特開2023-61616慢性腎臓病の治療または予防薬としてのヒポキサンチントランスポーター阻害薬のスクリーニング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023061616
(43)【公開日】2023-05-02
(54)【発明の名称】慢性腎臓病の治療または予防薬としてのヒポキサンチントランスポーター阻害薬のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20230425BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20230425BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230425BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02 ZNA
C12N5/10
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021171647
(22)【出願日】2021-10-20
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和３（２０２１）年１月、第５４回日本痛風・尿酸核酸学会総会プログラム・抄録集、令和３（２０２１）年２月１１日、第５４回日本痛風・尿酸核酸学会総会 令和３（２０２１）年６月１１日、１９ｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｐｕｒｉｎｅ ａｎｄ Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｍａｎ １４ｔｈ－１６ｔｈ ｏｆ Ｊｕｎｅ ２０２１，Ｏｎｌｉｎｅ，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ（Ｔｈｅ Ｐｕｒｉｎｅ ａｎｄ Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、Ｇｅｎｅｒａｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｒｏｇｒａｍ ａｎｄ ａｂｓｔｒａｃｔｓ 令和３（２０２１）年６月１５日、１９ｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｐｕｒｉｎｅ ａｎｄ Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｍａｎ １４ｔｈ－１６ｔｈ ｏｆ Ｊｕｎｅ ２０２１，Ｏｎｌｉｎｅ，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ（Ｔｈｅ Ｐｕｒｉｎｅ ａｎｄ Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ）
(71)【出願人】
【識別番号】399086263
【氏名又は名称】学校法人帝京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】細山田 真
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA05
4B063QQ08
4B063QQ65
4B063QR77
4B063QS38
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065BD22
4B065BD34
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】慢性腎臓病、特にはキサンチン尿症の治療もしくは予防薬の候補物質となるヒトＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーター阻害薬のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】前記スクリーニング方法は、ヒトＳＬＣ２３Ａ３（solute carrier family 23 member 3）遺伝子産物を発現する細胞と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる工程を含む。
【選択図】なし
【解決手段】前記スクリーニング方法は、ヒトＳＬＣ２３Ａ３（solute carrier family 23 member 3）遺伝子産物を発現する細胞と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる工程を含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）ヒトＳＬＣ２３Ａ３（solute carrier family 23 member 3）遺伝子産物を発現する細胞と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる工程（接触工程）
を含む、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害薬のスクリーニング方法。
を含む、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害薬のスクリーニング方法。
【請求項2】
前記細胞が微生物であり、前記接触工程の後に、
（２Ａ）ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で試験物質を接触させた状態で前記微生物を培養し、その増殖を観察する工程（培養観察工程）、
（３Ａ）微生物増殖が観察される試験物質を候補物質として選択する工程（選択工程）
を更に含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
（２Ａ）ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で試験物質を接触させた状態で前記微生物を培養し、その増殖を観察する工程（培養観察工程）、
（３Ａ）微生物増殖が観察される試験物質を候補物質として選択する工程（選択工程）
を更に含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項3】
前記細胞が動物細胞であり、前記接触工程の後に、
（２Ｂ）ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で試験物質を接触させた状態で前記動物細胞におけるヒポキサンチン取り込み量を測定する工程（測定工程）、
（３Ｂ）ヒポキサンチンの取り込み量を減少させる試験物質を候補物質として選択する工程（選択工程）
を更に含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
（２Ｂ）ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で試験物質を接触させた状態で前記動物細胞におけるヒポキサンチン取り込み量を測定する工程（測定工程）、
（３Ｂ）ヒポキサンチンの取り込み量を減少させる試験物質を候補物質として選択する工程（選択工程）
を更に含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項4】
（４）選択した候補物質について、別の評価系を用いて、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害効果、慢性腎臓病の治療もしくは予防効果、又はキサンチン尿症の治療もしくは予防効果を確認する工程（確認工程）
を更に含む、請求項２又は３に記載のスクリーニング方法。
を更に含む、請求項２又は３に記載のスクリーニング方法。
【請求項5】
ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害薬が慢性腎臓病の治療または予防薬である、請求項１～４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項6】
慢性腎臓病がキサンチン尿症である、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、慢性腎臓病（ＣＫＤ；chronic kidney disease）、特にはキサンチン尿症の治療または予防薬としてのヒポキサンチントランスポーター阻害薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
腎臓近位尿細管直部に発現するヒトＳＬＣ２３Ａ３（solute carrier family 23 member 3）遺伝子は、ＳＬＣ２３ Ｎａ＋依存性アスコルビン酸トランスポーターファミリーの一員であり、ＮＭ＿００１１４４８８９（ｍＲＮＡ，２３２２ｂｐ）として登録されている。ヒトでは、ＳＬＣ２３ Ｎａ＋依存性アスコルビン酸トランスポーターファミリーとして、ＳＬＣ２３Ａ１～ＳＬＣ２３Ａ４が知られており、ＳＬＣ２３Ａ１、ＳＬＣ２３Ａ２は、Ｎａ＋依存的にＬ－アスコルビン酸を輸送すること、ＳＬＣ２３Ａ４は偽遺伝子（pseudogene）であることが知られていたが、ＳＬＣ２３Ａ３の機能はこれまで不明であった（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Burzle, M et al: The sodium-dependent ascorbic acid transporter family SLC23. Mol Aspects Med 34(2-3): 436-454, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子は、これまで機能が不明であったが、本発明者は今回、ツメガエル卵母細胞発現系を用いて、Ｎａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターであることを明らかにした。
ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を含むプラスミドを有する大腸菌は、Ｎａ＋存在下で増殖が阻害される一方、Ｎａ＋非存在下で増殖可能となることから、ヒト腎臓においてもＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物はヒポキサンチン毒性を発現するトランスポーターであると考えられる。従って、ＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害薬は腎保護薬の候補物質と考えられる。
ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を含むプラスミドを有する大腸菌は、Ｎａ＋存在下で増殖が阻害される一方、Ｎａ＋非存在下で増殖可能となることから、ヒト腎臓においてもＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物はヒポキサンチン毒性を発現するトランスポーターであると考えられる。従って、ＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害薬は腎保護薬の候補物質と考えられる。
【0005】
本発明の課題は、慢性腎臓病、特にはキサンチン尿症の治療もしくは予防薬の候補物質となるヒトＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーター阻害薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
前記課題は、以下の本発明により解決することができる：
［１］（１）ヒトＳＬＣ２３Ａ３（solute carrier family 23 member 3）遺伝子産物を発現する細胞と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる工程（接触工程）
を含む、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害薬のスクリーニング方法。
［２］前記細胞が微生物であり、前記接触工程の後に、
（２Ａ）ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で試験物質を接触させた状態で前記微生物を培養し、その増殖を観察する工程（培養観察工程）、
（３Ａ）微生物増殖が観察される試験物質を候補物質として選択する工程（選択工程）
を更に含む、［１］のスクリーニング方法。
［３］前記細胞が動物細胞であり、前記接触工程の後に、
（２Ｂ）ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で試験物質を接触させた状態で前記動物細胞におけるヒポキサンチン取り込み量を測定する工程（測定工程）、
（３Ｂ）ヒポキサンチンの取り込み量を減少させる試験物質を候補物質として選択する工程（選択工程）
を更に含む、［１］のスクリーニング方法。
［４］（４）選択した候補物質について、別の評価系を用いて、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害効果、慢性腎臓病の治療もしくは予防効果、又はキサンチン尿症の治療もしくは予防効果を確認する工程（確認工程）
を更に含む、［２］又は［３］のスクリーニング方法。
［５］ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害薬が慢性腎臓病の治療または予防薬である、［１］～［４］のいずれかのスクリーニング方法。
［６］慢性腎臓病がキサンチン尿症である、［５］のスクリーニング方法。
［１］（１）ヒトＳＬＣ２３Ａ３（solute carrier family 23 member 3）遺伝子産物を発現する細胞と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる工程（接触工程）
を含む、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害薬のスクリーニング方法。
［２］前記細胞が微生物であり、前記接触工程の後に、
（２Ａ）ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で試験物質を接触させた状態で前記微生物を培養し、その増殖を観察する工程（培養観察工程）、
（３Ａ）微生物増殖が観察される試験物質を候補物質として選択する工程（選択工程）
を更に含む、［１］のスクリーニング方法。
［３］前記細胞が動物細胞であり、前記接触工程の後に、
（２Ｂ）ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で試験物質を接触させた状態で前記動物細胞におけるヒポキサンチン取り込み量を測定する工程（測定工程）、
（３Ｂ）ヒポキサンチンの取り込み量を減少させる試験物質を候補物質として選択する工程（選択工程）
を更に含む、［１］のスクリーニング方法。
［４］（４）選択した候補物質について、別の評価系を用いて、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害効果、慢性腎臓病の治療もしくは予防効果、又はキサンチン尿症の治療もしくは予防効果を確認する工程（確認工程）
を更に含む、［２］又は［３］のスクリーニング方法。
［５］ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害薬が慢性腎臓病の治療または予防薬である、［１］～［４］のいずれかのスクリーニング方法。
［６］慢性腎臓病がキサンチン尿症である、［５］のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【0007】
本発明のスクリーニング方法によれば、慢性腎臓病、特にはキサンチン尿症の治療もしくは予防薬の候補物質となるヒトＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーター阻害薬のスクリーニング方法を提供することができる。特に、本発明のスクリーニング方法の好適態様である微生物（典型的には大腸菌）を用いるスクリーニング方法によれば、ヒポキサンチンの取り込み量を測定することなく、微生物の増殖の有無または程度を指標として候補物質を選択できるため、大量の試験物質を迅速かつ安価にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】ヒトＳＬＣ２３Ａ３ ＲＮＡを微量注入したアフリカツメガエル卵母細胞におけるＮａ＋非存在下またはＮａ＋存在下でのヒポキサンチンの取り込み量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明のスクリーニング方法は、
（１）ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物を発現する細胞と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる工程（接触工程）
を含む。
（１）ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物を発現する細胞と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる工程（接触工程）
を含む。
【0010】
前記接触工程における前記細胞が微生物（例えば、大腸菌）である場合、本発明のスクリーニング方法は、
（１）ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物を発現する微生物と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる工程（接触工程）、
（２Ａ）前記接触工程に続いて、その接触状態を維持したまま前記微生物を培養し、その増殖を観察する工程（培養観察工程）、
（３Ａ）微生物増殖が観察される試験物質を候補物質として選択する工程（選択工程）
を含む。
前記スクリーニング方法は、所望により、
（４）選択した候補物質について、別の評価系を用いて、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害効果、慢性腎臓病の治療もしくは予防効果、又はキサンチン尿症の治療もしくは予防効果を確認する工程（確認工程）
を更に含むことができる。
（１）ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物を発現する微生物と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる工程（接触工程）、
（２Ａ）前記接触工程に続いて、その接触状態を維持したまま前記微生物を培養し、その増殖を観察する工程（培養観察工程）、
（３Ａ）微生物増殖が観察される試験物質を候補物質として選択する工程（選択工程）
を含む。
前記スクリーニング方法は、所望により、
（４）選択した候補物質について、別の評価系を用いて、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害効果、慢性腎臓病の治療もしくは予防効果、又はキサンチン尿症の治療もしくは予防効果を確認する工程（確認工程）
を更に含むことができる。
【0011】
前記接触工程における前記細胞が動物細胞（例えば、ツメガエル卵母細胞）である場合、本発明のスクリーニング方法は、
（１）ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物を発現する動物細胞と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる工程（接触工程）、
（２Ｂ）前記接触工程に続いて、その接触状態を維持したまま前記動物細胞におけるヒポキサンチン取り込み量を測定する工程（測定工程）、
（３Ｂ）ヒポキサンチンの取り込み量を減少させる試験物質を候補物質として選択する工程（選択工程）
を含む。
前記スクリーニング方法は、所望により、
（４）選択した候補物質について、別の評価系を用いて、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害効果、慢性腎臓病の治療もしくは予防効果、又はキサンチン尿症の治療もしくは予防効果を確認する工程（確認工程）
を更に含むことができる。
（１）ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物を発現する動物細胞と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる工程（接触工程）、
（２Ｂ）前記接触工程に続いて、その接触状態を維持したまま前記動物細胞におけるヒポキサンチン取り込み量を測定する工程（測定工程）、
（３Ｂ）ヒポキサンチンの取り込み量を減少させる試験物質を候補物質として選択する工程（選択工程）
を含む。
前記スクリーニング方法は、所望により、
（４）選択した候補物質について、別の評価系を用いて、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害効果、慢性腎臓病の治療もしくは予防効果、又はキサンチン尿症の治療もしくは予防効果を確認する工程（確認工程）
を更に含むことができる。
【0012】
以下、本発明のスクリーニング方法について詳細に説明するが、微生物と動物細胞で共通する接触工程（１）を説明した後、細胞として微生物を用いる本発明の一態様における培養観察工程（２Ａ）および選択工程（３Ａ）、細胞として動物細胞を用いる本発明の別の一態様における測定工程（２Ｂ）および選択工程（３Ｂ）をこの順に説明し、最後に微生物と動物細胞で共通する確認工程（４）を説明する。
【0013】
《接触工程（１）》
本発明のスクリーニング方法における接触工程（１）では、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物を発現する細胞（以下、スクリーニング用細胞と称することがある）と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる。
本発明のスクリーニング方法における接触工程（１）では、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物を発現する細胞（以下、スクリーニング用細胞と称することがある）と、試験物質とを、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で接触させる。
【0014】
ヒトＳＬＣ２３Ａ３（solute carrier family 23 member 3）遺伝子は、ＳＬＣ２３ Ｎａ＋依存性アスコルビン酸トランスポーターファミリーの一員であり、ＮＭ＿００１１４４８８９（ｍＲＮＡ，２３２２ｂｐ）として登録されている。ヒトでは、ＳＬＣ２３ Ｎａ＋依存性アスコルビン酸トランスポーターファミリーとして、ＳＬＣ２３Ａ１～ＳＬＣ２３Ａ４が知られており、ＳＬＣ２３Ａ１、ＳＬＣ２３Ａ２は、Ｎａ＋依存的にＬ－アスコルビン酸を輸送すること、ＳＬＣ２３Ａ４は偽遺伝子（pseudogene）であることが知られていたが、ＳＬＣ２３Ａ３の機能はこれまで不明であった。後述の実施例２に示すように、本発明者は今回、ツメガエル卵母細胞発現系を用いて、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物がＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターであることを明らかにした。
【0015】
例えば、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を動物細胞で発現させると、Ｎａ＋存在下において細胞外のヒポキサンチンを細胞内に取り込むヒポキサンチン輸送が行われるが、細胞内でのヒポキサンチン集積は毒性を示すため、Ｎａ＋存在下では細胞増殖が阻害される。同様に、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を微生物で発現させると、Ｎａ＋存在下において細胞外のヒポキサンチンを細胞内に取り込むヒポキサンチン輸送が行われるが、微生物においてもヒポキサンチン集積は毒性を示すため、Ｎａ＋存在下では微生物の増殖が阻害される。
【0016】
本発明のスクリーニング法で使用することのできる細胞としては、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を細胞内に発現可能な状態で導入することができ、且つ、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物が機能を発揮できる細胞であれば、特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌等の微生物、卵母細胞等の動物細胞（好ましくは哺乳動物細胞）、植物細胞などを挙げることができる。
【0017】
前記細胞として微生物を用いる場合には、それ自体公知の遺伝子導入法、例えば、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、その発現ベクターを用いて微生物を形質転換する方法、エレクトロポレーション等によりヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を微生物に導入し、ゲノムに該遺伝子を組み込む方法等により、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物を発現する微生物を取得することができる。
【0018】
前記細胞として動物または植物細胞を用いる場合には、公知の遺伝子導入法、例えば、微量注入（マイクロインジェクション）等によりヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を該細胞内に注入し、細胞内で発現させる方法、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、その発現ベクターを用いて該細胞を形質転換する方法、エレクトロポレーション等によりヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を該細胞に導入し、ゲノムに該遺伝子を組み込む方法等により、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物を発現する動物または植物細胞を取得することができる。
【0019】
本発明のスクリーニング法で使用することのできる試験物質は、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の化合物、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Terrett N.K. et al., Tetrahedron，51，8135－73, 1995）によって得られる化合物群、ファージ・ディスプレイ法（Felici, F. et al., J.Mol.Biol., 222, 301-310, 1991）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群；タンパク質、核酸分子、ペプチド、抗体；微生物または植物若しくは動物細胞の培養上清または細胞抽出物、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、生体内の体液；更には、本発明のスクリーニング法により選択された化合物等を化学的又は生物学的に修飾した化合物などを挙げることができる。
【0020】
ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下におけるスクリーニング用細胞と試験物質との接触は、例えば、細胞が微生物（典型的には大腸菌）である場合、試験物質、ヒポキサンチン、及びナトリウムイオンを含有する培地を用いて微生物の培養を開始することにより実施することができる。あるいは、各ウェルに試験物質を予め分注したマイクロプレートを用意しておき、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンを含有する培地に懸濁した微生物を各ウェルに添加して培養を開始することにより、前記接触を実施することができる。
【0021】
細胞が動物細胞（典型的にはツメガエル卵母細胞）である場合、前記接触は、例えば、インビトロ転写により合成したヒトＳＬＣ２３Ａ３ ＲＮＡを動物細胞に微量注入し、所定時間（ツメガエル卵母細胞では３６時間以上）培養してヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を発現させた後、試験物質、３Ｈ－ヒポキサンチン、及びナトリウムイオンを含有する培地と交換または追加することにより実施することができる。
【0022】
本発明のスクリーニング方法における接触工程において、使用する細胞量（例えば、細胞数／培地容量）、ヒポキサンチン濃度、ナトリウムイオン濃度等は、後述の実施例を参考に、適宜決定することができる。試験物質の濃度については、例えば、その種類、精製の程度、活性の強弱などが異なるため、一概には規定できないが、当業者であれば、複数の異なる濃度で予備実験を行うことにより適宜決定することができる。
【0023】
本発明のスクリーニング方法における接触工程では、試験物質を添加する試験群に加えて、所望により、試験物質を添加しないネガティブコントロールや、試験物質の代わりにＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーター（すなわち、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物）の公知阻害薬（例えば、ジピリダモール）を添加したポジティブコントロールを用意することができる。
【0024】
《培養観察工程（２Ａ）、選択工程（３Ａ）》
本発明のスクリーニング方法において、細胞として微生物を用いる本発明の一態様における培養観察工程（２Ａ）では、前記接触工程（１）に続いて、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で試験物質を接触させた状態で前記微生物を培養し、その増殖を観察する。続いて、本態様における選択工程（３Ａ）では、微生物増殖が観察される試験物質を候補物質として選択する。
本発明のスクリーニング方法において、細胞として微生物を用いる本発明の一態様における培養観察工程（２Ａ）では、前記接触工程（１）に続いて、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で試験物質を接触させた状態で前記微生物を培養し、その増殖を観察する。続いて、本態様における選択工程（３Ａ）では、微生物増殖が観察される試験物質を候補物質として選択する。
【0025】
前記培養観察工程において、微生物の増殖を観察する方法は、増殖しているか否か、及び／又は増殖の程度を判断できる方法であれば、特に限定されるものではないが、例えば、目視により濁度を観察する方法、吸光度により濁度を定量する方法、培養液を遠心することにより沈殿した微生物の量により判断する方法等を挙げることができる。
【0026】
先述したとおり、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を微生物で発現させると、Ｎａ＋存在下において細胞外のヒポキサンチンを細胞内に取り込むヒポキサンチン輸送が行われるが、微生物においてもヒポキサンチン集積は毒性を示すため、Ｎａ＋存在下では微生物の増殖が阻害される（試験物質を添加しないネガティブコントロール）。一方、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物であるＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターの阻害薬を添加したポジティブコントロールでは、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を微生物で発現させても、ヒポキサンチン輸送が阻害されるため、微生物内でのヒポキサンチン集積は発生せず、従って、Ｎａ＋存在下でも微生物は増殖する。
【0027】
前記選択工程では、試験物質を添加した試験群の内、Ｎａ＋存在下で微生物の増殖が観察された試験物質を候補物質として選択する。選択された候補物質は、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物であるＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターの阻害薬の候補物質である。Ｎａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターはヒポキサンチン毒性を発現するトランスポーターであると考えられるので、Ｎａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーター阻害薬は、腎保護薬、すなわち、慢性腎臓病の治療または予防薬、特にはキサンチン尿症の治療または予防薬の候補と考えられる。
【0028】
得られた候補物質をリード化合物として化学的又は生物学的に修飾した複数の化合物を、再度、試験物質として本発明のスクリーニング方法に適用することにより、より効果の高い候補物質を取得することができる。
【0029】
《測定工程（２Ｂ）および選択工程（３Ｂ）》
本発明のスクリーニング方法において、細胞として動物細胞を用いる本発明の一態様における測定工程（２Ａ）では、前記接触工程（１）に続いて、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で試験物質を接触させた状態で前記動物細胞におけるヒポキサンチン取り込み量を測定する。続いて、本態様における選択工程（３Ａ）では、ヒポキサンチンの取り込み量を減少させる試験物質を候補物質として選択する。
本発明のスクリーニング方法において、細胞として動物細胞を用いる本発明の一態様における測定工程（２Ａ）では、前記接触工程（１）に続いて、ヒポキサンチン及びナトリウムイオンの存在下で試験物質を接触させた状態で前記動物細胞におけるヒポキサンチン取り込み量を測定する。続いて、本態様における選択工程（３Ａ）では、ヒポキサンチンの取り込み量を減少させる試験物質を候補物質として選択する。
【0030】
前記測定工程において、ヒポキサンチンの取り込み量を測定する方法は、公知のヒポキサンチン測定法であれば、特に限定されるものではないが、例えば、放射性同位体等の標識化合物でラベルしたヒポキサンチンを用いて実施することができる。
【0031】
ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を動物細胞で発現させると、Ｎａ＋存在下において細胞外のヒポキサンチンを細胞内に取り込むヒポキサンチン輸送が行われるので、Ｎａ＋存在下でヒポキサンチンの取り込み量が増加する（試験物質を添加しないネガティブコントロール）。一方、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物であるＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターの阻害薬を添加したポジティブコントロールでは、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を動物細胞で発現させても、ヒポキサンチン輸送が阻害されるため、Ｎａ＋存在下でヒポキサンチンの取り込み量が減少する。
【0032】
前記選択工程では、試験物質を添加した試験群の内、ネガティブコントロールのヒポキサンチン取り込み量と比較して、Ｎａ＋存在下でヒポキサンチンの取り込み量を減少させた試験物質を候補物質として選択する。選択された候補物質は、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物であるＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターの阻害薬の候補物質である。先述のとおり、Ｎａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターはヒポキサンチン毒性を発現するトランスポーターであると考えられるので、Ｎａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーター阻害薬は、腎保護薬、すなわち、慢性腎臓病の治療または予防薬、特にはキサンチン尿症の治療または予防薬の候補と考えられる。
【0033】
得られた候補物質をリード化合物として化学的又は生物学的に修飾した複数の化合物を、再度、試験物質として本発明のスクリーニング方法に適用することにより、より効果の高い候補物質を取得することができる。
【0034】
《確認工程（４）》
本発明のスクリーニング方法における確認工程（４）では、選択した候補物質について、別の評価系を用いて、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害効果、慢性腎臓病の治療もしくは予防効果、又はキサンチン尿症の治療もしくは予防効果を確認する。
本発明のスクリーニング方法における確認工程（４）では、選択した候補物質について、別の評価系を用いて、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害効果、慢性腎臓病の治療もしくは予防効果、又はキサンチン尿症の治療もしくは予防効果を確認する。
【0035】
例えば、細胞として微生物を用いる本発明のスクリーニング方法の一態様により選択した候補物質を、細胞として動物細胞を用いる本発明のスクリーニング方法の別の一態様に適用し、Ｎａ＋存在下でヒポキサンチンの取り込み量が減少することを確認することにより、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害効果を再確認することができる。また、その逆に、細胞として動物細胞を用いる本発明のスクリーニング方法の一態様により選択した候補物質を、細胞として微生物を用いる本発明のスクリーニング方法の別の一態様に適用し、Ｎａ＋存在下で微生物が増殖することを確認することにより、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害効果を再確認することができる。
【0036】
また、慢性腎臓病、特にはキサンチン尿症の治療または予防薬の公知の評価系により、候補物質の慢性腎臓病、特にはキサンチン尿症の治療もしくは予防効果を確認することができる。この際、所望により、公知の該治療または予防薬と比較しながら、候補物質の効果を確認することができる。
【実施例0037】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0038】
《実施例１：ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子のクローニング》
ヒトＳＬＣ２３Ａ３ ｃＤＮＡは、ヒト腎臓由来の全ＲＮＡを用いるｎｅｓｔｅｄ ＲＴ－ＰＣＲによりクローニングした。第一回および第二回の各ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲに用いたプライマーセットを表１に示す。クローニングは、ＰＣＲ産物のクローニングの際にＮａＣｌ無添加のＬＢ培地を用いて大腸菌を培養すること以外は、常法に従って実施した。なお、通常のＬＢ培地の組成は、トリプトン１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム１％（ｗ／ｖ）である。
ヒトＳＬＣ２３Ａ３ ｃＤＮＡは、ヒト腎臓由来の全ＲＮＡを用いるｎｅｓｔｅｄ ＲＴ－ＰＣＲによりクローニングした。第一回および第二回の各ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲに用いたプライマーセットを表１に示す。クローニングは、ＰＣＲ産物のクローニングの際にＮａＣｌ無添加のＬＢ培地を用いて大腸菌を培養すること以外は、常法に従って実施した。なお、通常のＬＢ培地の組成は、トリプトン１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム１％（ｗ／ｖ）である。
【0039】
【表1】
【0040】
得られたｃＤＮＡの塩基配列（配列番号５）は、ＮＭ＿００１１４４８８９（ｍＲＮＡ，２３２２ｂｐ）として登録されているヒトＳＬＣ２３Ａ３（solute carrier family 23 member 3）遺伝子の塩基配列と一致した。
【0041】
《実施例２：ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子のツメガエル卵母細胞における発現とＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーター活性の確認》
１．ＳＬＣ２３Ａ３クローンベクターからのインビトロ転写
ＳＬＣ２３Ａ３－ｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミドは５’側にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合配列を有するので、ＳＬＣ２３Ａ３－ｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミドを３’側に位置するＳｐｅＩ制限酵素部位で切断して直鎖状にし、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＳＬＣ２３Ａ３ ＲＮＡをインビトロ合成し、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＳＬＣ２３Ａ３－ｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミドを分解後、ＭｅｇａＣｌｅａｒ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＲＮＡを精製し、Ｐｏｌｙ Ａ ｔａｉｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＲＮＡにＰｏｌｙ Ａ ｔａｉｌを付加した。蒸留水を用いて１μｇ／μＬに調整し、－８０℃で保存した。
１．ＳＬＣ２３Ａ３クローンベクターからのインビトロ転写
ＳＬＣ２３Ａ３－ｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミドは５’側にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合配列を有するので、ＳＬＣ２３Ａ３－ｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミドを３’側に位置するＳｐｅＩ制限酵素部位で切断して直鎖状にし、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＳＬＣ２３Ａ３ ＲＮＡをインビトロ合成し、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＳＬＣ２３Ａ３－ｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミドを分解後、ＭｅｇａＣｌｅａｒ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＲＮＡを精製し、Ｐｏｌｙ Ａ ｔａｉｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＲＮＡにＰｏｌｙ Ａ ｔａｉｌを付加した。蒸留水を用いて１μｇ／μＬに調整し、－８０℃で保存した。
【0042】
２．ツメガエル卵母細胞の調製
麻酔下の雌アフリカツメガエルの腹部を切開し、卵巣塊を一部摘出後、４－０外科用吸収糸で閉創した。卵巣被膜をピンセットで破砕後、２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ／ＯＲ２溶液１０ｍＬ中で室温２時間振盪して卵母細胞を単離した。卵母細胞をゲンタマイシン入りＮＤ９６溶液に移動させると卵母細胞を包む卵胞細胞がはがれるため、微量注入可能な状態となる。顕微鏡下でステージ６の大きさまで成熟した卵母細胞を選別した。
麻酔下の雌アフリカツメガエルの腹部を切開し、卵巣塊を一部摘出後、４－０外科用吸収糸で閉創した。卵巣被膜をピンセットで破砕後、２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ／ＯＲ２溶液１０ｍＬ中で室温２時間振盪して卵母細胞を単離した。卵母細胞をゲンタマイシン入りＮＤ９６溶液に移動させると卵母細胞を包む卵胞細胞がはがれるため、微量注入可能な状態となる。顕微鏡下でステージ６の大きさまで成熟した卵母細胞を選別した。
【0043】
３．ＲＮＡのツメガエル卵母細胞への微量注入
ガラスキャピラリーをプーラーで引き、針状となった先端をピンセットで折り、１８０℃で２時間乾熱滅菌してガラスニードルとして用いた。ガラスニードルにシリコンオイルを少量充填し、Ｍａｎｕａｌ Ｏｏｃｙｔｅ Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｐｉｐｅｔｔｅ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に取り付けて、同Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｐｉｐｅｔｔｅをマニピュレーターに取り付けた。パラフィルム上に置いたＲＮＡ溶液もしくは蒸留水をガラスニードル内に吸引した。ガーゼを貼り付けたシャーレ上にＮＤ９６溶液を入れ、２．で調整したツメガエル卵母細胞を置いた。ツメガエル卵母細胞の赤道部分にガラスニードルを刺入し、ＲＮＡもしくは蒸留水を５０ｎＬ注入した。ＮａＣｌをコリンＣｌもしくはＮＭＤＧ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｃａｍｉｎｅ）で置換したＮＤ９６溶液（Ｎａ無添加ＮＤ９６溶液）にツメガエル卵母細胞を移し、１８℃で４８時間以上培養した。
ガラスキャピラリーをプーラーで引き、針状となった先端をピンセットで折り、１８０℃で２時間乾熱滅菌してガラスニードルとして用いた。ガラスニードルにシリコンオイルを少量充填し、Ｍａｎｕａｌ Ｏｏｃｙｔｅ Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｐｉｐｅｔｔｅ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に取り付けて、同Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｐｉｐｅｔｔｅをマニピュレーターに取り付けた。パラフィルム上に置いたＲＮＡ溶液もしくは蒸留水をガラスニードル内に吸引した。ガーゼを貼り付けたシャーレ上にＮＤ９６溶液を入れ、２．で調整したツメガエル卵母細胞を置いた。ツメガエル卵母細胞の赤道部分にガラスニードルを刺入し、ＲＮＡもしくは蒸留水を５０ｎＬ注入した。ＮａＣｌをコリンＣｌもしくはＮＭＤＧ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｃａｍｉｎｅ）で置換したＮＤ９６溶液（Ｎａ無添加ＮＤ９６溶液）にツメガエル卵母細胞を移し、１８℃で４８時間以上培養した。
【0044】
４．３Ｈ－ヒポキサンチン取り込み実験
２４ウェルプレートにＮａ無添加ＮＤ９６溶液を入れて、４８時間以上培養したツメガエル卵母細胞を１ウェル当たり１０個入れた。１ウェル当たり５００μＬの１０ｎｍｏｌ／Ｌ ３Ｈ－ヒポキサンチン／ＮＤ９６溶液を添加し、２分間取り込みを行った後、氷冷したＮＤ９６溶液を約１ｍＬ×５回洗浄し、ツメガエル卵母細胞１個を液シンバイアル１本に移し、１ウェルより８個移した。液体シンチレーションバイアルに５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１００μＬ加え、一晩溶解させた。液体シンチレーションカクテルを１ｍＬ加え、シンチレーションカウンターにてｄｐｍを計測した。
２４ウェルプレートにＮａ無添加ＮＤ９６溶液を入れて、４８時間以上培養したツメガエル卵母細胞を１ウェル当たり１０個入れた。１ウェル当たり５００μＬの１０ｎｍｏｌ／Ｌ ３Ｈ－ヒポキサンチン／ＮＤ９６溶液を添加し、２分間取り込みを行った後、氷冷したＮＤ９６溶液を約１ｍＬ×５回洗浄し、ツメガエル卵母細胞１個を液シンバイアル１本に移し、１ウェルより８個移した。液体シンチレーションバイアルに５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１００μＬ加え、一晩溶解させた。液体シンチレーションカクテルを１ｍＬ加え、シンチレーションカウンターにてｄｐｍを計測した。
【0045】
５．結果
結果を図１に示す。
ＳＬＣ２３Ａ３ ＲＮＡを注入していない卵母細胞（対照）では、Ｎａ＋の有無によりヒポキサンチンの取り込み量に変化がなかった。一方、同ＲＮＡを注入した卵母細胞では、Ｎａ＋の有無にかかわらず、対照と比較してより多くのヒポキサンチンの取り込みが観察され、また、Ｎａ＋非存在下とＮａ＋存在下との比較では、Ｎａ＋存在下において有意な取り込み量増加が認められた。
この結果から、ヒト腎臓で発現するＳＬＣ２３Ａ３は、Ｎａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターであることが確認された。
結果を図１に示す。
ＳＬＣ２３Ａ３ ＲＮＡを注入していない卵母細胞（対照）では、Ｎａ＋の有無によりヒポキサンチンの取り込み量に変化がなかった。一方、同ＲＮＡを注入した卵母細胞では、Ｎａ＋の有無にかかわらず、対照と比較してより多くのヒポキサンチンの取り込みが観察され、また、Ｎａ＋非存在下とＮａ＋存在下との比較では、Ｎａ＋存在下において有意な取り込み量増加が認められた。
この結果から、ヒト腎臓で発現するＳＬＣ２３Ａ３は、Ｎａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターであることが確認された。
【0046】
《実施例３：ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子の大腸菌における発現とＮａ＋依存的な大腸菌増殖の確認》
ＳＬＣ２３Ａ３のＰＣＲ産物のクローニングの際に得られたＳＬＣ２３Ａ３－ｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミド含有大腸菌をＮａＣｌ無添加ＬＢ寒天培地（カナマイシン含有）でコロニー形成ののち、１つのコロニーをピックアップしてＮａＣｌ無添加ＬＢ溶液（カナマイシン含有）に加えて菌液を作成し、菌液をＮａＣｌ添加ＬＢ溶液（カナマイシン含有）とＮａＣｌ無添加ＬＢ溶液（カナマイシン含有）に一定量加え、３７℃、２２５ｒｐｍで一晩培養した。なお、本実施例および次の実施例４における「ＮａＣｌ添加ＬＢ溶液」は、通常のＬＢ培地（トリプトン１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム１％（ｗ／ｖ））である。また、通常のＬＢ培地は、酵母エキスに由来するヒポキサンチンを含有するため、別途、ヒポキサンチンを添加する必要はない。
ＳＬＣ２３Ａ３のＰＣＲ産物のクローニングの際に得られたＳＬＣ２３Ａ３－ｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミド含有大腸菌をＮａＣｌ無添加ＬＢ寒天培地（カナマイシン含有）でコロニー形成ののち、１つのコロニーをピックアップしてＮａＣｌ無添加ＬＢ溶液（カナマイシン含有）に加えて菌液を作成し、菌液をＮａＣｌ添加ＬＢ溶液（カナマイシン含有）とＮａＣｌ無添加ＬＢ溶液（カナマイシン含有）に一定量加え、３７℃、２２５ｒｐｍで一晩培養した。なお、本実施例および次の実施例４における「ＮａＣｌ添加ＬＢ溶液」は、通常のＬＢ培地（トリプトン１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム１％（ｗ／ｖ））である。また、通常のＬＢ培地は、酵母エキスに由来するヒポキサンチンを含有するため、別途、ヒポキサンチンを添加する必要はない。
【0047】
ＳＬＣ２３Ａ３－ｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミド含有大腸菌は、ＮａＣｌ無添加ＬＢ溶液では、増殖可能で、培養液の混濁が確認されたのに対して、ＮａＣｌ添加ＬＢ溶液では、増殖が阻害され、培養液の混濁が少なく、培養液を遠心して得られる大腸菌の沈殿も少ないことが確認された。
この結果は、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物であるＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターが、Ｎａ＋存在下の大腸菌においてヒポキサンチン集積により毒性を示すため、該遺伝子産物を発現する大腸菌の増殖を阻害すること、そして、この培養系をスクリーニングに用いることにより、Ｎａ＋含有培地で該大腸菌の増殖を回復させる試験物質はヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害薬の候補物質となり得ることを示す。
この結果は、ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子産物であるＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターが、Ｎａ＋存在下の大腸菌においてヒポキサンチン集積により毒性を示すため、該遺伝子産物を発現する大腸菌の増殖を阻害すること、そして、この培養系をスクリーニングに用いることにより、Ｎａ＋含有培地で該大腸菌の増殖を回復させる試験物質はヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子機能阻害薬の候補物質となり得ることを示す。
【0048】
《実施例４：ヒトＳＬＣ２３Ａ３遺伝子を発現する大腸菌を用いたＮａ＋依存性ヒポキサンチントランスポーターの活性阻害薬のスクリーニング》
ＳＬＣ２３Ａ３－ｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミド含有大腸菌をＮａＣｌ無添加ＬＢ寒天培地（カナマイシン含有）でコロニー形成ののち、１つのコロニーをピックアップしてＮａＣｌ無添加ＬＢ溶液（カナマイシン含有）に加えて菌液を作成する。東大創薬機構から入手したＡｓｓａｙ ｒｅａｄｙ ｐｌａｔｅの各ウェルにＤＭＳＯ ２μＬ添加後、ＮａＣｌ添加ＬＢ溶液（カナマイシン含有）を１００μＬ添加して回転振盪することで被検薬を溶解する。さらに上記菌液を各ウェルに１００μＬ添加し、滅菌済みガス透過性プレートシール（ＳｕｒｅＳｅａｌ Ｂｒｅａｔｈａｂｌｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ；ＢＭ機器）でシールして３７℃で一晩培養し、６６０ｎｍ吸光度を測定して菌の増殖しているウェルを検索する。
ＳＬＣ２３Ａ３－ｐＣＲ４ＴＯＰＯプラスミド含有大腸菌をＮａＣｌ無添加ＬＢ寒天培地（カナマイシン含有）でコロニー形成ののち、１つのコロニーをピックアップしてＮａＣｌ無添加ＬＢ溶液（カナマイシン含有）に加えて菌液を作成する。東大創薬機構から入手したＡｓｓａｙ ｒｅａｄｙ ｐｌａｔｅの各ウェルにＤＭＳＯ ２μＬ添加後、ＮａＣｌ添加ＬＢ溶液（カナマイシン含有）を１００μＬ添加して回転振盪することで被検薬を溶解する。さらに上記菌液を各ウェルに１００μＬ添加し、滅菌済みガス透過性プレートシール（ＳｕｒｅＳｅａｌ Ｂｒｅａｔｈａｂｌｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ；ＢＭ機器）でシールして３７℃で一晩培養し、６６０ｎｍ吸光度を測定して菌の増殖しているウェルを検索する。
【産業上の利用可能性】
【0049】
本発明のスクリーニング方法は、慢性腎臓病、特にはキサンチン尿症の治療または予防薬の開発に利用することができる。
【図1】
【配列表】