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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023064821
(43)【公開日】2023-05-12
(54)【発明の名称】細胞用液体培地及び幹細胞培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/02 20060101AFI20230502BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20230502BHJP
【ＦＩ】
C12N5/02
C12N5/074
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021175194
(22)【出願日】2021-10-27
(71)【出願人】
【識別番号】519092200
【氏名又は名称】グラドコフ・アレクセイ
(71)【出願人】
【識別番号】519092211
【氏名又は名称】グラドコワ・ニナ
(71)【出願人】
【識別番号】521471981
【氏名又は名称】亀井 一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100108442
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 義孝
(72)【発明者】
【氏名】グラドコフ・アレクセイ
(72)【発明者】
【氏名】グラドコワ・ニナ
(72)【発明者】
【氏名】亀井 一郎
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BC02
4B065BC06
(57)【要約】
【課題】ミトコンドリアの電子伝達系の活性を誘導し、ミトコンドリアを活性化させることができ、ミトコンドリアの活性による細胞分裂を促進することができる細胞用液体培地を提供する。
【解決手段】細胞用液体培地は、純水と、所定の栄養素と、純水に溶存させるガス組成物とから形成されている。ガス組成物は、イオン化した水素イオン（Ｈ+）と、酸素分子（Ｏ２）とを含有し、ガス組成物における水素イオン（Ｈ+）の濃度が０．５～０．７０ｐｐｍの範囲にあり、ガス組成物における酸素分子（Ｏ２）の濃度が１２．５～１５．５ｐｐｍの範囲にある。細胞用液体培地では、所定量の栄養素が純水に溶解しているとともに、水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とを含有するガス組成物がナノサイズのナノバブルの状態で純水に溶存している。
【選択図】図１
【解決手段】細胞用液体培地は、純水と、所定の栄養素と、純水に溶存させるガス組成物とから形成されている。ガス組成物は、イオン化した水素イオン（Ｈ+）と、酸素分子（Ｏ２）とを含有し、ガス組成物における水素イオン（Ｈ+）の濃度が０．５～０．７０ｐｐｍの範囲にあり、ガス組成物における酸素分子（Ｏ２）の濃度が１２．５～１５．５ｐｐｍの範囲にある。細胞用液体培地では、所定量の栄養素が純水に溶解しているとともに、水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とを含有するガス組成物がナノサイズのナノバブルの状態で純水に溶存している。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞の培養に使用される細胞用液体培地において、
前記細胞用液体培地が、純水と、所定の栄養素と、前記純水に溶存させるガス組成物とから形成され、前記ガス組成物が、イオン化した水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とを含有し、前記ガス組成物における前記水素イオン（Ｈ+）の濃度が、０．５～０．７０ｐｐｍの範囲にあり、前記ガス組成物における前記酸素分子（Ｏ２）の濃度が、１２．５～１５．５ｐｐｍの範囲にあり、前記ガス組成物では、前記水素イオン（Ｈ+）と前記酸素分子（Ｏ２）とが非結合の分離した状態にあり、前記細胞用液体培地では、所定量の前記栄養素が前記純水に溶解しているとともに、前記水素イオン（Ｈ+）と前記酸素分子（Ｏ２）とを含有する前記ガス組成物がナノサイズのナノバブルの状態で前記純水に溶存していることを特徴とする細胞用液体培地。
前記細胞用液体培地が、純水と、所定の栄養素と、前記純水に溶存させるガス組成物とから形成され、前記ガス組成物が、イオン化した水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とを含有し、前記ガス組成物における前記水素イオン（Ｈ+）の濃度が、０．５～０．７０ｐｐｍの範囲にあり、前記ガス組成物における前記酸素分子（Ｏ２）の濃度が、１２．５～１５．５ｐｐｍの範囲にあり、前記ガス組成物では、前記水素イオン（Ｈ+）と前記酸素分子（Ｏ２）とが非結合の分離した状態にあり、前記細胞用液体培地では、所定量の前記栄養素が前記純水に溶解しているとともに、前記水素イオン（Ｈ+）と前記酸素分子（Ｏ２）とを含有する前記ガス組成物がナノサイズのナノバブルの状態で前記純水に溶存していることを特徴とする細胞用液体培地。
【請求項2】
前記ガス組成物の粒径が、１００ｎｍ以下であり、前記細胞用液体培地では、該細胞用液体培地１ｃｃの中に５～８臆個の前記ガス組成物のマイクロバブルが溶存している請求項1に記載の細胞用液体培地。
【請求項3】
前記細胞用液体培地が、前記酸素分子（Ｏ２）を含有する好気性培地であって前記細胞のミトコンドリアを活性化させる請求項１又は請求項２に記載の細胞用液体培地。
【請求項4】
前記細胞用液体培地の０℃における粘度が、３．５～５．５ｍＰａ・ｓの範囲にあり、前記細胞用液体培地では、前記ナノバブルとして該細胞用液体培地に溶存する前記ガス組成物の５０％が該細胞用液体培地から外気に放出されるまでの時間が４８～７２時間の範囲にある請求項１ないし請求項３いずれかに記載の細胞用液体培地。
【請求項5】
前記栄養素が、炭素源と窒素源とビタミン類と無機塩類とのうちの少なくとも該炭素源であり、前記細胞用液体培地は、前記純水に前記ガス組成物を溶存させた後、前記ガス組成物が溶存する前記純水に粉末状態にある前記栄養素を溶解することから作られている請求項１ないし請求項４いずれかに記載の細胞用液体培地。
【請求項6】
前記細胞用液体培地では、前記純水に微量の炭酸ガスを溶存させた後、前記微量の炭酸ガスが溶存する純水に前記ガス組成物を溶存させる請求項５に記載の細胞用液体培地。
【請求項7】
所定の細胞用液体培地を利用して幹細胞を培養する幹細胞培養方法において、
前記幹細胞培養方法が、前記ドナーから採取した第１骨髄液を層状に分離する骨髄液分離工程と、前記骨髄液分離工程によって層状に分離した第１骨髄液のうちの中間層に位置する第２骨髄液を抽出する骨髄液抽出工程と、純水にガス組成物を溶存させた後、前記純水に所定の栄養素を溶解して前記ガス組成物を含有する細胞用第１液体培地を作る細胞用液体培地第１作成工程と、前記骨髄液抽出工程によって抽出した前記第２骨髄液と前記細胞用液体培地第１作成工程によって作った作成直後の前記細胞用第１液体培地とを所定の高さ寸法及び所定面積の底面を有する所定容量の第１培養容器に注入し、前記第１培養容器を所定時間静的に放置して前記第２骨髄液に含まれる第１幹細胞を該第１培養容器の底面に定着させるとともに前記第１幹細胞を増殖させ、前記第１培養容器の底面において前記第１幹細胞の平面形状が拡張して該第１培養容器の底面面積に対する該第１幹細胞の総平面面積が第１目標割合に達した場合、前記第１培養容器から前記第１幹細胞を抽出する幹細胞第１抽出工程と、前記幹細胞第１抽出工程によって抽出した第１幹細胞を層状に遠心分離する幹細胞遠心分離工程と、前記幹細胞遠心分離工程によって前記第１幹細胞を層状に分離させた後、最下層に位置する第２幹細胞を抽出する幹細胞第２抽出工程と、前記純水に前記ガス組成物を溶存させた後、該純水に前記栄養素を溶解して前記ガス組成物を含有する細胞用第２液体培地を作る細胞用液体培地第２作成工程と、前記幹細胞第２抽出工程によって抽出した前記第２幹細胞と前記細胞用液体培地第２作成工程によって作った作成直後の前記細胞用第２液体培地とを前記第１培養容器よりも大きい容量及び大きい底面面積の底面を有する所定容量の第２培養容器に注入し、前記第２培養容器を所定時間静的に放置して前記第２幹細胞を該第２培養容器の底面に定着させるとともに該第２幹細胞を増殖させ、前記第２培養容器の底面において前記第２幹細胞の平面形状が拡張して該第２培養容器の底面面積に対する該第２幹細胞の総平面面積が第２目標割合に達した場合、前記第２培養容器から前記第２幹細胞を抽出する幹細胞第３抽出工程とを有することを特徴とする幹細胞培養方法。
前記幹細胞培養方法が、前記ドナーから採取した第１骨髄液を層状に分離する骨髄液分離工程と、前記骨髄液分離工程によって層状に分離した第１骨髄液のうちの中間層に位置する第２骨髄液を抽出する骨髄液抽出工程と、純水にガス組成物を溶存させた後、前記純水に所定の栄養素を溶解して前記ガス組成物を含有する細胞用第１液体培地を作る細胞用液体培地第１作成工程と、前記骨髄液抽出工程によって抽出した前記第２骨髄液と前記細胞用液体培地第１作成工程によって作った作成直後の前記細胞用第１液体培地とを所定の高さ寸法及び所定面積の底面を有する所定容量の第１培養容器に注入し、前記第１培養容器を所定時間静的に放置して前記第２骨髄液に含まれる第１幹細胞を該第１培養容器の底面に定着させるとともに前記第１幹細胞を増殖させ、前記第１培養容器の底面において前記第１幹細胞の平面形状が拡張して該第１培養容器の底面面積に対する該第１幹細胞の総平面面積が第１目標割合に達した場合、前記第１培養容器から前記第１幹細胞を抽出する幹細胞第１抽出工程と、前記幹細胞第１抽出工程によって抽出した第１幹細胞を層状に遠心分離する幹細胞遠心分離工程と、前記幹細胞遠心分離工程によって前記第１幹細胞を層状に分離させた後、最下層に位置する第２幹細胞を抽出する幹細胞第２抽出工程と、前記純水に前記ガス組成物を溶存させた後、該純水に前記栄養素を溶解して前記ガス組成物を含有する細胞用第２液体培地を作る細胞用液体培地第２作成工程と、前記幹細胞第２抽出工程によって抽出した前記第２幹細胞と前記細胞用液体培地第２作成工程によって作った作成直後の前記細胞用第２液体培地とを前記第１培養容器よりも大きい容量及び大きい底面面積の底面を有する所定容量の第２培養容器に注入し、前記第２培養容器を所定時間静的に放置して前記第２幹細胞を該第２培養容器の底面に定着させるとともに該第２幹細胞を増殖させ、前記第２培養容器の底面において前記第２幹細胞の平面形状が拡張して該第２培養容器の底面面積に対する該第２幹細胞の総平面面積が第２目標割合に達した場合、前記第２培養容器から前記第２幹細胞を抽出する幹細胞第３抽出工程とを有することを特徴とする幹細胞培養方法。
【請求項8】
前記幹細胞培養方法が、前記骨髄液抽出工程によって抽出した前記第２骨髄液と前記細胞用第１液体培地とを前記第１培養容器に注入した後、前記第１培養容器を所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で該第１培養容器内の第１幹細胞の初期平面形状からの変形を観察する形状変形第１観察工程と、前記形状変形第１観察工程における観察の結果、前記第１幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、前記第１幹細胞が前記第１培養容器の底面に定着したと判断し、前記第１培養容器内の前記細胞用第１液体培地を排出した後、前記細胞用液体培地第１作成工程によって作った作成直後の新たな細胞用第１液体培地を該第１培養容器に注入し、前記第１培養容器を所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で該第１培養容器の底面に定着した前記第１幹細胞の該第１培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する総平面面積第１観察工程とを含み、前記幹細胞第１抽出工程では、前記総平面面積第１観察工程における観察の結果、前記第１幹細胞が増殖して該第１幹細胞の平面形状が拡張し、前記第１幹細胞の総平面面積が前記第１培養容器の底面面積に対して前記第１目標割合に達した場合、前記第１培養容器から前記第１幹細胞を抽出する請求項７に記載の幹細胞培養方法。
【請求項9】
前記幹細胞培養方法が、前記幹細胞第２抽出工程によって抽出した前記第２幹細胞と前記細胞用第２液体培地とを前記第２培養容器に注入した後、前記第２培養容器を所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で該第２培養容器内の前記第２幹細胞の初期平面形状からの変形を観察する形状変形第２観察工程と、前記形状変形第２観察工程における観察の結果、前記第２幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、前記第２幹細胞が前記第２培養容器の底面に定着したと判断し、前記第２培養容器内の前記細胞用第２液体培地を排出した後、前記細胞用液体培地第２作成工程によって作った作成直後の新たな細胞用第２液体培地を該第２培養容器に注入し、前記第２培養容器を所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で該第２培養容器の底面に定着した前記第２幹細胞の該第２培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する総平面面積第２観察工程とを含み、前記幹細胞第３抽出工程では、前記総平面面積第２観察工程における観察の結果、前記第２幹細胞が増殖して該第２幹細胞の平面形状が拡張し、前記第２幹細胞の総平面面積が前記第２培養容器の底面面積に対して前記第２目標割合に達した場合、前記第２培養容器から前記第２幹細胞を抽出する請求項８に記載の幹細胞培養方法。
【請求項10】
前記細胞用液体培地第１作成工程によって作られた前記細胞用第１液体培地と前記細胞用液体培地第２作成工程によって作られた前記細胞用第２液体培地とが、純水と、前記純水に溶解した所定の栄養素と、濃度０．５～０．７５ｐｐｍの範囲のイオン化した水素イオン（Ｈ+）及び濃度１２．５～１５．５ｐｐｍの範囲であって前記水素イオン（Ｈ+）に非結合の酸素分子（Ｏ２）を含有して前記純水にナノサイズのナノバブルの状態で溶存するガス組成物とから形成されている請求項７ないし請求項９いずれかに記載の幹細胞培養方法。
【請求項11】
前記細胞用第１液体培地及び前記細胞用第２液体培地では、前記ガス組成物の粒径が１００ｎｍ以下であり、前記細胞用第１液体培地１ｃｃの中に５～８臆個の前記ガス組成物のマイクロバブルが溶存し、前記細胞用第２液体培地１ｃｃの中に５～８臆個の前記ガス組成物のマイクロバブルが溶存している請求項１０に記載の幹細胞培養方法。
【請求項12】
前記細胞用第１液体培地及び前記細胞用第２液体培地では、それら液体培地の０℃における粘度が３．５～５．５ｍＰａ・ｓの範囲にあり、前記ナノバブルとして前記細胞用第１液体培地に溶存する前記ガス組成物の５０％が該細胞用第１液体培地から外気に放出されるまでの時間が４８～７２時間の範囲にあり、前記ナノバブルとして前記細胞用第２液体培地に溶存する前記ガス組成物の５０％が該細胞用第２液体培地から外気に放出されるまでの時間が４８～７２時間の範囲にある請求項１０又は請求項１１に記載の幹細胞培養方法。
【請求項13】
前記栄養素が、炭素源と窒素源とビタミン類と無機塩類とのうちの少なくとも該炭素源であり、前記細胞用第１液体培地及び前記細胞用第２液体培地が、前記純水に前記ガス組成物を溶存させた後、前記ガス組成物が溶存する前記純水に粉末状態にある前記栄養素を溶解することから作られている請求項１０ないし請求項１２いずれかに記載の幹細胞培養方法。
【請求項14】
前記細胞用液体培地第１作成工程及び前記細胞用液体培地第２作成工程では、前記純水に微量の炭酸ガスを溶存させた後、前記微量の炭酸ガスが溶存する純水に前記ガス組成物を溶存させる請求項１３に記載の幹細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞の培養に使用される細胞用液体培地に関するとともに、細胞用液体培地を利用して幹細胞を培養する幹細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【0002】
栄養培地がクエン酸、コハク酸、リンゴ酸、αケトグルタル酸、フマル酸、オキサロ酢酸、イソクエン酸、オキサロコハク酸、酒石酸、アジピン酸、乳酸及びこれらの混合物、並びにこれらの酸の塩、誘導体又は複合体からなる群から選ばれた少なくとも１つの物質を含むことを特徴とする、細胞培養のための栄養培地が開示されている（特許文献１参照）。この栄養培地によれば、細胞増殖を改善することができ、代謝副産物の生産を減少させることができる。
【0003】
幹細胞を培養する培地と、幹細胞に対して照射エネルギーが０を超え１０ジュール／ｃｍ２以下、レーザパワー密度が０．１Ｗ／ｃｍ２以下、照射エネルギーを０．１以上２．５ジュール／ｃｍ２以下の低出力の炭酸ガスレーザーの照射光をデフォーカスして培地全体に照射し、幹細胞を活性化させるレーザー照射手段とを備え、幹細胞に低出力のレーザーを照射して活性化させた後、幹細胞に所定の休止期間を設けて目標増殖数まで増殖させる幹細胞培養方法が開示されている（特許文献２参照）。この幹細胞培養方法によれば、ヒト、非ヒト（動物）から採取した組織又はその細胞に存在する幹細胞を活性化させて飛躍的に増殖させることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特表２００９－５０９５１４号公報
【特許文献2】特開２０１５－１８６４６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
特許文献１に開示の栄養培地は、細胞内小器官のミトコンドリアの電子伝達系の活性を誘導することができないから、ミトコンドリアを活性化させることができず、ミトコンドリアの活性による細胞分裂を促進することはなく、単位時間内に細胞を多量に増殖させることができず、短期間に多量の培養細胞を作ることができない。
【0006】
特許文献２に開示の幹細胞培養方法は、炭酸ガスレーザーの照射光をデフォーカスして培地全体に照射することで、幹細胞を活性化させるが、コヒーレント光である炭酸ガスレーザーを培地全体に均等に照射しなければならないとともに、炭酸ガスレーザーの出力が一定となるように培地に炭酸ガスレーザーを照射しなければならず、単位時間内に細胞を多量に増殖させることが難しく、短期間に多量の培養細胞を作ることができない。
【0007】
本発明の目的は、ミトコンドリアの電子伝達系の活性を誘導することができ、ミトコンドリアを活性化させることができるとともに、ミトコンドリアの活性による細胞分裂を促進することができる細胞用液体培地及び幹細胞培養方法を提供することにある。更に、単位時間内に細胞を多量に増殖させることができ、短期間に多量の培養細胞を作ることができる細胞用液体培地及び幹細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
前記課題を解決するための本発明の第1の前提は、細胞の培養に使用される細胞用液体培地である。
【0009】
前記第1の前提における本発明の第1の特徴は、細胞用液体培地が、純水と、所定の栄養素と、純水に溶存させるガス組成物とから形成され、ガス組成物が、イオン化した水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とを含有し、ガス組成物における水素イオン（Ｈ+）の濃度が、０．５～０．７０ｐｐｍの範囲にあり、ガス組成物における酸素分子（Ｏ２）の濃度が、１２．５～１５．５ｐｐｍの範囲にあり、ガス組成物では、水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とが非結合の分離した状態にあり、細胞用液体培地では、所定量の栄養素が純水に溶解しているとともに、水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とを含有するガス組成物がナノサイズのナノバブルの状態で純水に溶存していることにある。
【0010】
前記第１の特徴を有する本発明の一例としては、ガス組成物の粒径が、１００ｎｍ以下であり、細胞用液体培地では、細胞用液体培地１ｃｃの中に５～８臆個のガス組成物のマイクロバブルが溶存している。
【0011】
前記第１の特徴を有する本発明の他の一例としては、細胞用液体培地が、酸素分子（Ｏ２）を含有する好気性培地であって細胞のミトコンドリアを活性化させる。
【0012】
前記第１の特徴を有する本発明の他の一例としては、細胞用液体培地の０℃における粘度が、３．５～５．５ｍＰａ・ｓの範囲にあり、細胞用液体培地では、ナノバブルとして細胞用液体培地に溶存するガス組成物の５０％が細胞用液体培地から外気に放出されるまでの時間が４８～７２時間の範囲にある。
【0013】
前記第１の特徴を有する本発明の他の一例としては、栄養素が、炭素源と窒素源とビタミン類と無機塩類とのうちの少なくとも炭素源であり、細胞用液体培地は、純水にガス組成物を溶存させた後、ガス組成物が溶存する純水に粉末状態にある栄養素を溶解することから作られている。
【0014】
前記第１の特徴を有する本発明の他の一例として、細胞用液体培地では、純水に微量の炭酸ガスを溶存させた後、微量の炭酸ガスが溶存する純水にガス組成物を溶存させる。
【0015】
前記課題を解決するための本発明の第２の前提は、所定の細胞用液体培地を利用して幹細胞を培養する幹細胞培養方法である。
【0016】
前記第２の前提における本発明の第２の特徴は、幹細胞培養方法が、ドナーから採取した第１骨髄液を層状に分離する骨髄液分離工程と、骨髄液分離工程によって層状に分離した第１骨髄液のうちの中間層に位置する第２骨髄液を抽出する骨髄液抽出工程と、純水にガス組成物を溶存させた後、純水に所定の栄養素を溶解してガス組成物を含有する細胞用第１液体培地を作る細胞用液体培地第１作成工程と、骨髄液抽出工程によって抽出した第２骨髄液と細胞用液体培地第１作成工程によって作った作成直後の細胞用第１液体培地とを所定の高さ寸法及び所定面積の底面を有する所定容量の第１培養容器に注入し、第１培養容器を所定時間静的に放置して第２骨髄液に含まれる第１幹細胞を第１培養容器の底面に定着させるとともに第１幹細胞を増殖させ、第１培養容器の底面において第１幹細胞の平面形状が拡張して第１培養容器の底面面積に対する第１幹細胞の総平面面積が第１目標割合に達した場合、第１培養容器から第１幹細胞を抽出する幹細胞第１抽出工程と、幹細胞第１抽出工程によって抽出した第１幹細胞を層状に遠心分離する幹細胞遠心分離工程と、幹細胞遠心分離工程によって第１幹細胞を層状に分離させた後、最下層に位置する第２幹細胞を抽出する幹細胞第２抽出工程と、純水にガス組成物を溶存させた後、純水に栄養素を溶解してガス組成物を含有する細胞用第２液体培地を作る細胞用液体培地第２作成工程と、幹細胞第２抽出工程によって抽出した第２幹細胞と細胞用液体培地第２作成工程によって作った作成直後の細胞用第２液体培地とを第１培養容器よりも大きい容量及び大きい底面面積の底面を有する第２培養容器に注入し、第２培養容器を所定時間静的に放置して第２幹細胞を該第２培養容器の底面に定着させるとともに第２幹細胞を増殖させ、第２培養容器の底面において第２幹細胞の平面形状が拡張して第２培養容器の底面面積に対する第２幹細胞の総平面面積が第２目標割合に達した場合、第２培養容器から第２幹細胞を抽出する幹細胞第３抽出工程とを有することにある。
【0017】
前記第２の特徴を有する本発明の一例としては、幹細胞培養方法が、骨髄液抽出工程によって抽出した第２骨髄液と細胞用第１液体培地とを第１培養容器に注入した後、第１培養容器を所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第１培養容器内の第１幹細胞の初期平面形状からの変形を観察する形状変形第１観察工程と、形状変形第１観察工程における観察の結果、第１幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、第１幹細胞が第１培養容器の底面に定着したと判断し、第１培養容器内の細胞用第１液体培地を排出した後、細胞用液体培地第１作成工程によって作った作成直後の新たな細胞用第１液体培地を第１培養容器に注入し、第１培養容器を所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第１培養容器の底面に定着した第１幹細胞の第１培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する総平面面積第１観察工程とを含み、幹細胞第１抽出工程では、総平面面積第１観察工程における観察の結果、第１幹細胞が増殖して第１幹細胞の平面形状が拡張し、第１幹細胞の総平面面積が第１培養容器の底面面積に対して第１目標割合に達した場合、第１培養容器から第１幹細胞を抽出する。
【0018】
前記第２の特徴を有する本発明の他の一例としては、幹細胞培養方法が、幹細胞第２抽出工程によって抽出した第２幹細胞と細胞用第２液体培地とを第２培養容器に注入した後、第２培養容器を所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第２培養容器内の第２幹細胞の初期平面形状からの変形を観察する形状変形第２観察工程と、形状変形第２観察工程における観察の結果、第２幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、第２幹細胞が第２培養容器の底面に定着したと判断し、第２培養容器内の細胞用第２液体培地を排出した後、細胞用液体培地第２作成工程によって作った作成直後の新たな細胞用第２液体培地を第２培養容器に注入し、第２培養容器を所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第２培養容器の底面に定着した第２幹細胞の第２培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する総平面面積第２観察工程とを含み、幹細胞第３抽出工程では、総平面面積第２観察工程における観察の結果、第２幹細胞が増殖して第２幹細胞の平面形状が拡張し、第２幹細胞の総平面面積が第２培養容器の底面面積に対して第２目標割合に達した場合、第２培養容器から前記第２幹細胞を抽出する。
【0019】
前記第２の特徴を有する本発明の他の一例としては、細胞用液体培地第１作成工程によって作られた細胞用第１液体培地と細胞用液体培地第２作成工程によって作られた細胞用第２液体培地とが、純水と、純水に溶解した所定の栄養素と、濃度０．５～０．７５ｐｐｍの範囲のイオン化した水素イオン（Ｈ+）及び濃度１２．５～１５．５ｐｐｍの範囲であって水素イオン（Ｈ+）に非結合の酸素分子（Ｏ２）を含有して純水にナノサイズのナノバブルの状態で溶存するガス組成物とから形成されている。
【0020】
前記第２の特徴を有する本発明の他の一例としては、細胞用第１液体培地及び細胞用第２液体培地では、ガス組成物の粒径が１００ｎｍ以下であり、細胞用第１液体培地１ｃｃの中に５～８臆個のガス組成物のマイクロバブルが溶存し、細胞用第２液体培地１ｃｃの中に５～８臆個のガス組成物のマイクロバブルが溶存している。
【0021】
前記第２の特徴を有する本発明の他の一例として、細胞用第１液体培地及び細胞用第２液体培地では、それら液体培地の０℃における粘度が３．５～５．５ｍＰａ・ｓの範囲にあり、ナノバブルとして細胞用第１液体培地に溶存するガス組成物の５０％が細胞用第１液体培地から外気に放出されるまでの時間が４８～７２時間の範囲にあり、ナノバブルとして細胞用第２液体培地に溶存するガス組成物の５０％が細胞用第２液体培地から外気に放出されるまでの時間が４８～７２時間の範囲にある。
【0022】
前記第２の特徴を有する本発明の他の一例としては、栄養素が、炭素源と窒素源とビタミン類と無機塩類とのうちの少なくとも炭素源であり、細胞用第１液体培地及び細胞用第２液体培地が、純水にガス組成物を溶存させた後、ガス組成物が溶存する純水に粉末状態にある栄養素を溶解することから作られている。
【0023】
前記第２の特徴を有する本発明の他の一例として、細胞用液体培地第１作成工程及び細胞用液体培地第２作成工程では、純水に微量の炭酸ガスを溶存させた後、微量の炭酸ガスが溶存する純水にガス組成物を溶存させる。
【発明の効果】
【0024】
第１の特徴を有する本発明の細胞用液体培地によれば、それが純水と所定の栄養素と純水に溶存させるガス組成物とから形成され、ガス組成物がイオン化した水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とを含有し、ガス組成物における水素イオン（Ｈ+）の濃度が０．５～０．７０ｐｐｍの範囲にあり、ガス組成物における酸素分子（Ｏ２）の濃度が１２．５～１５．５ｐｐｍの範囲にあり、水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とが非結合の分離した状態にあり、所定量の栄養素が純水に溶解しているとともに、ガス組成物がナノサイズのナノバブルの状態で純水に溶存しているから、ナノバブルの状態で細胞用液体培地に存在する水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とがミトコンドリアの外膜から内膜に進入し、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）がミトコンドリアの電子伝達系の活性を誘導しつつＡＴＰの産生を誘導し、ミトコンドリアを活性化させることができ、ミトコンドリアの活性によって細胞分裂を促進することができる。細胞用液体培地は、単位時間内に細胞を多量に増殖させることができ、短期間に多量の培養細胞を作ることができる。
【0025】
ガス組成物の粒径が１００ｎｍ以下であり、細胞用液体培地１ｃｃの中に５～８臆個のガス組成物のマイクロバブルが溶存している細胞用液体培地は、前記粒径のガス組成物のマイクロバブルが細胞用液体培地１ｃｃの中に５～８臆個溶存することで、細胞用液体培地におけるガス組成物の上昇速度が遅く、ガス組成物が細胞用液体培地内に長時間留まり、そのガス組成物の水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を長時間利用することができ、ミトコンドリアを十分に活性化させることができるとともに、ミトコンドリアの活性によって細胞分裂を確実に促進することができる。細胞用液体培地は、単位時間内に細胞を多量に増殖させることができ、短期間に多量の培養細胞を確実に作ることができる。
【0026】
酸素分子（Ｏ２）を含有する好気性培地であって細胞のミトコンドリアを活性化させる細胞用液体培地は、ナノバブルの状態で存在する酸素分子（Ｏ２）が細胞用液体培地を好気性培地とし、水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とがミトコンドリアの外膜から内膜に進入し、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）がミトコンドリアの電子伝達系の活性を誘導しつつＡＴＰの産生を誘導し、ミトコンドリアを活性化させることができ、ミトコンドリアの活性によって細胞分裂を促進することができるとともに、好気性培地を利用して短期間に多量の培養細胞を作ることができる。
【0027】
細胞用液体培地の０℃における粘度が３．５～５．５ｍＰａ・ｓの範囲にあり、ナノバブルとして細胞用液体培地に溶存するガス組成物の５０％が細胞用液体培地から外気に放出されるまでの時間が４８～７２時間の範囲にある細胞用液体培地は、ガス組成物の５０％が細胞用液体培地から外気に放出されるまでの時間が前記範囲にあるから、ガス組成物が細胞用液体培地内に長時間留まり、そのガス組成物の水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を長時間利用することができ、ミトコンドリアを十分に活性化させることができるとともに、ミトコンドリアの活性によって細胞分裂を確実に促進することができる。細胞用液体培地は、単位時間内に細胞を多量に増殖させることができ、短期間に多量の培養細胞を確実に作ることができる。
【0028】
栄養素が炭素源と窒素源とビタミン類と無機塩類とのうちの少なくとも炭素源であり、純水にガス組成物を溶存させた後、ガス組成物が溶存する純水に粉末状態にある栄養素を溶解することから作られている細胞用液体培地は、栄養素が炭素源と窒素源とビタミン類と無機塩類とのうちの少なくとも炭素源であるから、栄養素を利用して細胞を確実に培養することができるとともに、純水にガス組成物を溶存させた後、ガス組成物が溶存する純水に粉末状態にある栄養素を溶解するから、細胞用液体培地の作成過程においてその液体培地に溶存するガス組成物が細胞用液体培地から外気に放出され難く、ガス組成物が細胞用液体培地内に長時間留まる細胞用液体培地を作ることができ、その細胞用液体培地を利用することで単位時間内に細胞を多量に増殖させることができるとともに、短期間に多量の培養細胞を確実に作ることができる。
【0029】
純水に微量の炭酸ガスを溶存させた後、微量の炭酸ガスが溶存する純水にガス組成物を溶存させる細胞用液体培地は、純水に溶存させた微量の炭酸ガス分子がキャリアとなり、その炭酸ガス分子に水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）が結合することで、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を高い濃度で細胞用液体培地に溶存させることができ、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を高い濃度で含む細胞用液体培地を利用することで単位時間内に細胞を多量に増殖させることができ、短期間に多量の培養細胞を確実に作ることができる。
【0030】
第２の特徴を有する本発明の幹細胞培養方法によれば、ドナーから採取した第１骨髄液を層状に分離させ、層状に分離させた第１骨髄液のうちの中間層に位置する第２骨髄液を抽出し、純水にガス組成物を溶存させた後、純水に所定の栄養素を溶解してガス組成物を含有する細胞用第１液体培地を作り、第２骨髄液と作成直後の細胞用第１液体培地とを注入した第１培養容器において第２骨髄液に含まれる第１幹細胞を第１培養容器の底面に定着させるとともに第１幹細胞を増殖させ、第１幹細胞の総平面面積が第１培養容器の底面面積に対して第１目標割合に達した場合、第１培養容器から第１幹細胞を抽出し、第１幹細胞を層状に分離させた後、最下層に位置する第２幹細胞を抽出し、純水にガス組成物を溶存させた後、純水に栄養素を溶解してガス組成物を含有する細胞用第２液体培地を作り、第２幹細胞と作成直後の細胞用第２液体培地とを注入した第２培養容器において第２幹細胞を第２培養容器の底面に定着させるとともに第２幹細胞を増殖させ、第２幹細胞の総平面面積が第２培養容器の底面面積に対して第２目標割合に達した場合、第２培養容器から第２幹細胞を抽出するから、幹細胞のミトコンドリアを活性化させつつ、ミトコンドリアの活性によって幹細胞の細胞分裂を促進させ、単位時間内に幹細胞を多量に増殖させることができ、短期間に多量の培養幹細胞を作ることができる。幹細胞培養方法は、層状に分離させた第１幹細胞から特定の第２幹細胞（最下層に位置する第２幹細胞）を抽出するから、多種雑多な幹細胞の増殖を防ぐことができ、製造対象の特定種類の幹細胞（第２幹細胞）のみを培養することができるとともに、不要な幹細胞が除去されたピュア（純粋）な幹細胞を製造することができる。幹細胞培養方法は、特定種類の幹細胞のみを培養することができるから、各種の疾患に対する治療の効果や再生医療における再生の効果が大きく、各種の疾患を完治させる確立が高いとともに各種の組織や各種の臓器を再生させる確立が高い幹細胞を培養することができる。
【0031】
抽出した第２骨髄液と細胞用第１液体培地とを第１培養容器に注入した後、第１培養容器を所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第１培養容器内の第１幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第１幹細胞の変形を観察の結果、第１幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、第１幹細胞が第１培養容器の底面に定着したと判断し、第１培養容器内の細胞用第１液体培地を排出し、作成直後の新たな細胞用第１液体培地を第１培養容器に注入し、第１培養容器を所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第１培養容器の底面に定着した第１幹細胞の第１培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察し、総平面面積を観察した結果、第１幹細胞が増殖して第１幹細胞の平面形状が拡張し、第１幹細胞の総平面面積が第１培養容器の底面面積に対して第１目標割合に達した場合、第１培養容器から第１幹細胞を抽出する幹細胞培養方法は、幹細胞のミトコンドリアを活性化させる細胞用第１液体培地を利用することで、第１培養容器の底面に第１幹細胞を確実に定着させることができ、第１培養容器の底面に第１幹細胞が定着した後、第１培養容器内の細胞用第１液体培地を排出し、新たな細胞用第１液体培地を第１培養容器に注入し、幹細胞のミトコンドリアを活性化させる新たな細胞用第１液体培地を利用することで、第１幹細胞の増殖を確実に促進することができる。幹細胞培養方法は、幹細胞のミトコンドリアを活性化させる細胞用第１液体培地を利用することで、第１培養容器において第１幹細胞を確実に定着かつ増殖させることができるとともに、第１目標割合に対する第１幹細胞の総平面面積の到達度を正確に確認することができるから、他の幹細胞を含まない第１幹細胞のみを培養することができ、多種雑多な幹細胞の増殖を防ぎつつ、製造対象の特定種類の幹細胞（第２幹細胞）のみを培養することができる。
【0032】
抽出した第２幹細胞と細胞用第２液体培地とを第２培養容器に注入した後、第２培養容器を所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第２培養容器内の第２幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第２幹細胞の変形を観察した結果、第２幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、第２幹細胞が第２培養容器の底面に定着したと判断し、第２培養容器内の細胞用第２液体培地を排出し、作成直後の新たな細胞用第２液体培地を第２培養容器に注入し、第２培養容器を所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第２培養容器の底面に定着した第２幹細胞の第２培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察し、総平面面積を観察した結果、第２幹細胞が増殖して第２幹細胞の平面形状が拡張し、第２幹細胞の総平面面積が第２培養容器の底面面積に対して第２目標割合に達した場合、第２培養容器から第２幹細胞を抽出する幹細胞培養方法は、幹細胞のミトコンドリアを活性化させる細胞用第２液体培地を利用することで、第２培養容器の底面に第２幹細胞を確実に定着させることができ、第２培養容器の底面に第２幹細胞が定着した後、第２培養容器内の細胞用第２液体培地を排出し、新たな細胞用第２液体培地を第２培養容器に注入し、幹細胞のミトコンドリアを活性化させる新たな細胞用第２液体培地を利用することで、第２幹細胞の増殖を確実に促進することができる。幹細胞培養方法は、幹細胞のミトコンドリアを活性化させる細胞用第２液体培地を利用することで、第２培養容器において第２幹細胞を確実に定着かつ増殖させることができるとともに、第２目標割合に対する第２幹細胞の総平面面積の到達度を正確に確認することができるから、他の幹細胞を含まない第２幹細胞のみを培養することができ、多種雑多な幹細胞の増殖を防ぎつつ、製造対象の特定種類の第２幹細胞のみを培養することができる。
【0033】
細胞用第１液体培地と細胞用第２液体培地とが純水と純水に溶解した所定の栄養素と濃度０．５～０．７５ｐｐｍの範囲のイオン化した水素イオン（Ｈ+）及び濃度１２．５～１５．５ｐｐｍの範囲であって水素イオン（Ｈ+）に非結合の酸素分子（Ｏ２）を含有して純水にナノサイズのナノバブルの状態で溶存するガス組成物とから形成されている幹細胞培養方法は、ナノバブルの状態で細胞用液体培地に存在する水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とが幹細胞のミトコンドリアの外膜から内膜に進入し、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）がミトコンドリアの電子伝達系の活性を誘導しつつＡＴＰの産生を誘導し、ミトコンドリアを活性化させることができ、ミトコンドリアの活性によって幹細胞の細胞分裂を促進することができる。幹細胞培養方法は、単位時間内に製造対象の特定種類の幹細胞（第２幹細胞）を多量に増殖させることができ、短期間に多量の培養幹細胞を作ることができる。
【0034】
ガス組成物の粒径が１００ｎｍ以下であり、細胞用第１液体培地１ｃｃの中に５～８臆個のガス組成物のマイクロバブルが溶存し、細胞用第２液体培地１ｃｃの中に５～８臆個のガス組成物のマイクロバブルが溶存している幹細胞培養方法は、前記粒径のガス組成物のマイクロバブルが細胞用第１液体培地及び細胞用第２液体培地１ｃｃの中に５～８臆個溶存することで、細胞用第１液体培地及び細胞用第２液体培地におけるガス組成物の上昇速度が遅く、ガス組成物が細胞用第１液体培地内や細胞用第２液体培地内に長時間留まり、そのガス組成物の水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を長時間利用することができ、幹細胞のミトコンドリアを十分に活性化させることができるとともに、ミトコンドリアの活性によって幹細胞の細胞分裂を確実に促進することができる。幹細胞培養方法は、単位時間内に製造対象の特定種類の幹細胞（第２幹細胞）を多量に増殖させることができ、短期間に多量の培養幹細胞を確実に作ることができる。
【0035】
細胞用第１液体培地及び細胞用第２液体培地の０℃における粘度が３．５～５．５ｍＰａ・ｓの範囲にあり、ナノバブルとして細胞用第１液体培地に溶存するガス組成物の５０％が細胞用第１液体培地から外気に放出されるまでの時間が４８～７２時間の範囲にあり、ナノバブルとして細胞用第２液体培地に溶存するガス組成物の５０％が細胞用第２液体培地から外気に放出されるまでの時間が４８～７２時間の範囲にある幹細胞培養方法は、ガス組成物の５０％が細胞用第１液体培地及び細胞用第２液体培地から外気に放出されるまでの時間が前記範囲にあるから、ガス組成物が細胞用第１液体培地内や細胞用第２液体培地内に長時間留まり、そのガス組成物の水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を長時間利用することができ、幹細胞のミトコンドリアを十分に活性化させることができるとともに、ミトコンドリアの活性によって幹細胞の細胞分裂を確実に促進することができる。幹細胞培養方法は、単位時間内に製造対象の特定種類の幹細胞（第２幹細胞）を多量に増殖させることができ、短期間に多量の培養幹細胞を確実に作ることができる。
【0036】
栄養素が炭素源と窒素源とビタミン類と無機塩類とのうちの少なくとも炭素源であり、細胞用第１液体培地及び細胞用第２液体培地が純水にガス組成物を溶存させた後、ガス組成物が溶存する純水に粉末状態にある栄養素を溶解することから作られている幹細胞培養方法は、栄養素が炭素源と窒素源とビタミン類と無機塩類とのうちの少なくとも炭素源であるから、栄養素を利用して幹細胞を確実に培養することができるとともに、純水にガス組成物を溶存させた後、ガス組成物が溶存する純水に粉末状態にある栄養素を溶解するから、液体培地の作成工程において細胞用第１液体培地及び細胞用第２液体培地に溶存するガス組成物が細胞用第１液体培地や細胞用第２液体培地から外気に放出され難く、ガス組成物が細胞用第１液体培地内や細胞用第２液体培地内に長時間留まる液体培地を作ることができ、細胞用第１液体培地や細胞用第２液体培地を利用することで単位時間内に幹細胞を多量に増殖させることができるとともに、短期間に多量の培養幹細胞を確実に作ることができる。
【0037】
細胞用液体培地第１作成工程及び細胞用液体培地第２作成工程において、純水に微量の炭酸ガスを溶存させた後、微量の炭酸ガスが溶存する純水にガス組成物を溶存させる幹細胞培養方法は、純水に溶存させた微量の炭酸ガス分子がキャリアとなり、その炭酸ガス分子に水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）が結合することで、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を高い濃度で細胞用第１液体培地及び細胞用第２液体培地に溶存させることができ、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を高い濃度で含む細胞用第１液体培地や細胞用第２液体培地を利用することで単位時間内に幹細胞を多量に増殖させることができ、短期間に多量の培養幹細胞を確実に作ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】一例として示すナノバルブ発生システムの構成図。
【図2】一例として示すナノバルブ発生装置の構成図。
【図3】一例として示す幹細胞培養システムの構成図。
【図4】骨髄液分離工程の一例を示す説明図。
【図6】第１扁平培養容器を使用した形状変形第１観察工程の一例を示す説明図。
【図7】第１間葉系幹細胞の平面形状の一例を示す部分拡大図。
【図8】第１間葉系幹細胞の平面形状の他の一例を示す部分拡大図。
【図9】幹細胞遠心分離工程の一例を示す説明図。
【図10】幹細胞第２抽出工程の一例を示す説明図。
【図11】第２扁平培養容器を使用した形状変形第２観察工程の一例を示す説明図。
【図12】第２間葉系幹細胞の平面形状の一例を示す部分拡大図。
【図13】第２間葉系幹細胞の平面形状の他の一例を示す部分拡大図。
【図14】第２間葉系幹細胞の保存の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0039】
一例として示すナノバルブ発生システム１０の構成図である図１等の添付の図面を参照し、本発明に係る細胞用液体培地１１の詳細を説明すると、以下のとおりである。尚、図２は、一例として示すナノバルブ発生装置１２の構成図である。細胞用液体培地１１は、各種の細胞の培養に使用され、特に好ましくは、間葉系幹細胞（幹細胞）の培養に好適に使用される。
【0040】
細胞用液体培地１１は、純水４１と、所定の栄養素と、純水４１に溶存させるガス組成物１３とから形成されている。ガス組成物１３は、イオン化（電離）した水素イオン（Ｈ+）と、酸素分子（Ｏ２）とを含有する。ガス組成物１３では、水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とが非結合の分離した状態にある。細胞用液体培地１１では、所定量の栄養素が純水に溶解しているとともに、水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とを含有するガス組成物１３がナノサイズのナノバブルの状態で純水に溶存している。
【0041】
ナノバルブ発生システム１０は、純水生成装置１４と電気分解装置１５とナノバルブ発生装置１２とから形成されている。純水生成装置１４は、原水管１６（ホース）及び第１フィルタハウジング１７と、原水管１６に設置された原水給水ポンプ１８と、純水生成ユニット１９と、純水管２０（ホース）及び第２フィルタハウジング２１と、純水管２０に設置された純水給水ポンプ２２とから形成されている。原水管１７は、純水生成ユニット１９の原水流入口に連結されている。原水給水ポンプ１８は、原水（水道水等）を純水生成ユニット１９に流入させる。第１フィルタハウジング１７は、原水管２０に設置され、その内部に前処理フィルタが収容されている。第１フィルタハウジング１７は、原水管２０に流れる原水を濾過し、原水に含まれる不純物を除去する。
【0042】
純水生成ユニット１９には、陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂が混合された状態で充填されている。純水生成ユニット１９は、原水中のイオン化した電解質を除去し、純水を生成する。尚、純水生成ユニット１９には、図示はしていないが、電気伝導率計（水質計）が設置されている。純水管２０は、純水生成ユニット１９の純水流出口に連結されている。第２フィルタハウジング２１は、純水管２０に設置され、その内部に後処理フィルタが収容されている。第２フィルタハウジング２１は、純水管２０に流れる純水を濾過し、純水に含まれる不純物を除去する。純水給水ポンプ２２は、純水生成ユニット１９によって生成された純水を電気分解装置１５に流入させる。
【0043】
電気分解装置１５は、電源２３と電気分解ユニット２４とから形成されている。電源２３は、電気分解ユニット２４に設置された陽極（アノード）及び陰極（カソード）に電気を通電する。電気分解ユニット２４は、図示はしていないが、陽極（アノード）及び陰極（カソード）と、陽極及び陰極の間に位置（介在）する固体高分子電解質膜（スルホン酸基を有するフッ素系イオン交換膜）と、陽極給電部材及び陰極給電部材と、陽極用貯水槽及び陰極用貯水槽と、陽極主電極および陰極主電極とから形成されている。
【0044】
電気分解ユニット２４には、水素給気管２５（ホース）と酸素給気管２６（ホース）とが連結されている。水素給気管２５には、水素給気ポンプ２７が設置されている。水素給気ポンプ２７は、水素給気管２５を通流する水素イオンをナノバルブ発生装置１２の第１微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３３に給気する。酸素給気管２６には、酸素給気ポンプ２８が設置されている。酸素給気ポンプ２８は、酸素給気管２６を通流する酸素分子をナノバルブ発生装置１２の第２細気泡（ナノバブル）発生ノズル３３に給気する。
【0045】
電気分解ユニット２４は、電源２３から電気を通電された陽極で酸化反応を起こすとともに陰極で還元反応を起こすことで原水を化学分解する。電気分解ユニット２４では、陽極及び陰極、固体高分子電解質膜（図示せず）が厚み方向へ重なり合って一体化し、膜/電極接合体 (Membrane Electrode Assembly, MEA)を構成し、膜/電極接合体を陽極給電部材（図示せず）と陰極給電部材（図示せず）とが挟み込んでいる。固体高分子電解質膜は、プロトン導電性があり、電子導電性がない。
【0046】
陽極給電部材は、陽極の外側に位置して陽極に密着し、陽極に＋の電流を給電する。陽極用貯水槽は、陽極給電部材の外側に位置して陽極給電部材に密着している。陽極主電極は、陽極用貯水槽の外側に位置して陽極給電部材に＋の電流を給電する。陰極給電部材は、陰極の外側に位置して陰極に密着し、陰極に－の電流を給電する。陰極用貯水槽は、陰極給電部材の外側に位置して陰極給電部材に密着している。陰極主電極は、陰極用貯水槽の外側に位置して陰極給電部材に－の電流を給電する。
【0047】
電気分解ユニット２４における純水の電気分解では、陽極用貯水槽及び陰極用貯水槽に純水管２０から純水（Ｈ２Ｏ）が給水され、陽極主電極に電源２３から＋の電流が給電されるとともに、陰極主電極に電源２３から－の電流が給電される。陽極主電極に給電された＋の電流が陽極給電部材から陽極（アノード）に給電され、陰極主電極に給電された－の電流が陰極給電部材から陰極（カソード）に給電される。陽極（電極）では、２Ｈ２Ｏ→４Ｈ＋＋４ｅ－＋Ｏ２の陽極反応（触媒作用）によって酸素分子（Ｏ２）が生成され、陰極（電極）では、４Ｈ＋＋４ｅ－→２Ｈ２の陰極反応（触媒作用）によって水素イオン（Ｈ+）が生成される。プロトン（水素イオン：Ｈ＋）は、固体高分子電解質膜内を通って陽極から陰極（電極）へ移動する。固体高分子電解質膜には、陽極で生成されたプロトンが通流する。
【0048】
電気分解ユニット２４において発生した水素イオン（Ｈ+）は、水素給気管２５を通流してナノバルブ発生装置１２に流入し、電気分解ユニット２４において発生した酸素分子（Ｏ２）は、酸素給気管２６を通流してナノバルブ発生装置１２に流入する。尚、水素給気管２５には、水素流量計２９が設置され、酸素給気管２６には、酸素流量計３０が設置されている。
【0049】
ナノバルブ発生装置１２は、所定容積の貯水槽３１と、第１微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３２及び第２微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３３と、給水ポンプ３４とから形成されている。尚、図示はしていないが、ナノバルブ発生装置１２（貯水槽３１）には、既述の純水生成装置１４と同様の純水生成装置が附属（接続）し、純水生成装置において生成された純水４１が貯水槽３１に流入する。貯水槽３１には、純水生成装置において生成された純水４１が流入し、純水４１が貯水されている。貯水槽３１の下部には、抽出管３５（ホース）が連結されている。給水ポンプ３４には、吸水管３６（ホース）が連結されているとともに、第１給水管３７（ホース）及び第２給水管３８（ホース）が連結されている。吸水管３６は、その吸水口４０が貯水槽３１の内部に設置され、純水４１中に配置される。
【0050】
第１微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３２は、貯水槽３１の内部に設置され、純水中に配置される。第１微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３２は、電気分解ユニット２４において発生した水素イオンをナノバブルの状態にし、水素イオン（ガス組成物）をナノサイズのナノバブルの状態で純水４１中に溶存させる。第１微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３２には、水素給気管２５が連結されているとともに、第１給水管３７が連結されている。第１給水管３７には、圧力計３９が設置されている。
【0051】
第２微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３３は、貯水槽３１の内部に配置され、純水中に位置する。第２微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３３は、電気分解ユニット２４において発生した酸素分子をナノバブルの状態にし、酸素分子（ガス組成物）をナノサイズのナノバブルの状態で純水４１中に溶存させる。第２微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３３には、酸素給気管２６が連結されているとともに、第２給水管３７が連結されている。第２給水管３７には、圧力計３９が設置されている。給水ポンプ３４は、貯水槽３１に貯水された純水４１を吸水し、吸水した純水４１を第１及び第２微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３２，３３に強制的に給水する。
【0052】
ナノバルブ発生システム１０の純水生成装置１２や電気分解装置１５、ナノバルブ発生装置１６を使用して細胞用液体培地１１（以下の幹細胞培養方法において利用する第１及び第２細胞用液体培地１１ａ，１１ｂ（細胞用液体培養液））を作る。ナノバルブ発生システム１０では、ガス組成物１３（水素イオン、酸素分子）を貯水槽３１の純水４１に溶存させる。ナノバルブ発生システム１０を起動する直前又は起動させた直後に、貯水槽３１に貯水された純水４１に微量の炭酸ガス４２（炭酸水）を加え、微量の炭酸ガス４２を貯水槽３１の純水４１に溶存させる。尚、貯水槽３１の純水４１に微量の炭酸ガス４２（炭酸水）を加えることなく、炭酸ガス４２を貯水槽３１の純水４１に溶存させなくてもよい。貯水槽３１に貯水された純水４１の全水量に対する炭酸ガス４２（炭酸水）の濃度は、０．００５～０．００９ｐｐｍである。
【0053】
ナノバルブ発生システム１０において純水生成装置１２、電気分解装置１５、ナノバルブ発生装置１６が起動すると、原水給水ポンプ１８によって原水（水道水等）が原水管１６を通流し、原水管１６を通流する原水が第１フィルタハウジング１７を通流した後、純水生成ユニット１９に流入する。純水生成ユニット１９によって原水から純水が生成され、生成された純水が純水給水ポンプ２２によって純水管２０を通流し、純水が第２フィルタハウジング２１を通流した後、電気分解ユニット２４に流入する。
【0054】
電気分解ユニット２４において純水が電気分解され、発生した水素イオンが水素給気ポンプ２７によって水素給気管２５を通流し、水素イオンが第１微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３２に給気されるとともに、発生した酸素分子が酸素給気ポンプ２８によって酸素給気管２６を通流し、酸素分子が第２微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３３に給気される。貯水槽３１に貯水された純水４１が吸水管３６を通って給水ポンプ３４に給水され、その純水４１が第１給水管３７を通って第１微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３２に給水されるとともに、その純水４１が第２給水管３８を通って第２微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３３に給水される。
【0055】
第１微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３２では、電気分解ユニット２４において発生した水素イオンが水素給気管２５から給気されるとともに、貯水槽３１の純水４１が第１給水管３７から給水される。第１微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３２は、水素イオンをナノサイズのナノバルブの状態にしつつ、ナノバルブの水素イオンを純水４１（微量の炭酸ガス４２が溶存する純水４１）に溶存（混入）させ、ナノバルブの水素イオン（ガス組成物）が溶存（混入）した純水４１を貯水槽３１の純水４１中に噴射する。ナノバルブの水素イオンが溶存した純水４１を貯水槽３１に連続して噴射することで、貯水槽３１に貯水された純水４１におけるナノバルブの水素イオンの濃度が次第に増加する。
【0056】
第２微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３３では、電気分解ユニット２４において発生した酸素分子が酸素給気管２６から給気されるとともに、貯水槽３１の純水４１が第２給水管３８から給水される。第２微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３３は、酸素分子をナノサイズのナノバルブの状態にしつつ、ナノバルブの酸素分子を純水４１（微量の炭酸ガス４２が溶存する純水４１）に溶存（混入）させ、ナノバルブの酸素分子が溶存（混入）した純水４１を貯水槽３１の純水４１中に噴射する。ナノバルブの酸素分子（ガス組成物）が溶存した純水４１を貯水槽３１に連続して噴射することで、貯水槽３１に貯水された純水４１におけるナノバルブの酸素分子の濃度が次第に増加する。
【0057】
第１微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３２で作られたナノバルブの水素イオンと第２微細気泡（ナノバブル）発生ノズル３３で作られたナノバルブの酸素分子とが貯水槽３１の純水４１に所定濃度で溶存した後、貯水槽３１の下部の抽出管３５を開放し、ナノバルブの水素イオン（ガス組成物）とナノバルブの酸素分子（ガス組成物）とが溶存した純水４１を貯水槽３１からビーカー４３（三角フラスコ）に取り出す。次に、ビーカー４３に粉末状態にある栄養素（図示せず）を投入し、ガス組成物１３（ナノバルブの水素イオン、ナノバルブの酸素分子）が溶存する純水４１に栄養素を溶解することで、細胞用液体培地１１を作る。
【0058】
栄養素としては、炭素源(ブドウ糖等)と窒素源(アミノ酸)とビタミン類(チアミン等)と無機塩類とが使用される。尚、栄養素として炭素源と窒素源とビタミン類と無機塩類とのうちの少なくとも炭素源を使用することができる。ナノバルブ発生システム１０によって作られた細胞用液体培地１１は、酸素分子（Ｏ２）を含有する好気性培地であって細胞のミトコンドリアを活性化させる。
【0059】
ナノバルブ発生システム１０（細胞用液体培地１１）は、純水４１に溶存させた微量の炭酸ガス４２（炭酸水）の分子がキャリアとなり、その炭酸ガス４２の分子に水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）が結合することで、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を高い濃度で純水４１（細胞用液体培地１１）に溶存させることができ、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を高い濃度で含む細胞用液体培地１１を作ることができる。又、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を高い濃度で含む細胞用液体培地１１を利用することで単位時間内に幹細胞（細胞）を多量に増殖させることができ、短期間に多量の培養幹細胞（培養細胞）を確実に作ることができる。
【0060】
ナノバルブ発生システム１０（細胞用液体培地１１）は、純水４１にガス組成物１３（ナノバルブの水素イオン、ナノバルブの酸素分子）を溶存させた後、ガス組成物１３が溶存する純水４１に粉末状態にある栄養素を溶解するから、細胞用液体培地１１の作成過程においてその液体培地１１（純水４１）に溶存するガス組成物１３が細胞用液体培地１１から外気に放出され難く、ガス組成物１３が細胞用液体培地１１内に長時間留まる細胞用液体培地１１を作ることができる。ナノバルブ発生システム１０によって作られた細胞用液体培地１１は、栄養素が炭素源と窒素源とビタミン類と無機塩類とのうちの少なくとも炭素源であるから、栄養素を利用して幹細胞（細胞）を確実に培養することができるとともに、その細胞用液体培地１１を利用することで単位時間内に幹細胞（細胞）を多量に増殖させることができるとともに、短期間に多量の培養幹細胞（培養細胞）を確実に作ることができる。
【0061】
ナノバルブ発生システム１０によって作られた細胞用液体培地１１は、ナノバブルの状態で存在する酸素分子（Ｏ２）がその細胞用液体培地１１を好気性培地とし、水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とがミトコンドリアの外膜から内膜に進入し、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）がミトコンドリアの電子伝達系の活性を誘導しつつＡＴＰの産生を誘導し、ミトコンドリアを活性化させることができ、ミトコンドリアの活性によって細胞分裂（増殖）を促進することができるとともに、好気性の細胞用液体培地１１を利用して短期間に多量の培養幹細胞（培養細胞）を作ることができる。
【0062】
ナノバルブ発生システム１０によって作られた細胞用液体培地１１は、ガス組成物１３の全ガス量（全質量）に対する水素イオン（Ｈ+）の濃度が０．５～０．７０ｐｐｍの範囲にあり、ガス組成物１３の全ガス量（全質量）に対する酸素分子（Ｏ２）の濃度が１２．５～１５．５ｐｐｍの範囲にある。ガス組成物１３における水素イオン（Ｈ+）の濃度が０．５ｐｐｍ未満であり、ガス組成物１３における酸素分子（Ｏ２）の濃度が１２．５ｐｐｍ未満の場合、ミトコンドリアを活性化させることができず、ミトコンドリアの活性を利用して細胞分裂（増殖）を促進することができない。
【0063】
ナノバルブ発生システム１０によって作られた細胞用液体培地１１は、ガス組成物１３の全ガス量（全質量）に対する水素イオン（Ｈ+）の濃度が前記範囲にあり、ガス組成物１３の全ガス量（全質量）に対する酸素分子（Ｏ２）の濃度が前記範囲にあり、ガス組成物１３（水素イオン、酸素分子）がナノサイズのナノバブルの状態で細胞用液体培地１１（純水４１）に溶存しているから、ナノバブルの状態で細胞用液体培地１１に存在する水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とがミトコンドリアの外膜から内膜に容易に進入し、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）がミトコンドリアの電子伝達系の活性を誘導しつつＡＴＰの産生を誘導し、細胞のミトコンドリアを活性化させることができ、ミトコンドリアの活性によって細胞分裂（増殖）を促進することができる。
【0064】
ナノバルブ発生システム１０によって作られた細胞用液体培地１１は、ガス組成物１３の粒径が１００ｎｍ以下であり、細胞用液体培地１１の１ｃｃの中に５～８臆個のガス組成物１３のマイクロバブルが溶存している。ガス組成物１３の粒径が１００ｎｍを超過し、細胞用液体培地１１の１ｃｃの中に溶存するガス組成物１３のマイクロバブルの個数が５臆個未満では、細胞用液体培地１１におけるガス組成物１３（水素イオン、酸素分子）の上昇速度が速くなり、ガス組成物１３が細胞用液体培地１１内に長時間留まることはなく、ガス組成物１３の水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を長時間利用することができない。ナノバルブ発生システム１０によって作られた細胞用液体培地１１は、前記粒径のガス組成物１３のマイクロバブルが細胞用液体培地１１の１ｃｃの中に５～８臆個溶存するから、細胞用液体培地１１におけるガス組成物１３（水素イオン、酸素分子）の上昇速度が遅く、ガス組成物１３が細胞用液体培地１１内に長時間留まり、そのガス組成物１３の水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を長時間利用することができる。
【0065】
ナノバルブ発生システム１０によって作られた細胞用液体培地１１は、細胞用液体培地１１の０℃における粘度が３．５～５．５ｍＰａ・ｓの範囲にあり、ナノバブルとして細胞用液体培地１１に溶存するガス組成物１３の５０％が細胞用液体培地１１から外気に放出されるまでの時間が細胞用液体培地１１の室温において４８～７２時間の範囲にある。細胞用液体培地１１の０℃における粘度が３．５ｍＰａ・ｓ未満では、細胞用液体培地１１におけるガス組成物１３（水素イオン、酸素分子）の上昇速度が速くなり、ガス組成物１３が細胞用液体培地１１内に長時間留まることはなく、ガス組成物１３の水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を長時間利用することができない。
【0066】
ナノバルブ発生システム１０によって作られた細胞用液体培地１１は、細胞用液体培地１１の０℃における粘度が前記範囲にあり、ナノバブルとして細胞用液体培地１１に溶存するガス組成物１３の５０％が細胞用液体培地１１から外気に放出されるまでの時間が細胞用液体培地１１の室温において４８～７２時間の範囲にあるから、ガス組成物１３（水素イオン、酸素分子）が細胞用液体培地１１内に長時間留まり、そのガス組成物１３の水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を長時間利用することができる。
【0067】
図３は、一例として示す幹細胞培養システム５０の構成図であり、図４は、骨髄液分離工程の一例を示す説明図である。図５は、図４から続く骨髄液分離工程の説明図である。幹細胞培養システム５０（幹細胞培養方法）は、複数のドナー（人）から採取した第１骨髄液５１を利用し、骨髄液分離工程、骨髄液抽出工程、細胞用液体培地第１作成工程、形状変形第１観察工程、総平面面積第１観察工程、幹細胞第１抽出工程、幹細胞遠心分離工程、幹細胞第２抽出工程、細胞用液体培地第２作成工程、形状変形第２観察工程、総平面面積第２観察工程、幹細胞第３抽出工程を行うことにより、第１骨髄液５１に含まれる複数種類の間葉系幹細胞の中から特定種類の単一種間葉系幹細胞を培養（製造）する。
【0068】
幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）では、コンピュータ５２及び電子顕微鏡５３が使用される。コンピュータ５２は、中央処理装置（ＣＰＵや仮想ＣＰＵ）と記憶装置（メモリや仮想メモリ）と大容量記憶領域（ハードディスクや仮想ハードディスク等）とを備え、物理的なＯＳ（オペレーティングシステム）や仮想ＯＳ（仮想オペレーティングシステム）によって動作する。コンピュータ５２には、キーボードやマウス等の入力装置、ディスプレイやプリンタ（図示せず）等の出力装置がインターフェイス（無線または有線）を介して接続されている。コンピュータ５２の大容量記憶領域には、ドナーデータ（ドナー特定情報）が記憶（格納）されている。ドナーデータには、ドナーの氏名、住所、電話番号、生年月日、性別、血液型、身長、体重、メールアドレス等がある。
【0069】
骨髄液分離工程では、ドナーから採取した第１骨髄液５１を層状に分離させる。骨髄液採取では、それらドナーの胸骨または腸骨（骨盤）から２～３ｃｃ（２～３ｍｌ）の第１骨髄液５１が採取される。第１骨髄液５１は、ドナーに局所麻酔をかけた後、骨髄を穿刺して骨髄液（骨髄血）を吸引する「骨髄穿刺」（マルク）によって採取される。担当者（医師や看護師、研究者等）は、第１骨髄液５１の採取と同時に、コンピュータ５２においてシステム１０を起動し、キーボードやマウス等の入力装置を利用してドナーデータをコンピュータ５２に入力する。コンピュータ５２は、ドナーデータが入力される度毎（ドナーから第１骨髄液５１を採取する度毎）に各ドナーを特定するユニークなドナー識別子を生成し、ドナーデータをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に記憶（格納）する。
【0070】
ドナーから採取された２～３ｃｃの第１骨髄液５１は、上下方向へ延びるガラス試験管５４（分離容器）内に注入（収容）される。尚、２～３ｃｃの第１骨髄液５１には、０．５～１ｍｌ（約５×１０７（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ））の複数種類の間葉系幹細胞が含まれる。第１骨髄液５１を注入したガラス試験管５４は、図４に示すように、試験管立て５５にセットされ、試験管立て５５とともに恒温槽５６内に収容される。
【0071】
ガラス試験管５４を恒温槽５６に所定時間（約２時間）静的に放置することで、図５に示すように、試験管５４に注入された第１骨髄液５１が試験管５４内において上下方向へ何層か（３層）の層状に分離する。第１骨髄液５１を層状に分離させた骨髄液分離工程の後、骨髄液抽出工程が行われる。骨髄液抽出工程では、層状に分離した第１骨髄液５１から第２骨髄液５７を抽出する。幹細胞の培養には通常１５０～２００ｃｃ（１５０～２００ｍｌ）の骨髄液が必要とされているが、この幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、ドナーから２～３ｃｃの第１骨髄液５１を採取すればよく、少量の骨髄液４１で特定種類の間葉系幹細胞（第２間葉系幹細胞）を培養（製造）することができるから、骨髄液５１の採取時間を大幅に短縮することができ、骨髄液４１を低コストで採取することができるとともに、骨髄液５１の採取時にドナーにかかる負担を最小限にすることができる。
【0072】
担当者は、恒温槽５６内から試験管立て５５を取り出し、試験管立て５５からガラス試験管５４を引き抜き、層状に分離した第１骨髄液５１の特定の層に存在する第２骨髄液５７を抽出する。担当者は、注射器やピペットを利用して層状に分離した第１骨髄液５１のうちの中間層に位置する３～４ｍｍの層厚みの第２骨髄液５７を抽出（吸引）する。幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）では、多種雑多な間葉系幹細胞を含む第１骨髄液５１を上下方向へ層状（３層）に分離させた後、第１骨髄液５１から特定（中間）の第２骨髄液５７を抽出することで、第１骨髄液５１に含まれる不要な間葉系幹細胞を除去することができる。
【0073】
第１骨髄液５１から第２骨髄液５７を抽出する骨髄液抽出工程の後、又は、骨髄液抽出工程と同時に、細胞用液体培地第１作成工程が行われる。細胞用液体培地第１作成工程では、ナノバルブ発生システム１０によって純水４１にガス組成物１３を溶存させた後、所定濃度の水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を含むガス組成物１３が溶存する純水４１に所定の栄養素を溶解し、ガス組成物１３（水素イオン、酸素分子）を含有する細胞用第１液体培地１１ａ（細胞用第１液体培養液）を作る。
【0074】
細胞用液体培地第１作成工程で作られた細胞用第１液体培地１１ａは、純水４１と、純水４１に溶解した所定の栄養素と、濃度０．５～０．７５ｐｐｍの範囲のイオン化した水素イオン（Ｈ+）及び濃度１２．５～１５．５ｐｐｍの範囲であって水素イオン（Ｈ+）に非結合の酸素分子（Ｏ２）を含有して純水４１にナノサイズのナノバブルの状態で溶存するガス組成物１３とから形成されている。
【0075】
細胞用液体培地第１作成工程で作られた細胞用第１液体培地１１ａでは、ガス組成物１３の粒径が１００ｎｍ以下であり、細胞用第１液体培地１１ａの１ｃｃの中に５～８臆個のガス組成物１３のマイクロバブルが溶存している。細胞用液体培地第１作成工程で作られた細胞用第１液体培地１１ａでは、細胞用第１液体培地１１ａの０℃における粘度が３．５～５．５ｍＰａ・ｓの範囲にあり、ナノバブルとして細胞用第１液体培地１１ａに溶存するガス組成物１３の５０％が細胞用第１液体培地１１ａから外気に放出されるまでの時間が細胞用第１液体培地１１ａの室温において４８～７２時間の範囲にある。
【0076】
図６は、第１扁平培養容器５８（第１培養容器）を使用した形状変形第１観察工程の一例を示す説明図であり、図７は、第１間葉系幹細胞５９の平面形状の一例を示す部分拡大図である。図８は、第１間葉系幹細胞５９の平面形状の他の一例を示す部分拡大図である。図７，８は、電子顕微鏡５３によって撮影された第１間葉系幹細胞５９の平面形状の拡大画像を示す。
【0077】
細胞用液体培地第１作成工程の後、又は、骨髄液抽出工程及び細胞用液体培地第１作成工程後、形状変形第１観察工程が行われる。形状変形第１観察工程では、第２骨髄液５７を第１扁平培養容器５８（第１培養容器）（細胞培養容器）に収容するとともに、細胞用液体培地第１作成工程（ナノバルブ発生システム１０）によって作られた作成直後（作成から１５分～３０分以内）の細胞用第１液体培地１１ａ（細胞用第１液体培養液）を第１扁平培養容器５８に注入（注水）する。
【0078】
次に、培養容器５８内を体温と略同一の温度（約３６～３７℃）に保持しつつ、６～１２時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）し、６～１２時間の間において約１～２時間間隔で培養容器５８内の第２骨髄液５７に含まれる第１間葉系幹細胞５９（第１幹細胞）の初期平面形状からの変形を電子顕微鏡５３で観察し、第１間葉系幹細胞５９が培養容器５８の底面に定着したか否かを判断する。
【0079】
形状変形第１観察工程で使用される第１扁平培養容器５８は、透明なガラス又は透明なプラスチックから作られ、小容量かつ所定面積の底面を有する平面形状が略正四角形の扁平な容器である。第１扁平培養容器５８は、頂部及び底部と頂底部の間に位置する中間部と、頂部に形成された注入口とを有する。注入口は、蓋によって水密（気密）に閉塞されている。第１扁平培養容器５８は、その容量が約２０～３０ｃｃ（好ましくは、２５ｃｃ）であり、その底面面積が約２５～３６ｍｍ２である。第１扁平培養容器５８は、その一辺の長さが５～６ｍｍである。尚、第１扁平培養容器５８として小容量かつ所定面積の底面を有する平面形状が円形や楕円形の扁平な容器を使用することもできる。
【0080】
担当者は、注入口から蓋を取り外し、注射器又はピペットに吸引された第２骨髄液５７を第１扁平培養容器５８の注入口から培養容器５８の内部に注入（収容）するとともに、ビーカー４３から注射器又はピペットに吸引された細胞用第１液体培地１１ａの所定量を第１扁平培養容器５８の注入口から培養容器５８の内部に注入（注水）し、蓋によって注入口を閉塞（密閉）する。
【0081】
細胞用第１液体培地１１ａ（後記する細胞用第２液体培地１１ｂを含む）には、ペニシリン（約１００Ｕ／ｍｌ）、アムホテリシン（約１００ｎｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（約１００ｍｋｇ／ｍｌ）、Ｌ－グルタミン（約２～４ｍｌ）、２０％ウシ胎児血清を添加したミネラル塩溶液及びアミノ酸を加えることができる。又、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウム、２－メルカプトエタノール、Ｌ―アラニル－Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラチン酸、グリシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン等を溶解（添加）することもできる。
【0082】
第１扁平培養容器５８に注入された第２骨髄液５７に含まれる第１間葉系幹細胞５９は、時間の経過とともに培養容器５８の底面に定着しつつ、細胞用第１液体培地１１ａによって培養され、培養容器５８の底面において次第に増殖（分化）してコロニーを形成する。担当者は、第２骨髄液５７及び細胞用第１液体培地１１ａを第１扁平培養容器５８に注入した後、その培養容器５８を電子顕微鏡５３の試料ホルダに設置（セット）する。
【0083】
電子顕微鏡５３は、インターフェイス（有線または無線）を介してコンピュータ５２に接続されている。電子顕微鏡５３は、撮像素子によって被写体の拡大画像を撮影する画像撮影機能を有するとともに、その拡大画像をコンピュータ５２に送信する画像送信機能を有する。電子顕微鏡５３は、第１扁平培養容器５８に注入された第２骨髄液５７に含まれる第１間葉系幹細胞５９の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で撮影し、撮影した第１間葉系幹細胞５９の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔でコンピュータ５２に送信する。電子顕微鏡５３における画像撮影間隔や画像送信間隔は、キーボードやマウス等の入力装置によって１～２時間の間で自由に設定することができる。
【0084】
コンピュータ５２は、電子顕微鏡５３から送信された第１間葉系幹細胞５９の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する。コンピュータ５２は、電子顕微鏡５３から送信された第１間葉系幹細胞５９の平面形状の拡大画像と撮影時間とをコンピュータ５２に接続されたディスプレイに出力（表示）する。担当者は、ディスプレイに表示された第１間葉系幹細胞５９の平面形状の拡大画像を６～１２時間の間において約１～２時間間隔で確認（視認）し、第２骨髄液５７に含まれる第１間葉系幹細胞５９の平面形状の変化を観察する。尚、担当者が電子顕微鏡５３の観察窓から第１間葉系幹細胞５９の平面形状の変化を６～１２時間の間において約１～２時間間隔で直接観察してもよい。
【0085】
第１間葉系幹細胞５９の初期平面形状は略円形であり、第１間葉系幹細胞５９の平面形状が略円形の場合、第１間葉系幹細胞５９が第１扁平培養容器５８の底面（底壁内面）に定着しておらず、第１間葉系幹細胞５９が増殖（分化）を開始していない。第１間葉系幹細胞５９の変形後の平面形状は定着前の略円形を核として第１間葉系幹細胞５９が一方向（所定方向）へ不定形に伸張（拡張）した扁平形状であり、第１間葉系幹細胞５９が第１扁平培養容器５８の底面（底壁内面）に定着し、第１間葉系幹細胞５９が増殖（分化）を開始している。
【0086】
担当者は、形状変形第１観察工程における観察の結果、図６に示すように、ディスプレイに表示された第１間葉系幹細胞５９の平面形状の拡大画像が略円形のまま観察される場合、第１間葉系幹細胞５９が第１扁平培養容器５８の底面（底壁内面）に定着していないと判断し、第１間葉系幹細胞５９の平面形状の変化を約１～２時間間隔で継続して観察する。担当者は、形状変形第１観察工程における観察の結果、ディスプレイに表示された第１間葉系幹細胞５９の平面形状が略円形から略円形を核として不定形の扁平形状に変形した場合、第１間葉系幹細胞５９が第１扁平培養容器５８の底面に定着したと判断する。
【0087】
尚、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）がナノバブルの状態で細胞用第１液体培地１１ａに溶存し、形状変形第１観察工程において、水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とが第１間葉系幹細胞５９のミトコンドリアの外膜から内膜に容易に進入する。第１間葉系幹細胞５９のミトコンドリアの内膜に進入した水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とがミトコンドリアの電子伝達系の活性を誘導しつつＡＴＰの産生を誘導し、ミトコンドリアが活性化するとともに、ミトコンドリアの活性によって第１間葉系幹細胞５９の細胞分裂（定着）が促進される。
【0088】
細胞用第１液体培地１１ａを使用せず、市販の培養液を使用して（市販の培養液を第１扁平培養容器５８に注入して）培養容器５８内を体温と略同一の温度（約３６～３７℃）に保持した場合、第１間葉系幹細胞５９の第１扁平培養容器５８の底面への定着までに１２～２４時間を要するが、細胞用第１液体培地１１ａを使用して培養容器５８内を体温と略同一の温度（約３６～３７℃）に保持した場合、６～１２時間で第１間葉系幹細胞５９が第１扁平培養容器５８の底面に定着した。細胞用第１液体培地１１ａを使用することで、第１間葉系幹細胞５９の第１扁平培養容器５８の底面への定着時間を約１／２に短縮することができた。
【0089】
第１間葉系幹細胞５９の定着時に容量が３０ｃｃを超過するとともに底面面積が３６ｍｍ２を超過する大きな扁平培養容器を使用すると、第１間葉系幹細胞５９が容器の底面に定着し難くなるとともに第１間葉系幹細胞５９の増殖が遅くなるが、幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、前記容量かつ前記底面面積の第１扁平培養容器５８を使用することで、第１間葉系幹細胞５９を培養容器５８の底面に容易に定着させることができ、培養容器５８において第１間葉系幹細胞５９を素早く増殖させることができる。幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、第１扁平培養容器５８を体温と略同一の温度で６～１２時間静的放置しつつ、６～１２時間の間において約１～２時間間隔で培養容器５８内の第１間葉系幹細胞５９の初期平面形状からの変形を観察するから、第１間葉系幹細胞５９の変形を見逃すことはなく、第１間葉系幹細胞５９の培養容器５８の底面に対する定着を正確に確認することができる。
【0090】
形状変形第１観察工程における観察の結果、第１間葉系幹細胞５９（第１幹細胞）が略円形（初期平面形状）から略円形を核として不定形の扁平形状に変形し、第１間葉系幹細胞５９の第１扁平培養容器５８（第１培養容器）の底面への定着を確認した形状変形第１観察工程の後、総平面面積第１観察工程が行われる。
【0091】
総平面面積第１観察工程では、第１扁平培養容器５８内に注入（収容）されている細胞用第１液体培地１１ａを培養容器５８から排出する。第１扁平培養容器５８から細胞用第１液体培地１１ａを排出した後、細胞用液体培地第１作成工程によって作られた作成直後（作成から１５分～３０分以内）の新たな細胞用第１液体培地１１ａ（細胞用第１液体培養液）を培養容器５８内に注入（注水）する。
【0092】
次に、第１扁平培養容器５８を体温と略同一の温度（約３６～３７℃）に保持しつつ、１８～２４時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）し、１８～２４時間の間において約１～２時間間隔で培養容器５８の底面に定着した第１間葉系幹細胞５９の培養容器５８の底面面積に対する総平面面積を電子顕微鏡５３で観察し、第１間葉系幹細胞５９の総平面面積が培養容器５８の底面面積に対して第１目標割合に達したか否かを判断する。第１扁平培養容器５８の底面面積に対する第１間葉系幹細胞５９の総平面面積の第１目標割合は、７０～８０％（７０～８０％コンフルエント）である。
【0093】
担当者は、形状変形第１観察工程において第１扁平培養容器５８に注入した細胞用第１液体培地１１ａを注射器又はピペットを利用して培養容器５８から排出し、ビーカー４３から注射器又はピペットに吸引された作成直後（作成から１５分～３０分以内）の新たな細胞用第１液体培地１１ａ（細胞用第１液体培養液）を培養容器５８に注入（注水）する。担当者は、新たな細胞用第１液体培地１１ａを第１扁平培養容器５８に注入した後、培養容器５８を電子顕微鏡５３の試料ホルダに設置（セット）する。幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、第１間葉系幹細胞５９の定着を確認した後、第１扁平培養容器５８の細胞用第１液体培地１１ａを排出し、作成直後の新たな細胞用第１液体培地１１ａを培養容器５８に注入することで、第１間葉系幹細胞５９の増殖を確実に促進することができる。
【0094】
電子顕微鏡５３は、第１扁平培養容器５８内の第１間葉系幹細胞５９の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で撮影し、撮影した第１間葉系幹細胞５９の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔でコンピュータ５２に送信する。コンピュータ５２は、電子顕微鏡５３から送信された第１間葉系幹細胞５９の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する。コンピュータ５２は、電子顕微鏡５３から送信された第１間葉系幹細胞５９の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイに出力（表示）する。
【0095】
担当者は、ディスプレイに表示された第１間葉系幹細胞５８の平面形状の拡大画像を１８～２４時間の間において約１～２時間間隔で確認（視認）し、第１扁平培養容器５８の底面に定着した第１間葉系幹細胞５９の培養容器５８の底面面積に対する総平面面積を観察しつつ、第１間葉系幹細胞５９の総平面面積が培養容器５８の底面面積に対して第１目標割合（７０～８０％コンフルエント）に達したか否かを判断する。尚、担当者が電子顕微鏡５３の観察窓から第１間葉系幹細胞５９の第１扁平培養容器５８の底面面積に対する総平面面積を１８～２４時間の間において約１～２時間間隔で直接観察し、第１間葉系幹細胞５９の総平面面積が培養容器５８の底面面積に対して第１目標割合（７０～８０％コンフルエント）に達したか否かを判断してもよい。
【0096】
担当者は、総平面面積第１観察工程における観察の結果、ディスプレイに表示された第１間葉系幹細胞５９の第１扁平培養容器５８の底面面積に対する総平面面積が第１目標割合（７０～８０％コンフルエント）に達していない場合、第１間葉系幹細胞５９の培養容器５８の底面面積に対する総平面面積を約１～２時間間隔で継続して観察する。尚、ディスプレイに表示された拡大画像の全面積に対して第１間葉系幹細胞５９の総平面面積が第１目標割合に達した場合に、第１間葉系幹細胞５９の第１扁平培養容器５８の底面面積に対する総平面面積が第１目標割合に達したものとする。
【0097】
総平面面積第１観察工程における観察の結果、第１間葉系幹細胞５９が第１扁平培養容器５８の底面（底壁内面）において増殖して第１間葉系幹細胞５９がコロニーを形成し、第１間葉系幹細胞５９の平面形状が拡張することで、図８に示すように、ディスプレイに表示された第１間葉系幹細胞５９の培養容器５８の底面面積に対する総平面面積が第１目標割合（７０～８０％コンフルエント）に達した場合、培養容器５８から第１間葉系幹細胞５９を抽出する幹細胞第１抽出工程が行われる。幹細胞第１抽出工程では、第１扁平培養容器５８内において増殖（分化）した第１間葉系幹細胞５９を培養容器５８から抽出する。
【0098】
総平面面積第１観察工程において、ナノバブルの状態で細胞用第１液体培地１１ａに溶存する水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とが第１間葉系幹細胞５９のミトコンドリアの外膜から内膜に容易に進入する。第１間葉系幹細胞５９のミトコンドリアの内膜に進入した水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とがミトコンドリアの電子伝達系の活性を誘導しつつＡＴＰの産生を誘導し、ミトコンドリアが活性化するとともに、ミトコンドリアの活性によって第１間葉系幹細胞５９の細胞分裂（増殖）が促進される。
【0099】
細胞用第１液体培地１１ａを使用せず、市販の培養液を使用して（市販の培養液を第１扁平培養容器５８に注入して）培養容器５８内を体温と略同一の温度（約３６～３７℃）に保持した場合、第１間葉系幹細胞５９の培養容器５８の底面面積に対する総平面面積が第１目標割合に達するまでに３６～４８時間を要するが、細胞用第１液体培地１１ａを使用して培養容器５８内を体温と略同一の温度（約３６～３７℃）に保持した場合、第１間葉系幹細胞５９の培養容器５８の底面面積に対する総平面面積が第１目標割合に１８～２４時間で達した。細胞用第１液体培地１１ａを使用することで、第１間葉系幹細胞５９の培養容器５８の底面面積に対する総平面面積が第１目標割合に達するまでの時間を約１／２に短縮することができた。
【0100】
担当者は、第１扁平培養容器５８に注入されている総平面面積第１観察工程時の細胞用第１液体培地１１ａ（細胞用第１液体培養液）を注射器又はピペットを利用して培養容器５８から排出し、培養容器５８内をＰＢＳで洗浄した後、注射器又はピペットに吸引されたトリプシン液を培養容器５８内に注入する。第１扁平培養容器５８にトリプシン液を注入すると、培養容器５８の底面に定着した第１間葉系幹細胞５９がトリプシン液によって底面から剥離し、トリプシン液の水面に浮上する。担当者は、ピペットを利用して第１間葉系幹細胞５９を吸引し、第１間葉系幹細胞５９をピペット内に収容する。
【0101】
幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、約１～２時間間隔で第１間葉系幹細胞５９の総平面面積を観察することで、第１間葉系幹細胞５９の第１扁平培養容器５８の底面面積に対する総平面面積を正確に確認することができ、培養容器５８の底面面積に対して第１間葉系幹細胞５９の総平面面積が第１目標割合に達したことを確実に把握することができる。
【0102】
図９は、幹細胞遠心分離工程の一例を示す説明図であり、図１０は、幹細胞第２抽出工程の一例を示す説明図である。第１扁平培養容器５８から第１間葉系幹細胞５９を抽出した幹細胞第１抽出工程の後、幹細胞遠心分離工程が行われる。幹細胞遠心分離工程では、幹細胞第１抽出工程によって抽出された第１間葉系幹細胞５９を遠心分離器６０によって層状に遠心分離する。担当者は、ピペット内の第１間葉系幹細胞５９をガラス試験管６１に注入（収容）し、ガラス試験管６１を遠心分離器６０に設置（セット）する。担当者は、第１間葉系幹細胞５９を遠心分離器６０によって所定時間遠心分離した後、ガラス試験管６１を遠心分離器６０から取り出す。ガラス試験管６１内の第１間葉系幹細胞５９は、遠心分離器によって上下方向へ２層の層状に分離する。
【0103】
第１間葉系幹細胞５９を層状（２層）に分離させた幹細胞遠心分離工程の後、幹細胞第２抽出工程が行われる。幹細胞第２抽出工程では、層状に分離した第１間葉系幹細胞５９から下層（最下層）に位置する第２間葉系幹細胞６２を抽出する。担当者は、ガラス試験管６１において層状に分離した第１間葉系幹細胞５９のうちの下層（最下層）に存在する第２間葉系幹細胞６２を注射器又はピペットを利用して抽出（吸引）する。
【0104】
幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、不要な幹細胞を含む第１間葉系幹細胞５９を遠心分離器６０で遠心分離して上下方向へ層状に分離させ、層状（２層）に遠心分離した第１間葉系幹細胞５９のうちの下層（最下層）に位置する第２間葉系幹細胞６２を抽出することで、第１間葉系幹細胞５９から特定の第２間葉系幹細胞６２を確実に抽出することができ、第１間葉系幹細胞５９から不要な間葉系幹細胞を除去することができる。
【0105】
第１扁平培養容器５８（第１培養容器）の底面面積に対する第１間葉系幹細胞５９の総平面面積が８０％を超過して第１間葉系幹細胞５９が増殖すると、第１間葉系幹細胞５９の活性が次第に失われるが、幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、培養容器５８の底面面積に対して第１間葉系幹細胞５９の総平面面積が７０～８０％に増殖したときに、第１間葉系幹細胞５９を培養容器５８から抽出するから、第１間葉系幹細胞５９の活性を保持することができ、活性を保持した状態で第１間葉系幹細胞５９を増殖させることができるとともに、第１間葉系幹細胞５９から活性を有する第２間葉系幹細胞６２を抽出することができる。
【0106】
図１１は、第２扁平培養容器６３（第２培養容器）を使用した形状変形第２観察工程の一例を示す説明図であり、図１２は、第２間葉系幹細胞６２の平面形状の一例を示す部分拡大図である。図１３は、第２間葉系幹細胞６２の平面形状の他の一例を示す部分拡大図であり、図１４は、第２間葉系幹細胞６２の保存の一例を示す図である。図１２，１３は、電子顕微鏡５３によって撮影された第２間葉系幹細胞６２の平面形状の拡大画像を示す。
【0107】
第１間葉系幹細胞５９から下層（最下層）に位置する特定の第２間葉系幹細胞６２を抽出する幹細胞第２抽出工程の後、又は、幹細胞第２抽出工程と同時に、細胞用液体培地第２作成工程が行われる。細胞用液体培地第２作成工程では、ナノバルブ発生システム１０によって純水４１にガス組成物１３を溶存させた後、所定濃度の水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）を含むガス組成物１３が溶存する純水４１に所定の栄養素を溶解し、ガス組成物１３（水素イオン、酸素分子）を含有する細胞用第２液体培地１１ｂ（細胞用第２液体培養液）を作る。
【0108】
細胞用液体培地第２作成工程で作られた細胞用第２液体培地１１ｂは、純水と、純水に溶解した所定の栄養素と、濃度０．５～０．７５ｐｐｍの範囲のイオン化した水素イオン（Ｈ+）及び濃度１２．５～１５．５ｐｐｍの範囲であって水素イオン（Ｈ+）に非結合の酸素分子（Ｏ２）を含有して純水にナノサイズのナノバブルの状態で溶存するガス組成物１３とから形成されている。
【0109】
細胞用液体培地第２作成工程で作られた細胞用第２液体培地１１ｂでは、ガス組成物１３の粒径が１００ｎｍ以下であり、細胞用第２液体培地１１ｂの１ｃｃの中に５～８臆個のガス組成物１３のマイクロバブルが溶存している。細胞用液体培地第２作成工程で作られた細胞用第２液体培地１１ｂでは、細胞用第２液体培地１１ｂの０℃における粘度が３．５～５．５ｍＰａ・ｓの範囲にあり、ナノバブルとして細胞用第２液体培地１１ｂに溶存するガス組成物１３の５０％が細胞用第２液体培地１１ｂから外気に放出されるまでの時間が細胞用第２液体培地１１ｂの室温において４８～７２時間の範囲にある。
【0110】
細胞用液体培地第２作成工程の後、又は、幹細胞第２抽出工程及び細胞用液体培地第２作成工程後、形状変形第２観察工程が行われる。形状変形第２観察工程では、第２間葉系幹細胞６２を第２扁平培養容器６３（第２培養容器）（細胞培養容器）に収容するとともに、細胞用液体培地第２作成工程（ナノバルブ発生システム１０）によって作られた作成直後（作成から１５分～３０分以内）の細胞用第２液体培地１１ｂ（細胞用第２液体培養液）を第２扁平培養容器６２に注入（注水）する。次に、培養容器６２内を体温と略同一の温度（約３６～３７℃）に保持しつつ、１８～２４時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）し、１８～２４時間の間において約１～２時間間隔で培養容器６３内の第２間葉系幹細胞６２（第２幹細胞）の初期平面形状からの変形を電子顕微鏡５３で観察し、第２間葉系幹細胞６２が培養容器６３の底面に定着したか否かを判断する。
【0111】
形状変形第２観察工程で使用される第２扁平培養容器６３（第２培養容器）は、透明なガラス又は透明なプラスチックから作られ、小容量かつ所定面積の底面を有する平面形状が略四角形の扁平な容器であり、底面の面積が第１扁平培養容器５８（第１培養容器）のそれの約２倍である。第２扁平培養容器６３は、頂部及び底部と頂底部の間に位置する中間部と、頂部に形成された注入口とを有する。注入口は、蓋によって水密（気密）に閉塞されている。
【0112】
第２扁平培養容器６３（第２培養容器）は、その容量が約４０～６０ｃｃ（好ましくは、５０ｃｃ）であり、その底面面積が約５０～７２ｍｍ２である。第２扁平培養容器６３は、その一辺の長さが約７～８．５ｍｍである。尚、第２扁平培養容器６３として小容量かつ所定面積の底面を有する平面形状が円形や楕円形の扁平な容器を使用することもできる。第２扁平培養容器６３に収容された第２間葉系幹細胞６２は、時間の経過とともに培養容器６３の底面に定着しつつ、細胞用第２液体培地１１ｂによって培養され、培養容器６３の底面において次第に増殖（分化）してコロニーを形成する。
【0113】
担当者は、注入口から蓋を取り外し、ピペットに吸引された第２間葉系幹細胞６２を第２扁平培養容器６３の注入口から培養容器６３の内部に注入（収容）するとともに、ビーカー４３から注射器又はピペットに吸引された作成直後の細胞用第２液体培地１１ｂを培養容器６３の注入口から培養容器６３の内部に注入（注水）し、蓋によって注入口を閉塞（密閉）する。担当者は、第２間葉系幹細胞６２及び細胞用第２液体培地１１ｂを第２扁平培養容器６３に注入した後、培養容器６３を電子顕微鏡５３の試料ホルダに設置（セット）する。
【0114】
電子顕微鏡５３は、第２扁平培養容器６３に収容された第２間葉系幹細胞６２の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で撮影し、撮影した第２間葉系幹細胞６２の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔でコンピュータ５２に送信する。コンピュータ５２は、電子顕微鏡５３から送信された第２間葉系幹細胞６２の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する。
【0115】
コンピュータ５２は、電子顕微鏡５３から送信された第２間葉系幹細胞６２の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイに出力（表示）する。担当者は、ディスプレイに表示された第２間葉系幹細胞６２の平面形状の拡大画像を１８～２４時間の間において約１～２時間間隔で確認（視認）し、第２間葉系幹細胞６２の平面形状の変化を観察する。尚、担当者が電子顕微鏡５３の観察窓から第２間葉系幹細胞６２の平面形状の変化を１８～２４時間の間において約１～２時間間隔で直接観察してもよい。
【0116】
第２間葉系幹細胞６２の初期平面形状は略円形であり、第２間葉系幹細胞６２の平面形状が略円形の場合、第２間葉系幹細胞６２が第２扁平培養容器６３の底面（底壁内面）に定着しておらず、第２間葉系幹細胞６２が増殖（分化）を開始していない。第２間葉系幹細胞６２の変形後の平面形状は定着前の略円形を核として第２間葉系幹細胞６２が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、第２間葉系幹細胞６２が第２扁平培養容器６３の底面（底壁内面）に定着し、第２間葉系幹細胞６２が増殖（分化）を開始している。
【0117】
担当者は、形状変形第２観察工程における観察の結果、図１２に示すように、ディスプレイに表示された第２間葉系幹細胞６２の平面形状が略円形のまま観察される場合、第２間葉系幹細胞６２が第２扁平培養容器６３の底面（底壁内面）に定着していないと判断し、第２間葉系幹細胞６２の平面形状の変化を約１～２時間間隔で継続して観察する。担当者は、形状変形第２観察工程における観察の結果、ディスプレイに表示された第２間葉系幹細胞６２の平面形状が略円形から略円形を核として不定形の扁平形状に変形した場合、第２間葉系幹細胞６２が第２扁平培養容器６３の底面に定着したと判断する。
【0118】
尚、水素イオン（Ｈ+）及び酸素分子（Ｏ２）がナノバブルの状態で細胞用第２液体培地１１ｂに溶存し、形状変形第２観察工程において、水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とが第２間葉系幹細胞６２のミトコンドリアの外膜から内膜に容易に進入する。第２間葉系幹細胞６２のミトコンドリアの内膜に進入した水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とがミトコンドリアの電子伝達系の活性を誘導しつつＡＴＰの産生を誘導し、ミトコンドリアが活性化するとともに、ミトコンドリアの活性によって第２間葉系幹細胞６２の細胞分裂（定着）が促進される。
【0119】
細胞用第２液体培地１１ｂを使用せず、市販の培養液を使用して（市販の培養液を第２扁平培養容器６３に注入して）培養容器６３内を体温と略同一の温度（約３６～３７℃）に保持した場合、第２間葉系幹細胞６２の第２扁平培養容器６３の底面への定着までに３６～４８時間を要するが、細胞用第２液体培地１１ｂを使用して培養容器６３内を体温と略同一の温度（約３６～３７℃）に保持した場合、１８～２４時間で第２間葉系幹細胞６２が第２扁平培養容器６３の底面に定着した。細胞用第２液体培地１１ｂを使用することで、第２間葉系幹細胞６２の第２扁平培養容器６３の底面への定着時間を約１／２に短縮することができた。
【0120】
第２間葉系幹細胞６２の定着時に容量が６０ｃｃを超過するとともに底面面積が７２ｍｍ２を超過する大きな培養容器を使用すると、第２間葉系幹細胞６２が容器の底面に定着し難くなるとともに第２間葉系幹細胞６２の増殖が遅くなるが、幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、前記容量かつ前記底面面積の第２扁平培養容器６３を使用することで、第２間葉系幹細胞６２を培養容器６３の底面に容易に定着させることができ、培養容器６３において第２間葉系幹細胞６２を素早く増殖させることができる。
【0121】
幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、第２扁平培養容器６３を体温と略同一の温度で１８～２４時間静的放置しつつ、１８～２４時間の間において約１～２時間間隔で培養容器６３内の第２間葉系幹細胞６２の初期平面形状からの変形を観察するから、第２間葉系幹細胞６２の変形を見逃すことはなく、第２間葉系幹細胞６２の培養容器６３の底面に対する定着を正確に確認することができる。
【0122】
形状変形第２観察工程における観察の結果、第２間葉系幹細胞６２（第２幹細胞）が略円形（初期平面形状）から略円形を核として不定形の扁平形状に変形し、第２間葉系幹細胞６２の第２扁平培養容器６３（第２培養容器）の底面への定着を確認した幹細胞第３観察工程の後、総平面面積第２観察工程が行われる。
【0123】
総平面面積第２観察工程では、第２扁平培養容器６３内に注入されている細胞用第２液体培地１１ｂを培養容器６３から排出する。第２扁平培養容器６３から細胞用第２液体培地１１ｂを排出した後、細胞用液体培地第２作成工程によって作られた作成直後（作成から１５分～３０分以内）の新たな細胞用第２液体培地１１ｂ（細胞用第２液体培養液）を培養容器内に注入（注水）する。
【0124】
次に、第２扁平培養容器６３を体温と略同一の温度（約３６～３７℃）に保持しつつ、１８～２４時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）し、１８～２４時間の間において約１～２時間間隔で培養容器６３の底面に定着した第２間葉系幹細胞６２の培養容器６３の底面面積に対する総平面面積を電子顕微鏡５３で観察し、第２間葉系幹細胞６２の総平面面積が培養容器６３の底面面積に対して第２目標割合に達したか否かを判断する。第２扁平培養容器６３の底面面積に対する第２間葉系幹細胞６２の総平面面積の第２目標割合は、８８～９２％（８８～９２％コンフルエント）である。
【0125】
担当者は、形状変形第２観察工程において第２扁平培養容器６３に注入した細胞用第２液体培地１１ｂを注射器又はピペットを利用して培養容器６３から排出し、ビーカー４３から注射器又はピペットに吸引された作成直後の新たな細胞用第２液体培地１１ｂ（細胞用第２液体培養液）を培養容器６３に注入（注水）する。担当者は、新たな細胞用第２液体培地１１ｂを第２扁平培養容器６３に注入した後、培養容器６４を電子顕微鏡５３の試料ホルダに設置（セット）する。 幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）、第２間葉系幹細胞６２の定着を確認した後、第２扁平培養容器６３の細胞用第２液体培地１１ｂを排出し、新たな細胞用第２液体培地１１ｂを培養容器６３に注入することで、第２間葉系幹細胞６２の増殖を確実に促進することができる。
【0126】
電子顕微鏡５３は、第２扁平培養容器６３内の第２間葉系幹細胞６２の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で撮影し、撮影した第２間葉系幹細胞６２の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔でコンピュータ５２に送信する。コンピュータ５２は、電子顕微鏡５３から送信された第２間葉系幹細胞６２の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する。コンピュータ５２は、電子顕微鏡５３から送信された第２間葉系幹細胞６２の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイに出力（表示）する。
【0127】
担当者は、ディスプレイに表示された第２間葉系幹細胞６２の平面形状の拡大画像を１８～２４時間の間において約１～２時間間隔で確認（視認）し、第２扁平培養容器６３の底面に定着した第２間葉系幹細胞６２の培養容器６３の底面面積に対する総平面面積を観察しつつ、第２間葉系幹細胞６２の総平面面積が培養容器６３の底面面積に対して第２目標割合（８２～９２％コンフルエント）に達したか否かを判断する。尚、担当者が電子顕微鏡５３の観察窓から第２間葉系幹細胞６２の第２扁平培養容器６３の底面面積に対する総平面面積を１８～２４時間の間において約１～２時間間隔で直接観察し、第２間葉系幹細胞６２の総平面面積が培養容器６３の底面面積に対して第２目標割合（８８～９２％コンフルエント）に達したか否かを判断してもよい。
【0128】
担当者は、総平面面積第２観察工程における観察の結果、ディスプレイに表示された第２間葉系幹細胞６２の第２扁平培養容器６３の底面面積に対する総平面面積が第２目標割合（８８～９２％コンフルエント）に達していない場合、第２間葉系幹細胞６２の培養容器６３の底面面積に対する総平面面積を約１～２時間間隔で継続して観察する。尚、ディスプレイに表示された拡大画像の全面積に対して第２間葉系幹細胞６２の総平面面積が第２目標割合に達した場合に、第２間葉系幹細胞６２の第２扁平培養容器６３の底面面積に対する総平面面積が第２目標割合に達したものとする。
【0129】
総平面面積第２観察工程における観察の結果、第２間葉系幹細胞６２が第２扁平培養容器６３の底面（底壁内面）において増殖して第２間葉系幹細胞６２がコロニーを形成し、第２間葉系幹細胞６２の平面形状が拡張することで、図１３に示すように、ディスプレイに表示された第２間葉系幹細胞６２の培養容器６３の底面面積に対する総平面面積が第２目標割合（８８～９２％コンフルエント）に達した場合、培養容器６３から第２間葉系幹細胞６２を抽出する幹細胞第３抽出工程が行われる。幹細胞第３抽出工程では、第２扁平培養容器６３内において増殖（分化）した第２間葉系幹細胞６２を培養容器６３から抽出する。
【0130】
総平面面積第２観察工程において、ナノバブルの状態で細胞用第２液体培地１１ｂに溶存する水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とが第２間葉系幹細胞６２のミトコンドリアの外膜から内膜に容易に進入する。第２間葉系幹細胞６２のミトコンドリアの内膜に進入した水素イオン（Ｈ+）と酸素分子（Ｏ２）とがミトコンドリアの電子伝達系の活性を誘導しつつＡＴＰの産生を誘導し、ミトコンドリアが活性化するとともに、ミトコンドリアの活性によって第２間葉系幹細胞６２の細胞分裂（増殖）が促進される。
【0131】
細胞用第２液体培地１１ｂを使用せず、市販の培養液を使用して（市販の培養液を第２扁平培養容器６３に注入して）培養容器６３内を体温と略同一の温度（約３６～３７℃）に保持した場合、第２間葉系幹細胞６２の培養容器６３の底面面積に対する総平面面積が第２目標割合に達するまでに３６～４８時間を要するが、細胞用第２液体培地１１ｂを使用して培養容器６３内を体温と略同一の温度（約３６～３７℃）に保持した場合、第２間葉系幹細胞６２の培養容器６３の底面面積に対する総平面面積が第２目標割合に１８～２４時間で達した。細胞用第２液体培地１１ｂを使用することで、第２間葉系幹細胞６２の培養容器６３の底面面積に対する総平面面積が第２目標割合に達するまでの時間を約１／２に短縮することができた。
【0132】
担当者は、第２扁平培養容器６３内に注入されている総平面面積第２観察工程時の細胞用第２液体培地１１ｂ（細胞用第２液体培養液）を注射器又はピペットを利用して培養容器から排出し、培養容器６３内をＰＢＳで洗浄した後、注射器又はピペットに吸引されたトリプシン液を培養容器６３内に注入する。第２扁平培養容器６３にトリプシン液を注入すると、培養容器６３の底面に定着した第２間葉系幹細胞６２がトリプシン液によって底面から剥離し、トリプシン液の水面に浮上する。担当者は、ピペットを利用して第２間葉系幹細胞６２を吸引し、第２間葉系幹細胞６２をピペット内に収容する。
【0133】
幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、約１～２時間間隔で第２間葉系幹細胞６２の総平面面積を観察することで、第２間葉系幹細胞６２の第２扁平培養容器６３の底面面積に対する総平面面積を正確に確認することができ、培養容器６３の底面面積に対して第２間葉系幹細胞６２の総平面面積が第２目標割合に達したことを確実に把握することができる。
【0134】
担当者は、ピペットを利用して培養後（増殖後）の第２間葉系幹細胞６２を吸引し、第２間葉系幹細胞６２をピペットから保存容器６４に注入（収容）する。保存容器６４に収容された第２間葉系幹細胞６２は、不要な間葉系幹細胞が除去された活性を有する培養対象の特定種類（略単一種）のピュアな間葉系幹細胞６２である。担当者は、第２間葉系幹細胞６２をピペットから保存容器６４に注入した後、ドナーデータを格納した（表した）ＱＲコード（登録商標）が印字されたシールを保存容器６４の外周面に貼付する。担当者は、第２間葉系幹細胞６２を収容した保存容器６４を冷蔵庫６５に収納する。第２間葉系幹細胞６２は、冷蔵庫６５において約３～４℃で保存される。
【0135】
第２扁平培養容器６３（第２培養容器）の底面面積に対する第２間葉系幹細胞６２の総平面面積が９２％を超過して第２間葉系幹細胞６２が増殖すると、第２間葉系幹細胞６２の活性が次第に失われるが、幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、培養容器６３の底面面積に対して第２間葉系幹細胞６２の総平面面積が８８～９２％に増殖したときに、第２間葉系幹細胞６２を培養容器６３から抽出するから、第２間葉系幹細胞６２の活性を保持することができる。
【0136】
幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、ドナーから採取した第１骨髄液５１を層状に分離させ、層状に分離させた第１骨髄液５１のうちの中間層に位置する第２骨髄液５７を抽出し、純水４１にガス組成物１３を溶存させた後、純水４１に所定の栄養素を溶解してガス組成物１３を含有する細胞用第１液体培地１１ａを作り、第２骨髄液５７と作成直後の細胞用第１液体培地１１ａとを注入（収容）した第１扁平培養容器５８（第１培養容器）において第２骨髄液５７に含まれる第１間葉系幹細胞５９（第１幹細胞）を第１扁平培養容器５８の底面に定着させるとともに第１間葉系幹細胞５９を増殖させ、第１間葉系幹細胞５９の総平面面積が第１扁平培養容器５８の底面面積に対して第１目標割合に達した場合、第１扁平培養容器５８から第１間葉系幹細胞５９を抽出し、第１間葉系幹細胞５９を層状に分離させた後、最下層に位置する第２間葉系幹細胞６２（第２幹細胞）を抽出し、純水４１にガス組成物１３を溶存させた後、純水４１に栄養素を溶解してガス組成物１３を含有する細胞用第２液体培地１１ｂを作り、第２間葉系幹細胞６２と作成直後の細胞用第２液体培地１１ｂとを注入した第２扁平培養容器６３（第２培養容器）において第２間葉系幹細胞６２を第２扁平培養容器６３の底面に定着させるとともに第２間葉系幹細胞６２を増殖させ、第２間葉系幹細胞６２の総平面面積が第２扁平培養容器６３の底面面積に対して第２目標割合に達した場合、第２扁平培養容器６３から第２間葉系幹細胞６２を抽出するから、間葉系幹細胞５９，６２（幹細胞）のミトコンドリアを活性化させつつ、ミトコンドリアの活性によって間葉系幹細胞５９，６２の細胞分裂を促進させ、単位時間内に間葉系幹細胞５９，６２を多量に増殖させることができ、短期間に多量の培養間葉系幹細胞（培養幹細胞）を作ることができる。
【0137】
幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、層状に分離させた第１間葉系幹細胞５９（第１幹細胞）から特定の第２間葉系幹細胞６２（第２幹細胞）（最下層に位置する第２間葉系幹細胞６２（第２幹細胞））を抽出するから、多種雑多な間葉系幹細胞（幹細胞）の増殖を防ぐことができ、製造対象の特定種類の間葉系幹細胞（第２間葉系幹細胞６２（第２幹細胞））のみを培養することができるとともに、不要な間葉系幹細胞（幹細胞）が除去されたピュア（純粋）な間葉系幹細胞６２（幹細胞）を製造することができる。幹細胞培養システム１０（幹細胞培養方法）は、特定種類の間葉系幹細胞６２（幹細胞）のみを培養することができるから、各種の疾患に対する治療の効果や再生医療における再生の効果が大きく、各種の疾患を完治させる確立が高いとともに各種の組織や各種の臓器を再生させる確立が高い間葉系幹細胞６２（幹細胞）を培養することができる。
【符号の説明】
【0138】
１０ ノバルブ発生システム
１１ 細胞用液体培地
１２ ナノバルブ発生装置
１３ ガス組成物
１４ 純水生成装置
１５ 電気分解装置
１６ 原水管（ホース）
１７ 第１フィルタハウジング
１８ 原水給水ポンプ
１９ 純水生成ユニット
２０ 純水管（ホース）
２１ 第２フィルタハウジング
２２ 純水給水ポンプ
２３ 電源
２４ 電気分解ユニット
２５ 水素給気管（ホース）
２６ 酸素給気管（ホース）
２７ 水素給気ポンプ
２８ 酸素給気ポンプ
２９ 水素流量計
３０ 酸素流量計
３１ 貯水槽
３２ 第１微細気泡（ナノバブル）発生ノズル
３３ 第２微細気泡（ナノバブル）発生ノズル
３４ 給水ポンプ
３５ 抽出管（ホース）
３６ 吸水管（ホース）
３７ 第１給水管（ホース）
３８ 第２給水管（ホース）
３９ 圧力計
４０ 吸水口
４１ 純水
４２ 炭酸ガス（炭酸水）
４３ ビーカー
５０ 幹細胞培養システム
５１ 第１骨髄液
５２ コンピュータ
５３ 電子顕微鏡
５４ ガラス試験管
５５ 試験管立て
５６ 恒温槽
５７ 第２骨髄液
５８ 第１扁平培養容器（第１培養容器）
５９ 第１間葉系幹細胞（第１幹細胞）
６０ 遠心分離器
６１ ガラス試験管
６２ 第２間葉系幹細胞（第２幹細胞）
６３ 第２扁平培養容器（第２培養容器）
６４ 保存容器
６５ 冷蔵庫
１１ 細胞用液体培地
１２ ナノバルブ発生装置
１３ ガス組成物
１４ 純水生成装置
１５ 電気分解装置
１６ 原水管（ホース）
１７ 第１フィルタハウジング
１８ 原水給水ポンプ
１９ 純水生成ユニット
２０ 純水管（ホース）
２１ 第２フィルタハウジング
２２ 純水給水ポンプ
２３ 電源
２４ 電気分解ユニット
２５ 水素給気管（ホース）
２６ 酸素給気管（ホース）
２７ 水素給気ポンプ
２８ 酸素給気ポンプ
２９ 水素流量計
３０ 酸素流量計
３１ 貯水槽
３２ 第１微細気泡（ナノバブル）発生ノズル
３３ 第２微細気泡（ナノバブル）発生ノズル
３４ 給水ポンプ
３５ 抽出管（ホース）
３６ 吸水管（ホース）
３７ 第１給水管（ホース）
３８ 第２給水管（ホース）
３９ 圧力計
４０ 吸水口
４１ 純水
４２ 炭酸ガス（炭酸水）
４３ ビーカー
５０ 幹細胞培養システム
５１ 第１骨髄液
５２ コンピュータ
５３ 電子顕微鏡
５４ ガラス試験管
５５ 試験管立て
５６ 恒温槽
５７ 第２骨髄液
５８ 第１扁平培養容器（第１培養容器）
５９ 第１間葉系幹細胞（第１幹細胞）
６０ 遠心分離器
６１ ガラス試験管
６２ 第２間葉系幹細胞（第２幹細胞）
６３ 第２扁平培養容器（第２培養容器）
６４ 保存容器
６５ 冷蔵庫
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】