特開 2023-62088 ムコ多糖症Ｉ型を治療するための遺伝子治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023062088

(43)【公開日】2023-05-02

(54)【発明の名称】ムコ多糖症Ｉ型を治療するための遺伝子治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20230425BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230425BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20230425BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20230425BHJP

   A61K 38/47 20060101ALI20230425BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230425BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20230425BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20230425BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20230425BHJP

   C12N 9/64 20060101ALN20230425BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61K35/76

A61P3/00

A61P25/28

A61K38/47

A61P43/00 111

C12N15/55

C12N15/864 100Z

C12N7/01

C12N9/64 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023023041

(22)【出願日】2023-02-17

(62)【分割の表示】P 2018540838の分割

【原出願日】2017-02-02

(31)【優先権主張番号】62/452,560

(32)【優先日】2017-01-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/367,798

(32)【優先日】2016-07-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/290,547

(32)【優先日】2016-02-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/337,178

(32)【優先日】2016-05-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/323,271

(32)【優先日】2016-04-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

３．ＬＡＢＲＡＳＯＬ

(71)【出願人】

【識別番号】502409813

【氏名又は名称】ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア

(74)【代理人】

【識別番号】110000741

【氏名又は名称】弁理士法人小田島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ヒンデラー，クリスチャン

(72)【発明者】

【氏名】ウイルソン，ジェームス・エム

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）を治療するのに有用な医薬組成物、ならびにＭＰＳ Ｉであると診断されたヒト対象を治療する方法を提供する。
【解決手段】ｈＩＤＵＡ遺伝子を含有する発現カセットのＡＡＶ９が介在する髄内／嚢内及び／または全身性の送達に有用な懸濁液が提供される。また、ＭＰＳ Ｉ及びハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群及びシャイエ症候群に関連する症状を治療するのに有用なこれらのベクター及び組成物を含有する方法及びキットが提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト対象における髄内投与に好適な医薬組成物であって、
製剤緩衝液中の複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液を含み、
（ａ）前記ｒＡＡＶはヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）をコードする異種核酸を含み、その際、前記核酸はＣＢ７プロモータに操作可能に連結され、ＡＡＶ９カプシドにパッケージされ；
（ｂ）前記製剤緩衝液は生理的に適合性の水性緩衝液と界面活性剤と任意の賦形剤とを含み；
（ｃ）（ｉ）前記ｒＡＡＶのゲノムコピー（ＧＣ）力価は少なくとも１×１０^９ＧＣ／ｍＬ（±２０％）であり；
（ｉｉ）前記ｒＡＡＶの中空粒子／完全粒子の比は少なくとも約８０％が中空カプシドを含まず；
（ｉｉｉ）前記ｒＡＡＶ懸濁液の少なくとも約４×１０^８ＧＣ／ｇ脳質量～約４×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量が効能を有する、前記医薬組成物。

【請求項2】

効能は試験管内のアッセイによって測定される請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記試験管内のアッセイが、既知の感染効率のｒＡＡＶの細胞当たりのＧＣ力価でＨＥＫ２９３またはＨｕｈ７細胞に形質導入することと、４ＭＵ－イズロニド酵素アッセイを用いて形質導入の７２時間後にｈＩＤＵＡ活性について前記上清をアッセイすることとを含む請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記ヒトｈＩＤＵＡのコーディング配列が配列番号１のヌクレオチド配列または機能的なｈＩＤＵＡをコードする配列番号１に対して少なくとも約８０％同一である配列を有する請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記コードされたｈＩＤＵＡが
（ａ）配列番号２（ＧｅｎｂａｎｋＮＰ＿０００１９３）のアミノ酸１付近～６５３付近；及び
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２７付近～６５３付近に融合された異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素
から選択された配列を有する請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記ｒＡＡＶがさらに、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、ニワトリベータアクチンのイントロン、ウサギベータグロビンのポリアデニル化（ポリＡ）シグナル及び／または３’ＩＴＲ配列を含む請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記ＡＡＶのＩＴＲがＡＡＶ９に対して非相同である請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記ＩＴＲがＡＡＶ２に由来する請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記中空粒子／完全粒子の比が０．０１～０．０５の間（９５％～９９％が中空カプシドを含まない）である請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記懸濁液が６～９のｐＨを有する請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記懸濁液が６．８～７．８のｐＨを有する請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記懸濁液が髄内注入を介した送達のために製剤化される請求項１～１１のいずれか１
項に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記懸濁液が新生児患者への送達のために製剤化され、約１．４×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）～約１．４×１０^１４ＧＣを含む請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記懸濁液が約３ヵ月齢～約９ヵ月齢である患者への送達のために製剤化され、約２．４×１０^１１～約２．４×１０^１４ＧＣを含む請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記懸濁液が約９ヵ月齢～約３６ヵ月齢である患者への送達のために製剤化され、約４×１０^１１～約４×１０^１４ＧＣを含む請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記懸濁液が約３歳～約１２歳である患者への送達のために製剤化され、約４．８×１０^１１～約４．８×１０^１４ＧＣを含む請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記懸濁液が約１２歳以上である患者への送達のために製剤化され、約５．６×１０^１１～約５．６×１０^１４ＧＣを含む請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記懸濁液が約１８歳以上である患者への送達のために製剤化され、約１．４×１０^１３～約７．０×１０^１３ＧＣを含む請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項19】

ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、それを必要とするヒト対象に、約４×１０^８ＧＣ／ｇ脳質量～約４×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量で製剤緩衝液における複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の懸濁液を髄内注入によって投与することを含み、
（ａ）前記ｒＡＡＶはヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）をコードする異種核酸を含み、その際、前記核酸はＣＢ７プロモータに操作可能に連結され、ＡＡＶ９カプシドにパッケージされ；
（ｂ）前記製剤緩衝液は生理的に適合性の水性緩衝液と界面活性剤と任意の賦形剤とを含み；
（ｃ）（ｉ）前記ｒＡＡＶのゲノムコピー（ＧＣ）力価は少なくとも１×１０^９ＧＣ／ｍＬ（±２０％）であり；
（ｉｉ）前記ｒＡＡＶの中空粒子／完全粒子の比は０．０１～０．０５の間（９５％～９９％が中空カプシドを含まない）であり；
（ｉｉｉ）前記ｒＡＡＶ懸濁液の少なくとも約４×１０^８ＧＣ／ｇ脳質量～約４×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量が効能を有する、前記方法。

【請求項20】

前記ヒト対象がハーラー症候群であると診断される請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ヒト対象がハーラー・シャイエ症候群症候群であると診断される請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記ヒト対象がシャイエ症候群であると診断される請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

さらに、免疫抑制投薬計画にてｒＡＡＶを同時投与することを含む請求項１９～２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

前記方法が、Ｂａｙｌｅｙの乳児発達スケールを用いて評価したとき、前記対象にて知能指数（ＩＱ）の上昇を生じる請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記方法が、ＷＡＳＩを用いて評価したとき、前記対象にて知能指数（ＩＱ）の上昇を生じる請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記方法が、前記患者に由来する血清試料を測定したとき、機能的なｈＩＤＵＡレベルの上昇を生じる請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記方法が、前記患者の血清、尿及び／または脳脊髄液（ＣＳＦ）の試料で測定したとき、ＧＡＧレベルの低下を生じる請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

さらに、肝臓指向型注入によってｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡを前記患者に投与することを含む請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記肝臓指向型ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡが、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８、ｒｈ１０、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶｄｊから選択されるカプシドを有する請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

効能が試験管内のアッセイによって測定される請求項１９～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記試験管内のアッセイが、既知の感染効率のｒＡＡＶの細胞当たりのＧＣ力価でＨＥＫ２９３またはＨｕｈ７細胞に形質導入することと、４ＭＵ－イズロニド酵素アッセイを用いて形質導入の７２時間後にｈＩＤＵＡ活性について前記上清をアッセイすることとを含む請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記ヒトｈＩＤＵＡのコーディング配列が配列番号１のヌクレオチド配列または機能的なｈＩＤＵＡをコードする配列番号１に対して少なくとも約８０％同一である配列を有する請求項１９～３０のいずれか１項に記載の方法

【請求項33】

前記コードされたｈＩＤＵＡが
（ａ）配列番号２（ＧｅｎｂａｎｋＮＰ＿０００１９３）のアミノ酸１付近～６５３付近；及び
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２７付近～６５３付近に融合された異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素
から選択された配列を有する請求項１９～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記ｒＡＡＶがさらに、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、ニワトリベータアクチンのイントロン、ウサギベータグロビンのポリアデニル化（ポリＡ）シグナル及び／または３’ＩＴＲ配列を含む請求項１９～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記ＡＡＶのＩＴＲがＡＡＶ９に対して非相同である請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記前記ＩＴＲがＡＡＶ２に由来する請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記懸濁液が６～８のｐＨを有する請求項１９～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記懸濁液が６．８～７．８のｐＨを有する請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記懸濁液が髄内注入を介した送達のために製剤化される請求項１９～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記懸濁液が新生児患者への送達のために製剤化され、約１．４×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）～約１．４×１０^１４ＧＣを含む請求項１９～３８のいずれか１項に記載の

【請求項41】

前記懸濁液が約３ヵ月齢～約９ヵ月齢である患者への送達のために製剤化され、約２．４×１０^１１～約２．４×１０^１４ＧＣを含む請求項１９～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記懸濁液が約９ヵ月齢～約３６ヵ月齢である患者への送達のために製剤化され、約４×１０^１１～約４×１０^１４ＧＣを含む請求項１９～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記懸濁液が約３歳～約１２歳である患者への送達のために製剤化され、約４．８×１０^１１～約４．８×１０^１４ＧＣを含む請求項１９～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記懸濁液が約１２歳以上である患者への送達のために製剤化され、約５．６×１０^１１～約５．６×１０^１４ＧＣを含む請求項１９～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記懸濁液が約１８歳以上である患者への送達のために製剤化され、約１．４×１０^１３～約７．０×１０^１３ＧＣを含む請求項１９～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

ＭＰＳ Ｉ及び／またはハンター症候群に関連する症状を有するヒト患者を治療する方法であって、
（ａ）ＭＰＳ Ｉ及び／またはハンター症候群に関連する前記症状を有する患者に十分量のｈＩＤＵＡ酵素を投与して導入遺伝子に特異的な寛容を誘導することと、
（ｂ）前記患者にｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡを投与することとを含み、ｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡは前記患者にて治療レベルのｈＩＤＵＡの発現を指向する、前記方法。

【請求項47】

（ａ）の前記ｈＩＤＵＡが組換えタンパク質として投与される請求項４６に記載の方法

【請求項48】

前記患者が乳児である請求項４６または４７に記載の方法。

【請求項49】

前記投与すること（ｂ）が投与（ａ）の約３日～約１４日後に実施される請求項４６～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

請求項１～１８のいずれか１項に記載の懸濁液の成分と、髄内投与に必要とされる成分とを含むキット。

【請求項51】

前記懸濁液を希釈するのに有用な希釈緩衝液をさらに含む請求項５０に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

連邦政府の資金による研究の申告
本出願には、米国政府からの助成金、国立衛生研究所（ＮＩＨ）番号Ｒ０１ＤＫ５４４８１、Ｐ４０ＯＤ０１０９３９及びＰ３０ＥＳ０１３５０８によってある程度支援された研究が含まれている。米国政府は本発明に特定の権利を有してもよい。

【0002】

技術分野
本発明は、ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群及び／またはシャイエ症候群であると診断された患者を含むムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）を治療するための遺伝子治療のアプローチに関する。

【背景技術】

【0003】

ムコ多糖症は、ムコ多糖とも呼ばれるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に関与する特定のリソソーム酵素の欠乏が原因で起きる遺伝性疾病の一群である。部分的に分解されたＧＡＧの蓄積は細胞、組織及び臓器の機能の妨害を引き起こす。時間をかけてＧＡＧは細胞内、血中、及び結合組織に蓄積し、結果的に細胞及び臓器の損傷を増やしていく。

【0004】

ムコ多糖症（ＭＰＳ）の最も重篤なものの１つであるＭＰＳ Ｉはα－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）の欠乏が原因で生じる。具体的には、α－Ｌ－イズロニダーゼはヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸と呼ばれる２つのＧＡＧから末端のイズロン酸残基を取り除くと報告されている。α－Ｌ－イズロニダーゼは、様々な型の分子を消化し、再生利用する細胞内の区画であるリソソームにて見つけられる。ＩＤＵＡ遺伝子は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と呼ばれる大型の糖分子の分解に必須であるα－Ｌ－イズロニダーゼを産生するための指示を提供すると報告されている。ＩＤＵＡ遺伝子における１００を超える突然変異が見いだされ、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）を引き起こしている。１つのＤＮＡ構成要素（ヌクレオチド）を変化させる突然変異、単一ヌクレオチド多形または「ＳＮＰ」が最も一般的である。

【0005】

ＭＰＳ Ｉを引き起こす突然変異はα－Ｌ－イズロニダーゼの機能を低下させ、または完全に取り除き、３種の臨床的症候群：ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群及びシャイエ症候群につながる。それぞれは常染色体劣性型で遺伝し、酵素欠乏の程度が臨床的表現型の重症度に直接関係する。ハーラー症候群がＩＤＵＡ欠乏の最も重篤な発現を表し、普通、２つのヌル変異のために酵素活性の完全欠損の状況で発生する。臨床診断は２歳前に確定し、複数の身体的病状に関連する。加えて、自然史データは、ハーラー症候群遺伝子型の患者はＣＮＳ病変を有し、重度の認知障害及び精神遅滞につながることを確証している。ハーラー・シャイエ症候群は、普通２歳～８歳の間で診断されるさらに減衰した形態である。ハーラー症候群とは対照的に、ハーラー・シャイエ症候群の患者は、臨床発現の遅い発症と疾患のさらに減衰した進行につながる（理論的に）少量の残留ＩＤＵＡ活性を有する。さらに減衰した表現型にもかかわらず、一部のハーラー・シャイエ患者はＩＱの低下によって証拠付けられるような神経認知の低下を含む、ＩＤＵＡの欠乏に関連するＣＮＳ病変の複数の症状を経験する。シャイエ症候群はＭＰＳ Ｉの最も穏やかな形態である。症状は一般に５歳以降現れ始め、診断は最も一般的には１０歳以降に下される。シャイエ症候群の小児は正常な知性を有し、または軽い学習障害を有してもよく；一部は精神医学上の問題を有してもよい。緑内障、網膜変性及び角膜混濁は視力を有意に損傷し得る。他の問題には、手根管症候群または他の神経圧迫、関節のこわばり、鷲手及び変形した足、短頸、及び大動脈弁疾患が挙げられる。一部の冒された個人は閉塞性気道疾患及び睡眠時無呼吸も有する。シャイエ症候群の人は成人期まで生きることができる。

【0006】

臨床症候群に関しては、ハーラー症候群のケアの現在の標準は、たとえば、骨髄移植（ＢＭＴ）または臍帯血移植（ＵＣＢＴ）のような造血系幹細胞の移植（ＨＳＣＴ）である。処置は出来るだけ早期に、２歳になる前に行われ、疾患の身体上及びＣＮＳ双方の態様に影響を与える。しかしながら、ＭＰＳ ＩにためのＨＳＣＴは有意な量の病的状態及び２０％の死亡率に関連したままである。移植が選択肢でなければ、そのときは、患者の命を救うための酵素の毎週の点滴を要する酵素補充療法（ＥＲＴ）が開始されてもよい。ＥＲＴはＣＮＳ疾患の進行に影響を及ぼさないが、身体的発現を部分的に改善する。骨格系、眼及び心臓における疾患の態様は部分的に改善されるにすぎないが、臓器肥大症は有意に改善される。患者は、臀部及び膝を安定化し、手根管症候群及び指収縮を治療するために手術を必要としてもよい。最終的に手術が必要であってもよいが、心臓疾患は内科的に治療される。

【0007】

ＭＰＳ ＩのためのＥＲＴは、リソソームへの取り込み及びＧＡＧの異化の上昇のために外来性の酵素を提供する。リソソームの酵素は内部で機能するが、細胞表面のマンノース－６－リン酸受容体はこれらの酵素を結合し、内部移行させ、リソソームに送達することができる。組換えＩＤＵＡ（アルデュラザイム（登録商標），ＢｉｏＭａｒｉｎ）は、ＭＰＳ Ｉのハーラー及びハーラー・シャイエの形態の患者のために、ならびに中程度から重度の症状を有し、肺機能及び歩行能力を改善することが示されたシャイエ形態の患者のためにＦＤＡによって認可されている。ＥＲＴは、ＭＰＳ Ｉの患者にて肝腫脹を軽減すると共に尿中ＧＡＧのレベルを低減することも観察されている。しかしながら、静脈内酵素は容易には脳を横断しないので、ＥＲＴは一部のＭＰＳ Ｉ患者が経験する神経症状には現在対処していない。

【0008】

ＥＲＴの複雑さは、軽度から本格的なアナフィラキシーに至り得る組換え酵素に対する免疫応答と共に局所及び全身性の炎症のような生涯にわたる末梢投与の複雑さを中心に展開する。それがどれくらい有効性に影響を及ぼすのかは明らかではないが、アルデュラザジムの投与を受けている患者の９１％までが酵素に対する抗体を作り出す。さらに、ＥＲＴは病院において３～８時間かけて投与される毎週のｉ．ｖ．点滴を必要とし、それは患者の生活の質に十分に影響を及ぼし、高価であり、医療診療報酬制度における主要な重圧である。

【0009】

これらの限界の観点から、ＭＰＳ Ｉに関連する病的状態をさらに効果的に是正することができる治療は満たされない医学上のニーズのままである。

【発明の概要】

【0010】

ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）であると診断された患者（ヒト対象）のＣＮＳにヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）遺伝子を送達するための複製欠損のアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）が本明細書で提供される。ｈＩＤＵＡ遺伝子を送達するのに使用される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター（ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ）はＣＮＳに対して指向性を有するはずであり（たとえば、ＡＡＶ９カプシドを運ぶｒＡＡＶ）、ｈＩＤＵＡ導入遺伝子は特異的な発現制御要素、たとえば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンハンサとニワトリβアクチンのプロモータ（ＣＢ７）とのハイブリッドによって制御されるはずである。髄内及び嚢内の投与に好適な医薬組成物は、生理的に適合性の水性緩衝液と界面活性剤と任意の賦形剤とを含む製剤緩衝液にてｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡベクターの懸濁液を含む。ｒＡＡＶ懸濁液はさらに、
（ｉ）ｒＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）の力価が少なくとも１×１０^９ＧＣ／ｍＬ～１×１０^１４ＧＣ／ｍＬ（＋／－２０％）であること；
（ｉｉ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析（実施例５Ｄを参照のこと）によって測定されるｒＡＡＶの中空粒子／完全粒子の比が０．０１～０．０５（９５％～９９％中空カプシドがない）
の間である、または他の実施形態では、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％中空カプシドがないこと；及び／または
（ｉｉｉ）少なくとも約４×１０^８ＧＣ／脳質量ｇ～約４×１０^１１ＧＣ／脳質量ｇのｒＡＡＶ懸濁液の用量が効能を有することを特徴とする。効能は、試験管内での細胞培養アッセイ、たとえば、細胞当たり既知の感染効率のｒＡＡＶ ＧＣでＨｕｈ７またはＨＥＫ２９３の細胞に形質導入し、形質導入の７２時間後にＩＤＵＡ活性について上清をアッセイする、実施例６Ｇに記載されている試験管内の効能アッセイによって測定することができる。

【0011】

そのようなｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡベクターの調製物を髄内／嚢内の注入によってヒト対象に投与し、ＣＮＳにて治療レベルのｈＩＤＵＡ発現を達成することができる。治療の候補者である患者は、ＭＰＳ Ｉの及び／またはハーラー、ハーラー・シャイエ及びシャイエに関連する症状を持つ小児患者及び成人患者である。

【0012】

ＭＰＳ Ｉ患者についてのｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡの治療上有効な髄内／嚢内の用量は３．８×１０^１２から７．０×１０^１４ＧＣ（平坦用量）まで―１０^１０～５×１０^１１ＧＣ／患者の脳質量ｇの同等量に及ぶ。或いは、以下の治療上有効な平坦用量を指示した年齢群の患者に投与することができる。
・新生児：約３．８×１０^１２～約１．９×１０^１４ＧＣ；
・３～９ヵ月：約６×１０^１２～約３×１０^１４ＧＣ；
・９～３６カ月：約１０^１３～約５×１０^１４ＧＣ；
・３～１２歳：約１．２×１０^１３～約６×１０^１４ＧＣ；
・１２歳以上：約１．４×１０^１３～約７．０×１０^１４ＧＣ；
・１８歳以上（成人）：約１．４×１０^１３～約７．０×１０^１４ＧＣ。

【0013】

一部の実施形態では、１２歳以上のＭＰＳ Ｉ患者（１８歳以上を含む）に投与される用量は１．４×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）（１．１×１０^１０ＧＣ／脳質量ｇ）である。一部の実施形態では、１２歳以上のＭＰＳ Ｉ患者（１８歳以上を含む）に投与される用量は７×１０^１３ＧＣ（５．６×１０^１０ＧＣ／脳質量ｇ）である。その上、さらなる実施形態では、ＭＰＳ Ｉ患者に投与される用量は少なくとも約４×１０^８ＧＣ／脳質量ｇ～約４×１０^１１ＧＣ／脳質量ｇである。特定の実施形態では、ＭＰＳ Ｉの新生児に投与される用量は、約１．４×１０^１１から約１．４×１０^１４ＧＣまでに及び；３～９ヵ月の乳児に投与される用量は、約２．４×１０^１１から約２．４×１０^１４ＧＣまでに及び；９～３６カ月のＭＰＳ Ｉの幼児に投与される用量は、約４×１０^１１から約４×１０^１４ＧＣまでに及び；３～１２歳のＭＰＳ Ｉの小児に投与される用量は、約４．８×１０^１１から約４．８×１０^１４ＧＣまでに及び；１２歳以上の小児及び成人に投与される用量は、約５．６×１０^１１から約５．６×１０^１４ＧＣまでに及ぶ。

【0014】

治療の目標は、ｒＡＡＶに基づいたＣＮＳを指向する遺伝子治療を介して患者の欠損したα－Ｌ－イズロニダーゼを機能的に置き換えて疾患を治療することである。治療法の有効性は、（ａ）ＭＰＳ Ｉ患者における神経認知低下の防止、及び（ｂ）疾患の生体マーカー、たとえば、ＣＳＦ、血清及び／または尿におけるＧＡＧレベル及び／またはＩＤＵＡまたはヘキソサミニダーゼの酵素活性、及び／または肝臓及び脾臓の容量を評価することによって測定することができる。神経認知は、知能指数（ＩＱ）を測定することによって、たとえば、ハーラーの対象についてＢａｙｌｅｙの乳児発達スケールによって測定されるように、またはハーラー・シャイエの対象についてＷｅｃｈｓｌｅｒ短縮版知能検査（ＷＡＳＩ）によって測定されるように判定することができる。神経認知の発達及び機能の他の適当な測定、たとえば、Ｂａｙｌｅｙの乳児発達スケール（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）を用いて発達指数（ＤＱ）を評価すること、Ｈｏｐｋｉｎｓ言語学習試験を用いて記憶を評価すること、及びまたは注意変数試験（ＴＯＶＡ）を使用することが利用されてもよい。

【0015】

治療に先立って、ｈＩＤＵＡ遺伝子を送達するのに使用されるｒＡＡＶベクターのカプシドに対する中和抗体（Ｎａｂ）についてＭＰＳ Ｉ患者を評価することができる。そのようなＮａｂは形質導入効率を妨げ、治療の有効性を低下させる。≦１：５のベースライン血清Ｎａｂ力価を有するＭＰＳ Ｉ患者はｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡ遺伝子治療プロトコー
ルによる治療の良好な候補者である。＞１：５の血清Ｎａｂの力価を持つＭＰＳ Ｉ患者の治療は、ｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡベクター送達による治療の前に及び／または治療中に併
用療法、たとえば、免疫抑制剤による一時的な同時治療を必要としてもよい。任意で、ＡＡＶベクターのカプシド及び／または製剤の他の成分に対する中和抗体を前もって評価することなく、予防措置として免疫抑制剤の同時療法を使用してもよい。特定の実施形態では、特にＩＤＵＡ活性のレベルを実際有さない、導入遺伝子の産物が「異物」として見られ得る患者では、ｈＩＤＵＡ導入遺伝子の産物に対する有害な免疫反応を防ぐために前もっての免疫抑制療法が望ましくてもよい。以下の実施例に記載されているマウス、イヌ及びＮＨＰにおける非臨床試験の結果は、ｈＩＤＵＡに対する免疫応答及び神経炎症の発生に一致している。類似の反応はヒト対象では起きないかもしれないが、予防措置として免疫抑制療法はｒＡＡＶ-ｈＩＤＵＡのレシピエントすべてに推奨される。

【0016】

ｈＩＤＵＡの全身性送達が伴うＣＮＳへのｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡの遺伝子治療送達の併
用は本発明の方法によって包含される。全身性の送達は、ＥＲＴ（たとえば、アルデュラザジム（登録商標）を使用すること）を用いて、または肝臓に指向性を持つｒＡＡＶ.ｈ
ＩＤＵＡ（たとえば、ＡＡＶ８カプシドを運ぶｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡ）を用いた追加の遺
伝子治療によって達成することができる。

【0017】

特定の実施形態では、患者がＣＮＳにて治療濃度のｈＩＤＵＡを発現する乳児、小児及び／または成人である場合、ｈＩＤＵＡに対して患者を寛容化するために肝臓指向性の注入を介して患者にＡＡＶ.ｈＩＤＵＡを投与し、続いて、髄内／嚢内の注入を介して患者
にＡＡＶ.ｈＩＤＵＡを投与する。

【0018】

動物試験におけるｒＡＡＶ９.ＩＤＵＡのＩＴ投与がＣＮＳ内でのベクターの広範な分
布を生じたことを立証している本発明の利益は以下の実施例によって説明されている。さらに、ｆＩＤＵＡ、ｃＩＤＵＡまたはｈＩＤＵＡを送達する単回用量のｒＡＡＶ９ベクターはネコ及びイヌ双方の動物モデルにてＣＮＳに関連するＭＰＳ Ｉの組織学的な及び生化学的な所見を用量依存性に改善するまたは完全に元に戻すことに成功した。同様に、単回ＩＴ投薬のｒＡＡＶ９．ＩＤＵＡは注入後少なくとも２年間、乳児として注入された場合を含んでサルにて臨床的に上手く忍容された。動物におけるｒＡＡＶ９．ＩＤＵＡ投与に関連する単なる有害効果は調べた種すべてにわたって導入遺伝子への免疫応答に関連した。

【0019】

実施例で示すように、ｒＡＡＶ９．ＩＤＵＡ治療の有益な効果は抗ＩＤＵＡ抗体反応の発生によって限定された。寛容化されていないＭＰＳ Ｉイヌ（実施例３）またはアカゲザル（実施例７）で評価された最高用量では、有害効果が観察された。発症の変化及び時間の特徴はこれらの効果には導入遺伝子産物に対する免疫応答が介在することを示している。実施例３では、最高用量でのイヌは双方とも後肢虚弱を伴ってＣＳＦの高いＷＢＣ及びタンパク質レベルを有した。これらの動物は、運動及び感覚ニューロンに発現された導入遺伝子に対する免疫応答に起因する脊髄及び後根神経節における組織病理の病変を有した。アカゲザルにおける毒性研究（実施例７）では、ｈＩＤＵＡに対する液性の免疫応答及び細胞介在性の免疫応答の双方が観察され、ＣＳＦにおける有核細胞数の上昇と抗ＩＤＵＡ抗体、及び末梢血における弱い抗ＩＤＵＡのＴ細胞応答を特徴とした。イヌとは異なって、有害な臨床兆候は発生せず、脊髄内でのニューロンの壊死は観察されず、サルは治療を忍容すると思われた。しかしながら、白質後索における両側性の軸索変性から成るＣ
ＮＳの病変は９０日目及び１８０日目での脊髄にて観察された。これらの軸索の変化は後根神経節におけるニューロンに対する免疫が介在する効果に続発すると見なされる。

【0020】

非臨床種で観察されるヒトのタンパク質に対する後天性の免疫応答は、ヒトにおける同じ応答の性質または大きさを予測しなくてもよい。にもかかわらず、好まれる実施形態では、ヒト対象、特にｈＩＤＵＡを発現していないのでこの酵素に対して寛容であると期待されない個人は免疫抑制剤で予防的に治療されるべきである。以下の実施例におけるデータは、ｒＡＡＶ９.ＩＤＵＡ構築物の投与に先立ってｃＩＤＵＡまたはｈＩＤＵＡに対し
て寛容化された新生仔のイヌ及び非ヒト霊長類では、持続した形質導入及びＩＤＵＡの発現が達成されたことを示している。対照的に、ＩＤＵＡに対して予め寛容化されていない動物は一般にＩＤＵＡ及びＡＡＶ９カプシド抗原の双方に対する免疫応答を開始した。要するに、実施例におけるデータは免疫抑制治療はｒＡＡＶ９.ＩＤＵＡの有効性も高め得
ることを示している。

【0021】

本発明のさらなる他の態様及び利点は本発明の詳細な説明から明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】本明細書に記載されているようにＡＡＶにパッケージされているベクターゲノムの模式図である。ベクターゲノムでは、ベクターゲノムのＡＡＶの５’及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接する発現カセットの主要構成成分が描かれている。これらには、サイトメガロウイルスの前初期エンハンサ、ＣＢ７プロモータ、キメライントロン、ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼのコーディング配列（遺伝子）及びウサギβグロビンポリＡシグナルが含まれる。

【図2】ヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９による髄内注入で処理したネイティブのＭＰＳ Ｉイヌ（図２Ａ）または寛容化したＭＰＳ Ｉイヌ（図２Ｂ）におけるＣＳＦのＩＤＵＡ活性を示す図である。大槽へのベクターの髄内注入によって１ヵ月齢でイヌを処理した。その後のＣＳＦ試料にてＩＤＵＡ活性を測定した。ベクターの用量（ＧＣ／ｋｇ）を各動物について示す。破線は髄内ベクターのみで処理した動物を表す。黒い記号の実線は肝臓特異的プロモータからヒトＩＤＵＡを発現する静脈内ＡＡＶ８によって生後５日目に予備処理した動物を表す。白い記号の実線は組換えヒトＩＤＵＡの静脈内点滴で生後７日と１４日に予備処理した動物を表す。動物Ｉ－６６５及びＩ－６６６は神経兆候のために３６日目に安楽死させた。横の破線は正常なイヌにおけるＣＳＦでの平均のＩＤＵＡ活性を表す。点線は定量のアッセイ限界を示す。

【図3】ヒトＩＤＵＡに対するＣＳＦでの抗体力価を示す図である。ヒトＩＤＵＡに対する抗体力価はベクター投与の５０日後に採取したＣＳＦ試料におけるＥＬＩＳＡによって測定した。Ｉ－６６５及びＩ－６６６から調べたＣＳＦ試料は剖検（注入の３６日後）の時点で回収した。誤差棒＝ＳＥＭ。抗体力価は、ＩＴベクターのみで処理した対照（Ｉ－６０４、Ｉ－６０８、Ｉ－６０５、Ｉ－６６５、Ｉ－６６６）に比べてＡＡＶ８ベクター（Ｉ－６５２、Ｉ－６５３、Ｉ－６０２、Ｉ－６０７、Ｉ－６０１、Ｉ－６０６）または組換えヒトＩＤＵＡ（Ｉ－６６３、Ｉ－６６４）で新生仔として予備処理した動物にて有意に低かった（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。

【図4】ＡＡＶ９の髄内注入に続くＣＳＦの有核細胞数を示す図である。髄内ＡＡＶ９で処理した投薬を受けてことがないイヌ（図４Ａ）と同様に髄内ＡＡＶ９を受け取る前に全身性組換えヒトＩＤＵＡ（Ｉ－６６３及びＩ－６６４）またはＩＤＵＡを発現するＡＡＶ８ベクターで新生仔として処理した動物（図４Ｂ）に由来するＣＳＦ試料にて有核細胞の総数を測定した。ＡＡＶ８ベクターまたは組換えヒトＩＤＵＡで新生仔として処理したものに比べて投薬を受けたことがない動物にてベクター注入の２１日後、有核細胞数は有意に増えていた（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。

【図5】髄内ＡＡＶ９で処理したヒトＩＤＵＡに寛容であるＭＰＳ Ｉイヌにおける脳のヘキソサミニダーゼ活性の正常化を示す図である。脳の６つの領域（前頭葉皮質、側頭葉皮質、後頭葉皮質、海馬、髄質及び小脳）から採取した試料にてＨｅｘ活性を測定した。正常対照イヌ、未処理のＭＰＳ Ｉイヌ及びヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９の髄内注入で処理したｈＩＤＵＡに寛容である８匹のイヌについて平均活性を示す。白い記号は組換えヒトＩＤＵＡの点滴によって寛容化された動物を示す。Ｈｅｘ活性は、未処理の対照に比べて高用量のコホートでは有意に低下した（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、とその後のＤｕｎｎの多重比較検定）。

【図6】ヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９の髄内注入によって処理したヒトＩＤＵＡに寛容であるイヌにおける脳蓄積病変の用量依存性の是正を示す図である。ＬＩＭＰ２及びＧＭ３について脳の切片を作り、染色した。髄膜のＧＡＧの蓄積はＡｌｃｉａｎブルー染色を用いて画像化した。ＧＭ３（図６Ａ）及びＬＩＭＰ２（図６Ｂ）の陽性細胞の自動定量は皮質脳の画像にて行った（動物当たりｎ＝１０）。白い記号は組換えヒトＩＤＵＡの点滴によって寛容化された動物を示す。ＧＭ３及びＬＩＭＰ２は未処理の対照に比べて高用量のコホートにて有意に低下した（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、とその後のＤｕｎｎの多重比較検定）。

【図7】ヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９の髄内注入によって処理した、投薬を受けたことがないイヌにおける脳ヘキソサミニダーゼ活性の部分正常化を示す図である。ヘキソサミニダーゼ活性は６つの脳領域（前頭葉皮質、側頭葉皮質、後頭葉皮質、海馬、髄質及び小脳）から採取した試料にて測定した。平均活性は、正常な対照イヌ、未処理のＭＰＳ Ｉイヌ、及び１０^１２ＧＣ／ｋｇまたは１０^１１ＧＣ／ｋｇの用量で１ヵ月齢にてヒトＩＤＵＡを発現する髄内ＡＡＶ９によって処理したイヌについて示す。

【図8】ｈＩＤＵＡに寛容であるイヌにおけるＩＴ ＡＡＶ９処理後のＣＳＦのヘキソサミニダーゼ活性の正常化を示す図である。Ｈｅｘ活性は試験の終了時ヒトＩＤＵＡに寛容化されたＭＰＳ ＩイヌのＣＳＦにて測定した。白い記号は組換えヒトＩＤＵＡの点滴によって寛容化された動物を示す。ＣＳＦのＨｅｘ活性は未処理のＭＰＳ Ｉ対照に比べて処理した動物すべてで有意に低下した（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。

【図9】ヒトＩＤＵＡを発現する髄内ＡＡＶ９で処理したｈＩＤＵＡに寛容であるイヌにおける頸部髄膜肥厚の解消を示す図である。髄膜の平均総厚さは頸部脊髄のＨ＆Ｅ染色切片にて測定した。白い記号は組換えヒトＩＤＵＡの点滴によって寛容化された動物を示す。髄膜の厚さは未処理のＭＰＳ Ｉ対照に比べて処理した動物すべてで有意に低下した（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。

【図10】ＩＴでのＡＡＶ９によって処理したＭＰＳ Ｉマウスにおける酵素発現の比較及び脳蓄積病変の是正を示す図である。ＭＰＳ Ｉマウスを２～３ヵ月齢で３つの用量：３×１０^８ＧＣ（低）、３×１０^９ＧＣ（中）、または３×１０^１０ＧＣ（高）の１つでのＡＡＶ９.ＣＢ.ｈＩＤＵＡのＩＣＶ注入によって処理した。（図１０Ａ）ベクター注入の３週間後に屠殺した動物のコホートの１つであり、ＩＤＵＡ活性の測定のために脳を回収した。（図１０Ｂ）注入の３週間後に屠殺した動物の第２のコホートであり、リソソーム膜タンパク質ＬＩＭＰ２について脳を染色した。ＬＩＭＰ２について陽性に染まった細胞は盲検化したレビュアーによって４つの皮質脳切片にて定量された。^＊ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡとその後のＤｕｎｎｅｔｔ検定。

【図11】製造過程のフローチャートである。

【図12】１０ｃｃのベクター注射器（１２）と、１０ｃｃの事前に充填した水洗注射器（１４）と、Ｔ型コネクタ延長セット（配管（２０）と、配管の末端でのクリップ（２２）とコネクタ（２４）とを含む）、２２Ｇ×５”のクモ膜下穿刺針（２６）と、任意の１８Ｇ×３．５”の導入針（２８）とを含む、同軸挿入法のための任意の導入針を含む医薬組成物の嚢内送達のための装置（１０）を示す図である。説明しているのはまた旋回オスルアーロック付きの四方活栓（１６）である。

【図13】嚢内注入の模式的説明を示す図である。

【図14】ＩＣＶでのＡＡＶ９によって処理したイヌにおける脳炎及び導入遺伝子特異的なＴ細胞応答を説明する図である。１歳のＭＰＳ Ｉイヌを、ＧＦＰを発現するＡＡＶ９のＩＣＶ注入またはＩＣ注入によって処理した。注入の１２日後に死んでいるのが発見されたＩ－５６７を除いて動物はすべて注入の１４日後に屠殺した。脳を冠状断面に分割し、それはＩＣＶ処理した動物にて注入部位の近傍で（矢頭）肉眼的病変を示した。肉眼的病変を取り囲む脳領域の組織切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。剖検の時点でＩＣＶ処理したイヌ１匹（Ｉ－５６５）から末梢血単核細胞を採取し、ＡＡＶ９カプシド及びＧＦＰタンパク質に対するＴ細胞応答をインターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴによって測定した（図１４）。完全なＧＦＰ配列を網羅する重なり合う１５アミノ酸の長さのペプチドの単一プールを用いてＧＦＰ導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答を測定した。ＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むペプチドは３つのプール（プールＡ～Ｃと名付けた）に分割した。^＊＝バックグランド（未刺激細胞）の＞３倍及び１００万個の細胞当たり５５を超えるスポットとして定義される陽性反応。植物血球凝集素（ＰＨＡ）及びホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）を伴ったイオノマイシンはＴ細胞活性化の陽性対照として役立った。

【図15】ＩＣＶまたはＩＣでのＡＡＶ９によって処理したイヌにおけるベクターの生体分布を示す棒グラフである。注入の１２日後に剖検した動物Ｉ－５６７を除いて、ＧＦＰを発現するＡＡＶ９ベクターの単回ＩＣＶまたはＩＣ注入による注入の１４日後にイヌを屠殺した。定量的ＰＣＲによって組織試料にてベクターゲノムを検出した。値は２倍体細胞当たりのベクターゲノムのコピー（ＧＣ／２倍体ゲノム）として表す。海馬または大脳皮質から採取した脳試料はＩＣＶ処理したイヌについては注入したまたは注入しない半球として示され、ＩＣ処理した動物については、これらはそれぞれ右半球と左半球である。動物Ｉ－５６７の注入した脳半球からはＰＣＲのために試料を採取しなかった。

【図16】髄内ＡＡＶ９で処理したＮＨＰにおけるベクターの生体分布を示す棒グラフである。５ｍＬのイオヘキソール１８０で希釈したＡＡＶ９の腰椎穿刺を介した髄内注入の１４日後、ＮＨＰを屠殺した。動物のうち２匹を注入後１０分間トレンデレンブルグ体位に置いた。定量的ＰＣＲによって組織試料にてベクターゲノムを検出した。値は２倍体細胞当たりのベクターゲノムのコピー（ＧＣ／２倍体ゲノム）として表す。

【図17】ＭＰＳ Ｉにて上昇したＣＳＦのスペルミンを示す図である。ＭＰＳ Ｉイヌ（ｎ＝１５）及び正常対照（ｎ＝１５）に由来するＣＳＦ試料にて高処理能力のＬＣ／ＭＳ及びＧＣ／ＭＳの代謝産物評価を行った。（１７Ａ）上位１００の差次的に検出された代謝産物のヒートマップを示す（ＡＮＯＶＡ）。ＭＰＳ Ｉのコホートにて最若年の動物（２８日齢）を星印で示す。（１７Ｂ）６匹のＭＰＳ Ｉ幼若動物及び２匹の正常幼若動物に由来するＣＳＦ試料にて定量的アイソトープ希釈ＬＣ／ＭＳアッセイによって測定されたスペルミン濃度を示すグラフである。

【図18】ＭＰＳ Ｉのニューロンにおけるスペルミン依存性の異常な神経突起成長を示す図である。Ｅ１８の野生型またはＭＰＳ Ｉのマウス胚から回収した皮質ニューロンをプレートに入れた２４時間後、スペルミン（５０ｎｇ／ｍＬ）またはスペルミンシンターゼ阻害剤ＡＰＣＨＡで処理した。処理条件当たり２つ組の培養に由来する４５～６５の無作為に選択したニューロンについて神経突起の数、長さ及び枝分かれが盲検的にレビュアーによって定量された。（図１８Ａ）野生型と比較したＭＰＳＩ、ＭＰＳＩ＋ＡＰＣＨＡまたはＭＰＳＩ＋ＡＰＣＨＡ＋スペルミンについて神経突起を提供する棒グラフである。（図１８Ｂ）野生型と比較したＭＰＳＩ、ＭＰＳＩ＋ＡＰＣＨＡまたはＭＰＳＩ＋ＡＰＣＨＡ＋スペルミンについて分岐点を提供する棒グラフである。（図１８Ｃ）野生型と比較したＭＰＳＩ、ＭＰＳＩ＋ＡＰＣＨＡまたはＭＰＳＩ＋ＡＰＣＨＡ＋スペルミンについて分枝の長さを提供する棒グラフである。^＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡとその後のＤｕｎｎｅｔｔの検定）。（図１８Ｄ）野生型と比較したスペルミンで処理した野生型について神経突起／細胞を比較する棒グラフである。（図１８Ｅ）野生型と比較したスペルミンで処理した野生型について分岐点／細胞を比較する棒グラフである。（図１８Ｆ）野生型と比較したスペルミンで処理した野生型について分枝の長さ／細胞を比較する棒グラフである。

【図19】遺伝子治療に続くＭＰＳ ＩイヌにおけるＣＳＦスペルミンのレベル及び脳のＧＡＰ４３発現の正常化を示す図である。５匹のＭＰＳ Ｉイヌを、イヌＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９の１ヵ月齢での髄内注入によって処理した。イヌのうち２匹（Ｉ－５４９、Ｉ－５５２）は、一部のＭＰＳ ＩイヌにてＩＤＵＡに対して惹起される抗体反応を防ぐために出生の１日後に肝臓指向遺伝子治療によってＩＤＵＡに対して寛容化した。（図１９Ａ）髄内ベクター注入の６ヵ月後脳組織にて測定されたＩＤＵＡ活性の結果を示す棒グラフである。（図１９Ｂ及び１９Ｃ）デンシトメトリーによってβ－アクチンに対して定量された皮質脳試料におけるＧＡＰ４３の測定に続く結果を示すグラフである。ＣＳＦのスペルミンはアイソトープ希釈ＬＣ／ＭＳ（Ｅ）によって屠殺の時点で測定した。未処理のＭＰＳ Ｉイヌ（ｎ＝３）及び正常のイヌ（ｎ＝２）は対照として役立った。^＊ｐ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定とその後のＤｕｎｎの検定）。

【図20】ＭＰＳ ＩにおけるＣＮＳ指向の遺伝子治療の評価のためのＣＳＦの生体マーカーとしてのスペルミンの使用を説明するグラフである。出生時にヒトＩＤＵＡに対して寛容化された６匹のＭＰＳ Ｉイヌを１ヵ月齢にてヒトＩＤＵＡを発現する髄内ＡＡＶ９によって処理した（１０^１２ＧＣ／ｋｇ、ｎ＝２，１０^１１ＧＣ／ｋｇ，ｎ＝２，１０^１０ＧＣ／ｋｇ，ｎ＝２）。（図２０Ａ）処理の６ヵ月後に測定したＣＳＦのスペルミンのレベルの測定に続く結果を提供する。３匹のＭＰＳ Ｉのネコを、ネコＩＤＵＡ（１０^１２ＧＣ／ｋｇ）を発現する髄内ＡＡＶ９によって処理した。（図２０Ｂ）処理の６ヵ月後ＣＳＦスペルミンの定量に続く結果を提供する。未処理のＭＰＳ Ｉイヌ（ｎ＝３）及び正常のイヌ（ｎ＝２）は対照として役立った。

【図21】ランダムフォレスト解析によって特定された代謝産物についての予測精度の低下を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）であると診断された患者（ヒト対象）のＣＮＳにヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）遺伝子を送達するための複製欠損のアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）が本明細書で提供される。ｈＩＤＵＡ遺伝子を送達するのに使用される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター（ｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ）はＣＮＳに対して指向性を有し（たとえば、ＡＡＶ９カプシドを運ぶｒＡＡＶ）、ｈＩＤＵＡ導入遺伝子は特異的な発現制御要素、たとえば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンハンサとニワトリβアクチンのプロモータ（ＣＢ７）とのハイブリッドによって制御される。特定の実施形態では、髄内、嚢内、及び全身性の投与に好適な医薬組成物が提供され、それは、生理的に適合性の水性緩衝液と界面活性剤と任意の賦形剤とを含む製剤緩衝液にてｒＡＡＶ．ｈＩＤＵＡベクターの懸濁液を含む。ｒＡＡＶ懸濁液はさらに、
（ｉ）ｒＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）の力価が少なくとも１×１０^９ＧＣ／ｍＬ～１×１０^１４ＧＣ／ｍＬ（＋／－２０％）であること；
（ｉｉ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析（実施例６Ｄを参照のこと）によって測定されるとき、ｒＡＡＶの中空粒子／完全粒子の比が０．０１～０．０５（９５％～９９％中空カプシドがない）の間である、または他の実施形態では、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％中空カプシドがないこと；及び／または
（ｉｉｉ）少なくとも約４×１０^８ＧＣ／脳質量ｇ～約４×１０^１１ＧＣ／脳質量ｇのｒＡＡＶ懸濁液の投与が効能を有すること
を特徴とする。

【0024】

効能は、試験管内での細胞培養アッセイ、たとえば、細胞当たり既知の感染効率のｒＡＡＶ ＧＣでＨｕｈ７またはＨＥＫ２９３の細胞に形質導入し、形質導入の７２時間後にＩＤＵＡ活性について上清をアッセイする、実施例６Ｇに記載されている試験管内の効能アッセイによって測定することができる。ｈＩＤＵＡの機能（活性）及び／または効能は好適な試験管内のアッセイにおいて、たとえば、蛍光発生基質である４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イズロニドを切断する能力によって測定されてもよい。記載されている条件下で測定すると比活性は＞７，５００ピコモル／分／μｇである。ｗｗｗ．ＲｎＤＳ
ｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍでの活性のアッセイプロトコールを参照のこと。酵素活性を測定する他の好適な方法は、本明細書に記載されているものを含めて記載されている［たとえば、Ｋａｋｋｉｓ，Ｅ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ（１９９４）．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆ．５：２２５－２３２；Ｒｏｍｅ，Ｌ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ（１９７９）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：２３３１－２３３４を参照のこと］。活性はまた、記載されている方法、たとえば、Ｅ．Ｏｕｓｓｏｒｅｎ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１３，Ａｕｇ；１０９（４）：３７７－８１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｇｍｅ．２０１３．０５．０１６．Ｅｐｕｂ，２０１３，Ｊｕｎ，４を用いて評価してもよい。

【0025】

治療の候補者である患者は、ＭＰＳ Ｉの及び／またはハーラー、ハーラー・シャイエ及びシャイエに関連する症状を持つ小児患者及び成人患者である。

【0026】

以下の治療上有効な平坦用量を指示した年齢群のＭＰＳ Ｉ患者に投与することができる。
・新生児：約３．８×１０^１２～約１．９×１０^１４ＧＣ；
・３～９ヵ月：約６×１０^１２～約３×１０^１４ＧＣ；
・９～３６カ月：約１０^１３～約５×１０^１４ＧＣ；
・３～１２歳：約１．２×１０^１３～約６×１０^１４ＧＣ；
・１２歳以上：約１．４×１０^１３～約７．０×１０^１４ＧＣ；
・１８歳以上（成人）：約１．４×１０^１３～約７．０×１０^１４ＧＣ。

【0027】

一部の実施形態では、１２歳以上のＭＰＳ Ｉ患者（１８歳以上を含む）に投与される用量は１．４×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）（１．１×１０^１０ＧＣ／脳質量ｇ）である。一部の実施形態では、１２歳以上のＭＰＳ Ｉ患者（１８歳以上を含む）に投与される用量は７×１０^１３ＧＣ（５．６×１０^１０ＧＣ／脳質量ｇ）である。その上、さらなる実施形態では、ＭＰＳ Ｉ患者に投与される用量は少なくとも約４×１０^８ＧＣ／脳質量ｇ～約４×１０^１１ＧＣ／脳質量ｇである。特定の実施形態では、ＭＰＳ Ｉの新生児に投与される用量は約１．４×１０^１１から約１．４×１０^１４ＧＣまでに及び；３～９ヵ月の乳児に投与される用量は、約２．４×１０^１１から約２．４×１０^１４ＧＣまでに及び；９～３６カ月の幼児に投与される用量は、約４×１０^１１から約４×１０^１４ＧＣまでに及び；３～１２歳の小児に投与される用量は、約４．８×１０^１１から約４．８×１０^１４ＧＣまでに及び；１２歳以上の小児及び成人に投与される用量は、約５．６×１０^１１から約５．６×１０^１４ＧＣまでに及ぶ。

【0028】

治療の目標は、疾患を治療するための実行可能なやり方としてｒＡＡＶに基づいたＣＮＳを指向する遺伝子治療を介して患者の欠損したα－Ｌ－イズロニダーゼを機能的に置き換えることである。本明細書に記載されているｒＡＡＶベクターから発現されるので、ＣＳＦ、血清、ニューロンまたは他の組織または流体で検出されるような正常レベルの少なくとも約２％の発現レベルが治療効果を提供してもよい。しかしながら、さらに高い発現レベルが達成されてもよい。そのような発現レベルは正常な機能的なヒトＩＤＵＡレベルの約２％～約１００％であってもよい。特定の実施形態では、正常な発現レベルよりも高いレベルがＣＳＦ、血清、または他の組織または流体で検出されてもよい。

【0029】

本発明はまたｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡ医薬組成物の製造及び特徴付けも提供する（以下の
実施例６）。

【0030】

本明細書で使用されるとき、用語「髄内送達」または「髄内投与」は、それが脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように脊柱管、さらに具体的にはクモ膜下腔への注入を介した薬剤の投与の経路を指す。髄内送達には、腰椎穿刺、脳室内、後頭下／嚢内及び／またはＣ１
－２の穿刺が挙げられてもよい。たとえば、腰椎穿刺の手段によってクモ膜下腔全体にわたる拡散のために物質が導入されてもよい。別の例では、注入は大槽内にであってもよい。

【0031】

本明細書で使用されるとき、用語「嚢内送達」または「嚢内投与」は、さらに具体的には後頭下穿刺を介して、または大槽への直接注入によって、または永続的に置かれた管を介して直接脳室の脳脊髄液に、または大槽小脳延髄の中に投与する経路を指す。図１３は嚢内注入がどのように行われるかについての説明を提供する。

【0032】

本明細書で使用されるとき、「治療上有効な量」はＭＰＳ Ｉのハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群及び／またはシャイエ症候群の症状の１以上を改善するまたは治療するのに十分な酵素の量を標的細胞に送達し、発現させるＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡ組成物の
量を指す。「治療」には、ＭＰＳ Ｉ症候群の１つの症状を悪化させるのを防ぐことが挙げられてもよく、たぶん、その症状の１以上の反転が挙げられてもよい。治療上の効果（有効性）を評価する方法は以下（たとえば、以下のセクション５．２．３を参照のこと）で詳細に記載されている。

【0033】

ヒト患者にとって「治療上有効な量」は動物モデルに基づいて予測されてもよい。好適なネコモデル及び好適なイヌモデルの例は本明細書に記載されている。参照によって本明細書に組み入れられるＣ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，（２０１４）；２２，１２，２０１８－２０２７；Ａ．Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍａｒｃｈ，２０１５，２６（１）：２７－３７を参照のこと。イヌモデルに関しては、ヒト患者では投与は上手く忍容されるのに対してイヌにおける静脈内投与はヒトＩＤＵＡに対する強力で持続する抗体反応を引き出すことが観察されているので、モデルは通常免疫抑制された動物モデルまたは寛容化された動物である。これらのモデルでは、特定の症状の反転が観察されてもよく、及び／または特定の症状の進行の予防が観察されてもよい。たとえば、角膜混濁の是正が観察されてもよく、及び／または中枢神経系（ＣＮＳ）の病変の是正が観察され、及び／または血管周囲及び／または髄膜のＧＡＧ蓄積の反転が観察される。

【0034】

本明細書で使用されるとき、「機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ」は、ＭＰＳ Ｉがないまたは、たとえば、ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群及び／またはシャイエ症候群のような関連する症候群がないヒトにて正常に機能するヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素を指す。逆に、ＭＰＳ Ｉまたはこれらの症候群の１つを引き起こすα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素変異体は、機能的ではないと見なされる。一実施形態では、機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼは、Ｂｒｅｍｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１０４（３）：２８９－２９４（２０１１）によって記載された野生型のヒトα－Ｌ－イズロニダーゼのアミノ酸配列を有し、配列番号２（６５３アミノ酸）で再生されるＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１９４．２を有する。しかしながら、この配列の幾つかの天然に存在する機能的な多形（変異体）が記載されており、本発明の範囲内に包含されてもよい。そのような変異体は記載されており；たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１５１３４１と同様に参照によって組み入れられるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ；ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ３５４７５を参照のこと。

【0035】

本明細書で使用されるとき、用語「Ｎａｂ力価」は、その標的とされるエピトープ（たとえば、ＡＡＶ）の生理的効果を中和する中和抗体（たとえば、抗ＡＡＶ Ｎａｂ）がどれほど多く産生されるかの測定値である。抗ＡＡＶ Ｎａｂ力価は、たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＣａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄ
ｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９．１９９（３）：ｐ．３８１－３９０にて記載されたように測定されてもよい。

【0036】

本明細書で使用されるとき、「発現カセット」はＩＤＵＡ遺伝子とプロモータとを含み、そのための他の調節性配列を含んでもよい核酸分子を指し、そのカセットは遺伝要素（たとえば、カプシド）を介してパッケージング宿主細胞に送達されてもよく、ウイルスベクター（たとえば、ウイルス粒子）のカプシドにパッケージされてもよい。通常、ウイルスベクターを生成するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルが隣接するＩＤＵＡコーディング配列及び本明細書に記載されているもののような他の発現制御配列を含有する。

【0037】

略記「ｓｃ」は自己相補性を指す。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって運ばれるコーディング領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染の際、第２の鎖の細胞が介在する合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補性の半分ずつが会合して即時の複製及び転写の準備ができている１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成する。たとえば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ，ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ
ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ，２００１），Ｖｏｌ.８，Ｎｕｍｂｅｒ，１６，Ｐａｇｅｓ，１２４８－１２５４を参照のこと
。自己相補性ＡＡＶは米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号；及び同第７，４５６，６８３号に記載されており、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる。

【0038】

本明細書で使用されるとき、用語「操作可能に連結される」は対象とする遺伝子に隣接する発現制御配列及びトランスでまたは少し離れて対象とする遺伝子を制御するように作用する発現制御配列の双方を指す。

【0039】

用語「異種の」はタンパク質または核酸を参照して使用される場合、タンパク質または核酸が自然界では互いに同じ関係では見いだされない２以上の配列または部分配列を含むことを示す。たとえば、新しい機能的な核酸を作るように配置される無関係な遺伝子に由来する２以上の配列を有する核酸は通常組換えで産生される。たとえば、一実施形態では、核酸は、異なる遺伝子に由来するコーディング配列の発現を指向するように配置される１つの遺伝子に由来するプロモータを有する。従って、コーディング配列を参照してプロモータは異種である。

【0040】

「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、対象とする遺伝子を含有する発現カセットがウイルスのカプシドまたはエンベロープにパッケージされる合成のまたは人工的なウイルス粒子を指し、その際、ウイルスのカプシドまたはエンベロープの中にパッケージされるウイルスゲノムの配列も複製欠損であり、すなわち、それらは子孫ビリオンを生成することはできないが、標的細胞に感染する能力を保持する。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは複製するのに必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工的ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルが隣接する対象とする導入遺伝子のみを含有する―「パワー不足」であるように操作することができる）が、これらの遺伝子は産生の間に供給されてもよい。従って、複製に必要とされるウイルス酵素の存在を除いて子孫ビリオンの複製及び感染は起きないので、それは遺伝子治療での使用に安全であると見なされる。

【0041】

本明細書で使用されるとき、「組換えＡＡＶ９ウイルス粒子」は、ＡＡＶ９のカプシドを有するヌクレアーゼ耐性の粒子（ＮＲＰ）を指し、カプシドは所望の遺伝子産物のための発現カセットを含む異種核酸分子をその中にパッケージしている。そのような発現カセットは通常遺伝子配列に隣接するＡＡＶの５’及び／または３’の逆方向末端反復を含有し、該遺伝子配列は発現制御配列に操作可能に連結される。発現カセットのこれらの及び他の好適な要素は以下でさらに詳細に記載されており、或いは本明細書では導入遺伝子ゲノム配列と呼ばれてもよい。これはまた「完全な」ＡＡＶカプシドとも呼ばれてもよい。そのようなｒＡＡＶウイルス粒子は、それが発現カセットによって運ばれる所望の遺伝子産物を発現することができる宿主細胞に導入遺伝子を送達する場合、「薬学上活性がある」と称される。

【0042】

多数の例では、ｒＡＡＶ粒子はＤＮＡ分解酵素耐性であると言われる。しかしながら、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮＡ分解酵素）に加えて、他のエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼも本明細書に記載されている精製工程で使用されて混入している核酸を取り除いてもよい。そのようなヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡ及び／または二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを分解するように選択されてもよい。そのような工程は単一のヌクレアーゼまたは異なる標的を指向するヌクレアーゼの混合物を含有してもよく、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであってもよい。

【0043】

用語「ヌクレアーゼ耐性」は、宿主細胞に導入遺伝子を送達し、製造過程から存在してもよい混入している核酸を取り除くように設計されるヌクレアーゼインキュベート工程の間にパッケージされたゲノム配列を分解（消化）から保護するように設計される発現カセットの周囲でＡＡＶカプシドが完全に組み立てられることを示す。

【0044】

本明細書で使用されるとき、「ＡＡＶ９カプシド」は、ＧｅｎＢａｎｋ登録ＡＡＳ９９２６４のアミノ酸配列を有するＡＡＶ９を指し、参照によって本明細書に組み入れられ、ＡＡＶｖｐ１カプシドタンパク質は配列番号７にて再現される。このコードされた配列からの一部の変動は本発明によって包含され、それは、ＧｅｎＢａｎｋ登録ＡＡＳ９９２６４及びＵＳ７９０６１１１（ＷＯ２００５／０３３３２１）にて参照されるアミノ酸配列に対して約９９％の同一性を有する配列（すなわち、参照された配列からの約１％未満の変動）を含んでもよい。そのようなＡＡＶには、たとえば、天然の単離体（たとえば、ｈｕ３１またはｈｕ３２）、または、たとえば、ＵＳ９，１０２，９４９、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／３４９９１１；及びＷＯ２０１６／０４９２３０Ａ１に記載された、ＡＡＶ９のカプシドと並べた他のＡＡＶのカプシドにおける相当する位置から「募った」代替残基から選択されるアミノ酸置換を含むが、これらに限定されないアミノ酸の置換、欠失または付加を有するＡＡＶ９の変異体が挙げられてもよい。しかしながら、他の実施形態では、上記の参照配列に対して少なくとも約９５％の同一性を有するＡＡＶ９またはＡＡＶ９カプシドの他の変異体が選択されてもよい。たとえば、米国公開特許出願番号２０１５／００７９０３８を参照のこと。カプシドを生成する方法、そのためのコーディング配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターの製造のための方法は記載されている。たとえば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照のこと。

【0045】

用語「ＡＡＶ９中間体」または「ＡＡＶ９ベクター中間体」はその中にパッケージされた所望のゲノム配列を欠いている組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらはまた「中空」カプシドと呼ばれてもよい。そのようなカプシドは発現カセットの検出できないゲノム配列、または遺伝子産物の発現を達成するには不十分である部分的にしかパッケージされないゲノム配列を含有してもよい。これらの中空カプシドは宿主細胞に対象とする
遺伝子を移すのに機能的ではない。

【0046】

用語「ａ」または「ａｎ」は１以上を指す。そのようなものとして用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１以上」及び「少なくとも１」は本明細書では相互交換可能に使用される。

【0047】

単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は独占的にではなく包括的に解釈されるべきである。単語「ｃｏｎｓｉｓｔ」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ」及びその変形は包括的にではなく独占的に解釈されるべきである。本明細書における種々の実施形態が他の状況下で「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」言語を用いて提示されている一方で、関連する実施形態は「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」言語を用いて解釈され、記載されることも意図される。

【0048】

用語「約」は特定されない限り、±１０％の範囲内で且つそれを含む変動を包含する。

【0049】

本明細書で定義されない限り、本明細書で使用されている専門用語及び科学用語は、当業者によって及び出版された教科書を参照することによって一般に理解されるものと同じ意味を有し、それは本出願で使用されている用語の多数に対する一般的な指針を当業者に提供する。

【0050】

５．１．ＡＡＶ.ｈＩＤＵＡの構築物及び製剤
５．１.１．発現カセット
特定の実施形態では、配列番号１のヌクレオチド配列を有することを特徴とするｈＩＤＵＡ遺伝子を含有する発現カセットを含むＡＡＶベクターが提供される。本発明者らによって開発されたこの配列は、配列番号２をコードするＧｅｎＢａｎｋＮＰ０００１９４．２の公開された遺伝子コーディング配列と約８３％の同一性を有する。別の実施形態では、発現カセットは配列番号１に対して少なくとも約８０％同一であるヌクレオチド配列を有することを特徴とするｈＩＤＵＡ遺伝子を含有し、機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする。別の実施形態では、配列は配列番号１に対して少なくとも約８５％同一性であり、または配列番号１に対して少なくとも約９０％同一であり、機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする。一実施形態では、配列は、配列番号１に対して少なくとも約９５％同一であり、配列番号１に対して少なくとも約９７％同一であり、または配列番号１に対して少なくとも約９９％同一であり、機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする。一実施形態では、これは、配列番号１の約１～約７８に相当するヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（すなわち、配列番号２のアミノ酸２６付近またはアミノ酸２７付近からアミノ酸６５３付近をコードする）のリーダーペプチド配列を含む完全長のｈＩＤＵＡ遺伝子を包含する。別の実施形態では、ｈＩＤＵＡ遺伝子は、機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素、すなわち、配列番号２のアミノ酸２７付近～６５３付近または本明細書で特定されるその機能的な変異体の１つの分泌された部分に融合される異種リーダー配列を含む合成ペプチドである機能的な合成ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素をコードする。その上さらなる発現カセットは配列番号５及び配列番号６で特定されるものを含む。それぞれでは、各発現カセットはＡＡＶ２の５’及び３’ＩＴＲが隣接する。さらに、それぞれはプロモータ、エンハンサ、ｈＩＤＵＡ遺伝子、及びポリＡを含有する。

【0051】

別の実施形態では、機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼは、リーダー（シグナル）ペプチドに相当する配列番号２の最初の２６アミノ酸の全部または一部が異種のリーダーペプチドで置き換えられている合成アミノ酸配列を含んでもよい。このリーダーペプチド、たとえば、インターロイキン２（ＩＬ－２）またはオンコスタチンに由来するリーダーペプチドは細胞から出て分泌経路を介して循環に入る酵素の輸送を改善することができる。
好適なリーダーペプチドは必然ではないが、好ましくはヒト起源のものである。好適なリーダーペプチドは参照によって本明細書に組み入れられるｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／ｚｈａｎｇ２７０．ｈｔｍから選択されてもよく、または選択されたタンパク質におけるリーダー（シグナル）ペプチドを決定するための種々のコンピュータプログラムを用いて決定されてもよい。限定されないが、そのような配列は長さ約１５～約５０アミノ酸、または長さ約１９～約２８アミノ酸であってもよく、または必要に応じてさらに長くてもよく、もしくはさらに短くてもよい。加えて、ＩＤＵＡ酵素の酵素活性を評価するのに有用であるとして少なくとも１つの試験管内の方法が記載されている［たとえば、Ｋａｋｋｉｓ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂｏｌ，２００１，Ｍａｒ；７２（３）：１９９－２０８を参照のこと］。

【0052】

配列に関する同一性または類似性は、配列を並べ、必要に応じてギャップを導入し、最大の配列同一性百分率を達成した後、本明細書で提供されるペプチド及びポリペプチドの領域と同一である（すなわち、同一残基）または類似する（すなわち、共通の側鎖特性に基づく同一群に由来するアミノ酸残基）候補配列におけるアミノ酸残基の比率として本明細書では定義されている。パーセント（％）同一性は、そのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をそれぞれ比較することによって決定されるような２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド間での関係性の測定値である。一般に、比較される２つの配列は配列間で最大の相関を得るように並べられる。２つの配列の配列比較が調べられ、決定される２つの配列間での正確なアミノ酸またはヌクレオチドの対応を与える位置の数を配列比較の長さ全体で割り、１００を掛けて％同一性の数字を得る。この％同一性の数字は比較される配列の全長にわたって決定されてもよく、それは、同一のまたは非常に類似した長さの配列及び高度に相同性である、またはさらに短い定義された長さにわたる配列に特に好適であり、不均等な長さ配列または低レベルの相同性を有する配列にさらに好適である。多数のアルゴリズム及びそれに基づいたコンピュータプログラムがあり、それらは文献で使用するのに利用でき、及び／または配列比較及びパーセント同一性を行うのに公的にまたは商業的に利用できる。アルゴリズムまたはプログラムの選択は本発明の限定ではない。

【0053】

たとえば、Ｕｎｉｘのもとでの、次いでＢｉｏｅｄｉｔプログラムにインポートされるソフトウエアＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｈａｌｌ，Ｔ．Ａ．１９９９，ＢｉｏＥｄｉｔ：Ｗｉｎｄｏｗｓ９５／９８／ＮＴのための使いやすい生物配列の配列比較エディタ及び解析プログラム．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４１：９５－９８）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列解析パッケージ、バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：３８７－３９５，１９８４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡから利用可能）を含む好適な配列比較プログラムの例。プログラムＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰを用いて２つのポリヌクレオチド間での％同一性及び２つのポリペプチド配列間の％同一性を決定してもよい。

【0054】

配列間の同一性及び／または類似性を決定するための他のプログラムには、たとえば、米国、Ｍｄ、Ｂｅｔｈｅｓｄａの全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢ）から入手可能であり、ｗｗｗ.ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでのＮＣＢＩのホームページ
を介してアクセスできるプログラムのＢＬＡＳＴファミリー、ＧＣＧ配列比較ソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）が挙げられる。アミノ酸配列を比較するのにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０残基重み付け表、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用することができ；及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４－２４４８，１９８８，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列解析パッケージの一部として利用可能）。ＳｅｑＷｅｂソフトウエア（ウ
ェブに基づくＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージへのインターフェース：Ｇａｐプログラム）。

【0055】

一部の実施形態では、カセットは組換えアデノ随伴ウイルスから発現されるように設計され、ベクターゲノムもＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）も含有する。一実施形態では、ｒＡＡＶは偽型であり、すなわち、ＡＡＶのカプシドはＩＴＲを提供するＡＡＶとは異なる供給源のＡＡＶに由来する。一実施形態では、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲが使用される。しかしながら、他の好適な供給源に由来するＩＴＲが選択されてもよい。任意でＡＡＶは自己相補性ＡＡＶであってもよい

【0056】

本明細書に記載されている発現カセットはＡＡＶの５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及びＡＡＶの３’ＩＴＲを利用した。しかしながら、これらの要素の他の構成が好適であってもよい。Ｄ－配列と末端分離部位（ｔｒｓ）を欠失させているΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮型が記載されている。他の実施形態では、完全長のＡＡＶの５’ＩＴＲ及び／または３’ＩＴＲが使用される。偽型ＡＡＶが作製されるべきである場合、発現におけるＩＴＲはカプシドのＡＡＶ供給源とは異なる供給源から選択される。たとえば、ＡＡＶ２のＩＴＲは、ＣＮＳまたはＣＮＳ内の組織もしくは細胞を標的とするのに特定の効率性を有するＡＡＶのカプシドと共に使用するために選択されてもよい。一実施形態では、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列またはその欠失型（ΔＩＴＲ）を都合上使用して規制当局の承認を加速する。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶのカプシドが別のＡＡＶ供給源に由来する場合、得られるベクターは偽型と呼ばれてもよい。しかしながら、ＡＡＶのＩＴＲの他の供給源が利用されてもよい。

【0057】

一実施形態では、発現カセットは、脳脊髄液及び脳を含む中枢神経系（ＣＮＳ）での発現及び分泌のために設計される。特に所望の実施形態では、発現カセットはＣＮＳ及び肝臓の双方での発現に有用であり、それによってＭＰＳ Ｉ、ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群及び／またはシャイエ症候群の全身性の及びＣＮＳ関連双方の影響の治療を可能にする。たとえば、本発明者らは、特定の構成的なプロモータ（たとえば、ＣＭＶ）は髄内送達された際、所望のレベルでの発現を促さず、それによって準最適なｈＩＤＵＡの発現レベルを提供することを観察している。しかしながら、ニワトリのβアクチンプロモータは髄内送達及び全身性送達の双方で発現を十分に促す。従って、これは特に望ましいプロモータである。他のプロモータが選択されてもよいが、同じものを含有する発現カセットがニワトリのβアクチンプロモータによるものの利点のすべてを有さなくてもよい。種々のニワトリのβアクチンプロモータが単独で、または種々のエンハンサ要素（たとえば、ＣＢ７はサイトメガロウイルスのエンハンサ要素を伴ったニワトリのβアクチンプロモータであり、プロモータ、ニワトリのβアクチンの第１エクソンと第１イントロン及びウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含むＣＡＧプロモータ）、ＣＢｈプロモータ［Ｓ.Ｊ. Ｇｒａｙ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１，
Ｓｅｐ；２２（９）：１１４３－１１５３］との組み合わせで記載されている。

【0058】

組織特異的であるプロモータの例は、とりわけ、肝臓及び他の組織について周知である（アルブミン，Ｍｉｙａｔａｋｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモータ，Ｓａｎｄｉｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９；アルファ－フェトタンパク質（ＡＦＰ），Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４），骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６）；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４），リンパ球（ＣＤ２，Ｈａｎｓａｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８），Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖），ニューロン特異的なエノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータのようなニューロン性（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３），Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５），ニューロフィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５），及びニューロン特異的なｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５），Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４）。或いは、調節できるプロモータが選択されてもよい。たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２０１１／１２６８０８Ｂ２を参照のこと。

【0059】

一実施形態では、発現カセットは１以上の発現エンハンサを含む。一実施形態では、発現カセットは２以上の発現エンハンサを含有する。これらのエンハンサは同一であってもよく、または異なっていてもよい。たとえば、エンハンサにはアルファｍｉｃ/ｂｉｋエ
ンハンサまたはＣＭＶエンハンサが挙げられてもよい。エンハンサは互いに隣接して位置する２コピーで存在してもよい。或いは、エンハンサの二重コピーは１以上の配列によって分離されてもよい。さらに別の実施形態では、発現カセットはさらにイントロン、たとえば、ニワトリβアクチンのイントロン、ヒトβグロブリンのイントロン、及び／または市販のプロメガ（登録商標）イントロンを含有する。他の好適なイントロンには、当該技術で既知のもの、たとえば、ＷＯ２０１１／１２６８０８にて記載されているものが挙げられる。

【0060】

さらに、本発明の発現カセットには好適なポリアデニル化シグナルが提供される。一実施形態では、ポリＡ配列はウサギグロブリンのポリＡである。たとえば、ＷＯ２０１４／１５１３４１を参照のこと。或いは、別のポリＡ、たとえば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のポリアデニル化配列、ＳＶ５０ポリＡ、または合成ポリＡ。さらに他の従来の調節要素が追加的にまたは任意で発現カセットに含まれてもよい。

【0061】

５．１．２．ｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡウイルス粒子の作製
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシド、その中でパッケージされているＡＡＶ逆方向末端反復、その発現を制御する調節性配列の制御下でのヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）遺伝子を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子が提供され、その際、前記ｈＩＤＵＡ遺伝子は配列番号１で示される配列または機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードするそれと少なくとも約９５％同一である配列を有する。図１の模式図も参照のこと。一実施形態では、ｈＩＤＵＡの発現カセットにはＡＡＶの５’ＩＴＲとＡＡＶの３’ＩＴＲが隣接する。別の実施形態では、ＡＡＶは一本鎖ＡＡＶであってもよい。

【0062】

髄内送達については、ＡＡＶ９が特に望ましい。ＡＡＶ９の配列及びＡＡＶ９のカプシドに基づいてベクターを生成する方法は、参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ７，９０６，１１１；ＵＳ２０１５／０３１５６１２；ＷＯ２０１２／１１２８３２に記載されている。任意で、本明細書に記載されているようなｒＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡベクター
は肝臓を特異的に標的とするように設計されたベクターと同時投与されてもよい。肝臓指向性をもつ多数のｒＡＡＶベクターのいずれかを使用することができる。ｒＡＡＶのカプシドのための供給源として選択されてもよいＡＡＶの例には、たとえば、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８が挙げられる［たとえば、米国公開特許出願番号２００７－００３６７６０－Ａ１；米国公開特許出願番号２００９－０１９７３３８－Ａ１；ＥＰ１３１０５７１］。ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ），米国特許７７９０４４９及び米国特許７２８２１９９（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１及びＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、及びＷＯ２００６／１１０６８９］、及びｒｈ１０［ＷＯ２００３／０４２３９７］，ＡＡＶ３Ｂ；ＡＡＶｄｊ［
ＵＳ２０１０／００４７１７４］も参照のこと。特に望ましいｒＡＡＶの１つはＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＩＤＵＡ．ｃｏである。

【0063】

多くの例で、ｒＡＡＶ粒子はＤＮＡ分解酵素耐性と呼ばれる。しかしながら、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮＡ分解酵素）に加えて、他のエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼも本明細書に記載されている精製工程で使用されて混入している核酸を取り除いてもよい。そのようなヌクレアーゼを選択して一本鎖ＤＮＡ及び／または二本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡを分解してもよい。そのような工程は単一のヌクレアーゼ、または異なる標的に向けられたヌクレアーゼの混合物を含有してもよく、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであってもよい。

【0064】

ＡＡＶに基づくベクターを調製する方法は知られている。たとえば、参照によって本明細書に組み入れられる米国公開特許出願番号２００７／００３６７６０（２００７年２月１５日）を参照のこと。ＡＡＶ９のＡＡＶカプシドの使用は本明細書に記載されている組成物及び方法に特によく適している。さらに、ＡＡＶ８の配列及びＡＡＶ８カプシドに基づいてベクターを生成する方法は、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許７，２８２，１９９Ｂ２，ＵＳ７，７９０，４４９、及びＵＳ８，３１８，４８０に記載されている。しかしながら、他のＡＡＶカプシドが本発明での使用のために選択されてもよく、または生成されてもよい。多数のそのようなＡＡＶの配列が、上記で引用された米国特許第７，２８２，１９９ Ｂ２号、同第７，７９０，４４９号、同第８，３１８，４８０号及び同第７，９０６，１１１号にて提供されており、ＧｅｎＢａｎｋから利用できる。ＡＡＶカプシド母いずれかの配列は合成で、または種々の分子生物学及び遺伝子工学の技法を用いて容易に生成することができる。好適な製造方法は当業者に周知である。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと。或いは、ペプチド（たとえば、ＣＤＲ）をコードするオリゴヌクレオチドまたはペプチド自体は、たとえば、周知の固相ペプチド合成法によって合成で生成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９６２），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９；Ｓｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９），ｐｐ．２７－６２）。これらの及び他の好適な製造方法は当業者の知識の範囲内にあり、本発明の限定ではない。

【0065】

本明細書に記載されている組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は既知である技法を用いて生成されてもよい。たとえば、ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照のこと。そのような方法には、ＡＡＶカプシド；機能的なｒｅｐ遺伝子；最小でもＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）と導入遺伝子とで構成される発現カセット；及び発現カセットのＡＡＶカプシドタンパク質へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能をコードする核酸配列を含有する宿主細胞を培養することが関与する。

【0066】

中空粒子と完全粒子の含量を計算するために、選択された試料（本明細書試料では、たとえば、ＧＣの数＝粒子の数であるイオジキサノール勾配精製した調製物）についてのＶＰ３のバンド容量を負荷したＧＣ粒子に対してプロットする。得られる線形の方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて試験物品のピークのバンド容量における粒子の数を計算する。次いで、負荷した２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を乗じて粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。ＧＣ／ｍＬで割ったＰｔ／ｍＬが粒子のゲノムコピーに対する比（ｐｔ／ＧＣ）を与える。Ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬは中空Ｐｔ／ｍＬを与える。Ｐｔ／ｍＬで割った中空Ｐｔ／ｍＬに１００を掛けて中空粒子の比率を得る。

【0067】

一般に、中空カプシド及びパッケージされたゲノムを伴うＡＡＶベクター粒子をアッセイする方法は当該技術で既知である。たとえば、Ｇｒｉｍｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９９），６：１３２２－１３３０；Ｓｏｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３），７：１２２－１２８を参照のこと。変性させたカプシドについて調べるために、方法には、３種のカプシドタンパク質を分離することができるゲル、たとえば、緩衝液にて３～８％のトリス・酢酸塩を含有する勾配ゲルから成るＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理されたＡＡＶストックを供することと、次いで試料物質が分離されるまでゲルを泳動させることと、ナイロンまたはニトロセルロース膜、好ましくはナイロンに対してゲルをブロットすることとが関与する。次いで、変性させたカプシドタンパク質に結合する一次抗体として、抗ＡＡＶカプシド抗体、好ましくは抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ２モノクローナル抗体が使用される（Ｗｏｂｕｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体との結合を検出する手段を含有するものである二次抗体、さらに好ましくは、それに共有結合する検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは西洋ワサビのペルオキシダーゼに共有結合する抗マウスＩｇＧ抗体を使用する。結合を検出する方法を用いて一次抗体と二次抗体の間の結合を半定量的に決定し、好ましくは、検出方法は、放射性同位元素の放出、電磁放射、または比色変化を検出することができ、最も好ましくは化学発光検出キットである。たとえば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥについては、カラム分画からの試料を取り出し、還元剤（たとえば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ負荷緩衝液にて加熱し、プレキャストの勾配ポリアクリルアミドゲル（たとえば、Ｎｏｖｅｘ）にてカプシドタンパク質を分解した。銀染色は製造元の指示書に従ってＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて行ってもよく、または他の好適な染色法、すなわち、ＳＹＰＲＯｒｕｂｙまたはクマシー染色を行ってもよい。一実施形態では、カラム分画におけるＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料を希釈し、ＤＮＡ分解酵素Ｉ（または他の好適なヌクレアーゼ）によって消化して外来性のＤＮＡを取り除く。ヌクレアーゼの不活化の後、試料をさらに希釈し、プライマーとプライマー間でのＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅する。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システムにて各試料について蛍光の定義されたレベルに達するのに必要とされるサイクルの数（閾値サイクル、Ｃｔ）を測定する。ＡＡＶベクターに含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを採用してＱ－ＰＣＲ反応における標準曲線を生成する。試料から得られるサイクルの閾値（Ｃｔ）の値を使用してプラスミドの標準曲線のＣｔ値に対してそれを基準化することによってベクターゲノムの力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づいたエンドポイントアッセイも使用することができる。

【0068】

態様の１つでは、スペクトルの広いセリンプロテアーゼ、たとえば、プロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎから市販されているような）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲを使用する。さらに詳しくは、最適化ｑ－ＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮＡ分解酵素Ｉによる消化の後、試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理し、その後熱で不活化することを除いて、標準アッセイに類似する。好適には、試料は、試料サイズと同等の量でのプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテイナーゼＫ緩衝液は２倍以上に濃縮されてもよい。通常、プロテイナーゼＫ処理は約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬまで変化してもよい。処理工程は一般に約５５℃で約１５分間行われるが、さらに低い温度（たとえば、約３７℃～約５０℃）でさらに長い時間（たとえば、約２０分間～約３０分間）、またはさらに高い温度（たとえば、約６０℃まで）でさらに短い時間（たとえば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱による不活化は一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度はさらに低下させてもよく（たとえば、約７０℃～約９０℃）、時間は増やしてもよい（たとえば、約２０分間～約３０分間）。次いで試料を希釈し（たとえば、１０００倍）、標準アッセイで記載されたよう
なＴａｑＭａｎ解析に供する。

【0069】

さらにまたは代わりに、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。たとえば、ｄｄＰＣＲによって一本鎖及び自己相補性のＡＡＶベクターゲノムの力価を測定する方法が記載されている。たとえば、Ｍ．Ｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４，Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ，２０１４，Ｆｅｂ，１４を参照のこと。

【0070】

手短には、ゲノム欠損ＡＡＶ９中間体からパッケージされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ９粒子を分離する方法には、組換えＡＡＶ９ウイルス粒子とＡＡＶ９カプシド中間体を含む懸濁液を高速液体クロマトグラフィに供することが関与し、その際、ＡＡＶ９ウイルス粒子とＡＡＶ９中間体は１０．２のｐＨで平衡化した強アニオン交換樹脂に結合し、約２６０及び約２８０での紫外線吸光度について溶出液をモニターしながら塩勾配に供される。ｒＡＡＶ９にとってあまり最適ではないが、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であってもよい。この方法では、ＡＡＶ９完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に達した際に溶出される分画から回収される。一例では、アフィニティクロマトグラフィ工程については、ＡＡＶ２／９血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ ＡＡＶ２／９親和性樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に透析濾過した生成物を適用してもよい。これらのイオン条件下では、ＡＡＶ粒子が効率的に捕捉される一方で、残留する細胞性のＤＮＡ及びタンパク質のかなりの割合がカラムを通過する。

【0071】

ｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡベクターは図１１で示すフローチャートで示されるように製造す
ることができ、それは以下のセクション５．４及び実施例５にてさらに詳細に記載されている。

【0072】

５.１．３．ｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡの医薬製剤
ｒＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡ製剤は、生理食塩水と界面活性剤と生理的に適合性の塩または
塩の混合物とを含有する水溶液に懸濁された有効量のＡＡＶ.ｈＩＤＵＡベクターを含有
する懸濁液である。好適には、製剤は、生理的に許容できるｐＨに、たとえば、ｐＨ６～８、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲で調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２なので、髄内送達のためにはこの範囲内のｐＨが所望であってもよいのに対して、静脈内送達については、６．８～約７．２のｐＨが所望であってもよい。しかしながら、最も広い範囲内及びこれら部分範囲内での他のｐＨが他の経路の送達のために選択されてもよい。

【0073】

好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは非毒性である非イオン性界面活性剤の間から選択されてもよい。一実施形態では、１級ヒドロキシル基で終結する二官能性のブロックコポリマー界面活性剤、たとえば、中性のｐＨを有し、８４００の平均分子量を有するポロキサマー１８８としても知られるプルロニック（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド）の２つの親水性の鎖が隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド）の中央の疎水性の鎖で構成される非イオン性のトリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール及びポリエチレングリコールが選択されてもよい。一実施形態では、製剤はポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、文字「Ｐ」（ポロキサマーのための）に続く３つの数字によって共通して名付けられ、最初の２つの数字×１００はポリオキシプロピレンのコアの
およその分子量を与え、最後の数字×１０はポリオキシエチレン含量の比率を与える。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％までの量で存在してもよい。

【0074】

一実施形態では、製剤は、たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＭ．Ｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４，Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ，２０１４，Ｆｅｂ．１４にて記載されたようなｏｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定されるとき少なくとも約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ～１×１０^１４ＧＣ／ｍＬの濃度を含有してもよい。

【0075】

一実施形態では、本明細書に記載されているような緩衝溶液におけるｒＡＡＶを凍結形態で含有する凍結組成物が提供される。任意で、１以上の界面活性剤（たとえば、プルロニックＦ６８）、安定剤または保存剤がこの組成物に存在する。好適には、使用のために、組成物は解凍され、好適な希釈剤、たとえば、無菌の生理食塩水または緩衝化生理食塩水によって所望の用量に滴定される。

【0076】

一例では、製剤は、水中にて、たとえば、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（たとえば、硫酸マグネシウム・７Ｈ_２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（たとえば、塩化カルシウム・２Ｈ_２Ｏ）、二塩基リン酸ナトリウム及びそれらの混合物の１以上を含む緩衝化生理食塩水溶液を含有してもよい。好適には、髄内送達については、浸透圧は脳脊髄液（たとえば、約２７０～約２９０）に適合する範囲内である。たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗ．を参照のこと。任意で、髄内送達については、市販の希釈剤を懸濁剤として、または別の懸濁剤及び他の任意の賦形剤との組み合わせで使用してもよい。たとえば、エリオットＢ（登録商標）［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照のこと。

【0077】

他の実施形態では、製剤は１以上の透過促進剤を含有してもよい。好適な透過促進剤には、たとえば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウレルエーテル、またはＥＤＴＡが挙げられてもよい。

【0078】

特定の実施形態では、製剤にて懸濁された濃縮ベクター（任意で凍結された）と任意の希釈緩衝液と用具とを含むキットが提供され、髄内投与に必要とされる他の成分が提供される。別の実施形態では、キットは追加的にまたは代わりに静脈内送達のための成分を含んでもよい。一実施形態では、キットは注入を可能にするのに十分な緩衝液を提供する。そのような緩衝液は、濃縮されたベクターの１：１～１：５またはそれ以上の希釈を可能にしてもよい。他の実施形態では、さらに多いまたはさらに少ない量の緩衝液または無菌水が含まれて、治療を行う医師による用量滴定及び他の調整を可能にする。さらに他の実施形態では、用具の１以上の成分がキットに含まれる。

【0079】

５．２．遺伝子治療プロトコール
５．２．１．標的患者集団
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されているような治療上有効な量の修飾されたｈＩＤＵＡの発現カセットを送達することを含むＩ型ムコ多糖症を治療する方法である。特に、本明細書で提供されるのは、それを必要とする患者に治療上有効な量の本明細書に記載されているｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡを送達することを含む、ＭＰＳ Ｉであると診
断された患者にて神経認知の低下を防ぐ、治療する及び／または改善する方法である。「治療上有効な量」の本明細書に記載されているｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡベクターは以下の段
落のいずれか１つで特定される症状の１以上を是正してもよい。

【0080】

治療の候補者である患者は、ＭＰＳ Ｉの及び／またはハーラー、ハーラー・シャイエ及びシャイエに関連する症状を持つ小児患者及び成人患者である。ＭＰＳ Ｉ疾患は早期に重度の形態（ハーラー）から晩期の発症形態（シャイエ）までの疾患のスペクトルである。ハーラー症候群は通常、ＩＤＵＡ酵素活性がない（０％）ことを特徴とし、早期に診断され、発達遅滞、肝脾肥大症、骨格病変、角膜混濁、関節病変、難聴、心臓病変及び１０歳までの死亡を特徴とする。ハーラー・シャイエの患者は、一部のＩＤＵＡ酵素活性を有する（０％を超えるが、通常２％未満）ことが観察され、多様な知的結果、呼吸器疾患、閉塞性気道疾患、循環器疾患、関節のこわばり／痙縮、骨格の異常、視力の低下、及び十代または二十代での死亡を有する。シャイエ症候群の患者は通常、少なくとも２％の「正常な」ＩＤＵＡ酵素活性を有し、遅くなって診断され；そのような患者は通常、正常な知性を有するが、肝脾肥大症、関節の病変、神経絞扼、難聴、心臓の病変及び正常な寿命を有する。ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）についての新生児スクリーニング：母子健康事務局のために作成された最終知見、最終バージョン１．１の証拠報告の体系的レビュー。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｒｓａ．ｇｏｖ／ａｄｖｉｓｏｒｙｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ／ｍｃｈｂａｄｖｉｓｏｒｙ／－ｈｅｒｉｔａｂｌｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ／ｎｏｍｉｎａｔｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ／ｒｅｖｉｅｗｓ／ｍｐｓ１ｆｉｎａｌｒｅｐｏｒｔ．ｐｄｆを参照のこと。

【0081】

本発明の組成物は、軽度から本格的なアナフィラキシーに及び得る組換え酵素に対する免疫応答に関連する長期間の酵素補充療法（ＥＲＴ）の合併症、と同様にたとえば、局所及び全身性の感染症のような長期間の末梢投与の合併症を回避する。ＥＲＴとは対照的に本発明の組成物は長期間の反復する毎週の注射を必要としない。理論によって束縛されることを望まないで、本明細書に記載されている治療方法は、ＣＮＳ区画の外側で治療の影響力を提供する連続した高い循環ＩＤＵＡのレベルを提供する高い形質導入効率のベクターによって得られる効率的で長期の遺伝子導入を提供することによってＭＰＳ Ｉ疾病に関連する少なくとも中枢神経系の表現型を是正することに有用であると考えられる。加えて、本明細書で提供されるのは、ＡＡＶが介在するＣＮＳへの送達に先立って、タンパク質の形態またはｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡの形態での酵素の直接的な全身性送達によることを
含む、種々の経路による酵素に対する能動的寛容を提供し、抗体の形成を防ぐ方法である。

【0082】

一部の実施形態では、ハーラー症候群であると診断された患者は本明細書に記載されている方法に従って治療される。一部の実施形態では、ハーラー・シャイエ症候群であると診断された患者は本明細書に記載されている方法に従って治療される。一部の実施形態では、シャイエ症候群であると診断された患者は本明細書に記載されている方法に従って治療される。一部の実施形態では、神経認知欠損を有するＭＰＳ Ｉの小児対象は本明細書に記載されている方法に従って治療される。

【0083】

特定の実施形態では、新生児（３ヵ月齢未満）は本明細書に記載されている方法に従って治療される。特定の実施形態では、３ヵ月齢～９ヵ月齢である乳児は本明細書に記載されている方法に従って治療される。特定の実施形態では、９ヵ月齢～３６カ月齢である幼児は本明細書に記載されている方法に従って治療される。特定の実施形態では、３歳～１２歳である小児は本明細書に記載されている方法に従って治療される。特定の実施形態では、１２歳～１８歳である小児は本明細書に記載されている方法に従って治療される。特定の実施形態では、１８歳以上である成人は本明細書に記載されている方法に従って治療される。

【0084】

一実施形態では、患者はハーラー症候群を有してもよく、少なくとも３ヵ月齢から１２ヵ月齢未満の男子または女子である。別の実施形態では、患者は男子または女子のハーラー・シャイエ症候群であってもよく、少なくとも約６歳から１８歳までであってもよい。他の実施形態では、対象は老齢であっても、または若年であってもよく、男子であっても、または女子であってもよい。

【0085】

好適には、治療のために選択される患者には、以下の特徴：血漿、線維芽細胞または白血球で測定されたときＩＤＵＡ活性の欠如または低下によって確認されたＭＰＳ Ｉの文書化された診断；以下、他の神経学的なまたは精神医学的な因子によって説明できなければ：ＩＱ検査の平均値を１標準偏差下回るスコアもしくは神経心理学的機能（言語、記憶、注意または非言語能力）の１ドメインにおけるスコアのいずれかとして定義されるＭＰＳ Ｉによる早期の神経認知欠損の文書化された証拠、または逐次試験における１標準偏差を上回る低下の文書化された歴史的証拠の１以上を有するものが含まれてもよい。或いは、尿における高いＧＡＧまたは遺伝子検査が使用されてもよい。

【0086】

治療に先立って、対象、たとえば、乳児は好ましくは、ＭＰＳ Ｉ患者、すなわち、ｈＩＤＵＡをコードする遺伝子に突然変異を有する患者を特定する遺伝子型判定を受ける。治療に先立って、ＭＰＳ Ｉ患者は、ｈＩＤＵＡ遺伝子を送達するのに使用されるＡＡＶ血清型に対する中和抗体（Ｎａｂ）について評価され得る。特定の実施形態では、５以下であるＡＡＶに対する中和抗体力価を持つＭＰＳ Ｉ患者は本明細書に記載されている方法の１以上に従って治療される。

【0087】

治療に先立って、ＭＰＳ Ｉ患者を、ｈＩＤＵＡ遺伝子を送達するのに使用されるＡＡＶベクターのカプシドに対する中和抗体（Ｎａｂ）について評価することができる。そのようなＮａｂは形質導入効率を妨害することができ、治療有効性を低下させることができる。≦１．５のベースライン血清Ｎａｂ力価を有するＭＰＳ Ｉ患者は、ｒＡＡＶ.ｈＩ
ＤＵＡ遺伝子治療プロトコールによる治療について良好な候補者である。＞１：５の血清Ｎａｂの力価を持つＭＰＳ Ｉ患者の治療は、ｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡベクターの送達によ
る治療の前に及び／または治療中にたとえば、免疫抑制剤による一時的な同時治療のような併用療法を必要としてもよい。任意で、免疫抑制剤の同時療法は、ＡＡＶベクターのカプシド及び／または製剤の他の成分に対する中和抗体を前もって評価することなく、予防措置として使用されてもよい。特に、実際にＩＤＵＡ活性のレベルを有さない、導入遺伝子の産物が「異物」として見られ得る患者では、ｈＩＤＵＡ導入遺伝子の産物に対する有害な免疫応答の可能性を防ぐために、前もっての免疫抑制療法が望ましくてもよい。以下に記載されているマウス、イヌ及びＮＨＰにおける非臨床試験の結果は、ｈＩＤＵＡに対する免疫応答及び神経炎症の発生に矛盾しない。類似の反応はヒト対象では起きないかもしれないが、予防免疫抑制療法はｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡのレシピエントすべてに推奨され
る。

【0088】

そのような同時療法のための免疫抑制剤には、グルココルチコイド、ステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（たとえば、ラパマイシンまたはラパログ）、及びアルキル化剤を含む細胞増殖抑制剤、代謝拮抗剤、細胞傷害性の抗生剤、抗体、またはイムノフィリンに対して活性のある作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メソトレキセート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）またはＣＤ３に向けられた抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイドまたはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－アルファ）結合剤が挙げられてもよい。特定の実施形態では、免疫抑制療法は遺伝子
治療の投与の０、１、２、７日以上前に開始されてもよい。そのような治療法には、同一日における２以上の薬剤（たとえば、プレドニゾロン、ミコフェノレートモフェチル（ＭＭＦ））及び／またはシロリムス（すなわち、ラパマイシン）の同時投与が関与してもよい。これら薬剤の１以上が同一用量または調整された用量で、遺伝子治療の投与後に継続してもよい。そのような治療法は必要に応じて約１週間（７日間）、約６０日間またはそれ以上であってもよい。特定の実施形態では、タクロリムスを含まない投薬計画が選択される。

【0089】

にもかかわらず、一実施形態では、以下の特徴の１以上を有する患者が主治医の裁量によって治療から排除されてもよい：
・以下のいずれかを含むＩＣ注入について禁忌を有する：
_゜ベースラインＭＲＩ検査の見直しがＩＣ注入の禁忌を示す
_゜ＩＣ注入の禁忌を生じる頭部／頸部の手術の既往
_゜ＣＴ（または造影剤）または全身麻酔に対する禁忌を有する
_゜ＭＲＩ（またはガドリニウム）に対する禁忌を有する
_゜＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の推定糸球体濾過量(ｅＧＦＲ）を有する
・ＭＰＳ Ｉに起因しない神経認知欠損を有する、または神経精神病状態も診断を有する・シロリムス、ＭＭＦまたはプレドニゾロンに対する過敏性反応の既往を有する
・免疫抑制療法について適当ではない状態（たとえば、＜１．３×１０^３／μＬの好中球の絶対数、＜１００×１０^３／μＬの血小板数及び＜１２ｇ／ｄＬ（男）または＜１０ｇ／ｄＬ（女）のヘモグロビン）を有する
・腰椎穿刺に対する禁忌を有する
・ＨＳＣＴを受けている
・治療の前６ヵ月以内にＩＴ投与を介してラロニダーゼ投与を受けていた
・どこかの時点でラロニダーゼＩＴ投与を受け、患者を過度のリスクに置くＩＴ投与に関連すると見なされる重大な有害事象を経験した
・治療の前少なくとも３ヵ月間完全寛解になっていない、リンパ腫の既往、または皮膚の有棘細胞癌もしくは基底細胞癌以外の別の癌の既往
・患者がギルバート症候群の以前既知の既往症及び総ビリルビンの＜３５％の結合ビリルビンを示す分画ビリルビンを有さない限り、＞３×正常の上限（ＵＬＮ）のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）または＞１．５×ＵＬＮの総ビリルビン
・ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）陽性検査の既往、活動型または再発性のＢ型肝炎またはＣ型肝炎、またはＢ型肝炎、Ｃ型肝炎またはＨＩＶの陽性スクリーニング検査の既往
・妊娠中、出産後＜６週、母乳授乳中、または妊娠を計画中（自己またはパートナー）
・治療の前１年以内のアルコールまたは薬物の乱用の既往
・患者の安全を脅かす深刻なまたは不安定な医学的または心理学的な状態を有する。
・制御不良の発作。
他の実施形態では、主治医は、これらの身体的な特徴（医学的既往）の１以上の存在が本明細書で提供されているような治療を除外すべきではないことを決定してもよい。

【0090】

５．２．２．投与量及び投与の方式
患者への投与に好適な医薬組成物は、生理的に適合性の水性緩衝液と界面活性剤と任意の賦形剤とを含む製剤緩衝液におけるｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡベクターの懸濁液を含む。特
定の実施形態では、本明細書に記載されている医薬組成物は髄内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載されている医薬組成物は嚢内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載されている医薬組成物は静脈内に投与される。特定の実施形態では、医薬組成物は２０分間（±５分間）にわたる点滴によって末梢静脈を介して送達される。しかしながら、この時間は必要に応じてまたは所望に応じて調整されてもよい。しかしながら、投与のさらに他の経路が選択されてもよい。代わりにまたはさらに、投与の経路は所
望に応じて組み合わせてもよい。

【0091】

ｒＡＡＶの単回投与が有効であることが予測される一方で、投与は繰り返されてもよい（たとえば、特に新生児の治療では年に４回、年に２回、毎年または別の方法で必要に応じて）。任意で、点滴／注入を忍容するために対象の年齢及び能力を考慮して、治療上有効な量の初回用量は分割点滴／注入の期間にわたって送達されてもよい。しかしながら、完全な治療用量の反復毎週の注入は必要とされず、心地よさと治療結果の双方の点で患者に利点を提供する。

【0092】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ懸濁液は少なくとも１×１０^９ＧＣ／ｍＬであるｒＡＡＶのゲノムコピー（ＧＣ）の力価を有する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ懸濁液におけるｒＡＡＶの中空粒子／完全粒子の比は０．０１～０．０５の間である（９５％～９９％中空カプシドはない）。一部の実施形態では、それを必要とするＭＰＳ Ｉ患者は、ｒＡＡＶ懸濁液の少なくとも約４×１０^８ＧＣ／脳質量ｇ～約４×１０^１１ＧＣ／脳質量ｇの用量を投与される。

【0093】

以下のｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡの治療上有効な平坦用量を指示した年齢群のＭＰＳ Ｉ患
者に投与することができる。
・新生児：約３．８×１０^１２～約１．９×１０^１４ＧＣ；
・３～９ヵ月：約６×１０^１２～約３×１０^１４ＧＣ；
・９～３６カ月：約１０^１３～約５×１０^１４ＧＣ；
・３～１２歳：約１．２×１０^１３～約６×１０^１４ＧＣ；
・１２歳以上：約１．４×１０^１３～約７．０×１０^１４ＧＣ；
・１８歳以上（成人）：約１．４×１０^１３～約７．０×１０^１４ＧＣ。

【0094】

一部の実施形態では、１２歳以上のＭＰＳ Ｉ患者（１８歳以上を含む）に投与される用量は１．４×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）（１．１×１０^１０ＧＣ／脳質量ｇ）である。一部の実施形態では、１２歳以上のＭＰＳ Ｉ患者（１８歳以上を含む）に投与される用量は７×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）（５．６×１０^１０ＧＣ／脳質量ｇ）である。その上さらなる実施形態では、ＭＰＳ Ｉ患者に投与される用量は約４×１０^８ＧＣ／脳質量ｇ～約４×１０^１１ＧＣ／脳質量ｇである。特定の実施形態では、ＭＰＳ Ｉ新生児に投与される用量は約１．４×１０^１１から約１．４×１０^１４ＧＣにまで及び；３～９ヵ月の乳児に投与される用量は約２．４×１０^１１から約２．４×１０^１４ＧＣにまで及び；９～３６カ月の幼児に投与される用量は約４×１０^１１から約４×１０^１４ＧＣにまで及び；３～１２歳の小児に投与される用量は約４．８×１０^１１から約４．８×１０^１４ＧＣにまで及び；１２歳以上の小児及び成人に投与される用量は約５．６×１０^１１から約５．６×１０^１４ＧＣにまで及ぶ。

【0095】

これらの用量及び濃度の送達のために好適な体積は当業者によって決定されてもよい。たとえば、約１μＬ～１５０ｍＬの体積が選択されてもよく、高い体積は成人にために選択されてもよい。通常、新生児のためには好適な体積は約０．５ｍＬ～約１０ｍＬであり、年長乳児については約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択されてもよい。幼児については約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの体積が選択されてもよい。小児については約３０ｍＬまでの体積が選択されてもよい。思春期前の子供及び十代については約５０ｍＬまでの体積が選択されてもよい。さらに他の実施形態では、患者は、選択される約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの体積で髄内投与を受けてもよい。他の好適な体積及び投与量が決定されてもよい。投与量は副作用に対して治療利益のバランスを取るように調整され、そのような投与量は、組換えベクターが採用される治療応用に応じて変化してもよい。

【0096】

髄内送達についての一実施形態では、患者は成人対象であり、用量は約１×１０^８ＧＣ～５×１０^１４ＧＣを含む。別の実施形態では、用量は約３．８×１０^１２～約１．９×１０^１４ＧＣを含む。さらなる実施形態では、患者はハーラー症候群を有する少なくとも約３ヵ月齢から１２ヵ月齢までの乳児対象であり、用量は４×１０^８ＧＣのｒＡＡＶ９.
ｈＩＤＵＡ／脳質量ｇ～３×１０^１２ＧＣのｒＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡ／脳質量ｇの少なく
とも同等物を含む。別の例では、患者はハーラー・シャイエ症候群を有する少なくとも約６歳から１８歳までの小児であり、用量は少なくとも４×１０^８ＧＣのｒＡＡＶ９.ｈＩ
ＤＵＡ／脳質量ｇ～３×１０^１２ＧＣのｒＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡ／脳質量ｇの同等物を含
む。

【0097】

５．２．３．モニタリング有効性
治療法の有効性は、（ａ）ＭＰＳ Ｉ患者における神経認知低下の予防、及び（ｂ）疾患の生体マーカー、たとえば、ＣＳＦ、血清及び／または尿におけるＧＡＧのレベル及び／または酵素活性の低下、及び／または肝臓及び脾臓の容量を評価することによって測定することができる。神経認知は、知能指数（ＩＱ）を測定することによって、たとえば、ハーラーの対象についてＢａｙｌｅｙの乳児発達スケールによって測定されるように、またはハーラー・シャイエの対象についてＷｅｃｈｓｌｅｒ短縮版知能検査（ＷＡＳＩ）によって測定されるように判定することができる。神経認知の発達及び機能の他の適当な測定、たとえば、Ｂａｙｌｅｙの乳児発達スケール（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）を用いて発達指数（ＤＱ）を評価すること、Ｈｏｐｋｉｎｓ言語学習試験を用いて記憶を評価すること、及び／または注意変数試験（ＴＯＶＡ）を使用することが利用されてもよい。他の神経心理学的機能、たとえば、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度、視覚処理、微細運動、コミュニケーション、社会化、日常生活技能、及び情動や行動上の健康がモニターされる。容量測定の拡散テンソル画像（ＤＴＩ）を取得するための脳の磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）、及び休息状態のデータ、超音波検査による平均神経断面積、脊髄圧迫の改善、安全性、肝臓サイズ及び脾臓サイズも管理される。

【0098】

任意で、有効性の他の測定には、生体マーカー（たとえば、本明細書に記載されているようなポリアミン）及び臨床的転帰の評価が挙げられてもよい。尿は、ＧＡＧの総含量、クレアチニンと比べたＧＡＧの濃度、と同様にＭＰＳ Ｉに特異的なｐＧＡＧについて評価される。血清及び／または血漿は、ＩＤＵＡ活性、抗ＩＤＵＡ抗体、ｐＧＡＧ、及びヘパリン補因子ＩＩ・トロンビン複合体及び炎症のマーカーの濃度について評価される。ＣＳＦは、ＩＤＵＡ活性、抗ＩＤＵＡ抗体、ヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘ）活性、及びｐＧＡＧ（たとえば、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸）について評価される。ベクター（たとえば、ＡＡＶ９）に対する中和抗体及び抗ＩＤＵＡ抗体への結合抗体の存在はＣＳＦ及び血清にて評価されてもよい。ベクターのカプシド（たとえば、ＡＡＶ９）またはｈＩＤＵＡ導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答はＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価されてもよい。血清及び尿におけるＩＤＵＡ発現の薬物動態と同様にベクター濃度（ＡＡＶ９ＤＮＡに対するＰＣＲ）もモニターされてもよい。

【0099】

ｈＩＤＵＡの全身性の送達が伴うｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡのＣＮＳへの遺伝子治療送達の
併用は本発明の方法によって包含される。全身性送達は、ＥＲＴ（たとえば、アルデュラザイム（商標）を用いて）を用いて、または肝臓に指向性を持つｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡ（
ＡＡＶ８カプシドを運ぶｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡ）を用いた追加の遺伝子治療を用いて達成
することができる。

【0100】

全身性送達に関連する臨床有効性の追加の測定には、たとえば、整形外科の測定、たとえば、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）によって測定される骨塩密度、骨塩量、骨の形状及び強度、骨密度；高さ（身長／年齢別臥位長についてのＺスコア）；骨代謝のマーカー；血清オステオカルシン（ＯＣＮ）及び骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＳ
ＡＰ）、コラーゲンＩ型のカルボキシ末端テロペプチド（ＩＣＴＰ）及びコラーゲンＩ型のカルボキシ末端テロペプチドα１鎖（ＣＴＸ）の測定；柔軟性及び筋力；６分間歩行試験を含むバイオデックス及び理学療法（バイオデックスＩＩＩ等速性筋力試験システムを用いて各参加者について膝及び肘での筋力を評価する）；能動的関節可動域（ＲＯＭ）；小児健康状態質問票／健康状態質問票（ＣＨＡＱ／ＨＡＱ）身体障害指標スコア；個々の心肺適応度をモニターするための筋電図（ＥＭＧ）及び／または酸素の利用；運動試験中のピーク酸素取り込み（ＶＯ２ピーク）；無呼吸・低呼吸指数（ＡＨＩ）；強制肺活量（ＦＶＣ）；左心室重量（ＬＶＭ）が挙げられてもよい。

【0101】

特定の実施形態では、患者にてＭＰＳ Ｉを診断する、及び／または治療する、または治療をモニターする方法が提供される。方法には、ＭＰＳ Ｉを有することが疑われるヒト患者から脳脊髄液または血漿の試料を得ることと、試料にてスペルミンの濃度レベルを検出することと、１ｎｇ／ｍＬを超えるスペルミン濃度を有する患者にてＭＰＳ Ｉから選択されるムコ多糖症であると患者を診断することと、たとえば、本明細書に記載されているような用具を用いて本明細書で提供されるように診断された患者に有効量のヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）を送達することとが関与する。

【0102】

別の態様では、方法にはＭＰＳ Ｉ治療法をモニターし、調整することが関与する。そのような方法には、ＭＰＳ Ｉについて治療を受けているヒト患者から脳脊髄液または血漿の試料を得ることと、質量スペクトル分析を行うことによって試料におけるスペルミンの濃度レベルを検出することと、ＭＰＳ Ｉ治療剤の投薬レベルを調整することとが関与する。たとえば、「正常な」ヒトスペルミン濃度は脳脊髄液では１ｎｇ／ｍＬ以下である。しかしながら、未治療のＭＰＳ Ｉを有する患者は２ｎｇ／ｍＬを超えて約１００ｎｇ／ｍＬまでのスペルミン濃度レベルを有してもよい。もし、患者が正常レベルに近づくレベルを有するのであれば、併用ＥＲＴの投薬を減らしてもよい。逆に患者が所望より高いスペルミンのレベルを有するのであれば、さらに高い用量または追加の治療法、たとえばＥＲＴが患者に提供されてもよい。

【0103】

スペルミン濃度は好適なアッセイを用いて決定されてもよい。たとえば、Ｊ．Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｌｏｐｅｚ，ｅｔ ａｌ， “Ｕｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｓ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｉｏｎ ｐａｉｒ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，”Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７（２００９）：５９２－５９８，オンラインで利用可能，２００９年２月２８日；ＭＲ．Ｈａｋｋｉｎｅｎ，ｅｔ ａｌ，“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｕｎｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，Ｊ.Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｃ．Ａｎａｌｙｓｉｓ，４４（２００７）：
６２５－６３４に記載されているアッセイ、定量的同位元素希釈液体クロマトグラフィ（ＬＣ）／質量分光分析（ＭＳ）アッセイ。他の好適なアッセイが使用されてもよい。

【0104】

一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療剤の有効性は、早期の神経認知欠損を有するＭＰＳ Ｉの小児対象にて投与の５２週後に神経認知を評価することによって判定される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療剤の有効性は、ＭＰＳ
Ｉ患者にてＣＳＦのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の神経認知との関係を評価することによって判定される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療剤の有効性は、磁気共鳴画像解析（ＭＲＩ）によって、たとえば、灰白質及び白質及びＣＦＳ脳室の容量分析によって測定されるようなＭＰＳ Ｉ患者におけるＣＮＳへの物理的変化に対する治療剤の効果を評価することによって判定される。一部の実施形態では、本明細書に記
載されている治療剤の有効性は、ＭＰＳ Ｉ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清及び尿における生体マーカー（たとえば、ＧＡＧ、ＨＳ）に対する治療剤の薬物動態効果を評価することによって判定される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療剤の有効性は、ＭＰＳ Ｉ患者における生活の質（ＱＯＬ）に対する治療剤の影響を評価することによって判定される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療剤の有効性は、ＭＰＳ Ｉ患者における運動機能に対する治療剤の影響を評価することによって判定される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療剤の有効性は、ＭＰＳ Ｉ患者における成長及び発達の診査事項に対する治療剤の効果を評価することによって判定される。

【0105】

本明細書に記載されているｒＡＡＶベクターから発現されるように、ＣＳＦ，血清または他の組織にて検出されるとき、少なくとも約２％の発現レベルが治療効果を提供してもよい。しかしながら、さらに高い発現レベルが達成されてもよい。そのような発現レベルは正常で機能的なヒトＩＤＵＡレベルの２％から約１００％までであってもよい。特定の実施形態では、正常の発現よりも高いレベルがＣＳＦ，血清または他の組織にて検出されてもよい。

【0106】

特定の実施形態では、本明細書に記載されているＭＰＳ Ｉ及び／またはその症状を治療する、予防する及び／または改善する方法は、ハーラー対象のためのＢａｙｌｅｙの乳児発達スケールを用いて評価されるとき、治療された患者にて知能指数（ＩＱ）における有意な上昇を生じる。特定の実施形態では、本明細書に記載されているＭＰＳ Ｉ及び／またはその症状を治療する、予防する及び／または改善する方法は、ハーラー・シャイエ対象のためのＷｅｃｈｓｌｅｒ短縮版知能検査（ＷＡＳＩ）によって測定されるとき、治療された患者にて神経認知ＩＱにおける有意な上昇を生じる。特定の実施形態では、本明細書に記載されているＭＰＳ Ｉ及び／またはその症状を治療する、予防する及び／または改善する方法は、Ｂａｙｌｅｙの乳児発達スケールを用いて評価されるとき、治療された患者にて神経認知ＤＱにおける有意な上昇を生じる。

【0107】

特定の実施形態では、本明細書に記載されているＭＰＳ Ｉ及び／またはその症状を治療する、予防する及び／または改善する方法は、機能的なヒトＩＤＵＡレベルにて有意な上昇を生じる。特定の実施形態では、本明細書に記載されているＭＰＳ Ｉ及び／またはその症状を治療する、予防する及び／または改善する方法は、患者の血清、尿及び／または脳脊髄液（ＣＳＦ）の試料で測定されるとき、ＧＡＧのレベルにて有意な上昇を生じる。

【0108】

５．３．併用療法
ｈＩＤＵＡの全身性送達を伴うＣＮＳへのｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡの遺伝子治療送達の併
用は本発明の方法によって包含される。全身性送達はＥＲＴ（たとえば、アルデュラザイム（登録商標）を用いて）、または肝臓に指向性を持つｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡ（ＡＡＶ８
カプシドを持つｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡ）を用いた追加の遺伝子治療が伴われ得る。

【0109】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡの髄内投与は、たとえば、肝臓を指向す
る第２のＡＡＶ.ｈＩＤＵＡ注入と共に同時投与される。そのような例では、ベクターは
同一であってもよい。たとえば、ベクターは同じカプシド及び／または同じベクターゲノム配列を有してもよい。或いは、ベクターは異なってもよい。たとえば、ベクターストックのそれぞれは異なる調節性配列（たとえば、異なる組織特異的プロモータを伴うそれぞれ）、たとえば、肝臓特異的なプロモータ及びＣＮＳ特異的なプロモータと共に設計されてもよい。さらにまたは代わりに、ベクターストックのそれぞれは異なるカプシドを有してもよい。たとえば、肝臓に向けられるベクターストックは、とりわけ、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８、ｒｈ１０、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶｄ
ｊから選択されるカプシドを有してもよい。そのような投薬計画では、各ベクターストックの用量は、髄内で送達されるベクターの合計が約１×１０^８ＧＣ～１×１０^１４ＧＣの範囲内であるように調整されてもよく；他の実施形態では、双方の経路によって送達される組み合わせたベクターが１×１０^１１～１×１０^１６の範囲内である。或いは、各ベクターは約１０^８ＧＣ～約１０^１２ＧＣ／ベクターの量で送達されてもよい。そのような用量が実質的に同時に、または異なった時間に、たとえば、約１日～約１２週間離して、もしくは約３日～約３０日離して、もしくは他の好適な時に送達されてもよい。

【0110】

一部の実施形態では、患者は肝臓指向型の注入と髄内注入を介してＡＡＶ.ｈＩＤＵＡ
を同時投与される。一部の実施形態では、治療方法は、（ａ）ＭＰＳ Ｉ及び／またはハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群及びシャイエ症候群に関連する症状を有する患者に十分量のｈＩＤＵＡ酵素または肝臓を指向するｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡを投与して導入
遺伝子に特異的な寛容を誘導することと、（ｂ）患者のＣＮＳにｒＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡ
を投与することとを含み、ｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡは患者にて治療レベルのｈＩＤＵＡの発
現を指向する。

【0111】

さらなる実施形態では、ＭＰＳ Ｉ及び／またはハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群及びシャイエ症候群に関連する症状を有する患者を十分量のｈＩＤＵＡ酵素または肝臓を指向するｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡによって寛容化して導入遺伝子特異的な寛容を誘導
し、その後、ＣＮＳ指向性のｒＡＡＶが介在するｈＩＤＵＡの患者への送達が続くことが関与する、ＭＰＳ Ｉ及び／またはハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群及びシャイエ症候群に関連する症状を有するヒト患者を治療する方法が提供される。特定の実施形態では、たとえば、患者が４週齢未満（新生児段階）または乳児である場合、患者をｈＩＤＵＡに対して寛容化するために患者は肝臓指向型の注入を介してｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡ
を投与され、患者が乳児、小児及び／または成人である場合、患者は髄内注入を介してその後ｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡが投与され、ＣＮＳにて治療濃度のｈＩＤＵＡを発現させる。

【0112】

一例では、ＭＰＳ Ｉ患者は、出生の約２週間以内、たとえば、約０日～約１４日以内、または約１日～１２日、または約３日～約１０日以内、約５日～約８日以内に患者にｈＩＤＵＡを送達することによって寛容化され、すなわち、患者は新生児である。他の実施形態では、年長乳児が選択されてもよい。ｈＩＤＵＡの寛容化用量はｒＡＡＶを介して送達されてもよい。しかしながら、別の実施形態では、用量は酵素の直接送達（酵素補充療法）によって送達されてもよい。チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞にて組換えｈＩＤＵＡを、及びタバコ細胞［ＬＨ Ｆｕ，ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，（Ｉｍｐａｃｔ Ｆａｃｔｏｒ：３．６１）．１２／２００９；１７７（６）：６６８－６７５］にてまたは植物種子［Ｘ Ｈｅ，ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０１３，Ｄｅｃ；１１（９）：１０３４－１０４３］にて可溶性ｈＩＤＵＡを作る方法は文献に記載されている。

【0113】

さらに、組換えｈＩＤＵＡはアルデュラザイム（登録商標）（ラロニダーゼ）として商業的に製造されており、抗ヒトインスリン受容体モノクローナル抗体とα－Ｌ－イズロニダーゼの融合タンパク質［ＡＧＴ－１８１；ＡｒｍａＧｅｎ，Ｉｎｃ］が有用であってもよい。現在あまり好まれてはいないが、酵素は「裸の」ＤＮＡ、ＲＮＡまたは別の好適なベクターを介して送達されてもよい。一実施形態では、酵素は患者の静脈内に及び／または髄内に送達される。別の実施形態では、投与の別の経路が使用される（たとえば、筋肉内、皮下等）。一実施形態では、寛容化のために選択されるＭＰＳ Ｉ患者は寛容化投薬の開始に先立って検出可能な量のｈＩＤＵＡを発現することはできない。組換えヒトＩＤＵＡ酵素が送達される場合、髄内ｒｈＩＤＵＡ注入は、注入（たとえば、静脈内または髄内）当たり約０．５８ｍｇ／ｋｇ体重または約０．２５ｍｇ～約２ｍｇの合計ｒｈＩＤＵＡから成ってもよい。たとえば、３ｃｃの酵素（たとえば、およそ１．７４ｍｇのアルデ
ュラザイム（登録商標）（ラロニダーゼ））は９ｃｃの合計注入のために６ｃｃのエリオットＢ（登録商標）によって希釈される。或いは、さらに多いまたはさらに少ない用量が選択される。同様に、ベクターから発現される場合、低い発現タンパク質のレベルが送達されてもよい。一実施形態では、寛容化のために送達されるｈＩＤＵＡの量は治療上有効な量よりも少ない。しかしながら、他の用量が選択されてもよい。

【0114】

通常、寛容化用量の投与に続いて、たとえば、寛容化投薬ののち約３日～約６ヵ月以内に、さらに好ましくは寛容化投薬ののち約７日～約１ヵ月以内に、治療用量が対象に送達される。しかしながら、さらに長いまたはさらに短い待ち時間であってもよいように、これらの範囲内で他の時点が選択されてもよい。

【0115】

ベクター投与の前に、最中に及び／またはそれに続いて、代替として、免疫抑制療法がベクターに加えて与えられてもよい。免疫抑制療法には、上記に記載されているように、プレドニゾロン、ミコフェノレートモフェチル（ＭＭＦ）及びタクロリムスまたはシロリムスを挙げることができる。以下に記載されているタクロリムスを含まない投薬計画が好まれてもよい。

【0116】

５．４．製造
本発明は本明細書に記載されている（以下の実施例５）ｒＡＡＶ.ｈＩＤＵＡ医薬組成
物の製造を提供する。説明に役立つ製造プロセスは図１１に提供されている。ｒＡＡＶ.
ｈＩＤＵＡベクターは図１１に示すフローチャートで示すように製造することができる。手短には、好適な細胞培養によって細胞を製造する（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞）。本明細書に記載されている遺伝子治療のベクターを製造する方法には、遺伝子治療のベクターの作製に使用されるプラスミドＤＮＡの生成、ベクターの生成及びベクターの精製のような当該技術で周知の方法が含まれる。一部の実施形態では、遺伝子治療のベクターはＡＡＶベクターであり、生成されるプラスミドは、ＡＡＶゲノムと対象とする遺伝子とをコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶトランス－プラスミド、及びアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成のプロセスは、たとえば、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞への形質移入、形質移入後の無血清培地への培地交換、及びベクター含有細胞及び培養培地の回収のような方法工程を含むことができる。回収されたベクター含有細胞及び培養培地は本明細書では粗細胞回収物と呼ばれる。

【0117】

粗細胞回収物はその後、たとえば、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物の透析濾過、ベクター回収物のマイクロ流動化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、流動化された中間体の濾過、クロマトグラフィによる粗精製、超遠心による粗精製、接線流濾過による緩衝液交換、及び／または大量のベクターを調製するための製剤化及び濾過のような方法工程に供されてもよい。

【0118】

高塩濃度での２段階アフィニティクロマトグラフィ精製とそれに続くアニオン交換樹脂クロマトグラフィを用いてベクター薬剤生成物を精製し、中空カプシドを取り除く。これらの方法は、参照によって本明細書に組み入れられる２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０及びその優先権書類である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願番号６２／３２２，０７１及び２０１５年１２月１１日に出願され、「ＡＡＶ９についての拡張可能な精製法」と題する同６２／２２６，３５７にてさらに詳細に記載されている。ＡＡＶ８についての精製法、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６及びその優先権書類である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願番号６２／３２２，０９８及び２０１５年１２月１１日に出願された６２／２６６，３４１及びｒｈ１０、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３及びその優先
権書類である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願番号６２／３２２，０５５、及び「ＡＡＶｒｈ１０についての拡張可能な精製法」と題する、２０１５年１２月１１日に出願された同６２／２６６，３４７、ならびにＡＡＶ１については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４及びその優先権書類である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願番号６２／３２２，０８３及び「ＡＡＶ１についての拡張可能な精製法」と題する、２０１５年１２月１１日に出願された同６２／２６，３５１はすべて参照によって本明細書に組み入れられる。

【0119】

５．５．医薬組成物の脳脊髄液への送達のための装置及び方法
態様の１つでは、本明細書で提供されるベクターはこのセクションで提供され、実施例及び図１２にてさらに記載されている方法及び／または用具を介して髄内に投与されてもよい。代わりに、他の用具及び方法が選択されてもよい。方法は、患者の大槽の中にクモ膜下穿刺針を進める工程と、クモ膜下穿刺針の近位ハブに柔軟な配管の全長を接続し、柔軟な配管の近位末端に弁の出力ポートを接続する工程と、前記進める工程と接続する工程の後、患者の脳脊髄液で配管が自給されるのを可能にした後、ある量の等張溶液を含有する第１の容器を弁の水洗入口部に接続し、その後、ある量の医薬組成物を含有する第２の容器を弁のベクター入口部に接続する工程とを含む。第１と第２の容器を弁に接続した後、流体流動のための経路は弁のベクター入口部と出口部の間で開放され、医薬組成物がクモ膜下穿刺針を介して患者に注入され、医薬組成物を注入した後、流体流動のための経路は弁の水洗入口部と出口部の間で開放され、クモ膜下穿刺針を介して等張溶液が注入され、医薬組成物を患者のなかへ洗い流す。

【0120】

別の態様では、医薬組成物の嚢内送達のための用具が提供される。用具には、ある量の医薬組成物を含有する第１の容器と、等張溶液を含有する第２の溶液と、それを介して医薬組成物が用具から患者の大槽内の脳脊髄液の中に直接噴出されてもよいクモ膜下穿刺針とが含まれる。用具にはさらに、第１の容器に相互接続される第１の入口部と、第２の容器に相互接続される第２の入口部と、クモ膜下穿刺針に相互接続される出口部と、クモ膜下穿刺針を介して医薬組成物と等張溶液の流動を制御するルアーロックとを有する弁が含まれる。

【0121】

本明細書で使用されるとき、用語、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）は、身体構造の三次元画像が軸に沿って作製される一連の平面断面画像からコンピュータによって構築されるＸ線写真を指す。

【0122】

図１２で示すような装置または医療用具１０には、弁１６を介して相互接続される１以上の容器１２及び１４が含まれる。容器１２及び１４はそれぞれ、医薬組成物、薬剤、ベクターまたは類似の物質の新鮮な供給源及び生理食塩水のような等張溶液の新鮮な供給源を提供する。容器１２及び１４は流体の患者への注入を可能にする医療用具の任意の形態であってもよい。

【0123】

例として、各容器１２及び１４は注射器、カニューレ等の形態で提供されてもよい。たとえば、説明されている実施形態では、容器１２はある量の医薬組成物を含有する別個の注射器として提供され、本明細書では「ベクター注射器」と呼ばれる。単に例示の目的で、容器１２は約１０ｃｃの医薬組成物等を含有してもよい。

【0124】

同様に、容器１４は、ある量の生理食塩水溶液を含有する別個の注射器、カニューレ等の形態で提供されてもよく、「水洗注射器」と呼ばれてもよい。単に例示の目的で、容器１４は約１０ｃｃの生理食塩水溶液を含有してもよい。

【0125】

代替として、容器１２及び１４は注射器以外の形態で提供されてもよく、単一用具に統
合されてもよく、そのような統合された医療用注入用具は、一方が医薬組成物用であり、一方が生理食塩水溶液用である別個のチャンバーのペアを有する。また、チャンバーまたは容器のサイズは所望の量の流体を含有するように必要に応じて提供されてもよい。

【0126】

説明されている実施形態では、弁１６は旋回オスルアーロック１８を有する四方活栓として提供される。弁１６は容器１２と容器１４（すなわち、説明されている実施形態におけるベクター注射器及び水洗注射器）を相互接続し、旋回オスルアーロックは、弁１６を通る経路が容器１２及び容器１４のそれぞれに対して開放され、または閉鎖されるのを可能にする。このように、弁１６を通る経路は、ベクター注射器及び水洗注射器の双方に対して閉鎖されてもよいし、またはベクター注射器及び水洗注射器の選択された一方に対して開放されてもよい。四方活栓に対する代替として、弁は三方活栓または流体制御用具であってもよい。

【0127】

説明されている実施形態では、弁１６は延長配管２０または流体に対する類似の水路の全長の一方の端に接続される。配管２０は所望の長さまたは内部体積に基づいて選択されてもよい。単に例として、配管は長さ約６～７インチであってもよい。

【0128】

説明されている実施形態では、配管１２の反対側の端２２は、その次にクモ膜下穿刺針２６に接続されるＴ型コネクタ延長セット２４に接続される。例として、針２６は５インチの２２または２５ゲージのクモ膜下穿刺針であってもよい。加えて、選択肢として、クモ膜下穿刺針２６は、たとえば、３．５インチで１８ゲージの導入針のような導入針２８に接続されてもよい。

【0129】

使用中、クモ膜下穿刺針２６及び／または任意の導入針２８は大槽に向かって患者の中で患者の中に進めてもよい。針の前進の後、針２６及び／または２８及び関連組織（たとえば、腰部傍脊柱筋、骨、脳幹及び脊髄）の視覚化を可能にするコンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像を入手してもよい。針ハブにおける脳脊髄液（ＣＳＦ）の観察及び大槽内での針先端の視覚化によって正しい針の配置を確認する。その後、相対的に短い配管２０を挿入されたクモ膜下穿刺針２６に連結し、次いで四方活栓１６を配管２０の反対側の端に連結してもよい。

【0130】

上記の構築は患者のＣＳＦで「自給される」ようになるのを可能にする。その後、予め充填した生理食塩水の水洗注射器１４を四方活栓１６の水洗入口部に連結し、次いで医薬組成物を含有するベクター注射器を四方活栓１６のベクター入口部に連結する。その後、活栓１６の出力ポートをベクター注射器１２に対して開放し、ベクター弁及び構築装置を介して時間をかけて注射器の内容物をゆっくり患者に注入してもよい。単に例示の目的で、この時間はおよそ１～２分間であってもよく、及び／または望みの他の時間であってもよい。

【0131】

ベクター注射器１２の内容物を注入した後、連結された予め充填した水洗注射器１４を用いて所望の量の生理食塩水で活栓１６及び針構築を洗い流すことができるように、活栓１６における旋回ロック１８を第２の位置に回す。単に例として、必要に応じてさらに多いまたは少ない量が使用されてもよいが、１～２ｃｃの生理食塩水が使用されてもよい。生理食塩水は、医薬組成物がほとんどまたは全く構築用具には残らないように医薬組成物のすべてまたはほとんどが構築用具を介して患者の中に注入されるのを強いることを保証する。

【0132】

構築用具が生理食塩水で洗い流された後、針（複数可）、延長配管、活栓及び注射器を含む構築用具全体をゆっくり対象から取り外し、バイオハザード廃棄物容器または硬質容器（針（複数可）用）の中に廃棄するための外科用トレイに置く。

【0133】

最終的に嚢内（ＩＣ）処置につながってもよいスクリーニング過程は治験責任医師によって取り組まれてもよい。治験責任医師は、対象（または指定された介護人）が完全に情報を提供されるために、過程、処置、投与手順自体、及び可能性のある安全性のリスクすべてを記載してもよい。既往歴、併用薬物、身体検査、生命兆候、心電図（ＥＣＧ）及び臨床検査の結果が入手され、または実施され、ＩＣ処置のための対象の適格性のスクリーニング評価で使用するために、神経放射線科医、神経外科医、及び麻酔科医に提供される。

【0134】

適格性を再検討する適当な時間を持たせるために、以下の手順を最初のスクリーニング来診と試験来診に先立つ１週間までの間の任意の時間で行ってもよい。たとえば、「０日目」にガドリニウム（すなわち、ｅＧＦＲ＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）の有無での頭頚部の磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）が得られてもよい。頭頚部のＭＲＩに加えて、治験医師は屈曲／拡張試験を介した頸部のさらなる評価の必要性を判定してもよい。ＭＲＩプロトコールはＴ１、Ｔ２、ＤＴＩ、ＦＬＡＩＲ及びＣＩＮＥのプロトコール画像を含んでもよい。

【0135】

加えて、ＣＳＦの流動の適正な評価及びＣＳＦ空間の間での連絡の考えられる切断または欠如の特定を可能にする頭／頸のＭＲＡ／ＭＲＶが施設のプロトコールによって得られてもよい（すなわち、硬膜内／経硬膜手術の既往を持つ対象は除外されてもよく、またはさらなる検査（たとえば、放射線ヌクレオチド大槽造影法）を必要としてもよい）。

【0136】

神経放射線科医、神経外科医、及び麻酔科医は、利用できる情報（走査、既往歴、身体検査、臨床検査等）すべてに基づいてＩＣ処置のための各対象の適格性を最終的に議論し、決定する。気道、頸部（短縮した／肥厚した）及び頭部の可動域（頸部の屈曲の程度）の詳細な評価を提供する麻酔の手術前評価も「－２８日目」～「１日目」に得られてもよく、ＭＰＳ対象の特定の生理的ニーズに留意する。

【0137】

ＩＣ処置に先立って、ＣＴ室は存在する以下の設備及び薬物が存在することを確認するであろう：
成人の腰椎穿刺（ＬＰ）キット（施設によって供給される）；
ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の２２または２５ゲージ×３－７”のクモ膜下穿刺針（Ｑｕｉｎｃｋｅ ｂｅｖｅｌ）；
インターベンション医師の指示で使用される同軸導入針（クモ膜下穿刺針の導入用）；
旋回（回転）オスルアーロック付き四方小口径活栓；
メスルアーロックアダプター付きＴコネクタ延長セット（配管）、６．７インチのおよその長さ；
髄内投与用のオムニパック１８０（イオヘキソール）；
静脈内（ＩＶ）投与用のヨウ素化造影剤；
注入用の１％リドカイン溶液（成人ＬＰキットで供給されなければ）；
予め充填された生理食塩水（無菌）の１０ｃｃの水洗注射器；
Ｘ線不透過性マーカー（複数可）；
外科用調製器具／髭剃り用かみそり刃；
挿管された対象の適正な位置決めを可能にする枕／支持体；
気管内挿管器具、一般的な麻酔器及び人工呼吸器；
手術中の神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）器具（及び必要な人材）；ならびに
ベクターを含有する１０ｃｃの注射器；別個の調剤学マニュアルに従って調製され、ＣＴ／手術室（ＯＲ）の部屋に運ばれる。

【0138】

処置についてのインフォームドコンセントが確認され、カルテ及び／または試験ファイ
ルの中で文書化される。放射線科及び麻酔科のスタッフからの処置についての別個のコンセントが施設の要件によって得られる。対象は、施設の指針に従って適当な病院での看護ユニット内で配置される静脈内アクセス（たとえば、２つのＩＶアクセス部位）を有する。静脈内流体は麻酔科医の裁量で投与される。麻酔科医の裁量で及び施設の指針によって、対象は誘導され、適当な患者看護ユニット、保持領域または外科／ＣＴ処置室にて全身麻酔の投与と共に気管内挿管を受ける。

【0139】

腰椎穿刺を行い、先ず、５ｃｃの脳脊髄液（ＣＳＦ）を取り出し、その後、造影剤（オムニパック１８０）を髄内に注入して大槽の視覚化を助ける。対象の適当な位置決め操作を行って大槽への造影剤の拡散を促す。

【0140】

手術中の神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）器具を対象に取り付ける。対象は、腹臥位または側臥位にてＣＴスキャナー台の上に載せられる。運搬及び位置決めの間で対象の安全を確保するために適当なスタッフが存在しなければならない。適切と見なされれば、手術前の評価の間に安全であると判定される程度に頸部の屈曲を提供する方法で、及び位置決めの後で文書化される正常な神経生理学的モニターシグナルによって対象が位置決めされてもよい。

【0141】

以下のスタッフが現場で存在し、特定されることが確認されてもよい：処置を実施するインターベンション医師／神経外科医；麻酔科医及び呼吸器科技師（複数可）；看護師及び医師助手；ＣＴ（またはＯＲ）技師；神経生理学技師；及び施設コーディネーター。「タイムアウト」は合同委員会／病院のプロトコールによって完了させ、正しい対象、処置、部位、位置決め、及び室内で必要な器具すべての存在を検証してもよい。次いで主要現場治験医師はスタッフと共に彼／彼女が対象を準備することを進めてもよいことを確認してもよい。

【0142】

頭蓋底の下の対象の皮膚は適宜剃毛される。ＣＴスカウト画像を撮り、その後、必要であると見なされれば、インターベンション医師によるＩＶ造影剤を伴った処置前の計画ＣＴが続き、標的位置を局在化し、脈管構造を画像化する。標的部位（大槽）が特定され、針の軌跡が計画された後、皮膚を準備し、施設の指針のとおりに無菌の技法を用いて手術用覆布で覆う。インターベンション医師によって指示されたように標的皮膚の位置にＸ線不透過マーカーを置く。マーカーの下の皮膚は１％リドカインの浸潤を介して麻酔する。同軸導入針を使用する選択肢と共に、２２Ｇまたは２５Ｇのクモ膜下穿刺針を次いで大槽に向かって進める。

【0143】

針を進めた後、施設の器具を用いて実行可能な最も薄いＣＴスライスの厚さ（理想的には≦２．５ｍｍ）を用いてＣＴ画像を得る。針及び関連する軟組織（たとえば、腰部傍脊柱筋、骨、脳幹及び脊髄）の適正な視覚化を可能にすることが可能である最低放射線量を用いた連続ＣＴ画像が得られる。針ハブにおけるＣＳＦの観察及び大槽内での針先端の視覚化によって正しい針の配置を確認する。

【0144】

インターベンション医師は、ベクター注射器が滅菌野に近いが、その外側に位置することを確認する。ベクター注射器における医薬組成物を取り扱うことまたは投与することに先立って、手袋、マスク及び眼の保護が滅菌野内での処置を手助けするスタッフによって身に付けられる。

【0145】

延長配管が挿入されたクモ膜下穿刺針に取り付けられ、次いでそれは四方活栓に取り付けられる。この装置がいったん対象のＣＳＦによって「自給される」と、１０ｃｃの予め充填された生理食塩水の水洗注射器が四方活栓の水洗入口部に取り付けられる。次いでベクター注射器がインターベンション医師に提供され、四方活栓のベクター入口部に取り付
けられる。

【0146】

活栓の旋回ロックを第１の位置に置くことによって活栓の出口部がベクター注射器に対して開放された後、注入の間注射器のプランジャーに過剰な力をかけないように注意を払って、ベクター注射器の内容物をゆっくり（およそ１～２分にわたって）注入する。ベクター注射器の内容物が注入された後、活栓及び針の構築が取り付けられた予め充填された水洗注射器を用いて１～２ｃｃの生理食塩水で洗い流され得るように活栓の旋回ロックを第２の位置に回す。

【0147】

準備ができると、インターベンション医師は次いでスタッフに彼／彼女が装置を対象から取り外すことを注意喚起する。単一の動きで、針、延長配管、活栓及び注射器を対象からゆっくり取り外し、バイオハザード廃棄物容器または硬質容器（針用）の中に廃棄するための外科用トレイに置く。

【0148】

針の挿入部位は出血またはＣＳＦの漏出の兆候について調べ、治験医師によって指示されたように処理する。指示されたように、ガーゼ、外科用テープ及び／またはＴｅｇａｄｅｒｍ包帯を用いて部位を手当てする。次いで対象はＣＴスキャナーを出て、仰臥位でストレッチャーに乗る。運搬及び位置決めの間、対象の安全を確保するための適正なスタッフが存在する。

【0149】

麻酔が中断され、対象は麻酔後看護についての以下の施設の指針について看護される。神経生理的モニターを対象から取り外す。回復の間、対象が横たわるストレッチャーの頭部をやや高くすべきである（約３０度）。対象は施設の指針のとおりに好適な麻酔後看護ユニットに移される。対象が適正に回復した意識を有し、安定した状態にある後、彼／彼女はプロトコールが命じる評価のために適当なフロア／ユニットに収容されるであろう。神経学的な評価がプロトコールのとおりに続くであろうし、主任治験医師が病院及び研究スタッフと共同で対象の看護を監督する。

【0150】

一実施形態では、本明細書で提供される組成物の送達の方法は、患者の大槽にクモ膜下穿刺針を進める工程と、柔軟な配管の全長をクモ膜下穿刺針の近位ハブに接続し、弁の出力ポートを柔軟な配管の近位端に接続する工程と、前記進める工程と接続する工程の後及び配管が患者の脳脊髄液で自給されるのを可能にした後、ある量の等張溶液を含有する第１の容器を弁の水洗入口部に接続し、その後、ある量の医薬組成物を含有する第２の容器を弁のベクター入口部に接続する工程と、前記第１と第２の容器を弁に接続した後、弁のベクター入口部と出口部の間での流体流動の経路を開放し、クモ膜下穿刺針を介して医薬組成物を患者に注入する工程と、医薬組成物を注入した後、弁の水洗入口部と出口部を通る流体流動のための経路を開放し、クモ膜下穿刺針の中に等張溶液を注入して患者への医薬組成物を洗い流す工程とを含む。特定の実施形態では、方法はさらに、配管と弁をクモ膜下穿刺針のハブに接続する前に大槽内でクモ膜下穿刺針の遠位先端の正しい配置を確認することを含む。特定の実施形態では、確認する工程は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）によって大槽内でのクモ膜下穿刺針の遠位先端を視覚化することを含む。特定の実施形態では、確認する工程はクモ膜下穿刺針のハブにて患者の脳脊髄液の存在を観察することを含む。

【0151】

上記に記載されている方法では、弁は、ベクター入口部から出口部までの流動を可能にする一方で同時に水洗入口部を通る流動を遮断する第１の位置に、及び水洗入口部から出口部までの流動を可能にする一方で同時にベクター入口部を通る流動を遮断する第２の位置に回すように適合させた旋回ルアーロック付きの活栓であってもよく、その際、旋回ルアーロックは、前記医薬組成物が患者に注入される場合前記第１の位置に配置され、且つ前記医薬組成物が等張溶液によって前記患者の中に洗い流される場合前記第２の位置に配
置される。特定の実施形態では、等張溶液をクモ膜下穿刺針に注入して医薬組成物を患者の中に洗い流した後、クモ膜下穿刺針は、構築としての配管、弁及びそれに接続された容器と共に患者から引き出される。特定の実施形態では、弁は旋回オスルアーロック付き四方活栓である。特定の実施形態では、第１と第２の容器は別個の注射器である。特定の実施形態では、Ｔコネクタはクモ膜下穿刺針のハブに設置され、配管をクモ膜下穿刺針に相互接続する。任意で、クモ膜下穿刺針はクモ膜下穿刺針の遠位端で導入針を含む。クモ膜下穿刺針は５インチで２２または２４ゲージのクモ膜下穿刺針である。特定の実施形態では、導入針は３．５インチで１８ゲージの導入針である。

【0152】

特定の態様では、方法は、最少でも、ある量の医薬組成物を含有する第１の容器と；等張溶液を含有する第２の容器と；それを介して医薬組成物が用具から直接患者の大槽内の脳脊髄液に押し出されてもよいクモ膜下穿刺針と；第１の容器に相互接続される第１の入口部と第２の容器に相互接続される第２の入口部とクモ膜下穿刺針に相互接続される出口部とクモ膜下穿刺針を介した医薬組成物及び等張溶液の流動を制御するためのルアーロックとで構成される用具を利用する。特定の実施形態では、弁は、第１の入口部から出口部までの流動を可能にする一方で同時に第２の入口部を通る流動を遮断する第１の位置に、及び第２の入口部から出口部までの流動を可能にする一方で同時に第１の入口部を通る流動を遮断する第２の位置に回すように適合させた旋回ルアーロック付きの活栓である。任意で、弁は旋回オスルアーロック付き四方活栓である。特定の実施形態では、第１と第２の容器は別個の注射器である。特定の実施形態では、クモ膜下穿刺針は柔軟な配管の全長を介して弁に相互接続される。Ｔコネクタは配管をクモ膜下穿刺針に相互接続してもよい。特定の実施形態では、クモ膜下穿刺針は５インチで２２または２４ゲージのクモ膜下穿刺針である。特定の実施形態では、用具はさらにクモ膜下穿刺針の遠位端に接続される導入針を含む。任意で、導入針は３．５インチで１８ゲージの導入針である。

【0153】

この方法及びこの用具はそれぞれ任意で、本明細書で提供されている組成物の髄内送達に使用されてもよい。代わりに、他の方法及び送達がそのような髄内送達に使用されてもよい。

【0154】

以下の実施例は説明の役立つのみであり、本明細書に記載されている本発明での限定ではない。

【実施例0155】

実施例１：ヒト対象の治療のためのプロトコール
この実施例はＭＰＳ Ｉを有する患者のための遺伝子治療の処置に関する。この実施例では、遺伝子治療のベクターである、野生型のｈＩＤＵＡ酵素をコードする修飾されたｈＩＤＵＡ遺伝子を発現する複製欠損のアデノ随伴ウイルスベクター９であるＡＡＶ９.Ｃ
Ｂ７.ｈＩＤＵＡがＭＰＳ Ｉ患者の中枢神経系（ＣＮＳ）に投与される。ＡＡＶベクタ
ーの用量が全身麻酔下でＣＮＳに直接注入される。本明細書に記載されているように、神経認知の発達及び／または生体マーカーを含む代理マーカーの臨床測定、たとえば、対象のＣＳＦまたは血清における病原性ＧＡＧ及び／またはヘキソサミニダーゼの濃度の低下を用いて治療の有効性を評価する。

【0156】

Ａ．遺伝子治療のベクター
説明に役立つ遺伝子治療のベクターであるＡＡＶ９.ＣＢ.ｈＩＤＵＡが実施例３に記載されている。導入遺伝子のカセットからの発現は、ＣＭＶの前初期エンハンサ（Ｃ４）とニワトリのβアクチンプロモータのハイブリッドであるＣＢ７プロモータによって推進される一方で、このプロモータからの転写はニワトリのβアクチンのイントロン（ＣＩ）の存在によって増強される。発現カセットのためのポリＡシグナルはＲＢＧポリＡである。ベクターは製剤緩衝液（エリオットＢ溶液、０．００１％プルロニックＦ６８）に懸濁さ
れる。製造過程は以下の実施例５にて詳細に記載されている。

【0157】

Ｂ．投薬及び投与の経路
１８歳以上である患者は、１．４×１０^１３ＧＣ（１．１×１０^１０ＧＧ／脳質量ｇ）（低用量）または７．０×１０^１３ＧＣ（５．６×１０^１０ＧＣ／脳質量ｇ）（高用量）のｒＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡの単回の髄内／嚢内投与を受ける。ベクターの投与については、患者は全身麻酔下に置かれる。腰椎穿刺を行い、先ず５ｃｃのＣＳＦを取り出し、続いてＩＴで造影剤を注入して大槽の視覚化を助ける。ＣＴ（造影剤による）を利用して針の挿入及び後頭下の空間へのｒＡＡＶ９.ＣＢ７.ｈＩＤＵＡの投与を導く。ベクターに加えて免疫抑制療法が付与されてもよい。免疫抑制療法には、プレドニゾロン（－２～８日目での６０ｍｇのＰＯ ＱＤ）、ＭＭＦ（－２～６０日目での１ｇＰＯ ＢＩＤ）及びシロリムス（－２日目の６ｍｇＰＯ、次いで－１日目から４８週目の来診まで２ｍｇＱＤ）が挙げられる。シロリムス用量の調整を行って１６～２４ｎｇ／ｍＬ以内の全血トラフ濃度を維持することができる。ほとんどの対象では、用量投与は方程式：新しい用量＝現在の用量×（標的濃度／現在の濃度）に基づくことができる。対象は、濃度のモニタリングによるさらなる投与量の調整の前に少なくとも７～１４日間新しい維持用量を継続すべきである。好中球減少症が発生すれば（好中球の絶対数＜１．３×１０^３μＬ）、ＭＭＦ投薬を中断するまたは用量を減らすべきである。任意で、患者は静脈内酵素補充療法（ＥＲＴ、たとえば、アルデュラザイム（商標）［ラロニダーゼ］）の安定な投薬計画、と同様に対処療法（たとえば、理学療法）にとどまることが許され得る。重篤な有害事象には、「Ｈｙの法則」と呼ばれる約３×ＵＬＮのＡＬＴ及び約２×ＵＬＮのビリルビン（＞３５％直接）として定義される高ビリルビン血症を伴う、考えられる薬剤誘発の肝障害が挙げられてもよい。

【0158】

以下の治療上有効な平坦用量が指示した年齢群の患者に投与される。
・新生児：約３．８×１０^１２～約１．９×１０^１４ＧＣ；
・３～９ヵ月：約６×１０^１２～約３×１０^１４ＧＣ；
・９～３６カ月：約１０^１３～約５×１０^１４ＧＣ；
・３～１２歳：約１．２×１０^１３～約６×１０^１４ＧＣ；
・１２歳以上：約１．４×１０^１３～約７．０×１０^１４ＧＣ；
・１８歳以上（成人）：約１．４×１０^１３～約７．０×１０^１４ＧＣ。

【0159】

患者に投与されるｒＡＡＶ９.ＣＢ７.ｈＩＤＵＡの用量から中空カプシドが確実に取り除かれるために、本明細書の実施例５にて考察されるように、塩化セシウムの勾配超遠心によって、またはベクター精製過程の間のイオン交換クロマトグラフィによって中空カプシドをベクター粒子から分離する。

【0160】

Ｃ．患者亜集団
好適な患者には、
血漿、線維芽細胞または白血球で測定されたとき酵素活性によって確認されたＭＰＳ
Ｉの文書化された診断を有するもの；
他の神経学的なまたは精神医学的な因子によって説明できなければ、以下：ＩＱ検査の平均値を下回る２：１標準偏差のスコアもしくは神経心理学的機能（言語の理解力、記憶、注意または知覚的推論）の１ドメインにおけるスコアのいずれかとして定義されるＭＰＳ Ｉによる早期の神経認知欠損の文書化された証拠（カルテ）、
逐次試験における１標準偏差を上回る低下の文書化された歴史的証拠（カルテ）を有するもの；
補助具の有無にかかわらず、試験日に該当する場合、必要とされるプロトコール試験を完成させ、進んで補助具を装用することに従うのに十分な聴覚能力及び視覚能力を有するものが挙げられてもよく、
任意で、少なくとも６ヵ月間のＥＲＴ（たとえば、アルデュラザイム（登録商標）［ラロニダーゼ］ＩＶ）の安定な投薬計画上にある。

【0161】

治療に先立って、患者はスクリーニングされ、以下基準の１以上は、この治療法が患者にとって好適ではないことを示してもよい。
・以下のいずれかを含むＩＣ注入について禁忌を有する：
ベースラインＭＲＩ検査の見直しがＩＣ注入の禁忌を示す
ＩＣ注入の禁忌を生じる以前の頭部／頸部の手術の既往
ＣＴ（または造影剤）または全身麻酔に対する禁忌を有する
ＭＲＩ（またはガドリニウム）に対する禁忌を有する
＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）を有する
・ＭＰＳ Ｉに起因しない神経認知欠損または神経精神病の状態を有する
・シロリムス、ＭＭＦまたはプレドニゾロンに対する過敏性反応の既往を有する
・免疫抑制療法について適当ではない状態（たとえば、＜１．３×１０^３／μＬの好中球の絶対数、＜１００×１０^３／μＬの血小板数及び＜１２ｇ／ｄＬ［男］または＜１０ｇ／ｄＬ［女］のヘモグロビン）を有する
・腰椎穿刺に対する禁忌を有する
・ＨＳＣＴを受けている
・治療の前６ヵ月以内にＩＴ投与を介してラロニダーゼ投与を受けていた
・どこかの時点でラロニダーゼＩＴ投与を受け、患者を過度のリスクに置くＩＴ投与に関連すると見なされる有意な有害事象を経験した
・治療の前少なくとも３ヵ月間完全寛解になっていない、リンパ腫の既往、または皮膚の有棘細胞癌または基底細胞癌以外の別の癌の既往
・患者がギルバート症候群の以前既知の既往症及び総ビリルビンの＜３５％の結合ビリルビンを示す分画ビリルビンを有さない限り、＞３×正常の上限（ＵＬＮ）のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）または＞１．５×ＵＬＮの総ビリルビン
・ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）陽性検査の既往、活動型または再発性のＢ型肝炎またはＣ型肝炎、またはＢ型肝炎、Ｃ型肝炎またはＨＩＶの陽性スクリーニング検査の既往
・妊娠中、出産後＜６週、母乳授乳中、または妊娠を計画中（自己またはパートナー）
・治療の前１年以内のアルコールまたは薬物の乱用の既往
・患者の安全を脅かす深刻なまたは不安定な医学的または心理学的な状態を有する。
・制御不良の発作。

【0162】

好適な患者には
・新生児
・３～９ヵ月齢
・９～３６ヵ月齢
・３～１２歳
・１２歳以上
・１８歳以上の年齢での男女の対象が挙げられる。

【0163】

Ｄ．臨床目的を評価すること
主要な臨床目的には、ＭＰＳ Ｉ欠損に関連する神経認知の低下を防ぐこと及び／または任意で元に戻すことが挙げられる。臨床目的は、たとえば、ハーラーの対象についてＢａｙｌｅｙの乳児発達スケールによって測定されるような、またはハーラー・シャイエの対象についてＷＡＳＩによって測定されるような、知能指数（ＩＱ）を測定することによって判定される。神経認知の発達及び機能の他の適当な測定、たとえば、Ｂａｙｌｅｙの乳児発達スケール（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）を用いて発達指数（ＤＱ）を評価すること、Ｈｏｐｋｉｎｓ言語学習試験を用いて、及び／または注意変数試験（ＴＯＶＡ）を用いて記憶
を評価することが利用される。

【0164】

二次的な評価項目には、生体マーカー及び臨床転帰の評価が挙げられる。尿は、ＧＡＧ総含量と同様にＭＰＳ Ｉに特異的なｐＧＡＧについて評価される。血清は、ＩＤＵＡ活性、抗ＩＤＵＡ抗体、ｐＧＡＧ、ヘパリン補因子ＩＩ・トロンビン複合体の濃度について評価される。ＣＳＦは、ＩＤＵＡ活性、抗ＩＤＵＡ抗体、ヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘ）活性、及びｐＧＡＧについて評価される。ベクター（たとえば、ＡＡＶ９）に対する中和抗体及びＩＤＵＡに対する結合抗体の存在はＣＳＦ及び血清にて評価されてもよく、ベクターのカプシド（たとえば、ＡＡＶ９）に対するＴ細胞応答はＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価されてもよく、ＣＳＦ、血清及び尿におけるＩＤＵＡ発現の薬物動態と同様にベクターの濃度（ＡＡＶ９のＤＮＡに対するＰＣＲ）がモニターされてもよい。

【0165】

実施例２：新生仔の全身性ＡＡＶはＭＰＳ Ｉイヌ及び非ヒト霊長類にてＣＮＳ遺伝子治療に対する寛容を誘導する
この実施例は、イヌ及び非ヒト霊長類の双方において、新生仔におけるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いた肝指向型の遺伝子導入は導入遺伝子に対する免疫寛容の持続した状態を誘導し、中枢神経系（ＣＮＳ）を標的とするその後のベクター投与の有効性を実質的に改善することを実証している。このアプローチは、酵素α－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）の活性の欠損のための進行性のＣＮＳ疾患を特徴とするリソソーム蓄積症であるムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）のイヌモデルに適用された。１ヵ月齢のイヌにおける髄内ＡＡＶ送達を用いたＣＮＳを標的とする遺伝子導入はイヌＩＤＵＡに対する抗体の誘導を生じ、それは脳の病変の改善を部分的に減衰させた。１週齢にてイヌＩＤＵＡを発現しているベクターによって全身性に処理されたＭＰＳ Ｉイヌは酵素に対する抗体を発生させず、１ヵ月齢での髄内ＡＡＶ送達の際、ＣＮＳにて強固な発現を示し、脳の蓄積症の完全な是正を生じた。ヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶベクターで全身性に処理された新生仔アカゲザルは同様に導入遺伝子に対して寛容を発生し、劇的に高いＣＳＦでのＩＤＵＡの発生及びその後のＣＮＳでの遺伝子治療後の抗体誘導の非存在を生じた。これらの知見は、免疫学的な発達の決定的な期間の間に導入遺伝子に対する寛容を誘導することによって遺伝子治療の有効性及び安全性を改善する可能性を示唆している。

【0166】

Ａ．材料及び方法
１．ベクターの作製
被験物質は、ニワトリβアクチンプロモータ（ＣＢ７）とキメライントロン（ＣＩ）とコドンを最適化させたイヌＩＤＵＡ導入遺伝子（ｃＩＤＵＡ）とポリアデニル化シグナル（ＲＢＧ）から成る発現カセットをパッケージするＡＡＶ９のカプシドから成った。発現構築物にはＡＡＶ血清型２の逆方向末端反復が隣接した。このベクターは、ＡＡＶ２／９．ＣＢ７．ＣＩ．ｃＩＤＵＡ．ＲＢＧまたはＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｃＩＤＵＡ．ＲＢＧと名付けられる。一部の動物は新生仔のとき異なるベクターによって静脈内で処理されてイヌＩＤＵＡタンパク質に対する寛容を誘導した。このベクターは、肝臓特異的な甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモータ（ＴＢＧ）と人工イントロン（ＰＩ）とコドンを最適化させたイヌＩＤＵＡ導入遺伝子（ｃＩＤＵＡ）とポリアデニル化シグナル（ＲＢＧ）から成る発現カセットをパッケージするＡＡＶ８のカプシドから成った。発現構築物にはＡＡＶ血清型２の逆方向末端反復が隣接した。ベクターは２９３細胞の三重形質移入によって作製し、以前記載された［Ｌ．Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，２２，１３８９－１４０１，（２０１１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＮｏｖ］ようなイオジキサノール勾配で精製した。

【0167】

２．動物
ＭＰＳ Ｉイヌのコロニーは、研究における動物の飼育及び使用に関するＮＩＨ及びＵＳＤＡのガイドラインのもとでペンシルベニア大学獣医学部で維持された。ＭＰＳ Ｉイ
ヌの試験プロトコールはすべてペンシルベニア大学の施設内実験動物委員会によって承認された。新生仔ＭＰＳ Ｉイヌにおけるベクター注入については、ＡＡＶ８ベクターを０．５～１ｍＬの無菌生理食塩水にて希釈し、頸静脈を介して注入した。ＡＡＶ９ベクターの髄内注入及びＣＳＦの回収は、以前記載された［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｏｒｒｅｃｔｓ ＣＮＳ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ Ｆｅｌｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ Ｉ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪｕｌ，１６］ような後頭下のアプローチを介して行った。合計９匹のＭＰＳ Ｉイヌがこの研究に含まれた。遺伝子型はＰＣＲ及び血清の酵素アッセイによって出生時に確認した。６匹のイヌが、１日齢（Ｎ＝３）または７日齢（Ｎ＝３）でＡＡＶ血清型８ベクター（５×１０^１２ゲノムコピー／ｋｇ［ＧＣ／ｋｇ］体重）のＩＶ注入を投与された。１匹は出生後３日で死亡した。処理した残り５匹の動物と同様に３匹の未処理のＭＰＳ Ｉイヌを１ヵ月齢で髄内ＡＡＶ９（１０^１２ＧＣ／ｋｇ）によって処理した。最初の７週齢まで毎週、その後毎月、血液を末梢血管から採取した。ＣＳＦ（１ｍＬ）は、髄内注入のとき（１ヵ月齢）、注入の７及び２１日目、及びその後毎月採取した。ナトリウムペントバルビタール８０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）の投与によって安楽死を行った。５匹の動物は９ヵ月齢で安楽死させ、残りは１１カ月齢で安楽死させた。未処理のＭＰＳ Ｉ及び対照は６ヵ月齢～２６カ月齢の間で安楽死させた。組織を採取し、以前記載［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，２０１４］されたように処理した。

【0168】

動物福祉法に準拠する動物の処置はすべて実施に先立ってカリフォルニア大学デービス校の実験動物委員会によって承認された。動物飼育に関する活動はカリフォルニア国立霊長類研究センターの操作手順に従って実施した。正常な周期の成熟メスのアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ；Ｎ＝４）を、確立された方法［ＡＦ Ｔａｒａｎｔａｌ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｉｍａｔｅ．（２００５），ｐｐ．３１７－３５２］を用いて繁殖させ、妊娠として特定した。研究のために選択された母親はすべて予めスクリーニングしてそれらがＡＡＶ抗体について血清反応陰性であることを保証した。妊娠中、胎仔を超音波でモニターして正常な発育及び発生を確認し［ＡＦ Ｔａｒａｎｔａｌ（２００５）］、確立されたプロトコール［Ａ．Ｆ．Ｔａｒａｎｔａｌ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２，８７－９８（２００５）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪｕｌ］に従って予定日（１６０±２日の妊娠）に帝王切開によって新生仔を分娩させた。新生仔を分娩後保温器に入れ、研究のために人工保育した。確立したプロトコールに従って新生仔室にて乳児の健康、食物摂取及び体重を毎日または毎週（年齢に応じて）記録した。全動物が出生した時点で選択されたＡＶＶベクターＩＶを投与した。出生後１ヵ月目及びその後毎月の起点で（導入の２ヵ月後まで、今まで）、すべて無菌条件下にてＣＳＦの採取（約０．５ｍＬ；注入前、次いで毎週または毎月）及び髄内注入に備えて乳児動物は、ケタミン（筋肉内で１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）とデクスメデトミジン（０．０１５～０．０７５ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）によって鎮静状態にした（約０．５ｍＬ、ＣＳＦ採取後１か月及び直ちに）。ＣＢＣ及び臨床検査パネルをモニターするために及び血清や血漿を採取するために末梢血管から血液試料（約３～６ｍＬ）を出生時、次いで毎月採取した。試料採取が完了した際、デクスメデトミジンに匹敵する用量で反転アチパメゾールをＩＭで与えた。

【0169】

ＤＮＡを組織から単離し、記載されている［Ｌ．Ｗａｎｇ，２０１１］ようなＴａｑＭａｎＰＣＲによってベクターゲノムを定量した。ＩＤＵＡ及びＨｅｘの活性についてのアッセイは記載されている［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，２０１４］ように行った。

【0170】

ＣＳＦのｐＧＡＧの測定は、以前記載された方法［Ｒ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ｅｔ ａｌ
，Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，８，１９７－２０４（２０１２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＦｅｂ］を用いてカリフォルニア大学サンディエゴ校のＧｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅによって実施された。手短には、ＣＳＦ試料からＧＡＧを抽出し、ヘパリナーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩで二糖類に消化した。還元カップリングによるアニリン^１２Ｃで二糖類にタグを付け、それをスピードバックで乾燥させた。乾燥させた試料をＬＣ－ＭＳ等級の水にて再構成し、既知の濃度のアニリン^１２Ｃでタグを付けた標準に混ぜ合わせた。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステムを備えたＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙエレクトロスプレーイオン化質量分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて試料を解析した。

【0171】

イヌＩＤＵＡに対する抗体についてのＥＬＩＳＡは、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモータの制御下でイヌｃＤＮＡに含有される発現構築物及びｃＩＤＵＡタンパク質がＨｕｈ７細胞で産生されることを除いて、記載されている［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，２０１４］ように実施した。使用された検出抗体はＨＲＰを結合したヒツジ抗イヌ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）だった。アカゲザルにおけるヒトＩＤＵＡに対する抗体についてのアッセイは、アルデュラザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）１０μｇ／ｍＬをコーティング抗原に使用し、検出抗体がポリクローナルヤギ抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）であったことを除いて同一だった。

【0172】

ＭＰＳ Ｉイヌの脳の組織学的な解析は、ＧＭ３について陽性のニューロン、コレステロール及びＬＩＭＰ２の蓄積を定量するための以下の改変と共に以前記載された［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，２０１４］ように実施し；ＬＩＭＰ２及びフィリピンで染色した大脳皮質の切片の画像は、層Ｉ（分子層）と層ＩＩの間の境界が画像の上縁を形成するように１０×の対物レンズで撮影した。各動物から合計１０枚の画像を取得した。ＧＭ３で染色した脳の切片の画像は、脳の分子層を含む大脳皮質表面に直下の領域から４×対物レンズで撮影した。各動物からの７枚の画像を解析した。画像はすべて以前記載された［Ｍ．Ａｌｄｅｎｂｏｖｅｎ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１４，４８５－４９８（２００８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＭａｙ］ように「閾値」及び「粒子を解析する」モジュールを用いてＩｍａｇｅＪソフトウエア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ． Ｓ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ；ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）によって処理した。

【0173】

Ｂ．結果
１．ＭＰＳ Ｉイヌにおける髄内ＡＡＶ９が介在する遺伝子導入の後のイヌＩＤＵＡに対する抗体の誘導
ＭＰＳ Ｉイヌモデルはヒト疾患の症状の多数を忠実に繰り返す［Ｅ．Ｋａｋｋｉｓ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８３，１６３－１７４（２００４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＳｅｐ－Ｏｃｔ；Ｒ．Ｍ．Ｓｈｕｌｌ，ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１１４，４８７－４９５（１９８４）］。これらの動物は、ＩＤＵＡの第１イントロンの保持を生じるスプライス部位の突然変異のせいで検出可能なＩＤＵＡ活性を有さない［Ｋ．Ｍｅｎｏｎ，ｅｔ ａｌ，（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１４，７６３－７６８（１９９２）］。これらの動物には検出可能なＩＤＵＡ発現がないことを考えて、これらの個体は一般に完全長ではないＩＤＵＡを産生する対立遺伝子を運び、そのタンパク質に対してそれらが免疫的に遭遇したことがないままであるので、我々はそれらが、ＭＰＳ Ｉの重篤形態の患者で生じる髄内遺伝子治療に対する免疫応答をモデル化することを予想した［Ｎ．Ｊ．Ｔｅｒｌａｔｏ，Ｇ．Ｆ．Ｃｏｘ，Ｃａｎ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ｔｙｐｅ
Ｉ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｂｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ’ｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅ？ Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５，２８６－２９４（２００３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪｕｌ－Ａｕｇ］。ＭＰＳ Ｉイヌの脳は、ニューロンにおけるＧＭ３のようなガングリオシドの広範な蓄積、と同様にコレステロールとＬＩＭＰ２を含むリソソームの膜タンパク質との異常な蓄積を含む、ＭＰＳ
Ｉに関連する特徴的な病態を示す［Ｒ．Ｍ．Ｓｈｕｌｌ，ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１１４，４８７－４９５（１９８４）］。ＭＰＳ Ｉイヌはまた、髄膜におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の顕著な蓄積を示し、一部のＭＰＳ Ｉ患者における脊髄圧迫に寄与する過程である有意な髄膜肥厚を生じる［Ｅ．Ｋａｃｈｕｒ，ｅｔ ａｌ，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，４７，２２３－２２８（２０００）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ
ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪｕｌ；Ａ．Ｔａｃｃｏｎｅ，ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２３，３４９－３５２（１９９３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＳｅｐ；Ｓ．Ｖｉｊａｙ，Ｊ．Ｅ．Ｗｒａｉｔｈ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ｔｙｐｅ Ｉ．Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ，９４，８７２－８７７（２００５）］。

【0174】

普遍型プロモータの制御下でイヌＩＤＵＡ配列を運ぶＡＡＶ９ベクターの髄内注入によって３匹のイヌを１ヵ月齢で先ず処理した。注入はすべての動物で上手く忍容され、研究全体にわたって臨床兆候は観察されなかった。ＣＳＦの分析は一般に平凡であり、ＣＳＦのリンパ球の軽度にすぎない一時的な上昇が２匹の動物で生じた。１匹の動物における単回のＣＳＦ試料は主として単球に似た細胞から成る顕著な髄液細胞増加症を示した。その後の穿刺は髄液細胞増加症の証拠を示さず、安楽死の時点では、処理した動物のいずれにおいても脳または脊髄にて炎症の組織学的な証拠はなかった。ベクターはＣＮＳ全体にわたって分布し、脳及び脊髄の分析した領域すべてにおける細胞に形質導入していた。動物はすべてＣＳＦにてＩＤＵＡの超生理学的な発現を示し、それは３ヵ月の経過にわたって１匹の動物では正常範囲に低下し、２匹では正常レベルを下回り、その後ＣＳＦの酵素レベルは動物を安楽死させるまで５ヵ月間、本質的に安定だった。臨床兆候、ベクターゲノムの喪失、または脳炎の組織学的な証拠が存在しないことは、ＣＳＦのＩＤＵＡ活性の低下が細胞傷害性Ｔリンパ球による形質導入された細胞の殺傷のせいではないことを示し、それはまた、持続的に残留するＣＳＦのＩＤＵＡ活性によっても支持された。代わりに、ＣＳＦのＩＤＵＡ活性の低下はイヌＩＤＵＡに対する高力価の抗体の誘導に関連した。

【0175】

Ｂ．新生仔遺伝子導入によるＩＤＵＡに対する寛容の誘導
ＭＰＳ ＩイヌにおいてイヌＩＤＵＡの新生仔発現がその酵素に対する免疫寛容を誘導し得るかどうかを判定するために、出生後１日目（Ｎ＝３）または７日目（Ｎ＝３）に肝臓選択性のプロモータからイヌＩＤＵＡを発現するＡＡＶ血清型８ベクターのＩＶ注入によって６匹のイヌを処理した。出生日に処理したイヌのうち１匹は処理の２日後に死亡した。生き残った新生仔のイヌは全体として未処理のＭＰＳ Ｉイヌについての病歴データに類似し、最初の２週齢でおよそ２０％の死亡率を有する［Ｖｉｔｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５，１４２３－１４３１（２００７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＡｕｇ］。ＭＰＳ Ｉイヌにおけるこの早期の死亡率の原因は究明されていない；この処理された動物では、死体の検視はＭＰＳ Ｉに典型的な全身性の病変と同様に全身性の細菌感染の可能な証拠を示した。処理した動物は血清ＩＤＵＡの上昇とそれに続く迅速な低下を明らかにした。こ
れは、新生仔における肝臓遺伝子導入に非統合性のベクターを利用する以前の研究における肝細胞の分裂の間でのベクターゲノムの喪失による一時的な発現の観察に一致する［Ｌ．Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，２３，５３３－５３９（２０１２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＭａｙ］。

【0176】

１ヵ月齢にて、１週齢でＩＶのＡＡＶ８投与を受けた５匹の生き残りのイヌに髄内アプローチを用いてＡＡＶ９ベクターを注入した。５匹の動物すべてが、ベクターの髄内注入に続いてＣＳＦにてＩＤＵＡの正常レベルの３０倍を超えるピークレベルを示し、未処理の動物で達成されるのものより３～１００倍高い長期のＣＳＦ酵素レベルだった。イヌＩＤＵＡに対する抗体が出生後１日目で処理されたイヌのＣＳＦでは検出できず、出生後７日目で処理された動物では検出限界をやや上回ったに過ぎなかったということは、双方の群における酵素に対する免疫寛容の状態を示唆している。

【0177】

２．ＭＰＳ ＩイヌのＣＮＳにおける生化学的な及び組織学的な異常の是正
リソソーム酵素であるヘキソサミニダーゼ（Ｈｅｘ）はＭＰＳ Ｉ動物の組織で上方調節され、脳組織及びＣＳＦの双方で上昇したＨｅｘ活性はＩＤＵＡ欠乏の下流で生じる異常な細胞性の過程についての有用なマーカーとして役立つ［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）］。ベクターの髄内送達のとき（生後約１ヵ月）のＣＳＦのＨｅｘ活性の測定は、ＭＰＳ Ｉイヌすべてにて異常に上昇したＨｅｘ活性を示した。髄内ＡＡＶ９のみで処理した動物はＨｅｘ活性で中程度の低下を示し、最高の残留ＩＤＵＡ発現を伴う動物のみが正常範囲のＨｅｘ活性に達した。新生仔で全身性の遺伝子導入によって処理され、その後ベクターの髄内投与を受けた５匹の動物はすべてＣＳＦのＨｅｘの完全な正常化を実証した。２匹の髄内の処理のみを受けた最低のＣＳＦのＩＤＵＡレベルの動物では効果はやや低下したが、脳組織試料におけるＨｅｘ活性はＣＳＦのＨｅｘよりも治療に大きな応答を示し、処理した動物すべてにおいて脳のＨｅｘ活性の実質的な低下を伴った。

【0178】

ＣＳＦにおけるＧＡＧ濃度は、ＩＤＵＡ欠乏のせいで蓄積する病的ＧＡＧ（ｐＧＡＧ）の非還元末端に特異的なアッセイを用いて測定した［Ｒ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ｅｔ ａｌ；Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，８，１９７－２０４（２０１２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＦｅｂ］。ＡＡＶの髄内注入の３週間後、動物はすべてＣＳＦのｐＧＡＧ濃度の顕著な低下を示した。ＩＤＵＡに対して免疫寛容ではないイヌは免疫寛容のイヌよりもＣＳＦの高い残留ｐＧＡＧ維持したが、この低下は１１２日目で持続していた。組織学的な解析は、未処理のＭＰＳ Ｉイヌの脳全体にわたる重度の蓄積病変を明らかにし、ＧＭ３、コレステロール及びＬＩＭＰ２の広範なニューロンでの蓄積を伴った。ＣＳＦでの最高のＩＤＵＡを伴う動物のみがニューロン蓄積の完全な解消を経験したが、髄内ＡＡＶ９のみで処理した動物は蓄積病変の実質的な改善を実証した。他の２匹の髄内処理したイヌは残留する蓄積病変を有した。新生仔でＡＡＶ８全身性の遺伝子導入によって処理され、その後ＡＡＶ９の髄内投与を受けた５匹のイヌすべてにおいてＣＮＳの蓄積病変は完全に元に戻った。脳実質における蓄積病変に加えて、未処理のＭＰＳ Ｉイヌはアルシアンブルー染色によって眼に見える髄膜にてＧＡＧの蓄積を示した。この髄膜のＧＡＧ蓄積及び結果として生じる髄膜の肥厚は外科的介入を必要とする脊髄圧迫の多数の症例に関与し、ＣＳＦ再吸収の正常な経路を妨害することによって一部のＭＰＳ Ｉ患者における交通性水頭症の発症に寄与する可能性もある。処理された動物はすべて髄膜のＧＡＧ蓄積での改善の証拠を示した。寛容のイヌすべて及び非寛容のイヌ１匹において髄膜はほぼ完全に正常であると思われた一方で、ＣＳＦの最低のＩＤＵＡ活性を持つ２匹の非寛容の動物は一部のＧＡＧ蓄積を保持した。

【0179】

３．新生仔アカゲザルにおけるヒトＩＤＵＡに対する寛容の誘導
ＭＰＳ Ｉイヌにおいて観察された免疫寛容誘導のための新生仔の時間帯が霊長類にて見いだされ得るかどうかを評価するために、新生仔アカゲザル（Ｎ＝４）にて類似の研究
を行った。これらの動物はＩＤＵＡ欠乏ではないので、ヒトＩＤＵＡ導入遺伝子を用いて、活性のある内在性遺伝子を欠いている患者にて種特異的な導入遺伝子に対して予想され得る免疫応答をモデル化した。２匹の新生仔アカゲザルに肝臓特異的なプロモータからヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ８ベクターをＩＶで出生時投与した。双方とも血清ＩＤＵＡ活性の一時的な上昇を明らかにした。２匹の追加の新生仔に無関係な導入遺伝子（ヒト第ＩＸ因子）を発現するＡＡＶ８ベクターをＩＶで出生時投与した。４匹の動物すべてに、１ヵ月齢で髄内注入によってヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９ベクターを投与した。ＭＰＳ Ｉイヌに類似して、ＩＤＵＡ未処理の動物は注入の３週間後、ＣＳＦのＩＤＵＡ活性の低下を示し、投与後２ヵ月までにほぼベースラインレベルに戻った。これらの動物はまたＣＳＦにおいて導入遺伝子特異的な抗体を発生した。出生時にＩＤＵＡ遺伝子導入をＩＶで投与した２匹の動物はＣＳＦにてヒトＩＤＵＡに対する抗体を発生させず、ＡＡＶ９の髄内投与の２ヵ月後、正常の１０倍を超える高いＣＳＦの酵素活性を維持した。動物はすべて研究期間の間、頑丈で健康のままであり、有害事象の証拠はなく、年齢に基づいて且つ既往対照と比べて正常な成長の軌跡、及び完全な血球数（ＣＢＣ）及び正常限界範囲内の生化学検査を伴った。

【0180】

Ｃ．考察
野生型の治療用タンパク質に対する免疫活性化は劣性疾患についての潜在的な懸念である。抗体は静脈内で送達される酵素の分布及び取り込みを妨害することができるので、タンパク質補充療法に対する抗体反応は一部のＬＳＤについて特に難易度が高い［Ｅ．Ｊ．Ｌａｎｇｅｒｅｉｓ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＯｃｔ，２９］。抗体は形質導入された細胞から分泌される酵素が介在する相互是正を妨害し得るので、抗体はこれらの疾患を標的とする遺伝子治療にとって同等に問題がある。

【0181】

この研究は、ＡＡＶ９の髄内送達がイヌのＣＮＳ全体にわたって細胞を効果的に標的とすることができ、大型動物の脳におけるＭＰＳ Ｉに関連する生化学的な及び組織学的な異常を是正するように十分な発現を達成する。ベクターの生体分布データは、脳における細胞当たり１未満のベクターゲノムがあることを示すということは、観察された蓄積病態における広範な軽減が分泌される酵素による交差是正のせいであることを示している。しかしながら、髄内ベクターのみで処理した３匹の動物のうち、２匹が十分に強固な抗導入遺伝子抗体反応を発生してＣＮＳの蓄積病変の完全な解消を妨げた。導入遺伝子に対する抗体誘導の後ＣＳＦでのほぼ正常なＩＤＵＡ活性を維持した動物のみがＣＮＳの遺伝子治療に対して完全な応答を示した。この結果から、ＣＳＦにおけるＩＤＵＡ活性は髄内遺伝子導入に続く有効性の理に適った予測因子であり、完全な治療利益にはほぼ正常なレベルが求められると結論付けられる。このことはＭＰＳ Ｉのネコにおける髄内遺伝子治療による我々の知見に一致している［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ（２０１４）］。ＭＰＳ Ｉのネコは一般にＭＰＳ Ｉイヌよりも髄内遺伝子導入に対して弱い抗体反応を示し、ＣＳＦのさらに安定したＩＤＵＡ活性を示す。ＭＰＳ Ｉのネコは不活性の変異体ＩＤＵＡを発現し、潜在的にその酵素に対してそれらを部分的に免疫寛容にしているので、これは２つのモデルにおける根底にある突然変異に関係してもよい。重要なことに、ＭＰＳ Ｉイヌにおける現在のデータは、イヌと同様に残留ＩＤＵＡ活性を有さない重篤な疾患のＭＰＳ Ｉ患者についてさえ、髄内遺伝子導入の後で生じる可能性がある抗導入遺伝子抗体反応は有害な臨床事象を生じず、抗体反応にもかかわらず、実質的な有効性は保持されることを示している。しかしながら、これらのデータはまた、ＣＮＳにおけるＩＤＵＡに対する抗体反応を防ぐことがＭＰＳ Ｉのための髄内遺伝子治療の有効性を改善することも示唆している。

【0182】

肝指向性の遺伝子導入を用いて、髄内遺伝子治療後のあとに続く免疫応答でＩＤＵＡに対する早期曝露の効果を調べた。新生仔のＩＤＵＡ発現はＭＰＳ Ｉイヌにて酵素に対す
る寛容を誘導したが、それは１ヵ月齢での髄内遺伝子治療によって非常に高いＣＳＦ酵素のレベルが達成されていた。免疫寛容群におけるＣＳＦの高いＩＤＵＡレベルは一貫して神経病理の完全な反転を生じ、妨害する抗体反応が克服されるとＬＳＤの髄内遺伝子治療によって可能である有効性の強力な例を提供する。導入遺伝子に対する免疫寛容の誘導のための新生仔の時間帯が非ヒト霊長類にも存在するという知見は、病院への変換について有望であると思われる。本研究に対する幾つかの重要な限界がある。新生仔ＭＰＳ Ｉ患者にてベクターの髄内注入を行うことに関連する高いリスクのために、新生仔では、寛容を誘導する手段としてＣＮＳ指向型の遺伝子治療ではなく全身性の遺伝子導入が使用されている。

【0183】

この実施例で使用されているアプローチは、髄内遺伝子治療が実験群すべてにおいて同一の方法及び同じ年齢で実施され、異なる年齢の動物における形質導入の効率の差異の効果を混同することなく、動物間でＣＳＦのＩＤＵＡレベルの直接比較を可能にするという利点を有した。この研究は、ベクターの髄内注入の時点でこれらの動物ではＣＳＦにてＩＤＵＡは検出できないことを考えるとこれはありそうにないと思われるが、以前の肝指向性遺伝子治療が免疫寛容の動物における脳の病態の改善された是正に寄与する可能性も除外しなかったし、ＣＳＦのＨｅｘ活性及びｐＧＡＧの濃度は髄内遺伝子導入の前での是正の証拠を示さなかった。このことは、極端に高い血清ＩＤＵＡ活性は脳の病変に効果を有さなかったＭＰＳ Ｉのネコにおける以前の研究と一致している［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ＰＮＡＳ，１１１：１４８９４－１４８９９（２０１４）］。検出可能な抗体は出生後７日目で処理されたＭＰＳ Ｉイヌで現れ始めたという観察に基づいて、この期間はわずか１～２週間続くと推定され、それはヒト研究にとって有用な出発点として役立ち得る。

【0184】

ヒト新生児が、イヌ及び非ヒト霊長類にて本明細書で実証されている導入遺伝子に特異的な免疫寛容について同じ潜在力を有するのであれば、新生児遺伝子導入は免疫応答が治療の安全性または有効性を限定している多数の遺伝性疾患を治療する膨大な可能性を有し得る。臨床試験を実現可能にするためには、このアプローチが有効であるには十分早期の患者を特定するために出生前及び新生児のスクリーニングが必須であろう。ＭＰＳ Ｉについては、新生児のスクリーニングが今や実施されており、ヒト初回投与試験を行う機会の可能性を提供している［ＰＶ Ｈｏｐｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ，（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＯｃｔ．１８］。

【0185】

実施例３：導入遺伝子に特異的な免疫寛容の誘導はイヌ疾患モデルにおけるヒト遺伝子治療の正確な評価を可能にする。
Ａ．材料及び方法
ベクターは、ヒトのイズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）を発現する血清型９の非複製組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶ９血清型はＩＣ投与に続いてＣＮＳでのｈＩＤＵＡ産物の効率的な発現を可能にする。

【0186】

１．ベクターの作製
ＡＡＶ－ｈＩＤＵＡベクターゲノムのプラスミドであるｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏ．ＲＢＧ（ｐ３０３２）は７，１６５ｂｐのサイズである。このプラスミドに由来するベクターゲノムは、ｈＩＤＵＡ発現カセットに隣接するＡＡＶ２に由来するＩＴＲを伴った一本鎖ＤＮＡゲノムである。導入遺伝子カセットからの発現は、ＣＭＶの前初期エンハンサ（Ｃ４）とニワトリのβアクチンプロモータの間のハイブリッドであるＣＢ７プロモータによって推進される一方で、このプロモータからの転写はニワトリのβアクチンのイントロン（ＣＩ）の存在によって増強される。発現カセットのためのポリＡシグナルはＲＢＧポリＡである。プラスミドはコドンを最適化し、ｈＩＤＵＡ配列を合成することによって構築され、得られた構築物は次いでプラスミド、ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＲＢＧ（ｐ１０４４）、ＣＢ７とＣＩとＲＢＧを含有するＡＡＶ２のＩＴＲが隣
接する発現カセットの発現要素にクローニングされてｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏ．ＲＢＧ（ｐ３０３２）を得た。

【0187】

配列要素の記載
逆方向末端反復（ＩＴＲ）：ＡＡＶのＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ＮＣ００１４０１）は両端で同一であるが、逆向きである配列である。ＡＡＶ２のＩＴＲ配列は、ＡＡＶとアデノウイルスのヘルパー機能がトランスで提供されると、双方ともベクターＤＮＡの複製の開始点及びベクターゲノムのパッケージングシグナルとして機能する。そのようなものとして、ＩＴＲ配列はベクターゲノムの複製及びパッケージングに必要とされるシス配列のみを表す。

【0188】

ＣＭＶ前初期エンハンサ（３８２ｂｐ，Ｃ４；ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｋ０３１０４．１）：この要素はベクターゲノムのプラスミドに存在する。

【0189】

ニワトリβアクチンプロモータ（２８２ｂｐ；ＣＢ；ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｘ００１８２．１）：プロモータであり、且つ高レベルのｈＩＤＵＡの発現を推進するのに使用される。

【0190】

ニワトリβアクチンイントロン：ニワトリβアクチン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｘ００１８２．１）に由来する９７３ｂｐのイントロンはベクターの発現カセットに存在する。イントロンは転写されるが、スプライシングによって成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から取り外され、そのいずれかの側の配列に接合する。発現カセットにおけるイントロンの存在は核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を促すことが示されているので翻訳のための定常レベルのｍＲＮＡの蓄積を向上させる。これは高いレベルの遺伝子発現を目的とする遺伝子ベクターで共通する特徴である。この要素は双方のベクターゲノムプラスミドに存在する。

【0191】

α－Ｌ－イズロニダーゼのコーディング配列：ｈＩＤＵＡの配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ＿０００１９４）がコドンで最適化され、合成された［配列番号１］。コードされたタンパク質は７３ｋＤの予想分子量とＳＤＳ－ＰＡＧＥによる８３ｋＤの見かけの分子量を持つ６５３のアミノ酸［配列番号２］である。

【0192】

ポリアデニル化シグナル：１２７ｂｐのウサギβグロビンのポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｖ００８８２．１）は抗体ｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化のためにシス配列を提供する。この要素は、転写終結、新生転写物の３’末端での特異的な切断事象及び長いポリアデニル尾部の付加のためのシグナルとして機能する。この要素は双方のベクターゲノムプラスミドに存在する。

【0193】

逆方向末端反復（ＩＴＲ）：ＡＡＶのＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ＮＣ００１４０１）は両端で同一であるが、逆向きである配列である。ＡＡＶ２のＩＴＲ配列は、ＡＡＶとアデノウイルスのヘルパー機能がトランスで提供されると、双方ともベクターＤＮＡの複製の開始点及びベクターゲノムのパッケージングシグナルとして機能する。そのようなものとして、ＩＴＲ配列はベクターゲノムの複製及びパッケージングに必要とされるシス配列のみを表す。

【0194】

構築物をＡＡＶ９カプシドにパッケージし、Ｍ．Ｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２１：１２５９－１２７１（２０１０）にて以前記載されたように精製し、滴定した。

【0195】

２．動物の処置
ＭＰＳ Ｉイヌのコロニーは、研究における動物の飼育及び使用に関するＮＩＨ及びＵＳＤＡのガイドラインのもとでペンシルベニア大学獣医学部で維持された。試験プロトコールはすべてペンシルベニア大学の施設内実験動物委員会によって承認された。組換えヒトＩＤＵＡの点滴については、使用直前にラロニダーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を生理食塩水で５倍に希釈した。末梢静脈のカテーテルを介して点滴は２時間にわたって行った。ＡＡＶ９ベクターの髄内注入及びＣＳＦの採取は、以前記載された［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２，２０１８－２０２７（２０１４）］ように後頭下のアプローチを介して行った。ナトリウムペントバルビタール（８０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）の投与によって安楽死を行った。以前記載された［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ（２０１４）］ように組織を採取し、処理した。

【0196】

３．酵素アッセイ
以前記載された［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２，２０１８－２０２７（２０１４））］ように組織溶解物及びＣＳＦにてＩＤＵＡ及びＨｅｘの活性を測定した。

【0197】

４．抗ＩＤＵＡのＥＬＩＳＡ
リン酸緩衝液ｐＨ５．８にて５μｇ／ｍＬに希釈した組換えヒトＩＤＵＡ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）によって４度で一晩ポリスチレンのＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。プレートを洗浄し、ｐＨ５．８のリン酸緩衝液中の２％ＢＳＡでブロックした。ＰＢＳにて１：５０に希釈したＣＳＦ試料と共にプレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、２％ＢＳＡを伴ったリン酸緩衝液にて１：１０，０００に希釈したＨＲＰを結合した抗イヌＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって結合抗体を検出した。テトラメチルベンジジン基質で１５分間ＥＬＩＳＡを発色させ、次いで２Ｎの硫酸で反応を止め、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。連続希釈した陽性試料の標準曲線から力価を算出した。

【0198】

５．組織学、生体分布及び統計
脳の組織学的な解析は、ＧＭ３について陽性のニューロン、コレステロール及びＬＩＭＰ２の蓄積を定量するための以下の改変と共に以前記載された［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，２０１４］ように実施し；ＬＩＭＰ２及びフィリピンで染色した大脳皮質の切片の画像は、層Ｉ（分子層）と層ＩＩの間の境界が画像の上縁を形成するように１０×の対物レンズで撮影した。各動物から合計１０枚の画像を取得した。ＧＭ３で染色した脳の切片の画像は、脳の分子層を含む大脳皮質表面に直下の領域から４×対物レンズで撮影した。各動物からの７枚の画像を解析した。画像はすべて以前記載された［Ｍ．Ａｌｄｅｎｂｏｖｅｎ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１４，４８５－４９８（２００８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＭａｙ］ように「閾値」及び「粒子を解析する」モジュールを用いてＩｍａｇｅＪソフトウエア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ． Ｓ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ；ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）によって処理した。頸部髄膜の肥厚の定量は頸部脊髄のＨ＆Ｅ染色した切片で実施した。３００μｍ間隔でスライド当たり髄膜の全厚さの１５の測定を行った。

【0199】

ベクターの生体分布は以下のように評価した。ＤＮＡを組織から単離し、以前記載された［Ｌ．Ｌ．Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｐｒｅ－Ｅｘｉｓｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｌｉｖｅｒ ｗｉｔｈ Ａｄｅｎｏ－ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ
８ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，２２，１３８９－１４０１，（２０１１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＮｏｖ］ようなＴａ
ｑＭａｎＰＣＲによってベクターゲノムを定量した。データは適宜、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓの検定、とその後のＤｕｎｎの検定またはＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙの検定を用いて評価した。ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なした。統計的解析はすべてＰｒｉｓｍ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア）を用いて行った。

【0200】

Ｂ．結果
１．ヒトＩＤＵＡを発現する髄内ＡＡＶ９はＭＰＳ Ｉイヌにて導入遺伝子に特異的な強力な免疫を引き出す。
ＭＰＳ Ｉイヌは、即時停止コドンを作り出す、成熟ｍＲＮＡにて第１イントロンの包含を生じるＩＤＵＡの突然変異を保有する。ＭＰＳ Ｉイヌにおける突然変異は検出できないＩＤＵＡ活性を生じる［ＫＰ．Ｍｅｎｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１４：７６３－７６８（１９９２）；ＮＪ．Ｔｅｒｌａｔｏ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ，５：２８６－２９４（２００３）；ＸＸ．Ｈｅ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ，６７：１０６－１１２（１９９９）］。リソソームＩＤＵＡ活性の非存在下で分解されないＧＡＧが細胞に蓄積する［ＧＮ．Ｓａｎｄｏ，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，１２：６１９－６２７（２０１１）］。冒された組織におけるこの主要なＧＡＧ蓄積物質はアルシアンブルー染色によって直接、組織学的に検出することができる［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２，２０１８－２０２７（２０１４）；ＮＪ Ｔｅｒｌｏａｔｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３）；Ｒ．Ｍ．Ｓｈｕｌｌ，ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１１４，４８７－９５（１９８４）；Ｒ．Ｍ．Ｓｈｕｌｌ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，１２９３７－１２９４１（１９９４）；Ｌ．Ａ．Ｃｌａｒｋｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１２３，２２９－４０（２００９）；Ｎ．Ｍ．Ｅｌｌｉｎｗｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．９１，２３９－２５０（２００７）；Ｍ．Ｅ．Ｈａｓｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１１２，２７（１９８３）；Ａ．Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ，Ａｐｍｉｓ，１１９，５１３－５２１（２０１１）］。主要なＧＡＧの蓄積病変に加えて、リソソームＧＡＧの蓄積は特徴的なカスケードの細胞性の異常につながる。上方調節されたＧＡＧはリソソーム拡張の原因となり、それはＬＩＭＰ２のようなリソソーム膜タンパク質についての強染色によって組織学的に眼に見える。ニューロンはまた、たとえば、ガングリオシド（たとえば、ＧＭ３）及びエステル化されていないコレステロールのような物質の二次蓄積も示す。リソソームの蓄積は、たとえば、ヘキソサミニダーゼ（Ｈｅｘ）のようなリソソーム酵素の異常な過剰発現も誘導する。

【0201】

ヒトＩＤＵＡを発現する臨床候補であるＡＡＶ９ベクターの大槽への単回髄内注入によって１ヵ月齢でＭＰＳ Ｉイヌを処理した。ベクターの用量は、１０^１１ゲノムコピー／ｋｇ（ＧＣ／ｋｇ）（ｎ＝２）から１０^１２ＧＣ／ｋｇ（ｎ＝１）までに及ぶ。手順は対象すべてにて上手く忍容された。ＣＳＦにおけるＩＤＵＡ活性はベクター投与に続いて迅速に上昇し、７日目までに正常対照のそれを超えた（図２Ａ、未処理）。しかしながら、ベクター投与後２１日目までにＣＳＦのＩＤＵＡのレベルはベースラインまで低下し、ＣＳＦの抗ｈＩＤＵＡ抗体力価での上昇が伴った（図２Ａ、未処理）。２１日目のＣＳＦ試料はすべての動物でリンパ球性の髄液細胞増加症も示した（図４Ａ、未処理）。このコホートでは、上昇したＣＳＦの抗体及び細胞数は臨床兆候及び他の臨床検査の異常とは関連せず、髄液細胞増加症は自然に解消した。注入の６ヵ月後の剖検時、組織学的な評価は脳または脊髄にて病状の証拠を示さなかった。ベクターの生体分布は広範なＣＮＳの形質導入及びベクターゲノムの持続性を実証した。

【0202】

それはいずれの用量でも正常化されなかったが、脳のヘキソサミニダーゼの過剰発現は未処理のＭＰＳ Ｉイヌに比べて低下した（図７）。組織学はまた、ＬＩＭＰ２及びＧＭ３の免疫染色によって脳の蓄積病変の部分的な解消も示したが、それは用量依存性である
とは思われなかった。

【0203】

これらのイヌで観察された好都合な安全性プロファイルに基づいて、１０倍高い用量（１０^１３ＧＣ／ｋｇ）のベクターで追加の２匹のＭＰＳ Ｉイヌを処理した。これらのイヌは、さらに低い２つの用量で処理した動物と類似の動態でＣＳＦの髄液細胞増加症を発生した（図４Ａ、未処理）；しかしながら、これら２匹の対象では、反応はさらに顕著であり、髄液細胞増加症は神経学的な兆候の発症と一時的に関連した。ベクター投与の２１日後で始まって、動物は後肢の反射低下及び虚弱、及び頸部の屈曲の際の疼痛を示した。疼痛及びＣＳＦの髄液細胞増加症は鎮痛剤及びコルチコステロイドによる治療に続いて解消し始めた；しかしながら、後肢の虚弱は持続し、症状発症の２週間後、動物を安楽死させた。組織病理は、脊髄運動ニューロン、特に腰部脊髄の強い形質導入、及び形質導入したニューロンの周囲のリンパ球の浸潤を実証した。脳及び脊髄全体にわたる切片の系統的な評価は、時折の浸潤は脳で観察されるが、病態は主として腰部脊髄に局在することを確認した。

【0204】

２．肝臓遺伝子導入を介したヒトＩＤＵＡへの新生仔曝露はその後の髄内遺伝子導入に対する寛容を誘導する
導入遺伝子に対する誇張された免疫応答の非存在下でヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９ベクターを評価するために、我々は新生仔曝露を介してヒトタンパク質に対する免疫寛容を誘導しようと試みた。出生５日後に、肝特異的プロモータからヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ血清型８ベクター（ＡＡＶ８）の単回静脈内注入によって６匹のＭＰＳ Ｉイヌを処理した。１ヵ月齢にて、以下：１０^１０、１０^１１及び１０^１２ＧＣ／ｋｇのような３つのコホート（コホート当たりｎ＝２の動物）においてヒトＩＤＵＡを発現する異なる用量のＡＡＶ９ベクターの大槽内への髄内注入によって動物を処理した。動物はすべて寛容化されていない動物に類似してＣＳＦのＩＤＵＡ活性の用量依存性の上昇を示した（図２Ａ）が、このコホートではＣＳＦ酵素の発現は２１日目を超えて持続し、実験が持続する間検出可能なままだった（図２Ｂ、寛容化）。ＣＳＦの抗体反応は、処理を経験したことがない（すなわち、寛容化されていない）動物が髄内ベクターを投与された場合に見られるものと比べて鈍く；寛容化されたコホートにおける２匹（Ｉ－６０２及びＩ－６０６）だけが検出可能な力価を示し、それは同等のベクター用量で処理した処理未経験動物よりもおよそ２０倍低かった（図３）。このコホートで最高の抗体力価を持つイヌ（Ｉ－６０６）だけが処理未経験動物よりも低レベルにもかかわらず、２１日目でＣＳＦでの高いリンパ球を示した（図４Ａ及び４Ｂ）。これらのコホートでは臨床的な有害事象はなかった。

【0205】

３．髄内ＡＡＶ９が介在するｈＩＤＵＡの発現は脳の生化学的異常及び蓄積病変の用量依存性の是正を達成する
新生仔遺伝子導入を介してヒトＩＤＵＡに対して寛容化した６匹のＭＰＳ ＩイヌをＡＡＶ９の髄内注入の６ヵ月後に屠殺した。脳の溶解物はベクターの最高用量でヘキソサミニダーゼ活性の完全な正常化を実証し、最低用量での部分的な是正を伴った（図５）。ヘキソサミニダーゼ活性はベクター用量のすべてにおいてＣＳＦにて正常化された（図８）。ＭＰＳ Ｉ患者における脊髄圧迫に寄与し得る頸部髄膜の肥厚は、すべての用量で処理された動物にて元に戻った（図９）。脳の組織学的な評価は、ｈＩＤＵＡに寛容のイヌではＬＩＭＰ２及びＧＭ３の蓄積での用量依存性の低下を示した（図６Ａ、６Ｂ）。最高のベクター用量で処理した動物は正常対照に類似するＬＩＭＰ２及びＧＭ２の染色を示し；最低用量では、一部のマーカー（ＬＩＭＰ２及びＨｅｘ）では測定できる改善がなかったのに対してＧＭ２の蓄積は明らかには低下しなかった。従って、１０^１０ＧＣ／ｋｇの低用量は最小効果用量（ＭＥＤ）であると思われた。

【0206】

ヒトタンパク質に対する混乱する免疫応答の非存在下で有効性を評価するために以前ヒ
トＩＤＵＡに対して寛容化された８匹のＭＰＳ ＩイヌにてＩＴでのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡのＭＥＤを確立した。１ヵ月齢にてイヌをＩＴでのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡによって処理し、６ヵ月後、脳の蓄積病変の評価のために安楽死させた。ＭＥＤの確立は、ＬＩＭＰ２及びＧＭ３を含むＣＮＳ組織におけるＭＰＳ Ｉ疾患のよく特徴付けられた組織学的な基準を利用した。リソソームの蓄積病変の基準すべてが評価された最高用量（１０^１２ＧＣ／ｋｇ体重）にて正常化された。このコホートの動物はＧＭ３またはＬＩＭＰ２の蓄積の正常範囲に達しなかったが、一貫した改善は１０倍低い用量（１０^１１ＧＣ／ｋｇ体重）でも観察された。最低用量群（１０^１０ＧＣ／ｋｇ体重）では、リソソーム蓄積の組織学的な証拠は、ＬＩＭＰ２染色による中程度の改善及びＧＭ３の蓄積における最小限の改善を示した。従って、我々は１０^１０ＧＣ／ｋｇ体重がＩＴでのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡのＭＥＤであると推定した。脳の蓄積病変の用量依存性の解消がＣＳＦのＩＤＵＡ活性に相関し、ＣＳＦのスペルミン濃度に逆相関したということは、ＣＳＦのＩＤＵＡ活性及びＣＳＦのスペルミンが臨床試験にてＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡの薬物動態の評価のための有用な生体マーカーであり得ることを示している。

【0207】

これらのデータはＭＰＳ ＩイヌではＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡのＭＥＤは１０^１０ＧＣ／ｋｇであることを示している。

【0208】

処理未経験のＭＰＳ ＩイヌにてＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡの投与も評価した。ＭＰＳ Ｉイヌ（５匹）が１ヵ月齢でＡＡＶ９.ＭＰＳ Ｉ試験ベクターの髄内注入を受け
た。１０^１１ＧＣ／ｋｇ体重及び１０^１２ＧＣ／ｋｇ体重で処理された動物はすべて軽い自然治癒性のリンパ球性髄液細胞増加症を示した。これらの動物は研究全体にわたって健康であると思われ、注入の６ヵ月後の剖検では、脳、脊髄または髄膜における炎症の証拠はなかった。１０^１３ＧＣ／ｋｇ体重の用量で処理された２匹のイヌは、当初調子が良いと思われたが、注入の３ヵ月後、さらに重篤な髄液細胞増加症及び形質導入した細胞に対するＴ細胞の応答の組織学的な証拠と一致して神経兆候を発症し、腰部脊髄にて死んだ運動ニューロンを単核細胞が取り囲んでいた。これらの結果は、形質導入した脊髄の運動ニューロンを標的とするリンパ球が介在する用量依存性の免疫毒性に一致する。ヒトとイヌのＩＤＵＡタンパク質の間での配列の差異を考慮して、ヒトＩＤＵＡがイヌにおいて免疫原性であることは驚くべきではない。

【0209】

寛容化されていないＭＰＳ Ｉイヌでは、ＭＴＤは１０^１２ＧＣ／ｋｇだった。ＭＴＤはヒトのタンパク質に対するイヌの免疫応答に基づいているので、これはＭＴＤの控えめな推定値である。１ヵ月齢のイヌの４５ｇの脳質量に合わせ、且つ２ｋｇの平均体重を伴って、この用量は、成人（ＧＣ／ｋｇ脳質量ベースでの約５×イヌＭＥＤ）における９×１０^１０合計または２×１０^９ＧＣ／ｇ脳質量、またはおよそ１．４×１０^１３ＧＣ合計（１．１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量）ＧＣに相当する。

【0210】

４．新生仔ＭＰＳ Ｉイヌにおける組換えｈＩＤＵＡの点滴は髄内ＡＡＶ９が介在するｈＩＤＵＡの発現に対する寛容を誘導するのに十分である
ヒトＩＤＵＡの肝臓発現が寛容の誘導に必要であるかどうかを判定するために、我々は、１ヵ月齢でのＡＡＶ９の髄内注入の前、出生後７及び１４日目に組換えヒトＩＤＵＡ（０．５８ｍｇ／ｋｇ）の点滴によって２匹のＭＰＳ Ｉイヌ（Ｉ－６６３及びＩ－６６４）を処理した。ヒトＩＤＵＡを発現するベクターで新生仔として処理されたイヌに類似して、酵素処理したイヌは高レベルのＣＳＦ ＩＤＵＡ活性（図２Ａ、２Ｂ）及びヒトＩＤＵＡに対する最小の抗体反応（図２）またはＣＳＦの髄液細胞増加症（図４Ａ－４Ｂ３）を持続して示した。双方の動物で脳のヘキソサミニダーゼ活性は低下し（図５）、蓄積病変は効果的に一掃された（図６Ａ、６Ｂ）。

【0211】

Ｃ．考察
ＭＰＳ Ｉの治療のための髄内ＡＡＶ９送達の有効性を評価することは、ＣＳＦへの注入を介して達成され得るベクターの分布及び疾患特異的なマーカーに対する形質導入のその程度の影響の双方の評価を必要とした。これらの研究は、十分に類似するサイズ及び生体構造も示して臨床的な送達法及び得られるベクター分布の意味ある評価を可能にしつつ、疾患の病態生理を正確に反映し得る動物モデルの使用を必要とした。ＭＰＳ Ｉイヌモデルはヒトの表現型を忠実に複製し、同じ生化学的な及び組織学的な病変だけでなく、同じ臨床所見も示す［ＫＰ．Ｍｅｎｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１４：７６３－８（１９９２）；ＲＭ．Ｓｈｕｌｌ，ｅｔ ａｌ，（１９８４）；ＲＭ．Ｓｈｕｌｌ，ｅｔ ａｌ，（１９９４）；Ｃ．Ｃｉｒｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，６０：２０４－２１３（２００６）；Ｐ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ，６０：２０４－２１３（２００６）］。ヒトにおけるＭＰＳ Ｉに対する表現型の類似性のゆえに、ＭＰＳ Ｉイヌは全身性疾患の治療のための酵素補充療法の開発で広範に使用された［ＲＭ．Ｓｈｕｌｌ，ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，９１：１２９３７－１２９４１（１９９４）；Ｐ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，１１８：２８６８－２８７６（２００８）］。ＭＰＳ Ｉイヌはまた、散発的に脊髄圧迫及び水頭症を発生する疾患のＣＮＳ所見も模倣する［Ｐ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．９９，Ｓ１５－Ｓ１５（２０１０）；Ｐ．Ｉ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．９８，７０－７０（２００９）；Ｃ．Ｈ．Ｖｉｔｅ，ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．６３，１６３－１７３（２０１３）］。ＭＰＳ Ｉイヌについて認知試験は報告されていないけれども、脳における組織学的な及び生化学的な所見は十分に特徴付けられ、その疾患の重篤な形態を持つヒトにおける知見を忠実に反復している［ＲＭ Ｓｈｕｌｌ（１９８４）；Ｃ．Ｃｉｒｏｎ（２００６）；ＳＵ Ｗａｌｋｌｅｙ，ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（Ｂｅｒｌ．）７５，６１１－６２０（１９８８）］。ＭＰＳ Ｉイヌの脳はリソソーム膜タンパク質（ＬＩＭＰ２）及びガングリオシド（ＧＭ３）の蓄積ならびにヘキソサミニダーゼ（Ｈｅｘ）のようなリソソーム酵素の上方調節を明示している。ガングリオシドの蓄積はＭＰＳ
Ｉ及び他のリソソーム蓄積疾患における認知機能と相関するので、疾患の重症度及び治療転帰を評価するための重要なマーカーである［Ｓ．Ｕ．Ｗａｌｋｌｅｙ，Ｍ．Ｔ．Ｖａｎｉｅｒ，Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｄｉｓｅａｓｅ， Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ＢＢＡ－Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１７９３，７２６－７３６（２００９）；Ｇ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．３４，１３９９－１４１１（１９８０）］。ＭＰＳ Ｉイヌはまた患者で特定されるものに類似するニューロンの形態における変化も示す［ＳＵ Ｗａｌｋｌｅｙ，（１９８８）］。これらの著しい類似性によってこれはヒトにおけるＭＰＳ ＩのＣＮＳ所見に対する新規の治療法としてのＡＡＶの髄内送達の評価のための説得力のあるモデルになった。ＩＴでのＡＡＶ９の送達のために臨床的に使用される投与の経路を反復する大型動物モデルの能力と同様に得られるベクターのＣＮＳにおける分布はさらに、これらの研究にとってのＭＰＳ Ｉイヌの妥当性を支持した。

【0212】

ＭＰＳ Ｉイヌは臨床ベクターの評価について優れたモデルであると思われたが、ヒトＩＤＵＡに対する免疫応答は決定的な障害を提示した。以前の研究から、ＭＰＳ ＩイヌにおけるヒトＩＤＵＡに対する免疫応答は患者で観察されるものよりもはるかに極端であることは明らかである。イヌ及びＭＰＳ Ｉ患者の双方におけるタンパク質の静脈内送達は抗体を誘発することが多いが、イヌでは、これらの反応はさらに強力であり、連続投与の際、低下しそうになく、それに続く点滴に対するアナフィラキシー反応に関連することが多い［ＲＭ．Ｓｈｕｌｌ，ｅｔ ａｌ，１９９４）；Ｅ．Ｋａｋｋｉｓ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＡ．１０１，８２９－３４（２００４）］。ＣＮＳにおけるヒトＩＤＵＡに対する免疫応答の差異は一層さらに顕著であり；酵素の髄内点滴で処理されたＭＰＳ Ｉイヌは髄膜炎と同様にＣＳＦで検出可能な抗体反応の証拠
を示す。対照的に、タンパク質の反復ＩＴ点滴によって治療された小児及び成人のＭＰＳ
Ｉ患者双方については、類似の有害効果はなく、ＩＤＵＡに対するＣＳＦ抗体について治療された５人の患者のうち、たった１人が陽性であった［Ｃ．Ｃｉｒｏｎ（２００６）；Ｐ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，（２０１０）；Ｐ．Ｉ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．９８，７０－７０（２００９）；Ｐ．Ｉ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１０１，１１５－１２２（２０１０）；Ｐ．Ｉ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．９３，２４７－２４７（２００８）；Ｅ．Ｋａｋｋｉｓ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．８３，１６３－１７４（２００４）；Ｔ．Ｃ．Ｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１１１，Ｓ７４（２）；Ｍ．Ｖｅｒａ，ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．７４，７１２－７２０（２０１３）］。興味深いことに、ＭＰＳ
Ｉイヌは、ヒト酵素に対するよりも低レベルであるが、イヌＩＤＵＡに対してもＣＳＦ抗体を発生させるということは、このモデルがＩＤＵＡに対する免疫に向けた全体的に大きな傾向を有することを示唆しており、それは種特異的ではないタンパク質の使用によって悪化する。ＭＰＳ Ｉイヌ及び患者におけるヒトＩＤＵＡの静脈内送達及び髄内送達双方の転帰におけるこれらの際立った差異は、ＭＰＳ ＩイヌにおけるヒトＩＤＵＡに対する一貫して悪化した免疫応答を示し、この応答を防ぐことがヒトにて予想されるベクター活性を反復させるのに必要であることを示唆している。新生仔曝露を介してタンパク質に対する寛容を誘導することが、悪化した免疫応答の介入なしでこのモデルにてヒトベクターの有効性の評価を可能にした。これは、最も妥当な動物モデルにてヒト初回遺伝子治療試験の設計で必須の因子である最小有効用量の正確な決定を可能にする重要情報を提供した。さらに詳しくは、広範な投与量決定試験をＭＰＳ Ｉイヌにて実施した。最小有効用量は免疫寛容の動物で決定されたが、本明細書に記載されているｏｑＰＣＲ法によって決定されたように２×１０^９ＧＣ／ｇ脳質量の用量であると推定される。用量漸増安全性試験は免疫能力のある（すなわち、ＩＤＵＡにもＡＡＶにも遭遇していない）イヌにて実施し、毒性は１０^１２ＧＣ／ｇの用量で観察された。免疫介在性毒性の厳密なイヌモデルにおける１０^１２ＧＣ／ｇでの用量制限毒性試験（ＤＬＴ）の知見に基づいて、アカゲザルにおける公式の医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）の毒性試験にて１０倍低い用量を投与するであろう。公式のＧＬＰ非ヒト霊長類（ＮＨＰ）毒性試験で評価される用量は１．１×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量であろう。毒性に遭遇しなければ、臨床の出発用量は１．１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量であろう。この出発用量はイヌＭＰＳ Ｉモデルにおける最小有効用量（ＭＥＤ）よりもほぼ５倍多く、ＭＰＳ Ｉイヌ及びネコの研究にて信頼できる組織学的反応を明示した用量とほぼ同じであるということは、この用量の臨床有効性の理に適った期待を支持している。出発用量はまたＭＰＳ Ｉイヌで毒性が観察された用量よりもほぼ９０倍少なく、非ヒト霊長類で調べられた用量よりも１０倍少ないということは、ベクターまたは導入遺伝子に関連する毒性に対してさらに大きな感受性を示すヒト対象の潜在力を説明する許容できる安全性限界を提供している。これらのデータに基づいて、出発用量は許容できる利益：リスクのプロファイルを表し、その際、用量は治療範囲内にある（従って臨床利益を提供してもよい）と予想されるが、毒性ベクター用量を下回る（従ってそれなりに安全であるはずである）と予想される。以下の計算はイヌにおける用量をヒトにおける出発用量にどのように外挿するかを示す：１ヵ月齢のイヌの脳＝４５グラム；ＭＥＤ９×１０^１０ＧＣ合計（２×１０^９ＧＣ／ｇ脳質量）；成人の脳＝１３００グラム；ヒトの出発用量（５×イヌＭＥＤ）、１．４×１０^１３ＧＣ合計（１．１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量）。このアプローチがなければ、唯一の選択肢は種特異的導入遺伝子によるベクターからの有効性データを外挿することであり、それは効能に重要な差異を有してもよく、またはヒトタンパク質に対してさらに免疫寛容であるあまり代表的ではない動物モデルに研究を動かし得る。新生仔寛容の誘導プロトコールが免疫抑制剤の二次的な結末を回避する明瞭な利点を有するけれども、この設定では薬理学的な免疫抑制も採用することができる。

【0213】

有効性の評価は、ヒトベクターで処理された非寛容のイヌでは免疫応答及び循環ＩＤＵＡの喪失によって混乱させられたが、一部の有用なデータをこれらの動物から導き出すことができる。強力な免疫応答がヒトでの免疫応答を表しそうにはない一方で、それは、免疫が介在する毒性の重要な特徴を明示することによってヒト初回投与試験のためのモニタリング計画に同調し得る。この場合、我々は、免疫が介在する毒性が用量依存性であり、免疫応答のピークがベクター投与の３週間後に発生し、脊髄運動ニューロンの高度な形質導入のせいであると思われる局所運動症状を呈し、ＣＳＦの髄液細胞増加症が伴うことを観察した。免疫が介在する毒性及びベクター投与後数週間延長する神経症状の広範なモニタリング、及び注入後２～４週間生じる髄液細胞増加のＣＳＦでの分析によるこれらの知見をフェーズＩの試験プロトコールに直接統合してもよい。髄液細胞増加が伴う神経症状がヒト試験対象における類似の動態で現れたならば、処理未経験のイヌにおける知見は、毒性が免疫応答によるものであり（たとえば、過剰発現の毒性とは対照的に）、治療の決断を導き得ることを示唆している。

【0214】

ヒトＩＤＵＡに対して寛容化されているＭＰＳ Ｉイヌではベクターの用量、ＣＳＦの酵素レベル及び脳の蓄積病変の是正の間で強力な相関が出現した。ＣＳＦにおけるＩＤＵＡ活性と脳の病変の是正との間の関係は、このアプローチがヒト試験に進むとき有益な観察であってもよく、その際、ＣＳＦにて検出されるＩＤＵＡ活性は臨床反応の有用な予測因子であってもよい。一層さらに有用であるのは、ＣＮＳの蓄積病変の重症度を直接反映するＣＳＦマーカーの特定である。ＣＳＦ生体マーカーはＭＰＳ Ｉ患者にて潜在するＣＮＳ病変の是正を評価するための有益なツールであり、イヌモデルはそのようなマーカーの特定のための理想的な系であってもよい。この研究では、我々は可能性がある１つのＣＳＦ生体マーカーである酵素ヘキソサミニダーゼを評価した。ＭＰＳ Ｉイヌの脳組織ではＨｅｘ活性は実質的に上昇する一方で、ＣＳＦでは穏やかに上昇するにすぎない。組織反応の程度にかかわらず、ＣＳＦのＨｅｘは処理した動物すべてにおいて正常化した。従って、ＣＳＦのＨｅｘは臨床試験にてベクター活性を確認するのに有用であってもよいが、治療反応を予想しそうにはない。ＭＰＳ Ｉイヌのモデルを用いた将来の研究が追加のＣＳＦマーカーの評価及び脳の蓄積病変とのそれらの相関を可能にしてもよく、それらは最終的にＭＰＳ ＩにおけるＣＮＳ病変の重症度を非侵襲的に評価する強力な新しいツール及び新規治療法の効果を生じ得る。

【0215】

本知見は、酵素の２つの異なる供給源を用いてヒトＩＤＵＡへの新生仔曝露が寛容を誘導することができることを示している。実施例３はＡＡＶ介在の発現が新生仔にて導入遺伝子に特異的な寛容を誘導してもよいことを示す一方で、この実施例は組換え酵素の点滴も寛容を誘導してもよいことを示す。このアプローチが他のタンパク質に一般化できるのであれば、それは動物モデルにおける多数のヒト治療剤のさらに正確な前臨床評価に有用であってもよい。さらに、類似のアプローチがヒト新生児にて外来性のタンパク質に対する寛容を誘導し得るのであれば、それは、正常なタンパク質に対する抗体反応が有効性を限定する疾患についてのタンパク質補充療法の有効性を改善する膨大な潜在力を有し得る。ほとんどのＭＰＳ Ｉ患者はＩＤＵＡの髄内点滴に寛容であると思われる一方で、大半は静脈内の酵素補充に対して血清抗体を発生させ、これらの抗体は治療への反応を低下させることができる。新生児での寛容の誘導を遺伝子補充療法またはタンパク質補充療法と併用することが患者の転帰を実質的に改善してもよい。認可された組換え酵素の利便性によってＭＰＳ Ｉがこのアプローチの最初のヒト試験での優れた候補者になる。ヒト新生児が寛容の誘導のために１～２週間の同様の時間帯を示すのであれば、上手く行く介入に十分早期の患者を特定するために新生児のスクリーニングが必須である。従って、ＭＰＳ
Ｉ及び他のリソソーム蓄積疾患についての新生児スクリーニングの進行中の実施は新生児寛容の誘導プロトコールの臨床的評価に決定的に重要であろう。

【0216】

実施例４：幼若アカゲザルにおける髄内ＡＡＶが介在するヒトＩＤＵＡ遺伝子導入
Ａ．髄内送達
この研究の目的は、６～９ヵ月齢のヒト乳児に発達上類似するモデルである１ヵ月齢のアカゲザルにてヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９ベクターであるＡＡＶ２／９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏ．ＲＢＧの髄内（ＩＴ）投与の安全性を評価することだった。加えて、この研究は血清または脳脊髄液（ＣＳＦ）における導入遺伝子産物に対する抗体がベクター投与の安全性及びヒトＩＤＵＡの活性に影響を及ぼすかどうかを評価した。

【0217】

この研究には４匹のアカゲザルが含まれた。予備研究はアカゲザルがヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）に対する抗体を作ることができることを示した。アカゲザルではヒトＩＤＵＡ導入遺伝子産物に対する抗体反応が予想されたので、動物のうち２匹は肝特異的プロモータからヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ＰＩ．ＣＯｈＩＤＵＡ．ｎＲＢＧ）の静脈内（ＩＶ）投与によって出生時に寛容化した。手順の影響及びＡＡＶ８ベクターに対する曝露について制御するために、他の２匹のアカゲザルには無関係な導入遺伝子（ヒト第ＩＸ凝固因子）を発現するＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ２／８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＦＩＸｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨ）を出生時にＩＶで投与した。１ヵ月齢で、ヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９ベクターであるＡＡＶ２／９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏ．ＲＢＧを３×１０^１２ＧＣ／ｋｇの用量にて４匹の動物すべてにＩＴ注入によって投与した。動物は投与後１６カ月間、報告書の発行の時点で観察したが、少なくともさらに１年間は研究中のままであろう。研究全体にわたって評価した評価項目には、一般的観察、体重、及び包括的な臨床病状（分画を伴う血球数及び血清臨床検査値）が挙げられる。加えて、ＩＤＵＡ酵素活性及び導入遺伝子に対する抗体反応をＣＳＦで測定した。

【0218】

この研究はベクターに関連する病変及び臨床的続発症（０）を明らかにしなかった。動物はすべて正常な成長軌跡を示した。血清臨床検査値及び血球数は匹敵する年齢及び飼育条件の歴史的対照アカゲザルの正常範囲の範囲内だった。導入遺伝子に対する抗体は２匹の非寛容化動物ではＣＳＦにて検出されたが、新生仔としてヒトＩＤＵＡに対して寛容化された２匹の動物では検出されなかった。ＩＤＵＡに寛容化した双方の動物では、ベースラインレベルよりも少なくとも１５％高いＩＤＵＡ活性が研究全体にわたってＣＳＦにて検出可能だった。非寛容化動物では、ＣＳＦのＩＤＵＡ活性はＡＡＶ９.ＭＳＰＩ試験ベ
クターの投与後迅速に上昇したが、抗体の誘導に続いてベースラインに低下した。ＣＳＦにおける導入遺伝子に特異的な抗体の存在はＩＴでのＡＡＶ９.ＣＢ７.ｈＩＤＵＡの投与の安全性に影響を及ぼさなかったが、ＣＳＦにおけるヒトＩＤＵＡのレベルを検出する能力に影響を及ぼした。

【0219】

結論として、単回用量のＡＡＶ９.ＣＢ７.ｈＩＤＵＡの髄内投与は３×１０^１２ＧＣ／ｋｇの用量で１ヵ月齢のアカゲザルにて上手く忍容された。この用量では、出生時ヒトＩＤＵＡに対して寛容化されている動物のＣＳＦにおいてベースラインを少なくとも１５％超えるレベルのｈＩＤＵＡが検出可能だった；寛容化されていない動物はＣＳＦにて検出可能であるｈＩＤＵＡに対する抗体反応を発生し、ｈＩＤＵＡの発現と負に相関した。抗ＩＤＵＡ抗体について陽性である動物及び抗体陽性ではない動物のいずれにおいても成長、行動、または臨床検査値または血液パラメータに対する処理に起因する影響は観察されなかった。

【0220】

Ａ．材料及び方法
この研究で使用したベクターには、ｒＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡ、ｒＡＡＶ８.ｈＩＤＵＡ及び無関係な導入遺伝子（ｈＦＩＸ）を有するＡＡＶ８ベクターが含まれる。

【0221】

それが臨床使用で提案された経路なので、後頭下穿刺を介した髄内（ＩＴ）投与が選択された。この研究は動物の体重に合わせた単回のベクター用量を評価した。ヒトＩＤＵＡ
に対して免疫寛容を誘導するために、出生後１日目（研究では０日目）にて２匹の動物にｒＡＡＶ８.ｈＩＤＵＡ（１０^１２ＧＣ／ｋｇ）のＩＶ注入を投与した。対照動物には、
出生後１日目にて肝特異的プロモータから無関係な導入遺伝子（ヒト第ＩＸ因子）を発現する対照ベクター（ｒＡＡＶ８.ｈＦＩＸ）を投与した。次いで、動物はすべて１ヵ月齢
（研究の３０日目）にて後頭下穿刺によってＩＴでのＡＡＶ９.ＭＰＳＩ試験ベクターを
投与した。

【0222】

Ｂ．結果及び結論
４匹の１ヵ月齢のアカゲザル（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ）に３×１０^１２ＧＣ／ｋｇのｒＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡをＩＴで投与し、ベクター投与の後１年を超えてモニターした。これ
らの動物のうち２匹はヒトＩＤＵＡタンパク質に対して出生時寛容化した。

【0223】

体重または体重増に対する処理に関連した影響はなく、処理に関連した臨床兆候もなかった。臨床検査値または血液パラメータに対する処理に関連した影響はなかった。導入遺伝子産物に対する抗体は、ヒトタンパク質に対する寛容を誘導するよう予め処理しなかった２匹の動物のＣＳＦにて検出可能だった。寛容化した動物と寛容化しなかった動物の間で評価した評価項目（臨床兆候、体重、血液学及び臨床検査値）に差異がなかったということは、タンパク質に対するＣＳＦの抗体は明らかな毒性に関連しなかったことを示している。ＩＤＵＡに寛容の動物では、１匹の動物でＣＳＦにてベースラインレベルの２倍を超える持続したＩＤＵＡの発現があり、他の動物でベースラインをおよそ１５％超えていた。

【0224】

結論として、単回用量のｒＡＡＶ９.ＣＢ７.ｈＩＤＵＡの髄内投与は、３×１０^１２ＧＣ／ｋｇの用量で１ヵ月齢のアカゲザルにて上手く忍容された。この用量では、出生時ヒトＩＤＵＡに対して寛容化されている動物のＣＳＦにてベースラインの１１５～２００％のレベルのｈＩＤＵＡが検出可能だった；寛容化されていない動物はＣＳＦにて検出可能であるｈＩＤＵＡに対する抗体反応を発生し、ｈＩＤＵＡの発現と負に相関した。抗ＩＤＵＡ抗体について陽性である動物及び抗体陽性ではない動物のいずれにおいても成長、行動、または臨床検査値または血液パラメータに対する処理に起因する影響は観察されなかった。

【0225】

実施例５：カニクイザルにおける髄内ＡＡＶが介在するヒトＩＤＵＡ遺伝子の導入
ベクターは、サイトメガロウイルスのプロモータ（ＣＭＶ）とキメライントロン（ＰＩ）とコドンを最適化したヒトＩＤＵＡ導入遺伝子（ｈＩＤＵＡ）とポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０）とから成る発現カセットをパッケージするＡＡＶ９カプシドから成った。発現カセットにはＡＡＶ血清型２の逆方向末端反復が隣接した。この研究ではベクターは１つ使用されたが、このベクターは、ＡＡＶ２／９．ＣＭＶ．ＰＩ．ｈＩＤＵＡ．ＳＶ４０、ＡＡＶ２／９．ＣＭＶ．ＰＩ．ｈＩＤＵＡｃｏ．ＳＶ４０、ＡＡＶ２／９．ＣＭＶ．ＰＩ．ｈＩＤＵＡｃｏ．ＳＶ４０ＰＡまたはＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＰＩ．ｈＩＤＵＡ．ＳＶ４０のいずれかとして示される。

【0226】

Ａ．材料と方法
この研究には、２匹のメスのカニクイザル（ＩＤ０６－０９及び０７－１９）が含まれた。双方のカニクイザルは１０^１２ゲノムコピー／ｋｇ体重（ＧＣ／ｋｇ）のＡＡＶ２／９．ＣＭＶ．ＰＩ．ｈＩＤＵＡｃｏ．ＳＶ４０ＰＡの投与を受けた。それが臨床使用で提案された経路なので、後頭下穿刺を介した髄内（ＩＴ）投与が選択された。

【表1】

１．脳質量のグラム当たりの用量は９０ｇの脳に基づく。

【0227】

Ｂ．結果及び結論
２匹のメス成熟カニクイザルをＣＮＶプロモータからヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９ベクターの髄内注入によって処理した。ベクター投与ののち研究の１、７、１４、２８、９１、１１８、１４７、１８２、２０８、２３９、２６１、２９４、３２２、３５０、３７８、４１３、４３４、４６２、４９０、５１８、５６１、５８９、６２４、及び６３６日目に、体重、身体検査、及び血球数及び血清臨床検査値を評価し、その後、組織病理及びベクターの生体分布の解析のために動物を剖検した。ベクターに関連した臨床的な有害事象はなかった。１匹の動物がベクター投与の６００日後に大腿動脈瘤を発症した。これは反復した採血に続発すると考えられ、処理関連でありそうにない。最終ＣＳＦパラメータを含む臨床病理パラメータに対する処理関連の影響はなかった。組織病理はＣＮＳ病変の証拠を示さず、末梢器官における明らかなベクター関連の異常を示さなかった。生体分布の解析は、例外１つを伴って末梢器官よりも１～２桁多い、双方のＮＨＰＳの脳及び脊髄におけるベクターの沈着を示した。ＡＡＶ９カプシドに対する予め存在する中和抗体がない動物１匹にて有意な肝臓分布が生じ、その際、ベクターに対する血清抗体が予め存在する動物は最小限の肝臓の形質導入を示した。双方の動物からの脳切片の免疫染色はヒトＩＤＵＡの発現を明らかにした。

【0228】

この研究はＩＴでのＡＡＶ９が介在する遺伝子導入は脳におけるＩＤＵＡの長期発現を可能するという証拠を提供した。この研究はまたこのアプローチの安全性の予備的な証拠も提供した。

【0229】

実施例６：ｈＩＤＵＡに対する既存の免疫の状況でのマウスにおけるＡＡＶ９.ｈＩＤＵ
Ａの脳室内（ＩＣＶ）送達
処理に遭遇したことがないマウスと同様に導入遺伝子産物であるヒトのイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）に対する既存の抗体を持つマウスにおいてＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡの脳室内（
ＩＣＶ）投与に続く毒性の証拠を評価するように予備研究が設計された。

【0230】

被験物質は、ニワトリβアクチンプロモータ（ＣＢ７）とキメライントロン（ＣＩ）とコドンを最適化したヒトＩＤＵＡ導入遺伝子（ｈＩＤＵＡｃｏ）とポリアデニル化シグナル（ＲＢＧ）とから成る発現構築物をパッケージしているＡＡＶ９カプシドから成った。発現構築物にはＡＡＶ血清型２の逆方向末端反復が隣接した。このベクターはＡＡＶ９.
ＣＢ７. ＣＩ.ｈＩＤＵＡ.ＲＢＧと表される。最終産物はエリオット製剤緩衝液（ＥＦＢ）で希釈した。

【0231】

この非ＧＬＰ研究は予め免疫されたマウスにおけるＧＬＰ毒性研究を設計する補助として元々計画されたが、正常マウスにおける非種特異的タンパク質に対する免疫に基づいた実験は酵素補充療法（ＥＲＴ）で以前治療された患者を代表しそうにないというＦＤＡのフィードバックに基づいてＧＬＰ研究は実施されなかった。予め免疫されたマウスにおけるＧＬＰ毒性研究を行うことに対する決定が下された時点で、最初の予備研究はすでに進行中だった。予備研究の結果はこの報告に含まれる。

【0232】

この研究には１００匹の成熟Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５０／性別）が含まれた。動物の半分は、アジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ）中の組換えヒトＩＤＵＡ（アルデュラザイム（登録商標））の筋肉内（ＩＭ）注入によってヒトＩＤＵＡに対して免疫した。免疫の６ヵ月後、免疫した動物及び免疫に遭遇したことのない動物の双方は２種の用量（５×１０^１０ＧＣまたは２．５×１０^１１ＧＣ）の一方でのＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡのＩＣＶ注入に
よって処理した。ベクター投与後の５つの時点（７、１４、３０、６０または９０日目）の１つにて各処理群の動物を屠殺した。脳、脊髄、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓及び生殖腺を組織病理のために回収した。

【0233】

免疫に遭遇したことのない（非免疫）コホート（ｎ＝５０、２５／性別）では、予定された剖検の前に動物は死亡せず、臨床的な異常を示さなかった。脳の組織病理は、一部の動物で側脳室及び眼に見える針経路の膨張を示し、投与のＩＣＶ経路に一致した。５０匹のうち１２匹で髄膜及び／または脳実質への最小限から軽度のリンパ球の浸潤が生じ、それはベクターの用量または注入後の時間との明瞭な相関を示さなかった。用量依存性で且つベクター投与後の時間に相関して肝炎が発生した。ベクター投与の１４日後に屠殺した高用量のコホートでの５匹の動物すべてにおいて最小限から中程度の肝炎が発生した。７、３０、６０または９０日で屠殺した高用量の動物にて最小限にすぎない肝炎が観察された。低用量コホートでは、最小限にすぎない肝炎が観察され、これは８匹の動物で発生し、ベクター投与後の時間とは明瞭な相関はなかった。ベクター投与後６０日の高用量コホートでは１匹の動物に中程度の心筋炎が発生した；高用量コホートにおける３匹の追加の動物はベクター投与後３０日または９０日で最小限の心筋炎を示した。低用量コホートの２匹の動物は最小限の心筋炎を示し、１匹は軽度の心筋炎を示し、すべてベクター投与後６０日で発生した。免疫に遭遇したことのない（非免疫）コホートでは、他の潜在的にベクターに関連する異常は観察されなかった。

【0234】

ベクター投与の前にヒトＩＤＵＡに対して免疫したコホート（ｎ＝５０、２５／性別）では、３匹（オス２、メス１）；高用量（２．５×１０^１１ＧＣ）のＡＡＶ９．ＣＢ７.
ｈＩＤＵＡの投与を受けた２匹と低用量（５×１０^１０ＧＣ）の投与を受けた１匹が死亡した。３匹はすべて研究の１８または１９日目に死亡した。免疫群における組織病理は、末梢器官における形質導入された細胞に対する激しい細胞介在性の免疫応答に一致し、中程度から重度の心筋炎が５０匹の動物のうち８匹に発生し、中程度から重度の肝炎が５０匹の動物のうち８匹に発生した。双方の知見はベクターの用量及びベクター投与のタイミングと相関し、最も重度の知見はベクター投与の１４日後に発生した。脳における知見はさほど重度ではなく；中程度の髄膜炎または脳炎が高ベクター用量で処理した３匹の動物及び低ベクター用量で処理した１匹の動物で発生した。これらの知見はベクター投与の時間と相関しなかった。脳における他の知見は最小限または軽度だった。

【0235】

全体的に、免疫に遭遇したことがない（非免疫）コホートにおける結果は、肝臓及び軽度での心臓へのリンパ球の浸潤によって証拠付けられるように、ヒト導入遺伝子に対する免疫応答の誘導に一致したが、双方の臓器はＩＴ注入に続いて末梢循環に逃れているＡＡＶ９によって形質導入される^１，２。この状況では、評価された最高用量（２．５×１０^１１ＧＣ）にて毒性は明らかだった。

【0236】

予め免疫したコホートでは、免疫戦略は導入遺伝子に対する強力な細胞介在性免疫応答を誘導すると思われ、一部のベクター処理動物にて中程度から重度の心筋炎及び肝炎を生じた。毒性はベクターの用量に相関した。実験設計は正常マウスにおける非種特異的タンパク質に対する免疫に基づいたので、ＥＲＴで以前治療された患者への適用可能性は不明瞭である。

【0237】

実施例７：非ヒト霊長類にて髄内（ＩＴ）に注入されたＡＡＶ９.ＣＢ７.ｈＩＤＵＡベクターの安全性及び生体分布
この研究は、アカゲザルにおける画像誘導の後頭下穿刺法によって投与後１８０日までのＡＡＶ９.ＣＢ７.ｈＩＤＵＡの安全性及び生体分布を評価した。成熟アカゲザル（ｎ＝９、メス６、オス３、１Ａ、Ｂ及びＣ群）に画像誘導の後頭下穿刺法によって１．１×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量に近似的に相当する１０^１３ＧＣのＡＡＶ９.ＣＢ７.ｈＩＤＵＡの単回用量を投与した。追加の３匹の動物（メス２、オス１、２Ａ及びＢ群）に画像誘導の後頭下穿刺法によって溶媒（エリオットＢ（登録商標）＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８）の単回用量を投与した。被験物質または対照物質の投与ののち１４日目（１Ａ及び２Ａ群）、９０日目（１Ｂ及び２Ｂ群）または１８０日目（１Ｃ群）に動物を安楽死させ、剖検した。毒性は、研究の０、３、７、１４、２１、３０、４５、６０及び９０日目に毎日の観察によって、及び身体検査、ＣＢＣや血清の化学パネル、凝固パネル、及びＣＳＦの細胞数の解析、タンパク質やグルコースの濃度によって評価した。剖検では、病理学者が肉眼病変について組織を評価し、顕微鏡で調べた。ベクターのカプシド及び導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答はＥＬＩＳＰＯＴによって評価し、導入遺伝子産物に対する抗体反応はＥＬＩＳＡによって血清及びＣＳＦにて測定した。ベクターの生体分布はｑＰＣＲによって評価した。

【0238】

投与処置に関連した有害事象（ＡＥ）はなかった。評価された最初の時点である研究の１４日目からベクターゲノムは処理した動物すべての脳及び脊髄全体にわたって検出することができ（１０^４ＧＣ／μｇＤＮＡ前後のレベル）、９０日目及び１８０日目で安楽死させ、剖検した動物の脳及び脊髄にて同じレベルで持続した。末梢器官、特に肝臓及び脾臓（１０^５～１０^６ＧＣ／μｇＤＮＡ）、細網内皮系組織（リンパ節及び骨髄１０^３～１０^４ＧＣ／μｇＤＮＡ）及び心臓（１０^３～１０^４ＧＣ／μｇＤＮＡ）への有意なベクターの分布もあった。これらのデータはベクターが末梢に広がり、ベクターの髄内送達に続いて肝臓の形質導入が可能であることを示唆している。

【0239】

液性及びＴ細胞介在性の双方の免疫応答がヒトＩＤＵＡタンパク質に対して引き出された。この応答は、ＣＳＦでの一時的な単核細胞増加及び脊髄背側白質の軸索変性症（９０日目及び１８０日目の脊髄全体にわたって観察された）の組織学的所見に相関すると思われた。これらの知見は臨床的な異常または脊髄背側索以外の組織への損傷の組織学的な証拠に関連しなかった。これらの知見に基づいて、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）はカニクイザルでは１０^１３ＧＣ（およそ１．１×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量）の単回用量の試験によっては定義できなかった。

【0240】

Ａ．材料及び方法
ＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡ試験ベクター（エリオットＢ（登録商標）＋０．００１％プルロ
ニック（登録商標）Ｆ６８における）を評価した。この研究には１２匹のアカゲザルが含まれた。動物は無作為に５群に割り当てた。オス１及びメス２から成る試験群１Ａ、１Ｂ及び１Ｃを試験ベクターで処理し、それぞれ、研究の１４±２日目、９０±２日目、または１８０±２日目に安楽死させ、剖検した。２Ａ群及び２Ｂ群の動物は溶媒（エリオット製剤緩衝液）で処理し、それぞれ１４±２日目または９０±２日目に安楽死させ、剖検した。

【0241】

それが臨床使用のための提案された経路なので、画像誘導の後頭下穿刺法を介したＩＴ経路を選択した。この用量がＭＰＳ Ｉイヌでの最大忍容された用量に類似し（グラム脳質量ベース当たりの用量で）、初回ヒト投与研究に提案された出発用量よりも１０倍多いので１０^１３ＧＣの用量を選択した。

【0242】

研究の０日目に、動物を麻酔し、ＣＳＦの採取及び大槽への投薬のために頭部を曲げて
側臥位にてＸ線台に置いた。注入の部位を無菌的に準備した。無菌法を用いて、２１～２７ゲージで１～１．５インチのＱｕｉｎｃｋｅクモ膜下穿刺針（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をＣＳＦの流動が観察されるまで後頭下空間に進めた。ベースライン解析のために１．０ｍＬまでのＣＳＦを採取した。蛍光顕微鏡（ＯＥＣ９８００ Ｃ－Ａｒｍ，ＧＥ）を用いた脊髄造影法を介して針の正しい配置を検証した。ＣＳＦを採取した後、ルアーアクセスの延長カテーテルをクモ膜下穿刺針に接続してイオヘキソール（商品名：オムニパック１８０ｍｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）造影剤と被験物質または対照物質の投薬を促した。カテーテルとクモ膜下穿刺針を介して１ｍＬまでのイオヘキソールを投与した。大槽における造影剤の観察によって針の正しい配置を確認したのち、試験物質または溶媒（１．４ｍＬの容量、１ｍＬに注射器の体積とリンカーのデッドスペースを加えたものに等しい）を含有する注射器を柔軟なリンカーに接続し、２０～６０秒にわたってゆっくり注入した。針を取り出し、穿刺部位に直圧を適用した。

【0243】

Ｂ．結果
ベクターの投与処置に関連した有害事象はなかった。ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡ試験ベクターで処理した動物すべての脳及び脊髄の全体にわたって測定し
た時点すべてにおいて検出され、レベルはこれらの組織では時間を超えて同等だった。末梢臓器、特に肝臓にて有意なベクターの分布もあり、末梢組織におけるベクターゲノムのレベルは時間を超えて同等だった。溶媒対照にも１４日で安楽死させた試験ベクター動物にも臨床的な、肉眼でのまたは組織学的な知見はなかった。軽い一時的なＣＳＦでの単核細胞増加症が５／６のＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡ処理動物で観察され、ピークは投与後３０日
前後だった。

【0244】

ｈＩＤＵＡ（導入遺伝子産物）に対する血清及びＣＳＦでの抗体は２１日目の６／６のＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡ試験ベクター処理動物で検出され、ｈＩＤＵＡペプチドに対する末
梢Ｔ細胞の応答は４／６の試験ベクターで処理した９０日の動物及び１／３の処理した１８０日の動物にて観察された。顕微鏡上では、６／６のＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡ試験ベクタ
ー処理動物にて、後根神経節（組織学的評価には利用できないＤＲＧ）の感覚ニューロン内での細胞体損傷を示唆する脊髄の背面感覚白質路における最小限から中程度の軸索変性症があった。上行背面感覚路における軸索変性症の解剖学的位置は、後根神経節からの感覚ニューロンの特異的な関与を示唆している。それらのニューロンはＡＡＶの髄内投与ののち普通相当に形質導入されるという事実及びＣＳＦ抗体（２１日からの）とＣＳＦの髄液細胞増加（３０日でピーク）の経時変化、及び９０日での動物の大半における導入遺伝子特異的なＴ細胞応答の存在は、ｈＩＤＵＡに対する細胞介在性の細胞傷害性免疫応答が後根神経節で生じたことを示唆している。

【0245】

実施例８：ｒＡＡＶ９.ＣＢ７.ｈＩＤＵＡベクターの製造
ｒＡＡＶ９.ＣＢ７.ｈＩＤＵＡは、（ｉ）ｈＩＤＵＡベクターゲノムプラスミドと、（ｉｉ）ＡＡＶのｒｅｐ２とｃａｐ９の野生型遺伝子を含有するｐＡＡＶ２９と呼ばれるＡＡＶヘルパープラスミドと、（ｉｉｉ）ｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）と呼ばれるヘルパーアデノウイルスプラスミドとのヒトＨＥＫ２９３ＭＣＢ細胞への三重形質移入によって作製する。パッケージされたベクターゲノムのサイズは４３４４ｎｔである。

【0246】

上記プラスミドｐＡＡＶ．ＣＶ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏ．ＲＧＢのクローニング：プラスミドは７，１６５ｂｐのサイズである。このプラスミドに由来するベクターゲノムは、ｈＩＤＵＡ発現カセットに隣接するＡＡＶ２に由来するＩＴＲを伴った一本鎖のＤＮＡゲノムである。導入遺伝子のカセットからの発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期エンハンサ（Ｃ４）とニワトリのβアクチンプロモータとの間のハイブリッドであるＣＢ７プロモータによって推進される一方で、このプロモータからの転写はニワトリのβ
アクチンのイントロン（ＣＩ）の存在によって増強される。発現カセットのためのポリＡシグナルはウサギβグロビン（ＲＢＧ）のポリＡである。プラスミドはコドンを最適化し、ｈＩＤＵＡ配列［配列番号１］を合成することによって構築され、得られた構築物は次いでプラスミド、ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＲＢＧ（ｐ１０４４）、ＣＢ７とＣＩとＲＢＧを含有するＡＡＶ２のＩＴＲが隣接する発現カセットの発現要素にクローニングされてｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏ．ＲＢＧ（ｐ３０３２）を得た。

【0247】

シスプラスミドｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡ．ＲＢＧ．ＫａｎＲのクローニング：ＰａｃＩ制限酵素を用いてベクターゲノムをｐ３０３２から切り出し、カナマイシン耐性遺伝子を含有するｐＫＳＳ基準のプラスミド主鎖（ｐ２０１７）にクローニングした。最終的なベクターゲノムプラスミドはｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏ．ＲＢＧ．ＫａｎＲである。

【0248】

ＡＡＶ２／９ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＲｅｐ２
ＡＡＶ２／９ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＲｅｐは４つの野生型ＡＡＶ２ｒｅｐタンパク質とＡＡＶ９に由来する３つの野生型ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードする。キメラパッケージ構築物を作り出すために、先ず、野生型ＡＡＶ２のｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するプラスミドｐ５Ｅ１８からＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子を取り出し、肝臓ＤＮＡから増幅したＡＡＶ９のｃａｐ遺伝子のＰＣＲ断片で置き換えた。得られたプラスミドは識別子ｐＡＡＶ２－９（ｐ０００８）を与えられた。正常ではｒｅｐの発現を推進するＡＡＶのｐ５プロモータがこの構築物ではｒｅｐの５’末端からｃａｐの３’末端に動かされることに留意のこと。この配置は、プロモータとｒｅｐ遺伝子（すなわち、プラスミドの主鎖）の間にスペーサーを導入し、ｒｅｐの発現を下方調節し、ベクターの作製を支援する能力を高めるのに役立つ。ｐ５Ｅ１８におけるプラスミドの主鎖はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳに由来する。ＡＡＶ２／９ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＲｅｐ２は４つの野生型ＡＡＶ２ｒｅｐタンパク質と３つの野生型ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質とカナマイシン耐性とをコードする。

【0249】

ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）アデノウイルスヘルパープラスミドは１５，７７０ｂｐのサイズである。プラスミドは、ＡＡＶの複製に重要であるアデノウイルスゲノムの領域、すなわち、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡ（アデノウイルスＥ１機能は２９３細胞によって提供される）を含有するが、他のアデノウイルスの複製遺伝子または構造遺伝子を含有しない。プラスミドはアデノウイルスの逆方向末端反復のような複製に重要なシス要素を含有しないので感染性アデノウイルスが生成されることは予想されない。それはＡｄ５のＥ１、Ｅ３が欠失した分子クローン（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミド）に由来した。Ａｄ５のＤＮＡに欠失を導入して不必要なアデノウイルスの遺伝子の発現を取り除き、アデノウイルスＤＮＡの量を３２Ｋｂから１２ｋｂに減らした。最終的にアンプリコン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置き換えてｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）を得た。ＡＡＶベクターの作製に必要なＥ２、Ｅ４及びＶＡＩのアデノウイルス遺伝子の機能的な要素はこのプラスミドに残る。アデノウイルスのＥ１必須遺伝子の機能はＨＥＫ２９３細胞によって供給される。ＤＮＡプラスミドの配列決定はＱｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって実施され、参照配列ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）ｐ１７０７ＦＨ－Ｑの以下の重要な機能的要素：Ｅ４ ＯＲＦ６ ３６９２－２８０８ｂｐ；Ｅ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質１１７８４－１０１９４ｂｐ；ＶＡ ＲＮＡ領域１２４２６－１３３７８ｂｐとの１００％の相同性を示した。

【0250】

製造過程を要約しているフローチャートを図１１にて提供する。

【0251】

細胞の播種：適格のヒト胚性腎臓２９３細胞株が作製過程で使用されるであろう。ＢＤＳロット当たりのベクター作製のための５０までのＨＳ－３６に播種するのに十分な細胞
塊を生成させるＣｏｒｎｉｎｇＴフラスコとＣＳ－１０を用いて細胞を５×１０^９～５×１０^１０個まで増やすであろう。ガンマ線照射したＵＳが供給源の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補完したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で構成される培地にて細胞が培養されるであろう。細胞は足場依存性であり、細胞の解離は動物産物を含まない解離試薬であるＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて達成されるであろう。細胞の播種は無菌で使い捨てのバイオプロセスバッグ及び配管セットを用いて達成されるであろう。細胞は、３７℃（±２℃）で５％（±０．５％）ＣＯ_２の雰囲気にて維持されるであろう。細胞培養培地は新鮮な無血清のＤＭＥＭ培地で置き換えられ、最適化されたＰＥＩに基づく形質導入法を用いて３種の作製プラスミドで形質移入されるであろう。作製過程で使用されるプラスミドはすべてＣＭＯ品質システムならびにｃＧＭＰ製造の最も際立った特徴；追跡可能性、文書管理及び材料分離を利用する基礎構造という背景において作製されるであろう。

【0252】

十分なＤＮＡプラスミド形質移入複合体がＢＳＣにて調製されて５０までのＨＳ－３６（ＢＤＳバッチ当たり）に形質移入するであろう。最初に、７．５ｍｇのｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏ．ＲＢＧ．ＫａｎＲベクターゲノムのプラスミドと、１５０ｍｇのｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）と、７５ｍｇのｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＲｅｐ２ ＡＡＶヘルパープラスミドと、ＧＭＰ等級のＰＥＩ（ＰＥＩＰｒｏ，ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ）とを含有するＤＮＡ／ＰＥＩ混合物が調製されるであろう。このプラスミド比は少量の最適化試験でのＡＡＶの作製に最適であると判定された。よく混合した後、溶液を室温で２５分間静置し、次いで無血清培地を加えて反応を止め、次いでＨＳ－３６に加える。形質移入混合物をＨＳ－３６の３６層すべての間で均衡化し、細胞を３７℃（±２℃）で５％（±０．５％）ＣＯ_２の雰囲気にてインキュベートする。

【0253】

細胞培地の回収：使い捨てのバイオプロセスバッグを用い、ユニットの外に培地を無菌的に引き出すことによって、形質移入された細胞及び培地が各ＨＳ－３６から回収されるであろう。培地の回収に続いて、約８０リットル容量が２ｍＭの最終濃度までＭｇＣｌ２（ベンゾナーゼの補因子）で補完され、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（カタログ番号：１．０１６７９７．０００１，Ｍｅｒｃｋ Ｇｒｏｕｐ）が２５単位／ｍｌの最終濃度まで添加されるであろう。生成物（使い捨てのバイオプロセスバッグの中の）をインキュベータにて３７℃で２時間インキュベートし、形質移入の手順の結果、回収物に存在する残留した細胞性の及びプラスミドのＤＮＡの酵素消化のために十分な時間を提供するであろう。この工程を実施して最終ベクターにおける残留ＤＮＡの量を出来るだけ抑える。インキュベート時間の後、ＮａＣｌが５００ｍＭの最終濃度で加えられ、濾過及び下流の接線流濾過（以下の工程４及び５を参照のこと）の間、生成物の回収に役立つであろう。

【0254】

清澄化：ペリスタポンプによって駆動される閉鎖配管とバッグのセットとして順に接続された深層濾過器カプセルを（１．２μｍ／０．２２ｕｍ）用いて細胞及び細胞残渣が生成物から除かれるであろう。清澄化は下流のフィルター及びクロマトグラフィカラムが汚染から保護されるのを保証し、汚染微生物数低減濾過は、フィルター回路の端部で、上流の作製過程の間に導入された可能性がある汚染微生物数を下流の精製の前に取り除くことを保証する。回収物質はＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ ＰＥＳ カプセルフィルター（１．２／０．２２μｍ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を通過するであろう。

【0255】

大規模接線流濾過：清澄化した生成物の容量低下（１０倍）は、特注の無菌の閉鎖バイオプロセス配管、バッグ及び膜等を用いた接線流濾過（ＴＦＦ）によって達成されるであろう。ＴＦＦの原理は好適な多孔性の膜に平行な圧力下で溶液を流すことである（１００ｋＤａ）。膜の孔より大きな分子を保持する一方で、圧力差が膜を通ってサイズの小さい
分子を運び、廃棄の流れに運び込む。溶液を再循環させることによって、平行な流れが膜表面を掃き、膜孔の汚染を防ぐ。適当な膜孔サイズ及び表面積を選択することによって所望の分子を保持し、濃縮する一方で液体試料は容量が急速に減らされてもよい。ＴＦＦ適用における透析濾過には、新鮮な緩衝液の液体が膜を通過する同じ速度で再循環している試料への及び廃棄の流れへの添加が関与する。透析濾過の体積の増加に伴って、増量した小分子が再循環している試料から除かれる。これは、清澄化した生成物の控えめな精製を生じるが、後に続くアフィニティクロマトグラフィ工程と適合性である緩衝液交換も達成する。従って、我々は２０ｍＭのトリスｐＨ７．５と４００ｍＭのＮａＣｌで構成される緩衝液の４容量でその後透析濾過される濃縮のための１００ｋＤａのＰＥＳ膜を利用する。透析濾過された生成物は４℃で一晩保存され、さらに、１．２μｍ／０．２２ｕｍの深層濾過器カプセルによって清澄化し、析出物質を取り除くであろう。

【0256】

アフィニティクロマトグラフィ：透析濾過された生成物は、ＡＡＶ２／９血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ ＳｅｌｅｃｔＴＭ Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用されるであろう。これらのイオン条件下で、有意な比率の残留する細胞性のＤＮＡ及びタンパク質がカラムを通って流れる一方で、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉される。適用に続いて、カラムを洗浄して追加の供給不純物を取り除き、その後に１０分の１の容量の中和緩衝液（Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ，２００ｍＭ，ｐＨ１０．２）への回収によって即座に中和される低ｐＨ工程の溶出（４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．５）が続く。

【0257】

アニオン交換クロマトグラフィ：中空ＡＡＶ粒子を含む製造過程の不純物のさらなる減少を達成するために、Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９溶出プールを５０倍（２０ｍＭのビストリスプロパン、０．００１％プルニックＦ６８；ｐＨ１０．２）に希釈し、イオン強度を低下させてＣＩＭｕｌｔｕｓ Ｑモノリスマトリクス（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）への結合を可能にする。低塩洗浄に続いて、６０ＣＶのＮａＣｌ線形塩勾配（１０～１８０ｍＭのＮａＣｌ）を用いてベクター生成物を溶出する。この浅い塩勾配は、ベクターゲノムを含有する粒子（完全粒子）からベクターゲノムのないカプシド粒子（中空粒子）を効率的に分離し、完全なカプシドについて濃縮された調製物を生じる。１００分の１容量の０．１％プルロニックＦ６８と２７分の１容量のビストリスｐＨ６．３を含有する試験管に分画を回収して、それぞれ試験管への非特異的な結合及び高ｐＨへの曝露の長さを出来るだけ抑えるであろう。適当なピーク分画を回収し、およそのベクター収量を決定するためにピーク面積を評価し、以前のデータと比較するであろう。

【0258】

ＢＤＳを得るための最終的な製剤化及び無菌濾過：ＴＦＦを使用してプールしたＡＥＸ分画にて１００ｋＤａの膜によって最終的な製剤化を達成するであろう。これは、４容量の製剤緩衝液（エリオットＢ溶液、０．００１％プルロニックＦ６８）による透析濾過によって達成され、それによって、≧５×１０^１３ＧＣ／ｍｌの力価を達成する濃度因子を推定するためにアニオン交換クロマトグラフィに由来するピーク面積を以前のデータと比較するであろう。ＢＤＳ試験のために試料を取り出すであろう（以下のセクションに記載される）。濾過した精製バルクを無菌のポリプロピレン管に保存し、最終充填のための公開まで隔離場所にて≦－６０℃で凍結するであろう。予備的な安定性研究は、ＤＰは我々が提案した製剤緩衝液では凍結及び融解に続いて活性を失わないことを示している。－８０℃での長期保存の後の安定性を評価する追加の研究が進行中である。

【0259】

最終充填：凍結したＢＤＳを解凍し、プールし、最終製剤緩衝液を用いて標的力価に希釈し、バイアル当たり≧０．６ｍｌ～≦２．０ｍｌの充填容量で１３ｍｍのストッパーとシール付きのＷｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌの「すぐ使える」（予め滅菌した）２ｍｌのガラス製バイアルに０．２２ｕｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を介して充填するであろう。個々にラベルを付けたバイアルが以下
の仕様に従って標識されるであろう。ラベルを付けたバイアルは≦－６０℃で保存される。

【0260】

ベクター（薬剤製品）は単一の固定濃度でバイアルに詰められ、唯一の変数はバイアル当たりの容量であろう。低用量濃度を達成するには、薬剤製品をエリオットＢ溶液、０．００１％プルロニックＦ６８で希釈するであろう。高用量のベクターは希釈せずに直接使用される一方で、低用量のベクターは投薬のとき薬局によって実施されるであろう製剤緩衝液での１：５の希釈を必要とするであろう。

【0261】

実施例９：ベクターの検査
血清型の同一性、中空粒子の含量及び導入遺伝子産物の同一性を含む特徴付けアッセイが行われる。アッセイの説明は以下に現れる。

【0262】

Ａ．ベクターゲノムの独自性：ＤＮＡ配列決定
ウイルスベクターのゲノムＤＮＡを単離し、プライマーウォーキングを用いた２倍配列包括度によって配列が決定されるであろう。配列比較が行われ、予想配列と比較されるであろう。

【0263】

Ｂ．ベクターカプシドの独自性：ＶＰ３のＡＡＶカプシドの質量分光分析
ベクターのＡＡＶ２／９血清型の確認は、質量分光分析（ＭＳ）によるＶＰ３カプシドタンパク質のペプチドの解析に基づいたアッセイによって達成される。方法には、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから切り出したＶＰ３タンパク質のバンドの多重酵素消化（トリプシン、キモトリプシン、及びエンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ）、とその後のカプシドタンパク質の配列決定を行うためのＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分光計におけるＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳでの性状分析が関与する。宿主タンパク質生成物の差し引き及び質量スペクトルから導き出したカプシドタンパク質の配列を可能にする直列質量スペクトル（ＭＳ）法が開発された。

【0264】

Ｃ．ゲノムコピー（ＧＣ）の力価
ｏｑＰＣＲに基づいたゲノムコピー力価が連続希釈の範囲にわたって決定され、同族のプラスミド標準（ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏ．ＲＢＧ．ＫａｎＲ）と比較されるであろう。ｏｑＰＣＲはＤＮＡ分解酵素Ｉ及びプロテイナーゼＫによる逐次消化とそれに続くｑＰＣＲ解析を利用して、カプシドに包まれたベクターゲノムのコピーを測定する。ＤＮＡの検出は、ＲＢＧポリＡ領域とハイブリッド形成する蛍光でタグを付けたプローブと組み合わせたこの同じ領域を標的とする配列特異的なプライマーを用いて達成されるであろう。プラスミドＤＮＡの標準曲線との比較はＰＣＲ後の試料の操作を必要とすることなく力価の決定を可能にする。多数の標準、検証試料及び対照（バックグランド及びＤＮＡの混入のための）がアッセイに導入されている。このアッセイは現在制限されていないが、ＣＭＯによって制限されるであろう。アッセイは、感度、検出の限界、制限の範囲、及びアッセイ内やアッセイ間の精度を含むアッセイのパラメータを確立し、定義することによって制限されるであろう。内部ＡＡＶ９参照ロットが確立され、適格性試験に使用されるであろう。我々の以前の経験は、ここに記載されている最適化されたｑＰＣＲによって得られる力価が前臨床データの生成で使用された我々の標準ｑＰＣＲによって達成されたものよりも一般に２．５倍高いことを示唆していることに留意のこと。

【0265】

Ｄ．中空粒子対完全粒子の比
薬剤製品の粒子総含量はＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析によって決定されるであろう。イオジキサノール勾配で精製される参照ベクターの調製物は種々の方法（分析用超遠心、電子顕微鏡、及び２６０／２８０ｎｍでの吸光度）によって解析され、調製物が＞９５％のゲノム含有（完全）粒子を含有することを立証する。この参照物質を既知のゲノムコピー数（従
って延長上で考えると粒子数）に連続希釈し、類似の希釈系列の薬剤製品と共にＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにて泳動する。参照物質及び薬剤製品ＶＰ３タンパク質のバンド双方のピーク領域の体積をデンシトメトリーによって測定し、参照物質の体積を粒子数に対してプロットする。薬剤物質の粒子総濃度はこの曲線からの外挿によって決定され、次いでゲノムコピー（ＧＣ）力価を差し引いて中空粒子の力価を得る。中空粒子の完全粒子に対する比は中空粒子力価に対するＧＣ力価の比である。

【0266】

Ｅ．感染力価
感染力価（ＩＵ）を用いてＲＣ３２細胞（ｒｅｐ２を発現しているＨｅＬａ細胞）におけるベクターの生産的取り込み及び複製を判定する。以前公開されたものに類似する９６穴終点形式が採用されている。手短には、ｒＡＡＶ９．ＣＢ.ｈＩＤＵＡの連続希釈及び
各希釈でｒＡＡＶの１２の複製を伴う単一希釈のＡｄ５によってＲＣ３２細胞を同時に感染させる。感染の７２時間後、細胞を溶解し、ｑＰＣＲを行ってｒＡＡＶベクターの入力に比べた増幅を検出する。ＴＣＩＤ５０算出の終点希釈（Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ）を行ってＩＵ／ｍｌとして表される複製力価を決定する。「感染力」の値は細胞と接触する粒子、受容体結合、内部移行、核への輸送及びゲノム複製に左右されるので、それらは、アッセイの構造、及び使用される細胞株における適当な受容体及び結合後の経路の存在によって影響を受ける。受容体及び結合後の経路は普通、不死化された細胞株では維持されないので、感染力アッセイの力価は存在する「感染性」粒子の数の絶対測定値ではない。しかしながら、カプシドに包まれたＧＣの「感染性単位」に対する比（ＧＣ／ＩＵ比として記載される）はロットからロットの間での製品一貫性の測定値として使用することができる。

【0267】

ＧＣ／ＩＵ比は製品一貫性の測定値である。ｏｑＰＣＲの力価（ＧＣ／ｍｌ）を「感染性単位」（ＩＵ／ｍｌ）で割って算出されたＧＣ／ＩＵ比を得る。

【0268】

Ｆ．複製能力のあるＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）のアッセイ
作製過程で生じる可能性があり得る複製能力を持つＡＡＶ２／９（ｒｃＡＡＶ）の存在について試料が解析されるであろう。細胞に基づく増幅及び継代とそれに続くリアルタイムｑＰＣＲによるｒｃＡＡＶのＤＮＡの検出（ｃａｐ９標的）から成る３継代アッセイが開発されている。細胞に基づく成分は、試験試料及び野生型ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）の希釈物を伴うＨＥＫ２９３細胞の植菌単層（Ｐ１）から成る。１０^１０ＧＣのベクター生成物が調べた生成物の最大量であろう。アデノウイルスの存在のゆえに、複製能力のあるＡＡＶは細胞培養にて複製するであろう。２日後、細胞溶解物を生成し、Ａｄ５を熱不活化する。清澄化した溶解物を次いで２回目の細胞（Ｐ２）に入れ、（再びＡｄ５の存在下で）感度を高める。２日後、細胞溶解物を生成し、Ａｄ５を熱不活化する。清澄化した溶解物を次いで３回目の細胞（Ｐ３）に入れ、（再びＡｄ５の存在下で）感度を最大化する。２日後、細胞を溶解し、ＤＮＡを遊離させ、次いでそれをｑＰＣＲに供し、ＡＡＶ９ ｃａｐ配列を検出する。Ａｄ５依存性の様子でのＡＡＶ９ ｃａｐ配列の増幅はｒｃＡＡＶの存在を示す。ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子とＡＡＶ９ｃａｐ遺伝子とを含有するＡＡＶ２／９代理陽性対照の使用は、アッセイの検出限界（ＬＯＤ）が決定される（０．１、１、１０及び１００ＩＵ）のを可能にし、ｒＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡベクターの連続希釈（１×１０^１０、１×１０^９、１×１０^８、１×１０^７ＧＣ）を用いて試験試料に存在するｒｃＡＡＶのおよそのレベルを定量することができる。

【0269】

Ｇ．試験管内の効能
ｑＰＣＲのＧＣ力価を遺伝子発現に関連付けるために、既知の感染効率の細胞当たりのＧＣによってＨｕｈ７またはＨＥＫ２９３細胞に形質導入し、形質導入の７２時間後ＩＤＵＡ活性について上清をアッセイすることによって試験管内のバイオアッセイが行われるであろう。ＩＤＵＡ活性は、０．１ｍｌの水で希釈した試料を１００ミリモル／Ｌの４Ｍ
Ｕ－イズロニド０．１ｍｌと共に３７度で１～３時間インキュベートすることによって測定される。２９０ミリモル／Ｌのグリシン２ｍｌ、１８０ミリモル／Ｌのクエン酸ナトリウムｐＨ１０．９の添加によって反応を止め、４ＭＵの標準希釈に対する蛍光を比較することによって遊離した４ＭＵを定量する。高度に活性がある前臨床及びｔｏｘのベクター調製物は製品活性の解釈を可能にするであろう。

【0270】

Ｈ．総タンパク質、カプシドタンパク質、タンパク質純度の決定及びカプシドタンパク質比
ビシンコニン酸アッセイを用いたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の標準曲線に対する総タンパク質についてベクター試料を先ず定量する。キットで提供されているＭｉｃｒｏ－ＢＣＡ試薬と等量の試料を混合することによって測定は行われる。同じ手順がＢＳＡ標準の希釈に対して適用される。混合物を６０℃でインキュベートし、吸光度を５６２ｎｍで測定する。４パラメータ適合を用いて既知の濃度の標準吸光度から標準曲線を生成する。４パラメータ回帰に従って未知の試料が定量される。

【0271】

ＡＡＶの純度の半定量的な決定を提供するために、次いで試料をゲノム力価について基準化し、還元条件下でＳＤＳ－ポリアクリルアミド（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲル上で５×１０^９ＧＣを分離する。次いでゲルをＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ色素で染色する。レーン当たり２５、５０及び１００ｎｇのタンパク質の同時に電気泳動したＢＳＡ標準と比較することによって不純物のバンドをデンシトメトリーにより定量する。これらの量はＡＡＶの総タンパク質試料の１％、２％及び４％を表す。３つのＡＡＶ特異的なタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の添加で出現する染色されたバンドはタンパク質の不純物と見なされる。不純物のバンドはすべて参照タンパク質と比較し、不純物の質量パーセントと同様におよその分子量が報告される。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを用いてＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質を定量し、その比も決定するであろう。

【0272】

実施例１０：生体分布及び脳酵素
成熟カニクイザルに１×１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９．ＣＭＶ．ｈＩＤＵＡを後頭下で注入し、６３６日後、組織を回収し、即座に－８０℃に凍結する。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて細胞性の全ＤＮＡを組織から抽出する。抽出したＤＮＡにおけるベクターゲノムの検出及び定量は、ＳＶ４０ポリＡ内の配列を標的とするプライマー及びプローブのセットを用いたリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって実施する。ＰＣＲ条件は、それぞれ鋳型としての１００ｎｇの細胞性の全ＤＮＡ、３００ｎＭのプライマー及び２００ｎＭのプローブで設定する。サイクルは、９５．８℃で１０分間、９５．８℃で１５秒間と６０．８℃で１分とを４０サイクルだった。

【0273】

成熟ＭＰＳ Ｉノックアウトマウスに３×１０^８、３×１０^９、または３×１０^１０ＧＣ／マウスのＡＡＶ９.ＣＢ７.ｈＩＤＵＡを右側脳室で注入する。２１日後、脳全体を回収し、直ちに－８０℃に凍結する。組織試料を溶解緩衝液（０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）にてホモジネートし、手短に超音波処理する。次いで試料を凍結融解し、遠心分離によって清澄化する。ＢＣＡアッセイによってタンパク質濃度を決定する。ＩＤＵＡ活性は、ＩＤＵＡ緩衝液（０．１５モル／ＬのＮａＣｌ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、０．１モル／Ｌの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５８）にて１００ミリモル／Ｌの４ＭＵ－イズロニド（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ；Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）０．１ｍＬと共に、０．１ｍＬの水で希釈された試料を３７℃で１～３時間インキュベートすることによって測定する。２９０ミリモル／Ｌのグリシン２ｍｌ、１８０ミリモル／Ｌのクエン酸ナトリウムｐＨ１０．９の添加によって反応
を止める。４ＭＵの標準希釈に対する蛍光を比較することによって遊離した４ＭＵを定量する。単位は、タンパク質のｍｇ当たり時間当たり遊離したナノモルの４ＭＵとして与えられる。

【0274】

実施例１１：ＭＰＳ Ｉの生体マーカー
本研究では、ＭＰＳ Ｉイヌに由来するＣＳＦ試料の代謝産物のプロファイリングを行ったが、それはＣＳＦのメタボロームにおける実質的な疾患関連の変化を明らかにした。最も顕著な差異は正常対照に比較したスペルミンのレベルでの３０倍の上昇だった。この知見はＭＰＳ Ｉ患者の試料と同様にＭＰＳ Ｉのネコモデルで確認された。スペルミンはＨＳに結合し、スペルミンの細胞への取り込みはこの相互作用に依存する［Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇ，Ｓ．Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｌ．－Å．Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，３３８，３１７－３２３（１９９９）；Ｊ．Ｅ．Ｗｅｌｃｈ，Ｐ．Ｂｅｎｇｔｓｏｎ，Ｋ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，Ａ．Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｇ．Ｊ．Ｊｅｎｎｉｓｋｅｎｓ，Ｇ．Ｂ．Ｔｅｎ Ｄａｍ，Ｔ．Ｈ．Ｖａｎ Ｋｕｐｐｅｖｅｌｔ，Ｍ． Ｂｅｌｔｉｎｇ，Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉ－ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｈｅ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３２，７４９－７５６（２００８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＡｐｒ］。グリピカン－１のような細胞表面のプロテオグリカンはそのＨＳ部分を介してスペルミンを結合することができ、グリピカンタンパク質のエンドサイトーシスの後、ＨＳ鎖の細胞内切断は結合したスペルミンを細胞内で遊離させる（Ｋ．Ｄｉｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６，４６７７９－４６７９１，（２００１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＤｅｃ，１４）。従って、インタクトなＨＳの再生利用はスペルミンの取り込みに必須である。ＭＰＳ Ｉでは、細胞外のスペルミンの蓄積は、不十分なＨＳの再生利用のゆえのこの取り込みメカニズムの阻害を介して、またはＭＰＳで蓄積する細胞外ＧＡＧへのスペルミンの単純な結合を介して生じ、スペルミン結合の平衡をシフトさせて細胞外分布をより好む。さらなる研究はＭＰＳ ＩのＣＳＦにおけるスペルミン蓄積に対するこれらのメカニズムの相対的な寄与に対処すべきである。

【0275】

我々は、スペルミン合成の阻害剤がＭＰＳのニューロンにて過剰な神経突起成長を阻止すること、及び神経突起成長が患者のＣＳＦで見いだされるものに類似するスペルミン濃度によってＷＴのニューロンで誘導され得ることを見いだした。ＭＰＳ Ｉイヌモデルにおける遺伝子治療がスペルミンの蓄積を反転し、ＧＡＰ４３の発現を正常化したということは同じ経路が生体内で影響を受けることを示唆している。利用できる阻害剤が血管脳関門を交差しないので、我々は生体内でのスペルミン合成阻害の効果を直接評価することができず、出生からの慢性で直接のＣＮＳ投与は我々の動物モデルでは実現可能ではない。我々の試験管内の知見がＭＰＳ Ｉにおける異常な神経突起成長でのスペルミンの役割を支持する一方で、スペルミン合成を阻害することは表現型を完全に反転しなかったし、正常ニューロンへのスペルミンの添加はＭＰＳ Ｉのニューロンのレベルまで神経突起成長を増やさなかったことを言及するのは重要である。スペルミン調節の効果は治療の相対的に短い期間によって限定されていてもよい。スペルミンの蓄積がＭＰＳ Ｉにおける神経突起の伸長に寄与する唯一のメディエータではないことも可能である。特に、多数の神経栄養因子はＨＳが修飾した受容体を介して結合し、細胞外マトリクスにおけるＨＳとの相互作用は神経突起成長に影響を与えることができる［Ｄ．Ｖａｎ Ｖａｃｔｏｒ，Ｄ．Ｐ．Ｗａｌｌ，Ｋ．Ｇ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｏ
ｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１６，４０－５１（２００６）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＦｅｂ（１０．１０１６／ｊ．ｃｏｎｂ．２００６．０１．０１１）］。従って、スペルミンの蓄積はＭＰＳ Ｉにおける異常な神経突起成長を促進する幾つかの因子の１つであってもよい。

【0276】

スクリーニングした１５のＭＰＳ Ｉイヌの試料のうち、たった１つだけがスペルミン濃度の正常範囲内に入った。２８日齢にてこれは研究に含まれた最も幼若な動物だった。この知見はスペルミンの蓄積は年齢依存性であってもよいことを示している。将来の研究はＭＰＳ患者にてＣＳＦのスペルミンのレベルを長期にわたって評価すべきである。ＭＰＳ患者においてスペルミンが年齢と共に増加するのであれば、ほとんど患者が発達遅滞の発症前に１～２年の正常な発達を経験するので、これは認知低下の動態を説明し得る。

【0277】

ニューロン成長を変える代謝産物の蓄積を誘発する損傷したＨＳ代謝の可能性が、ＭＰＳ Ｉにおいて酵素欠乏と異常な神経突起成長の表現型との間の新規の関連性を指し示してもよく、それはこの疾患に関連する認知不全を説明してもよい。これらの知見はまた、ＣＳＦのスペルミンがＭＰＳ Ｉのための新規のＣＮＳ指向型の治療の薬物力学を評価するための非侵襲性の生体マーカーとして有用であってもよいことも示している。

【0278】

材料及び方法
実験設計：この研究は当初、健常対照に由来する試料に比べてＭＰＳ Ｉ患者のＣＳＦ試料にて有意に異なるレベルで存在する代謝産物を検出するように設計された。ＭＰＳ ＩＨの小児及び健常対照に由来するＣＳＦ試料の限定された利用可能性のせいで、その後ヒト試料にて候補生体マーカーを評価するつもりで、当初の評価は多数が利用できるＭＰＳ Ｉイヌに由来するＣＳＦ試料を用いて実施した。個々の未処理のＭＰＳ Ｉイヌに由来する合計１５のＣＳＦ試料が分析に利用可能であり、追加の１５試料は健常対照から得られた。前向き代謝産物評価におけるＭＰＳ ＩイヌのＣＳＦにて上昇したスペルミンを特定した後、遺伝子治療によって処理されたＭＰＳ Ｉイヌ及びネコの以前の研究に由来するＣＳＦ試料と同様に患者の試料にてスペルミンを後向きに測定した。これらの分析のための各群に含まれる対象の数は試料の利用性によって限定され、統計的考慮に基づかなかったので、場合によっては数は統計的比較には不十分である。各状態について定量された細胞の数は、状態当たり＞３０細胞が細胞当たりの分枝長、神経突起数または神経突起分岐で２０％の差異を検出するのに必要とされることを示した予備実験に基づいた。細胞をプレートに入れ、指定された薬剤で処理した後、ウェルをコード化し、細胞画像の取得及び神経突起長や分岐の手動での定量が盲検化したレビュアーによって実施された。異なる基材（チャンバースライド（ＳｉｇｍａＳ６８１５）ではなくポリ－Ｌ－リシン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた組織培養プレート）を用いて野生型とＭＰＳのマウスのニューロンの比較を繰り返し、類似の結果だった。双方の基材を用いて、スペルミン添加の有無で野生型ニューロンの比較を４回行い、類似の結果だった。ＣＳＦ代謝産物のプロファイリング：ＣＳＦ代謝産物のプロファイリングはＭｅｔａｂｏｌｏｎによって行った。

【0279】

処理まで試料を－８０℃で保存した。Ｍｉｃｒｏｌａｂ Ｓｔａｒ（登録商標）システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて試料を調製した。ＱＣ目的での抽出過程における第１の工程に先立って回収標準を加えた。２分間の激しい撹拌のもとでメタノールによってタンパク質を沈殿させ、その後遠心分離した。得られた抽出物を５つの分画：陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化を伴った逆相（ＲＰ）ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる解析のための１つ、陰イオンモードエレクトロスプレーイオン化を伴った（ＲＰ）ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる解析のための１つ、陰イオンモードエレクトロスプレーイオン化を伴った親水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）／ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる解析のための１つ、ＧＣ－ＭＳによるによる解析のための１つ、及びバックアップ
のために取っておいた試料１つに分割した。試料を手短にＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）（Ｚｙｍａｒｋ）に載せ有機溶媒を取り除いた。ＬＣについては、解析についての調製の前に試料を一晩窒素のもとで保存した。ＧＣについては、解析についての調製の前に各試料を一晩真空下で乾燥させた。

【0280】

プラットフォームのＬＣ／ＭＳ部分は、ＷａｔｅｒｓのＡＣＱＵＩＴＹ超高速液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）と、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ－ＩＩ）源及び３５，０００の質量分解能で操作されるＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計と適合させたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ高分解能／精密質量分光計とに基づいた。試料抽出物は乾燥させ、ＬＣ／ＭＳ法のそれぞれに適合性の溶媒で再構成した。各再構成溶媒は固定した濃度での一連の標準を含有して注入及びクロマトグラフィの一貫性を保証した。ＲＰクロマトグラフィについては、一方のアリコートは酸性の陽イオンで最適化した条件を用いて解析し、他方は塩基性の陰イオンで最適化した条件を用いて解析した。各方法は別々の専用のカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８－２．１×１００ｍｍ，１．７μｍ）を利用した。酸性条件で再構成した抽出物は０．１％のギ酸を含有する水とエタノールを用いて勾配溶出した。塩基性抽出物はメタノールと水を用いて、しかし、６．５ｍＭの重炭酸アンモニウムによって同様に溶出した。第３のアリコートは、陰性イオン化とその後の１０ｍＭのギ酸アンモニウムを伴った水とアセトニトリルから成る勾配を用いたＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ２．１×１５０ｍｍ，１．７μｍ）からの溶出を介して解析した。ＭＳ解析はＭＳと動的排除を用いたデータ依存性のＭＳｎ走査との間で交互に行った。走査範囲は方法間でやや変化したが、８０～１０００ｍ／ｚを対象とした。

【0281】

ＧＣ－ＭＳによる解析に定められた試料は、ビストリメチル－シリルトリフルオロアセトアミドを用いて乾燥窒素のもとで誘導体化されるのに先立って、最低１８時間真空下で乾燥させた。誘導体化した試料は、ヘリウムをキャリア気体として６０℃～３４０℃の温度範囲で１７．５分間で５％ジフェニル／９５％ジメチルポリシロキサン溶融石英カラム（２０ｍ×０．１８ｍｍ ＩＤ；０．１８ｕｍの膜厚）にて分離した。電子衝撃イオン化（ＥＩ）を用い、単位質量分解能で操作されるＴｈｅｒｍｏ－ Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｔｒａｃｅ ＤＳＱ高速走査シングル四重極質量分析計で試料を解析した。走査範囲は５０～７５０ｍ／ｚだった。

【0282】

幾つかの種類の対照が実験試料と併せて解析された：データセット全体を通して技術的複製として役立つ各実験試料の少量を採取することによって生成されるプールしたマトリクス試料；工程ブランクとして役立つ抽出された水試料；及び分析した試料ごとに混入した内在性の化合物の測定を妨害しないように慎重に選択され、設備性能のモニタリングを可能にし、クロマトグラフィの調整を助けるＱＣ標準のカクテル。設備の変動性は質量分析計に注入するのに先立って各試料に加えられる標準についての中央値相対標準偏差（ＲＳＤ）を計算することによって決定された。全体的な過程の変動性は、プールしたマトリクス試料の１００％に存在する内在性の代謝産物（すなわち、非設備性標準）すべてについて中央値ＲＳＤを計算することによって決定された。実験試料はプラットフォームでの測定にわたって無作為化し、ＱＣ試料は注入の間で均等に間隔を空けた。

【0283】

代謝産物は、保持時間、分子量（ｍ／ｚ）、好まれる付加体、及び内部調達の断片と同様に関連するＭＳスペクトルを含む、及びＭｅｔａｂｏｌｏｎにて開発されたソフトウエアを用いた品質管理のための目視検査によってキュレートされる化学標準項目の参照ライブラリに実験試料におけるイオンの特徴を自動的に比較することによって特定された。既知の化学項目の特定は精製した標準のメタボロミクスライブラリの項目との比較に基づく。曲線下面積の測定を用いてピークを定量した。各試料における各代謝産物についての生面積の計算を基準化して各測定日についての中央値、従って、各測定について１．０の中
央値を設定することによって設備の日間調整の差異の結果生じる変動を補正した。これは試料間の変動を防いだが、同じグラフ尺度で比較される広く異なる生ピーク面積の代謝産物を許した。欠測値は基準化の後に観察された最小値に帰属させた。

【0284】

定量的ＭＳアッセイ：ＣＳＦ試料（５０μＬ）をスペルミン－ｄ８内部標準（ＩｓｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した。４倍過剰のメタノールと混合し、４℃にて１２，０００×ｇで遠心分離することによって試料からタンパク質を除去した。上清を窒素の流れのもとで乾燥させ、次いで５０μＬの水に再懸濁した。５μＬのアリコートをＬＣ－ＭＳ解析に供した。Ｘｂｒｉｄｇｅ（登録商標）Ｃ１８カラム（３．５μｍ，１５０×２．１ｍｍ）を備えたＷａｔｅｒｓのＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてＬＣ分離を行った。流速は０．１５ｍＬ／分であり、溶媒Ａは０．１％ギ酸であり、溶媒Ｂは０．１％ギ酸を伴った９８／２のアセトニトリル／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）だった。溶出条件は以下のとおりであった：０分で２％Ｂ、２分で２％Ｂ、５分で６０％Ｂ、１０分で８０％Ｂ、１１分で９８％Ｂ、１６分で９８％Ｂ、１７分で２％Ｂ、２２分で２％Ｂ；カラム温度は３５℃だった。Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて以下のパラメータ：４０００Ｖでのスプレー電圧、２７０℃でのキャピラリー温度、３５任意単位でのシース気体圧、２任意単位でのイオンスイープ気体圧、１０任意単位での補助気体圧、２００℃の気化器温度、５０でのチューブレンズオフセット、３５でのキャピラリーオフセット及び０でのスキマーオフセットによる陽イオンモードでＭＳ／ＭＳを実施した。０．００２ｍ／ｚの走査幅及び０．１５秒の走査時間で以下の推移：２０３．１／１１２．１（スペルミン）；２１１．１／１２０．１（スペルミン－ｄ８）をモニターした。

【0285】

動物の処置：動物のプロトコールはすべてペンシルベニア大学の施設内実験動物委員会によって承認された。ＣＳＦの代謝産物のスクリーニングについては、試料は、３～２６カ月齢の正常イヌ及び１～１８ヵ月齢のＭＰＳ Ｉイヌにおける後頭下穿刺法によって採取した。ＭＰＳ Ｉイヌ及びネコにおける遺伝子導入研究は以前記載された（２０、２２）ように実施した。ＣＳＦ試料はベクター投与の６～８カ月後に採取した。マウスの皮質ニューロン実験については、Ｅ１８のＩＤＵＡ－／－またはＩＤＵＡ＋／＋胚から初代皮質ニューロン培養物を調製した。

【0286】

患者の試料：ＣＳＦの代謝産物のプロファイリング：代謝産物のプロファイリングは記載された（Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ、参照）ように行った。各患者の両親または法定後見人からインフォームドコンセントを得た。プロトコールはミネソタ大学施設内治験審査委員会によって承認された。ＣＳＦは腰椎穿刺によって採取した。ＭＰＳ Ｉ患者はすべてハーラー症候群の診断を有し、試料採取に先立って酵素補充療法または造血幹細胞移植を受けていなかった。ＭＰＳ Ｉ患者は６～２６ヵ月齢だった。健常対照は３６及び４８ヵ月齢だった。

【0287】

統計的解析：ランダムフォレスト解析及びヒートマップ生成はＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ ３．０を用いて行った［Ｒ．Ｇ．Ｋａｌｂ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２０，３０６３－３０７１（１９９４）；Ｊ．Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６４，５３１－５３９（１９９５），Ｄ．Ｖａｎ Ｖａｃｔｏｒ，Ｄ．Ｐ．Ｗ，ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１６，４０－５１（２００６）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ
ＥｐｕｂＦｅｂ（１０．１０１６／ｊ．ｃｏｎｂ．２００６．０１．０１１）。生ピークデータを対数変換し、正常試料の値の平均値に対して基準化した。他の統計的解析はすべてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で行った。培養したニューロンの分枝長、神経突起数、及び分岐をＡＮＯＶＡとその後のＤｕｎｎｅｔｔの検定によって比較した。ＣＳＦの
スペルミン及び皮質のＧＡＰ４３はＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓの検定とその後のＤｕｎｎの検定によって比較した。

【0288】

ＧＡＰ４３のウエスタン：Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒを用いて３０Ｈｚで５分間、０．２％ＴｒｉｔｏｎＡ－１００にて前頭皮質の試料をホモジネートした。４℃での遠心分離によって試料を清澄化した。タンパク質濃度は上清にてＢＣＡアッセイによって決定した。試料はＤＴＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴ったＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ緩衝液でインキュベートし、ＭＯＰＳ緩衝液中のビストリス４～１２％のポリアクリルアミドゲル上で分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、５％脱脂粉乳で１時間ブロックした。５％脱脂粉乳で１μｇ／ｍＬに希釈したウサギポリクローナル抗ＧＡＰ４３抗体（Ａｂｃａｍ）とその後の５％脱脂粉乳で１：１０，０００に希釈したＨＲＰ結合ポリクローナル抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって膜を探査した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてバンドを検出した。ＩｍａｇｅＬａｂ５．１（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてデンシトメトリーを行った。

【0289】

神経突起成長アッセイ：１８日齢の胚性皮質ニューロンを上記で記載されているように回収し、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）によって補完された無血清の神経基礎培地（Ｇｉｂｃｏ）にて１００，０００個／ｍＬの濃度でチャンバースライド（Ｓｉｇｍａ Ｓ６８１５）またはポリ－Ｌ－リシン（Ｓｉｇｍａ）をコーティングした組織培養プレートに播いた。播いた２４時間後、２つ組ウェルに処理を適用した（１日目）。６００ミリ秒の手動露出と高コントラストでの１．７０×ゲインを用いて２０倍でＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉにて定量のための位相差画像を撮影した。処理条件に対する個々の盲検によってウェル当たり１０～２０枚の画像を捕捉し、それらをコード化した。盲検化されたレビュアーによって画像はＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）にて８ビット形式に変換され、ＮｅｕｒｏｎＪ（３０）にてトレースされた。細胞体直径、神経突起数、分岐点及び分枝長を手動でトレースした。ＮｅｕｒｏｎＪでトレースされた画像を画像サイズに基づく変換因子を用いてマイクロメートルに変換し、０．１７マイクロメートル／画素の変換因子を用いて２５６０×１９２０画素の画像をマイクロメートルに変換した。

【0290】

組織学：脳組織の処理及びＬＩＭＰ２の免疫蛍光法は以前記載された［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２，２０１８－２０２７，（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＤｅｃ，（１０．１０３８／ｍｔ．２０１４．１３５）］ように行った。

【0291】

ＲＴ－ＰＣＲ：３匹の正常イヌ及び５匹のＭＰＳイヌに由来する前頭皮質の試料を剖検の際、ドライアイスで即時凍結した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってＲＮＡを抽出し、室温にて２０分間、ＤＮＡ分解酵素Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）で処理し、製造元の指示書に従ってＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ランダムヘキサマープライマーと共に高性能ｃＤＮＡ合成キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、精製したＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００を用いたＳｙｂｒ ｇｒｅｅｎＰＣＲによって、アルギナーゼ、オルニチン脱炭酸酵素、スペルミンシンターゼ、スペルミジンシンターゼ、スペルミン・スペルミジンアセチル転換酵素、及びグリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素についての転写物を定量した。

【0292】

リアルタイムＰＣＲシステム：個々の試料すべてで構成されるプールした標準の４倍希釈を用いて各標的遺伝子について標準曲線を生成した。最高の標準に任意の転写物番号を割り当て、個々の試料についてのＣｔ値を標準曲線に基づいて転写物番号に変換した。値
はＧＡＰＤＨ対照に比べて表す。

【0293】

統計的解析：ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ ３．０［Ｊ．Ｘｉａ，ｅｔ ａｌ，ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ，２．０－ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２０１２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＭａｙ，２，２０１２（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｓ３７４）；Ｊ．Ｘｉａ，ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ：ａ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３７，Ｗ６５２－Ｗ６６０（２００９）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪｕｌｙ，１，２００９（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｐ３５６）．Ｊ．Ｘｉａ，ｅｔ ａｌ，ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ ３．０－ｍａｋｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ｍｏｒｅ ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２０１５）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＡｐｒｉｌ，２０，２０１５（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ３８０）］を用いてランダムフォレスト解析及びヒートマップ生成を行った。代謝産物の評価において検出できない値はデータセットで観察された最小値に帰属させた。生ピークデータを正常試料の値の平均値に対して基準化し、対数変換した。他の統計的解析はすべてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で行った。培養したニューロンの分枝長、神経突起数、及び分岐はＡＮＯＶＡとそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの検定によって比較した。ＣＳＦのスペルミン及び皮質のＧＡＰ４３はＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓの検定とその後のＤｕｎｎの検定によって比較した。

【0294】

結果
１．代謝産物のプロファイリングを介した上昇したＣＳＦスペルミンの特定
ＣＳＦ代謝産物の当初の評価はＭＰＳ Ｉのイヌモデルを用いて行った。これらの動物はＩＤＵＡ遺伝子にてスプライス部位に突然変異を持ち、酵素発現の完全な喪失及びＭＰＳ Ｉ患者のそれに類似する臨床的及び組織学的な特徴の発達を生じる（Ｋ．Ｐ．Ｍｅｎｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１４，７６３－７６８，（１９９２）；Ｒ．Ｓｈｕｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１１４，４８７（１９８４））。ＣＳＦ試料は１５匹の正常イヌ及び１５匹のＭＰＳ Ｉイヌから採取した。ＣＳＦ試料はＬＣ及びＧＣ－ＭＳによって代謝産物の相対的な量について評価した。質量分光計によってＣＳＦ試料にて合計２８１の代謝産物を陽性で特定することができた。これらのうち、４７（１７％）は対照に比べてＭＰＳ Ｉイヌで有意に上昇し、８８（３１％）は対照に比べて低下していた。群間で最も異なる５０代謝産物のヒートマップを図１７Ａに示す。代謝産物のプロファイリングは、ＭＰＳ Ｉイヌと正常イヌとの間でポリアミン、スフィンゴ脂質、アセチル化アミノ酸及びヌクレオチドの代謝において顕著な差異を特定した。ランダムフォレストクラスター化解析は、ＭＰＳ Ｉイヌと正常イヌとの間における代謝産物の差異への最大の寄与因子としてポリアミンスペルミンを特定した（図２１）。試料採取の時点で１ヵ月齢未満だったＭＰＳ Ｉイヌ１匹を除いて、ＭＰＳ Ｉイヌでは平均でスペルミンは３０倍を超えて上昇した。ＣＳＦにおけるスペルミンを定量的に測定するために安定同位元素希釈（ＳＩＤ）－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイが開発された。ハーラー症候群の６人の幼児（６～２６ヵ月齢）及び２人の健常対照（３６及び４８ヵ月齢）に由来する試料を評価した。双方の健常対照はアッセイの定量限界（１ｎｇ／ｍＬ）を下回るＣＳＦのスペルミンのレベルを有したのに対して、ＭＰＳ Ｉ患者に由来するＣＳＦ試料は平均で定量限界を１０倍上回った（図１７Ｂ）。ＭＰＳ ＩＨ患者におけるスペルミンの上昇は、スペルミンの結合と取り込みにおけるＨＳの既知の役割に矛盾しないと思われた［Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７８，４７１８１－４７１８９（２００３）；Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ
ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，３３８，３１７－３２３（１９９９）；Ｊ．Ｅ．Ｗｅｌｃｈ，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３２，７４９－７５６（２００８））］。正常イヌ及びＭＰＳ Ｉイヌの脳試料はポリアミン合成経路における転写上調節される酵素について類似のｍＲＮＡ発現レベルを有するので、上昇した合成は上昇したＣＳＦスペルミンの原因ではありそうにないと思われた。

【0295】

２．ＭＰＳに関連する異常な神経突起成長におけるスペルミンの役割
軸索の損傷に続いて、ニューロンはポリアミン合成を上方調節し、それは神経突起の伸長を促進する（Ｄ．Ｃａｉ，ｅｔ ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ，３５，７１１－７１９（２００２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＡｕｇ，１５；Ｋ．Ｄｅｎｇ，ｅｔ
ａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２９，９５４５－９５５２（２００９）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪｕｌ，２９；Ｙ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ，４４，６０９－６２１（２００４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＮｏｖ，１８；Ｒ．Ｃ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２８，７４１－７４９（２００４））。従って我々は、ＭＰＳのニューロンで記載されている異常な神経突起過剰成長の表現型におけるスペルミンの役割を評価した（Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ，８８，２０２－２１３（２０１０））。ＭＰＳ Ｉマウスに由来するＥ１８皮質ニューロンの培養はコロニーの野生型マウスに由来するニューロンよりも培養にて４日後、大きな神経突起数、分岐及び合計分枝長を示した（図１９Ａ～Ｆ）。スペルミン合成の阻害剤であるＡＰＣＨＡによるＭＰＳニューロンの処理は神経突起成長と分岐を有意に減らした。この効果はスペルミンを置き換えることによって反転できた（図１８Ａ～Ｆ）。同じ濃度のＡＰＣＨＡは正常ニューロンの成長に影響を及ぼさなかった。生体内で特定されたものに類似する濃度で野生型ニューロンの培養にスペルミンを添加することは神経突起成長と分岐において有意な増加を生じた（図１８Ａ～Ｆ）。

【0296】

３．ＣＳＦでのスペルミン及びＧＡＰ４３の発現に対する遺伝子治療の効果
生体内でのＧＡＰ４３の発現及びスペルミンの蓄積に対するＩＤＵＡ欠乏の効果を評価するために、我々は、未処理のＭＰＳ Ｉイヌと同様にＣＮＳ指向型の遺伝子治療で処理したものにてＣＳＦのスペルミンのレベル及び脳のＧＡＰ４３のレベルを測定した。我々は以前、イヌＩＤＵＡ導入遺伝子を運ぶアデノ随伴ウイルス血清型９ベクターの髄内注入で処理した５匹のＭＰＳ Ｉイヌを記載した（Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２３，１２９８－１３０７（２０１５）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ａｕｇ）。ＭＰＳ Ｉイヌは正常なＩＤＵＡ酵素に対する抗体を発生することができるので、イヌのうち２匹は新生仔として肝臓ＩＤＵＡ遺伝子導入で予備処理してそのタンパク質に対する免疫寛容を誘導した。寛容化されたイヌは双方とも、ＡＡＶ９処理に続く正常を十分に上回る脳ＩＤＵＡ活性を示した。３匹の寛容化されなかったイヌは様々なレベルの発現を示し、１匹の動物は正常より大きいレベルに達し、他の２匹はほぼ正常の発現を示した（図１９Ａ～Ｄ）。ＣＳＦのスペルミン低下は脳のＩＤＵＡ活性に反比例し、最低のＩＤＵＡ発現の２匹のイヌでは未処理の動物に比べて３倍の低下を示し、最高の発現の動物では２０倍を超える低下があった（図１９Ａ～Ｄ）。ＧＡＰ４３はＭＰＳ Ｉイヌの前頭皮質では上方調節され、発現はベクターで処理した動物すべてにおいて正常化された（図１９Ａ～１９Ｄ）。

【0297】

我々はさらに、様々なベクター用量で処理したＭＰＳ ＩイヌにおけるＣＳＦのスペル
ミンのレベルとＩＤＵＡの再構成との間の関係性を評価した。新生仔肝臓遺伝子導入によってヒトＩＤＵＡに対して予め寛容化したＭＰＳ Ｉイヌを３つの用量（１０^１０、１０^１１、１０^１２ＧＣ／ｋｇ、用量当たりｎ＝２）のうち１つでのヒトＩＤＵＡを発現するＡＡＶ９ベクターの髄内注入によって処理した（Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｎｅｏｎａｔａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＭＰＳ Ｉ ｉｎ ａ ｃａｎｉｎｅ ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｇｍｅ．２０１６．０６．００６））。注入の６ヵ月後、ＣＳＦのスペルミンを評価した（図２０Ａ－２０Ｂ）。ＣＳＦのスペルミンの低下は用量依存性であり、中程度及び高い用量の動物は正常範囲に達したのに対して低用量の動物ではＣＳＦのスペルミンは部分的に低下するに過ぎなかった。ＩＤＵＡ欠乏とＣＳＦスペルミンの蓄積の間での関係を独立して検証するために、我々はＭＰＳ ＩのネコモデルにてＣＳＦスペルミンのレベルを評価した。我々が以前報告した遺伝子治療研究に由来するＣＳＦ試料を用いて、我々は、未処理のＭＰＳ Ｉネコは高いＣＳＦスペルミンを示すことを見いだした（図２０Ａ、２０Ｂ）（Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２２，２０１８－２０２７（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＤｅｃ（１０．１０３８／ｍｔ．２０１４．１３５））。ネコＩＤＵＡを発現する高用量のＡＡＶ９の髄内投与はＣＳＦスペルミンのレベルを正常化した（図２０Ａ）。

【0298】

Ｃ．考察
本研究で我々はＭＰＳ Ｉイヌに由来するＣＳＦ試料の代謝産物のプロファイリングを行い、それはＣＳＦメタボロームにおける実質的な疾患関連の変化を明らかにした。最も顕著な差異は正常対照に比べたスペルミンのレベルでの３０倍を超える上昇だった。この知見はＭＰＳ Ｉ患者と同様にＭＰＳ Ｉのネコモデルにて確認された。スペルミンは高親和性でＨＳに直接結合し、スペルミンの細胞取り込みはこの相互作用に左右される（Ｍ．Ｂｅｌｔｉｎｇ，Ｓ．ＰＥＲＳＳＯＮ，Ｌ．－Ａ．Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，３３８，３１７－３２３（１９９９）；Ｊ．Ｅ．Ｗｅｌｃｈ，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３２，７４９－７５６（２００８））。グリピカン－１のような細胞表面のプロテオグリカンはそのＨＳ部分を介してスペルミンを結合することができ、グリピカンタンパク質のエンドサイトーシスの後、ＨＳ鎖の細胞内切断は結合したスペルミンを細胞内で遊離させる（Ｂｅｌｔｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．上記で引用；Ｋ．Ｄｉｎｇ，Ｓ．ｅｔ
ａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６，４６７７９－４６７９１，（２００１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＤｅｃ，１４）。従って、インタクトなＨＳの再生利用はスペルミンの取り込みに必須である。ＩＤＵＡの欠乏のゆえの不十分なＨＳの再生利用はこのスペルミンの取り込みメカニズムを阻害し、細胞外スペルミンの蓄積をもたらす。或いは、細胞外ＧＡＧがスペルミンを隔離し、平衡をシフトさせて細胞外分布に有利に働いてもよい。この研究におけるＬＣ－ＭＳの試料調製で採用されるメタノール脱タンパク質工程も可溶性ＨＳを沈殿させるということは、ＣＳＦで検出されるスペルミンは結合していないので、ＧＡＧの結合ではなく取り込みの阻害が細胞外スペルミンの蓄積の原因であることを示唆している（Ｎ．Ｖｏｌｐｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｂ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，６８５，２７－３４（１９９６）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＯｃｔ，１１）。神経ネットワークの形成及び維持は神経突起成長及びシナプス形成の正確な制御を必要とする。発生の間、ＣＮＳの環境は神経突起の形成に対してだんだん阻害性になっていき、ミエリン関連タンパク質が成人
の脳では神経突起成長を大きく遮断している。神経突起成長の低下に向かうこの発生上のシフトはＧＡＰ４３の発現と平行する（Ｓ．Ｍ．Ｄｅ ｌａ Ｍｏｎｔｅ，ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６，１６１－１６８（１９８９）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ４／１／）。ＭＰＳのニューロンが示す持続するＧＡＰ４３の発現及び誇張された神経突起の伸長が阻害と成長の促進シグナルのこの正常な均衡を妨げ、その結果、異常な結合性及び損傷された認知を生じてもよい（Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ，上記で引用）。ＨＳの蓄積が神経突起成長の増加にどのようにつながるのかは解明されていない。多数の研究が神経突起の伸長にポリアミンを関与させ；軸索の損傷に続いて、スペルミン及びその前駆体であるプトレシン及びスペルミジンの合成についての律速酵素が上昇し、ミエリンからの阻害性シグナルが存在しても神経突起の伸長の増強を可能にする（Ｃｉａ（２００２），Ｄｅｎｇ（２００９），Ｇａｏ（２００４）すべて上記で引用）。さらに、プトレシンによるニューロンの処理はＣＳＦに直接注入されると神経突起成長を誘導し、効果はスペルミン合成の阻害剤によって阻止される（Ｄｅｎｇ（２００９）；上記で引用）。ポリアミンが神経突起成長に対して効果を発揮するメカニズムは知られていない。可能性のある標的の１つは、ＮＭＤＡ受容体であり、その活性化はスペルミンの結合によって強化される。（Ｊ．Ｌｅｒｍａ，Ｎｅｕｒｏｎ，８，３４３－３５２（１９９２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ２／／（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０８９６－６２７３（９２）９０３００－３））。ＮＭＤＡのシグナル伝達は神経突起の伸長を誘導し、受容体のスペルミン感受性のサブユニットは発生の間、高度に発現される（Ｄ．Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１４，２６０３－２６１７（２００８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＡｕｇ，１５（１０．１０１６／ｊ．ｙｅｘｃｒ．２００８．０６．００９）；Ｒ．Ｇ．Ｋａｌｂ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｅｎｄｒｉｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２０，３０６３－３０７１（１９９４）；Ｊ．Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６４，５３１－５３９（１９９５））。とりわけ、多数の神経栄養因子はＨＳが修飾した受容体を介して結合し、細胞外マトリクスにおけるＨＳとの相互作用は神経突起成長に影響を及ぼすことができる（Ｄ．Ｖａｎ Ｖａｃｔｏｒ，ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１６，４０－５１（２００６）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ
ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＦｅｂ（１０．１０１６／ｊ．ｃｏｎｂ．２００６．０１．０１１））。従って、スペルミンの蓄積はＭＰＳ Ｉにおける異常な神経突起成長を促進する幾つかの因子の１つであってもよい。ＣＳＦ試料が評価された１５匹のＭＰＳ Ｉイヌのうち、１匹だけがスペルミン濃度の正常範囲内に入った。２８日齢で、これは研究に含まれた最も幼若な動物だった。この研究はそれがハーラー症候群の乳児で６ヵ月齢までにすでに上昇することを実証しているが、この知見はスペルミンの蓄積が年齢依存性であってもよいことを示している。将来の研究はＭＰＳ患者にてＣＳＦスペルミンのレベルを長期にわたって評価すべきである。ほとんどの患者は発達遅滞の発症に先立って１～２年の正常な発達を経験するので、もし、スペルミンがＭＰＳ患者の年齢と共に増加するのであれば、これは認知低下の動態を説明し得る。神経突起成長を変化させる代謝産物の蓄積を誘発する損傷されたＨＳ代謝の可能性は、ＭＰＳにおける酵素の欠乏と異常な神経突起成長の表現型との間での新規の関係性を指し示し、それはこれらの疾患に関連する認知不全を説明してもよい。将来の研究は他のＭＰＳにおけるスペルミンの上昇を確認すべきである。これらの知見はまた、ＣＳＦのスペルミンが、ＭＰＳのための新規のＣＮＳ指向型の治療法の薬物動態を評価するための非侵襲性の生体マーカーとして有用であることも示している。ＣＮＳ指向型の治療法についての将来の試験は認知評価項目とＣＳＦスペルミンの変化との間の相関を評価すべきである。

【0299】

実施例１２：ＣＴ誘導のＩＣＶ送達装置
Ａ．前処置スクリーニングの評価
１．プロトコール来診１：スクリーニング
治験責任医師は、対象（または指定された介護者）がインフォームドコンセントにサインする際、完全に情報が与えられるために嚢内（ＩＣ）処置、投与処置自体及び可能性のある安全性リスクすべてにつながるスクリーニング過程を記載するであろう。

【0300】

ＩＣ処置、既往歴、併用薬物、身体検査、生命兆候、心電図（ＥＣＧ）及び臨床検査成績についての対象の適格性のスクリーニング評価において以下が実施され、神経放射線科医／神経外科医／麻酔科医に提供されるであろう。

【0301】

２．間隔：スクリーニングから試験来訪２まで
適格性をよく調べる適当な時間を与えるために、最初のスクリーニング来訪と試験来訪２（０日目）前の１週間までの間の時間で以下の手順が行われるべきである。
・ガドリニウムの有無での頭部／頸部の磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）［注：対照はガドリニウムを受け取る好適な候補者でなければならない（すなわち、ｅＧＦＲ＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２）］
・頭部／頸部のＭＲＩに加えて、治験医師は屈曲／伸長試験を介した頸部のさらなる評価の必要性を判定するであろう
・ＭＲＩプロトコールにはＴ１、Ｔ２、ＤＴＩ、ＦＬＡＩＲ及びＣＩＮＥのプロトコール画像が含まれるであろう
・ＣＳＦの流れの適切な評価及びＣＳＦ空間の間での連絡の考えられる遮断または喪失の特定を可能にする頭部／頸部のＭＲＡ／ＭＲＶ（注：硬膜内／経硬膜手術の既往を持つ対象は除外されてもよく、またはさらなる検査（たとえば、放射線ヌクレオチド大槽造影法）を必要としてもよい）
・神経放射線科医／神経外科医の対象処置評価会議：３施設からの代表者が電話会議（またはウェブ会議）を有して利用できる情報（走査、既往歴、身体検査、臨床検査等）に基づいてＩＣ処置について各対象の適格性を議論するであろう。あらゆる試みを行って対象を損なうＩＣ処置または評価に向かう手続きの際の合意を達成すべきである（すなわち、各メンバーは行われた決断を受け入れる準備万端であるべきである）
・麻酔術前評価、ＭＰＳ患者の特定の生理的必要性に留意しながら、気道、頸部（短縮した／肥厚した）及び頭部の可動域（頸部屈曲の程度）の詳細な評価を伴った－２８日目～１日目

【0302】

３．１日目：コンピュータ断層撮影室及び投与用のベクターの調製
ＩＣ処置に先立って、ＣＴ室は以下の設備及び薬物が存在することを確認するであろう：
・成人腰椎穿刺キット（施設ごとに供給される）
・ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２２または２５ゲージ×３～７”のクモ膜下穿刺針（Ｑｕｉｎｃｋｅ先端部）
・インターベンション医師の裁量で使用される（クモ膜下穿刺針の導入のための）同軸導入針（たとえば、１８Ｇ×３．５”）
・旋回（回転）オスルアーロック付きの四方小口径活栓
・メスルアーロックアダプター付きのＴコネクタ延長セット（配管）、およそ６．７”の長さ
・オムニパック１８０（イオヘキソール）、クモ膜下腔内投与用
・静脈内（ＩＶ）投与用のヨウ素化造影剤
・注入用の１％リドカイン溶液（成人ＬＰキットで供給されなければ）
・予め充填された１０ｃｃ生理食塩水（無菌）の水洗注射器
・Ｘ線不透過性マーカー（複数可）
・外科用準備装備／髭剃り刃
・挿管された対象の正しい位置決めを可能にする枕／支持体
・気管内挿管の装置、全身麻酔用の機械、及び人工呼吸器
・手術中の神経生理学的なモニタリング（ＩＯＮＭ）装置（及び必要な人材）
・別々の薬局マニュアルに従って調製され、ＣＴ／手術室（ＯＲ）の部屋に運ばれるＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡを含有する１０ｃｃの注射器

【0303】

４．１日目：対象の準備及び投薬
・試験及び手順についてのインフォームドコンセントが確認され、カルテ及び／または試験ファイルの中で文書化されるであろう。放射線科及び麻酔科のスタッフからの手順に関する別々の合意が施設内要件によって得られるであろう。
・試験対象は施設内指針に従って適当な病院内看護ユニットにて取り付けられる静脈内アクセスを有するであろう（たとえば、２つのＩＶアクセス部位）。静脈内流体は麻酔科医の裁量で投与されるであろう。
・麻酔科医の裁量で及び施設内指針ごとに、試験対象は、適当な患者看護ユニット、保持区域または外科／ＣＴの処置室に誘導され、そこで全身麻酔の投与と共に気管内挿管を受けるであろう。
・腰椎穿刺を行い、先ず５ｃｃの脳脊髄液（ＣＳＦ）を取り出し、その後髄内に造影剤（オムニパック１８０）を注入して大槽の視覚化を助けるであろう。患者の適当な位置決め操作を行って造影剤の大槽内への拡散を促す。
・すでにそのように行われていないのであれば、手術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）装置を対象に取り付けるであろう。
・対象は腹臥位または側臥位でＣＴスキャナー台に載せられるであろう。
・適当と見なされれば、対象は、術前評価の間安全であると判定される程度に頸部屈曲を提供し、且つ位置決めの後文書化される正常な神経生理学的なモニターシグナルを提供する方法で位置決めされるであろう。
・以下の試験スタッフ及び治験医師（複数可）が存在することを確認し、施設内で特定されるであろう。
_゜処置を行うインターベンション医師／神経外科医
_゜麻酔科医及び呼吸器技師
_゜看護師及び医師助手
_゜ＣＴ（またはＯＲ）技師
_゜神経生理学技師
_゜現場研究コーディネーター
・頭蓋底の下の患者の皮膚は適宜剃られるであろう。
・ＣＴスカウト画像化を行い、その後、必要とみなされればインターベンション医師よる処置前計画のＩＶ造影剤でのＣＴを行い標的の位置を突き止め、脈管構造を画像化するであろう。
・いったん標的部位（大槽）が特定され、針の軌道が計画されると、皮膚が用意され、施設内指針のとおりに無菌技法を用いて手術用覆布で覆われるであろう。
・インターベンション医師によって指示されたようにＸ線不透過性マーカーが標的皮膚の位置に置かれるであろう。
・マーカーの下の皮膚は１％リドカインの浸潤を介して麻酔されるであろう。
・同軸導入針を使用する選択肢と共に、２２Ｇまたは２５Ｇのクモ膜下穿刺針が大槽に向かって進められるであろう。
・針を進めた後、施設内設備を用いて実現可能な最薄のＣＴスライス厚さ（理想的には
≦２．５ｍｍ）を用いてＣＴ画像が得られるであろう。連続ＣＴ画像は、針及び関連する軟組織（たとえば、傍脊柱筋群、骨、脳幹及び脊髄）の適切な視覚化を可能にする可能な最低放射線量を使用すべきである。
・正しい針の配置は、針ハブにおけるＣＳＦの観察及び大槽内での針の視覚化によって確認されるであろう。
・インターベンション医師は、ベクターを含有する注射器が滅菌野に近いが、その外側に置かれることを確認するであろう。ベクターを取り扱う、または投与することに先立って、施設は、滅菌野内での処置を支援するスタッフによって手袋、マスク及び眼の保護が行われることを確認するであろう（滅菌野の外側の他のスタッフはこれらの手順を取る必要はない）。
・短い（約６”）の延長配管を挿入されたクモ膜下穿刺針に取り付け、それを次いで四方活栓に取り付けるであろう。この装置が対象のＣＳＦでいったん自給されると、１０ｃｃの予め充填された生理食塩水の水洗注射器が四方活栓に取り付けられるであろう。
・ベクターを含有する注射器がインターベンション医師に手渡され、四方活栓のポートに取り付けられるであろう。
・ベクターを含有する注射器に対する活栓のポートがいったん開放されると、注入の間に過剰な力がプランジャーにかからないように注意を払いながら、注射器の内容物はゆっくり（およそ１～２分間かけて）注入されるべきである。
・ＡＡＶ９.ｈＩＤＵＡ試験ベクターを含有する注射器の内容物がいったん注入されると
、取り付けられた予め充填された注射器を用いて活栓と針の構築が１～２ｃｃの生理食塩水で洗い流され得るように活栓が回されるであろう。
・準備ができると、インターベンション医師は彼／彼女が対象から装置を取り外すことをスタッフに注意喚起する。
・１回の動きで、針、延長配管、活栓及び注射器が対象からゆっくり取り外され、バイオハザード廃棄物容器または硬質容器（針用）の中に廃棄するための外科用トレイに置く。・針の挿入部位は出血またはＣＳＦの漏出の兆候について調べ、治験医師によって指示されたように処理されるであろう。指示されたように、ガーゼ、外科用テープ及び／またはＴｅｇａｄｅｒｍ包帯を用いて部位が手当てされるであろう。
・対象はＣＴスキャナーを出て、仰臥位でストレッチャーに乗るであろう。
・麻酔が中断され、麻酔後の看護についての以下の施設内指針について対象が看護されるであろう。神経生理モニターはこの研究対象から取り除かれる。
・回復の間、対象が横たわるストレッチャーの頭部をやや高くすべきである（約３０度）。
・対象は、施設内指針のとおりに好適な麻酔後看護ユニットに移されるであろう。
・対象が適正に意識を回復し、安定な状態になった後、彼／彼女はプロトコールが命じる評価のために適当なフロア／ユニットに収容されるであろう。神経学的な評価がプロトコールのとおりに続き、治験責任医師は病院スタッフ及び研究スタッフと共同で対象の看護を監督する。

【0304】

実施例１３：大型動物における投与の髄内経路の評価
この研究の目的は、脳室内（ＩＣＶ）注入及び腰椎穿刺を介した注入を含む、ＣＳＦへの投与のさらに日常的な方法を評価することであった。手短には、この研究では、ＩＣＶとＩＣのＡＡＶ投与をイヌで比較した。ベクターの投与を非ヒト霊長類にて腰椎穿刺を介して評価し、一部の動物はベクターの頭蓋分布を改善することが示唆されている手順である、注入後のトレンデレンブルグ体位に置いた。イヌの研究では、ＩＣＶ及びＩＣのベクター投与は脳及び脊髄の全体を通して類似する効率的な形質導入を生じた。しかしながら、ＩＣＶコホートの動物は、明らかに導入遺伝子産物に対する重度のＴ細胞応答のせいで脳炎を発症した。ＩＣＶコホートのみでのこの導入遺伝子に特異的な免疫応答の発生は導入遺伝子発現の部位での注入手順に由来する局在化した炎症の存在に関連することが疑われる。ＮＨＰの研究では、腰椎槽へのベクター投与に続く形質導入効率は、極度に大きな注入容量（ＣＳＦ総容量のおよそ４０％）を用いることによって我々の以前の研究に比べて改善した。しかしながら、このアプローチはＩＣ投与よりも依然として効率が悪い。注入の後トレンデレンブルグ体位に動物を置くことは追加の利益を提供しなかった。しかしながら、大きな注入容量はベクターの頭蓋分布を改善できることが見いだされた。

【0305】

ＡＡＶの髄内送達の有効性を最大化するためには、ＣＳＦへのベクター投与の最適な経路を決定することが決定的であろう。我々は以前、後頭下穿刺法による大槽（脳髄槽）へのベクターの注入は非ヒト霊長類にて有効なベクター分布を達成するのに対して、腰椎穿刺を介した注入は脊髄の実質的に低い形質導入を生じ、脳に分布せず、投与の経路の重要性を強調することを報告した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ，２０１４；１］。他は、一般的な臨床処置である側脳室へのベクター送達は効果的なベクター分布を生じることを示唆している［Ｈａｕｒｉｇｏｔ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ａｕｇ，２０１３；１２３（８）：３２５４－３２７１］。腰椎穿刺を介した送達は、注入後トレンデレンブルグ体位に動物を置いて頭蓋のベクター分布を促すことによって改善できることも報告されている［Ｍｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ，３１，２０１４］。この研究では、イヌにおける緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を発現するＡＡＶ９ベクターの脳室内及び嚢内の投与を比較した。脳室内送達は導入遺伝子特異的な免疫応答の追加のリスクを運んでもよいが、我々は、双方の経路がＣＮＳ全体にわたる有効な分布を達成することを見いだした。我々はまたＮＨＰにおける腰椎穿刺によるベクター送達、及び注入後トレンデレンブルグ体位に動物を置くことの効果も評価した。我々は大きな注入容量がベクターの頭蓋分布を改善できることを見いだしたが、注入後の位置決めの明瞭な効果はなかった。

【0306】

Ａ．材料及び方法
１．ベクターの作製：ＧＦＰベクターは、サイトメガロウイルスの前初期エンハンサを伴ったニワトリβアクチンプロモータと、人工イントロンと、増強緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡと、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子と、ウサギβグロビンポリアデニル化配列とを含む発現カセットを運ぶＡＡＶ血清型９のカプシドから成った。ＧＵＳＢベクターは、サイトメガロウイルスの前初期エンハンサを伴ったニワトリβアクチンプロモータと、人工イントロンと、イヌＧＵＳＢのｃＤＮＡと、ウサギβグロビンポリアデニル化配列とを含む発現カセットを運ぶＡＡＶ血清型９のカプシドから成った。ベクターはＨＥＫ２９３細胞の三重形質移入によって作製し、以前記載された［Ｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ，２０１０；２１（１０）：１２５９－１２７１］ようにイオジキサノール勾配で精製した。

【0307】

２．動物実験
イヌはすべて、研究における動物の飼育と使用に関する国立衛生研究所とＵＳＤＡの指針のもとでペンシルベニア大学獣医学部のヒト遺伝性疾患の動物モデルのための国立委託センターで育てられた（ＮＩＨ ＯＤ Ｐ４０－０１０９３９）。

【0308】

３．ＮＨＰの研究
この研究には９歳～１２歳の間の６匹のカニクイザルが含まれた。動物は１回につき４～８ｋｇの間で注入された。注入に先立ってベクター（２×１０^１３ＧＣ）を５ｍＬのオムニパック（イオヘキソール）１８０造影剤で希釈した。腰椎穿刺を介したベクターの注入は以前記載された［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ，２０１４；１］ように行った。髄内空間への正しい注入は蛍光透視法によって検証した。トレンデレンブルグ群の動物については、ベッドの頭部を注入の直後１０分間３０度下げた。安楽死及び組織採取は以前記載された［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ，２０１４；１］ように行った。

【0309】

４．イヌの研究
この研究には１歳のＭＰＳ Ｉイヌ６匹が含まれた。ＩＣＶ処理したイヌすべてにおいてベースラインＭＲＩを行い、注入の組み合わせを計画した。嚢内注入は以前記載された［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇ，２０１５；２３（８）：１２９８－１３０７］ように行った。ＩＣＶの注入については、静脈内プロポフォールでイヌを麻酔し、気管内挿管し、イソフルランで麻酔下を維持し、定位固定枠に入れた。皮膚を無菌で準備し、注入部位の上で切開した。注入部位で単一の穿頭孔を開け、それを介して２６ゲージの針を所定の深さに進めた。ＣＳＦの戻りで配置を確認した。ベクター（１ｍＬ中で１．８×１０^１３ＧＣ）をゆっくり１～２分かけて注入した。安楽死及び組織採取は以前記載された［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇ，２０１５；２３（８）：１２９８－１３０７］ように行った。

【0310】

５．組織学
ＧＰＦの発現の評価について記載されたように脳を処理した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ，２０１４；１］。ＧＵＳＢ酵素の染色及びＧＭ３の染色は以前記載された［Ｇｕｒｄａ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ
ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ，８，２０１５．］ように行った。

【0311】

６．ＥＬＩＳＰＯＴ
剖検のとき、ベクターで処理したイヌからヘパリン処理した試験管に血液を採取した。Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって末梢血単核細胞を単離した。ＡＡＶ９カプシドペプチド及びＧＦＰペプチドに対するＴ細胞応答はインターフェロンガンマのＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。ＡＡＶ９及びＧＦＰのペプチドライブラリは１０アミノ酸が重複した１５量体として合成した（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）。ＡＡＶ９ペプチドライブラリは３つのプール：ペプチド１～５０のプールＡ、ペプチド５１～１００のプールＢ及びペプチド１０１～１４６のプールＣにグループ分けした。ＧＦＰペプチドライブラリも３つのプールにグループ分けした。ホルボール１２－ミリステート１３－アセテートに加えたイオノマイシン塩（ＰＭＡ＋ＩＯＮ）を陽性対照として使用した。ＤＭＳＯを陰性対照として使用した。細胞をペプチドで刺激し、記載されたようにインターフェロンガンマの分泌を検出した。応答が１００万個のリンパ球当たり双方とも５５スポット形成単位（ＳＦＵ）を超え、且つＤＭＳＯ陰性対照の少なくとも３倍であった場合、応答を陽性と見なした。

【0312】

７．生体分布
剖検のとき、生体分布についての組織をドライアイスで即座に凍結した。ＤＮＡの単離及びＴａｑＭａｎＰＣＲによるベクターゲノムの定量は記載された［Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｏｖ，０１１；２２（１１）：１３８９－１４０１］ように行った。

【0313】

８．ＧＵＳＢ酵素アッセイ
ＧＵＳＢ活性は記載された［Ｇｕｒｄａ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ，８，２０１５］ようにＣＳＦにて測定した。

【0314】

Ｂ．結果
１．イヌにおける脳室内及び嚢内のベクター送達の比較
リソソーム蓄積症であるムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）のイヌモデルを用いた我々の以前の研究は、大槽へのＡＡＶ９の注入は脳及び脊髄全体を効果的に標的とすることができることを実証した［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇ，２０１５；２３（８）：１２９８－１３０７］。この研究では、我々は、成熟ＭＰＳ Ｉイヌの大槽または側脳室に投与されたＧＦＰレポーター遺伝子を発現するＡＡＶ９ベクターの分布を比較した。ベクター（１．８×１０^１３ゲノムコピー）の大槽への１ｍＬの単回注入によって３匹のイヌを処理した。追加の３匹のイヌは側脳室への同じベクターの単回ベクター注入を受けた。ＩＣＶ注入によって処理したイヌについてはベースラインＭＲＩを行って注入のためのさらに大きな側脳室を選択し、目標座標を定義する。定位固定枠を用いて注入を行い、指定された脳室を正確に標的とした。

【0315】

ＩＣベクター注入で処理した３匹のイヌは研究全体にわたって健常に見えた。ベクターの生体分布及び導入遺伝子の発現を評価するためにベクター注入の２週間後、それらを安楽死させた。ＩＣ処理したイヌでは、肉眼で、または顕微鏡で脳の病変は観察されなかった（図１４）。定量的ＰＣＲによるベクターゲノムの測定は脳の採取した領域及び脊髄すべての全体を通してベクターの沈着を明らかにした（図１５）。ベクターゲノムの分布と一致して、大脳皮質のほとんどの領域と同様に脊髄全体にわたって導入遺伝子の強力な発現が検出できた。脊髄の組織学はアルファ運動ニューロンの強い形質導入について顕著であり、形質導入の勾配は胸椎及び腰椎のセグメントをより好んだ。

【0316】

ＩＣＶ注入のベクターで処理した３匹のイヌは当初、処置に続いて健常に見えた。しかしながら、１匹の動物（Ｉ－５６７）は注入の１２日後死体で見つかった。１匹の動物（Ｉ－５６５）は安楽死の前に混迷状態になり、他方（Ｉ－５６８）は顔面筋の衰弱を示し始めたが、この２匹は指定された１４日目の剖検の時点まで生き延びた。これらの臨床的知見は有意な肉眼的な脳の病変に相関した。３匹の動物すべてに由来する脳は、死体で見つかった動物における関連する出血と共に、針跡周囲の変色を示した。組織学的な評価は注入部位周辺の領域での重度なリンパ球性炎症を明らかにした。血管周囲のリンパ球の浸潤も各動物の脳全体にわたって観察された。免疫毒性についてのこの証拠を考えると、ＡＡＶ９カプシドタンパク質及びＧＦＰ導入遺伝子の双方に対するＴ細胞応答は、剖検の際にＩＣＶ処理イヌの１匹（Ｉ－５６５）から採取した末梢血試料で評価された。インターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴはＧＦＰに対して向けられた強力なＴ細胞応答を示したが、カプシドペプチドに対する応答の証拠はなかった。このことは観察された脳炎が導入遺伝子産物に対する細胞介在性の免疫応答によって引き起こされたことを示唆している。

【0317】

脊髄での形質導入はＩＣコホートにおいて幾分多かったが、ＩＣＶで処理した動物におけるベクターの分布はＩＣ処理群で見られたものと類似した（図１５）。ＧＦＰの発現はＩＣＶで処理した動物で調べたＣＮＳの領域全体にわたって観察された。

【0318】

ＧＦＰを発現しているＡＡＶ９ベクターのＩＣＶ投与に関連する毒性は導入遺伝子産物に対する免疫応答に一致した。そのような免疫応答は、ＧＦＰ導入遺伝子が全体として異物であるので特に深刻であり得る；動物は内在性タンパク質に類似する導入遺伝子に対してさらに免疫的に寛容であってもよい。

【0319】

２．ＮＨＰにおける腰椎穿刺によるＡＡＶ９投与の後のＣＮＳの形質導入に対するトレンデレンブルグ体位の効果
我々は以前、ＮＨＰの大槽または腰椎槽へのＡＡＶ９の注入を比較し、腰椎経路は脊髄を標的とするのに１０倍効率が低く、脳を標的とするのに１００倍効率が低いことを見いだした［Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ，２０１４；１］。その後、他の研究者が、腰椎穿刺によるＡＡＶ９の投与を用いたさらに良好な形質導入を実証し、ベクターの頭蓋分布の改善は注入後、動物をトレンデレンブルグ体位に置くことによって達成された［Ｍｙｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ，３１，２０１４］。このアプローチでは、ベクターは過剰容量の造影剤に希釈され、溶液の密度を高め、トレンデレンブルグにある間、重力が推進する分布を促進する。Ｌ３－４間隙にてＧＦＰを発現するＡＡＶ９（２×１０^１３ゲノムコピー）の単回注入で６匹の成熟カニクイザルを処理した。ベクターは最終容量５ｍＬのイオヘキソール１８０造影剤に希釈した。動物のうち４匹は、注入直後の１０分間、処置台の頭側を－３０度の角度の状態で置いた。１０分後、蛍光透視画像を捕捉してＣＳＦにおける造影剤分布を検証した。とりわけ、この大きな注入容量（動物のＣＳＦ総容量のおよそ４０％）［Ｒｅｉｓｅｌｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９６２；２６７（２５）：１２７３－１２７８］に伴って、トレンデレンブルグ体位に置かれていない動物においてでさえ造影剤は脊髄クモ膜下腔に沿って及び基底槽の中に迅速に分布した（図１８）。ＰＣＲによるベクターゲノムの分布（図１９）及びＧＦＰ発現（図２０）の解析は脳及び脊髄の全体にわたる形質導入を実証した。形質導入された細胞の数または分布に対する注入後位置決めの明らかな効果はなかった。以前報告されたように、髄内のＡＡＶ投与の後、末梢及び肝形質導入へのベクター逃避があった［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ，２０１４；１；Ｈａｕｒｉｇｏｔ，ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ａｕｇ，２０１３；１２３（８）：３２５４－３２７１］。肝臓形質導入の程度はＡＡＶ９に対する既存の中和抗体（ＮＡｂ）の存在に依存する。６匹の動物のうち４匹は検出できるベースラインのＡＡＶ９のＮＡｂ（＜１．５の力価）を有さず、２匹の動物（４０５１及び０７－１１）は１：４０の力価でＡＡＶ９に対する検出できる既存の抗体を有した。以前の結果に一致して、既存の抗体は肝臓形質導入を阻止し、脾臓へのベクターの分布の増加を生じた［Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｏｖ，２０１１；２２（１１）：１３８９－１４０１，ｂｕｔ ｈａｄ ｎｏ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ
ＣＮＳ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ；Ｈａｕｒｉｇｏｔ，ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ａｕｇ，２０１３；１２３（８）：３２５４－３２７１］。

【0320】

Ｃ．考察
後頭下穿刺法は臨床現場では一般的な手順ではないので、我々は、側脳室及び腰椎槽を含むＣＳＦアクセスのさらに日常的な部位を評価した。ここで、我々は、高い密度のベクター溶液と注入後のトレンデレンブルグ体位とを採用して腰椎領域から頭蓋へのベクターの分布を改善する方法を評価した。

【0321】

イヌの研究では、ＩＣ及びＩＣＶのベクター注入は双方とも似たように有効なベクターの分布を生じたが、ＩＣＶ群でのみ脳炎が発生した。ＧＦＰ導入遺伝子に対するＴ細胞応答はＩＣＶで処理したイヌでのみ検出できたということは、これらの動物で見られたリンパ球性脳炎は導入遺伝子に特異的な免疫応答のせいだったことを示唆している。新しい抗原に対するＴ細胞応答の誘導は、２つの要素―ナイーブＴ細胞によるタンパク質に由来するエピトープの認識と、Ｔ細胞の活性化を促進する炎症性の「危険シグナル」とを必要とする。ＡＡＶは自然免疫系を活性化せず、それによって炎症性シグナルを回避し、ナイーブリンパ球が新しく発現された抗原に遭遇する際に免疫ではなく寛容を促進するので、ＡＡＶは導入遺伝子産物に対する免疫を引き出すことなく外来性導入遺伝子を発現することができると考えられている。脳実質に浸透し、外来性導入遺伝子産物が発現される同じ位
置で発生する外傷によって引き起こされる局所の炎症は、導入遺伝子産物に対する免疫応答を誘導するのに必要とされる危険シグナルを提供してもよい。このことは、ＩＣ注入ではなく、脳への直接注入によって送達されるＡＡＶベクターから発現される酵素に対する細胞介在性免疫応答を発生するＭＰＳ Ｉイヌにおける以前の研究によって支持されている［Ｃｉｒｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．Ａｕｇ，２００６；６０（２）：２０４－２１３；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｕｇ，２０１５；２３（８）：１２９８－１３０７］。そのような免疫応答についての潜在力は、導入遺伝子産物が異物として認識されるかどうかに左右され―内在性にも産生されるタンパク質を発現するベクターの送達については、注入によって引き起こされる炎症反応でさえも自己タンパク質に対する寛容を壊さないかもしれない。同じことは、導入遺伝子産物に類似するタンパク質の産生を可能にするミスセンス変異を運ぶ劣性疾患の患者について真実であってもよい。従って、免疫のリスクは、患者集団及び導入遺伝子産物に応じて変化し、場合によっては導入遺伝子に対する破壊的なＴ細胞応答を防ぐのに免疫抑制が必要であってもよい。本知見は、有害な免疫応答のリスクは投与のＩＣＶ経路ではなくＩＣ経路を用いて軽減されそうであり得ることを示唆している。

【0322】

ＮＨＰにおける腰椎穿刺を介したＡＡＶ９投与の研究は、我々が投与のこの経路で以前観察したものより大きなＣＮＳ全体にわたる形質導入を示した。この差異は、ベクターを過剰容量の造影剤に希釈するために必要だった、本研究における大きな注入容量のせいであると思われる。以前の研究は、そのような大きな注入容量（ＣＳＦ容量のおよそ４０％）が注入された物質をサルの基底槽及びさらに脳室ＣＳＦの中に直接入れることができることを示している［Ｒｅｉｓｅｌｂａｃｈ，上記で引用］。このアプローチを再現することは、患者に日常的には投与されない極端に大きな注入容量（＞６０ｍＬ）を必要とすることを考えると、このアプローチをヒトに転換する可能性は不明である。さらに、この高容量のアプローチによったとしても、腰椎穿刺を介した注入はＩＣ送達による以前の成績よりも効率が低かった。この以前の研究では、動物は体重によって投与されたので、１匹の動物だけがここで使用されたものと同等のＩＣベクター投与を受けた［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２／１０／ｏｎｌｉｎｅ，２０１４；１］。その動物が脳及び脊髄にて平均で３倍多いベクターの分布を有していたということは、腰椎槽への非常に大きな容量のベクター送達でさえＩＣ送達よりも効率が低いことを示している。文献での報告とは対照的に、我々は腰椎へのベクター注入後に動物をトレンデレンブルグ体位に置くことに対する追加の利益を見いださなかった［Ｍｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｃｔ，３１，２０１４］。

【0323】

まとめて、これらの知見は、このアプローチが腰椎穿刺を介した投与よりも効率的なベクターの分布を達成しているので大槽のレベルでのベクターの投与を支持し、ＩＣＶ投与よりも導入遺伝子産物に対する免疫のリスクが少ないと思われる。大槽へのベクターの送達は、前臨床試験で使用された後頭下穿刺のアプローチを用いて臨床的に実施され得る。さらに、側面アプローチ（Ｃ１－２穿刺）を用いた第１頸椎と第２頸椎の間のクモ膜下腔への注入は、大槽への注入部位の近傍を考えると類似のベクター分布を生じる可能性がある。Ｃ１－２のアプローチは、後頭下穿刺法とは異なってそれはＣＳＦのアクセスに、特に造影剤の髄内投与に臨床的に広く使用されるという追加の利点を有する。

【0324】

本出願は、２０１７年１月３１日に出願された米国仮特許出願番号６２／４５２５６０、２０１６年７月２８日に出願された米国仮特許出願番号６２／３６７，７９８、２０１
６年５月１６日に出願された米国仮特許出願番号６２／３３７，１７８、２０１６年４月１６日に出願された米国仮特許出願番号６２／３２３，２７１、及び２０１６年２月３日に出願された米国仮特許出願番号６２／２９０，５４７のように参照によって本明細書に組み入れられる配列表を含有する。本明細書で引用されている出版物、特許及び特許出願はすべて、それぞれの出版物、特許及び特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのようにその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。前述の本発明は理解の明瞭さの目的で説明及び例示のために少し詳しく記載されているが、添付のクレームの精神または範囲から逸脱することなく特定の変更及び改変をそれらに対して行うことができることは、本発明の教示の観点から当業者には容易に明らかであろう。

【0325】

表
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は数的識別子＜２２３＞のもとで配列を含有するフリーテキストのために提供される。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18-1】

【図18-2】

【図19-1】

【図19-2】

【図20】

【図21】

【手続補正書】

【提出日】2023-02-17

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

明細書に記載された発明。

【外国語明細書】