特開 2023-73582 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定補助方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023073582

(43)【公開日】2023-05-26

(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定補助方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20230519BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 N

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021186126

(22)【出願日】2021-11-16

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国立研究開発法人日本医療研究開発機構、令和２年度ウイルス等感染症対策技術開発事業「ＣＯＶＩＤ－１９定量的スクリーニング（抗原・抗体検査）検査法の基盤開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】504160781

【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学

(71)【出願人】

【識別番号】504205521

【氏名又は名称】国立大学法人 長崎大学

(71)【出願人】

【識別番号】516079785

【氏名又は名称】セルスペクト株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】山下 太郎

(72)【発明者】

【氏名】島上 哲朗

(72)【発明者】

【氏名】寺島 健志

(72)【発明者】

【氏名】丹尾 幸樹

(72)【発明者】

【氏名】岡島 正樹

(72)【発明者】

【氏名】谷口 巧

(72)【発明者】

【氏名】金子 周一

(72)【発明者】

【氏名】柳原 克紀

(72)【発明者】

【氏名】酒井 博則

(57)【要約】

【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者における重症化リスクを予測可能な判定補助方法を提供する。
【解決手段】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者より採取した検体に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド抗体量を測定し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定を補助する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者より採取した検体に含まれる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質に結合可能な抗体を測定する工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定を補助する方法。

【請求項2】

前記抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合可能な抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記検体が、血液検体である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド抗原を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者より採取した検体に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質に結合可能な抗体の測定に使用される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定を補助するための試薬。

【請求項6】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド抗原が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及びこれらの部分断片からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドである、請求項５に記載の試薬。

【請求項7】

抗ヒトＩｇＧ抗体をさらに含む、請求項５又は６に記載の試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定を補助する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

コロナウイルスは、ニドウイルス目コロナウイルス科オルソコロナウイルス亜科よりなるＲＮＡウイルスの一群である。コロナウイルスは、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノムと、らせん対称のヌクレオカプシドを持つエンベロープウイルスであり、カプシド表面からこん棒型の突起が突き出た特徴的な形状を有する。コロナウイルスは、ＲＮＡウイルスの中でも大型のウイルスであり、そのゲノムサイズは約２６～３２キロベースである。

【0003】

コロナウイルスは、哺乳類、鳥類等に感染性疾患を引き起こすＲＮＡウイルスとして知られ、特に、軽度～重篤の気道感染症を引き起こすことが知られる。ヒトにおいては、コロナウイルスは、一般的な風邪の原因ウイルスの一つとしても知られるが、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ等の一部のコロナウイルスは、より致命的な症状を引き起こすことが知られる。特に、２０１９年に中国で発見された新型コロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、短期間に全世界に蔓延し、有効な治療薬が存在しなかったという背景もあり、多数の感染者及び死者を出すこととなった。

【0004】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２には、そのウイルス表面に、宿主細胞の受容体に結合するスパイクタンパク質が存在する。このスパイクタンパク質は、三量体構造を有する糖タンパク質であり、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、Ｓ１ドメイン及びＳ２ドメインから構成される。Ｓ１ドメイン上の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）には、「ダウン型構造」と「アップ型構造」があり、アップ型構造のＲＢＤが宿主細胞表面のアンジオテンシン変異酵素ＩＩ（ＡＣＥ２）受容体に結合することが明らかにされている（非特許文献１）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染歴のないヒトであっても、多くに既存の低病原性コロナウイルスに対する獲得免疫が存在すること、この獲得免疫はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染時に増強されるが、感染防御には寄与しないことが報告されている（非特許文献２）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】D. Wrapp et al., Science, Vol. 367, pp. 1260-1263 (2020)

【非特許文献2】E. M. Anderson et al., Cell, Vol. 184, pp. 1858-1864 (2021)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者について、その重症化率は、患者の年齢（高年齢である程、重症化率が高い）、居住地域によって異なるとされてきたが、若年者や、患者の重症化率の低い地域であっても、重篤な症状を示すことがあり、他にも重症化の要因があると考えられている。患者の重症化リスクを重症化前に予測することができれば、より早期に高度な医学的介入を行うことが可能であり、これにより患者の重症化や死亡のリスクを大幅に低減することが期待できる。

【0007】

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者における重症化リスクを予測可能な判定補助方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者における重症化リスクを予測するための判定補助用試薬を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本明細書によれば、以下の発明が提供される。
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者より採取した検体に含まれる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質に結合可能な抗体を測定する工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定を補助する方法。
（２）前記抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合可能な抗体である、（１）に記載の方法。
（３）前記検体が、血液検体である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記抗体が、ＩｇＧ抗体である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド抗原を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者より採取した検体に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質に結合可能な抗体の測定に使用される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定を補助するための試薬。
（６）前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド抗原が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及びこれらの部分断片からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドである、（５）に記載の試薬。
（７）抗ヒトＩｇＧ抗体をさらに含む、（５）又は（６）に記載の試薬。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者における重症化リスクを予測可能な判定補助方法を提供することができる。また、本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者における重症化リスクを予測するための判定補助用試薬を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】各種コロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸配列の同一性、類似性を示すアラインメント図である。

【図2】各種コロナウイルスのＳ１ドメイン上の受容体結合ドメインのアミノ酸配列の同一性、類似性を示すアラインメント図である。

【図3】２０１９年以前に採取したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非感染者群の血清検体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質結合抗体測定値を、採取時期に分けて示した散布図である。

【図4】２０１９年以前に採取したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非感染者群の血清検体における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質結合抗体測定値（ＩｇＧ ＮＣ）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ドメイン結合抗体測定値（ＩｇＧ Ｓ）とを対比した相関図である。

【図5】２０２０年に採取したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非感染者群の血清検体における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質結合抗体測定値（ＩｇＧ ＮＣ）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ドメイン結合抗体測定値（ＩｇＧ Ｓ）とを対比した相関図である。

【図6】の中等度及び重症患者の発症後日数と、各種抗体測定値（ＯＤ）との関係を示す散布図である。（Ａ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質結合抗体測定値（ＩｇＧ ＮＣ）を、（Ｂ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ドメイン結合抗体測定値（ＩｇＧ Ｓ）を示す。

【図7】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の入院重症患者のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質結合抗体（抗ＮＣ抗体）陽性群、抗ＮＣ抗体陰性群の経過日数と死亡率の関係を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

［１］定義
本明細書において、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいう。構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）も本発明のポリペプチドに包含される。

【0012】

本明細書において、「抗体」とは、特定の物質（抗原）に特異的に結合するタンパク質を指す。ここでいう抗体は、哺乳類及び鳥類の体内で通常生成されるアイソタイプがいずれも包含される。ヒト由来の抗体においては、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥのいずれのアイソタイプも包含される。本明細書において、「抗原」とは、抗体が結合する対象となる物質を指す。より具体的には、人体においては異物として認識されるべき物質を指す。

【0013】

本明細書において、抗体の「中和活性」とは、抗体が特定タンパク質（抗原）の活性を中和する活性を指す。

【0014】

本明細書において、アミノ酸配列の「配列同一性」及び「配列類似性」とは、ＢＬＡＳＴ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）等のタンパク質検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる値を指し、「配列同一性」はアミノ酸が一致する割合、「配列類似性」はアミノ酸が一致又は類似アミノ酸に置換されている割合を指す。類似アミノ酸とは、アミノ酸を電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質に基づいて分類した場合に、同一の集団に属するアミノ酸をいう。このような集団には、例えば、塩基性アミノ酸群（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸群（アスパラギン酸、グルタミン酸）、非極性アミノ酸群（グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン）、極性無電荷アミノ酸群（セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン）、分枝鎖アミノ酸群（ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸群（フェニルアラニン、チロシン）、異節環状アミノ酸群（ヒスチジン、トリプトファン、プロリン）、脂肪族アミノ酸群（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）が挙げられる。

【0015】

本明細書において「患者」とは、何らかの疾患にり患し、入院又は通院を要するヒトを指す。本明細書において、「予後判定」とは、疾患の進行、治癒に対する医学的な見通しを指す。

【0016】

本明細書において「検体」とは、ヒトから体外に取り出される検体を指す。特に限定さないが、血液（例、全血、血清、血漿）、尿、糞便、乳汁、組織又は細胞抽出液、咽頭ぬぐい液、鼻汁、唾液、喀痰、うがい液、あるいはこれらの混合物とすることができる。特に、血液検体、さらには血清又は血漿検体とすることができる。

【0017】

本明細書において、「試薬」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで検体中の目的物質を検出するために使用される組成物等を指す。ここでいう試薬は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体の検出が可能であれば、その形態は時に限定されず、組成物等の単剤であってもよいが、例えば、マイクロウェルプレート、磁性ビーズ等の固相、洗浄液、検出用試薬等の複数の組成物、基材等を含むキットの形態も包含する。

【0018】

［２］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定を補助する方法
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定を補助する方法（以下、「本発明の方法」とも称する）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者より採取した検体に含まれる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質に結合可能な抗体を測定する工程を含む、ことを特徴とする。

【0019】

本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者」は、発熱、呼吸困難、味覚・嗅覚障害等の症状の有無及びＰＣＲ法、抗原検査法等の公知の検査の結果等より、臨床医がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症にり患していると確定診断した患者を指す。

【0020】

本発明の方法において、測定対象となる検体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者から体外に取り出された検体であれば特に限定さないが、例えば、血液（例、全血、血清、血漿）、尿、糞便、乳汁、組織又は細胞抽出液、咽頭ぬぐい液、鼻汁、唾液、喀痰、うがい液、あるいはこれらの混合物とすることができる。中でも、血液検体、特に血清又は血漿検体とすることが好ましい。

【0021】

本発明において「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質に結合可能な抗体（以下、「抗ＮＣ抗体」とも称する）」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質を抗原として、これに結合可能な抗体を指す。本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質」は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは、８５％以上、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。

【0022】

図１に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（配列番号１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（配列番号２）、低病原性ヒトコロナウイルス（ＯＣ４３（配列番号３）、ＨＫＵ１（配列番号４）、２２９Ｅ（配列番号５）及びＮＬ６３（配列番号６））におけるヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す。また、表１にＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ及びＮＬ６３のヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸配列の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸配列との同一性・類似性を示す。

【0023】

【表1】

【0024】

図１、表１に示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質の構造は、既知のコロナウイルスであるＳＡＲＳ-ＣｏＶ及び低病原性コロナウイルスと高い類似性を有する。

【0025】

本明細書において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ドメインと結合可能な抗体（以下、「抗Ｓ１抗体」とも称する）」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ドメイン、特に受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を抗原として、これに結合する抗体を指す。本発明において、ＲＢＤは、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号７で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは、８５％以上、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。

【0026】

図２に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（配列番号７）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（配列番号８）、ＯＣ４３（配列番号９）、ＨＫＵ１（配列番号１０）、２２９Ｅ（配列番号１１）及びＮＬ６３（配列番号１２）におけるＲＢＤのアミノ酸配列のアラインメントを示す。また、表２にＳＡＲＳ－Ｃｏｖ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ及びＮＬ６３のＲＢＤのアミノ酸配列の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤのアミノ酸配列との同一性・類似性を示す。

【0027】

【表2】

【0028】

本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していないヒトの血清において、抗ＮＣ抗体を含むものが一定割合以上存在することを見出した。また、この抗体の存在率（陽性率）が、季節によって大きく変動することを見出した（図３）。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者の約半数において、発症初期から抗ＮＣ抗体（ＩｇＧ）が陽性となることを見出した（図６）。一方で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していないヒトにおいては、抗Ｓ１抗体（ＩｇＧ）は検出できなかった（図４）。

【0029】

これらの事実より、本発明者らは、以下の仮説を立てた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の流行前より、市中には風邪等の原因ウイルスとして知られる既存のコロナウイルスがあり、これに対する獲得免疫を有するヒトが多数存在する。この中に抗ＮＣ抗体を保有しているか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ヌクレオカプシドタンパク質に反応可能な免疫記憶を有している個体が一定以上存在する。このような個体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した場合、免疫記憶を有しない個体と比較して早期に抗ＮＣ抗体を産生することが可能である。しかし、既存のコロナウイルスとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の主要な感染責任部位であるＲＢＤの構造の類似性が低いことから、既存コロナウイルスに対する獲得免疫を有するヒトであっても、抗Ｓ１抗体又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに反応可能な免疫記憶を有する可能性は低く、前記獲得免疫がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染防御には寄与し難い。

【0030】

本発明者らは、さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症患者において、血清中に検出可能な量の抗ＮＣ抗体が含まれる患者と含まれない患者とで、前者で死亡リスクが低くなることを見出した（図７）。既存のコロナウイルスとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質の構造が類似することから、既存コロナウイルスへの獲得免疫を有するヒトの場合、元々抗ＮＣ抗体を保有するか、感染初期に免疫記憶により抗ＮＣ抗体が産生され得る。この抗ＮＣ抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症化を抑制し得る。

【0031】

上記の知見より、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者から採取した検体中の抗ＮＣ抗体を測定することで、患者の予後判定において、客観的な指標の一つとできることが示された。

【0032】

本発明の方法において、測定対象となる抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよいが、特にＩｇＭ又はＩｇＧであることが好ましい。さらに、長期間の免疫記憶が維持されることから、ＩｇＧであることが好ましい。

【0033】

本発明の方法は、検体に含まれる抗ＮＣ抗体を検出する工程を含む。抗ＮＣ抗体の測定方法は、特に限定されないが、免疫測定を用いて測定することが好ましい。免疫測定は、具体的には、検体を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質又はそのペプチド断片からなる抗原と反応させる工程を含む。このような免疫測定としては、例えば、直接競合法、間接競合法、及びサンドイッチ法が挙げられる。また、このような免疫測定としては、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、及びサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及びイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。上記の免疫測定の原理及び具体的な手法は、いずれも当業者にとって周知である。

【0034】

検体を反応させる抗原は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは、８５％以上、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及びこれらの部分断片からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドである。ここでいう部分断片は、７アミノ酸以上、８アミノ酸以上、９アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、１５アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、３０アミノ酸以上、４０アミノ酸以上、５０アミノ酸以上、又は１００アミノ酸以上の長さを有することが好ましい。

【0035】

本発明の方法において、抗ＮＣ抗体の測定は、定性的であっても定量的であってもよい。定性的手法としては、例えば、検体から得られるシグナルを予め設定したカットオフと比較することで、検体中の抗ＮＣ抗体の存在の有無を判定する手法をとり得る。定量的手法としては、既知量の抗ＮＣ抗体を含む標準液について、検体と同様に免疫測定を行い、検体と標準液より得られるシグナル強度を比較して検体中の抗体量を算出する手法をとり得る。この場合、本発明の方法は、標準液中の抗ＮＣ抗体を測定する工程、及び標準液の測定結果より検体中の抗ＮＣ抗体を算出する工程を含んでいてもよい。

【0036】

本発明の方法は、得られた抗ＮＣ抗体の測定結果を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定の指標の一つとして提供し、予後判定を補助することを含む。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いる場合、検体から得られたシグナルがカットオフ未満であれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者の重症化リスク又は死亡リスクが高く、カットオフ以上であれば、重症化リスク又は死亡リスクが低いという判断の指標となり得る。

【0037】

本発明の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者の予後判定をより客観的に実施するために有用である。予後判定が正確に行われることで、より患者に適した治療レジメンの作成が可能となる。本発明の方法は、特に中等度から重症のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者において、さらに重症化するリスクを早期に判定するために有用である。

【0038】

本発明の方法に付随して、例えば、健常者の抗ＮＣ抗体を測定して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した場合の重症化リスクの指標としてもよい。しかし、獲得免疫を有するヒトであっても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は他のコロナウイルスに感染していない状態では、検出可能なレベルの抗ＮＣ抗体が産生されない可能性があるため、その判定には注意を要する。

【0039】

［３］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定を補助するための試薬
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定を補助するための試薬（以下、「本発明の試薬」とも称する）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド抗原（以下「ＮＣ抗原」とも称する）を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者より採取した検体に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質に結合可能な抗体の測定に使用される、ことを特徴とする。

【0040】

本発明の試薬は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者から取り出した検体に含まれる抗ＮＣ抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出することが可能な試薬である。抗ＮＣ抗体の測定結果より、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の重症化リスク又は死亡リスクの判定を補助することができる。

【0041】

本発明の試薬は、免疫測定用試薬である。免疫測定は、具体的には、検体を、ＮＣ抗原と反応させる工程を含む。このような免疫測定としては、例えば、直接競合法、間接競合法、及びサンドイッチ法が挙げられる。また、このような免疫測定としては、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、及びサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及びイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。上記の免疫測定の原理及び具体的な手法は、いずれも当業者にとって周知である。

【0042】

本発明の試薬に含まれる前記ＮＣ抗原は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは、８５％以上、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及びこれらの部分断片からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドであることが好ましい。ここでいう部分断片は、７アミノ酸以上、８アミノ酸以上、９アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、１５アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、３０アミノ酸以上、４０アミノ酸以上、５０アミノ酸以上、又は１００アミノ酸以上の長さを有することが好ましい。

【0043】

本発明の試薬は、ＮＣ抗原を含み、かつ、検体中の抗ＮＣ抗体の検出が可能であれば、単独の組成物等の形態であってもよく、また、複数の組成物、基材等を含むキットの形態であってもよい。

【0044】

本発明の試薬の測定対象である検体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者から体外に取り出された検体であれば特に限定さないが、例えば、血液（例、全血、血清、血漿）、尿、糞便、乳汁、組織又は細胞抽出液、咽頭ぬぐい液、鼻汁、唾液、喀痰、うがい液、あるいはこれらの混合物とすることができる。中でも、血液検体、特に血清又は血漿検体とすることが好ましい。

【0045】

本発明の試薬は、ヒト抗体に特異的に結合可能な抗体を含むことが好ましい。ここでいうヒト抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよいが、特にＩｇＭ又はＩｇＧであることが好ましい。さらに、長期間の免疫記憶が維持されることから、ＩｇＧであることが好ましい。すなわち、本発明の試薬は、抗ヒトＩｇＧ抗体を含むことがより好ましい。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いる場合、抗ヒトＩｇＧ抗体は、標識化されていることがさらに好ましい。標識としては、ビオチン、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等）、蛍光色素等、当業者にとって公知の標識をいずれも使用できる。

【0046】

抗ＮＣ抗体の測定は、定性的であっても定量的であってもよい。定性的手法としては、例えば、検体から得られるシグナルを予め設定したカットオフと比較することで、検体中の抗ＮＣ抗体の存在の有無を判定する手法をとり得る。定量的手法としては、既知量の抗ＮＣ抗体を含む標準液について、検体と同様に免疫測定を行い、検体と標準液より得られるシグナル強度を比較して検体中の抗体量を算出する手法をとり得る。定性的手法の場合、本発明の試薬は、陽性対照及び／又は陰性対照を含んでいてもよい。また、定量的手法の場合、本発明の試薬は、１以上の標準液を含んでいてもよい。

【0047】

本発明の試薬は、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定を補助する方法に使用することができる。本発明の試薬を使用することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者の予後判定をより客観的に実施することが可能となる。

【実施例0048】

以下、本発明をより詳細に説明するために実施例を示すが、本発明の範囲を実施例の範囲に限定することを意図するものではない。

【0049】

［参考例］一般患者における各種抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の陽性率
（１）検体採取
２００４年７月２３日～２０１９年１２月２６日に金沢大学付属病院を受診したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症以外の患者（Ｃ型慢性肝炎、Ｂ型慢性肝炎、脂肪肝患者）から取得し、冷凍保存していた血清検体のうち、患者のインフォームドコンセントが得られた３８６検体を使用した（Ａ群）。これとは別に、２０２０年１１月～１２月に金沢大学付属病院を受診した一般の通院患者から、インフォームドコンセントを得たうえで採血を行い、血清検体を調製した（Ｂ群、１４２３検体）。

【0050】

（２）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド抗体（抗ＮＣ抗体）の測定
Ａ群及びＢ群の血清検体中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド抗体（抗ＮＣ抗体）を、クオリサーチ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡキット（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（セルスペクト株式会社製）を使用して測定した。当該キットの抗原固相化プレートには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ヌクレオカプシドタンパク（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＹＰ＿００９７２４３９７．２，１－４１９ＡＡ（配列番号１３））のリコンビナントタンパク質が固相化されている。キットの手順に従い測定を実施し、反応停止後のプレートの各ウェルの４５０ｎｍの吸光度をマイクロウェルプレートで測定した。吸光度０．５をカットオフとしてカットオフ以上を「陽性」、カットオフ未満を「陰性」と判定した。

【0051】

Ａ群の抗ＮＣ抗体（ＩｇＧ ＮＣ）の測定結果を、採取時期（３月～５月（春）、６～８月（夏）、９～１１月（秋）、１２～２月（冬））に分けた散布図を図３に示す。春～冬の陽性率は、それぞれ１０．０、９．３、１０．７、２５．０％であり、風邪やインフルエンザの流行する冬に陽性率が高くなる傾向が示された。

【0052】

Ｂ群の抗ＮＣ抗体の測定結果において、「陽性」と判定された検体は、全体で６．６％であった。これは、２０２０年初旬より感染予防対策が我が国全体で強化されたことから、コロナウイルスに限らず、従来の風邪原因ウイルスの無症候感染が抑えられたことが要因と考えられた。

【0053】

Ａ群とＢ群において、採取時期は異なるものの、同一の患者から採取されたものが２１９例あった。そのうち、Ａ群で陽性と判定された患者は３５例存在したが、そのうち３２例は２０２０年採取時には陰性化していた。また、Ａ群で陰性と判定された１８４例のうち、１６例が２０２０年採取時に陽性化していた。抗ＮＣ抗体量は、経過によって大きく変動することが示唆された。

【0054】

（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ドメイン質結合抗体（抗Ｓ１抗体）の測定
抗ＮＣ抗体と同様に、各検体の抗Ｓ１抗体を、クオリサーチ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ キット（Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（セルスペクト株式会社製）を使用した。当該キットの抗原固相化プレートには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質Ｓ１ドメイン（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＹＰ＿００９７２４３９０．１，２５１－６６０ ＡＡ（配列番号１４））のリコンビナントタンパク質が固相化されている。キットの手順に従い測定を実施し、反応停止後のプレートの各ウェルの４５０ｎｍの吸光度をマイクロウェルプレートで測定した。吸光度０．２をカットオフとしてカットオフ以上を「陽性」、カットオフ未満を「陰性」と判定した。

【0055】

Ａ群の血清検体における、抗ＮＣ抗体測定値（ＩｇＧ ＮＣ）と抗Ｓ１抗体測定値（ＩｇＧ Ｓ）の対比を図４に示す。また、Ｂ群の血清検体における、抗ＮＣ抗体測定値（ＩｇＧ ＮＣ）と抗Ｓ１抗体測定値（ＩｇＧ Ｓ）の対比を図５に示す。Ａ群においては、抗Ｓ１抗体が陽性となる検体が５例存在した。一方、抗ＮＣ抗体、抗Ｓ１抗体の両方が陽性となる検体は見られなかった。Ｂ群においては、抗Ｓ１抗体が陽性となる患者が２０例見られた。また、抗ＮＣ抗体、抗Ｓ１抗体の両方が陽性となる検体が２例見られた。

【0056】

（４）ＲＢＤ中和活性の測定
上記（３）の測定で抗Ｓ１抗体陽性となった２５検体について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｄｉｐｏｇｅｎ ＡＧ、スイス、リースタール)を用いて、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）へのＲＢＤの結合阻害活性（中和活性）を測定した。その結果、阻害率が５０％を超えたのは、抗ＮＣ抗体、抗Ｓ１抗体の両方が陽性となった２検体のみであった。別途、ワクチン接種後のボランティアから同様に採取した検体６例においては、いずれも８０～１００％の高いＲＢＤ結合阻害活性を有した。

【0057】

［実施例］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者における各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の陽性率と予後観察
（１）検体採取と各種抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体測定
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染が確認された患者のうち、中等度症（「Ｓｅｖｅｒｅ」とも判定される）及び重症（「Ｃｒｉｔｉｃａｌ」とも判定される）の患者より、インフォームドコンセントを得たうえで採血を行い、血清検体を調製した（Ｃ群、４９検体）。発熱、呼吸困難等の発症から採血までの期間は２週間以内とした。Ｃ群の各検体について、［参考例］と同様の方法で、抗ＮＣ抗体及び抗Ｓ１抗体を測定した。

【0058】

図６に、各検体の発症後日数と各種抗体測定値（ＯＤ）との関係を示す。図６Ａは、抗ＮＣ抗体測定値（ＩｇＧ ＮＣ）を、図６Ｂは、抗Ｓ１抗体測定値（ＩｇＧ Ｓ）を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者において、抗ＮＣ抗体の陽性率は４８．０％と高かったのに対し、抗Ｓ１抗体の陽性率は４．２％であった。抗ＮＣ抗体は、発症後日数が短い検体においても陽性例が見られたのに対し、抗Ｓ１抗体は発症１１日後以降に見られた。

【0059】

（２）入院重症患者の予後観察
上記のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連症患者４９例のうち、入院重症患者２１例については、人工呼吸器装着、薬剤投与等の治療が継続された。２１例の患者の死亡率を、抗ＮＣ抗体陽性群、抗ＮＣ抗体陰性群に分けて調査した。図７に、入院重症患者の抗ＮＣ抗体陽性群、抗ＮＣ抗体陰性率群の経過日数と死亡率の関係を示す。抗ＮＣ抗体陰性群において、有意に死亡率が高くなることが確認された（ｐ＝０．０２２、ログランク検定）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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