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特開2023-72623過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物
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  • 特開-過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物 図1A
  • 特開-過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物 図1B
  • 特開-過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物 図2A
  • 特開-過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物 図2B
  • 特開-過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物 図3
  • 特開-過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物 図4
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023072623
(43)【公開日】2023-05-24
(54)【発明の名称】過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物
(51)【国際特許分類】
   A61K 35/747 20150101AFI20230517BHJP
   A61K 35/744 20150101ALI20230517BHJP
   A61K 9/14 20060101ALI20230517BHJP
   A61K 9/20 20060101ALI20230517BHJP
   A61K 9/16 20060101ALI20230517BHJP
   A61K 9/02 20060101ALI20230517BHJP
   A61K 9/50 20060101ALI20230517BHJP
   A61K 9/08 20060101ALI20230517BHJP
   A61K 9/12 20060101ALI20230517BHJP
   A61P 13/10 20060101ALI20230517BHJP
   A23L 33/135 20160101ALI20230517BHJP
【FI】
A61K35/747
A61K35/744
A61K9/14
A61K9/20
A61K9/16
A61K9/02
A61K9/50
A61K9/08
A61K9/12
A61P13/10
A23L33/135
【審査請求】有
【請求項の数】9
【出願形態】OL
(21)【出願番号】P 2021202523
(22)【出願日】2021-12-14
(31)【優先権主張番号】110142294
(32)【優先日】2021-11-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW
(71)【出願人】
【識別番号】519298765
【氏名又は名称】葡萄王生技股▲フン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】陳 勁初
(72)【発明者】
【氏名】陳 炎▲錬▼
(72)【発明者】
【氏名】林 詩偉
(72)【発明者】
【氏名】蔡 侑珊
(72)【発明者】
【氏名】王 ▲啓▼憲
(72)【発明者】
【氏名】侯 毓欣
(72)【発明者】
【氏名】石 仰慈
(72)【発明者】
【氏名】林 ▲静▼▲ウェン▼
(72)【発明者】
【氏名】陳 雅君
(72)【発明者】
【氏名】江 佳琳
(72)【発明者】
【氏名】▲呉▼ 姿和
(72)【発明者】
【氏名】陳 ▲彦▼博
【テーマコード(参考)】
4B018
4C076
4C087
【Fターム(参考)】
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE03
4B018LE05
4B018MD86
4B018ME14
4C076AA01
4C076AA11
4C076AA24
4C076AA29
4C076AA31
4C076AA36
4C076AA61
4C076BB01
4C076CC17
4C076CC40
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC55
4C087BC56
4C087CA09
4C087MA13
4C087MA16
4C087MA31
4C087MA35
4C087MA38
4C087MA41
4C087MA43
4C087MA52
4C087NA14
4C087ZA81
(57)【要約】
【課題】過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物に関する。
【解決手段】この複合プロバイオティクス組成物は、ラクトバチルスブレビス菌株GKJOY、ラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3、ラクトバチルスプランタルム菌株GKK1及びペディオコッカスラクティス菌株GKA4を含み、連続して被験者に一定期間投与され、効果的に排尿頻度を遅らせ、膀胱圧力を低下させて膀胱容量を増加させて、更に有効成分として様々な組成物の調製に用いられる。
【選択図】図4
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)菌株GKJOY、ラクトバチルスファーメンタム(L.fermentum)菌株GKF3、ラクトバチルスプランタルム(L.plantarum)菌株GKK1及びペディオコッカスラクティス(Pediococcus acidilactici)菌株GKA4を含み、前記ラクトバチルスブレビス菌株GKJOYは、2020年11月6日に日本独立行政法人製品評価技術基盤機構(National Institute of Technology and Evaluation;NITE)の特許微生物寄託センター(National Patent Microorganisms Depositary、アドレス:292-0818日本千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に寄託され、受託番号がNITE BP-0331であり、前記ラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3は、2018年1月12日に中国北京市朝陽区北辰西路1号院3号の中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託され、受託番号がCGMCC 15203であり、前記ラクトバチルスプランタルム菌株GKK1は、2019年7月18日に財団法人食品産業発展研究所生物資源保存研究センター(BCRC、台湾新竹食品路331号)に寄託され、受託番号がBCRC 910919であり、且つ前記ペディオコッカスラクティス菌株GKA4は、2020年11月6日にNITEに寄託され、受託番号がNITE BP-03311である過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項2】
前記複合プロバイオティクス組成物は、経口組成物である請求項1に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項3】
前記複合プロバイオティクス組成物は、医薬組成物又は食品組成物である請求項2に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項4】
医薬及び食品に許容される担体、賦形剤及び/又は添加剤を更に含む請求項2に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項5】
前記複合プロバイオティクス組成物の剤形は、粉剤、錠剤、顆粒剤、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレー又は座剤を含む請求項1に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項6】
前記過活動膀胱関連症状には、排尿頻度の増加、膀胱圧力の増加、及び/又は膀胱容量の減少が含まれる請求項1に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項7】
有効投与量の複合プロバイオティクスを含有する経口組成物を含み、前記経口組成物が連続して被験者に少なくとも30日間投与され、且つ前記複合プロバイオティクスは、受託番号がNITE BP-0331であるラクトバチルスブレビス菌株GKJOY、受託番号がCGMCC 15203であるラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3、受託番号がBCRC 910919であるラクトバチルスプランタルム菌株GKK1及び受託番号がBCRC 910876であるペディオコッカスラクティス菌株GKA4を含む過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項8】
前記過活動膀胱関連症状には、排尿頻度の増加、膀胱圧力の増加、及び/又は膀胱容量の減少が含まれる請求項7に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項9】
前記被験者は、成人であり、且つ前記複合プロバイオティクスの前記被験者に対する前記有効投与量は、150mg/60kg体重/日間~600mg/60kg体重/日間である請求項7に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項10】
前記被験者は、ラットであり、且つ前記複合プロバイオティクスの前記被験者に対する前記有効投与量は、5mg/kg体重/日間~20mg/kg体重/日間である請求項7に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プロバイオティクス組成物に関し、特に排尿頻度を遅らせ、膀胱圧力を低下させて膀胱容量を増加させること等ができる過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
過活動膀胱(overactive bladder syndrome;OAB)とは、膀胱尿貯蔵過程において、突然自律的ではない収縮が発生して緊急にすぐに排尿する必要があり、且つ患者は一般的にトイレまで間に合わず尿漏れが発生するという現象を指す。一般的な顕著症状には、尿意切迫感、排尿頻度の増加(頻尿とも呼ばれる)、夜間頻尿、切迫性尿失禁等がある。国際尿失禁協会(International Continence Society;ICS)によると、頻尿とは、1日に8回以上排尿し、夜尿の排尿が1回を超えることを指す。夜間頻尿とは、深夜で尿急感により睡眠を中断して起き上がって排尿することを指す。尿意切迫感とは、急に起こる強い尿意を指す。尿失禁とは、尿が不随意に排出し、つまりトイレまで間に合わず尿漏れが発生することを指す。
【0003】
過活動膀胱は、性交の低下、旅行、運動、仕事の不能、罪悪感又は自尊心の低下等、生活の質に深刻な影響を与える可能性があり、また、体、心、魂に悪影響を及ぼす。一般的に、加齢とともに過活動膀胱の発作率が高くなり、加齢による膀胱弾性の低下(排尿筋弛緩)、膀胱容量の低下、エストロゲンの喪失による骨盤底筋の衰弱、前立腺肥大による尿抵抗、神経障害等に関連がある。台湾の統計によると、20歳以上の成人人口の約18%がこれらの問題を抱えているが、中国社会の高齢者が尿路関連疾患の治療を求めるのにより保守的であることを考えると、実際の過活動膀胱の患者の割合はもっと高いはずである。
【0004】
過活動膀胱に対する治療は、行動療法と薬物療法に分けることができる。行動療法には、過活動膀胱を引き起こす総合的な原因を回避するために、身体的健康の改善(他の合併症の改善)、食習慣の制御、水分摂取の制御、定期的な排尿、膀胱訓練、骨盤底運動、体重減少、禁煙等が含まれる。軽度でない患者に対して、薬物療法を採用して治療する。一般的な薬には、ムスカリン拮抗薬(muscarinic antagonist)、抗コリン作用薬(anticholinergics)、カルシウム拮抗薬(calcium antagonists)、筋弛緩薬(muscle relaxant)等がある。それらのほとんどは、神経系の伝達の一部をブロックすることによって調節の効果を達成する。しかしながら、これらの治療薬は、必然的に口渇、便秘、めまい、かすみ目、認知機能障害等の副作用があり、長期間使用するのが難しく、すべての人に適しているわけではない。
プロバイオティクスの多くの機能が徐々に発見され報告されており、菌株によっては機能や特徴も異なる。研究によると、肥満マウスモデルではラクトバチルスプランタルム(Lactobacillus plantarum)は、マウスの体重と血中脂質等の代謝指標を減らすことに役立ち(Hus et al.,2019)、喘息動物の病気モデルではアレルギーの改善し、免疫力の改善という効果を有する(Shih et al.,2019)。研究によると、ラクトバチルスプランタルム(L.plantarum)は、サルコペニアのマウスモデルでは筋肉喪失を遅らせる機能を持っていることも発見した(Li et al.,2020)。研究によると、また、ラクトバチルスパラカゼイ(Lactobacillus paracasei)は、老化マウスの老化指標を遅らせることができ、老化防止効果を持つことを更に発見した(Lin et al.,2021)。近年、多くの学者は更に脳腸軸を関連付けて、神経調節のためのプロバイオティクスのメカニズムを説明している。例えば、ラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)又はラクトバチルスファーメンタム(Lactobacillus fermentum)を与えると、禁錮によるうつ病性障害のマウスの異常な行動を改善できることが研究で指摘されている。(Chen et al.,2021;Lin et al.,2021)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Hus et al.,2019
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、過活動膀胱に対するプロバイオティクスの研究はほとんどなく、過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物及びその用途を開発することは至急に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
従って、本発明の一態様は、ラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)菌株GKJOY、ラクトバチルスファーメンタム(L.fermentum)菌株GKF3、ラクトバチルスプランタルム(L.plantarum)菌株GKK1及びペディオコッカスラクティス(Pediococcus acidilactici)菌株GKA4を含む過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物を提供する。
【0008】
そして、本発明の別の態様は、過活動膀胱関連症状を緩和する用途として複合プロバイオティクスを提供し、上記菌株を含む有効投与量の複合プロバイオティクスを含有する経口組成物を連続して被験者に一定期間投与することを含む。
【0009】
本発明の上記態様によれば、過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物を提出する。一実施例において、この過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物は、ラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)菌株GKJOY、ラクトバチルスファーメンタム(L.fermentum)菌株GKF3、ラクトバチルスプランタルム(L.plantarum)菌株GKK1及びペディオコッカスラクティス(Pediococcus acidilactici)菌株GKA4を含み、ラクトバチルスブレビス菌株GKJOYは、2020年11月6日に日本独立行政法人製品評価技術基盤機構(National Institute of Technology and Evaluation;NITE)の特許微生物寄託センター(National Patent Microorganisms Depositary、アドレス:292-0818日本千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に寄託され、受託番号がNITE BP-0331であり、ラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3は、2018年1月12日に中国北京市朝陽区北辰西路1号院3号の中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託され、受託番号がCGMCC 15203であり、ラクトバチルスプランタルム菌株GKK1は、2019年7月18日に財団法人食品産業発展研究所生物資源保存研究センター(BCRC、台湾新竹食品路331号)に寄託され、受託番号がBCRC 910919であり、且つペディオコッカスラクティス菌株GKA4は、2020年11月6日にNITEに寄託され、受託番号がNITE BP-03311である。
【0010】
上記実施例において、前記複合プロバイオティクス組成物は、例えば、医薬組成物又は食品組成物等の経口組成物であってよい。上記例示において、前記複合プロバイオティクス組成物は、医薬及び食品に許容される担体、賦形剤及び/又は添加剤を更に含む。
【0011】
上記実施例において、前記複合プロバイオティクス組成物の剤形は、例えば、粉剤、錠剤、顆粒剤、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレー又は座剤を含んでよい。
【0012】
上記実施例において、前記過活動膀胱関連症状には、排尿頻度の増加、膀胱圧力の増加、及び/又は膀胱容量の減少が含まれる。
【0013】
本発明の別の態様によれば、有効投与量の複合プロバイオティクスを含有する経口組成物を含み、この経口組成物が連続して被験者に少なくとも30日間投与され、且つこの複合プロバイオティクスは、受託番号がNITE BP-0331であるラクトバチルスブレビス菌株GKJOY、受託番号がCGMCC 15203であるラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3、受託番号がBCRC 910919であるラクトバチルスプランタルム菌株GKK1及び受託番号がBCRC 910876であるペディオコッカスラクティス菌株GKA4を含む過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物を提出する。
【0014】
上記実施例において、前記被験者は、例えば、成人であってよく、且つ前記複合プロバイオティクスのこの被験者に対する有効投与量は、例えば、150mg/60kg体重/日間~600mg/60kg体重/日間であってよい。
【0015】
上記実施例において、前記被験者は、例えば、ラットであってよく、且つ前記複合プロバイオティクスのこの被験者に対する有効投与量は、例えば、5mg/kg体重/日間~20mg/kg体重/日間であってよい。
【発明の効果】
【0016】
本発明の、ラクトバチルスブレビス菌株GKJOY、ラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3、ラクトバチルスプランタルム菌株GKK1及びペディオコッカスラクティス菌株GKA4を含む、上記の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物及びその用途を適用すれば、連続して被験者に一定期間投与して、効果的に排尿頻度を遅らせ、膀胱圧力を低下させて膀胱容量を増加させて、更に有効成分として様々な組成物の調製に用いられることができる。
【0017】
理解すべきなのは、前記の一般的な説明及び以下の詳細な説明は単なる例であり、クレームされた発明のさらなる説明を提供することを意図している。
本発明の上記及び他の目的、特徴、メリット及び実施例をより分かりやすくするために、添付図面の説明は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【0018】
図1A】それぞれ本発明の一実施例による生理食塩水の投与前後の対照群(図1A)及び実験組(図1B)の動物の膀胱圧力を示す曲線図であり、図番▲は生理食塩水の投与時点を示す。
図1B】それぞれ本発明の一実施例による生理食塩水の投与前後の対照群(図1A)及び実験組(図1B)の動物の膀胱圧力を示す曲線図であり、図番▲は生理食塩水の投与時点を示す。
図2A】それぞれ本発明の別の実施例による生理食塩水の投与後且つ安定化時間を経た後の対照群(図2A)及び実験組(図2B)の動物の膀胱圧力を示す曲線図であり、図番▲は生理食塩水の投与時点を示す。
図2B】それぞれ本発明の別の実施例による生理食塩水の投与後且つ安定化時間を経た後の対照群(図2A)及び実験組(図2B)の動物の膀胱圧力を示す曲線図であり、図番▲は生理食塩水の投与時点を示す。
図3】本発明の一実施例による対照群及び実験組の動物の膀胱容量を示すバーグラフである。
図4】本発明の一実施例による対照群及び実験組の動物の排尿頻度を示すバーグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0019】
引用文献による用語に対する定義又は使用法がここでの当該用語に対する定義と矛盾するか又は反対である場合、引用文献による用語に対する定義の代わりに、ここでの用語に対する定義は適用される。次に、上下文で別に明確に指示されない限り、単数形の用語には複数形の用語が含まれてよく、複数形の用語には単数形の用語も含まれてよい。
【0020】
上記のように、本発明は、連続して被験者に一定期間投与された後で、効果的に排尿頻度を遅らせ、膀胱圧力を低下させて膀胱容量を増加させることができる過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物を提供する。
【0021】
一実施例において、ここに呼ばれる「複合プロバイオティクス」とは、異なる種又は異なる属を含むプロバイオティクスを指してもよく、例えば、ラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)菌株GKJOY、ラクトバチルスファーメンタム(L.fermentum)菌株GKF3、ラクトバチルスプランタルム(L.plantarum)菌株GKK1及びペディオコッカスラクティス(Pediococcus acidilactici)菌株GKA4を含む。ラクトバチルスブレビス菌株GKJOYは、2019年7月18日に財団法人食品産業発展研究所生物資源保存研究センター(BCRC、台湾新竹食品路331号)に寄託され、受託番号がBCRC 910920であり、2019年7月26日に前記菌株の生存は確認された。ラクトバチルスブレビス菌株GKJOYは、別に日本独立行政法人製品評価技術基盤機構(National Institute of Technology and Evaluation;NITE)の特許微生物寄託センター(National Patent Microorganisms Depositary、アドレス:292-0818日本千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に寄託され、寄託日が2020年11月6日であり、且つ受託番号がNITE BP-03316であり、2020年11月11日に前記菌株の生存は確認された。ラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3は、2018年2月12日にBCRCに寄託され、受託番号がBCRC 910824であり、2018年3月1日に前記菌株の生存は確認された。ラクトバチルスファーメンタムGKF3は、別に中国北京市朝陽区北辰西路1号院3号の中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託され、寄託日が2018年1月12日であり、受託番号がCGMCC 15203である。ラクトバチルスプランタルム菌株GKK1は、2019年7月18日にBCRCに寄託され、受託番号がBCRC 910919であり、2019年7月26日に前記菌株の生存は確認された。ペディオコッカスラクティス菌株GKA4は、2020年11月6日にNITEに寄託され、受託番号がNITE BP-03311であり、2020年11月11日に前記菌株の生存は確認された。注意すべきなのは、本発明は、特定の菌株の複合プロバイオティクスを選択する必要があり、これだけで、得られた複合プロバイオティクス組成物が過活動膀胱関連症状を緩和する等の効果を発揮することができる。複合プロバイオティクスは、上記特定の菌株から選択されない場合、菌株を増減する場合、或いはそれらの一部又はすべてを同種の他の菌株に置き換える場合、過活動膀胱の症状を緩和する効果は期待できない。
【0022】
ここに呼ばれる「過活動膀胱関連症状」とは、過活動膀胱の主な症状及びそれに起因する症状を指す。主な症状は、例えば、尿液急迫感であり、関連症状は排尿頻度の増加、膀胱圧力の増加及び/又は膀胱容量の減少を含んでよいが、これらに限定されない。
【0023】
一実施例において、上記複合プロバイオティクス各菌株の含有量は、特に制限されない。一例において、ラクトバチルスブレビス菌株GKJOY(BCRC 910920)、ラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3(BCRC 910824)、ラクトバチルスプランタルム菌株GKK1(BCRC 910919)及びペディオコッカスラクティス菌株GKA4(NITE BP-03311)の重量(mg)比又は細菌数(CFU)比は、例えば、1:1:1:1であってよいが、他の例において、上記4種の菌株は、1:1:1:1以外の割合を採用してよい。
【0024】
適用時、複合プロバイオティクス組成物は、例えば、医薬組成物又は食品組成物のような経口組成物である。前記複合プロバイオティクスの使用態様は、発酵液全体、菌泥、上澄み液及び凍結乾燥粉末を含んでよいが、これらに限定されない。上記実施例において、前記発酵液全体は、菌体と培養液を含む生成物を指す。前記菌泥は、発酵液全体から上澄み液を取り除いた後の生成物を指す。前記上澄み液は、発酵液全体から菌泥を取り除いた後の生成物を指す。前記凍結乾燥粉末は、発酵液全体、菌泥及び/又は上澄み液で製造される凍結乾燥粉末を指す。
【0025】
前記医薬組成物に適用される例は、医薬品を含んでよいが、これに限定されない。複合プロバイオティクスが食品組成物に適用される例は、一般食品、保健食品、飲料、栄養補助食品、乳製品又は飼料等を含んでよいが、これらに限定されない。前記経口組成物の例において、複合プロバイオティクス組成物は、医薬及び食品に許容される担体、賦形剤及び/又は添加剤を更に選択的に含んでよい。他の例において、複合プロバイオティクス組成物の剤形は、粉剤、錠剤、顆粒剤、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレー又は座剤を含んでよいが、これらに限定されない。
【0026】
過活動膀胱関連症状を緩和する用途として上記複合プロバイオティクスを使用する場合、有効投与量の複合プロバイオティクスを含有する経口組成物を連続して被験者に一定期間投与することができる。前記有効投与量は、被験者によっては異なり、特に制限されない。例として、被験者が成人であり場合、複合プロバイオティクスの成人への有効投与量は、例えば、150mg/60kg体重/日間~600mg/60kg体重/日間であるが、225mg/60kg体重/日間~450mg/60kg体重/日間であることが好ましく、また、約300mg/60kg体重/日間であることがより好ましい。別の例において、被験者がラットである場合、複合プロバイオティクスのこの被験者への有効投与量は、例えば、5mg/kg体重/日間~20mg/kg体重/日間であるが、7.5mg/kg体重/日間~15mg/kg体重/日間であることが好ましく、また、約10mg/kg体重/日間であることがより好ましい。他の例において、前記投与期間は、例えば、連続の少なくとも30日間であってよい。
【0027】
理解すべきなのは、下記特定の菌株、特定の配合、特定の使用投与量、特定の検出方式、観点、例示及び実施例は、単に例を挙げて説明するものであり、本発明の制限条件ではない。本発明の精神と範囲から逸脱しない限り、本願に必要な技術的特性を簡単に判断ことができ、本発明に対して多様の変更や修飾を加えることができて、異なる用途及び条件に適用される。
実施例 1
1.1菌種源
【0028】
この実施例に使用される菌種は、特定の組合せのプロバイオティクスを含み、中にラクトバチルス属(Lactobacillus spp.)のラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)菌株 GKJOY、ラクトバチルスファーメンタム(Lactobacillus fermentum)菌株 GKF3、ラクトバチルスプランタルム(Lactobacillus plantarum)菌株 GKK1、及びペディオコッカス属(Pediococcus spp.)のペディオコッカスラクティス(Pediococcus acidilactici)菌株 GKA4がある。ラクトバチルスブレビス菌株GKJOYは、2019年7月18日に財団法人食品産業発展研究所生物資源保存研究センター(BCRC、台湾新竹食品路331号)に寄託され、受託番号がBCRC 910920であり、2019年7月26日に前記菌株の生存は確認された。ラクトバチルスブレビス菌株GKJOYは、別に日本独立行政法人製品評価技術基盤機構(National Institute of Technology and Evaluation;NITE)の特許微生物寄託センター(National Patent Microorganisms Depositary、アドレス:292-0818日本千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に寄託され、寄託日が2020年11月6日であり、且つ受託番号がNITE BP-03316であり、2020年11月11日に前記菌株の生存は確認された。ラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3は、2018年2月12日にBCRCに寄託され、受託番号がBCRC 910824であり、2018年3月1日に前記菌株の生存は確認された。ラクトバチルスファーメンタムGKF3は、別に中国北京市朝陽区北辰西路1号院3号の中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託され、寄託日が2018年1月12日であり、受託番号がCGMCC 15203である。ラクトバチルスプランタルム菌株GKK1は、2019年7月18日にBCRCに寄託され、受託番号がBCRC 910919であり、2019年7月26日に前記菌株の生存は確認された。ペディオコッカスラクティス菌株GKA4は、2020年11月6日にNITEに寄託され、受託番号がNITE BP-03311であり、2020年11月11日に前記菌株の生存は確認された。
【0029】
上記菌種は、何れも異なる地域の漬物からのものである。例として、菌株GKJOYは、桃園地域のザワークラウトから分離された。菌株GKF3は、新竹地域の台湾のキムチから分離された。菌株GKK1及び菌株GKA4は、花蓮地域のサワーペッパーから分離された。
【0030】
いくつかの例において、上記菌株GKFは、台湾新竹の北埔で市販された伝統的な漬け発酵キムチから採取されてよい。30日以上自然発酵させた様々な果物や野菜のキムチ製品からサンプリングし、収集し包装した後でラベルを付け、冷蔵庫に低温で保管し、同日に実験室に輸送して菌株を分離させた。それから、検体バッグ内のろ液又は野菜や果物の葉を無菌的に抽出して、検体の10倍の体積に相当する滅菌水で均質化処理を行った。1mLの希釈液を取り0.1%ブロモクレゾールグリーン(bromocresol green)を含むMRS培地に入れ、37°Cで16時間の増菌培養を行って、検体内に含まれる乳酸桿菌の数を増加させ、スクリーニングサンプルにおける数が少ない乳酸菌菌株が分離される確率を強化した。次に、増菌培養後のサンプルを取り、配列希釈操作を行った。十万倍及び百万倍に希釈した配列希釈操作の後、それぞれ0.1mLを取り無菌シャーレに入れ、シャーレにそれぞれRogosa培地寒天、BIM-25寒天、馬鈴薯澱粉+酵母エキス寒天、ブロモクレゾールグリーンMRS寒天及びブロモクレゾールパープル寒天を入れた。37°Cで40時間嫌気培養を行った後で、各種の培地から15~20個の菌株の単一のコロニーをそれぞれ選択した。分離後の単一の菌株培養をMRS培養液において特定の温度で16時間培養した後で50%菌種凍結保存液(グリセリン)を加えた。
【0031】
上記乳酸桿菌又はペディオコッカスは、それぞれ固体培地に接種されて菌種を活性化した。好ましい実施形態において、前記固体培地はMRS寒天である。コロニー(colony)が生成した後、単一のコロニー(single colony)を取り液体培地に入れて液体培養を行った。好ましい実施形態において、菌株の培養温度が25°C~40°Cであり、例えば通気量が0~1vvmの窒素又は二酸化炭素、振とう速度が250rpm~1000rpmの条件で液体培養16~24時間を行ったが、好ましく18時間行って、生菌数が最高点に達した。液体培地はMRS(deMan、Rogosa、and Sharpe)液体培地である。液体培養が完成した後、発酵培養を行い、発酵培地の配合は、表1に示された。
【0032】
【表1】
1.2凍結乾燥粉末の調製
【0033】
上記乳酸桿菌又はペディオコッカスは、それぞれ発酵培養により生長が終わった後、菌体と培養液を含む発酵液全体を収集し1000rpm~15000rpmの速度で遠心分離を行って菌体ペレット(cell pellet)が得られた。得られた菌体ペレットと保護剤(即ち、6重量%~50重量%の脱脂粉乳)を混合した後で凍結乾燥を行った。前記凍結乾燥は、勾配設定モードで事前凍結を行って、順次に20°C~0°Cで1~4時間保存して、次に0°C~-20°Cで4~8時間保存してから、-196°C~-30°Cで8時間を超えるように保存した。好ましい実施形態において、凍結乾燥の温度と時間は、-40°Cで2時間保存して、次に-20°Cで2時間保存して、更に0°Cで2時間保存して、最後20°Cで約10時間以上保存した。それから、上記得られた凍結乾燥粉末を低温で保存した。別の好ましい実施形態において、低温保存の温度は-30°C~4°Cである。保存される凍結乾燥粉末は、以下の動物実験において実験動物に投与される複合プロバイオティクス組成物の原料として使用された。
1.3実験動物
【0034】
以下の実施例では、BioLASCO(LASCOバイオテクノロジー会社)から購入したそれぞれ重量が約300グラムである0週齢のWistar雄ラットを選択した。ラットは、ケージあたり2~3匹となるように開放式ケージに収容される。ラット室について、平均温度が約22±2℃であり、平均湿度が35±5%であり、通常の12時間の昼光と12時間の暗闇にし、十分な飲料水と標準飼料を供給した。すべての動物実験手順は、財団法人農業科学技術研究院実験動物介護及び使用委員会(IACUC)によってレビューされ承認され、承認番号実動字第109099号が取得された。試験動物は環境に適応して1週間後、対照群と実験群にランダムに分けられ、各群に7匹いた。
1.4実験設計
【0035】
実験動物を素手で保持した後、0.9%生理食塩水(対照群)又は複合プロバイオティクス組成物(実験群)を30日間連続して毎日経口投与した。実験組の実験動物に投与された投与量が10mg/kg体重(B.W.)である複合プロバイオティクス組成物は、体重60kgの成人が1日あたり300mg経口投与した量に相当する。一カ月連続して投与された後、実験動物を3~4%のイソフルラン(isoflurane)で麻酔させた。実験動物の下腹部に小さな切り欠きを切り、膀胱を露出させ眼科用ハサミで膀胱の上端に小さな開口を切った。PE50カテーテル(BB31695-PE/3)を膀胱の上部開口に挿入し、外科用タイワイヤー(SW SERALON)でその開口とPEカテーテルとを結び付け、MP150モニタシステム(MP150 Systems,Biopac)の圧力値が安定になった後、注入ポンプ(Syringe Pump,KD Scientific(登録商標)Syringe Pump,KDS230)により0.04 ml/minの速度でPE50カテーテルに沿って生理食塩水を膀胱内に注入し、膀胱圧力(bladder pressure)、膀胱容量(bladder capacity)、排尿頻度(urination frequency)、及び排尿遅延指数(urination delay index)を検出した。
1.5 データ統計
【0036】
本文に記載の数値は、平均値±標準偏差値(mean±SD)で示され、一元配置分散分析(One-way ANOVA)及び市販ソフトウェアで分析されて、p<0.05で判断すると、統計的に有意な差異性を有することを示す。
実施例2
2.1膀胱圧力の検出
【0037】
この実施例は、MP150検出システムにより、実験動物の生理食塩水を注入していない膀胱の圧力値、生理食塩水を注入した後の膀胱の圧力値、及び生理食塩水を注入した後且つ安定化時間を経た後の膀胱の圧力値を含む膀胱容積圧力(cystomertrogram)を検出した。膀胱圧力は、水銀柱ミリメートル(mmHg)で示された。前記の安定化時間は、膀胱圧力が安定するまでの時間を指し、対照群の実験動物の安定化時間は3分間であるが、実験組の実験動物の安定化時間は1分間である。
【0038】
図1A及び図1Bを参照されたく、それぞれ本発明の一実施例による生理食塩水の投与前後の対照群(図1A)及び実験組(図1B)の動物の膀胱圧力を示す曲線図であり、図番▲は生理食塩水を注射する時点を示す。
【0039】
図1Aの結果からわかるように、対照群の実験動物に生理食塩水が投与される前に、その膀胱の圧力値は比較的に低く(<5mmHg)、生理食塩水が投与された後、その圧力値は即座に上昇し、且つ圧力値の乱れが約3分間続き、検出された最大の膀胱の圧力値は20mmHgを超え、約3分間後徐々に安定になり、膀胱の圧力値は10mmHg以下になった。
【0040】
図1Bの結果からわかるように、実験組の実験動物は、生理食塩水が投与される前に、その膀胱の圧力値(7.5mmHg)が対照群よりも高いが、標準範囲内にあった。生理食塩水が投与された後、その圧力値は徐々に最大17mmHgまで上昇し、対照群よりも有意に低く、且つ1分間内に安定になった(約8mmHg)。
【0041】
図2A及び図2Bを参照されたく、それぞれ本発明の別の実施例による生理食塩水の投与後且つ安定化時間を経た後の対照群(図2A)及び実験組(図2B)の動物の膀胱圧力を示す曲線図であり、図番▲は生理食塩水を注射する時点を示す。
【0042】
図2Aの結果からわかるように、対照群の実験動物は連続して生理食塩水が投与された後、その膀胱の圧力値が約9mmHgであり、圧力が依然として安定であるが、その圧力曲線の帯域が乱れている。
【0043】
図2Bの結果からわかるように、実験組の実験動物は連続して生理食塩水が投与された後、その膀胱の圧力値も約9mmHgであるが、その圧力曲線の帯域が安定的且つ規則的である。
【0044】
上記の結果によれば、試験動物に複合プロバイオティクス組成物を連続して一定期間投与した後、生理食塩水を与えて、膀胱の圧力値が影響を受けにくく、膀胱の圧力値による排尿の行動を緩和することができることを示している。
2.2膀胱容量の検出
【0045】
この実施例は、毎匹の実験動物の第1回の排尿時間を記録し、0.04mL/分間の流速で計算した後、その膀胱容量が得られた。膀胱容量は、ミリリットル(mL)で示され、その結果が図3に示された。
【0046】
図3を参照されたく、本発明の一実施例によるを示す対照群及び実験組の動物の膀胱容量を示すバーグラフである。図3の結果からわかるように、実験組と対照群との膀胱容量について統計的に有意な差に達していないが、複合プロバイオティクス組成物が投与された実験組の実験動物は、その膀胱容量が対照群よりも大きく、膀胱容量を増加させる傾向があった。
2.3排尿頻度の検出
【0047】
この実施例は、毎匹の実験動物の排尿時間と回数を記録し、1分間あたりの排尿回数(times/min;回/分間)で統計し分析した。動物の排尿に対する観察について、尿道口からの継続的な排出は排尿の動作として定義され、尿道口のみが湿っていて、継続的な排出がない場合、排尿とされなく、その結果は図4に示される。
【0048】
図4を参照されたく、本発明の一実施例による対照群及び実験組の動物の排尿頻度を示すバーグラフである。図4の結果からわかるように、実験組と対照群との排尿頻度について統計的に有意な差に達していないが、複合プロバイオティクス組成物が投与された実験組の実験動物は、排尿頻度が対照群よりも少なく、排尿頻度を減らす傾向があった。
2.4排尿遅延指数の検出
【0049】
この実施例は、実験組と対照群との実験動物の膀胱容量を比較して、排尿遅延指数を取得し、倍数(fold)で示す。排尿遅延指数の結果からわかるように、複合プロバイオティクス組成物に投与された実験組の実験動物は、その膀胱容量が対照群の約1.2倍であり、排尿遅延を増加させる(即ち、排尿頻度を遅らせる)傾向があった。
【0050】
要するに、本発明において、特定の菌株、特定の配合、特定の使用投与量、特定の検出方式、又は特定の評価方法は、単に例を挙げて過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物及びその用途を説明するものである。しかしながら、当業者であれば、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り、他の菌株、他の配合、他の使用投与量、他の検出方式、又は他の評価方法も過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物及びその用途に適用でき、且つ上記に限定されない。例として、複合プロバイオティクス組成物は、例えば、医薬組成物又は食品組成物であってよく、医薬及び食品に許容される担体、賦形剤及び/又は添加剤を選択的に含んでよく、粉剤、錠剤、顆粒剤、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレー又は座剤等の剤形に製造してよい。
【0051】
上記実施例によれば、本発明の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物は、以下のメリットがあり、ラクトバチルスブレビス菌株GKJOY、ラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3、ラクトバチルスプランタルム菌株GKK1及びペディオコッカスラクティス菌株GKA4を含み、連続して被験者に一定期間投与され、効果的に排尿頻度を遅らせ、膀胱圧力を低下させて膀胱容量を増加させて、将来、有効成分として様々な組成物の調製に用いられることができる。
【0052】
本発明を複数の特定の実施例で上記の通り開示したが、他の実施例も実現されてもよい。従って、本発明の下記の請求項の精神及び範囲は、ここに含まれる実施例の記載のものに限定されない。
【0053】
[生物材料の寄託]
国内寄託情報(寄託組織、日付、番号の順に注記されたい)
ラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)菌株GKJOYは、台湾新竹食品路331号の中国財団法人食品産業発展研究所生物資源保存研究センターに寄託され、寄託日が2019年7月18日であり、受託番号がBCRC 910920であり、2019年7月26日に前記菌株の生存は確認された。
ラクトバチルスファーメンタム(L.fermentum)菌株GKF3は、台湾新竹食品路331号の中国財団法人食品産業発展研究所生物資源保存研究センターに寄託され、寄託日が2018年2月12日であり、受託番号がBCRC 910824であり、2018年3月1日に前記菌株の生存は確認された。
ラクトバチルスプランタルム(L.plantarum)菌株GKK1は、台湾新竹食品路331号の中国財団法人食品産業発展研究所生物資源保存研究センターに寄託され、寄託日が2019年7月18日であり、受託番号がBCRC 910919であり、2019年7月26日に前記菌株の生存は確認された。
ペディオコッカスラクティス(Pediococcus acidilactici)菌株GKA4は、2020年11月6日にNITEに寄託され、受託番号がNITE BP-03311であり、2020年11月11日に前記菌株の生存は確認された。
国外寄託情報(寄託国、組織、日付、番号の順に注記されたい)
ラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)菌株GKJOYは、日本独立行政法人製品評価技術基盤機構(National Institute of Technology and Evaluation;NITE)の特許微生物寄託センター(National Patent Microorganisms Depositary、アドレス:292-0818日本千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に寄託され、寄託日が2020年11月6日であり、且つ受託番号がNITE BP-03316であり、2020年11月11日に前記菌株の生存は確認された。
ラクトバチルスファーメンタムGKF3は、中国北京市朝陽区北辰西路1号院3号の中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託され、寄託日が2018年1月12日であり、受託番号がCGMCC 15203である。
【符号の説明】
【0054】
無し
図1A
図1B
図2A
図2B
図3
図4
【手続補正書】
【提出日】2023-03-23
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)菌株GKJOY、ラクトバチルスファーメンタム(L.fermentum)菌株GKF3、ラクトバチルスプランタルム(L.plantarum)菌株GKK1及びペディオコッカスラクティス(Pediococcus acidilactici)菌株GKA4を含み、前記ラクトバチルスブレビス菌株GKJOYは、2020年11月6日に日本独立行政法人製品評価技術基盤機構(National Institute of Technology and Evaluation;NITE)の特許微生物寄託センター(National Patent Microorganisms Depositary、アドレス:292-0818日本千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に寄託され、受託番号がNITE BP-0331であり、前記ラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3は、2018年1月12日に中国北京市朝陽区北辰西路1号院3号の中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託され、受託番号がCGMCC 15203であり、前記ラクトバチルスプランタルム菌株GKK1は、2019年7月18日に財団法人食品産業発展研究所生物資源保存研究センター(BCRC、台湾新竹食品路331号)に寄託され、受託番号がBCRC 910919であり、且つ前記ペディオコッカスラクティス菌株GKA4は、2020年11月6日にNITEに寄託され、受託番号がNITE BP-03311である過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物であって、前記複合プロバイオティクス組成物は、経口組成物であり、前記過活動膀胱関連症状には、膀胱圧力の増加が含まれる、過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物
【請求項2】
前記複合プロバイオティクス組成物は、医薬組成物又は食品組成物である請求項に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項3】
医薬及び食品に許容される担体、賦形剤及び/又は添加剤を更に含む請求項に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項4】
前記複合プロバイオティクス組成物の剤形は、粉剤、錠剤、顆粒剤、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液体スプレー又は座剤を含む請求項1に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項5】
前記過活動膀胱関連症状には、排尿頻度の増加、及び/又は膀胱容量の減少が更に含まれる請求項1に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項6】
有効投与量の複合プロバイオティクスを含有する経口組成物を含み、前記経口組成物が連続して被験者に少なくとも30日間投与され、且つ前記複合プロバイオティクスは、受託番号がNITE BP-0331であるラクトバチルスブレビス菌株GKJOY、受託番号がCGMCC 15203であるラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3、受託番号がBCRC 910919であるラクトバチルスプランタルム菌株GKK1及び受託番号がBCRC 910876であるペディオコッカスラクティス菌株GKA4を含む過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物であって、前記過活動膀胱関連症状には、膀胱圧力の増加が含まれる、過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物
【請求項7】
前記過活動膀胱関連症状には、排尿頻度の増加、及び/又は膀胱容量の減少が更に含まれる請求項に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項8】
前記被験者は、成人であり、且つ前記複合プロバイオティクスの前記被験者に対する前記有効投与量は、150mg/60kg体重/日間~600mg/60kg体重/日間である請求項に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【請求項9】
前記被験者は、ラットであり、且つ前記複合プロバイオティクスの前記被験者に対する前記有効投与量は、5mg/kg体重/日間~20mg/kg体重/日間である請求項に記載の過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0009
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0009】
本発明の上記態様によれば、過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物を提出する。一実施例において、この過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物は、ラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)菌株GKJOY、ラクトバチルスファーメンタム(L.fermentum)菌株GKF3、ラクトバチルスプランタルム(L.plantarum)菌株GKK1及びペディオコッカスラクティス(Pediococcus acidilactici)菌株GKA4を含み、ラクトバチルスブレビス菌株GKJOYは、2020年11月6日に日本独立行政法人製品評価技術基盤機構(National Institute of Technology and Evaluation;NITE)の特許微生物寄託センター(National Patent Microorganisms Depositary、アドレス:292-0818日本千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に寄託され、受託番号がNITE BP-0331であり、ラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3は、2018年1月12日に中国北京市朝陽区北辰西路1号院3号の中国普通微生物菌種保蔵管理センターに寄託され、受託番号がCGMCC 15203であり、ラクトバチルスプランタルム菌株GKK1は、2019年7月18日に財団法人食品産業発展研究所生物資源保存研究センター(BCRC、台湾新竹食品路331号)に寄託され、受託番号がBCRC 910919であり、且つペディオコッカスラクティス菌株GKA4は、2020年11月6日にNITEに寄託され、受託番号がNITE BP-03311である。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0013
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0013】
本発明の別の態様によれば、有効投与量の複合プロバイオティクスを含有する経口組成物を含み、この経口組成物が連続して被験者に少なくとも30日間投与され、且つこの複合プロバイオティクスは、受託番号がNITE BP-0331であるラクトバチルスブレビス菌株GKJOY、受託番号がCGMCC 15203であるラクトバチルスファーメンタム菌株GKF3、受託番号がBCRC 910919であるラクトバチルスプランタルム菌株GKK1及び受託番号がBCRC 910876であるペディオコッカスラクティス菌株GKA4を含む過活動膀胱関連症状の緩和用の複合プロバイオティクス組成物を提出する。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0030
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0030】
いくつかの例において、上記菌株GKFは、台湾新竹の北埔で市販された伝統的な漬け発酵キムチから採取されてよい。30日以上自然発酵させた様々な果物や野菜のキムチ製品からサンプリングし、収集し包装した後でラベルを付け、冷蔵庫に低温で保管し、同日に実験室に輸送して菌株を分離させた。それから、検体バッグ内のろ液又は野菜や果物の葉を無菌的に抽出して、検体の10倍の体積に相当する滅菌水で均質化処理を行った。1mLの希釈液を取り0.1%ブロモクレゾールグリーン(bromocresol green)を含むMRS培地に入れ、37°Cで16時間の増菌培養を行って、検体内に含まれる乳酸桿菌の数を増加させ、スクリーニングサンプルにおける数が少ない乳酸菌菌株が分離される確率を強化した。次に、増菌培養後のサンプルを取り、配列希釈操作を行った。十万倍及び百万倍に希釈した配列希釈操作の後、それぞれ0.1mLを取り無菌シャーレに入れ、シャーレにそれぞれRogosa培地寒天、BIM-25寒天、馬鈴薯澱粉+酵母エキス寒天、ブロモクレゾールグリーンMRS寒天及びブロモクレゾールパープル寒天を入れた。37°Cで40時間嫌気培養を行った後で、各種の培地から15~20個の菌株の単一のコロニーをそれぞれ選択した。分離後の単一の菌株培養をMRS培養液において特定の温度で16時間培養した後で50%菌種凍結保存液(グリセリン)を加えた。