特開 2023-7271 受精卵および胚の発生を予測する非侵襲的解析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023007271

(43)【公開日】2023-01-18

(54)【発明の名称】受精卵および胚の発生を予測する非侵襲的解析方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20230110BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20230110BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20230110BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20230110BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

C12N5/071

G01N33/48 M

G01N33/483 C

【審査請求】有

【請求項の数】7

【出願形態】書面

(21)【出願番号】P 2021128603

(22)【出願日】2021-06-25

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り １．３６ｔｈ Ｖｉｒｔｕａｌ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｗｅｂ開催、令和２年７月７日公開（開催期間：令和２年７月５日から７月８日）． ２．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ３５，Ｉｓｓｕｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ＿１，Ｊｕｌｙ ２０２０，第ｉ５０－ｉ５１頁、３６ｔｈ Ｖｉｒｔｕａｌ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，令和２年７月９日公開． ３．日本繁殖生物学会、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ．６６，Ｓｕｐｐｌ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０２０ 第ｊ１０６頁、令和２年９月５日公開． ４．第１１３回日本繁殖生物学会大会、Ｗｅｂ開催、令和２年９月２５日公開（開催期間：令和２年９月２３日から９月２５日）． ５．第３８回日本受精着床学会総会・学術講演会事務局、第３８回日本受精着床学会総会・学術講演会 プログラム・講演抄録集 第７４頁、令和２年９月１５日公開．

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ６．第３８回日本受精着床学会総会・学術講演会、Ｗｅｂ開催、オンデマンド配信、令和２年１０月１日公開（配信期間：令和２年１０月１日から１０月２３日）． ７．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ Ｖｏｌｕｍｅ １１４ ｉｓｓｕｅ ３ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ 第ｅ１１８－ｅ１１９頁、令和２年９月１日公開． ８．ＡＳＲＭ ２０２０ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ＆ Ｅｘｐｏ、Ｗｅｂ開催、令和２年１０月１７日（開催期間：令和２年１０月１７日から１０月２１日）． ９．日本生殖医学会、第６５回日本生殖医学会学術講演会・総会 Ａｂｓｔｒａｃｔ ｂｏｏｋ 第１７２頁、令和２年１１月１日公開． １０．第６５回日本生殖医学会学術講演会・総会、Ｗｅｂ会期、オンデマンド配信、令和２年１２月３日（配信期間：令和２年１２月３日から１２月２３日）． １１．生殖補助医療技術者のためのリカレントセミナー ｆｒｏｍ 岡大ＡＲＴセンタ、オンラインセミナー、令和３年３月２８日公開． １２．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ｉｎ ｐｒｅｓｓ）令和３年４月３日（ｏｎ ｌｉｎｅによる早期公開）．

(71)【出願人】

【識別番号】521343666

【氏名又は名称】井上 岳人

(72)【発明者】

【氏名】井上 岳人

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

2G045CB30

2G045DA80

2G045FA16

2G045FA19

2G045GB02

2G045GC01

2G045JA03

4B063QA11

4B063QA20

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QS10

4B063QS39

4B063QX01

4B065AA93X

4B065AC20

4B065BA30

4B065CA60

(57)【要約】

【課題】受精卵および胚の発生を予測するための非侵襲的解析方法の提供。
【解決手段】前核期卵および胚における雌雄前核内および核内の形態動態学的解析を行うことで、受精卵および胚の発生ならびに核型を予測し、生児を得るための非侵襲的解析方法。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

前核期卵および胚の品質を決定するための、該前核期卵および該胚における雌雄前核および核に対する形態学および形態動態学的解析方法。

【請求項2】

請求項１の解析方法を用い、胚発生、受精卵・胚の核型および胚移植後の妊娠・出産・生児獲得への指標とすること、ならびに移植胚の優先順位を決定すること。

【請求項3】

請求項１を実施する上で、雌雄前核内に存在する核小体前駆体の移動ならびにその速度の解析を用い、胚発生、受精卵・胚の核型および胚移植後の妊娠・出産・生児獲得への指標とすること。

【請求項4】

請求項１を実施する上で、核内に存在する核小体前駆体および核小体の移動ならびにその速度の解析を用い、胚発生、受精卵・胚の核型および胚移植後の妊娠・出産・生児獲得への指標とすること。

【請求項5】

請求項１、３および４を実施する上で、核小体前駆体および核小体の座標を解析に用いること。

【請求項6】

請求項１を実施する上で、雌雄前核内および核内の細胞小器官等の挙動を解析し、該前核および該核の中心座標で補正すること。

【請求項7】

請求項１を実施する上で、核小体前駆体と共局在にあるクロマチンの挙動ならびにそれに付随する現象を解析し、胚発生、受精卵・胚の核型および胚移植後の妊娠・出産・生児獲得への指標とすること。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、体外受精や顕微授精等にて得られた前核期卵および胚に対し、形態学的および形態動態学的解析を行うことで前核期卵および胚の発生、核型、妊娠および出産を予測し、移植胚の優先順位を決定する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生殖医療において、良質な胚を選択し移植することは、妊娠率を増加、流産率を低下させ、健常生児獲得までの時間が短縮され、患者の精神的ストレスや経済的負担も軽減される。

【0003】

生殖医療において受精卵および胚の品質を評価する方法として、一般的に形態学的評価により受精卵および胚の移植順位が決定される（特許文献１、２）。しかし、従来の形態学的な評価により、最良のグレードの胚を移植しても妊娠に至らない場合や、流産となる場合も散見される。このように生児獲得に至らない場合、胚の染色体異常が多いと言われている。

【0004】

受精卵および胚の染色体の異常を検査する方法として、一部の細胞を採取し、遺伝子を解析する着床前胚染色体異数性検査（ＰＧＴ－Ａ）が行われており、移植前に胚の選別をすることによって、生児獲得までの時間の短縮や流産率の低下に寄与している（非特許文献１、２）。ただ、この方法にはデメリットもあり、胚および胚盤胞に対して侵襲が高い検査である。主に実施されている胚盤胞生検では栄養外胚葉細胞を採取し、解析に用いる。従って、栄養外胚葉細胞数が少ない場合や胚盤胞が弱い場合には、技術的に困難なこともあり、胚生検を行った胚盤胞が死滅する可能性もある。また、内部細胞塊（将来、主に胎児となる細胞）と解析に用いた栄養外胚葉細胞の核型の不一致が起こる場合もあり、本来、移植され児に至るような正倍数性胚（染色体数が正常な胚）を異数性胚（染色体数が異常な胚）として除外すること（偽陽性）や異数性胚が正倍数性胚と判断され、胚移植に用いられる危険性もある（偽陰性）。治療費の面でもＰＧＴ－Ａを施行することで患者の経済的負担が大きいものになる。

【0005】

近年、従来のＰＧＴ－Ａのデメリットであった侵襲の高い胚生検を回避するため、胚を培養した培養液内および胚盤胞腔内のフリーＤＮＡを胚の染色体検査に用いる方法も考案されている（ｎｉＰＧＴ－Ａ：非侵襲的着床前胚染色体異数性検査）（特許文献３、４）。しかし、ｎｉＰＧＴ－Ａでは遺伝的コンタミネーションの危険性の報告もある（非特許文献３、４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特表２０１４－５０７６６４号公報

【特許文献2】特表２０１９－５０９０５７号公報

【特許文献3】特開２０１８－６１４５３号公報

【特許文献4】特開２０１９－１６５７３８号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｓｓｉｓｔ Ｒｅｐｒｏｄ Ｇｅｎｅｔ．２０１９；３６：１６５－７２．

【非特許文献2】Ｂｏｙｎｕｋａｌｉｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０２０；１５：ｅ０２２７６１９．

【非特許文献3】Ｖｅｒａ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ．２０１８；３３：７４５－５６．

【非特許文献4】Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ．２０１７；１０７：２２０－８．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は生殖医療で得られた受精卵および胚の発生ならびに核型を予測するための非侵襲的解析方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記課題を解決するために本発明者は、鋭意検討した結果、前核期卵における雌雄前核内の形態動態学的解析を行うことで、受精卵および胚の発生ならびに核型を予測し、健常児を得るための非侵襲的解析方法を見出した。

【発明の効果】

【0010】

本発明の課題は、受精卵および胚の画像を形態動態学的解析に用いるため、胚に対し非侵襲的な方法である。画像を解析に用いるため、胚生検のように実施者の技術や経験の差が生ずることもない。該方法は前核内の解析を行うため、解析で得られた結果は完全に受精卵および胚自身のデータを示している。現行のＰＧＴ－Ａのように検査を行った一部の栄養外胚葉細胞と移植する胚盤胞との核型の不一致の危険性もない。また、遺伝的コンタミネーションの危険性も皆無である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】雌雄前核内の核小体前駆体の移動速度と胚盤胞形成との関係を示す図である。（実施例１）

【図2】雌雄前核内の核小体前駆体の移動速度と胚盤胞到達時間との関係を示す図である。（実施例１）

【図3】核小体前駆体の移動速度と胚盤胞形成との受信者動作特性（ＲＯＣ）解析結果を示す図（ａ）およびＲＯＣ解析にて得られた核小体前駆体の移動速度のカットオフ値にて区分した場合の胚盤胞到達率を示す図（ｂ）である。（実施例１）

【図4】雌雄前核内の核小体前駆体の移動速度と継続妊娠・生児獲得との関係を示す図である。（実施例２）

【図5】核小体前駆体の移動速度と継続妊娠・生児獲得とのＲＯＣ解析結果を示す図（ａ）およびＲＯＣ解析にて得られた核小体前駆体の移動速度のカットオフ値にて区分した場合の継続妊娠・生児獲得率を示す図（ｂ）である。（実施例２）

【図6】核小体前駆体の移動速度と胚の核型との関係を示す図（ａ）および核小体前駆体の移動速度と継続妊娠・生児獲得とのＲＯＣ解析により得られたカットオフ値（実施例２）にて区分した場合の胚の核型の比率を示す図（ｂ）である。（実施例３）

【発明を実施するための形態】

【0012】

顕微授精を含む体外受精にて得られた受精卵における前核内もしくは胚における核内の核小体前駆体もしくは核小体をトラッキングし、移動速度を解析する。実施例を下記に示す。

【実施例0013】

以下、本発明の理解を深めるために実施例により発明内容を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことは言うまでもない。

【実施例0014】

前核期卵における前核の解析とｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚発生
（１）女性はゴナドトロピンアンタゴニス卜法により卵巣刺激を受けた。経膣超音波検査にて少なくとも２つの卵胞径が１８ｍｍ以上に達した時点で、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを５０００ＩＵ投与した。ヒト絨毛性ゴナドトロピン投与３６時間後、採卵を行い、卵子卵丘細胞複合体を回収した。卵子卵丘細胞複合体をヒアルロニダーゼ処理し、卵丘細胞を除去し、成熟卵子を顕微授精に用いた。顕微授精後、タイムラプスインキュベーター内で７日間培養を続けた（Ｇｅｒｉ＋，Ｇｅｎｅａ Ｂｉｏｍｅｄｘ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ：ＣＯ_２，６％；Ｏ_２，５％；３７℃；７６．５％湿潤下；ｉｍａｇｅ／５分）。

【0015】

（２）顕微授精施行翌朝、タイムラプスモニタリング下にて、前核および極体を確認した。２前核２極体のものを正常受精卵と判断した。雌雄前核の判断は極体直下に出現し、中央に移動したものを雌性前核、もう一方を雄性前核とした。

【0016】

（３）前核期卵の雌雄前核および核小体前駆体の解析はモーションキャプチャーソフトウェア（Ｋｉｎｏｖｅａ ｍｏｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐａｔｒｅｏｎ，ＵＳＡ）を用いトラッキングを行った。核小体前駆体の各フレームの座標を測定し、それぞれの前核の中心座標で補正し、補正後の座標を算出した。核小体前駆体および前核の座標は各フレームに対し、トラッキングのズレの有無を確認し、修正および決定を行った。各フレームでの核小体前駆体の座標を算出しフレーム間の核小体前駆体の移動速度を算出した。その後、全フレームにて各核小体前駆体の速度を算出した。各前核内の２～５個の核小体前駆体を解析し平均移動速度を算出した。前核期卵のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養を継続し、胚盤胞到達と核小体前駆体の移動速度の関係を調べた。

【0017】

（４）胚盤胞到達に関係する細胞分裂の時間や前核の出現・消失時間、核小体前駆体の移動速度の単変量解析を実施し、有意水準（Ｐ値）が０．１５未満の事象に対し多変量解析を行い、オッズ比を算出した。ＲＯＣ解析にて胚盤胞到達にかかわる核小体前駆体の移動速度のカットオフ値および定量テストの有用性を示すＡＵＣ（ＲＯＣ曲線の下の面積）を算出した。

【0018】

前核期卵における前核内の核小体前駆体の解析とｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚発生の結果を図１および図２に示す。図１では雌雄前核内の核小体前駆体の移動速度は胚盤胞到達群の方が発生停止群よりも有意に速いことがわかった。図２では雄性前核内の核小体前駆体の移動速度と胚盤胞到達時間との間に負の相関があることがわかった。

【0019】

多変量解析結果を表１に、ＲＯＣ解析の結果を図３に示す。胚盤胞到達には雄性前核内の核小体前駆体の速度のみが関与していることがわかった。カットオフ値で前核期卵を区別した場合、カットオフ値以上で８４％の前核期卵が胚盤胞に到達することがわかった。カットオフ値未満では８２％の前核期卵が胚盤胞に至らず、発生の途中で停止することがわかった。また、胚盤胞到達の指標に核小体前躯体の移動速度を用いる解析方法の精度を示すＡＵＣは０．８１３であった。

【表1】