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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023059809
(43)【公開日】2023-04-27
(54)【発明の名称】セラミド含有組成物、およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 8/42 20060101AFI20230420BHJP
A61K 8/34 20060101ALI20230420BHJP
A61K 8/60 20060101ALI20230420BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20230420BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20230420BHJP
A61K 31/7028 20060101ALI20230420BHJP
A61K 31/164 20060101ALI20230420BHJP
A61K 31/05 20060101ALI20230420BHJP
A61K 36/87 20060101ALI20230420BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20230420BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20230420BHJP
A61P 17/16 20060101ALN20230420BHJP
A61P 17/18 20060101ALN20230420BHJP
【ＦＩ】
A61K8/42
A61K8/34
A61K8/60
A61Q19/00
A61Q19/08
A61K31/7028
A61K31/164
A61K31/05
A61K36/87
A23L33/105
C12N5/071
A61P17/16
A61P17/18
【審査請求】未請求
【請求項の数】32
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022094514
(22)【出願日】2022-06-10
(31)【優先権主張番号】P 2021169620
(32)【優先日】2021-10-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】500101243
【氏名又は名称】株式会社ファーマフーズ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】金 有宏
(72)【発明者】
【氏名】山田 裕晃
(72)【発明者】
【氏名】アンガ サンジャヤ
(72)【発明者】
【氏名】金 英一
(72)【発明者】
【氏名】山津 敦史
(72)【発明者】
【氏名】金 武祚
【テーマコード（参考）】
4B018
4B065
4C083
4C086
4C088
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B018MD52
4B018MD93
4B018MD94
4B018ME06
4B018ME10
4B018ME14
4B018MF01
4B065AA93X
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA22
4B065BB06
4B065BB10
4B065BB26
4B065BD27
4B065BD43
4B065CA41
4B065CA44
4B065CA50
4B065CA60
4C083AA031
4C083AA032
4C083AA111
4C083AA112
4C083AC471
4C083AC472
4C083AC641
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4C083AD391
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4C083EE12
4C083FF01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA05
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA63
4C086NA14
4C086ZA89
4C086ZC52
4C088AB56
4C088CA25
4C088MA52
4C088MA63
4C088NA14
4C088ZA89
4C088ZC52
4C206AA01
4C206AA02
4C206CA19
4C206GA03
4C206MA02
4C206MA04
4C206MA72
4C206MA83
4C206NA14
4C206ZA89
4C206ZC52
(57)【要約】
【課題】 天然物由来のセラミドを含有する組成物を提供すること。
【解決手段】 本願発明は、ポリフェノールおよびセラミドを含有する組成物を提供する。また本願発明は、ワイン発酵粕由来のセラミド含有組成物を提供する。またセラミド含有組成物を製造する方法であって、ワイン発酵粕を洗浄する工程と、該洗浄によって得られた残渣物を極性溶媒で抽出する工程とを含む、方法が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】 本願発明は、ポリフェノールおよびセラミドを含有する組成物を提供する。また本願発明は、ワイン発酵粕由来のセラミド含有組成物を提供する。またセラミド含有組成物を製造する方法であって、ワイン発酵粕を洗浄する工程と、該洗浄によって得られた残渣物を極性溶媒で抽出する工程とを含む、方法が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリフェノールおよびセラミドを含有する美容用および／または経口摂取用組成物。
【請求項2】
前記セラミドが、フリーセラミドおよびグルコシルセラミドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記組成物が、少なくとも約１重量％のフリーセラミドを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記組成物が、少なくとも約１重量％のグルコシルセラミドを含む、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項5】
前記組成物が、少なくとも約１重量％のポリフェノールを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記組成物におけるフリーセラミド、グルコシルセラミド、及びポリフェノールの重量比が、約０．７～約２．４：約１．０：約１．４～約１１．０である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記組成物におけるフリーセラミド、グルコシルセラミド、及びポリフェノールの重量比が、約１．０：約１．０：約１．０である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記組成物のｐＨが約５未満である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
約１００ｇあたり少なくとも約１０ｍｇのレスベラトロールを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
食品用である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
化粧料用である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
前記ポリフェノールおよび前記セラミドが、ワイン発酵粕由来である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
ケラチノサイトの分化を促進するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
セラミド合成を促進するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
ワイン発酵粕由来のセラミド含有組成物。
【請求項16】
前記セラミド含有組成物が、少なくとも約１重量％のフリーセラミドを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記セラミド含有組成物が、少なくとも約１重量％のグルコシルセラミドを含む、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記セラミド含有組成物が、少なくとも約１重量％のポリフェノールを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
前記組成物におけるフリーセラミド、グルコシルセラミド、及びポリフェノールの重量比が、約０．７～約２．４：約１．０：約１．４～約１１．０である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
前記セラミド含有組成物におけるフリーセラミド、グルコシルセラミド、及びポリフェノールの重量比が、約１．０：約１．０：約１．０である、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項21】
前記セラミド含有組成物のｐＨが約５未満である、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
約１００ｇあたり少なくとも約１０ｍｇのレスベラトロールを含む、請求項１５～２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項23】
食品用である、請求項１５～２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項24】
化粧料用である、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項25】
ケラチノサイトの分化を促進するための、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項26】
セラミド合成を促進するための、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項27】
セラミド含有組成物を製造する方法であって、
ワイン発酵粕を洗浄する工程と、
該洗浄によって得られた残渣物を極性溶媒で抽出する工程と
を含む、方法。
ワイン発酵粕を洗浄する工程と、
該洗浄によって得られた残渣物を極性溶媒で抽出する工程と
を含む、方法。
【請求項28】
前記極性溶媒がエタノールを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記エタノールの濃度が約９５％である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記洗浄する工程が水によって行われる、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記抽出する工程によって得られた抽出物をｐＨ調整する工程をさらに含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記ｐＨ調整が酒石酸またはクエン酸によって行われる、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はセラミドを含有する組成物に関する。より具体的には、ポリフェノールおよびセラミド、特にフリーセラミドを含有する組成物、及びそれを製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
セラミドはスフィンゴ脂質の一種であり、角層細胞間脂質の主成分である。セラミドは、皮膚への塗布や経口摂取により、皮膚のバリヤー効果（表面保護）をはじめ、保湿効果、水分調節、弾力性保持、コラーゲン保護、酸化防止等の効果が期待されることから、セラミドを配合した化粧品や機能性食品が多数提供されている。
【0003】
セラミドの中でも植物由来のセラミド原料は、コンニャクやコメなど多くの植物から実用化されており、いずれもグルコシルセラミド（糖セラミド）を主成分とし、主に食品用原料として使用されている。
【0004】
一方で、これらのグルコシルセラミドは非ヒト型セラミドであり、ヒト型セラミドとは構造が異なる。またヒト型セラミドは、糖やリン酸が結合していない遊離の形（フリーセラミド）をとり、通常の生きた細胞には含まれないことから、自然界にはほとんど存在していない成分となる。そのため、天然物由来のフリーセラミドの開発が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、ポリフェノールとセラミド（特に、フリーセラミド）とを含む、健康および／または美容に有用な新規組成物を見出した。本発明者らはまた、ワイン醸造の際に生成される発酵粕に対して特定の処理を行うことにより、ポリフェノールに加えてセラミド（特に、フリーセラミド）を含む組成物を得ることができることを見出した。したがって、本願発明では、このようなポリフェノールおよびセラミドを含有する天然物由来の組成物や、その製造方法を提供する。
【0006】
したがって、本発明の主要な観点によれば、以下の発明が提供される。
（項目１）
ポリフェノールおよびセラミドを含有する美容用および／または経口摂取用組成物。
（項目２）
前記セラミドが、フリーセラミドおよびグルコシルセラミドを含む、上記項目に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物が、少なくとも約１重量％のフリーセラミドを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４）
前記組成物が、少なくとも約１重量％のグルコシルセラミドを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
前記組成物が、少なくとも約１重量％のポリフェノールを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
前記組成物におけるフリーセラミド、グルコシルセラミド、及びポリフェノールの重量比が、約０．７～約２．４：約１．０：約１．４～約１１．０である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
前記組成物におけるフリーセラミド、グルコシルセラミド、及びポリフェノールの重量比が、約１．０：約１．０：約１．０である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。（項目８）
前記組成物のｐＨが約５未満である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
約１００ｇあたり少なくとも約１０ｍｇのレスベラトロールを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
食品用である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
化粧料用である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
前記ポリフェノールおよび前記セラミドが、ワイン発酵粕由来である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３）
ケラチノサイトの分化を促進するための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４）
セラミド合成を促進するための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ１）
ワイン発酵粕由来のセラミド含有組成物。
（項目Ａ２）
前記セラミド含有組成物が、少なくとも約１重量％のフリーセラミドを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ３）
前記セラミド含有組成物が、少なくとも約１重量％のグルコシルセラミドを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ４）
前記セラミド含有組成物が、少なくとも約１重量％のポリフェノールを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ５）
前記組成物におけるフリーセラミド、グルコシルセラミド、及びポリフェノールの重量比が、約０．７～約２．４：約１．０：約１．４～約１１．０である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ６）
前記セラミド含有組成物におけるフリーセラミド、グルコシルセラミド、及びポリフェノールの重量比が、約１．０：約１．０：約１．０である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ７）
前記セラミド含有組成物のｐＨが約５未満である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ８）
約１００ｇあたり少なくとも約１０ｍｇのレスベラトロールを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ９）
食品用である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ１０）
化粧料用である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ１１）
ケラチノサイトの分化を促進するための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ１２）
セラミド合成を促進するための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ｂ１）
セラミド含有組成物を製造する方法であって、
ワイン発酵粕を洗浄する工程と、
該洗浄によって得られた残渣物を極性溶媒で抽出する工程と
を含む、方法。
（項目Ｂ２）
前記極性溶媒がエタノールを含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ３）
前記エタノールの濃度が約９５％である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ４）
前記洗浄する工程が水によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ５）
前記抽出する工程によって得られた抽出物をｐＨ調整する工程をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ６）
前記ｐＨ調整が酒石酸またはクエン酸によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１）
ケラチノサイトの分化を促進するための方法であって、上記項目のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
（項目Ｃ２）
セラミド合成を促進するための方法であって、上記項目のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
（項目１）
ポリフェノールおよびセラミドを含有する美容用および／または経口摂取用組成物。
（項目２）
前記セラミドが、フリーセラミドおよびグルコシルセラミドを含む、上記項目に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物が、少なくとも約１重量％のフリーセラミドを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４）
前記組成物が、少なくとも約１重量％のグルコシルセラミドを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
前記組成物が、少なくとも約１重量％のポリフェノールを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
前記組成物におけるフリーセラミド、グルコシルセラミド、及びポリフェノールの重量比が、約０．７～約２．４：約１．０：約１．４～約１１．０である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
前記組成物におけるフリーセラミド、グルコシルセラミド、及びポリフェノールの重量比が、約１．０：約１．０：約１．０である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。（項目８）
前記組成物のｐＨが約５未満である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
約１００ｇあたり少なくとも約１０ｍｇのレスベラトロールを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
食品用である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
化粧料用である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
前記ポリフェノールおよび前記セラミドが、ワイン発酵粕由来である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３）
ケラチノサイトの分化を促進するための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４）
セラミド合成を促進するための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ１）
ワイン発酵粕由来のセラミド含有組成物。
（項目Ａ２）
前記セラミド含有組成物が、少なくとも約１重量％のフリーセラミドを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ３）
前記セラミド含有組成物が、少なくとも約１重量％のグルコシルセラミドを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ４）
前記セラミド含有組成物が、少なくとも約１重量％のポリフェノールを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ５）
前記組成物におけるフリーセラミド、グルコシルセラミド、及びポリフェノールの重量比が、約０．７～約２．４：約１．０：約１．４～約１１．０である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ６）
前記セラミド含有組成物におけるフリーセラミド、グルコシルセラミド、及びポリフェノールの重量比が、約１．０：約１．０：約１．０である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ７）
前記セラミド含有組成物のｐＨが約５未満である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ８）
約１００ｇあたり少なくとも約１０ｍｇのレスベラトロールを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ９）
食品用である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ１０）
化粧料用である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ１１）
ケラチノサイトの分化を促進するための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ１２）
セラミド合成を促進するための、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ｂ１）
セラミド含有組成物を製造する方法であって、
ワイン発酵粕を洗浄する工程と、
該洗浄によって得られた残渣物を極性溶媒で抽出する工程と
を含む、方法。
（項目Ｂ２）
前記極性溶媒がエタノールを含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ３）
前記エタノールの濃度が約９５％である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ４）
前記洗浄する工程が水によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ５）
前記抽出する工程によって得られた抽出物をｐＨ調整する工程をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ６）
前記ｐＨ調整が酒石酸またはクエン酸によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１）
ケラチノサイトの分化を促進するための方法であって、上記項目のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
（項目Ｃ２）
セラミド合成を促進するための方法であって、上記項目のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【0007】
本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【0008】
なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【発明の効果】
【0009】
本願発明の方法により、ポリフェノールおよびセラミド、特にヒト型のフリーセラミドを含有する組成物を得ることができる。また、ワイン発酵粕からそのような組成物を得る場合には特に、ワイン発酵粕という安全性の高い天然の材料を使用しているため、機能性食品や化粧品などに配合しても、人体に対して悪影響を及ぼすことなく、安全性に優れ、利用価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図3】図３は、セラミド含有組成物の製法における洗浄工程の検討に用いた、セラミド含有組成物の製法フローを示す模式図である。図３左は原料のワイン澱から９５％エタノールでセラミドエキスを抽出した場合、図３右は原料のワイン澱を５０％エタノールで洗浄した場合をそれぞれ示す。
【図5】図５は、洗浄工程の相違（原料のワイン澱から９５％エタノールでセラミドエキスを抽出した場合、および原料のワイン澱を５０％エタノールで洗浄した場合）によるセラミド含有組成物の組成の相違を示す一実施形態に係るグラフである。図５は各成分の割合を示している。
【図6】図６は、セラミド含有組成物の製法における洗浄工程の検討に用いた、セラミド含有組成物の製法フローを示す模式図である。原料のワイン澱を水、１０％、３０％、または５０％エタノールで洗浄した場合を示す。
【図7】図７は、洗浄工程の相違（原料のワイン澱を水、１０％、３０％、または５０％エタノールで洗浄した場合）によるセラミド含有組成物の組成の相違を示す一実施形態に係るグラフである。図７左は各成分の割合を、図７右は各成分の含有量（ｍｇ）を、それぞれ示している。
【図9】図９は、洗浄工程の相違（原料のワイン澱を４０℃または６０℃の水で洗浄した場合）によるセラミド含有組成物の組成の相違を示す一実施形態に係るグラフである。図９左は各成分の割合を、図９右は各成分の含有量（ｍｇ）を、それぞれ示している。
【図10】図１０は、セラミド含有組成物の製法における洗浄工程の検討に用いた、セラミド含有組成物の製法フローを示す模式図である。原料のワイン澱を３０、６０、または１８０分にわたって水で洗浄した場合を示す。
【図11】図１１は、洗浄工程の相違（原料のワイン澱を３０、６０、または１８０分にわたって水で洗浄した場合）によるセラミド含有組成物の組成の相違を示す一実施形態に係るグラフである。図１１左は各成分の割合を、図１１右は各成分の含有量（ｍｇ）を、それぞれ示している。
【図13】図１３は、洗浄工程の相違（原料のワイン澱を１０倍、８．３倍、６．７倍の加水量で洗浄した場合）によるセラミド含有組成物の組成の相違を示す一実施形態に係るグラフである。図１１左は各成分の割合を、図１１右は各成分の含有量（ｍｇ）を、それぞれ示している。
【図14】図１４は、セラミド含有組成物の製法におけるｐＨ調整の検討に用いた、セラミド含有組成物の製法フローを示す模式図である。原料のワイン澱から抽出されたセラミドエキスに酒石酸、クエン酸、または炭酸ナトリウムを添加した場合を示す。
【図16】図１６は、セラミド含有組成物のヒト表皮細胞の増殖への影響を示す一実施形態に係るグラフである。セラミド含有組成物を様々な濃度で添加した培地でヒト表皮細胞（Ｈａｃａｔ細胞）を培養すると、無添加の培地に比べて、セラミド含有組成物の処理群では細胞増殖活性が顕著に増加した。
【図18】図１８は、本願発明の一実施形態に係るワインセラミドをヒト表皮ケラチノサイトＨａｃａｔ細胞株に添加し、７２時間培養した場合の分化マーカー（Ｐｒｏ－ＦｉｌａｇｇｒｉｎおよびＬｏｒｉｃｒｉｎ）のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図19】図１９は、本願発明の一実施形態に係るワインセラミドをヒト表皮ケラチノサイトＨａｃａｔ細胞株に添加し、７２時間培養した場合のセラミド合成経路マーカー（ＳＰＴ：Ｓｅｒｉｎｅ－Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図20】図２０は、本願発明の一実施形態に係るワインセラミド、グルコシルセラミド、およびフリーセラミドをヒト表皮ケラチノサイトＨａｃａｔ細胞株に添加し、７２時間培養した場合の分化マーカー（Ｐｒｏ－Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、およびセラミド合成経路マーカー（ＳＰＴ）のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図21】図２１は、本願発明の一実施形態に係るワインセラミド、およびワイン以外の原料から得られた各セラミド（米セラミド、パインセラミド、およびこんにゃくセラミド）をヒト表皮ケラチノサイトＨａｃａｔ細胞株に添加し、７２時間培養した場合の分化マーカー（Ｐｒｏ－Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、およびセラミド合成経路マーカー（ＳＰＴ）のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【0012】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【0013】
本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
【0014】
本明細書において、「セラミド」とは、スフィンゴ脂質の一種であり、スフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合した化合物群をいう。本明細書において、「セラミド」には、セラミドの誘導体も含まれる。セラミドはスフィンゴイド塩基のアミノ基（－ＮＨ２）に脂肪酸のカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）が結合した構造（－ＮＨ－ＣＯ－）を有する化合物である。セラミドのスフィンゴイド塩基のアルコール性ヒドロキシル基（－ＯＨ）に、さらに糖及びリン酸などの極性基が結合し、それぞれスフィンゴ糖脂質及びスフィンゴリン脂質となる。ここで、糖が結合したものを特にグリコシルセラミドと呼び、特に糖がグルコースである場合、グルコシルセラミドと呼ぶ。セラミドに糖やリン酸などが結合していない場合にフリーセラミドと呼ぶ。フリーセラミドは一般にはスフィンゴ脂質合成系の中間代謝物であるため、特に動物及び植物においては、微量しか存在しない。ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、およびスフィンゴミエリンなどのように、セラミドに糖やリン酸が結合したものは、動植物から抽出されるものの、糖やリン酸が結合しているために、細胞間脂質中での配向性がフリーセラミドとは異なる。
【0015】
本明細書において、「ポリフェノール」とは、分子内に複数のフェノール性水酸基を有する化合物の総称をいい、具体的には、フラボノール、フラボン、イソフラボン、タンニン、カテキン、ケルセチン、アントシアニン、アントシアニジン、ロイコアントシアニジン、プロアントシアニジン、没食子酸プロピル、カテキン、ルチン、ケルセチン、フェルラ酸、レスベラトロール、プロシアニジン、テアフラビン、クルクミン、ピクノジェノール、ロズマリン酸、エラグ酸、キナ酸、クロロゲン酸、ヒドロキシチロソール等が挙げられる。
【0016】
本明細書において、「洗浄」とは、ワイン発酵粕（ワイン澱）と液体を攪拌しながら混合して不純物を洗い流して除去することをいう。
【0017】
本明細書において、「抽出」とは、溶液に含まれる分析対象物とそれ以外の不純物とを分離することを意味し、溶媒抽出または液液抽出ともいう。
【0018】
（好ましい実施形態）
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
【0019】
本願発明の一局面において、ポリフェノールおよびセラミドを含有する美容用および／または経口摂取用組成物が提供される。また本開示の他の局面において、ワイン発酵粕由来のセラミド含有組成物が提供される。ポリフェノールおよびセラミドを含有する美容用および／または経口摂取用組成物、並びにワイン発酵粕由来のセラミド含有組成物は、ともにセラミドを含有するものであるため、本明細書においては、特に言及する場合を除いて、まとめて「セラミド含有組成物」ということができる。また本明細書において、本願発明のセラミド含有組成物を「ワインセラミド」と呼ぶ場合がある。
【0020】
セラミドは、スフィンゴ脂質の一種であり、スフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合した化合物群を含む。またセラミドは、分子中に１個以上の長鎖の直鎖および／もしくは分岐アルキルまたはアルケニル基、さらに、少なくとも２個以上の水酸基、１個以上のアミド基（および／またはアミノ基）を有する非イオン系両親媒性物質であってもよい。また、セラミドは、前記非イオン系両親媒性物質の水酸基にフォスファチジルコリン残基、または糖残基が結合した物質（いわゆるセラミド誘導体の一種）であってもよい。
【0021】
一実施形態において、セラミドには、フリーセラミドおよびグルコシルセラミドが含まれる。例えば、好ましい一実施態様において、セラミドとしては、植物由来のセラミドが含まれ、好ましくはワイン発酵粕由来のセラミドを含む。
【0022】
フリーセラミドとしては、化粧品や皮膚外用剤、または食品用に用いることができるものであれば特に限定されず、セラミド１、セラミド２、セラミド３、セラミド３Ｂ、セラミド４、セラミド５、セラミド６、セラミド６Ｉ、およびセラミド６ＩＩなどの天然フリーセラミドを挙げることができる。本願発明のセラミド含有組成物は、その取得に際し、人体に対して悪影響を及ぼすことのない材料を用いて取得することが可能であるため、食品用や皮膚塗布用を始めとして、安全性が重要視される用途の原料として有効である。またヒト型のフリーセラミドを含むため、健康食品などの食品用原料としても適している。本開示の一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物は、これらのフリーセラミドの１種のみ、または２種以上の任意の混合比の組み合わせを含むことができる。
【0023】
本願発明のセラミド含有組成物におけるセラミドは皮膚の水分を蒸散させないバリア機能、バリア機能を回復する機能、毛髪にハリやコシを付与する機能、角質剥離作用促進し、皮膚を滑らかにする機能、皮膚や毛髪に適用された場合に保湿効果を発揮する機能、セラミド産生促進効果を発揮する機能など種々の機能を有するが、本願発明のセラミド含有組成物の機能はこれらの機能のうちの１つもしくは２つ以上に限定されるものではなく、これら機能以外のセラミドとしての機能を有していてもよい。
【0024】
本願発明の一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物は、皮膚に適用しても良いし、食用として用いることもできる。いずれの場合にも肌の保湿や、シミしわ改善、紫外線対策などを含む上記機能を享受することができる。
【0025】
本願発明の一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物は、皮膚に適用し、および／または食品として摂取することにより、皮膚におけるケラチノサイトの分化を促進し、および／またはセラミドのＤｅ ｎｏｖｏ合成を促進することができる。本願発明のセラミド含有組成物は、例えば、ケラチノサイトの分化マーカーの遺伝子発現を増加させることができる。ケラチノサイトの分化マーカーとしては、ケラチノサイトの分化を確認できるものであれば特に限られないが、好ましくは遺伝子マーカーを挙げることができ、例えば、Ｐｒｏ－Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ（肌の角質層を形成するタンパク質。天然保湿因子（ＮＭＦ）の原料）やＬｏｒｉｃｒｉｎ（角質層を正常に形成するための骨組みとなるタンパク質）などを挙げることができる。
【0026】
また本願発明のセラミド含有組成物は、例えば、セラミドの合成経路におけるセラミド合成に関連する遺伝子の発現を増強させることにより、セラミドの合成を促進することができる。セラミドのＤｅ ｎｏｖｏ合成は、Ｓｅｒｉｎｅ＋Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ＣｏＡ → ３－ｋｅｔｏ－ｓｐｈｉｎｇａｎｉｎｅ → Ｓｐｈｉｎｇａｎｉｎｅ → Ｄｉｈｙｄｒｏｃｅｒａｍｉｄｅ → Ｃｅｒａｍｉｄｅという経路が知られている。セラミド合成経路の分化マーカーとしては、セラミドの合成経路に関与するものであれば特に限られないが、好ましくは遺伝子マーカーを挙げることができ、例えば、ＳＰＴ：Ｓｅｒｉｎｅ－Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（セラミド ｄｅ ｎｏｖｏ合成経路の酵素）などを挙げることができる。ＳＰＴは、上記セラミド合成経路におけるＳｅｒｉｎｅ＋Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ＣｏＡから３－ｋｅｔｏ－ｓｐｈｉｎｇａｎｉｎｅへの変換を触媒する。
【0027】
また本願発明のセラミド含有組成物は、ケラチノサイトの増加および分化を促進することで、皮膚の厚さを増加させ、皮膚のターンオーバーも促進させることができる。
【0028】
本願発明の一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物は、少なくとも約０．０１重量％以上のフリーセラミドを含み、好ましくは少なくとも約０．１重量％以上、少なくとも約０．３重量％以上、少なくとも約０．５重量％以上、または少なくとも約０．８重量％以上のフリーセラミドを含むことができ、さらに好ましくは少なくとも約１重量％以上のフリーセラミドを含むことができる。
【0029】
本願発明の一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物は、少なくとも約０．０１重量％以上のグルコシルセラミドを含み、好ましくは少なくとも約０．１重量％以上、少なくとも約０．３重量％以上、少なくとも約０．５重量％以上、または少なくとも約０．８重量％以上のグルコシルセラミドを含むことができ、さらに好ましくは少なくとも約１重量％以上のグルコシルセラミドを含むことができる。
【0030】
ポリフェノールは、分子内に複数のフェノール性水酸基を有する化合物であり、本願発明の組成物に含まれるポリフェノールの種類については、特に制限されないが、例えば、フラボノール、フラボン、イソフラボン、タンニン、カテキン、ケルセチン、アントシアニン、アントシアニジン、ロイコアントシアニジン、プロアントシアニジン、没食子酸プロピル、カテキン、ルチン、ケルセチン、フェルラ酸、レスベラトロール、プロシアニジン、テアフラビン、クルクミン、ピクノジェノール、ロズマリン酸、エラグ酸、キナ酸、クロロゲン酸、ヒドロキシチロソール等が挙げられる。本願発明の組成物においては、これらのポリフェノールが１種単独で含まれていてもよく、また２種以上が組み合わせて含まれていてもよい。
【0031】
一実施形態において、本願発明の組成物におけるポリフェノールの含有量は、少なくとも約０．０１重量％以上であり、好ましくは少なくとも約０．１重量％以上、少なくとも約０．３重量％以上、少なくとも約０．５重量％以上、または少なくとも約０．８重量％以上であり、さらに好ましくは少なくとも約１重量％以上とすることができる。
【0032】
本願発明の一実施形態において、本願発明の組成物は、ポリフェノールとしてレスベラトロールを含むことができ、約１００ｇの本願発明の組成物あたり少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約７ｍｇ、または少なくとも約１０ｍｇのレスベラトロールを含むことができる。
【0033】
本願発明の一実施形態において、本願発明の組成物は、上記のようなグルコシルセラミド、フリーセラミド、及びポリフェノールを、その重量比で、グルコシルセラミド：フリーセラミド：ポリフェノール＝約１．０：約０．５～約３．０：約１．０～約１５．０、好ましくは約１．０：約０．７～約２．４：約１．４～約１１．０、さらに好ましくは約約１．０：約１．０：約１．０とすることができる。食品原料としてのセラミドについては、コンニャクやコメなど多くの植物由来のセラミドが製造されているが、いずれもグルコシルセラミドを主成分としているため、本願発明のセラミド含有組成物は、グルコシルセラミドと同程度に、またはそれ以上にフリーセラミドを含む点で有用である。
【0034】
他の実施形態において、本願発明の組成物は、セラミド及びポリフェノールを、その重量比で、総セラミド：ポリフェノール＝約１．０：約０．５～約５．０、好ましくは約１．０：約０．７～約４．０とすることができる。
【0035】
本願発明の他の局面において、セラミド含有組成物を製造する方法であって、ワイン発酵粕を洗浄する工程と、該洗浄によって得られた残渣物を極性溶媒で抽出する工程とを含む、方法が提供される。
【0036】
本願発明のセラミド含有組成物の製造方法は、ワイン醸造の際に得られるワイン発酵粕（澱）（Bitartrate）を洗浄し、その後、残渣物を極性溶媒で抽出し発酵物抽出液を得ることを特徴とする。ワイン発酵粕の原料となるブドウ品種や酵母の種類やワインの製法は特に限定されず、どのようなブドウ品種や製法を用いた場合でも、例えばワイン樽の底や壁面にたまる澱を本願発明のワイン発酵粕として利用することができる。ワイン発酵の際に使用するワイン酵母は特に限定されないが、自然酵母や培養酵母を利用することができる。したがって、どのような種類のワイン澱を出発原料としても、本願発明のセラミド含有組成物の製造方法により、セラミドやグルコシルセラミドの含量を高めた組成物をセルことができる。
【0037】
一実施形態において、極性溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、１，３－ブチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、酢酸エチル等の極性溶媒を使用することができる。これらの溶媒を２種以上混合してもよい。好ましくは、極性溶媒として、エタノール、またはエタノールと水の混合物である含水エタノールを用いると、本願発明のセラミド含有組成物を効率よく抽出することができる。
【0038】
極性溶媒としての含水エタノールを用いる場合、エタノールの濃度は特に限定されず、例えばエタノール濃度を約１０％～約９９％（ｗｔ／ｗｔ）とすることができ、好ましくはエタノール濃度を、少なくとも約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９３％以上、約９５％以上、約９８％以上、約９９％以上（ｗｔ／ｗｔ）とすることができる。
【0039】
一実施形態において、抽出工程における抽出温度としては、約３０℃～約８０℃、好ましくは約４０℃～約６０℃で行うことができる。また抽出時間としては、約１時間～約８時間、好ましくは、約３時間～約６時間とすることができる。
【0040】
抽出方法としては、撹拌抽出、連続抽出、浸漬抽出、向流抽出、超臨界抽出など任意の方法を採用することができ、室温ないし還流加熱下において任意の装置を使用することができる。好ましくは、本願発明の方法において、抽出方法としてはオール型やプロペラ型の撹拌機を用いて攪拌抽出を行うことができる。一実施形態において、攪拌抽出を行う場合には、所定の温度に加温しながら抽出タンク内でワイン澱と溶媒（エタノールなど）を攪拌させて抽出することができる。所定の時間にわたって攪拌した後、ろ過し、ろ液をセラミド画分（本願発明のセラミド含有組成物）とすることができる。抽出の規模は適宜設定することができ、そのため、他の実施形態において、ウォーターバス内にビーカーを設置し、そのビーカー内で、ワイン澱と溶媒（エタノールなど）を攪拌させて抽出することもできる。
【0041】
一実施形態において、洗浄工程では、ワイン発酵粕（ワイン澱）を水で洗浄することができる。一実施形態において、洗浄工程では、オール型やプロペラ型の撹拌機を用いてワイン発酵粕と水を攪拌しながら洗浄することができる。一実施形態において、ワイン発酵粕と水を混合する際に加温しながら攪拌することもできる。所定の時間にわたって攪拌した後、ろ過し、残渣を抽出工程で用いることができる。水としては、例えば精製水、滅菌水、水道水等が挙げられるが、不純物が少ない点で精製水又は滅菌水が好ましい。この場合、洗浄温度としては、約３０℃～約８０℃、好ましくは約４０℃～約６０℃で行うことができる。また洗浄時間としては、約５分～約６時間、好ましくは、約１時間～約２時間とすることができる。
【0042】
本願発明の一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物を製造する方法は、さらに、極性溶媒による抽出工程によって得られた抽出物をｐＨ調整することもできる。このようなｐＨ調整によって、得られたセラミド含有組成物の色彩を調整することができ、好ましくは所望のワイン色にすることもできる。このようなｐＨ調整は酸やアルカリによって行うことができ、酸やアルカリの種類は、本願発明のセラミド含有組成物の効果を損なわない範囲において、また化粧品、飲食品、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、サプリメント、医薬品、医薬部外品、または皮膚外用剤などに用いられるものであれば特に限られないが、例えば、リン酸、酒石酸、クエン酸、または炭酸ナトリウムなどによって行うことができる。
【0043】
一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物は、所望の用途に応じた色となるようにｐＨ調整することができ、上記のようなｐＨ調整によってセラミド含有組成物のｐＨを例えば約５未満、約４．８未満、約４．０未満、または約３．５未満とすることができる。
【0044】
その他、本願発明のセラミド含有組成物の抽出分離、精製、同定などは通常の操作を幅広く適用することができ、例えば、上記のような抽出工程によって得られたセラミド含有組成物を必要に応じてｐＨ調整し、さらに必要に応じて所望の賦形剤と混合し、濃縮、加熱殺菌、凍結乾燥などを行うこともできる。
【0045】
本願発明の1つの好ましい態様において、本願発明のセラミド含有組成物は、ワイン発酵粕（ワイン澱）を好ましくは約１０倍量の約６０℃の水で約１時間洗浄し、その後、残渣物を好ましくは約９５％のエタノール溶液を用いて約４０℃で約６時間にわたって抽出を行うことによって得ることができる。また本願発明の1つの好ましい態様において、本願発明のセラミド含有組成物は、上記のようにして得た抽出物を、ｐＨ約４．０未満に調整することができる。さらに本願発明の1つの好ましい態様において、本願発明のセラミド含有組成物は、シクロデキストリンなどの賦形剤と混合し、さらにエタノールを水に置換することにより濃縮し、約１２０℃で加熱殺菌し、凍結乾燥して粉末状にすることができる。
【0046】
本願発明の1つの好ましい態様において、本願発明のセラミド含有組成物は、上記のような製法で得ることにより、グルコシルセラミド、フリーセラミド、及びポリフェノールを、その重量比で、約１．０：約１．０：約１．０の割合で含むことができる。また本願発明の1つの好ましい態様において、本願発明のセラミド含有組成物は、上記のような製法で得ることにより、約１００ｇの本願発明の組成物あたり少なくとも約１０ｍｇのレスベラトロールを含むことができる。
【0047】
本願発明の方法により製造されたセラミド含有組成物は、様々な用途に適用または配合することができる。用途として、例えば、化粧品、医薬品、試薬、経口摂取用組成物（例えば、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、サプリメント、及び特定用途食品等）などが挙げられる。
【0048】
一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物を含む製品は、賦形剤、担体、または添加剤などを含んでいてもよく、その種類としては、通常使用され、かつ薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、またその配合量も適宜変更が可能である。例えば賦形剤としては、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられ、担体としては、滅菌水、生理食塩水、及び各種緩衝液等が挙げられ、添加剤としては、粘ちょう剤、緩衝材、保存剤、防腐剤等を挙げることができる。
【0049】
一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物を含む医薬品の剤型としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤や、注射剤、坐剤、塗布剤等の非経口剤とすることができる。これらの医薬品中の本願発明のセラミド含有組成物の配合量は特に限定されるものではなく、医薬品の種類や用途に応じて適宜設定することができる。
【0050】
一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物を含む経口摂取用組成物（例えば、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、サプリメント、及び特定用途食品等）は、必要に応じてデキストリン、乳糖、デンプン等の賦形剤や香料、色素、ゼラチン等とともに本願発明のセラミド含有組成物を配合させて製造することができる。これらの経口摂取用組成物に配合される本願発明のセラミド含有組成物の量は特に限定されるものではなく、経口摂取用組成物の種類や用途に応じて適宜設定することができる。また一実施形態において、これらの経口摂取用組成物にはその種類に応じて種々の成分を配合することができる。また一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物は通常消費される飲食品に添加することもできる。
【0051】
一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物は、化粧品、医薬品および医薬部外品を含む皮膚外用剤に配合することもできる。例えば、本願発明のセラミド含有組成物は、例えば、化粧水、乳液、クリーム、ローション、石鹸、洗顔料、入浴剤、オーデコロン、化粧オイル、日焼け・日焼け止めローション、パウダー、ファンデーション、香水、パック、アイクリーム、アイシャドー、マスカラ、アイライナー、口紅、リップクリーム、シャンプー、リンス、染毛剤、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤等に配合することができる。
【0052】
本願発明の一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物を含む皮膚外用剤（化粧品、医薬品および医薬部外品を含む）には、本願発明のセラミド含有組成物の作用を損なわない範囲において、通常の皮膚外用剤に用いられる各種成分、例えば、界面活性剤、加脂剤、毛髪保護剤、保湿剤、高分子類、紫外線吸収剤、金属封鎖剤、溶剤、ｐＨ調節剤、ビタミン類、酸化防止剤、酸化防止助剤、防腐剤、香料、油性成分、高級アルコール、脂肪酸、極性脂質、抗菌成分、粘度調整剤、色素などを配合できる。
【0053】
本願発明の一実施形態において、本願発明のセラミド含有組成物は、スプレードライ、凍結乾燥、または真空乾燥し、これを粉末、顆粒、または溶液にすることで皮膚外用剤、飲食品、医薬品などに容易に含有させることができる。
【0054】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【0055】
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例0056】
（実施例１：ワイン澱中のセラミド分子種）
ワイン澱（Ｂｉｔａｒｔｒａｔｅ）５０ｇを６０℃の水で１時間洗浄し、残渣物を得た。この残渣物について、９５％エタノールを用いて４０℃で６時間にわたって抽出した。この抽出物中におけるセラミド分子種について、同じく大豆から得られたセラミド分子種とその組成を比較した。結果を図１に示す。この結果からわかるとおり、大豆から得られたセラミドはグルコシルセラミドのみであり、フリーセラミドは含まれない一方で、ワイン澱から得られたセラミドにはグルコシルセラミドおよびフリーセラミドの両方が含まれる。大豆セラミドは、長良サイエンス株式会社製の大豆由来グルコシルセラミド純品を使用した。
ワイン澱（Ｂｉｔａｒｔｒａｔｅ）５０ｇを６０℃の水で１時間洗浄し、残渣物を得た。この残渣物について、９５％エタノールを用いて４０℃で６時間にわたって抽出した。この抽出物中におけるセラミド分子種について、同じく大豆から得られたセラミド分子種とその組成を比較した。結果を図１に示す。この結果からわかるとおり、大豆から得られたセラミドはグルコシルセラミドのみであり、フリーセラミドは含まれない一方で、ワイン澱から得られたセラミドにはグルコシルセラミドおよびフリーセラミドの両方が含まれる。大豆セラミドは、長良サイエンス株式会社製の大豆由来グルコシルセラミド純品を使用した。
【0057】
またワイン澱抽出物とワイン自体に含まれるセラミド分子種とその量を確認した結果が図２である。この結果から、ワイン自体にはフリーセラミドおよびグルコシルセラミドともに含まれないものの、ワイン澱から得られた抽出物中には、フリーセラミドおよびグルコシルセラミドともに含まれることがわかる。
【0058】
（実施例２：洗浄工程の検討１）
本実施例では、ワイン澱から抽出物を得る際の、原料となるワイン澱の洗浄工程について検討した。図３には、本実施例において検討したワイン澱抽出物（図中、「Ｗセラミドエキス」）の製法を示した。図３左では、ワイン澱から９５％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出し（６０℃、６時間）、その後その残渣物からさらに６０％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出した（６０℃、３時間）。図３右では、５０％エタノールを用いてワイン澱を洗浄し（４０℃、１時間）、その後、洗浄後の残渣物から９５％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出した（６０℃、６時間）。結果を図４および図５に示す。図４では各成分の含有量（ｍｇ）を、図５では各成分の割合を示した。
本実施例では、ワイン澱から抽出物を得る際の、原料となるワイン澱の洗浄工程について検討した。図３には、本実施例において検討したワイン澱抽出物（図中、「Ｗセラミドエキス」）の製法を示した。図３左では、ワイン澱から９５％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出し（６０℃、６時間）、その後その残渣物からさらに６０％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出した（６０℃、３時間）。図３右では、５０％エタノールを用いてワイン澱を洗浄し（４０℃、１時間）、その後、洗浄後の残渣物から９５％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出した（６０℃、６時間）。結果を図４および図５に示す。図４では各成分の含有量（ｍｇ）を、図５では各成分の割合を示した。
【0059】
この図からもわかるとおり、９５％エタノール抽出に続けて６０％エタノール抽出をした場合には、夾雑物が多く残ってしまう。一方で、初めに５０％エタノールを用いてワイン澱を洗浄し、続けて９５％エタノール抽出を行った場合には、夾雑物を減らすことができた。
【0060】
（実施例３：洗浄工程の検討２）
実施例２において、はじめにエタノール抽出を行うよりもワイン澱の洗浄を行ったほうが夾雑物を除去できることがわかったため、続いて、洗浄溶液の検討を行った。本実施例においては、水、１０％エタノール、３０％エタノール、または５０％エタノールを用いてワイン澱を洗浄し（いずれも４０℃で３時間）、その後、洗浄後の残渣物から９５％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出した（４０℃、６時間）（図６）。結果を図７に示す。
実施例２において、はじめにエタノール抽出を行うよりもワイン澱の洗浄を行ったほうが夾雑物を除去できることがわかったため、続いて、洗浄溶液の検討を行った。本実施例においては、水、１０％エタノール、３０％エタノール、または５０％エタノールを用いてワイン澱を洗浄し（いずれも４０℃で３時間）、その後、洗浄後の残渣物から９５％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出した（４０℃、６時間）（図６）。結果を図７に示す。
【0061】
この図からもわかるとおり、５０％エタノールで洗浄した場合に夾雑物を多く減らすことができたが、セラミド量やポリフェノール量も減少してしまった。また５０％エタノールで洗浄した場合には、得られたＷセラミドエキスがワイン色ではなくなっていた（図示せず）。一方で、水で洗浄した場合には、５０％エタノールで洗浄した場合と比べて夾雑物の量は多いものの、セラミド量やポリフェノール量は多く残り、夾雑物の量も１０％や３０％のエタノールで洗浄した場合と比べて減少することができた。このことから洗浄溶液は水が最適であることがわかった。
【0062】
（実施例４：洗浄温度の検討）
実施例３において、水での洗浄が最適であることがわかったため、続いて、洗浄温度の検討を行った。本実施例においては、４０℃、または６０℃の水を用いてワイン澱を洗浄し（いずれも５００ｍｌ、３時間）、その後、洗浄後の残渣物から９５％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出した（４０℃、６時間）（図８）。結果を図９に示す。
この図からもわかるとおり、６０℃で洗浄した場合には、４０℃で洗浄した場合に比べて夾雑物（図中、「ｏｔｈｅｒｓ」で示す）を大幅に減らすことができた。
実施例３において、水での洗浄が最適であることがわかったため、続いて、洗浄温度の検討を行った。本実施例においては、４０℃、または６０℃の水を用いてワイン澱を洗浄し（いずれも５００ｍｌ、３時間）、その後、洗浄後の残渣物から９５％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出した（４０℃、６時間）（図８）。結果を図９に示す。
この図からもわかるとおり、６０℃で洗浄した場合には、４０℃で洗浄した場合に比べて夾雑物（図中、「ｏｔｈｅｒｓ」で示す）を大幅に減らすことができた。
【0063】
（実施例５：洗浄時間の検討）
実施例４において、ワイン澱を水で洗浄する場合には６０℃で行うのが最適であることがわかったため、続いて、洗浄時間の検討を行った。本実施例においては、３０分、６０分、１８０分にわたってワイン澱を洗浄し（いずれも５００ｍｌ、６０℃）、その後、洗浄後の残渣物から９５％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出した（４０℃、６時間）（図１０）。結果を図１１に示す。
実施例４において、ワイン澱を水で洗浄する場合には６０℃で行うのが最適であることがわかったため、続いて、洗浄時間の検討を行った。本実施例においては、３０分、６０分、１８０分にわたってワイン澱を洗浄し（いずれも５００ｍｌ、６０℃）、その後、洗浄後の残渣物から９５％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出した（４０℃、６時間）（図１０）。結果を図１１に示す。
【0064】
この図からもわかるとおり、水で３０分間洗浄した場合には、夾雑物が一番除去できた。一方で、水で６０分間洗浄した場合には、夾雑物が除去されつつ、グルコシルセラミドおよびフリーセラミドの含有率が一番高くなった。このことから、洗浄時間は６０分とするのが最適であることがわかった。
【0065】
（実施例６：加水量の検討）
実施例４および５において、ワイン澱を水で洗浄する場合には６０℃で６０分間にわたって行うのが最適であることがわかったため、続いて、洗浄の際の加水量の検討を行った。本実施例においては、５０ｇ、６０ｇ、７５ｇのワイン澱に対して５００ｍｌの水で洗浄し（それぞれ１０倍加水、８．３倍加水、６．７倍加水。いずれも６０℃で１時間）、その後、洗浄後の残渣物から９５％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出した（４０℃、６時間）（図１２）。結果を図１３に示す。
実施例４および５において、ワイン澱を水で洗浄する場合には６０℃で６０分間にわたって行うのが最適であることがわかったため、続いて、洗浄の際の加水量の検討を行った。本実施例においては、５０ｇ、６０ｇ、７５ｇのワイン澱に対して５００ｍｌの水で洗浄し（それぞれ１０倍加水、８．３倍加水、６．７倍加水。いずれも６０℃で１時間）、その後、洗浄後の残渣物から９５％エタノールを用いてＷセラミドエキスを抽出した（４０℃、６時間）（図１２）。結果を図１３に示す。
【0066】
この図からもわかるとおり、１０倍加水（ワイン澱５０ｇ、水５００ｍｌ）で洗浄した場合には、８．３倍加水（ワイン澱６０ｇ、水５００ｍｌ）、６．７倍加水（ワイン澱７５ｇ、水５００ｍｌ）の場合に比べて夾雑物（図中、「ｏｔｈｅｒｓ」で示す）を大幅に減らすことができた。
【0067】
（実施例７：ｐＨ調整の検討）
実施例２～６において、ワイン澱からセラミド抽出物を得る際には、ワイン澱を１０倍加水量の６０℃の水で６０分間にわたって洗浄するのが最適であることがわかったため、続いて、エタノール抽出によって得られたＷセラミドエキスのｐＨの検討を行った。本実施例においては、エタノール抽出によって得られたＷセラミドエキスに対して、酒石酸、クエン酸、または炭酸ナトリウムを添加し、さらに賦形剤（シクロデキストリン）を添加した後、フリーズドライによって粉末化した場合の粉末色を確認した（図１４）。結果を図１５に示す。
実施例２～６において、ワイン澱からセラミド抽出物を得る際には、ワイン澱を１０倍加水量の６０℃の水で６０分間にわたって洗浄するのが最適であることがわかったため、続いて、エタノール抽出によって得られたＷセラミドエキスのｐＨの検討を行った。本実施例においては、エタノール抽出によって得られたＷセラミドエキスに対して、酒石酸、クエン酸、または炭酸ナトリウムを添加し、さらに賦形剤（シクロデキストリン）を添加した後、フリーズドライによって粉末化した場合の粉末色を確認した（図１４）。結果を図１５に示す。
【0068】
図１５からもわかるとおり、抽出エキスをｐＨ調整することにより、望ましい粉末の色に調整することが可能であることがわかった。特にクエン酸または酒石酸でｐＨ４．０またはｐＨ３．５に調整した場合には、ワイン色の粉末を得ることができた。
【0069】
（実施例８：細胞増殖試験）
本願発明のセラミド含有組成物による細胞増殖効果を調べるため、ヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ細胞）を用いて細胞増殖試験を行った。ヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ細胞）を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、播種２４時間後に、ワイン澱から得た様々な濃度のセラミド抽出物を含む培地で培養した。培養３時間後に、細胞増殖を測定した。細胞増殖はＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ ８（株式会社同人化学研究所製）を用いて測定した。結果を図１６に示す。
本願発明のセラミド含有組成物による細胞増殖効果を調べるため、ヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ細胞）を用いて細胞増殖試験を行った。ヒト表皮細胞（ＨａＣａＴ細胞）を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、播種２４時間後に、ワイン澱から得た様々な濃度のセラミド抽出物を含む培地で培養した。培養３時間後に、細胞増殖を測定した。細胞増殖はＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ ８（株式会社同人化学研究所製）を用いて測定した。結果を図１６に示す。
【0070】
これにより、ワイン澱から得られたセラミド抽出物は、ケラチノサイト細胞（ＨａＣａＴ細胞）において、細胞増殖を促進させることがわかった（図１６の０．０１～１μｇ／ｍＬ添加群を参照）。
【0071】
（実施例９：レスベラトロール量測定）
本実施例では、本願発明のセラミド含有組成物中のレスベラトロール量を測定した。レスベラトロールは抗酸化作用を持つポリフェノールの１種であり、赤ワインに含まれる成分として知られている。レスベラトロールを摂取することで、細胞の酸化を防ぎ、肌の弾力を改善するなどの効果が期待される。本実施例では、赤ワイン、ワイン澱（ワインクリスタル）、セラミド含有組成物（ワインセラミド）に含まれるレスベラトロールの量を、それぞれＨＰＬＣを用いて測定した。結果を図１７に示す。
本実施例では、本願発明のセラミド含有組成物中のレスベラトロール量を測定した。レスベラトロールは抗酸化作用を持つポリフェノールの１種であり、赤ワインに含まれる成分として知られている。レスベラトロールを摂取することで、細胞の酸化を防ぎ、肌の弾力を改善するなどの効果が期待される。本実施例では、赤ワイン、ワイン澱（ワインクリスタル）、セラミド含有組成物（ワインセラミド）に含まれるレスベラトロールの量を、それぞれＨＰＬＣを用いて測定した。結果を図１７に示す。
【0072】
この図からも明らかなとおり、本願発明のセラミド含有組成物（ワインセラミド）に含まれるレスベラトロール量は赤ワインまたはワイン澱（ワインクリスタル）に含まれるレスベラトロール量と比較して顕著に増加していることがわかる。
【0073】
（実施例１０：ワインセラミドによる各種遺伝子マーカーの発現増強効果）
ヒトケラチノサイト細胞株（ＨａＣａＴ）を１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で１２ｗｅｌｌプレートに播種し、１０％ ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地で培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。オーバーナイトで培養した後、ＤＭＳＯに溶かしたワインセラミドおよび他の原料由来のセラミド（表１）を所定の濃度で添加したＤＭＥＭ培地（ＦＢＳフリー）で７２時間培養した（ＤＭＳＯの最終添加濃度は０．１％）。他の原料由来のセラミドは、表１に記載した各メーカーから購入したものを利用した。ワインセラミドは、実施例２～６に示した最適な手法（１０倍加水による６０℃、６０分の水洗浄および４０℃、６時間の９５％エタノール抽出）によって抽出した。
ヒトケラチノサイト細胞株（ＨａＣａＴ）を１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で１２ｗｅｌｌプレートに播種し、１０％ ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地で培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。オーバーナイトで培養した後、ＤＭＳＯに溶かしたワインセラミドおよび他の原料由来のセラミド（表１）を所定の濃度で添加したＤＭＥＭ培地（ＦＢＳフリー）で７２時間培養した（ＤＭＳＯの最終添加濃度は０．１％）。他の原料由来のセラミドは、表１に記載した各メーカーから購入したものを利用した。ワインセラミドは、実施例２～６に示した最適な手法（１０倍加水による６０℃、６０分の水洗浄および４０℃、６時間の９５％エタノール抽出）によって抽出した。
【表1】
【0074】
ＤＭＳＯの最終濃度が０．１％となるように添加したＤＭＥＭ培地（ＦＢＳフリー）をコントロールとして用いた。７２時間培養後、細胞からｍＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡを作成した。これを用いて、ｑＰＣＲによって各マーカーのｍＲＮＡ発現を測定した。評価した各マーカーは以下のとおりである。
・分化マーカー；Pro-Filaggrin、Loricrin
・セラミド合成経路マーカー； Serine-Palmitoyl Transferase
・分化マーカー；Pro-Filaggrin、Loricrin
・セラミド合成経路マーカー； Serine-Palmitoyl Transferase
【0075】
結果を図１８～２１に示した。図１８に示すとおり、ワインセラミドはコントロールと比較して、分化マーカーであるＰｒｏ－Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ（肌の角質層を形成するタンパク質。天然保湿因子（ＮＭＦ）の原料）、およびＬｏｒｉｃｒｉｎ（角質層を正常に形成するための骨組みとなるタンパク質）のｍＲＮＡ発現量を増加させた。これにより、ワインセラミドはケラチノサイト分化を促進することがわかる。
【0076】
また図１９に示すとおり、ワインセラミドはコントロールと比較して、セラミド合成経路マーカーであるＳＰＴ：Ｓｅｒｉｎｅ－Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（セラミド ｄｅ ｎｏｖｏ合成経路の酵素）のｍＲＮＡ発現量を増加させた。これにより、ワインセラミドはセラミド合成経路を促進することがわかる。
【0077】
また図２０には、本発明のワインセラミドと、グルコシルセラミドおよびフリーセラミドとを比較した場合のＰｒｏ－Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ ｍＲＮＡ発現量およびＳＰＴ ｍＲＮＡ発現量を示した。グルコシルセラミドおよびフリーセラミドの添加量はワインセラミドに含まれるグルコシルセラミドおよびフリーセラミドの同等量で算出し、具体的には、ワインセラミド１μｇ／ｍＬ、グルコシルセラミド０．０７５μｇ／ｍＬ、フリーセラミド０．０３５μｇ／ｍＬを用いた。グルコシルセラミドおよびフリーセラミドは、ワインセラミドから単離したものを使用した。この図からもわかるとおり、ワインセラミドはグルコシルセラミド単独またはフリーセラミド単独の場合よりもそれぞれのｍＲＮＡ発現量の増加効果が高い。
【0078】
また図２１には、本発明のワインセラミドと、ワイン以外の原料から得られた各セラミド（米セラミド、パインセラミド、およびこんにゃくセラミド）とを比較した場合のＰｒｏ－Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ ｍＲＮＡ発現量およびＳＰＴ ｍＲＮＡ発現量を示した。各セラミドの組成は表１に示したとおりである。この図からもわかるとおり、ワインセラミドは米セラミドまたはパインセラミドよりもそれぞれのｍＲＮＡ発現量の増加効果が高い。
【0079】
（実施例１１：ケラチノサイトに対するワインセラミドの効果）
トランスウェルを用いて３Ｄ培養した初代培養ケラチノサイトにおいて、ワインセラミドの有効性を評価した。ワインセラミドは実施例１０と同様のものを用いた。トランスウェルの角層側（Ｕｐｐｅｒウェル）および基底膜側（Ｂｏｔｔｏｍウェル）にそれぞれワインセラミド含有の培地を所定の時間添加して培養した。対照群として、ＤＭＳＯ ０．１％含有の培地にて培養した。各培地で培養した後、３Ｄ培養した初代培養ケラチノサイトの凍結切片を作成し、ヘマトキシリン・エオシン染色および抗セラミド抗体を用いた免疫染色を行った。
トランスウェルを用いて３Ｄ培養した初代培養ケラチノサイトにおいて、ワインセラミドの有効性を評価した。ワインセラミドは実施例１０と同様のものを用いた。トランスウェルの角層側（Ｕｐｐｅｒウェル）および基底膜側（Ｂｏｔｔｏｍウェル）にそれぞれワインセラミド含有の培地を所定の時間添加して培養した。対照群として、ＤＭＳＯ ０．１％含有の培地にて培養した。各培地で培養した後、３Ｄ培養した初代培養ケラチノサイトの凍結切片を作成し、ヘマトキシリン・エオシン染色および抗セラミド抗体を用いた免疫染色を行った。
【0080】
ヘマトキシリン・エオシン染色した切片を位相差顕微鏡下で観察し、表皮層の厚さを測定した結果を図２２に示した。この結果からわかるとおり、ワインセラミド処理により、皮膚の厚さが増加している。皮膚の厚さについては、加齢とともに皮膚のターンオーバーが低下して薄くなることが知られているため、今回の結果は、ワインセラミド処理によってケラチノサイトの増加および分化が促進され、皮膚のターンオーバーも促進したことが考えられる。
【0081】
また抗セラミド抗体で免疫染色した切片を蛍光顕微鏡下で観察し、表皮層中のセラミド含量を測定した結果を図２３に示した。この結果からわかりとおり、対照群と比較して、ワインセラミド処理した３Ｄ培養ケラチノサイトでは、免疫染色部分が拡大しており、セラミド量が増加している。実施例１０に示したとおり、平面培養（２Ｄ培養）において、セラミド合成経路マーカー（ＳＰＴ）のｍＲＮＡ発現量が増加していたことから、本実施例におけるセラミド量の増加は、セラミドの取り込みだけではなく、セラミドの新規合成が増加したことがわかる。
【0082】
（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２１年１０月１５日に出願された特願２０２１－１６９６２０に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２１年１０月１５日に出願された特願２０２１－１６９６２０に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【0083】
本願発明により、ワイン発酵粕由来のセラミド含有組成物を提供することができる。また本願発明の方法によれば、ワイン発酵粕を原料として、夾雑物を除去しながらセラミド組成物の安定的な抽出が可能となり、またセラミド組成物の色も制御することができる。さらに本願発明のセラミド組成物はフリーセラミドを含み、ワイン発酵粕という安全性の高い天然の材料を使用しているため、機能性食品や化粧品などに配合しても、人体に対して悪影響を及ぼすことなく、安全性に優れているため、化粧品、医薬品、及び医薬部外品などの分野において有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
