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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023069533
(43)【公開日】2023-05-18
(54)【発明の名称】胃分泌ホルモン分泌促進剤の評価又は選択方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20230511BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021181444
(22)【出願日】2021-11-05
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000006884
【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】権藤 祐輔
(72)【発明者】
【氏名】須田 一徳
(72)【発明者】
【氏名】平沢 元希
(72)【発明者】
【氏名】松田 一乗
(72)【発明者】
【氏名】河合 光久
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ89
4B063QR56
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】胃分泌ホルモン分泌促進剤を評価又は選択する方法を提供する。
【解決手段】下記の（１）－（３）の工程を行うことを特徴とする胃分泌ホルモン分泌促進剤の評価又は選択方法。
（１）被験物質をＨｓ７４６Ｔ細胞又はＭＫＮ１細胞に接触させる工程
（２）当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度を測定する工程
（３）（２）で測定された結果に基づいて、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる被験物質を、胃分泌ホルモン分泌促進物質として評価する工程
【選択図】なし
【解決手段】下記の（１）－（３）の工程を行うことを特徴とする胃分泌ホルモン分泌促進剤の評価又は選択方法。
（１）被験物質をＨｓ７４６Ｔ細胞又はＭＫＮ１細胞に接触させる工程
（２）当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度を測定する工程
（３）（２）で測定された結果に基づいて、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる被験物質を、胃分泌ホルモン分泌促進物質として評価する工程
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の（１）－（３）の工程を行うことを特徴とする胃分泌ホルモン分泌促進剤の評価又は選択方法。
（１）被験物質をＨｓ７４６Ｔ細胞又はＭＫＮ１細胞に接触させる工程
（２）当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度を測定する工程
（３）（２）で測定された結果に基づいて、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる被験物質を、胃分泌ホルモン分泌促進物質として評価する工程
（１）被験物質をＨｓ７４６Ｔ細胞又はＭＫＮ１細胞に接触させる工程
（２）当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度を測定する工程
（３）（２）で測定された結果に基づいて、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる被験物質を、胃分泌ホルモン分泌促進物質として評価する工程
【請求項2】
胃分泌ホルモンがセロトニン、グレリン、ガストリン又はソマトスタチンである、請求項１記載の方法。
【請求項3】
被験物質が微生物である、請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、胃分泌ホルモン分泌促進剤の評価又は選択方法に関する。
【背景技術】
【0002】
グレリン、セロトニンなど消化管内分泌細胞から放出されるホルモンは、迷走神経にある受容体を介してそれを刺激する（非特許文献１）。したがって、斯かるホルモンの分泌を促進する物質は、迷走神経刺激を促進する物質として有用であると考えられる。
例えば、本出願人は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＹＩＴ ９０２９株（ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９株、以下、「ＬｃＳ」とも称する）を高密度で摂取すると、睡眠の質の向上、ストレス緩和効果が発揮されること、当該作用はＬｃＳが胃の迷走神経を刺激することによって発揮されることを報告しているが（非特許文献２、３）、当該薬理作用には、消化管から分泌されるホルモンが関与すると考えられている。
例えば、本出願人は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＹＩＴ ９０２９株（ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９株、以下、「ＬｃＳ」とも称する）を高密度で摂取すると、睡眠の質の向上、ストレス緩和効果が発揮されること、当該作用はＬｃＳが胃の迷走神経を刺激することによって発揮されることを報告しているが（非特許文献２、３）、当該薬理作用には、消化管から分泌されるホルモンが関与すると考えられている。
【0003】
従来、消化管内分泌ホルモンの分泌に対する影響を調べるためには、人や動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験、動物の胃から採取した器官や細胞を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ試験、既に株化されている内分泌細胞（ＳＴＣ－１細胞（小腸細胞）、ＲＩＮ－１４Ｂ細胞（膵臓細胞）等）を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験が行われる。しかしながら、胃については、株化された内分泌細胞が知られておらず、動物を用いた評価系しか存在していなかった（例えば、特許文献１、２）。このため、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価するためには、既存の胃由来細胞株から内分泌細胞様性質を有する細胞を探索する、あるいは、多能性幹細胞から胃内分泌細胞様に分化誘導することが必要となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特表２００９－５１６６３７号公報
【特許文献2】特表２０２０－５１３８２５号公報
【非特許文献】
【0005】
【特許文献1】Berthoud HR. (2008) Vagal and hormonal gut-brain communication: from satiation to satisfaction. Neurogastroenterol Motil. 20 Suppl 1:64-72.
【特許文献2】Takada, M. et al. (2016) Probiotic Lactobacillus casei strain Shirota relieves stress-associated symptoms by modulating the gut-brain interaction in human and animal models. Neurogastroenterol Motil. 28:1027-1036.
【特許文献3】Takada, M. et al. (2017) Beneficial effects of Lactobacillus casei strain Shirota on academic stress-induced sleep disturbance in healthy adults: a double-blind, randomised, placebo-controlled trial. Benef Microbes. 26; 8: 153-162.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、胃分泌ホルモン分泌促進剤を評価又は選択する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、胃由来細胞株について検討したところ、胃がん由来の株化細胞であるＨｓ７４６Ｔ細胞及びＭＫＮ１細胞が胃内分泌細胞様の性質を有し、当該細胞に胃分泌ホルモン分泌促進物質を作用させると細胞内カルシウムイオン濃度が上昇することを見出した。したがって、当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度を指標として、胃分泌ホルモン分泌促進剤の評価や選択が可能となる。
【0008】
すなわち、本発明は、以下の１）－３）に係るものである。
１）下記の（１）－（３）の工程を行うことを特徴とする胃分泌ホルモン分泌促進剤の評価又は選択方法。
（１）被験物質をＨｓ７４６Ｔ細胞又はＭＫＮ１細胞に接触させる工程
（２）当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度を測定する工程
（３）（２）で測定された結果に基づいて、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる被験物質を、胃分泌ホルモン分泌促進物質として評価する工程
２）胃分泌ホルモンがセロトニン、グレリン、ガストリン又はソマトスタチンである、１）の方法。
３）被験物質が微生物である、１）又は２）の方法。
１）下記の（１）－（３）の工程を行うことを特徴とする胃分泌ホルモン分泌促進剤の評価又は選択方法。
（１）被験物質をＨｓ７４６Ｔ細胞又はＭＫＮ１細胞に接触させる工程
（２）当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度を測定する工程
（３）（２）で測定された結果に基づいて、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる被験物質を、胃分泌ホルモン分泌促進物質として評価する工程
２）胃分泌ホルモンがセロトニン、グレリン、ガストリン又はソマトスタチンである、１）の方法。
３）被験物質が微生物である、１）又は２）の方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、グレリン、セロトニン等の胃内分泌細胞に含有される胃分泌ホルモンの分泌促進剤をｉｎ ｖｉｔｒｏで簡易に探索又は評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】胃がん由来細胞６株のホルモン放出誘導処理による細胞内カルシウムイオン濃度の変動。グラフ中矢印の時点において被験物質を処理した。
【図2】Ｈｓ７４６Ｔ細胞のｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ Ａ（ＣｇＡ）免疫細胞染色。青はＤＡＰＩ（核）、赤はＣｇＡを表す。ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ。
【図3】Ｈｓ７４６Ｔ細胞におけるカルシウムイオン濃度上昇細胞とＣｇＡ陽性細胞の多重染色。（Ａ）ＬｃＳ処理２８秒（ｓ）後の、４９５ｎｍ波長で励起した時の蛍光波長５１０ｎｍにおける蛍光（Ｆ４９５）画像、（Ｂ）同視野のＣｇＡ免疫染色画像、（Ｃ）安息香酸デナトニウム（ｄｅｎａｔｏｎｉｕｍ ｂｅｎｚｏａｔｅ：ＤＢ）処理２８ｓ後のＦ４９５画像、（Ｄ）同視野のＣｇＡ免疫染色画像。青はＤＡＰＩ（核）、赤はＣｇＡを表す。ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝５０μｍ。
【図4】Ｈｓ７４６Ｔ細胞、ＭＫＮ１細胞における胃内分泌ホルモンの発現。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明において、「胃分泌ホルモン」とは、胃内分泌細胞に含有され、胃内腔を通る食物やその消化物の刺激を受容して、胃粘膜下に放出されるホルモンを指す。具体的には、セロトニン、グレリン、ガストリン、ソマトスタチン、ヒスタミン、パンクレアスタチン等が挙げられ、このうちセロトニン、グレリン、ガストリン、ソマトスタチンが好ましい。
【0012】
後記実施例に示すとおり、胃がん細胞であるＨｓ７４６Ｔ細胞及びＭＫＮ１細胞は、内分泌細胞マーカーを発現し、グレリン、セロトニンのような胃分泌ホルモン分泌能を有する（実施例２、３）。そして、当該細胞に胃分泌ホルモン分泌誘導物質であるＤＢ又は迷走神経刺激作用を有するＬｃＳ（ＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６）を作用させると細胞内カルシウムイオン濃度が上昇する（実施例１）。なお、ＬｃＳは、２０２０年のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の再分類（Zheng J et al. Int J Syst Evol Microbiol. 2020 Apr; 70(4): 2782-2858）以前には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６）として知られていた菌株であり、昭和５６年１月１２日、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター）に寄託されているが、現在は、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉに分類されており、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＹＩＴ ９０２９である。
これらの結果は、Ｈｓ７４６Ｔ細胞又はＭＫＮ１細胞を用いて、その細胞内カルシウムイオン濃度を測定することにより、胃分泌ホルモンの分泌を促進する被験物質を評価又は選択できることを示唆している。
これらの結果は、Ｈｓ７４６Ｔ細胞又はＭＫＮ１細胞を用いて、その細胞内カルシウムイオン濃度を測定することにより、胃分泌ホルモンの分泌を促進する被験物質を評価又は選択できることを示唆している。
【0013】
胃分泌ホルモン分泌促進剤の評価又は選択方法は、下記の（１）－（３）の工程を行うことを特徴とする。
（１）被験物質をＨｓ７４６Ｔ細胞またはＭＫＮ１細胞に接触させる工程
（２）当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度を測定する工程
（３）（２）で測定された結果に基づいて、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる被験物質を、胃分泌ホルモン分泌促進剤として評価する工程
（１）被験物質をＨｓ７４６Ｔ細胞またはＭＫＮ１細胞に接触させる工程
（２）当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度を測定する工程
（３）（２）で測定された結果に基づいて、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる被験物質を、胃分泌ホルモン分泌促進剤として評価する工程
【0014】
本発明において、Ｈｓ７４６Ｔ細胞はヒト胃がん由来の株化細胞であり、ＡＴＣＣから購入できる。
Ｈｓ７４６Ｔ細胞は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％ ＦＢＳ、１０５Ｕ／Ｌ ペニシリン、０．１ｇ／Ｌ ストレプトマイシン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含む培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養することにより、セミコンフルエント状態で継代を行うことができる。ＤＭＥＭは哺乳類細胞の培養に汎用性のある培地であり、試薬メーカーから購入可能である。
Ｈｓ７４６Ｔ細胞は、内分泌細胞マーカーであるＣｇＡを発現する。そして、胃分泌ホルモンであるセロトニン及びグレリンを発現する。
Ｈｓ７４６Ｔ細胞は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％ ＦＢＳ、１０５Ｕ／Ｌ ペニシリン、０．１ｇ／Ｌ ストレプトマイシン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含む培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養することにより、セミコンフルエント状態で継代を行うことができる。ＤＭＥＭは哺乳類細胞の培養に汎用性のある培地であり、試薬メーカーから購入可能である。
Ｈｓ７４６Ｔ細胞は、内分泌細胞マーカーであるＣｇＡを発現する。そして、胃分泌ホルモンであるセロトニン及びグレリンを発現する。
【0015】
本発明において、ＭＫＮ１細胞はヒト胃腺扁平上皮がん由来の株化細胞であり、ヒューマンサイエンス資源財団から購入できる。
ＭＫＮ１細胞は、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＢＳ、１０５Ｕ／Ｌ ペニシリン、０．１ｇ／Ｌ ストレプトマイシン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含む培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養することにより、セミコンフルエント状態で継代を行うことができる。ＲＰＭＩ１６４０は哺乳類細胞の培養に汎用性のある培地であり、試薬メーカーから購入可能である。
ＭＫＮ１細胞は、内分泌細胞マーカーであるＣｇＡ、ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １（ＮＣＡＭ１）、ｅｎｏｌａｓｅ ２（ＥＮＯ２）を発現する。そして、胃分泌ホルモンであるセロトニン、グレリン、ガストリン及びソマトスタチンを発現する。
ＭＫＮ１細胞は、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＢＳ、１０５Ｕ／Ｌ ペニシリン、０．１ｇ／Ｌ ストレプトマイシン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含む培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養することにより、セミコンフルエント状態で継代を行うことができる。ＲＰＭＩ１６４０は哺乳類細胞の培養に汎用性のある培地であり、試薬メーカーから購入可能である。
ＭＫＮ１細胞は、内分泌細胞マーカーであるＣｇＡ、ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １（ＮＣＡＭ１）、ｅｎｏｌａｓｅ ２（ＥＮＯ２）を発現する。そして、胃分泌ホルモンであるセロトニン、グレリン、ガストリン及びソマトスタチンを発現する。
【0016】
上記細胞に接触される被験物質としては、胃分泌ホルモン分泌促進剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されず、例えば、動植物、海洋生物、微生物等及びその抽出物；それらに由来する天然成分；合成化合物；ならびにそれらの混合物及び組成物等が挙げられる。
【0017】
上記細胞に被験物質を接触させる手段としては、当該分野で公知の手段であればよく、例えば、当該被験物質の細胞培養培地や緩衝液への添加、または細胞への直接的な添加（例えば、滴下、塗布、散布、噴霧、パッチ等）が挙げられる。被験物質の濃度及び接触量は、被験物質の形態、化学的性質、細胞毒性等に基づいて適宜設定すればよい。例えば、適当な濃度に希釈した被験物質の所定量を、室温～３７℃の条件下で、該細胞に曝露することが挙げられる。なお、接触工程に使用する細胞は、後述するとおり、細胞内カルシウムイオン濃度を測定するために、被験物質と接触する前にカルシウム感受性色素を導入しておくとよい。
【0018】
細胞内カルシウムイオン濃度の測定は、細胞内カルシウム量測定法によって行えばよい。例えば、カルシウム感受性色素等を用いた蛍光強度測定が挙げられる。この方法は、被験物質と、カルシウム感受性色素（例えば、Ｆｕｒａ－２、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４等）を導入したＨｓ７４６Ｔ細胞又はＭＫＮ１細胞とを一定期間接触させたときの蛍光強度の変化により、細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定できる。例えば、室温～３７℃で接触させた直後～１６０秒間の蛍光強度の変化により、細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定できる。
カルシウム感受性色素のＨｓ７４６Ｔ細胞又はＭＫＮ１細胞への導入は、カルシウム感受性色素を含んだ緩衝液に接触させ、一定期間、例えば室温～３７℃、３０～６０分間、静置することで行うことができる。緩衝液としては、例えばＨａｎｋｓ’ ＨＥＰＥＳ バッファー、ＨＢＳＳバッファー、Ｋｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ ＨＥＰＥＳバッファーなどが挙げられる。
また、上述の被験物質と細胞を接触させる工程は、細胞をカルシウム感受性色素を含まない緩衝液で洗浄、置換して行う。洗浄や置換に使用する緩衝液はカルシウム感受性色素を含まない以外は特に限定されないが、Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄのようなカルシウム感受性色素が細胞外に出ることを防止する阻害剤を添加してもよい。細胞内カルシウムイオン濃度の測定に関する緩衝液はキットとしても販売されており、例えば同仁化学社製のＣａｌｃｉｕｍ Ｋｉｔ－Ｆｕｒａ－２のキットを用いてもよい。
カルシウム感受性色素のＨｓ７４６Ｔ細胞又はＭＫＮ１細胞への導入は、カルシウム感受性色素を含んだ緩衝液に接触させ、一定期間、例えば室温～３７℃、３０～６０分間、静置することで行うことができる。緩衝液としては、例えばＨａｎｋｓ’ ＨＥＰＥＳ バッファー、ＨＢＳＳバッファー、Ｋｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ ＨＥＰＥＳバッファーなどが挙げられる。
また、上述の被験物質と細胞を接触させる工程は、細胞をカルシウム感受性色素を含まない緩衝液で洗浄、置換して行う。洗浄や置換に使用する緩衝液はカルシウム感受性色素を含まない以外は特に限定されないが、Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄのようなカルシウム感受性色素が細胞外に出ることを防止する阻害剤を添加してもよい。細胞内カルシウムイオン濃度の測定に関する緩衝液はキットとしても販売されており、例えば同仁化学社製のＣａｌｃｉｕｍ Ｋｉｔ－Ｆｕｒａ－２のキットを用いてもよい。
【0019】
蛍光強度の測定は、ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）等の蛍光プレートリーダを用いて、例えば、温度：室温～３７℃、測定時間：被験物質注入前の２５秒間及び同物質注入後の１６０秒間、励起波長及び検出波長：指示薬の既定波長、にて行うことができる。例えば、カルシウム感受性色素としてＦｕｒａ－２を用いた場合、３４０ｎｍと３８０ｎｍの波長で励起した時の蛍光波長５１０ｎｍにおける蛍光強度の比（Ｆ３４０／Ｆ３８０）の変動が細胞内カルシウムイオン濃度の変動を表すとされている。
【0020】
次いで、上記のとおり測定された細胞内カルシウムイオン濃度の変化に基づいて、被験物質の胃分泌ホルモン分泌促進効果が評価されるが、斯かる評価は、例えば、被験物質添加前後で、又は被験物質添加群と被験物質非添加群若しくは対照物質添加群とを比較することによって行われる。あるいは、評価は、種々の濃度の被験物質間で測定結果を比較することによって行われ得る。
そして、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる被験物質は、胃分泌ホルモン分泌促進剤として同定される。
そして、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる被験物質は、胃分泌ホルモン分泌促進剤として同定される。
【0021】
斯くして得られた胃分泌ホルモン分泌促進剤は、胃分泌ホルモンの分泌を促進するための胃分泌ホルモン分泌促進剤として、食品又は医薬品として、或いはこれらに配合することにより使用できる。
【実施例0022】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0023】
実施例１ 細胞内カルシウムイオン濃度の上昇
消化管内分泌ホルモン分泌誘導物質として、グレリンやセロトニン分泌を誘導するとされるＤＢ［１）Rozengurt E. (2006) Taste receptors in the gastrointestinal tract. I. Bitter taste receptors and alpha-gustducin in the mammalian gut. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291: G171-7.、２）Janssen S. et al. (2011) Bitter taste receptors and α-gustducin regulate the secretion of ghrelin with functional effects on food intake and gastric emptying. Proc Natl Acad Sci U S A. 108(5):2094-9、３）日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）124，２１０～２１８（２００４）］と、迷走神経刺激作用を有し（前記非特許文献２、３）、胃の消化管内分泌細胞からのホルモン分泌を誘導すると解されるＬｃＳを用意した。以下の（１）で示す胃がん由来細胞６株をこれらの消化管内分泌ホルモン分泌誘導物質で処理した場合の表１細胞内カルシウムイオン濃度を（２）で示される蛍光指示薬を用いて測定した。
消化管内分泌ホルモン分泌誘導物質として、グレリンやセロトニン分泌を誘導するとされるＤＢ［１）Rozengurt E. (2006) Taste receptors in the gastrointestinal tract. I. Bitter taste receptors and alpha-gustducin in the mammalian gut. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291: G171-7.、２）Janssen S. et al. (2011) Bitter taste receptors and α-gustducin regulate the secretion of ghrelin with functional effects on food intake and gastric emptying. Proc Natl Acad Sci U S A. 108(5):2094-9、３）日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）124，２１０～２１８（２００４）］と、迷走神経刺激作用を有し（前記非特許文献２、３）、胃の消化管内分泌細胞からのホルモン分泌を誘導すると解されるＬｃＳを用意した。以下の（１）で示す胃がん由来細胞６株をこれらの消化管内分泌ホルモン分泌誘導物質で処理した場合の表１細胞内カルシウムイオン濃度を（２）で示される蛍光指示薬を用いて測定した。
【0024】
（１）細胞培養
胃由来細胞株として、６種類の胃がん細胞株を用意した。各胃がん細胞株の購入元、培養培地を表１に示す。細胞は、１００ｍｍシャーレで各種培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養し、セミコンフルエント状態で継代を行って維持した。培地の各種試薬（ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム及びペニシリン／ストレプトマイシン）はすべてＧＩＢＣＯ社より購入した。
胃由来細胞株として、６種類の胃がん細胞株を用意した。各胃がん細胞株の購入元、培養培地を表１に示す。細胞は、１００ｍｍシャーレで各種培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養し、セミコンフルエント状態で継代を行って維持した。培地の各種試薬（ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム及びペニシリン／ストレプトマイシン）はすべてＧＩＢＣＯ社より購入した。
【0025】
【表1】
【0026】
（２）Ｆｕｒａ－２蛍光指示薬を用いた細胞内カルシウムイオン濃度の測定
各細胞株を適切な細胞数で９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種し、２～３日後にセミコンフルエントで使用した。培地をＨａｎｋｓ’ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１３．８ｍＭ グルコース、ｐＨ７．４、１００μＬ／ｗｅｌｌ）に置換して３７℃、１．５時間静置した。５μＭ Ｆｕｒａ－２－ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（同仁化学）、２．５ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（同仁化学）及び０．０２％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（同仁化学）を含むＨａｎｋｓ’ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加えて、３７℃、３０分静置した。Ｈａｎｋｓ’ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後に、１．２５ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを含むＨａｎｋｓ’ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒに置換し、３７℃、３０分以上静置した後、ＤＢ（Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ）またはＬｃＳ処理を行い、Ｆｕｒａ－２の蛍光波長を測定した。
ＤＢ処理には、ＤＢを１００ｍＭになるようにＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ）に溶解したものを被験物質として用いた。ＬｃＳ処理には、ＬｃＳをＬａｃｔｏｓｅ－ＩＬＳ培地に１％接種して３７℃で２０時間培養し、ＤＰＢＳで３回洗浄した後、１×１０１０ｃｆｕ／ｍＬになるようにＤＰＢＳに懸濁したものを被験物質として使用した。
ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯには試薬注入機能があり、蛍光波長を連続測定中にｂｕｆｆｅｒの１／１０量の上記被験物質を自動で注入した（１００μＬ／ｓｅｃ）。そのため、ＤＢは終濃度１０ｍＭ、ＬｃＳは１×１０９ｃｆｕ／ｍＬの密度となる。対照群はＤＰＢＳを同量処理した。測定は、ＤＢまたはＬｃＳの処理約２５秒前から開始し、処理後約１６０秒まで計測した。
蛍光波長測定には、ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯを用い、３４０ｎｍ及び３８０ｎｍの波長で励起した時の蛍光波長５１０ｎｍの強度をそれぞれ測定した。
各細胞株を適切な細胞数で９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種し、２～３日後にセミコンフルエントで使用した。培地をＨａｎｋｓ’ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１３．８ｍＭ グルコース、ｐＨ７．４、１００μＬ／ｗｅｌｌ）に置換して３７℃、１．５時間静置した。５μＭ Ｆｕｒａ－２－ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（同仁化学）、２．５ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（同仁化学）及び０．０２％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（同仁化学）を含むＨａｎｋｓ’ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加えて、３７℃、３０分静置した。Ｈａｎｋｓ’ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後に、１．２５ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを含むＨａｎｋｓ’ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒに置換し、３７℃、３０分以上静置した後、ＤＢ（Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ）またはＬｃＳ処理を行い、Ｆｕｒａ－２の蛍光波長を測定した。
ＤＢ処理には、ＤＢを１００ｍＭになるようにＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ）に溶解したものを被験物質として用いた。ＬｃＳ処理には、ＬｃＳをＬａｃｔｏｓｅ－ＩＬＳ培地に１％接種して３７℃で２０時間培養し、ＤＰＢＳで３回洗浄した後、１×１０１０ｃｆｕ／ｍＬになるようにＤＰＢＳに懸濁したものを被験物質として使用した。
ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯには試薬注入機能があり、蛍光波長を連続測定中にｂｕｆｆｅｒの１／１０量の上記被験物質を自動で注入した（１００μＬ／ｓｅｃ）。そのため、ＤＢは終濃度１０ｍＭ、ＬｃＳは１×１０９ｃｆｕ／ｍＬの密度となる。対照群はＤＰＢＳを同量処理した。測定は、ＤＢまたはＬｃＳの処理約２５秒前から開始し、処理後約１６０秒まで計測した。
蛍光波長測定には、ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯを用い、３４０ｎｍ及び３８０ｎｍの波長で励起した時の蛍光波長５１０ｎｍの強度をそれぞれ測定した。
【0027】
（３）結果
ＤＢ（１０ｍＭ）、ＬｃＳ（１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）を各細胞に処理した時点からのＦ３４０／Ｆ３８０を経時的に測定し、処理前２５秒間の同値平均値を基点とした時の変化量を算出した結果を図１に示す。図１では、左側に経時的な波形データ（処理０秒時点を矢印で示した）、右側に処理後以降の時点におけるＦ３４０／Ｆ３８０変化量最大値のグラフを示した（平均値±標準誤差（ｎ＝３）、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ ｃｏｎｔ（Ｄｕｎｎｅｔ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ））。
ＤＢ（１０ｍＭ）、ＬｃＳ（１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）を各細胞に処理した時点からのＦ３４０／Ｆ３８０を経時的に測定し、処理前２５秒間の同値平均値を基点とした時の変化量を算出した結果を図１に示す。図１では、左側に経時的な波形データ（処理０秒時点を矢印で示した）、右側に処理後以降の時点におけるＦ３４０／Ｆ３８０変化量最大値のグラフを示した（平均値±標準誤差（ｎ＝３）、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ ｃｏｎｔ（Ｄｕｎｎｅｔ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ））。
【0028】
その結果、ＭＫＮ１細胞とＨｓ７４６Ｔ細胞では、ＤＢ処理及びＬｃＳ処理で蛍光強度比が有意に上昇した（図１（Ａ）、（Ｆ））。一方、ＭＫＮ４５やＫＡＴＯＩＩＩではＤＢ処理により蛍光強度比が有意に低下した（図１（Ｂ）、（Ｄ））。ＭＫＮ７４、ＮＵＧＣ－４では、ＤＢ及びＬｃＳ処理に伴う蛍光強度比の有意な変化は認められなかった（図１（Ｃ）、（Ｅ））。
【0029】
実施例２ Ｈｓ７４６Ｔ細胞の生理学的性質
（１）免疫細胞染色
１）方法
Ｈｓ７４６Ｔ細胞を８ウェルチャンバースライド（ＩＷＡＫＩ）に１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１～２日後にセミコンフルエントで４％ パラホルムアルデヒド／０．１Ｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢ）にて固定した。ＤＰＢＳで５分、３回洗浄した後に５％ Ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）／ＤＰＢＳ ｗｉｔｈ ０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ＰＢＳＴ）にて室温、１時間ブロッキングした。１次抗体としてｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ＣｇＡ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１／３００、ａｂｃａｍ）で４℃、一晩処理した。ＰＢＳＴで５分、３回洗浄後に２次抗体として、ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（１／１，０００、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）で室温、１時間処理した。ＰＢＳＴで５分、３回洗浄した後に、ＤＡＰＩを０．１％の終濃度で含むＤＰＢＳで３０分処理し、チャンバーを外してＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて封入し、共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８，Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で顕鏡した。陽性細胞の割合は、×４００倍率下、２視野におけるＤＡＰＩ陽性細胞数に対する割合を平均して算出した。
２）結果
図２に示すようにＣｇＡ陽性細胞が確認された。ＤＡＰＩ陽性細胞数に対するＣｇＡ陽性細胞の割合は８５．４±０．８％であった。
（１）免疫細胞染色
１）方法
Ｈｓ７４６Ｔ細胞を８ウェルチャンバースライド（ＩＷＡＫＩ）に１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１～２日後にセミコンフルエントで４％ パラホルムアルデヒド／０．１Ｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢ）にて固定した。ＤＰＢＳで５分、３回洗浄した後に５％ Ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）／ＤＰＢＳ ｗｉｔｈ ０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ＰＢＳＴ）にて室温、１時間ブロッキングした。１次抗体としてｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ＣｇＡ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１／３００、ａｂｃａｍ）で４℃、一晩処理した。ＰＢＳＴで５分、３回洗浄後に２次抗体として、ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（１／１，０００、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）で室温、１時間処理した。ＰＢＳＴで５分、３回洗浄した後に、ＤＡＰＩを０．１％の終濃度で含むＤＰＢＳで３０分処理し、チャンバーを外してＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて封入し、共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８，Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で顕鏡した。陽性細胞の割合は、×４００倍率下、２視野におけるＤＡＰＩ陽性細胞数に対する割合を平均して算出した。
２）結果
図２に示すようにＣｇＡ陽性細胞が確認された。ＤＡＰＩ陽性細胞数に対するＣｇＡ陽性細胞の割合は８５．４±０．８％であった。
【0030】
（２）カルシウムイオン濃度上昇細胞におけるＣｇＡ発現比率
１）方法
Ｈｓ７４６Ｔ細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルガラス底プレート（ＩＷＡＫＩ）に播種して使用した。Ｆｕｒａ－２の代わりに５μＭ Ｆｌｕｏ－４－ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（同仁化学）を用いて、実施例１（２）と同様に処理した。Ｆｌｕｏ－４蛍光波長測定には、ＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）を用い、４９５ｎｍ励起で５１０ｎｍ蛍光波長を観察した。
本試験では、視野全体の平均輝度を測定することで蛍光強度を定量化した。ＤＢまたはＬｃＳの処理８秒前から開始し、処理後６４秒まで計測した。計測後、４％ パラホルムアルデヒド／０．１Ｍ ＰＢにて固定し、（１）と同様にＣｇＡの免疫細胞染色を行った。なお、ＤＡＰＩ処理後は封入せずに、Ｈａｎｋｓ’ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒでウェルを満たし、ＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡で観察した。Ｆｌｕｏ－４測定時と同じ座標の視野を撮影し、Ｆｌｕｏ－４顕鏡画像と重ね合わせた。画像中のＦｌｕｏ－４蛍光を示す細胞数、ＣｇＡ陽性細胞数及びＦｌｕｏ－４蛍光強度が上昇したＣｇＡ陽性細胞数を計数した。陽性細胞数は、×２００倍率下、３視野における細胞数を平均して算出した。
２）結果
ＬｃＳ処理群（２８秒（ｓ）時点）のＦｌｕｏ－４蛍光画像を図３（Ａ）に、同視野のＣｇＡ免疫染色像を図３（Ｂ）に示す。２８ｓ時点でＦｌｕｏ－４蛍光強度が上昇した細胞数、ＣｇＡ陽性細胞数及びＦｌｕｏ－４蛍光強度が上昇したＣｇＡ陽性細胞数をそれぞれ計数し、割合を算出した。Ｆｌｕｏ－４蛍光強度が上昇した細胞のうちＣｇＡ陽性細胞の割合は９４．１７±１．５８％（ｎ＝３）であり、細胞内カルシウムイオン濃度が上昇した細胞のほとんどがＣｇＡ陽性細胞であることを確認した。また、ＣｇＡ陽性細胞のうちＦｌｕｏ－４蛍光強度が上昇した細胞の割合は、４０．４１±３．３４％（ｎ＝３）であった。また、ＤＢ処理群（２８ｓ時点）において、Ｆｌｕｏ－４蛍光強度が上昇した細胞のほとんどがＣｇＡ陽性細胞であることが確認された。（図３（Ｃ）、（Ｄ））
１）方法
Ｈｓ７４６Ｔ細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルガラス底プレート（ＩＷＡＫＩ）に播種して使用した。Ｆｕｒａ－２の代わりに５μＭ Ｆｌｕｏ－４－ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（同仁化学）を用いて、実施例１（２）と同様に処理した。Ｆｌｕｏ－４蛍光波長測定には、ＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）を用い、４９５ｎｍ励起で５１０ｎｍ蛍光波長を観察した。
本試験では、視野全体の平均輝度を測定することで蛍光強度を定量化した。ＤＢまたはＬｃＳの処理８秒前から開始し、処理後６４秒まで計測した。計測後、４％ パラホルムアルデヒド／０．１Ｍ ＰＢにて固定し、（１）と同様にＣｇＡの免疫細胞染色を行った。なお、ＤＡＰＩ処理後は封入せずに、Ｈａｎｋｓ’ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒでウェルを満たし、ＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡で観察した。Ｆｌｕｏ－４測定時と同じ座標の視野を撮影し、Ｆｌｕｏ－４顕鏡画像と重ね合わせた。画像中のＦｌｕｏ－４蛍光を示す細胞数、ＣｇＡ陽性細胞数及びＦｌｕｏ－４蛍光強度が上昇したＣｇＡ陽性細胞数を計数した。陽性細胞数は、×２００倍率下、３視野における細胞数を平均して算出した。
２）結果
ＬｃＳ処理群（２８秒（ｓ）時点）のＦｌｕｏ－４蛍光画像を図３（Ａ）に、同視野のＣｇＡ免疫染色像を図３（Ｂ）に示す。２８ｓ時点でＦｌｕｏ－４蛍光強度が上昇した細胞数、ＣｇＡ陽性細胞数及びＦｌｕｏ－４蛍光強度が上昇したＣｇＡ陽性細胞数をそれぞれ計数し、割合を算出した。Ｆｌｕｏ－４蛍光強度が上昇した細胞のうちＣｇＡ陽性細胞の割合は９４．１７±１．５８％（ｎ＝３）であり、細胞内カルシウムイオン濃度が上昇した細胞のほとんどがＣｇＡ陽性細胞であることを確認した。また、ＣｇＡ陽性細胞のうちＦｌｕｏ－４蛍光強度が上昇した細胞の割合は、４０．４１±３．３４％（ｎ＝３）であった。また、ＤＢ処理群（２８ｓ時点）において、Ｆｌｕｏ－４蛍光強度が上昇した細胞のほとんどがＣｇＡ陽性細胞であることが確認された。（図３（Ｃ）、（Ｄ））
【0031】
実施例３ ＭＫＮ１細胞の生理学的性質
（１）細胞培養
ＭＫＮ１細胞は、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＢＳ、１０５Ｕ／Ｌ ペニシリン、０．１ｇ／Ｌ ストレプトマイシン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含む培地を用いて、シャーレで３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養し、セミコンフルエント状態で継代を行って維持した。
（１）細胞培養
ＭＫＮ１細胞は、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＢＳ、１０５Ｕ／Ｌ ペニシリン、０．１ｇ／Ｌ ストレプトマイシン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含む培地を用いて、シャーレで３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養し、セミコンフルエント状態で継代を行って維持した。
【0032】
（２）内分泌細胞マーカーの発現
内分泌細胞マーカーの発現をＲＴ－ＰＣＲで調べた。主要な内分泌細胞マーカーとしてＣｇＡを、補完的なマーカーとしてＮＣＡＭ１及びＥＮＯ２を選択し、それらの発現を調べた。
培養後の細胞をＤＰＢＳで洗浄した後に、ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁して回収したものからＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて１，２５０ｎｇのＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製し、ＰＣＲに供した。
ＰＣＲでは、０．５μＭ プライマー、２５０ｎｇ ｃＤＮＡ及びＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いた。９５℃で５分間変性させた後、「９５℃で３０秒間変性させ、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間伸長させる」というサイクルを３５回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長させた。
各プライマー配列を表２に示す。ＰＣＲ後、２％のアガロース（関東化学）ゲルで電気泳動を行い、ＧｅｌＲｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）で染色し、ＵＶトランスイルミネーターで撮影した。
その結果、表３に示すとおり、ＣｇＡ、ＮＣＡＭ１及びＥＮＯ２の発現が確認された。
内分泌細胞マーカーの発現をＲＴ－ＰＣＲで調べた。主要な内分泌細胞マーカーとしてＣｇＡを、補完的なマーカーとしてＮＣＡＭ１及びＥＮＯ２を選択し、それらの発現を調べた。
培養後の細胞をＤＰＢＳで洗浄した後に、ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁して回収したものからＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて１，２５０ｎｇのＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製し、ＰＣＲに供した。
ＰＣＲでは、０．５μＭ プライマー、２５０ｎｇ ｃＤＮＡ及びＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いた。９５℃で５分間変性させた後、「９５℃で３０秒間変性させ、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間伸長させる」というサイクルを３５回繰返し、最後に７２℃で７分間伸長させた。
各プライマー配列を表２に示す。ＰＣＲ後、２％のアガロース（関東化学）ゲルで電気泳動を行い、ＧｅｌＲｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）で染色し、ＵＶトランスイルミネーターで撮影した。
その結果、表３に示すとおり、ＣｇＡ、ＮＣＡＭ１及びＥＮＯ２の発現が確認された。
【0033】
【表2】
【0034】
【表3】
【0035】
（３）胃内分泌ホルモンの発現
ＭＫＮ１細胞株を８ウェルチャンバースライドに播種し、セミコンフルエントで４％ パラホルムアルデヒド／０．１Ｍ ＰＢにて固定した。ＤＰＢＳで３回洗浄したのちに、５％ Ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ／ＰＢＳＴにて室温、３０分間ブロッキングし、続いて１次抗体で４℃、一晩処理した。ＰＢＳＴで３回洗浄後に２次抗体で室温、１時間処理した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後に、ＤＡＰＩを０．１％の終濃度で含むＤＰＢＳで室温、３０分間処理し、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤにて封入した。サンプルはすべて共焦点顕微鏡で顕鏡した。
１次抗体の特異的抗原として内分泌ホルモンのセロトニン（５－ＨＴ）、グレリン（Ｇｈｒｌ）、ガストリン（Ｇａｓｔ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）を標的とした。使用した１次抗体と２次抗体について、表４にまとめた。
ＭＫＮ１細胞株を８ウェルチャンバースライドに播種し、セミコンフルエントで４％ パラホルムアルデヒド／０．１Ｍ ＰＢにて固定した。ＤＰＢＳで３回洗浄したのちに、５％ Ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ／ＰＢＳＴにて室温、３０分間ブロッキングし、続いて１次抗体で４℃、一晩処理した。ＰＢＳＴで３回洗浄後に２次抗体で室温、１時間処理した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後に、ＤＡＰＩを０．１％の終濃度で含むＤＰＢＳで室温、３０分間処理し、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤにて封入した。サンプルはすべて共焦点顕微鏡で顕鏡した。
１次抗体の特異的抗原として内分泌ホルモンのセロトニン（５－ＨＴ）、グレリン（Ｇｈｒｌ）、ガストリン（Ｇａｓｔ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）を標的とした。使用した１次抗体と２次抗体について、表４にまとめた。
【0036】
【表4】
【0037】
図４に示すとおり、セロトニン（５－ＨＴ）、グレリン（Ｇｈｒｌ）、ガストリン（Ｇａｓｔ）及びソマトスタチン（ＳＳＴ）の発現が確認された。
【0038】
実施例４ Ｈｓ７４６Ｔ細胞の生理学的性質２
実施例３のＭＫＮ１細胞株をＨｓ７４６Ｔ細胞に変えて、同様の処理を行い、セロトニン（５－ＨＴ）及びグレリン（Ｇｈｒｌ）の発現を確認した。
実施例３のＭＫＮ１細胞株をＨｓ７４６Ｔ細胞に変えて、同様の処理を行い、セロトニン（５－ＨＴ）及びグレリン（Ｇｈｒｌ）の発現を確認した。
【0039】
図４に示すとおり、セロトニン（５－ＨＴ）およびグレリン（Ｇｈｒｌ）の発現が確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】