▶ ウィルソン ウォルフ マニュファクチャリング コーポレイションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023065668
(43)【公開日】2023-05-12
(54)【発明の名称】養子細胞療法のための改良型細胞培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20230502BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230502BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230502BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230502BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20230502BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230502BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230502BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20230502BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
C12N5/10
A61P31/12
A61K35/17
A61P31/10
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/62 Z
【審査請求】有
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023035371
(22)【出願日】2023-03-08
(62)【分割の表示】P 2020134448の分割
【原出願日】2013-06-11
(31)【優先権主張番号】13/493,768
(32)【優先日】2012-06-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】506118799
【氏名又は名称】ウィルソン ウォルフ マニュファクチャリング コーポレイション
【氏名又は名称原語表記】ＷＩＬＳＯＮ ＷＯＬＦ ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】110000394
【氏名又は名称】弁理士法人岡田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジョン・アール・ウィルソン
(57)【要約】
【課題】ドナーとレシピエントとの間でＨＬＡ適合があるか否かに関係なく使用可能な治療細胞を生産する。
【解決手段】抗原でドナーＰＢＭＣ又はドナー臍帯血を刺激して、抗原に対する天然抗原特異性を有するＴ細胞の成長を活性化させ、抗原に対する抗原特異性を有する天然抗原受容体からなる抗原特異的Ｔ細胞群を得る。そして、抗原特異的Ｔ細胞群を、天然抗原受容体の抗原特異性とは無関係な治療属性を有するよう改変する。
【選択図】図１４
【解決手段】抗原でドナーＰＢＭＣ又はドナー臍帯血を刺激して、抗原に対する天然抗原特異性を有するＴ細胞の成長を活性化させ、抗原に対する抗原特異性を有する天然抗原受容体からなる抗原特異的Ｔ細胞群を得る。そして、抗原特異的Ｔ細胞群を、天然抗原受容体の抗原特異性とは無関係な治療属性を有するよう改変する。
【選択図】図１４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
養子細胞療法用の遺伝子改変されたＴ細胞であって、
前記Ｔ細胞は、真菌由来の抗原又はウイルス由来の抗原を認識する天然Ｔ細胞受容体を有するヒトＴ細胞由来であり、
前記Ｔ細胞は、前記Ｔ細胞のＨＬＡに適合しないＨＬＡを有する患者に注入される。
前記Ｔ細胞は、真菌由来の抗原又はウイルス由来の抗原を認識する天然Ｔ細胞受容体を有するヒトＴ細胞由来であり、
前記Ｔ細胞は、前記Ｔ細胞のＨＬＡに適合しないＨＬＡを有する患者に注入される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２００９年１２月８日に出願された「養子細胞療法のための改良型細胞培養方法」という名称の特許文献１の利点を請求する２０１０年１２月８日に出願された「養子細胞療法のための改良型細胞培養方法」という名称の特許文献２（以下、「親出願」）（その全体を参照により本出願に援用する）の一部継続出願である。
本出願は、２００９年１２月８日に出願された「養子細胞療法のための改良型細胞培養方法」という名称の特許文献１の利点を請求する２０１０年１２月８日に出願された「養子細胞療法のための改良型細胞培養方法」という名称の特許文献２（以下、「親出願」）（その全体を参照により本出願に援用する）の一部継続出願である。
【0002】
本発明は概して細胞培養方法に関するものであり、より詳細には細胞療法のための細胞培養に関するものである。更に、本発明は、養子細胞療法で使用するための治療属性を有するＴ細胞の生産に関するものである。
【背景技術】
【0003】
細胞培養は、細胞療法の費用及び複雑性の主要な要因である。現在の方法では、細胞培養プロセスは時間がかかり高価である。典型的には、多数の細胞を生産するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養プロセスが段階的に進行するように行われる。最も早い段階で、目的の細胞は、細胞培養器具内に置かれる細胞集団中で比較的小さな個体群となっている。この段階では、細胞集団は、典型的には目的の細胞の供給源（末梢血単核細胞など）、目的細胞の成長を刺激するフィーダー細胞、及び／又は抗原提示が含まれる。細胞が存在する培地をおおむね無撹拌状態とすることのできる培養器具及び方法は、細胞が比較的無撹拌のままであるので好ましい。このような器具は、標準的な組織培養プレート、フラスコ及びバッグを含む。培養は段階的に進行し、一般に、細胞集団にグルコースなどの成長基質の培地を枯渇させ、使用済みの培地を取り除き、使用済みの培地を新鮮培地と交換し、所望量の目的の細胞が得られるまでプロセスを繰り返すことからなる。多くの場合、目的細胞群の個体数が増大して更なる生育面が必要となると、新たな生産段階を開始するために、細胞集団を他の器具へ移す。しかしながら、従来の方法では、目的細胞群の成長速度は、生育面上の細胞群の個体数が増大するにつれて遅くなる。最終的に、目的細胞のかなり大きな個体群を生産するには非常に時間がかかり、かつ、複雑であるという結果になる。
【0004】
エプスタイン・バーウイルスに対する抗原特異性を有するＴリンパ球（ＥＢＶ－ＣＴＬ）を生成するための最先端の生産方法は、生産の複雑さを示す一例である。ＥＢＶ－ＣＴＬの最適な増殖のための従来の方法は、標準２４ウェル組織培養プレートを使用する。各ウェルの細胞が載置される表面積は２ｃｍ2であり、その培地容量は気体移動の必要性に起因して１ｍｌ／ｃｍ2に制限されている。培養プロセスは、照射された抗原提示細胞系統の存在下にＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）からなる細胞集団を入れることによって開始するが、リンパ芽球様細胞系統（ＬＣＬ）であってもよく、約４０：１の表面密度（すなわち生育面１ｃｍ2あたりの細胞数）比で、ＰＢＭＣ１×１０6個／ｃｍ2及び照射抗原提示細胞２．５×１０4個／ｃｍ2である。これによって細胞集団中のＥＢＶ－ＣＴＬ群の個体数の増殖が促進する。９日後、ＥＢＶ－ＣＴＬは、照射抗原提示ＬＣＬの存在下、４：１の新たな表面密度比で、ＥＢＶ－ＣＴＬ約２．５×１０5個／ｃｍ2の最小表面密度で再び選択的に増殖する。酸素が細胞に達することができるように、培地容量は、生育面面積の最大比１ｍｌ／ｃｍ2に制限されるが、これはグルコースなどの成長溶質を制限する。結果として、達成可能な最大表面密度は、ＥＢＶ－ＣＴＬ約２×１０6個／ｃｍ2である。よって、１週当たりの最大細胞増殖は約８倍（すなわち、ＥＢＶ－ＣＴＬ２×１０6個／ｃｍ2をＥＢＶ－ＣＴＬ２．５×１０5個／ｃｍ2で割る）以下である。ＥＢＶ－ＣＴＬの継続的な増殖には、抗原再刺激を有する追加の２４ウェルプレートにＥＢＶ－ＣＴＬを毎週移動させ、２４ウェルプレートの各ウェル内の培地及び成長因子を週に２回交換することが必要である。従来の方法によると、ＥＢＶ－ＣＴＬ表面密度がウェル１つ当たりの可能な最大量に近づくにつれて、ＥＢＶ－ＣＴＬ群の増殖速度が遅くなるため、細胞注入、並び無菌性アッセイ、同一性アッセイ及び効力アッセイなどの品質管理手段に十分な量のＥＢＶ－ＣＴＬを得るには、これらの操作をしばしば４～８週間もの長い生産期間にわたって繰り返さなければならない。
【0005】
ＥＢＶ－ＣＴＬの培養は、細胞療法に固有の複雑な細胞生産プロセスの一例にすぎない。生産時間を短縮し、同時に生産コスト及び複雑さを低減し得る細胞療法のための細胞を培養する、より実用的な方法が必要とされる。
【0006】
我々は、生産の全体を通して個体群の成長速度を増大し、また、そうすることによって細胞生産に必要な複雑さ及び時間を低減する新規方法を生み出した。
【0007】
養子細胞療法において、天然抗原特異性を有するＴ細胞（すなわち、特定のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子との関連において提示される際、特定の標的抗原由来の特定のペプチドに対するＴ細胞）は、ウイルス感染及び標的腫瘍を治療するために、自己セッティング及び部分的にＨＬＡ適合したセッティングにおいて投与される。これらの場合はいずれも、（ｉ）天然のＴ細胞受容体が目的の抗原を認識した、及び（ｉｉ）標的化ペプチドを提示するのに必要なＨＬＡ対立遺伝子を発現したレシピエントにＴ細胞が投与されたという事実から治療的利点が得られた。
【0008】
同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）のセッティングにおける最初の養子Ｔ細胞移送プロトコールは、ドナー末梢血が、ＨＳＣＴレシピエントにおける抗腫瘍及び／又は抗ウイルス活性を調節し得るＴ細胞を含有するという前提に基づくものであった。従って、抗腫瘍免疫を付与し、かつ、より少ない程度で抗ウイルス免疫を付与するべく、ドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）が広範に使用されている。ＤＬＩは、腫瘍特異的な記憶Ｔ細胞並びに広範なウイルスを含有するべきである。しかしながら、アデノウイルス及びＥＢＶに感染した個体群の治療に効果的である一方で、この療法の効能は、多くの一般的な急性ウイルス（ロタウイルス（ＲＳＶ）及びパラインフルエンザなど）に特異的な低頻度のＴ細胞及び比較的高頻度の同種反応性Ｔ細胞によって制限される。ウイルス特異的Ｔ細胞に対する同種反応性Ｔ細胞の比率が高いことは、移植片対宿主病（ＧＶＤＨ）のより高い発生率が、許容可能なＤＬＩ用量を制限し、受容されたウイルス特異的Ｔ細胞の用量を制限する、半合致移植のレシピエントにおいて特に問題である。
【0009】
利点を保つと共にＤＬＩの安全性を向上させるために、レシピエント特異的な同種反応性Ｔ細胞の選択的な不活性化又は除去のための方策が評価され、このような方策としては、アネルギー誘導、レシピエントに投与される同種反応性Ｔ細胞数を最小にする選択的同種枯渇、及び標的から外れた同種反応性Ｔ細胞を生体内で破壊するための自殺遺伝子の使用が挙げられる。
【0010】
ＨＳＣＴ後の特定のウイルス感染を予防・治療するための代替方策は、抗ウイルス活性を有する生体外で増殖されたＴ細胞の養子細胞移入である。ウイルス反応性Ｔ細胞の特定の増殖は、同種反応性Ｔ細胞を増大させることなく注入可能なウイルス特異的Ｔ細胞の数を増大させるという利点を有する。特定の抗原に対する反応性を有する富化された抗原特異的Ｔ細胞の注入は、潜在的にＧＶＨＤなどの望ましくないオフターゲット効果を低減しつつ治療有効性を増大させ、この治療様式は、血液悪性腫瘍並びに黒色腫などの固形腫瘍及びホジキンリンパ腫及び鼻咽頭がんなどのＥＢＶ関連悪性腫瘍の治療に対して効果的かつ安全であることが証明されている。
【0011】
注目すべきは、全ての療法では、天然Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子との関連において、抗原を認識するために天然Ｔ細胞受容体の特異性を使用することが必要とされる。故に、治療的利点自体が、ＨＬＡ適合したＴ細胞又は部分的に適合したＴ細胞の使用／投与に依存する。例えば、黒色腫細胞を標的とするために、ＧＰ１００（がん細胞に発現する腫瘍関連抗原）に対するＨＬＡハプロタイプ（ａ）を発現するドナー由来の抗原特異的な黒色腫指向性Ｔ細胞を増殖することができる。この状況において、治療的利点は、標的抗原を有する天然Ｔ細胞受容体の特異的相互作用によってもたらされる。しかしながら、この相互作用は、適合可能なＨＬＡのセッティングにおいて（つまり、自己セッティングにおいて、又はＨＬＡも発現する別の個人との関連において）のみ生じ得る。この手法は、様々なＨＬＡハプロタイプを有する系統を含む細胞バンクの生成によって複数の患者を治療するために拡張することができるだけで、ここでは、患者は最も適するＴ細胞系統に適合される。
【0012】
要するに、現在の養子細胞療法の全適用では、その治療目的を付与するＴ細胞の治療属性は、ドナーＴ細胞の天然抗原特異性である。この固有の特徴は、ドナーとレシピエントとの少なくとも部分的なＨＬＡ適合を必要とし、同種セッティングにおいて、ＧＶＨＤなどのオフターゲット効果の可能性を生み出す。他のものは、複雑な遺伝子操作によってドナーＴ細胞抗原受容体を完全に排除すること、及びキメラ抗原受容体を担持するようにＴ細胞の遺伝子再操作を行うことにより、Ｔ細胞の固有の認識能力を全て排除することを提案している。しかしながら、これはＴ細胞生産方法を更に複雑にし、このことは既に養子細胞療法の主要な問題の１つとなっている。
【0013】
メインストリームの社会におけるより広範な用途を可能にするために、既存の問題を克服する養子細胞療法に対する全く新しい手法が必要とされている。我々は、ドナーＴ細胞の抗原特異性を損なわずに、しかし、ドナーＴ細胞の天然抗原特異性をその治療目的と無関係にする治療属性でドナーＴ細胞を改変する新たなパラダイムを開示する。本質的に、このパラダイムシフトは、ドナーとレシピエントとの間でＨＬＡ適合があるか否かに関係なく、これまでには想定されていなかった方法でＴ細胞の治療用途への扉を開けるものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【特許文献1】米国仮出願第６１／２６７７６１号
【特許文献2】米国特許出願第１２／９６３５９７号
【発明の概要】
【0015】
生産プロセス全体を通して従来とは異なる条件を周期的に再確立することを可能にする段階的な生産プロセスを用いることによって、現在可能であるよりも短時間でより経済的な様式で細胞療法のための細胞の生産が可能であることが発見された。従来とは異なる条件とは、低減された目的細胞の表面密度（つまり細胞数／ｃｍ2）、抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞に対する目的細胞の新規な比、及び／又は培地容量：表面積比が増大された気体透過性材料からなる生育面の使用が挙げられる。
【0016】
本発明の実施形態は、細胞療法用途のための細胞を培養する改良型方法に関する。これらの実施形態は、生産プロセス全体にわたって目的細胞の個体群が従来方法と比べて高い成長速度を維持することを可能にする多様な新規方法の使用により、所望の数の目的細胞を生成するのに必要な時間、コスト及び複雑さを低減する方法を包含する。
【0017】
本発明の一態様は、培養プロセスを段階的に行い、目的細胞群の成長速度が現在可能であるものを超えるようにする１以上の段階の開始時に条件を確立することに依拠する。少なくとも１つの培養段階、好ましくはほぼ全ての培養段階において、従来とは異なる低い表面密度で、目的細胞に対する抗原提示細胞（及び／又はフィーダー細胞）の従来とは異なる比で、非気体透過性生育面又は気体透過性生育面のいずれかの上に目的細胞を静置することが含まれる初期条件が確立される。本発明の本態様の新規実施形態を使用することにより、目的細胞群は、従来方法が許容するよりも短い時間でより多くの回数の倍増を受けるので、生産時間が短縮される。
【0018】
本発明の別の態様は、培養プロセスを段階的に行い、目的細胞群の成長速度が現在可能であるものを超えるような１以上の段階の開始時に条件を確立することに依拠する。少なくとも１つの培養段階、好ましくはほぼ全ての培養段階において、従来とは異なる高い培地容量：生育面面積比で、気体透過性材料からなる生育面上に目的細胞を静置することが含まれる条件が確立される。本発明の本態様の新規実施形態を使用することにより、目的細胞群は、従来方法が許容するよりも短い時間でより多くの回数の倍増を受けるので、生産時間が短縮される。
【0019】
本発明の別の態様は、培養プロセスを段階的に行い、目的細胞群の成長速度が現在可能であるものを超えるような各段階の条件を確立することに依拠する。少なくとも１つの培養段階、好ましくはほぼ全ての培養段階において、従来とは異なる低い表面密度（つまり細胞数／ｃｍ2）で、目的細胞に対する抗原提示細胞（及び／又はフィーダー細胞）の従来とは異なる比で、従来とは異なる高い培地容量：生育面面積比で、気体透過性材料からなる生育面上に目的細胞を静置することが含まれる初期条件が確立される。本発明の本態様の新規実施形態を使用することにより、目的細胞群は、従来方法が許容するよりも短い時間でより多くの回数の倍増を受けるので、生産時間が短縮される。
【0020】
本発明の実施形態において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）にレシピエントを曝さないが、レシピエントの利益になる治療目的を有する治療属性を備えた同種Ｔビヒクルが作成される。
【0021】
本発明の一実施形態において、抗原でドナーＰＢＭＣ又はドナー臍帯血を刺激して、１又は複数の抗原に対する天然抗原特異性を有するＴ細胞の成長を活性化することを含むプロセスによって作成されるＴビヒクルを得ることによって治療が開始される。そうすることにより、それらの成長を刺激するために使用された１又は複数の抗原に対する抗原特異性を有する天然抗原受容体からなる抗原特異的Ｔ細胞群が生産される。抗原特異的Ｔ細胞群は、天然抗原受容体を包含せずに、天然抗原受容体の抗原特異性とは無関係な治療目的を有する少なくとも１つの治療属性を包含することにより、Ｔビヒクルの個体群を作成するように改変される。次いで、レシピエントの細胞がＴビヒクルの１又は複数の天然抗原受容体により認識された抗原を提示するか否かに関係なく、及び／又はレシピエントの細胞がＴビヒクルの１又は複数の天然抗原受容体により認識された抗原を提示しない場合に、Ｔビヒクルから治療的利点を引き出すことができるレシピエントにＴビヒクルが送達される。
【0022】
本発明の別の実施形態において、抗原でドナーＰＢＭＣ又はドナー臍帯血を刺激して、１又は複数の抗原に対する天然抗原特異性を有するＴ細胞の成長を活性化することを含むプロセスによって作成されるＴビヒクルを得ることによって治療が開始される。そうすることにより、それらの成長を刺激するために使用された１又は複数の抗原に対する抗原特異性を有する天然抗原受容体からなる抗原特異的Ｔ細胞群が生産される。抗原特異的Ｔ細胞群は、天然抗原受容体を包含せずに、天然抗原受容体の抗原特異性とは無関係な治療目的を有する少なくとも１つの治療属性を包含することにより、Ｔビヒクルの個体群を作成するように改変される。次いでＴビヒクルから治療的利点を引き出すことができ、Ｔビヒクルに対するＨＬＡ適合を持たないレシピエントにＴビヒクルが送達される。
【0023】
本発明の多様な実施形態において、Ｔビヒクルは、免疫療法のアジュバントとして投与される組換えタンパク質が負荷されるように改変され、がんの標的療法用化学療法剤の治療属性で改変され、抗菌剤の治療属性で改変され、腫瘍特異性を細胞に与えるトランスジェニック分子を発現するという治療属性で改変され、自己免疫疾患を治療するための組換えタンパク質が負荷される又は当該組換えタンパク質で遺伝子操作されるという治療属性で改変され、生体内画像化のために負荷される及び／又は遺伝子操作されるという治療属性で改変される。
【0024】
本発明の別の実施形態において、目的の抗原認識を有する抗原特異的Ｔ細胞を生産する方法は、ＰＢＭＣ又は臍帯血を細胞培養器具内に入れ、細胞培養器具内に２以上の抗原を添加して、２以上の抗原特異的Ｔ細胞群の成長を活性化し（各個体群は抗原の１つを認識することができる）、抗原特異的Ｔ細胞が個体数の増殖を開始するための期間を許容し、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞群の存在及び／又は量を決定するべく培養物を評価し、いずれのＴ細胞群が継続増殖に適するのかを決定し、好適なＴ細胞群によって認識される抗原のみで培養物を再刺激することによって達成される。
【0025】
本発明の別の実施形態において、目的の抗原認識を有する抗原特異的Ｔ細胞を生産する方法は、ＰＢＭＣ又は臍帯血を細胞培養器具内に入れ、最初に細胞培養器具内に２以上の抗原を添加して、２以上の抗原特異的Ｔ細胞群の成長を活性化し（各群は抗原の１つを認識することができる）、抗原特異的Ｔ細胞が個体数の増殖を開始するための期間を許容し、２つ以上の器具内に培養物を分離し、初期抗原のうち１つだけを各器具内に添加し、どの器具が継続増殖に適する抗原特異的Ｔ細胞群を含有しているのかを判断し、継続増殖に適する抗原特異的Ｔ細胞群を含まない器具における培養を終了することによって達成される。
【0026】
本発明の多様な実施形態において、正常なヒト細胞上に存在せず、かつ、正常な哺乳動物細胞上にも存在しない抗原の単一エピトープのみを認識させることを可能にする天然抗原特異性を有するドナーＴ細胞が生産される。
【0027】
本発明は、添付図面と組み合わせて本発明の多様な実施形態に関する以下の詳細な説明を考慮すればより完全に理解される。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】実施例１における抗原特異的Ｔ細胞群が、最初の７日間にわたり、初期刺激の後に少なくとも７回の細胞倍増を受けることを示す。
【図1B】実施例１についての四量体分析によって測定された、時間の経過につれて細胞集団中のＴ細胞群が増殖する大きさを実証するデータを示す。
【図1C】実施例１において、２３日の期間にわたり抗原特異的Ｔ細胞群の増殖速度が減少することを示す。
【図2】実施例１において、抗原特異的Ｔ細胞の予測される増殖と観察された増殖倍率との間の相違を例示する表である。
【図3A】実施例２の刺激後の抗原特異的Ｔ細胞の存在を示す。
【図3B】実施例２において、抗原特異的Ｔ細胞：抗原提示細胞の比を４：１に維持しながら、表面密度が１×ｌ０6／ｃｍ2から３．１×１０4／ｃｍ2まで減少するときの抗原特異的Ｔ細胞群の増殖を示す。
【図3C】実施例２において、一定数の抗原提示細胞の存在下で、表面密度が１×１０6／ｃｍ2から３．１×１０4／ｃｍ2まで減少するときの抗原特異的Ｔ細胞群の増殖を示す。
【図4】図３に記載される研究を継続する際に得られた結果の例を示し、目的の細胞が他の細胞のサポートを必要とする際に、目的細胞がフィーダー細胞及び／又は抗原提示細胞の適切な供給の存在下にある限り、従来とは異なって低い目的細胞の表面密度で個体数の増殖を開始できることをさらに実証する。
【図5】３種の異なる細胞表面密度（ＣＴＬ数／ｃｍ2）で培養を開始することによって、目的の細胞の個体数増殖の大きさを繰り返す能力を実証するヒストグラムを示す。
【図6】データを得るために使用した気体透過性試験器具の横断面図を示す。
【図7A】本発明に従って生産された抗原特異的Ｔ細胞の成長曲線を、実施例５で行なったような従来の方法と比較して示す。
【図7B】実施例５において、フローサイトメトリーの前方散乱対側方散乱分析によって測定したとき、細胞生存率は、本発明に従って生産された抗原特異的Ｔ細胞における方が従来の方法と比較して有意に高かったことを示す。
【図7C】実施例５において、アネキシン－ＰＩ７ＡＡＤによって測定したとき、細胞生存率が、本発明に従って生産された抗原特異的Ｔ細胞における方が従来の方法と比較して有意に高かったことを示す。
【図7D】実施例５において、本発明の新規の方法において生産された細胞の優位な増殖が、毎日のＣＦＳＥ標識細胞のフローサイトメトリー分析によって測定されたとき、従来の方法を使用して培養された細胞と同じ細胞特異的増殖速度を示しており、これにより、細胞増殖速度の増加が細胞死の減少に起因したことを確認したことを示す。
【図8A】培地を交換する必要のない従来の方法において可能であった範囲を超えて、ＥＶＢ－ＣＴＬがどのように増殖することができたかを示す。
【図8B】ＥＢＥＲをＱ－ＰＣＲによって評価したとき、実施例６の培養条件が最終細胞産物をどのように改変しなかったかを示す。
【図8C】Ｂ細胞マーカーであるＣＤ２０をＱ－ＰＣＲによって評価したとき、実施例６の培養条件が最終細胞産物をどのように改変しなかったかを示す。
【図9】目的の細胞及び抗原提示細胞の表面密度の累積が非常に低い（ここでは、ＡＬ－ＣＴＬ細胞及びＬＣＬ細胞を組み合わせて、細胞表面密度３００００個／ｃｍ2の細胞集団を作成している）ことによって、ＡＬ－ＣＴＬ群が成長を開始することができなかったことを実験により実証した例示的実施例を示す。
【図10A】細胞を培養する新規の２つの方法が、２３日の期間にわたって、従来の方法より多くの細胞をどのように生産するかを示す実施例８のデータを提示する。
【図10B】実施例８における試験器具の中で培養された細胞の写真を示す。
【図10C】実施例８において、２つの新規の培養方法及び従来の方法が全て同じ表現型を有する細胞を生産することを示す。
【図10D】実施例８で、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＢＺＬＦ１由来のＥＢＶペプチドエピトープ及びＥＢＶのＥＢＮＡ１で刺激され、ＨＬＡ－Ａ２－ＬＭＰ２ペプチド五量体染色法で染色されたＴ細胞がペプチド特異的Ｔ細胞と同様の発生頻度を示した代表的な培養を示す。
【図10E】
51Ｃｒ放出アッセイによって評価したとき、細胞が細胞溶解活性及び細胞特異性を維持し、自己ＥＢＶ－ＬＣＬを死滅させたが、ＨＬＡ不適合ＥＢＶ－ＬＣＬの死滅は低かったことを実施例８の新規の方法及び従来の方法に関して示す。
【図11】本発明の一態様を使用した目的の細胞型の個体群の増殖と、従来のシナリオに基づく生育面上の目的細胞群の増殖とを比較したグラフ表示を示す。
【図12】気体透過性材料を含む生育面、及び、１又は２ｍｌ／ｃｍ2を超える、従来と異なって高い培地容量：生育面面積比を利用することにより得ることができる利点の一例を示す。
【図13】完了時の細胞表面密度が従来の表面密度より極めて大きい、本発明の一実施形態下における目的細胞型群の増殖と従来のシナリオに基づく生育面上の目的細胞群の増殖の新規の方法を比較したグラフ表示を示す。
【図14】従来の方法を超える別のさらなる利点を提供する細胞生産の別の新規な方法を示す。
【図16】生産が進むにつれて効率を獲得するために、新規な方法では生産プロトコールをどのように調節することができるのかの一例を示す。
【図17】Ｔビヒクルが不適合同種ドナー由来の細胞を認識できないことを実証する試験結果を示す。
【図18】フロー分析によって測定されるとき、ＣＤ３４Δ－ＩＬ７サイトカイン発現の治療属性を有するＴビヒクルを作成するようにドナーＴ細胞を改変可能であることを示す試験結果を示す。
【図19A】ＩＬ７サイトカインの全身送達により、マウス腎臓では腫瘍部位より多くのサイトカインが検出されたことを示す試験結果を示す。
【図19B】ＩＬ７サイトカインのＴビヒクル送達により、他の臓器と比べてマウスの腫瘍部位でのサイトカイン濃度が高いことを示す試験結果を示し、かつ、Ｔビヒクル投与後から少なくとも２週間、どのようにサイトカイン生産が腫瘍で持続されたかを示す。
【図20】フロー分析により測定されるとき、ＣＡＲ－ＰＳＣＡの治療属性を有するＴビヒクルを作成するようにドナーＴ細胞を改変可能であることを示す試験結果を示す。
【図21】ＣＡＲ－ＰＳＣＡの治療属性を有するＴビヒクルが、腫瘍細胞を全滅させることができることを示す試験結果を示す。
【図22A】ＩＬ４を結合することができる受容体を含むＴビヒクルが、ＩＬ４サイトカインを発現する腫瘍細胞に近接していることを示す。
【図22B】どのように、ＴビヒクルにＩＬ４サイトカインが結合され、腫瘍細胞を保護するＩＬ４サイトカインの量が大きく低減され得るかを示す。
【図23】細胞外組換えサイトカイン受容体ＩＬ４Ｒ／７を発現するという治療属性を有するＴビヒクルが、ＩＬ４サイトカインを枯渇させることができることを実証する試験結果を示す。
【図24A】化学療法剤が負荷されたＴビヒクルが、どのように炎症部位へ向かって移動するのかを示す。
【図24B】レシピエントの免疫系が、どのように腫瘍細胞の部位に配置されたＴビヒクルを標的とするかを示す。
【図24C】レシピエントの免疫系による攻撃下で、Ｔビヒクルが、どのように腫瘍細胞の部位で負荷物（この場合には、化学療法剤）を放出するのかを示す。
【発明を実施するための形態】
【0029】
定義
抗原提示細胞（ＡＰＣ）：特定の抗原に応答するように目的細胞を惹起するために作用する細胞。
ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔ細胞。
目的細胞：生産プロセスにおいて量を増やすことを目標とする特異的な型の細胞。一般に、目的細胞は非接着性であり、例としては制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、初代Ｔリンパ球及び多様な抗原特異的細胞、及び他の多くのもの（これらはすべて、機能、生体内での残留性又は安全性を改良するように遺伝子改変することもできる）が挙げられる。臨床的使用に必要な細胞は、フィーダー細胞及び／又は抗原提示細胞を用いて増殖させることができるが、これらの細胞としては、ＰＢＭＣ、ＰＨＡ ｂｌａｓｔ、ＯＫＴ３ Ｔ、Ｂ ｂｌａｓｔ、ＬＣＬ及びＫ５６２（天然又は発現するように遺伝子改変されており、抗原及び／又はエピトープ、並びに４１ＢＢＬ、ＯＸ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ及びその他多くのものなどの共刺激分子）を挙げることができ、これらはペプチド又は他の関連する抗原でパルスする場合もあれば、しない場合もある。
ＥＢＶ：エプスタイン・バーウイルス。
ＥＢＶ－ＣＴＬ：ＥＢＶ感染細胞又はＥＢＶ由来のペプチドを発現したり提示したりする細胞を、Ｔ細胞表面受容体により特異的に認識したＴ細胞。
ＥＢＶ－ＬＣＬ：エプスタイン・バーウイルスで形質転換されたＢリンパ芽球様細胞系。
フィーダー細胞：目的細胞の量を増大させるように作用する細胞。状況によっては抗原提示細胞もフィーダー細胞として作用することができる。
生育面：細胞がその上に静置される、培養器具内の領域。
ＰＢＭＣ：末梢血由来の末梢血単核細胞で、いくつかの目的細胞の源となり、フィーダー細胞として作用することができる。
応答細胞（Ｒ）：刺激細胞に反応する細胞。
静置細胞培養：常套的な操作のために培養器具の設定場所が移動される場合、及び／又は細胞に新鮮培地などが定期的に供給される場合以外は、撹拌されたり混合されたりしない培地中で細胞を培養する方法。一般に、静置培養中の培地は、通常、静止状態にある。本発明は静置細胞培養方法に関する。
刺激：抗原提示及び／又はフィーダー細胞が目的細胞上で有する作用。
刺激細胞（Ｓ）：応答細胞に影響を及ぼす細胞。
表面密度：細胞が静置される器具内の表面の、単位面積当たりの細胞量。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）：特定の抗原に応答するように目的細胞を惹起するために作用する細胞。
ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔ細胞。
目的細胞：生産プロセスにおいて量を増やすことを目標とする特異的な型の細胞。一般に、目的細胞は非接着性であり、例としては制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、初代Ｔリンパ球及び多様な抗原特異的細胞、及び他の多くのもの（これらはすべて、機能、生体内での残留性又は安全性を改良するように遺伝子改変することもできる）が挙げられる。臨床的使用に必要な細胞は、フィーダー細胞及び／又は抗原提示細胞を用いて増殖させることができるが、これらの細胞としては、ＰＢＭＣ、ＰＨＡ ｂｌａｓｔ、ＯＫＴ３ Ｔ、Ｂ ｂｌａｓｔ、ＬＣＬ及びＫ５６２（天然又は発現するように遺伝子改変されており、抗原及び／又はエピトープ、並びに４１ＢＢＬ、ＯＸ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ及びその他多くのものなどの共刺激分子）を挙げることができ、これらはペプチド又は他の関連する抗原でパルスする場合もあれば、しない場合もある。
ＥＢＶ：エプスタイン・バーウイルス。
ＥＢＶ－ＣＴＬ：ＥＢＶ感染細胞又はＥＢＶ由来のペプチドを発現したり提示したりする細胞を、Ｔ細胞表面受容体により特異的に認識したＴ細胞。
ＥＢＶ－ＬＣＬ：エプスタイン・バーウイルスで形質転換されたＢリンパ芽球様細胞系。
フィーダー細胞：目的細胞の量を増大させるように作用する細胞。状況によっては抗原提示細胞もフィーダー細胞として作用することができる。
生育面：細胞がその上に静置される、培養器具内の領域。
ＰＢＭＣ：末梢血由来の末梢血単核細胞で、いくつかの目的細胞の源となり、フィーダー細胞として作用することができる。
応答細胞（Ｒ）：刺激細胞に反応する細胞。
静置細胞培養：常套的な操作のために培養器具の設定場所が移動される場合、及び／又は細胞に新鮮培地などが定期的に供給される場合以外は、撹拌されたり混合されたりしない培地中で細胞を培養する方法。一般に、静置培養中の培地は、通常、静止状態にある。本発明は静置細胞培養方法に関する。
刺激：抗原提示及び／又はフィーダー細胞が目的細胞上で有する作用。
刺激細胞（Ｓ）：応答細胞に影響を及ぼす細胞。
表面密度：細胞が静置される器具内の表面の、単位面積当たりの細胞量。
【0030】
養子Ｔ細胞療法のための目的細胞群の生産を単純化する新規の方法を見つけようとしたとき、細胞療法適用のための細胞のより効率的な培養に門戸を開いた一連の実験が行なわれた。本発明の多数の例示的実施例及び多様な態様が、従来の方法と比較して、生産時間及び複雑さを低減する能力をどのように達成することができるかを示すべく記載される。
【0031】
実施例１：従来方法の限界の実証
【0032】
本実施例のデータは、ウェル１つ当たり２ｍｌ（つまり、培地の高さが１．０ｃｍで、培地容量：表面積比が１ｍｌ／ｃｍ2）の培地容量を用いる標準２４ウェル組織培養プレート（つまり、ウェル１つ当たりの表面積が２ｃｍ2）中でＥＢＶ－ＣＴＬを生産するための従来の培養方法の限界を実証する。
【0033】
培養段階１（０日目）：１ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：生育面比及び４０：１の比（ＰＢＭＬ：ＬＣＬ）で、抗原提示γ照射（４０Ｇｙ）自己ＥＢＶ－ＬＣＬで、正常なドナー由来のＰＢＭＣ（約１×１０6個／ｍｌ）細胞集団を培養し、４５％のＣｌｉｃｋ培地（カリフォルニア州サンタアナのＩｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ及び１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０中の細胞集団の表面密度を約１×１０6個／ｃｍ2とすることによって、ＥＢＶ－ＣＴＬ群の増殖を開始した。
【0034】
培養段階２（９～１６日目）：９日目に、段階１で作成した細胞集団からＥＢＶ－ＣＴＬを回収し、０．５×１０6個／ｃｍ2の表面密度で新鮮培地に再懸濁し、４：１のＣＴＬ：ＬＣＬ比（ＣＴＬの表面密度０．５×１０6個／ｃｍ2：ＬＣＬ１．２５×１０5個／ｃｍ2）の照射自己ＥＢＶ－ＬＣＬで再刺激した。１３日目に、２４ウェルプレートの各ウェル中にある培地容量２ｍｌのうち１ｍｌを取り除き、組換えヒトＩＬ－２（ＩＬ－２）（５０Ｕ／ｍＬ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；カリフォルニア州エメリービルのＣｈｉｒｏｎ社）を含有する１ｍｌの新鮮培地と取り換えた。
【0035】
培養段階３（１７～２３日目）：段階２の条件をＩＬ－２の添加を週に２回行って反復し、２３日目に培養を終了した。終了しても、段階２及び３の培養を模倣した更なる培養段階を伴って培養は継続することができた。
【0036】
細胞障害性アッセイにおける標的細胞として使用するための細胞系統及び腫瘍細胞：ＢＪＡＢ（Ｂ細胞リンパ腫）及びＫ５６２（慢性赤白血病）をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（アメリカ合衆国メリーランド州ロックビル）から入手した。細胞は全て、１０％の熱失活したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、２５ＩＵ／ｍＬのペニシリン及び２５ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（全てＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（メリーランド州ウォーカーズビル）から入手）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で培養を維持した。細胞は、３７℃で５％のＣＯ2を含有する加湿環境に維持した。
【0037】
免疫表現型検査：
細胞表面：Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（アメリカ合衆国カリフォルニア州マウンテンビュー）からのフィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリオディン（ｐｅｒｉｏｄｉｎ）クロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）及びＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２５、ＣＤ４４に対するアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合モノクローナル抗体（ＭＡｂ）で細胞を染色した。ＰＥ結合四量体（ＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）及びＡＰＣ結合五量体（イギリス、オックスフォードのＰｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｌｔｄ社）を使用してＥＢＶ－ＣＴＬ前駆体の頻度を定量化した。細胞表面及び五量体染色のための、１００００及び１０００００のライブイベントをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターでそれぞれ獲得し、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトフェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてデータを分析した。
細胞表面：Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（アメリカ合衆国カリフォルニア州マウンテンビュー）からのフィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリオディン（ｐｅｒｉｏｄｉｎ）クロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）及びＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２５、ＣＤ４４に対するアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合モノクローナル抗体（ＭＡｂ）で細胞を染色した。ＰＥ結合四量体（ＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）及びＡＰＣ結合五量体（イギリス、オックスフォードのＰｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｌｔｄ社）を使用してＥＢＶ－ＣＴＬ前駆体の頻度を定量化した。細胞表面及び五量体染色のための、１００００及び１０００００のライブイベントをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターでそれぞれ獲得し、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトフェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてデータを分析した。
【0038】
細胞分裂を測定するためのＣＦＳＥ標識：２×１０7の倍増速度を評価するために、ＰＢＭＣ又はＥＢＶ特異的ＣＴＬ（ＥＢＶ－ＣＴＬ）を２回洗浄し、０．１％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）８５０μｌに再懸濁した。染色する前に、カルボキシ－フルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（ジメチルスルホキシド中１０ｍＭ）（Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｃ３４５５４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のアリコートを解凍し、１×ＰＢＳで１：１０００に希釈し、１５０μｌの希釈物を細胞懸濁液に添加した（標識濃度は１μＭであった）。細胞をＣＦＳＥと共に１０分間室温でインキュベートした。その後、１ｍｌのＦＢＳを細胞懸濁液に添加し、次いで１０分間３７℃でインキュベートした。その後、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、数を計測し、記載される抗原で刺激した。
【0039】
アネキシンＶ－７－ＡＡＤ染色：培養中のアポトーシス細胞及び壊死細胞の割合を測定するために、製造者の指示（カリフォルニア州サンディエゴのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）＃５５９７６３）通りにアネキシン－７－ＡＡＤ染色を行った。簡潔に言うと、２４ウェルプレート又はＧ－ＲｅｘからのＥＢＶ－ＣＴＬを冷ＰＢＳで洗浄し、細胞１×１０6個／ｍｌの濃度で１×結合緩衝液に再懸濁し、暗所にて室温（２５℃）で１５分間アネキシンＶ－ＰＥ及び７－ＡＡＤで染色した。インキュベーション後、フローサイトメトリーによって細胞を直ちに分析した。
【0040】
クロム放出アッセイ：先に述べたように、標準４時間の51Ｃｒ放出アッセイにおいてＥＢＶ－ＣＴＬの細胞障害活性を評価した。目的の細胞として、自己並びにＨＬＡクラスＩ及びＩＩ不適合ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞系統（ＥＢＶ－ＬＣＬ）を使用してＭＨＣ拘束及び非拘束による死滅を測定し、Ｋ５６２細胞系統を使用してナチュラルキラー活性を測定した。培地のみで、又は１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００でインキュベートした、クロム標識した目的の細胞を使用して、自然発生及び最大51Ｃｒ放出をそれぞれ測定した。三連ウェルの特異的溶菌の平均の割合を以下のように計算した：［（試験数－自然発生数）／（最大数－自然発生数）］×１００。
【0041】
酵素連結免疫スポット（ＥＬＩｓｐｏｔ）アッセイ：ＥＬＩｓｐｏｔ分析を用いて、抗原刺激に応答してＩＦＮγを分泌したＴ細胞の頻度及び機能を定量化した。２４ウェルプレート又はＧ－Ｒｅｘ中で増殖したＣＴＬ系統を、照射ＬＣＬ（４０Ｇｙ）若しくはＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＢＺＬＦ１及びＥＢＮＡ１ ｐｅｐｍｉｘ（１μｇ／ｍｌに希釈）（ドイツ、ベルリンのＪＰＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ社）、又はＥＢＶペプチドＨＬＡ－Ａ２ ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ＝ＧＬＣ、ＨＬＡ－Ａ２ ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ＝ＣＬＧ、ＨＬＡ－Ａ２－ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ＝ＦＬＹ及びＨＬＡ－Ａ２９ ＩＬＬＡＲＬＦＬＹ＝ＩＬＬ（テキサス州サンアントニオのＧｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｉｎｃ．社）で刺激し、最終濃度２μＭに希釈し、ＣＴＬのみがネガティブコントロールとして役立った。ＣＴＬは、ＥＬＩｓｐｏｔ培地［５％のヒト血清（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ）（バージニア州ウィンチェスターのＶａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ， Ｉｎｃ．社）及び２ｍＭのＬ－グルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ）（カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０（ユタ州ローガンのＨｙｃｌｏｎｅ社）］中に１×１０6／ｍｌで再懸濁した。９６ウェル濾過プレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ，＃ＭＡＨＡＳ４５１０）（マサチューセッツ州ベドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社）は、１０μｇ／ｍＬの抗ＩＦＮ－γ抗体（Ｃａｔｃｈｅｒ－ｍＡＢ９１－ＤＩＫ）（オハイオ州シンシナティのＭａｂｔｅｃｈ社）で４℃で一晩コーティングし、次いで洗浄し、３７℃で１時間ＥＬＩｓｐｏｔ培地でブロックした。応答細胞及び刺激細胞をプレート上で２０時間インキュベートし、次いでプレートを洗浄し、ビオチン結合抗ＩＦＮ－γモノクローナル第２抗体（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ－ｍＡＢ（７－Ｂ６－１－Ｂｉｏｔｉｎ））（Ｍａｂｔｅｃｈ）を用いてインキュベートし、その後、アビジン：ビオチン化された西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ（標準）、＃ＰＫ６１００）（カリフォルニア州バーリンゲームのＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いてインキュベートし、ＡＥＣ基質（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ社）で発色させた。各培養条件を３回実行した。評価のためにプレートをＺｅｌｌｎｅｔ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ（ニューヨーク州ニューヨーク）へ送った。スポット形成単位（ＳＦＣ）及び投入した細胞数をプロットした。
【0042】
統計分析：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのデータは、平均値±１ＳＤとして示される。ステューデントｔ検定を使用してサンプル間の差異の統計的有意差を測定し、Ｐ＜０．０５は有意差を示すものとして許容された。
【0043】
これら培養条件下では、図１Ａに示すように、初期刺激の後、抗原特異的Ｔ細胞群は、最初の７日間にわたって少なくとも７回の細胞倍増を受ける。したがって、Ｔ細胞は一週間で１２８倍に増殖すると予測される（抗原特異的Ｔ細胞の頻度に細胞集団中の総細胞数を乗じて得られる）。１回目、２回目及び３回目の刺激後の四量体陽性細胞の頻度を図１Ｂに示す。０日目には、２種のＥＢＶ四量体、ＲＡＫ及びＱＡＫに対して反応性であるＴ細胞の頻度はそれぞれ０．０２％及び０．０１％であった。０日目の一回だけ刺激した後、９日目までに、細胞集団中の四量体陽性Ｔ細胞の頻度は０．０２％及び０．０１％から２．７％及び１．２５％までそれぞれ増加していた。よって、細胞集団中に存在する抗原特異的四量体陽性Ｔ細胞の割合は、ＲＡＫ及びＱＡＫによって測定するとき、それぞれ１３５倍及び１２５倍の増大を達成した。また、培養段階１の０日目に一回だけ刺激した後、９日目までに細胞集団中の細胞の表面密度において１．１倍の増大（データは示さず）が認められた（およそ１．１×１０6個／ｃｍ2が存在していた）。ＰＢＭＣ集団中の細胞の大半は刺激抗原に特異的ではないので、総細胞数の全体的な増大はほとんど認められないが、図１Ｃに示すように、集団中の抗原特異的細胞群の増殖倍率は、培養の第１段階中約２８０であった。不運にも、ＣＳＦＥによって測定するとき、第２及び第３培養段階の間、細胞倍増回数は同じであったが、第２及び第３培養段階の間、この抗原特異的Ｔ細胞増殖速度は持続せず、第２段階ではわずか５．７、第３段階では４．３であった。図２は、抗原特異的Ｔ細胞（ｎ＝３）の、予想される増殖と、観察した増殖倍率との相違を例証する表を示している。
【0044】
実施例１は、目的細胞群の増殖速度が後続の培養段階において低下するため、目的細胞を生産するのにかかる時間が、典型的に、ほぼ生産の第１週の後に遅くなることを実証する。
【0045】
実施例２：目的細胞群を増大させるのに必要な時間の短縮は、培養の任意の所与の１又は複数の段階の開始時に、目的細胞群の細胞表面密度を低減することによって達成可能である。
【0046】
１回目の刺激と比べて２回目のＴ細胞刺激後に目的細胞群の増殖速度が低下したのは、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）をもたらす細胞培養条件に限定したためと仮定した。例えば、図３Ａを参照すると、１回目の刺激では、ＰＢＭＣのＥＢＶ抗原特異的Ｔ細胞成分は最大でも個体数の２％であるため、抗原特異的応答Ｔ細胞の播種密度は、１ｃｍ2当たり２×１０4未満である。残りのＰＢＭＣは、非増殖フィーダー細胞（図３ＡにおいてはＣＦＳＥ陽性細胞として示されている）として作用し、抗原特異的ＣＴＬの増殖を可能にする最適な細胞間接触を維持する。それに反して、９日目の２回目の刺激では、Ｔ細胞の大半が抗原特異的であり、集団の総細胞密度はほぼ同じであるが、増殖細胞密度は５０～１００倍高い。結果として、再刺激で大半の細胞が増殖し、故に、急速にそれらの栄養素及びＯ2供給を消費して使い果たす可能性がある。
【0047】
培養条件の限定が最適以下のＴ細胞成長速度に関与していたかどうかを判断するために、より低い細胞密度でプレーティングした活性化Ｔ細胞の増殖を測定した。方法は前述の実施例１の通りである。
【0048】
図３Ｂに示すように、各ウェルが２ｃｍ2の生育面面積を有する標準２４ウェルプレートのウェル内に、応答細胞：刺激細胞比（Ｒ：Ｓ）を４：１に維持しつつ、１×１０6／ｃｍ2～３．１×１０4／ｃｍ2の範囲で低下する表面密度を生み出す倍々の希釈で、活性化ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を播種した。１ｃｍ2当たり１．２５×１０5の出発ＣＴＬ表面密度で、最大のＣＴＬ増殖（４．７±１．１倍）が達成されたが、図３Ｂに示すように、更なる希釈によって増殖速度は低下した。この限定的な希釈効果はおそらく細胞間接触の欠如によるものであると推測されるので、一定数のフィーダー細胞（１．２５×１０5／ｃｍ2の表面密度でプレーティングされたＥＢＶ－ＬＣＬ）と共に、１×１０6から３．１×１０4までの表面密度でのＥＢＶ－ＣＴＬの倍々の希釈を培養し、７日間にわたって細胞増殖を評価した。図３Ｃに示すように、ＣＴＬ増殖は、表面密度１×１０6／ｃｍ2でのＥＢＶ－ＣＴＬによるわずか２．９±０．８倍の増殖から、表面密度３．１×１０4／ｃｍ2でのＥＢＶ－ＣＴＬによる３４．７±１１倍の増殖に至るまで劇的に増大したことが観察された。重要なことに、培養条件のこの変更は、細胞の機能や抗原特異性を変えるものではなかった（データは示さず）。故に、活性化された抗原特異的Ｔ細胞群は、従来の培養方法が許容するよりも大きく増殖することができる。注意すべきは、刺激後に達成された最大表面密度（１．７～２．５×１０6／ｃｍ2）は、出発表面密度に関わらず同じであった。
【0049】
よって、従来の培養条件は限定的であり、目的の細胞群が従来方法の表面密度の限界を超えるためには、培地容量：生育面面積比を従来の１ｍｌ／ｃｍ2よりも高くしなければならないことを示している。更に、任意の培養段階の開始時に、目的細胞群の表面密度を従来方法よりも低減することによって、抗原特異的ＣＴＬの増殖を約３４倍まで向上することができる。これは、生産開始時の細胞量がしばしばかなり限定されている細胞療法においてかなりの派生効果を有する。例えば、限られた量の目的細胞を、増大された表面積上に、低下された表面密度で分配することによって、個体群の成長速度が従来の表面密度と比べて劇的に高くなるため、より短い時間でより大きな目的細胞群を達成することができる。
【0050】
実施例３：目的細胞及び／又は抗原提示細胞を含む細胞群の最小表面密度は、非常に低い表面密度で播種される目的細胞群の成長を可能にする。
【0051】
図４は、図３に記載される研究を継続して得られた結果の一例を示しており、更に、目的細胞が他の細胞のサポートを必要とする際に、目的細胞がフィーダー細胞及び／又は抗原提示細胞の十分な供給の存在下にある限り、従来とは異なって低い目的細胞表面密度で個体数の増殖を開始し得ることを実証した。これらの実験において、Ｒ：Ｓ比が８：１で目的細胞約１．０×１０6個／ｃｍ2とＲ：Ｓ比が１：３２で単に目的細胞約３９００個／ｃｍ2との間の表面密度及びＲ：Ｓ比を有する細胞集団全体が、どのようにして出発表面密度の５０倍を超えるまで目的細胞を大幅に増殖し得るのかを継続して実証し、その時点で試験を中断した。
【0052】
実施例４：従来とは異なって低い目的細胞表面密度で段階を開始し、個体数を増殖させ、段階を終了し、条件を反復することにより生産プロセスの段階的な反復を可能にする能力が、反復可能な結果を生むことが実証された。
【0053】
図５に示すように、３種の目的細胞表面密度（ＣＴＬ数／ｃｍ2）で、実施例３に記載される評価を継続した。各特定の播種密度は、同じ増殖倍率を一貫して達成することができた。この示唆については、目的細胞群の生産時間を劇的に短縮する能力に関連して、より詳細に記載する。
【0054】
実施例５：気体透過性材料からなる生育面上で目的細胞を培養しつつ、同時に培地容量：生育面面積比を増大させることは、従来方法と比べて、所与の培養段階において目的細胞群が倍増し得る回数を増やし、かつ、達成可能な表面密度を増大させる。
【0055】
細胞系統及び腫瘍細胞、免疫表現型検査、ＣＦＳＥ標識、アネキシンＶ－７－ＡＡＤ染色、クロム放出アッセイ、酵素連結免疫スポット（ＥＬＩｓｐｏｔ）アッセイ、Ｔリンパ球のレトロウイルス生産及び形質導入、並びに統計分析については実施例１に記載した通りであった。
【0056】
試験器具（以下、一般的に「Ｇ－Ｒｅｘ」と呼ぶ）を図６に示すように構築した。各Ｇ－Ｒｅｘ１０の底部２０は気体透過性シリコーン膜からなるものであり、この膜の厚さはおよそ０．００５～０．００７インチであった。同時係属中の米国特許公開公報２００５／０１０６７１７号（以下、Ｗｉｌｓｏｎ‘７１７と呼ぶ）は、代替気体透過性材料の使用に関する多くの他の情報源の中の１つであり、当業者はここから本発明の実施形態の多くにとって有益である気体透過性培養器具の形状、特性及び他の有用な特徴についての知識を得ることができる。本実施例３において、Ｇ－Ｒｅｘ（「Ｇ－Ｒｅｘ４０」と呼ぶ）の生育面面積は１０ｃｍ2であり、その上に細胞集団（要素３０として示す）を静置した。細胞集団の特徴は本明細書に記載されるように実験を通して様々であった。培地容量（要素４０として示す）は、特記しない限り、３０ｍＬであり、３ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：生育面面積比を生み出した。
【0057】
活性化ＥＢＶ特異的ＣＴＬ及び照射自己ＥＢＶ－ＬＣＬは、ＣＴＬ：ＬＣＬ比を従来の４：１にしてＧ－Ｒｅｘ４０器具内で培養された。Ｇ－Ｒｅｘ４０内でＥＢＶ－ＣＴＬを表面密度５×１０5個／ｃｍ2で播種し、ＥＢＶ－ＣＴＬ群の増殖速度を、生育面面積に対する培地容量が１ｍｌ／ｃｍ2の標準２４ウェルプレート中に同一表面密度で播種したＥＢＶ－ＣＴＬと比較した。３日後、図７Ａ（ｐ＝０．００５）に示すように、Ｇ－Ｒｅｘ４０内のＥＢＶ－ＣＴＬは、培地を交換することなく、５×１０5／ｃｍ2から７．９×１０6／ｃｍ2の中央値（範囲５．７～８．１×１０6／ｃｍ2）まで増加していた。対照的に、従来の２４ウェルプレート内で３日間培養したＥＢＶ－ＣＴＬは、３日目までに表面密度５×１０5／ｃｍ2から１．８×１０6／ｃｍ2の中央値（範囲１．７～２．５×１０6／ｃｍ2）までしか増加しなかった。Ｇ－Ｒｅｘ４０において培地を補充することによって表面密度を更に増大させることができたが、２４ウェルプレート内に培地又はＩＬ２を補充しても細胞表面密度を増大させることはできなかった。例えば、ＥＢＶ－ＣＴＬ表面密度は、７日目に培地及びＩＬ－２を補充した後、Ｇ－Ｒｅｘ４０において９．５×１０6個／ｃｍ2（範囲８．５×１０6～１１．０×１０6／ｃｍ2）まで更に増加した（データは示さず）。
【0058】
Ｇ－Ｒｅｘ器具における優位な細胞増殖の背後にあるメカニズムを理解すべく、培養５日目に、フローサイトメトリーの前方対側方散乱分析を用いて、ＯＫＴ３に刺激された末梢血Ｔ細胞の生存率を評価した。分析を妨げる残留照射ＥＢＶ－ＬＣＬが培養物中に存在していたために、本アッセイではＥＢＶ－ＣＴＬを評価できなかった。図７Ｂに示すように、細胞生存率は、Ｇ－Ｒｅｘ４０の培養における方が有意に高かった（Ｇ－Ｒｅｘ４０中での生存率は８９．２％であり、２４ウェルプレートでは４９．９％であった）。次いで、生細胞とアポトーシス／壊死細胞とを識別するためにアネキシン－ＰＩ ７ＡＡＤを使用して７日間毎日培養物を分析し、図７Ｃに示すように、Ｇ－Ｒｅｘにおいて増殖するＴ細胞の生存率と比べて２４ウェルプレート内で増殖するＴ細胞の生存率の方が一貫してより低いことが観察された。これらのデータは、増殖細胞の生存が累積的に向上したことが、２４ウェルプレートと比較したＧ－Ｒｅｘ器具内での細胞数の増加に寄与したことを示している。
【0059】
Ｇ－Ｒｅｘ対２４ウェルプレート内での細胞分裂数の増加からも寄与が存在するかどうかを判断するために、０日目にＴ細胞をＣＦＳＥで標識し、培地容量４０ｍｌであるＧ－Ｒｅｘ４０と、各ウェル内の培地容量が２ｍｌである２４ウェルプレートに分けた。毎日フローサイトメトリー分析を行った結果、１日目から３日目までは細胞分裂数に差異はないことが実証された。しかしながら、３日目以降、図７Ｄに示すように、Ｇ－Ｒｅｘ４０で培養した目的細胞の個体群は、２ｍｌウェルの低下率を上回る比率で増加し続けた。このことは、培養条件が限定的になっていたことを示している。よって、Ｇ－Ｒｅｘ４０試験器具における目的細胞の大きな個体群は、従来方法と比べて、細胞死が低下したことと増殖が持続されたこととの組み合わせから得られたものであった。
【0060】
実施例６：従来とは異なって高い培地容量：生育面面積比及び気体透過性材料からなる生育面を用いることにより、生産中に培養物に栄養供給する必要性を低減しつつ、同時に従来とは異なって高い目的細胞表面密度を得ることができる。
【0061】
これは、ＥＢＶ：ＬＣＬの開始及び増殖のためにＧ－Ｒｅｘ試験器具を使用することによって実証された。本実施例では、Ｇ－Ｒｅｘ２０００は、図８に記載されるような器具を指すが、底部が１００ｃｍ2の生育面面積からなり、使用可能な培地容量が２０００ｍｌであることを除外する。Ｇ－Ｒｅｘ２０００内でＥＢＶ－ＬＣＬを培養し、細胞表現型を変化させることなく増殖した。１０００ｍｌの完全ＲＰＭＩ培地と共に、表面密度１×１０5個／ｃｍ2でＧ－Ｒｅｘ２０００内にＥＢＶ－ＬＣＬをプレーティングして、培地容量：表面積比を１０ｍｌ／ｃｍ2とした。比較のために、３０ｍｌの完全ＲＰＭＩ培地と共に、表面密度５×１０5個／ｃｍ2でＴ１７５フラスコ内にＥＢＶ－ＬＣＬをプレーティングして培地容量：表面積比を０．１８ｍｌ／ｃｍ2とした。図８Ａに示すように、Ｇ－Ｒｅｘ２０００内で培養したＥＢＶ－ＬＣＬは、いかなる操作又は培地変更をも必要とすることなく、Ｔ１７５フラスコ内で培養したものよりも大きく増殖した。図８Ｂ及び図８Ｃに示すように、ＥＢＥＲ及びＢ細胞マーカーのＣＤ２０をＱ－ＰＣＲによって評価すると、この培養条件では最終的な細胞生成物は改変されなかった。
【0062】
実施例７：培養開始時に十分なフィーダー及び／又は抗原細胞が存在しないと、目的細胞は増殖しない場合がある。しかしながら、細胞集団は、増殖させるために、フィーダー細胞及び／又は抗原提示細胞として作用する更なる細胞型を包含するように改変することができる。
【0063】
図９は、目的細胞及び抗原提示細胞の累積表面密度が非常に低い（この場合、ＡＬ－ＣＴＬ及びＬＣＬ細胞を組み合わせて、表面密度３００００個／ｃｍ2の細胞集団を作成している）ために、ＡＬ－ＣＴＬ群の成長を開始することができなかったことを、実験により実証した例示的実施例を示している。しかしながら、フィーダー細胞として機能する他の細胞型を包含するように当該集団を改変することによって、これと同じ細胞集団を成長させることができた。この場合、表面密度が約０．５×１０6個／ｃｍ2である３種の様々な形態の照射Ｋ５６２細胞のフィーダー層を評価した。いずれの場合も、ＡＬ－ＣＴＬ群がヒストグラムの最初のカラムに示された初期細胞集団から増殖し、わずか１５０００個／ｃｍ2の表面密度から４．０×１０6個／ｃｍ2の表面密度まで１４日間にわたって変化した。また、第３の細胞型の添加とは対照的に、ＬＣＬ群の増大により同様の好ましい結果が得られたことを実証した。細胞集団が十分な数のフィーダー及び／又は抗原特異的細胞を包含する際に、成長を開始するために非常に低い目的細胞群を使用することができることを実証するために、ＬＣＬ又はＫ５６２に使用される高い表面密度を任意に選択した。フィーダー細胞が供給不足であったり、その費用が高かったり、又は調製するのが煩雑である場合、それらの表面密度を０．５×１０6個／ｃｍ2未満に低減することが推奨される。一般に、及び実証してきたように、抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞が細胞集団中に存在する場合、抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞及び目的細胞の付加的な表面密度は、目的細胞群の増殖を開始するのに十分な細胞集団における表面密度を生み出すために、好ましくは少なくとも約０．１２５×１０6個／ｃｍ2であるべきである。また、標準的な表面密度の限界を超える継続増殖を達成するために、本実施例では、４ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：表面積比と共に気体透過性材料からなる生育面を使用した。
【0064】
実施例８：目的細胞の表面密度を低減し、応答細胞：刺激細胞比を改変し、培地：生育面面積比を増大させ、かつ、気体透過性材料からなる生育面上へ表面密度の低い培養で細胞を周期的に分配することによって、他の方法と比べて、より短い時間でより多くの目的細胞が生産可能となり、生産プロセスが簡略化される。
【0065】
目的細胞の生産を簡略化・短期化する能力を更に評価するために、Ｇ－Ｒｅｘ試験器具を使用してＥＢＶ－ＣＴＬの開始及び増殖を行った。本実施例では、Ｇ－Ｒｅｘ５００は、図６に記載されるような器具を指すが、底部が１００ｃｍ2の生育面面積からなり、使用可能な培地容量が５００ｍｌであることを除外する。
【0066】
ＥＢＶ－ＣＴＬ生産の初期段階として、Ｇ－Ｒｅｘ４０内に表面密度１×１０6／ｃｍ2（合計＝Ｇ－Ｒｅｘ４０の生育面面積１０ｃｍ2に分配された１０7個のＰＢＭＣ）でＰＢＭＣを播種し、ＰＢＭＣ：ＥＢＶ－ＬＣＬ比４０：１にてＥＢＶ－ＬＣＬでそれらを刺激した。ＣＴＬの生産にとって、応答Ｔ細胞の抗原特異性を維持するために、この４０：１の比が１回目の刺激においては好ましい。初期培養段階の後、９日目に第２段階を開始した。ここでは、１×１０7個の応答Ｔ細胞をＧ－Ｒｅｘ４０からＧ－Ｒｅｘ５００試験器具へと移した。第２培養段階を開始するために、２００ｍＬのＣＴＬ培地をＧ－Ｒｅｘ５００内に置くと、第２段階開始時の培地容量：表面積比は２ｍｌ／ｃｍ2となり、培地の高さは生育面の領域よりも２．０ｃｍ高くなった。第２段階開始時の目的細胞の表面密度は、ＣＴＬ１×１０5個／ｃｍ2であり、抗原提示細胞の表面密度はＬＣＬ５×１０5個／ｃｍ2であるため、目的細胞：抗原提示細胞比は従来とは異なる１：５であった。この第２段階の細胞表面密度及びＲ：Ｓ比は、スクリーニングした全てのドナーにおいて一貫したＥＢＶ－ＣＴＬ増殖を生じた。４日後（１３日目）、ＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ－最終濃度）を培養物に直接添加し、同様に２００ｍｌの新鮮培地を添加すると、培地容量：表面積比は４ｍｌ／ｃｍ2となった。１６日目、細胞を回収して計測した。得られたＣＴＬの表面密度中央値は、１ｃｍ2当たり６．５×１０6（２．４×１０6～３．５×１０7の範囲）であった。
【0067】
気体透過性材料からなる生育面を使用することにより、従来のプロトコールと比較して、培地容量：表面積比の増大（すなわち、１ｍｌ／ｃｍ2よりも大きい）、細胞表面密度の低下（つまり、０．５×１０6／ｃｍ2未満）及び応答細胞：刺激細胞比の改変（４：１未満）が可能となり、生産時間が短縮される。図１０Ａは、実施例８の当該Ｇ－Ｒｅｘ手法と、実施例１の従来方法の使用及び実施例５に記載されるＧ－Ｒｅｘ手法との比較を示している。示すように、従来方法は、いずれのＧ－Ｒｅｘ法においても約１０日で付与することができるのと同数の目的細胞を付与するのに２３日を要した。２３日後、実施例８のＧ－Ｒｅｘ手法は、実施例５のＧ－Ｒｅｘ法よりも２３．７倍多い目的細胞を生産することができ、そして、実施例１の従来方法よりも６８．４倍多い目的細胞を生産することができた。更に、細胞表面密度が７×１０6／ｃｍ2を超えたときに培養物を分割したところ、目的細胞は、更なる抗原提示細胞刺激を必要とすることなく２７～３０日目まで分裂し続けた。
【0068】
光学顕微鏡を用いてＧ－Ｒｅｘ中のＣＴＬを明確に見ることはできなかったが、ＣＴＬクラスターは目で又は倒立顕微鏡によって見ることができた。培養の９、１６及び２３日目の細胞の外観を図１０Ｂに示す。図１０Ｃに示すように、Ｇ－Ｒｅｘにおける培養は、増殖された細胞の表現型を変化させず、細胞集団の９０％超過がＣＤ３＋細胞であり（Ｇ－Ｒｅｘ対２４ウェルが９６．７±１．７対９２．８±５．６）、これらは主にＣＤ８＋であった（６２．２％±３８．３対７５％±２１．７）。活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ２７並びに記憶マーカーＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌの評価により、各培養条件下で増殖したＥＢＶ－ＣＴＬ間に実質的な差異はないことが実証された。ＥＬＩｓｐｏｔ及び五量体分析により測定したところ、抗原特異性も培養条件には影響されなかった。図１０Ｄは、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＢＺＬＦ１及びＥＢＮＡ１由来のＥＢＶペプチドエピトープで刺激され、ＨＬＡ－Ａ２－ＬＭＰ２ペプチド五量体染色で染色されたＴ細胞がペプチド特異的Ｔ細胞と同様の頻度を示す代表的な培養を示している。更に、図１０Ｅに示すように、51Ｃｒ放出アッセイにより評価すると、増殖した細胞は、それらの細胞溶解活性及び特異性を維持し、自己ＥＢＶ－ＬＣＬを死滅させ（Ｇ－Ｒｅｘ対２４ウェルプレートが、Ｅ：Ｔ比２０：１で６２％±１２対５７％±８）、ＨＬＡ不適合ＥＢＶ－ＬＣＬの死滅は少なかった（２０：１の比で、１５％±５対１２％±７）。
【0069】
細胞療法のための改良型細胞生産のための様々な新規方法についての検討：生産サイクルの開始時における目的細胞群の表面密度の低下、応答細胞と刺激細胞との間の表面密度比の低下、気体透過性材料からなる生育面及び／又は培地容量：生育面面積比の増大などの様々な条件を用いて、どのようにして細胞療法の研究及び臨床応用のための細胞の生産を促進し簡略化することができるかを当業者に実証するために実施例１～８を提示してきた。実施例１～８は抗原特異的Ｔ細胞の生産に関するものであるが、これらの新規培養条件は、臨床的関連性のある（又は概念マウスモデルの前臨床証拠に必要とされる）多くの重要な浮遊細胞型、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、初代Ｔリンパ球、広範な抗原特異的細胞及びその他多くのもの（これらは全て、機能、生体内での残留性又は安全性を向上させるために遺伝子改変することもできる）に適用可能である。細胞は、フィーダー細胞及び／又は抗原提示細胞を用いて増殖させることができるが、これらの細胞は、ＰＢＭＣ、ＰＨＡ ｂｌａｓｔ、ＯＫＴ３ Ｔ、Ｂ ｂｌａｓｔ、ＬＣＬ及びＫ５６２（天然又は発現するように遺伝子改変されており、抗原及び／又はエピトープ、並びに４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ及びその他多くのものなどの共刺激分子）を包含することができ、これらはペプチド及び／又は関連する抗原でパルスする場合もあれば、しない場合もある。
【0070】
従来とは異なる低い初期表面密度：本発明の一態様は、より低い目的細胞表面密度によって、従来方法と比べて生産時間を短縮できるという発見である。このように、目的細胞は、従来方法が許容するよりも、最大細胞表面密度と最小細胞表面密度との間に大きな差を有することができる。目的細胞群の成長速度は低下し始めたが、目的細胞の量がまだ生産を終了するには十分でない場合、気体透過性材料からなる追加の生育面上に再び低い出発表面密度で目的細胞を再分配するのが好ましい。
【0071】
任意の所与の培養段階の開始時に、より低い表面密度に依存する新規の細胞生産方法がどのように適用可能であるのかを説明するために、ここで一例を記載する。図１１は、本発明の一態様を用いた目的細胞型の個体数増殖と比較した、従来のシナリオに基づく生育面上での目的細胞群の増殖に関するグラフ表示を示している。この新規方法において、生産段階開始時の目的細胞の表面密度は、従来の表面密度より小さい。この新規方法の利点に焦点を合わせるために、本説明では、目的細胞群を最初に得るプロセスについては触れない。当業者がこの新規方法の相対的な時間の利点をより確認しやすいように、培養「日（Ｄａｙ）」は「０」から始まる。本実施例において、従来方法の各生産サイクルは、従来の目的細胞の表面密度０．５×１０6個／ｃｍ2で始まるが、本実施例の各生産サイクルは、従来と異なるはるかに低い目的細胞の表面密度０．１２５×１０6個／ｃｍ2で始まる。よって、本実施例においては、従来方法が要する表面積よりも４倍大きい表面積（すなわち、５０００００／１２５０００）が、培養を開始するのに必要となる。本実施例において、従来方法の目的細胞は１４日で最大表面密度２×１０6個／ｃｍ2に達する。よって、１ｃｍ2の成長面積は２×１０6個／ｃｍ2を付与し、それらの細胞は次いで４ｃｍ2の成長面積上に再分配されて、従来の出発密度０．５×１０6個／ｃｍ2（すなわち、４ｃｍ2×０．５×１０6細胞＝２×１０6細胞）を用いて生産を継続することができる。このサイクルを更に１４日間繰り返し、その時点で再び最大細胞表面密度に到達し、４ｃｍ2の生育面面積の各々が２．０×１０6細胞、つまり、合計で８．０×１０6細胞を付与し、次いでそれら細胞を１６ｃｍ2の成長面積上に分配し、成長サイクルを繰り返して４２日間で合計３２×１０6細胞が付与される。
【0072】
図１１に示す新規方法は、生産開始時に１ｃｍ2上に５０００００個の目的細胞を堆積させる従来方法を使用する代わりに、４ｃｍ2の成長面積上に５０００００個の細胞を等しく分配して、０日目に目的細胞１２５０００個／ｃｍ2の従来とは異なる低い出発表面密度を生み出す。例において、新規方法は、従来方法と同様、まさに７日目に低下し始める成長速度を有する。新規方法における細胞は、表面密度が１×１０6個／ｃｍ2である。よって、成長速度が低下し始めた時点で、この培養段階は４×１０6細胞を生じ、次いでそれらの細胞が３２ｃｍ2の成長面積上に再分配されることにより、出発表面密度０．１２５×１０6個／ｃｍ2（すなわち、３２ｃｍ2×０．１２５×１０6細胞＝４×１０6細胞）を用いて段階２における生産を継続することができる。生産サイクル又は段階を更に７日間、１４日目まで繰り返し、その時点で、１．０×１０6個の目的細胞を含有する３２ｃｍ2の各生育面面積により再び細胞表面密度が最大に達し、わずか１４日間で合計３２×１０6個の細胞を生じる。留意すべきは、従来方法と同様、各生産サイクルの終了時に、新規方法がどのようにして最終表面密度を出発表面密度で除した倍数を付与するのかということである。しかしながら、細胞が成長生産に入る前に出発細胞表面密度を低減し、かつ、各生産段階を終えることによって、時間が劇的に短縮される。本実施例では、目的細胞表面密度を低減する（この場合には、０．１２５×１０6個／ｃｍ2まで）ことによって、従来の細胞表面密度と比べて、従来方法でかかる時間のわずか３３％（１４日対４２日）で同量の目的細胞がどのようにして付与されるかについて記載している。
【0073】
０．１２５×１０6個／ｃｍ2の出発表面密度を用いて利点を定量化したが、当業者は、本発明のこの例が、従来の細胞表面密度を下回る任意の減少により生産時間が短縮されることを実証することに気付くはずである。更に、当業者は、本明細書に提示された本方法及びその他の新規の方法に記載される細胞成長速度及び細胞成長の低下が起きる時点は、例証目的のためにのみ記載され、実際の比率は培地の組成、細胞型などの広範な条件に基づく各用途において様々であることを認識するであろう。更に、当業者は、本発明の本態様の利点が、任意の特定の用途において細胞表面密度を従来の細胞表面密度よりも低くすることから生じる生産時間の短縮であり、本例示的実施例において使用される特定の従来の表面密度は用途ごとに異なる場合があることを、所与の用途のために認識するであろう。
【0074】
したがって、低減された細胞表面密度を使用することによって細胞集団中に存在する所与量の目的細胞の生産時間を最小にする要望がある場合の本発明の方法の一態様についてここで説明する。目的細胞は、以下を満たすように、従来とは異なる低い細胞表面密度で生育面上に堆積されるべきである：
ａ．目的細胞は、抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞の存在下、生育面が気体透過性材料からなるものではない場合には最大で１ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：表面積比であり、生育面が気体透過性材料からなる場合には最大で２ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：表面積比であり、
ｂ．生産サイクル開始時の好ましい表面密度条件は、標的細胞表面密度が好ましくは０．５×１０6個／ｃｍ2未満であり、より好ましくは図４に記載されるように低下しており、
ｃ．目的細胞の表面密度＋抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞の表面密度は、好ましくは少なくとも約１．２５×１０5個／ｃｍ2である。
ａ．目的細胞は、抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞の存在下、生育面が気体透過性材料からなるものではない場合には最大で１ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：表面積比であり、生育面が気体透過性材料からなる場合には最大で２ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：表面積比であり、
ｂ．生産サイクル開始時の好ましい表面密度条件は、標的細胞表面密度が好ましくは０．５×１０6個／ｃｍ2未満であり、より好ましくは図４に記載されるように低下しており、
ｃ．目的細胞の表面密度＋抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞の表面密度は、好ましくは少なくとも約１．２５×１０5個／ｃｍ2である。
【0075】
抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞の表面密度を１．２５×１０5個／ｃｍ2よりも更に低くしようとする場合、目的細胞群の増殖が限定的にならないことを、上記実施例に基づき立証するのが良い。抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞を十分に供給することによって増大させるとき、従来とは異なる低い密度で目的細胞群の成長が達成可能であることを実証するという目的に基づき、１．２５×１０5個／ｃｍ2を選択した。
【0076】
気体透過性材料からなる生育面及びより高い培地容量：生育面面積比の使用により生産が簡略化かつ短縮され得る。本発明の別の態様は、気体透過性材料からなる生育面及び従来の比率を超える培地容量：生育面面積比を使用し、かつ、生育面面積の使用量を経時的に増大させる生産サイクルを繰り返すことによって生産時間が短縮されるという発見である。
【0077】
ここで、これらの条件が、生産時間をどのように短縮し得るのかを示す例示的実施例を提示する。図１２は、気体透過性材料からなる生育面と、１又は２ｍｌ／ｃｍ2を超える従来とは異なる高い培地容量：生育面面積比を利用することによって得られる利点の一例を示すために考察を補強するものである。以下の考察は、このような方法を用いることによって、生産時間の短縮、生育面面積の使用量の低減並びに／又は労力及び汚染リスクの低減を含む幾つかの選択肢がどのように利用可能であるかを当業者に実証することを意図している。当業者は、図１２及び関連する考察が単なる例であり、本発明の範囲を限定するものではないことを認識するであろう。
【0078】
本例示的実施例における目的細胞群を含有する細胞集団は、「Ｘ」時間当たり約１ｍｌ消費するものと考える。図１２は、「従来方法」及び「新規方法」と名付けられた２つの生産プロセスを示している。成長開始時、各プロセスは０．５×１０6／ｃｍ2の表面密度の目的細胞から始まる。しかしながら、新規方法の生育面は気体透過性材料からなり、また、その培地容量：表面積比は、従来方法が１ｍｌ／ｃｍ2であるのに対して、２ｍｌ／ｃｍ2である。時間「Ｘ」において、従来方法の目的細胞群は２×１０6／ｃｍ2の表面密度プラトーに達して栄養素を枯渇させるが、新規方法の追加の培地容量は成長を継続させ、目的細胞表面密度は３×１０6／ｃｍ2となる。新規方法が継続する場合、４×１０6／ｃｍ2の表面密度に達する。よって、多くの有利な選択肢が生じる。新規方法は、従来方法よりも多くの細胞を生産して時間「Ｘ」の前に終了してもよく、従来方法の約１．５倍の細胞を生産して時間「Ｘ」で終了してもよく、又は、２倍の時間がかかるが、供給用の器具を操作する必要がなく、従来方法の２倍の目的細胞を生産して、栄養素が枯渇するまで継続してもよい。従来方法が同数の細胞を収集するためには、細胞を回収しなければならず、プロセスを再開すると、労力及び起こり得る汚染リスクが加わる。細胞療法の用途は典型的には一定数の細胞を用いないと始めることができないので、従来方法では、生産開始時に単純に表面積を増大させるという選択肢は許容されない。
【0079】
図１３は、２回以上の生産サイクルがどのように更に有利であり得るかを示すために図１２の例を継続する。図１３は、本発明の１つの新規方法により目的細胞型の個体群を増殖した場合と比較した、従来方法による生育面上での目的細胞群の増殖に関するグラフ表示を示しており、新規方法の表面密度は従来方法の表面密度よりも高い。本実施形態に焦点を合わせるために、本説明では、目的細胞群を得るプロセスについては触れない。当業者が本発明の当該態様の相対的な時間の利点をより確認しやすいように、培養「日」は「０」から始まる。本実施例では、「０日目」に従来の目的細胞表面密度０．５×１０5個／ｃｍ2を使用して両培養を開始する。本例示的実施例は、従来方法の生育面も気体透過性材料からなる。しかしながら、従来方法の培地容量：生育面比は、新規方法の４ｍｌ／ｃｍ2に対して、１ｍｌ／ｃｍ2である。図１３に示すように、従来方法の目的細胞群は、表面密度が約４日間で約１．５×１０6個／ｃｍ2のときに成長速度が低下し始め、１４日間で最大表面密度２×１０6個／ｃｍ2に達する。その時点で、目的細胞群は、１．０ｍｌ／ｃｍ2の新鮮培地において０．５×１０6／ｃｍ2の表面密度で４ｃｍ2の成長面積に分配され、生産サイクルが再び始まり、更に１４日間で表面密度２×１０6個／ｃｍ2に達し、２８日間で８×１０6の目的細胞を付与する。比較すると、新規方法の目的細胞群は、およそ約１０～１１日間で表面密度が約３．６×１０6個／ｃｍ2のときに成長速度が低下し始め、２８日間で最大表面密度４×１０6個／ｃｍ2に達することができた。しかしながら、生産を加速するために、目的細胞群の成長速度がまだ高いうちにサイクルを終了する。よって、約１０～１１日間で、３×１０6の細胞が、４．０ｍｌ／ｃｍ2の新鮮培地中に０．５×１０6／ｃｍ2の表面密度で６ｃｍ2の成長面積に再分配され、生産サイクルが再び始まり、目的細胞群は、更におよそ１０～１１日間で表面密度が約３×１０6個／ｃｍ2となり、およそ２１日で１８×１０6の目的細胞を付与する。よって、新規方法は、従来方法と比べて約７５％の時間で２倍を超える数の目的細胞を生産した。
【0080】
気体透過性材料からなる生育面上に１０×１０6個／ｃｍ2を超える細胞表面密度を得ることができた。このことは、本発明の高表面密度の態様の使用が、本実施例に記載される密度に限定されないことを実証する。
【0081】
したがって、低減された細胞表面密度を使用することによって、細胞集団中に存在する所与量の目的細胞を生産するための時間を最小にする要望がある場合の、本発明の方法の別の例を以下に記載する：
ａ．抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞の存在下で、少なくとも２ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：表面積比で、気体透過性材料からなる生育面面積上に目的細胞を播種すること、
ｂ．標的細胞表面密度が約０．５×１０6個／ｃｍ2の従来密度以内になるような好ましい表面密度条件を生産サイクル開始時に確立すること、
ｃ．従来の表面密度約２×１０6個／ｃｍ2を超えて目的細胞群が増殖することができるようにすること、及び
ｄ．より多くの目的細胞が求められる場合には、気体透過性材料からなる追加の生育面に目的細胞を再分配し、十分な目的細胞が得られるまで工程ａ～ｄを繰り返すこと。
ａ．抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞の存在下で、少なくとも２ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：表面積比で、気体透過性材料からなる生育面面積上に目的細胞を播種すること、
ｂ．標的細胞表面密度が約０．５×１０6個／ｃｍ2の従来密度以内になるような好ましい表面密度条件を生産サイクル開始時に確立すること、
ｃ．従来の表面密度約２×１０6個／ｃｍ2を超えて目的細胞群が増殖することができるようにすること、及び
ｄ．より多くの目的細胞が求められる場合には、気体透過性材料からなる追加の生育面に目的細胞を再分配し、十分な目的細胞が得られるまで工程ａ～ｄを繰り返すこと。
【0082】
これら新規方法を用いると、以下の培養を開始する属性を組み合わせることによって更なる利点を達成することができる。すなわち、従来とは異なる低表面積を使用すること、目的細胞及び／又はフィーダー細胞の新規表面密度比を使用すること、気体透過性材料からなる生育面面積を利用すること、従来とは異なる高い培地容量：生育面面積比を利用すること、及びサイクルで生産を行うことである。当該条件は、生産時間の短縮、表面積の利用、供給頻度などのバランスを取るなど、目的の結果を達成するべく任意の生産サイクルで変更可能である。
【0083】
図１４は、従来方法と比べて更なる利点が得られる別の新規方法を示している。当業者は、本明細書に記載する他の例示的実施形態と同様、本明細書の記載が本発明の範囲を限定せず、代わりに、生産効率の向上という利点を得るための方法について説明する役割を果たすことを認識するであろう。
【0084】
本実施例では、目的細胞は、従来の条件下では毎週倍増している。当業者がこの実施形態の相対的な時間の利点を確認しやすいように、培養「日（Ｄａｙ）」は「０」から始まる。また、本実施例を簡略化するために、フィーダー及び／又は抗原提示細胞表面密度比に関して先に記載した事項は繰り返さない。例証のために、生産の「０日目」には、従来の条件において７日間の倍増時間で５０００００個の出発目的細胞群が存在すると仮定する。従来方法は、０．５×１０6個／ｃｍ2の表面密度及び１ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：表面積比から始まる。示すように、目的細胞群が表面密度２×１０6個／ｃｍ2に達すると、細胞を０．５×１０6個／ｃｍ2の表面密度で追加の表面域上に分配し、生産サイクルを新たに始める。本実施例の新規方法は、０．０６×１０6個／ｃｍ2の表面密度、気体透過性材料からなる生育面域及び６ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：表面積比から始まる。図示したように、当該個体群が成長プラトーの開始に近づくと、細胞をより多くの生育面域に再分配する。この場合、従来方法では、細胞表面密度が培地容量：表面積比の１．５倍に近づく（すなわち、１．５×１０6個／ｍｌ）とプラトーが開始されることから、当該個体群はプラトーに達していると判定する。よって、約９日目に、約４．５×１０6個／ｃｍ2の表面密度で細胞を３６ｃｍ2の生育面域上に分配し、生産サイクルを新たに始める。
【0085】
図１５は、図１４に示した各生産方法の比較を表にし、新規方法の力、及びその効果を十分に得るために様々な段階で生産プロトコールを調節するのが賢明である理由を実証するべく段階に増殖する。新規方法は、生産サイクルのわずか第２段階が完了しただけで従来方法を圧倒し、たった半分ほどの時間でわずか６１％の必要表面積でほぼ１．３７倍多くの細胞を付与することに留意すべきである。しかしながら、生産サイクルの第３段階において、どのようにして細胞が量的に増大し、相当して表面積も増大するのかにも留意すべきである。よって、任意の所与プロセスに最適な効果レベルを達成するために、プロセスの各サイクル全体での、初期の細胞表面密度及び／又は最終の細胞表面密度の調節方法を予測するために、生産サイクルをモデル化すべきである。
【0086】
一例として、図１６は、生産が進行するにつれ効率を獲得するために、新規方法においてどのように可変量を変更することができるのかという例を示している。例えば、サイクル３の出発表面密度は０．０６から０．７０個／ｃｍ2へと増大し、最終表面密度は４．５から７．５個／ｃｍ2へと変化し得る。最終表面密度の増大は、培地容量：表面積比が最初の６ｍｌ／ｃｍ2よりも大きな数となるということである。培地容量：表面積比が大きくなるにつれ、サイクルが急速な成長相（すなわち、横ばい区間の前の個体群増殖）にとどまる時間が長くなる。この場合、更に５日かけて急速成長相を完了させて、培地容量：表面積比を約８ｍｌ／ｃｍ2に増大させた。そうすることによって、本実施例では、３４日間で妥当な表面積にて３兆を超える細胞を生産することができる。例えば、器具を作製し、気体透過性材料からなる約６２５ｃｍ2の生育面で試験した。これは明らかに、従来方法よりも優れた細胞生産手法である。
【0087】
よって、低減された細胞表面密度を使用することによって細胞集団中に存在する所与量の目的細胞を生産するための時間を最小にする要望がある場合の、本発明の方法の別の好ましい実施形態をここで説明する：
ａ．抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞の存在下で、少なくとも２ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：表面積比で、気体透過性材料からなる生育面面積上に目的細胞を播種すること、
ｂ．標的細胞表面密度が従来の密度未満、好ましくは目的細胞約０．５×１０6個／ｃｍ2～約３９００個／ｃｍ2の範囲内であり、かつ、目的細胞及び抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞の合計が少なくとも約１．２５×１０5個／ｃｍ2であるような好ましい表面密度条件を生産サイクル開始時に確立すること、
ｃ．約２×１０6個／ｃｍ2の従来の表面密度を超えて目的細胞群が増殖することを可能にすること、
ｄ．より多くの目的細胞が求められる場合には、気体透過性材料からなる追加の生育面に目的細胞を再分配し、十分な目的細胞が得られるまで工程ａ～ｄを繰り返すこと。
ａ．抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞の存在下で、少なくとも２ｍｌ／ｃｍ2の培地容量：表面積比で、気体透過性材料からなる生育面面積上に目的細胞を播種すること、
ｂ．標的細胞表面密度が従来の密度未満、好ましくは目的細胞約０．５×１０6個／ｃｍ2～約３９００個／ｃｍ2の範囲内であり、かつ、目的細胞及び抗原提示細胞及び／又はフィーダー細胞の合計が少なくとも約１．２５×１０5個／ｃｍ2であるような好ましい表面密度条件を生産サイクル開始時に確立すること、
ｃ．約２×１０6個／ｃｍ2の従来の表面密度を超えて目的細胞群が増殖することを可能にすること、
ｄ．より多くの目的細胞が求められる場合には、気体透過性材料からなる追加の生育面に目的細胞を再分配し、十分な目的細胞が得られるまで工程ａ～ｄを繰り返すこと。
【0088】
本発明の開示は、Ｔビヒクルと呼ばれる新規クラスの治療用細胞を作成することによって養子細胞療法の分野を前進させる。Ｔビヒクルは、ＧＶＨＤの固有のリスクを持たないＴ細胞群からなり、更に治療のために作用することができる１以上の治療属性を包含するように更に改変され、治療的利点をレシピエントに与える。ＴビヒクルはＧＶＨＤ疾患を引き起こす天然の能力を持たないため、広範な病状及び疾患と闘うことができる任意数の対抗手段を備える理想的な生物学的輸送ビヒクルとなる。本発明は、最先端の方法に存在するＧＶＨＤの固有のリスクを有することなく養子細胞療法の健康上の利点をレシピエントに付与するために、治療属性を備えたＴビヒクルを生産かつ使用する方法を開示する。重要なことに、Ｔビヒクルの治療目的は天然のＴ細胞受容体の抗原特異性とは全く無関係であるため、Ｔビヒクルは最先端の養子細胞療法とは逆に機能する。当業者は、本開示や提示された例示的実施形態の全体を通して、Ｔビヒクルの治療属性にはＴビヒクルの天然抗原受容体が含まれないことを認識すべきである。
【0089】
Ｔビヒクルは、ドナーＰＢＭＣ又はドナー臍帯血を抗原で刺激して、抗原に対する天然抗原特異性を有するドナーＴ細胞の成長を活性化させ、それにより抗原に対する抗原特異性を有する抗原受容体を含む抗原特異的Ｔ細胞群を生産することによって生産される。正常細胞上には存在しない抗原を選択することによって、正常細胞を認識できない抗原受容体を有するＴ細胞群を作成することができる。天然Ｔ細胞の抗原特異性から得られるであろう治療的利点を無視し、天然の抗原受容体認識能力を包含しない、１以上の治療属性を有する天然Ｔ細胞を改変することによって、それらの抗原特異的認識とは無関係の目的を有し、かつ、ＧＶＨＤを本質的に引き起こす傾向がない又は引き起こすことができないＴビヒクル群を作成することができる。
【0090】
Ｔビヒクルは２以上の天然抗原特異的Ｔ細胞群を包含し得るが、Ｔビヒクルはその治療目的のためにそれらの天然抗原特異性に依存していないため、Ｔビヒクルはレシピエントの血清型がＴビヒクルの１以上の天然抗原受容体に対して陽性適合を呈するか否かに関係なく、レシピエントに注入することができる。また、Ｔビヒクルが得られる１以上の天然Ｔ細胞群はＧＶＨＤの固有のリスクを持たないため、Ｔビヒクルの重要な属性としては、ＨＬＡ不適合の場において使用されるそれらの能力が挙げられる。これは、最先端の方法で必要とされるＨＬＡ適合の制限なく、広範な社会に役立ち得るＴビヒクルの同種バンクを確立させることができる。Ｔビヒクルがレシピエントに対してＨＬＡ不適合である天然の抗原特異性を有する場合、Ｔビヒクルの天然Ｔ細胞受容体は、レシピエントの細胞を認識し、ＧＶＨＤ引き起こすことができない。にもかかわらず、Ｔビヒクルは、その治療目的を達成するために天然抗原受容体に依存しない治療属性を有するように改変されているため、完全にＨＬＡ不適合の場においてそれらの治療活性を開始する。しかしながら、ＴビヒクルはＨＬＡ不適合の場での使用に限定されない。通常細胞では発現しない抗原に対する高度に制限された抗原特異性を伴う天然抗原受容体を有するＴ細胞からなるＴビヒクルを作成することによって、レシピエントとＴビヒクルの天然抗原特異性との間の部分的なＨＬＡ適合にもかかわらず、ＧＶＨＤ疾患の発症を回避することができる。ＴビヒクルをＨＬＡ適合又はＨＬＡ不適合の場で使用させるためには、Ｔビヒクルの天然抗原特異性が、通常細胞好ましくは通常のヒト細胞には存在しない抗原をＴビヒクルに認識させることが好ましく、通常の哺乳類細胞には存在しない抗原の単一エピトープのみを認識できることが更により好ましい。
【0091】
Ｔビヒクルがレシピエントに対してＨＬＡ不適合である場合、レシピエントは、最終的にはＴビヒクルを排除することになる激しい免疫応答を開始すると予想される。故に、１以上の追加のＴビヒクル用量を付与することによって、Ｔビヒクルの治療目的を継続することができる。このプロセスは、所望の治療目的を得るために、必要に応じて継続することができる。好ましい方法において、Ｔビヒクルの各用量はＨＬＡの点で異なるため、患者の免疫系は、Ｔビヒクルの新たな用量を攻撃しようとするたびに、それ自体準備し直さなければならず、それにより、Ｔビヒクルの各用量の間隔をおおよそ等しく保つ。
【0092】
高度に制限された抗原特異性を有する天然抗原受容体を有するＴ細胞を生産する方法：歴史的に見て、養子細胞療法での広範な使用に必要なスケールでＴ細胞群を生産することは実際には不可能であった。Ｔ細胞群を好ましいサイズの治療用量へと増殖するための最先端の生産方法はあまりに実用的ではなく扱いにくいため、少数の非常に専門的な機関で扱わねばならない極めて小さな個体群に細胞療法を限定する。Ｔビヒクルの基本的な属性は、それらの天然Ｔ細胞の特性が本質的にはレシピエントをＧＶＨＤに暴露しないということである。Ｔビヒクルの天然抗原特異性は正常細胞、より好ましくは正常なヒト細胞には存在しない抗原をそれらに認識させるだけであるのが好ましく、正常な哺乳類細胞には存在しない抗原の単一エピトープのみを認識できるのが更により好ましいため、これら細胞の効果的な生産は、Ｔビヒクルを包含する方法の広範な使用の基礎となる。このようなＴ細胞は、ドナーＰＢＭＣ又は臍帯血中に非常に低い、時に検出不能な頻度で存在するにすぎない。よって、最先端のＴ細胞生産方法に固有の問題は、Ｔビヒクルでの使用に最も適するＴ細胞群を生成しようとすると悪化する。
【0093】
我々は、２０１２年５月１８日に「養子細胞療法のための改良型細胞培養方法」という名称で出願された米国特許出願第１３／４７５７００号（以下、Ｖｅｒａ’７００と呼ぶ）（参照により本明細書に援用する）に記載されるような方法及び器具を発見した。これは、最先端の方法と相反し、本質的にレシピエントをＧＶＨＤに暴露しない天然の特性を有するＴ細胞を効率的に生産するものである。そのように行う際、ドナーＰＢＭＣ又は臍帯血中に低頻度で見られるＴ細胞の実用的な生産に必要な長い期間が満たされる。更に、Ｔ細胞の天然抗原特異性に固有ではない治療属性を所有するＴ細胞の新規概念と組み合わせたとき、生物学的担体として機能するＴビヒクルの生産が可能になり、実用的になる。
【0094】
１つの例示的方法において、培養開始時に、２以上の選択された抗原が、２以上の独特の抗原特異的Ｔ細胞群（各群は提示される抗原の１つに対する抗原受容体を発現する）の成長を刺激するために、ＰＢＭＣ又は臍帯血（すなわち、抗原特異的Ｔ細胞の元来の貯蔵場）に提示される。その意図は、生産のために最も豊富及び／又は望ましい天然Ｔ細胞群を後に選択して、その他のものを終結させることである。開始後に培養が進行するにつれ、様々な抗原に反応する様々なＴ細胞群は、それらの元の個体群の大きさに応じて、様々な個体数増殖レベルを呈する可能性がある。更に、それらの一部又は全ては検出不能であり続ける場合がある。しばらくしたら、選択された抗原のいずれかに反応するＴ細胞群の許容可能な成長に関して培養を評価する。このような評価は、１つの抗原に特異的なたった１つの個体群又は更なる抗原に特異的な更なる個体群に関するものである可能性がある。１つの抗原特異的Ｔ細胞群が許容可能な増殖を実証しているとき、それが認識する抗原を器具内に加えるだけで当該特定のＴ細胞群を再刺激して残りのＴ細胞を最終的に死滅させ、一方で、特定の目的のＴ細胞群は増殖し続ける。しかしながら、２以上のＴ細胞群が許容可能な増殖を実証しているときには２つの選択肢がある：１）培養物を、特定のＴ細胞群が反応している抗原のみで再刺激することができる（それによって、豊富ではないＴ細胞群の増殖を終結させる）、又は２）培養物を２つ以上の培養器具に分ける。各器具は他の全ての器具の抗原とは異なる単一の抗原を受容してたった１つのＴ細胞群を各器具内で増殖させ、最も豊富な培養物以外は全て最終的に終結される。好ましくは、全ての培養器具は気体透過性であり、同時係属米国特許公開公報２００５／０１０６７１７Ａ１（Ｗｉｌｓｏｎら）（以下、Ｗｉｌｓｏｎ‘７１７と呼ぶ）及び２００８／０２２７１７６Ａ１（Ｗｉｌｓｏｎら）（以下、Ｗｉｌｓｏｎ‘１７６と呼ぶ）（これらはいずれも参照により本明細書に援用する）に記載され、Ｖｅｒａ‘７００の方法に依拠する種類である。
【0095】
更なる例により、培養器具内に存在するＰＢＭＣ群は、抗原Ａ、抗原Ｂ及び抗原Ｃを提示することができる。しばらくすると、抗原Ａ、Ｂ又はＣに反応性である個体群の存在及び／又は増殖に関して培養物を評価することができる。抗原Ａに反応性の抗原特異的群が、許容可能な頻度及び／又は個体数増殖を呈さない唯一の個体群である場合、抗原Ｂ及び抗原Ｃのみで再刺激することによってその個体群を終結させることができる。あるいは、抗原Ｂ及び抗原Ｃに反応性の抗原特異的群がほぼ等しく増殖しているが、いずれが最良の比率で増殖し続けるか不明である場合、最終的に１つの器具での生産を続け、他方の器具の生産は終結することを意図して、培養物を２つの器具に分けることができる。第１の器具は抗原Ｂを受容し、第２の器具は抗原Ｃを受容する。抗原Ｂに対する抗原特異性を呈するＴ細胞が第１器具内で増殖するが、抗原Ｃに対する抗原特異性を呈するＴ細胞は最終的には絶滅する。第２器具内では反対のことが起こる。やがて第１及び第２器具内での培養開始後のある時点で、目的のＴ細胞群の増殖が最も効率的でない培養物を終結させる目的で、頻度及び／又は個体群サイズの検討が開始され得る。当業者は、培養開始時にたった１つの抗原ではなく複数の抗原を用いることの主要な利点は、好適な抗原特異性及び成長速度を有するＴ細胞群を見つける可能性を増やすことであると認識すべきである。更に、１つの抗原を伴う複数の器具の代わりに１つの器具において複数の抗原を使用することにより、ＰＢＭＣ又は臍帯血、培地、サイトカイン、実験室スペース、労力及び生体有害廃棄スペースがより効率的に使用される。
【0096】
Ｔビヒクルの好ましい天然抗原特異性の選択についてここで説明する：Ｔビヒクルの天然抗原特異性のみが正常細胞、より好ましくは正常なヒト細胞には存在しない抗原をそれらに認識させるのが好ましく、正常な哺乳類細胞には存在しない抗原の単一エピトープのみを認識できるのが更により好ましいが、これは非限定的であり、当業者が考慮すべき天然抗原受容体の多くの好適な属性がある。多くの選択肢及び特性が好適である。例として、Ｔビヒクルの天然抗原特異性は、天然抗原特異性を有する２以上のＴ細胞群からなるものであり得る。Ｔビヒクルの天然抗原特異性は、自己又は非自己抗原；爬虫類、両生類、魚類又は鳥類；海綿動物、腔腸動物、蠕虫、節足動物、軟体動物又は棘皮動物などの無脊椎動物；細菌類、真菌類、寄生虫及び海綿動物；アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス（Ａｄｖ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、インフルエンザ、Ｈ１Ｎ１、パラインフルエンザ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、パルボウイルスＢ１９、コロナウイルス、メタニューモウイルス、ボカウイルス又はＫ１ウイルス／ＷＵウイルスなどを含むがこれらに限定されないウイルス；又はサバイビン、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＣＥＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、クローディン－６、サイクリン－Ｂ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ－ＥｒｂＢ２、ヒストンＨ１．２、ヒストンＨ４、マンマグロビン－Ａ、メラン－Ａ／ＭＡＲＴ－１、Ｍｙｃ、ｐ５３、ｒａｓ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｓｏｘ２、ストロメリシン－３、Ｔｒｐ２、ＷＴ１、プロテイナーゼ３、Ｍｕｃ１、αフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ｂｃｒ－ａｂｌ、ｈＴＥＲＴ又は前立腺酸性フォスファターゼ－３の全抗原又は単一エピトープに対するものである可能性がある。
【0097】
ドナー細胞の適切な天然Ｔ細胞群の成長を促進するために、当業者は、米国特許公開公報第２０１１／０１８２８７０Ａ１号（以下、Ｌｅｅｎ‘８７０と呼ぶ）（参照により本明細書に援用する）を精査し、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＰＢＭＣ又は人工抗原提示細胞、例えば改変ｋ５６２（これらはいずれも目的の抗原を提示して天然ドナーＴ細胞群の目的の抗原特異性及び故にＴビヒクルの天然抗原特異性を生じることができる）を使用した刺激；目的の抗原を含有する細胞溶解物、目的の抗原を含有する精製タンパク質、目的の抗原を含有する組換えタンパク質、目的の抗原をコードするプラスミドＤＮＡ、目的の抗原をコードするプラスミドＲＮＡ、及び／若しくは目的の抗原を含有するペプチドライブラリー並びに／又は目的の抗原を含有する１以上の単一合成ペプチドによりドナー細胞において目的の免疫応答を誘導するための抗原の使用についても考慮すべきである。
【0098】
Ｔ細胞群の生産は、好ましくはＶｅｒａ‘７００の方法及び／又は本明細書に提示されるものを用いて開始され、より好ましくはＷｉｌｓｏｎ‘７１７及びＷｉｌｓｏｎ‘１７６に記載される種類の気体透過性培養器具を利用して開始される。当業者は、記載された一連の実施例における多様な方法が各用途の特定の目的に応じて多かれ少なかれ適切であると認識すべきである。例えば、多様な表面密度、培地の高さ、培地容量：生育面面積比などが利用可能であり、同様に、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１２、ＩＬ７、ＩＬ２７、ＩＬ６、ＩＬ１８及び／又はＩＬ４などのサイトカインによる様々な頻度や濃度での刺激、及び抗原提示方法のいずれかと組み合わせたいずれかの抗原供給源を用いた反復的なｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激の使用も可能であり、γ線捕獲、磁気分離、単一細胞クローニング及び／又はフローサイトメトリーなどを含むがこれらに限定されない方法により、細胞を選別して又は選別することなく開始され得る。
【0099】
実施例９：ＣＭＶエピトープＮＬＶを認識する天然Ｔ細胞受容体を有するＴビヒクルは非自己細胞標的を認識することができない。
【0100】
ＮＬＶ－ＣＭＶに対する天然抗原特異性を有する抗原特異的Ｔ細胞を、先に記載した方法により１２日間でＰＢＭＣ中０．０３％から８７％の頻度に増殖させた。次いで、これらの細胞を、標的ＣＭＶ抗原のＮＬＶペプチドを提示する３体のＨＬＡ不適合ドナーから得られた細胞を有する培養物中に置いた。
【0101】
図１７は、どのようにＴビヒクルが不適合同種ドナー由来の細胞を認識できないか、ＮＬＶペプチド（「Ａｕｔｏ４ ｐｅｐ」）を提示する自己細胞を認識しかつ死滅させる能力及びＮＬＶペプチド（Ａｕｔｏ４）を提示しない自己細胞の死滅を回避する能力によって実証されるように完全な機能性を有しているにもかかわらず、それらがＮＬＶペプチド（「ａｌｌｏ１」及び「ａｌｌｏ１ ｐｅｐ」、「ａｌｌｏ２」及び「ａｌｌｏ２ ｐｅｐ」、「ａｌｌｏ３」及び「ａｌｌｏ３ ｐｅｐ」）を発現したか否かを示している。
【0102】
目的とする１以上の治療属性の選択及び作成：少なくとも１つの治療属性を包含するように抗原特異的Ｔ細胞群を改変するための広範な選択肢がある。以下の例は、非限定的であるが、治療属性の選択がどのようにして治療目的によって決まるのか、何故治療属性及びその治療目的がＴビヒクル天然抗原受容体の抗原特異性とは無関係であるのかを当業者に認識させることを意図している。
【0103】
実施例１０：免疫療法のアジュバントとして投与した、組換えタンパク質が負荷されたＴビヒクル。
【0104】
免疫療法は、患者の免疫応答を引き出す又は増幅するように設計される治療クラスである。例としては、がん細胞上に発現した腫瘍抗原に対する免疫応答を活性化するように設計されるワクチンの投与又は生体外で増殖されたＴ細胞又はＮＫ細胞の送達が挙げられる。ＩＬ２、ＩＬ７、ＧＭ－ＣＳＦのようなサイトカインなどの組換えタンパク質が全身に投与され、これら細胞の成長、増殖、持続及び／又は機能を生体内で促進するものであるが、一部のサイトカイン（例えば、ＩＬ２）の全身投与は、深刻な粘膜炎、吐き気、下痢、浮腫、呼吸困難、肝及び腎機能障害並びに誘導／注入されたＴ細胞の機能を損なう制御性Ｔ細胞の増殖を含む生体内での毒性と関連している。サイトカインを含む組換えタンパク質が負荷されたＴビヒクルの投与は、炎症部位に移動し、これらの組換えタンパク質を免疫療法によって誘発された炎症部位に直接送達することによって、このような毒性を克服し得る。
【0105】
当業者は、Ｔビヒクルを使用して、伝統的な非特異的全身投与の代わりにこのようなサイトカインの送達を目的とし得ることを認識すべきである。例えば、サイトカインＩＬ７を生産し、切断型ＣＤ３４Δを発現することができるＴビヒクルを作成すべく実験に着手した。この切断型ＣＤ３４Δは、形質導入細胞の割合を検出し、トランスジェニック個体群を選択するのに使用することができる。この場合、図１８に示すように、フロー分析によって測定されるとき、ＣＭＶウイルスのＮＬＶエピトープに対して９８％の天然抗原特異性を有するドナーＴ細胞を、ＣＤ３４Δ－ＩＬ７サイトカイン発現の治療属性を有するＴビヒクルを作成するように首尾よく改変した。更に、試験により、レトロウイルスベクター（ＣＤ３４Δ－ＩＬ７サイトカイン）で修飾したＴビヒクルのみが、ＥＬＩＳＡで検出されるように、ＩＬ７を生産できることが実証された。
【0106】
ＩＬ７サイトカインの生体内での効果及び生体内での分配に関して、レトロウイルスベクター（ＣＤ３４Δ－ＩＬ７サイトカイン）で修飾した治療的Ｔビヒクルを評価するために、マウスを２つのグループに分けた（１グループにつき５匹）。グループ１では、静脈注射によって全身投与された２０００ｎｇのＩＬ７サイトカインで担腫瘍マウスを処置した。グループ２では、１０Ｅ＋０６Ｔビヒクルの単回静脈注射でマウスを処置した。次いで、各グループから無作為に選んだ被検体を１週目及び２週目に犠牲にし、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、腹膜、腫瘍及び血液などの様々な位置でのＩＬ７サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡによって評価した。
【0107】
図１９Ａは、グループ１について、様々な位置でのＩＬ７サイトカイン蓄積を示している。ＩＬ７サイトカインのＥＬＩＳＡ分析により、より高いサイトカインレベルが腎臓で検出され、それらが腫瘍部位で検出限界未満であったことが実証されている。
【0108】
図１９Ｂは、グループ２について、様々な位置でのＩＬ７サイトカイン蓄積を示している。ＩＬ７サイトカインのＥＬＩＳＡ分析により、他の臓器と比較して腫瘍部位におけるサイトカイン濃度がより高く、Ｔビヒクル投与後から少なくとも２週間、サイトカイン生産が腫瘍で持続されたことを実証している。故に、Ｔビヒクルは、腫瘍部位に移動して、長時間サイトカインＩＬ７を優先的に送達することができた。これは明らかに、サイトカインを送達することができる治療属性を有するＴビヒクルの能力により、全身投与されるサイトカインの最先端の送達方法と比べて優れた治療的利点が得られることを実証している。予想されるように、１週目から２週目の間のサイトカイン濃度の低下によって示されるように、Ｔビヒクルの生体内での存在は制限されている。Ｔビヒクルがレシピエント内にとどまらないため、これはＴビヒクルの更なる利点と見なすことができる。好ましくは、治療結果が満たされるまで、更なる用量のＴビヒクルが必要に応じて投与され、更なる用量を投与しない場合、Ｔビヒクルはレシピエントから除去される。
【0109】
実施例１１：治療属性が特定抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であるＴビヒクルを作成するようにドナーＴ細胞を修飾することができる。
【0110】
ウイルスＣＭＶのエピトープＮＬＶに対する天然抗原特異性を有するＴ細胞の９８％を有するドナーＴ細胞（五量体分析によって評価される）を、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）を認識することができるＣＡＲを発現するという治療属性を有するＴビヒクルを作成するように形質導入することができる。Ｔビヒクルの治療目的は、前立腺腫瘍細胞の破壊である。図２０に示すように、四分割部分Ｅ２では、ドナーＴ細胞の５７．２３％が、フロー分析により測定されるとき、ＣＡＲ－ＰＳＣＡの治療属性を有するＴビヒクルを作成するように首尾よく改変された。ＣＡＲ－ＰＳＣＡの治療属性を含むＴビヒクルの死滅有効性を試験するために、未改変ドナーＴ細胞及びドナーＴ細胞をＣＡＲ－ＰＳＣＡで修飾することによって作成されたＴビヒクルを、抗原ＰＳＣＡ陽性（ＧＦＰ＋）又はＰＳＣＡ陰性（ｍＯｒａｎｇｅ＋）である標的細胞と共に１：１の比で培養した。７２時間の培養後、残留ＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞数をフロー分析で測定した。図２１は、７２時間での実験結果を示しており、四分割部分Ａ１は、ＰＳＣＡ陰性細胞数を表し、四分割部分Ａ３は、Ｔビヒクル数を表し、四分割部分Ａ４は、ＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞数を表す。予想するように、７２時間後、未改変ドナーＴ細胞は元の培養集団を改変しなかった。しかしながら、それとは逆に、ＣＡＲ－ＰＳＣＡを発現するＴビヒクルは、ＰＳＣＡ陽性腫瘍細胞群全体をほぼ全滅させることができ、同時に、ＰＳＣＡ陰性細胞を無傷のままにしておくことによってＰＳＣＡ抗原に対する優れた選択を実証した。これは明らかに、その天然抗原特異性とは無関係に治療的利点を生じるＴビヒクルの能力を実証している。
【0111】
実施例１２：治療属性がレシピエントにおいて望ましくないサイトカインを枯渇させることができる受容体であるＴビヒクルを作成するように、ドナーＴ細胞を改変することができる。
【0112】
腫瘍細胞は、内因性Ｔ細胞の抗腫瘍効果を抑制する免疫抑制サイトカインを生産することによって免疫系から保護される。ドナーＴ細胞は、望ましくない特定サイトカインを腫瘍から吸引するという治療目的を付与するために特定のサイトカイン受容体が必要とされるものなら何でも発現するという治療属性を有するＴビヒクルを作成するように改変され、それにより、免疫療法の戦略に対して腫瘍環境をより寛容なものにするという治療的利点を有することができる。図２２Ａ及び図２２Ｂは、このようなプロセスを描写する図である。図２２Ａの描写では、ＩＬ４を結合することができる受容体の治療属性を含むＴビヒクルが、ＩＬ４サイトカインを発現する腫瘍細胞に近接している。図２２Ｂの描写では、ＴビヒクルにはＩＬ４サイトカインが結合され、腫瘍細胞を保護するＩＬ４サイトカインの量は、大きく低減されている。留意すべきは、Ｔビヒクルの治療属性、治療目的及び治療的利点がいかにＴビヒクルの天然抗原受容体を包含せず、かつ、それとは無関係であるかということである。細胞外組換えサイトカイン受容体ＩＬ４Ｒ／７を発現するという治療属性を有するＴビヒクルの能力を評価し、ＩＬ４サイトカインを枯渇させるために実験を行った。ＣＭＶウイルスのＮＬＶエピトープに対する天然特異性を有するドナーＴ細胞を改変することによって、Ｔビヒクルを調整した。５Ｅ＋０５Ｔビヒクルを、２４ウェルプレート内で、２０００ｐｇ／ｍｌのＩＬ４の存在下、用量２ｍｌの培地中で培養し、ドナーＴ細胞と比較した。次いで、サイトカインＩＬ４の濃度を、２４、４８及び７２時間目にＥＬＩＳＡにより評価した。結果を図２３に示す。７２時間での免疫抑制腫瘍成長因子ＩＬ４サイトカインの低下が著しかったため、Ｔビヒクルは明らかにそれらの治療目的を達成することができた。逆に、ドナーＴ細胞（すなわち、「未修飾Ｔビヒクル」と名付けられたヒストグラム）は、ＩＬ４の存在を低減する能力を全く示さなかった。
【0113】
当業者は、Ｔビヒクルが多くの治療属性を備えることにより、レシピエントに治療的利点を付与することを意図した治療目的を達成することができるようになることを認識すべきである。ここで、開示された可能性を幾つかの更なる例により増補する。
【0114】
がんの標的治療のための化学療法剤の治療属性で改変されたＴビヒクル：様々な化学療法剤又は抗腫瘍薬を使用して、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、黒色腫及び骨髄腫などの様々な種類のがんを治療する。ほとんどの化学療法は静脈内に送達されるが、多くの薬剤は経口投与され、その後体中を循環する。化学療法剤は、急速に分裂する（ほとんどのがん細胞の主要な特性の１つである）細胞を死滅させることによって作用する。これは、化学療法が正常な状況下で急速に分裂する細胞（例えば、骨髄、消化管及び毛嚢における細胞）も傷付けてしまうことを意味する。この結果、化学療法の最も一般的な副作用は骨髄抑制（血液細胞生産の低下、故に免疫抑制）、粘膜炎（消化管粘膜の炎症）及び脱毛症（毛髪の損失）である。化学療法に誘発される吐き気及び嘔吐も、よく見られる治療の副作用である。これらの薬剤が負荷されたＴビヒクルの投与は、これらの毒性を相殺する可能性を有する。これは、Ｔビヒクルに化学療法剤を含有させて、それらをレシピエントに注入することによって起こり得る。これにより、Ｔビヒクルは炎症（がん）部位に移動して走化性勾配を下げる。このように、化学療法剤は、レシピエントに全身投与される場合とは対照的に、腫瘍細胞に近接して配置される。ＨＬＡ不適合の場合、レシピエントの免疫系は、Ｔビヒクルに対する攻撃を開始することにより、それらは破壊されるが、腫瘍細胞部位では化学療法剤は放出されない。よって、負荷物（すなわち、化学療法剤）は、全身投与とは異なり、標的部位に直接堆積され、それにより、化学療法に関連するオフターゲット毒性を低減させる。
【0115】
このプロセスは、図２４Ａ、図２４Ｂ及び図２４Ｃに示される通りである。図２４Ａに示すように、化学療法剤が負荷されたＴビヒクルは、炎症部位（すなわち、腫瘍細胞）へ向かって移動し、Ｔビヒクルとレシピエント細胞とのＨＬＡ不適合に起因して、Ｔビヒクルの天然抗原受容体は、レシピエント細胞を認識せず、ＧＶＨＤを引き起こすことなく腫瘍細胞へ到達する。図２４Ｂに示すように、レシピエントの免疫系は、腫瘍細胞の部位に配置されたＴビヒクルを標的とする。図２４Ｃに示すように、レシピエントの免疫系による攻撃下で、Ｔビヒクルは腫瘍細胞の部位で化学療法剤を放出し、それにより、最先端の化学療法送達方法に固有のオフターゲット毒性を回避する。
【0116】
抗菌剤の治療属性で改変されたＴビヒクル：抗菌剤は、細菌類、真菌類又は原生動物などの微生物を死滅させる又はその成長を阻害する物質である。これらの薬剤は、典型的には全身に投与され、それらの負荷物を送達するために炎症部位に戻る能力を有するＴビヒクル上に負荷される場合には、より標的を絞って送達され得る。
【0117】
免疫療法のアジュバントとして投与される組換えタンパク質を生産するという治療属性で改変されたＴビヒクル：外因性組換えタンパク質が負荷されるのと同様、Ｔビヒクルは、ウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなど）又は非ウイルストランスフェクション手法を用いて遺伝子改変し、サイトカイン、ケモカイン、酵素、腫瘍抗原及びサイトカイン受容体を含む組換えタンパク質をトランスジェニック的に発現することができ、これらはまた、例えば、Ｔ細胞持続性を向上する、増殖を促進する、ホーミングを誘発するために他の免疫療法介入に対するアジュバントとして作用するように設計することもできる。
【0118】
腫瘍特異性を有する細胞を与えるトランスジェニック分子を発現するという治療属性で改変されたＴビヒクル：同様に、サイトカインなどの組換えタンパク質でＴビヒクルを修飾することができ、Ｔビヒクルはまた、ウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなど）又は非ウイルストランスフェクション手法を用いて遺伝子改変し、キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）をトランスジェニック的に発現することもできる。
【0119】
自己免疫疾患治療のための組換えタンパク質が負荷される又は当該タンパク質で遺伝子改変されるという治療属性で改変されたＴビヒクル：自己免疫疾患は、身体内に通常存在する物質及び組織に対する身体の不適切な免疫応答から生じる。換言すると、免疫系は、身体の一部を病原体と間違って、それ自身の細胞を攻撃する。これは一部の臓器に限定され得る。炎症を抑制するＩＬ１０、ＴＧＦＢ、ＩＬ１３サイトカインなどの組換えタンパク質が負荷されたＴビヒクルの投与は、これらの組換えタンパク質を無差別に分配するのではなく、必要とされる場合に組換えタンパク質を炎症部位に直接送達することによって、このような自己免疫作用を克服し得る。
【0120】
Ｔビヒクルは自殺遺伝子を発現するように遺伝子改変可能である：注入された細胞を迅速かつ完全に排除するために、Ｔビヒクルを安全スイッチ又は自殺遺伝子と共に組み込むことができ、これらの安全スイッチ又は自殺遺伝子は、万一毒性が生じた場合に作動し得る。自殺遺伝子の最も有効なものは、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ－ｔｋ）からのチミジンキナーゼである。この酵素は、非毒性プロドラッグであるガンシクロビルをリン酸化し、次いでこのガンシクロビルは、内因性キナーゼによりリン酸化されてＧＣＶ－三リン酸塩となって、ＤＮＡに組み込まれると連鎖停止及び単鎖切断を引き起こし、それにより分裂中の細胞を死滅させる。幾つかの段階Ｉ－ＩＩの研究は、ガンシクロビルの投与が移植ＨＳＶ－ｔｋ－修飾細胞を生体内で安全に排除し得ることを示している。より最近になって、誘導性Ｆａｓ、Ｆａｓ関連死ドメイン含有タンパク質（ＦＡＤＤ）及びカスパーゼ９が、代替の非免疫原性自殺遺伝子として考えられている。これら分子の各々は、健康なボランディアにおいて安全性が証明された合成剤である二量化化学誘導物質（ＣＩＤ）ＡＰ１９０３を結合するＦＫ結合タンパク質（ＦＫＢＰ）変異体と融合されると、自殺スイッチとして作用し得る。この小分子を投与すると、プロアポトーシス標的分子の架橋及び活性化が起こる。誘導性Ｆａｓ又はＦＡＤＤを形質導入されたＴ細胞の最大９０％が、ＣＩＤへの曝露後にアポトーシスを受ける。有望ではあるが、形質導入細胞の９０％を排除することは、遺伝子改変された細胞の安全性を生体内で確保するには不十分な場合がある。通常はＢ細胞上で発現されるＣＤ２０分子のトランスジェニック発現も、Ｔ細胞療法のための自殺遺伝子と仮定される。この戦略は、ＣＤ２０抗原を発現する腫瘍性Ｂ細胞及び正常なＢ細胞の両方を排除するのに広く使用されるヒト化抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）の臨床利用可能性に依存している。よって、ヒトＣＤ２０をトランスジェニック的に発現するＴ細胞を注入し、次いでリツキシマブを生体内で投与することによって、注入されたＴ細胞群は効果的に排除されるが、正常なＢ細胞もやはり排除されてしまう。よって、Ｔビヒクルは、これら異なる自殺遺伝子の１つ又はそれらの組み合わせを発現して負荷物の排除及び送達を制御するように修飾可能である。
【0121】
生体内画像化に対して遺伝子改変された及び／又は負荷された治療属性で改変されたＴビヒクル：ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）は、身体内の機能的プロセスの三次元画像又は写真を生み出す核医学画像法である。このシステムは、身体内の生物学的活性分子上に導入されるポジトロン放出放射性核種（トレーサー）によって間接的に放出されるγ線対を検出する。次いで、身体内のトレーサー濃度の三次元画像がコンピューター分析によって構築される。腫瘍部位まで移動するＴビヒクルの能力に起因して、Ｔビヒクルは、腫瘍部位の位置を生体内で検出し、決定することを可能にする放射性同位体を負荷し得る。
【0122】
同様に、ヨウ素１２３（１２３Ｉ又はＩ－１２３）は、単光子放出コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などの核医学画像法で使用されるヨウ素の放射性同位体である。これは、甲状腺疾患の診断検査に最も適する同位体である。およそ１３．３ｈ（時間）の半減期が２４ｈ（時間）ヨウ素摂取試験にとって理想的であり、１２３Ｉは、甲状腺組織及び甲状腺がん転移を画像診断するための他の利点を有する。ヨウ素は、酵素甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）により生成される過酸化水素による「ヨウ素捕集」において選択的に捕獲されるため、甲状腺腫瘍の画像化又は処置のために安全に使用することができる。このように、Ｔビヒクルは、ヨウ素を捕集した後にＴビヒクルを画像化／死滅させるために使用できる甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）で修飾可能である。
【0123】
当業者は、Ｔビヒクルの任意の所与の治療目的に関する治療属性が、以下の技術を含むがこれらに限定されない多くの技術によって作成可能であることを認識すべきである：
ａ）レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス又はレンチウイルスなどのウイルスベクターでの遺伝的修飾、及び／又は
ｂ）トランスポゾン及びトランスポーゼース（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）を使用するエレクトロポレーション及び／又はリポフェクション法、及び／又はピギーバック（Ｐｉｇｇｙｂａｃ）技術などの物理的及び／又は化学的技術により組み込まれるＤＮＡ及び／又はＲＮＡベクターの使用を含む、非ウイルスベクターによる遺伝的修飾、及び／又は
ｃ）Ｔビヒクル移動を改変する、自殺遺伝子を組み込む、レシピエントの免疫再構築（例えば、サイトカイン生産）を改善する、及び／又は直接的な抗ウイルス又は抗腫瘍効果を導く（例えば、キメラ抗原受容体）又は自己免疫疾患治療のために免疫応答を抑制する１以上のトランスジーンを包含させるための遺伝的修飾、及び／又は
ｄ）Ｔビヒクルの移動を改善するＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３－Ａ、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ3ＣＲ１及び／又はＸＣＲ１などの１以上のケモカイン受容体の発現によりＴビヒクルの移動を改善するための遺伝的修飾、及び／又は
ｅ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ２、ＩＬ８、ＩＬ１５、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ２１又はＩＬ２６などの１以上のサイトカインのＴビヒクル発現により、又は、共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌの発現又は過剰発現により、レシピエントの免疫再構築を改善するための遺伝的修飾、及び／又は
ｆ）チミジンキナーゼＴＫ遺伝子、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ｉカスパーゼ９などの１以上の自殺遺伝子の発現によりＴビヒクルの死を誘導するための遺伝的修飾、及び／又は
ｇ）ｉ）ＩｇＧ－ＦＣ領域由来のＣＨ２ＣＨ３配列を使用する細胞外スペーサーと、又はｉｉ）ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ３又はＣＤ８の配列を含むがこれらに限定されない膜貫通成分と、ｉｉｉ）ＣＤ３(エンドドメイン（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）と連結された、又はｉｖ）ＣＤ３(エンドドメインをコードするサイトカイン受容体又はサイトカインなどの天然リガンドの発現により連結された特定の抗体から単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を介して腫瘍標的を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの１以上のトランスジーンの発現、を含むがこれらに限定されない、直接的な抗ウイルス又は抗腫瘍効果を導くための遺伝的修飾、及び／又は
ｈ）例えば、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＴＦＧβなどの１以上の免疫抑制サイトカインを生産するトランスジーンの発現により又はＣＴＬＡ－４、ＰＤ１などの競合リガンドの発現により、自己免疫疾患治療のために免疫応答を抑制するための遺伝的修飾。
ａ）レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス又はレンチウイルスなどのウイルスベクターでの遺伝的修飾、及び／又は
ｂ）トランスポゾン及びトランスポーゼース（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）を使用するエレクトロポレーション及び／又はリポフェクション法、及び／又はピギーバック（Ｐｉｇｇｙｂａｃ）技術などの物理的及び／又は化学的技術により組み込まれるＤＮＡ及び／又はＲＮＡベクターの使用を含む、非ウイルスベクターによる遺伝的修飾、及び／又は
ｃ）Ｔビヒクル移動を改変する、自殺遺伝子を組み込む、レシピエントの免疫再構築（例えば、サイトカイン生産）を改善する、及び／又は直接的な抗ウイルス又は抗腫瘍効果を導く（例えば、キメラ抗原受容体）又は自己免疫疾患治療のために免疫応答を抑制する１以上のトランスジーンを包含させるための遺伝的修飾、及び／又は
ｄ）Ｔビヒクルの移動を改善するＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３－Ａ、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ3ＣＲ１及び／又はＸＣＲ１などの１以上のケモカイン受容体の発現によりＴビヒクルの移動を改善するための遺伝的修飾、及び／又は
ｅ）ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ２、ＩＬ８、ＩＬ１５、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ２１又はＩＬ２６などの１以上のサイトカインのＴビヒクル発現により、又は、共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌの発現又は過剰発現により、レシピエントの免疫再構築を改善するための遺伝的修飾、及び／又は
ｆ）チミジンキナーゼＴＫ遺伝子、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ｉカスパーゼ９などの１以上の自殺遺伝子の発現によりＴビヒクルの死を誘導するための遺伝的修飾、及び／又は
ｇ）ｉ）ＩｇＧ－ＦＣ領域由来のＣＨ２ＣＨ３配列を使用する細胞外スペーサーと、又はｉｉ）ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ３又はＣＤ８の配列を含むがこれらに限定されない膜貫通成分と、ｉｉｉ）ＣＤ３(エンドドメイン（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）と連結された、又はｉｖ）ＣＤ３(エンドドメインをコードするサイトカイン受容体又はサイトカインなどの天然リガンドの発現により連結された特定の抗体から単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を介して腫瘍標的を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの１以上のトランスジーンの発現、を含むがこれらに限定されない、直接的な抗ウイルス又は抗腫瘍効果を導くための遺伝的修飾、及び／又は
ｈ）例えば、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＴＦＧβなどの１以上の免疫抑制サイトカインを生産するトランスジーンの発現により又はＣＴＬＡ－４、ＰＤ１などの競合リガンドの発現により、自己免疫疾患治療のために免疫応答を抑制するための遺伝的修飾。
【0124】
当業者は、Ｔビヒクルの治療目的が以下のいずれかを含むがこれらに限定されない広範な範囲であり得ることを認識すべきである：
ａ）ＤＮＡ、ＲＮＡ、組換えタンパク質、ペプチド又はアプタマーを担持するための生物学的ビヒクルとして、
ｂ）化学化合物を担持するための生物学的ビヒクルとして、
ｃ）化学療法剤、小分子、ナノ粒子、ホルモン作動薬又は拮抗薬、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤を含むがこれらに限定されない治療目的を有する化学化合物の担持を許容する生物学的ビヒクルとして、及び／又は
ｄ）治療目的は持たないが、転移性疾患部位の同定を可能にする生体内での同定及び画像化を含むがこれらに限定されない副次的利点を有する１以上の化学化合物を担持するための生物学的ビヒクルとして。
ａ）ＤＮＡ、ＲＮＡ、組換えタンパク質、ペプチド又はアプタマーを担持するための生物学的ビヒクルとして、
ｂ）化学化合物を担持するための生物学的ビヒクルとして、
ｃ）化学療法剤、小分子、ナノ粒子、ホルモン作動薬又は拮抗薬、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤を含むがこれらに限定されない治療目的を有する化学化合物の担持を許容する生物学的ビヒクルとして、及び／又は
ｄ）治療目的は持たないが、転移性疾患部位の同定を可能にする生体内での同定及び画像化を含むがこれらに限定されない副次的利点を有する１以上の化学化合物を担持するための生物学的ビヒクルとして。
【0125】
本明細書に引用される各々の出願、特許、及び論文、更にこれらの出願、特許、及び論文の各々に引用される各々の文書又は参考文献（各々の発行された特許の審査の間を含む；「出願引用文書」）、係属中の米国特許公開公報第２００５／０１０６７１７号と第２００８／０２２７１７６号、これらの出願及び特許の何れかからの優先権に対応するか及び／又は優先権を主張する各々のＰＣＴ及び外国出願又は特許、更に各々の出願引用文書に引用又は言及された各々の文書は、参照により本明細書中に明確に援用する。
【0126】
上記参照により援用した文書はいずれも、本明細書中の明確な開示に反する主題を援用しないように制限される。上記参照により援用した文書はいずれも、当該文書に包含されるクレームが本明細書中に参照により援用しないように更に制限される。上記参照により援用した文書はいずれも、当該文書中に付与された定義がいずれも明らかに本明細書中に包含されない限り、参照により本明細書中に援用しないように更に制限される。
【0127】
本発明のクレームを解釈するにあたり、特定の用語「～ための手段」又は「～ための工程」がクレーム中に記載されない限り、米国特許法第１１２条第６段落の規定を行使すべきではないことが明らかに意図される。
【0128】
当業者は、本明細書中に記載される発明の趣旨を逸脱しない限り、本開示に対して多くの変更を行うことができることを認識するであろう。故に、本発明範囲を記載される実施形態及び実施例に限定する意図はない。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物により解釈されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図24C】
【手続補正書】
【提出日】2023-04-06
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えタンパク質を輸送する養子細胞療法薬を製造する方法であって、
少なくとも２ｍｌ／ｃｍ 2 の培地容量：表面積比で、気体透過性材料からなる気体透過性培養器具にＰＢＭＣを播種すること、
２以上の抗原特異的Ｔ細胞群の成長を刺激すること、及び
Ｔ細胞群を組換えタンパク質を発現するように改変すること
を含む、方法。
少なくとも２ｍｌ／ｃｍ 2 の培地容量：表面積比で、気体透過性材料からなる気体透過性培養器具にＰＢＭＣを播種すること、
２以上の抗原特異的Ｔ細胞群の成長を刺激すること、及び
Ｔ細胞群を組換えタンパク質を発現するように改変すること
を含む、方法。
【請求項2】
請求項１に記載の方法であって、
前記組換えタンパク質はＩＬ１５である、方法。
前記組換えタンパク質はＩＬ１５である、方法。
【請求項3】
請求項１に記載の方法であって、
前記組換えタンパク質はＩＬ７である、方法。
前記組換えタンパク質はＩＬ７である、方法。
【請求項4】
請求項１に記載の方法であって、
前記組換えタンパク質はＩＬ２１である、方法。
前記組換えタンパク質はＩＬ２１である、方法。
【請求項5】
請求項１に記載の方法であって、
前記組換えタンパク質はＩＬ１２である、方法。
前記組換えタンパク質はＩＬ１２である、方法。
【請求項6】
請求項１に記載の方法であって、
前記組換えタンパク質はＩＬ４である、方法。
前記組換えタンパク質はＩＬ４である、方法。
【請求項7】
請求項１に記載の方法であって、
前記組換えタンパク質はＩＬ２である、方法。
前記組換えタンパク質はＩＬ２である、方法。
【請求項8】
請求項１に記載の方法であって、
前記Ｔ細胞群はウイルストランスフェクションを用いた遺伝子操作により改変されている、方法。
前記Ｔ細胞群はウイルストランスフェクションを用いた遺伝子操作により改変されている、方法。
【請求項9】
請求項１に記載の方法であって、
前記Ｔ細胞群は、エレクトロポレーションによるＤＮＡ及び／又はＲＮＡベクターの導入を用いて、ウイルスを利用せずに改変されている、方法。
前記Ｔ細胞群は、エレクトロポレーションによるＤＮＡ及び／又はＲＮＡベクターの導入を用いて、ウイルスを利用せずに改変されている、方法。
【請求項10】
請求項１に記載の方法であって、
前記Ｔ細胞群は、リポフェクション法によるＤＮＡ及び／又はＲＮＡベクターの導入を用いて、ウイルスを利用せずに改変されている、方法。
前記Ｔ細胞群は、リポフェクション法によるＤＮＡ及び／又はＲＮＡベクターの導入を用いて、ウイルスを利用せずに改変されている、方法。
【請求項11】
請求項９又は１０に記載の方法であって、
前記ＤＮＡ及び／又はＲＮＡベクターはトランスポゾンを含有している、方法。
前記ＤＮＡ及び／又はＲＮＡベクターはトランスポゾンを含有している、方法。
【請求項12】
請求項１に記載の方法であって、
前記２以上の抗原特異的Ｔ細胞群の成長はＯＫＴ３により刺激される、方法。
前記２以上の抗原特異的Ｔ細胞群の成長はＯＫＴ３により刺激される、方法。