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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023070540
(43)【公開日】2023-05-19
(54)【発明の名称】皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20230512BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230512BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230512BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20230512BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230512BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230512BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20230512BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20230512BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
A61K45/00
A61P17/00
A61P17/04
A61P17/06
A61P43/00 105
A61Q19/00
C12N5/071
【審査請求】未請求
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021182782
(22)【出願日】2021-11-09
(71)【出願人】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ニヨンサバ フランソワ
(72)【発明者】
【氏名】ペン グ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C083
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B063QA05
4B063QQ79
4B063QR08
4B063QR48
4B063QR77
4B063QS33
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BA30
4B065CA44
4C083BB51
4C083CC02
4C083EE12
4C084AA17
4C084MA63
4C084NA14
4C084ZA89
4C084ZB21
(57)【要約】
【課題】皮膚バリア機能改善剤をスクリーニングする新たな手段を提供すること。
【解決手段】皮膚細胞のオートファジー活性を指標として被験物質を評価する工程を含む、皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法。
【選択図】なし
【解決手段】皮膚細胞のオートファジー活性を指標として被験物質を評価する工程を含む、皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
皮膚細胞のオートファジー活性を指標として被験物質を評価する工程を含む、皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法。
【請求項2】
オートファジー活性化剤を有効成分とする、皮膚バリア機能改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法に関する。より詳細には、皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法、並びに皮膚バリア機能改善剤に関する。
【背景技術】
【0002】
皮膚バリアは、角層バリア及びタイトジャンクションバリアで構成されている。
この皮膚バリアは、皮膚への異物侵入や水分の蒸散防止などを担っており、皮膚バリア機能障害は、アトピー性皮膚炎や乾癬、老人性乾皮症等といった様々な皮膚疾患の他、乾燥肌、荒れ肌に関連すると考えられている。そのため、皮膚バリア機能改善剤の開発が望まれている。
一方、オートファジーは、細胞内で生成された不要タンパク質を細胞がリサイクルするシステムであり、細胞の通常の新陳代謝の他、感染症や神経障害との関連が報告されている（非特許文献１）。
この皮膚バリアは、皮膚への異物侵入や水分の蒸散防止などを担っており、皮膚バリア機能障害は、アトピー性皮膚炎や乾癬、老人性乾皮症等といった様々な皮膚疾患の他、乾燥肌、荒れ肌に関連すると考えられている。そのため、皮膚バリア機能改善剤の開発が望まれている。
一方、オートファジーは、細胞内で生成された不要タンパク質を細胞がリサイクルするシステムであり、細胞の通常の新陳代謝の他、感染症や神経障害との関連が報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Mizushima N, Levine B. Autophagy in Human Diseases. N Engl J Med. 2020;383(16):1564-1576. doi: 10.1056/NEJMra2022774.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかしながら、皮膚細胞のオートファジー活性の変化と、皮膚バリア機能との間に相関関係があるということはこれまで知られていない。
本発明の課題は、皮膚バリア機能改善剤をスクリーニングする新たな手段を提供することにある。
本発明の課題は、皮膚バリア機能改善剤をスクリーニングする新たな手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは鋭意検討した結果、皮膚細胞のオートファジー活性の変化と、皮膚バリア機能との間に相関関係があることを見出した。そして、この知見に基づいて、皮膚細胞のオートファジー活性を指標とすることで皮膚バリア機能改善剤をスクリーニングできることを見出した。
【0006】
すなわち、本発明は、以下の＜１＞～＜２＞を提供するものである。
＜１＞ 皮膚細胞のオートファジー活性を指標として被験物質を評価する工程を含む、皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法。
＜２＞ オートファジー活性化剤を有効成分とする、皮膚バリア機能改善剤。
＜１＞ 皮膚細胞のオートファジー活性を指標として被験物質を評価する工程を含む、皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法。
＜２＞ オートファジー活性化剤を有効成分とする、皮膚バリア機能改善剤。
【発明の効果】
【0007】
本発明のスクリーニング方法によれば、皮膚バリア機能改善剤を簡便にスクリーニングできる。
本発明の皮膚バリア機能改善剤は、皮膚バリア機能の改善に有用である。
本発明の皮膚バリア機能改善剤は、皮膚バリア機能の改善に有用である。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】ｈＢＤ－３のオートファジー活性化効果を示す図。
【図2-1】ｈＢＤ－３のＣＬＤＮ－１発現促進効果を示す図。
【図2-2】ｈＢＤ－３のＺＯ－１発現促進効果を示す図。
【図3-1】ｍＢＤ－１４を適用した場合のマウスの耳の厚さを示す図。
【図3-2】ｍＢＤ－１４を適用した場合のＴＥＷＬを示す図。
【図4-1】ＡｈＲアンタゴニストを投与した場合のＬＣ３発現量を示す図。
【図4-2】ＡｈＲアンタゴニストを投与した場合のｐ６２発現量を示す図。
【図5-1】ＡｈＲ経路活性化とアトピー性皮膚炎改善効果との関連を示す図（マウスの耳の厚さ）。
【図5-2】ＡｈＲ経路活性化とアトピー性皮膚炎改善効果との関連を示す図（ＴＥＷＬ）。
【図6-1】アトピー性皮膚炎患者由来皮膚サンプルにおけるＬＣ３発現量を示す図。
【図6-2】アトピー性皮膚炎患者由来皮膚サンプルにおけるｐ６２発現量を示す図。
【図7-1】ＤＮＣＢ誘発性ＡＤモデルマウス由来皮膚サンプルにおけるＬＣ３、ｐ６２発現量を示す図。
【図7-2】ＭＣ９０３誘発性ＡＤモデルマウス由来皮膚サンプルにおけるＬＣ３、ｐ６２発現量を示す図。
【図7-3】ダニ誘発性ＡＤモデルマウス由来皮膚サンプルにおけるＬＣ３、ｐ６２発現量を示す図。
【図8】オートファジー欠損細胞における皮膚バリア機能の低下を示す図。
【図9】オートファジー欠損細胞におけるＣＬＤＮ－１、ＺＯ－１発現量の低下を示す図。
【図10】オートファジー欠損した場合にアトピー性皮膚炎が悪化しやすくなることを示す図。
【発明を実施するための形態】
【0009】
〔スクリーニング方法〕
本発明の皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法は、皮膚細胞のオートファジー活性を指標として被験物質を評価する工程を含むことを特徴とする。
被験物質は、天然に存在する物質であっても化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよい。また、組成物や混合物であってもよい。
本発明の皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法は、皮膚細胞のオートファジー活性を指標として被験物質を評価する工程を含むことを特徴とする。
被験物質は、天然に存在する物質であっても化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよい。また、組成物や混合物であってもよい。
【0010】
上記皮膚細胞としては、表皮角化細胞、線維芽細胞、及びメラノサイトから選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。
後記実施例に記載のとおり、本発明者らの検討によって、オートファジー欠損表皮角化細胞では皮膚バリア機能の低下がみられることが判明した。さらにアトピー性皮膚炎患者やアトピー性皮膚炎マウスの皮膚に、オートファジー関連マーカーであるＬＣ３発現量の低下及びｐ６２発現量の増大がみられることと、オートファジー欠損した場合にアトピー性皮膚炎が悪化しやすくなることが判明した。
したがって、皮膚細胞のオートファジー活性の変化と、皮膚バリア機能との間に相関関係があることがわかった。また、被験物質非存在下又は対象物質存在下と被験物質存在下とで皮膚細胞のオートファジー活性を測定し、被験物質存在下の皮膚細胞のオートファジー活性が、被験物質非存在下又は対象物質存在下の皮膚細胞のオートファジー活性より高いと認められる場合に、皮膚バリア機能改善効果を示す可能性が高いことがわかる。
後記実施例に記載のとおり、本発明者らの検討によって、オートファジー欠損表皮角化細胞では皮膚バリア機能の低下がみられることが判明した。さらにアトピー性皮膚炎患者やアトピー性皮膚炎マウスの皮膚に、オートファジー関連マーカーであるＬＣ３発現量の低下及びｐ６２発現量の増大がみられることと、オートファジー欠損した場合にアトピー性皮膚炎が悪化しやすくなることが判明した。
したがって、皮膚細胞のオートファジー活性の変化と、皮膚バリア機能との間に相関関係があることがわかった。また、被験物質非存在下又は対象物質存在下と被験物質存在下とで皮膚細胞のオートファジー活性を測定し、被験物質存在下の皮膚細胞のオートファジー活性が、被験物質非存在下又は対象物質存在下の皮膚細胞のオートファジー活性より高いと認められる場合に、皮膚バリア機能改善効果を示す可能性が高いことがわかる。
【0011】
本明細書において「皮膚バリア機能改善」とは、皮膚バリア機能を改善させることをいい、具体的には、皮膚バリア機能関連タンパク質の発現を増強させることや経表皮水分蒸散量を減少させることをいう。
また、本明細書において「アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療」とは、アトピー性皮膚炎を予防及び／又は治療することをいい、具体的には、アトピー性皮膚炎の炎症やかゆみを抑制することをいう。アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療は、好ましくは皮膚バリア機能改善によるアトピー性皮膚炎予防及び／又は治療である。
また、本明細書において「アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療」とは、アトピー性皮膚炎を予防及び／又は治療することをいい、具体的には、アトピー性皮膚炎の炎症やかゆみを抑制することをいう。アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療は、好ましくは皮膚バリア機能改善によるアトピー性皮膚炎予防及び／又は治療である。
【0012】
オートファジー活性の評価としては、例えば、オートファゴソームが形成されるときのオートファジー活性の評価、オートファゴソームがリソソームと融合するときのオートファジー活性の評価（より具体的にはこれら活性の免疫蛍光や電子顕微鏡観察法を用いた評価）が挙げられる。また、オートファジー活性の測定は、オートファジー関連タンパク質群の遺伝子発現量の測定でもタンパク質発現量の測定でもよい。
また、オートファジー活性を測定する具体的な手法としては、例えば、顕微鏡で細胞を観察する手法、蛍光標識したオートファジー関連マーカーを発現させた後に蛍光顕微鏡で観察又は機器（例えば、フローサイトメータ、蛍光プレートリーダ等）で測定する手法、オートファジー関連マーカーをウエスタンブロティング法等で測定する手法が挙げられる。より具体的には、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、免疫学的測定法（例えば、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降等）等の手法でオートファジー活性を検出できる。
オートファジー関連マーカーとしては、ＬＣ３（具体的にはＬＣ３－Ｉ、ＬＣ３－ＩＩ）、ｐ－ｐ６２、ｐ６２、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ａｔｇ５、ｍＴＯＲ、ｐ－ｍＴＯＲ、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２／Ｇａｔｅ－１６等が挙げられる。
また、オートファジー活性を測定する具体的な手法としては、例えば、顕微鏡で細胞を観察する手法、蛍光標識したオートファジー関連マーカーを発現させた後に蛍光顕微鏡で観察又は機器（例えば、フローサイトメータ、蛍光プレートリーダ等）で測定する手法、オートファジー関連マーカーをウエスタンブロティング法等で測定する手法が挙げられる。より具体的には、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、免疫学的測定法（例えば、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降等）等の手法でオートファジー活性を検出できる。
オートファジー関連マーカーとしては、ＬＣ３（具体的にはＬＣ３－Ｉ、ＬＣ３－ＩＩ）、ｐ－ｐ６２、ｐ６２、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ａｔｇ５、ｍＴＯＲ、ｐ－ｍＴＯＲ、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２／Ｇａｔｅ－１６等が挙げられる。
【0013】
そして、本発明のスクリーニング方法によれば、皮膚バリア機能改善剤を簡便にスクリーニングできる。スクリーニングされた皮膚バリア機能改善剤は、アトピー性皮膚炎や乾癬、老人性乾皮症等といった様々な皮膚疾患の他、乾燥肌、荒れ肌を改善するのに有用である。
【0014】
〔皮膚バリア機能改善剤〕
本発明の皮膚バリア機能改善剤は、オートファジー活性化剤を有効成分とする。オートファジー活性化剤は、公知のオートファジー活性化剤であっても本発明のスクリーニング方法で皮膚細胞オートファジー活性化が認められたものであってもよい。本明細書において「オートファジー活性化剤」とは、皮膚細胞のオートファジーを活性化させる剤を意味する。
本発明の皮膚バリア機能改善剤は、皮膚バリア機能改善に有効な医薬品、医薬部外品、化粧品若しくは食品として、又は医薬品、医薬部外品、化粧品若しくは食品に配合する素材として使用可能である。
なお、食品は、皮膚バリア機能改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した保健機能食品（例えば機能性表示食品、特定保健用食品、栄養機能食品等）とすることが可能である。
本発明の皮膚バリア機能改善剤は、オートファジー活性化剤を有効成分とする。オートファジー活性化剤は、公知のオートファジー活性化剤であっても本発明のスクリーニング方法で皮膚細胞オートファジー活性化が認められたものであってもよい。本明細書において「オートファジー活性化剤」とは、皮膚細胞のオートファジーを活性化させる剤を意味する。
本発明の皮膚バリア機能改善剤は、皮膚バリア機能改善に有効な医薬品、医薬部外品、化粧品若しくは食品として、又は医薬品、医薬部外品、化粧品若しくは食品に配合する素材として使用可能である。
なお、食品は、皮膚バリア機能改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した保健機能食品（例えば機能性表示食品、特定保健用食品、栄養機能食品等）とすることが可能である。
【0015】
本発明の皮膚バリア機能改善剤の適用手段は、経口、注射、皮膚外用等のいずれでもよいが、皮膚外用又は注射が好ましく、皮膚外用がより好ましい。なお、このような皮膚を適用部位とする形態としては、例えば、皮膚外用剤、入浴剤、注射用製剤が挙げられる。なお、「皮膚」は、顔や身体、手足の皮膚、及び頭皮を包含する概念である。
【0016】
本発明の皮膚バリア機能改善剤を経口投与する場合、その剤形としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤、ドライシロップ剤等の固形製剤；半固形製剤；懸濁剤、シロップ剤等の液状製剤等が挙げられる。医薬品、医薬部外品、食品のいずれの場合においても、これらの剤形にしてよい。また、経口投与用組成物とする場合には、上記の有効成分に加えて、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤等の添加剤を含有せしめることができる。
また、上記食品の具体的な形態としては、錠剤等の上記剤形の保健機能食品やサプリメントの他、ウエハース、ビスケット、ガム等の各種食品が挙げられる。
また、上記食品の具体的な形態としては、錠剤等の上記剤形の保健機能食品やサプリメントの他、ウエハース、ビスケット、ガム等の各種食品が挙げられる。
【0017】
本発明の皮膚バリア機能改善剤を経皮用（皮膚外用剤）とする場合、その剤形としては、軟膏剤、クリーム剤、乳液、ゲル剤、ペースト剤、ローション、スプレー剤、貼付剤等が挙げられる。また、皮膚外用剤は、例えば、化粧水、美容液、パック、乳液、クリーム、サンスクリーン、サンオイル等の形態にしてもよい。
皮膚を適用部位とする形態とする場合には、上記の有効成分に加えて、通常の外用剤や入浴剤において基材や添加剤として用いられる各種成分を含有せしめることができる。
皮膚を適用部位とする形態とする場合には、上記の有効成分に加えて、通常の外用剤や入浴剤において基材や添加剤として用いられる各種成分を含有せしめることができる。
【0018】
そして、本発明の皮膚バリア機能改善剤は、皮膚バリア機能の改善に有用である。本発明の皮膚バリア機能改善剤は、アトピー性皮膚炎や乾癬、老人性乾皮症等といった様々な皮膚疾患の他、乾燥肌、荒れ肌を改善するのに有用である。
【実施例0019】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0020】
〔試験例１〕
１２ウェルのプレート１ウェルに培地（ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２）を０．８ｍＬ添加し、ケラチノサイトを５×１０4個播種した後、３－４日間培養（３７℃、９５％Ａｉｒ、５％ＣＯ2）した。次に、ヒトβ－ディフェンシン－３（ｈＢＤ－３）１０μｇ／ｍＬで９時間処理した。オートファジーマーカーＬＣ３－Ｉ、ＬＣ３－ＩＩをイムノブロットで検出し、ＬＣ３－ＩＩ／ＬＣ３－Ｉ比を算出した。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。
結果を図１に示す（ｎ＝３，＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。
図１に示すとおり、ヒトβ－ディフェンシン－３がオートファジーを活性化させることが確認できた。
１２ウェルのプレート１ウェルに培地（ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２）を０．８ｍＬ添加し、ケラチノサイトを５×１０4個播種した後、３－４日間培養（３７℃、９５％Ａｉｒ、５％ＣＯ2）した。次に、ヒトβ－ディフェンシン－３（ｈＢＤ－３）１０μｇ／ｍＬで９時間処理した。オートファジーマーカーＬＣ３－Ｉ、ＬＣ３－ＩＩをイムノブロットで検出し、ＬＣ３－ＩＩ／ＬＣ３－Ｉ比を算出した。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。
結果を図１に示す（ｎ＝３，＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。
図１に示すとおり、ヒトβ－ディフェンシン－３がオートファジーを活性化させることが確認できた。
【0021】
〔試験例２〕
１２ウェルのプレート１ウェルに培地（ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２）を０．８ｍＬ添加し、ケラチノサイトを５×１０4個播種した後、３－４日間培養（３７℃、９５％Ａｉｒ、５％ＣＯ2）した。次に、Ｅ＆Ｐ（Ｅ６４ｄ ａｎｄ ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ）１０μｇ／ｍＬ、クロロキン（ＣＱ）１０μＭ、バフィロマイシンＡ１（ＢＡＦ）１０μｇ／ｍＬ、ワートマニン（ＷＯＲＴ）１０μＭ、又はＤＭＳＯ０．１％（コントロール群及びｈＢＤ－３群）で２時間前処理した。その後、コントロール群以外については、ヒトβ－ディフェンシン－３（ｈＢＤ－３）１０μｇ／ｍＬで９時間処理した。なお、Ｅ＆Ｐ、ＣＱ、ＢＡＦ及びＷＯＲＴはオートファジー阻害剤である。
マウス由来抗クローディン－１（ＣＬＤＮ－１）抗体又はマウス由来抗ＺＯ－１抗体を一次抗体として、ヤギ由来抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ コンジュゲートＩｇＧ抗体を二次抗体としてそれぞれ使用して染色した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて免疫蛍光顕微鏡写真を取得し、タイトジャンクションタンパク質であるＣＬＤＮ－１及びＺＯ－１について発現量を定量化した。
ＣＬＤＮ－１発現量を図２－１（ｎ＝３，＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１，＃＃：ｐ＜０．０１，＃＃＃＃：ｐ＜０．０００１）に、ＺＯ－１発現量を図２－２（ｎ＝３，＊：ｐ＜０．０５，＃：ｐ＜０．０５）に、それぞれ示す。
図２－１及び図２－２に示すとおり、ヒトβ－ディフェンシン－３がＣＬＤＮ－１、ＺＯ－１の発現を促進することが確認できた。
１２ウェルのプレート１ウェルに培地（ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２）を０．８ｍＬ添加し、ケラチノサイトを５×１０4個播種した後、３－４日間培養（３７℃、９５％Ａｉｒ、５％ＣＯ2）した。次に、Ｅ＆Ｐ（Ｅ６４ｄ ａｎｄ ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ）１０μｇ／ｍＬ、クロロキン（ＣＱ）１０μＭ、バフィロマイシンＡ１（ＢＡＦ）１０μｇ／ｍＬ、ワートマニン（ＷＯＲＴ）１０μＭ、又はＤＭＳＯ０．１％（コントロール群及びｈＢＤ－３群）で２時間前処理した。その後、コントロール群以外については、ヒトβ－ディフェンシン－３（ｈＢＤ－３）１０μｇ／ｍＬで９時間処理した。なお、Ｅ＆Ｐ、ＣＱ、ＢＡＦ及びＷＯＲＴはオートファジー阻害剤である。
マウス由来抗クローディン－１（ＣＬＤＮ－１）抗体又はマウス由来抗ＺＯ－１抗体を一次抗体として、ヤギ由来抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ コンジュゲートＩｇＧ抗体を二次抗体としてそれぞれ使用して染色した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて免疫蛍光顕微鏡写真を取得し、タイトジャンクションタンパク質であるＣＬＤＮ－１及びＺＯ－１について発現量を定量化した。
ＣＬＤＮ－１発現量を図２－１（ｎ＝３，＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１，＃＃：ｐ＜０．０１，＃＃＃＃：ｐ＜０．０００１）に、ＺＯ－１発現量を図２－２（ｎ＝３，＊：ｐ＜０．０５，＃：ｐ＜０．０５）に、それぞれ示す。
図２－１及び図２－２に示すとおり、ヒトβ－ディフェンシン－３がＣＬＤＮ－１、ＺＯ－１の発現を促進することが確認できた。
【0022】
〔試験例３〕
（オートファジー欠損マウスの作製）
Ｋ１４－Ｃｒｅトランスジェニックマウス（Ｋ１４プロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウス（ジャクソンラボラトリー製））とＡｔｇ７－ｆｌｏｘｅｄマウス（Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/f）とを交配させて、オートファジー欠損マウス（Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/f）を作製した。Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/fにおけるオートファジーのケラチノサイト特異的欠失を確認した。
（ＤＮＣＢ処理）
Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/fマウス、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/fマウスについて、２，４－ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）連用開始５日前に背中を剃毛し、ＤＮＣＢ連用開始４日前に耳と背中を１％ＤＮＣＢで１回処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。その処理の４日後から１９日間の間、１週間あたりに３回の頻度で０．２％ＤＮＣＢ処理（０．１ｍＬ／ｃｍ2）した。
また、Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/f ＋ ｍＢＤ－１４群、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/f ＋ ｍＢＤ－１４群のマウスには、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１５日目から１９日目までの間、２日おきにｍＢＤ－１４（ｈＢＤ－３のマウスオーソログ）処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。
一方、Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/f ＋ ｖｅｈｉｃｌｅ群、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/f ＋ ｖｅｈｉｃｌｅ群のマウスには、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１５日目から１９日目までの間、２日おきに同じ量の食塩水で処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。
その後、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１９日目に、マウスの耳の厚さと経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した。
マウスの耳の厚さを図３－１（ｎ＝８，＊＊＊：ｐ＜０．００１，＃＃＃＃：ｐ＜０．０００１）に、ＴＥＷＬを図３－２（ｎ＝１２，＊：ｐ＜０．０５，＃＃＃＃：ｐ＜０．０００１）に、それぞれ示す。
図３－１及び図３－２に示す結果から、ｍＢＤ－１４（ｈＢＤ－３のマウスオーソログ）は、オートファジーを活性化させることによってアトピー性皮膚炎を改善させるものと考えられる。
（オートファジー欠損マウスの作製）
Ｋ１４－Ｃｒｅトランスジェニックマウス（Ｋ１４プロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウス（ジャクソンラボラトリー製））とＡｔｇ７－ｆｌｏｘｅｄマウス（Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/f）とを交配させて、オートファジー欠損マウス（Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/f）を作製した。Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/fにおけるオートファジーのケラチノサイト特異的欠失を確認した。
（ＤＮＣＢ処理）
Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/fマウス、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/fマウスについて、２，４－ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）連用開始５日前に背中を剃毛し、ＤＮＣＢ連用開始４日前に耳と背中を１％ＤＮＣＢで１回処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。その処理の４日後から１９日間の間、１週間あたりに３回の頻度で０．２％ＤＮＣＢ処理（０．１ｍＬ／ｃｍ2）した。
また、Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/f ＋ ｍＢＤ－１４群、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/f ＋ ｍＢＤ－１４群のマウスには、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１５日目から１９日目までの間、２日おきにｍＢＤ－１４（ｈＢＤ－３のマウスオーソログ）処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。
一方、Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/f ＋ ｖｅｈｉｃｌｅ群、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/f ＋ ｖｅｈｉｃｌｅ群のマウスには、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１５日目から１９日目までの間、２日おきに同じ量の食塩水で処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。
その後、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１９日目に、マウスの耳の厚さと経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した。
マウスの耳の厚さを図３－１（ｎ＝８，＊＊＊：ｐ＜０．００１，＃＃＃＃：ｐ＜０．０００１）に、ＴＥＷＬを図３－２（ｎ＝１２，＊：ｐ＜０．０５，＃＃＃＃：ｐ＜０．０００１）に、それぞれ示す。
図３－１及び図３－２に示す結果から、ｍＢＤ－１４（ｈＢＤ－３のマウスオーソログ）は、オートファジーを活性化させることによってアトピー性皮膚炎を改善させるものと考えられる。
【0023】
〔試験例４〕
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５～６週齢）３匹を、ＡｈＲアンタゴニスト経口投与群と溶媒経口投与群の２群に分けた。
ＡｈＲアンタゴニスト経口投与群のマウスには、ＣＨ－２２３１９１（２－メチル－２Ｈ－ピラゾール－３－カルボン酸（２－メチル－４－ｏ－トリルアゾ－フェニル）－アミド）を、溶媒経口投与群のマウスには、同じ量のコーン油を、それぞれＤＮＣＢ連用開始１５日前からＤＮＣＢ連用１７日経過後まで給餌した。
各群のマウスについて、ＤＮＣＢ連用開始５日前に背中を剃毛し、ＤＮＣＢ連用開始４日前に耳と背中を１％ＤＮＣＢで１回処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。その処理の４日後から１７日間の間、１週間あたりに３回の頻度で０．２％ＤＮＣＢ処理（０．１ｍＬ／ｃｍ2）した。
また、各群のマウスについて、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１５日目及び１７日目に、ｍＢＤ－１４（ｈＢＤ－３のマウスオーソログ）処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。
その後、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１８日目にマウスを安楽死させ、病変部位の表皮を採取した。
ウサギ由来抗ＬＣ３抗体又はウサギ由来抗ｐ６２抗体を一次抗体として、ヤギ由来抗ラビットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ コンジュゲートＩｇＧ抗体を二次抗体としてそれぞれ使用して染色した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて免疫蛍光顕微鏡写真を取得し、オートファジー関連マーカーであるＬＣ３及びｐ６２について発現量を定量化した。なお、ＬＣ３はオートファジー活性化に従って発現量が増大し、ｐ６２はオートファジー活性化に従って発現量が低下する。
ＬＣ３発現量を図４－１（ｎ＝３，＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）に、ｐ６２発現量を図４－２（ｎ＝３，＊：ｐ＜０．０５）に、それぞれ示す。
図４－１及び図４－２に示すとおり、ＡｈＲアンタゴニストを投与した場合に、ＬＣ３発現量の低下及びｐ６２発現量の増大が確認できた。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５～６週齢）３匹を、ＡｈＲアンタゴニスト経口投与群と溶媒経口投与群の２群に分けた。
ＡｈＲアンタゴニスト経口投与群のマウスには、ＣＨ－２２３１９１（２－メチル－２Ｈ－ピラゾール－３－カルボン酸（２－メチル－４－ｏ－トリルアゾ－フェニル）－アミド）を、溶媒経口投与群のマウスには、同じ量のコーン油を、それぞれＤＮＣＢ連用開始１５日前からＤＮＣＢ連用１７日経過後まで給餌した。
各群のマウスについて、ＤＮＣＢ連用開始５日前に背中を剃毛し、ＤＮＣＢ連用開始４日前に耳と背中を１％ＤＮＣＢで１回処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。その処理の４日後から１７日間の間、１週間あたりに３回の頻度で０．２％ＤＮＣＢ処理（０．１ｍＬ／ｃｍ2）した。
また、各群のマウスについて、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１５日目及び１７日目に、ｍＢＤ－１４（ｈＢＤ－３のマウスオーソログ）処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。
その後、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１８日目にマウスを安楽死させ、病変部位の表皮を採取した。
ウサギ由来抗ＬＣ３抗体又はウサギ由来抗ｐ６２抗体を一次抗体として、ヤギ由来抗ラビットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ コンジュゲートＩｇＧ抗体を二次抗体としてそれぞれ使用して染色した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて免疫蛍光顕微鏡写真を取得し、オートファジー関連マーカーであるＬＣ３及びｐ６２について発現量を定量化した。なお、ＬＣ３はオートファジー活性化に従って発現量が増大し、ｐ６２はオートファジー活性化に従って発現量が低下する。
ＬＣ３発現量を図４－１（ｎ＝３，＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）に、ｐ６２発現量を図４－２（ｎ＝３，＊：ｐ＜０．０５）に、それぞれ示す。
図４－１及び図４－２に示すとおり、ＡｈＲアンタゴニストを投与した場合に、ＬＣ３発現量の低下及びｐ６２発現量の増大が確認できた。
【0024】
〔試験例５〕
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５～６週齢）４匹を、ＡｈＲアンタゴニスト非投与溶媒適用群（ＡＤ ｍｉｃｅ＋ｖｅｈｉｃｌｅ群）、ＡｈＲアンタゴニスト非投与ｍＢＤ－１４適用群（ＡＤ ｍｉｃｅ＋ｍＢＤ－１４群）、ＡｈＲアンタゴニスト＋溶媒適用群（ＡＤ ｍｉｃｅ＋ＣＨ＋ｖｅｈｉｃｌｅ群）、及びＡｈＲアンタゴニスト＋ｍＢＤ－１４適用群（ＡＤ ｍｉｃｅ＋ＣＨ＋ｍＢＤ－１４群）の４群に分けた。
ＡＤ ｍｉｃｅ＋ＣＨ＋ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ＣＨ＋ｍＢＤ－１４群のマウスには、ＣＨ－２２３１９１（２－メチル－２Ｈ－ピラゾール－３－カルボン酸（２－メチル－４－ｏ－トリルアゾ－フェニル）－アミド）を、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ｍＢＤ－１４群のマウスには、同じ量のコーン油を、それぞれＤＮＣＢ連用開始１５日前からＤＮＣＢ連用１７日経過後まで給餌した。
各群のマウスについて、ＤＮＣＢ連用開始５日前に背中を剃毛し、ＤＮＣＢ連用開始４日前に耳と背中を１％ＤＮＣＢで１回処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。その処理の４日後から１７日間の間、１週間あたりに３回の頻度で０．２％ＤＮＣＢ処理（０．１ｍＬ／ｃｍ2）した。
また、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ｍＢＤ－１４群、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ＣＨ＋ｍＢＤ－１４群のマウスについて、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１５日目及び１７日目に、ｍＢＤ－１４（ｈＢＤ－３のマウスオーソログ）処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。
一方、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ＣＨ＋ｖｅｈｉｃｌｅ群のマウスについては、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１５日目及び１７日目に、同じ量の食塩水で処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。
その後、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１９日目に、マウスの耳の厚さと経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した。
マウスの耳の厚さを図５－１（ｎ＝４，＊＊：ｐ＜０．０１，＃＃＃＃：ｐ＜０．０００１）に、ＴＥＷＬを図５－２（ｎ＝４，＊：ｐ＜０．０５，＃＃：ｐ＜０．０１）に、それぞれ示す。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５～６週齢）４匹を、ＡｈＲアンタゴニスト非投与溶媒適用群（ＡＤ ｍｉｃｅ＋ｖｅｈｉｃｌｅ群）、ＡｈＲアンタゴニスト非投与ｍＢＤ－１４適用群（ＡＤ ｍｉｃｅ＋ｍＢＤ－１４群）、ＡｈＲアンタゴニスト＋溶媒適用群（ＡＤ ｍｉｃｅ＋ＣＨ＋ｖｅｈｉｃｌｅ群）、及びＡｈＲアンタゴニスト＋ｍＢＤ－１４適用群（ＡＤ ｍｉｃｅ＋ＣＨ＋ｍＢＤ－１４群）の４群に分けた。
ＡＤ ｍｉｃｅ＋ＣＨ＋ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ＣＨ＋ｍＢＤ－１４群のマウスには、ＣＨ－２２３１９１（２－メチル－２Ｈ－ピラゾール－３－カルボン酸（２－メチル－４－ｏ－トリルアゾ－フェニル）－アミド）を、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ｍＢＤ－１４群のマウスには、同じ量のコーン油を、それぞれＤＮＣＢ連用開始１５日前からＤＮＣＢ連用１７日経過後まで給餌した。
各群のマウスについて、ＤＮＣＢ連用開始５日前に背中を剃毛し、ＤＮＣＢ連用開始４日前に耳と背中を１％ＤＮＣＢで１回処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。その処理の４日後から１７日間の間、１週間あたりに３回の頻度で０．２％ＤＮＣＢ処理（０．１ｍＬ／ｃｍ2）した。
また、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ｍＢＤ－１４群、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ＣＨ＋ｍＢＤ－１４群のマウスについて、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１５日目及び１７日目に、ｍＢＤ－１４（ｈＢＤ－３のマウスオーソログ）処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。
一方、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＡＤ ｍｉｃｅ＋ＣＨ＋ｖｅｈｉｃｌｅ群のマウスについては、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１５日目及び１７日目に、同じ量の食塩水で処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。
その後、０．２％ＤＮＣＢ処理開始から１９日目に、マウスの耳の厚さと経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した。
マウスの耳の厚さを図５－１（ｎ＝４，＊＊：ｐ＜０．０１，＃＃＃＃：ｐ＜０．０００１）に、ＴＥＷＬを図５－２（ｎ＝４，＊：ｐ＜０．０５，＃＃：ｐ＜０．０１）に、それぞれ示す。
【0025】
〔試験例６〕
健常者皮膚を健康なドナー５名から、病変皮膚をアトピー性皮膚炎患者５名から、それぞれ提供してもらった。各皮膚サンプルを液体窒素で急速凍結し、免疫蛍光分析のために－８０℃で保存した。
ラビット由来抗ＬＣ３抗体又はラビット由来抗ｐ６２抗体を一次抗体として、ゴート由来抗ラビットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ コンジュゲートＩｇＧ抗体を二次抗体としてそれぞれ使用して染色した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて免疫蛍光顕微鏡写真を取得し、オートファジー関連マーカーであるＬＣ３及びｐ６２について発現量を定量化した。なお、ＬＣ３はオートファジー活性化に従って発現量が増大し、ｐ６２はオートファジー活性化に従って発現量が低下する。
ＬＣ３発現量を図６－１（ｎ＝５，＊＊＊：ｐ＜０．００１）に、ｐ６２発現量を図６－２（ｎ＝５，＊：ｐ＜０．０５）に、それぞれ示す。
図６－１及び図６－２に示すとおり、アトピー性皮膚炎患者の病変皮膚サンプルには、ＬＣ３発現量の低下及びｐ６２発現量の増大が確認できた。
健常者皮膚を健康なドナー５名から、病変皮膚をアトピー性皮膚炎患者５名から、それぞれ提供してもらった。各皮膚サンプルを液体窒素で急速凍結し、免疫蛍光分析のために－８０℃で保存した。
ラビット由来抗ＬＣ３抗体又はラビット由来抗ｐ６２抗体を一次抗体として、ゴート由来抗ラビットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ コンジュゲートＩｇＧ抗体を二次抗体としてそれぞれ使用して染色した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて免疫蛍光顕微鏡写真を取得し、オートファジー関連マーカーであるＬＣ３及びｐ６２について発現量を定量化した。なお、ＬＣ３はオートファジー活性化に従って発現量が増大し、ｐ６２はオートファジー活性化に従って発現量が低下する。
ＬＣ３発現量を図６－１（ｎ＝５，＊＊＊：ｐ＜０．００１）に、ｐ６２発現量を図６－２（ｎ＝５，＊：ｐ＜０．０５）に、それぞれ示す。
図６－１及び図６－２に示すとおり、アトピー性皮膚炎患者の病変皮膚サンプルには、ＬＣ３発現量の低下及びｐ６２発現量の増大が確認できた。
【0026】
〔試験例７〕
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５～６週齢）３－５匹を、健常マウス群（Ｎｏｒｍａｌ ｍｉｃｅ）とアトピー性皮膚炎マウス群（ＡＤ ｍｉｃｅ）の２群に分けた。
アトピー性皮膚炎マウス群のマウスについては、ＤＮＣＢ連用開始５日前に背中を剃毛し、ＤＮＣＢ連用開始４日前に耳と背中を１％ＤＮＣＢで１回処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。その処理の４日後から１９日間の間、１週間あたりに３回の頻度（合計９回）で０．２％ＤＮＣＢ処理（０．１ｍＬ／ｃｍ2）することで、ＤＮＣＢ誘発性ＡＤモデルマウスとした。
アトピー性皮膚炎マウス群に０．２％ＤＮＣＢ処理を開始してから２０日目に、各群のマウスを安楽死させ、病変部位の表皮を採取した。
ラビット由来抗ＬＣ３抗体又はラビット由来抗ｐ６２抗体を一次抗体として、ヤギ由来抗ラビットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ コンジュゲートＩｇＧ抗体を二次抗体としてそれぞれ使用して染色した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて免疫蛍光顕微鏡写真を取得し、オートファジー関連マーカーであるＬＣ３及びｐ６２について発現量を定量化した。
ＬＣ３発現量、ｐ６２発現量を図７－１（ｎ＝３－５，＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１）に示す。
また、ＤＮＣＢ誘発性ＡＤモデルマウスを、ＭＣ９０３誘発性ＡＤモデルマウス、ダニ誘発性ＡＤモデルマウスに変更する以外は、上記と同様にしてＬＣ３及びｐ６２について発現量を定量化した。
ＭＣ９０３誘発性ＡＤモデルマウスを用いた結果を図７－２に、ダニ誘発性ＡＤモデルマウスを用いた結果を図７－３に、それぞれ示す。
図７－１～図７－３に示すとおり、アトピー性皮膚炎マウスの皮膚サンプルには、ＬＣ３発現量の低下及びｐ６２発現量の増大が確認できた。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５～６週齢）３－５匹を、健常マウス群（Ｎｏｒｍａｌ ｍｉｃｅ）とアトピー性皮膚炎マウス群（ＡＤ ｍｉｃｅ）の２群に分けた。
アトピー性皮膚炎マウス群のマウスについては、ＤＮＣＢ連用開始５日前に背中を剃毛し、ＤＮＣＢ連用開始４日前に耳と背中を１％ＤＮＣＢで１回処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。その処理の４日後から１９日間の間、１週間あたりに３回の頻度（合計９回）で０．２％ＤＮＣＢ処理（０．１ｍＬ／ｃｍ2）することで、ＤＮＣＢ誘発性ＡＤモデルマウスとした。
アトピー性皮膚炎マウス群に０．２％ＤＮＣＢ処理を開始してから２０日目に、各群のマウスを安楽死させ、病変部位の表皮を採取した。
ラビット由来抗ＬＣ３抗体又はラビット由来抗ｐ６２抗体を一次抗体として、ヤギ由来抗ラビットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ コンジュゲートＩｇＧ抗体を二次抗体としてそれぞれ使用して染色した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて免疫蛍光顕微鏡写真を取得し、オートファジー関連マーカーであるＬＣ３及びｐ６２について発現量を定量化した。
ＬＣ３発現量、ｐ６２発現量を図７－１（ｎ＝３－５，＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１）に示す。
また、ＤＮＣＢ誘発性ＡＤモデルマウスを、ＭＣ９０３誘発性ＡＤモデルマウス、ダニ誘発性ＡＤモデルマウスに変更する以外は、上記と同様にしてＬＣ３及びｐ６２について発現量を定量化した。
ＭＣ９０３誘発性ＡＤモデルマウスを用いた結果を図７－２に、ダニ誘発性ＡＤモデルマウスを用いた結果を図７－３に、それぞれ示す。
図７－１～図７－３に示すとおり、アトピー性皮膚炎マウスの皮膚サンプルには、ＬＣ３発現量の低下及びｐ６２発現量の増大が確認できた。
【0027】
〔試験例８〕
アデノウイルス発現ベクターキット（タカラバイオ製）を使用して、“Ｓｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ． ２００８；１９（１１）：４７６２－７５．）”の記載に準じアデノウイルスのＡｔｇ３変異体、Ａｔｇ３Ｃ２６４Ｓ変異体を調製した。
次に、１２ウェルのプレート１ウェルに培地（ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２）を０．８ｍＬ添加し、ケラチノサイトを５×１０4個播種した後、３－４日間培養（３７℃、９５％Ａｉｒ、５％ＣＯ2）した。ケラチノサイトにＡｔｇ３変異体又はＡｔｇ３Ｃ２６４Ｓ変異体を４８時間トランスフェクトした。また、Ａｔｇ３Ｃ２６４Ｓ変異体でトランスフェクトしたケラチノサイトについて、オートファジー欠損を確認した。
全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製し、定量リアルタイムＰＣＲを用いてクローディン－１（ＣＬＤＮ－１）、ＴＪＰ－１、フィラグリン（ＦＬＧ）及びロリクリン（ＬＯＲ）の遺伝子発現量を検出した。
結果を図８に示す（Ａｔｇ３：野生型表皮角化細胞、Ａｔｇ３Ｃ２６４Ｓ：オートファジー欠損表皮角化細胞、ｎ＝３，＊＊：ｐ＜０．０１）。
図８に示すとおり、オートファジー欠損表皮角化細胞では皮膚バリア機能の低下が確認できた。
アデノウイルス発現ベクターキット（タカラバイオ製）を使用して、“Ｓｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ． ２００８；１９（１１）：４７６２－７５．）”の記載に準じアデノウイルスのＡｔｇ３変異体、Ａｔｇ３Ｃ２６４Ｓ変異体を調製した。
次に、１２ウェルのプレート１ウェルに培地（ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２）を０．８ｍＬ添加し、ケラチノサイトを５×１０4個播種した後、３－４日間培養（３７℃、９５％Ａｉｒ、５％ＣＯ2）した。ケラチノサイトにＡｔｇ３変異体又はＡｔｇ３Ｃ２６４Ｓ変異体を４８時間トランスフェクトした。また、Ａｔｇ３Ｃ２６４Ｓ変異体でトランスフェクトしたケラチノサイトについて、オートファジー欠損を確認した。
全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製し、定量リアルタイムＰＣＲを用いてクローディン－１（ＣＬＤＮ－１）、ＴＪＰ－１、フィラグリン（ＦＬＧ）及びロリクリン（ＬＯＲ）の遺伝子発現量を検出した。
結果を図８に示す（Ａｔｇ３：野生型表皮角化細胞、Ａｔｇ３Ｃ２６４Ｓ：オートファジー欠損表皮角化細胞、ｎ＝３，＊＊：ｐ＜０．０１）。
図８に示すとおり、オートファジー欠損表皮角化細胞では皮膚バリア機能の低下が確認できた。
【0028】
〔試験例９〕
アデノウイルス発現ベクターキット（タカラバイオ製）を使用して、“Ｓｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ． ２００８；１９（１１）：４７６２－７５．）”の記載に準じアデノウイルスのＡｔｇ３変異体、Ａｔｇ３Ｃ２６４Ｓ変異体を調製した。
次に、１２ウェルのプレート１ウェルに培地（ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２）を０．８ｍＬ添加し、ケラチノサイトを５×１０4個播種した後、３－４日間培養（３７℃、９５％Ａｉｒ、５％ＣＯ2）した。ケラチノサイトにＡｔｇ３変異体又はＡｔｇ３Ｃ２６４Ｓ変異体を４８時間トランスフェクトした。また、Ａｔｇ３Ｃ２６４Ｓ変異体でトランスフェクトしたケラチノサイトについて、オートファジー欠損を確認した。
マウス由来抗クローディン－１（ＣＬＤＮ－１）抗体、マウス由来抗ＺＯ－１抗体を一次抗体として、ヤギ由来抗マウスＨＲＰ コンジュゲートＩｇＧ抗体を二次抗体としてそれぞれ使用してウエスタンブロッティング法で、ＣＬＤＮ－１発現量、ＺＯ－１発現量の評価を行った。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。
結果を図９に示す（Ａｔｇ３：野生型表皮角化細胞、Ａｔｇ３Ｃ２６４Ｓ：オートファジー欠損表皮角化細胞、ｎ＝３，＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１）。
アデノウイルス発現ベクターキット（タカラバイオ製）を使用して、“Ｓｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ． ２００８；１９（１１）：４７６２－７５．）”の記載に準じアデノウイルスのＡｔｇ３変異体、Ａｔｇ３Ｃ２６４Ｓ変異体を調製した。
次に、１２ウェルのプレート１ウェルに培地（ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２）を０．８ｍＬ添加し、ケラチノサイトを５×１０4個播種した後、３－４日間培養（３７℃、９５％Ａｉｒ、５％ＣＯ2）した。ケラチノサイトにＡｔｇ３変異体又はＡｔｇ３Ｃ２６４Ｓ変異体を４８時間トランスフェクトした。また、Ａｔｇ３Ｃ２６４Ｓ変異体でトランスフェクトしたケラチノサイトについて、オートファジー欠損を確認した。
マウス由来抗クローディン－１（ＣＬＤＮ－１）抗体、マウス由来抗ＺＯ－１抗体を一次抗体として、ヤギ由来抗マウスＨＲＰ コンジュゲートＩｇＧ抗体を二次抗体としてそれぞれ使用してウエスタンブロッティング法で、ＣＬＤＮ－１発現量、ＺＯ－１発現量の評価を行った。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。
結果を図９に示す（Ａｔｇ３：野生型表皮角化細胞、Ａｔｇ３Ｃ２６４Ｓ：オートファジー欠損表皮角化細胞、ｎ＝３，＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１）。
【0029】
〔試験例１０〕
Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/fマウス、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/fマウスを試験例３と同様にして作製した。
Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/fマウス、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/fマウスそれぞれについて、ＤＮＣＢ処理群（Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/f ＡＤ ｍｉｃｅ、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/f ＡＤ ｍｉｃｅ）、ＤＮＣＢ非処理群（Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/f ｍｉｃｅ、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/f ｍｉｃｅ）に分けた。
ＤＮＣＢ処理群について、２，４－ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）連用開始５日前に背中を剃毛し、ＤＮＣＢ連用開始４日前に耳と背中を１％ＤＮＣＢで１回処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。その処理の４日後から１７日間の間、１週間あたりに３回の頻度（合計９回）で０．２％ＤＮＣＢ処理（０．１ｍＬ／ｃｍ2）した。
ＤＮＣＢ処理群に０．２％ＤＮＣＢ処理を開始してから１８日目に、各群のマウスについて、ＡＤスコア、マウスの耳の厚さ、及び経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した。
結果を図１０に示す（ｎ＝８－１２，＊＊：ｐ＜０．０１，＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。
図１０に示す結果から、オートファジー欠損した場合にアトピー性皮膚炎が悪化しやすくなることが確認できた。
Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/fマウス、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/fマウスを試験例３と同様にして作製した。
Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/fマウス、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/fマウスそれぞれについて、ＤＮＣＢ処理群（Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/f ＡＤ ｍｉｃｅ、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/f ＡＤ ｍｉｃｅ）、ＤＮＣＢ非処理群（Ｋ１４+/+Ａｔｇ７f/f ｍｉｃｅ、Ｋ１４CRE/+Ａｔｇ７f/f ｍｉｃｅ）に分けた。
ＤＮＣＢ処理群について、２，４－ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）連用開始５日前に背中を剃毛し、ＤＮＣＢ連用開始４日前に耳と背中を１％ＤＮＣＢで１回処理した（０．１ｍＬ／ｃｍ2）。その処理の４日後から１７日間の間、１週間あたりに３回の頻度（合計９回）で０．２％ＤＮＣＢ処理（０．１ｍＬ／ｃｍ2）した。
ＤＮＣＢ処理群に０．２％ＤＮＣＢ処理を開始してから１８日目に、各群のマウスについて、ＡＤスコア、マウスの耳の厚さ、及び経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した。
結果を図１０に示す（ｎ＝８－１２，＊＊：ｐ＜０．０１，＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。
図１０に示す結果から、オートファジー欠損した場合にアトピー性皮膚炎が悪化しやすくなることが確認できた。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8】
【図9】
【図10】
