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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023062338
(43)【公開日】2023-05-08
(54)【発明の名称】がんワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/385 20060101AFI20230426BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230426BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230426BHJP
A61K 47/58 20170101ALI20230426BHJP
C07K 14/82 20060101ALN20230426BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20230426BHJP
C07K 14/005 20060101ALN20230426BHJP
【ＦＩ】
A61K39/385
A61P35/00
A61K39/00 H
A61K47/58
C07K14/82 ZNA
C07K14/705
C07K14/005
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021172241
(22)【出願日】2021-10-21
(71)【出願人】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(71)【出願人】
【識別番号】503420833
【氏名又は名称】学校法人常翔学園
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】白川 利朗
(72)【発明者】
【氏名】北川 孝一
(72)【発明者】
【氏名】佐久間 信至
(72)【発明者】
【氏名】伴野 拓巳
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB21
4C076BB25
4C076CC06
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C085AA06
4C085BB01
4C085CC31
4C085EE01
4C085GG10
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA20
4H045BA41
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA20
4H045FA20
(57)【要約】
【課題】腫瘍抗原エピトープによる抗腫瘍効果を向上させる技術の提供。
【解決手段】腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチド、及び
下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含む、がんワクチン。
（式中、Ｘ１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示し、Ｘ２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。）
【選択図】なし
【解決手段】腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチド、及び
下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含む、がんワクチン。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチド、及び
下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含む、がんワクチン。
（式中、Ｘ１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示し、Ｘ２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。）
下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含む、がんワクチン。
【化1】
【請求項2】
経粘膜がんワクチンである、請求項１に記載のがんワクチン。
【請求項3】
経鼻がんワクチンである、請求項１又は２に記載のがんワクチン。
【請求項4】
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドを構成するアミノ酸の数が、１５～１００個である、請求項１～３のいずれ一項に記載のがんワクチン。
【請求項5】
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１）、
ＤＫＫＱＲＦＨＮＩ（配列番号２）、
ＹＲＤＧＮＰＹＡＶ（配列番号３）、
ＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＣＤ（配列番号４）、
ＫＬＰＱＬＣＴＥＬ（配列番号５）、
ＫＬＰＱＬＣＴＥＶ（配列番号６）、
ＫＩＳＥＹＲＨＹＣ（配列番号７）、
ＩＳＥＹＲＨＹＶ（配列番号８）、
ＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬ（配列番号９）、
ＱＬＹＮＫＰＬＣＤＶ（配列番号１０）、
ＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１１）、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣ（配列番号１２）、
ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号１３）、
ＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号１４）、
ＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣ（配列番号１５）、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１６）、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＶ（配列番号１７）、
ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ（配列番号１８）、
ＴＬＨＥＹＭＬＤＶ（配列番号１９）、
ＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴ（配列番号２０）、
ＲＴＬＥＤＬＬＭＧＶ（配列番号２１）、及び
ＱＡＥＰＤＲＡＨＶＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤ（配列番号２２）
からなる群より選択される少なくとも１種
である、請求項１～４のいずれか一項に記載のがんワクチン。
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１）、
ＤＫＫＱＲＦＨＮＩ（配列番号２）、
ＹＲＤＧＮＰＹＡＶ（配列番号３）、
ＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＣＤ（配列番号４）、
ＫＬＰＱＬＣＴＥＬ（配列番号５）、
ＫＬＰＱＬＣＴＥＶ（配列番号６）、
ＫＩＳＥＹＲＨＹＣ（配列番号７）、
ＩＳＥＹＲＨＹＶ（配列番号８）、
ＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬ（配列番号９）、
ＱＬＹＮＫＰＬＣＤＶ（配列番号１０）、
ＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１１）、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣ（配列番号１２）、
ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号１３）、
ＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号１４）、
ＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣ（配列番号１５）、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１６）、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＶ（配列番号１７）、
ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ（配列番号１８）、
ＴＬＨＥＹＭＬＤＶ（配列番号１９）、
ＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴ（配列番号２０）、
ＲＴＬＥＤＬＬＭＧＶ（配列番号２１）、及び
ＱＡＥＰＤＲＡＨＶＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤ（配列番号２２）
からなる群より選択される少なくとも１種
である、請求項１～４のいずれか一項に記載のがんワクチン。
【請求項6】
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が、
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２３）、
ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２４）、
ＳＥＮＨＴＡＰＩ（配列番号２５）、
ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号２６）、
ＳＬＧＥＱＱＹＳＶ（配列番号２７）、
ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２８）、
ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２９）、
ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（配列番号３０）、
ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ（配列番号３１）、
ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号３２）、
ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号３３）、
ＥＱＣＬＳＡＦＴＬＨＦＳＧＱＦＴＧ（配列番号３４）、
ＦＲＧＩＱＤＶＲＲＶＳＧＶＡＰＴＬＶＲ（配列番号３５）、
ＲＶＰＧＶＡＰＴＬ（配列番号３６）、
ＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ（配列番号３７）、
ＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号３８）、及び
ＳＧＱＡＹＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号３９）
からなる群より選択される少なくとも１種
である、請求項１～４のいずれか一項に記載のがんワクチン。
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２３）、
ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２４）、
ＳＥＮＨＴＡＰＩ（配列番号２５）、
ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号２６）、
ＳＬＧＥＱＱＹＳＶ（配列番号２７）、
ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２８）、
ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２９）、
ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（配列番号３０）、
ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ（配列番号３１）、
ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号３２）、
ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号３３）、
ＥＱＣＬＳＡＦＴＬＨＦＳＧＱＦＴＧ（配列番号３４）、
ＦＲＧＩＱＤＶＲＲＶＳＧＶＡＰＴＬＶＲ（配列番号３５）、
ＲＶＰＧＶＡＰＴＬ（配列番号３６）、
ＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ（配列番号３７）、
ＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号３８）、及び
ＳＧＱＡＹＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号３９）
からなる群より選択される少なくとも１種
である、請求項１～４のいずれか一項に記載のがんワクチン。
【請求項7】
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドが、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上直接又はリンカーを介して連結してなるペプチドである、請求項１～６のいずれか一項に記載のがんワクチン。
【請求項8】
前記膜透過性ペプチドが、
２～３０個のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマーを有するペプチド、
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＤＤＰＶＤなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド、及び
ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の膜透過性ペプチドである、請求項１～７のいずれか一項に記載のがんワクチン。
２～３０個のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマーを有するペプチド、
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＤＤＰＶＤなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド、及び
ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の膜透過性ペプチドである、請求項１～７のいずれか一項に記載のがんワクチン。
【請求項9】
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドが、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＲＲＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＲＲＡＨＹＮＩＶＴＦＲＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号４０）、又は
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬＲＲＣＭＴＷＮＱＭＮＬＲＲＳＥＮＨＴＡＰＩＲＲＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号４１）のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１～８のいずれか一項に記載のがんワクチン。
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＲＲＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＲＲＡＨＹＮＩＶＴＦＲＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号４０）、又は
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬＲＲＣＭＴＷＮＱＭＮＬＲＲＳＥＮＨＴＡＰＩＲＲＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号４１）のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１～８のいずれか一項に記載のがんワクチン。
【請求項10】
前記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の幹高分子が、ビニル系親水性高分子又は多糖である、請求項１～９のいずれか一項に記載のがんワクチン。
【請求項11】
前記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物が、
下記一般式（２）で表される化合物である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のがんワクチン。
（式中ａ、ｘ及びｙは、１以上の整数を示し、且つ、ａ：（ｘ＋ｙ）＝１０：１～１０を満たす整数を示す。但し、ａのユニット、ｘのユニット、及びｙのユニットはランダム重合している。式中、Ｘ１及びＸ２は、前記に同じである。）
下記一般式（２）で表される化合物である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のがんワクチン。
【化2】
【請求項12】
ｘとｙが、ｘ：ｙ＝０～４０：１０を満たす整数である、請求項１１に記載のがんワクチン。
【請求項13】
前記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物が、重量平均分子量１０ｋＤａ～３００００ｋＤａの高分子化合物である、請求項１～１２のいずれかに記載のがんワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、がんワクチン等に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、がんペプチドワクチンとしては、１０前後のアミノ酸からなるショートペプチドワクチンが主流であった。しかし、ショートペプチドは樹状細胞や、Ｔ細胞、Ｂ細胞の表層に発現するＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉと直接結合してしまうため、強力な細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）を誘導することができない点が課題とされていた。
【0003】
強力なＣＴＬを誘導するには、腫瘍抗原が抗原提示細胞である樹状細胞の内部に取り込まれて処理され、その断片であるエピトープがＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉと共に表層に発現される必要があることから、近年は、複数の腫瘍抗原エピトープを合わせた３０アミノ酸程度のロングペプチドワクチンが注目されている。しかし、ロングペプチドワクチンにおいては、抗原タンパクを如何に効率よく樹状細胞に取り込ませるかが課題とされていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】国際公開第２０１４／１５７６９２号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Vaccine. 2017 May 2; 35 (19):2605-2611.
【非特許文献2】Vaccine. 2009 Jan 14;27(3):431-40.
【非特許文献3】Vaccine. 2007 April 30; 25(17): 3302-3310.
【非特許文献4】Curr Opin Immunol. 2008 Apr;20 (2):211-20.
【非特許文献5】Blood. 2010 Jul 15; 116 (2):171-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
腫瘍抗原エピトープによる抗腫瘍効果を向上させる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が複数連結したペプチドと膜透過性ペプチドを側鎖に有する高分子化合物とを併用することによって、効率的に抗腫瘍免疫を誘導しうることを見出し、さらに改良を重ねた。
【0008】
本開示は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチド、及び
下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含む、がんワクチン。
（式中、Ｘ１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示し、Ｘ２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。）
項２．
経粘膜がんワクチンである、項１に記載のがんワクチン。
項３．
経鼻がんワクチンである、項１又は２に記載のがんワクチン。
項４．
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドを構成するアミノ酸の数が、１５～１００個である、項１～３のいずれか一項に記載のがんワクチン。
項５．
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１）、
ＤＫＫＱＲＦＨＮＩ（配列番号２）、
ＹＲＤＧＮＰＹＡＶ（配列番号３）、
ＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＣＤ（配列番号４）、
ＫＬＰＱＬＣＴＥＬ（配列番号５）、
ＫＬＰＱＬＣＴＥＶ（配列番号６）、
ＫＩＳＥＹＲＨＹＣ（配列番号７）、
ＩＳＥＹＲＨＹＶ（配列番号８）、
ＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬ（配列番号９）、
ＱＬＹＮＫＰＬＣＤＶ（配列番号１０）、
ＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１１）、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣ（配列番号１２）、
ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号１３）、
ＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号１４）、
ＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣ（配列番号１５）、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１６）、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＶ（配列番号１７）、
ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ（配列番号１８）、
ＴＬＨＥＹＭＬＤＶ（配列番号１９）、
ＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴ（配列番号２０）、
ＲＴＬＥＤＬＬＭＧＶ（配列番号２１）、及び
ＱＡＥＰＤＲＡＨＶＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤ（配列番号２２）
からなる群より選択される少なくとも１種
である、項１～４のいずれか一項に記載のがんワクチン。
項６．
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が、
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２３）、
ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２４）、
ＳＥＮＨＴＡＰＩ（配列番号２５）、
ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号２６）、
ＳＬＧＥＱＱＹＳＶ（配列番号２７）、
ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２８）、
ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２９）、
ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（配列番号３０）、
ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ（配列番号３１）、
ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号３２）、
ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号３３）、
ＥＱＣＬＳＡＦＴＬＨＦＳＧＱＦＴＧ（配列番号３４）、
ＦＲＧＩＱＤＶＲＲＶＳＧＶＡＰＴＬＶＲ（配列番号３５）、
ＲＶＰＧＶＡＰＴＬ（配列番号３６）、
ＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ（配列番号３７）、
ＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号３８）、及び
ＳＧＱＡＹＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号３９）
からなる群より選択される少なくとも１種
である、項１～４のいずれかに記載のがんワクチン。
項７．
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドが、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上直接又はリンカーを介して連結してなるペプチドである、項１～６のいずれか一項に記載のがんワクチン。
項８．
前記膜透過性ペプチドが、
２～３０個のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマーを有するペプチド、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＤＤＰＶＤなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド、及び
ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の膜透過性ペプチドである、項１～７のいずれか一項に記載のがんワクチン。
項９．
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドが、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＲＲＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＲＲＡＨＹＮＩＶＴＦＲＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号４０）、又は
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬＲＲＣＭＴＷＮＱＭＮＬＲＲＳＥＮＨＴＡＰＩＲＲＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号４１）のアミノ酸配列からなるペプチドである、項１～８のいずれか一項に記載のがんワクチン。
項１０．
前記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の幹高分子が、ビニル系親水性高分子又は多糖である、項１～９のいずれか一項に記載のがんワクチン。
項１１．
前記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物が、
下記一般式（２）で表される化合物である、項１～１０のいずれか一項に記載のがんワクチン。
（式中ａ、ｘ及びｙは、１以上の整数を示し、且つ、ａ：（ｘ＋ｙ）＝１０：１～１０を満たす整数を示す。但し、ａのユニット、ｘのユニット、及びｙのユニットはランダム重合している。式中、Ｘ１及びＸ２は、前記に同じである。）
項１２．
ｘとｙが、ｘ：ｙ＝０～４０：１０を満たす整数である、項１１に記載のがんワクチン。
項１３．
前記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物が、重量平均分子量１０ｋＤａ～３００００ｋＤａの高分子化合物である、項１～１２のいずれかに記載のがんワクチン。
項１．
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチド、及び
下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含む、がんワクチン。
【化1】
項２．
経粘膜がんワクチンである、項１に記載のがんワクチン。
項３．
経鼻がんワクチンである、項１又は２に記載のがんワクチン。
項４．
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドを構成するアミノ酸の数が、１５～１００個である、項１～３のいずれか一項に記載のがんワクチン。
項５．
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１）、
ＤＫＫＱＲＦＨＮＩ（配列番号２）、
ＹＲＤＧＮＰＹＡＶ（配列番号３）、
ＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＣＤ（配列番号４）、
ＫＬＰＱＬＣＴＥＬ（配列番号５）、
ＫＬＰＱＬＣＴＥＶ（配列番号６）、
ＫＩＳＥＹＲＨＹＣ（配列番号７）、
ＩＳＥＹＲＨＹＶ（配列番号８）、
ＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬ（配列番号９）、
ＱＬＹＮＫＰＬＣＤＶ（配列番号１０）、
ＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１１）、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣ（配列番号１２）、
ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号１３）、
ＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号１４）、
ＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣ（配列番号１５）、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１６）、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＶ（配列番号１７）、
ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ（配列番号１８）、
ＴＬＨＥＹＭＬＤＶ（配列番号１９）、
ＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴ（配列番号２０）、
ＲＴＬＥＤＬＬＭＧＶ（配列番号２１）、及び
ＱＡＥＰＤＲＡＨＶＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤ（配列番号２２）
からなる群より選択される少なくとも１種
である、項１～４のいずれか一項に記載のがんワクチン。
項６．
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が、
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２３）、
ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２４）、
ＳＥＮＨＴＡＰＩ（配列番号２５）、
ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号２６）、
ＳＬＧＥＱＱＹＳＶ（配列番号２７）、
ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２８）、
ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２９）、
ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ（配列番号３０）、
ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ（配列番号３１）、
ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号３２）、
ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号３３）、
ＥＱＣＬＳＡＦＴＬＨＦＳＧＱＦＴＧ（配列番号３４）、
ＦＲＧＩＱＤＶＲＲＶＳＧＶＡＰＴＬＶＲ（配列番号３５）、
ＲＶＰＧＶＡＰＴＬ（配列番号３６）、
ＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ（配列番号３７）、
ＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号３８）、及び
ＳＧＱＡＹＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号３９）
からなる群より選択される少なくとも１種
である、項１～４のいずれかに記載のがんワクチン。
項７．
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドが、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上直接又はリンカーを介して連結してなるペプチドである、項１～６のいずれか一項に記載のがんワクチン。
項８．
前記膜透過性ペプチドが、
２～３０個のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマーを有するペプチド、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＤＤＰＶＤなるアミノ酸配列を有するペプチド、
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド、及び
ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の膜透過性ペプチドである、項１～７のいずれか一項に記載のがんワクチン。
項９．
前記腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドが、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＲＲＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＲＲＡＨＹＮＩＶＴＦＲＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号４０）、又は
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬＲＲＣＭＴＷＮＱＭＮＬＲＲＳＥＮＨＴＡＰＩＲＲＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号４１）のアミノ酸配列からなるペプチドである、項１～８のいずれか一項に記載のがんワクチン。
項１０．
前記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の幹高分子が、ビニル系親水性高分子又は多糖である、項１～９のいずれか一項に記載のがんワクチン。
項１１．
前記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物が、
下記一般式（２）で表される化合物である、項１～１０のいずれか一項に記載のがんワクチン。
【化2】
項１２．
ｘとｙが、ｘ：ｙ＝０～４０：１０を満たす整数である、項１１に記載のがんワクチン。
項１３．
前記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物が、重量平均分子量１０ｋＤａ～３００００ｋＤａの高分子化合物である、項１～１２のいずれかに記載のがんワクチン。
【発明の効果】
【0009】
優れた抗腫瘍効果を示すがんワクチンが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】マウスの平均腫瘍体積を示す。
【図2】マウスの平均腫瘍体積示す。
【図3】マウスの生存率を示す。
【図4】マウスの腫瘍写真を示す。
【図5】マウスの体重変化を示す。
【図6】ＩＦＮ－γ産生ＣＤ８Ｔ細胞の割合を測定した結果を示す。
【図7】ＨＰＶ Ｅ７ ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７特異的ＣＤ８Ｔ細胞の割合を測定した結果を示す。
【図8】ＴＣ－１細胞に対する細胞傷害活性を測定した結果を示す。
【図9】マウスの平均腫瘍体積を示す。
【図10】マウスの生存率を示す。
【図11】マウスの生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。
本開示に包含されるがんワクチンは、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチド、及び後述する一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含む。本明細書において、当該がんワクチンを「本開示のがんワクチン」と表記することがある。なお、本明細書において、「がんワクチン」とは、がん患者に投与されるワクチンを意味し、がんの治療に利用できる。つまり、本明細書において、がんワクチンは、がん治療剤と言うこともできる。
本開示に包含されるがんワクチンは、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチド、及び後述する一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含む。本明細書において、当該がんワクチンを「本開示のがんワクチン」と表記することがある。なお、本明細書において、「がんワクチン」とは、がん患者に投与されるワクチンを意味し、がんの治療に利用できる。つまり、本明細書において、がんワクチンは、がん治療剤と言うこともできる。
【0012】
腫瘍抗原エピトープは、抗腫瘍免疫を誘導し得るものである限り、特に限定されない。例えば、公知の腫瘍抗原エピトープ等が挙げられる。
【0013】
腫瘍抗原エピトープは、例えば、ＣＤ８エピトープ（ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープ）であってもよく、ＣＤ４エピトープ（ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープ）であってもよい。
【0014】
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸の数は、例えば、８～２０個程度とすることができる。腫瘍抗原エピトープが、ＭＨＣ ＣｌａｓｓＩ分子に提示される場合、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸の数は、例えば、８～１０個程度であってもよい。また、腫瘍抗原エピトープが、ＭＨＣ ＣｌａｓｓＩＩ分子に提示される場合、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸の数は、例えば、１５～２０個程度であってもよい。
【0015】
対象とする腫瘍抗原としては、特に限定されないが、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ １６型）Ｅ６タンパク質、Ｅ７タンパク質；Ｗｉｌｍｓ Ｔｕｍｏｒ １（ＷＴ１）タンパク質；ＭＵＣ１；ＬＭＰ２；ＥＧＦＲｖＩＩＩ；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；Ｉｄｉｏｔｙｐｅ；ＭＡＧＥ Ａ３；ｐ５３ ｎｏｎｍｕｔａｎｔ；ＮＹ－ＥＳＯ－１；ＰＳＭＡ；ＧＤ２；ＣＥＡ；ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１；ネオアンチゲン等が挙げられる。
【0016】
対象とする腫瘍抗原がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ １６型）のＥ６タンパク質である場合、公知の腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列としては、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬ４９－５７（ＣＤ８エピトープ配列：配列番号１）、
ＤＫＫＱＲＦＨＮＩ１２７－１３５（ＣＤ８エピトープ配列：配列番号２）、
ＹＲＤＧＮＰＹＡＶ６１－６９（ＣＤ８エピトープ：配列番号３）、
ＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＣＤ５７－７１（ＣＤ８エピトープ：配列番号４）、
ＫＬＰＱＬＣＴＥＬ１１－１９（ＣＤ８エピトープ：配列番号５）、
ＫＬＰＱＬＣＴＥＶ１１－１９（ＣＤ８エピトープ：配列番号６）、
ＫＩＳＥＹＲＨＹＣ７２－８０（ＣＤ８エピトープ：配列番号７）、
ＩＳＥＹＲＨＹＶ７２－８０（ＣＤ８エピトープ：配列番号８）、
ＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬ９０－９９（ＣＤ８エピトープ：配列番号９）、
ＱＬＹＮＫＰＬＣＤＶ９０－９９（ＣＤ８エピトープ：配列番号１０）、
ＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ４３－５７（ＣＤ８エピトープ：配列番号１１）、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣ４９－５８（ＣＤ８エピトープ：配列番号１２）
等が例示される（非特許文献１～３）。なお、本明細書において、Ｅ６タンパク質の腫瘍抗原エピトープを示すアミノ酸配列において、アミノ酸配列と共に記載する数字は、ヒトＥ６タンパク質のアミノ酸配列における位置を示す。
中でも、腫瘍抗原（Ｅ６タンパク質）エピトープを構成するアミノ酸配列としては、ＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１）、又は
ＤＫＫＱＲＦＨＮＩ（配列番号２）が好ましい。
対象とする腫瘍抗原がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ １６型）のＥ７タンパク質である場合、公知の腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列としては、
ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７（ＣＤ８エピトープ配列：配列番号１３）、
ＬＣＶＱＳＴＨＶＤ６７－７５（ＣＤ８エピトープ配列：配列番号１４）、
ＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣ４５－５９（ＣＤ８エピトープ：配列番号１５）、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ１１－１９（ＣＤ８エピトープ：配列番号１６）、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＶ１１－１９（ＣＤ８エピトープ：配列番号１７）、
ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ７－１５（ＣＤ８エピトープ：配列番号１８）、
ＴＬＨＥＹＭＬＤＶ７－１５（ＣＤ８エピトープ：配列番号１９）、
ＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴ７７－８６（ＣＤ８エピトープ：配列番号２０）、
ＲＴＬＥＤＬＬＭＧＶ７７－８６（ＣＤ８エピトープ：配列番号２１）、
ＱＡＥＰＤＲＡＨＶＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤ４４－６２（ＣＤ８エピトープ配列：配列番号２２）
等が例示される（非特許文献１～３）。なお、本明細書において、Ｅ７タンパク質の腫瘍抗原エピトープを示すアミノ酸配列において、アミノ酸配列と共に記載する数字は、ヒトＥ７タンパク質のアミノ酸配列における位置を示す。
中でも、腫瘍抗原（Ｅ７タンパク質）エピトープを構成するアミノ酸配列としては、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号１３）、又は
ＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号１４）が好ましい。
例えば、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドは、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１）、
ＤＫＫＱＲＦＨＮＩ（配列番号２）、
ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号１３）、及び
ＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号１４）からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましく、少なくとも２種を含むことがより好ましく、少なくとも３種を含むことがさらにより好ましく、４種全てを含むことを特に好ましい。
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬ４９－５７（ＣＤ８エピトープ配列：配列番号１）、
ＤＫＫＱＲＦＨＮＩ１２７－１３５（ＣＤ８エピトープ配列：配列番号２）、
ＹＲＤＧＮＰＹＡＶ６１－６９（ＣＤ８エピトープ：配列番号３）、
ＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＣＤ５７－７１（ＣＤ８エピトープ：配列番号４）、
ＫＬＰＱＬＣＴＥＬ１１－１９（ＣＤ８エピトープ：配列番号５）、
ＫＬＰＱＬＣＴＥＶ１１－１９（ＣＤ８エピトープ：配列番号６）、
ＫＩＳＥＹＲＨＹＣ７２－８０（ＣＤ８エピトープ：配列番号７）、
ＩＳＥＹＲＨＹＶ７２－８０（ＣＤ８エピトープ：配列番号８）、
ＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬ９０－９９（ＣＤ８エピトープ：配列番号９）、
ＱＬＹＮＫＰＬＣＤＶ９０－９９（ＣＤ８エピトープ：配列番号１０）、
ＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ４３－５７（ＣＤ８エピトープ：配列番号１１）、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣ４９－５８（ＣＤ８エピトープ：配列番号１２）
等が例示される（非特許文献１～３）。なお、本明細書において、Ｅ６タンパク質の腫瘍抗原エピトープを示すアミノ酸配列において、アミノ酸配列と共に記載する数字は、ヒトＥ６タンパク質のアミノ酸配列における位置を示す。
中でも、腫瘍抗原（Ｅ６タンパク質）エピトープを構成するアミノ酸配列としては、ＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１）、又は
ＤＫＫＱＲＦＨＮＩ（配列番号２）が好ましい。
対象とする腫瘍抗原がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ １６型）のＥ７タンパク質である場合、公知の腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列としては、
ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７（ＣＤ８エピトープ配列：配列番号１３）、
ＬＣＶＱＳＴＨＶＤ６７－７５（ＣＤ８エピトープ配列：配列番号１４）、
ＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣ４５－５９（ＣＤ８エピトープ：配列番号１５）、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ１１－１９（ＣＤ８エピトープ：配列番号１６）、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＶ１１－１９（ＣＤ８エピトープ：配列番号１７）、
ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ７－１５（ＣＤ８エピトープ：配列番号１８）、
ＴＬＨＥＹＭＬＤＶ７－１５（ＣＤ８エピトープ：配列番号１９）、
ＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴ７７－８６（ＣＤ８エピトープ：配列番号２０）、
ＲＴＬＥＤＬＬＭＧＶ７７－８６（ＣＤ８エピトープ：配列番号２１）、
ＱＡＥＰＤＲＡＨＶＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤ４４－６２（ＣＤ８エピトープ配列：配列番号２２）
等が例示される（非特許文献１～３）。なお、本明細書において、Ｅ７タンパク質の腫瘍抗原エピトープを示すアミノ酸配列において、アミノ酸配列と共に記載する数字は、ヒトＥ７タンパク質のアミノ酸配列における位置を示す。
中でも、腫瘍抗原（Ｅ７タンパク質）エピトープを構成するアミノ酸配列としては、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号１３）、又は
ＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号１４）が好ましい。
例えば、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドは、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１）、
ＤＫＫＱＲＦＨＮＩ（配列番号２）、
ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号１３）、及び
ＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号１４）からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましく、少なくとも２種を含むことがより好ましく、少なくとも３種を含むことがさらにより好ましく、４種全てを含むことを特に好ましい。
【0017】
対象とする腫瘍抗原がＷＴ１タンパク質である場合、公知の腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列としては、
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ１２６－１３４（ＣＤ８エピトープ：配列番号２３）、
ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ２３５－２４３（ＣＤ８エピトープ：配列番号２４）、
ＳＥＮＨＴＡＰＩ２７３－２８０（ＣＤ８エピトープ：配列番号２５）、
ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ３３２－３３７（ＣＤ４エピトープ：配列番号２６）、
ＳＬＧＥＱＱＹＳＶ１８７－１９５（ＣＤ８エピトープ：配列番号２７）、
ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ１２６－１３４（ＣＤ８エピトープ：配列番号２８）、
ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ２３５－２４３（ＣＤ８エピトープ：配列番号２９）、
ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ４１７－４２５（ＣＤ８エピトープ：配列番号３０）、
ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ４２７－４４５（ＣＤ４エピトープ：配列番号３１）、
ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ１０－１８（ＣＤ８エピトープ：配列番号３２）、
ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ３５-５２（ＣＤ４エピトープ：配列番号３３）、
ＥＱＣＬＳＡＦＴＬＨＦＳＧＱＦＴＧ８６-１０２（ＣＤ４エピトープ：配列番号３４）、
ＦＲＧＩＱＤＶＲＲＶＳＧＶＡＰＴＬＶＲ２９４－３１２（ＣＤ４エピトープ：配列番号３５）、
ＲＶＰＧＶＡＰＴＬ３０２－３１０（ＣＤ８エピトープ：配列番号３６）、
ＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ３２８－３４９（ＣＤ４エピトープ：配列番号３７）、
ＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ１２２－１４０（ＣＤ４エピトープ：配列番号３８）、
ＳＧＱＡＹＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ１２２－１４０（ＣＤ４エピトープ：配列番号３９）
等が例示される（特許文献１、非特許文献４及び５）。なお、本明細書において、ＷＴ１の腫瘍抗原エピトープを示すアミノ酸配列において、アミノ酸配列と共に記載する数字は、ヒトＷＴ１のアミノ酸配列における位置を示す。
中でも、腫瘍抗原（ＷＴ１タンパク質）エピトープを構成するアミノ酸配列としては、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２３）、
ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２４）、
ＳＥＮＨＴＡＰＩ（配列番号２５）、又は
ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号２６）が好ましい。
例えば、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドは、
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２３）、
ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２４）、
ＳＥＮＨＴＡＰＩ（配列番号２５）、及び
ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号２６）からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましく、少なくとも２種を含むことがより好ましく、少なくとも３種を含むことがさらにより好ましく、４種全てを含むことを特に好ましい。
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ１２６－１３４（ＣＤ８エピトープ：配列番号２３）、
ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ２３５－２４３（ＣＤ８エピトープ：配列番号２４）、
ＳＥＮＨＴＡＰＩ２７３－２８０（ＣＤ８エピトープ：配列番号２５）、
ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ３３２－３３７（ＣＤ４エピトープ：配列番号２６）、
ＳＬＧＥＱＱＹＳＶ１８７－１９５（ＣＤ８エピトープ：配列番号２７）、
ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ１２６－１３４（ＣＤ８エピトープ：配列番号２８）、
ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ２３５－２４３（ＣＤ８エピトープ：配列番号２９）、
ＲＷＰＳＣＱＫＫＦ４１７－４２５（ＣＤ８エピトープ：配列番号３０）、
ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ４２７－４４５（ＣＤ４エピトープ：配列番号３１）、
ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ１０－１８（ＣＤ８エピトープ：配列番号３２）、
ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ３５-５２（ＣＤ４エピトープ：配列番号３３）、
ＥＱＣＬＳＡＦＴＬＨＦＳＧＱＦＴＧ８６-１０２（ＣＤ４エピトープ：配列番号３４）、
ＦＲＧＩＱＤＶＲＲＶＳＧＶＡＰＴＬＶＲ２９４－３１２（ＣＤ４エピトープ：配列番号３５）、
ＲＶＰＧＶＡＰＴＬ３０２－３１０（ＣＤ８エピトープ：配列番号３６）、
ＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ３２８－３４９（ＣＤ４エピトープ：配列番号３７）、
ＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ１２２－１４０（ＣＤ４エピトープ：配列番号３８）、
ＳＧＱＡＹＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ１２２－１４０（ＣＤ４エピトープ：配列番号３９）
等が例示される（特許文献１、非特許文献４及び５）。なお、本明細書において、ＷＴ１の腫瘍抗原エピトープを示すアミノ酸配列において、アミノ酸配列と共に記載する数字は、ヒトＷＴ１のアミノ酸配列における位置を示す。
中でも、腫瘍抗原（ＷＴ１タンパク質）エピトープを構成するアミノ酸配列としては、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２３）、
ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２４）、
ＳＥＮＨＴＡＰＩ（配列番号２５）、又は
ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号２６）が好ましい。
例えば、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドは、
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２３）、
ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２４）、
ＳＥＮＨＴＡＰＩ（配列番号２５）、及び
ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号２６）からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましく、少なくとも２種を含むことがより好ましく、少なくとも３種を含むことがさらにより好ましく、４種全てを含むことを特に好ましい。
【0018】
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列は、抗腫瘍免疫を誘導し得るものである限り、上述した公知の腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。欠失、置換、又は付加されたアミノ酸の個数は、例えば、１～３個程度であってもよく、１～２個程度であってもよい。
【0019】
アミノ酸の欠失、置換、又は付加などの変異を特定のアミノ酸配列に加える技術は当該技術分野において公知であり、任意の手法を用いて行うことができる。例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法、ランダム突然変異導入法等を利用して行うことができる。
【0020】
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドにおいて、連結される腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列の数は、２個以上であることが好ましい。連結される腫瘍抗原エピトープの数の下限値は、例えば、３個以上であってもよく、４個以上であってもよい。連結される腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列の数の上限値は、特に限定されず、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、又は４個以下等とすることができる。
【0021】
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドにおいて、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。例えば、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドにおいて、それぞれの腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列はすべて異なっていてもよい。
【0022】
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドにおいて、腫瘍抗原エピトープは、ＣＤ８エピトープであってもよく、ＣＤ４エピトープであってもよく、これらの組み合わせであってもよい。例えば、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドが、ＣＤ８エピトープ及びＣＤ４エピトープを含む場合、ＣＤ８エピトープとＣＤ４エピトープとの比率は、例えば、４：１～１：４程度であってもよく、３：１～１：３程度であってもよい。
【0023】
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドにおいて、腫瘍抗原エピトープの由来となる腫瘍抗原は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。
【0024】
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドにおいて、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列の連結される順序は、特に限定されず、適宜設定することができる。
【0025】
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドにおいて、それぞれの腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列は、直接又はリンカーを介して連結することができる。
【0026】
リンカーとしては、例えば、２個以上のアミノ酸からなるリンカー等が例示される。
リンカーを構成するアミノ酸としては、アルギニン、リジン、ヒスチジン等の塩基性側鎖を有するアミノ酸；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、及びシステイン等の非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸等が例示される。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。リンカーを構成するアミノ酸としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸が好ましく、アルギニンがより好ましい。
リンカーを構成するアミノ酸の数は、例えば、１～５個程度であってもよく、１～３個程度であってもよく、１～２個程度であってもよい。
中でも、リンカーとしては、アルギニンオリゴマーが好ましい。アルギニンオリゴマーとしては、アルギニンの繰り返し数が２～５のアルギニンオリゴマーが好ましく、アルギニンダイマー（ＲＲ）がより好ましい。
リンカーを構成するアミノ酸としては、アルギニン、リジン、ヒスチジン等の塩基性側鎖を有するアミノ酸；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、及びシステイン等の非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸等が例示される。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。リンカーを構成するアミノ酸としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸が好ましく、アルギニンがより好ましい。
リンカーを構成するアミノ酸の数は、例えば、１～５個程度であってもよく、１～３個程度であってもよく、１～２個程度であってもよい。
中でも、リンカーとしては、アルギニンオリゴマーが好ましい。アルギニンオリゴマーとしては、アルギニンの繰り返し数が２～５のアルギニンオリゴマーが好ましく、アルギニンダイマー（ＲＲ）がより好ましい。
【0027】
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドを構成するアミノ酸の数は、例えば、１５～１００個程度とすることができる。例えば、３０～９０個程度であってもよい。
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドは、例えば、腫瘍抗原タンパク質そのものであってもよい。
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドは、例えば、腫瘍抗原タンパク質そのものであってもよい。
【0028】
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドとしては、具体的には、
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＲＲＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＲＲＡＨＹＮＩＶＴＦＲＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号４０：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７）、
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬＲＲＣＭＴＷＮＱＭＮＬＲＲＳＥＮＨＴＡＰＩＲＲＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号４１：ＷＴ１）等が例示される。
ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＲＲＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＲＲＡＨＹＮＩＶＴＦＲＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤ（配列番号４０：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７）、
ＲＭＦＰＮＡＰＹＬＲＲＣＭＴＷＮＱＭＮＬＲＲＳＥＮＨＴＡＰＩＲＲＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ（配列番号４１：ＷＴ１）等が例示される。
【0029】
本開示のがんワクチンに含まれる、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドの含有濃度は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、０．０５～５０μｇ／μｌ程度とすることができる。
【0030】
腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドは、上述した公知のアミノ酸配列の情報に基づいて、一般的なペプチドの化学合成法（例えば、液相法及び固相法）を用いて製造することができる。また、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドは、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用して、遺伝子工学的な手法で製造することができる。
【0031】
本開示に用いられる高分子化合物は、下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する。
【0032】
【化3】
【0033】
一般式（１）中、Ｘ１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示す。
【0034】
膜透過性ペプチド残基を構成するアミノ酸の少なくとも１つは塩基性アミノ酸であることが好ましい。また、塩基性アミノ酸は、Ｌ体又はＤ体のいずれであってもよい。
【0035】
塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、オルニチン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン等が挙げられ、中でも、グアニジノ基含有アミノ酸が好ましく、アルギニンが更に好ましい。膜透過性ペプチド残基を構成する全アミノ酸に対する塩基性アミノ酸の割合は、モル基準で、５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。膜透過性ペプチド残基を構成するアミノ酸のうち、塩基性アミノ酸以外のアミノ酸は、中性アミノ酸であることが好ましい。なお、本明細書中、アミノ酸と記載する場合、特に断らない限り、α－アミノ酸を意味する。
【0036】
膜透過性ペプチド残基を構成するアミノ酸の数は、例えば、２～４０個程度とすることができる。当該範囲の上限若しくは下限は、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９個であってもよい。より具体的には、例えば、３～３９個であってもよい。
【0037】
膜透過性ペプチドとしては、例えば、２～３０個のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマーを有するペプチド、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＨＩＶ－１ Ｔａｔ：配列番号４２）、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＨＩＶ－１ Ｒｅｖ：配列番号４３）、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＦＨＶ Ｃｏａｔ：配列番号４４）、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＨＴＬＶ－ＩＩ Ｒｅｘ：配列番号４５）、ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＣＣＭＶ Ｇａｇ：配列番号４６）等の親水性の塩基性ペプチド；ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＢＭＷ Ｇａｇ：配列番号４７）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ペネトラチン：配列番号４８）、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、Ｐ２２Ｎ：配列番号４９）、ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＤＤＰＶＤなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＶＰ２２：配列番号５０）等の両親媒性の塩基性ペプチド；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、トランスポータン：配列番号５１）、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＴＰ－１０：配列番号５２）等の疎水性の塩基性ペプチド等が挙げられる。膜透過性ペプチドは、上述したアルギニンオリゴマー又は配列番号４２～５２に示すアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
中でも、膜透過性ペプチドとしては、親水性の塩基性ペプチドが好ましく、アルギニンオリゴマーを有するペプチドがより好ましく、アルギニンオリゴマーからなるペプチドがさらにより好ましい。アルギニンオリゴマーにおけるアルギニンの繰り返し数は、２～２０が好ましく、２～１５がより好ましく、４～１０が好ましい。例えば、６～１０であってもよい。
中でも、膜透過性ペプチドとしては、親水性の塩基性ペプチドが好ましく、アルギニンオリゴマーを有するペプチドがより好ましく、アルギニンオリゴマーからなるペプチドがさらにより好ましい。アルギニンオリゴマーにおけるアルギニンの繰り返し数は、２～２０が好ましく、２～１５がより好ましく、４～１０が好ましい。例えば、６～１０であってもよい。
【0038】
一般式（１）中、Ｘ２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。
炭素数１～４のアルコキシル基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、１－メチルプロポキシ基、ｔ－ブトキシ基等が挙げられる。Ｘ２としては、水酸基、アミノ基、ｔ－ブトキシ基、ベンジルオキシ基が好ましく、水酸基、アミノ基が更に好ましく、アミノ基が最も好ましい。
一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物中、一般式（１）で表される基が複数存在する場合、それぞれの一般式（１）で表される基の、Ｘ１及びＸ２は同一であってもよく、異なっていてもよい。
炭素数１～４のアルコキシル基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、１－メチルプロポキシ基、ｔ－ブトキシ基等が挙げられる。Ｘ２としては、水酸基、アミノ基、ｔ－ブトキシ基、ベンジルオキシ基が好ましく、水酸基、アミノ基が更に好ましく、アミノ基が最も好ましい。
一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物中、一般式（１）で表される基が複数存在する場合、それぞれの一般式（１）で表される基の、Ｘ１及びＸ２は同一であってもよく、異なっていてもよい。
【0039】
本明細書において、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の主鎖部分を幹高分子という。
【0040】
幹高分子は、特に限定されないが、親水性高分子であることが好ましい。ここで、親水性高分子とは、水溶性高分子、または水中で膨潤する高分子を意味する。本明細書において、水溶性高分子とは、常圧下で２５℃の水に０．１質量％以上の量で均一に溶解する高分子をいう。
【0041】
親水性高分子としては、例えば、グアーガム、アガロース、マンナン、グルコマンナン、ポリデキストロース、リグニン、キチン、キトサン、カラギーナン、プルラン、コンドロイチン硫酸、セルロース、ヘミセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、カチオンデンプン、デキストリン、ヒアルロン酸等の多糖；アルブミン、カゼイン、ゼラチン、ポリグルタミン酸、ポリリジン等の水溶性タンパク質又は水溶性ポリペプチド；ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（アクリル酸ヒドロキシエチル）、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリＮ－ビニルアセトアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２－アミノエチル（メタ）アクリレート）、（メタ）アクリル酸／アクリルアミド共重合物、（メタ）アクリル酸／Ｎ－イソプロピルアクリルアミド共重合物、（メタ）アクリル酸／Ｎ－ビニルアセトアミド共重合物、（メタ）アクリル酸／マレイン酸共重合物、（メタ）アクリル酸／フマル酸共重合物、エチレン／マレイン酸共重合物、イソブチレン／マレイン酸共重合物、スチレン／マレイン酸共重合物、アルキルビニルエーテル／マレイン酸共重合物、アルキルビニルエーテル／フマル酸共重合物等のビニル系親水性高分子；水溶性ポリウレタン等が挙げられる。なお、本明細書において（メタ）アクリル酸とはアクリル酸および／またはメタクリル酸を意味する。
【0042】
幹高分子への膜透過性ペプチド基のグラフト化が容易になることから、幹高分子としては、カルボキシル基を有する高分子が好ましく、カルボキシル基を有する親水性高分子がより好ましく、カルボキシル基を有するモノマーとカルボキシル基を有しないモノマーとの共重合物が更に好ましく、（メタ）アクリル酸／Ｎ－ビニルアセトアミド共重合物が最も好ましい。
【0043】
例えば、一般式（１）で表される基は、リンカーを介して、幹高分子に結合していてもよい。一般式（１）で表される基がリンカーを介して、幹高分子に結合する場合、幹高分子としては、例えば、ヒアルロン酸が好ましい。
リンカーとしては、例えば、２個以上のアミノ酸からなるリンカー等が例示される。
リンカーを構成するアミノ酸としては、特に限定されないが、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン等が例示される。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。リンカーを構成するアミノ酸としては、グリシン、アラニンが好ましく、グリシンがより好ましい。
リンカーを構成するアミノ酸の数は、例えば、２～４個程度であってもよく、２～３個程度であってもよい。
中でも、リンカーとしては、グリシンオリゴマーが好ましい。グリシンオリゴマーとしては、グリシンの繰り返し数が２～４のグリシンオリゴマーが好ましい。
リンカーとしては、例えば、２個以上のアミノ酸からなるリンカー等が例示される。
リンカーを構成するアミノ酸としては、特に限定されないが、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン等が例示される。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。リンカーを構成するアミノ酸としては、グリシン、アラニンが好ましく、グリシンがより好ましい。
リンカーを構成するアミノ酸の数は、例えば、２～４個程度であってもよく、２～３個程度であってもよい。
中でも、リンカーとしては、グリシンオリゴマーが好ましい。グリシンオリゴマーとしては、グリシンの繰り返し数が２～４のグリシンオリゴマーが好ましい。
【0044】
幹高分子を構成するモノマー単位の数に対するカルボキシル基を有するモノマー単位の数の割合は、例えば、１０～５０％程度が好ましく、１０～４０％程度がより好ましい。
【0045】
一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物における膜透過性ペプチド残基の数は、幹高分子を構成するモノマー単位（多糖類の場合は単糖単位、水溶性タンパク質又は水溶性ポリペプチドの場合はアミノ酸単位）の数に対して、０．００１～０．９程度であることが好ましく、０．００５～０．８程度であることが更に好ましく、０．０１～０．７程度であることが最も好ましい。例えば、０．０５～０．５程度であってもよい。
【0046】
幹高分子の重量平均分子量は、例えば、１０ｋＤａ～１００００ｋＤａが好ましく、１０ｋＤａ～５０００ｋＤａが更に好ましく、１０ｋＤａ～３０００ｋＤａが最も好ましい。幹高分子の重量平均分子量は、例えば、１００ｋＤａ～３０００ｋＤａであってもよく、２００ｋＤａ～３０００ｋＤａであってもよい。なお、本明細書において重量平均分子量とは、水系溶媒を用いてＧＰＣ分析を行った場合の重量平均分子量であって、幹高分子が多糖類、又は水溶性タンパク質の場合には、プルラン換算の重量平均分子量、幹高分子がビニル系親水性高分子の場合には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）若しくはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）換算の重量平均分子量をいう。
【0047】
一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の重量平均分子量は、例えば、１０ｋＤａ～３００００ｋＤａが好ましく、１０ｋＤａ～２００００ｋＤａが更に好ましく、１０ｋＤａ～１００００ｋＤａが最も好ましい。また、例えば、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物が、後述する一般式（２）で表される化合物である場合、重量平均分子量は、例えば、１０ｋＤａ～１００００ｋＤａが好ましく、１０ｋＤａ～１０００ｋＤａが更に好ましい。一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物が、後述する一般式（２）で表される化合物である場合、重量平均分子量は、例えば、５００ｋＤａ～１０００ｋＤａであってもよい。
【0048】
一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物としては、例えば、下記一般式（２）で表される化合物等が挙げられる。
式中ａ、ｘ及びｙは、１以上の整数を示し、且つ、ａ：（ｘ＋ｙ）＝１０：１～１０を満たす整数を示す。但し、ａのユニット、ｘのユニット、及びｙのユニットはランダム重合している。式中、Ｘ１及びＸ２は、前記に同じである。
なお、本明細書において、下記の構造をａのユニットと表記することがある。
また、本明細書において、下記の構造をｘのユニットと表記することがある。
また、本明細書において、下記の構造をｙのユニットと表記することがある。
一般式（２）において、ａ：（ｘ＋ｙ）は、例えば、１０：１～１０が好ましく、１０：２～８がより好ましく、１０：３～６がさらに好ましい。
【化4】
なお、本明細書において、下記の構造をａのユニットと表記することがある。
【化5】
【化6】
【化7】
【0049】
一般式（２）において、ｘとｙは、ｘ：ｙ＝０～４０：１０を満たす整数であることが好ましい。例えば、ｘ：ｙ＝０～２０：１０が好ましく、０～１０：１０がより好ましい。例えば、ｘ：ｙ＝１～１０：１０であってもよい。
【0050】
一般式（２）において、ｙ／（ａ＋ｘ＋ｙ）は、０．００１～０．９程度であることが好ましく、０．００５～０．８程度であることが更に好ましく、０．０１～０．７程度であることが最も好ましい。例えば、０．０５～０．５程度であってもよい。
【0051】
特に好ましい一例としては、一般式（２）において、ａ：ｘ：ｙ＝７０：１０～２０：１０～２０等が例示される。
【0052】
一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の製造方法は特に限定されず、当業者に広く知られている各種の方法を適用できる。例えば、一般式（１）で表される基を有する重合性モノマーを重合して製造してもよく、幹高分子に一般式（１）で表される基を導入して製造してもよい。例えば、幹高分子のカルボキシル基に、膜透過性ペプチドのアミノ基をペプチド反応させることにより得ることができる。カルボキシル基とアミノ基との反応は、公知の方法を用いればよく、例えば、カルボキル基をＮ－ヒドロキシコハク酸イミドによりスクシイミドエステル化した後、アミノ基を反応させる方法等が挙げられる。より具体的には、例えば、特許第５８０８０８２号公報、特許第５２８１３５８号公報、特許第６６９２０５１号公報、特許第６８８０５２６号公報等に記載の方法にならって、製造することができる。
【0053】
本開示のがんワクチンに含まれる、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の含有濃度は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、０．１～１００μｇ／μｌ程度とすることができる。
【0054】
本開示のがんワクチンに含まれる、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチドと一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物との含有質量比率は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、１：０．１～１：１０００程度とすることができる。
【0055】
本開示のがんワクチンは、さらに他の成分を含むことができる。当該他の成分としては、薬学的に許容される各種担体（例えば、溶剤、分散剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等）等が例示される。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。また、本開示のがんワクチンは、アジュバントを含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。
【0056】
本開示のがんワクチンの製剤形態は、特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、ゼリー剤、フィルム剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、軟膏剤、パップ剤、貼付剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤等の非経口投与剤等を挙げられる。中でも、点鼻剤が好ましい。
【0057】
本開示のがんワクチンの製造方法は特に限定されず、当該技術分野において、公知の手法により製造することができる。例えば、腫瘍抗原エピトープを構成するアミノ酸配列が２個以上連結してなるペプチド、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び必要に応じて他の成分を混合することにより製造することができる。
【0058】
本開示のがんワクチンの投与方法としては、例えば、経粘膜投与、経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等により、投与することができる。中でも、経粘膜投与（例えば、経鼻、経肺、経口腔（例えば、経舌下等）、経消化管（例えば、経直腸等）、経膣、経眼など）が好ましく、経鼻、経肺、経口腔投与がより好ましく、経鼻投与がさらにより好ましい。
つまり、本開示のがんワクチンは、経粘膜がんワクチンとして好適に用いることができ、経鼻がんワクチンとしてより好適に用いることができる。従来のワクチンはほとんどが皮下注射剤であるため、特に、経鼻がんワクチンは投与法として患者の苦痛、負担を軽減できる。
つまり、本開示のがんワクチンは、経粘膜がんワクチンとして好適に用いることができ、経鼻がんワクチンとしてより好適に用いることができる。従来のワクチンはほとんどが皮下注射剤であるため、特に、経鼻がんワクチンは投与法として患者の苦痛、負担を軽減できる。
【0059】
本開示のがんワクチンの投与対象としては、例えば、哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、ヒト；ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、サル等の非ヒト哺乳動物などが例示される。
【0060】
本開示のがんワクチンの投与（摂取）量は、特に限定されず、投与する対象の年齢、性別、症状の程度、投与方法等により決定される。
【0061】
本開示のがんワクチンによれば、例えば、腫瘍抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の誘導等の細胞性免疫応答の誘導等により、抗腫瘍効果が発揮される。つまり、本開示のがんワクチンは、液性免疫を誘導する従来の予防ワクチンとは異なり、がんの治療に好適に用いることができる。また、本開示のがんワクチンは、がん（腫瘍）の増大を抑制する又はがん（腫瘍）を縮小するために好適に用いることができる。
本開示のがんワクチンが対象とするがん（腫瘍）は、特に限定されず、用いる腫瘍抗原エピトープにより決定される。例えば、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、大腸がん、肛門がん、膵臓がん、舌がん、咽頭がん、甲状腺がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、小児がん、脳腫瘍、骨肉腫、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん等が挙げられる。
本開示のがんワクチンが投与される対象としては、特に限定されないが、例えば、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、大腸がん、肛門がん、膵臓がん、舌がん、咽頭がん、甲状腺がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、小児がん、脳腫瘍、骨肉腫、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん患者等が挙げられる。
本開示のがんワクチンが対象とするがん（腫瘍）は、特に限定されず、用いる腫瘍抗原エピトープにより決定される。例えば、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、大腸がん、肛門がん、膵臓がん、舌がん、咽頭がん、甲状腺がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、小児がん、脳腫瘍、骨肉腫、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん等が挙げられる。
本開示のがんワクチンが投与される対象としては、特に限定されないが、例えば、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、大腸がん、肛門がん、膵臓がん、舌がん、咽頭がん、甲状腺がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、小児がん、脳腫瘍、骨肉腫、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん患者等が挙げられる。
【0062】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件の任意の組み合わせを全て包含する。
【0063】
また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例0064】
本開示の内容を以下の実験例を用いて具体的に説明する。しかし、本開示はこれらに何ら限定されるものではない。下記において、特に言及する場合を除いて、実験は大気圧及び常温条件下で行っている。また特に言及する場合を除いて、「％」は「質量％」を意味する。
【0065】
ＨＰＶを用いた検討
精製ロングペプチドの作製
精製ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（アミノ酸配列（配列番号４０）：ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＲＲＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＲＲＡＨＹＮＩＶＴＦＲＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤ）をＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにて合成した。当該ロングペプチドはＨＰＶ １６型のＥ６、Ｅ７タンパク中の以下のＨ２－Ｄｂ ａｎｄ Ｈ２－Ｋｂ 拘束性ＣＤ８エピトープ配列［Ｅ６（ＶＹＤＦＡＦＲＤＬ４９－５７（配列番号１）；ＤＫＫＱＲＦＨＮＩ１２７－１３５（配列番号２））およびＥ７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７（配列番号１３）；ＬＣＶＱＳＴＨＶＤ６７－７５（配列番号１４））］を２残基のアルギニン（Ｒ）で連結したペプチド配列を有する。当該ロングペプチドについて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にて１００ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作成した。
上記ＨＰＶ Ｅ７ ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７（配列番号１３）についても同様にＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにて合成し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にて１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作成した。
精製ロングペプチドの作製
精製ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（アミノ酸配列（配列番号４０）：ＶＹＤＦＡＦＲＤＬＲＲＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＲＲＡＨＹＮＩＶＴＦＲＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤ）をＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにて合成した。当該ロングペプチドはＨＰＶ １６型のＥ６、Ｅ７タンパク中の以下のＨ２－Ｄｂ ａｎｄ Ｈ２－Ｋｂ 拘束性ＣＤ８エピトープ配列［Ｅ６（ＶＹＤＦＡＦＲＤＬ４９－５７（配列番号１）；ＤＫＫＱＲＦＨＮＩ１２７－１３５（配列番号２））およびＥ７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７（配列番号１３）；ＬＣＶＱＳＴＨＶＤ６７－７５（配列番号１４））］を２残基のアルギニン（Ｒ）で連結したペプチド配列を有する。当該ロングペプチドについて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にて１００ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作成した。
上記ＨＰＶ Ｅ７ ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７（配列番号１３）についても同様にＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにて合成し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にて１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作成した。
【0066】
膜透過ペプチド固定化高分子ＶＰ－Ｒ８
ＶＰ－Ｒ８の構造式を以下に示す。ＶＰ－Ｒ８は、特許第５８０８０８２号公報の記載にならって、使用するモノマー原料の量等を調製し、製造した。なお、膜透過ペプチド固定化高分子ＶＰ－Ｒ８の幹高分子（ＰＮＶＡ－ｃｏ－ＡＡ：アクリル酸／Ｎ－ビニルアセトアミド共重合体）の重量平均分子量は、２８０ｋＤａである。ＰＮＶＡ－ｃｏ－ＡＡの重量平均分子量、膜透過ペプチドとして用いたＤ－オクタアルギニンの分子量とその固定化率から算出した膜透過ペプチド固定化高分子ＶＰ－Ｒ８の重量平均分子量は９２５ｋＤａ（計算値）であった。
ＶＰ－Ｒ８の構造式を以下に示す。ＶＰ－Ｒ８は、特許第５８０８０８２号公報の記載にならって、使用するモノマー原料の量等を調製し、製造した。なお、膜透過ペプチド固定化高分子ＶＰ－Ｒ８の幹高分子（ＰＮＶＡ－ｃｏ－ＡＡ：アクリル酸／Ｎ－ビニルアセトアミド共重合体）の重量平均分子量は、２８０ｋＤａである。ＰＮＶＡ－ｃｏ－ＡＡの重量平均分子量、膜透過ペプチドとして用いたＤ－オクタアルギニンの分子量とその固定化率から算出した膜透過ペプチド固定化高分子ＶＰ－Ｒ８の重量平均分子量は９２５ｋＤａ（計算値）であった。
【0067】
【化8】
【0068】
担癌マウスを用いた動物試験
１×１０５個のＴＣ－１細胞をそれぞれ３０匹の６週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスにマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）とともに皮下移植し、腫瘍を形成させた。ＴＣ－１細胞は組換えによりＨＰＶ １６ Ｅ６およびＥ７タンパクを安定発現するマウス肺癌細胞株である。ＴＣ－１細胞は米国ジョンズ・ホプキンス大学のＴＣ Ｗｕ博士より譲渡された。ＴＣ－１細胞の培養には１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（富士フィルム和光純薬株式会社）を使用した。腫瘍移植から７日後にマウスをランダムに下記の６投与群（ｎ＝５）に分類した。
投与群１－１：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（１０μｇ）＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群１－２：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（１００μｇ）＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群１－３：ＨＰＶ Ｅ７ショートペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７、１０μｇ）＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群１－４：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（１０μｇ）＋生理食塩水 ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群１－５：生理食塩水＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群１－６：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（１００μｇ）＋不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ） ｉｎ １００μＬ（腹腔内投与）
１×１０５個のＴＣ－１細胞をそれぞれ３０匹の６週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスにマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）とともに皮下移植し、腫瘍を形成させた。ＴＣ－１細胞は組換えによりＨＰＶ １６ Ｅ６およびＥ７タンパクを安定発現するマウス肺癌細胞株である。ＴＣ－１細胞は米国ジョンズ・ホプキンス大学のＴＣ Ｗｕ博士より譲渡された。ＴＣ－１細胞の培養には１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（富士フィルム和光純薬株式会社）を使用した。腫瘍移植から７日後にマウスをランダムに下記の６投与群（ｎ＝５）に分類した。
投与群１－１：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（１０μｇ）＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群１－２：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（１００μｇ）＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群１－３：ＨＰＶ Ｅ７ショートペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７、１０μｇ）＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群１－４：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（１０μｇ）＋生理食塩水 ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群１－５：生理食塩水＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群１－６：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（１００μｇ）＋不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ） ｉｎ １００μＬ（腹腔内投与）
【0069】
投与群１－１、投与群１－２についてはＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド、投与群１－３についてはＨＰＶ Ｅ７ ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７ペプチドのストック溶液をそれぞれ６０μｇ、６００μｇ、または６０μｇを生理食塩水に混和しそれぞれ５８μＬとした。これらの溶液に対しＶＰ－Ｒ８溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれ５８μＬ添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群１－４については、６０μｇのＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドのストック溶液を生理食塩水に混和し５８μＬとした。この溶液に対し５８μＬの生理食塩水を添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群１－５については、５８μＬの生理食塩水と５８μＬのＶＰ－Ｒ８溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群１－６についてはＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド８００μｇを生理食塩水に混合して４００μＬとし、４００μＬの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ，富士フィルム和光純薬株式会社）と混合して、投与液とした。
投与群１－４については、６０μｇのＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドのストック溶液を生理食塩水に混和し５８μＬとした。この溶液に対し５８μＬの生理食塩水を添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群１－５については、５８μＬの生理食塩水と５８μＬのＶＰ－Ｒ８溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群１－６についてはＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド８００μｇを生理食塩水に混合して４００μＬとし、４００μＬの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ，富士フィルム和光純薬株式会社）と混合して、投与液とした。
【0070】
腫瘍移植後７日目にマウスを分類した後、投与群１－１、１－２、１－３、１－４および１－５についてはマイクロピペットを用いて各投与液２０μＬを麻酔下にマウスの片鼻腔から投与した。投与群１－６については１００μＬの投与液を麻酔下に腹腔内投与した。投与は腫瘍移植後７日目、１４日目、２１日目および２８日目に行った。経日的に腫瘍径を測定し、以下の計算式から腫瘍体積を算出した；［腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径×（短径）２×０．５］。投与群１－１、１－３、１－４及び１－５の平均腫瘍体積を図１に示す。また、投与群１－２、１－５及び１－６の平均腫瘍体積を図２に、マウスの生存率を図３に示す。また、投与後の代表的なマウス腫瘍写真を図４に示す。
【0071】
図１、及び図４に示す通り、ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を経鼻投与した場合（投与群１－１）、それぞれを単独で経鼻投与した場合（投与群１－４、１－５）と比較して、有意に腫瘍体積の増加を抑制することが確認された。腫瘍体積増加抑制効果は、ＨＰＶ Ｅ７ ショートペプチドを経鼻投与した場合（投与群１－３）と比較して高かった。
図２に示す通り、ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を経鼻投与した場合（投与群１－２）、ＶＰ－Ｒ８を単独で経鼻投与した場合（投与群１－５）と比較して、有意に腫瘍体積の増加を抑制することが確認された。腫瘍体積増加抑制効果は、ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドと不完全フロイントアジュバントの混合物を腹腔内投与した場合（投与群１－６）と比較して高かった。
図３に示す通り、投与群１－２では、投与群１－５及び１－６と比較して、マウスの生存率を有意に改善した。このことから、ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を投与すると、Ｅ６Ｅ７タンパク発現腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を強く示し、また生存率も改善されることが示された。
図２に示す通り、ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を経鼻投与した場合（投与群１－２）、ＶＰ－Ｒ８を単独で経鼻投与した場合（投与群１－５）と比較して、有意に腫瘍体積の増加を抑制することが確認された。腫瘍体積増加抑制効果は、ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドと不完全フロイントアジュバントの混合物を腹腔内投与した場合（投与群１－６）と比較して高かった。
図３に示す通り、投与群１－２では、投与群１－５及び１－６と比較して、マウスの生存率を有意に改善した。このことから、ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を投与すると、Ｅ６Ｅ７タンパク発現腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を強く示し、また生存率も改善されることが示された。
【0072】
マウスを用いた免疫試験
６週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスを下記の投与群（ｎ＝５）に分類した。
投与群２－１：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（１０μｇ）＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群２－２：ＨＰＶ Ｅ７ショートペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７、１０μｇ）＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群２－３：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（１０μｇ）＋生理食塩水 ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群２－４：生理食塩水＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
６週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスを下記の投与群（ｎ＝５）に分類した。
投与群２－１：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（１０μｇ）＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群２－２：ＨＰＶ Ｅ７ショートペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７、１０μｇ）＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群２－３：ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド（１０μｇ）＋生理食塩水 ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群２－４：生理食塩水＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
【0073】
投与群２－１についてはＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチド、投与群２－２についてはＨＰＶ Ｅ７ショートペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７）を、それぞれ６０μｇを生理食塩水に混和しそれぞれ５８μＬとした。これらの溶液に対しＶＰ－Ｒ８溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれ５８μＬ添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群２－３については、６０μｇのＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドを生理食塩水に混和し５８μＬとした。この溶液に対し５８μＬの生理食塩水を添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群２－４については、５８μＬの生理食塩水と５８μＬのＶＰ－Ｒ８溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群２－３については、６０μｇのＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドを生理食塩水に混和し５８μＬとした。この溶液に対し５８μＬの生理食塩水を添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群２－４については、５８μＬの生理食塩水と５８μＬのＶＰ－Ｒ８溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
【0074】
上記のように分類したマウスに対し、マイクロピペットを用いて各投与液２０μＬを麻酔下にマウスの片鼻腔から投与した。投与は０日目、７日目、および１４日目に行った。図５に示す通り、体重変化に有意な差は見られなかった。
１５日目にマウスを安楽死させ、脾臓を採取した。単離した脾臓細胞を以下の実験に用いた。
１５日目にマウスを安楽死させ、脾臓を採取した。単離した脾臓細胞を以下の実験に用いた。
【0075】
細胞内サイトカイン染色によるＨＰＶ特異的Ｔ細胞の検出
投与群２－１～４のマウスから単離した１×１０６個の脾臓細胞を５μｇ／ｍＬのＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドを用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下で刺激培養した後、脾臓細胞を回収した。培養時間は３６時間とし、培養開始２４時間から３６時間の間はＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を培養液中に添加した状態で培養した。ＴＣ－１細胞については、２００μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（ナカライテスク）で処理したものを刺激培養に使用した。脾臓細胞の培養は２ｍＭＬ－グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１ｍＭ非必須アミノ酸、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地を使用した。
回収した脾臓細胞を遠心回収し、１０μｇ／ｍＬ 抗マウスＣＤ１６／３２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を４℃、２０分間反応させた。抗体希釈液にはＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１％ＦＢＳ、０．０９％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水）を使用した。反応後に細胞を遠心洗浄し、それぞれ２μｇ／ｍＬのＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＣＤ４抗体、ＰｅｒＣＰ標識抗マウスＣＤ３抗体およびＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）標識抗マウスＣＤ８抗体（いずれもＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加したＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで脾臓細胞を遮光下、氷冷で３０分間染色した。染色後に細胞を洗浄し、ＢＤ／Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に付属のＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎにて氷上、遮光下で２０分間処理を行った。細胞を１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で遠心洗浄した後、ＰＥ標識抗マウスインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）抗体で遮光下、氷上で３０分間染色した。その後細胞を１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで遠心洗浄し、Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。細胞をＧｕａｖａ ｅａｓｙｃｙｔｅフローサイトメーター（Ｌｕｍｉｎｅｘ）で測定し、Ｇｕａｖａ Ｉｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ）で解析を行った。結果を図６に示す。
投与群２－１～４のマウスから単離した１×１０６個の脾臓細胞を５μｇ／ｍＬのＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドを用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下で刺激培養した後、脾臓細胞を回収した。培養時間は３６時間とし、培養開始２４時間から３６時間の間はＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を培養液中に添加した状態で培養した。ＴＣ－１細胞については、２００μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（ナカライテスク）で処理したものを刺激培養に使用した。脾臓細胞の培養は２ｍＭＬ－グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１ｍＭ非必須アミノ酸、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地を使用した。
回収した脾臓細胞を遠心回収し、１０μｇ／ｍＬ 抗マウスＣＤ１６／３２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を４℃、２０分間反応させた。抗体希釈液にはＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１％ＦＢＳ、０．０９％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水）を使用した。反応後に細胞を遠心洗浄し、それぞれ２μｇ／ｍＬのＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＣＤ４抗体、ＰｅｒＣＰ標識抗マウスＣＤ３抗体およびＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）標識抗マウスＣＤ８抗体（いずれもＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加したＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで脾臓細胞を遮光下、氷冷で３０分間染色した。染色後に細胞を洗浄し、ＢＤ／Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に付属のＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎにて氷上、遮光下で２０分間処理を行った。細胞を１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で遠心洗浄した後、ＰＥ標識抗マウスインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）抗体で遮光下、氷上で３０分間染色した。その後細胞を１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで遠心洗浄し、Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。細胞をＧｕａｖａ ｅａｓｙｃｙｔｅフローサイトメーター（Ｌｕｍｉｎｅｘ）で測定し、Ｇｕａｖａ Ｉｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ）で解析を行った。結果を図６に示す。
【0076】
図６に示す通り、脾臓細胞をＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドで刺激した場合に、投与群２－１においてＩＦＮ－γ産生ＣＤ８Ｔ細胞の割合が投与群２－３に対して有意に増加した（ｐ＜０．０５）。このことから、ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を投与すると、Ｅ６Ｅ７ペプチド特異的な細胞性免疫応答を誘導することが示された。
【0077】
ＭＨＣテトラマーによるＨＰＶ Ｅ７ ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ
４９－５７
特異的ＣＤ８Ｔ細胞の検出
投与群２－１～４のマウスから単離した１×１０６個の脾臓細胞を５μｇ／ｍＬのＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドを用いて３７℃、５％ ＣＯ２ 条件下で６日間刺激培養した後、脾臓細胞を回収した。培養２日目及び４日目に２０ＩＵ／ｍｌインターロイキン２（ＩＬ－２）を添加した。細胞を回収し、１０μｇ／ｍｌ抗マウスＣＤ１６／３２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で氷上、２０分静置した。抗体希釈液にはＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを使用した。反応後に細胞を遠心洗浄し、４μｇ／ｍＬ Ｔ－Ｓｅｌｅｃｔ Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ－ＰＥ（ＭＢＬ）で遮光下、室温、３０分間反応させた。遠心洗浄後、ＰｅｒＣＰ標識抗マウスＣＤ３抗体およびＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）標識抗マウスＣＤ８抗体で遮光下、４℃で３０分間染色した。遠心洗浄後、細胞をＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙｃｙｔｅフローサイトメーターで測定した後、Ｇｕａｖａ Ｉｎｃｙｔｅソフトウェアで解析した。結果を図７に示す。
投与群２－１～４のマウスから単離した１×１０６個の脾臓細胞を５μｇ／ｍＬのＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドを用いて３７℃、５％ ＣＯ２ 条件下で６日間刺激培養した後、脾臓細胞を回収した。培養２日目及び４日目に２０ＩＵ／ｍｌインターロイキン２（ＩＬ－２）を添加した。細胞を回収し、１０μｇ／ｍｌ抗マウスＣＤ１６／３２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で氷上、２０分静置した。抗体希釈液にはＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを使用した。反応後に細胞を遠心洗浄し、４μｇ／ｍＬ Ｔ－Ｓｅｌｅｃｔ Ｈ－２Ｄｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７ Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ－ＰＥ（ＭＢＬ）で遮光下、室温、３０分間反応させた。遠心洗浄後、ＰｅｒＣＰ標識抗マウスＣＤ３抗体およびＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）標識抗マウスＣＤ８抗体で遮光下、４℃で３０分間染色した。遠心洗浄後、細胞をＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙｃｙｔｅフローサイトメーターで測定した後、Ｇｕａｖａ Ｉｎｃｙｔｅソフトウェアで解析した。結果を図７に示す。
【0078】
図７に示す通り、脾臓細胞をＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドで刺激した場合に、投与群２－１においてＨＰＶ Ｅ７ ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７特異的ＣＤ８Ｔ細胞の割合が他の投与群に対して有意に増加した（ｐ＜０．０５）。このことから、ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を投与すると、ＨＰＶ Ｅ７ ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ４９－５７特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することが示された。
【0079】
脾臓細胞におけるＨＰＶ Ｅ６Ｅ７特異的細胞傷害活性の検出
投与群２－１～４のマウスから単離した２×１０７個のマウス脾臓細胞を２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのマイトマイシンＣ処理ＴＣ－１細胞と混合し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で６日間培養した。培養２日目及び４日目に２０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を添加した。脾臓細胞を回収し、９６ウェルプレートにて脾臓細胞と５×１０３個のＴＣ－１細胞を４０：１の比率で混合後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で８時間培養した。培養上清を回収し、Ｃｙｔｏｔｏｘ ９６ Ｎｏｎ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（プロメガ）を用いて、培養上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を測定した。測定方法はキットの説明書に従った。吸光度値から細胞傷害活性を算出した。結果を図８に示す。
投与群２－１～４のマウスから単離した２×１０７個のマウス脾臓細胞を２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのマイトマイシンＣ処理ＴＣ－１細胞と混合し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で６日間培養した。培養２日目及び４日目に２０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を添加した。脾臓細胞を回収し、９６ウェルプレートにて脾臓細胞と５×１０３個のＴＣ－１細胞を４０：１の比率で混合後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で８時間培養した。培養上清を回収し、Ｃｙｔｏｔｏｘ ９６ Ｎｏｎ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（プロメガ）を用いて、培養上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を測定した。測定方法はキットの説明書に従った。吸光度値から細胞傷害活性を算出した。結果を図８に示す。
【0080】
図８に示す通り、脾臓細胞をＴＣ－１細胞で刺激した場合、投与群２－１においてに対してＴＣ－１細胞に対する細胞傷害活性が有意に増加した（ｐ＜０．０５）。このことから、ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を投与すると、ＨＰＶ Ｅ６Ｅ７特異的な細胞傷害活性を有する細胞性免疫応答を誘導することが示された。
【0081】
ＷＴ１を用いた検討
精製ロングペプチドの作製
精製Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ １（ＷＴ１）ロングペプチド（アミノ酸配列（配列番号４１）：ＲＭＦＰＮＡＰＹＬＲＲＣＭＴＷＮＱＭＮＬＲＲＳＥＮＨＴＡＰＩＲＲＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ）をＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにて合成した。当該ロングペプチドはＷＴ１タンパク中の以下のエピトープ配列（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ１２６－１３４（配列番号２３）：Ｈ－２Ｄｂ拘束性ＣＤ８エピトープ、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ２３５－２４３（配列番号２４）：ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ＣＤ８エピトープ、ＳＥＮＨＴＡＰＩ２７３－２８０（配列番号２５）：Ｈ－２Ｋｋ拘束性ＣＤ８エピトープ、ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ３３２－３３７（配列番号２６）：ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５拘束性ＣＤ４エピトープ）を２残基のアルギニン（Ｒ）で連結したペプチド配列を有する。当該ロングペプチドについて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にて１００ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作成した。
上記ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２３）についても同様にＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにて合成し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にて１００ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作成した。
精製ロングペプチドの作製
精製Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ １（ＷＴ１）ロングペプチド（アミノ酸配列（配列番号４１）：ＲＭＦＰＮＡＰＹＬＲＲＣＭＴＷＮＱＭＮＬＲＲＳＥＮＨＴＡＰＩＲＲＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ）をＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにて合成した。当該ロングペプチドはＷＴ１タンパク中の以下のエピトープ配列（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ１２６－１３４（配列番号２３）：Ｈ－２Ｄｂ拘束性ＣＤ８エピトープ、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ２３５－２４３（配列番号２４）：ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ＣＤ８エピトープ、ＳＥＮＨＴＡＰＩ２７３－２８０（配列番号２５）：Ｈ－２Ｋｋ拘束性ＣＤ８エピトープ、ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ３３２－３３７（配列番号２６）：ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５拘束性ＣＤ４エピトープ）を２残基のアルギニン（Ｒ）で連結したペプチド配列を有する。当該ロングペプチドについて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にて１００ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作成した。
上記ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号２３）についても同様にＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにて合成し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にて１００ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作成した。
【0082】
担癌マウスを用いた動物試験
１×１０５個のＣ１４９８－ＷＴ１細胞を４０匹の６週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスにマトリゲルとともに皮下移植し、腫瘍を形成させた。Ｃ１４９８－ＷＴ１細胞は組換えによりマウスＷＴ１タンパクを安定発現するマウス白血病細胞株である。Ｃ１４９８－ＷＴ１細胞は大阪大学 橋井佳子博士より譲渡された。Ｃ１４９８－ＷＴ１細胞の培養には１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８、および１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地を使用した。腫瘍移植から７日後にマウスをランダムに下記の８投与群（ｎ＝５）に分類した。
投与群３－１：ＷＴ１ロングペプチド（１００μｇ）＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群３－２：ＷＴ１ロングペプチド（１００μｇ）＋生理食塩水 ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群３－３：生理食塩水＋ＶＰ－Ｒ８（１００ μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群３－４：ＷＴ１ロングペプチド（１００μｇ）＋不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ） ｉｎ １００μＬ（腹腔内投与）
投与群３－５：ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ１２６－１３４＋不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ） ｉｎ １００μＬ（腹腔内投与）
１×１０５個のＣ１４９８－ＷＴ１細胞を４０匹の６週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスにマトリゲルとともに皮下移植し、腫瘍を形成させた。Ｃ１４９８－ＷＴ１細胞は組換えによりマウスＷＴ１タンパクを安定発現するマウス白血病細胞株である。Ｃ１４９８－ＷＴ１細胞は大阪大学 橋井佳子博士より譲渡された。Ｃ１４９８－ＷＴ１細胞の培養には１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８、および１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地を使用した。腫瘍移植から７日後にマウスをランダムに下記の８投与群（ｎ＝５）に分類した。
投与群３－１：ＷＴ１ロングペプチド（１００μｇ）＋ＶＰ－Ｒ８（１００μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群３－２：ＷＴ１ロングペプチド（１００μｇ）＋生理食塩水 ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群３－３：生理食塩水＋ＶＰ－Ｒ８（１００ μｇ） ｉｎ ２０μＬ（経鼻投与）
投与群３－４：ＷＴ１ロングペプチド（１００μｇ）＋不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ） ｉｎ １００μＬ（腹腔内投与）
投与群３－５：ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ１２６－１３４＋不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ） ｉｎ １００μＬ（腹腔内投与）
【0083】
投与群３－１についてはＷＴ１ロングペプチドを、６００μｇを生理食塩水に混和しそれぞれ５８μＬとした。これらの溶液に対しＶＰ－Ｒ８溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれ５８μＬ添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群３－２については、６００μｇのＷＴ１ロングペプチドを生理食塩水に混和し５８μＬとした。この溶液に対し５８μＬの生理食塩水を添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群３－３については、５８μＬの生理食塩水と５８μＬのＶＰ－Ｒ８溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群３－４については８００μｇのＷＴ１ロングペプチドを生理食塩水に混合して４００μＬとし、４００μＬの不完全フロイントアジュバントと混合して、投与液とした。
投与群３－５については８００μｇのＲＭＦＰＮＡＰＹＬ１２６－１３４ペプチドを生理食塩水に混合して４００μＬとし、４００μＬの不完全フロイントアジュバントと混合して、投与液とした。
投与群３－２については、６００μｇのＷＴ１ロングペプチドを生理食塩水に混和し５８μＬとした。この溶液に対し５８μＬの生理食塩水を添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群３－３については、５８μＬの生理食塩水と５８μＬのＶＰ－Ｒ８溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加して計１１６μＬとし、よく混和した後室温で１５分以上静置して投与液とした。
投与群３－４については８００μｇのＷＴ１ロングペプチドを生理食塩水に混合して４００μＬとし、４００μＬの不完全フロイントアジュバントと混合して、投与液とした。
投与群３－５については８００μｇのＲＭＦＰＮＡＰＹＬ１２６－１３４ペプチドを生理食塩水に混合して４００μＬとし、４００μＬの不完全フロイントアジュバントと混合して、投与液とした。
【0084】
腫瘍移植後７日目にマウスを分類した後、投与群３－１～３についてはマイクロピペットを用いて各投与液２０μＬを麻酔下にマウスの片鼻腔から投与した。投与群３－４および投与群３－５については１００μＬの投与液を麻酔下に腹腔内投与した。投与は腫瘍移植後７日目、１４日目、２１日目および２８日目に行った。経日的に腫瘍径を測定し、以下の計算式から腫瘍体積を算出した；［腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径×（短径）２×０．５］。投与群３－１～４の平均腫瘍体積を図９に、マウスの生存率を図１０に示す。また、投与群３－１及び３－５のマウスの生存率を図１１に示す。
【0085】
図９及び１０に示す通り、ＷＴ１ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を経鼻投与した場合（投与群３－１）、ＷＴ１ロングペプチドと不完全フロイントアジュバントの混合物を腹腔内投与した場合（投与群３－４）と比較して、有意に腫瘍体積の増加を抑制すること、並びに生存率を有意に改善することが確認された。
図１１に示す通り、ＷＴ１ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を経鼻投与した場合（投与群３－１）、ＷＴ１ショートペプチドと不完全フロイントアジュバントの混合物を腹腔内投与した場合（投与群３－５）と比較して、生存率の改善効果が高いことが確認された。
このことから、ＷＴ１ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を投与すると、ＷＴ１タンパク発現腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を誘導することが示された。
図１１に示す通り、ＷＴ１ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を経鼻投与した場合（投与群３－１）、ＷＴ１ショートペプチドと不完全フロイントアジュバントの混合物を腹腔内投与した場合（投与群３－５）と比較して、生存率の改善効果が高いことが確認された。
このことから、ＷＴ１ロングペプチドとＶＰ－Ｒ８の混合物を投与すると、ＷＴ１タンパク発現腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を誘導することが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】