｄ）にＩＭ投与し、続いて、ＩＭ－ＥＰを行った。血清を回収して、循環においてヒトＩｇＧ１発現を長期間モニターした。投与後の１００～１２０日間にわたって、双方のＤＭＡｂの発現が観察されたことは、これらの新規なＤＮＡ送達モノクローナル抗体が、全身循環において検出可能な有意な量で骨髄筋において産生され、数週間にわたって発現が続くという仮説を支持している（図３Ａ及び図３Ｄ）。
【0241】
次に、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染のモデルとして一般的に使用されている免疫正常ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＤＭＡｂ発現を評価した。マウス（ｎ＝１０／群）に対して、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶまたはＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡの１００μｇ及び３００μｇ用量（３つの注入箇所×１００μｇ）を、ＩＭ－ＥＰで投与した。注射をして７日後に、ピークのＤＭＡｂ発現レベルが出現し、それらは、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡについて、１００μｇ用量では、それぞれ、７．１～１７．１μｇ／ｍｌ、及び、２．９～７．２μｇ／ｍｌであり、３００μｇ用量では、それぞれ、３１．２～４９．７μｇ／ｍＬ、及び、３．２～１２．７μｇ／ｍＬであった（図３Ｂ及び図３Ｅ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるヒトＩｇＧ１ ＤＭＡｂ発現は、１４日目までに、マウス免疫系によって排除された（図４Ａ及び図４Ｂ）。比較のために、マウスＩｇＧ２ａ ＤＭＡｂもデザインした。このことは、免疫正常ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける１００日超の長期発現を実証しており、免疫系による排除を受けることなく、ＤＭＡｂの長期発現を実証する（図４Ｃ）。ＤＭＡｂの標的抗原特異性を確認するために、７日後に投与した血清もＥＬＩＳＡで組換えＰｃｒＶタンパク質への結合に関するアッセイと確認も行った（図３Ｃ及び図３Ｆ）。
【0242】
致命的肺炎モデルにおけるＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡの評価
【0243】
インビトロ及びインビボでの発現の研究は、ＤＭＡｂが、組換えＰｃｒＶタンパク質に結合する完全なヒトＩｇＧ１抗体を形成することを示した。インビボでＤＮＡ送達したＤＭＡｂの機能的活性に対処するために、致命的なマウス肺炎モデルを用いて、高病原性で、かつ、高細胞毒性のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株６０７７（ＰＡ６０７７）に対する防御を評価した。ＰＡ６０７７を接種する５日前に、マウスに対して、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ（３００μｇ）、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ（３００μｇ）、または、デングウイルスを標的とする無関係なコントロールのＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３（３００μｇ）を注射した（Ｆｌｉｎｇａｉｅｔ ａｌ， ２０１５， Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５， １２６１６）。接種をする１日前に、マウスに対して、タンパク質ＡＢＣ１２３ ＩｇＧ（２ｍｇ／ｋｇ）を投与する、陽性コントロール群も使用した。ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡで処置した動物から無作為に選択した動物を安楽死させて、接種時の血清でのＤＭＡｂ発現レベルをモニターし、ならびに、発現したＤＭＡｂの効力を評価した。図５Ａに示したように、単一特異性ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、二重特異性ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡの双方は、血清から全ヒトＩｇＧを定量する場合に、それぞれ、約１６、及び、８μｇ／ｍｌの中央値力価を示した。インビボで発現したＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡの効力を、血清での抗－細胞毒性活性に基づいて、抗体発現を定量することで評価した。定量化方法に差異は認められず、このことは、インビボで発現された単一特異性、及び、二重特異性ＤＭＡｂ－ＩｇＧが、バイオプロセスで生成したＩｇＧと比較して、完全に機能的であり、かつ、同等の活性を有することを示している（図５Ａ）。次いで、各群での残余の動物に対して、致死量のＰ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを鼻腔内に接種して感染させた後の６日間（１４４時間）の生存をモニターした。コントロールのＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３を与えた動物は、２４～５５時間以内に死亡した。これとは対照的に、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶまたはＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡのいずれかを与えられた約９４％の動物（１５／１６）は、接種をしても生存していた（図５Ｂ、ＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３と比較してｐ＜０．０００１）。予想した通りに、ＡＢＣ１２３ ＩｇＧ（２ｍｇ／ｋｇ）を投与した陽性コントロールの動物は、すべてが、接種を受けても生存していた。加えて、１００μｇ（１箇所×１００μｇ）、２００μｇ（２箇所×１００μｇ）、または、３００μｇ（３箇所×１００μｇ）のＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡを用いた処置を受け、次いで、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを感染させたマウスは、濃度依存的な生存を示した（図５Ｃ）。これらの結果は、これらの動物の血清で発現したＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡの定量と一致しており、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡの血清タンパク質濃度は、電気穿孔を受けたＤＮＡの量の減少に伴って減る（図５Ｄ）。
【0244】
抗－Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＤＭＡｂが、肺の細菌負荷を減らし、そして、全身の細菌の播種を防止する能力について分析をした。Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを接種して２４時間の後に、肺、脾臓、及び、腎臓をアッセイし、続いて、各組織におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量を行った。ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡで処置した場合では、ＣＦＵ、肺での負荷については有意な減少が認められたが、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶで処置した動物では認められなかった（図６Ａ）。重要なことに、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡで処置した動物の肺における細菌負荷は、タンパク質ＡＢＣ１２３ ＩｇＧで処置したマウスで認められた肺での負荷と類似しており、また、双方の抗－ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＤＭＡｂは、コントロールのＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３と比較して、脾臓及び腎臓への細菌播種を抑制した（図６Ａ）。加えて、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ、及び、ＡＢＣ１２３ ＩｇＧは、コントロールのＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３で処置したマウスと比較して、感染動物の肺水腫の予防に対して有効であることが、肺重量を測定して明らかとなった（図６Ｂ）。これらの結果と一致して、炎症性サイトカインＩＬ－１β、及び、ＩＬ－６、ならびに、ケモカインＫＣ／ＧＲＯ（図６Ｃ）もまた、コントロールのＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３と比較して、抗－Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＤＭＡｂで処置したマウス、及び、タンパク質ＩｇＧで処置したマウスにおいて減少していた。非感染動物とＰＡ６０７７を接種して２４時間後の感染動物との間で、血清ＩｇＧレベルを比較した（図６Ｄ）。まとめると、このデータは、ＤＮＡ送達モノクローナル抗体が、骨格筋においてインビボで産生されており、そして、保護活性を媒介し、また、外因的に産生したＩｇＧ モノクローナル抗体と同様の効力を示すことを示唆している。
【0245】
接種後の肺組織病理
【0246】
感染の４８時間後に採取した肺組織の病理は、ＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３で処置した動物での顕著な肺胞炎を実証しており、同組織は、出血及び肺胞壊死の領域に加えて、肺胞及び脈管周囲空間内への好中球及びマクロファージの浸潤を有していた。これとは対照的に、上記した肺上清由来の炎症性サイトカイン及びケモカインの減少とも符合して、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡで処置した動物において、主に好中球と少なめのマクロファージとの緩やかな集団による炎症は顕著に減少しており、これは、ＤＭＡｂ－αＰｃｒＶ及びコントロールのＡＢＣ１２３ ＩｇＧ群におけるのと同様の変化であった（図７）。
【0247】
抗生物質とＤＭＡｂとの併用
【0248】
グラム陰性またはＰ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染が疑われる場合には、メロペネム（ＭＥＭ）などの広域カルバペネム系抗生物質を投与する。さらに、コリスチンなどの最終手段的な抗生物質投与計画は、ヒトでの高毒性と関連しており（Ｆａｌａｇａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００５， ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ５，１；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ， ２０１０， Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ３０，１２７９－１２９１）、また、それらの細菌が、さらなる抗菌抵抗性を獲得する可能性がある（Ｈｉｒｓｃｈ ａｎｄ Ｔａｍ，２０１０，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｒｅｓ １０，４４１－４５１；Ｌｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２２，５８２－６１０；Ｂｒｅｉｄｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９，４１９－４２６）。したがって、これらのリスクを低減するための代替的かつ補助的な戦略が、非常に有利である。ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡ処置の考え得る適用を、ＭＥＭと組み合わせて評価した。これらの実験では、必要量以下の用量のＭＥＭ（２．３ｍｇ／ｋｇ）を用いて、抵抗性細菌に感染した患者において遭遇する不適切な薬物暴露、及び、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡの必要量以下の用量（１００μｇ、図５Ｃで同定した）をシミュレーションした。これらの必要量以下の用量を組み合わせると、ＤＭＡｂ－ＢｉＳＰＡのみを投与した動物での１０％と比較して、６７％の生存期間が得られた（ｐ＝０．０２６、図８）。ＭＥＭのみ、または、ＤＭＡｂ－ＤＶＳＦ３を投与したコントロールのマウスは、致命的接種をすると死亡した。ここまでをまとめると、このことは、ＤＭＡｂ処置の適用を、独立した処置として、あるいは、既存の抗生物質投与計画との組み合わせのいずれかにまで拡大する。さらに、このデータは、ＤＭＡｂ投与が、精製ＩｇＧモノクローナル抗体と同様に機能し、そして、標準の抗生物質処置計画と組み合わせた場合に、強化された保護活性を媒介できるという仮説を支持する。
【0249】
モノクローナル抗体改変技術の分野は、ダイナミックに進化を遂げており、また、ＤＭＡｂ送達は、インビボで迅速に生物学的に機能的なモノクローナル抗体を輸送するのに役立つさらなる戦略を提供する。臨床上の明白な利点に加えて、本明細書に記載の非伝統的な二重特異性モノクローナル抗体アイソフォームのインビボでの発現は、タンパク質生産工場として関与する筋肉の多様性を際立たせる。重要なことに、ＤＭＡｂ発現は一過性であり、その他の治療的送達と同様の有効性を有する。ＤＮＡプラスミドが必要でなくなったときに、それを除去する誘導可能なシステムを開発することが可能であり得る。あるいは、ＤＭＡｂ ＤＮＡは、関連する抗－ベクター応答がないので、潜在的に無期限に再投与することができ、反復投与による長期間の治療が可能となる（Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １８， １５６８－１５７６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ２０１３， Ｖａｃｃｉｎｅｓ １， ２２５－２４９；Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ １８７、９１～９６）。ＤＭＡｂ送達は、モノクローナル抗体療法、及び、ＤＮＡ送達技術のためだけでなく、宿主免疫を増強するための新規の病原体特異的処置法のための重要な進歩を表す。
【0250】
最近、ヒト乳癌腫のマウスモデルにおいて、Ｈｅｒ２を標的とするＤＮＡでコードした抗体の送達が報告されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２３，３４１－３４７）。この研究は、タンパク質ＩｇＧに匹敵する抗腫瘍効果を示し、さらに、遺伝子でコードされたモノクローナル抗体が機能性を有することができるという概念を支持している。これは、細菌標的に対する防御であり、かつ、改変されたＩｇＧアイソフォームの最初の送達である、ＤＮＡでコードしたモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）送達の最初の実証である。ＤＮＡプラスミドでコードした抗体を用いた初期の研究は実現可能性を実証はしたが、血清では低ＩｇＧ発現を示した（Ｔｊｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９，３２８－３３６；Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００４， Ｇｅｎｅｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｔｈｅｒ ２，２）。ウイルス感染を標的とするＤＭＡｂの防御効力は以前に研究されており、チクングニア感染（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６， Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１４，３６９－３７８）、及び、デングウイルス（ＤＥＮＶ）感染（Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．，２００５， Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，１２６１６）に対する迅速な防御を示している。ＤＥＮＶを標的とするＤＭＡｂもまた、疾患の抗体依存的増強を促さなかった。これら２つの感染症モデルは、高血清ＩｇＧレベルを必要としなかったが、単一のＤＭＡｂを投与した後に対象を拡大するためにも、発現レベルを増加させる最適化したＤＭＡｂ製剤が望ましい。この目的のために、血清ＤＭＡｂ発現レベルを、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対して使用するために最適化した（図９）。この例では、製剤計画にヒアルロニダーゼを採用しているので、処置を受けた筋肉でのＩｇＧ発現を大きくすることができる。
【0251】
ヒトへの翻訳についてはさらなる研究が必要であるが、ＤＭＡｂは、モノクローナル抗体の日常的な送達を可能にするためのステップであり、世界中の多様なコミュニティへの利用可能性を改善し得る。大型動物やヒトでの用量翻訳は、将来の研究、特に、ＤＭＡｂを投与している最中にＤＮＡ用量制限の理解に取り組む上で重要である。これには、異なる送達、及び、製剤の最適化を調べて、インビボでのＤＮＡ発現を増強することを含む。ある戦略は、その他の細胞外マトリックス酵素を用いて、筋肉細胞へのＤＮＡ取り込みを促すものであり得る３７。非ヒト霊長類におけるさらなる研究は、ＤＮＡ投薬量の閾値、及び、薬物動態学的レベルへの影響を理解する上で役立つかもしれない。さらなる研究では、筋肉で産生されたヒトＩｇＧ ＤＭＡｂのグリコシル化パターンを評価しており、バイオプロセスで産生したタンパク質ＩｇＧと比較することは有益であろうが、現在の研究に照らして、ＤＭＡｂとそのタンパク質ＩｇＧ対応物との間に機能性に差異はなかった。
【0252】
結論として、本明細書に記載の例は、ＡＭＲ感染、特に、数多くの広域抗生物質投与計画に対して難治性であるＥＳＫＡＰＥ病原体の処置について、非常に重要であり得る。ＤＭＡｂは用途が広く、かつ、複数の抗原性標的に対する単一特異性ＩｇＧを送達することができ、また、新規の二重特異性ＩｇＧをコードすることができる。ＤＭＡｂの単回用量によって産生される持続的な血清モノクローナル抗体トラフレベルは、インビボでバイオプロセス製造されたタンパク質ＩｇＧが奏する機能性レベルと保護レベルとに一致する。このプラットフォームの急速な発達、及び、筋肉からの一時的な発現の延長は、タンパク質ＩｇＧモノクローナル抗体投与計画と比較して、低頻度でのモノクローナル抗体の投与を可能にすることができるので、好ましい。さらに、ＤＭＡｂは、温度安定性であるので、輸送、長期保存、及び、広範な集団への投与を可能にする。ヒトにおけるＤＮＡ送達の安全性プロファイルと組み合わせた数々の魅力的な特徴は、感染症、及び、その他の潜在的な治療標的を標的とする病原体特異的手法として、大型動物モデルにおける、ＤＭＡｂのさらなる研究を支援する。
【0253】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0254】
上記した詳細な説明、及び、関連する実施例は、単なる例示でしかなく、そして、添付した特許請求の範囲、及び、それらの等価範囲のみをもってして定義される本発明の範囲が、それらによって、限定的に解釈されることはない、ことが理解されよう。
【0255】
開示した実施形態に対する様々な変更や修正は、当業者にとって明白のことであろう。そのような変更や修正は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに実施し得るものであり、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または、使用方法に関するものなどがあるが、これらに限定されない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-02-13
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本願明細書に記載される発明。
【外国語明細書】