特開 2023-58509 ＰＣＳＫ９遺伝子の認識配列に特異的な操作されたメガヌクレアーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023058509

(43)【公開日】2023-04-25

(54)【発明の名称】ＰＣＳＫ９遺伝子の認識配列に特異的な操作されたメガヌクレアーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/22 20060101AFI20230418BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20230418BHJP

【ＦＩ】

C12N9/22

C12N15/55 ZNA

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023005733

(22)【出願日】2023-01-18

(62)【分割の表示】P 2022145178の分割

【原出願日】2018-04-20

(31)【優先権主張番号】62/516,966

(32)【優先日】2017-06-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/488,403

(32)【優先日】2017-04-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】508117721

【氏名又は名称】プレシジョン バイオサイエンシズ，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】バートサビチ，ビクター

(72)【発明者】

【氏名】ジャンツ，デレック

(72)【発明者】

【氏名】スミス，ジェームス，ジェファーソン

(72)【発明者】

【氏名】ラペ，ジャネル

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ヒトＰＣＳＫ９遺伝子内の認識配列を認識し切断する操作されたメガヌクレアーゼを提供する。
【解決手段】第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは、認識配列の第１の認識ハーフサイトに結合し、第１のサブユニットは、（ａ）特定の配列を有するアミノ酸配列と、（ｂ）第１の超可変（ＨＶＲ１）領域とを含み、第２のサブユニットは、認識配列の第２の認識ハーフサイトに結合し、第２のサブユニットは、（ｉ）特定の配列を有するアミノ酸配列と、（ｉｉ）第２の超可変（ＨＶＲ２）領域とを含む、特定の配列を含む認識配列を認識し切断する操作されたメガヌクレアーゼである。本発明は、医薬組成物において、及びコレステロール関連障害の症状を治療又は低減する方法において、そのような操作されたメガヌクレアーゼを使用する方法を包含する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、
前記第１のサブユニットは、前記認識配列の第１の認識ハーフサイトに結合し、前記第
１のサブユニットは、
（ａ）配列番号６～１４のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０％の配
列同一性を有するアミノ酸配列と、
（ｂ）第１の超可変（ＨＶＲ１）領域と
を含み、
前記第２のサブユニットは、前記認識配列の第２の認識ハーフサイトに結合し、前記第
２のサブユニットは、
（ｉ）配列番号６～１４のいずれか１つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％
の配列同一性を有するアミノ酸配列と、
（ｉｉ）第２の超可変（ＨＶＲ２）領域と
を含む、配列番号４を含む認識配列を認識し切断する操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項2】

前記ＨＶＲ１領域は、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２４～７９に対応するア
ミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項
１に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項3】

前記ＨＶＲ１領域は、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０
、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する
残基を含む、請求項１又は２に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項4】

前記ＨＶＲ１領域は、配列番号８の残基４８、５０、７１、及び７３に対応する残基を
更に含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項5】

前記ＨＶＲ１領域は、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２４～７９を含む、請求
項１～４のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項6】

前記ＨＶＲ２領域は、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応す
るアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請
求項１～５のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項7】

前記ＨＶＲ２領域は、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９
、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１
、２６６、及び２６８に対応する残基を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の操作
されたメガヌクレアーゼ。

【請求項8】

前記ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２５８に対応する残基を更に含む、請求項６
又は７に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項9】

前記ＨＶＲ２領域は、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む、
請求項１～８のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項10】

前記第１のサブユニットは、配列番号６～１４のいずれか１つの残基８０に対応する残
基を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項11】

前記第２のサブユニットは、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２７１に対応する
残基を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項12】

前記第１のサブユニットは、配列番号６～１４のいずれか１つの残基７～１５３を含む
、請求項１～１１のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項13】

前記第２のサブユニットは、配列番号６～１４のいずれか１つの残基１９８～３４４を
含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項14】

前記操作されたメガヌクレアーゼはリンカーを含み、前記リンカーは前記第１のサブユ
ニットと前記第２のサブユニットを共有結合する、請求項１～１３のいずれか１項に記載
の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項15】

前記操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６～１４のいずれか１つのアミノ酸配列
を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする
核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項17】

前記ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項18】

前記ｍＲＮＡは、請求項１～１５のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレア
ーゼ及び少なくとも１つの更なるポリペプチドをコードする多シストロン性ｍＲＮＡであ
る、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項19】

請求項１～１５のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする
核酸配列を含む、組換えＤＮＡ構築物。

【請求項20】

前記組換えＤＮＡ構築物は、プロモーターと、請求項１～１５のいずれか１項に記載の
前記操作されたメガヌクレアーゼ及び少なくとも１つの更なるポリペプチドをコードする
多シストロン性核酸配列とを含むカセットを含み、前記プロモーターは、前記多シストロ
ン性核酸配列の発現を駆動し、標的細胞に多シストロン性ｍＲＮＡを産生する、請求項１
９に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項21】

前記組換えＤＮＡ構築物は、請求項１～１５のいずれか１項に記載の前記操作されたメ
ガヌクレアーゼをコードする前記核酸配列を含むウイルスベクターをコードする、請求項
１９に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項22】

前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチ
ウイルスベクター、又は組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２
１に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項23】

前記ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである、請求項２１又は２２に記載の組
換えＤＮＡ構築物。

【請求項24】

請求項１～１５のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする
核酸配列を含むウイルスベクター。

【請求項25】

前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチ
ウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである、請求項２４に記載のウイルスベクター。

【請求項26】

前記ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである、請求項２４又は２５に記載のウ
イルスベクター。

【請求項27】

前記ウイルスベクターは、プロモーターと、請求項１～１５のいずれか１項に記載の前
記操作されたメガヌクレアーゼ及び少なくとも１つの更なるポリペプチドをコードする多
シストロン性核酸配列とを含むカセットを含み、前記プロモーターは、前記多シストロン
性核酸配列の発現を駆動し、標的細胞に多シストロン性ｍＲＮＡを産生する、請求項２４
～２６のいずれか１項に記載のウイルスベクター。

【請求項28】

薬学的に許容される担体と、
（ａ）請求項１～１５のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコー
ドする核酸、または
（ｂ）請求項１～１５のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼと
を含む医薬組成物。

【請求項29】

前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸は、請求項１７又は１８に記載
の前記ｍＲＮＡである、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項30】

前記医薬組成物は、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の前記組換えＤＮＡ構築物
を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項31】

前記医薬組成物は、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の前記ウイルスベクターを
含む、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項32】

前記医薬組成物は、請求項１～１５のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレ
アーゼを含む、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項33】

前記医薬組成物は、脂質ナノ粒子内にカプセル化された請求項１７又は１８に記載の前
記ｍＲＮＡを含む、請求項２８又は２９に記載の医薬組成物。

【請求項34】

被験体のＰＣＳＫ９の発現を減少させる方法であって、前記方法は、前記被験体の標的
細胞に、
（ａ）有効量の請求項１～１５のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアー
ゼをコードする核酸であって、前記操作されたメガヌクレアーゼは前記標的細胞で発現さ
れる、核酸、又は
（ｂ）有効量の請求項１～１５のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアー
ゼ
を送達することを含み、前記操作されたメガヌクレアーゼは、前記標的細胞の配列番号４
を含む認識配列を認識し切断し、対照細胞と比較してＰＣＳＫ９の発現を減少させる、方
法。

【請求項35】

前記被験体は、高コレステロール血症を有する、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記被験体は、家族性高コレステロール血症を有する、請求項３４又は３５に記載の方
法。

【請求項37】

前記被験体は、常染色体優性家族性高コレステロール血症を有する、請求項３４～３６
のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記方法は、請求項２８～３３のいずれか１項に記載の前記医薬組成物を前記被験体に
投与することを含む、請求項３４～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記医薬組成物は、請求項２６に記載の前記組換えＡＡＶベクターを含む、請求項３８
に記載の方法。

【請求項40】

前記医薬組成物は、脂質ナノ粒子内にカプセル化された請求項１７又は１８に記載の前
記ｍＲＮＡを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

前記標的細胞は肝細胞である、請求項３４～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記肝細胞は肝実質細胞である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記被験体は、ヒト又は非ヒト霊長類である、請求項３４～４２のいずれか１項に記載
の方法。

【請求項44】

前記細胞表面上におけるＬＤＬ受容体のディスプレイは、ベースラインＬＤＬ受容体レ
ベルと比較した場合、肝細胞において増加する、請求項３４～４３のいずれか１項に記載
の方法。

【請求項45】

肝細胞の前記細胞表面上のＬＤＬ受容体の前記ディスプレイは、前記肝細胞の前記ベー
スラインＬＤＬ受容体レベルと比較した場合、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０
％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は最高１００％増加
する、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

血清総コレステロールレベルは、ＰＣＳＫ９の発現減少後、前記被験体において減少す
る、請求項３４～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

血清総コレステロールレベルは、前記ベースライン血清総コレステロールレベルと比較
した場合、
（ａ）少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％
、８０％、９０％、９５％、若しくは最高１００％、又は
（ｂ）５～１５ｍｇ／ｄＬ、１０～２０ｍｇ／ｄＬ、１０～３０ｍｇ／ｄＬ、１５～３
０ｍｇ／ｄＬ、２０～３０ｍｇ／ｄＬ、２５～３５ｍｇ／ｄＬ、２５～４０ｍｇ／ｄＬ、
２５～５０ｍｇ／ｄＬ、４０～６０ｍｇ／ｄＬ、５０～７０ｍｇ／ｄＬ、６０～８０ｍｇ
／ｄＬ、若しくは７０～１００ｍｇ／ｄＬ減少する、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

血清ＬＤＬコレステロールレベルは、治療後、前記被験体において減少する、請求項３
４～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

血清ＬＤＬコレステロールレベルは、前記ベースライン血清ＬＤＬコレステロールレベ
ルと比較した場合、
（ａ）少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％
、８０％、９０％、９５％、若しくは最高１００％、又は
（ｂ）５～１５ｍｇ／ｄＬ、１０～２０ｍｇ／ｄＬ、１０～３０ｍｇ／ｄＬ、１５～３
０ｍｇ／ｄＬ、２０～３０ｍｇ／ｄＬ、２５～３５ｍｇ／ｄＬ、２５～４０ｍｇ／ｄＬ、
２５～５０ｍｇ／ｄＬ、４０～６０ｍｇ／ｄＬ、５０～７０ｍｇ／ｄＬ、若しくは６０～
８０ｍｇ／ｄＬ減少する、請求項４８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分子生物学及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は、ＰＣＳＫ
９遺伝子内の認識配列に対して特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼに関する。こ
のような操作されたメガヌクレアーゼは、心血管疾患及び常染色体優性家族性高コレステ
ロール血症を含む高コレステロール血症を治療する方法に有用である。

【0002】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列リストへの参照
本願は、ＥＦＳ－ＷＥＢを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照することによりその
全文が本明細書に組み込まれる配列リストを含む。２０１８年４月２０日に作成された当
該ＡＳＣＩＩコピーはＰ１０９０７００２２ＷＯ００－ＳＥＱＴＸＴ－ＭＪＴという名称
であり、８９，６６０バイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

高レベルの低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）に関連した心血管疾患
は、先進国における主な死因であり、ＬＤＬ－Ｃレベルの上昇は、冠動脈疾患（ＣＨＤ）
及びアテローム斑発生の主な危険因子である。例えば、家族性高コレステロール血症（Ｆ
Ｈ）は、高いコレステロールレベル、特に高レベルのＬＤＬ－Ｃ及び早期発症型ＣＨＤの
発症を特徴とする遺伝病である。ヘテロ接合性ＦＨ患者は典型的には、総コレステロール
レベル、具体的にはＬＤＬ－Ｃレベルを減少させるスタチン等の脂質低下薬で治療される
。実際に、スタチンの投与はある患者集団の心血管疾患のリスクを大いに減少させた。し
かし、一部の患者集団、特にホモ接合型のＦＨ患者集団は、高用量スタチンを含む治療に
応じて正常なＬＤＬ－Ｃレベルを達成できなかった。

【0004】

脂質低下分野における重要な進歩は、プロタンパク質コンバターゼであるサブチリシン
／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）を標的とする治療法の進歩であった。ヒトＰＣＳＫ９遺伝
子は染色体１ｐ３２．３に局在し、長さは２５，３７８ｂｐｓである。ヒトＰＣＳＫ９遺
伝子は、６９２個のアミノ酸をコードする１２個のエキソンを含む。ＰＣＳＫ９タンパク
質は、シグナルペプチド、プロドメイン、触媒ドメイン、及び３つのモジュール（Ｍ１、
Ｍ２、及びＭ３）から構成されるＣ末端システインヒスチジンリッチドメインを含む。

【0005】

ＰＣＳＫ９の合成、分泌、及び発現は主に肝臓で起こるが、ＰＣＳＫ９は胃腸管、腎臓
、及び中枢神経系（ＣＮＳ）では低レベルで発現される。ＰＣＳＫ９前駆体タンパク質の
分子量は７５ｋＤａである。小胞体（ＥＲ）での自己触媒切断後、ＰＣＳＫ９プロドメイ
ンは６２ｋＤａの成熟型ＰＣＳＫ９タンパク質から分離される。分離されたプロドメイン
は、成熟型ＰＣＳＫ９タンパク質に非共有結合したままであり、ＰＣＳＫ９の触媒ドメイ
ンを強制的に不活性な構造にするプロセグメントＰＣＳＫ９複合体を形成する。その後、
切断された複合体は、ＥＲからゴルジ装置に輸送され、放出される。肝細胞においては、
分泌されたＰＣＳＫ９は肝細胞膜上のＬＤＬ受容体に結合する。この結合は、ＰＣＳＫ９
の触媒ドメイン及びプロドメインがそれぞれＬＤＬ受容体の上皮成長因子様反復相同性ド
メインＡ（ＥＧＦ－Ａ）及びβ－プロペラドメインと相互作用することによって媒介され
る。

【0006】

ＬＤＬ受容体は典型的には、細胞外液（コレステロールを含む）中の脂肪分子を細胞内
に輸送し、それにより循環ＬＤＬ濃度を減少させる。ＰＣＳＫ９の非存在下では、ＬＤＬ
受容体－リガンド複合体は、ＬＤＬの細胞内輸送及びＬＤＬ受容体の細胞表面への再利用
を可能にする構造変化を受ける。しかし、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ受容体への結合は、複合体
のこの構造変化を防止し、分解のために受容体をリソソームへと案内する。その結果、細
胞表面上に存在するＬＤＬ受容体は少なくなり、血流中の循環ＬＤＬコレステロールレベ
ルが増加する。ＬＤＬ受容体に加えて、ＰＣＳＫ９は、超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ
）受容体、アポリポタンパクＥ受容体２、ＬＤＬ受容体関連タンパク１を含む、同じファ
ミリーの他の脂質受容体の分解を媒介することが示されている。

【0007】

ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ受容体及びアポリポタンパクＢをコードする遺伝子とともに、Ｆ
Ｈの常染色体優性型に関連する第３の遺伝子である。常染色体優性ＦＨでは、ＰＣＳＫ９
遺伝子の機能獲得型変異は更に細胞表面でのＬＤＬ受容体の局在を減少させ、ＬＤＬコレ
ステロールレベルの上昇と関連する。興味深いことに、ＰＣＳＫ９の機能喪失型変異は、
ＬＤＬコレステロールレベルが低く、心血管系事象の発生率が大幅に低下した患者におい
て発見されることが観察されている。更に、ＰＣＳＫ９機能喪失患者は、スタチン療法に
対する反応が高まることが示されている。

【0008】

従って、ＰＣＳＫ９のターゲティングは、心血管疾患及び常染色体優性ＦＨを含む高コ
レステロール血症の治療に対する有望な治療アプローチである。この分野の研究は、複数
の治療を用いてＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との相互作用を阻害することに重点を置いてき
た。こうした阻害によるアプローチとしては、アリロクマブ（ＲＥＧＮ７２７／ＳＡＲ２
３６５５３）、エボロクマブ（ＡＭＧ１４５）、及びボコシズマブ（ＲＮ３１６）を含む
、ＰＣＳＫ９に対するモノクローナル抗体の使用が挙げられる。しかし、抗体によるアプ
ローチは、過敏反応及び免疫原性をはじめとする抗体療法に特有の問題だけではなく、神
経認知的な副作用を起こしやすい。阻害によるアプローチはアドネクチン及びペプチドミ
メティクスも使用して研究されてきた。これまで、治療の観点から望ましいＰＣＳＫ９小
分子阻害剤の使用の大部分は失敗している。

【0009】

推し進められてきた他のアプローチとしては、ＰＣＳＫ９発現の阻害が挙げられる。こ
のような戦略は、遺伝子発現をダウンレギュレーションするためのアンチセンスオリゴヌ
クレオチド又はｓｉＲＮＡの使用を含む。とりわけ、ＰＣＳＫ９遺伝子を恒久的に変化さ
せ、タンパク質発現をノックアウトするための遺伝子編集アプローチも推し進められてき
た。例えば、Ｄｉｎｇらは、マウス肝臓のＰＣＳＫ９を標的とするアデノウイルスによる
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して、マウス肝臓のＰＣＳＫ９の突然変異率が３
日目から４日目で５０％超であり、ＰＣＳＫ９レベルは減少し、肝ＬＤＬ受容体レベルは
上昇し、血清コレステロールレベルは３５％～４０％減少することを発見した（非特許文
献１）。キメラヒト肝臓を有するＦａｈ^－／－Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－（ＦＲＧ
ＫＯ）マウスを使用したＷａｎｇらの更なる研究においては、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子を
標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いた治療により、ＰＣＳＫ９のオンターゲット突
然変異誘発が高レベルで引き起こされ、血液中のヒトＰＣＳＫ９タンパク質レベルが５２
％減少した（非特許文献２）。しかし、現在、ＰＣＳＫ９に焦点を合わせたヒト遺伝子治
療に必要である、ヒト肝臓を含む霊長類の肝臓で特異的に遺伝子を修飾及び／又はノック
アウトするためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをうまく利用できるという証拠が当該技
術分野では著しく欠如している。

【0010】

Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号１）は、藻類であるクラミドモナスの葉緑体染色体内の２２塩
基対の認識配列を認識し切断するホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（
配列番号２）ファミリーのメンバーである。遺伝子選択技術を用いて、野生型Ｉ－Ｃｒｅ
Ｉ切断部位の好みを変更した（非特許文献３～６）。哺乳動物、酵母菌、植物、及びウイ
ルスゲノムを含む広く多様なＤＮＡ部位を標的とするＩ－ＣｒｅＩ及び他のホーミングエ
ンドヌクレアーゼを包括的に再設計できるモノＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ホーミ
ングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記載されている（特許文献１）。

【0011】

まず特許文献２に記載されているように、Ｉ－ＣｒｅＩ及びその操作された誘導体は通
常二量体だが、第１のサブユニットのＣ末端を第２のサブユニットのＮ末端に結合する短
いペプチドリンカーを使用して単一のポリペプチドに融合できる（非特許文献７～８）。
従って、機能的な「一本鎖」メガヌクレアーゼは、単一の転写物から発現させることがで
きる。

【0012】

操作されたメガヌクレアーゼの使用は、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とし、ＰＣＳＫ９発現
を減少させ、従って、コレステロール関連疾患の患者の循環ＬＤＬレベル及び総コレステ
ロールレベルを減少させるための有望なアプローチとなる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】国際公開ＷＯ２００７／０４７８５９号公報

【特許文献2】国際公開ＷＯ２００９／０５９１９５号公報

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １１５（５）：４８８－４９２

【非特許文献2】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ３６：７８３－７８６

【非特許文献3】Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１－４１

【非特許文献4】Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ１７８

【非特許文献5】Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０－９

【非特許文献6】Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３－５８

【非特許文献7】Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：１６５０－６２

【非特許文献8】Ｇｒｉｚｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：５４０５－１９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

本発明は、部分的に、ＰＣＳＫ９遺伝子内のＤＮＡ配列を認識するように操作された部
位特異的レアカットエンドヌクレアーゼの開発に依存する。本発明者らは、ＰＣＳＫ９の
発現及び／又は活性を減でき、後に霊長類、例えば、ヒトの総コレステロールレベル及び
ＬＤＬコレステロールレベルを減少させるＰＣＳＫ９遺伝子の特定の認識配列を特定した
。

【課題を解決するための手段】

【0016】

従って、本明細書に開示の方法及び組成物は、被験体のコレステロール関連障害、例え
ば、常染色体優性ＦＨを含む高コレステロール血症の症状を治療又は低減するのに有用で
ある。従って、本発明は、霊長類のコレステロール関連障害に対する更なる遺伝子治療ア
プローチのための当該技術分野における必要性を満たす。

【0017】

本発明は、被験体のコレステロール関連障害、例えば、常染色体優性ＦＨを含む高コレ
ステロール血症の治療に有用な操作されたメガヌクレアーゼを提供する。本発明の操作さ
れたメガヌクレアーゼは、ＰＣＳＫ９遺伝子内の認識配列（配列番号３）を認識し切断す
る。本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼによるそのような認識配列での切断は
、切断部位での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によりＰＣＳＫ９の発現及び／又は活性を阻
害できる。ＮＨＥＪは、挿入、欠失を生じさせることができ、又は遺伝子発現と干渉し得
るフレームシフト突然変異を生じさせることができる。従って、正常な遺伝子発現を阻害
することにより、ＰＣＳＫ９の発現及び／又は活性が本明細書で開示される方法に従って
減少するか又はなくされる。本発明はまた、ＰＣＳＫ９遺伝子内に位置する認識配列に対
して特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼを利用した、コレステロール関連障害の
治療のための医薬組成物及び方法を提供する。本発明は、総コレステロールレベル及び／
又はＬＤＬコレステロールレベルを減少させるために、且つ／又はコレステロール関連障
害に関連する症状を減少させるために、本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼを
、コレステロール関連障害を有する被験体に送達する方法を更に提供する。

【0018】

従って、一態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子内の認識配列を認識し切断する操作
されたメガヌクレアーゼを提供する。操作されたメガヌクレアーゼは、第１のサブユニッ
ト及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは、認識配列の第１の認識ハーフ
サイトに結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットは、認識配
列の第２の認識ハーフサイトに結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、認識配列は、配列番号４（即ち、ＰＣＳ７－８認識配列）を
含むことができる。認識配列が配列番号４を含むいくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域
は、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して
少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ
以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかのそのような実施
形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２４、２６、２８、
３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応
する残基を含むことができる。ある種の実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号８の残
基４８、５０、７１、及び７３に対応する残基を更に含むことができる。特定の実施形態
では、ＨＶＲ１領域は、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２４～７９を含むことが
できる。

【0020】

認識配列が配列番号４を含むいくつかのそのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配
列番号６～１４のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少
なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以
上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかのそのような実施形
態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１
９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６
１、２６６、及び２６８に対応する残基を含むことができる。そのような実施形態では、
ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２５８に対応する残基を更に含むことができる。特
定の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２１５～２
７０を含むことができる。

【0021】

認識配列が配列番号４を含むそのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番
号６～１４のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５
％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸
配列を含むことができ、第２のサブユニットは、配列番号６～１４のいずれか１つの残基
１９８～３４４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少な
くとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。あ
る種の実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号６～１４のいずれか１つの残基８
０に対応する位置にＤ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、及びＳ残基を含む。ある種の実施形態では
、第２のサブユニットは、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２７１に対応する位置
にＤ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、及びＳ残基を含む。ある種の実施形態では、第１のサブユニ
ットは、配列番号６～１４のいずれか１つの残基８０に対応する残基を含む。ある種の実
施形態では、第２のサブユニットは、配列番号６～１４のいずれか１つの残基２７１に対
応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号６～１４
のいずれか１つの残基７～１５３を含むことができる。同様に、いくつかの実施形態では
、第２のサブユニットは、配列番号６～１４のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む
ことができる。

【0022】

認識配列が配列番号４を含むある種のこのような実施形態では、操作されたメガヌクレ
アーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニッ
トを共有結合する。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６～
１４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。

【0023】

別の態様では、本発明は、本明細書に開示の任意の操作されたメガヌクレアーゼをコー
ドする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、ポリヌクレオ
チドはｍＲＮＡであり得る。

【0024】

更なる実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載の１又は複数の操作されたメガヌク
レアーゼをコードする多シストロン性ｍＲＮＡであり得る。更なる実施形態では、本発明
の多シストロン性ｍＲＮＡは、本明細書に記載の１又は複数の操作されたメガヌクレアー
ゼと、コレステロール関連障害を有する被験体において治療的に有益な効果をもたらす１
又は複数の追加のタンパク質とをコードできる。

【0025】

別の態様では、本発明は、本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核
酸配列を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構
築物は、プロモーターと本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸
配列とを含むカセットを含む。

【0026】

他の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、プロモーターと多シストロン性核酸配列と
を含むカセットを含み、プロモーターは、多シストロン性核酸配列の発現を駆動し、標的
細胞に本明細書に記載の多シストロン性ｍＲＮＡを産生する。

【0027】

特定の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、本明細書に開示の任意の操作されたメガ
ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むウイルスベクターをコードする。そのような実
施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、
アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。特定
の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターであり得る。

【0028】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモーターと本明細書に記載の操作
されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。他の実施形態で
は、ウイルスベクターは、２以上のカセットを含み、各カセットは、プロモーターと本明
細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むことができる。

【0029】

他の実施形態では、ウイルスベクターは、プロモーターと多シストロン性核酸配列とを
含む１つのカセットを含み、プロモーターは、多シストロン性核酸配列の発現を駆動し、
標的細胞に本明細書に記載の多シストロン性ｍＲＮＡを産生する。

【0030】

別の態様では、本発明は、本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核
酸配列を含むウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクター
は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又は
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。特定の実施形態では、ウイルスベク
ターは組換えＡＡＶベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは
、プロモーターと本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列と
を含むカセットを含む。

【0031】

更なる実施形態では、ウイルスベクターは、プロモーターと多シストロン性核酸配列と
を含む１つのカセットを含み、プロモーターは、多シストロン性核酸配列の発現を駆動し
、標的細胞に本明細書に記載の多シストロン性ｍＲＮＡを産生する。

【0032】

別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と、（ａ）本明細書に記載の操作さ
れたメガヌクレアーゼをコードする核酸、又は（ｂ）本明細書に記載の操作されたメガヌ
クレアーゼタンパク質とを含む、医薬組成物を提供し、操作されたメガヌクレアーゼは、
配列番号４等のＰＣＳＫ９内の認識配列に対して特異性を有する。

【0033】

一実施形態では、本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼをコードする医薬組成
物の核酸配列は、本明細書に記載のｍＲＮＡであり得る。いくつかのそのような実施形態
では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載の２以上の操作されたメガヌクレアーゼがインビボ（
ｉｎ ｖｉｖｏ）で標的細胞において発現されるような本明細書に記載の多シストロン性
ｍＲＮＡであり得る。

【0034】

別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼをコ
ードする核酸配列を含む本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物を含む。いくつかのそのよ
うな実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、プロモーターと本発明の操作されたメガヌク
レアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。

【0035】

他の実施形態では、医薬組成物の組換えＤＮＡ構築物は、プロモーターと多シストロン
性核酸配列とを含むカセットを含み、プロモーターは、多シストロン性核酸配列の発現を
駆動し、本明細書に記載の２つ以上の操作されたメガヌクレアーゼが標的細胞で発現され
るように、標的細胞にインビボで本明細書に記載の多シストロン性ｍＲＮＡを産生する。

【0036】

別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼをコ
ードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む。そのような一実施形態では、ウイルス
ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶであり得る
。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターであり得る。

【0037】

いくつかのそのような実施形態では、ウイルスベクターは、プロモーターと本明細書に
記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。

【0038】

他のそのような実施形態では、ウイルスベクターは、プロモーターと多シストロン性核
酸配列とを含む１つのカセットを含み、プロモーターは、本明細書に記載の２以上の操作
されたメガヌクレアーゼが標的細胞で発現されるように、多シストロン性核酸配列の発現
を駆動し、標的細胞にインビボで本明細書に記載の多シストロン性ｍＲＮＡを産生する。

【0039】

一実施形態では、医薬組成物は、配列番号４を認識し切断する本明細書に開示の操作さ
れたメガヌクレアーゼを含むことができる。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレ
アーゼは、配列番号６～１４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。

【0040】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子内にカプセル化された本明細書
に記載の１又は複数のｍＲＮＡを含むことができる。特定の実施形態では、医薬組成物の
脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の２以上のｍＲＮＡを含むことができ、各々は、本発明
の操作されたメガヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は
、肝臓、特に肝実質細胞内での送達及び取り込みを増強する組成を有する。

【0041】

別の態様では、本発明は、被験体のＰＣＳＫ９の発現又は活性を減少させる治療方法を
提供する。同様に、本明細書では、コレステロール関連障害、例えば、常染色体優性ＦＨ
を含む高コレステロール血症を治療するか、又はコレステロール関連障害に関連する症状
を低減する方法が提供される。本方法は、被験体の標的細胞に、（ａ）有効量の、標的細
胞で発現される操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸、又は（ｂ）有効量の操作
されたメガヌクレアーゼタンパク質を送達することを含み、操作されたメガヌクレアーゼ
は配列番号４等のＰＣＳＫ９の認識配列に対する特異性を有する。

【0042】

本方法のいくつかの実施形態では、被験体はコレステロール関連障害を有する。特定の
実施形態では、被験体は高コレステロール血症を有する。いくつかの実施形態では、被験
体の高コレステロール血症は、家族性高コレステロール血症又は常染色体優性家族性高コ
レステロール血症である。特定の実施形態では、被験体はヒト又は非ヒト霊長類である。

【0043】

本方法の特定の実施形態では、被験体は、本明細書に開示の医薬組成物を投与される。
医薬組成物は、本明細書に開示の組換えＡＡＶベクターを含むことができる。ある種の実
施形態では、医薬組成物は、操作されたメガヌクレアーゼをコードする本明細書に開示の
ｍＲＮＡを含むことができる。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子内にカプセ
ル化することができる。

【0044】

本方法のいくつかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼ、又は操作されたメガ
ヌクレアーゼをコードする核酸は標的肝細胞に送達され得る。標的肝細胞は、初代肝実質
細胞等の肝実質細胞であり得る。

【0045】

本方法のいくつかの実施形態では、被験体の肝細胞の細胞表面上におけるＬＤＬ受容体
のディスプレイは、ベースラインＬＤＬ受容体レベルと比較した場合、治療により増加す
る。細胞表面上のＬＤＬ受容体のディスプレイは、ベースラインＬＤＬ受容体レベルと比
較した場合、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０
％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２５０％、５００％、１０００％、又はそれ
以上増加し得る。

【0046】

本方法のある種の実施形態では、被験体の血清総コレステロールレベルは治療により減
少する。血清総コレステロールレベルは、ベースライン血清総コレステロールレベルと比
較した場合、（ａ）少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０
％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは最高１００％、又は（ｂ）５～１５ｍｇ
／ｄＬ、１０～２０ｍｇ／ｄＬ、１０～３０ｍｇ／ｄＬ、１５～３０ｍｇ／ｄＬ、２０～
３０ｍｇ／ｄＬ、２５～３５ｍｇ／ｄＬ、２５～４０ｍｇ／ｄＬ、２５～５０ｍｇ／ｄＬ
、４０～６０ｍｇ／ｄＬ、５０～７０ｍｇ／ｄＬ、６０～８０ｍｇ／ｄＬ、若しくは７０
～１００ｍｇ／ｄＬ減少し得る。

【0047】

ある種の実施形態では、被験体の血清ＬＤＬコレステロールレベルは治療により減少す
る。血清ＬＤＬコレステロールレベルは、ベースライン血清ＬＤＬコレステロールレベル
と比較した場合、（ａ）少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、
６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは最高１００％、又は（ｂ）５～１５
ｍｇ／ｄＬ、１０～２０ｍｇ／ｄＬ、１０～３０ｍｇ／ｄＬ、１５～３０ｍｇ／ｄＬ、２
０～３０ｍｇ／ｄＬ、２５～３５ｍｇ／ｄＬ、２５～４０ｍｇ／ｄＬ、２５～５０ｍｇ／
ｄＬ、４０～６０ｍｇ／ｄＬ、５０～７０ｍｇ／ｄＬ、若しくは６０～８０ｍｇ／ｄＬ減
少し得る。

【0048】

本方法の特定の実施形態では、第１の認識配列は配列番号４を含むことができる。いく
つかのそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４を認識し切
断する本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施形態では、操
作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６～１４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むこ
とができる。

【0049】

別の態様では、本発明は、薬剤として使用するための本明細書に記載の操作されたメガ
ヌクレアーゼを提供する。本発明は、コレステロール関連障害、例えば、常染色体優性Ｆ
Ｈを含む高コレステロール血症を治療するか、ＰＣＳＫ９の活性若しくは発現を減少させ
るか、又はコレステロール関連障害に関連する症状を低減するための薬剤としての本明細
書に記載の操作されたメガヌクレアーゼの使用を更に提供する。特定の実施形態では、本
発明は、被験体の総コレステロールレベル及び／又はＬＤＬコレステロールレベルを減少
させるための薬剤としての本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼの使用を提供す
る。

【0050】

別の態様では、本発明は、薬剤として使用するための単離されたポリヌクレオチドを提
供し、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼを
コードする核酸配列を含む。本発明は、コレステロール関連障害、例えば、常染色体優性
ＦＨを含む高コレステロール血症を治療するか、ＰＣＳＫ９の活性若しくは発現を減少さ
せるか、又はコレステロール関連障害に関連する症状を低減するための薬剤としての単離
されたポリヌクレオチドの使用を更に提供し、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書
に開示の操作されたメガヌクレアーゼをコードする。特定の実施形態では、本発明は、被
験体の総コレステロールレベル及び／又はＬＤＬコレステロールレベルを減少させるため
の薬剤としての本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする単離されたポ
リヌクレオチドの使用を提供する。

【0051】

別の態様では、本発明は、薬剤として使用するための組換えＡＡＶベクターを提供し、
組換えＡＡＶベクターは単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオチ
ドは、本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。本発
明は、コレステロール関連障害、例えば、常染色体優性ＦＨを含む高コレステロール血症
を治療するか、ＰＣＳＫ９の活性若しくは発現を減少させるか、又はコレステロール関連
障害に関連する症状を低減するための薬剤としての組換えＡＡＶベクターの使用を更に提
供し、組換えＡＡＶベクターは単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌク
レオチドは、本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む
。本発明は、被験体の総コレステロールレベル及び／又はＬＤＬコレステロールレベルを
減少させるための薬剤としての組換えＡＡＶベクターの使用を更に提供し、組換えＡＡＶ
ベクターは単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオチドは、本明細
書に開示の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。

【0052】

本発明の上記及び他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を参
照することによってより完全に理解することができる。明確さのために別個の実施形態に
関連して記述されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせた形で提供
されてもよい。実施形態の全ての組み合わせは、本発明により具体的に包含され、あたか
もありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に開示されるかのように本明細書で開示
される。逆に、簡潔さのために単一の実施形態に関連して記述されている本発明の種々の
特徴は、別個に又は任意の適した下位組み合わせの形で提供されてもよい。実施形態に列
挙される特徴の全ての下位組み合わせも、本発明により具体的に包含され、あたかもあり
とあらゆる下位組み合わせが個別にかつ明示的に本明細書で開示されるかのように本明細
書で開示される。本明細書で開示される本発明の各態様の実施形態は、必要な変更を加え
て本発明の互いの態様に適用される。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1】ヒトＰＣＳＫ９遺伝子の操作されたメガヌクレアーゼ認識配列。本発明の操作されたメガヌクレアーゼにより標的とされる認識配列は、２つの認識ハーフサイトを含む。各認識ハーフサイトは９塩基対を含み、２つのハーフサイトは、４塩基対の中央配列によって分離される。ＰＣＳ７－８認識配列（配列番号４）は、ＰＣＳ７及びＰＣＳ８と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。

【図2】本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、２つのサブユニットを含み、第１のサブユニットは、第１の認識ハーフサイト（例えばＰＣＳ７）に結合するＨＶＲ１領域を含み、第２のサブユニットは、第２の認識ハーフサイト（例えばＰＣＳ８）に結合するＨＶＲ２領域を含む。操作されたメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして位置し得る。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして位置し得る。

【図3】ＰＣＳ７－８認識配列を標的とした操作されたメガヌクレアーゼを評価するＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞のレポーターアッセイの概略。本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼについては、ＣＨＯ細胞株が産生され、レポーターカセットは細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。レポーターカセットは、５’から３’の順で、ＳＶ４０初期プロモーター、ＧＦＰ遺伝子の５’ ２／３、本発明の操作されたメガヌクレアーゼの認識配列（例えばＰＣＳ７－８認識配列）、ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼの認識配列（国際公開第２０１２／１６７１９２号）、及びＧＦＰ遺伝子の３’ ２／３を含んでいた。このカセットを安定的にトランスフェクトされた細胞は、ＤＮＡ切断誘導剤の非存在下でＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、各メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡの形質導入により導入された。ＤＮＡ切断がメガヌクレアーゼ認識配列のいずれかで誘導されると、ＧＦＰ遺伝子の複製領域は互いに再結合し、機能的ＧＦＰタンパク質を産生する。すると、ＧＦＰ発現細胞の割合は、メガヌクレアーゼによりゲノム切断頻度の間接的な尺度として、フローサイトメトリーにより決定され得る。

【図4】ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおけるＰＣＳＫ９遺伝子内の認識配列を認識し切断するための操作されたメガヌクレアーゼの効率。配列番号６～１４に規定された操作されたメガヌクレアーゼを操作して、ＰＣＳ７－８認識配列（配列番号４）を標的とし、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性についてスクリーニングした。示されている結果は、各アッセイにて観察されたＧＦＰ発現細胞の割合を提供し、これは、標的認識配列又はＣＨＯ－２３／２４認識配列を切断する各メガヌクレアーゼの有効性を示す。陰性対照（ｂｓ）を更に各アッセイに含めた。図４Ａ～図４Ｃは、ＰＣＳ７－８認識配列を標的としたメガヌクレアーゼを示す。図４Ａは、ＰＣＳ７－８ｘ．８８及びＰＣＳ７－８ｘ．６６を示す。図４Ｂは、ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７、ＰＣＳ７－８Ｌ．２０４、ＰＣＳ７－８Ｌ．２０９、ＰＣＳ７－８Ｌ．２６１、ＰＣＳ７－８Ｌ．２６２、及びＰＣＳ７－８Ｌ．２６８を示す。図４Ｃは、ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７及びＰＣＳ７－８Ｌ．３６７を示す。

【図5】ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおけるヒトＰＣＳＫ９遺伝子内の認識配列を認識し切断するための操作されたメガヌクレアーゼの効率。配列番号６～１４に規定された操作されたメガヌクレアーゼを操作して、ＰＣＳ７－８認識配列（配列番号４）を標的とし、ヌクレオフェクション後１１日にわたる複数時点でＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性についてスクリーニングした。示されている結果は、１１日間の分析中の各アッセイにて観察されたＧＦＰ発現細胞の割合を提供し、これは、時間に応じた標的認識配列又はＣＨＯ－２３／２４認識配列を切断する各メガヌクレアーゼの有効性を示す。図５Ａは、ＰＣＳ７－８認識配列を標的とするＰＣＳ７－８ｘ．８８及びＰＣＳ７－８ｘ．６６メガヌクレアーゼを示す。図５Ｂは、ＰＣＳ７－８認識配列を標的とするＰＣＳ７－８ｘ．８８及びＰＣＳ７－８Ｌ．１９７メガヌクレアーゼを示す。図５Ｃは、ＰＣＳ７－８認識配列を標的とするＰＣＳ７－８Ｌ．３６７メガヌクレアーゼを示す。

【図6】Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ）アッセイ。Ｔ７Ｅアッセイを行って、ＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼがＨＥＫ２９３細胞のその認識部位においてｉｎｄｅｌを生じさせたかどうかを判定した。Ｔ７Ｅアッセイでは、ＰＣＳ７－８座は、ＰＣＳ７－８認識配列に隣接するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅された。ＰＣＳ７－８座内にｉｎｄｅｌ（無秩序な挿入又は欠失）があった場合、得られるＰＣＲ産物は野生型対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子の混合物からなる。ＰＣＲ産物は変性され、ゆっくりとリアニールされ得る。ゆっくりとしたリアニールにより、野生型対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子からなるヘテロ二本鎖が形成され、ミスマッチ塩基及び／又はバルジが生じる。Ｔ７Ｅ１酵素はミスマッチ部位で切断され、ゲル電気泳動により可視化され得る切断産物が生じる。ＰＣＳ７－８ｘ．８８及びＰＣＳ７－８ｘ．６６メガヌクレアーゼはヌクレオフェクションの２日後及び５日後に評価した。

【図7】非ヒト霊長類における血清ＰＣＳＫ９タンパク質レベル。ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ＰＣＳ７－８ｘ．８８．ＷＰＲＥ．ｂＧＨと呼ばれるＡＡＶベクターを調製して異なる３用量で３匹のオス及び１匹のオスのアカゲザルに投与した。動物ＲＡ１８６６（オス）は、３×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの単回用量を受けた。動物ＲＡ１８５７（オス）は、６×１０^１２ＧＣ／ｋｇの単回用量を受けた。動物ＲＡ１８２９（メス）及びＲＡ２３３４（オス）はそれぞれ、２×１０^１２ＧＣ／ｋｇの単回用量を受けた。血液サンプルは、ＥＬＩＳＡによる血清ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの分析のために、－３日目及び０日目、並びに投与後１６８日間（低用量動物）又は２８０日間（中用量及び高用量動物）の間に複数の時点で採取した。

【図8】総コレステロールレベル、ＬＤＬレベル、ＨＤＬレベル、及びトリグリセリドレベルは、－３日目、０日目、及びＰＣＳ７－８ｘ．８８メガヌクレアーゼをコードするＡＡＶの投与後の複数の時点で測定した。図８Ａは、各被験体の経時的に測定されたＬＤＬレベルを示す。図８Ｂは、被験体ＲＡ１８６６の総コレステロールレベル、ＨＤＬレベル、ＬＤＬレベル、及びトリグリセリドレベルを示す。図８Ｃは、被験体ＲＡ１８５７の総コレステロールレベル、ＨＤＬレベル、ＬＤＬレベル、及びトリグリセリドレベルを示す。図８Ｄは、被験体ＲＡ１８２９の総コレステロールレベル、ＨＤＬレベル、ＬＤＬレベル、及びトリグリセリドレベルを示す。図８Ｅは、被験体ＲＡ２３３４の総コレステロールレベル、ＨＤＬレベル、ＬＤＬレベル、及びトリグリセリドレベルを示す。

【図9】アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルは、各被験体において、－３日目、０日目、及びＰＣＳ７－８ｘ．８８メガヌクレアーゼをコードするＡＡＶの投与後の複数の時点で測定した。

【図10】肝細胞のＰＣＳ７－８認識配列においてインビボで観察される挿入及び欠失（ｉｎｄｅｌ）の頻度。ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ＰＣＳ７－８ｘ．８８．ＷＰＲＥ．ｂＧＨベクターの投与後１７日目に肝生検を行い、ＰＣＳ７－８認識配列におけるｉｎｄｅｌの存在について検査した。ｉｎｄｅｌは、認識配列に隣接するＰＣＲプライマー、ゲノムの介在領域の増幅、及び得られたＰＣＲ産物のシーケンシングにより検出した。

【図11】インビボでの肝細胞のＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼｍＲＮＡを検出するためのインサイチューハイブリッド形成。ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ＰＣＳ７－８ｘ．８８．ＷＰＲＥ．ｂＧＨベクターの投与後１７日目及び１２９日目で得た肝生検材料をインサイチューハイブリッド形成（ＩＳＨ）により検査した。蛍光標識オリゴプローブを設計し、各被験体由来の生検した肝細胞中のＰＣＳ７－８ｘ．８８ ｍＲＮＡに結合する。図１１Ａは、オリゴプローブなしで対照として行った別の被験体Ｍ１１６５７由来の生検細胞の模擬処理を示す。図１１Ｂは、被験体ＲＡ１８６６の生検サンプルを示す。図１１Ｃは、被験体ＲＡ１８５７の生検サンプルを示す。図１１Ｄは、被験体ＲＡ１８２９の生検サンプルを示す。図１１Ｅは、被験体ＲＡ２３３４の生検サンプルを示す。

【図12】非ヒト霊長類の血清ＰＣＳＫ９タンパク質レベル及び血清ＬＤＬ。ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７．ＷＰＲＥ．ｂＧＨと呼ばれるＡＡＶベクターを調製して６×１０^１２遺伝子コピー／ｋｇの用量を１匹のオス及び１匹のメスのアカゲザル（被験体ＲＡ２１２５及びＲＡ２３４３）に投与した。血液サンプルは、ＥＬＩＳＡによる血清ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの分析のために、投与前、及び投与後の複数の時点で採取した。

【図13】総コレステロールレベル、ＬＤＬレベル、ＨＤＬレベル、及びトリグリセリドレベルは、投与前、及びＰＣＳ７－８Ｌ．１９７メガヌクレアーゼをコードするＡＡＶの投与後の複数の時点で測定した。図１３Ａは、各被験体の経時的に測定されたＬＤＬレベルを示す。図１３Ｂは、被験体ＲＡ２１２５の総コレステロールレベル、ＨＤＬレベル、ＬＤＬレベル、及びトリグリセリドレベルを示す。図１３Ｃは、被験体ＲＡ２３４３の総コレステロールレベル、ＨＤＬレベル、ＬＤＬレベル、及びトリグリセリドレベルを示す。

【図14】アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルは、各被験体において、投与前、及びＰＣＳ７－８Ｌ．１９７メガヌクレアーゼをコードするＡＡＶの投与後の複数の時点で測定した。

【図15】インビボでの肝細胞のＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼｍＲＮＡを検出するためのインサイチューハイブリッド形成。ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７．ＷＰＲＥ．ｂＧＨベクターの投与後１８日目及び１２８日目で得た肝生検材料をインサイチューハイブリッド形成（ＩＳＨ）により検査した。蛍光標識オリゴプローブを設計し、各被験体由来の生検した肝細胞中のＰＣＳ７－８Ｌ．１９７ ｍＲＮＡに結合する。図１５Ａは、被験体ＲＡ２１２５の生検サンプルを示す。図１５Ｂは、被験体ＲＡ２３４３の生検サンプルを示す。

【図16】アンカードマルチプレックスＰＣＲ（ＡＭＰ－ｓｅｑ）による各被験体のｒｈＰＣＳＫ９標的化座に対するｉｎｄｅｌ分析。

【発明を実施するための形態】

【0054】

配列の簡単な説明
配列番号１は、野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定する。

【0055】

配列番号２は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧのアミノ酸配列を規定する。

【0056】

配列番号３は、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子の核酸配列を規定する。

【0057】

配列番号４は、ＰＣＳ７－８認識配列（センス）の核酸配列を規定する。

【0058】

配列番号５は、ＰＣＳ７－８認識配列（アンチセンス）の核酸配列を規定する。

【0059】

配列番号６は、ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定する。

【0060】

配列番号７は、ＰＣＳ７－８ｘ．８８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定する。

【0061】

配列番号８は、ＰＣＳ７－８Ｌ．３６７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定する。

【0062】

配列番号９は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２０４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定する。

【0063】

配列番号１０は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２０９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定する
。

【0064】

配列番号１１は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２６１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定する
。

【0065】

配列番号１２は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２６２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定する
。

【0066】

配列番号１３は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２６８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定する
。

【0067】

配列番号１４は、ＰＣＳ７－８ｘ．６６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定する。

【0068】

配列番号１５は、ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７メガヌクレアーゼＰＣＳ７結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0069】

配列番号１６は、ＰＣＳ７－８ｘ．８８メガヌクレアーゼＰＣＳ７結合サブユニットの
アミノ酸配列を規定する。

【0070】

配列番号１７は、ＰＣＳ７－８Ｌ．３６７メガヌクレアーゼＰＣＳ７結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0071】

配列番号１８は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２０４メガヌクレアーゼＰＣＳ７結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0072】

配列番号１９は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２０９メガヌクレアーゼＰＣＳ７結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0073】

配列番号２０は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２６１メガヌクレアーゼＰＣＳ７結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0074】

配列番号２１は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２６２メガヌクレアーゼＰＣＳ７結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0075】

配列番号２２は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２６８メガヌクレアーゼＰＣＳ７結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0076】

配列番号２３は、ＰＣＳ７－８ｘ．６６メガヌクレアーゼＰＣＳ７結合サブユニットの
アミノ酸配列を規定する。

【0077】

配列番号２４は、ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７メガヌクレアーゼＰＣＳ８結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0078】

配列番号２５は、ＰＣＳ７－８ｘ．８８メガヌクレアーゼＰＣＳ８結合サブユニットの
アミノ酸配列を規定する。

【0079】

配列番号２６は、ＰＣＳ７－８Ｌ．３６７メガヌクレアーゼＰＣＳ８結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0080】

配列番号２７は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２０４メガヌクレアーゼＰＣＳ８結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0081】

配列番号２８は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２０９メガヌクレアーゼＰＣＳ８結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0082】

配列番号２９は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２６１メガヌクレアーゼＰＣＳ８結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0083】

配列番号３０は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２６２メガヌクレアーゼＰＣＳ８結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0084】

配列番号３１は、ＰＣＳ７－８Ｌ．２６８メガヌクレアーゼＰＣＳ８結合サブユニット
のアミノ酸配列を規定する。

【0085】

配列番号３２は、ＰＣＳ７－８ｘ．６６メガヌクレアーゼＰＣＳ８結合サブユニットの
アミノ酸配列を規定する。

【0086】

配列番号３３は、ＰＣＳ７－８ｘ．８８を用いた治療後のインビボで観察されたｉｎｄ
ｅｌの核酸配列を規定する。

【0087】

配列番号３４は、ＰＣＳ７－８ｘ．８８を用いた治療後のインビボで観察されたｉｎｄ
ｅｌの核酸配列を規定する。

【0088】

配列番号３５は、ＰＣＳ７－８ｘ．８８を用いた治療後のインビボで観察されたｉｎｄ
ｅｌの核酸配列を規定する。

【0089】

配列番号３６は、ＰＣＳ７－８ｘ．８８を用いた治療後のインビボで観察されたｉｎｄ
ｅｌの核酸配列を規定する。

【0090】

配列番号３７は、ＰＣＳ７－８ｘ．８８を用いた治療後のインビボで観察されたｉｎｄ
ｅｌの核酸配列を規定する。

【0091】

配列番号３８は、ＰＣＳ７－８ｘ．８８を用いた治療後のインビボで観察されたｉｎｄ
ｅｌの核酸配列を規定する。

【0092】

配列番号３９は、ＰＣＳ７－８ｘ．８８を用いた治療後のインビボで観察されたｉｎｄ
ｅｌの核酸配列を規定する。

【0093】

配列番号４０は、ＰＣＳ７－８ｘ．８８を用いた治療後のインビボで観察されたｉｎｄ
ｅｌの核酸配列を規定する。

【0094】

１．１ 参考文献及び定義
本明細書で参照される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立している。
本明細書に引用されているＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む、登録済み米国特許、
認可された出願、公開された外国出願、及び参考文献は、あたかもそれぞれが具体的且つ
個々に示されて、参照により組み込まれた場合と同じ程度で参照により本明細書に組み込
まれている。

【0095】

本発明は異なる形態で実施でき、本明細書で記載される実施形態に限定されるものとし
て解釈されるべきではない。むしろ、本開示が完璧かつ完全であるように、また当業者に
完全に本発明の範囲を伝えるように、これらの実施形態が提供される。例えば、一実施形
態に関して例示した特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の一実施形態に関し
て例示した特徴をその実施形態から削除することもできる。加えて、本開示に照らせば、
本明細書に示した実施形態に対する本発明から逸脱しない多くの変更及び追加が当業者に
は明白である。

【0096】

特に定義しない限り、本明細書で用いる技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野
における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における本発明
の説明で使用する用語は、詳細な実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定
することを意図していない。

【0097】

本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献はその全文が参
照することにより本明細書に組み込まれている。

【0098】

本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」は１又は複数を意味する
可能性がある。例えば「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は単一の細胞又は複数の細胞を意味して
よい。

【0099】

本明細書で使用する場合、特に断りがない限り、「又は」という語は、「及び／又は」
の包含的な意味で使用されるのであって、「いずれか一方」の排他的な意味で使用される
のではない。

【0100】

本明細書で使用する場合、用語「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」は同じ意
味で用いられ、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する、天然に存在す
るか又は操作された酵素を指す。

【0101】

本明細書で使用する場合、用語「メガヌクレアーゼ」は、１２塩基対を超える認識配列
で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。好ましくは、本発明のメガヌクレ
アーゼのための認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩに由来
するエンドヌクレアーゼであり得、例えばＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結
合親和性、又は二量体化特性に関して天然Ｉ－ＣｒｅＩと比較して改変されたＩ－Ｃｒｅ
Ｉの操作された変異体を指すことができる。Ｉ－ＣｒｅＩのこのような改変された変異体
を作製するための方法は、当該技術分野において公知である（例えば、国際公開第２００
７／０４７８５９号）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として
二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼは更に、一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチ
ドリンカーを用いて単一のポリペプチドに連結された「一本鎖メガヌクレアーゼ」であっ
てもよい。用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、用語「メガヌクレアーゼ」と同義
である。本発明のメガヌクレアーゼは、本明細書に記載の方法を用いて測定した場合に、
細胞生存率に対する有害な効果又はメガヌクレアーゼ切断活性の有意な減少を観察するこ
となく、細胞において発現した場合に実質的に非毒性である。

【0102】

本明細書で使用する場合、用語「一本鎖メガヌクレアーゼ」は、リンカーによって連結
された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。一本鎖メガヌクレア
ーゼは、Ｎ末端サブユニット－リンカー－Ｃ末端サブユニットという構成を有する。２つ
のメガヌクレアーゼサブユニットは、一般的に、アミノ酸配列において同一ではなく、同
一ではないＤＮＡ配列を認識する。従って、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、偽
パリンドローム又は非パリンドロームの認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼは
、実際、二量体ではないにもかかわらず、「一本鎖ヘテロ二量体」又は「一本鎖ヘテロ二
量体メガヌクレアーゼ」と呼ばれる場合がある。明確さのために、特に指定のない限り、
用語「メガヌクレアーゼ」は二量体又は一本鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。

【0103】

本明細書で使用する場合、用語「リンカー」は、２つのメガヌクレアーゼサブユニット
を１つのポリペプチドへと結合するために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカ
ーは、天然タンパク質に見出される配列を有していても、又は天然タンパク質には見出さ
れない人工配列であってもよい。リンカーは可撓性で二次構造が欠如していても、又は生
理学的条件下で特定の三次元構造を形成する性質を有していてもよい。リンカーとしては
、限定するものではないが、米国特許第８，４４５，２５１号及び米国特許第９，４３４
，９３１号に包含されるものを挙げることができる。いくつかの実施形態では、リンカー
は、配列番号６～１４のいずれか１つの残基１５４～１９５を含むアミノ酸配列を有する
ことができる。

【0104】

タンパク質に関して本明細書で使用する場合、用語「組換え」又は「操作された」は、
タンパク質をコードする核酸及び当該タンパク質を発現する細胞又は生物に遺伝子工学技
術を適用した結果として変更されたアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して
、用語「組換え」又は「操作された」は、遺伝子工学技術を適用した結果として変更され
た核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術としては、ＰＣＲ及びＤＮＡクロー
ニング技術；トランスフェクション、形質転換及び他の遺伝子移入技術；相同組換え；部
位特異的突然変異誘発；並びに遺伝子融合が挙げられるが、これらに限定されない。この
定義に従って、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主で
のクローニング及び発現によって産生されるタンパク質は、組換え体とはみなされない。

【0105】

本明細書で使用する場合、用語「野生型」は、同種の遺伝子の対立遺伝子集団における
最も一般的な天然に存在する対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド配列）を指し、野生型
対立遺伝子によってコードされるポリペプチドがその元の機能を有する。用語「野生型」
は、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドも指す。野生型対立遺伝子（即
ち、ポリヌクレオチド）及びポリペプチドは、野生型配列に対して１又は複数の突然変異
及び／又は置換を含む突然変異体又は変異体の対立遺伝子及びポリペプチドとは区別され
る。野生型の対立遺伝子又はポリペプチドは、生物において正常な表現型を付与すること
ができるが、突然変異体又は変異体の対立遺伝子又はポリペプチドは、場合によっては、
変化した表現型を付与し得る。野生型ヌクレアーゼは、組換え体又は非天然のヌクレアー
ゼとは区別される。用語「野生型」は、特定の遺伝子の野生型対立遺伝子、又は比較目的
のために使用される細胞、生物及び／若しくは被験体を有する細胞、生物、及び／又は被
験体を指すこともできる。

【0106】

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子改変」は、細胞若しくは生物、又はそれらの祖
先において、ゲノムＤＮＡ配列が組換え技術によって故意に改変された細胞又は生物を指
す。本明細書で使用する場合、用語「遺伝子改変」は、用語「トランスジェニック」を包
含する。

【0107】

組換えタンパク質に関して本明細書で使用する場合、用語「改変」は、参照配列（例え
ば、野生型配列又は天然配列）に対する組換え配列中のアミノ酸残基の挿入、欠失、又は
置換を意味する。

【0108】

本明細書で使用する場合、用語「認識配列」又は「認識部位」は、エンドヌクレアーゼ
によって結合及び切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、
４つの塩基対によって分離された一対の逆位９塩基対「ハーフサイト」を含む。一本鎖メ
ガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１のハーフサイトに接触し、タ
ンパク質のＣ末端ドメインは第２のハーフサイトに接触する。メガヌクレアーゼによる切
断は、４塩基対の３’「オーバーハング」を生じる。「オーバーハング」又は「粘着末端
」は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によって産生することができる短い一
本鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ?ＣｒｅＩに由来するメガヌクレアーゼ及び一本鎖メガ
ヌクレアーゼの場合、オーバーハングは、２２塩基対認識配列の塩基１０～１３を含む。

【0109】

本明細書で使用する場合、用語「標的部位」又は「標的配列」は、ヌクレアーゼの認識
配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。

【0110】

本明細書で使用する場合、用語「ＤＮＡ結合親和性」又は「結合親和性」は、メガヌク
レアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列又は任意の配列）と非共有的に関連する傾
向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋ_ｄによって測定される。本明細書で使用される
場合、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫ_ｄが参照ヌクレアーゼに対して統計的に有
意な量（ｐ＜０．０５）だけ増加又は減少する場合、ヌクレアーゼは「変化した」結合親
和性を有する。

【0111】

本明細書で使用される場合、用語「特異性」は、認識配列と呼ばれる特定の塩基対の配
列でのみ、又は認識配列の特定のセットにおいてのみ、二本鎖ＤＮＡ分子を認識し切断す
るメガヌクレアーゼの能力を意味する。認識配列のセットは、特定の保存された位置又は
配列モチーフを共有するが、１又は複数の位置で縮重していてもよい。高度に特異的なメ
ガヌクレアーゼは、１又は非常に少数の認識配列のみを切断することができる。特異性は
、当該技術分野において公知の任意の方法によって決定することができる。本明細書で使
用する場合、メガヌクレアーゼは、生理学的条件下で参照メガヌクレアーゼ（例えば野生
型）に結合されず切断されない認識配列に結合し切断する場合、又は認識配列の切断率が
参照メガヌクレアーゼに対して生物学的に有意な量（例えば、少なくとも２倍、又は２倍
～１０倍）増加又は減少する場合、「変化した」特異性を有する。

【0112】

本明細書で使用する場合、用語「相同組換え」又は「ＨＲ」は、二本鎖ＤＮＡ切断が相
同ＤＮＡ配列を修復鋳型として用いて修復される、天然の細胞プロセスを指す（例えば、
Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８
－１９７６）。相同ＤＮＡ配列は、内因性染色体配列又は細胞に送達された外因性核酸で
あってよい。

【0113】

本明細書で使用する場合、用語「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」は、二本鎖ＤＮＡ
切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接結合によって修復される、天然の細胞プロセ
スを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃ
ｉ．１１：１９５８－１９７６を参照）。非相同末端結合によるＤＮＡ修復は間違いを起
こしやすく、修復部位で鋳型と対応しないＤＮＡ配列の付加又は欠失が頻繁に起こる。場
合によっては、標的認識配列における切断は、標的認識部位にＮＨＥＪを生じる。遺伝子
のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導切断に続くＮＨＥＪによるＤＮＡ修復によ
って、フレームシフト突然変異等、コード配列への突然変異を導入し、遺伝子機能を破壊
する可能性がある。このように、操作されたメガヌクレアーゼは、細胞集団中の遺伝子を
効果的にノックアウトするために使用することができる。

【0114】

本明細書で使用する場合、用語「減少した」は、コレステロール関連疾患の症状若しく
は重症度の低下、又はＰＣＳＫ９のタンパク質発現若しくは活性の減少を指す。いずれの
状況においても、このような減少は、最高５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０
％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は最高１００％であってよい。従って
、用語「減少した」は、病態、タンパク質発現、タンパク質活性、又はＬＤＬ受容体への
ＰＣＳＫ９の結合の部分的な減少及び完全な減少の両方を包含する。

【0115】

本明細書で使用する場合、用語「増加した」は、細胞表面上のＬＤＬ受容体のディスプ
レイの増加を指す。このような増加は、最高５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５
０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２５０％、５０
０％、１０００％、又はそれ以上であってよい。ＬＤＬ受容体の表面ディスプレイの増加
を測定するために、任意の方法が使用できる。

【0116】

本明細書で使用する場合、用語「高コレステロール血症」は、コレステロールレベルが
望ましいレベルを超えて上昇している状態を指す。ある種の実施形態では、ＬＤＬコレス
テロールレベルは望ましいレベルを超えて上昇している。ある種の実施形態では、血清Ｌ
ＤＬコレステロールレベルは望ましいレベルを超えて上昇している。本明細書で使用する
場合、用語「家族性高コレステロール血症」又は「ＦＨ」は、血清中の低比重リポタンパ
ク質（ＬＤＬ）関連コレステロールレベルの上昇を特徴とする遺伝病を指す。正常な患者
のＬＤＬコレステロールレベル（例えば１３０ｍｇ／ｄＬ未満）と比較すると、ヘテロ接
合性ＦＨ患者のレベルは３５０～５５０ｍｇ／ｄＬに、ホモ接合性ＦＨ患者のレベルは６
００ｍｇ／ｄＬ超まで上昇している。ＦＨを有する患者又は被験体におけるこれらのレベ
ルでのＬＤＬコレステロールの上昇は、組織内のコレステロール沈着及び若年での心血管
疾患リスクの増加につながる。

【0117】

アミノ酸配列及び核酸配列の両方に関して本明細書で使用する場合、用語「同一性割合
」、「配列同一性」、「類似性割合」、「配列類似性」等は、整列したアミノ酸残基又は
ヌクレオチド間の類似性を最大にする配列のアライメントに基づく、２つの配列の類似性
の程度の尺度を指し、これは配列のアライメントにおける同一又は類似の残基又はヌクレ
オチドの数、全ての残基又はヌクレオチドの数、並びにギャップの存在及び長さの関数で
ある。標準的なパラメータを使用して配列類似性を決定するための様々なアルゴリズム及
びコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用する場合、配列類似性は、
アミノ酸配列のＢＬＡＳＴｐプログラム及び核酸配列のＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて
測定され、これらは両方ともＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
）を通じて利用可能であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３?４１０；Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ（１９
９３），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６?２７２；Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．
（１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１?１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ
ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３ ８９
?３４０２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７
（１?２）：２０３?１４に記載されている。本明細書で使用する場合、２つのアミノ酸配
列の類似性割合は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムのパラメータ、即ち、ワードサイズ＝３、
ギャップオープニングペナルティ＝－１１、ギャップ伸長ペナルティ＝－１、及びスコア
リングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２に基づくスコアである。本明細書で使用する場合
、２つの核酸配列の類似性割合は、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムのパラメータ、すなわち、
ワードサイズ＝１１、ギャップオープニングペナルティ＝－５、ギャップ伸長ペナルティ
＝－２、マッチ報酬＝１、及びミスマッチペナルティ＝－３に基づくスコアである。

【0118】

２つのタンパク質又はアミノ酸配列の改変に関して本明細書で使用する場合、用語「対
応する」は、第１のタンパク質における特定の改変が第２のタンパク質における改変と同
じアミノ酸残基の置換であり、第１のタンパク質における改変のアミノ酸位置は、２つの
タンパク質が標準的な配列アライメント（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて）に
供される場合に、第２のタンパク質における改変のアミノ酸位置に対応するか、又はそれ
と整列することを示すために使用される。従って、配列アライメントにおいて残基Ｘ及び
残基Ｙが互いに対応する場合には、第１のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」に対する残
基「Ｘ」の修飾は、第２のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」に対する残基「Ｙ」の修飾
に対応し、残基Ｘ及び残基Ｙは異なる数であってもよい。

【0119】

本明細書で使用する場合、用語「認識ハーフサイト」、「認識配列ハーフサイト」、又
は単に「ハーフサイト」は、ホモ二量体若しくはヘテロ二量体メガヌクレアーゼのモノマ
ーによって、又は一本鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって認識される、二
本鎖ＤＮＡ分子中の核酸配列を意味する。

【0120】

本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」は、比較的高い変動性を有するアミノ
酸を含むメガヌクレアーゼモノマー又はサブユニット内の局在配列を指す。超可変領域は
、約５０～６０個の連続残基、約５３～５７個の連続残基、又は好ましくは約５６個の残
基を含むことができる。いくつかの実施形態では、超可変領域の残基は、配列番号６～１
４のいずれか１つの位置２４～７９又は位置２１５～２７０に対応し得る。超可変領域は
、認識配列中のＤＮＡ塩基に接触する１個又は複数個の残基を含むことができ、単量体又
はサブユニットの塩基選択を変化させるように改変することができる。超可変領域はまた
、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と関連するときにＤＮＡ骨格に結合する１個
又は複数個の残基を含むことができる。そのような残基は、ＤＮＡ骨格及び標的認識配列
に対するメガヌクレアーゼの結合親和性を変化させるように改変することができる。本発
明の異なる実施形態では、超可変領域は、変動性を示す１～２０個の残基を含んでよく、
塩基選択及び／又はＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる。いく
つかの実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号６～１４のいずれか１つの位
置２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、
７５、及び７７のうちの１又は複数に対応する。ある種の実施形態では、超可変領域内の
可変残基はまた、配列番号８の位置４８、５０、７１、及び７３のうちの１又は複数に対
応する。他の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号６～１４のいずれか１
つの位置２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、
２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８のうちの１又は複数に対応する。
更なる実施形態では、超可変領域内の可変残基はまた、配列番号１２の位置２５８に対応
してもよい。

【0121】

用語「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」
、「キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えＤＮＡ断片」は、本明細書では同じ意味
で用いられ、核酸断片である。組換え構築物は、限定されるものではないが、天然には一
緒に見出されない調節配列及びコード配列を含む核酸断片の人工的な組み合わせを含む。
例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は
同じ供給源に由来し、天然に見出されるものとは異なる様式で配置された調節配列及びコ
ード配列を含み得る。このような構築物は、単独で使用しても、又はベクターと組み合わ
せて使用してもよい。

【0122】

本明細書で使用する場合、「ベクター」又は「組換えＤＮＡベクター」は、所定の宿主
細胞においてポリペプチドをコードする配列の転写及び翻訳が可能な複製系及び配列を含
む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知の宿
主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターとしては、プラスミド
ベクター及び組換えＡＡＶベクター、又は本発明のメガヌクレアーゼをコードする遺伝子
を標的細胞に送達するのに適した当該技術分野で公知の任意の他のベクターを挙げること
ができるが、これらに限定されない。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチド又は核
酸配列のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択、及び増殖させるために、ベ
クター上に存在しなければならない遺伝因子を十分に認識している。

【0123】

本明細書で使用する場合、「ベクター」は、ウイルスベクターを指すこともできる。ウ
イルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウ
イルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を挙げることができるが、
これらに限定されない。

【0124】

本明細書で使用する場合、「多シストロン性」ｍＲＮＡは、２以上のコード配列（即ち
、シストロン）を含み、複数のタンパク質をコードする単一のメッセンジャーＲＮＡを指
す。多シストロン性ｍＲＮＡは、ＩＲＥＳエレメント、Ｔ２Ａエレメント、Ｐ２Ａエレメ
ント、Ｅ２Ａエレメント、及びＦ２Ａエレメントが挙げられるがこれらに限定されない、
同じｍＲＮＡ分子から２以上の遺伝子の翻訳を可能にする当該技術分野において公知の任
意のエレメントを含むことができる。

【0125】

本明細書で使用する場合、用語「対照」又は「対照細胞」は、遺伝子改変細胞の遺伝子
型又は表現型における変化を測定するための参照点を提供する細胞を指す。対照細胞は、
例えば（ａ）野生型細胞、即ち、遺伝子改変細胞を生じる遺伝子変更のための出発物質と
同じ遺伝子型の細胞、（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型の細胞であるが、ヌル構築物
で形質転換された（即ち、目的の形質に対して既知の効果を有していない構築物を有する
）細胞、又は（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変化した遺伝子型又は表現
型の発現を誘導する条件又は刺激、あるいは更なる遺伝子改変に曝されていない細胞を含
んでよい。

【0126】

２つのタンパク質又はアミノ酸配列の改変に関して本明細書で使用する場合、用語「対
応する」は、第１のタンパク質における特定の改変が第２のタンパク質における改変と同
じアミノ酸残基の置換であり、第１のタンパク質における改変のアミノ酸位置は、２つの
タンパク質が標準的な配列アライメント（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて）に
供される場合に、第２のタンパク質における改変のアミノ酸位置に対応するか、又はそれ
と整列することを示すために使用される。従って、配列アライメントにおいて残基Ｘ及び
残基Ｙが互いに対応する場合には、第１のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」に対する残
基「Ｘ」の修飾は、第２のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」に対する残基「Ｙ」の修飾
に対応し、残基Ｘ及び残基Ｙは異なる数であってもよい。

【0127】

本明細書で使用する場合、用語「治療」又は「被験体を治療する」は、本発明の操作さ
れたメガヌクレアーゼ又は本発明の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を、高
レベルの脂肪及び／又は血中を循環するコレステロール値の増加を特徴とする疾患、例え
ばコレステロール関連障害を有する被験体に投与することを指す。例えば、この被験体は
、心血管疾患、常染色体優性ＦＨを含む高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、
及び他のコレステロール関連障害を有していてもよい。治療の望ましい効果としては、疾
患の発症又は再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の減少、
病勢悪化速度の減少、病態の改善又は一時的軽減、及び予後の緩解又は改善が挙げられる
が、これらに限定されない。従って、疾患及び／又は障害を治療することとは、疾患及び
／又は障害の進行を変化させること（例えば遅らせること）、総コレステロールレベル及
び／又は低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベルを減少させること、クリ
グラー・ナジャー症候群を改善すること、鉄の取り込みを調節するためにヘプシジン及び
／又はヘモクロマトーシス２型の機能を回復させること、胆汁酸代謝を回復させること、
家族性高コレステロール血症の冠状動脈性心疾患リスクを低減すること、手及び／又は足
の過角化性斑（ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅ）を治癒させ得る、過角化
性斑及び角膜混濁の防止を指す。いくつかの態様では、本発明の操作されたメガヌクレア
ーゼ、又はこれをコードする核酸は、本発明の医薬組成物の形で治療中に投与される。

【0128】

本明細書で使用する場合、「コレステロール関連疾患」としては、高コレステロール血
症、心疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病、冠状動脈性心疾患、脳卒中、心血管疾
患、アルツハイマー病、及び一般的な脂質異常症で、例えば高血清総コレステロール、高
ＬＤＬ、高トリグリセリド、ＶＬＤＬ、及び／又は低ＨＤＬにより顕在化可能なもののう
ちのいずれか１つ又は複数が挙げられる。本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼ
を単独で又は１種若しくは複数種の他の薬剤と組み合せて使用して治療できる原発性及び
続発性脂質異常症のいくつかの非限定的な例としては、メタボリックシンドローム、真性
糖尿病、家族性複合型高脂血症、家族性高トリグリセリド血症、ヘテロ接合性高コレステ
ロール血症、ホモ接合性高コレステロール血症を含む家族性高コレステロール血症、家族
性欠陥アポリポタンパク質Ｂ－１００；多遺伝子性高コレステロール血症；レムナント除
去疾患、肝性リパーゼ欠乏症；食事の不摂生、甲状腺機能低下症、エストロゲン及びプロ
ゲスチン療法、ベータ遮断薬、及びチアジド系利尿薬を含む薬剤のうちの任意のものに続
発する脂質異常症；ネフローゼ症候群、慢性腎不全、クッシング症候群、原発性胆汁性肝
硬変、糖原病、肝癌、胆汁うっ滞、末端肥大症、インスリノーマ、成長ホルモン単独欠損
症及びアルコール性高トリグリセリド血症が挙げられる。本明細書に開示の操作されたメ
ガヌクレアーゼはまた、例えば、冠状動脈性心疾患、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳卒中
（虚血性及び出血性）、狭心症、又は脳血管疾患及び急性冠動脈症候群、心筋梗塞等のア
テローム性動脈硬化症の予防又は治療にも有用であり得る。

【0129】

用語「プロタンパク質コンバターゼスブチリシンケキシン９型」又は「ＰＣＳＫ９」は
、配列番号３に規定されるヒトＰＣＳＫ９遺伝子（及び活性ＰＣＳＫ９ポリペプチドをコ
ードするその変異体）等のＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされるポリペプチド又はその
断片、並びに対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、誘導体バリアント、置換バ
リアント、欠失バリアント、及び／又は挿入バリアント（Ｎ末端メチオニンの付加を含む
）、融合ポリペプチド、及び種間相同体が挙げられるがこれらに限定されない関連するポ
リペプチドを指す。ある種の実施形態では、ＰＣＳＫ９ポリペプチドとしては、リーダー
配列残基、標的残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基、及び／又は融
合タンパク質残基等であるがこれらに限定されない末端残基が挙げられる。「ＰＣＳＫ９
」は、ＦＨ３、ＮＡＲＣ１、ＨＣＨＯＬＡ３、プロタンパク質コンバターゼサブチリシン
／ケキシン９型、及び神経アポトーシス調節コンバターゼ１とも呼ばれている。ＰＣＳＫ
９遺伝子は、分泌性サブチラーゼファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属する
プロタンパク質コンバターゼタンパク質をコードする。用語「ＰＣＳＫ９」は、プロタン
パク質及びプロタンパク質の自己触媒後に産生される産物の両方を表す。自己触媒された
産物のみが引用されている場合には、タンパク質は、「成熟」、「切断された」、「プロ
セシングされた」、又は「活性な」ＰＣＳＫ９と呼ぶことができる。非活性形態のみが引
用されている場合には、タンパク質は、ＰＣＳＫ９の「非活性」、「プロ型」、又は「プ
ロセシングを受けていない」形態と呼ぶことができる。本明細書において使用される用語
「ＰＣＳＫ９」は、変異Ｄ３７４Ｙ、Ｓ１２７Ｒ、及びＦ２１６Ｌ等の天然に存在する対
立遺伝子も含む。用語「ＰＣＳＫ９」は、グリコシル化、ＰＥＧ化されたＰＣＳＫ９配列
、そのシグナル配列が切断されたＰＣＳＫ９配列、触媒ドメインからそのプロドメインか
ら切断されているが、触媒ドメインから分離されていないＰＣＳＫ９配列等、ＰＣＳＫ９
アミノ酸配列の翻訳後修飾を取り込んだＰＣＳＫ９分子も包含する。

【0130】

用語「ＰＣＳＫ９活性」は、ＰＣＳＫ９のあらゆる生物学的作用を含む。ある種の実施
形態では、ＰＣＳＫ９活性は、基質若しくは受容体と相互作用するか、又は基質若しくは
受容体に結合するＰＣＳＫ９の能力を含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９活性は
、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）に結合するＰＣＳＫ９の能力によって表される。いくつかの
実施形態では、ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲに結合し、ＬＤＬＲに関与する反応を触媒する。
例えば、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬＲの利用可能性を変化させる（例えば、低下させる）
ＰＣＳＫ９の能力を含む。従って、いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９活性は、被験体
のＬＤＬ量を増加させるＰＣＳＫ９の能力を含む。特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９活性
は、ＬＤＬへの結合に利用可能なＬＤＬＲの量を減少させるＰＣＳＫ９の能力を含む。従
って、ＰＣＳＫ９活性を減少させることによって、表面上にディスプレイされ、被験体の
ＬＤＬを見つけられるＬＤＬＲの量が増加する。いくつかの実施形態では、「ＰＣＳＫ９
活性」は、ＰＣＳＫ９シグナル伝達から生じるあらゆる生物活性を含む。例示的な活性と
しては、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合、ＬＤＬＲ又は他のタンパク質を切断するＰＣＳ
Ｋ９酵素活性、ＰＣＳＫ９作用を促進するＬＤＬＲ以外のタンパク質へのＰＣＳＫ９の結
合、ＡＰＯＢ分泌を変化させるＰＣＳＫ９（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｈｕｍ
ａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４：１１６１－１１６９、及びＯｕｇ
ｕｅｒｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ ｔｈｒｏｍｂ
Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２４：１４４８－１４５３）、肝臓の再生及び神経細胞の分化にお
けるＰＣＳＫ９の役割（Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １００：９２８－９３
３，２００３）及び肝臓のグルコース代謝におけるＰＣＳＫ９の役割（Ｃｏｓｔｅｔ ｅ
ｔ ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（１０）：６２１１－１８）
が挙げられるが、これらに限定されない。

【0131】

用語「有効量」又は「治療有効量」は、有益な又は望ましい生物学的及び／又は臨床結
果を達成するのに十分な量を指す。治療有効量は、メガヌクレアーゼの配合又は組成、治
療される被験体の疾患及びその重症度、年齢、体重、健康状態、並びに反応性に依存して
変化する。特定の実施形態では、有効量の本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼ
又は医薬組成物は、被験体の総コレステロール又はＬＤＬコレステロール（即ち、血清Ｌ
ＤＬ）のレベルを減少させることによって、高コレステロール血症又はその他コレステロ
ール関連障害、及び／又は脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患（ＣＶＤ）
、若しくは冠状動脈性心疾患のうちの少なくとも１つの症状を治療又は防止する。

【0132】

用語「脂質ナノ粒子」は、典型的には、平均直径が１０～１０００ナノメートルの球状
構造を有する脂質組成物を指す。いくつかの配合物では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１
つのカチオン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質及び少なくとも１つの複合脂質
を含むことができる。ｍＲＮＡ等の核酸をカプセル化するのに適した当該技術分野におい
て公知の脂質ナノ粒子は、本発明中での使用が予想される。

【0133】

本明細書で使用する場合、変数の数値範囲の列挙は、本発明が、その範囲内の値のいず
れかに等しい変数で実施されてもよいと伝えることが意図されている。従って、本質的に
離散的な変数の場合、その変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しく
なり得る。同様に、本質的に連続する変数の場合、その変数は、範囲の終点を含む数値範
囲内の任意の実数値と等しくなり得る。限定ではなく例として、０と２の間の値を有する
と記載される変数は、変数が本質的に離散的である場合には、０、１、又は２の値をとる
ことができ、変数が本質的に連続している場合には、０．０、０．１、０．０１、０．０
０１、又は０以上２以下の任意の他の実数値をとることができる。

【0134】

２．１ 本発明の原理
本発明は、部分的に、操作されたメガヌクレアーゼを使用して、ＰＣＳＫ９の発現を減
少させ、それにより血液から脂肪及び／又はコレステロールの除去を増加させることがで
きるという仮説に基づく。ＰＣＳＫ９の発現減少により、細胞表面上のＬＤＬ受容体のデ
ィスプレイが増加し、それにより血流からの脂質の除去を増加させることができる。従っ
て、ＰＣＳＫ９遺伝子の認識配列に特異的な操作されたメガヌクレアーゼを送達すること
によって、ＰＣＳＫ９発現を減少させることができ、これによって後に被験体の血中の総
コレステロール（例えば、血中ＬＤＬ）を減少させることができる。従って、本明細書に
開示の方法及び組成物は、適切に制御されたＰＣＳＫ９発現レベルと比べて、ＰＣＳＫ９
の発現が増加したことによって引き起こされるコレステロール関連障害の治療に特定の用
途を見出す。

【0135】

従って、本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子内の認識配列を認識し切断する操作されたメガヌ
クレアーゼを包含する。本発明は、医薬組成物中、及びコレステロール関連障害、例えば
、高コレステロール血症を治療する方法においてそのような操作されたメガヌクレアーゼ
を使用する方法も包含する。更に、本発明は、操作されたメガヌクレアーゼタンパク質、
又は操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む医薬組成物と、コレステロール
関連障害、例えば、高コレステロール血症の治療のためのそのような組成物の使用とを包
含する。

【0136】

２．２ ＰＣＳＫ９遺伝子内の認識配列を認識し切断するためのメガヌクレアーゼ
部位特異的ヌクレアーゼは、ＰＣＳＫ９遺伝子に切断を導入するために使用でき、その
ような切断の修復により、活性なＰＣＳＫ９遺伝子が発現しないようにＮＨＥＪを介して
遺伝子を永久的に改変することができる。従って、一実施形態では、本発明は、操作され
た組換えメガヌクレアーゼを用いて実施することができる。

【0137】

好ましい実施形態では、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは一本鎖メガ
ヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって接合された
Ｎ末端サブユニット及びＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインの各々は、認識配列
の半分（即ち、認識ハーフサイト）を認識し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニット
の界面付近の認識配列の中央にある。ＤＮＡ鎖切断は、メガヌクレアーゼによるＤＮＡ切
断が４塩基対の３’一本鎖オーバーハングの対を生成するように、４塩基対によって相殺
される。

【0138】

いくつかの例では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、ＰＣＳ７－８認識配列（
配列番号４）を認識して切断するように操作されている。ＰＣＳ７－８認識配列は、配列
番号３に規定されるＰＣＳＫ９遺伝子の中に位置する。このような操作されたメガヌクレ
アーゼは、本明細書では集合的に「ＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的
なＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼは、配列番号６～１４に提供される。

【0139】

本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含む第１の
サブユニットと、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む第２のサブユニットとを含む。更
に、第１のサブユニットは、認識配列の第１の認識ハーフサイト（例えば、ＰＣＳ７ハー
フサイト）に結合し、第２のサブユニットは、認識配列の第２の認識ハーフサイト（例え
ば、ＰＣＳ７ハーフサイト）に結合する。操作されたメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌク
レアーゼである実施形態では、ＨＶＲ１領域を含み、第１のハーフサイトに結合する第１
のサブユニットがＮ末端サブユニットとして位置し、ＨＶＲ２領域を含み、第２のハーフ
サイトに結合する第２のサブユニットがＣ末端サブユニットとして位置するように第１の
サブユニット及び第２のサブユニットを配向できる。代替的実施形態では、ＨＶＲ１領域
を含み、第１のハーフサイトに結合する第１のサブユニットがＣ末端サブユニットとして
位置し、ＨＶＲ２領域を含み、第２のハーフサイトに結合する第２のサブユニットがＮ末
端サブユニットとして位置するように第１のサブユニット及び第２のサブユニットを配向
できる。本発明の例示的なＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼを表１に示す。

【0140】

表１．ＰＣＳ７－８認識配列（配列番号４）を認識して切断するように操作された例示的
な操作されたメガヌクレアーゼ

【表1】

【0141】

^＊「ＰＣＳ７サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼのＰＣＳ７結合サブユニット領
域とＰＣＳ７－８Ｌ．１９７メガヌクレアーゼのＰＣＳ７結合サブユニット領域とのアミ
ノ酸配列同一性を表し、「ＰＣＳ８サブユニット％」とは、各メガヌクレアーゼのＰＣＳ
８結合サブユニット領域とＰＣＳ７－８Ｌ．１９７メガヌクレアーゼのＰＣＳ８結合サブ
ユニット領域とのアミノ酸配列同一性を表す。

【0142】

２．３ エンドヌクレアーゼの送達及び発現方法
被験体の高コレステロール血症及び心血管疾患を治療する方法が本明細書に開示される
。同様に、薬学的に許容される担体及び本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼ（
又は操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸）を含む医薬組成物を投与することを
含む、被験体の高コレステロール血症及び心血管疾患の症状を低減させる方法が提供され
る。本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼを被験体の標的細胞に送達することを
含む、被験体のＰＣＳＫ９の発現及び／又は活性を減少させる方法もまた提供される。本
発明の方法において、本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼは、標的細胞内のＤ
ＮＡ／ＲＮＡに送達され、且つ／又はそこから発現され得る。

【0143】

本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、又は好ましく
は操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸として細胞内に送達される。このような
核酸はＤＮＡ（例えば、環状若しくは線状プラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物）又はＲＮＡ
（例えば、ｍＲＮＡ）であってよい。操作されたメガヌクレアーゼコード配列がＤＮＡの
形で送達される実施形態の場合、ヌクレアーゼ遺伝子の転写を促すためにプロモーターに
作動可能に連結されるべきである。本発明に適した哺乳動物プロモーターとしては、構成
型プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモーター（Ｔｈｏｍ
ｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．
８１（３）：６５９－６３）又はＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ
Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ ２９０（５８０４）：３０４－１０）並び
に誘導性プロモーター、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｄｉｎｇｅｒｍ
ａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（９）：４０３
８－４５）が挙げられる。本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、合成プロモーターに
も作動可能に連結され得る。合成プロモーターとしては、ＪｅＴプロモーター（国際公開
第２００２／０１２５１４号）を挙げることができるが、これに限定されない。特定の実
施形態では、本明細書で開示される操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列は
、肝臓特異的プロモーター又は肝実質細胞特異的プロモーターに作動可能に連結され得る
。肝臓特異的プロモーターの例としては、限定されないが、ヒトα－１抗トリプシンプロ
モーター、ハイブリッド肝臓特異的プロモーター（ＡｐｏＥ遺伝子の肝臓遺伝子座制御領
域（ＡｐｏＥ－ＨＣＲ）及び肝臓特異的α１－抗トリプシンプロモーター）、ヒトチロキ
シン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター及びアポリポタンパク質Ａ－ＩＩプロモータ
ーが挙げられる。

【0144】

特定の実施形態では、少なくとも１つの操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸
配列は組換えＤＮＡ構築物又は発現カセットに送達される。例えば、組換えＤＮＡ構築物
は、プロモーターと、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配
列とを含む発現カセット（即ち、「カセット」）を含むことができる。他の実施形態では
、組換えＤＮＡ構築物は、２以上のカセットを含み、各カセットは、プロモーターと本明
細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含む。特定の実施形
態では、組換えＤＮＡ構築物は、２つのカセット、３つのカセット、４つのカセット、又
はそれ以上を含むことができる。

【0145】

他の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、プロモーターと多シストロン性核酸配列と
を含むカセットを含み、プロモーターは、多シストロン性核酸配列の発現を駆動し、標的
細胞に本明細書に記載の多シストロン性ｍＲＮＡを産生する。

【0146】

いくつかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは細胞に
送達されるが、これは、このことにより操作されたメガヌクレアーゼをコードする遺伝子
が細胞のゲノムに組み込まれる可能性が低下するためである。操作されたメガヌクレアー
ゼをコードするそのようなｍＲＮＡは、インビトロ転写等の当該技術分野で公知の方法を
用いて産生することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、７－メチルグアノ
シン、ＡＲＣＡ、ＣｌｅａｎＣａｐを使用してキャッピングされるか、又はＶａｃｃｉｎ
ｉａキャッピング酵素等を使用して酵素的にキャッピングされる。いくつかの実施形態で
は、ｍＲＮＡはポリアデニル化されていてもよい。ｍＲＮＡは、コードされた操作された
メガヌクレアーゼの発現を促し、且つ／又はｍＲＮＡ自体の安定性を高めるために、様々
な５’及び３’非翻訳配列要素を含んでいてもよい。ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、５
－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルウリジン、又は２－チオウリジ
ン等のヌクレオシド類似体を含んでいてもよい。

【0147】

特定の実施形態では、本発明の操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、細胞
内で同時に発現される２以上のヌクレアーゼをコードする多シストロン性ｍＲＮＡであっ
てよい。いくつかの実施形態では、多シストロン性ｍＲＮＡは、本明細書に記載の２以上
のメガヌクレアーゼと、細胞において治療的に有益な効果をもたらす少なくとも１種の更
なるタンパク質とをコードできる。本発明の多シストロン性ｍＲＮＡは、ＩＲＥＳエレメ
ント、Ｔ２Ａエレメント、Ｐ２Ａエレメント、Ｅ２Ａエレメント、及びＦ２Ａエレメント
が挙げられるがこれらに限定されない、同じｍＲＮＡ分子から２以上の遺伝子の翻訳を可
能にする当該技術分野において公知の任意のエレメントを含むことができる。特定の実施
形態では、多シストロン性ｍＲＮＡは、本明細書に記載の２つのメガヌクレアーゼをコー
ドするバイシストロン性ｍＲＮＡ、本明細書に記載の３つのメガヌクレアーゼをコードす
るトリシストロン性ｍＲＮＡである。

【0148】

別の特定の実施形態では、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、一本鎖Ｄ
ＮＡ鋳型として標的細胞に送達され得る。一本鎖ＤＮＡは、操作されたメガヌクレアーゼ
をコードする配列の上流及び／又は下流に５’及び／又は３’ＡＡＶ逆方向末端反復（Ｉ
ＴＲ）を更に含むことができる。他の実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、操作されたメガヌ
クレアーゼをコードする配列の上流及び／又は下流に５’及び／又は３’相同性アームを
更に含むことができる。

【0149】

別の特定の実施形態では、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、線状Ｄ
ＮＡ鋳型として標的細胞に送達され得る。いくつかの例において、エンドヌクレアーゼを
コードするプラスミドＤＮＡは、標的細胞への送達前に環状プラスミドＤＮＡが線状にな
るように、１又は複数の制限酵素により消化され得る。

【0150】

精製されたヌクレアーゼタンパク質を細胞に送達して、本明細書で以下に更に詳述する
ものを含む、当該技術分野で公知の様々な異なるメカニズムによってゲノムＤＮＡを切断
することができる。

【0151】

本発明の操作されたメガヌクレアーゼの送達のための標的組織としては、限定されない
が、肝実質細胞、又は好ましくは初代肝実質細胞、より好ましくはヒト肝実質細胞又はヒ
ト初代肝実質細胞、ＨｅｐＧ２．２．１５又はＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ細胞等の肝臓の細
胞が挙げられる。特定の実施形態では、細胞は霊長類初代肝実質細胞等の霊長類肝実質細
胞の細胞である。説明したように、本発明のメガヌクレアーゼは、精製タンパク質として
、又はメガヌクレアーゼをコードするＲＮＡ若しくはＤＮＡとして送達することができる
。一実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードする
ｍＲＮＡ若しくはＤＮＡベクターは、標的組織への直接の注射を介して標的細胞（例えば
、肝臓の細胞）に供給される。あるいは、メガヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ、又は
ＤＮＡは、循環系を介して全身に送達することができる。

【0152】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコ
ードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、公知の技術に従って薬学的に許容される担体中において、
全身投与するために、又は標的組織に投与するために製剤化される。例えば、Ｒｅｍｉｎ
ｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃ
ｙ（２１ｓｔ ｅｄ．２００５）を参照のこと。本発明による医薬製剤の製造において、
タンパク質／ＲＮＡ／ｍＲＮＡは典型的には薬学的に許容される担体と混合される。担体
は、当然ながら、製剤中の他の成分と適合性があるという意味で許容されなければならず
、また患者に有害であってはならない。担体は、固体、液体、又はその両方であってよく
、１回用量製剤として化合物と共に製剤化されてもよい。

【0153】

いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、膜透過性ペプチド又は標的リガンドに結合し、細胞取り込み
を促す。当該技術分野で公知の膜透過性ペプチドの例としては、ポリアルギニン（Ｊｅａ
ｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：
１６２４－９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚ ｅｔ ａｌ．（
２００５）、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９－７３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎ
ｉ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７
－２７２４）、Ｐｅｐ－１（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ４３：７６９８－７７０６、及びＨＳＶ－１ ＶＰ－２２（Ｄｅｓｈａ
ｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１８
３９－４９）が挙げられる。代替的実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメ
ガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、メガヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ
／ｍＲＮＡが標的細胞に結合し、且つ標的細胞によって内在化されるように、標的細胞上
に発現される特異的細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合又は非共有結合する。ある
いは、メガヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、このような細胞表面受容体の
天然リガンド（又は天然リガンドの一部）に共有結合又は非共有結合することができる（
ＭｃＣａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）
：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４－７４；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｃ
ｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５ （３）：２２０－３０； Ｑｉａｎ
ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘ
ｉｃｏｌ．１０（１１）：１４９１－５０８）。

【0154】

いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、肝臓の所望の領域内に注射又は移植するための生分解性ヒド
ロゲル内にカプセル化される。ヒドロゲルは、頻繁な注射を必要とすることなく、標的組
織の所望の領域に治療ペイロードの持続的かつ調整可能な放出を提供することができ、刺
激応答性材料（例えば温度応答性ヒドロゲル及びｐＨ応答性ヒドロゲル）は、環境的又は
外因的に加えられる合図に応答してペイロードを放出するように設計することができる（
Ｋａｎｇ Ｄｅｒｗｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｔｒａｎｓ Ａｍ Ｏｐｈｔｈ
ａｌｍｏｌ Ｓｏｃ．１０６：２０６－２１４）。

【0155】

いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、当該技術分野で公知の方法を用いて、ナノ粒子に共有結合す
る、好ましくは非共有結合するか、又はそのようなナノ粒子内にカプセル化される（Ｓｈ
ａｒｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４：３２
７９５０）。ナノ粒子は、その長さスケールが１μｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満で
あるナノスケール送達システムである。そのようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、
又は生体高分子から構成されるコアを用いて設計されてもよく、メガヌクレアーゼタンパ
ク質、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡの複数のコピーをナノ粒子コアに結合させるか又はカプセル
化することができる。これは、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピ
ー数を増加させ、したがって各メガヌクレアーゼの細胞内発現を増加させて、標的認識配
列が切断される可能性を最大にする。このようなナノ粒子の表面にポリマー又は脂質（例
えば、キトサン、カチオン性ポリマー、又はカチオン性脂質）を更に修飾して、表面が追
加の官能性を付与するコアシェルナノ粒子を形成し、細胞送達及びペイロードの取り込み
を増強してもよい（Ｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ
３３（３０）：７６２１－３０）。有利には、ナノ粒子を標的分子に更に結合させて、ナ
ノ粒子を適切な細胞型に導き、且つ／又は細胞取り込みの可能性を高めてもよい。そのよ
うな標的分子の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体、及び細胞表面受容体の天然
リガンド（又は天然リガンドの一部）が挙げられる。

【0156】

いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、カチオン性脂質を用いてリポソーム内にカプセル化又は複合
化される（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥトランスフェクション試薬、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｚｕｒｉｓ ｅｔ
ａｌ．（２０１５），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３－８０；Ｍｉｓｈｒａ
ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参
照）。リポソーム及びリポプレックス製剤は、ペイロードを分解から保護し、標的部位で
の蓄積及び保持を促進し、標的細胞の細胞膜との融合及び／又は破壊により細胞の取り込
み及び送達効率を促進することができる。

【0157】

いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー足場（例えば、ＰＬＧＡ）内にカプセル化されるか
、又はカチオン性ポリマー（例えばＰＥＩ、ＰＬＬ）を用いて複合化される（Ｔａｍｂｏ
ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３－５３６）
。ポリマー担体は、ポリマー侵食及び薬物拡散の制御によって調整可能な薬物放出速度を
提供するように設計することができ、高効率の薬物カプセル化によって、所望の標的細胞
集団への細胞内送達まで治療ペイロードの保護を提供することができる。

【0158】

いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又は操作されたメガヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わさ
れる（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９（１１）：９５
６－６６）。ポリマーミセルは、親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で
形成されたミセルシェルを含んでもよく、親水性ポリマーは、凝集を防止し、電荷相互作
用をマスクし、非特異的相互作用を減少させることができる。

【0159】

いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞への投与及び／又は送達のために、エマルジョン又
はナノエマルジョン（即ち、平均粒子直径１ｎｍ未満）に製剤化される。用語「エマルジ
ョン」は、限定すされないが、水中油型、油中水型、水中油中水型、又は油中水中油型の
分散液又は液滴を指し、水不混和相が水相と混合されると、無極性残基（例えば、長い炭
化水素鎖）を水から離れるように移動させ、極性頭部基を水に向かって移動させる疎水力
の結果として形成することができる脂質構造体を指す。これらの他の脂質構造体としては
、単層、少数層（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ）、及び多重層脂質小胞体、ミセル、並び
にラメラ相が挙げられるが、これらに限定されない。エマルジョンは、水相及び親油相（
典型的には油及び有機溶媒を含有する）から構成される。エマルジョンはまた、１種又は
複数種の界面活性剤を含有することが多い。ナノエマルジョン製剤は、例えば、米国特許
出願第２００２／００４５６６７号及び第２００４／００４３０４１号、並びに米国特許
第６，０１５，８３２号、第６，５０６，８０３号、第６，６３５，６７６号、及び第６
，５５９，１８９号に記載されているように周知であり、これらの各々は参照によりその
全体が本明細書に組み込まれる。

【0160】

いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多官能性ポリマー複合体、ＤＮＡデンドリマー、及びポリマ
ーデンドリマーに共有結合しているか、又は非共有結合している（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓ
ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｎａｎｏｓｃａｌｅ ７（９）：３８４５－５６；Ｃｈｅ
ｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（１）：１２３－４３
）。デンドリマー生成は、ペイロードの容量及びサイズを制御することができ、高い薬物
ペイロード容量を提供することができる。更に、複数の表面基のディスプレイを利用して
、安定性を改善し、非特異的相互作用を低減し、細胞特異的標的化及び薬物放出を増強す
ることができる。

【0161】

いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼをコードする遺伝子は、ウイルスベクター
を用いて送達される。そのようなベクターは、当該技術分野で公知であり、レトロウイル
スベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイル
ス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる（Ｖａｎｎｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｎ
ｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２に概説されている）。いくつかの実施形態で
は、ウイルスベクターは標的組織（例えば肝組織）に直接注射される。代替的実施形態で
は、ウイルスベクターは、循環系を介して全身に送達される。当該技術分野では、異なる
ＡＡＶベクターが異なる組織に局在する傾向があることが知られている。肝標的組織では
、肝実質細胞の効果的な形質導入が、例えばＡＡＶ血清型２、８、及び９で示されている
（Ｓａｎｄｓ（２０１１），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ８０７：１４１－１５
７；国際出願公開第２００３／０５２０５１号公報）。ＡＡＶベクターはまた、宿主細胞
において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙ
ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：１２４８－５４）。

【0162】

一実施形態では、エンドヌクレアーゼ遺伝子送達に使用されるウイルスベクターは、自
己制限ウイルスベクターである。自己制限ウイルスベクターは、ベクター内の操作された
メガヌクレアーゼの認識配列の存在故に、細胞又は生物において持続時間が制限され得る
。従って、自己制限ウイルスベクターを操作して、プロモーター、本明細書に記載のエン
ドヌクレアーゼ、及びＩＴＲ内のエンドヌクレアーゼ認識部位のコードを提供することが
できる。自己制限ウイルスベクターは、エンドヌクレアーゼ遺伝子を細胞、組織、又は生
物に送達することで、エンドヌクレアーゼが発現され、ゲノム内の内因性認識配列で細胞
のゲノムを切断することができるようにする。送達されたエンドヌクレアーゼはまた、自
己制限ウイルスベクター自体の中にその標的部位を見出し、この標的部位でベクターを切
断する。切断されると、ウイルスゲノムの５’及び３’末端は、エキソヌクレアーゼによ
って曝露されて分解され、それによりウイルスを殺し、エンドヌクレアーゼの産生を停止
する。

【0163】

エンドヌクレアーゼ遺伝子がＤＮＡ形態（例えばプラスミド）で、且つ／又はウイルス
ベクター（例えばＡＡＶ）を介して送達される場合、それらはプロモーターに作動可能に
連結されてよい。いくつかの実施形態では、これは、ウイルスベクター（例えば、レンチ
ウイルスベクターのＬＴＲ）又は周知のサイトメガロウイルス初期プロモーター若しくは
ＳＶ４０ウイルス初期プロモーター由来の内因性プロモーター等のウイルスプロモーター
であってもよい。好ましい実施形態では、メガヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞において
遺伝子発現を優先的に駆動するプロモーターに作動可能に連結される。肝臓特異的プロモ
ーターの例としては、限定されないが、ヒトα－１抗トリプシンプロモーター、ハイブリ
ッド肝臓特異的プロモーター（ＡｐｏＥ遺伝子の肝臓遺伝子座制御領域（ＡｐｏＥ－ＨＣ
Ｒ）及び肝臓特異的α１－抗トリプシンプロモーター）、ヒトチロキシン結合グロブリン
（ＴＢＧ）プロモーター及びアポリポタンパク質Ａ－ＩＩプロモーターが挙げられる。

【0164】

特定の実施形態では、ウイルスベクターは、プロモーターと本明細書に記載の操作され
たメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。ウイルスベクターは
２以上のカセットを含むこともでき、各カセットは、プロモーターと本明細書に記載の操
作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ウ
イルスベクターは、プロモーターと多シストロン性核酸配列とを含む１つのカセットを含
み、プロモーターは、多シストロン性核酸配列の発現を駆動し、標的細胞に本明細書に記
載の多シストロン性ｍＲＮＡ、例えば、操作されたメガヌクレアーゼをコードする多シス
トロン性ｍＲＮＡを産生する。

【0165】

コレステロール関連障害、例えば、常染色体優性ＦＨを含む高コレステロール血症を有
する被験体の肝臓に本明細書に開示のメガヌクレアーゼを送達する方法及び組成物が提供
される。一実施形態では、哺乳動物から取り出された天然肝実質細胞は、操作されたメガ
ヌクレアーゼをコードするベクターを用いて形質導入され得る。あるいは、被験体の天然
肝実質細胞は、操作されたメガヌクレアーゼ及び／又は肝再生を刺激する分子、例えば肝
臓毒素をコードするアデノウイルスベクターを用いてエクスビボで形質導入され得る。好
ましくは、肝臓毒素はｕＰＡであり、ウイルスベクターにより発現されると肝実質細胞か
らの分泌を阻害するように改変されている。別の実施形態では、ベクターは、肝実質細胞
再生を新たに刺激することができるｔＰＡをコードする。次いで、哺乳動物から取り出さ
れた形質導入肝実質細胞を哺乳動物に戻すことができ、操作されたメガヌクレアーゼの発
現を促す条件が提供される。典型的には、形質導入肝実質細胞は、脾臓又は門脈系を通し
て注入することによって患者に戻すことができ、投与は１～５日間又はそれ以上の期間に
わたって単回又は複数回であってよい。

【0166】

本発明の方法のインビボ態様では、操作されたメガヌクレアーゼをコードし、被験体に
投与されるレトロウイルス、偽型又はアデノウイルス関連ベクターが構築される。操作さ
れたメガヌクレアーゼをコードするベクターの投与は、分泌障害肝臓毒素をコードする、
又は肝臓毒素として作用することなく肝実質細胞の再生を刺激するｔＰＡをコードするア
デノウイルスベクターの投与を用いて行うことができる。

【0167】

適切な用量は、他の要因の中でも、使用するリポソーム製剤、選択した任意のＡＡＶベ
クターの特異性（例えば、血清型等）、投与経路、治療される被験体（即ち、被験体の年
齢、体重、性別、及び全身状態）、及び投与方法に依存する。従って、適切な用量は患者
ごとに異なっていてもよい。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。投薬
治療は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであってよい。更に、被験体
は、必要に応じて何回投与されてもよい。当業者は、適切な投薬回数を容易に決定するこ
とができる。代替的な投与経路を考慮するか、又は治療的利益と副作用とのバランスをと
るために、用量は調整する必要がある場合がある。

【0168】

本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼ、又は本明細書に開示の操作されたメガ
ヌクレアーゼをコードする核酸の被験体への送達は、コレステロール関連障害、例えば、
常染色体優性ＦＨを含む高コレステロール血症を治療するか、又はその重症度を低下させ
ることができる。特定の実施形態では、本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼ、
又は操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸の被験体への送達は、コレステロール
関連障害、例えば、常染色体優性ＦＨを含む高コレステロール血症の少なくとも１つの症
状を低減することができる。いくつかの実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼ、又
は操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸は、有効量で被験体に送達される。本明
細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼ、又は本明細書に開示の操作されたメガヌクレ
アーゼをコードする核酸が送達される被験体は、任意の哺乳動物であってよい。特定の実
施形態では、被験体は、馴化動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊
長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、
マウス及びラット）である。ある種の実施形態では、被験体は、非ヒト霊長類又はヒトで
ある。いくつかの実施形態では、被験体はコレステロール関連障害を有する。例えば、被
験体は、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、又は常染色体優性家族性
高コレステロール血症を有していてもよい。特定の実施形態では、被験体は、１７０ｍｇ
／ｄＬ又は２００ｍｇ／ｄＬ超、例えば、１７０～２００ｍｇ／ｄＬ、又は２００～２５
０ｍｇ／ｄＬ、２００～３００ｍｇ／ｄＬ、２００～３５０ｍｇ／ｄＬ、２００～４００
ｍｇ／ｄＬ、２００～４５０ｍｇ／ｄＬ、２００～５００ｍｇ／ｄＬ、又は２００～６０
０ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベルを有する。いくつかの実施形態では、被験体は、
１１０ｍｇ／ｄＬ又は１３０ｍｇ／ｄＬ超、例えば、１１０～１２０ｍｇ／ｄＬ、１１０
～１３０ｍｇ／ｄＬ、１３０～１５０ｍｇ／ｄＬ、１３０～１８０ｍｇ／ｄＬ、１３０～
２００ｍｇ／ｄＬ、１３０～２５０ｍｇ／ｄＬ、１３０～３００ｍｇ／ｄＬ、１３０～３
５０ｍｇ／ｄＬ、１３０～４００ｍｇ／ｄＬ、１３０～４５０ｍｇ／ｄＬ、１３０～５０
０ｍｇ／ｄＬ、又は１３０～６００ｍｇ／ｄＬのＬＤＬコレステロールレベルを有する。

【0169】

特定の実施形態では、本明細書に開示のメガヌクレアーゼ、又は本明細書に開示の操作
されたメガヌクレアーゼをコードする核酸の被験体への送達は、ＰＣＳＫ９の発現を減少
させ、且つ／又はＰＣＳＫ９活性を減少させることができる。例えば、ＰＣＳＫ９の発現
又は活性は、対照細胞又はベースラインＰＣＳＫ９活性と比較した場合、少なくとも約５
％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５
％、又は最高１００％減少され得る。いくつかの態様では、ＰＣＳＫ９の発現及び／又は
活性は、対照細胞又はベースラインＰＣＳＫ９活性と比較した場合、約５～１０％、５～
２０％、１０～３０％、２０～４０％、３０～５０％、４０～６０％、５０～７０％、６
０～８０％、７０～９０％、又は８０～１００％減少され得る。ＰＣＳＫ９活性は、本明
細書の他の箇所で開示されているように、当該技術分野で公知の任意の手段によって測定
することができる。本明細書で使用する場合、対照細胞は、医薬組成物、操作されたメガ
ヌクレアーゼ、又は本明細書で開示される操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸
の送達前の被験体由来の細胞等の任意の適切な対照であり得る。特定の実施形態では、対
照細胞は、医薬組成物、操作されたメガヌクレアーゼ、又は本明細書で開示される操作さ
れたメガヌクレアーゼをコードする核酸が送達されていない被験体の肝臓細胞又は初代肝
実質細胞である。本明細書で使用する場合、被験体の「ベースライン」レベル（例えば、
ＰＣＳＫ９発現若しくは活性又は総コレステロールレベル若しくはＬＤＬコレステロール
レベルのベースラインレベル等）は、本明細書に記載の医薬組成物を個体に投与する前の
レベルを指す。ある種の実施形態では、ベースラインは、本明細書に記載の医薬組成物の
投与前に得られた２以上の測定値の平均（ｍｅａｎ）又は平均（ａｖｅｒａｇｅ）であっ
てよい。

【0170】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のメガヌクレアーゼ、又は本明細書に開示さ
れ操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸の被験体の標的細胞への送達は、細胞表
面上のＬＤＬ受容体のディスプレイを増加させるか、又はＬＤＬ受容体のレベルを増加さ
せることができる。ＬＤＬ受容体のレベルは、被験体の肝臓におけるＬＤＬ受容体又はア
ポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）受容体のレベルを測定する等、当該技術分野で公知の方
法によって測定することができる。例えば、ＬＤＬ受容体のディスプレイ又はレベルは、
対照細胞又は細胞表面上のＬＤＬ受容体のベースラインレベルと比較した場合、本明細書
に開示のメガヌクレアーゼ、又は本明細書に開示の操作されたメガヌクレアーゼをコード
する核酸を、標的細胞に送達した後に少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０
％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２５０％
、５００％、１０００％、又はそれ以上増加し得る。

【0171】

本明細書に開示の医薬組成物、操作されたメガヌクレアーゼ、又は操作されたメガヌク
レアーゼをコードする核酸の被験体の標的細胞への送達は、送達前の被験体の総コレステ
ロールレベルと比較した場合、被験体の総コレステロールレベルを減少させ得る。例えば
、総コレステロールレベルは、治療前の被験者と比較した場合、少なくとも約５％、１０
％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は
最高１００％減少させることができる。特定の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成
物を送達された被験体の総コレステロールレベルは、最終投薬後から少なくとも２週間、
少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、又は３ヶ月間、医薬組成物送達前の総コレス
テロールレベルと比較して減少を維持する。

【0172】

特定の実施形態では、総コレステロールレベルは、本明細書に開示の医薬組成物を被験
体に送達する前のコレステロールレベルと比較した場合、約５ｍｇ／ｄＬ、１０ｍｇ／ｄ
Ｌ、１５ｍｇ／ｄＬ、２０ｍｇ／ｄＬ、２５ｍｇ／ｄＬ、３０ｍｇ／ｄＬ、４０ｍｇ／ｄ
Ｌ、５０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、８０ｍｇ／ｄＬ、９０ｍｇ／ｄ
Ｌ、１００ｍｇ／ｄＬ、１１０ｍｇ／ｄＬ、５～１５ｍｇ／ｄＬ、１０～２０ｍｇ／ｄＬ
、１０～３０ｍｇ／ｄＬ、１５～３０ｍｇ／ｄＬ、２０～３０ｍｇ／ｄＬ、２５～３５ｍ
ｇ／ｄＬ、２５～４０ｍｇ／ｄＬ、２５～５０ｍｇ／ｄＬ、４０～６０ｍｇ／ｄＬ、５０
～７０ｍｇ／ｄＬ、６０～８０ｍｇ／ｄＬ、７０～１００ｍｇ／ｄＬ、又はそれ以上減少
する。特定の実施形態では、被験体は、１４０ｍｇ／ｄＬ、１５０ｍｇ／ｄＬ、１６０ｍ
ｇ／ｄＬ、１７０ｍｇ／ｄＬ、１７５ｍｇ／ｄＬ、１８０ｍｇ／ｄＬ、１８５ｍｇ／ｄＬ
、１９０ｍｇ／ｄＬ、１９５ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、２０５ｍｇ／ｄＬ、２１０
ｍｇ／ｄＬ、２１５ｍｇ／ｄＬ、２２０ｍｇ／ｄＬ、２２５ｍｇ／ｄＬ、２３０ｍｇ／ｄ
Ｌ、２３５ｍｇ／ｄＬ、２４０ｍｇ／ｄＬ、２５０ｍｇ／ｄＬ、２６０ｍｇ／ｄＬ、２７
０ｍｇ／ｄＬ、２８０ｍｇ／ｄＬ、２９０ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、又はそれ以上
のベースライン総コレステロールレベルを有する。いくつかの実施形態では、総コレステ
ロールレベルは、血清コレステロールレベル又は全身コレステロールレベルである。

【0173】

本明細書に開示の医薬組成物、操作されたメガヌクレアーゼ、又は操作されたメガヌク
レアーゼをコードする核酸の被験体の標的細胞への送達は、送達前の被験体のＬＤＬコレ
ステロールレベルと比較した場合、被験体のＬＤＬコレステロールレベルを減少させるこ
とができる。例えば、ＬＤＬコレステロールレベルは、治療前の被験体と比較した場合、
少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％
、９０％、９５％、又は最高１００％減少され得る。特定の実施形態では、本明細書に開
示の医薬組成物を送達された被験体のＬＤＬコレステロールレベルは、最終投薬後から少
なくとも２週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、又は３ヶ月間、医薬組成物
送達前の総コレステロールレベルと比較して減少を維持する。

【0174】

特定の実施形態では、ＬＤＬコレステロールレベルは、本明細書に開示の医薬組成物を
被験体に送達する前のＬＤＬコレステロールレベルと比較した場合、約５ｍｇ／ｄＬ、１
０ｍｇ／ｄＬ、１５ｍｇ／ｄＬ、２０ｍｇ／ｄＬ、２５ｍｇ／ｄＬ、３０ｍｇ／ｄＬ、４
０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、８０ｍｇ／ｄＬ、９
０ｍｇ／ｄＬ、５～１５ｍｇ／ｄＬ、１０～２０ｍｇ／ｄＬ、１０～３０ｍｇ／ｄＬ、１
５～３０ｍｇ／ｄＬ、２０～３０ｍｇ／ｄＬ、２５～３５ｍｇ／ｄＬ、２５～４０ｍｇ／
ｄＬ、２５～５０ｍｇ／ｄＬ、４０～６０ｍｇ／ｄＬ、５０～７０ｍｇ／ｄＬ、６０～８
０ｍｇ／ｄＬ、７０～１００ｍｇ／ｄＬ、又はそれ以上減少する。特定の実施形態では、
被験体は、１００ｍｇ／ｄＬ、１１０ｍｇ／ｄＬ、１１５ｍｇ／ｄＬ、１２０ｍｇ／ｄＬ
、１２５ｍｇ／ｄＬ、１３０ｍｇ／ｄＬ、１３５ｍｇ／ｄＬ、１４０ｍｇ／ｄＬ、１４５
ｍｇ／ｄＬ、１５０ｍｇ／ｄＬ、１５５ｍｇ／ｄＬ、１６０ｍｇ／ｄＬ、１６５ｍｇ／ｄ
Ｌ、１７０ｍｇ／ｄＬ、１７５ｍｇ／ｄＬ、１８０ｍｇ／ｄＬ、１８５ｍｇ／ｄＬ、１９
０ｍｇ／ｄＬ、１９５ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、又はそれ以上のベースラインＬＤ
Ｌコレステロールレベルを有する。いくつかの実施形態では、ＬＤＬコレステロールレベ
ルは、血清ＬＤＬコレステロールレベル又は全身ＬＤＬコレステロールレベルである。

【0175】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、本明細書に開示の医薬
組成物を被験体に送達する前のアテローム斑の初期サイズと比較した場合、被験体のアテ
ローム斑のサイズを少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９
％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９
％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９
％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９
％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９
％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９
％、又は６０％、又は更に多く減少させるのに有効であり得る。アテローム斑のサイズは
、約１９％～２４％、１４％～２９％、１２％～３５％、１０～４０％、８％～４５％、
５％～５０％、２％～６０％、又は１％～７０％減少され得る。

【0176】

２．４ 医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体と本発明の操作されたメ
ガヌクレアーゼ、又は薬学的に許容される担体と本発明の操作されたメガヌクレアーゼを
コードする核酸を含むポリヌクレオチドとを含む、医薬組成物を提供する。他の実施形態
では、本発明は、薬学的に許容される担体と、標的組織に送達することができ、本明細書
に開示の操作されたメガヌクレアーゼを発現する、本発明の細胞とを含む医薬組成物を提
供する。本発明の医薬組成物は、心血管疾患、及び常染色体優性ＦＨを含む高コレステロ
ール血症を有する被験体の治療、又はＰＣＳＫ９の発現及び／若しくは活性の減少に有用
であり得る。

【0177】

そのような医薬組成物は、公知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍ
ｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍ
ａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．２００５）を参照のこと。本発明による医薬製剤の製造におい
て、メガヌクレアーゼポリペプチド（又はそれをコードするＤＮＡ／ＲＮＡ）は、典型的
には、薬学的に許容される担体と混合され、得られた組成物が被験体に投与される。担体
は、当然ながら、製剤中の他の成分と適合性があるという意味で許容されなければならず
、また被験体に有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物
は、被験体における疾患の治療に有用な１種又は複数種の追加の薬剤又は生物学的分子を
更に含むことができる。同様に、追加の薬剤及び／又は生物学的分子は、別個の組成物と
して同時投与することができる。

【0178】

本発明の特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書の別の箇所に記載されている、
脂質ナノ粒子内にカプセル化された本明細書に記載の１又は複数のｍＲＮＡを含むことが
できる。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の１又は複数の多シスト
ロン性ｍＲＮＡを含むことができ、各多シストロン性ｍＲＮＡは、２以上の本発明の操作
されたメガヌクレアーゼをコードする。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書
に記載の２つ、３つ、又は４つの操作されたメガヌクレアーゼをコードする多シストロン
性ｍＲＮＡを含むことができる。他の特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に
記載の２以上の多シストロン性ｍＲＮＡを含むことができ、その各々は、２以上の本発明
の操作されたメガヌクレアーゼをコードする。

【0179】

本発明中で使用するために考えられる脂質ナノ粒子の一部は、少なくとも１つのカチオ
ン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、及び少なくとも１つの複合脂質を含む。
更なる特定の例では、脂質ナノ粒子は、約４０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％のカチオン性脂
質、約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、及び約０．５ｍｏｌ％～
約１０ｍｏｌ％の脂質複合体を含むことができ、非ラメラ（即ち、非二重層）形態を有す
るような方法で産生される。

【0180】

カチオン性脂質としては、例えば、パルミトイル－オレオイル－ノル－アルギニン（Ｐ
ＯＮＡ）、ＭＣ３、ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－ＬｅｎＭＣ３、γ－ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－γ－
ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３アミ
ド、Ｐａｎ－ＭＣ３、Ｐａｎ－ＭＣ４、及びＰａｎ ＭＣ５、１，２－ジリノレイルオキ
シ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ
－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（
２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ
；「ＸＴＣ２」）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１
，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（
４－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ
）、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキサン（ＤＬ
ｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペピアジノ－［１，３］
－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノ
メチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカ
ルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジ
リノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１
，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノ
レオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ
－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノ
レイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリ
ノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、
１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．
Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉ
ｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬ
ｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、
１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（
ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリ
ド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯ
ＤＭＡ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ
）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアン
モニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウ
ムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，
Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジ
メチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，
２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチル
アンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミ
ン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオ
ロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、
３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－β－オキシブタン－４－オキシ）
－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）
、２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ
）－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１－２’－オクタデカジエンオキシ）プロ
パン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミ
ン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロ
パン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチ
ルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、又はこれらの混合物のうちの１又は複数
を挙げることができる。カチオン性脂質は、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭ
Ａ（「ＸＴＣ２」）、ＭＣ３、ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－ＬｅｎＭＣ３、γ－ＬｅｎＭＣ３、
ＣＰ－γ－ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、
ＭＣ３アミド、Ｐａｎ－ＭＣ３、Ｐａｎ－ＭＣ４、Ｐａｎ ＭＣ５、又はこれらの混合物
であってもよい。

【0181】

種々の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約４０ｍｏｌ％～
約９０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、
約４０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～
約６５ｍｏｌ％、又は約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を占めていてもよい。

【0182】

非カチオン性脂質は、例えば、１又は複数のアニオン性脂質及び／又は中性脂質を含ん
でいてもよい。好ましい実施形態では、非カチオン性脂質は、中性脂質成分、即ち、（１
）コレステロール若しくはその誘導体；（２）リン脂質、又は（３）リン脂質とコレステ
ロールの混合物若しくはその誘導体のうちの１つを含む。コレステロール誘導体の例とし
ては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル
－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、
及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質は、ジパルミトイ
ルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ
）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイ
ル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタ
ノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルグリセロール（Ｐ
ＯＰＧ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリスト
イル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル
エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチ
ル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミ
ン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ
）、卵ホスファチジルコリン、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されな
い中性脂質であってもよい。ある種の好ましい実施形態では、リン脂質は、ＤＰＰＣ、Ｄ
ＳＰＣ、又はこれらの混合物である。

【0183】

いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質（例えば、１又は複数のリン脂質及び／又
はコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約
１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約
６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約
１５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約
５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約
１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、又は約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を占めていてもよ
い。非カチオン性脂質がリン脂質とコレステロール又はコレステロール誘導体との混合物
である場合、この混合物は粒子中に存在する総脂質の最高約４０、５０、又は６０ｍｏｌ
％を占めていてもよい。

【0184】

粒子の凝集を阻害する複合脂質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質
複合体、ポリアミド（ＡＴＴＡ）－脂質複合体、カチオン性ポリマー－脂質複合体（ＣＰ
Ｌ）、又はこれらの混合物のうちの１又は複数を含んでいてもよい。好ましい一実施形態
では、核酸－脂質粒子は、ＰＥＧ－脂質複合体又はＡＴＴＡ－脂質複合体のいずれかを含
む。ある種の実施形態では、ＰＥＧ－脂質複合体又はＡＴＴＡ－脂質複合体は、ＣＰＬと
共に使用される。粒子の凝集を阻害する複合脂質は、例えば、ＰＥＧ－ジアシルグリセロ
ール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥ
Ｇ－セラミド（Ｃｅｒ）、又はこれらの混合物等のＰＥＧ－脂質を含んでいてもよい。Ｐ
ＥＧ－ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリ
スチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、Ｐ
ＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）、又はこれらの混合物であってもよい。

【0185】

本発明での使用に適した追加のＰＥＧ－脂質複合体としては、ｍＰＥＧ２０００－１，
２－ジ－Ｏ－アルキル－ｓｎ３－カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）が挙
げられるが、これに限定されない。ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧの合成は、ＰＣＴ出願番号ＰＣ
Ｔ／ＵＳ０８／８８６７６に記載されている。本発明での使用に適した更なる追加のＰＥ
Ｇ－脂質複合体としては、１－［８’－（１，２－ジミリストイル－３－プロパノキシ）
－カルボキサミド－３’、６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－ω－メチル－ポリ
（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ－ＤＭＧ）が挙げられるが、これに限定されない。
２ＫＰＥＧ－ＤＭＧの合成は、米国特許第７，４０４，９６９号に記載されている。

【0186】

場合によっては、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質複合体）は、
粒子中に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍ
ｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７
ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約
１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍ
ｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、
又は約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９
、又は２ｍｏｌ％（又はその任意の割合若しくはその範囲内）を占めていてもよい。典型
的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。そ
の他の場合、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質複合体）は、粒子中
に存在する総脂質の約５．０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、
約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ
％、又は約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、又は１０ｍ
ｏｌ％（又はその任意の割合若しくはその範囲内）を占めていてもよい。典型的には、そ
のような場合、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。

【0187】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、肝臓、特に肝実質細胞内での送達及び取り
込みを特異的に増強する組成を有する。

【0188】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、本発明の操作さ
れたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物
とを含む。特定の実施形態では、そのような組換えＤＮＡ構築物は、脂質ナノ粒子内にカ
プセル化されるか、又は標的細胞（例えば、肝臓細胞、特に肝実質細胞）への送達に適し
た、当該技術分野で公知の他の送達媒体にパッケージ化され得る。

【0189】

ある種の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、本発明の操作され
たメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む本明細書に記載のウイルスベクターとを
含む。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、標的細胞、特に肝実質細胞等の肝臓細
胞への送達に適したＡＡＶベクターであってよい。このようなＡＡＶベクターは、例えば
、ＡＡＶ８、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９のカプシド、又は当該技術分野で公知の他の肝臓標的化
キャプシドを有し得る。ある種の実施形態では、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ８キャプシド
であり、これは５’逆方向末端反復、肝臓特異的ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ
）プロモーター、イントロン、本発明の操作されたメガヌクレアーゼのコード配列、ウッ
ドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント、及び３’逆方向末端反復を含
むカセットを含む。

【0190】

ある種の実施形態では、治療有効量の本明細書に開示の医薬組成物を別の治療薬と一緒
に投与することを含む、高コレステロール血症等のコレステロール関連障害を治療する方
法が提供される。特定の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は単独で投与される
。

【0191】

本発明の医薬組成物は、併用療法で、即ち他の薬剤と組み合わせて投与することができ
る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、少なくとも１つの他の治
療薬の投与前に送達される。本明細書に開示の医薬組成物は、少なくとも１つの他の治療
薬の投与と同時に送達されても、又は少なくとも１つの他の治療薬の投与後に送達されて
もよい。ある種の実施形態では、併用療法は、本明細書に開示の医薬組成物を、少なくと
も１つの抗コレステロール薬と組み合わせて含む。薬剤としては、インビトロで合成的に
調製された化学的組成物、抗体、抗原結合領域、並びにそれらの組み合わせ及び複合体が
挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、薬剤は、アゴニスト、ア
ンタゴニスト、アロステリックモジュレーター、又は毒素として作用し得る。ある種の実
施形態では、薬剤は、その標的を阻害又は刺激するように作用し（例えば、受容体又は酵
素の活性化又は阻害）、それによりＬＤＬＲの発現増加を促進するか、又はＰＣＳＫ９発
現若しくは血清コレステロールレベルを減少させる。

【0192】

治療薬（本明細書に開示の医薬組成物以外）としては、少なくとも１つの他のコレステ
ロール低下（血清及び／又は全身コレステロール）薬又は薬剤が挙げられるが、これらに
限定されない。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＬＤＬＲの発現を増加させ、血清ＨＤ
Ｌレベルを増加させ、ＬＤＬレベルを減少させ、又はトリグリセリドレベルを減少させる
ことが観察されている。例示的な薬剤としては、スタチン（アトルバスタチン、セリバス
タチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチ
ン、ロスバスタチン、シンバスタチン）、ニコチン酸（ナイアシン）（ＮＩＡＣＯＲ、Ｎ
ＩＡＳＰＡＮ（徐放性ナイアシン）、ＳＬＯ－ＮＩＡＣＩＮ（徐放性ナイアシン））、フ
ィブリン酸（ＬＯＰＩＤ（ゲムフィブロジル）、ＴＲＩＣＯＲ（フェノフィブラート）、
胆汁酸隔離剤（ＱＵＥＳＴＲＡＮ（コレスチラミン）、コレセベラム（ＷＥＬＣＨＯＬ）
、ＣＯＬＥＳＴＩＤ（コレスチポール））、コレステロール吸収阻害剤（ＺＥＴＩＡ（エ
ゼチミブ））、ニコチン酸とスタチンとの組み合わせ（ＡＤＶＩＣＯＲ（ＬＯＶＡＳＴＡ
ＴＩＮ及びＮＩＡＳＰＡＮ）、スタチンと吸収阻害剤との組み合わせ（ＶＹＴＯＲＩＮ（
ＺＯＣＯＲ及びＺＥＴＩＡ）、及び／又は脂質修飾剤が挙げられるが、これらに限定され
ない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、ＰＰＡＲγアゴニスト
、ＰＰＡＲα／γアゴニスト、スクアレンシンターゼ阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤、降圧剤、
抗糖尿病薬（スルホニル尿素、インスリン、ＧＬＰ－１類似体、ＤＤＰＩＶ阻害剤等）、
ＡｐｏＢ調節物質、ＭＴＰ阻害剤、及び／又は閉塞性動脈硬化症治療と組み合わされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、スタチン、オンコスタチンＭ
のようなある種のサイトカイン、エストロゲン、及び／又はベルベリン等のある種の植物
成分のような、被験体中のＬＤＬＲタンパク質のレベルを増加させる薬剤と組み合わされ
る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、（ある種の抗精神病薬、
ある種のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、高フルクトース、スクロース、コレステロール又は
ある種の脂肪酸等の食事要因並びにＲＸＲ、ＲＡＲ、ＬＸＲ、ＦＸＲに対するある種の核
受容体アゴニスト及びアンタゴニスト等）、被験体の血清コレステロールレベルを増加さ
せる薬剤と組み合わされる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、
スタチン及び／又はインスリン等の、被験体中のＰＣＳＫ９のレベルを増加させる薬剤と
組み合わされる。２つの組み合わせは、他の薬剤の望ましくない副作用を本明細書に開示
の医薬組成物によって軽減させることを可能とし得る。

【0193】

ある種の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、コレステロール低下（血清及
び／又は総コレステロール）薬を用いた治療の前、同時、及び後に投与することができる
。ある種の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、高コレステロール血症、心臓
病、糖尿病、及び／又はコレステロール関連障害のいずれかの発症を予防又は軽減するた
めに、予防的に投与することができる。ある種の実施形態では、本明細書に開示の医薬組
成物は、既存の高コレステロール血症症状の治療のために投与することができる。いくつ
かの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、コレステロール関連障害に伴う障害
及び／又は症状の発症を遅延させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組
成物は、コレステロール関連障害のいずれか１つの任意の症状がない被験体に提供される
。

【0194】

２．５ 組換えＡＡＶベクターの産生方法
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法において使用するための組換えＡＡ
Ｖベクターを提供する。組換えＡＡＶベクターは、典型的には、ＨＥＫ－２９３等の哺乳
動物細胞株で産生される。ウイルスのｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子は、その自己複製に
よって治療遺伝子（例えば、メガヌクレアーゼ遺伝子）が送達される余地を作ることを防
ぐためにベクターから除去されるため、パッケージング細胞株においてトランスで供給す
る必要がある。更に、複製を支持するために必要な「ヘルパー」（例えば、アデノウイル
ス）成分を提供することが必要である（Ｃｏｔｓ Ｄ，Ｂｏｓｃｈ Ａ，Ｃｈｉｌｌｏｎ
Ｍ（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０－８１）。しばし
ば、組換えＡＡＶベクターは、「ヘルパー」成分をコードする第１のプラスミドと、ｃａ
ｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミドと、ウイルスにパッケージングされる
介在ＤＮＡ配列を含有するウイルスＩＴＲを含む第３のプラスミドとで細胞株がトランス
フェクトされる、三重トランスフェクション（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
）を用いて産生される。キャプシドに包まれたゲノム（目的のＩＴＲ及び介在遺伝子）を
含むウイルス粒子は、その後、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当該技
術分野で公知の他の手段によって細胞から単離される。次いで、塩化セシウム密度勾配遠
心分離又は親和性クロマトグラフィーを用いて粒子を精製し、続いて細胞、組織、又はヒ
ト患者等の生物の目的の遺伝子に送達する。

【0195】

組換えＡＡＶ粒子は、典型的には細胞中に産生（製造）させるため、部位特異的メガヌ
クレアーゼがパッケージング細胞中で発現しないことを確実にするように、本発明を実施
する際に注意を払わなければならない。本発明のウイルスゲノムは、メガヌクレアーゼの
認識配列を含むため、パッケージング細胞株で発現する任意のメガヌクレアーゼは、ウイ
ルスゲノムがウイルス粒子にパッケージングされる前にウイルスゲノムを切断することが
できる。このことは、パッケージング効率の低下及び／又は断片化したゲノムのパッケー
ジングをもたらす。以下を含むいくつかのアプローチを使用して、パッケージング細胞に
おけるメガヌクレアーゼ発現を防止することができる。
１．メガヌクレアーゼを、パッケージング細胞において活性ではない組織特異的プロモ
ーターの制御下に置くことができる。例えば、筋組織にメガヌクレアーゼ遺伝子を送達す
るためにウイルスベクターを開発する場合、筋特異的プロモーターを使用することができ
る。筋特異的プロモーターの例としては、Ｃ５－１２（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００４
），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７８３－９２）、筋特異的クレアチンキナーゼ
（ＭＣＫ）プロモーター（Ｙｕａｓａ、ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
．９：１５７６－８８）、又は平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモーター（Ｈａａｓｅ ｅｔ
ａｌ．（２０１３），ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９－５４）が挙げられ
る。ＣＮＳ（ニューロン）特異的プロモーターの例としては、ＮＳＥ、シナプシン、及び
ＭｅＣＰ２プロモーターが挙げられる（Ｌｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｎｅｕ
ｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．４８：１７９－８８）。肝臓特異的プロモーターの例としては、
アルブミンプロモーター（Ｐａｌｂ等）、ヒトα１－抗トリプシン（Ｐａ１ＡＴ等）、及
びヘモペキシン（Ｐｈｐｘ等）が挙げられる（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）
，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ７：３７５－８５）。眼特異的プロモーターの例としては、
オプシン、及び角膜上皮特異的Ｋ１２プロモーターが挙げられる（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ
ａｌ．（２００２），Ｍｅｔｈｏｄｓ（２８）：２６７－７５）（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ
．（２００７），Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、９：９５６－６６）。これらのプロモーター又
は当該技術分野で公知の他の組織特異的プロモーターは、ＨＥＫ－２９３細胞において高
度に活性ではなく、従って、本発明のウイルスベクターに組み込まれた場合に、パッケー
ジング細胞において有意なレベルのメガヌクレアーゼ遺伝子発現を生じることは期待され
ない。同様に、本発明のウイルスベクターは、不適合組織特異的プロモーター（即ち、周
知のＨｅＬａ細胞株（ヒト上皮細胞）及び肝臓特異的ヘモペキシンプロモーターを用いる
）の使用と共に他の細胞株を使用することを企図している。組織特異的プロモーターの他
の例としては、滑膜肉腫ＰＤＺＤ４（小脳）、Ｃ６（肝臓）、ＡＳＢ５（筋肉）、ＰＰＰ
１Ｒ１２Ｂ（心臓）、ＳＬＣ５Ａ１２（腎臓）、コレステロール調節ＡＰＯＭ（肝臓）、
ＡＤＰＲＨＬ１（心臓）、及び一遺伝子性奇形症候群ＴＰ７３Ｌ（筋肉）が挙げられる（
Ｊａｃｏｘ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０），ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（８）：ｅ１２２７
４）。
２．別の方法として、ベクターは、メガヌクレアーゼが発現されにくい異なる種に由来
する細胞にパッケージングすることができる。例えば、ウイルス粒子は、非哺乳動物パッ
ケージング細胞において活性ではない、周知のサイトメガロウイルス初期プロモーター又
はＳＶ４０ウイルス初期プロモーター等の哺乳動物プロモーターを用いて、微生物、昆虫
、又は植物細胞中に産生させることができる。好ましい実施形態では、Ｇａｏらによって
記載されているようなバキュロウイルス系を用いてウイルス粒子を昆虫細胞中に産生させ
る（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１（２）：１
３８－４３）。哺乳動物プロモーターの制御下にあるメガヌクレアーゼは、これらの細胞
中で発現する可能性は低い（Ａｉｒｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｍｏｌ．Ｔｈ
ｅｒ．２１（４）：７３９－４９）。更に、昆虫細胞は、哺乳動物細胞とは異なるｍＲＮ
Ａスプライシングモチーフを利用する。したがって、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）イント
ロン又はＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン等の哺乳動物イントロンをメガヌクレアーゼの
コード配列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞のプレｍＲＮＡ
転写物から効率的にスプライシングされないため、昆虫細胞は機能的メガヌクレアーゼを
発現せず、全長ゲノムをパッケージングする。対照的に、得られた組換えＡＡＶ粒子が送
達される哺乳動物細胞は、プレｍＲＮＡを適切にスプライシングし、機能的メガヌクレア
ーゼタンパク質を発現する。Ｈａｉｆｅｎｇ Ｃｈｅｎは、ＨＧＨ及びＳＶ４０ラージＴ
抗原イントロンを使用して、昆虫パッケージング細胞中の毒性タンパク質バルナーゼ及び
ジフテリア毒素断片Ａの発現を減弱させ、これらの毒素遺伝子を担持する組換えＡＡＶベ
クターの産生を可能にすることを報告した（Ｃｈｅｎ（２０１２），Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１（１１）：ｅ５７）。
３．メガヌクレアーゼ遺伝子は、メガヌクレアーゼ発現のために小分子誘導物質が必要
とされるように、誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る。誘導性プロモーターの
例としては、Ｔｅｔ－Ｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０
１５），ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：４））及びＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ
システム（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ；Ｓｏｗａ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｓｐｉｎｅ ３６
（１０）：Ｅ６２３－８）が挙げられる。両方のシステム及び当該技術分野で公知の類似
のシステムは、小分子アクチベーター（それぞれドキシサイクリン又はエクジソン）に応
答して転写を活性化するリガンド誘導性転写因子（それぞれＴｅｔリプレッサー及びエク
ジソン受容体の変異体）に依存する。このようなリガンド誘導性転写アクチベーターを用
いて本発明を実施することは、１）対応する転写因子に応答するプロモーターの制御下に
メガヌクレアーゼ遺伝子を配置することであって、メガヌクレアーゼ遺伝子が（ａ）転写
因子の結合部位を有することと、２）パッケージングされたウイルスゲノム中の転写因子
をコードする遺伝子を含むこととを含む。転写アクチベーターが同じ細胞にも供給されな
い場合、組換えＡＡＶ送達後に標的細胞又は組織中にメガヌクレアーゼが発現しないため
、後者のステップが必要である。次いで、転写アクチベーターは、コグネイト小分子アク
チベーターで処理された細胞又は組織中にのみメガヌクレアーゼ遺伝子発現を誘導する。
このアプローチは、小分子誘導因子がいつ、どの組織に送達されるかを選択することによ
って、メガヌクレアーゼ遺伝子発現を空間時間的に調節することができるため有利である
。しかしながら、担持能力が著しく制限されたウイルスゲノムに誘導因子を含める必要性
は、このアプローチの欠点を作り出す。
４．別の好ましい実施形態では、組換えＡＡＶ粒子は、メガヌクレアーゼの発現を妨げ
る転写リプレッサーを発現する哺乳動物細胞株に産生される。転写リプレッサーは当該技
術分野で公知であり、Ｔｅｔリプレッサー、Ｌａｃリプレッサー、Ｃｒｏリプレッサー、
及びＬａｍｂｄａリプレッサーが挙げられる。エクジソン受容体等の多くの核内ホルモン
受容体は、それらのコグネイトのホルモンリガンドの非存在下で転写リプレッサーとして
も作用する。本発明を実施するために、パッケージング細胞は、転写リプレッサーをコー
ドするベクターでトランスフェクション／形質導入され、ウイルスゲノム中のメガヌクレ
アーゼ遺伝子（パッケージングベクター）は、プロモーターに作動可能に結合され、この
プロモーターは、リプレッサーがプロモーターをサイレンシングするように、リプレッサ
ーのための結合部位を含むように改変されている。転写リプレッサーをコードする遺伝子
は、種々の位置に配置することができる。この遺伝子は、別のベクターにコードすること
ができ、ＩＴＲ配列の外側のパッケージングベクターに組み込むことができ、ｃａｐ／ｒ
ｅｐベクター又はアデノウイルスヘルパーベクターに組み込むことができ、又は最も好ま
しくは、構成的に発現されるようにパッケージング細胞のゲノムに安定的に組み込むこと
ができる。転写リプレッサー部位を組み込むために一般的な哺乳動物プロモーターを改変
する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｒｏｎｉｎｓｏ
ｎは、強力な構成的ＣＭＶ及びＲＳＶプロモーターをＬａｃリプレッサーのオペレーター
を含むように改変し、改変プロモーターからの遺伝子発現がリプレッサーを発現する細胞
で大きく減弱したことを示した（Ｃｈａｎｇ及びＲｏｎｉｎｓｏｎ（１９９６），Ｇｅｎ
ｅ １８３：１３７－４２）。非ヒト転写リプレッサーの使用は、メガヌクレアーゼ遺伝
子の転写が、リプレッサーを発現するパッケージング細胞においてのみ抑制され、得られ
る組換えＡＡＶベクターで形質導入される標的細胞又は組織においては抑制されないこと
を確実にする。

【0196】

２．６ 操作されたメガヌクレアーゼ変異体
本発明の実施形態は、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼ及びその変異体を
包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載のメガヌクレアーゼをコードする
核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドの変異体を
包含する。

【0197】

本明細書で使用する場合、「変異体」は、実質的に類似の配列を意味することを意図す
る。「変異体」ポリペプチドは、天然のタンパク質の１若しくは複数の内部部位における
１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失若しくは付加、及び／又は天然のポリペプチドの１
若しくは複数の部位における１個以上のアミノ酸の置換によって、「天然の」ポリペプチ
ド由来のポリペプチドを意味することを意図する。本明細書で使用する場合、「天然の」
ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、変異体が由来する親配列を含む。実施形態によっ
て包含される変異体ポリペプチドは生物学的に活性である。即ち、それらは天然のタンパ
ク質の所望の生物学的活性、即ち、例えば、ＰＣＳ７－８認識配列（配列番号４）を含む
、ＰＣＳＫ９遺伝子の認識配列を認識し切断する能力を保持し続けている。そのような変
異体は、例えばヒトの操作から生じ得る。実施形態の天然のポリペプチドの生物学的に活
性な変異体（例えば、配列番号６～１４）、又は本明細書に記載のサブユニットを結合す
る認識ハーフサイトの生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載されている
配列アライメントプログラム及びパラメータによって決定されるように、天然のポリペプ
チド又は天然のサブユニットのアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、約４５％、約
５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約
９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約
９８％、又は約９９％の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチド又はサブユニット
の生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチド又はサブユニットと、わずか約１～４０
個のアミノ酸残基、わずか約１～２０個、わずか約１～１０個、わずか約５、わずか４、
３、２個、又は更には１個のアミノ酸残基だけが異なっていてもよい。

【0198】

実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含む様々な方法
で変化させることができる。そのような操作のための方法は、当該技術分野において一般
的に公知である。例えば、アミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ中の突然変異によって調製する
ことができる。突然変異誘発及びポリヌクレオチド変更の方法は、当該技術分野において
周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－４９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８２；米国特許第４，８７３，１
９２号；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びそれらに引用されている参考文献を参照の
こと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する
ガイダンスは、参照により本明細書に組み込まれているＤａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（
１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ
．Ｃ．）に記載されているだろう。あるアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と交
換する等の保存的置換が最適であり得る。

【0199】

いくつかの実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に開示の
ＨＶＲ１領域及びＨＶＲ２領域の変異を含むことができる。親ＨＶＲ領域は、例えば例示
された操作されたメガヌクレアーゼの残基２４～７９又は残基２１５～２７０を含むこと
ができる。従って、変異ＨＶＲ領域が操作されたメガヌクレアーゼの生物活性（即ち、認
識配列に結合し切断する）を維持するように、本明細書で例示された操作されたメガヌク
レアーゼの残基２４～７９又は残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少な
くとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上
の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。更に、本発明のいくつかの実施
形態では、変異ＨＶＲ１領域又は変異ＨＶＲ２領域は、親ＨＶＲ内の特定の位置で見出さ
れるアミノ酸残に対応する残基を含むことができる。本文脈中、「対応する」とは、変異
ＨＶＲのアミノ酸残基が、同じ相対位置で（即ち、親配列の残りのアミノ酸に対して）親
ＨＶＲ配列中に存在する同じアミノ酸残基（即ち、別個の同一残基）であることを意味す
る。例として、親ＨＶＲ配列が位置２６にセリン残基を含む場合、残基２６「に対応する
残基を含む」変異ＨＶＲは、親位置２６に相対的な位置にもセリンを含む。

【0200】

野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対するかなりの数のアミ
ノ酸修飾が以前に同定されており（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号）、これは
単独で又は組み合わせて、ＤＮＡ認識配列ハーフサイト内の個々の塩基において特異性が
変更された組換えメガヌクレアーゼを生じることで、得られる合理的に設計されたメガヌ
クレアーゼは、野生型酵素とは異なるハーフサイト特異性を有するようになる。表２は、
認識ハーフサイトの各ハーフサイト位置（－１～－９）に存在する塩基に基づいて、特異
性を増強するために操作されたメガヌクレアーゼモノマー又はサブユニットにてなされ得
る潜在的置換を提供する。

【0201】

【表2】

【0202】

太字の項目は野生型の接触残基であり、本明細書で使用される「改変」を構成しない。
星印は、残基がアンチセンス鎖上の塩基と接触することを示す。

【0203】

ポリヌクレオチドについて、「変異体」は、天然のポリヌクレオチド内の１又は複数の
部位で１又は複数のヌクレオチドの欠失及び／又は付加を含む。当業者は、実施形態の核
酸の変異体が、オープンリーディングフレームが維持されるように構築されることを認識
するであろう。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体には、遺伝コードの縮重故に、実
施形態のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。変異体ポリヌ
クレオチドとしては、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて生成されるが、実施形態
の操作されたメガヌクレアーゼを依然としてコードするような、合成由来のポリヌクレオ
チドが挙げられる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明細書の
他の箇所に記載されている配列アライメントプログラム及びパラメータによって決定され
るように、その特定のポリペプチドに対して少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、
約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、
約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、
約９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する。実施形態の特定のポリヌクレオチドの変
異体（即ち、参照ポリヌクレオチド）は、変異体ポリヌクレオチドによってコードされる
ポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間の配列同
一性割合を比較することによって評価することもできる。

【0204】

本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入、及び置換は、ポリペプチドの特徴
において根本的な変化を生じることは期待されない。しかし、置換、欠失、又は挿入の正
確な効果をそれに先立って予測することが困難な場合、当業者は、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子
内の認識配列を優先的に認識し切断する能力についてポリペプチドをスクリーニングする
ことによって、その効果が評価されることを理解するであろう。

【実施例0205】

本発明を以下の実施例によって更に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するも
のと解釈されるべきではない。当業者であれば、日常的な実験を用いて、本明細書に記載
の特定の物質及び手順に対する多数の等価物を認識し、又は確認することができるであろ
う。そのような等価物は、以下の実施例に従う特許請求の範囲に包含されることが意図さ
れる。

【0206】

実施例１
ＰＣＳＫ９認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼの特性評価
１．ＰＣＳ７－８認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書で「ＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼ」と集合的に呼ばれる操作されたメガヌク
レアーゼ（配列番号６～１４）は、ＰＣＳ１－２認識配列（配列番号４）を認識し切断す
るように操作され、ＰＣＳ１－２認識配列（配列番号４）は、ＰＣＳＫ９遺伝子内に位置
する。操作されたＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼの各々は、ＳＶ４０に由来するＮ末端ヌ
クレアーゼ局在化シグナルと、第１のメガヌクレアーゼサブユニットと、リンカー配列と
、第２のメガヌクレアーゼサブユニットとを含む。各ＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼの第
１のサブユニットは配列番号４のＰＣＳ７認識ハーフサイトに結合し、第２のサブユニッ
トはＰＣＳ８認識ハーフサイトに結合する（図２参照）。

【0207】

ＰＣＳ７結合サブユニット及びＰＣＳ８結合サブユニットは、それぞれＨＶＲ１及びＨ
ＶＲ２と呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＰＣＳ７結合サブユニットは、ＨＶＲ
１領域の外側で高度に保存されている。同様に、ＰＣＳ８結合サブユニットも、ＨＶＲ２
領域の外側で高度に保存されている。配列番号６～１４のＰＣＳ７結合領域は、それぞれ
配列番号１５～２３として提供される。配列番号１５～２３の各々は、メガヌクレアーゼ
ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７（配列番号６）のＰＣＳ７結合領域である配列番号１５と少なく
とも９０％の配列同一性を共有する。配列番号６～１４のＰＣＳ８結合領域は、それぞれ
配列番号２４～３２として提供される。配列番号２４～３２の各々は、メガヌクレアーゼ
ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７（配列番号６）のＰＣＳ８結合領域である配列番号２４と少なく
とも９０％の配列同一性を共有する。

【0208】

２．ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおけるＰＣＳＫ９認識配列の切断
ＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼがその対応する認識配列（配列番号４）を認識し切断で
きるかどうかを決定するために、先に記載されたＣＨＯ細胞レポーターアッセイを用いて
各操作されたメガヌクレアーゼを評価した（国際公開第２０１２／１６７１９２号及び図
３を参照）。アッセイを行うために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能的緑色蛍光タン
パク質（ＧＦＰ）遺伝子発現カセットを担持するＣＨＯ細胞レポーター株を産生させた。
各細胞株のＧＦＰ遺伝子は、メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が
機能的ＧＦＰ遺伝子をもたらす相同組換え事象を刺激するように、一対の認識配列によっ
て割り込まれた。

【0209】

この研究のために開発したＣＨＯレポーター細胞株において、ＧＦＰ遺伝子に挿入され
た１つの認識配列は、ＰＣＳ７－８認識配列（配列番号４）であった。ＧＦＰ遺伝子に挿
入された第２の認識配列は、「ＣＨＯ－２３／２４」と呼ばれる対照メガヌクレアーゼに
よって認識され切断されるＣＨＯ－２３／２４認識配列であった。ＰＣＳ７－８認識配列
及びＣＨＯ－２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞を「ＰＣＳ７－８細胞」と
呼ぶ。

【0210】

ＣＨＯレポーター細胞を、その対応する操作されたメガヌクレアーゼをコードするプラ
スミドＤＮＡでトランスフェクトするか（例えば、ＰＣＳ７－８細胞を、ＰＣＳ７－８メ
ガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした）、又はＣＨＯ－
２３／３４メガヌクレアーゼをコードするプラスミドでトランスフェクトした。各アッセ
イにおいて、４ｅ^５ ＣＨＯレポーター細胞を、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔ
ａｍｉｎｅ ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて９６ウェルプレートにて５
０ｎｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後
、細胞をフローサイトメトリーによって評価し、トランスフェクトされていない陰性対照
（ＰＣＳ ｂｓ）と比較したＧＦＰ陽性細胞の割合を決定した。図４Ａ～図４Ｃに示すよ
うに、全ＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼは、対応する認識配列を含む細胞株において陰性
対照を有意に超える頻度でＧＦＰ陽性細胞を産生することが見出された。

【0211】

ＣＨＯレポーター細胞にメガヌクレアーゼを導入した後、ＰＣＳ７－８メガヌクレアー
ゼの有効性も時間依存的に測定した。この研究では、製造者の指示に従ってＢｉｏＲａｄ
Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌを使用して、ＰＣＳ７－８細胞（１．０×１０^６
個）に、細胞ごとに１×１０^６コピーのメガヌクレアーゼｍＲＮＡをエレクトロポレーシ
ョンした。トランスフェクション後の指定された時点で、細胞をフローサイトメトリーに
よって評価し、ＧＦＰ陽性細胞の割合を決定した。ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼ
も、陽性対照として各時点で含めた。

【0212】

図５Ａ～図５Ｃに示すように、異なるＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼによって産生され
た％ＧＦＰは、各研究の時間経過にわたって比較的一貫しており、細胞における持続的な
切断活性及び実質的な毒性の欠如を示している。

【0213】

３．結論
これらの研究は、本発明に包含されるＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼが、細胞中の対応
する認識配列を効率的に標的とし切断できることと、この効果は時間経過にわたって一貫
していることと、ヌクレアーゼは細胞に対して非毒性であることとを実証した。

【0214】

実施例２
ＨＥＫ２９３細胞におけるＰＣＳ７－８認識配列の切断
１．実験プロトコル及びＴ７Ｅアッセイ
この研究は、本発明に包含されるＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼがＨＥＫ２９３細胞に
おけるＰＣＳ７－８認識配列を切断できることを実証した。

【0215】

２ｅ^６ ２９３細胞に、製造者の指示に従ってＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ
Ｘｃｅｌｌを使用して、２．７ｕｇの所与のＰＣＳメガヌクレアーゼｍＲＮＡをエレク
トロポレーションした。トランスフェクションの２日後及び５日後に、ゲノムＤＮＡ（ｇ
ＤＮＡ）を細胞から回収し、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ）アッセイを行って内因
性ＰＣＳ７－８認識配列における遺伝子改変を評価した（図６）。Ｔ７Ｅアッセイでは、
ＰＣＳ７－８座は、ＰＣＳ７－８認識配列に隣接するプライマーを用いたＰＣＲによって
増幅された。ＰＣＳ７－８座内にｉｎｄｅｌ（無秩序な挿入又は欠失）があった場合、得
られるＰＣＲ産物は野生型対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子の混合物からなる。ＰＣＲ
産物は変性され、ゆっくりとリアニールされ得る。ゆっくりとしたリアニールにより、野
生型及び突然変異対立遺伝子からなるヘテロ二本鎖が形成され、ミスマッチ塩基及び／又
はバルジが生じる。Ｔ７Ｅ１酵素はミスマッチ部位で切断され、ゲル電気泳動により可視
化され得る切断産物が生じる。

【0216】

２．結果
トランスフェクションの２日後及び５日後に、低分子量ＤＮＡ断片がＰＣＳ７－８ｘ．
６６及びＰＣＳ７－８ｘ．８８を受け取った細胞で観察されたが、ＧＦＰ対照のみをコー
ドするｍＲＮＡで模擬トランスフェクト又はトランスフェクトされた細胞は、全長ＰＣＲ
産物を示した（図６）。これらの低分子量ＤＮＡ断片は、ＰＣＳ認識部位でのメガヌクレ
アーゼの活性により起こるミスマッチＤＮＡにおけるＴ７エンドヌクレアーゼＩ切断によ
って産生される。

【0217】

３．結論
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイは、ＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼで処理されたＨ
ＥＫ２９３細胞内のＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼ認識部位周辺におけるｉｎｄｅｌの存
在を検出し、標的部位の切断及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により当該部位の誤りがち
な修復を示す。

【0218】

実施例３
ＰＣＳ７－８認識配列におけるｉｎｄｅｌを観察するためのディープシーケンシング
１．ディープシーケンシングプロトコル
目的のＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼ標的部位における挿入又は欠失を直接観察するた
めに、ディープシーケンシングプロトコルを用いた。２ｅ^６ ＨＥＫ２９３細胞に、製造
者の指示に従ってＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌを使用して、５ｕ
ｇのＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。模擬エレク
トロポレーションはｍＲＮＡなしでも行った。トランスフェクションの４８時間後、ゲノ
ムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を細胞から回収した。ＰＣＳ７－８座は、ＰＣＳ７－８認識配列に
隣接するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅された。このアンプリコンは、目視によ
る確認のためにアガロースゲルで行い、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ社製Ｎｕｃｌｅｏ
ｓｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキットを用いて抽出し、Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製のＩｌｌｕｍｉｎａ用ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ
ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔを使用してシーケンシングライブラリーを調製
した。ペアエンドシーケンシングライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製Ｍｉｓｅｑ Ｄ
ＮＡシーケンサで読み取った。シーケンスシングデータはカスタムスクリプトを用いて分
析した。全長アンプリコンの２５ｂｐ内にない始点又は終点を含むリードは除いた。ｉｎ
ｄｅｌを含むリードの割合は、認識配列の中間８ｂｐのうちの少なくとも１つを組み込ん
だｉｎｄｅｌを持つ全長リードの数を全長リードの総数で除して計算した。

【0219】

２．結果
表３に示すように、ディープシーケンシングにより評価されたＰＣＳ７－８メガヌクレ
アーゼの各々は、模擬処理と比較して、その目的の認識部位におけるｉｎｄｅｌの割合の
少なくとも１００倍の増加を示した。

【0220】

【表3】

【0221】

３．結論
これらの実験は、本発明のＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼがＨＥＫ２９３細胞内のその
目的とする標的部位（即ち、ＰＣＳ７－８認識配列）を切断し、非相同末端結合による誤
りがちな修復を介したｉｎｄｅｌの出現を誘導する能力をはっきりと実証している。

【0222】

実施例４
ＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼを用いた霊長類肝臓のインビボ遺伝子編集
１．方法及び材料
実験を行って、ＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼが非ヒト霊長類モデルの肝臓細胞をイン
ビボでＰＣＳ７－８認識部位編集する能力を評価し、被験体のＰＣＳＫ９の血清レベルに
対するそのような編集の効果を決定した。

【0223】

ＰＣＳ７－８ｘ．８８メガヌクレアーゼは組換えＡＡＶベクターを介して導入された。
ＡＡＶベクターはＡＡＶ８キャプシドを有し、５’から３’へ、５’逆方向末端反復、肝
臓特異的ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、イントロン、ＰＣＳ７
－８ｘ．８８メガヌクレアーゼのコード配列、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転
写後調節エレメント、及び３’逆方向末端反復を含んでいた。このベクターをＡＡＶ８．
ＴＢＧ．ＰＩ．ＰＣＳ７－８ｘ．８８．ＷＰＲＥ．ｂＧＨと呼ぶ。

【0224】

ＡＡＶベクターは、医薬組成物で調製され、０日目に各々の体重が約６．５ｋｇの４匹
の異なるアカゲザルに単回注入として投与した。動物（オス）ＲＡ１８６６は、３×１０
^１３ＧＣ／ｋｇの単回用量を受けたが、これはこれらの研究において評価される最高用量
を表す。動物ＲＡ１８５７（オス）は、６×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの単回
用量を受けた。動物ＲＡ１８２９（メス）動物ＲＡ２３３４（オス）はそれぞれ、２×１
０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの単回用量を受けた。血液サンプルは、ＥＬＩＳＡに
よる血清ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの分析、総コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ、及び
トリグリセリドの分析、並びにアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの分
析のために、－３日目及び０日目、並びに投与後１６８日間（低用量動物）又は２８０日
間（高用量及び中用量動物）の間に複数の時点で採取した。加えて、ＰＣＳ７－８認識配
列における挿入及び欠失（ｉｎｄｅｌ）のＰＣＲ分析、並びにインサイチューハイブリッ
ド形成（ＩＳＨ）による肝細胞におけるＰＣＳ７－８ｘ．８８メガヌクレアーゼ発現の分
析のために、肝生検サンプルを投与後１７日目に得た。

【0225】

２．血清ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの変化
血清ＰＣＳＫ９タンパク質レベルは、－３日目、０日目、及びＡＡＶベクターの投与後
の複数の時点にてＥＬＩＳＡにより測定した。高用量及び中用量動物は、投与後２８０日
間追跡調査したが、低用量動物は１６８日間追跡調査された。

【0226】

図７に示すように、０日目でのメガヌクレアーゼＡＡＶの単回投与は、７日目までに被
験体ＲＡ１８６６、ＲＡ１８５７、及びＲＡ１８２９において、１４日目までには全群に
おいて血清ＰＣＳＫ９レベルの劇的な用量依存性の増加を引き起こした。高用量の３×１
０^１３ＧＣ／ｋｇを受けた被験体ＲＡ１８６６は、７日目までに約８４％の減少、２０日
目までには約９１％の減少を示した。６×１０^１２ＧＣ／ｋｇの用量を受けた被験体ＲＡ
１８５７は、７日目までに約４６％の減少、２０日目までには約７７％の減少を示した。
２×１０^１２ＧＣ／ｋｇを受けた被験体ＲＡ１８２９は、７日目までに約３５％の減少、
２０日目までには約７０％の減少を示した。更に２×１０^１２ＧＣ／ｋｇを受けた被験体
ＲＡ２３３４は、１４日目までに約３５％の減少を示したが、２０日目までにはベースラ
イン付近へ戻り、ここでは約１０％の減少が観察された。

【0227】

更なる時点を評価して、研究の全期間を通じてタンパク質阻害の一貫性を評価した。血
清ＰＣＳＫ９レベルの用量依存性の減少は、測定した最終時点を通じて引き続き観察され
た。両方の低用量動物（ＲＡ１８２９及びＲＡ２３３４）において、約２５％の減少が１
６８日目にも引き続き観察された。中用量動物（ＲＡ１８５７）において、約５０％の減
少が２８０日目にも引き続き観察された。高用量動物（ＲＡ１８６６）において、約８５
％の減少が２８０日目にも引き続き観察された。全体的に見て、観察期間を通じた血清Ｐ
ＣＳＫ９レベルの減少は用量依存性であると思われ、減少は各被験体について研究終了ま
で持続した。

【0228】

３．血清コレステロールレベル、ＬＤＬレベル、ＨＤＬレベル、及びトリグリセリドレベ
ルの変化
血清コレステロールレベル、ＬＤＬレベル、ＨＤＬレベル、及びトリグリセリドレベル
に対するＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼ治療の効果は、－３日目、０日目、及びＡＡＶベ
クターの投与後の複数の時点にも測定した。

【0229】

重要なことには、総ＬＤＬレベルは、ＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼを用いた治療によ
り全４匹の動物において減少した（図８Ａ）。全４匹の動物は、２０日目までに血清ＬＤ
Ｌのかなりの減少を示し、減少は用量依存的に研究の期間全体を通じて持続した。動物Ｒ
Ａ２３３４は、１６８日目まで約２５％の減少を示し、もう一方の低用量動物ＲＡ１８２
９は同じ時点で約３５％のより大きな減少を示した。動物ＲＡ１８５７（中用量）及びＲ
Ａ１８６６（高用量）はそれぞれ、研究２６８日目に測定したときに約７０％の減少を示
した。

【0230】

とりわけ、ＬＤＬレベルの一時的な増加が各動物において研究２８日目及び４２日目に
観察された。これは、同じ時点で観察されたＡＬＴレベルの変化と一致し（図９）、メガ
ヌクレアーゼ又はベクターキャプシドに対するＴ細胞の活性から生じたものであり得る。

【0231】

図８Ｂ～図８Ｅにおいて、各動物についての研究期間中の総コレステロール、ＨＤＬ、
ＬＤＬ、及びトリグリセリドの変化を示す。示されているように、総コレステロールレベ
ルは、高用量動物（ＲＡ１８６６）及び中用量動物（ＲＡ１８５７）では明らかに減少し
たが、低用量動物ではより穏やかな効果が観察された。ＨＤＬも高用量の動物ではいくら
か減少したが、他の３匹においては比較的安定している。各動物についてトリグリセリド
レベルの一時的な変化が研究期間中に観察されたが、測定した最後の時点ではほぼベース
ラインレベルのままであった。

【0232】

４．メガヌクレアーゼ発現及び肝細胞のインビボ遺伝子編集
１７日目に肝生検を行い、ＰＣＳ７－８認識配列における挿入又は欠失（ｉｎｄｅｌ）
の存在について検査した。ｉｎｄｅｌは、認識配列に隣接するＰＣＲプライマー、ゲノム
の介在領域の増幅、及び得られたＰＣＲ産物のシーケンシングにより検出した。種々のｉ
ｎｄｅｌ、即ち、異なった長さの挿入及び欠失の両方がＰＣＳ７－８認識配列にて種々の
頻度で検出された。図１０は、被験体ＲＡ１８５７及びＲＡ１８６６において最も頻繁に
観察された８つのｉｎｄｅｌとその対応する頻度を示す。これら８つのｉｎｄｅｌは、被
験体ＲＡ１８５７で観察されるｉｎｄｅｌの７３％、被験体ＲＡ１８６６で観察されるｉ
ｎｄｅｌの６６％を占めていた。

【0233】

ＰＣＳ７－８ｘ．８８メガヌクレアーゼは肝細胞にてインビボで実際に発現されたかを
確認するために、１７日目及び１２９日目で得た肝生検材料をインサイチューハイブリッ
ド形成（ＩＳＨ）で検査した。蛍光標識オリゴプローブを設計し、各被験体由来の生検し
た肝細胞中のＰＣＳ７－８ｘ．８８ ｍＲＮＡに結合する。対照として別の被験体Ｍ１１
６５７由来の生検細胞の模擬処理をオリゴプローブなしで行った。図１１に示すように、
模擬処理細胞では蛍光シグナルは観察されなかった（図１１Ａ）。しかし、治療済みの被
験体の肝細胞（図１１Ｂ～図１１Ｅ）では１７日目にかなりの蛍光が観察された。従って
、ＰＣＳ７－８ｘ．８８メガヌクレアーゼｍＲＮＡは、ｉｎｄｅｌ形成が観察され、血清
ＰＣＳＫ９及び血清脂質の減少が検出された早い時点で治療済みの被験体においては強く
発現されたことが明らかである。図１１は、メガヌクレアーゼｍＲＮＡの発現が、２回目
の肝生検材料を得た研究の１２９日目では観察されなくなったことを更に示す。

【0234】

５．ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７メガヌクレアーゼを用いた治療
更なる研究を行って、最適化された第２世代ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７メガヌクレアーゼ
の有効性を決定した。研究プロトコルは前述したものと同様であった。ＰＣＳ７－８Ｌ．
１９７メガヌクレアーゼは組換えＡＡＶベクターを介して導入された。ＡＡＶベクターは
ＡＡＶ８キャプシドを有し、５’から３’へ、５’逆方向末端反復、肝臓特異的ヒトチロ
キシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、イントロン、ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７メ
ガヌクレアーゼのコード配列、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメ
ント、及び３’逆方向末端反復を含んでいた。ＡＡＶベクターは、医薬組成物で調製され
、０日目に各々の体重が約６．５ｋｇの１匹のオスと１匹のメスのアカゲザルに６×１０
^１２ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの単回用量で単回注入として投与した。初期の血液サン
プルは、ＥＬＩＳＡによる血清ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの分析及び総ＬＤＬレベルの
分析のために、０日目及び投与後７日目に採取した。

【0235】

図１２に示すように、ＰＣＳＫ９血清レベルは、研究７日目までに両被験体において急
速かつ劇的に減少した。被験体ＲＡ２１２５では、ＰＣＳＫ９レベルは０日目の約１８０
ｎｇ／ｍＬから７日目の約５５ｎｇ／ｍＬに減少した（約７０％の減少）。被験体ＲＡ２
３４３では、ＰＣＳＫ９レベルは０日目の約２４５ｎｇ／ｍＬから７日目の約１２５ｎｇ
／ｍＬに減少した（約４９％の減少）。ＰＣＳＫ９レベルの減少は、メガヌクレアーゼＡ
ＡＶの投与後１８２日目まで持続し、各被験体は約６０％の減少を示し続けた。

【0236】

図１３Ａは、血清ＰＣＳＫ９レベルの減少が、治療の７日以内に血清ＬＤＬレベルのか
なり減少を伴ったことを示す。被験体ＲＡ２１２５では、血清ＬＤＬレベルは、０日目の
約４０ｍｇ／ｄＬから７日目の約２５ｍｇ／ｄＬに減少した（約３８％の減少）。被験体
ＲＡ２３４３では、血清ＬＤＬレベルは０日目の約７５ｍｇ／ｄＬから７日目の約５５ｍ
ｇ／ｄＬに減少した（約２７％の減少）。血清ＬＤＬレベルは引き続き２１日目から２８
日目まで減少し続け、ベースラインと比較して約６５％減少した。血清ＬＤＬの減少は、
研究１６８日目まで持続し、その時点では被験体ＲＡ２１２５及びＲＡ２３４３はそれぞ
れ約３５％及び５０％の大幅に安定した減少を示した。

【0237】

図１３Ｂ及び図１３Ｃにおいて、各動物についての研究期間中の総コレステロール、Ｈ
ＤＬ、ＬＤＬ、及びトリグリセリドの変化を示す。示されているように、総コレステロー
ルレベルは、各被験体において研究期間を通じて穏やかに減少したが、被験体ＲＡ２３４
３ではより穏やかな減少であった。ＨＤＬレベル及びトリグリセリドレベルは、各被験体
において研究期間を通じて本質的に変化していない。ＰＣＳ７－８ｘ．８８ ＡＡＶの投
与と同様に、２８日目から４２日目までの間に被験体ＲＡ２１２５では血清脂質の一時的
な増加が観察され、これはＡＬＴの上昇と一致し（図１４）、メガヌクレアーゼ又はＡＡ
Ｖキャプシドに応答したＴ細胞活性化に起因し得る。

【0238】

ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７メガヌクレアーゼが肝細胞にてインビボで発現されたことを確
認するために、１８日目及び１２９日目で得た肝生検材料をインサイチューハイブリッド
形成（ＩＳＨ）で検査した。蛍光標識オリゴプローブを設計し、各被験体由来の生検した
肝細胞中のＰＣＳ７－８Ｌ．１９７ ｍＲＮＡに結合する。図１５に示すように、治療済
みの被験体の肝細胞では１８日目にかなりの蛍光が観察された。従って、ＰＣＳ７－８Ｌ
．１９７メガヌクレアーゼｍＲＮＡは、血清ＰＣＳＫ９及び血清脂質の減少が検出された
早い時点で治療済みの被験体において強く発現されたことが明らかである。図１５は、メ
ガヌクレアーゼｍＲＮＡの発現が、２回目の肝生検材料を得た研究の１２８日目では観察
されなくなったことを更に示す。

【0239】

６．オンターゲットゲノム編集の分子評価
肝生検サンプルから単離したＤＮＡを、アンカードマルチプレックスＰＣＲシーケンシ
ング（ＡＭＰ－ｓｅｑ）により生じたアンプリコンのディープシーケンシングによる指定
したｒｈＰＣＳＫ９エキソン７標的部位でのオンターゲット編集のために特性決定した。
ＡＭＰアンプリコンは、入れ子状の遺伝子座特異的プライマーを用いて産生されるが、フ
ォワードプライマーは、標的とされるメガヌクレアーゼ切断部位の５０ｂｐ上流の固定位
置にハイブリダイズし、アンプリコンの３’末端は、増幅前のゲノムＤＮＡのランダムシ
ェアリング後にＤＮＡ断片の長さによって画定される。

【0240】

全ての肝臓サンプルにおいて、ＡＭＰシーケンシングによって観察される短い挿入及び
欠失の頻度は、陰性対照（即ち、ナイーブ動物由来のＰＢＭＣサンプル）で観察されるよ
りも高いことが見出された（図１６）。ＰＣＳ７－８ｘ．８８メガヌクレアーゼについて
は、１２９日目にＡＭＰ－ｓｅｑによって検出されたｉｎｄｅｌの頻度は、高用量で４６
％であり、低用量では用量に比例して１３％（平均、ｎ＝２）に減少した。ＡＡＶ８血清
型及びＴＢＧプロモーターの使用により初代肝実質細胞のみが選択的に編集されることを
考慮すると、ＡＭＰ－ｓｅｑは、未編集の混入非実質細胞が肝生検サンプル中に存在する
ため、オンターゲットゲノム編集の合計頻度を少なく見積もりすぎる可能性が高い。編集
事象の総数は、２つの時点（即ち、１７日目及び１２９日目）の間で、増加した高用量を
除いて全ての動物で僅かに減少した。挿入の総数は各サンプルの欠失の総数を超えたが、
時間の経過に応じて程度は変化した。欠失の頻度は、高用量動物と中用量動物の両方で経
時的に増加し、低用量動物では経時的に減少することが判明したが、分析される各サンプ
ルについて、挿入は経時的に一貫して減少した。ＰＣＳ７－８Ｌ．１９７ ＡＡＶで治療
された被験体から得たサンプルの同様のオンターゲット分子分析は、中用量のＡＡＶを受
けた被験体ＲＡ１８５７で観察されたようなｉｎｄｅｌのスペクトル及び頻度を示した。

【0241】

７．結論
これらの研究から、ＩＳＨで観察されるように、ＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼは霊長
類肝細胞においてインビボで首尾良く発現され、その後、ＰＣＳ７－８認識配列に切断部
位を生ずることが明らかになった。切断部位における誤りがちな非相同末端結合は、その
後、当該部位のＰＣＲ分析及びＡＭＰ－ｓｅｑ分析で観察されるように多数のｉｎｄｅｌ
を生じさせ、これにより、ＥＬＩＳＡで観察されるようにＰＣＳＫ９タンパク質発現を阻
害する。これらの研究は、本発明者らに公知の霊長類肝臓における遺伝子編集の最初の報
告された観察である。更に、これは霊長類におけるＰＣＳＫ９遺伝子の遺伝子編集の最初
の観察であり、これは血清ＰＣＳＫ９タンパク質レベル、血清ＬＤＬレベル、及び総コレ
ステロールレベルのかなりの持続的な減少を伴った。本発明者らは、これらの実験で投与
されたＡＡＶの用量が比較的多いことを認め、有効性及び安全性プロファイルの両方を決
定するために、追加のＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼを用いた更なる実験を大幅に少ない
用量で実施する。総コレステロールレベル、血清ＬＤＬレベル、及び肝細胞ＬＤＬレベル
の更なる分析も、コレステロールを減少させるこの方法の前臨床検証のために実施する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

2023058509000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2023-02-16

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、
前記第１のサブユニットは、前記認識配列の第１の認識ハーフサイトに結合し、前記第１のサブユニットは、
（ａ）配列番号６～１４のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、
（ｂ）第１の超可変（ＨＶＲ１）領域と
を含み、
前記第２のサブユニットは、前記認識配列の第２の認識ハーフサイトに結合し、前記第２のサブユニットは、
（ｉ）配列番号６～１４のいずれか１つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、
（ｉｉ）第２の超可変（ＨＶＲ２）領域と
を含む、配列番号４を含む認識配列を認識し切断する操作されたメガヌクレアーゼ。

【外国語明細書】