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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023061389
(43)【公開日】2023-05-01
(54)【発明の名称】医薬組成物、抗体、及び核酸分子
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20230421BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230421BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20230421BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230421BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230421BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 S
C12N15/13 ZNA
C07K16/10
A61P31/14
C12P21/08
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022167074
(22)【出願日】2022-10-18
(31)【優先権主張番号】P 2021170471
(32)【優先日】2021-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告） ○ 令和３年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業、「ＶＨＨ抗体技術を用いた新規ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願 ○ 令和元年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業 共創の場形成支援（産学共創プラットフォーム共同研究推進プログラム）「安全な酸化剤による革新的な酸化反応活性化制御技術の創出に関する国立大学法人大阪大学による研究開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】518190064
【氏名又は名称】株式会社ＣＯＧＮＡＮＯ
(71)【出願人】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(71)【出願人】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110003281
【氏名又は名称】弁理士法人大塚国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】前田 良太
(72)【発明者】
【氏名】藤田 純三
(72)【発明者】
【氏名】高折 晃史
(72)【発明者】
【氏名】白川 康太郎
(72)【発明者】
【氏名】笠井 一樹
(72)【発明者】
【氏名】山崎 寛章
(72)【発明者】
【氏名】伊村 明浩
(72)【発明者】
【氏名】牧野 文信
(72)【発明者】
【氏名】難波 啓一
(72)【発明者】
【氏名】山口 桂史
(72)【発明者】
【氏名】井上 豪
(72)【発明者】
【氏名】安齋 樹
(72)【発明者】
【氏名】松浦 善治
(72)【発明者】
【氏名】淺原 時泰
(72)【発明者】
【氏名】森口 舞子
【テーマコード（参考）】
4B064
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4C085AA14
4C085BA71
4C085BB11
4C085BB31
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】新型コロナウイルスに対して中和活性を有する新たな抗体を提供する。
【解決手段】Ｃｏｖｉｄ－１９を予防又は治療するための医薬組成物。配列番号１～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体を含有する。
【選択図】図４
【解決手段】Ｃｏｖｉｄ－１９を予防又は治療するための医薬組成物。配列番号１～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体を含有する。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃｏｖｉｄ－１９を予防又は治療するための医薬組成物であって、
配列番号１～９、４３、及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体を含有する、医薬組成物。
配列番号１～９、４３、及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体を含有する、医薬組成物。
【請求項2】
Ｃｏｖｉｄ－１９を予防又は治療するための医薬組成物であって、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含有し、
前記抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、
（ｉ）配列番号１～９、４３、及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する、
（ｉｉ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｉｉｉ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｉｖ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１７で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１８で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｖ）配列番号１９で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｖｉ）配列番号２２で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２３で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｖｉｉ）配列番号２５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２７で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｖｉｉｉ）配列番号２８で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２９で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３０で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｉｘ）配列番号３１で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３２で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３３で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｘ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、又は、
（ｘｉ）配列番号４４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
医薬組成物。
前記抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、
（ｉ）配列番号１～９、４３、及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する、
（ｉｉ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｉｉｉ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｉｖ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１７で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１８で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｖ）配列番号１９で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｖｉ）配列番号２２で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２３で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｖｉｉ）配列番号２５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２７で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｖｉｉｉ）配列番号２８で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２９で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３０で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｉｘ）配列番号３１で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３２で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３３で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
（ｘ）配列番号３４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、又は、
（ｘｉ）配列番号４４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
医薬組成物。
【請求項3】
前記抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体はＶＨＨ抗体である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の３４９番、３５１番、４６８番、４７０番、又は４７１番のアミノ酸残基に対応するエピトープに結合する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
【請求項5】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に加えてＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）に結合する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
【請求項6】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質のｄｏｗｎ状態の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
【請求項7】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の３７５番、３７６番、４０５番、４０８番、又は５０５番のアミノ酸残基に対応するエピトープに結合する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
【請求項8】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質の２つの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の間に結合する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
【請求項9】
前記抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体はＶＨＨ抗体である、請求項４から８のいずれか１項に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
【請求項10】
Ｃｏｖｉｄ－１９を予防又は治療するための医薬組成物であって、
請求項４から９のいずれか１項に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含有する、医薬組成物。
請求項４から９のいずれか１項に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含有する、医薬組成物。
【請求項11】
請求項４から９のいずれか１項に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体をコードする、核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体に関し、特に抗新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＶＨＨ抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
ＶＨＨ抗体は、ラクダ科（フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、及びアルパカ等）の血清中に含まれる重鎖抗体である。ＶＨＨ抗体は、通常の抗体と同様に抗原に特異的に結合できる一方で、認識能が高く、安定性も高いことから、注目が集まっている（例えば特許文献１～３参照）。また、ＶＨＨ抗体は通常アミノ酸鎖長が短いため、簡単に生産できる点でも優れている。特許文献４は、目的物質を認識するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列をロジカルに特定し、これを生産する方法を開示している。さらには、特許文献１，３に記載されているように、ＶＨＨ抗体を修飾すること、例えば抗原を認識するＶＨＨ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の前後のフレームワーク領域を変異させること、ＣＤＲのアミノ酸配列を他の種類の抗体に導入すること、も行われている。
【0003】
このような背景技術の下、非特許文献１は、新型コロナウイルスに対して中和能を有するＶＨＨ抗体の取得に成功したことを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特表２００５－５２０４９４号公報
【特許文献2】特開２０１７－１４１１２号公報
【特許文献3】特表２０１３－５０６４１１号公報
【特許文献4】国際公開第２０１９／２３０８２３号明細書
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】２０２０年５月７日付北里大学プレスリリース「北里大学大村智記念研究所片山和彦教授らの研究グループが新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）に対して感染抑制能（中和能）を有するVHH抗体の取得に成功」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
一方で、新型コロナウイルス感染症（Ｃｏｖｉｄ－１９）が広まっている中、新型コロナウイルスに対する中和活性を有するより多くの種類の抗新型コロナウイルス抗体を用意することが、社会的に求められている。
【0007】
本発明は、新型コロナウイルスに対して中和活性を有する新たな抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の一実施形態に係る医薬組成物は、Ｃｏｖｉｄ－１９を予防又は治療するための医薬組成物であって、配列番号１～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体を含有する。
【発明の効果】
【0009】
新型コロナウイルスに対して中和活性を有する新たな抗体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1A】ＶＨＨ抗体による細胞染色の結果を示す写真。
【図1B】ＶＨＨ抗体による細胞染色の結果を示す写真。
【図1C】ＶＨＨ抗体による細胞染色の結果を示す写真。
【図1D】ＶＨＨ抗体による細胞染色の結果を示す写真。
【図1E】ＶＨＨ抗体による細胞染色の結果を示す写真。
【図1F】ＶＨＨ抗体による細胞染色の結果を示す写真。
【図2A】ＶＨＨ抗体による細胞染色の結果を示す写真。
【図2B】ＶＨＨ抗体による細胞染色の結果を示す写真。
【図3A】ＶＨＨ抗体によるウエスタンブロッティングの結果を示す写真。
【図3B】ＶＨＨ抗体によるラテラルフローアッセイの結果を示す写真。
【図4】ウイルス中和アッセイの結果を示す図。
【図5】ＳＰＩＫＥタンパク質とＶＨＨ抗体の複合体の構造を示す図。
【図6】ＳＰＩＫＥタンパク質とＶＨＨ抗体の複合体の結合状態を示す図。
【図7】ＳＰＩＫＥタンパク質とＶＨＨ抗体の複合体の結合状態を示す図。
【図8】ＳＰＩＫＥタンパク質とＶＨＨ抗体の複合体の結合状態を示す図。
【図9】一実施形態に係るＶＨＨ抗体が認識するエピトープを示す図。
【図10】ＳＰＩＫＥタンパク質とＶＨＨ抗体の複合体の構造を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明の実施形態を詳しく説明する。なお、以下の実施形態は特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また実施形態で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明に必須のものとは限らない。実施形態で説明されている複数の特徴のうち二つ以上の特徴は任意に組み合わされてもよい。
【0012】
本発明の一実施形態に係る抗体は、配列番号１～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体である。また、本発明の別の一実施形態に係る抗体は、配列番号４３又は４８のアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体である。
【0013】
本発明の別の一実施形態に係る抗体は、配列番号１～９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する、抗新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）抗体である。また、本発明の別の一実施形態に係る抗体は、配列番号４３又は４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する、抗新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）抗体である。一実施形態において、相同性は９５％以上、９８％以上、又は９９％以上である。アミノ酸配列の相同性(Identity)は、タンパク質相同性解析プログラムであるＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｐを用いて評価される。一実施形態において、抗体はＶＨＨ抗体である。
【0014】
本発明の別の一実施形態に係る抗体は、抗体のＣＤＲとして、
配列番号１０で示されるＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＣＤＲ２、及び配列番号１２で示されるＣＤＲ３を有する、
配列番号１３で示されるＣＤＲ１、配列番号１４で示されるＣＤＲ２、及び配列番号１５で示されるＣＤＲ３を有する、
配列番号１６で示されるＣＤＲ１、配列番号１７で示されるＣＤＲ２、及び配列番号１８で示されるＣＤＲ３を有する、
配列番号１９で示されるＣＤＲ１、配列番号２０で示されるＣＤＲ２、及び配列番号２１で示されるＣＤＲを有する、
配列番号２２で示されるＣＤＲ１、配列番号２３で示されるＣＤＲ２、及び配列番号２４で示されるＣＤＲ３を有する、
配列番号２５で示されるＣＤＲ１、配列番号２６で示されるＣＤＲ２、及び配列番号２７で示されるＣＤＲを有する、
配列番号２８で示されるＣＤＲ１、配列番号２９で示されるＣＤＲ２、及び配列番号３０で示されるＣＤＲ３を有する、
配列番号３１で示されるＣＤＲ１、配列番号３２で示されるＣＤＲ２、及び配列番号３３で示されるＣＤＲを有する、又は、
配列番号３４で示されるＣＤＲ１、配列番号３５で示されるＣＤＲ２、及び配列番号３６で示されるＣＤＲ３を有する、抗新型コロナウイルス抗体である。本発明の別の一実施形態に係る抗体は、抗体のＣＤＲとして、配列番号４４で示されるＣＤＲ１、配列番号４５で示されるＣＤＲ２、及び配列番号４６で示されるＣＤＲ３を有する、抗新型コロナウイルス抗体である。一実施形態において、抗体はＶＨＨ抗体である。
配列番号１０で示されるＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＣＤＲ２、及び配列番号１２で示されるＣＤＲ３を有する、
配列番号１３で示されるＣＤＲ１、配列番号１４で示されるＣＤＲ２、及び配列番号１５で示されるＣＤＲ３を有する、
配列番号１６で示されるＣＤＲ１、配列番号１７で示されるＣＤＲ２、及び配列番号１８で示されるＣＤＲ３を有する、
配列番号１９で示されるＣＤＲ１、配列番号２０で示されるＣＤＲ２、及び配列番号２１で示されるＣＤＲを有する、
配列番号２２で示されるＣＤＲ１、配列番号２３で示されるＣＤＲ２、及び配列番号２４で示されるＣＤＲ３を有する、
配列番号２５で示されるＣＤＲ１、配列番号２６で示されるＣＤＲ２、及び配列番号２７で示されるＣＤＲを有する、
配列番号２８で示されるＣＤＲ１、配列番号２９で示されるＣＤＲ２、及び配列番号３０で示されるＣＤＲ３を有する、
配列番号３１で示されるＣＤＲ１、配列番号３２で示されるＣＤＲ２、及び配列番号３３で示されるＣＤＲを有する、又は、
配列番号３４で示されるＣＤＲ１、配列番号３５で示されるＣＤＲ２、及び配列番号３６で示されるＣＤＲ３を有する、抗新型コロナウイルス抗体である。本発明の別の一実施形態に係る抗体は、抗体のＣＤＲとして、配列番号４４で示されるＣＤＲ１、配列番号４５で示されるＣＤＲ２、及び配列番号４６で示されるＣＤＲ３を有する、抗新型コロナウイルス抗体である。一実施形態において、抗体はＶＨＨ抗体である。
【0015】
本発明の別の一実施形態に係る抗体は、抗体のＣＤＲとして、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号１６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１７で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１８で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号１９で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号２２で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２３で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号２５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２７で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号２８で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２９で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３０で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号３１で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３２で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３３で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、又は、
配列番号３４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、抗新型コロナウイルス抗体である。本発明の別の一実施形態に係る抗体は、抗体のＣＤＲとして、配列番号４４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、抗新型コロナウイルス抗体である。一実施形態において、抗体はＶＨＨ抗体である。
配列番号１０で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号１６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１７で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１８で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号１９で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号２２で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２３で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号２５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２７で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号２８で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２９で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３０で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、
配列番号３１で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３２で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３３で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、又は、
配列番号３４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、抗新型コロナウイルス抗体である。本発明の別の一実施形態に係る抗体は、抗体のＣＤＲとして、配列番号４４で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４５で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４６で示されるアミノ酸配列において０個若しくは１個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する、抗新型コロナウイルス抗体である。一実施形態において、抗体はＶＨＨ抗体である。
【0016】
本発明の別の一実施形態に係る抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の他の株と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特定の株に選択的に結合する抗体である。一実施形態において、抗体はＶＨＨ抗体である。
【0017】
本発明の別の一実施形態に係る抗体は、新型コロナウイルスのＳＰＩＫＥタンパク質に対する平衡解離定数ＫＤが１．５×１０－９Ｍ以下である抗体である。一実施形態において、抗体はＶＨＨ抗体である。
【0018】
本明細書において、抗体の意義は通常の用法に従うが、多量体及び抗原結合性断片を含む。例えば、一実施形態に係る抗体は、リンカーを介して二量体を形成していてもよい。具体例として、本発明の一実施形態に係る、配列番号１～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体は、同じＶＨＨ抗体とホモダイマーを形成していてもよいし、他の配列を有するＶＨＨ抗体とヘテロダイマーを形成していてもよい。
【0019】
ＶＨＨ抗体とは、シングルドメイン抗体又はナノボディとも呼ばれる重鎖抗体である。ＶＨＨは、一般に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の各領域により構成されている。ＦＲ１～ＦＲ４はフレームワーク領域と呼ばれる。また、フレームワーク領域に挟まれたＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、超可変性領域であり、相補性決定領域と呼ばれる。一般に、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３が抗原を認識し、抗原に特異的に結合すると考えられている。なお、各領域は、Elvin A. Kabat et al. "Sequence of proteins of immunological interest", NIH publication No. 91-3242、及びL. Riechmann et al. "Single domain antibodies: comparison of camel VH and camelised human VH domains", J. Immunol. Methods, 1999, 231, 25-38の記載に従って特定することができる。
【0020】
このようなＶＨＨ抗体は、アルパカ等のラクダ科の動物によって生産される。一方で、特定のアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体は、遺伝子合成を行い、遺伝子をプラスミドとして大腸菌に導入するなどの方法により、容易に生産可能である。
【0021】
一方で、ＶＨＨ抗体はヒト化されていてもよい。例えば、ＶＨＨ抗体のフレームワーク領域において、１つ又は複数のアミノ酸残基が、ヒト抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列に従って欠失、置換若しくは付加されてもよい。また、ＶＨＨ抗体はその他の手法で最適化されていてもよい。このような観点から、上記のように、配列番号１～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する抗体に加えて、これと一定の相同性を有する抗体、同一のＣＤＲを有する抗体、及びアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたＣＤＲを有する抗体も、抗新型コロナウイルス抗体として用いることができる。
【0022】
また、一実施形態に係る抗体には、さらなる分子が結合していてもよい。結合していてもよい分子としては、ポリペプチド鎖（例えばＶＨＨ抗体、免疫グロブリン、若しくはこれらの断片、又は酵素）、医薬品（例えば抗ウイルス剤）、発光物質、又はその他の化学物質（例えばポリエチレングリコール）などであってもよい。これらの分子は、リンカー配列を介してＶＨＨ抗体に結合していてもよい。本明細書において、抗体には、このように分子が結合するなどの方法で修飾された抗体も含まれる。
【0023】
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）には、野生型（武漢型）に加えて、ＶＯＣ２０２０１２／０１（英国型）、ＶＯＣ２０２０１２／０２（南アフリカ型）、及びブラジル型等の変異体がこれまで知られている。一実施形態に係る抗体は、これらの新型コロナウイルスのうちの少なくとも１つに対して結合する。本明細書では、抗体が結合する新型コロナウイルスのことを認識対象と呼ぶ。また、本明細書では、野生型と１又は複数のアミノ酸が異なる新型コロナウイルスのことを変異体と呼ぶ。
【0024】
一実施形態に係る抗体は、新型コロナウイルスのうちの１つに対して特異的に結合する。例えば、一実施形態に係る抗体は、別のコロナウイルス株（野生型又は変異体）と比較して、認識対象であるコロナウイルス株に対して選択的に結合する。また、別の実施形態に係る抗体は、これらの新型コロナウイルスのうちの全てに結合する。一方で、一実施形態に係る抗体は、従来型コロナウイルス（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）と比較して、認識対象に対して選択的に結合する。
【0025】
一実施形態において、抗体の認識対象に対する平衡解離定数ＫＤは、１×１０－７Ｍ以下、１×１０－８Ｍ以下、１．５×１０－９Ｍ以下、１．０×１０－９Ｍ以下、又は５．０×１０－１０Ｍ以下である。また、本明細書において、比較対象と比較して認識対象に対して選択的に結合するとは、認識対象に対する平衡解離定数ＫＤが、比較対象よりも１０倍以上小さいこと、１０２倍以上小さいこと、又は１０３倍以上小さいことを意味する。これらの平衡解離定数ＫＤは、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって測定される。
【0026】
一実施形態に係る抗体は、新型コロナウイルスのＳＰＩＫＥタンパク質、とりわけＳＰＩＫＥタンパク質のＳ１領域を認識するように設計されている。例えば、一実施形態に係る抗体は、ＳＰＩＫＥタンパク質のＳ２領域と比較して、ＳＰＩＫＥタンパク質のＳ１領域に対して選択的に結合する。
【0027】
一実施形態に係る抗体は、国際公開第２０１９／２３０８２３号明細書に記載の方法に従って、そのアミノ酸配列を特定することができる。例えば、新型コロナウイルスのＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（Ｓ１及びＳ２領域）を目的物質、Ｓ２領域を対照物質として用い、目的物質を認識する抗体のアミノ酸配列から対象物質を認識する抗体のアミノ酸配列をサブトラクトすることにより、Ｓ１領域を特異的に認識する抗体のアミノ酸配列を特定することができる。このような抗体は、新型コロナウイルス上の結合部位をブロックするために適している。一方で、新型コロナウイルスの特定の変異型のＳＰＩＫＥタンパク質を目的物質、従来型のコロナウイルス又は野生型の新型コロナウイルスのＳＰＩＫＥタンパク質を対照物質として用いることにより、新型コロナウイルス特定の変異型を特異的に認識する抗体のアミノ酸配列を特定することもできる。
【0028】
一実施形態に係る抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の特定のエピトープに結合する。Ｓ１領域はＲＢＤとＮ末端ドメインを含むことが知られている。後述する実施例に示すように、本願発明者らの検討により、ＲＢＤのうちＳ３４９、Ｙ３５１、Ｉ４６８、Ｔ４７０、及びＥ４７１に対応するエピトープに結合する抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を中和できることが確認された。
【0029】
一実施形態に係る抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の３４９番、３５１番、４６８番、４７０番、又は４７１番のアミノ酸残基に対応するエピトープに結合する。このような抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を中和するために用いることができる。また、これらのアミノ酸残基は、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の間で保存される傾向があるため、様々な変異株の感染を中和できることが期待される。なお、アミノ酸残基の番号は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株における番号を指す。また、特定のアミノ酸残基に対応するエピトープとは、特定のアミノ酸残基を含むエピトープのことを指す。抗体との結合界面に特定のアミノ酸残基が含まれる場合、抗体はこのアミノ酸残基に対応するエピトープに結合するということができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＳＰＩＫＥタンパク質における、上記のアミノ酸残基に対応するエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株との配列の比較を通じて特定することができる。例えば、変異株がアミノ酸配列の欠失、挿入、又は置換を受けていても、野生株のＳＰＩＫＥタンパク質の４６８番のアミノ酸残基に対応する、変異株のＳＰＩＫＥタンパク質のアミノ酸残基は、配列の比較により特定することができる。一実施形態に係る抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の４６８番～４７１番のアミノ酸残基に対応するエピトープに結合する。
【0030】
一実施形態に係る抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質のＲＢＤに加えてＮＴＤに結合する。本願発明者らの検討により、ＲＢＤに加えてＮＴＤに結合する抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への親和性が高く、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を中和できることが確認された。
【0031】
また、一実施形態に係る抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質のｄｏｗｎ状態のＲＢＤに結合する。本願発明者らの検討により、ｄｏｗｎ状態のＲＢＤに結合する抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を中和できることが確認された。
【0032】
一実施形態に係る抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染中和作用のＩＣ５０が１０μｇ／ｍＬ未満、５μｇ／ｍＬ未満、１μｇ／ｍＬ未満、又は０．１μｇ／ｍＬ未満である。感染を中和できるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としては、Ｄ６１４Ｇ変異株、α変異株、β変異株、又はδ変異株等が挙げられる。
【0033】
一実施形態に係る抗体は、新型コロナウイルスを認識するために用いることができる。例えば、酵素又は発光物質で標識した抗体を用いることにより、サンプル中に新型コロナウイルスが存在するか否かを検出することができる（例えばＥＬＩＳＡ法、ＣＩＡ法、又はＦＩＡ法）。また、一実施形態に係る抗体は、新型コロナウイルス上の結合部位をブロックするために用いることもできる。
【0034】
また、一実施形態に係る抗体は、Ｃｏｖｉｄ－１９を予防又は治療するために用いることができる。すなわち、一実施形態に係る医薬組成物は、Ｃｏｖｉｄ－１９を予防又は治療するための医薬組成物であって、上記の抗体を含有している。
【0035】
このような医薬組成物を必要とする対象に対して投与することにより、Ｃｏｖｉｄ－１９を予防又は治療することができる。投与対象は、ヒト又はその動物でありうる。また、投与対象は、Ｃｏｖｉｄ－１９に感染している患者、Ｃｏｖｉｄ－１９の感染リスクが高い対象であってもよい。
【0036】
医薬組成物は、上記の抗体以外の成分を含んでいてもよい。例えば、医薬組成物は、上記の抗体とは異なる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、又はＣｏｖｉｄ－１９治療に用いられる有効成分を含有していてもよい。例えば、複数種類の抗体を含有する医薬組成物は、いわゆる抗体カクテル治療のために用いることができる。一実施形態に係る抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の従来とは異なるエピトープを認識するため、抗体カクテルとして用いるために適している。また、医薬組成物は、担体、安定剤、又は賦形剤等の、薬学的に許容される添加物を含んでいてもよい。
【0037】
医薬組成物の形態は特に限定されないが、例えば凍結乾燥製剤又は溶液製剤であってもよい。医薬組成物の投与方法も特に限定されないが、例えば経皮投与、筋肉内投与、又は静脈内投与のような非経口投与であってもよい。
【0038】
医薬組成物の投与量及び投与間隔も特に限定されず、Ｃｏｖｉｄ－１９を予防又は治療するために十分な量の上記の抗体が投与されるように、医薬組成物の投与量及び投与間隔を定めることができる。投与量は、患者の体表面積、年齢、健康状態、及び併用薬のような要因に基づいて決定することができる。
【0039】
上記の抗体をコードする核酸分子も、本発明の範囲に含まれる。もちろん、このような核酸分子を含むベクター、及びこのようなベクターでトランスフェクトされた細胞も、本発明の範囲に含まれる。
【実施例0040】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。抗体の特定は、以下のとおり、国際公開第２０１９／２３０８２３号に記載の方法に従って行った。
【0041】
実施例１：アルパカにおける免疫応答の誘導
アルパカに対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質を注射することにより免疫応答を誘導した。注射による、アルパカにおける免疫応答は、公知の方法に従って実施した。
アルパカに対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質を注射することにより免疫応答を誘導した。注射による、アルパカにおける免疫応答は、公知の方法に従って実施した。
【0042】
具体的には、免疫抗原として、Ｄ６１４Ｇ変異を加えた及び加えていない全長のオリジナルＷＨ－１（GenBank：QHD43416）、Ｄ６１４Ｇ変異を加えた及び加えていないオリジナルＷＨ－１の細胞外ドメイン、並びにこれらに対してフリン切断部位の変異（Ｎ６７９ＳＰＲＲＡ又はＩＬ６８０）を導入したものを含む、組み換えＣｏＶ－２ＳＰＩＫＥ複合体を精製したものを用いた。これらのタンパク質混合物は、完全フロイントアジュバント中で乳化させて、２頭のアルパカに２週間の間隔で９回まで皮下注射した。
【0043】
実施例２：ＶＨＨ抗体ファージライブラリーの作製
実施例１に従って免疫応答をおこした１頭のアルパカの血液から、リンパ球を回収した。リンパ球に含まれるＶＨＨ抗体遺伝子群（ＶＨＨ抗体遺伝子ライブラリー）の取得、及びその遺伝子配列群を持つファージ群の作製（ＶＨＨ抗体ファージライブラリー）は、公知の方法を参照して実施した。
実施例１に従って免疫応答をおこした１頭のアルパカの血液から、リンパ球を回収した。リンパ球に含まれるＶＨＨ抗体遺伝子群（ＶＨＨ抗体遺伝子ライブラリー）の取得、及びその遺伝子配列群を持つファージ群の作製（ＶＨＨ抗体ファージライブラリー）は、公知の方法を参照して実施した。
【0044】
具体的には、頸静脈から血液サンプルを採取し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ（ナカライテスク社製）を用いたショ糖密度勾配で得た。ＰＢＭＣをＰＢＳで洗浄した後、ＲＮＡｌａｔｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に懸濁した。そして、ＰＢＭＣサンプルからトータルＲＮＡを分離した（Ｄｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）。それぞれ１μｇのトータルＲＮＡをテンプレートとし、ランダムな６量体プライマーを用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて、相補的ＤＮＡを合成した。重鎖可変ドメインのコーディング領域を、ＬＡ ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と、ＰＡＧＥ精製した２つのプライマー（ＣＡＬＬ００１：５’－ＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧ－３’（配列番号４１）及びＣＡＬＬ００２：５’－ＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣ－３’（配列番号４２））で増幅した。増幅した重鎖可変ドメインのコーディング遺伝子断片を、１．５％低融点アガロースゲル（Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ社製）で分離し、重鎖のみの免疫グロブリンに対応する約７００塩基対の下位バンドを抽出した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社製）。ＶＨＨドメインのコーディング遺伝子を増幅するためにＶＨＨ－ＰｓｔＩ－Ｆｏｒ及びＶＨＨ－ＢｓｔＥＩＩ－Ｒｅｖプライマーを用いてネスティッドＰＣＲを行い、ｐＭＥＳ４ファージミドベクター（ＧｅｎｅＡｒｔ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏ社製）へとサブクローニングした。エレクトロポレーションコンピテントな大腸菌ＴＧ１細胞（アジレントテクノロジージャパン社製）を、ライゲーションしたプラスミドを用いて低温条件で形質転換し、１マイクロリットルあたり１０７コロニー形成単位より高く維持するように、限界希釈で力価を確認した。８ｍＬの培養細胞からコロニーを採取してプールし、マザーライブラリとして凍結グリセロールストックに保存した。
【0045】
実施例３：目的物質と相互作用するＶＨＨ抗体の選択、及び実施例４：対照物質と相互作用するＶＨＨ抗体の選択
目的物質としてはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（Ｓ１領域及びＳ２領域）の三量体を用いた。磁気ビーズの製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨条件に従い、５０ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ（１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）と５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）試薬を使い、上記三量体を磁気ビーズ表面に存在する活性基（Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）へと共有結合させた。
目的物質としてはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（Ｓ１領域及びＳ２領域）の三量体を用いた。磁気ビーズの製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨条件に従い、５０ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ（１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）と５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）試薬を使い、上記三量体を磁気ビーズ表面に存在する活性基（Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）へと共有結合させた。
【0046】
実施例２で得られたファージ群を、目的物質が結合した磁気ビーズに結合させる方法は、磁気ビーズの製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨する条件で実施した。具体的には、目的物質が結合した磁気ビーズ２００μＬ分を、１．５ｍＬ容量のサンプルチューブに入れ、さらにファージ（１０００００００個以上）を加えて、ひと晩撹拌することで結合を飽和させた。磁気ビーズへの結合を飽和させた後、十分量のバッファー（界面活性剤入りトリス緩衝液 中性ｐＨ）で洗った（１ｍＬ、２０分撹拌を４回）。洗浄後に磁気ビーズに結合していたファージをプロテアーゼ処理で磁気ビーズからはがして回収した。
【0047】
回収したファージは、ファージ感染用の大腸菌（ＴＧ１コンピテントセル）に感染させて、大腸菌ライブラリーとして保存した。目的物質が結合した磁気ビーズに結合してきたＶＨＨ抗体の遺伝子配列群は、作成された大腸菌ライブラリーにプラスミドの形で存在しており、製造業者の推奨する方法で（Ｑｉａｇｅｎ）それらのプラスミドを精製した。
【0048】
対照物質としてはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質のＳ２領域を用いた。実施例３と同様に、Ｓ２領域を磁気ビーズに結合させ、実施例２で得られたファージ群のうち、磁気ビーズに結合したファージを回収して、大腸菌ライブラリーとして保存した。また、ＶＨＨ抗体の遺伝子配列を含むプラスミドを精製した。
【0049】
具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（目的物質）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質のＳ２領域のみ（対照物質）のそれぞれを、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化したマグネットビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｔｈｅｒｍｏ社製）にアミン結合させた。また、季節性風邪コロナウイルスＨＣｏＶ－ＯＣ４３のＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（対照物質）、及び触媒ポリペプチド様３Ｇ（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｉｋｅ（ＡＰＯＢＥＣ）３Ｇ（Ａ３Ｇ））も、同様にマグネットビーズに結合させた。１ラウンドのバイオパニングは、１％（ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド）（ＤＤＭ）（ナカライ社製）、０．１％ ３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）（ナカライ社製）、０．００１％コハク酸水素コレステロール（ＣＨＳ）（東京化成工業社製）、０．１％ラウリルマルトースネオペンチルグリコール（ＬＭＮＧ）（Ａｎａｔｒａｃｅ社製）、及び５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液中で、それぞれのタンパク質でコーティングされたマグネットビーズを用いて１ラウンドのバイオパニングを行った。同じ緩衝液で３回洗浄した後、洗浄したビーズに結合したままのファージをトリプシン－エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（ナカライ社製）を用いて室温で３０分間溶出させた。溶出した各ファージ含有溶液をタンパク質阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ、ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ，Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔｓ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）のＰＢＳ希釈液で中和し、ＴＧ１エレクトロポレーションコンピテント細胞に感染させるために用いた。感染した細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライ社製）を含むＬＢブロス（ミラー社製）中で３７℃で一晩培養し、選別した。ＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、選別したファージミドを回収した。
【0050】
実施例５：ＶＨＨ抗体のアミノ酸配列の解読
実施例３及び４で得られたＶＨＨ抗体の遺伝子配列群を次世代シーケンス解析により解読した。具体的には、ＶＨＨ抗体の遺伝子配列のうち、５００塩基対以下の部分をターゲット領域として、その部分に含まれる遺伝子配列を解読した。ターゲット領域を増幅するためのプライマーとして５’gaaatacctattgcctacggc（５’側、配列番号３７）と５’ggaaccgtagtccggaacgtc（３’側、配列番号３８）を設計した。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）でこれらのプライマーセットを使うことで、ＶＨＨ抗体の遺伝子配列のうち、５００塩基対以下の部分のターゲット領域を増幅した。さらに、次世代シーケンサーに固有の指定配列 ５’TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG－（配列番号３９）と５’GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG－（配列番号４０）を上記プライマーにそれぞれ融合したプライマーセットを用いることで、製造業者（イルミナ社）が推奨する方法でｉｌｌｕｍｉｎａ＿ＭｉＳｅｑ＿Ａｍｐｌｉｃｏｎ＿Ｄｅｅｐ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法によるターゲット領域の遺伝子配列を解読した。
実施例３及び４で得られたＶＨＨ抗体の遺伝子配列群を次世代シーケンス解析により解読した。具体的には、ＶＨＨ抗体の遺伝子配列のうち、５００塩基対以下の部分をターゲット領域として、その部分に含まれる遺伝子配列を解読した。ターゲット領域を増幅するためのプライマーとして５’gaaatacctattgcctacggc（５’側、配列番号３７）と５’ggaaccgtagtccggaacgtc（３’側、配列番号３８）を設計した。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）でこれらのプライマーセットを使うことで、ＶＨＨ抗体の遺伝子配列のうち、５００塩基対以下の部分のターゲット領域を増幅した。さらに、次世代シーケンサーに固有の指定配列 ５’TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG－（配列番号３９）と５’GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG－（配列番号４０）を上記プライマーにそれぞれ融合したプライマーセットを用いることで、製造業者（イルミナ社）が推奨する方法でｉｌｌｕｍｉｎａ＿ＭｉＳｅｑ＿Ａｍｐｌｉｃｏｎ＿Ｄｅｅｐ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法によるターゲット領域の遺伝子配列を解読した。
【0051】
こうして解読された遺伝子配列群からアミノ酸配列群への翻訳は、市販の解析ソフトウェアでおこなった（Ｇｅｎｅｔｙｘ社）。これらの遺伝子配列群及びアミノ酸配列群のうち、末端の配列が使用したプライマーと完全に一致するもの、ターゲット領域の塩基長が４０１塩基対以上であるもの、リードカウント数が２以上であるもの、ベクター配列に含まれるヒスタグ配列（６×Ｈｉｓ）を含むもの、を選び出した。さらに、遺伝子配列が異なっていてもアミノ酸配列が同一であるものを合算して、出現頻度（リードカウント数）が高いアミノ酸配列の順にまとめた。
【0052】
具体的には、マザーライブラリと、１ラウンドのターゲット濃縮後のサブライブラリ内のＶＨＨコーディング領域をＰＣＲ増幅し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて精製した。その後、デュアルインデックスライブラリを調製し、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３を用い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）で、ペアード、３００ｂｐリードでシーケンシングした。こうして、それぞれのサブライブラリについて、約１０００００のペアードリードを生成した。リードの生データに対し、ｃｕｔａｄａｐｔ ｖ１．１８（Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal, 17, 10-12, doi:10.14806/ej.17.1.200 (2011).）を用いてアダプター配列をトリミングし、その後低品質のリードをＴｒｉｍｍａｔｉｃ ｖ０．３９（Bolger, A. M., Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 30, 2114-2120, doi:10.1093/bioinformatics/btu170 (2014)）を用いて除去した。残るペアードリードはｆａｓｔｑ－ｊｏｉｎ（Aronesty, E. Comparison of Sequencing Utility Programs.The Open Bioinformatics Journal 7, 1-8, doi:10.2174/1875036201307010001 (2013)）を用いてマージし、ＥＭＢＯＳＳ ｖ６．６．０．０（Rice, P., Longden, I. & Bleasby, A. EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in genetics : TIG 16, 276-277, doi:10.1016/s0168-9525(00)02024-2 (2000)）を用いてアミノ酸配列へと翻訳した。
【0053】
実施例６：対照物質と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ｂ群）を、目的物質と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ａ群）からサブトラクトしたアミノ酸配列群（Ｃ群）を取得する（Ｃ群＝Ａ群－Ｂ群）
具体的には、以下の群に含まれるアミノ酸配列を選択し、Ｃ群を取得した。
Ａ群に含まれているアミノ酸配列（リード数＝２以上）で、かつＢ群には含まれないアミノ酸配列（リード数＝０）を選ぶ。
Ａ群に含まれているアミノ酸配列（リード数＝２０以上）のうち、Ｂ群にはその１０分の１以下のリード数しか現れないアミノ酸配列（リード数＝２以上）を選ぶ。
Ａ群に含まれているアミノ酸配列（リード数＝４以上）のうち、Ｂ群にはその半分以下のリード数しか現れないアミノ酸配列（リード数＝２以上）を選ぶ。
Ｃ群はＣ０群とＣ１／１０群とＣ１／２群に含まれるアミノ酸配列を合算したのちに、これら３群間で重複するアミノ酸配列を除いたものの集合である。この処理により、対照物質と相互作用する多数のＶＨＨ抗体を特定した（実施例９及び１０を参照）。
具体的には、以下の群に含まれるアミノ酸配列を選択し、Ｃ群を取得した。
Ａ群に含まれているアミノ酸配列（リード数＝２以上）で、かつＢ群には含まれないアミノ酸配列（リード数＝０）を選ぶ。
Ａ群に含まれているアミノ酸配列（リード数＝２０以上）のうち、Ｂ群にはその１０分の１以下のリード数しか現れないアミノ酸配列（リード数＝２以上）を選ぶ。
Ａ群に含まれているアミノ酸配列（リード数＝４以上）のうち、Ｂ群にはその半分以下のリード数しか現れないアミノ酸配列（リード数＝２以上）を選ぶ。
Ｃ群はＣ０群とＣ１／１０群とＣ１／２群に含まれるアミノ酸配列を合算したのちに、これら３群間で重複するアミノ酸配列を除いたものの集合である。この処理により、対照物質と相互作用する多数のＶＨＨ抗体を特定した（実施例９及び１０を参照）。
【0054】
具体的には、ｓｅｑｋｉｔ ｖ０．１０．１（Shen, W., Le, S., Li, Y. & Hu, F. SeqKit:A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation. PLOS ONE 11, e0163962, doi:10.1371/journal.pone.0163962 (2016)）及びｕｓｅａｒｃｈ ｖ．１１（Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.Bioinformatics 26, 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010)）を組み合わせたカスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを用いて、各ライブラリのユニークな配列をカウントした。各クローンの濃縮スコアは、バイオパニングされたそれぞれのサブライブラリのおける存在比の間でカイ二乗検定のＰ値を算出することによって分析した。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳＰＩＫＥタンパク質でバイオパニングしたサブライブラリにおける濃縮スコアが、バイオパニングした他のサブライブラリにおける濃縮スコアよりも高かった９クローンを選択した。
【0055】
実施例７：Ｃ群に含まれるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の人工遺伝子合成
Ｃ０群に含まれるアミノ酸配列はいずれも２００アミノ酸残基以下からなり、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、製造業者（ユーロフィン社）が提供する最適化された遺伝子配列（ここでの最適化された遺伝子配列とは、たとえば、合成しやすい、分解されにくい、塩基が偏っていない、配列の繰り返しが少ない、二次構造を取りにくいなどの遺伝子配列のこと）として人工的に合成することができた。本実施例においては、ＶＨＨ抗体の直列二量体をコードする遺伝子を合成した。ＶＨＨ抗体を二量体又は多量体として発現させて用いる方法は、特表２０１０－５３４４６５号公報等に記載されているようによく知られている。人工的に合成された遺伝子は、任意の発現ベクターに組み込むことができた。
Ｃ０群に含まれるアミノ酸配列はいずれも２００アミノ酸残基以下からなり、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、製造業者（ユーロフィン社）が提供する最適化された遺伝子配列（ここでの最適化された遺伝子配列とは、たとえば、合成しやすい、分解されにくい、塩基が偏っていない、配列の繰り返しが少ない、二次構造を取りにくいなどの遺伝子配列のこと）として人工的に合成することができた。本実施例においては、ＶＨＨ抗体の直列二量体をコードする遺伝子を合成した。ＶＨＨ抗体を二量体又は多量体として発現させて用いる方法は、特表２０１０－５３４４６５号公報等に記載されているようによく知られている。人工的に合成された遺伝子は、任意の発現ベクターに組み込むことができた。
【0056】
具体的には、選択された９個のアミノ酸配列のそれぞれを、（ＧＧＧＧＳ）４リンカーでタンデムホモダイマーとして連結した。９つのホモダイマーのコーディング遺伝子と、既知のＳＡＲＳ７２（Wrapp et al., Cell 2020）、ｍＮｂ６（Schoof et al., Science 2020）、及びＴｙ１（Hanke et al., Science 2020）の連結ホモダイマーの遺伝子を、コドン最適化して合成した。
【0057】
実施例８：人工遺伝子がコードするＶＨＨ抗体タンパク質の発現
発現ベクターに組み込んだ人工遺伝子をプラスミドとして大腸菌（ＢＬ２１株）に遺伝子導入することで、人工遺伝子がコードするＶＨＨ抗体タンパク質を大腸菌に発現させることができた。具体的には、人工遺伝子にコードされたアミノ酸配列の発現は、当該大腸菌が対数増殖期にあるときにＩＰＴＧを添加することで行った。発現されたアミノ酸配列（ＶＨＨ抗体にヒスタグが付加されている）は、製造業者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が推奨する方法でニッケル固相化樹脂カラムを使って精製した。
発現ベクターに組み込んだ人工遺伝子をプラスミドとして大腸菌（ＢＬ２１株）に遺伝子導入することで、人工遺伝子がコードするＶＨＨ抗体タンパク質を大腸菌に発現させることができた。具体的には、人工遺伝子にコードされたアミノ酸配列の発現は、当該大腸菌が対数増殖期にあるときにＩＰＴＧを添加することで行った。発現されたアミノ酸配列（ＶＨＨ抗体にヒスタグが付加されている）は、製造業者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が推奨する方法でニッケル固相化樹脂カラムを使って精製した。
【0058】
実施例９：得られたＶＨＨ抗体の抗原結合能の評価
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ法）により、実施例６で特定され、実施例７，８で得られたＶＨＨ抗体のうち、サンプルＩＤ：Ｐ０８６（配列番号８）、サンプルＩＤ：Ｐ５４３（配列番号３）、サンプルＩＤ：Ｃ１１６（配列番号５）、及びサンプルＩＤ：Ｐ０１７（配列番号６）について、抗原との結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ、及び平衡解離定数ＫＤを測定した。比較のために、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＨＨ抗体であるＴｙ１（L. Hanke et al. "An alpaca nanobody neutralizes SARS-CoV-2 by blocking receptor interaction", Nature Communications, 2020, 11, Article number: 4420.）及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＶＨＨ抗体でありＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能も確認されているＳＡＲＳ＿ＶＨＨ７２（D. Wrapp et al. "Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies", Cell, 2020, 181, p. 1004-1015.）についても同様にＢＬＩ測定を行った。ＢＬＩ測定装置としてはＦｏｒｔｅｂｉｏ社製ＢＬＩｔｚを用い、抗原としては、A. Wallsらが報告した（A. Walls et al. "Structure, Function, and Antigenicity of the SARSCoV-2 Spike Glycoprotein", Cell, 2020, 180, p. 281-292.）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）ＳＰＩＫＥタンパク質細胞外ドメインの三量体を用いた。なお、本明細書においては、サンプルＩＤ：Ｐ０８６などをＰ８６などと省略することがある。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ法）により、実施例６で特定され、実施例７，８で得られたＶＨＨ抗体のうち、サンプルＩＤ：Ｐ０８６（配列番号８）、サンプルＩＤ：Ｐ５４３（配列番号３）、サンプルＩＤ：Ｃ１１６（配列番号５）、及びサンプルＩＤ：Ｐ０１７（配列番号６）について、抗原との結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ、及び平衡解離定数ＫＤを測定した。比較のために、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＨＨ抗体であるＴｙ１（L. Hanke et al. "An alpaca nanobody neutralizes SARS-CoV-2 by blocking receptor interaction", Nature Communications, 2020, 11, Article number: 4420.）及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＶＨＨ抗体でありＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能も確認されているＳＡＲＳ＿ＶＨＨ７２（D. Wrapp et al. "Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies", Cell, 2020, 181, p. 1004-1015.）についても同様にＢＬＩ測定を行った。ＢＬＩ測定装置としてはＦｏｒｔｅｂｉｏ社製ＢＬＩｔｚを用い、抗原としては、A. Wallsらが報告した（A. Walls et al. "Structure, Function, and Antigenicity of the SARSCoV-2 Spike Glycoprotein", Cell, 2020, 180, p. 281-292.）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）ＳＰＩＫＥタンパク質細胞外ドメインの三量体を用いた。なお、本明細書においては、サンプルＩＤ：Ｐ０８６などをＰ８６などと省略することがある。
【0059】
結果を下表に示す。以下のように、サンプルＩＤ：Ｐ０８６、Ｐ５４３、Ｃ１１６、及びＰ０１７は、既知のＶＨＨ抗体と同等以上の結合能を有し、特にサンプルＩＤ：Ｐ５４３、Ｃ１１６、及びＰ０１７は、既知のＶＨＨ抗体よりも高い結合能（より低い平衡解離定数ＫＤ）を有することが確認された。
【表1-1】
【0060】
一方で、各サンプルのアフィニティは、測定に用いる緩衝液の塩濃度に影響を受けることが確認された。そこで、高濃度緩衝液（サンプルＩＤ：Ｐ０１７、Ｐ０８６、Ｐ３３４、及びＣ１１６）又は低濃度緩衝液（サンプルＩＤＰ１５８、Ｐ５４３、Ｃ０１７、Ｃ０４９、及びＣ２４６）のいずれかを用いて各サンプルのＢＬＩ測定を改めて行ったところ、以下の結果が得られた。高濃度緩衝液としては、５００ｍＭのＮａＣｌと０．００１%のＬＭＮＧを含むリン酸緩衝液を用いた。この緩衝液中ではＳＰＩＫＥタンパク質が安定化する。又、低濃度緩衝液としては、５ｍＭのＮａＣｌと０．００００５％のＬＭＮＧを含むリン酸緩衝液を用いた。この緩衝液中ではＳＰＩＫＥタンパク質が変動する。具体的には、センサーチップにはビオチン化したサンプルを固定化し、順次希釈した濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質細胞外ドメインの三量体との結合動態をリアルタイムで測定した。
【0061】
結果を下表に示す。以下のように、各サンプルがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）ＳＰＩＫＥタンパク質に対する高い結合能を有することが確認された。
【0062】
【表1-2】
【0063】
実施例１０：細胞染色によるＶＨＨ抗体の抗原認識能の確認
実施例６で特定され、実施例７，８で得られたＶＨＨ抗体を蛍光標識し、これらのＶＨＨ抗体による細胞染色を行った。ＶＨＨ抗体としては、上記のサンプルＩＤ：Ｐ０８６（配列番号８）、サンプルＩＤ：Ｐ５４３（配列番号３）、サンプルＩＤ：Ｃ１１６（配列番号５）、及びサンプルＩＤ：Ｐ０１７（配列番号６）の他、サンプルＩＤ：Ｃ２４６（配列番号２）、サンプルＩＤ：Ｐ３３４（配列番号４）、サンプルＩＤ：Ｃ０１７（配列番号７）、及びサンプルＩＤ：Ｐ１５８（配列番号９）を用いた。蛍光標識を行う細胞としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ変異体：欧州型）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体：南アフリカ型）のＳＰＩＫＥタンパク質全長遺伝子を一過性に遺伝子導入して発現させたＨＥＫ細胞をそれぞれ用いた。比較のために、上記のＳＡＲＳ＿ＶＨＨ７２及びＴｙ１、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するシングルドメイン抗体であるｍＮｂ６（M. School et al. "An ultrapotent synthetic nanobody neutralizes SARS-CoV-2 by stabilizing inactive Spike", Science, 2020, 370, p. 1473-1479.）を用いて同様に細胞染色を行った。さらに、比較のために、同じ細胞サンプルに対し、ＳＰＩＫＥタンパク質全長遺伝子のカルボキシル末端に結合したＣ９タグに対する抗体（Ｃ９ｔａｇ）、及びＤＡＰＩを用いた細胞染色も行った。図１Ａ～図１Ｆは、細胞染色の結果を示す写真である。
実施例６で特定され、実施例７，８で得られたＶＨＨ抗体を蛍光標識し、これらのＶＨＨ抗体による細胞染色を行った。ＶＨＨ抗体としては、上記のサンプルＩＤ：Ｐ０８６（配列番号８）、サンプルＩＤ：Ｐ５４３（配列番号３）、サンプルＩＤ：Ｃ１１６（配列番号５）、及びサンプルＩＤ：Ｐ０１７（配列番号６）の他、サンプルＩＤ：Ｃ２４６（配列番号２）、サンプルＩＤ：Ｐ３３４（配列番号４）、サンプルＩＤ：Ｃ０１７（配列番号７）、及びサンプルＩＤ：Ｐ１５８（配列番号９）を用いた。蛍光標識を行う細胞としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ変異体：欧州型）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体：南アフリカ型）のＳＰＩＫＥタンパク質全長遺伝子を一過性に遺伝子導入して発現させたＨＥＫ細胞をそれぞれ用いた。比較のために、上記のＳＡＲＳ＿ＶＨＨ７２及びＴｙ１、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するシングルドメイン抗体であるｍＮｂ６（M. School et al. "An ultrapotent synthetic nanobody neutralizes SARS-CoV-2 by stabilizing inactive Spike", Science, 2020, 370, p. 1473-1479.）を用いて同様に細胞染色を行った。さらに、比較のために、同じ細胞サンプルに対し、ＳＰＩＫＥタンパク質全長遺伝子のカルボキシル末端に結合したＣ９タグに対する抗体（Ｃ９ｔａｇ）、及びＤＡＰＩを用いた細胞染色も行った。図１Ａ～図１Ｆは、細胞染色の結果を示す写真である。
【0064】
また、実施例６で特定され、実施例７，８で得られたＶＨＨ抗体のうち、サンプルＩＤ：Ｐ０８６（配列番号８）及びＣ０４９（配列番号１）を蛍光標識し、これらのＶＨＨ抗体による細胞染色を行った。蛍光標識を行う細胞としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ変異体：欧州型）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｅ４８４Ｋ変異体）、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体：南アフリカ型）のＳＰＩＫＥタンパク質全長遺伝子を導入して安定に発現させたＤＴ４０細胞、及びネイティブのＤＴ４０細胞をそれぞれ用いた。比較のために、上記のｍＮｂ６を用いて同様に細胞染色を行った。染色により、サンプルＩＤ：Ｐ０８６は野生型、Ｄ６１４Ｇ変異体、Ｅ４８４Ｋ変異体、及びＤ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体を認識することが確認された。また、サンプルＩＤ：Ｃ０４９は、Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体を認識する一方で、野生型、Ｄ６１４Ｇ変異体、及びＥ４８４Ｋ変異体を認識しないことが確認された。ｍＮｂ６は、野生型及びＤ６１４Ｇ変異体を認識し、Ｅ４８４Ｋ変異体及びＤ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体を認識しなかった。図２Ａ及び図２Ｂは、細胞染色の結果を示す写真である。なお、図２Ａは写真のグレースケール画像であり、図２Ｂは同じ写真について細胞の位置を示す青色成分を抑制したグレースケール画像である。本実験においてＶＨＨ抗体には赤色で蛍光標識されており、図２ＢはＶＨＨ抗体が認識した細胞の位置をより明確に示している。
【0065】
表２は、上記の細胞染色の結果をまとめたものである。表２において、○はＶＨＨ抗体が細胞を染色したこと（すなわちＳＰＩＫＥタンパク質を認識したこと）、×はＶＨＨ抗体が細胞を染色しなかったこと（すなわちＳＰＩＫＥタンパク質を認識しなかったこと）、▲はＶＨＨ抗体が細胞を弱く染色したこと（すなわち○と判定されたＳＰＩＫＥタンパク質の方が選択的に認識されていたこと）を示す。図１Ａ～図１Ｆ及び表２に示されるように、サンプルＩＤ：Ｐ０１７、Ｐ０８６、Ｐ１５８、Ｐ３３４、Ｐ５４３、Ｃ０１７、Ｃ１１６、及びＣ２４６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）ＳＰＩＫＥタンパク質及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質を選択的に認識することが確認された。
【0066】
【表2】
【0067】
同様に、実施例６で特定されたＶＨＨ抗体から選択され、実施例７，８に従って得られた各ＶＨＨ抗体による細胞染色を行った。表３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）ＳＰＩＫＥタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体：南アフリカ型）ＳＰＩＫＥタンパク質に対する染色結果を示す。
【0068】
【表3-1】
【0069】
同様に、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）及びＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）に、Ｄ６１４Ｇ変異に加えて様々な変異（又は欠失）を有する各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質に対して、各サンプルを用いた染色を行った。染色結果を以下に示す。下表において、＋はＶＨＨ抗体が細胞を染色したこと（すなわちＳＰＩＫＥタンパク質を認識したこと）、－はＶＨＨ抗体が細胞を染色しなかったこと（すなわちＳＰＩＫＥタンパク質を認識しなかったこと）、±はＶＨＨ抗体が細胞を弱く染色したこと（すなわち○と判定されたＳＰＩＫＥタンパク質の方が選択的に認識されていたこと）を示す。
【0070】
【表3-2】
【0071】
表２、表３、及び表３－２の結果は、実施例１～６に従ってＶＨＨ抗体を特定することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を認識する様々なＶＨＨクローンが得られることを示す。この結果は、実施例９の結果も踏まえれば、所望の特性（例えば所定値よりも低い平衡解離定数ＫＤ）を有するＶＨＨ抗体を過度の試験を行うことなく取得できることを示している。これらの結果（特にサンプルＩＤ：Ｐ０１７、Ｐ３３４、Ｃ０１７、及びＣ０４９）は、実施例１～６に従ってＶＨＨ抗体を特定することにより、特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株と比較して選択的に結合するＶＨＨ抗体を、過度の試験を行うことなく取得できることを示している。また、サンプルＩＤ：Ｃ０４９について得られた結果は、実施例１～６に従ってＶＨＨ抗体を特定することにより、特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を認識する一方で、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を認識しないＶＨＨ抗体、及び野生型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特定の変異株に選択的に結合する抗体を、過度の試験を行うことなく取得できることを示している。
【0072】
また、表３－２に示されるように、各サンプルは、δ変異株のような、Ｌ４５２Ｒ変異を有するＳＰＩＫＥタンパク質に対する感度を維持していた。これは、Ｔｙ１がＬ４５２Ｒ変異を有するＳＰＩＫＥタンパク質を検出できないのとは対照的である。
【0073】
なお、サンプルＩＤ：Ｃ４９及びＣ２４６は、細胞内領域のＳＰＩＫＥタンパク質のみを染色した一方で、残りの７つのクローンは、細胞膜付近又は細胞膜上のＳＰＩＫＥタンパク質を染色した。この結果は、各クローンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質を状態に応じて認識していることを示唆している。例えば、Ｃ２４６は未熟な又は折りたたまれていないスパイクを認識するものと考えられる。後述するようにＣ２４６は様々な変異株を中和することができるが、これはウイルスの成熟を阻害しているものと考えられる。
【0074】
なお、サンプルＩＤ：Ｐ５４３、Ｐ３３４、及びＰ１５８は、ウエスタンブロッティングのためにも使用可能であることが確認された。すなわち、ＶＨＨ抗体はＳＤＳにより変性したタンパク質を認識しないことが多いが、サンプルＩＤ：Ｐ５４３、Ｐ３３４、及びＰ１５８はＳＤＳにより変性したＳＰＩＫＥタンパク質を認識可能であった。
【0075】
すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｄ６１４Ｇ変異体、Ｎ５０１Ｙ変異体、Ｎ５０１Ｙ＋Ｅ４８４Ｋ変異体、Ｎ５０１Ｙ＋Ｅ４８４Ｋ＋Ｋ４７１Ｎ変異体、及びＫ４１７Ｎ変異体のＳＰＩＫＥタンパク質のＣ末端にＣ９タグを付けたものをサンプルとして用い、ＤＴＴを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。そして、サンプルＩＤ：Ｐ５４３、Ｐ３３４、及びＰ１５８を用いてバンドの染色を行った。具体的には、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを付けたナノボディホモダイマー（Ｐ１５８、Ｐ３３４、及びＰ５４３の希釈比はそれぞれ１：５０００、１：１０００、及び１：２５００）、抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体（ＭＢＬ社製）、及びＨＲＰ結合抗ウサギ又は抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｃｙｔｉｖａ社製）と順次インキュベートし、反応したタンパク質のバンドをＥＬＣ ｐｌｕｓシステム（Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いて可視化した。結果を図３Ａに示す。図３Ａに示すように、サンプルＩＤ：Ｐ５４３、Ｐ３３４、及びＰ１５８は、マウスモノクローナルＣ９抗体と同様の感度でＳＰＩＫＥタンパク質を認識した。バインディングパターンから、それぞれのクローンはＳ１ドメインの一部を認識していることが示唆された。
【0076】
さらに、サンプルＩＤ：Ｐ５４３及びＰ１５８を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＳＰＩＫＥタンパク質を検出するキットを作製した。具体的には、ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）のウェルに、捕捉抗体としてサンプルＩＤ：Ｐ１５８のホモダイマーをコーティングした。また、ウェルを洗浄した後、Ｃａｒｂｏ－Ｆｒｅｅブロッキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）でブロッキングした。その後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質を含むサンプルを添加した。さらに、ビオチン結合したサンプルＩＤ：Ｐ５４３を検出抗体として添加してインキュベートした後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（東京化成工業株式会社製）を添加してさらにインキュベートした。その後、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）を用いて現像した後、マイクロプレートリーダーを用いて、ウェルの光学濃度を４５０ｎｍで読み取った。このように作製されたＥＬＩＳＡキットによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質の検出限界は１μｇ／ｍＬであった。Ｐ５４３及びＰ０８６は、サイボウホモジネート中のＤ６１４Ｇ変異株及びβ変異株（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｅ４８４Ｋ＋Ｋ４１７Ｎ）のＳＰＩＫＥタンパク質を特異的に検出することができた。さらに、検出抗体として、Ｆｃタグ付きのＰ５４３を用いたところ、検出限界は２０ｎｇ／ｍＬ以下となった。また、検出抗体としてＰ０８６を用いたＥＬＩＳＡキットも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質を検出することができた。
【0077】
さらに、ＶＨＨ抗体を用いた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質を検出できるラテラルフローアッセイの抗原検査キットも開発することができた。この抗原検査キットは、サンプルパッド、試薬パッド、キャプチャーラインを含む反応メンブレン、及び吸収パッドが並んでいるテストストリップを有している。そして、試薬パッドには微粒子に結合したＶＨＨ抗体が含まれ、キャプチャーラインにもＶＨＨ抗体が含まれている。このような抗原検査キットのサンプルパッドにサンプルをスポットすることにより、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質を検出することがてきた。
【0078】
具体的には、精製したＰ１５８（３３０ｎｇ／ｍＬ）を、ニトロセルロース膜（ＩＡＢ９０、東洋濾紙株式会社製）に約１ｍｍ幅で並べた。このメンブレンをＣａｒｂｏ－Ｆｒｅｅブロッキング溶液に室温で１時間浸し、風乾させた。また、精製したＰ０８６又はＰ５４３を、直径３０ｎｍのＥｓｔａｐｏｒｅビーズ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）にアミン結合させた。ガラス繊維紙（ＧＦ／ＤＶＡ、Ｃｙｔｉｖａ社製）を、０．００５％（ｗ／ｖ）のＶＨＨ抗体が結合したＥｓｔａｐｏｒｅビーズを含むブロッキング溶液に浸して飽和させた後、真空状態で乾燥させた。裏打ちしたニトロセルロース膜とビーズを吸着させたガラス繊維紙とをバッキングシート（Ｃｙｔｉｖａ社製）に重ね合わせた。ＣＦ４紙（Ｃｙｔｉｖａ社製）をサンプルパッドと吸収パッドの両方に使用し、同様に用意したバッキングシートに重ねた。４枚重ねのシートを５ｍｍ幅にカットし、黒いケースに入れて、シリカゲルと一緒に密封して保存した。乾燥した状態で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２δ変異株のＳＰＩＫＥタンパク質（Ｄ６１４Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ）サンプル３００ｎｇ（図３Ｂの＋）、又はＰＢＳ（図３Ｂの－）をサンプルパッドにスポットした。３１５ｎｍのＵＶランプ下で観察を行ったところ、ＳＰＩＫＥタンパク質をスポットした場合にのみシグナルが確認された。キャプチャーラインにＰ１５８を、ディテクタービーズにＰ０８６を用いた場合の観察結果を図３Ｂに示す。
【0079】
上記のように、少なくともＰ１５８、Ｐ３３４、Ｐ５４３、及びＰ８６は、Ｓ１ドメインに変異を持つＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質を検出することができた。この変異とは、Ｈ６９、Ｖ７０、Ｙ１４４、Ｙ１４５、Ｌ２４２、Ａ２４３、及びＬ２４４の欠失、並びにＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Ｒ２４６Ｉ、Ｎ４３９Ｙ、Ｙ４５３Ｆ、Ｔ４７８Ｋ、及びＡ５７０Ｄの点変異である。
【0080】
実施例１１：アルパカにおける免疫応答のさらなる誘導方法
１頭のアルパカに対して、様々な種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質を注射することにより免疫応答を誘導する。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質を注射する。本実施例によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体）を認識するＶＨＨ抗体を効率的に特定することができる。
１頭のアルパカに対して、様々な種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質を注射することにより免疫応答を誘導する。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質を注射する。本実施例によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体）を認識するＶＨＨ抗体を効率的に特定することができる。
【0081】
実施例１２：目的物質及び対照物質のさらなる選択方法（１）
目的物質としてはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特定の株（野生型又は変異体）のＳＰＩＫＥタンパク質を用い、対照物質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のその他の株のＳＰＩＫＥタンパク質を用いる。例えば、目的物質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（Ｓ１領域及びＳ２領域）三量体を用い、対照物質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（Ｓ１領域及びＳ２領域）三量体を用いる。本実施例によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）に対して選択的に結合するＶＨＨ抗体を効率的に特定することができる。
目的物質としてはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特定の株（野生型又は変異体）のＳＰＩＫＥタンパク質を用い、対照物質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のその他の株のＳＰＩＫＥタンパク質を用いる。例えば、目的物質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（Ｓ１領域及びＳ２領域）三量体を用い、対照物質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（Ｓ１領域及びＳ２領域）三量体を用いる。本実施例によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）に対して選択的に結合するＶＨＨ抗体を効率的に特定することができる。
【0082】
実施例１３：目的物質及び対照物質のさらなる選択方法（２）
複数の対照物質（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複数の株のＳＰＩＫＥタンパク質）を用いる。すなわち、目的物質と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ａ群）から、複数の対照物質のいずれかと相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ｂ群）をサブトラクトしたアミノ酸配列群（Ｃ群）を取得する。例えば、目的物質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（Ｓ１領域及びＳ２領域）三量体を用い、対照物質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ変異体）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｅ４８４Ｋ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（Ｓ１領域及びＳ２領域）三量体を用いる。そして、目的物質と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ａ群）から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン三量体と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ｂ群－１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン三量体と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ｂ群－２）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｅ４８４Ｋ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン三量体と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ｂ群－３）をサブトラクトする。本実施例によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の他の株に対して選択的に認識するＶＨＨ抗体を効率的に特定することができる。
複数の対照物質（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複数の株のＳＰＩＫＥタンパク質）を用いる。すなわち、目的物質と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ａ群）から、複数の対照物質のいずれかと相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ｂ群）をサブトラクトしたアミノ酸配列群（Ｃ群）を取得する。例えば、目的物質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（Ｓ１領域及びＳ２領域）三量体を用い、対照物質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ変異体）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｅ４８４Ｋ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン（Ｓ１領域及びＳ２領域）三量体を用いる。そして、目的物質と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ａ群）から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン三量体と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ｂ群－１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン三量体と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ｂ群－２）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｅ４８４Ｋ変異体）ＳＰＩＫＥタンパク質の細胞外ドメイン三量体と相互作用するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列群（Ｂ群－３）をサブトラクトする。本実施例によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｋ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ変異体）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の他の株に対して選択的に認識するＶＨＨ抗体を効率的に特定することができる。
【0083】
実施例１４：ＳＰＩＫＥタンパク質を発現するウイルスの中和アッセイ
上記のＶＨＨ抗体について、ウイルスの感染及び／又は伝播を中和できるかどうかを検証した。サンプルとして使用したＶＨＨ抗体は、上記のサンプルＩＤ：Ｐ０８６（配列番号８）、サンプルＩＤ：Ｐ５４３（配列番号３）、サンプルＩＤ：Ｃ１１６（配列番号５）、サンプルＩＤ：Ｐ０１７（配列番号６）、サンプルＩＤ：Ｃ２４６（配列番号２）、サンプルＩＤ：Ｐ３３４（配列番号４）、サンプルＩＤ：Ｃ０１７（配列番号７）、及びサンプルＩＤ：Ｐ１５８（配列番号９）、及びサンプルＩＤ：Ｃ４９（配列番号１）である。比較のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である上記のＴｙ１もサンプルとして用いた。
上記のＶＨＨ抗体について、ウイルスの感染及び／又は伝播を中和できるかどうかを検証した。サンプルとして使用したＶＨＨ抗体は、上記のサンプルＩＤ：Ｐ０８６（配列番号８）、サンプルＩＤ：Ｐ５４３（配列番号３）、サンプルＩＤ：Ｃ１１６（配列番号５）、サンプルＩＤ：Ｐ０１７（配列番号６）、サンプルＩＤ：Ｃ２４６（配列番号２）、サンプルＩＤ：Ｐ３３４（配列番号４）、サンプルＩＤ：Ｃ０１７（配列番号７）、及びサンプルＩＤ：Ｐ１５８（配列番号９）、及びサンプルＩＤ：Ｃ４９（配列番号１）である。比較のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である上記のＴｙ１もサンプルとして用いた。
【0084】
まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質を発現するＨＩＶ－１ベースの疑似ウイルスを調製した。ＬｅｎｔｉＸ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して、ポリエチレンイミントランスフェクション試薬（Ｃｙｔｉｖａ製）を用いて、製造会社によるプロトコルに従って、Ｃ末端にＣ９タグが付加された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質（オリジナル、α変異株、β変異株、又はγ変異株）の全長をコードするプラスミドと、ルシフェラーゼレポーターをコードするＨＩＶ－１トランスファーベクターとを、共トランスフェクトした。細胞を培地中３７℃で４－６時間培養した後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに交換してさらに４８時間培養を行った。その後、上澄み液を採取し、０．４５ｍの膜でろ過し、超遠心分離で濃縮した後、－８０℃で凍結した。各変異株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質としては、以下の変異を有しているものを用いた。
・オリジナル（Ｏｒｉｇｉｎａｌ：Ｄ６１４Ｇ）
・α変異株（Ａｌｐｈａ：Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、及びＤ１１１８Ｈ）
・β変異株（Ｂｅｔａ：Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、及びＡ７０１Ｙ）
・δ変異株（Ｄｅｌｔａ：Ｔ１９Ｒ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６ｄｅｌ、Ｆ１５７ｄｅｌ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、及びＤ９５０Ｎ）
・オリジナル（Ｏｒｉｇｉｎａｌ：Ｄ６１４Ｇ）
・α変異株（Ａｌｐｈａ：Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、及びＤ１１１８Ｈ）
・β変異株（Ｂｅｔａ：Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、及びＡ７０１Ｙ）
・δ変異株（Ｄｅｌｔａ：Ｔ１９Ｒ、Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５６ｄｅｌ、Ｆ１５７ｄｅｌ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、及びＤ９５０Ｎ）
【0085】
そして、ＡＣＥＩＩ及びＴＭＰＲＳＳ２を発現するＫ５６２細胞を、５段階に順次希釈したＶＨＨ抗体とともに３７℃で１時間インキュベートした後、上記の疑似ウイルスを感染させた。２日間の培養後に細胞を溶解し、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）とマイクロプレート分光光度計（ＡＲＶＯ Ｘ３、パーキンエルマージャパン社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。得られた発光単位は、ＶＨＨ抗体不存在下で疑似ウイルスを感染させた細胞由来の発光単位で規格化した。
【0086】
ＶＨＨ抗体の濃度と、規格化された発光単位に基づいて評価された、Ｋ５６２細胞への相対的な感染単位の平均値（各サンプルについてｎ＝３）との関係を図４に示す。また、各サンプルについて、各変異株の感染抑制作用のＩＣ５０の測定値を下表に示す。
【表4】
【0087】
図４の左上は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）のＳＰＩＫＥタンパク質を発現する疑似ウイルスに対する中和アッセイの結果を示す。図４に示すように、９つのサンプルそれぞれについて感染率を低下させる、すなわち感染を中和できることが確認された。特に、９つのサンプルのうち５つ（Ｐ０８６、Ｃ１１６、Ｐ０１７、Ｃ２４６、及びＣ０１７）は、オリジナル（Ｄ６１４Ｇ）の感染を用量依存的に阻害できることが確認された。
【0088】
図４の右上、左下、及び右下は、それぞれＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のα変異株、β変異株、及びδ変異株のＳＰＩＫＥタンパク質を発現する疑似ウイルスに対する中和アッセイの結果を示す。Ｐ０１７、Ｐ０８６、及びＣ１１６は、Ｔｙ１よりも強力にα変異株を中和した。さらに、Ｐ０８６及びＣ２４６は有意にβ変異株の感染を抑制し、Ｐ０１７及びＣ２４６はδ変異株を中和した。上記のように細胞内領域のＳＰＩＫＥタンパク質を染色したＣ２４６は、試験した全ての変異株を中和することができた。また、Ｐ０１７はβ変異株を中和したがδ変異株は中和せず、一方でＰ０８６はδ変異株を中和したがβ変異株は中和しなかった。
【0089】
実施例１５：クライオ電子顕微鏡を用いたＳＰＩＫＥタンパク質－ＶＨＨ抗体複合体の構造解析
上記のＶＨＨ抗体が結合するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質のエピトープを同定するために、クライオ電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）を用いてＳＰＩＫＥタンパク質－サンプルＩＤ：Ｐ０８６複合体、及びＳＰＩＫＥタンパク質－サンプルＩＤ：Ｐ０１７複合体の単一粒子解析を行った。
上記のＶＨＨ抗体が結合するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質のエピトープを同定するために、クライオ電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）を用いてＳＰＩＫＥタンパク質－サンプルＩＤ：Ｐ０８６複合体、及びＳＰＩＫＥタンパク質－サンプルＩＤ：Ｐ０１７複合体の単一粒子解析を行った。
【0090】
まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｄ６１４Ｇ変異体）を、以下のように発現させ、精製した。すなわち、ＨＥ４００ＡＺ培地（Ｇｍｅｐ社製）で維持されたＥｘｐｉ２９３－Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ社製）で、フリン耐性変異を有するＨｉｓタグ付きのスパイクタンパク質を一過性に発現させた。発現ベクターとしてはＧｘｐｒｅｓｓ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｍｅｐ社製）を用い、メーカーによるプロトコルに従って細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後５日目に培養上清を採取し、スパイクタンパク質をＮｉｃｋｅｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いて精製し、続いて５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０，２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。
【0091】
上記のように得た０．１ｍｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｄ６１４Ｇ）の三量体複合体を、５倍モル過剰のＶＨＨ抗体モノマー（Ｐ０８６又はＰ０１７）と混合し、氷上で１０分間インキュベートした後、得られたＳＰＩＫＥタンパク質－ＶＨＨ抗体複合体溶液３μＬをエポキシ化グラフェングリッドに塗布した。室温で５分間インキュベートした後、４℃、湿度１００％で平衡化したＶｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）のチャンバー内で、－３の力で２秒間グリッドをブロットし、すぐに液体エタンに投入した。余分なエタンは濾紙で取り除き、グリッドは液体窒素内で保存した。
【0092】
クライオ電子顕微鏡画像データセットは、Ｋ３直接電子検出器（Ｇａｔａｎ社製）を用い、ＣＤＳモードにおいて３００ｋＶで動作するＪＥＭ－Ｚ３００ＦＳＣ（ＣＲＹＯ ＡＲＭ ３００，ＪＥＯＬ社製）を用いて得た。ゼロロスイメージングのために、Ωタイプのインカラムエネルギーフィルタをスリット幅２０ｅＶで使用した。公称倍率は６００００倍で、０．８７０Å／ピクセルに相当する。デフォーカスは－０．５ｍから－２．０ｍの間で変化した。各動画は６０フレーム（１フレーム０．０５０５秒、総露光３．０４秒）に分割され、総線量は６０ｅ－／Å２であった。
【0093】
画像はＲＥＬＩＯＮ３．１（Zivanov et al., IURcJ 2020）を用いて処理した。動画に対してはＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２（Zheng et al., Nat. Methods 2017）を用いて動き補正を行い、ＣＴＦＦＩＮＤ４．１（Rohou et al., 2015）を用いてＣＴＦを推定した。ＣＴＦのｍａ解像度が５Åを超えている顕微鏡写真を選択した。すべての画像に対して３Ｄテンプレートベースのオートピッキングを行い，４ｘビニングで粒子を抽出し、これを２回の２Ｄ分類にかけた。Ｐ０８６についてのデータセットにおいては、初期モデルを作成し、次の３Ｄ分類における参照のために使用した。Ｐ０１７についてのデータセットにおいては、ＳＰＩＫＥタンパク質３量体の密度マップ（以前に得られたデータセット）を参照として使用した。対称性を適用することなくリファレンスベースの３Ｄ分類（４クラスに分類）を行い、選択した粒子をビン化せずに再抽出した。対称性を適用しない３次元オートリファイン、ソフトマスク生成、後処理、ＣＴＦリファイン、ベイジアンポリッシング、及びさらなる３次元オートリファインを行った。続いて、１つのＲＢＤについてのアップとダウンの状態を分離するために、アライメントを行わないフォーカスされた３Ｄ分類を行った。選択された粒子には、さらなる３Ｄオートリファイン、後処理、ＣＴＦリファイン、３Ｄオートリファイン、及び後処理を行った。最終的なマップの解像度（ＦＳＣ＝０．１４３）は、Ｐ０８６のデータセットでは２－ｕｐ及び３－ｕｐの状態でそれぞれ３．３７Å及び３．５６Åであり、Ｐ０１７のデータセットでは１－ｕｐ及び２－ｕｐの状態でそれぞれ３．０８Å及び３．２４Åであった。それぞれの複合体の３次元構造を示す画像を、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ（Pettersen et al., J. Comput. Chem. 2004）及びＣｈｉｍｅｒａＸ（Pettersen et al., Protein Sci. 2021）を用いて作成した。
【0094】
上記の解析により、ＳＰＩＫＥタンパク質－Ｐ０８６複合体からは、２－ＲＢＤ－ｕｐの状態（２－ｕｐ＋Ｐ０８６、図５（Ａ））及び３－ＲＢＤ－ｕｐの状態（３－ｕｐ＋Ｐ０８６、図５（Ｂ））の構造を確認できた。また、ＳＰＩＫＥタンパク質－Ｐ０１７複合体からは、１－ＲＢＤ－ｕｐの状態（１－ｕｐ＋Ｐ０１７、図５（Ｃ））及び２－ＲＢＤ－ｕｐの状態（２－ｕｐ＋Ｐ０１７、図５（Ｄ））の構造を確認できた。最終的な再構成マップの解像度は、２－ｕｐ＋Ｐ０８６、３－ｕｐ＋Ｐ０８６、１－ｕｐ＋Ｐ０１７、及び２－ｕｐ＋Ｐ０１７で、それぞれ３．３７Å、３，５６Å、３．０８Å、及び３．２４Åであった。Ｐ０８６及びＰ０１７のそれぞれについて、２つの状態の間でＶＨＨ結合領域に変化は見られなかった。Ｐ０８６及びＰ０１７に対応する電子密度は、ｄｏｗｎ状態とｕｐ状態の双方のＲＢＤの外側に位置していた。
【0095】
図６（Ａ）～（Ｃ）は、それぞれＰ０８６及びＰ０１７とｄｏｗｎ状態のＳＰＩＫＥタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）との結合状態を示す拡大図である。ｄｏｗｎ状態のＲＢＤに結合したＰ０８６及びＰ０１７の電子密度は、隣のプロトマーのＮＴＤまで伸びていた。この点はＰ０８６においてより明らかであり、Ｐ０８６はＲＢＤと隣のプロトマーのＮＴＤとの間のギャップを埋め、これらをつないでいることが確認された。また、Ｐ０１７の結合位置はＰ０８６の結合位置と部分的に重なっており、Ｐ０８６と比較してＲＢＤの受容体結合モチーフ（ＡＣＥＩＩ結合領域）側にわずかにシフトしていた。この結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ株の重要な変異点の一つであるＬ４５２は、ＲＢＤの表面とＰ０１７の間の空間に位置しており、Ｐ０１７はＬ４５２に直接接触していないことが確認された。また、各クローンに隣接するＮＴＤの残基（Ｓｅｒ３４９、Ｔｙｒ３５１、Ｉｌｅ４６８、Ｔｈｒ４７０、Ｇｌｕ４７１）は、Ｐ０１７と比較して、Ｐ０８６とより緊密な結合界面を形成していた。さらに、Ｐ０１７とＰ０８６は、ともにＲＢＤのＥ４８４を含むループ領域に結合していることが確認された。
【0096】
図７（Ａ）及び図７（Ｂ）は、それぞれＰ０８６及びＰ０１７とｕｐ状態のＳＰＩＫＥタンパク質のＲＢＤとの結合状態を示す拡大図である。この場合も、ｄｏｗｎ状態と同様、各クローンはＳＰＩＫＥタンパク質のＲＢＤに結合していた。Ｐ０８６のＲＢＤへの結合領域の端部は、重ね合わせたＡＣＥＩＩの構造（ＰＤＢエントリー：７ＫＭＳ）と重なっており、Ｐ０１７のＲＢＤへの結合領域は、ＡＣＥＩＩとより重なっていた。
【0097】
さらに、Ｐ０８６の結晶構造に基づいて、ＳＰＩＫＥタンパク質とＰ０８６との結合モデルを構築した。Ｐ０８６の結晶構造は、Ｐ０８６をシッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化させ、Ｘ線回折実験を行うことにより決定した。Ｐ０８６の構造を図８（Ａ）及び（Ｂ）に示す。また、図８（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれｄｏｗｎ状態のＲＢＤとＰ０８６との結合モデル、及びｕｐ状態のＲＢＤとＰ０８６との結合モデルである。Ｐ０８６が有するＣＤＲループ領域は、ｄｏｗｎ状態のＲＢＤと隣接するＮＴＤとの間に埋まっていることが確認された。
【0098】
図９に示すように、これまでに報告されていたヒトの抗体は、ＲＢＤのクラスＩ（図８（Ａ））、クラスＩＩ（図９（Ｂ））、ＲＢＤボディＩ（図９（Ｃ））、ＲＢＤボディＩＩ（図９（Ｄ））、の４つのエピトープのいずれかを標的としていた。一方で、Ｐ０８６のエピトープは、図９（Ｂ）及び（Ｃ）に示されるように、クラスＩＩ及びＲＢＤボディＩの外側に、クラスＩ及びＲＢＤボディＩＩの反対側に、位置していた。Ｐ０８６は小さいために、ヒトの抗体では見られなかった隠れたクレバスにアクセスしているものと考えられる。このように、Ｐ０８６のエピトープは、従来の抗体ではアクセスできないほど狭いものと思われる。
【0099】
このような結合領域の違いが、Ｐ０８６及びＰ０１７の変異耐性及び中和活性、すなわちＰ０１７はδ変異株（Ｌ４５２Ｒ）を中和でき、一方でＰ０８６はβ変異株（Ｅ４８４Ｋ）を中和できたこと、に影響を与えたものと考えられる。
【0100】
実施例１５：さらなるＶＨＨ抗体の取得及び評価
実施例６で特定され、実施例７，８で得られたＶＨＨ抗体のうち、サンプルＩＤ：Ｐ５５９（配列番号４３）について、さらにウイルスの感染及び／又は伝播を中和できるかどうかを検証した。本実施例における中和アッセイは実施例１４と同様に行ったが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質として、オリジナル及びδ変異株のＳＰＩＫＥタンパク質の他に、ο変異株ＢＡ．５のＳＰＩＫＥタンパク質を用いた。
実施例６で特定され、実施例７，８で得られたＶＨＨ抗体のうち、サンプルＩＤ：Ｐ５５９（配列番号４３）について、さらにウイルスの感染及び／又は伝播を中和できるかどうかを検証した。本実施例における中和アッセイは実施例１４と同様に行ったが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質として、オリジナル及びδ変異株のＳＰＩＫＥタンパク質の他に、ο変異株ＢＡ．５のＳＰＩＫＥタンパク質を用いた。
【0101】
各株の感染抑制作用のＩＣ５０の測定値を下表に示す。表５において、ＭＰ５５９はサンプルＩＤ：Ｐ５５９の単量体を用いた場合の結果を、ＴＰ５５９はサンプルＩＤ：Ｐ５５９の三量体（単量体をリンカーGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSで結合したもの）を用いた場合の結果を、それぞれ表す。以下の結果より、サンプルＩＤ：Ｐ５５９はο変異株ＢＡ．５を中和できることが確認された。
【表5】
【0102】
さらに、ＶＨＨ抗体の二量体について、同様に中和アッセイを行った。用いた二量体は以下の通りである。
・Ｐ８６－Ｐ５５９（サンプルＩＤ：Ｐ８６とサンプルＩＤ：Ｐ５５９とをリンカーGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSで結合したものであり、Ｐ８６がＮ末端側）
・Ｐ５５９－Ｐ８６（サンプルＩＤ：Ｐ５５９とサンプルＩＤ：Ｐ８６とをリンカーGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSで結合したものであり、Ｐ５５９がＮ末端側）
・Ｒ４７Ｌ－Ｐ５５９（サンプルＩＤ：Ｐ８６の４７番目のアミノ酸をＲからＬに改変したもの（Ｒ４７Ｌ、配列番号４８）と、サンプルＩＤ：Ｐ５５９とをリンカーGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSで結合したものであり、Ｒ４７ＬがＮ末端側）
・Ｐ５５９－Ｒ４７Ｌ（サンプルＩＤ：Ｐ５５９と、サンプルＩＤ：Ｐ８６の４７番目のアミノ酸をＲからＬに改変したもの（Ｒ４７Ｌ）とをリンカーGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSで結合したものであり、Ｐ５５９がＮ末端側）
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質として、オリジナル、β変異株、及びδ変異株のＳＰＩＫＥタンパク質の他に、ο変異株ＢＡ．２及びο変異株ＢＡ．５のＳＰＩＫＥタンパク質を用いた。
・Ｐ８６－Ｐ５５９（サンプルＩＤ：Ｐ８６とサンプルＩＤ：Ｐ５５９とをリンカーGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSで結合したものであり、Ｐ８６がＮ末端側）
・Ｐ５５９－Ｐ８６（サンプルＩＤ：Ｐ５５９とサンプルＩＤ：Ｐ８６とをリンカーGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSで結合したものであり、Ｐ５５９がＮ末端側）
・Ｒ４７Ｌ－Ｐ５５９（サンプルＩＤ：Ｐ８６の４７番目のアミノ酸をＲからＬに改変したもの（Ｒ４７Ｌ、配列番号４８）と、サンプルＩＤ：Ｐ５５９とをリンカーGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSで結合したものであり、Ｒ４７ＬがＮ末端側）
・Ｐ５５９－Ｒ４７Ｌ（サンプルＩＤ：Ｐ５５９と、サンプルＩＤ：Ｐ８６の４７番目のアミノ酸をＲからＬに改変したもの（Ｒ４７Ｌ）とをリンカーGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSで結合したものであり、Ｐ５５９がＮ末端側）
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰＩＫＥタンパク質として、オリジナル、β変異株、及びδ変異株のＳＰＩＫＥタンパク質の他に、ο変異株ＢＡ．２及びο変異株ＢＡ．５のＳＰＩＫＥタンパク質を用いた。
【0103】
各株の感染抑制作用のＩＣ５０の測定値を下表に示す。下表に示すように、いずれの二量体もο変異株を中和できることが確認された。特に、Ｐ８６－Ｐ５５９と比較して、Ｐ５５９－Ｐ８６は、より高い中和活性を有していた。また、いずれの場合についても、サンプルＩＤ：Ｐ８６に対してＲ４７Ｌ変異を加えることにより、各株に対する中和活性が向上した。Ｒ４７Ｌ変異は、ＳＰＩＫＥタンパク質－サンプルＩＤ：Ｐ８６複合体の構造解析結果により、サンプルＩＤ：Ｐ８６のＲ４７とδ変異株のＳＰＩＫＥタンパク質との間に立体障害が生じることが示唆されたことから、導入されたものである。この結果は、サンプルＩＤ：Ｐ８６の４７番目のアミノ酸をＲからＬに改変することにより、δ変異株及びο変異株に対する中和活性が向上することを示唆している。
【表6】
【0104】
さらに、実施例１５と同様に、クライオ電子顕微鏡を用いて、ＳＰＩＫＥタンパク質－サンプルＩＤ：Ｐ５５９複合体の構造解析を行った。図１０は、得られた３次元構造を示す。
【0105】
サンプルＩＤ：Ｐ５５９は、ＲＢＤの３７５番、３７６番、４０５番、４０８番、及び５０５番のアミノ酸残基に対応するエピトープに結合することが確認された。このように、一実施形態に係る抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の３７５番、３７６番、４０５番、４０８番、又は５０５番のアミノ酸残基に対応するエピトープに結合する。このような抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を中和するために用いることができ、特にδ変異株及びο変異株に対する向上した中和活性を有している。
【0106】
また、構造解析の結果より、サンプルＩＤ：Ｐ５５９は、ＲＢＤの側面に結合してｕｐコンフォメーションを安定化するだけでなく、ＲＢＤに結合した際にＲＢＤをＡＣＥ２結合時に近い位置に動かすという新規な作用を有することが確認された。また、サンプルＩＤ：Ｐ５５９は、ＲＢＤの側面のうちＶＯＣ変異の入っていない領域と主に相互作用することで、中和活性の低下を広く回避することが可能になっている。
【0107】
さらに、ＳＰＩＫＥタンパク質－サンプルＩＤ：Ｐ８６複合体の構造解析結果及びＳＰＩＫＥタンパク質－サンプルＩＤ：Ｐ５５９複合体の構造解析結果から、以下のことが分かった。すなわち、ＳＰＩＫＥタンパク質のｕｐ状態の１つのＲＢＤに結合したサンプルＩＤ：Ｐ８６のＣ末端から同じＲＢＤに結合したサンプルＩＤ：Ｐ５５９のＮ末端までの距離と比べて、ＳＰＩＫＥタンパク質のｕｐ状態の１つのＲＢＤに結合したサンプルＩＤ：Ｐ５５９のＣ末端からｕｐ状態の別のＲＢＤに結合したサンプルＩＤ：Ｐ８６のＮ末端までの距離の方が、想定されるリンカーGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSの長さと適合していた。このことは、Ｐ５５９－Ｐ８６が、ｕｐ状態の２つのＲＢＤの間に入るようにＳＰＩＫＥタンパク質と結合していることを示唆している。これらの結果から、２つの異なるＲＢＤ間に結合し、これら２つのＲＢＤの動きを固定することができるＶＨＨ抗体が、より高い中和活性を有することが示唆される。
【0108】
このように、一実施形態に係る抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＰＩＫＥタンパク質の２つの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の間に結合する。このような抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を中和できる。
【0109】
発明は上記の実施形態に制限されるものではなく、発明の要旨の範囲内で、種々の変形・変更が可能である。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】