特開 2023-66177 エンドトキシン検出方法及びエンドトキシン検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備、並びに精製水製造方法及び注射用水製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023066177

(43)【公開日】2023-05-15

(54)【発明の名称】エンドトキシン検出方法及びエンドトキシン検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備、並びに精製水製造方法及び注射用水製造方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/579 20060101AFI20230508BHJP

   G01N 33/18 20060101ALI20230508BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20230508BHJP

   C09K 11/06 20060101ALI20230508BHJP

   C02F 1/44 20230101ALI20230508BHJP

【ＦＩ】

G01N33/579

G01N33/18 F

G01N21/64 F

C09K11/06

C02F1/44 J

【審査請求】有

【請求項の数】22

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021176736

(22)【出願日】2021-10-28

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和３年９月８日 日本分析化学会第７０年会講演要旨集にて公開 令和３年９月２３日 日本分析化学会第７０年会講演にて公開

(71)【出願人】

【識別番号】000245531

【氏名又は名称】野村マイクロ・サイエンス株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】502350504

【氏名又は名称】学校法人上智学院

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】木本 洋

(72)【発明者】

【氏名】飯山 真充

(72)【発明者】

【氏名】橋本 剛

(72)【発明者】

【氏名】早下 隆士

【テーマコード（参考）】

2G043

4D006

【Ｆターム（参考）】

2G043AA01

2G043BA01

2G043BA14

2G043BA17

2G043CA03

2G043DA02

2G043DA05

2G043EA01

2G043FA03

2G043GA06

2G043GA07

2G043GA08

2G043GB07

2G043GB09

2G043GB21

2G043KA02

2G043KA03

2G043KA05

2G043LA01

2G043MA03

2G043MA04

4D006GA03

4D006GA06

4D006JA51Z

4D006KA31

4D006KA72

4D006KB11

4D006KB30

4D006PA01

4D006PB02

4D006PB54

4D006PC02

4D006PC45

(57)【要約】

【課題】リムルス試験によらず、また、電気化学的な方法によらずに、簡便かつ迅速に、低濃度でも定量可能なエンドトキシンの検出方法を提供する。
【解決手段】縮合多環芳香族炭化水素又はその誘導体である蛍光部位と、エンドトキシンの分子構造の特定部位を認識する認識部位とがスペーサで連結された構造を有する蛍光物質を用いて被験対象の試料からエンドトキシンを検出する、エンドトキシン検出方法。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

縮合多環芳香族炭化水素又はその誘導体である蛍光部位と、エンドトキシンの分子構造の特定部位を認識する認識部位とがスペーサで連結された構造を有する蛍光物質を用いて被験対象の試料からエンドトキシンを検出する、エンドトキシン検出方法。

【請求項2】

前記検出において、蛍光を測定する波長が３５０～９００ｎｍである、請求項１に記載のエンドトキシン検出方法。

【請求項3】

前記縮合多環芳香族炭化水素は六員環のみで構成される、請求項１又は請求項２に記載のエンドトキシン検出方法。

【請求項4】

前記六員環の環数は２以上８以下である、請求項３に記載のエンドトキシン検出方法。

【請求項5】

前記スペーサのうち、前記蛍光部位と前記認識部位との間を直鎖として連結する部分は、炭素を含む２以上１２以下の原子の単結合で構成されている、請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載のエンドトキシン検出方法。

【請求項6】

前記蛍光物質は、前記認識部位として金属イオン（Ｍ^ｎ＋：ただしｎは自然数）が配位されたジピコリルアミノ基を有し、前記蛍光部位としてピレンを有し、かつ前記スペーサの原子数が２以上１０以下であり、
前記特定部位はエンドトキシンのリン酸基及びアルキル基である、請求項５に記載のエンドトキシン検出方法。

【請求項7】

前記蛍光物質は、前記スペーサの炭素数が４であって、下記式に示す化学構造を有する物質である、請求項６に記載のエンドトキシン検出方法。

【化1】

【請求項8】

前記金属イオンは、亜鉛イオン（Ｚｎ^２＋）又はカドミウムイオン（Ｃｄ^２＋）である、請求項６又は請求項７に記載のエンドトキシン検出方法。

【請求項9】

被験対象の試料が導入される試料導入部と、
縮合多環芳香族炭化水素又はその誘導体である蛍光部位と、エンドトキシンの分子構造の特定部位を認識する認識部位とがスペーサで連結された構造を有する蛍光物質を前記試料に供給する供給部と、
前記試料と前記蛍光物質とが反応する反応部と、
前記反応を被った前記蛍光物質の発光又は発色を検出する検出部と、
を備える、エンドトキシン検出装置。

【請求項10】

前記検出において、蛍光を測定する波長が３５０～９００ｎｍである、請求項９に記載のエンドトキシン検出装置。

【請求項11】

前記縮合多環芳香族炭化水素は六員環のみで構成される、請求項９又は請求項１０に記載のエンドトキシン検出装置。

【請求項12】

前記六員環の環数は２以上８以下である、請求項１１に記載のエンドトキシン検出装置。

【請求項13】

前記スペーサのうち、前記蛍光部位と前記認識部位との間を直鎖として連結する部分は、炭素を含む２以上１２以下の原子の単結合で構成されている、請求項９から請求項１２までのいずれか１項に記載のエンドトキシン検出装置。

【請求項14】

前記蛍光物質は、前記認識部位として金属イオン（Ｍ^ｎ＋：ただしｎは自然数）が配位されたジピコリルアミノ基を有し、前記蛍光部位としてピレンを有し、かつ前記スペーサの炭素数が２以上１０以下であり、
前記特定部位はエンドトキシンのリン酸基及びアルキル基である、請求項１３に記載のエンドトキシン検出装置。

【請求項15】

前記蛍光物質は、前記スペーサの炭素数が４であって、下記式に示す化学構造を有する物質である、請求項１４に記載のエンドトキシン検出装置。

【化2】

【請求項16】

前記金属イオンは、亜鉛イオン（Ｚｎ^２＋）又はカドミウムイオン（Ｃｄ^２＋）である、請求項１４又は請求項１５に記載のエンドトキシン検出装置。

【請求項17】

前記試料は、精製水製造設備で製造された精製水又は注射用水製造設備で製造された注射用水から採取される、請求項９から請求項１６までのいずれか１項に記載のエンドトキシン検出装置。

【請求項18】

原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、
前記精製水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、
請求項９から請求項１６までのいずれか１項に記載のエンドトキシン検出装置と、
を備える精製水製造設備。

【請求項19】

原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、
前記精製水をろ過する高分子膜ろ過装置又は前記精製水を蒸留する蒸留器により前記精製水から注射用水を得る注射用水製造部と、
前記注射用水を加熱した状態で維持して貯留する注射用水タンクと、
前記注射用水タンクに備えられている前記注射用水を所定の使用場所へ送出する送出ラインと、
前記注射用水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、
請求項９から請求項１６までのいずれか１項に記載のエンドトキシン検出装置と、
を備える注射用水製造設備。

【請求項20】

前記試料採取部は、前記注射用水製造部より下流側でかつ前記注射用水タンクより上流側において、前記注射用水タンクから直接、又は、前記送出ラインから、前記試料を採取する、請求項１９に記載の注射用水製造設備。

【請求項21】

原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得て、
前記精製水から採取された前記被験対象の試料を、請求項１から請求項８までのいずれか１項に記載のエンドトキシン検出方法に供することを特徴とする精製水製造方法。

【請求項22】

原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得て、
前記精製水の高分子膜ろ過によるろ過により、又は、前記精製水の蒸留により、前記精製水から注射用水を得て、
前記注射用水から採取された前記被験対象の試料を、請求項１から請求項８までのいずれか１項に記載のエンドトキシン検出方法に供することを特徴とする注射用水製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、被験対象の試料中のエンドトキシン検出方法及びエンドトキシン検出装置に関し、さらに精製水製造設備及び注射用水製造設備、並びに精製水製造方法及び注射用水製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

精製水とは、常水を蒸留、イオン交換樹脂塔又は電気式脱塩装置（ＥＤＩ）等によるイオン交換、逆浸透若しくは限外ろ過、紫外線照射装置（ＵＶ）又はそれらの組み合わせにより精製したもので、製剤の原料のみでなく、試薬の調製などにも使用される。滅菌精製水とは、精製水を高圧蒸気滅菌などにより滅菌したもので、点眼剤の溶剤などに使用される。注射用水（ＷＦＩ、Ｗａｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）は、精製水を滅菌したのち、所定のエンドトキシン試験に適合したものである。これら製薬用水では、いずれも、人体に有害であるエンドトキシンを定量する必要が生じる場合がある。

【0003】

ＷＦＩ製造設備の一例として、下記特許文献１記載の技術が挙げられる。ＷＦＩの製造には、精製水製造設備で製造された精製水から、蒸留器又は高分子膜ろ過装置（好ましくは限外ろ過膜装置）のようなエンドトキシン除去設備によってエンドトキシンを高度に除去することが必須である。

【0004】

エンドトキシンとは、グラム陰性菌の細胞壁成分であるリポ多糖であり、生活環境に偏在する代表的な発熱物質である。エンドトキシンが血液中に入ると発熱、敗血症性ショック、多臓器不全、頻脈等などの作用が起こることから、医薬品や医療機器、特に生体内へ直接導入される液体や、製薬用水、注射器、人工臓器、透析膜などの医療機器の製造においては、厳重な管理が必要となる。たとえば、「日本薬局方（ＪＰ１７）品質適合試験」における注射用水の管理基準では、０．２５ＥＵ／ｍＬ未満と定められている。

【0005】

エンドトキシンの検出は、カブトガニの血球成分がエンドトキシンにより凝固することを利用したリムルス試験で行われている。リムルス試験では、カブトガニの血液から抽出されたライセート試薬を用いて行うのが現在では標準であるが、試験結果が出るのに１～２時間を要する。さらに、リムルス試験を用いたオンライン測定装置も考案されているが、実用的な定量下限を得ることが難しく、定量性や再現性が乏しい。たとえば、試薬自体が生物由来であるため、その性能は試薬のロットによっても異なる場合がある。このことから、より迅速に試験結果を得られ、かつオンライン測定を実用的な精度で行うことができる検出方法が望まれていた。また、ライセート試薬を得るためにはカブトガニという野生生物を捕獲して採血を行う必要があるため、動物愛護の観点からも、カブトガニの血液を使用しない代替手段の開発が望まれていた。

【0006】

たとえば、下記特許文献２及び特許文献３のように、電気化学的な方法によるエンドトキシンの検出も試みられてきた。しかし、電気化学的な方法によるエンドトキシンの検出は、特に実用的な定量下限を得るためには、検出に用いる電極の作製技術若しくは量産性、要求されるメンテナンス頻度、又は測定の精度や迅速性など課題が多く、実用化には至っていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２０１９－０２５４５６号公報

【特許文献2】特開２０１６－１５１４８２号公報

【特許文献3】特開２００７－０９３３７８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

エンドトキシン除去設備において、エンドトキシン除去能力に異常が発生すると、容易にＷＦＩ中のエンドトキシン濃度が増大し、注射液の製造には不適となる。特に近年は、エネルギー消費量の削減のため、このような設備として従来の蒸留器に代えて高分子膜ろ過装置を採用する傾向が強まっている。しかし、高分子膜ろ過装置では高分子膜として樹脂材料が使われているため、たとえば、加熱殺菌を行うたびに樹脂材料が損傷を受けるなど、蒸留器と比較して異常が起きやすいという懸念がある。この懸念が、エンドトキシン除去設備に高分子膜ろ過装置を採用することを妨げる要因となっている。

【0009】

したがって、安定的に要求水質のＷＦＩを製造するためには、エンドトキシン除去設備において異常が発生した際には、高分子膜などの部品を直ちに交換又は修理するなどのメンテナンスを行う必要がある。しかし、エンドトキシン除去能力の異常を迅速に検出できる方法は、まだ実現できていない。

【0010】

本発明は、リムルス試験によらず、また、電気化学的な方法によらずに、簡便かつ迅速に、低濃度でも定量可能なエンドトキシンの検出方法及びその検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備、並びに精製水製造方法及び注射用水製造方法の提供を課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本開示のエンドトキシン検出方法は、縮合多環芳香族炭化水素又はその誘導体である蛍光部位と、エンドトキシンの分子構造の特定部位を認識する認識部位とがスペーサで連結された構造を有する蛍光物質を用いて被験対象の試料からエンドトキシンを検出する方法である。

【0012】

ここで、前記検出において、蛍光を測定する波長が３５０～９００ｎｍであることが望ましい。また、前記縮合多環芳香族炭化水素は六員環のみで構成されることが望ましい。さらには、前記六員環の環数は２以上８以下であることが望ましい。また、前記スペーサのうち、前記蛍光部位と前記認識部位との間を直鎖として連結する部分は、炭素を含む２以上１２以下の原子の単結合で構成されていることが望ましい。この直鎖は、炭素原子のみで構成されていることが望ましいが、直鎖の途中には窒素、酸素、硫黄など炭素以外の原子が介在してもよく、また、直鎖の途中からの分岐があってもよい。

【0013】

また、前記蛍光物質は、前記認識部位として金属イオン（Ｍ^ｎ＋：ただしｎは自然数）が配位されたジピコリルアミノ基を有し、前記蛍光部位としてピレンを有し、かつ前記スペーサの原子数が２以上１０以下であり、前記特定部位はエンドトキシンのリン酸基及びアルキル基であることが望ましい。さらには、前記蛍光物質は、前記スペーサの炭素数が４であって、下記式（１）に示す化学構造を有する物質（以下、「ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙ」と称する。）であることが望ましい。

【0014】

【化1】

【0015】

上記式（１）におけるピレンは、蛍光反応を阻害しない、又は増強するような置換基、好ましくは疎水性の置換基を有していてもよい。

【0016】

また、上記式（１）における金属イオンは、亜鉛イオン（Ｚｎ^２＋）又はカドミウムイオン（Ｃｄ^２＋）であることが望ましく、これらのうちでは亜鉛イオンが最も望ましい。

【0017】

本開示のエンドトキシン検出装置は、被験対象の試料が導入される試料導入部と、縮合多環芳香族炭化水素又はその誘導体である蛍光部位と、エンドトキシンの分子構造の特定部位を認識する認識部位とがスペーサで連結された構造を有する蛍光物質を前記試料に供給する供給部と、前記試料と前記蛍光物質とが反応する反応部と、前記反応を被った前記蛍光物質の発光又は発色（これ以降、まとめて「発光」という）を検出する検出部と、を備える。

【0018】

ここで、前記縮合多環芳香族炭化水素は六員環のみで構成されることが望ましい。さらには、前記六員環の環数は２以上８以下であることが望ましい。また、前記スペーサのうち、前記蛍光部位と前記認識部位との間を直鎖として連結する部分は、炭素を含む２以上１２以下の原子の単結合で構成されていることが望ましい。この直鎖は、炭素原子のみで構成されていることが望ましいが、直鎖の途中には窒素、酸素、硫黄など炭素以外の原子が介在してもよく、また、直鎖の途中からの分岐があってもよい。

【0019】

また、前記蛍光物質は、前記認識部位として金属イオン（Ｍ^ｎ＋：ただしｎは自然数）が配位されたジピコリルアミノ基を有し、前記蛍光部位としてピレンを有し、かつ前記スペーサの原子数が２以上１０以下であり、前記特定部位はエンドトキシンのリン酸基及びアルキル基であることが望ましい。さらには、前記蛍光物質は、前記スペーサの炭素数が４であって、前記式（１）に示す化学構造を有する物質であることが望ましい。

【0020】

前記式（１）におけるピレンは、蛍光反応を阻害しない、又は増強するような置換基、好ましくは疎水性の置換基を有していてもよい。

【0021】

また、前記式（１）における金属イオンは、亜鉛イオン（Ｚｎ^２＋）又はカドミウムイオン（Ｃｄ^２＋）であることが望ましく、これらのうちでは亜鉛イオンが最も望ましい。

【0022】

また、前記試料は、精製水製造設備で製造された精製水又は注射用水製造設備で製造された注射用水から採取されることとしてもよい。

【0023】

本開示の精製水製造設備は、原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、前記精製水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、前記エンドトキシン検出装置と、を備える。

【0024】

本開示の注射用水製造設備は、原水を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方により前記原水から精製水を得る精製水製造部と、前記精製水をろ過する高分子膜ろ過装置又は前記精製水を蒸留する蒸留器により前記精製水から注射用水を得る注射用水製造部と、前記注射用水を加熱した状態で維持して貯留する注射用水タンクと、前記注射用水タンクに備えられている前記注射用水を所定の使用場所へ送出する送出ラインと、前記注射用水から前記被験対象の試料を採取する試料採取部と、前記エンドトキシン検出装置と、を備える。なお、前記試料採取部は、前記注射用水製造部より下流側でかつ前記注射用水タンクより上流側において、前記注射用水タンクから直接、又は、前記送出ラインから、前記試料を採取することが望ましい。

【0025】

本開示の精製水製造方法は、原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得て、前記精製水から採取された前記被験対象の試料を、前記エンドトキシン検出方法に供することを特徴とする。

【0026】

本開示の注射用水製造方法は、原水を逆浸透ろ過及びイオン交換のうちの少なくとも一方により処理して精製水を得て、前記精製水の高分子膜ろ過によるろ過により、又は、前記精製水の蒸留により、前記精製水から注射用水を得て、前記注射用水から採取された前記被験対象の試料を、前記エンドトキシン検出方法に供することを特徴とする。

【発明の効果】

【0027】

上述のとおり、本発明により、リムルス試験によらず、また、電気化学的な方法によらずに、簡便かつ迅速（たとえば、１回の検出につき３０分以内）に、かつ低濃度でも安定して定量可能なエンドトキシンの検出方法及びその検出装置、精製水製造設備及び注射用水製造設備、並びに精製水製造方法及び注射用水製造方法提供が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】エンドトキシン検出方法で用いられる蛍光物質の概略構成を模式図で示す。

【図2】エンドトキシン検出装置の構成を模式図で示す。

【図3】精製水製造設備の概略構成を模式図で示す。

【図4】注射用水製造設備の概略構成を模式図で示す。

【図5】ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙにエンドトキシンを加えたときの蛍光スペクトル変化をグラフで示す。

【図6】ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙによるエンドトキシンの定量性をグラフで示す。

【図7】銅イオンを配位させた各種蛍光物質のエンドトキシンに対する蛍光強度変化率をグラフで示す。

【図8】亜鉛イオンを配位させた各種蛍光物質のエンドトキシンに対する蛍光強度変化率をグラフで示す。

【図9】ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙにエンドトキシンを加えたときの蛍光強度の経時変化をグラフで示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

以下、実施の形態について、図面を参照しつつ説明する。なお、図面は概略図又は模式図であり、実際の寸法比率とは必ずしも一致しない。

【0030】

＜エンドトキシン検出方法＞
本開示のエンドトキシン検出方法は、縮合多環芳香族炭化水素又はその誘導体である蛍光部位と認識部位とがスペーサで連結された構造を有する蛍光物質を用いてエンドトキシンを検出する方法である。蛍光物質における認識部位は、エンドトキシンの分子構造の特定部位を認識する。

【0031】

蛍光物質１０は、図１の模式図に示すような概略構成を有する。すなわち、エンドトキシン５０を認識する認識部位４０と、発光する蛍光部位２０とがスペーサ３０で連結されている。

【0032】

エンドトキシン５０は、親水性の部位である糖鎖と、疎水性の部位であるアシル酸とが２分子のグルコサミンを介して結合した構造を有する。グルコサミンにはそれぞれリン酸が結合している（棚本憲一「エンドトキシンと医薬品の品質管理」Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉ．，１２６，１９－３３（２００８））。エンドトキシン５０のうち、アシル酸が結合したグルコサミンが２個結合した部分はリピドＡと称され、エンドトキシン５０の生物活性の多くはこの部分に由来する。

【0033】

蛍光部位２０は、発光する性質の物質であって、後述する認識部位４０における認識情報を受け取ることで発光特性が変化するものである。ここで、「発光」とは、蛍光又は燐光が発生することをいう。なお、大きい光量を得ることでエンドトキシンの検出感度をよくする観点からは、蛍光の発生がより好ましい。このような蛍光部位２０を構成する物質としては、縮合多環芳香族炭化水素が挙げられる。なお、この縮合多環芳香族炭化水素は、発光を増強するか、又は阻害しないような置換基又は元素が付加された誘導体であってもよい。この縮合多環芳香族炭化水素は、六員環のみで構成されることが望ましく、さらにはこの六員環の環数は２以上８以下であることが望ましく、２以上６以下がより好ましく、２以上４以下がさらに好ましい。たとえば、下記式（２）に示すナフタレン、下記式（３）に示すアントラセン、下記式（４）に示すフェナントレン、下記式（５）に示すピレン、下記式（６）に示すクリセン及び下記式（７）に示すペリレン並びにこれらの誘導体が蛍光部位２０として利用可能である。このような縮合多環芳香族炭化水素は、後述する認識部位４０から認識情報を受け取って蛍光を発生する際、近傍にある分子同士が二量体を形成してエキシマー蛍光を示す性質がある。

【0034】

【化2】

【0035】

【化3】

【0036】

【化4】

【0037】

【化5】

【0038】

【化6】

【0039】

【化7】

【0040】

認識部位４０は、その分子構造に応じて、エンドトキシン５０の特定部位を認識する。換言すると、認識部位４０は、エンドトキシン５０の所定の部位又は官能基と物理的又は化学的に相互作用する官能基であり、より好ましくは、エンドトキシン５０の特定の部位と特異的に相互作用する官能基のうち、認識した場合にその情報（以下、「認識情報」とする。）を蛍光部位２０に伝達することができるものである。ここでいう認識情報とは、たとえば、認識部位４０の化学構造内部における電子の配位状態の変化である。

【0041】

たとえば、下記式（８）に示すジピコリルアミノ基に金属イオン（Ｍ^ｎ＋：ただしｎは自然数）が配位された化学構造が認識部位４０となる場合であって、この金属イオンが亜鉛イオン又はカドミウムイオンであるとき、この認識部位４０は、エンドトキシン５０のグルコサミンに結合したリン酸を認識する。

【0042】

【化8】

【0043】

認識部位４０は、特定部位を認識すると、化学構造内で電子の配位状態が変化する。この電子の配位状態の変化が、認識情報として前記した蛍光部位２０に伝達される。認識情報が伝達された蛍光部位２０では電子の配位状態が変化することで、蛍光部位２０の発光強度を増大させ、これにより認識部位４０が特定部位を認識していることが可視化される。

【0044】

スペーサ３０とは、蛍光部位２０と認識部位４０との結合を仲介する物質である。より好ましくは、認識部位４０から蛍光部位２０への認識情報の受け渡しが効率的に行われる大きさ及び構造を有する物質である。具体的には、炭素数２～１２、好ましくは２～１０、さらに好ましくは４～８のアルキル直鎖若しくはこのようなアルキル直鎖の途中に炭素以外の原子（たとえば、酸素、窒素又は硫黄）が介在したもの、又はこれらに側鎖が結合した誘導体であって、蛍光部位２０と認識部位４０とを直鎖として連結する部分は単結合のみであることが望ましい。

【0045】

蛍光部位２０は疎水性であり、認識部位４０は親水性である。したがって、たとえば、スペーサ３０の種類を適切なものにして、蛍光物質１０に十分な親水性を持たせることにより蛍光物質１０が水溶性を持つこととなり、たとえば有機溶媒等に溶かして使用する等の必要がなく、検出精度を高くすることが可能である。スペーサ３０の種類を適切なものにする方法としては、たとえば、スペーサ３０の炭素数を調整したり、水溶性の側鎖を導入したり、窒素等の元素を導入する方法が考えられる。なお、同様の調整を、蛍光部位２０や認識部位４０に対して行うことも可能である。なお、上記したように縮合多環芳香族炭化水素である蛍光部位２０が疎水性であり、この蛍光部位２０がエンドトキシンのリピドＡのアルキル基と親和性が高いため、認識部位４０がリン酸基と配位する際の安定性が高まることになる。

【0046】

具体的な蛍光物質の例としては、前記式（８）に示す、金属イオンが配位されたジピコリルアミノ基と、前記式（５）に示すピレンとが、炭素数２～１０のスペーサを介して結合された物質があり、特に、前記スペーサの炭素数が４である、前記式（１）に示すｄｐａ－Ｃ４Ｐｙが挙げられる。さらには、この金属イオンは亜鉛イオン又はカドミウムイオン、特に亜鉛イオンであることが望ましい。

【0047】

ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙの蛍光部位２０であるピレンは、単体では、たとえば３５０ｎｍの励起波長に対し、３７５ｎｍ及び３９５ｎｍに蛍光強度のピークを示す。このピレンにスペーサ３０（－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－）を介して、亜鉛イオンが配位されたジピコリルアミノ基が認識部位として結合されたｄｐａ－Ｃ４Ｐｙでは、エンドトキシン５０の存在下では、４７０ｎｍ付近における蛍光強度が著しく増強されるエキシマー蛍光が生ずる。これは、亜鉛イオンに配位しているジピコリルアミノ基が、エンドトキシン５０のリン酸基と複合体を形成すると、近傍のリン酸基と複合体を形成したｄｐａ－Ｃ４Ｐｙのピレン同士が重なり合って二量体を形成することで、単体では発生しなかった波長におけるエキシマー蛍光が発生するものと考えられる。

【0048】

＜エンドトキシン検出装置＞
図２は、本開示のエンドトキシン検出装置１００の一例を模式図で示すものである。本開示のエンドトキシン検出装置１００は、被験対象の試料９６０が導入される試料導入部２００と、上述の蛍光物質１０を前記試料に供給する供給部３００と、前記試料９６０と前記蛍光物質１０とが反応する反応部４００と、前記反応を被った前記蛍光物質１０の蛍光を検出する検出部５００と、を備える。本例のエンドトキシン検出装置１００はフローインジェクション分析法（ＦＩＡ、Ｆｌｏｗ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を利用して構成されている。

【0049】

試料導入部２００は、試料９６０を搬送する液体としてのキャリアを貯留するキャリア貯留槽２１０と、キャリアを送液するキャリア送液ポンプ２２０と、キャリアが流動するキャリア送液路２３０と、キャリア送液路２３０に試料９６０が導入される試料導入部２４０とを備えている。キャリアは、試料９６０を搬送することのできる液体であれば特に限定はなく、試料９６０及び蛍光物質１０の性状に応じて、たとえば純水又は各種緩衝液を適宜使用することができる。試料９６０は、エンドトキシン５０を含有しているかどうかが検証される被験対象の液体であり、たとえば、注射剤、輸液、透析液などの溶媒となる精製水又は注射用水等の液体製品や、血液、唾液、尿等の生体液又はその希釈液等が試料９６０となり得る。試料導入部２４０には、上記した液体製品の製造ライン（特に、精製水製造設備や注射用水製造設備）に設けられた試料採取部７００から採取された試料９６０が直接、連続的に導入されることが望ましいが、測定の都度、採取された試料９６０が試料導入部２４０から導入されることとしてもよい。

【0050】

供給部３００は、蛍光物質１０を含有する試薬溶液を貯留する試薬貯留槽３１０と、試薬を送液する試薬送液ポンプ３２０と、試薬が流動する試薬送液路３３０と、キャリア送液路２３０に合流する混合部３４０とを備えている。混合部３４０では、蛍光物質１０が試薬溶液として試料９６０に供給され、そして混合される。蛍光物質１０は、上述のように、蛍光部位２０と、エンドトキシン５０の分子構造の特定部位５１を認識する認識部位４０とがスペーサ３０で連結された構造を有している。蛍光部位２０、認識部位４０及びスペーサ３０の意義については上述したとおりである。

【0051】

反応部４００では、試料９６０にエンドトキシン５０が含有されている場合、試薬中の蛍光物質１０とエンドトキシン５０との反応が発生し、蛍光物質１０から発光が生ずる。反応部４００としては、一般の検出システムで採用される反応コイルが用いられるが、単純なキャピラリ管を反応部４００としてもよい。

【0052】

検出部５００では、上述の反応を被った蛍光物質１０の発光が光学的に検出される。検出部５００としては、一般の発光検出器を使用可能である。

【0053】

なお、本開示のエンドトキシン検出装置１００は、上述のＦＩＡを利用した構成に限定されず、たとえば、ＣＦＡ（連続流れ分析法）、ＳＩＡ（逐次注入分析法）、ｒ－ＦＩＡ（リバースフローインジェクション分析法）を含めたＦＣＡ（液体流れ分析法）を利用した構成でも実現可能である。

【0054】

本開示のエンドトキシン検出装置１００においては、そして、蛍光物質１０として、特定部位５１としてのリン酸基と反応するｄｐａ－Ｃ４Ｐｙ（前記式（１））を用いることが望ましい。

【0055】

＜精製水製造設備＞
図３は、本開示の精製水製造設備６００の一例の概略構成を模式図で示すものである。本開示の精製水製造設備６００は、原水９００から精製水９２０を得る精製水製造部６１０と、精製水９２０から被験対象の試料９６０を採取する試料採取部７００と、前記のエンドトキシン検出装置１００と、を備える。

【0056】

精製水製造部６１０は、たとえば、原水９００を逆浸透ろ過する逆浸透膜装置、及び、原水をイオン交換するイオン交換装置のうちの少なくとも一方による処理で、原水９００から不純物を除去して、精製水９２０を製造する設備である。イオン交換装置には、たとえば、電気式脱塩装置や、混床式イオン交換樹脂装置を用いることができる。

【0057】

試料採取部７００は、精製水製造部６１０の下流側で、精製水９２０の搬送ラインの途中に設けられる。試料採取部７００により採取された精製水９２０は、被験対象の試料９６０として、前記した試料導入部２４０（図２参照）からエンドトキシン検出装置１００に導入される。エンドトキシン検出装置１００の詳細は上述のとおりである。これにより、精製水９２０から採取された被験対象の試料９６０が、上述のエンドトキシン検出方法に供されることになる。

【0058】

上記の構成により、本開示の精製水製造設備６００では、製造された精製水９２０から随時試料９６０を採取して、エンドトキシン検出装置１００によりリアルタイムでエンドトキシン５０を検出することが可能となる。そして、エンドトキシン５０の濃度が所定の基準値を超えた場合には、たとえば即時に精製水製造設備６００を停止して、部品交換又は修理等の適切な処置を講じることができる。

【0059】

＜注射用水製造設備＞
図４は、本開示の注射用水製造設備８００の一例の概略構成を模式図で示すものである。本開示の注射用水製造設備８００は、原水９００から精製水９２０を得る精製水製造部６１０と、精製水９２０から注射用水９４０を得る注射用水製造部８１０と、注射用水９４０を加熱した状態で維持して貯留する注射用水タンク８２０と、注射用水タンク８２０に備えられている注射用水９４０を所定の使用場所８５０へ送出する送出ライン８３０と、注射用水９４０から被験対象の試料９６０を採取する試料採取部７００と、前記のエンドトキシン検出装置１００と、を備える。

【0060】

精製水製造部６１０については、前記の精製水製造設備６００で説明したとおりである。

【0061】

注射用水製造部８１０では、高分子膜ろ過装置（好ましくは限外ろ過膜装置）により、精製水９２０をろ過することでエンドトキシン５０等の不純物を高度に除去して、注射用水９４０が製造される。なお、高分子膜ろ過装置の代わりに、蒸留器を用いてもよい。

【0062】

なお、この精製水製造部６１０にエンドトキシン検出装置１００が設けられており精製水９２０のエンドトキシン濃度が分かっている場合、それに合わせて注射用水製造部８１０の運転条件を調整してもよい。たとえば、精製水９２０のエンドトキシン濃度が十分に低いと分かっている場合は、そのぶんだけエンドトキシン除去能力を下げて高分子膜ろ過装置の透過水量を上げ、注射用水９４０の生産量を増やしてもよい。

【0063】

注射用水タンク８２０には、たとえば熱交換器のような加熱装置が装着され、注射用水９４０中の細菌等の増殖を防ぎ、清潔な状態を保つために、たとえば６０℃以上、望ましくは７０℃以上の温度状態が維持される。なお、この温度状態を維持しつつ、注射用水９４０の滞留を防ぐために、循環配管を用いてこの注射用水タンク８２０を構成することが望ましい。

【0064】

送出ライン８３０は、随時、又は必要に応じて、注射用水タンク８２０に貯留されている注射用水９４０を、所定の使用場所８５０へ送出する。ここでいう所定の使用場所８５０とは、たとえば、注射用水９４０の梱包設備、又は、注射液の製造設備等、注射用水９４０の用途に応じた様々な設備が想定される。

【0065】

試料採取部７００は、注射用水製造設備８００において、注射用水製造部８１０の下流側の所定の箇所に設けられる。試料採取部７００により採取された精製水９２０は、被験対象の試料９６０として、前記した試料導入部２４０（図２参照）からエンドトキシン検出装置１００に導入される。エンドトキシン検出装置１００の詳細は上述のとおりである。試料採取部７００が設けられる箇所としては、図４に示すように、注射用水製造部８１０より下流側でかつ注射用水タンク８２０より上流側か、注射用水タンク８２０に直接（たとえば、循環配管の途中）か、又は送出ライン８３０の途中かの、いずれに設けてもよい。いずれの場合も、注射用水９４０から採取された被験対象の試料９６０が、上述のエンドトキシン検出方法に供されることになる。

【0066】

試料採取部７００を注射用水製造部８１０より下流側でかつ注射用水タンク８２０より上流側に設ける場合、注射用水製造部８１０で製造された直後の注射用水９４０のエンドトキシン濃度が、たとえば日本薬局方に記載の基準（０．２５ＥＵ/ｍL）を満たしているかどうかを、実質的に常時確認することができる。そして、万一この基準を満たしていない場合は、すぐに下流への注射用水９４０の供給を止めることで、その時点で下流の注射用水タンク８２０に貯留されている基準を満たした状態の注射用水９４０へのコンタミネーションを防ぐことができる。なお、実質的に常時とは、たとえば、繰り返し測定時間を３０分以内、好ましくは１０分以内とする測定をいう。下流側の装置の保有水量及び装置の造水量を考慮すると、これらの頻度で測定を繰り返すことにより、トラブルによる水質悪化によるコンタミネーションにより、注射用水の製造を止めることなく運転できる。

【0067】

試料採取部７００を注射用水タンク８２０に直接設ける場合、循環貯留されている注射用水９４０が上記基準を満たしているかどうかを実質的に常時モニターすることができる。そして、たとえば上記基準を満たしていることが確認されているときのみ注射用水９４０を送出ライン８３０に供給し、万一上記基準を満たしていないときは図示していない返送ラインを用いて注射用水９４０を注射用水製造部８１０の上流側に戻し、注射用水製造部８１０で再処理するようにしてもよい。

【0068】

本発明のエンドトキシン検出装置１００は十分な測定精度があるため、実質的に常時モニターすることにより、前段の装置の不具合だけでなく、不具合の予兆も確認できる。たとえば、製造される注射用水９４０のエンドトキシン測定値が、エンドトキシンの基準値を満たすものの、わずかな上昇傾向を示した場合、これは前段の装置の性能悪化の予兆であることも多く、これをそのまま放置すると、製造される注射用水９４０がエンドトキシンの基準値を満たさなくなる場合もある。すなわち、注射用水製造装置の不具合を事前に検出する事で、トラブルを回避することが可能である。たとえば、前段の装置の運転条件を変更したり、メンテナンスを行うことにより対応可能である。

【0069】

試料採取部７００を送出ライン８３０に設ける場合、実際に使用される時点での注射用水９４０のエンドトキシン濃度を直接モニターすることができる。また、たとえば、使用場所８５０の直前にタンクを設置し、タンク内に注射用水を貯留して、これを使用場所８５０に供給し、タンクが空になったら再度注射用水を貯留するというバッチ式の使用も考えられる。そして、タンク内の注射用水のエンドトキシン濃度をエンドトキシン検出装置１００で各バッチ毎に確認することで、エンドトキシン濃度が管理基準を満たす注射用水の使用を保障することができる。

【0070】

以上述べた、３箇所はいずれも試料採取部７００を設置する利点がありいずれも好ましい設置箇所であるが、注射用水９４０のエンドトキシン５０汚染を最も早期に検出できる点で、注射用水製造部８１０より下流側でかつ注射用水タンク８２０より上流側に設けるのが最も好ましい。また、可能であれば３箇所のうち２箇所以上に試料採取部７００を設置することとしてもよい。

【0071】

上記の構成により、本開示の注射用水製造設備８００では、製造された注射用水９４０から随時試料９６０を採取して、エンドトキシン検出装置１００によりリアルタイムでエンドトキシン５０を検出することが可能となる。そして、エンドトキシン５０の濃度が所定の基準値を超えた場合には、即時に注射用水製造設備８００を停止して、部品交換又は修理等の適切な処置を講じることができる。これにより、要求水質の注射用水９４０を安定的に製造できるようになる。

【0072】

また、本開示の注射用水製造設備８００では、試料９６０となる注射用水９４０の不純物濃度は十分に小さくなっており、他の不純物による影響を最小限にすることができるため、特にエンドトキシン濃度を精度よく測定することができる。また、試料９６０となる注射用水９４０の粘性は十分に低いため、特にキャリア溶液等で希釈する必要がなく、エンドトキシン検出装置１００へ直接送液することができる。これにより、キャリア溶液が不要となり、試料９６０を不必要にキャリアで希釈することがなくなるという利点もある。

【0073】

なお、試料採取部７００を、注射用水タンク８２０に直接、又は、送出ライン８３０に設置する場合、試料９６０は加熱された状態で採取されることになる。このような高温の試料９６０は、エンドトキシン検出装置１００に供給される前に、熱交換器等で常温に冷却することが好ましい。

【実施例0074】

（１）ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙによるエンドトキシンの測定
ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙを用いてエンドトキシンの測定を試みた。実験方法は以下のとおりとした。

【0075】

測定サンプルとして、下記表１に示す組成のサンプル１～サンプル７を、１０ｍＬメスフラスコで調製した。なお、表中の単位である「Ｍ」は、「ｍｏｌＬ^－１」を意味する。

【0076】

【表1】

【0077】

上記サンプル１～サンプル７を、光路長１ｃｍの石英セルに取り、蛍光分光光度計で蛍光スペクトルを測定した。測定条件は以下のとおりとした。
励起波長：３５０ｎｍ
開始波長：３６０ｎｍ
終了波長：５８０ｎｍ

【0078】

本測定条件により、いずれのサンプルの測定も５分以内に終えることができた。

【0079】

上記サンプル１～サンプル７の蛍光スペクトルは、図５に示すとおりである。図５の縦軸は蛍光強度を、横軸は波長（ｎｍ）をそれぞれ示す。なお、図中のグラフは、エンドトキシン（ＬＰＳ）濃度が高いサンプルほど上側の曲線として描かれている。

【0080】

エンドトキシン濃度が０であるサンプル１では、３７５ｎｍ及び３９５ｎｍ付近に蛍光強度のピークが現れるが、４７０ｎｍ付近の蛍光強度はほぼ０であった。しかし、エンドトキシン濃度が高くなるほど、４７０ｎｍ付近に現れるエキシマー蛍光の蛍光強度のピークが高くなった。

【0081】

図６は、図５におけるサンプルのエンドトキシン（ＬＰＳ）濃度とエキシマー蛍光の蛍光強度のピークとの関係をプロットしたグラフである。図６の横軸はエンドトキシン（ＬＰＳ）濃度（μＭ）を示し、縦軸は蛍光スペクトル変化（エンドトキシンを添加したサンプルの波長４７０ｎｍの蛍光強度（Ｆ）から、エンドトキシンが添加されていないサンプル１の波長４７０ｎｍの蛍光強度（Ｆ_０）を差し引いた値）を示す。このグラフから、波長４７０ｎｍの蛍光強度は、エンドトキシン濃度と強い正の相関関係があることが推認される。よって、亜鉛イオンが配位されたｄｐａ－Ｃ４Ｐｙによって、少なくとも１μＭまでの濃度のエンドトキシンが測定し得ると考えられた。

【0082】

（２）各種蛍光物質と配位される金属イオン
次に、各種蛍光物質と、これらに配位される金属イオンとの相違による、エンドトキシンに対する蛍光強度を比較した。

【0083】

前記式（１）に示すｄｐａ－Ｃ４Ｐｙに加え、下記式（９）に示すｄｐａ－Ｃ１Ｐｙ及び下記式（１０）に示すｄｐａ－ＨＣＣを蛍光物質として使用した。

【0084】

【化9】

【0085】

【化10】

【0086】

ここで、式（９）に示すｄｐａ－Ｃ１Ｐｙは、ｄｐａ－Ｃ４Ｐｙのスペーサである炭素数４のテトラメチレン基（－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－）を、炭素数１のモノメチレン基（－ＣＨ_２－）に置換した蛍光物質である。また、式（１０）に示すｄｐａ－ＨＣＣは、金属イオンが配位されたジピコリルアミノ基を認識部位とし、７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸を蛍光部位として、これらを炭素数１のスペーサで連結した蛍光物質である。

【0087】

下記表２に示す組成のサンプル８～サンプル１３を、１０ｍＬメスフラスコで調製した。なお、表中の単位である「Ｍ」は、「ｍｏｌＬ^－１」を意味する。

【0088】

【表2】

【0089】

上記サンプル８～１３を、前記（１）と同条件にて測定した。そして、測定により得られた蛍光スペクトルにおいて、上記表２に示した測定波長における蛍光強度（Ｆ）の、各々エンドトキシン濃度が０の時の蛍光強度（Ｆ_０）に対する比率を図７及び図８に示す。なお、図７及び図８は、金属イオンとして銅イオン及び亜鉛イオンを使用した場合をそれぞれ示している。その結果、金属イオンとして亜鉛イオンを配位させたｄｐａ－Ｃ４Ｐｙを蛍光物質として使用することで、エンドトキシンに対する感度が飛躍的に高まった。

【0090】

（３）蛍光部位及びスペーサ
次に、蛍光物質につき、蛍光部位の種類及びスペーサの炭素数がエンドトキシンの感度に与える影響を検証した。すなわち、上記表２のサンプル１３を実施例１とし、この実施例１に対し蛍光物質を様々に変えたものを比較例及び実施例２～６とした。各実施例及び比較例の蛍光物質は下記表３のとおりであった。なお、いずれの実施例及び比較例においても、認識部位は全てジピコリルアミノ基（式（８））であり、これに配位される金属イオンは亜鉛イオンであった。

【0091】

【表3】

【0092】

上記各実施例及び比較例につき、前記（１）と同条件にて測定した。そして、測定により得られた蛍光スペクトルにおいて、上記表３に示した測定波長における蛍光強度（Ｆ）の、各々エンドトキシン濃度が０の時の蛍光強度（Ｆ_０）に対する比率が上記表３における感度比である。なお、比較例における測定波長は、エンドトキシン無添加でも蛍光するピークがエンドトキシンを添加することで、蛍光が増大することを利用して測定したものである。また、各実施例における測定波長は、エンドトキシン無添加で蛍光がほとんど起きない波長において、エンドトキシン添加で新たに生じたエキシマー蛍光を測定したものである。このようになる波長は、３５０～９００ｎｍであり、測定感度の点から３９０～
５２０ｎｍがより好ましい。上記の実施例の結果からは、縮合多環芳香族炭化水素を構成する環数が３～６で、かつ、スペーサの炭素数が３～６であれば、感度比が大幅に向上することが分かった。また、上記表３の実施例のうちでは、環数が４のピレンを蛍光部位に持ち、スペーサの炭素数が４である実施例１のｄｐａ－Ｃ４Ｐｙが最も蛍光物質として優れていることが分かった。

【0093】

なお、上記表３に示した以外の蛍光物質での測定結果も総合すると、エキシマー蛍光を発する物質（換言すると、平面構造を有する縮合多環芳香族炭化水素）を蛍光部位に用い、二分子間の蛍光部位が重なる適切な長さのアルキル鎖のスペーサを選択することで、エンドトキシンを高感度に検出することが可能となることが分かった。また、縮合多環芳香族炭化水素を構成する環数としては、１～８を用いることができ、２～６が好ましく、２～４がさらに好ましいことが分かった。さらに、スペーサの炭素数は２～１２を用いることができ、２～１０が好ましく、４～８がさらに好ましいことが分かった。なお、スペーサの炭素数が１と短い場合は、リン酸基に配位した蛍光物質の蛍光部位が重なり合って二量体を形成するには距離が短すぎるため、エキシマー蛍光が生じない一方、スペーサの炭素数が適切である場合には、蛍光部位同士が重なり合って二量体を形成することができるため、蛍光部位が本来蛍光を発しない新たな波長に強いエキシマー蛍光が生ずると考えられる。

【0094】

（４）測定時間
蛍光物質としてｄｐａ－Ｃ４Ｐｙを用いてエンドトキシンを検出する場合の適切な測定時間を検証した。すなわち、測定サンプルとして、前記表１に示すサンプル４を１０ｍＬメスフラスコで調製したものを、９サンプル調製した。各サンプルについては、調製後、６秒、１分、２分、３分、４分、８分、１２分、１６分及び２０分の各インキュベーション時間経過後に、光路長１ｃｍの石英セル内に注入した後、蛍光分光光度計で４７０ｎｍの蛍光強度を励起波長３５０ｎｍにて測定した。

【0095】

その結果、測定開始後１分～２分にかけて、エキシマー蛍光の蛍光強度が最大となり、その後は漸減していった。これにより、蛍光物質としてｄｐａ－Ｃ４Ｐｙを用いてエンドトキシンを検出する場合の適切な測定時間は、測定開始後１分～２分であることが分かった。

【符号の説明】

【0096】

１０ 蛍光物質 ２０ 蛍光部位 ３０ スペーサ
４０ 認識部位 ５０ エンドトキシン ５１ 特定部位
１００ エンドトキシン検出装置
２００ 試料導入部 ２１０ キャリア貯留槽 ２２０ キャリア送液ポンプ
２３０ キャリア送液路 ２４０ 試料導入部
３００ 供給部 ３１０ 試薬貯留槽 ３２０ 試薬送液ポンプ
３３０ 試薬送液路 ３４０ 混合部
４００ 反応部
５００ 検出部
６００ 精製水製造設備 ６１０ 精製水製造部
７００ 試料採取部
８００ 注射用水製造設備 ８１０ 注射用水製造部 ８２０ 注射用水タンク
８３０ 送出ライン ８５０ 使用場所
９００ 原水 ９２０ 精製水 ９４０ 注射用水
９６０ 試料

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】