特開 2023-67953 プラズモン特異的結合パートナーアッセイにおけるシグナル増幅

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023067953

(43)【公開日】2023-05-16

(54)【発明の名称】プラズモン特異的結合パートナーアッセイにおけるシグナル増幅

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20230509BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230509BHJP

   G01N 21/41 20060101ALI20230509BHJP

【ＦＩ】

G01N33/543 595

G01N33/53 E

G01N33/53 D

G01N33/53 N

G01N21/41 102

【審査請求】有

【請求項の数】45

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023032372

(22)【出願日】2023-03-03

(62)【分割の表示】P 2021149078の分割

【原出願日】2015-08-13

(31)【優先権主張番号】62/037,071

(32)【優先日】2014-08-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/082,468

(32)【優先日】2014-11-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】521282871

【氏名又は名称】ゾエティス サービシズ リミテッド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】メーラ ラジェッシュ ケイ．

(72)【発明者】

【氏名】チャン ヴィンセント

(72)【発明者】

【氏名】アロン ケニス ピー．

(72)【発明者】

【氏名】クレル アッシャー

(57)【要約】

【課題】本発明は、試料中の微量の標的分析物を検出するため、分析物検出デバイス及びかかるデバイスの使用方法を提供する。
【解決手段】分析物検出デバイスは、分析物の結合パートナーにコンジュゲートしている複数の複合金属ナノ構造体、及び複数の捕捉分子が固定化された金属ナノ層を含有する表面を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下を含む、分析物検出デバイス：
標的分析物に特異的に結合することができる結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む、複数の検出コンジュゲート；
金属ナノ層を含有する表面；及び
該金属ナノ層上に固定化されておりかつ該標的分析物に特異的に結合することができる、複数の捕捉分子。

【請求項2】

以下を含む、分析物検出デバイス：
標的分析物と結合している複合金属ナノ構造体を含む、複数の検出コンジュゲート；
金属ナノ層を含有する表面；及び
該金属ナノ層上に固定化されておりかつ該標的分析物に特異的に結合することができる、複数の捕捉分子。

【請求項3】

前記複合金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケル、及び亜鉛から選択される少なくとも２種の金属を含む、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項4】

前記複合金属ナノ構造体の各々が、第一の金属からなるコア及び第二の金属からなるコーティングを含む、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項5】

前記複合金属ナノ構造体の各々が、金のコーティング及び銀のコアを含む、請求項４に記載の分析物検出デバイス。

【請求項6】

前記複合金属ナノ構造体の各々が、第一の金属と第二の金属の合金である、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項7】

前記複合金属ナノ構造体が、球状ナノ粒子でありかつ約５ｎｍから約２００ｎｍの直径を有する、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項8】

前記複合金属ナノ構造体が、球状ナノ粒子でありかつ約１０ｎｍから約１００ｎｍの直径を有する、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項9】

前記複合金属ナノ構造体が、エッジ長が約１０ｎｍから約８００ｎｍでありかつ厚さが約１ｎｍから約１００ｎｍのナノプレートである、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項10】

前記複数の検出コンジュゲートが、凍結乾燥されたペレットまたはビーズの形である、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項11】

前記表面が、チップ、ウェル、ビーズ、またはキュベットの壁、蓋、及び／もしくは底部である、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項12】

前記金属ナノ層が金属フィルムである、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項13】

前記金属フィルムが、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、請求項１２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項14】

前記金属フィルムが金を含む、請求項１２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項15】

前記金属ナノ層が、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項16】

前記複数の金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、請求項１５に記載の分析物検出デバイス。

【請求項17】

前記複数の金属ナノ構造体が金ナノ構造体である、請求項１５に記載の分析物検出デバイス。

【請求項18】

前記複合ナノ構造体が、球状ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノシェル、ナノチューブ、ナノロッド、ナノドット、ナノアイランド、ナノワイヤ、またはそれらの組合せから選択される形状を有する、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項19】

前記結合パートナー及び／または捕捉分子が、抗体、抗原、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、アプタマー、リガンド、受容体、またはハプテンである、請求項１に記載の分析物検出デバイス。

【請求項20】

前記結合パートナーが、標的分析物の第一のエピトープを認識する抗体であり、かつ前記捕捉分子が、標的分析物の第二のエピトープを認識する異なる抗体である、請求項１に記載の分析物検出デバイス。

【請求項21】

前記捕捉分子が、抗体、抗原、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、アプタマー、リガンド、受容体、またはハプテンである、請求項２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項22】

前記標的分析物が、感染症、生理学的状態、または病理学的状態に関連するマーカーまたは抗原である、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項23】

前記標的分析物が、イヌ糸状虫、ネコ白血病ウイルス、イヌパルボウイルス、Ｃ反応性タンパク質、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、エールリヒア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）抗原もしくは抗体、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）抗原もしくは抗体、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）抗原もしくは抗体、がん抗原、心臓マーカー抗原、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、トロポニン、または脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項１または２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項24】

以下の工程を含む、試料中の標的分析物の検出方法：
該試料を複数の検出コンジュゲートと混合する工程であって、該コンジュゲートが、結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含み、該結合パートナーが、該試料中に該標的分析物が存在する場合に該標的分析物に特異的に結合することができ、それにより分析物－検出コンジュゲート複合体が形成される、工程；
該混合物を、金属ナノ層を含有する表面に接触させる工程であって、該金属ナノ層上に複数の捕捉分子が固定化されており、かつ、該複数の捕捉分子が、該試料中に該標的分析物が存在する場合に該標的分析物に特異的に結合することができる、工程；
該表面を紫外‐可視‐赤外スペクトルの波長範囲内の光源に暴露する工程；及び
該表面からの光シグナルを測定する工程であって、該光シグナルの変化が、該試料中に該標的分析物が存在することを示す、工程。

【請求項25】

前記光シグナルが、反射率、吸光度スペクトル、散乱スペクトル、または発光スペクトルである、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記光シグナルの変化が、スペクトルピーク波長シフトを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

ナノグラム量の前記標的分析物の存在が検出される、請求項２４に記載の方法。

【請求項28】

ピコグラム量の前記標的分析物の存在が検出される、請求項２４に記載の方法。

【請求項29】

フェムトグラム量の前記標的分析物の存在が検出される、請求項２４に記載の方法。

【請求項30】

前記表面が、遠心ロータに組み込まれるキュベットの壁または底部である、請求項２４に記載の方法。

【請求項31】

前記複合金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケル、及び亜鉛から選択される少なくとも２種の金属を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項32】

前記複合金属ナノ構造体の各々が、第一の金属からなるコア及び第二の金属からなるコーティングを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項33】

前記複合金属ナノ構造体の各々が、金のコーティング及び銀のコアを含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記複合金属ナノ構造体の各々が、第一の金属と第二の金属の合金である、請求項２４に記載の方法。

【請求項35】

前記金属ナノ層が金属フィルムである、請求項２４に記載の方法。

【請求項36】

前記金属フィルムが金を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記金属ナノ層が、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項38】

前記複数の金属ナノ構造体が金ナノ構造体である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記複合ナノ構造体が、球状ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノチューブ、ナノシェル、ナノロッド、ナノアイランド、ナノドット、ナノワイヤ、またはそれらの組合せから選択される形状を有する、請求項２４に記載の方法。

【請求項40】

以下の工程を含む、複合金属ナノ構造体の調製方法：
ポリマーと塩化金酸の混合物を含む第一の溶液を調製する工程；
銀または銅ナノ構造体を含む第二の溶液を調製する工程；及び
該第一の溶液と該第二の溶液を一定期間インキュベートする工程であって、得られる混合物が、金でコーティングされた銀ナノ構造体または金でコーティングされた銅ナノ構造体を含む、工程。

【請求項41】

前記第二の溶液が、銀ナノ構造体を含み、かつ、約５５０～７５０ｎｍのピーク吸光度を有する、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記ポリマーが、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリエチレングリコール、またはポリエチレンイミンである、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

以下を含む、アッセイ複合体：
結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む検出コンジュゲート；
標的分析物；及び
捕捉分子が固定化された金属ナノ層でコーティングされたビーズであって、該検出コンジュゲート中の該結合パートナーが該標的分析物上の第一のエピトープと結合し、かつ、該捕捉分子が該標的分析物上の第二のエピトープと結合し、それによって、該検出コンジュゲート、標的分析物、及び該捕捉分子を含む複合体が形成される、ビーズ。

【請求項44】

前記結合パートナーが抗体であり、かつ、前記捕捉分子が異なる抗体である、請求項４３に記載のアッセイ複合体。

【請求項45】

前記金属ナノ層が金属フィルムである、請求項４３に記載のアッセイ複合体。

【請求項46】

前記金属フィルムが、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、請求項４５に記載のアッセイ複合体。

【請求項47】

前記金属フィルムが金を含む、請求項４６に記載のアッセイ複合体。

【請求項48】

前記金属ナノ層が、前記ビーズに固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、請求項４３に記載のアッセイ複合体。

【請求項49】

前記複数の金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、請求項４８に記載のアッセイ複合体。

【請求項50】

前記複数の金属ナノ構造体が金ナノ構造体である、請求項４９に記載のアッセイ複合体。

【請求項51】

前記複合金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケル、及び亜鉛から選択される少なくとも２種の金属を含む、請求項４３に記載のアッセイ複合体。

【請求項52】

前記複合金属ナノ構造体が、第一の金属からなるコア及び第二の金属からなるコーティングを含む、請求項４３に記載のアッセイ複合体。

【請求項53】

前記複合金属ナノ構造体が、金のコーティング及び銀のコアを含む、請求項４３に記載のアッセイ複合体。

【請求項54】

前記複合金属ナノ構造体が、第一の金属と第二の金属の合金である、請求項４３に記載のアッセイ複合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年８月１３日に出願された米国仮出願第６２／０３７，０７１号、及び、２０１４年１１月２０日に出願された米国仮出願第６２／０８２，４６８号の優先権を主張する。これら仮出願の各々は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は、試料中の標的分析物の検出システム及び検出方法に関する。とりわけ、本発明は、試料中の微量の標的分析物の検出が可能な局在プラズモン共鳴に基づく分析物検出システムを提供する。

【背景技術】

【0003】

現行の免疫アッセイ及び生体分子結合アッセイは、通常、複数の工程及びこれらアッセイを行うための高機能の機器を要する。かかる不均質なアッセイの実施に伴う感度の不足及び複雑性は、標識された特異的結合パートナーを非標識の特異的結合パートナーと分離するという特定の必要性に起因する。

【0004】

貴金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）特性に基づくアッセイを開発する試みがなされている（Ｔｏｋｅｌら， Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．， Ｖｏｌ． １１４： ５７２８‐５７５２， ２０１４（非特許文献1））。ＬＳＰＲは、入射光によって誘導されるナノメートルサイズの構造体における電子の集団振動である。金属ナノ粒子は、それらのごく近傍での屈折率の変化に対する強い電磁応答性を有し、ひいては該ナノ粒子の共振周波数のシフトが、該ナノ粒子表面への分子の結合の指標として測定されうる。金属ナノ粒子、とりわけ金ナノ粒子が、結合事象を検出するための診断アッセイに用いられているが、かかるアッセイは、一般に、感度が低く、逐次結合事象の反応速度を定量的にモニタリングするには用いることができない。

【0005】

従って、感度の向上をもたらしながら、均質な形式を採用する改良されたアッセイ法が必要である。分光法等の標準的な実験技術を利用したアッセイもまた望まれる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｔｏｋｅｌら， Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．， Ｖｏｌ． １１４： ５７２８‐５７５２， ２０１４

【発明の概要】

【0007】

本発明は、一部分において、複合金属ナノ構造体が、金属ナノ層表面への分子の結合によって誘導される光シグナルを増強することができるという発見に基づく。観測される増幅は、サブピコグラム量の生体分子が検出できるように、特定の生体分子の結合事象の検出感度を著しく高める。従って、本発明は、試料中の微量の標的分析物を検出するため、分析物検出デバイス及びかかるデバイスの使用方法を提供する。

【0008】

１つの実施形態では、前記分析物検出デバイスは、複数の検出コンジュゲート、金属ナノ層を含有する表面、及び複数の捕捉分子を含み、ここで、該捕捉分子は、該金属ナノ層上に固定化されており、かつ、該標的分析物に特異的に結合することができる。前記分析物検出デバイスがサンドイッチアッセイ形式で構成される実施形態では、前記検出コンジュゲートは、前記標的分析物に特異的に結合することができる結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む。前記分析物検出デバイスが直接競合アッセイ形式で構成される実施形態では、前記検出コンジュゲートは、標的分析物と結合している金属ナノ構造体を含む。

【0009】

前記検出コンジュゲート中の前記複合金属ナノ構造体は、一般に、少なくとも２種の貴金属、遷移金属、アルカリ金属、ランタニド元素、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケル、及び亜鉛から選択される少なくとも２種の金属を含む。特定の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体の各々は、第一の金属からなるコアと第二の金属からなるコーティングを含む。いくつかの実施形態では、前記コアは、金のコーティングを備えた銀または銅でもよい。他の実施形態では、第一の金属からなる前記コアは、前記第二のコーティング金属結果物からなる中空構造が生じるように、コーティング後に溶解されてもよい。

【0010】

前記表面上に堆積した前記金属ナノ層は、金属フィルムでもよいし、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体からなっていてもよい。前記金属ナノ層はまた、貴金属または遷移金属からなっていてもよい。いくつかの実施形態では、前記金属ナノ層は、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む。１つの実施形態では、前記金属ナノ層は金を含む。別の実施形態では、前記金属ナノ層は銀を含む。さらに別の実施形態では、前記金属ナノ層は、金ナノ層を重ねた銀ナノ層を含む。

【0011】

本発明はまた、本明細書に記載の分析物検出デバイスを用いた試料中の標的分析物の検出方法を提供する。１つの実施形態では、前記方法は、当該試料を複数の検出コンジュゲートと混合する工程、該混合物を複数の捕捉分子が固定化された金属ナノ層を含有する表面に接触させる工程、該表面を紫外‐可視‐赤外スペクトルの波長範囲内の光源に暴露する工程；及び該表面からの光シグナルを測定する工程を含み、ここで、該光シグナルの変化は、該試料中に該標的分析物が存在することを示す。特定の実施形態では、本発明の方法は、試料中のフェムトグラムからナノグラム量の標的分析物の検出が可能である。

【0012】

本発明は、結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む検出コンジュゲート；標的分析物；及び捕捉分子が固定化された金属ナノ層でコーティングされたビーズを含むアッセイ複合体を含み、該検出コンジュゲート中の該結合パートナーが該標的分析物上の第一のエピトープと結合し、かつ、該捕捉分子が該標的分析物上の第二のエピトープと結合し、それによって、該検出コンジュゲートと標的分析物と該捕捉分子とを含む複合体が形成される。いくつかの実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、金でコーティングされた銀ナノ構造体または金でコーティングされた銅ナノ構造体であって、前記ビーズ上の前記金属ナノ層コーティングは、金を含む。

【0013】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の検出デバイス及び方法に用いる複合金属ナノ構造体の調製方法を提供する。１つの実施形態では、前記方法は、ポリマーと塩化金酸の混合物を含む第一の溶液を調製する工程、銀または銅ナノ構造体を含む第二の溶液を調製する工程、及び該第一の溶液と該第二の溶液を一定期間インキュベートする工程を含み、ここで、得られる混合物は、金でコーティングされた銀ナノ構造体または金でコーティングされた銅ナノ構造体を含む。特定の実施形態では、アスコルビン酸等の還元剤を前記反応混合物に添加し、ナノ構造体の生産量を増やす。１つの実施形態では、前記第一の溶液中の前記ポリマーはポリビニルピロリドンである。別の実施形態では、前記第一の溶液中の前記ポリマーはポリビニルアルコールである。
[本発明1001]
以下を含む、分析物検出デバイス：
標的分析物に特異的に結合することができる結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む、複数の検出コンジュゲート；
金属ナノ層を含有する表面；及び
該金属ナノ層上に固定化されておりかつ該標的分析物に特異的に結合することができる、複数の捕捉分子。
[本発明1002]
以下を含む、分析物検出デバイス：
標的分析物と結合している複合金属ナノ構造体を含む、複数の検出コンジュゲート；
金属ナノ層を含有する表面；及び
該金属ナノ層上に固定化されておりかつ該標的分析物に特異的に結合することができる、複数の捕捉分子。
[本発明1003]
前記複合金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケル、及び亜鉛から選択される少なくとも2種の金属を含む、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1004]
前記複合金属ナノ構造体の各々が、第一の金属からなるコア及び第二の金属からなるコーティングを含む、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1005]
前記複合金属ナノ構造体の各々が、金のコーティング及び銀のコアを含む、本発明1004の分析物検出デバイス。
[本発明1006]
前記複合金属ナノ構造体の各々が、第一の金属と第二の金属の合金である、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1007]
前記複合金属ナノ構造体が、球状ナノ粒子でありかつ約5ｎｍから約200ｎｍの直径を有する、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1008]
前記複合金属ナノ構造体が、球状ナノ粒子でありかつ約10ｎｍから約100ｎｍの直径を有する、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1009]
前記複合金属ナノ構造体が、エッジ長が約10ｎｍから約800ｎｍでありかつ厚さが約1ｎｍから約100ｎｍのナノプレートである、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1010]
前記複数の検出コンジュゲートが、凍結乾燥されたペレットまたはビーズの形である、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1011]
前記表面が、チップ、ウェル、ビーズ、またはキュベットの壁、蓋、及び／もしくは底部である、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1012]
前記金属ナノ層が金属フィルムである、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1013]
前記金属フィルムが、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、本発明1012の分析物検出デバイス。
[本発明1014]
前記金属フィルムが金を含む、本発明1012の分析物検出デバイス。
[本発明1015]
前記金属ナノ層が、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1016]
前記複数の金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、本発明1015の分析物検出デバイス。
[本発明1017]
前記複数の金属ナノ構造体が金ナノ構造体である、本発明1015の分析物検出デバイス。
[本発明1018]
前記複合ナノ構造体が、球状ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノシェル、ナノチューブ、ナノロッド、ナノドット、ナノアイランド、ナノワイヤ、またはそれらの組合せから選択される形状を有する、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1019]
前記結合パートナー及び／または捕捉分子が、抗体、抗原、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、アプタマー、リガンド、受容体、またはハプテンである、本発明1001の分析物検出デバイス。
[本発明1020]
前記結合パートナーが、標的分析物の第一のエピトープを認識する抗体であり、かつ前記捕捉分子が、標的分析物の第二のエピトープを認識する異なる抗体である、本発明1001の分析物検出デバイス。
[本発明1021]
前記捕捉分子が、抗体、抗原、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、アプタマー、リガンド、受容体、またはハプテンである、本発明1002の分析物検出デバイス。
[本発明1022]
前記標的分析物が、感染症、生理学的状態、または病理学的状態に関連するマーカーまたは抗原である、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1023]
前記標的分析物が、イヌ糸状虫、ネコ白血病ウイルス、イヌパルボウイルス、Ｃ反応性タンパク質、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、エールリヒア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）抗原もしくは抗体、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）抗原もしくは抗体、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）抗原もしくは抗体、がん抗原、心臓マーカー抗原、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、トロポニン、または脳性ナトリウム利尿ペプチドである、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1024]
以下の工程を含む、試料中の標的分析物の検出方法：
該試料を複数の検出コンジュゲートと混合する工程であって、該コンジュゲートが、結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含み、該結合パートナーが、該試料中に該標的分析物が存在する場合に該標的分析物に特異的に結合することができ、それにより分析物－検出コンジュゲート複合体が形成される、工程；
該混合物を、金属ナノ層を含有する表面に接触させる工程であって、該金属ナノ層上に複数の捕捉分子が固定化されており、かつ、該複数の捕捉分子が、該試料中に該標的分析物が存在する場合に該標的分析物に特異的に結合することができる、工程；
該表面を紫外‐可視‐赤外スペクトルの波長範囲内の光源に暴露する工程；及び
該表面からの光シグナルを測定する工程であって、該光シグナルの変化が、該試料中に該標的分析物が存在することを示す、工程。
[本発明1025]
前記光シグナルが、反射率、吸光度スペクトル、散乱スペクトル、または発光スペクトルである、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記光シグナルの変化が、スペクトルピーク波長シフトを含む、本発明1024の方法。
[本発明1027]
ナノグラム量の前記標的分析物の存在が検出される、本発明1024の方法。
[本発明1028]
ピコグラム量の前記標的分析物の存在が検出される、本発明1024の方法。
[本発明1029]
フェムトグラム量の前記標的分析物の存在が検出される、本発明1024の方法。
[本発明1030]
前記表面が、遠心ロータに組み込まれるキュベットの壁または底部である、本発明1024の方法。
[本発明1031]
前記複合金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケル、及び亜鉛から選択される少なくとも2種の金属を含む、本発明1024の方法。
[本発明1032]
前記複合金属ナノ構造体の各々が、第一の金属からなるコア及び第二の金属からなるコーティングを含む、本発明1024の方法。
[本発明1033]
前記複合金属ナノ構造体の各々が、金のコーティング及び銀のコアを含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記複合金属ナノ構造体の各々が、第一の金属と第二の金属の合金である、本発明1024の方法。
[本発明1035]
前記金属ナノ層が金属フィルムである、本発明1024の方法。
[本発明1036]
前記金属フィルムが金を含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記金属ナノ層が、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、本発明1024の方法。
[本発明1038]
前記複数の金属ナノ構造体が金ナノ構造体である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記複合ナノ構造体が、球状ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノチューブ、ナノシェル、ナノロッド、ナノアイランド、ナノドット、ナノワイヤ、またはそれらの組合せから選択される形状を有する、本発明1024の方法。
[本発明1040]
以下の工程を含む、複合金属ナノ構造体の調製方法：
ポリマーと塩化金酸の混合物を含む第一の溶液を調製する工程；
銀または銅ナノ構造体を含む第二の溶液を調製する工程；及び
該第一の溶液と該第二の溶液を一定期間インキュベートする工程であって、得られる混合物が、金でコーティングされた銀ナノ構造体または金でコーティングされた銅ナノ構造体を含む、工程。
[本発明1041]
前記第二の溶液が、銀ナノ構造体を含み、かつ、約550～750ｎｍのピーク吸光度を有する、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記ポリマーが、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリエチレングリコール、またはポリエチレンイミンである、本発明1040の方法。
[本発明1043]
以下を含む、アッセイ複合体：
結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む検出コンジュゲート；
標的分析物；及び
捕捉分子が固定化された金属ナノ層でコーティングされたビーズであって、該検出コンジュゲート中の該結合パートナーが該標的分析物上の第一のエピトープと結合し、かつ、該捕捉分子が該標的分析物上の第二のエピトープと結合し、それによって、該検出コンジュゲート、標的分析物、及び該捕捉分子を含む複合体が形成される、ビーズ。
[本発明1044]
前記結合パートナーが抗体であり、かつ、前記捕捉分子が異なる抗体である、本発明1043のアッセイ複合体。
[本発明1045]
前記金属ナノ層が金属フィルムである、本発明1043のアッセイ複合体。
[本発明1046]
前記金属フィルムが、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、本発明1045のアッセイ複合体。
[本発明1047]
前記金属フィルムが金を含む、本発明1046のアッセイ複合体。
[本発明1048]
前記金属ナノ層が、前記ビーズに固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、本発明1043のアッセイ複合体。
[本発明1049]
前記複数の金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、本発明1048のアッセイ複合体。
[本発明1050]
前記複数の金属ナノ構造体が金ナノ構造体である、本発明1049のアッセイ複合体。
[本発明1051]
前記複合金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケル、及び亜鉛から選択される少なくとも2種の金属を含む、本発明1043のアッセイ複合体。
[本発明1052]
前記複合金属ナノ構造体が、第一の金属からなるコア及び第二の金属からなるコーティングを含む、本発明1043のアッセイ複合体。
[本発明1053]
前記複合金属ナノ構造体が、金のコーティング及び銀のコアを含む、本発明1043のアッセイ複合体。
[本発明1054]
前記複合金属ナノ構造体が、第一の金属と第二の金属の合金である、本発明1043のアッセイ複合体。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が結合している金ナノ層センサー（チャネル１）及びヒトＩｇＧが結合している金ナノ層センサー（チャネル２～４）についての観測時間に対するピーク波長のシフトのプロット。矢印は、非標識プロテインＡ、１ｍＭのＨＣｌ、または金コロイド（ＣＧＣ）で標識されたプロテインＡのインジェクションの順序及び濃度を示す。

【図2】抗ＣＲＰ Ｃ７抗体が結合している金ナノ層センサーについての観測時間に対するピーク波長のシフトのプロット。矢印は、異なるチャネルでの濃度０～１００ｎｇ／ｍｌのＣＲＰ（ＣＲＰロード）、１μｇ／ｍｌの非標識抗ＣＲＰ Ｃ６抗体、または３μｇ／ｍｌの金コロイド標識抗ＣＲＰ Ｃ６抗体（Ｃ６－ＣＧＣ）のインジェクションの順序を示す。センサー表面が非標識抗ＣＲＰ Ｃ６抗体で占められた場合、さらなるＣ６－ＣＧＣ結合は認められなかった。

【図3】抗ＣＲＰ Ｃ７抗体が結合している金ナノ層センサーについての観測時間に対するピーク波長のシフトのプロット。矢印は、異なるチャネルにおける０～１００ｎｇ／ｍｌ濃度のＣＲＰ（ＣＲＰロード）、１μｇ／ｍｌの金コロイド標識抗ＣＲＰ Ｃ６抗体（Ｃ６－ＣＧＣ）、３μｇ／ｍｌのＣ６－ＣＧＣ、または１ｍＭのＨＣｌ（酸）のインジェクションの順序を示す。

【図4】図４Ａ．図３における様々なＣ６－ＣＧＣ濃度での、１０ｎｇ／ｍｌのＣＲＰがロードされた、抗ＣＲＰ Ｃ７抗体が結合している金ナノ層センサーの反射スペクトル。図４Ｂ．３種の濃度のうちの１種のＣＲＰとともにインキュベートされ、その後、３μｇ／ｍｌの金コロイド標識抗ＣＲＰ Ｃ６抗体（Ｃ６－ＣＧＣ）が導入された、抗ＣＲＰ Ｃ７抗体が結合している金ナノ層センサーについての観測時間に対するピーク波長のシフトのプロット。右の表は、Ｃ６－ＣＧＣの導入の７００秒後のピーク分析を示す。

【図5】抗ＣＲＰ Ｃ７抗体が結合している金ナノ層センサーについての観測時間に対するピーク波長のシフトのプロット。矢印は、異なるチャネルにおける０～１００ｎｇ／ｍｌ濃度のＣＲＰ（インキュベーション時間が最小化されたＣＲＰロード）、３μｇ／ｍｌの金コロイド標識抗ＣＲＰ Ｃ６抗体（Ｃ６－ＣＧＣ）、または１ｍＭのＨＣｌ（酸）のインジェクションの順序を示す。

【図6】３μｇ／ｍｌの金コロイド標識抗ＣＲＰ Ｃ６抗体（Ｃ６－ＣＧＣ）の即時導入後、図５のトレースについての観測時間に対するピーク波長のシフトのプロット。右の表は、Ｃ６－ＣＧＣの導入の７００秒後のピーク分析を、ＣＲＰのインキュベーションで得たピークシフト（図４Ｂに示す値）と比較して示す。

【図7】３種の濃度のうちの１種のＣＲＰ及び金でコーティングされた銀ナノ構造体にコンジュゲートしているＣ６抗ＣＲＰ抗体とともにインキュベートした、抗ＣＲＰ Ｃ７抗体が結合している金ナノ層センサーについての観測時間に対するピーク波長のシフトのプロット。対照は、Ｃ７抗体の代わりにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が固定化された金ナノ層センサーであった。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、複合金属ナノ構造体で標識された結合パートナーを用いることによって、ＬＳＰＲに基づくアッセイにおける有意な増幅が達成されうる、という発見に部分的に基づく。従って、本発明は、ＬＳＰＲ表面（例えば、金属ナノ層を含有する表面）と、該金属ナノ層上に固定化された複数の捕捉分子と、生体分子と結合している複合金属ナノ構造体を含む複数の検出コンジュゲートとを含む、分析物検出デバイスを提供する。

【0016】

前記分析物検出デバイスは、サンドイッチアッセイ形式または直接競合アッセイ形式で構成されうる。例えば、１つの実施形態では、サンドイッチアッセイ形式での分析物検出デバイスは、（ｉ）標的分析物に特異的に結合することができる結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む、複数の検出コンジュゲート、（ｉｉ）金属ナノ層を含有する表面、及び（ｉｉｉ）該金属ナノ層上に固定化されておりかつ該標的分析物に特異的に結合することができる、複数の捕捉分子を含む。別の実施形態では、直接競合アッセイ形式での分析物検出デバイスは、（ｉ）標的分析物と結合している複合金属ナノ構造体を含む、複数の検出コンジュゲート、（ｉｉ）金属ナノ層を含有する表面、及び（ｉｉｉ）該金属ナノ層上に固定化されておりかつ該標的分析物に特異的に結合することができる、複数の捕捉分子を含む。

【0017】

本発明の分析物検出デバイスは、金属ナノ層を含有する表面を含む。前記表面は、チップ、ウェル、キュベット、またはビーズ等の任意の適切なサイズと形状でもよい。いくつかの実施形態では、前記表面は矩形チップである。他の実施形態では、前記表面はディスクである。特定の実施形態では、前記表面は、キュベット（例えば、円筒または矩形のキュベット）の底部、蓋、及び／または内壁である。さらに別の実施形態では、前記表面は、非金属粒子のアレイである。前記表面は、限定されないが、ガラス、石英、ケイ素、シリカ、ポリスチレン、黒鉛、布帛（例えば、ポリエチレン布帛）、メッシュ、または膜（例えば、ラテックス膜、ポリビニル膜、ナイロン膜、もしくはポリエステル膜）等の様々な材料から製造されうる。

【0018】

前記表面上に、好ましくは金属ナノ層が堆積している。前記金属ナノ層は、いくつかの実施形態では、特定の表面の全表面積を覆っていてもよい。他の実施形態では、前記金属ナノ層は、前記表面の一部のみに堆積されていてもよい。例えば、前記表面は複数の凹部またはウェルを含んでいてもよく、該凹部またはウェル内に前記金属ナノ層が堆積されている。他の実施形態では、前記金属ナノ層は、前記表面にわたって存在する複数の離間した堆積物として前記表面に施されていてもよい。前記金属ナノ層の光学特性は、該ナノ層の厚さ及び／またはナノ構造体の性質を変えることによって調整されうる。１つの実施形態では、前記ナノ層は、金属ナノアイランドからなる。別の実施形態では、前記ナノ層は、ナノロッドからなる。本発明のデバイス及び方法での使用に適した前記金属ナノ層の厚さとしては、約０．５ｎｍから約１００ｎｍ、約５ｎｍから約３０ｎｍ、または約３ｎｍから約１０ｎｍが挙げられる。本発明のデバイス及び方法に用いることができる金属ナノ層コーティングを備えた典型的な表面としては、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００６／０２４０５７３号に記載の表面が挙げられる。

【0019】

特定の実施形態では、前記金属ナノ層は、金属フィルムである。基材表面への金属フィルムの堆積法は、当業者に公知であって、限定されないが、原子層堆積、パルスレーザー堆積、ドロップキャスティング、蒸着、及び吸着が挙げられる。例えば、Ａｔａｎａｓｏｖら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ： Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ ５１４ （２０１４）； Ｗａｌｔｅｒｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９： ５７４－５９０， ２００９；及びＧｕｐｔａら， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓ． ９２， ５２６４－５２７１， ２００２を参照されたい。これらの各々は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。前記金属フィルムは、他の成分を含んでもよく、例えば、前記金属フィルムは、ポリマーフィルム、ラングミュアーブロジェットフィルム、または酸化フィルムでもよい。いくつかの実施形態では、前記金属フィルムは、各層が異なる金属を含む２つの層を含む。一例として、前記金属フィルムは、金層を重ねた銀層を含みうる。

【0020】

他の実施形態では、前記金属ナノ層は、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体を含む。金属ナノ構造体は、前記表面の材料を試薬で処理して化学官能基（例えば、シアン化物、アミン、チオール、カルボキシル、アルデヒド、またはマレイミド）を付加し、処理された表面を金属ナノ構造体と反応させることによって、前記表面に固定化されうる。金属ナノ構造体は、かかる化学官能基に高い親和性で結合することが知られている。いくつかの実施形態では、前記金属ナノ層を構成する前記金属ナノ構造体は、球状ナノ粒子である。かかるナノ粒子は、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、または約１５０ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、前記球状ナノ粒子は、約５ｎｍから約２００ｎｍ、約１０ｎｍから約１００ｎｍ、または約２０ｎｍから約６０ｎｍの直径を有する。特定の実施形態では、前記金属ナノ層を作製するために使用される前記金属ナノ構造体のサイズは、前記検出コンジュゲートに用いられる前記複合ナノ構造体のサイズと同様である。かかる実施形態では、二組のナノ構造体のサイズを適合させることによって、反射率、発光、または散乱スペクトルの最適な波長シフトがもたらされうる。

【0021】

前記金属ナノ層（金属フィルムまたは複数の金属ナノ構造体）は、貴金属またはその複合材料からなってもよい。他の実施形態では、前記金属ナノ層（金属フィルムまたは複数の金属ナノ構造体）は、遷移金属またはその複合材料からなってもよい。特定の実施形態では、前記金属ナノ層は、金、銀、銅、白金、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、チタン、クロム、カドミウム、亜鉛、鉄、コバルト、ニッケル、及びそれらの複合材料から選択される金属を含む。１つの特定の実施形態では、前記金属ナノ層（例えば、金属フィルムまたは複数の金属ナノ構造体）は金を含む。別の特定の実施形態では、前記金属ナノ層（例えば、金属フィルムまたは複数の金属ナノ構造体）は銀を含む。特定の実施形態では、前記金属ナノ層（例えば、金属フィルムまたは複数の金属ナノ構造体）は金と銀または金と銅の複合材料を含む。アルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、及びフランシウム）またはランタニド元素（例えば、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、及びルテチウム）の使用は、ＬＳＰＲピーク強度を向上しうる。従って、いくつかの実施形態では、前記金属ナノ層（金属フィルムまたは複数の金属ナノ構造体）は、１種以上のアルカリ金属またはランタニド元素からなってもよい。別の実施形態では、前記金属ナノ層（金属フィルムまたは複数の金属ナノ構造体）は、貴金属とアルカリ金属またはランタニド元素との組合せからなってもよい。

【0022】

本発明の分析物検出デバイスは、さらに、表面に堆積した前記金属ナノ層上に固定化された複数の捕捉分子を含む。前記捕捉分子は、標的分析物に特異的に結合することができる。本明細書で用いられる「特異的結合」とは、高い親和性、例えば、少なくとも１０^－６Ｍの親和性で標的分子に結合することを指す。いくつかの実施形態では、前記捕捉分子は、ハプテン及び他の小分子、薬物、ホルモン、生体高分子であって、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）_２、一本鎖、ＣＤＲ等）、抗原、受容体、リガンド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、糖ペプチド、リポタンパク質、または核タンパク質を非限定的に含む。特定の実施形態では、前記複数の捕捉分子は抗体である。他の実施形態では、前記複数の捕捉分子は抗原である。

【0023】

金属ナノ層またはナノ構造体への分子の固定化法は当業者には公知である。かかる方法としては、コンジュゲーションケミストリー、例えば、１‐エチル‐３‐［３‐ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、スルホＮＨＳカップリング、疎水性結合、またはチオエーテル化学を含むものが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記分子は、より大きな担体分子またはタンパク質を介して間接的に、前記金属ナノ層またはナノ構造体に結合されうる。かかる間接的な結合は、前記分子が小さい場合（例えば、ホルモン、薬物、及び他の１０ｋＤ未満の小分子の場合）に特に有用である。前記担体タンパク質は、前記標的分析物と特異的に相互作用できないことが好ましい。

【0024】

本発明の分析物検出デバイスはまた、複数の検出コンジュゲートも含みうる。検出コンジュゲートは、アッセイの構成によって、標的分析物に特異的に結合することができる結合パートナーまたは捕捉分子と結合している金属ナノ構造体を含む。例えば、前記デバイスがサンドイッチアッセイ形式で構成される実施形態では、前記検出コンジュゲートは、標的分析物に特異的に結合することができる結合パートナーと結合またはコンジュゲートしている金属ナノ構造体を含む。前記デバイスが直接競合アッセイ形式で構成される他の実施形態では、前記検出コンジュゲートは、標的分析物と結合またはコンジュゲートしている金属ナノ構造体を含む。

【0025】

前記結合パートナーは、前記捕捉分子と同じ種類の分子でよく、限定されないが、ハプテン及び他の小分子、薬物、ホルモン、生体高分子、例えば、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）_２、一本鎖、ＣＤＲ等）、抗原、受容体、リガンド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、糖ペプチド、リポタンパク質、または核タンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記結合パートナーは、前記捕捉分子と同じ種類の分子であるが、好ましくは、前記捕捉分子の結合部位とは異なる位置で前記標的分析物に結合する。一例として、前記結合パートナーと前記捕捉分子はともに標的分析物を認識する抗体でもよいが、前記結合パートナーが前記標的分析物に結合するエピトープは、前記捕捉分子が前記標的分析物に結合するエピトープと離れており、理想的には重複していない。従って、特定の実施形態では、前記結合パートナーは、標的分析物の第一のエピトープを認識する抗体であって、前記捕捉分子は、標的分析物の第二のエピトープを認識する異なる抗体である。

【0026】

前記検出コンジュゲート中の前記金属ナノ構造体は、貴金属またはその複合材料からなりうる。いくつかの実施形態では、前記検出コンジュゲート中の前記金属ナノ構造体は、遷移金属またはその複合材料からなってもよい。いくつかの実施形態では、前記検出コンジュゲート中の前記金属ナノ構造体は、アルカリ金属またはランタニド元素と、貴金属または遷移金属との組み合わせを含んでもよい。特定の実施形態では、前記検出コンジュゲート中の金属ナノ構造体は、金、銀、銅、白金、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、チタン、クロム、カドミウム、亜鉛、鉄、コバルト、ニッケル、及びそれらの複合材料から選択される金属を含む。１つの実施形態では、前記金属ナノ構造体は、金ナノ構造体である。別の実施形態では、前記金属ナノ構造体は、銀ナノ構造体である。

【0027】

好ましい実施形態では、前記検出コンジュゲート中の前記金属ナノ構造体は、複合金属ナノ構造体である。「複合金属ナノ構造体」とは、少なくとも２種の貴金属、遷移金属、アルカリ金属、またはランタニド元素を含むナノ構造体を指す。前記２種以上の金属は、合金の場合のように互いに混合されていてもよいし、前記ナノ構造体の別個の部分に存在してもよい。例えば、１種の金属が前記ナノ構造体のコアを形成することができ、第二の金属は前記ナノ構造体のシェルまたはコーティングを形成する。いくつかの実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、金、銀、銅、白金、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、チタン、クロム、カドミウム、亜鉛、鉄、コバルト、及びニッケルから選択される少なくとも２種の金属を含む。他の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケル、及び亜鉛から選択される少なくとも２種の金属を含む。１つの特定の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、金と銀を含む。別の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、金と銅を含む。さらに別の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、銀と銅を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、前記複合金属ナノ構造体の各々は、第一の金属と第二の金属の合金である。特定の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体の各々は、第一の金属からなるコアと第二の金属からなるコーティングを含む。１つの実施形態では、前記コアは銀であって、前記コーティングは金である。別の実施形態では、前記コアは銅であって、前記コーティングは金である。別の実施形態では、前記コアは銀であって、前記コーティングは銅である。いくつかの実施形態では、前記複合金属ナノ構造体の各々は、誘電体コア（例えば、二酸化ケイ素、硫化金、二酸化チタン、シリカ、及びポリスチレン）、第一の金属からなる第一のコーティング、並びに第二の金属からなる第二のコーティングを含む。１つの特定の実施形態では、前記コアはシリカであって、前記第一のコーティング（すなわち、内側コーティング）は銀のコーティングであり、前記第二のコーティングは金のコーティング（すなわち、外側コーティング）である。別の実施形態では、前記コアはシリカであって、前記第一のコーティング（すなわち、内側コーティング）は銅のコーティングであり、前記第二のコーティングは金のコーティング（すなわち、外側コーティング）である。

【0029】

いくつかの実施形態では、第一の金属を含む前記コアは、第二の金属でのコーティング工程の後、溶解され、前記第二の金属からなる中空構造を形成する。例えば、銀のコアを金ナノ粒子でコーティングすることで前記銀のコアの周囲に金のシェルを生じ、前記銀のコアをその後溶解または分解することで、中空ナノ金シェル構造が形成される。

【0030】

前記金属ナノ構造体は、球状ナノ粒子と同様、ナノプレート及びナノシェルを含む。ナノプレートは、厚さよりも大きな横寸法（例えば、エッジ長）を有する。ナノプレートとしては、ナノディスク、ナノ多角形、ナノ六角形、ナノキューブ、ナノリング、ナノ星形、及びナノプリズムが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記金属ナノ構造体は、前記複合ナノ構造体を含めて、球状ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノチューブ、ナノシェル、ナノロッド、ナノドット、ナノアイランド、ナノワイヤ、ナノディスク、ナノキューブ、またはそれらの組合せから選択される形状を有する。不規則な形状を含む他の形状もまた可能である。特定の実施形態では、前記金属ナノ構造体のサイズ及び形状は、均一ではない－すなわち、前記金属ナノ構造体は、異なる形状とサイズのナノ構造体の不均質な混合物である。

【0031】

球状ナノ粒子については、適切な直径範囲としては、約５ｎｍから約２００ｎｍ、約１０ｎｍから約１００ｎｍ、及び約２０ｎｍから約６０ｎｍが挙げられる。ナノプレートについては、エッジ長は約１０ｎｍから約８００ｎｍ、約２０ｎｍから約５００ｎｍ、約５０ｎｍから約２００ｎｍ、約３０ｎｍから約１００ｎｍ、または、約１０ｎｍから約３００ｎｍでもよい。前記ナノプレートの厚さは、約１から約１００ｎｍ、約５ｎｍから約８０ｎｍ、約１０ｎｍから約５０ｎｍ、または、約５ｎｍから約２０ｎｍに及びうる。

【0032】

いくつかの実施形態では、前記ナノプレートは、２を超えるアスペクト比を有する。アスペクト比は、厚さに対するエッジ長の比である。好ましくは、前記ナノプレートはアスペクト比約２から約２５、約３から約２０、約５から約１０、約２から約１５、または約１０から約３０を有する。

【0033】

前記結合パートナーまたは標的分析物は、前記金属ナノ構造体（例えば、複合ナノ構造体）に、前記捕捉分子の前記金属ナノ層への固定化のための上記と同様の方法を用いて結合またはコンジュゲートされうる。かかる方法としては、限定されないが、ＥＤＣコンジュゲーションケミストリー、スルホＮＨＳカップリング、疎水性結合またはチオエーテル化学が挙げられる。前記結合パートナーまたは標的分析物は、チオール、アミン、ジチオール、アクリルホスホラミダイト、アジド、またはアルキンを含む様々な化学官能基を介して、前記金属ナノ構造体に結合されうる。

【0034】

いくつかの実施形態では、前記表面に堆積される前記金属ナノ層に使用される金属は、前記検出コンジュゲート中の前記金属ナノ構造体の製造に使用される金属と同じでもよい。例えば、１つの実施形態では、前記表面に堆積した前記金属ナノ層は、金フィルムまたは複数の金ナノ構造体を含み、かつ、前記検出コンジュゲートは金ナノ構造体を含む。他の実施形態では、前記表面に堆積される前記金属ナノ層に使用される金属は、前記検出コンジュゲートの前記金属ナノ構造体の作製に使用される金属とは異なる。例えば、いくつかの実施形態では、前記表面に堆積した前記金属ナノ層は、銀フィルムまたは複数の銀ナノ構造体を含み、かつ、前記検出コンジュゲートは金ナノ構造体を含む。他の実施形態では、前記表面に堆積した前記金属ナノ層は、金フィルムまたは複数の金ナノ構造体を含み、かつ、前記検出コンジュゲートは銀ナノ構造体を含む。特定の実施形態では、前記表面に堆積した前記金属ナノ層は、金フィルムまたは複数の金ナノ構造体を含み、かつ、前記検出コンジュゲートは複合ナノ構造体を含む。関連する実施形態では、前記複合ナノ構造体は、金でコーティングされた銀ナノ構造体を含む。他の特定の実施形態では、前記表面に堆積した前記金属ナノ層は、金フィルムまたは複数の金ナノ構造体を含み、かつ、前記検出コンジュゲートは、金でコーティングされた銅ナノ構造体を含む複合ナノ構造体を含む。さらに他の実施形態では、前記表面に堆積した前記金属ナノ層は、金フィルムまたは複数の金ナノ構造体を含み、かつ、前記検出コンジュゲートは、金でコーティングされたマグネタイトナノ構造体を含む複合ナノ構造体を含む。さらに他の実施形態では、前記表面に堆積した前記金属ナノ層は、金フィルムまたは複数の金ナノ構造体を含み、かつ、前記検出コンジュゲートは、金及びアルカリ金属またはランタニド元素を含む複合ナノ構造体を含む。

【0035】

本発明はまた、本明細書に記載の本発明の分析物検出デバイスを含むキットを含む。１つの実施形態では、前記キットは、（ｉ）複数の捕捉分子が固定化されている金属ナノ層を含有する表面及び（ｉｉ）本明細書に記載の複数の検出コンジュゲートを含む組成物を含む。特定の実施形態では、前記組成物は、後に前記検出方法の実施中に前記表面と接触させられるように、前記表面とは別に包装される。いくつかの実施形態では、前記複数の検出コンジュゲートを含む前記組成物は、例えばペレットまたはビーズの形で凍結乾燥されている。関連する実施形態では、前記金属ナノ層を含有する前記表面は、チップ、ディスク、またはキュベットでありうる。１つの特定の実施形態では、前記金属ナノ層を含有する前記表面は、遠心ロータでの使用に適合したキュベットである。かかる実施形態では、前記金属ナノ層は、前記キュベットの蓋、底部、及び／または壁に堆積されうる。

【0036】

特定の実施形態では、本明細書に記載の分析物検出システムのすべての構成要素は、遠心ロータまたはディスク内に含まれる。例えば、ロータまたはディスクは、１つ以上の反応チャンバを含むことができ、ここに、固定化された捕捉分子を含む前記金属ナノ層表面及び前記複数の検出コンジュゲートが配置される。１つの実施形態では、前記金属ナノ層表面は、前記反応チャンバの底部に位置するチップである。別の実施形態では、前記金属ナノ層は、前記反応チャンバの底に直接堆積されている。さらに別の実施形態では、前記金属ナノ層表面は、前記金属ナノ層でコーティングされたビーズ（例えば、プラスチックビーズ）である。かかる実施形態のすべてにおいて、前記捕捉分子は前記金属ナノ層表面に固定化されている。関連する実施形態では、前記複数の検出コンジュゲートは、凍結乾燥された組成物、例えば、凍結乾燥ビーズまたはペレットの形で存在する。

【0037】

別の実施形態では、捕捉分子は、コロイド懸濁液内の金属ナノ構造体にコンジュゲートしている。試験試料の存在下で前記懸濁液に前記複数の検出コンジュゲートが添加される。前記試料中に前記標的分析物が存在する場合、前記検出コンジュゲートと、前記捕捉分子を含む懸濁された前記ナノ構造体との間で複合体が形成され、光シグナルの変化（例えば、懸濁された前記ナノ構造体のピーク吸収波長のシフト）がもたらされる。

【0038】

従って、いくつかの実施形態では、前記キットは、１つ以上の反応チャンバを有するロータまたはディスクを含むとともに、各反応チャンバは、（ｉ）本明細書に記載の複数の検出コンジュゲートを含む凍結乾燥された組成物及び（ｉｉ）金属ナノ層でコーティングされたビーズであって、前記金属ナノ層上に複数の捕捉分子が固定化されている、ビーズを含む。かかるキットは、試験試料を前記ロータまたはディスクに接触させ、前記ロータまたはディスクに遠心力を加えることで前記試験試料を前記反応チャンバに供給し、そこで前記試料が前記複数の検出コンジュゲート及び固定化された捕捉分子を含む前記金属ナノ層でコーティングされたビーズと混ざる、一工程の分析物検出アッセイを提供する。前記ロータまたはディスクが２つ以上の反応チャンバを含む実施形態では、前記検出コンジュゲート及び捕捉分子は、各反応チャンバにおいて異なる分析物を検出できるように選択されうる。これらのロータ形式検出デバイスは、サンドイッチアッセイ形式、直接競合アッセイ形式、または前記ロータが複数の反応チャンバを含む場合は両方で構成されうる。

【0039】

本明細書で説明されている任意のタイプの金属ナノ層または金属ナノ構造体を、これらロータ形式検出デバイスで用いることができる。いくつかの実施形態では、前記ビーズ上の前記金属ナノ層コーティングは金ナノ層であり、かつ、前記検出コンジュゲートの前記金属ナノ構造体は金ナノ構造体である。他の実施形態では、前記ビーズ上の前記金属ナノ層コーティングは銀ナノ層であり、かつ、前記検出コンジュゲートの前記金属ナノ構造体は金ナノ構造体である。さらに他の実施形態では、前記ビーズ上の前記金属ナノ層コーティングは金ナノ層であり、かつ、前記検出コンジュゲートの前記金属ナノ構造体は銀ナノ構造体である。１つの実施形態では、前記ビーズ上の前記金属ナノ層コーティングは金ナノ層を重ねた銀ナノ層であり、かつ、前記検出コンジュゲートの前記金属ナノ構造体は金ナノ構造体である。特定の実施形態では、前記ビーズ上の前記金属ナノ層コーティングは金ナノ層であり、かつ、前記検出コンジュゲートの前記金属ナノ構造体は複合ナノ構造体である。例えば、１つの実施形態では、前記複合ナノ構造体は、金でコーティングされた銀ナノ構造体である。別の実施形態では、前記複合ナノ構造体は、金でコーティングされた銅ナノ構造体である。

【0040】

本発明のキットはまた、前記デバイスを用いて試験試料中の分析物を検出するための取扱説明書、生体試料を収集するためのデバイスもしくは道具、並びに／または、固体材料（例えば、土壌、食品、及び生体組織）から試料を採取するための抽出緩衝液を含んでもよい。

【0041】

本発明はまた、試料中の標的分析物の検出方法も提供する。１つの実施形態では、前記方法は、（ｉ）試験試料を本明細書に記載の複数の検出コンジュゲートと混合する工程；（ｉｉ）該混合物を本明細書に記載の複数の捕捉分子が固定化された金属ナノ層を含有する表面に接触させる工程；（ｉｉｉ）該表面を紫外‐可視‐赤外スペクトルの波長範囲内の光源に暴露する工程；（ｉｖ）該表面からの光シグナルを測定する工程を含み、ここで、該光シグナルの変化は、該試料中に該標的分析物が存在することを示す。

【0042】

いくつかの実施形態では、前記検出方法はサンドイッチアッセイである。かかる実施形態では、前記検出コンジュゲートは、結合パートナーと結合している金属ナノ構造体を含み、該結合パートナーは、前記試料中に前記標的分析物が存在する場合に前記標的分析物に特異的に結合することができ、それにより分析物－検出コンジュゲート複合体が形成される。前記金属ナノ層表面に固定化された前記複数の捕捉分子もまた、前記試料中に前記標的分析物が存在する場合に前記標的分析物に特異的に結合することができる。前記金属ナノ層が光源に暴露されると、光シグナルが測定され、前記光シグナルの変化は、前記試料中に分析物が存在することを示す。例として、前記標的分析物を含む試料を前記複数の検出コンジュゲートと混合した場合、前記標的分析物が前記検出コンジュゲートの前記結合パートナーと結合し、分析物－検出コンジュゲート複合体が形成される。これらの複合体は、同様に、前記分析物を介して、前記金属ナノ層表面に固定化された前記複数の捕捉分子に結合し、これにより、前記検出コンジュゲートの前記金属ナノ構造体を、前記金属ナノ層表面にごく接近させる。前記金属ナノ層表面で吸収または散乱される光量は、前記複合体中の前記金属ナノ構造体の近接性に影響され、ひいてはピーク吸収波長のシフトの増大を生じ、これは前記試料中に前記標的分析物が存在することを示す。

【0043】

他の実施形態では、前記検出方法は競合アッセイである。かかる実施形態では、前記検出コンジュゲートは、目的の前記標的分析物と結合している金属ナノ構造体を含む。前記サンドイッチアッセイ法のように、前記金属ナノ層表面に固定化された前記複数の捕捉分子は、前記標的分析物に特異的に結合することができる。この種類のアッセイでは、前記検出コンジュゲートは、最初に前記捕捉分子に結合する。標的分析物を含む試料がこれら初期の複合体と混合されると、前記試料中の非標識すなわち遊離の標的分析物は、前記捕捉分子への結合について前記検出コンジュゲートと競合する。この種類のアッセイにおける光シグナルの変化は、前記検出コンジュゲート中の前記金属ナノ構造体が前記金属ナノ層表面から離れたことに起因し、これに比例して前記ピーク吸収波長の波長シフトが減少する。

【0044】

試験試料は、生体試料または環境もしくは食品試料から調製される抽出物を含む任意の種類の液体試料でもよい。１つの特定の実施形態では、前記試験試料は生体試料である。生体試料としては、限定されないが、全血、血漿、血清、唾液、尿、胸水、汗、胆汁、脳脊髄液、糞便、膣液、精液、眼水晶体液、粘液、滑液、腹水、羊水、生検組織、唾液、及び細胞溶解物が挙げられる。生体試料は、がん、感染症（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、または真菌感染症）、心血管疾患、代謝性疾患、自己免疫疾患等の病状を有する疑いのあるヒト対象または動物対象から採取することができる。前記生体試料はまた、定期検診を受ける健康な対象（例えば、ヒトまたは動物）から採取してもよい。

【0045】

前記方法のいくつかの実施形態では、前記試験試料を複数の検出コンジュゲートと混合し、続いて当該混合物を前記固定化された捕捉分子を含む前記金属ナノ層表面に接触させる。他の実施形態では、前記試験試料を、前記固定化された捕捉分子を含む前記金属ナノ層表面に接触させ、続いて前記複数の検出コンジュゲートを添加する。特定の実施形態では、前記試料、前記複数の検出コンジュゲート、及び前記固定化された捕捉分子を含む前記金属ナノ層表面を同時に接触させる。例えば、前記試料の両試薬との同時の接触は、上記ロータ形式検出デバイスで生じうる。

【0046】

上記分析物検出デバイスのいずれかが本発明の検出方法に使用されうる。従って、本明細書に記載の様々な金属ナノ層表面、捕捉分子、及び検出コンジュゲートが前記検出方法での使用に適する。例えば、前記方法のいくつかの実施形態では、金属ナノ層を含有する前記表面は、チップ、ウェル、キュベット、またはビーズである。前記方法の特定の実施形態では、金属ナノ層を含有する前記表面は、遠心ロータに組み込まれた、または遠心ロータでの使用に適合したキュベットの壁及び底部である。これら及び他の実施形態では、前記表面上の前記金属ナノ層は、金フィルム等の金属フィルムである。前記方法の他の実施形態では、前記表面上の前記金属ナノ層は、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体、例えば金ナノ構造体を含む。

【0047】

前記検出方法の特定の実施形態では、前記検出コンジュゲートは、結合パートナーまたは標的分析物と結合している複合金属ナノ構造体を含む。本明細書に記載の通り、複合金属ナノ構造体は、少なくとも２種の貴金属または遷移金属を含む。前記方法のいくつかの実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、金、銀、銅、白金、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、チタン、クロム、カドミウム、亜鉛、鉄、コバルト、及びニッケルから選択される少なくとも２種の金属を含む。前記方法の他の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケル、及び亜鉛から選択される少なくとも２種の金属を含む。１つの特定の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、金と銀を含む。別の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、金と銅を含む。さらに別の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、銀と銅を含む。本発明の前記方法で使用される前記複合金属ナノ構造体としては、球状ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノチューブ、ナノシェル、ナノロッド、ナノドット、ナノアイランド、ナノワイヤ、ナノディスク、ナノキューブ、またはそれらの組合せ等の多数の異なる形状を挙げることができる。

【0048】

特定の実施形態では、本発明の方法で使用される前記複合金属ナノ構造体は、第一の金属と第二の金属の合金である。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される前記複合金属ナノ構造体は、第一の金属からなるコアと第二の金属からなるコーティングを含む。特定の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、銀のコアと金のコーティングを含む。他の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、銅のコアと金のコーティングを含む。別の実施形態では、前記コアは銀であり、前記コーティングは銅である。いくつかの実施形態では、前記複合金属ナノ構造体の各々は、誘電体コア（例えば、二酸化ケイ素、硫化金、二酸化チタン、シリカ、及びポリスチレン）、第一の金属からなる第一のコーティング、並びに第二の金属からなる第二のコーティングを含む。前記検出方法の１つの特定の実施形態では、前記コアはシリカであって、前記第一のコーティング（すなわち、内側コーティング）は銀のコーティングであり、前記第二のコーティングは金のコーティング（すなわち、外側コーティング）である。別の実施形態では、前記コアはシリカであって、前記第一のコーティング（すなわち、内側コーティング）は銅のコーティングであり、前記第二のコーティングは金のコーティング（すなわち、外側コーティング）である。

【0049】

本発明の検出方法は、標的分析物の定性的または定量的な量を測定するのに使用されうる。かかる方法は、試料中の標的分析物のおおよその量を測定するのに特に有用であって、とりわけ、特定の医学的状態の診断または薬物療法の有効性の評価に使用できる。１つの実施形態では、標的分析物の量が既知の試料について本明細書に記載の通りに前記金属ナノ層表面からの光シグナルの変化を測定することによって検量線を作成し；試験試料についての光シグナルの変化を測定し；前記試験試料についての光シグナルの変化と、前記検量線として得られた値を比較することによって、特定の分析物についての標的分析物の量を決定することができる。いくつかの実施形態では、第一の試薬と第二の試薬の複合体の量の測定は、試験試料からの吸光度比及び／または反応速度を、複合体の量が既知の試料からの吸光度比及び／または反応速度と比較し、それによって、前記試験試料中の前記複合体の量を決定することを含む。試験試料から得られた定量値は、所定の閾値と比較されてもよく、ここで、当該所定の閾値は、前記標的分析物の異常または正常レベルのどちらかを示す。

【0050】

本発明の検出方法は、試料中の微量の標的分析物を検出するための高感度の技術を提供する。実施例によって実証されているとおり、試料中のナノグラム量の標的分析物を検出できるように、金ナノ構造体コンジュゲートを用いて金ナノ層表面からのプラズモン共鳴に基づくシグナルの増幅を実現することができる。従って、前記方法の１つの実施形態では、ナノグラム量の標的分析物の存在が検出される。本発明者らは、意外にも、複合金属ナノ構造体コンジュゲートを用いることによって、金ナノ層表面からのプラズモン共鳴に基づくシグナルの有意に大きな増幅が実現されうることを見出した。分析物に特異的な抗体とコンジュゲートしている、金でコーティングされた銀ナノ構造体の使用は、ピコグラム量の前記標的分析物の検出を可能にしたが、これは、金ナノ構造体コンジュゲートで得られるものと比較して、感度が１０００倍増加している。実施例３を参照されたい。従って、前記方法のいくつかの実施形態では、ピコグラム量の前記標的分析物の存在が検出される。前記方法の他の実施形態では、フェムトグラム量の前記標的分析物の存在が検出される。より高い感度は、前記複合金属ナノ構造体並びに／または金属ナノ層表面の組成及び／もしくは形状を変えることによって得ることができる。

【0051】

金属ナノ構造体に入射光が当たると、前記金属中の伝導体電子は、前記入射電磁波と同じ周波数で集合的に振動する。これら共鳴振動の結果として、前記ナノ構造体は、特定の波長範囲で光を強く吸収及び散乱する。貴金属または遷移金属を含む金属ナノ構造体の場合のこの波長範囲は紫外‐可視‐赤外スペクトルにあり、これは前記ナノ構造体の個々の組成に依存する。従って、本発明の方法に使用するのに適した電磁エネルギーを印加するための光源としては、アーク灯及びレーザ等の、紫外‐可視スペクトルまたは紫外‐可視‐赤外スペクトルに入る波長範囲を適用しうる任意の光源を挙げることができる。いくつかの実施形態では、前記光源は、特定の波長の光が前記金属ナノ層表面に適用されうるように、モノクロメータを備えうる。

【0052】

前記金属ナノ層及びナノ構造体の光学特性は、それらのサイズ、形状、及び組成に依存する。例えば、固体金ナノ粒子は、粒径に依存して約５１５ｎｍから約５６０ｎｍの吸収ピーク波長（λ_ｍａｘ）を有する。直径３０ｎｍの球状金ナノ粒子は、約５２０ｎｍで最大限に吸収し、粒径が大きくなるにつれてλ_ｍａｘは長波長側へとシフトする。銀及び銅の粒子は、紫外／青または赤色領域（例えば、約３５０ｎｍから約５００ｎｍ）にλ_ｍａｘを有し、粒径が大きくなるにつれてλ_ｍａｘは長波長側へとシフトする。金属ナノロッドは、横λ_ｍａｘ１及び縦λ_ｍａｘ２を有する。異なる金属の合金は、通常、構成金属の吸収ピークの中間域に吸収ピークを示す。例えば、金と銀の５０／５０合金を含むナノ構造体は、約４７０ｎｍのλ_ｍａｘを示し、金の量が増加するにつれて吸収ピークは長波長側へとシフトする。前記ＬＳＰＲシグナルの局所媒質屈折率の変化に対する感度は、前記ナノ構造体の形状や配置を変えることで変更できる。例えば、非球形粒子（例えば、ナノプリズム、ナノロッド、ナノシェル、等）は、球形のものと比較して増加したＬＳＰＲ感度を有する。いくつかの実施形態では、光学特性（例えば、特定の波長での吸収／散乱）は、前記表面に堆積した前記金属ナノ層または前記検出コンジュゲートに使用される前記金属ナノ構造体のサイズ、形状、または組成を変えることで、特定の用途に合わせて調整される。

【0053】

入射光と前記金属ナノ層表面と間の相互作用は、反射光または透過光としてモニタリングされうる。入射光の吸収量または散乱量は、反射モードの吸収スペクトルまたは透過モードの吸収スペクトルとして測定されうる。いくつかの実施形態では、前記金属ナノ層から測定される光シグナルは、光の反射、吸光度スペクトル、散乱スペクトル、及び／または発光スペクトルの場合がある。

【0054】

前記結合パートナーと標的分析物と捕捉分子と間の複合体の形成に起因する、前記金属ナノ層と前記検出コンジュゲート中の前記金属ナノ構造体と間のプラズモンカップリングは、前記金属ナノ層の局在表面プラズモン共鳴スペクトルに変化をもたらす。例えば、かかる変化としては、光消衰の増加、光の反射の増加、並びに／または散乱及び／もしくは発光シグナルの増加を挙げることができる。いくつかの実施形態では、前記試料中に前記標的分析物が存在することを示す光シグナルの変化としては、シフト、すなわち、光学散乱の増加もしくは減少、またはこれらの特徴の組合せが挙げられる。特定の実施形態では、前記試料中に前記標的分析物が存在することを示す光シグナルの変化は、スペクトルピーク波長シフトである。１つの実施形態では、前記光学スペクトルピークの波長シフトは、２００ｎｍから１２００ｎｍのスペクトルウィンドウ内のレッドシフト（例えば、長波長側へのシフト）でありうる。別の実施形態では、前記光学スペクトルピークの波長シフトは、２００ｎｍから１２００ｎｍのスペクトルウィンドウ内のブルーシフト（例えば、短波長側へのシフト）でありうる。光シグナルのこれらの変化は、一定の反応時間後の特定の時点で測定されうる。追加として、または別の方法として、反応時間中の光シグナルの変化（例えば、速度決定）が測定されうる。両方の種類の測定を、標的分析物の定性的または定量的分析のどちらかに使用できる。

【0055】

種々の波長での光シグナルの様々な測定手段や、消衰スペクトル、散乱スペクトル、または発光スペクトルの様々な取得手段が、当技術分野で公知である。任意の分光光度計または光度計器が本開示の方法での使用に適する。いくつかの非限定的な例としては、プレートリーダー、Ｃｏｂａｓ Ｆａｒａアナライザー、並びにＰｉｃｃｏｌｏ ｘｐｒｅｓｓ（登録商標）及びＶｅｔｓｃａｎアナライザー（Ａｂａｘｉｓ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ユニオンシティー）、光ファイバーリーダー（例えば、ＬｉｇｈｔＰａｔｈ（商標）Ｓ４（ＬａｍｄａＧｅｎ、カリフォルニア州メンローパーク））、ＳＰＲ機器（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅより入手可能なＢｉａｃｏｒｅ機器）、オリンパス、日立等の遠心アナライザーが挙げられる。

【0056】

本発明はまた、（ｉ）結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む検出コンジュゲート、（ｉｉ）標的分析物、及び（ｉｉｉ）捕捉分子が固定化された金属ナノ層でコーティングされたビーズを含むアッセイ複合体も含み、該検出コンジュゲート中の該結合パートナーは、該標的分析物上の第一のエピトープと結合し、かつ、該捕捉分子は該標的分析物上の第二のエピトープと結合し、それによって、該検出コンジュゲート、標的分析物、及び該捕捉分子を含む複合体が形成される。いくつかの実施形態では、前記アッセイ複合体は、遠心ロータでの使用に適合したキュベット内に含まれる。他の実施形態では、前記アッセイ複合体は、遠心ロータまたはディスクの反応チャンバ内に含まれる。

【0057】

前記アッセイ複合体中の前記結合パートナー及び前記捕捉分子は、ハプテン及び他の小分子、薬物、ホルモン、生体高分子、例えば、抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）_２、一本鎖、ＣＤＲ等）、抗原、受容体、リガンド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、糖ペプチド、リポタンパク質、または核タンパク質を含めた上記のいずれかの種類の分子でありうる。１つの実施形態では、前記結合パートナーは抗体であり、前記捕捉分子は異なる抗体である。

【0058】

前記金属ナノ層及び複合金属ナノ構造体は、上記に詳述されている。１つの実施形態では、前記ビーズ（例えば、プラスチックまたはガラスビーズ）の前記金属ナノ層コーティングは金ナノ層である。別の実施形態では、前記ビーズの前記金属ナノ層コーティングは、銀ナノ層である。前記ビーズは、好ましくは、０．５ｃｍ未満だが０．１ｍｍより大きい。特定の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、金でコーティングされた銀ナノ構造体である。他の実施形態では、前記複合金属ナノ構造体は、金でコーティングされた銅ナノ構造体である。さらに他の実施形態では、前記金属ナノ構造体は、銀イオン、銅イオン、またはこれらイオンの両方でドープされた金を含む。

【0059】

任意の種類の標的分析物、特に疾患の診断において重要なものが、本発明の方法、デバイス、及びアッセイ複合体を用いて検出されうる。標的分析物としては、限定されないが、タンパク質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、ホルモン、糖タンパク質、多糖、毒素、ウイルス、ウイルス粒子、薬物分子、ハプテン、または化学薬品を挙げることができる。いくつかの実施形態では、前記標的分析物は、ヒト及び／または動物の感染症に関連するマーカーまたは抗原である。他の実施形態では、前記標的分析物は、特定の生理学的状態または病理学的状態に関連するマーカーまたは抗原である。

【0060】

特定の実施形態では、前記標的分析物は、病原性抗原または病原性抗原に対する抗体である。例えば、前記病原性抗原は、ウイルス抗原（例えば、ネコ白血病ウイルス、イヌパルボウイルス、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎Ａ型、Ｂ型、Ｃ型ウイルス、ＨＩＶウイルス、ヒトパピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、狂犬病ウイルス、等）、細菌性抗原（例えば、エールリヒア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、炭疽（Ａｎｔｈｒａｘ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、等）、真菌抗原、または寄生虫抗原（例えば、イヌ糸状虫、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、熱帯熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、アフリカトリパノソーマ症、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、等）でありうる。他の実施形態では、前記標的分析物は、疾患関連抗原または疾患関連抗原に対する抗体である。疾患関連抗原としては、限定されないが、がん関連抗原もしくはマーカー（例えば、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＥＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＵＣ１、ＧＭ３、ＧＤ２、ＥＲＢＢ２、等）、心血管疾患に関連する抗原もしくはマーカー（例えば、トロポニン、Ｃ反応性タンパク質、脳性ナトリウム利尿ペプチド、ＣＫＭＢ、脂肪酸結合タンパク質、等）、代謝関連抗原もしくはマーカー（例えば、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、レプチン、インスリン）、または自己免疫疾患関連抗原もしくはマーカー（例えば、自己抗体）が挙げられる。特定の実施形態では、前記標的分析物は、炎症性の抗原またはマーカー（例えば、Ｃ反応性タンパク質、ＭＲＰ１４、ＭＲＰ８、２５Ｆ９、等）である。他の実施形態では、前記標的分析物は、妊娠に関連する抗原またはマーカー（例えば、胎児抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン）である。

【0061】

本発明はまた、複合金属ナノ構造体の調製法も提供する。１つの実施形態では、前記方法は、ポリマーと塩化金酸の混合物を含む第一の溶液を調製する工程、銀または銅ナノ構造体を含む第二の溶液を調製する工程、及び該第一の溶液と該第二の溶液を一定期間インキュベートする工程を含み、得られる混合物は、金でコーティングされた銀ナノ構造体または金でコーティングされた銅ナノ構造体を含む。前記得られる混合物は、好ましくは、約５１５ｎｍから約６７０ｎｍ、または約５２０ｎｍから約５６０ｎｍのピーク吸光度を有する。１つの実施形態では、前記得られる混合物は、約５３０ｎｍのピーク吸光度を有する。

【0062】

前記第一の溶液の調製に使用されるポリマーは、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、種々のガム、ゼラチン、またはこれらのいずれかを含む混合ポリマーのうちのいずれかでもよい。１つの特定の実施形態では、前記ポリマーはポリビニルピロリドンである。前記ポリマーの分子量を変えることで、異なる種類のコーティングされたナノ構造体を得ることができる。前記ポリマーの適切な分子量範囲としては、約５，０００ダルトンから約１５０，０００ダルトン、約１０，０００ダルトンから約１００，０００ダルトン、約２０，０００ダルトンから約８０，０００ダルトンが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記ポリマーは、５０，０００ダルトン未満の分子量を有する。他の実施形態では、前記ポリマーは、２０，０００ダルトン未満の分子量を有する。特定の実施形態では、前記ポリマーは、約１０，０００ダルトンの分子量を有する。

【0063】

前記金のコーティングの特性は、ポリマーと塩化金酸の濃度比を調整することによって制御されうる。例えば、ポリマーと塩化金酸の濃度比は、約１００：１から約１：１００、約２：１から約５：１、または約１．５：１から約８：１である。いくつかの実施形態では、ポリマーと塩化金酸の濃度比は、１：１である。適切なポリマー濃度としては、限定されないが、水またはエタノール中で、約０．１％から約２０％ｗｔ／ウェットが挙げられる。適切な塩化金酸の濃度としては、限定されないが、約０．００１Ｍから約１．０Ｍ、約０．０１０Ｍから約０．５００Ｍ、及び約０．０５０Ｍから約０．１００Ｍが挙げられる。

【0064】

塗布効率及び厚さもまた、コーティング溶液（すなわち、第一の溶液）のｐＨとハロゲン化物含量に影響されうる。特定の実施形態では、前記溶液のｐＨは、約３から約１４の範囲に維持される。前記溶液の前記ハロゲン化物含量は、いくつかの実施形態では、１５０ｍＭ未満である。他の実施形態では、前記溶液の前記ハロゲン化物含量は、約０から約５０ｍＭの範囲である。

【0065】

銀及び銅ナノ構造体の溶液の調製法は当業者には公知である。例えば、銀または銅ナノ構造体を含む前記第二の溶液は、各々が参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２／０１０１００７号、米国特許公開第２０１４／０１０５９８２号、または米国特許公開第２０１３／０２３０７１７号に記載の方法のいずれかによって調製されうる。１つの実施形態では、銀または銅ナノ構造体を含む前記第二の溶液は、銀源または銅源と還元剤を混合することによって調製される。適切な銀源としては、銀塩、例えば、硝酸銀が挙げられる。適切な銅源としては、硫酸銅（ＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、水酸化銅（ＩＩ）、硝酸銅（ＩＩ）、酢酸銅（ＩＩ）及び、トリフルオロ酢酸銅（ＩＩ）が挙げられる。前記銀源または銅源と反応してナノ構造体を形成できる還元剤としては、グルコース、アスコルビン酸、水素化ホウ素ナトリウム、及びＰＶＰ等のポリマーのアルカリ性溶液（例えば、ｐＨ７．５を超える）を挙げることができる。特定の実施形態では、前記還元剤はアスコルビン酸である。前記銀ナノ構造体または銅ナノ構造体の所望の形状及び光学スペクトルピークは、当業者に知られる通り、反応物の比や濃度を調整することによって実現されうる。ほんの一例として、高濃度の前記還元剤は、５角両錐形状ナノ構造体をもたらしうるのに対し、低濃度の前記還元剤は、細長いナノワイヤまたはチューブをもたらしうる。前記ナノ構造体の個別の形状に応じて、銀または銅ナノ構造体を含む前記第二の溶液は、約５５０ｎｍから約１０００ｎｍ、約６００ｎｍから約７００ｎｍ、約６３０ｎｍから約６８０ｎｍ、約７５０ｎｍから約８５０ｎｍ、約９００ｎｍから約９４０ｎｍ、約５８０ｎｍから約６２０ｎｍ、約５５０ｎｍから約７５０ｎｍのピーク吸光度を有しうる。特定の実施形態では、銀ナノ構造体を含む前記第二の溶液は、約６００ｎｍ（すなわち、５９５ｎｍから６０５ｎｍ、端点を含む）のピーク吸光度を有する。いくつかの実施形態では、銅ナノ構造体を含む前記第二の溶液は、約５８５ｎｍ（すなわち、５８０ｎｍから５９０ｎｍ、端点を含む）のピーク吸光度を有する。いくつかの実施形態では、銅ナノ構造体を含む溶液のピーク吸光度は、同様のサイズ及び形状の銀ナノ構造体を含む溶液のピーク吸光度よりも大きい（すなわち、レッドシフトしている）。

【0066】

いくつかの実施形態では、第一の溶液の第二の溶液とのインキュベーション期間は、少なくとも１２時間である。他の実施形態では、第一の溶液の第二の溶液とのインキュベーション期間は、２４時間より長く、好ましくは４８時間より長く、より好ましくは少なくとも７２時間である。前記インキュベーション期間中に前記反応混合物のピーク吸光度の変化をモニタリングし、前記インキュベーション時間を適切に調整することができる。例えば、（例えば、５２０ｎｍから５５０ｎｍの領域における）短波長側へのピーク吸光度のシフトは、前記金でコーティングされたナノ構造体が安定化されたことを示しうる。特定の実施形態では、得られるナノ構造体の塩化ナトリウム（例えば、０．２５～１Ｍ）に対する安定性は、前記ナノ構造体の適正なコーティングを示すために用いられる。

【0067】

特定の実施形態では、本発明は、光学濃度が約５０／ｍＬより大きいナノ構造体の合成法を提供する。１つの実施形態では、前記方法は、本明細書に記載のポリマーを塩化金酸と混合する工程、該混合物を所定の温度で第一の期間攪拌する工程、該混合物にアスコルビン酸を添加する工程、及び該混合物を第二の期間インキュベートする工程を含む。前記ナノ構造体のサイズ及び形状は、ポリマーと塩化金酸の濃度比並びにインキュベーションの温度及び時間によって決まる。ポリマーと塩化金酸の前記濃度は、上述した範囲でもよい。前記温度は、所望の前記ナノ構造体のサイズ及び形状を基に調整されうるが、約４℃から約１００℃の範囲でありうる。同様に、前記インキュベーション期間（すなわち、第一の期間）は、前記ナノ構造体の所望の特性に基づいて調整されうるが、約１５分から１日に及びうる。

【0068】

いくつかの実施形態では、前記第一のインキュベーション期間の後、約０．１～１部のアスコルビン酸（例えば、約１～５Ｍ）が前記混合物に添加される。前記アスコルビン酸の添加後の第二のインキュベーション期間は約１～約２４時間でもよい。理論に拘束されるわけではないが、アスコルビン酸の添加は、生じるナノ構造体量の実質的な増加をもたらす。

【0069】

特定の実施形態では、前記方法は、さらに、前記混合物に、約１～約１００部の塩化金（例えば、約０．００１Ｍから１Ｍ）、硝酸銀（例えば、約０．００１Ｍから１Ｍ）、または他の金属（例えば、貴金属、遷移金属、アルカリ金属、もしくはランタニド元素）を追加またはドープする工程を含む。このドーピング工程は、得られるナノ構造体の共鳴強度をさらに増加させることができる。いくつかの実施形態では、前記塩化金、硝酸銀、または他の金属は、前記反応物にアルコルビン酸が添加される前に前記混合物に添加される。他の実施形態では、前記塩化金、硝酸銀、または他の金属は、アスコルビン酸の添加後に前記混合物に添加される。前記金属とアスコルビン酸の添加順序を調整し、得られるナノ構造体を所望の形状及びサイズに合わせてもよい。

【0070】

本発明は、以下、追加の実施例によってさらに説明されるが、これら実施例は限定とは解釈されないものとする。当業者には、本開示に照らし、開示され、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同等または同様の結果をさらに得る具体的な実施形態に対して、多くの変更がなされうることが理解されよう。

【0071】

本開示を通して参照されるすべての特許文献及び非特許文献は、すべての目的のため、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

【実施例0072】

実施例１．金ナノ粒子とコンジュゲートしている分析物を用いたＬＳＰＲシグナルの増幅
金ナノ層フィルムが堆積したプラスチックチップを用意することによって、分析物検出システムを調製した。この金ナノ層フィルムにヒトＩｇＧタンパク質（１００μｇ／ｍｌ）を固定化してセンサー表面を作製した。対照のセンサーは、この金ナノ層フィルムにウシ血清アルブミンを固定化することで構成した。これら２種類のセンサー表面を、金ナノ層表面への光の照射及び前記表面からの反射光の収集を行う発光集光ファイバーを備えた機器内に配置した。

【0073】

遊離のプロテインＡ（１０μｇ／ｍｌ）を含む試料を、これら２種類のセンサー表面に接触させ、反射スペクトルの変化を測定した。図１に示すように、固定化されたヒトＩｇＧを含むセンサーに遊離のプロテインＡを導入しても、ピーク波長のシフトによって測定される金ナノ層フィルムの反射スペクトルにおける有意な目に見える変化は生じていない。

【0074】

これらのセンサー表面を１ｍＭの塩酸で処理することによって再生し、これらセンサー表面に、２種の異なる濃度（３．５μｇ／ｍｌ及び０．１７５μｇ／ｍｌ）で金コロイドナノ粒子（ＣＧＣ）にコンジュゲートしたプロテインＡを含む試料を接触させた。プロテインＡ（すなわち、標的分析物）が金コロイドナノ粒子にコンジュゲートしていた場合に、金ナノ層表面の反射スペクトルの変化が強められた。具体的には、３．５μｇ／ｍｌのプロテインＡ－ＣＧＣは、１０μｇ／ｍｌの非標識プロテインＡより大きなピーク波長シフトをもたらした。図１、センサー２参照。プラズモン共鳴シグナルの増幅は、ナノグラム濃度のプロテインＡ－ＣＧＣの検出を可能にするのに十分大きかった。図１、センサー３参照。ＢＳＡセンサーの反射スペクトルの変化は、センサー表面へのプロテインＡ分子の非特異的結合を表しており、当該変化は、固定化されたＩｇＧ分子にプロテインＡ分子が特異的に結合することによって誘導される変化よりも有意に小さい。

【0075】

この最初の実験の結果は、標的分析物を金コロイドナノ粒子に結合させることによって、金属ナノ層表面での結合事象によって誘導される局在表面プラズモン共鳴シグナルの変化の大きな増幅が実現されうることを示している。ナノグラム量の分析物が検出される場合に、ほぼ６０倍の感度の増加が認められる。

【0076】

実施例２．サンドイッチアッセイにおけるＬＳＰＲシグナルの増幅
本実施例は、金ナノ粒子複合体での局在表面プラズモン共鳴シグナルの増幅が、標的分析物が金ナノ粒子に直接コンジュゲートされないサンドイッチアッセイ形式でも実現されうるかどうかを評価するために設計された一連の実験を示す。金ナノ層チップ表面は、実施例１に記載の通りに調製した。このチップ表面に堆積した金ナノ層フィルムに、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（１００μｇ／ｍｌ）に対するＣ７抗体を固定化して、抗ＣＲＰセンサーを作製した。このＣ７抗体と異なる、ＣＲＰの非重複エピトープを認識するＣ６抗体を、いくつかの実験については金コロイドナノ粒子にコンジュゲートさせ（Ｃ６－ＣＧＣ）、他の実験については非標識の形で使用した。

【0077】

最初の一連の実験では、３種の異なる濃度（１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌ）のうちの１種のＣＲＰを含む試料を抗ＣＲＰセンサーと１５～２０分間インキュベートし、金ナノ層の反射スペクトルの変化をモニタリングした。図２に示すように、センサー表面上に固定化されたＣ７抗ＣＲＰ抗体へのＣＲＰの結合時に、極めて最小限のピークシフトが認められた。その後、センサー表面を非標識Ｃ６抗ＣＲＰ抗体（１μｇ／ｍｌ）に暴露しても、さらなる有意なピークシフトは生じなかった。図２参照。同様に、その後、センサー表面を３μｇ／ｍｌのＣ６－ＣＧＣに暴露しても、さらなる反射スペクトルの変化は生じなかった。これは、結合したＣＲＰ分子はおそらく非標識Ｃ６抗体で飽和したことを示している。図２参照。

【0078】

第二の一連の実験では、３種の異なる濃度（１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌ）のうちの１種のＣＲＰを含む試料を抗ＣＲＰセンサーと１５～２０分間インキュベートした。その後、２種の異なる濃度（１μｇ／ｍｌ及び３μｇ／ｍｌ）のＣ６－ＣＧＣを導入し、反射スペクトルの変化を測定した（図３及び４Ａ）。これらの結果は、Ｃ６抗ＣＲＰ抗体の金ナノ粒子への結合は、非標識Ｃ６抗体と比較してピーク波長シフトを増幅することを示している。Ｃ６－ＣＧＣの濃度を増加させると、用量依存的にピーク波長のシフトが生じる。しかしながら、１ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌの間のシグナルの差は小さかった（図４Ｂ）。

【0079】

第三の一連の実験では、分析物のインキュベーション時間がシグナルの発達に与える影響を評価した。抗ＣＲＰセンサーを０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌのＣＲＰを含む試料と接触させ、分析物のインキュベーション時間または洗浄なしで直ちに３μｇ／ｍｌのＣ６－ＣＧＣを導入した。図５及び６に示す通り、分析物のインキュベーション時間が短いと、ピーク波長シフトが小さくなる。

【0080】

これら３組の実験の結果は、ＬＳＰＲシグナルの増幅は、サンドイッチアッセイ形式において金ナノ粒子コンジュゲートを用いて実現されうるということを示している。非標識抗体と比較して、検出抗体が金コロイド粒子で標識されている場合にシグナルのシフトの増強が認められ、それによって、ナノグラム濃度の分析物の検出が可能になる。

【0081】

実施例３．金でコーティングされた銀ナノ構造体でのシグナル増幅の増強
結合パートナーを標識するために使用される金属の種類を変えることがＬＳＰＲシグナルの増幅に影響したかどうかを調べるため、複合金属ナノ構造体を調製した。具体的には、金でコーティングされた銀ナノ構造体を以下のようにして調製した。室温で激しく攪拌しながら５０．０ｍＬの脱イオンＨ_２Ｏ、５００．０μＬのクエン酸三ナトリウム（７５ｍＭ）、２００μＬのＡｇＮＯ_３（２００ｍＭ）、及び５００．０μＬのＨ_２Ｏ_２（２７％）を添加することによって、銀ナノ構造体を調製した。その後、この水溶液に５００μＬアリコートのＮａＢＨ_４（２００ｍＭ）を速やかに注入し、淡黄色への変色を引き起した。数分にわたり、暗黄色から赤色、紫色へと変色が続き、最終的に青色で安定した。ＵＶ／可視スペクトルは、当該溶液のピーク吸光度を６０４．５ｎｍに決定した。

【0082】

この青色溶液５．０ｍＬを、５０μＬのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ ＭＷ≒１０，０００ ２０％エタノール溶液）と５０μＬのＨＡｕＣｌ_４（２０ｍＭ）の混合物に添加することによって、銀ナノ構造体に金コーティングが追加された。７２時間のインキュベーション時間の後、この試料は暗赤色になり、ピーク吸光度５３４．５ｎｍを呈した。これらナノ粒子を、２０，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって２度洗浄し、２．０ｍＬの脱イオンＨ_２Ｏに再懸濁した。この溶液は深紅色、吸収ピーク５３０．３ｎｍ、及び総吸光度１５．０ ＯＤ単位を呈した。

【0083】

６００．０μＬのＡｕ＠ＡｇＮＰと２０．０μＬのＣ６抗ＣＲＰ抗体（８．０ｍｇ／ｍＬ）を８８０．０μＬの脱イオンＨ_２Ｏに添加することによって、金でコーティングされた銀ナノ構造体（Ａｕ＠ＡｇＮＰ）がＣ６抗ＣＲＰ抗体にコンジュゲートされたが、最終的な抗体濃度は１７．８μｇ／ｍＬ／ＯＤであった。４℃で２時間のインキュベーション期間の後、この試料を３０，０００ｇで２０分間遠心分離し、ＰＢＳ中にＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含むブロッキング溶液１．５ｍＬに再懸濁した。抗ＣＲＰ Ｃ６抗体にコンジュゲートしたこのＡｕ＠ＡｇＮＰは、さらなる使用まで４℃で保管した。

【0084】

実施例２に記載の通りに抗ＣＲＰ金ナノ層センサーを調製したところ、５３０ｎｍにピーク吸収を呈した。固定化抗体なしの金ナノ層を含有する対照センサーも調製した。これらのセンサーは１００μＬのＰＢＳで平衡化した。

【0085】

ＰＢＳで１．５ＯＤまで希釈された、Ａｕ＠ＡｇＮＰとコンジュゲートしているＣ６抗ＣＲＰ抗体１００μＬを、１、１０、または５００ｐｇ／ｍＬのＣＲＰ抗原と１分間予備混合した。その後、当該混合物を、抗ＣＲＰセンサー表面または対照センサー表面と接触させ、金ナノ層表面の反射スペクトルの変化を測定した。これらの結果は、ＣＲＰ－抗体複合体のセンサー表面への結合によって誘導されたピーク波長シフトが、金でコーティングされた銀ナノ構造体によって増強されたことを示している（図７）。金でコーティングされた銀ナノ構造体を用いたところ、１ｐｇ／ｍＬのＣＲＰ抗原の検出が可能であったが、これは、金ナノ粒子で得られたものと比較して１０００倍の感度向上である。抗原が高濃度の場合は結合部位が飽和し、さらなるシフトは生じない。

【0086】

本実験の結果は、複合ナノ構造体（例えば、金でコーティングされた銀ナノ構造体）を用いて分析物の結合パートナーを標識した場合に、金属ナノ層表面からのＬＳＰＲシグナルの顕著に増強された増幅が実現されることを実証している。

【0087】

実施例４．光学濃度が高いナノ構造体の合成
以下の試薬を、示した順番に混合し、最終体積１ｍｌの金ナノ粒子を調製した：０．１ｍｌの１％ＰＶＰ－１０（１％ｗｔ／ｗｔ）、０．２ｍｌの０．１Ｍ塩化金、０．１ｍｌの５Ｎ ＮａＯＨ、０．４ｍｌの水、及び０．２ｍｌの１Ｍアスコルビン酸。反応混合物は、毎添加後に混合した。この反応の大部分は室温で２４時間後に完結したことが、分光計測によって示された。本プロトコルによって、ＬＳＰＲピーク約５３５ｎｍと、対応する光学濃度約８０／ｍｌを示す球状金ナノ粒子が得られた。さらなる金または銀の積層は、あらかじめ形成された金ナノ粒子に硝酸銀または塩化金を添加して行った。過剰の試薬は３０，０００ｇでの１～２時間の遠心分離によって除去した。

【0088】

別の反応では、２０％のＰＶＰ（ｗｔ／ｗｔ）０．０５ｍｌを水０．２５ｍｌ、５ＮのＮａＯＨ ０．１ｍｌ、１Ｍのクエン酸ナトリウム ０．１ｍｌ、０．１Ｍの塩化金 ０．５ｍｌ、及び１Ｍのアスコルビン酸 １ｍｌと混合した。本プロトコルは、ＯＤ約９０／ｍｌで、ＬＳＰＲピーク約５２５ｎｍの金コロイド粒子の即時形成をもたらした。最終的な反応混合物中、金２．５ｍＭと金２５ｍＭの間で、最終的なＯＤと金濃度の間に直線状の対応が認められた。

【0089】

本開示の発明は、特定の方法に限定されず、これらのように記載されたプロトコル及び材料は変えることができることが理解される。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないこともまた理解される。

【0090】

当業者には、通常に過ぎない実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認め、または確認することが可能になろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれるように意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【手続補正書】

【提出日】2023-03-31

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

以下を含む、分析物検出デバイス：
標的分析物に特異的に結合することができる結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む、複数の検出コンジュゲート；
金属ナノ層を含有する表面；及び
該金属ナノ層上に固定化されておりかつ該標的分析物に特異的に結合することができる、複数の捕捉分子。

【手続補正書】

【提出日】2023-04-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

以下を含む、分析物検出キット：
１つ以上の反応チャンバを有するロータまたはディスクであって、各反応チャンバは、
(i) 標的分析物に結合することができる複数の捕捉分子が固定化されている金属ナノ層を含有する表面、および
(ii) 凍結乾燥された組成物が、前記標的分析物に特異的に結合することができる結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む複数の検出コンジュゲートを含み、前記複合金属ナノ構造体が銀のコアと金のコーティングを含む、前記１つ以上の反応チャンバに配置された、凍結乾燥されたまたはコロイド状の組成物
を含む、分析物検出キット。

【請求項2】

以下を含む、分析物検出キット：
１つ以上の反応チャンバを有するロータまたはディスクであって、各反応チャンバは、
(i) 標的分析物に結合することができる複数の捕捉分子が固定化されている金属ナノ層でコーティングされたビーズ、および
(ii) 凍結乾燥された組成物が、前記標的分析物に特異的に結合することができる結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む複数の検出コンジュゲートを含み、前記複合金属ナノ構造体が銀のコアと金のコーティングを含む、前記１つ以上の反応チャンバに配置された、凍結乾燥されたまたはコロイド状の組成物
を含む、分析物検出キット。

【請求項3】

前記複合金属ナノ構造体が、５ｎｍから２００ｎｍの直径を有する球状ナノ粒子である、請求項１または２に記載の分析物検出キット。

【請求項4】

前記複合金属ナノ構造体が、１０ｎｍから１００ｎｍの直径を有する球状ナノ粒子である、請求項１または２に記載の分析物検出キット。

【請求項5】

前記複合金属ナノ構造体が、１０ｎｍから８００ｎｍのエッジ長および１ｎｍから１００ｎｍの厚さを有するナノプレートである、請求項１または２に記載の分析物検出キット。

【請求項6】

前記表面が、チップ、ウェル、ビーズ、またはキュベットの壁、蓋、および／もしくは底部である、請求項１に記載の分析物検出キット。

【請求項7】

前記金属ナノ層が金属フィルムである、請求項２に記載の分析物検出キット。

【請求項8】

前記金属フィルムが、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、請求項７に記載の分析物検出キット。

【請求項9】

前記金属フィルムが金を含む、請求項８に記載の分析物検出キット。

【請求項10】

前記金属ナノ層が、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、請求項２に記載の分析物検出キット。

【請求項11】

前記複数の金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、請求項１０に記載の分析物検出キット。

【請求項12】

前記複数の金属ナノ構造体が金ナノ構造体である、請求項１０に記載の分析物検出キット。

【請求項13】

前記複合金属ナノ構造体が、球状ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノシェル、ナノチューブ、ナノロッド、ナノドット、ナノアイランド、ナノワイヤ、またはそれらの組合せから選択される形状を有する、請求項１または２に記載の分析物検出キット。

【請求項14】

前記結合パートナーおよび／または捕捉分子が、抗体、抗原、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、アプタマー、リガンド、受容体、またはハプテンである、請求項１に記載の分析物検出キット。

【請求項15】

前記結合パートナーが、標的分析物の第一のエピトープを認識する抗体であり、かつ前記捕捉分子が、標的分析物の第二のエピトープを認識する異なる抗体である、請求項１に記載の分析物検出キット。

【請求項16】

前記捕捉分子が、抗体、抗原、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、アプタマー、リガンド、受容体、またはハプテンである、請求項２に記載の分析物検出キット。

【請求項17】

前記標的分析物が、感染症、生理学的状態、または病理学的状態に関連するマーカーまたは抗原である、請求項１または２に記載の分析物検出キット。

【請求項18】

前記標的分析物が、イヌ糸状虫、ネコ白血病ウイルス、イヌパルボウイルス、Ｃ反応性タンパク質、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、エールリヒア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）抗原もしくは抗体、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）抗原もしくは抗体、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）抗原もしくは抗体、がん抗原、心臓マーカー抗原、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、トロポニン、または脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項１または２に記載の分析物検出キット。

【請求項19】

ピコグラム量の前記標的分析物を検出する感度を有する、請求項１または２に記載の分析物検出キット。

【請求項20】

前記複合金属ナノ構造体が、５１５ｎｍから６７０ｎｍのピーク吸光度を有する、請求項１または２に記載の分析物検出キット。

【請求項21】

前記複合金属ナノ構造体が、５２０ｎｍから５６０ｎｍのピーク吸光度を有する、請求項１または２に記載の分析物検出キット。

【請求項22】

複合金属ナノ構造体が金からなること以外はキットとして同一の第２のキットに比べて、前記キットが有意に大きい感度の増加をもたらす、請求項１または２に記載の分析物検出キット。

【請求項23】

以下を含む、キュベット内に含まれるアッセイ複合体：
(i) 銀のコアと金のコーティングを含み、結合パートナーと結合している、複合金属ナノ構造体を含む検出コンジュゲート、
(ii) 標的分析物、および
(iii) 捕捉分子が固定化された金属ナノ層でコーティングされたビーズ、
ここで、該検出コンジュゲート中の該結合パートナーは、該標的分析物上の第一のエピトープと結合し、かつ、該捕捉分子は該標的分析物上の第二のエピトープと結合し、それによって、該検出コンジュゲート、標的分析物、及び該捕捉分子を含む複合体が形成される、アッセイ複合体。

【請求項24】

前記結合パートナーが抗体であり、かつ、前記捕捉分子が異なる抗体である、請求項２３に記載のアッセイ複合体。

【請求項25】

前記金属ナノ層が金属フィルムである、請求項２３に記載のアッセイ複合体。

【請求項26】

前記金属フィルムが、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、請求項２５に記載のアッセイ複合体。

【請求項27】

前記金属フィルムが金を含む、請求項２６に記載のアッセイ複合体。

【請求項28】

前記金属ナノ層が、前記ビーズに固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、請求項２３に記載のアッセイ複合体。

【請求項29】

前記複数の金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、請求項２８に記載のアッセイ複合体。

【請求項30】

前記複数の金属ナノ構造体が金ナノ構造体である、請求項２９に記載のアッセイ複合体。

【請求項31】

ピコグラム量の前記標的分析物を検出する感度を有する、請求項２３に記載のアッセイ複合体。

【請求項32】

前記複合金属ナノ構造体が、５１５ｎｍから６７０ｎｍのピーク吸光度を有する、請求項２３に記載のアッセイ複合体。

【請求項33】

前記複合金属ナノ構造体が、５２０ｎｍから５６０ｎｍのピーク吸光度を有する、請求項２３に記載のアッセイ複合体。

【請求項34】

以下を含む、分析物検出デバイス：
標的分析物に特異的に結合することができる結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含み、前記複合金属ナノ構造体が銅のコアと金のコーティングを含む、複数の検出コンジュゲート；
金属ナノ層を含有する表面；および
該金属ナノ層上に固定化されておりかつ該標的分析物に特異的に結合することができる、複数の捕捉分子。

【請求項35】

前記複合金属ナノ構造体が、５ｎｍから２００ｎｍの直径を有する球状ナノ粒子である、請求項３４に記載の分析物検出デバイス。

【請求項36】

前記複合金属ナノ構造体が、１０ｎｍから１００ｎｍの直径を有する球状ナノ粒子である、請求項３４に記載の分析物検出デバイス。

【請求項37】

前記複合金属ナノ構造体が、１０ｎｍから８００ｎｍのエッジ長および１ｎｍから１００ｎｍの厚さを有するナノプレートである、請求項３４に記載の分析物検出デバイス。

【請求項38】

前記表面が、チップ、ウェル、ビーズ、またはキュベットの壁、蓋、および／もしくは底部である、請求項３４に記載の分析物検出デバイス。

【請求項39】

前記金属ナノ層が金属フィルムである、請求項３４に記載の分析物検出デバイス。

【請求項40】

前記金属フィルムが、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、請求項３９に記載の分析物検出デバイス。

【請求項41】

前記金属フィルムが金を含む、請求項４０に記載の分析物検出デバイス。

【請求項42】

前記金属ナノ層が、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、請求項３４に記載の分析物検出デバイス。

【請求項43】

前記複数の金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、請求項４２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項44】

前記複数の金属ナノ構造体が金ナノ構造体である、請求項４２に記載の分析物検出デバイス。

【請求項45】

前記複合金属ナノ構造体が、球状ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノシェル、ナノチューブ、ナノロッド、ナノドット、ナノアイランド、ナノワイヤ、またはそれらの組合せから選択される形状を有する、請求項３４に記載の分析物検出デバイス。