特開 2023-75083 ドコサペンタエン酸を含む脂質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023075083

(43)【公開日】2023-05-30

(54)【発明の名称】ドコサペンタエン酸を含む脂質

(51)【国際特許分類】

   C11B 1/10 20060101AFI20230523BHJP

   C12P 7/64 20220101ALI20230523BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230523BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230523BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230523BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230523BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20230523BHJP

   A61K 31/19 20060101ALI20230523BHJP

   A61K 36/31 20060101ALI20230523BHJP

   A61K 36/28 20060101ALI20230523BHJP

   A61K 36/286 20060101ALI20230523BHJP

   A61K 36/48 20060101ALI20230523BHJP

   A61K 36/899 20060101ALI20230523BHJP

   A61K 36/889 20060101ALI20230523BHJP

   A61K 36/88 20060101ALI20230523BHJP

   A61K 35/66 20150101ALI20230523BHJP

   A61K 8/9789 20170101ALI20230523BHJP

   A61K 36/185 20060101ALI20230523BHJP

   A61K 36/55 20060101ALI20230523BHJP

   A61K 36/81 20060101ALI20230523BHJP

   A23K 10/30 20160101ALI20230523BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20230523BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20230523BHJP

   C12N 15/82 20060101ALN20230523BHJP

   A61P 3/00 20060101ALN20230523BHJP

【ＦＩ】

C11B1/10 ZNA

C12P7/64

C12N5/10

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

A01H5/00 A

A61K31/19

A61K36/31

A61K36/28

A61K36/286

A61K36/48

A61K36/899

A61K36/889

A61K36/88

A61K35/66

A61K8/9789

A61K36/185

A61K36/55

A61K36/81

A23K10/30

C12N15/53

C12N15/54

C12N15/82 126Z

A61P3/00

【審査請求】有

【請求項の数】23

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023017919

(22)【出願日】2023-02-08

(62)【分割の表示】P 2021043379の分割

【原出願日】2015-06-18

(31)【優先権主張番号】2014902471

(32)【優先日】2014-06-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(31)【優先権主張番号】20140104761

(32)【優先日】2014-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AR

(31)【優先権主張番号】PCT/AU2014/050433

(32)【優先日】2014-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(31)【優先権主張番号】14/575,756

(32)【優先日】2014-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．テフロン

(71)【出願人】

【識別番号】590003283

【氏名又は名称】コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション

(71)【出願人】

【識別番号】511119798

【氏名又は名称】グレインズ リサーチ アンド デヴェロップメント コーポレイション

(71)【出願人】

【識別番号】522099630

【氏名又は名称】ヌシード ニュートリショナル オーストラリア ピーティーワイ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100194423

【弁理士】

【氏名又は名称】植竹 友紀子

(72)【発明者】

【氏名】ペトリ―，ジェームズ ロバートソン

(72)【発明者】

【氏名】シング，スリンダー パル

(72)【発明者】

【氏名】シュレスタ，プシュカル

(72)【発明者】

【氏名】マカリスター，ジェイソン，ティモシー

(72)【発明者】

【氏名】ディバイン，マルコン，デビット

(72)【発明者】

【氏名】デ フェイター，ロバート，チャールズ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含む抽出植物脂質または微生物脂質、及び該抽出脂質の製造方法を提供する。
【解決手段】エステル化された形態の脂肪酸を含み、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合により、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のうち１つ以上を含んでもよく、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、７％から３５％の間である、抽出植物脂質または微生物脂質を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

エステル化された形態の脂肪酸を含み、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リ
ノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸及びド
コサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合により、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサ
ペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のうち１つ以上を含んで
もよく、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、７％から３５％の間
である、抽出植物脂質または微生物脂質。

【請求項2】

以下の特徴：
ｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、約２％から１５
％の間、または約３％から１０％の間であること、
ｉｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは
、約０．１％であること、
ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸のレベルは、約１％から約３
０％の間、約３％から約３０％の間、約６％から約３０％の間、約１％から約２０％の間
、約３０％から約６０％の間、約４５％～約６０％、約３０％、または約１５％から約３
０％の間であること、
ｉｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸（ＬＡ）のレベルは、約４％か
ら約３５％の間、約４％から約２０％の間、約４％から約１７％の間、または約５％から
約１０％の間であること、
ｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα－リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、約４
％から約４０％の間、約７％から約４０％の間、約１０％から約３５％の間、約２０％か
ら約３５％の間、約４％から約１６％の間、または約２％から約１６％の間であること、
ｖｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるγ－リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルは、
４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％から７％
の間、０．０５％から４％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２
％の間であること、
ｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルは、
約１０％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約４％未満、約３％未満、約０．
０５％から約７％の間、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約４％の間、約
０．０５％から約３％の間、約０．０５％から約１０％の間、または約０．０５％から約
２％の間であること、
ｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレ
ベルは、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５
％から約６％の間、０．０５％から約５％の間、０．０５％から約４％の間、０．０５％
から約３％の間、または０．０５％から約２％の間であること、
ｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベル
は、４％未満、約２％未満、約１％未満、０．０５％から４％の間、０．０５％から３％
の間、または０．０５％から約２％の間、または０．０５％から約１％の間であること、
ｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルは
、４％から１５％の間、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から１０％の間
、０．０５％から５％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の
間であること、
ｘｉ）もし、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＨＡのレベルが、２％未満、ま
たは０．０５％から約２％の間であること、
ｘｉｉ）該脂質は、その脂肪酸含有物中にω６－ドコサペンタエン酸（２２：５^{Δ４，
７，１０，１３，１６}）を含むこと、
ｘｉｉｉ）該脂質は、その脂肪酸含有物中に０．１％未満のω６－ドコサペンタエン酸
（２２：５^{Δ４，７，１０，１３，１６}）を含むこと、
ｘｉｖ）該脂質は、その脂肪酸含有物中に０．１％未満の１つ以上または全てのＳＤＡ
、ＥＰＡ及びＥＴＡを含むこと、
ｘｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルは、約４％から約２５
％の間、約４％から約２０％の間、約６％から約２０％の間、または約６％から約１２％
の間であること、
ｘｖｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸レベルは、約４％か
ら約４０％の間、約４％から約３５％の間、約８％から約２５％の間、８％から約２２％
の間、約１５％から約４０％の間または約１５％から約３５％の間であること、
ｘｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸レベルは、約２０
％から約７５％の間、３０％から７５％の間、約５０％から約７５％の間、約６０％、約
６５％、約７０％、約７５％、または約６０％から約７５％の間であること、
ｘｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸レベルは、約３５％か
ら約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から約２０％の間、２０％未満、約
１６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の間、または
約４％から約１０％の間であること、
ｘｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸レベルは、約１０％未満、
約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％から約１０％の間
、０．５％から約８％の間、または０．５％から４％の間であること、
ｘｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸レベルは、３６％から約６５
％の間、３６％から約７０％の間、４０％から約６０％の間、約３０％から約６０％の間
、約３５％から約６０％の間、４０％から約６５％の間、約３０％から約６５％の間、約
３５％から約６５％の間、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０
％、約６５％または約７０％であること、
ｘｘｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸レベルは、２１％から約４
５％の間、２１％から約３５％の間、約２３％から約３５％の間、約２５％から約３５％
の間、約２７％から約３５％の間、約２３％から約２５％の間、約２７％、約３０％、約
３５％、約４０％または約４５％であること、
ｘｘｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、
約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．
５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約１．
０未満、約０．１未満、約０．１０～約０．４、または約０．２であること、
ｘｘｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は
、約１．０から約３．０の間、約０．０２から約０．１の間、約０．１から約１の間、約
０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２
０未満、約０．１５未満、約０．０２、約０．０５、約０．１、約０．２または約１．０
であること、
ｘｘｉｖ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なく
とも約８０％、約６０％から約９８％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５％
から約９０％の間のΔ１２－デサチュラーゼによるオレイン酸からＬＡへの転換効率に基
づくこと、
ｘｘｖ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくと
も約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間、約
３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間のΔ６－デサチュラーゼによ
るＡＬＡからＳＤＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｖｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なく
とも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８８％の間、または約７５％
から約８５％の間のΔ６－エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡ酸への転換効率に基づく
こと、
ｘｘｖｉｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少な
くとも約７５％、約６０％から約９９％の間、約７０％から約９９％の間、または約７５
％から約９８％の間のΔ５－デサチュラーゼによるＥＴＡからＥＰＡへの転換効率に基づ
くこと、
ｘｘｖｉｉｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少
なくとも約９０％、約５０％から約９９％の間、約８５％から約９９％の間、約５０％か
ら約９５％の間、または約８５％から約９５％の間のΔ５－エロンガーゼによるＥＰＡか
らＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｉｘ）前記脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少な
くとも約２０％、少なくとも約２５％、約２０％、約２５％、約３０％、約１０％から約
５０％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間または約２０％から
約３０％の間のオレイン酸からＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｘ）前記脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なく
とも約２２％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、約２５
％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約１５％から約５０％の間、
約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間のＬＡからＤＰＡへの転換
効率に基づくこと、
ｘｘｘｉ）前記脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少な
くとも約２４％、少なくとも約３０％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５
０％、約５５％、約６０％、約２２％から約７０％の間、約１７％から約５５％の間、約
２２％から約４０％の間、または約２４％から約４０％の間のＡＬＡからＤＰＡへの転換
効率に基づくこと、
ｘｘｘｉｉ）該抽出脂質中の総脂肪酸は、１．５％未満のＣ２０：１、１％未満のＣ２
０：１または約１％のＣ２０：１を有すること、
ｘｘｘｉｉｉ）該脂質のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率は、少なくとも約７
０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約７０％から約
９９％の間、または約９０％から約９９％の間であること、
ｘｘｘｉｖ）該脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含み、ＤＡＧは好ましくは
ＤＰＡを含むこと、
ｘｘｘｖ）該脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満または約０．００１％か
ら約５％の間の遊離（非エステル化）脂肪酸及び／またはリン脂質を含む、または本質的
にそれを含まないこと、
ｘｘｘｖｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも７０％、少なくとも
７２％または少なくとも８０％は、前記ＴＡＧのｓｎ－１位またはｓｎ－３位であること
、
ｘｘｘｖｉｉ）前記脂質において最も豊富なＤＰＡ含有ＴＡＧ種は、ＤＰＡ／１８：３
／１８：３（ＴＡＧ５６：１２）であること、
ｘｘｘｖｉｉｉ）前記脂質は、トリＤＰＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含むこと、
及び
ｘｘｘｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、約７％、約８％
、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２２％、約２４％、
約２６％、約２８％、約３１％、約７％から約３１％の間、約７％から約２８％の間、約
１０％から約３５％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間、約１
０％から約２２％の間、約１４％から約３５％の間、約１６％から約３５％の間、約１６
％から約３０％の間、約１６％から約２５％の間、または約１６％から約２２％の間であ
り、場合により、ＤＨＡレベルは、該抽出脂質の総脂肪酸含有量の０．５％未満であるこ
と
の１つ以上を有する、請求項１に記載の脂質。

【請求項3】

前記脂質がオイル、好ましくは、油料種子から採れるオイルであり、より好ましくは、
前記脂質が、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）オイルまたはカラシナ
（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）オイルなどのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ
．）オイル、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）オイル、アマ（Ｌｉｎｕｍ
ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）オイル、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ
．）オイル、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）オイル、ダイズ（
Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）オイル、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）オイル、ギニアア
ブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）オイル、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）オイル、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ
ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）オイル、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉ
ｖａ）オイル、クランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）オイル、ジ
ャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）オイル、ま
たはススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）オイルを含むまたはである、請
求項１または２のいずれか１項に記載の脂質。

【請求項4】

ｉ）脂質を含む植物部分または微生物細胞を得る工程であって、前記脂質がエステル化
された形態の脂肪酸を含み、前記脂肪酸がオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ
）を含むω６脂肪酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（Ｓ
ＤＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合により、１つ以上のエイコサペンタ
エン酸（ＥＰＡ）及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含んでもよく、前記植物部分中
の抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが７％から３５％の間である前記工
程、及び
ｉｉ）前記植物部分または微生物細胞から脂質を抽出する工程
を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが７％から３５％の間で
ある抽出植物脂質または微生物脂質の産生方法。

【請求項5】

前記抽出脂質が請求項２または請求項３で定義された特徴の１つ以上を有する、請求項
４記載の方法

【請求項6】

前記植物部分が種子、好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ
）またはカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）などのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉ
ｃａ ｓｐ．）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ
ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．）、ベ
ニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａ
ｘ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ ｇｕｉ
ｎｅｅｎｉｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）
、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）、カメリナサティ
バ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）、またはクランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ ａ
ｂｙｓｓｉｎｉｃａ）、好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ
）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃ． ｓａｔｉｖａ）の
種子などの油料種子である、請求項４または５に記載の方法。

【請求項7】

前記植物部分または微生物細胞が、酵素の以下のセット：
ｉ）ω３－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エ
ロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６
－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ
６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュ
ラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－
エロンガーゼ、
ｖ）ω３－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エ
ロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９
－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ
９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサ
チュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ
５－エロンガーゼ、
ｉｘ）ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、
Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、または
ｘ）ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ
５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、前記植物部
分または微生物細胞の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上の
プロモーターと作動可能に結合している、請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記植物部分または微生物細胞が、以下の特徴：
ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少な
くとも約８０％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約９０％の間、または約７５
％から約８５％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、オ
レイン酸をリノール酸に転換すること、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少な
くとも約８５％、約６５％から約９５％の間、約７５％から約９１％の間、または約８０
％から約９１％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ω
６脂肪酸をω３脂肪酸に転換すること、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少
なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約
３０％から約７０％の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間
の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＡＬＡをＳＤＡに転換
すること、
ｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、約５％未満、約２．５％未満、約１％未満、約０
．１％から約５％の間、約０．５％から約２．５％の間、または約０．５％から約１％の
間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、リノール酸をγ‐リ
ノレン酸に転換すること、
ｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくと
も約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８０％の間、または約７５％か
ら約８０％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＳＤＡ
をＥＴＡに転換すること、
ｖｉ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少な
くとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約６０％から約９５％の間
、約７０％から約９５％の間、または約７５％から約９５％の間の効率で、前記植物部分
または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＥＴＡをＥＰＡに転換すること、
ｖｉｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少な
くとも約９０％、約５０％から約９０％の間、または約８５％から約９５％の間の効率で
、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＥＰＡをＤＰＡに転換すること
、
ｖｉｉｉ）前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、オレイン酸をＤＰＡ
に転換する効率が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少
なくとも約２５％、約２０％、約２５％、約３０％、約１０％から約５０％の間、約１０
％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間、または約２０％から約３０％の
間であること、
ｉｘ）前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＬＡをＤＰＡに転換する
効率が、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約
２５％、少なくとも約３０％、約２５％、約３０％、約３５％、約１５％から約５０％の
間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間であること、
ｘ）前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＡＬＡをＤＰＡに転換する
効率が、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、少なくとも約
３０％、約３０％、約３５％、約４０％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３
５％の間、または約２４％から約３５％の間であること、
ｘｉ）前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞は、前記外来性ポリヌクレオチ
ドを含まない対応細胞より、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、約２５％から約
４０％の間、または約２７．５％から約３７．５％の間で多いω３脂肪酸を含むこと、
ｘｉｉ）前記Δ６－デサチュラーゼは、リノール酸（ＬＡ）と比較してα－リノレン酸
（ＡＬＡ）を優先的に不飽和化すること、
ｘｉｉｉ）前記Δ６－エロンガーゼは、Δ９－エロンガーゼ活性も有すること、
ｘｉｖ）前記Δ１２－デサチュラーゼは、Δ１５－デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖ）前記Δ６－デサチュラーゼは、Δ８－デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖｉ）前記Δ８－デサチュラーゼは、Δ６－デサチュラーゼ活性も有する、またはΔ
６－デサチュラーゼ活性を有しないこと、
ｘｖｉｉ）前記Δ１５－デサチュラーゼは、ＧＬＡに対するω３－デサチュラーゼ活性
も有すること、
ｘｖｉｉｉ）前記ω３－デサチュラーゼは、ＬＡに対するΔ１５－デサチュラーゼ活性
も有すること、
ｘｉｘ）前記ω３－デサチュラーゼは、ＬＡ及び／またはＧＬＡの両方を不飽和化する
こと、
ｘｘ）前記ω３－デサチュラーゼは、ＬＡと比較してＧＬＡを優先的に不飽和化するこ
と、
ｘｘｉ）１つ以上または全ての前記デサチュラーゼは、対応するアシル‐ＰＣ基質より
、アシル－ＣｏＡ基質に対して高い活性を有すること、
ｘｘｉｉ）前記Δ６－デサチュラーゼは、脂肪酸基質として、ＬＡより、ＡＬＡに対し
て高いΔ６－デサチュラーゼ活性を有すること、
ｘｘｉｉｉ）前記Δ６－デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ－２位と結
合したＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ－ＣｏＡに対して高いΔ６－デサ
チュラーゼ活性を有すること、
ｘｘｉｖ）前記Δ６－デサチュラーゼは、ＬＡと比較して、基質としてのＡＬＡに対し
て、少なくとも約２倍高いΔ６－デサチュラーゼ活性、少なくとも３倍高い活性、少なく
とも４倍高い活性、または少なくとも５倍高い活性を有すること、
ｘｘｖ）前記Δ６－デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのｓｎ－２位と結合し
たＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ－ＣｏＡに対して高い活性を有するこ
と、
ｘｘｖｉ）前記Δ６－デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのｓｎ－２位に結合
したＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ－ＣｏＡに対して、少なくとも約５
倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性または少なくとも１０倍高い活性を有すること、
ｘｘｖｉｉ）前記デサチュラーゼは、フロントエンドデサチュラーゼであること、及び
ｘｘｖｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡに対する検出可能なΔ５‐デサチ
ュラーゼ活性を有しないこと
の１つ以上または全てを有する、請求項７記載の方法。

【請求項9】

前記植物部分または微生物細胞が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（
ＤＧＡＴ）、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、グリセロ
ール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１－アシル－グリセロール－
３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、好ましくは、ＤＰＡ－ＣｏＡなど
のＣ２２多価不飽和脂肪アシル－ＣｏＡ基質を使用できるＬＰＡＡＴ、アシル－ＣｏＡ：
リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスホリパーゼＡ
_２（ＰＬＡ_２）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、ＣＤＰ－
コリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）、ホスファチジ
ルコリンジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）、ホスファチジル
コリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、アシル－
ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、またはその２つ以上の組合せをコードする外来性ポリヌク
レオチドをさらに含む、請求項７または請求項８記載の方法。

【請求項10】

前記外来性ポリヌクレオチドが、前記植物部分または微生物細胞の細胞のゲノムに組み
込まれたＤＮＡ分子、好ましくは、Ｔ－ＤＮＡ分子内に共有結合しており、好ましくは、
前記植物部分または微生物細胞の細胞のゲノムに組み込まれたかかるＤＮＡ分子数が、１
以下、２もしくは３以下であり、または２もしくは３である、請求項７～９のいずれか１
項に記載の方法。

【請求項11】

前記外来性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分または微生物細胞の総オイル含有率が
、前記外来性ポリヌクレオチドを含まない対応する植物部分または微生物細胞の総オイル
含有率の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約
７０％、約５０％から約８０％の間、または約８０％から約１００％の間である、請求項
４～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記脂質を処理して、総脂肪酸含有率のパーセンテージとして、ＤＰＡのレベルを増加
させることをさらに含み、前記処理が、１つ以上の分別蒸留、蒸留またはＤＰＡのメチル
エステルまたはエチルエステルの生成などのエステル交換反応を含む、請求項４～１１の
いずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

その種子中に脂質を含む油料種子植物、もしくはその部分、または微生物細胞であって
、
ａ）エステル化された形態の脂肪酸を含む脂質、及び
ｂ）酵素の以下のセット；
ｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュ
ラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－
エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチ
ュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５
－エロンガーゼ
ｉｉｉ）ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチ
ュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、または
ｉｖ）ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュ
ラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチド
を含み、
各ポリヌクレオチドが、前記植物の発育種子中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可
能である１つ以上の種子特異的プロモーター、または前記微生物細胞中の前記ポリヌクレ
オチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合されており、前
記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－リ
ノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、及びドコサペンタエ
ン酸（ＤＰＡ）を含み、場合によっては、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及び／または
エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含んでもよく、及び前記種子または微生物細胞の脂質
の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが７％から３５％の間である、
前記油料種子植物、もしくはその部分、または微生物細胞。

【請求項14】

ＤＰＡを含む種子を産生可能であるセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ
）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａ
ｔｉｖａ）植物であって、前記植物の成熟した収穫された種子が、種子１グラム当たり少
なくとも約２８ｍｇ、好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約３２ｍｇ、種子１グ
ラム当たり少なくとも約３６ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約４０ｍｇ、より好ま
しくは、種子１グラム当たり少なくとも約４４ｍｇまたは少なくとも４８ｍｇ、種子１グ
ラム当たり少なくとも約８０ｍｇ、または種子１グラム当たり約３０ｍｇから約８０ｍｇ
の間のＤＰＡ含有量を有する、前記植物。

【請求項15】

前記外来性ポリヌクレオチドを含む請求項１３記載の植物細胞。

【請求項16】

以下の特徴：
ｉ）請求項１３または１４記載の植物由来であること、
ｉｉ）請求項１～３のいずれか１項に記載の脂質を含むこと、
ｉｉｉ）請求項４～１２のいずれか１項に記載の方法で使用できること
の１つ以上を有する植物部分、好ましくは種子、または微生物細胞。

【請求項17】

ＤＰＡ及び約４重量％から約１５重量％の間、好ましくは、約６重量％から約８重量％
の間または約４重量％から約８重量％の間の水分を含む成熟して収穫されたセイヨウアブ
ラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）またはカメリ
ナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）種子であって、前記種子のＤＰＡ含有量
が種子１グラム当たり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは、種子１グラム当たり少なくと
も約３２ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約３６ｍｇ、種子１グラム当たり少なくと
も約４０ｍｇ、より好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約４４ｍｇまたは種子１
グラム当たり少なくとも約４８ｍｇ、種子１グラム当たり約８０ｍｇ、または種子１グラ
ム当たり約３０ｍｇから約８０ｍｇの間である、前記種子。

【請求項18】

請求項１～３のいずれか１項に記載の抽出植物脂質または抽出微生物脂質の製造に使用
できる植物または微生物細胞の産生方法であって、前記方法が、
ａ）複数の植物または微生物細胞からの１つ以上の植物部分または微生物細胞により産
生された脂質中のＤＰＡのレベルをアッセイすることであって、各植物または微生物細胞
が、酵素の以下のセット；
ｉ）ω３－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エ
ロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６
－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ
６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ
、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロン
ガーゼ、
ｖ）ω３－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エ
ロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９
－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ
９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラ
ーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エ
ロンガーゼ、
ｉｘ）ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、
Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、または
ｘ）ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ
５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ
の１つをコードする１つ以上の外来性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドが、植物部分または微生物細胞の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発
現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合する、前記アッセイするこ
と、と
ｂ）１つ以上のその部分の請求項１～３のいずれか１項に記載の抽出植物脂質または微
生物脂質の産生に使用できる複数の植物または微生物細胞から植物または微生物細胞を同
定すること、と
ｃ）場合によっては、前記同定植物または微生物細胞、またはそれ由来の種子から後代
植物または微生物細胞を産生すること
とを含む前記方法。

【請求項19】

種子の産生方法であって、前記方法が、
ａ）好ましくは、少なくとも１０００または２０００または３０００のかかる植物の集
合部分としての耕地または標準栽植密度で植えられた少なくとも１ヘクタールまたは２ヘ
クタールまたは３ヘクタールの領域で、請求項１３または１４記載の植物、または請求項
１６記載の植物部分を産生、もしくは請求項１７記載の種子を産生する植物を生育するこ
と、
ｂ）前記１つまたは複数の植物から種子を収穫すること、及び
ｃ）場合によっては、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも６０ｋｇ
または７０ｋｇまたは８０ｋｇのＤＰＡ／ヘクタールの総ＤＰＡ収率でオイルを産生する
こと
を含む、前記方法。

【請求項20】

次の特徴：
ｉ）請求項２または請求項３に定義されるオイルを含むこと、及び
ｉｉ）前記植物部分または種子または微生物細胞が請求項４～１２のいずれか１項に記
載の方法で使用可能であること
の１つ以上を有する、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の植物、植物細胞、植物部
分もしくは種子、または微生物細胞。

【請求項21】

請求項４～１２のいずれか１項に記載の方法を用いて、請求項１５記載の細胞、請求項
１３記載の油料種子植物、請求項１３記載の微生物細胞、請求項１４記載のセイヨウアブ
ラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）もしくはカメ
リナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物、請求項１６記載の植物部分、ま
たは請求項１７記載の種子により産生、またはから得られる脂質、またはオイル。

【請求項22】

請求項１７記載の種子から得られる、または請求項１３または１４記載の植物から得ら
れるシードミール。

【請求項23】

１つ以上の請求項２１記載の脂質もしくはオイル、請求項１５記載の細胞、請求項２０
記載の植物細胞または微生物細胞、請求項１７記載の種子、または請求項２２記載のシー
ドミールを含む組成物。

【請求項24】

１つ以上の請求項２１記載の脂質もしくはオイル、請求項１５記載の細胞、請求項１３
記載の油料種子植物、請求項２０記載の植物細胞もしくは微生物細胞、請求項１４記載の
セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）
もしくはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物、請求項２０記載の
植物部分、請求項１７記載の種子、請求項２２記載のシードミール、または請求項２３記
載の組成物を含む家畜飼料、化粧品または化学薬品。

【請求項25】

家畜飼料の製造方法であって、前記方法が、少なくとも１つの他の食物成分と、１つ以
上の請求項１～３のいずれか１項に記載の脂質もしくはオイル、請求項１５記載の細胞、
請求項１３記載の油料種子植物、請求項２０記載の植物細胞もしくは微生物細胞、請求項
１４記載のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕ
ｎｃｅａ）もしくはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物、請求項
２０記載の植物部分、請求項１７記載の種子、請求項２２記載のシードミール、または請
求項２３記載の組成物を混合することを含む前記方法。

【請求項26】

ＰＵＦＡから利益を受けることになる症状の治療または予防用医薬品製造のための、請
求項１～３のいずれか１項に記載の１つ以上の脂質またはオイル、請求項１５記載の細胞
、請求項２０記載の植物細胞もしくは微生物細胞、請求項２０記載の植物部分、請求項１
７記載の種子、請求項２２記載のシードミール、または請求項２３記載の組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、植物細胞または微生物細胞から得られたドコサペンタエン酸を含む脂質、及
び該脂質の産生及び使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ω３長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）は、ヒト及び動物の健康のための重要な
化合物として、今では広く認識されている。これらの脂肪酸を、食事供給源からまたは、
その両方とも食餌の必須脂肪酸として見なされているリノール酸（ＬＡ、１８：２ω６）
またはα－リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ω３）脂肪酸の転換により得ることができる。
ヒト及び多くの他脊椎動物は、植物源から得られたＬＡまたはＡＬＡをＣ２２に転換でき
るが、この転換反応は、非常に遅い速度で起こる。さらに、現代社会のほとんどは、理想
とされるω６：ω３脂肪酸について４：１以下の比の代わりに、少なくとも９０％の多価
不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）がω６脂肪酸であるというバランスのとれていない食事をとっ
ている（Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ、２００１）。ヒトのためのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ
、２０：５ω３）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、
２２：６ω３）などのＬＣ－ＰＵＦＡの即時型食事供給源は、ほとんど、魚または魚油か
らである。従って、健康専門家はヒトの食事に、ＬＣ－ＰＵＦＡの有意なレベルを含む魚
を規則的に含めることを推奨している。益々、魚由来ＬＣ－ＰＵＦＡオイルは、例えば、
食品及び乳児用調製粉乳に配合されている。しかしながら、世界的及び国の水産業の衰退
のせいで、これらの有益な健康増進オイルの代替源が必要とされている。

【0003】

動物と対照的に、顕花植物類は、１８個の炭素より長い長鎖を有する多価不飽和脂肪酸
を合成する能力を有しない。特に、他被子植物類と共に作物及び園芸植物は、ＡＬＡから
誘導されるＥＰＡ、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５ω３）及びＤＨＡなどのより
長鎖ω３脂肪酸を合成するために必要な酵素を有しない。従って、植物バイオ技術の重要
ゴールは、実質的量のＬＣ－ＰＵＦＡを産生し、それ故、これらの化合物の代替供給源を
提供する作物のエンジニアリングである。

【発明の概要】

【0004】

ＬＣ－ＰＵＦＡ生合成経路
微細藻類、セン類及び真菌類などの生物のＬＣ－ＰＵＦＡの生合成は、通常、一連の酸
素依存性不飽和化及び伸長反応として起こる（図１）。これらの生物内でＥＰＡを産生す
る最も共通の経路としては、Δ６－不飽和化反応、Δ６－伸長反応及びΔ５－不飽和化反
応（Δ６－不飽和化反応経路と呼ばれる）が挙げられ、一方で、余り共通でない経路は、
Δ９－伸長反応、Δ８－不飽和化反応及びΔ５－不飽和化反応（Δ９－不飽和化反応経路
と呼ばれる）を使用する。これらの連続した不飽和化及び伸長反応は、図１の上左部に模
式的に示したω６脂肪酸基質ＬＡ（ω６）または図１の下右部に示したＥＰＡに完結する
ω３基質ＡＬＡ（ω３）のいずれかで開始し得る。もし、最初のΔ６－不飽和化反応が、
ω６基質ＬＡ上で起こるならば、一連の３種の酵素のＬＣ－ＰＵＦＡ産生物は、ω６脂肪
酸ＡＲＡであろう。ＬＣ－ＰＵＦＡ合成生物は、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ω６）
のＥＰＡへの転換について図１中のΔ１７－デサチュラーゼ工程として示したω３－デサ
チュラーゼを用いて、ω６脂肪酸をω３脂肪酸に転換し得る。ω３－デサチュラーゼファ
ミリーのいくつかのメンバーは、ＬＡからＡＲＡまでの範囲の様々な基質上で作用できる
。植物ω３－デサチュラーゼは、しばしば、ＬＡからＡＬＡまでのΔ１５－不飽和化反応
を特異的に触媒するが、一方、真菌類及び酵母のω３－デサチュラーゼは、ＡＲＡからＥ
ＰＡまでのΔ１７－不飽和化反応に対して特異的であり得る（Ｐｅｒｅｉｒａら，２００
４ａ；Ｚａｎｋら，２００５）。広範囲のω６基質をそれらの対応するω３産生物に転換
できる非特異的ω３－デサチュラーゼが存在し得ることを、いくつかの報告が示唆してい
る（Ｚｈａｎｇら，２００８）。

【0005】

これらの生物内におけるＥＰＡのＤＨＡへの転換は、ＥＰＡのΔ５－伸長反応により起
こり、ＤＰＡを産生し、次いで、Δ４－不飽和化反応によりＤＨＡを産生する（図１）。
対照的に、哺乳類は、Δ４－デサチュラーゼと独立した３種の別反応によりＤＰＡをＤＨ
Ａに転換する、いわゆる、「シュプレッヒャー」経路を使用する（Ｓｐｒｅｃｈｅｒら，
１９９５）。

【0006】

植物、セン類、微細藻類、及び線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ
）などの下等動物で概して見られるフロントエンドデサチュラーゼは、ホスファチジルコ
リン（ＰＣ）基質のｓｎ－２位とエステル化された脂肪酸基質を支配的にに受容する。従
って、これらのデサチュラーゼは、アシル－ＰＣ、脂質結合、フロントエンドデサチュラ
ーゼとして知られる（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら，２００３）。対照的に、高等動物フロントエ
ンドデサチュラーゼは、概して、脂肪酸基質がＰＣよりＣｏＡと結合しているアシル－Ｃ
ｏＡ基質を受容する（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら，２００５）。いくつかの微細藻類デサチュラ
ーゼ及び１つの植物デサチュラーゼは、ＣｏＡとエステル化された脂肪酸基質を使用する
ことが知られている（表２）。

【0007】

各ＰＵＦＡ伸長反応は、他成分タンパク質複合体により触媒される４工程から成る：先
ず、縮合反応の結果、マロニル－ＣｏＡから脂肪酸に２Ｃ単位が付加され、β－ケトアシ
ル中間体を生成する。それから、これが、ＮＡＤＰＨにより還元され、次いで、脱水反応
によりエノイル中間体を得る。この中間体は、最終的に、２回還元されて、伸長脂肪酸を
生成する。他工程はそうでないが、これらの４反応の縮合工程は基質特異的であると、概
して、考えられる。実際に、天然植物伸長機構は、非天然ＰＵＦＡ基質の伸長において天
然植物伸長機構の効率が低くあり得るが、ＰＵＦＡに特異的縮合酵素（通常、「エロンガ
ーゼ」と呼ぶ）が導入されること提供するＰＵＦＡを伸長可能であることを、このことは
意味している。２００７年に、酵母伸長サイクルデヒドラターゼの同定及び特徴付けが発
表された（ＤｅｎｉｃとＷｅｉｓｓｍａｎ、２００７）。

【0008】

伸長反応がアシル－ＣｏＡプールにおいて基質に対して起こる一方で、植物、セン類及
び微細藻類のＰＵＦＡ不飽和化は、アシル－ＰＣプールにおいて優先的に脂肪酸基質に対
して自然に起こる。ＰＣ担体へのアシル－ＣｏＡ脂肪酸の転移がリゾホスファチジルコリ
ンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）により起こる一方で、アシル－ＰＣ分子から
ＣｏＡ担体への脂肪酸の転移は、ホスホリパーゼ（ＰＬＡ）により起こる（Ｓｉｎｇｈら
、２００５）。

【0009】

ＬＣ－ＰＵＦＡの工学的産生
ほとんどのＬＣ－ＰＵＦＡ代謝工学は、好気性Δ６－不飽和化／伸長経路を用いて行わ
れている。タバコ中にγ－リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ω６）の生合成は、シアノバク
テリア・シネコシスティス（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉ
ｓ）のΔ６－デサチュラーゼを用いて、１９９６年に初めて報告された（ＲｅｄｄｙとＴ
ｈｏｍａｓ、１９９６）。より近年では、ＧＬＡは、ベニバナ（種子オイル中ＧＬＡ７３
％、ＷＯ２００６／１２７７８９）及びダイズ（ＧＬＡ２８％；Ｓａｔｏら、２００４）
などの作物で産生された。ＥＰＡ及びＤＨＡなどのＬＣ－ＰＵＦＡの産生は、関連する不
飽和化及び伸長工程数が多いせいで、より複雑な工学操作を伴う。ＥＰＡ陸上植物のＥＰ
Ａ産生は、Ｑｉらにより初めて報告され（２００４）、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏ
ｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）のΔ９－エロンガーゼ、ユーグレナ・グラシリス（Ｅ
ｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）のΔ８－デサチュラーゼ及びモルティエレラ・アルピ
ナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）のΔ５－デサチュラーゼをコードする遺伝
子を、ＥＰＡ３％までの収率で、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に導入し
た。この研究後、Ａｂｂａｄｉら（２００４）が続き、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏ
ｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）のΔ６－デサチュラーゼ及びΔ６－エロンガーゼ及び
フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔ
ｕｍ）のΔ５－デサチュラーゼをコードする遺伝子を用いて、亜麻仁でＥＰＡ０．８％ま
での産生を報告した。

【0010】

ＤＨＡ産生の最初の報告は、ダイズ胚芽内におけるＤＨＡ３％の産生を記載しているＷ
Ｏ０４／０１７４６７であったが、種子ではなく、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐ
ｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ６－デサチュラーゼ、モルティエレラ・アルピナ
（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ６－デサチュラーゼ、モルティエレラ・ア
ルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５－デサチュラーゼ、サプロレグニ
ア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ４－デサチュラーゼ、サ
プロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７－デサチ
ュラーゼ、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ６－
エロンガーゼ及びパブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ５－エロンガ
ーゼをコードする遺伝子導入によるものであった。ＤＨＡも産生する胚芽内の最大ＥＰＡ
レベルは１９．６％であり、ＥＰＡからＤＨＡへの転換効率は小さいことを示した（ＷＯ
２００４／０７１４６７）。この発見は、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）
Δ５／６－デサチュラーゼ、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）Δ
６－エロンガーゼ、並びにパブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ５－エ
ロンガーゼ及びΔ４－デサチュラーゼを用いて、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ）内におけるＥＰＡ３％及びＤＨＡ０．５％の産生についてＲｏｂｅｒｔら（２００
５）により発表されたものと類似していた。また、２００５年に、Ｗｕらは、ピシリウム
・イレグラーレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）Δ６－エロンガーゼ、スラウ
ストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）Δ５－デサチュラーゼ、ニセツリガ
ネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）Δ６－エロンガーゼ、キンセン
カ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）Δ１２－デサチュラーゼ、スラウ
ストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）Δ５－エロンガーゼ、フィトフトラ
・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）Δ１７－デサチ
ュラーゼ、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）ＬＣ－ＰＵＦＡエロンガ
ーゼ、スラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）Δ４－デサチュラーゼ
及びスラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＬＰＣＡＴを用いて、カ
ラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）内において、ＡＲＡ２５％、ＥＰＡ１５％、
及びＤＨＡ１．５％の産生を発表した（Ｗｕら、２００５）。ω３ＬＣ－ＰＵＦＡを合成
する油料種子作物を産生する試みの総括が、Ｖｅｎｅｇａｓ－Ｃａｎｅｌｏｎら（２０１
０）及びＲｕｉｚ－Ｌｏｐｅｚら（２０１２）により提供されている。 Ｒｕｉｚ－Ｌｏ
ｐｅｚら（２０１２）により示されたように、トランスジェニック植物内のＤＨＡ産生に
ついて、今日までに得られた結果は魚油で見られるレベルにはほど遠いものであった。よ
り近年、Ｐｅｔｒｉｅら（２０１２）は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔ
ｈａｌｉａｎａ）の種子内におけるＤＨＡ約１５％の産生を報告し、ＷＯ２０１３／１８
５１８４は、７％から２０％の間のＤＨＡを有する特定の種子オイルの産生を報告した。
しかしながら、２０％を超えるＤＨＡを有する植物油の産生の報告はない。

【0011】

ＤＨＡの同時産生なしに有意なレベルまで、組換え細胞内のＤＰＡ産生の報告はない。
実際、本発明者らは、ＤＨＡ産生なしで、組換え細胞内でＤＰＡを産生するいかなる公に
なった示唆も動機づけも知らない。

【0012】

従って、組換え細胞内でのＬＣ－ＰＵＦＡ、特に、油料種子植物の種子内のＤＰＡのよ
り効率的な産生の必要性が依然として存在する。

【0013】

発明の概要
ほとんどの生物体が、１～２％を超えてＤＰＡを有するオイルを産生することができず
、そのため、天然源からラージスケールでＤＰＡを産生するという選択肢は、たとえあっ
たとしても限定的である。本発明者らは、天然源よりも非常に高レベルのＤＰＡを有する
脂質を産生するための方法及び植物を特定した。

【0014】

第一の態様では、本発明は、エステル化された形態の脂肪酸、オレイン酸、パルミチン
酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸
を含み、及び場合により、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）
、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１つ以上を含ん
でもよく、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、約７％から３５％の
間である抽出脂質、好ましくは、抽出植物脂質または抽出微生物脂質を提供する。この態
様の実施形態において、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルは、約７％
、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２２％、約
２４％、約２６％、約２８％、約３０％、約７％から約２８％の間、約７％から約２５％
の間、約１０％から３５％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間
、約１０％から約２２％の間、約１４％から３５％の間、約１６％から３５％の間、約１
６％から約３０％の間、約１６％から約２５％の間、または約１６％から約２２％の間で
ある。

【0015】

上記態様の実施形態では、ＤＨＡは、該抽出脂質の総脂肪酸含有量の２％未満または０
．５％未満のレベルで存在し、より好ましくは、該脂質の総脂肪酸含有物中に存在しない
。

【0016】

別の態様では、本発明は、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含むエステル化された形態
の脂肪酸を含む抽出脂質、好ましくは、抽出植物脂質または抽出微生物脂質を提供し、ト
リアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡが
、該ＴＡＧのｓｎ－２位でエステル化されている。実施形態では、該抽出脂質は、（ｉ）
オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－リノレン酸（Ａ
ＬＡ）を含むω３脂肪酸の１つ以上または全てを含み、場合により、ステアリドン酸（Ｓ
ＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１つ
以上を含んでもよいこと、（ｉｉ）少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくと
も約４８％、３５％から約６０％の間、または３５％から約５０％の間のトリアシルグリ
セロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されたＤＰＡが該ＴＡＧのｓｎ－２位でエステル
化されていること、及び（ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベル
が約１％から３５％の間、または約７％から３５％の間または約２０．１％から３５％の
間であることの１つ以上または全てにより、さらに特徴付けられる。この態様の実施形態
では、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、約７％、約８％、約９％
、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２２％、約２４％、約２６％
、約２８％、約３０％、約７％から約２８％の間、約７％から約２５％の間、約１０％か
ら３５％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間、約１０％から約
２２％の間、約１４％から３５％の間、約１６％から３５％の間、約１６％から約３０％
の間、約１６％から約２５％の間、または約１６％から約２２％の間である。好ましい実
施形態では、該抽出脂質は、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）または（ｉｉ）
及び（ｉｉｉ）、より好ましくは、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の全てにより特徴付
けられる。好ましくは、該抽出脂質は、約２％から１６％の間である該抽出脂質の総脂肪
酸含有量におけるパルミチン酸レベル、及び、もし存在する場合、１％未満である該抽出
脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）レベルにより、さらに特徴付
けられる。

【0017】

上記の態様の各々の実施形態を、以下、さらに詳細に説明する。当業者が理解するよう
に、上記態様の対応する特徴より広範である、記載された実施形態のいかなる特徴もその
態様に適用しない。

【0018】

実施形態では、抽出脂質は、以下の特徴：
ｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、約２％から１８％
の間、約２％から１６％の間、約２％から１５％の間、または約３％から１０％の間であ
ること、
ｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、
６％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または約０．１％であること、
ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸のレベルは、約１％から約３
０％の間、約３％から約３０％の間、約６％から約３０％の間、約１％から約２０％の間
、約３０％から約６０％の間、約４５％～約６０％、約３０％、または約１５％から約３
０％の間であること、
ｉｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸（ＬＡ）のレベルは、約４％か
ら約３５％の間、約４％から約２０％の間、約４％から約１７％の間、または約５％から
約１０％の間であること、
ｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα－リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、約４
％から約４０％の間、約７％から約４０％の間、約１０％から約３５％の間、約２０％か
ら約３５％の間、約４％から約１６％の間、または約２％から約１６％の間であること、
ｖｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるγ－リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルは、４
％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％から約７％
の間、０．０５％から４％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２
％の間であること、
ｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルは、
約１０％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約４％未満、約３％未満、約０．
０５％から約７％の間、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約４％の間、約
０．０５％から約３％の間、約０．０５％から約１０％の間、または約０．０５％から約
２％の間であること、
ｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレ
ベルは、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５
％から約６％の間、０．０５％から約５％の間、０．０５％から約４％の間、０．０５％
から約３％の間、または０．０５％から約２％の間であること、
ｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベル
は、４％未満、約２％未満、約１％未満、０．０５％から４％の間、０．０５％から３％
の間、または０．０５％から約２％の間、または０．０５％から約１％の間であること、
ｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルは
、４％から１５％の間、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から１０％の間
、０．０５％から５％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の
間であること、
ｘｉ）該脂質は、その脂肪酸含有物中にω６－ドコサペンタエン酸（２２：５^{Δ４，７
，１０，１３，１６}）を含むこと、
ｘｉｉ）該脂質は、その脂肪酸含有物中に０．１％未満のω６－ドコサペンタエン酸（
２２：５^{Δ４，７，１０，１３，１６}）を含むこと、
ｘｉｉｉ）該脂質は、その脂肪酸含有物中に０．１％未満の１つ以上または全てのＳＤ
Ａ、ＥＰＡ及びＥＴＡを含むこと、
ｘｉｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルは、約４％から約２
５％の間、約４％から約２０％の間、約６％から約２０％の間、または約６％から約１２
％の間であること、
ｘｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸レベルは、約４％から
約４０％の間、約４％から約３５％の間、約８％から約２５％の間、８％から約２２％の
間、約１５％から約４０％の間または約１５％から約３５％の間であること、
ｘｖｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸レベルは、約２０％
から約７５％の間、３０％から７５％の間、約５０％から約７５％の間、約６０％、約６
５％、約７０％、約７５％、または約６０％から約７５％の間であること、
ｘｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸レベルは、約３５％から
約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から約２０％の間、２０％未満、約１
６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の間、または約
４％から約１０％の間であること、
ｘｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸レベルは、約１０％未
満、約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％から約１０％
の間、０．５％から約８％の間、または０．５％から４％の間であること、
ｘｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸レベルは、３６％から約６
５％の間、３６％から約７０％の間、４０％から約６０％の間、約３０％から約６０％の
間、約３５％から約６０％の間、４０％から約６５％の間、約３０％から約６５％の間、
約３５％から約６５％の間、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６
０％、約６５％または約７０％であること、
ｘｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸レベルは、２１％から約４５
％の間、２１％から約３５％の間、約２３％から約３５％の間、約２５％から約３５％の
間、約２７％から約３５％の間、約２３％から約２５％の間、約２７％、約３０％、約３
５％、約４０％または約４５％であること、
ｘｘｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約
１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５
０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約１．０
未満、約０．１未満、約０．１０～約０．４、または約０．２であること、
ｘｘｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、
約１．０から約３．０の間、約０．０２から約０．１の間、約０．１から約１の間、約０
．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０
未満、約０．１５未満、約０．０２、約０．０５、約０．１、約０．２または約１．０で
あること、
ｘｘｉｉｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少な
くとも約８０％、約６０％から約９８％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５
％から約９０％の間のΔ１２－デサチュラーゼによるオレイン酸からＬＡへの転換効率に
基づくこと、
ｘｘｉｖ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なく
とも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間、
約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間のΔ６－デサチュラーゼに
よるＡＬＡからＳＤＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｖ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくと
も約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８８％の間、または約７５％か
ら約８５％の間のΔ６－エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡ酸への転換効率に基づくこ
と、
ｘｘｖｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なく
とも約７５％、約６０％から約９９％の間、約７０％から約９９％の間、または約７５％
から約９８％の間のΔ５－デサチュラーゼによるＥＴＡからＥＰＡへの転換効率に基づく
こと、
ｘｘｖｉｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少な
くとも約９０％、約５０％から約９９％の間、約８５％から約９９％の間、約５０％から
約９５％の間、または約８５％から約９５％の間のΔ５－エロンガーゼによるＥＰＡから
ＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｖｉｉｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少
なくとも約２０％、少なくとも約２５％、約２０％、約２５％、約３０％、約１０％から
約５０％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間または約２０％か
ら約３０％の間のオレイン酸からＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｉｘ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なく
とも約２２％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、約２５
％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約１５％から約５０％の間、
約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間のＬＡからＤＰＡへの転換
効率に基づくこと、
ｘｘｘ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくと
も約２４％、少なくとも約３０％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％
、約５５％、約６０％、約２２％から約７０％の間、約１７％から約５５％の間、約２２
％から約４０％の間、または約２４％から約４０％の間のＡＬＡからＤＰＡへの転換効率
に基づくこと、
ｘｘｘｉ）該抽出脂質中の総脂肪酸は、１．５％未満のＣ２０：１、１％未満のＣ２０
：１または約１％のＣ２０：１を有すること、
ｘｘｘｉｉ）該脂質のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率は、少なくとも約７０
％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約７０％から約９
９％の間、または約９０％から約９９％の間であること、
ｘｘｘｉｉｉ）該脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含み、ＤＡＧは好ましく
はＤＰＡを含むこと、
ｘｘｘｉｖ）該脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満または約０．００１％
から約５％の間の遊離（非エステル化）脂肪酸及び／またはリン脂質を含む、または本質
的にそれを含まないこと、
ｘｘｘｖ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも７０％、少なくとも７
２％または少なくとも８０％は、該ＴＡＧのｓｎ－１位またはｓｎ－３位であり、
ｘｘｘｖｉ）該脂質中に最も豊富なＤＰＡを含むＴＡＧ化学種は、ＤＰＡ／１８：３／
１８：３（ＴＡＧ５８：１２）であり、該脂質はトリＤＰＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８
）を含むこと、及び
ｘｘｘｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、約７％、約８
％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２２％、約２４％
、約２６％、約２８％、約３１％、約７％から約３１％の間、約７％から約２８％の間、
約１０％から約３５％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間、約
１０％から約２２％の間、約１４％から約３５％の間、約１６％から約３５％の間、約１
６％から約３０％の間、約１６％から約２５％の間、または約１６％から約２２％の間で
あり、場合により、ＤＨＡレベルは、該抽出脂質の総脂肪酸含有量の０．５％未満である
こと
の１つ以上を有する。

【0019】

別の実施形態では、該抽出脂質は、以下の特徴：
ｉ） 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、２％から１５
％の間であること、
ｉｉ） 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベル
は、約０．１％であること、
ｉｉｉ） 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸のレベルは、１％から３
０％の間であること、
ｉｖ） 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸（ＬＡ）のレベルは、４％
から２０％の間であること、
ｖ） 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるα－リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、
４％から４０％の間であること、
ｖｉ） 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるγ－リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルは
、０．０５％から７％の間であること、
ｖｉｉ） 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベル
は、０．０５％から１０％の間であること、
ｖｉｉｉ） 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）
のレベルは、６％未満であること、
ｉｘ） 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレ
ベルは、４％未満であること、
ｘ） 該抽出植物脂質は、その脂肪酸含有物中に０．１％未満のω６－ドコサペンタエン
酸（２２：５^{Δ４，７，１０，１３，１６}）を含むこと、
ｘｉ） 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸のレベルは、１０％未満
であること、
ｘｉｉ） 該抽出植物脂質の脂肪酸含有物中の総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、１．
０から３．０の間、または０．１から１の間であること、
ｘｉｉｉ） 該抽出植物脂質の脂肪酸含有物中の新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、１
．０から３．０の間、または０．０２から０．１の間、または０．１から１の間であるこ
と、
ｘｉｖ） 該抽出植物脂質の脂肪酸組成は、少なくとも１０％のオレイン酸からＤＰＡへ
の転換効率に基づくこと、
ｘｖ） 該抽出植物脂質の脂肪酸組成は、少なくとも１５％のＬＡからＤＰＡへの転換効
率に基づくこと、
ｘｖｉ） 該抽出植物脂質の脂肪酸組成は、少なくとも１７％のＡＬＡからＤＰＡへの転
換効率に基づくこと、
ｘｖｉｉ） 該抽出植物脂質中の総脂肪酸は、１．５％未満のＣ２０：１であること、及
び
ｘｖｉｉｉ） 該抽出植物脂質中のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率は、少なく
とも７０％であり、１つ以上の以下の特徴により特徴付けられ得ること、
ｘｉｘ） 該抽出植物脂質は、ＤＰＡを含むジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含むこと
、
ｘｘ） 該抽出植物脂質は、１０％未満の遊離（非エステル化）脂肪酸及び／またはリン
脂質を含む、または本質的にそれを含まないこと、
ｘｘｉ） ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも７０％は、該ＴＡＧのｓ
ｎ－１位またはｓｎ－３位であること、
ｘｘｉｉ）該抽出植物脂質中の最も豊富なＤＰＡ含有ＴＡＧ化学種は、ＤＰＡ／１８：３
／１８：３（ＴＡＧ５８：１２）であること、及び
ｘｘｉｉｉ）該抽出植物脂質は、トリＤＰＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含むこと
の１つ以上を有する。

【0020】

実施形態では、該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサペンタエン酸（ＥＰ
Ａ）のレベルは、０．０５％から１０％の間である。。

【0021】

さらなる実施形態では、該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＨＡのレベルは、
２％未満、好ましくは１％未満、または０．１％から２％の間、より好ましくは検出され
ないことである。好ましくは、植物、または種子などその一部、または微生物細胞は、Δ
４－デサチュラーゼをコードするポリヌクレオチドを有していないか、またはΔ４－デサ
チュラーゼポリペプチドを有していない。別の実施形態では、該抽出脂質は、オイルの形
態であり、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９８重量％
、または約９５重量％から約９８重量％の間であるオイルは脂質である。

【0022】

好ましくは、該抽出脂質は、アブラナ属の種子オイルの脂質、またはカメリナサティバ
（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）の種子オイルの脂質である。

【0023】

上記第１の態様の好ましい実施形態では、脂質またはオイル、好ましくは、種子オイル
、より好ましくは、アブラナ属の種子オイルまたはカメリナサティバの種子オイルは、以
下の特徴を有する：脂質またはオイルの総脂肪酸含有量において、ＤＰＡレベルは、約７
％から３０％の間または約７％から３５％の間であり、パルミチン酸レベルは、約２％か
ら約１６％の間であり、ミリスチン酸レベルは、１％未満であり、オレイン酸レベルは、
約１％から約３０％の間であり、ＬＡレベルは、約４％から３５％の間であり、ＡＬＡは
存在し、抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルは、約４％から約２５％
の間であり、抽出脂質の脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、０．
０５から約３．０の間であり、脂質のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率は、少な
くとも約７０％であり、場合により、脂質は、コレステロールを本質的に含まなくてもよ
く、及び／または脂質は、トリ－ＤＰＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１５）を含む。より好ま
しくは、脂質またはオイル、好ましくは、種子オイルは、以下の特徴の１つ以上または全
てをさらに有する：少なくとも７０％のＤＰＡは、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の
ｓｎ－１位またはｓｎ－３位でエステル化されており、ＡＬＡは、総脂肪酸含有物の４％
から４０％の間のレベルで存在し、ＧＬＡは存在し、及び／またはＧＬＡレベルは、総脂
肪酸含有物の４％未満であり、ＳＤＡレベルは、０．０５％から約１０％の間であり、Ｅ
ＴＡレベルは、約４％未満であり、ＥＰＡレベルは、０．０５％から約１０％の間であり
、抽出脂質の総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸レベルは、約４％から約３５％
の間であり、抽出脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸レベルは、約２０％
から約７５％の間であり、抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸：新ω３脂肪
酸の比は、約０．０３から約３．０の間、好ましくは、約０．５０未満であり、脂質の脂
肪酸組成は：少なくとも約６０％のΔ１２－デサチュラーゼによるオレイン酸からＬＡへ
の転換効率、少なくとも約６０％のΔ６－エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡへの転換
効率、約５０％から約９５％の間のΔ５－エロンガーゼによるオレイン酸からＤＰＡへの
転換効率、少なくとも約１０％のオレイン酸からＤＰＡへの転換効率に基づく。最も好ま
しくは、少なくとも８１％のＤＰＡはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のｓｎ－１位ま
たはｓｎ－３位でエステル化されている。

【0024】

上記第２の態様の別の好ましい実施形態では脂質またはオイル、好ましくは、種子オイ
ル、より好ましくは、ＤＰＡを含むアブラナ属の種子オイルまたはカメリナサティバの種
子オイルは、以下の特徴を有する：脂質またはオイルの総脂肪酸含有量において、パルミ
チン酸レベルは、約２％から約１６％の間であり、ミリスチン酸レベルは、１％未満であ
り、オレイン酸レベルは、約１％から約３０％の間であり、ＬＡレベルは、約４％から３
５％の間であり、ＡＬＡは存在し、抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベ
ルは、約４％から約２５％の間であり、抽出脂質の脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：
総ω３脂肪酸の比は、０．０５から約３．０の間であり、脂質のトリアシルグリセロール
（ＴＡＧ）含有率は、少なくとも約７０％であり、場合により、脂質は、トリ－ＤＰＡ
ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１５）を含んでもよく、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態
でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡは、該ＴＡＧのｓｎ－２位でエステル化さ
れている。より好ましくは、脂質またはオイル、好ましくは、種子オイルは、加えて、次
の特徴の１つ以上または全てを有する：ＡＬＡは総脂肪酸含有物の４％から４０％の間の
レベルで存在し、ＧＬＡは存在し、及び／またはＧＬＡのレベルは総脂肪酸含有物の４％
未満であり、ＳＤＡレベルは、０．０５％から約１０％の間であり、ＥＴＡレベルは約４
％未満であり、ＥＰＡレベルは０．０５％から約１０％の間であり、該抽出脂質の総脂肪
酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは約４％から約３５％の間であり、該抽出
脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは約２０％から約７５％の間
であり、該抽出脂質の脂肪酸含有物中の新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は約０．０３か
ら約３．０の間、好ましくは、約０．５０未満であり、該脂質の脂肪酸組成は：少なくと
も約６０％のΔ１２－デサチュラーゼによるオレイン酸からＬＡへの転換効率、少なくと
も約６０％のΔ６－エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡへの転換効率、約５０％から約
９５％の間のΔ５－エロンガーゼによるＥＰＡからＤＰＡへの転換効率、少なくとも約１
０％のオレイン酸からＤＰＡへの転換効率に基づく。

【0025】

本発明の抽出脂質またはオイルに関連して、ある実施形態では、該抽出脂質またはオイ
ル中のＤＰＡのレベルは、抽出前の植物部分または微生物の脂質またはオイル中のＤＰＡ
のレベルから増加していない、または実質的に同じである。言い換えれば、他の抽出後の
脂肪酸と比較して、脂質またはオイル中のＤＰＡのレベルを増加させる処理はない。明白
であるようなとき、脂質またはオイルを、分取または他の方法により、その後に処理して
、脂肪酸組成を変化させてもよい。

【0026】

別の好ましい実施形態では、脂質またはオイル、好ましくは、種子オイル、より好まし
くは、カラシ油またはキャノーラオイルまたはカメリナサティバの種子オイルなどのアブ
ラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種子オイルは、以下の特徴を有する：脂質またはオイルの総脂
肪酸含有量におけるＤＰＡレベルは、約７％から３５％の間であり、パルミチン酸レベル
は、約２％から約１６％の間であり、ミリスチン酸レベルは、約６％未満、好ましくは１
％未満であり、オレイン酸レベルは、約１％から約３０％の間であり、ＬＡレベルは、約
４％から約３５％の間であり、ＡＬＡは存在し、ＳＤＡレベルは、約０．０５％から約１
０％の間であり、ＥＴＡレベルは、約６％未満であり、ＥＰＡレベルは、約０．０５％か
ら約１０％の間である。ＤＨＡは、脂質またはオイル中で検出され、好ましくは、脂質ま
たはオイル中で検出されない。好ましくは、ＤＨＡは、もし存在するならば、脂質または
オイルの総脂肪酸含有量の２％未満のレベル、または０．５％未満のレベルで存在し、よ
り好ましくは、該脂質またはオイルの総脂肪酸含有物中に存在しない。場合により、脂質
は、コレステロールを本質的に含まなくてもよく、及び／または脂質はトリ－ＤＰＡ Ｔ
ＡＧ（ＴＡＧ６６：１５）を含んでもよい。より好ましくは、脂質またはオイル、好まし
くは、種子オイルは、以下の特徴の１つ以上または全てをさらに有する：少なくとも７０
％のＤＰＡは、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のｓｎ－１位またはｓｎ－３位でエス
テル化されており、ＡＬＡは、総脂肪酸含有物の４％から４０％の間のレベルで存在し、
ＧＬＡは存在し、及び／またはＧＬＡレベルは、総脂肪酸含有物の４％未満であり、ＳＤ
Ａレベルは、０．０５％から約１０％の間であり、ＥＴＡレベルは、約４％未満であり、
ＥＰＡレベルは、０．０５％から約１０％の間であり、抽出脂質の総脂肪酸含有量におけ
る総一価不飽和脂肪酸レベルは、約４％から約３５％の間であり、抽出脂質の総脂肪酸含
有量における総多価不飽和脂肪酸レベルは、約２０％から約７５％の間であり、抽出脂質
の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、約０．０３から約３．０
の間、好ましくは、約０．５０未満であり、脂質の脂肪酸組成は：少なくとも約６０％の
Δ１２－デサチュラーゼによるオレイン酸からＬＡへの転換効率、少なくとも約６０％の
Δ６－エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡへの転換効率、約５０％から約９５％の間の
Δ５－エロンガーゼによるＥＰＡからＤＰＡへの転換効率、少なくとも約１０％のオレイ
ン酸からＤＰＡへの転換効率に基づく。実施形態では、少なくとも８１％のＤＰＡはトリ
アシルグリセロール（ＴＡＧ）のｓｎ－１位またはｓｎ－３位でエステル化されている。
あるいは、ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも３５％は、該ＴＡＧのｓ
ｎ－２位でエステル化されている。

【0027】

さらなる実施形態では、本発明の抽出脂質は、１つ以上のステロール類、好ましくは、
植物ステロール類をさらに含む。

【0028】

別の実施形態では、抽出脂質はオイルの形態であり、オイル１ｇ当たり約１０ｍｇ未満
のステロール類、オイル１ｇ当たり約７ｍｇ未満のステロール類、オイル１ｇ当たり約１
．５ｍｇから約１０ｍｇの間のステロール類、またはオイル１ｇ当たり約１．５ｍｇから
約７ｍｇの間のステロール類を含む。

【0029】

抽出脂質中のあり得るステロール類の例としては、必ずしも限定されないが、１つ以上
または全てのカンプエステロール／２４－メチルコレステロール、Δ５－スチグマステロ
ール、エブリコール、β－シトステロール／２４－エチルコレステロール、Δ５－アベナ
ステロール／イソフコステロール、Δ７－スチグマステロール／スチグマスト－７－エン
－３β－オール、及びΔ７－アベナステロールが挙げられる。

【0030】

実施形態では、植物種は、セイヨウアブラナなど、表１１にリストしたものであり、ス
テロール類のレベルは、その特定の植物種について、表１１にリストしたものとほぼ同じ
である。該植物種は、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅ
ａ）またはカンナビス・サティバ（Ｃ．ｓａｔｉｖａ）であってよく、それぞれ、野生型
のカラシナセイヨウアブラナ、カラシナまたはカンナビス・サティバ抽出オイル中に見ら
れる辺りのステロール類のレベルを含む。

【0031】

実施形態では、抽出植物脂質は、１つ以上まては全てのカンペステロール／２４－メチ
ルコレステロール、Δ５－スチグマステロール、エブリコール、β－シトステロール／２
４－エチルコレステロール、Δ５－アベナステロール／イソフコステロール、Δ７－スチ
グマステロール／スチグマスト－７－エン－３β－オール、及びΔ７－アベナステロール
を含む、または野生型キャノーラオイルと本質的に同じステロール含有率を有する。

【0032】

実施形態では、抽出脂質は、野生型キャノーラオイル、カラシナオイルまたはカンナビ
ス・サティバオイルと本質的に同じステロール含有率を有する。

【0033】

実施形態では、抽出脂質は、オイル１ｇ当たり約０．５ｍｇ未満のコレステロール、オ
イル１ｇ当たり約０．２５ｍｇ未満のコレステロール、オイル１ｇ当たり約０ｍｇから約
０．５ｍｇの間のコレステロール、またはオイル１ｇ当たり約０ｍｇから約０．２５ｍｇ
の間のコレステロールを含む、またはコレステロールを本質的に含まない。

【0034】

さらなる実施形態では、脂質はオイル、好ましくは、 油料種子のオイルである。かか
るオイルの例としては、これに限定されないが、例えば、キャノーラオイルもしくはカラ
シナオイルなどのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）オイル、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐ
ｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）オイル、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）
オイル、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．）オイル、ベニバナ（Ｃａｒｔ
ｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）オイル、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）オイル
、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）オイル、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ）オイル、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）オイル、モ
ロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）オイル、エンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖ
ａ）オイル、トリフォリウム属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐ．）オイル、ギニアアブラヤ
シ（Ｅｌａｅｓｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）オイル、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉ
ａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）オイル、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ
）オイル、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）オイル、
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）オイル、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒ
ｉｍａ）オイル、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）オイル、クラン
ベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）オイル、ジャイアントミスカンサ
ス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）オイル、またはススキ（Ｍｉｓｃ
ａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）オイルが挙げられる。より好ましくは、オイルは、ア
ブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）オイル、カメリナ・サティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ
ｓａｔｉｖａ）オイルまたはグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（ダイズ）
オイルである。実施形態では、脂質は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕ
ｓ）オイルまたはカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）オイルなどのアブラナ属
（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）オイル、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）
オイル、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）オイル、ヘリアンタス属（Ｈ
ｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．）オイル、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒ
ｉｕｓ）オイル、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）オイル、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍ
ａｙｓ）オイル、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）オイル、ベ
ンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）オイル、アオバナル
ーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）オイル、カメリナサティバ（Ｃ
ａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）オイル、クランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓ
ｓｉｎｉｃａ）オイル、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇ
ａｎｔｅｕｓ）オイル、またはススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）オイ
ルを含むまたはである。さらなる実施形態では、該オイルは、キャノーラオイル、カラシ
ナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）オイル、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）オイル、カメリナサ
ティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）オイルまたはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）オイルである。別の実施形態では、該オイルは、シロイ
ヌナズナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）オイル及び／またはカメリナサティバ（Ｃ． ｓａ
ｔｉｖａ）オイル以外の植物オイルである。実施形態では、植物オイルは、Ｇ．ｍａｘ（
ダイズ）オイル以外のオイルである。実施形態では、該オイルを、例えば、実施例１に記
載の標準条件下に生育した植物から、または標準条件下、畑または温室で生育した植物か
ら得た。

【0035】

さらなる態様では、本発明は、
ｉ）脂質を含む植物部分、好ましくは脂質を含むアブラナ属の種子もしくはカメリナサ
ティバの種子、または微生物細胞を得る工程であって、該脂質がエステル化された形態の
脂肪酸を含み、該脂肪酸がオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂
肪酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）
を含み、場合により、１つ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（Ｅ
ＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含んでもよく、該植物部分または微生物
部分の該脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが約７％から３５％の間である工
程、及び
ｉｉ）該植物部分または微生物細胞から脂質を抽出する工程であって、該抽出脂質の総
脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが約７％から３５％の間である工程、
を含む、抽出植物脂質または微生物脂質の産生方法を提供する。ある実施形態では、該抽
出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、約７％から２０％の間または２０．
１％から３５％の間である。ある実施形態では、ＤＰＡのレベルは、７％から２０％の間
、または２０．１％から３０％の間、好ましくは、２０．１％から３５％の間、より好ま
しくは、３０％から３５％の間である。ある実施形態では、該抽出脂質の総脂肪酸含有量
におけるＤＰＡのレベルが、８％から２０％の間、または１０％から２０％の間、より好
ましくは１１％から２０％の間、または１２％から２０％の間である。

【0036】

上記態様の実施形態では、本発明は、
ｉ）脂質を含む植物部分、好ましくはアブラナ属の種子もしくはカメリナサティバの種
子、または微生物細胞を得る工程であって、該脂質がエステル化された形態の脂肪酸を含
み、該脂質は、がオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α
－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、並びにス
テアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸
（ＥＴＡ）のうち１つ以上を含む脂肪酸組成を有し、（ｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量
におけるＤＰＡレベルが７％から３０％の間または７％から３５％の間、好ましくは３０
％から３５％の間であり、（ｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸レ
ベルが２％から１６％の間であり、（ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリ
スチン酸（Ｃ１４：０）レベルが６％未満、好ましくは１％未満であり、（ｉｖ）該抽出
脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸レベルが１％から３０％の間であり、（ｖ）該
抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸（ＬＡ）レベルが４％から３５％の間であ
り、（ｖｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα－リノレン酸（ＡＬＡ）が４％から
４０％の間であり、（ｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸
（ＥＴｒＡ）レベルが４％未満であり、（ｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけ
る総飽和脂肪酸レベルが４％から２５％の間であり、（ｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有
量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比が０．０５から１の間であり、（ｘ）該脂質
のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率が少なくとも７０％であり、及（ｘｉ）びＴ
ＡＧの形態でエステル化された少なくとも７０％のＤＰＡが該ＴＡＧのｓｎ－１位または
ｓｎ－３位である、並びに
ｉｉ）該植物部分から脂質を抽出する工程
を含み、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが約７％から３０％の間ま
たは７％から３５％の間、好ましくは、３０％から３５％の間である、抽出植物脂質また
は微生物脂質の産生方法を提供する。好ましくは、ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰ
Ａの少なくとも８１％または少なくとも９０％は、該ＴＡＧのｓｎ－１位またはｓｎ－３
位である。

【0037】

別の態様では、本発明は、
ｉ）脂質を含む細胞、好ましくは、脂質を含む細胞を含む植物部分または微生物細胞、
より好ましくはアブラナ属の種子またはカメリナサティバの種子を得る工程であって、該
脂質は、エステル化された形態の脂肪酸を含み、該脂肪酸は、ドコサペンタエン酸（ＤＰ
Ａ）を含み、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化された少なくとも３
５％のＤＰＡは、該ＴＡＧのｓｎ－２位でエステル化されており、及び
ｉｉ）該細胞から脂質を抽出する工程
を含み、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態
でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡは、該ＴＡＧのｓｎ－２位でエステル化さ
れている、抽出脂質の産生方法を提供する。実施形態では、該方法により産生された抽出
脂質は、（ｉ）オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－
リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸の１つ以上または全てを含み、場合により、ステ
アリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（
ＥＴＡ）の１つ以上を含んでもよいこと、（ｉｉ）少なくとも約４０％、少なくとも約４
５％、少なくとも約４８％、３５％から約６０％の間、または３５％から約５０％の間の
トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されたＤＰＡが該ＴＡＧのｓｎ－
２位でエステル化されていること、及び（ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における
ＤＰＡのレベルが約１％から３５％の間、または約７％から３５％の間または約２０．１
％から３５％の間であることの１つ以上または全てにより、さらに特徴付けられる。本態
様の実施形態では、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルは、約７％、約
８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２２％、約２４
％、約２６％、約２８％、約３０％、約７％から約２８％の間、約７％から約２５％の間
、約１０％から約３５％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間、
約１０％から約２２％の間、約１４％から約３５％の間、約１６％から約３５％の間、約
１６％から約３０％の間、約１６％から約２５％の間、または約１６％から約２２％の間
である。好ましい実施形態では、該抽出脂質は、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉ
ｉ）または（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、より好ましくは、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）
の全てにより特徴付けられる。好ましくは、該抽出脂質は、約２％から１６％の間である
該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸レベル、及び、もし存在する場合、１
％未満である該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）レベルに
より、さらに特徴付けられる。

【0038】

上記態様の実施形態では、本発明は、
ｉ）脂質を含む細胞、好ましくは、脂質を含む、細胞を含む植物部分または微生物細胞
、より好ましくは、アブラナ属の種子またはカメリナサティバの種子を得る工程であって
、該脂質がエステル化された形態の脂肪酸を含み、該脂肪酸は、ドコサペンタエン酸（Ｄ
ＰＡ）を含み、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－
リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、並びにステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペ
ンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のうち１つ以上をさらに含
み、（ｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸レベルが２％から１６％の
間であり、（ｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）レ
ベルが１％未満であり、（ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸レベ
ルが１％から３０％の間であり、（ｉｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール
酸（ＬＡ）レベルが４％から３５％の間であり、（ｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量にお
けるα－リノレン酸（ＡＬＡ）が４％から４０％の間であり、（ｖｉ）該抽出脂質の総脂
肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）レベルが４％未満であり、（ｖｉｉ
）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルが４％から２５％の間であり
、（ｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比が
０．０５から１の間であり、（ｉｘ）該脂質のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率
が少なくとも７０％であり、及び（ｘ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエス
テル化された少なくとも３５％のＤＰＡが該ＴＡＧのｓｎ－２位でエステル化されている
、並びに
ｉｉ）該植物部分から脂質を抽出する工程
を含み、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態
でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡは、該ＴＡＧのｓｎ－２位でエステル化さ
れている、抽出脂質の産生方法を提供する。

【0039】

植物部分または微生物細胞を得る工程は、該植物部分を産生する植物から植物部分、好
ましくは種子を収穫すること、かかる細胞の培養液から微生物細胞を回収すること、また
は製造業者もしくは供給業者から購入、または輸入により該植物部分もしくは微生物細胞
を得ることを含んでもよい。方法は、植物部分もしくは微生物細胞試料中の脂質、または
抽出脂質の脂肪酸組成を決定する工程を含んでもよい。

【0040】

好ましい実施形態では、本発明の方法により得られた抽出脂質は、該当する場合、本明
細書で定義した通り、例えば、最初の２つの態様に関連した上記定義した通りの１つ以上
の特徴を有する。

【0041】

本発明の上記の態様の実施形態を、以下、さらに詳細に説明する。当業者が理解するよ
うに、上記態様の対応する特徴より広範である、いかなる記載される実施形態もその態様
に適用しない。

【0042】

実施形態では、植物部分は種子、好ましくは油料種子である。かかる種子の例としては
、これに限定されないが、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、ワタ（Ｇｏｓｓｙ
ｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ヘ
リアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉ
ｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａ
ｙｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、モロコシ（Ｓ
ｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、エン
バク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、トリフォリウム属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐ．）
、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎ
ｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａ
ｒｅ）、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）、イネ（Ｏ
ｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、カメ
リナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）、またはクランベアビシニカ（Ｃｒａ
ｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）、好ましくは、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．
）の種子、カメリナサティバ（Ｃ． ｓａｔｉｖａ）の種子またはＧ．ｍａｘ（ダイズ）
の種子、より好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシ
ナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃ． ｓａｔｉｖａ）の種子が挙げ
られる。実施形態では、植物部分は、種子、好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓ
ｉｃａ ｎａｐｕｓ）またはカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）などのアブラ
ナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、
アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈ
ｕｓ ｓｐ．）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ダイズ（Ｇ
ｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌ
ａｅｓｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎ
ｔｈａｍｉａｎａ）、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ
）、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）、またはクランベアビシニカ
（Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）、好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓ
ｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃ．
ｓａｔｉｖａ）の種子などの油料種子である。実施形態では、種子は、キャノーラ種子
、カラシナ種子、ダイズ種子、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）種
子またはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）種子である。代
替の実施形態では、該種子は、シロイヌナズナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）の種子及び／
またはカメリナサティバ（Ｃ． ｓａｔｉｖａ）の種子以外の種子である。実施形態では
、種子は、ダイズの種子以外の種子である。実施形態では、植物部分は、アブラナ属（Ｂ
ｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）種子である。植物部分は、好ましくは、アブラナ属の種子また
はカメリナサティバの種子である。実施形態では、該種子を、例えば、実施例１に記載の
標準条件下に生育した植物から、または標準条件下、畑または温室で生育した植物から得
た。

【0043】

別の実施形態では、種子は、種子１ｇ当たり、少なくとも約１８ｍｇ、少なくとも約２
２ｍｇ、少なくとも約２６ｍｇ、約１８ｍｇから約１００ｍｇの間、約２２ｍｇから約７
０ｍｇの間、約８０ｍｇ、約３０ｍｇから約８０ｍｇの間、または約２４ｍｇから約５０
ｍｇの間のＤＰＡを含む。

【0044】

さらなる実施形態では、種子などの植物部分は、酵素の以下のセット；
ｉ）ω３－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エ
ロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６
－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ
６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュ
ラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－
エロンガーゼ、
ｖ）ω３－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エ
ロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９
－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ
９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサ
チュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ
５－エロンガーゼ、
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、該植物部分
の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動
可能に結合している。

【0045】

さらなる実施形態では、種子などの植物部分または微生物細胞などの組換え細胞は、酵
素の以下のセット；
ｉ）ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラー
ゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６
－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチ
ュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５
－エロンガーゼ、
ｉｖ）ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラ
ーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－
エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュ
ラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－
エロンガーゼ
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、該植物部分
または細胞の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモー
ターと作動可能に結合している。

【0046】

実施形態では、もし、植物部分または細胞がエステル化された形態の脂肪酸を含む脂質
を含み、該脂肪酸がドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、トリアシルグリセロール（Ｔ
ＡＧ）の形態でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡ及び／またはＤＨＡ（もし存
在する場合）が該ＴＡＧのｓｎ－２位でエステル化されているならば、種子などの植物部
分または微生物細胞などの組換え細胞は、１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシル
トランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、該ポリ
ヌクレオチドは、該植物部分の細胞もしくは細胞中のポリヌクレオチドの発現を誘導可能
である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合している。さらなる実施形態では、該細
胞は、酵素の以下のセット；
ｉ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
、ω３－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロン
ガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ
）、Δ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エ
ロンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉｉ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡ
Ｔ）、Δ１２－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－
エロンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｖ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ
）、Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラー
ゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロ
ンガーゼ、
ｖ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
、ω３－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロン
ガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ
）、Δ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エ
ロンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡ
Ｔ）、Δ１２－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－
エロンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡ
ＡＴ）、Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュ
ラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ、及びΔ５
－エロンガーゼ、
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、該細胞内の
前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合
している。好ましくは、ＬＰＡＡＴは、ＤＰＡ－ＣｏＡなどのＣ２２多価不飽和脂肪アシ
ル－ＣｏＡ基質を使用できる。

【0047】

好ましくは、植物部分、もしくはたとえば種子などのその一部、または微生物細胞は、
Δ４－デサチュラーゼをコードするポリヌクレオチドを有しておらず、またはΔ４－デサ
チュラーゼポリペプチドを有していない。

【0048】

実施形態では、Δ１２‐デサチュラーゼは、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５
－デサチュラーゼ活性も有する、すなわち、該活性は、１つのポリペプチドにより与えら
れる。あるいは、Δ１２‐デサチュラーゼは、ω３－デサチュラーゼ活性を有さず、かつ
Δ１５－デサチュラーゼ活性を有さない、すなわち、Δ１２‐デサチュラーゼは、ω３－
デサチュラーゼ活性及び／またはΔ１５－デサチュラーゼを有するポリペプチドと別のポ
リペプチドである。

【0049】

さらなる実施形態では、種子などの植物部分または微生物細胞などの組換え細胞は、以
下の特徴；
ｉ）Δ１２‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくと
も約８０％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約９０％の間、または約７５％か
ら約８５％の間の効率で、１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、
オレイン酸をリノール酸に転換すること、
ｉｉ）ω３‐デサチュラーゼが、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくと
も約８５％、約６５％から約９５％の間、約７５％から約９１％の間、または約８０％か
ら約９１％の間の効率で、１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、
ω６脂肪酸をω３脂肪酸に転換すること、
ｉｉｉ）Δ６‐デサチュラーゼが、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なく
とも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０
％から約７０％の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間の効
率で、１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ＡＬＡをＳＤＡに転
換すること、
ｉｖ）Δ６‐デサチュラーゼが、約５％未満、約２．５％未満、約１％未満、約０．１
％から約５％の間、約０．５％から約２．５％の間、または約０．５％から約１％の間の
効率で、１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、リノール酸をγ‐
リノレン酸に転換すること、
ｖ）Δ６‐エロンガーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約
７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８０％の間、または約７５％から約
８０％の間の効率で、１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ＳＤ
ＡをＥＴＡに転換すること、
ｖｉ）Δ５‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくと
も約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約６０％から約９５％の間、約
７０％から約９５％の間、または約７５％から約９５％の間の効率で、１つ以上の該植物
部分の細胞内または組換え細胞内において、ＥＴＡをＥＰＡに転換すること、
ｖｉｉ）Δ５‐エロンガーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくと
も約９０％、約５０％から約９０％の間、または約８５％から約９５％の間の効率で、１
つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ＥＰＡをＤＰＡに転換するこ
と、
ｉｘ）１つ以上の該植物部分の細胞または組換え細胞内において、オレイン酸をＤＰＡ
に転換する効率が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少
なくとも約２５％、約２０％、約２５％、約３０％、約１０％から約５０％の間、約１０
％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間、または約２０％から約３０％の
間であること、
ｘ）１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ＬＡをＤＰＡに転換
する効率が、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくと
も約２５％、少なくとも約３０％、約２５％、約３０％、約３５％、約１５％から約５０
％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間であること、
ｘｉ）１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ＡＬＡをＤＰＡに
転換する効率が、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、少な
くとも約３０％、約３０％、約３５％、約４０％、約１７％から約５５％の間、約２２％
から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間であること、
ｘｉ）１つ以上の該植物部分の細胞または組換え細胞は、該外来性ポリヌクレオチドを
含まない対応細胞より、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、約２５％から約４０
％の間、または約２７．５％から約３７．５％の間で多いω３脂肪酸を含むこと、
ｘｉｉ）Δ６－デサチュラーゼは、リノール酸（ＬＡ）と比較してα－リノレン酸（Ａ
ＬＡ）を優先的に不飽和化すること、
ｘｉｉｉ）Δ６－エロンガーゼは、Δ９－エロンガーゼ活性も有すること、
ｘｉｖ）Δ１２－デサチュラーゼは、Δ１５－デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖ）Δ６－デサチュラーゼは、Δ８－デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖｉ）Δ８－デサチュラーゼは、Δ６－デサチュラーゼ活性も有する、またはΔ６－
デサチュラーゼ活性を有しないこと、
ｘｖｉｉ）Δ１５－デサチュラーゼは、ＧＬＡに対するω３－デサチュラーゼ活性も有
すること、
ｘｖｉｉｉ）ω３－デサチュラーゼは、ＬＡに対するΔ１５－デサチュラーゼ活性も有
すること、
ｘｉｘ）ω３－デサチュラーゼは、ＬＡ及び／またはＧＬＡの両方を不飽和化すること
、
ｘｘ）ω３－デサチュラーゼは、ＬＡと比較してＧＬＡを優先的に不飽和化すること、
ｘｘｉ）１つ以上または全てのデサチュラーゼ、好ましくはΔ６－デサチュラーゼ及び
／またはΔ５－デサチュラーゼは、対応するアシル‐ＰＣ基質より、アシル－ＣｏＡ基質
に対して高い活性を有すること、
ｘｘｉｉ）Δ６－デサチュラーゼは、脂肪酸基質として、ＬＡより、ＡＬＡに対して高
いΔ６－デサチュラーゼ活性を有すること、
ｘｘｉｉｉ）Δ６－デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ－２位と結合し
たＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ－ＣｏＡに対して高いΔ６－デサチュ
ラーゼ活性を有すること、
ｘｘｉｖ）Δ６－デサチュラーゼは、ＬＡと比較して、基質としてのＡＬＡに対して、
少なくとも約２倍高いΔ６－デサチュラーゼ活性、少なくとも３倍高い活性、少なくとも
４倍高い活性、または少なくとも５倍高い活性を有すること、
ｘｘｖ）Δ６－デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのｓｎ－２位と結合したＡ
ＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ－ＣｏＡに対して高い活性を有すること、
ｘｘｖｉ）Δ６－デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのｓｎ－２位に結合した
ＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ－ＣｏＡに対して、少なくとも約５倍高
いΔ６‐デサチュラーゼ活性または少なくとも１０倍高い活性を有すること、
ｘｘｖｉｉ）デサチュラーゼは、フロントエンドデサチュラーゼであること、及び
ｘｘｖｉｉｉ）Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡに対する検出可能なΔ５‐デサチュラ
ーゼ活性を有しないこと
の１つ以上または全てを有する。

【0050】

さらなる実施形態では、種子、好ましくはアブラナ属の種子またはカメリナサティバの
種子などの植物部分または微生物細胞などの組換え細胞は、以下の特徴の１つ以上または
全てを有する。
ｉ）Δ１２－デサチュラーゼは、配列番号４で提供される配列を有するアミノ酸、その
生物活性なフラグメント、または配列番号４と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含
むこと、
ｉｉ）ω３－デサチュラーゼは、配列番号６で提供される配列を有するアミノ酸、その
生物活性なフラグメント、または配列番号６と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含
むこと、
ｉｉｉ）Δ６－デサチュラーゼは、配列番号９で提供される配列を有するアミノ酸、そ
の生物活性なフラグメント、または配列番号９と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を
含むこと、
ｉｖ）Δ６－エロンガーゼは、配列番号１６で提供される配列を有するアミノ酸、配列
番号１７などのその生物活性なフラグメント、または配列番号１６及び／または配列番号
１７と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含むこと、
ｖ）Δ５－デサチュラーゼは、配列番号２０で提供される配列を有するアミノ酸、その
生物活性なフラグメント、または配列番号２０と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を
含むこと、及び、
ｖｉ）Δ５－エロンガーゼは、配列番号２５で提供される配列を有するアミノ酸、その
生物活性なフラグメント、または配列番号２５と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を
含むこと。

【0051】

実施形態では、種子などの植物部分または微生物細胞などの組換え細胞は、ジアシルグ
リセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、モノアシルグリセロールアシルトラ
ンスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｇ
ＰＡＴ）、１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡ
Ｔ）、好ましくは、ＤＰＡ－ＣｏＡなどのＣ２２多価不飽和脂肪アシル－ＣｏＡ基質を使
用できるＬＰＡＡＴ、アシル－ＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラ
ーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスホリパーゼＡ_２（ＰＬＡ_２）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、
ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、ＣＤＰ－コリンジアシルグリセロールコリンホスホトラン
スフェラーゼ（ＣＰＴ）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールアシルトランスフ
ェラーゼ（ＰＤＡＴ）、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトラ
ンスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、アシル－ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、またはその２つ以
上の組合せをコードする外来性ポリヌクレオチドをさらに含む。

【0052】

別の実施形態では、種子などの植物部分または微生物細胞などの組換え細胞は、ＦＡＥ
１、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ、ＰＬＡ_２、ＰＬＣ、ＰＬ
Ｄ、ＣＰＴ、ＰＤＡＴ、ＦＡＴＢなどのチオエステラーゼ、もしくはΔ１２－デサチュラ
ーゼ、またはその２つ以上の組合せから選択される植物部分細胞内の内在性酵素の産生及
び／または活性をダウンレギュレートする導入変異体または外来性ポリヌクレオチドをさ
らに含む

【0053】

さらなる実施形態では、少なくとも１つ、または好ましくは全てのプロモーターは、種
子特異的プロモーターである。実施形態では、少なくとも１つ、または全てのプロモータ
ーを、オイル生合成もしくはオレオシンをコードする遺伝子などの集積遺伝子、またはコ
ンリニンをコードする遺伝子などの種子貯蔵タンパク質遺伝子から得た。

【0054】

別の実施形態では、Δ５－エロンガーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドの発現を
誘導するプロモーターは、該プロモーターがΔ１２－デサチュラーゼ及びω３－デサチュ
ラーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドの発現を誘導する前の微生物細胞などの植物
もしくは組換え細胞の発育種子内のポリヌクレオチドの発現を開始、または発現をピーク
にする。

【0055】

さらなる実施形態では、外来性ポリヌクレオチドは、植物部分の細胞または微生物細胞
などの組換え細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡ分子、好ましくは、Ｔ－ＤＮＡ分子内に
共有結合しており、好ましくは、植物部分の細胞または組換え細胞のゲノムに組み込まれ
たかかるＤＮＡ分子数が、１以下、２もしくは３以下であり、または２もしくは３である
場合である。

【0056】

さらに別の実施形態では、植物部分は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有するΔ６－
デサチュラーゼを各々コードする少なくとも２つの異なる外来性ポリヌクレオチドを含む
。

【0057】

さらなる実施形態では、外来性ポリヌクレオチドを含む植物部分の総オイル含有率は、
該外来性ポリヌクレオチドを含まない対応する植物部分の総オイル含有率の少なくとも約
４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約５０％から
約８０％の間、または約８０％から約１００％の間である。さらなる実施形態では、外来
性ポリヌクレオチドを含む種子は、該外来性ポリヌクレオチドを含まない対応する種子重
量の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０
％、約５０％から約８０％の間、または約８０％から約１００％の間である。

【0058】

別の実施形態では、脂質は、オイルの形態であり、好ましくは、油料種子の種子オイル
であり、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９８重量％、
または約９５重量％から約９８重量％の間の脂質はトリアシルグリセロール類である。

【0059】

さらなる実施形態では、方法は、総脂肪酸含有率パーセントとして、ＤＰＡのレベルを
増加するように脂質を処理することを含む。例えば、該処理は、遊離脂肪酸を生成するた
めのエステル化脂肪酸の加水分解、またはエステル交換反応を含む。例えば、キャノーラ
オイルなどの脂質を、該オイル中の脂肪酸を、メチルまたはエチルエステルなどのアルキ
ルエステルに転換してもよく、それから、ＤＰＡの脂質またはオイルが豊富になるように
分取してもよい。実施形態では、かかる処理後の脂質の脂肪酸組成は、少なくとも４０％
、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または
少なくとも９０％ＤＰＡを含む。ある実施形態では、処理後の総脂肪酸含有量におけるＤ
ＨＡレベルは、２．０％未満または０．５％未満であり、好ましくは、該脂質中に検出さ
れない。

【0060】

脂質、またはたとえば遊離脂肪酸もしくはアルキルエステルなどの脂質を含むオイルも
提供され、本発明の方法を用いて産生される。

【0061】

別の態様では、本発明は、多価不飽和脂肪酸のメチルまたはエチルエステルを産生する
方法を提供し、該方法は、抽出植物脂質中、または抽出過程中に、トリアシルグリセロー
ル類を、それぞれ、メタノールまたはエタノールと反応させることを含み、該抽出植物脂
質は、ＴＡＧの形態でエステル化された脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミ
チン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂
肪酸、及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合により、ステアリドン酸（ＳＤＡ
）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のうち１つ
以上を含んでもよく、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡレベルは約７％から３
５％の間、好ましくは２０．１％から３０％の間、または、２０．１％から３５％の間で
あり、それにより、多価不飽和脂肪酸のメチルまたはエチルエステルを産生する。

【0062】

別の態様では、本発明は、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）のメチルまたはエチルエステ
ルの産生方法を提供し、該方法は、それぞれ、メタノールまたはエタノールと抽出植物脂
質中、または抽出処理中にトリアシルグリセロール類（ＴＡＧ）を反応させることを含み
、該抽出植物脂質はエステル化された形態の脂肪酸を含み、該脂肪酸はドコサペンタエン
酸（ＤＰＡ）を含み、ＴＡＧの形態でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡは該Ｔ
ＡＧのｓｎ－２位でエステル化されており、それにより、多価不飽和脂肪酸のメチルまた
はエチルエステルを産生する

【0063】

好ましい実施形態では、上記２つの態様の方法で使用される脂質は、本発明の抽出脂質
またはオイルに関連して、本明細書で定義された１つ以上の特徴を有する。

【0064】

別の態様では、本発明は、
ａ）エステル化された形態の脂肪酸を含む脂質、及び
ｂ）酵素の以下のセット；
ｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュ
ラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－
エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチ
ュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５
－エロンガーゼ
ｉｉｉ）ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチ
ュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、または
ｉｖ）ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュ
ラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチド
を含み、
各ポリヌクレオチドが、前記植物の発育種子中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可
能である１つ以上の種子特異的プロモーター、または前記微生物細胞中の前記ポリヌクレ
オチドの発現を誘導可能である１つ以上の種子特異的プロモーターと作動可能に結合され
ており、前記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪
酸、及び場合により、γ－リノレン酸（ＧＬＡ）、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３
脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合に
よっては、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及び／またはエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ
）を含んでもよく、及び前記種子または微生物細胞の脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰ
Ａのレベルが７％から３５％の間である、
油料種子植物、もしくは種子などのその部分、好ましくはその種子中に脂質を含むアブラ
ナ属植物またはカメリナサティバ植物、または微生物細胞を提供する。本態様の好ましい
実施形態では、ＤＨＡは、種子及び抽出脂質の脂質の総脂肪酸含有物の２％未満、または
０．５％未満のレベルで存在し、より好ましくは、脂質の総脂肪酸含有物中に検出されな
い。

【0065】

別の態様では、本発明は、
ａ）エステル化された形態の脂肪酸であって、該脂肪酸は、ドコサペンタエン酸（ＤＰ
Ａ）を含み、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化された少なくとも３
５％のＤＰＡは、該ＴＡＧのｓｎ－２位でエステル化されている該脂肪酸、及び
ｂ）酵素の以下のセットのうち１つをコードする外来性ポリヌクレオチド；
ｉ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ
）、ω３－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロ
ンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡ
Ｔ）、Δ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－
エロンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉｉ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡ
ＡＴ）、Δ１２－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６
－エロンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｖ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡ
Ｔ）、Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラ
ーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エ
ロンガーゼ、
ｖ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ
）、ω３－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロ
ンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡ
Ｔ）、Δ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－
エロンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡ
ＡＴ）、Δ１２－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９
－エロンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰ
ＡＡＴ）、Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチ
ュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ、及びΔ
５－エロンガーゼ、
を含む細胞、好ましくは、油料種子植物などの植物中もしくはそれからの細胞または種
子などのその部分、または好ましくはアブラナ属植物もしくはカメリナサティバ植物とい
った油料植物もしくはその部分、または微生物細胞を提供し、各ポリヌクレオチドが、該
細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可
能に結合している。好ましくは、ＬＰＡＡＴは、ＤＰＡ－ＣｏＡなどのＣ２２多価不飽和
脂肪アシル－ＣｏＡ基質を使用でき、抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベル
は、約１％から３５％の間、または、約７％から３５％の間、または約２０．１％から３
５％の間である。実施形態では、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化
された、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４８％、３５％から約
６０％の間、または３５％から約５０％の間のＤＰＡは、ＴＡＧのｓｎ－２位でエステル
化されている。

【0066】

上記２つの態様の各々の好ましい実施形態では、Δ１５－デサチュラーゼは、真菌のΔ
１５－デサチュラーゼであり、ω３－デサチュラーゼは、真菌のω３－デサチュラーゼで
ある。

【0067】

好ましい実施形態では、本発明の油料植物、微生物細胞または細胞は、該当する場合、
本明細書で定義した、例えば、抽出植物脂質、抽出微生物脂質またはその産生方法に関連
した上記定義した通りの１つ以上の特徴を有する。

【0068】

油料種子植物の例としては、これに限定されないが、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ
ｓｐ．）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉ
ｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．）、ベニバナ
（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、
トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａ
ｌｉａｎａ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕ
ｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、エンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、トリフォリウム属（Ｔ
ｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐ．）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ
）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、オオムギ（
Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔ
ｉｆｏｌｉｕｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ ｇ
ｌａｂｅｒｒｉｍａ）、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）、または
クランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）が挙げられる。実施形態で
は、該植物は、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）植物、カメリナサティバ（Ｃ．
ｓａｔｉｖａ）植物またはグリシンマックス（Ｇ． ｍａｘ）（ダイズ）植物である。
実施形態では、該油料種子植物は、セイヨウアブラナ、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖ
ａ）またはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）植物である。
代替の実施形態では、該油料種子植物は、シロイヌナズナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）及
び／またはカメリナサティバ（Ｃ． ｓａｔｉｖａ）以外である。実施形態では、該油料
種子植物は、Ｇ．ｍａｘ（ダイズ）以外の植物である。該植物は、好ましくはアブラナ属
またはカメリナサティバである。実施形態では、油料種子植物は、例えば、実施例１に記
載したような標準条件で、畑にある、または畑で生育した、または温室で生育した。

【0069】

実施形態では、本発明の方法で使用される、または本発明の細胞もしくは植物もしくは
その植物部分に存在する１つ以上のデサチュラーゼは、アシル－ＣｏＡ基質を使用可能で
ある。好ましい実施形態では、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ及びΔ８－
デサチュラーゼは、もし存在するならば、アシル－ＣｏＡ基質を使用可能であり、好まし
くは、ｉ）Δ６－デサチュラーゼ、及びΔ５－デサチュラーゼまたはｉｉ）Δ５－デサチ
ュラーゼ、及びΔ８－デサチュラーゼの各々は、アシル－ＣｏＡ基質を使用可能である。
実施形態では、Δ１２－デサチュラーゼ及び／またはω３－デサチュラーゼは、アシル－
ＣｏＡ基質を使用可能である。該アシル－ＣｏＡ基質は、好ましくは、Δ６－デサチュラ
ーゼにはＡＬＡ－ＣｏＡ、Δ５－デサチュラーゼにはＥＴＡ－ＣｏＡ、そしてΔ８－デサ
チュラーゼにはＥＴｒＡ－ＣｏＡ、Δ１２－デサチュラーゼにはオレオイル－ＣｏＡ、ま
たはω３－デサチュラーゼにはＬＡ－ＣｏＡ、ＧＬＡ－ＣｏＡ、及びＡＲＡ－ＣｏＡのう
ち１つ以上である。

【0070】

実施形態では、植物の収穫された種子は、種子１グラム当たり少なくとも約２８ｍｇ、
好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約３２ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも
約３６ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは、種子１グラム
当たり少なくとも約４４ｍｇまたは少なくとも４８ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも
約８０ｍｇ、または種子１グラム当たり約３０ｍｇから約８０ｍｇの間のＤＰＡ含有量を
有する。

【0071】

さらなる態様では、本発明は、ＤＰＡを含む種子を産生可能であるセイヨウアブラナ（
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサテ
ィバ（Ｃ． ｓａｔｉｖａ）植物を提供し、該植物の成熟した収穫された種子が、種子１
グラム当たり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約３２
ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約３６ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約４０
ｍｇ、より好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約４４ｍｇまたは少なくとも４８
ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約８０ｍｇ、または種子１グラム当たり約３０ｍｇ
から約８０ｍｇの間のＤＰＡ含有量を有する。

【0072】

別の態様では、本発明は、本明細書で定義した外来性ポリヌクレオチドを含む本発明の
植物の植物細胞を提供する。

【0073】

以下の特徴：
ｉ）本発明の植物由来であること、
ｉｉ）本明細書で定義した脂質を含むこと、または
ｉｉｉ）本発明の方法で使用できること、のうちの１つ以上を有する植物部分、好まし
くは種子、または微生物細胞などの組換え細胞も提供される。

【0074】

さらに別の態様では、本発明は、ＤＰＡ及び約４重量％から約１５重量％の間、好まし
くは、約６重量％から約８重量％の間または約４重量％から約８重量％の間、より好まし
くは、約４重量％から約６重量％の水分を含む成熟して収穫されたセイヨウアブラナ（Ｂ
ｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティ
バ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）種子を提供し、該種子のＤＰＡ含有量が種子１グ
ラム当たり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約３２ｍ
ｇ、種子１グラム当たり少なくとも約３６ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約４０ｍ
ｇ、より好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約４４ｍｇまたは種子１グラム当た
り少なくとも約４８ｍｇ、種子１グラム当たり約８０ｍｇ、または種子１グラム当たり約
３０ｍｇから約８０ｍｇの間である。

【0075】

実施形態では、本発明の細胞、本発明の油料種子植物、本発明のセイヨウアブラナ（Ｂ
ｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティ
バ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、または本発明の種子を
、本明細書で定義した特徴の１つ以上または全てを含む抽出脂質を産生するために使用で
きる。

【0076】

その上、さらなる態様では、本発明は、本発明の抽出脂質を産生するために使用できる
植物または細胞の産生方法を提供し、該方法は、
ａ）複数の植物または微生物細胞などの組換え細胞からの種子などの１つ以上の植物部
分または微生物細胞などの組換え細胞により産生された脂質中のＤＰＡのレベルをアッセ
イすることであって、各植物または微生物細胞などの組換え細胞が、酵素の以下のセット
；
ｉ）ω３－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エ
ロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６
－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ
６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ
、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロン
ガーゼ、
ｖ）ω３－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エ
ロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９
－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ
９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラ
ーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エ
ロンガーゼ、
ｉｘ）ω３－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－
エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｘ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－
エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、または、
ｘｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６
－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
の１つをコードする１つ以上の外来性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドが、植物部分または組換え細胞の細胞内の該ポリヌクレオチドの発現
を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合する、該アッセイすること、
と
ｂ）１つ以上のその部分の本発明の抽出植物脂質または組換え細胞脂質の産生に使用で
きる複数の植物または組換え細胞から植物または組換え細胞を同定すること、と
ｃ）場合によっては、前記同定植物または組換え細胞、またはそれ由来の種子から後代
植物または組換え細胞を産生すること
とを含む。

【0077】

実施形態では、植物または組換え細胞は、本明細書で定義したＬＰＡＡＴをコードする
外来性ポリヌクレオチドをさらに含む。

【0078】

好ましくは、後代植物は、同定された植物から取り出された少なくとも第二または第三
世代であり、好ましくは、１つ以上のポリヌクレオチドにとってホモ接合である。より好
ましくは、該１つ以上のポリヌクレオチドは、１つの挿入遺伝子座のみにおいて、後代植
物中に存在する。すなわち、本発明は、複数の形質転換候補植物または種子から植物また
はその種子を同定するためのスクリーニング方法として使用できるような方法を提供し、
同定された植物またはその後代植物が好ましくはその種子内で、本発明の脂質を産生する
。かかる植物または後代植物またはその種子は、特に特定のＤＰＡレベルを有する本発明
の脂質を産生する場合に選択され、または本発明の脂質を産生しない場合選択されない。

【0079】

実施形態では、本明細書で定義した微生物細胞、または植物もしくはその部分などの細
胞内に存在する外来性ポリペプチドは、該細胞、植物または種子などの植物部分のゲノム
中に安定に組み込まれる。好ましくは、外来性ポリヌクレオチドは、該ゲノム中の１つの
遺伝子座において、該細胞、植物または種子などの植物部分のゲノム中に安定に組み込ま
れ、好ましくは、挿入にとってホモ接合である。より好ましくは、該植物、植物部分また
は種子は、１つ以上のＴ－ＤＮＡ分子以外の外来性ポリヌクレオチドを欠いているという
点でさらに特徴付けられる。すなわち、外来性ベクター配列は、Ｔ－ＤＮＡ配列以外のゲ
ノム中に組み込まれない。

【0080】

実施形態では、工程ａ）の前に、該方法は、１つ以上の外来性ポリヌクレオチドを、植
物の１つ以上の細胞に導入することを含む。

【0081】

本発明の方法を用いて産生した植物、及びかかる植物の種子も提供する。

【0082】

実施形態では、本発明の植物は、雌雄両方の生殖能力があり、好ましくは、対応する野
生型植物と比較して少なくとも７０％である、または好ましくはほぼ同じである雌雄両方
の生殖能力レベルを有する。実施形態では、本発明の植物または本発明の種子から産生さ
れた植物により産生された花粉は、生存性染色での染色により測定したとき、９０～１０
０％の生存性である。例えば、花粉の生存性を、実施例１に記載のように評価してもよい
。

【0083】

別の態様では、本発明は、種子を産生する方法を提供し、該方法は、
ａ）好ましくは、少なくとも１０００または２０００または３０００のかかる植物の集
合部分としての耕地または標準栽植密度で植えられた少なくとも１ヘクタールまたは２ヘ
クタールまたは３ヘクタールの領域、あるいは標準条件下温室内で、本発明の植物、また
は本発明の植物部分を産生、もしくは本発明の種子を産生する植物を生育すること、
ｂ）前記１つまたは複数の植物から種子を収穫すること、及び
ｃ）場合によっては、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも６０ｋｇ
または７０ｋｇまたは８０ｋｇのＤＰＡ／ヘクタールの総ＤＰＡ収率でオイルを産生する
こと
を含む。

【0084】

実施形態では、本発明の植物、植物細胞、植物部分もしくは種子、または組換え細胞は
、次の特徴：
ｉ） そのオイルは、本明細書で定義したものであること、または
ｉｉ） 該植物部分または種子または組換え細胞が本発明の方法で使用可能であること
の１つ以上を有する。

【0085】

例えば、種子を、本発明の植物を産生するために使用できる。植物は、例えば、実施例
１に記載したように、標準条件下で、畑または温室で生育してもよい。

【0086】

さらなる態様では、本発明は、本発明の方法を用いて、本発明の細胞、本発明の油料種
子、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓ
ｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇ． ｍａｘ）また
はカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、本発
明の種子、または本発明の植物、植物細胞、植物部分もしくは種子により産生された、ま
たはそれから得られた脂質、またはオイルを提供する。好ましくは、脂質またはオイルを
精製して、核酸（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）、タンパク質及び／または炭水化物、また
はクロロフィルなどの顔料などの夾雑物を取り除く。脂質またはオイルを精製して、例え
ば、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）またはリン脂質の除去により、ＴＡＧの割合を濃縮する

【0087】

実施形態では、脂質またはオイルを、油料種子からオイルを抽出することにより得る。
油料種子のオイルの例としては、これに限定されないが、キャノーラオイル（Ｂｒａｓｓ
ｉｃａ ｎａｐｕｓ，Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ）、カラシナオイル（Ｂｒａ
ｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、他のブラシカオイル、ヒマワリオイル（Ｈｅｌｉａｎｔｈ
ｕｓ ａｎｎｕｓ）、アマニオイル（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ダイ
ズオイル（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ベニバナオイル（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃ
ｔｏｒｉｕｓ）、トウモロコシオイル（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、タバコオイル（Ｎｉｃｏｔ
ｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ピーナッツオイル（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）
、パームオイル、綿実油（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ココナッツオイル
（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、アボカドオイル（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎ
ａ）、オリーブオイル（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、カシューオイル（Ａｎａｃａｒ
ｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミアオイル（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔ
ｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンドオイル（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、ま
たはアラビドプシス種子オイル（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）が挙げら
れる。

【0088】

実施形態では、本発明の、または本発明で使用される細胞（組換え細胞）は、発酵に適
切な細胞などの微生物細胞、好ましくは、重量基準で少なくとも２５％のレベルまでトリ
アシルグリセロールを蓄積可能である油性微生物細胞である。好ましい発酵方法は、当技
術分野で周知であるような嫌気性発酵方法である。適切な発酵細胞、通常、微生物は、発
酵可能である、すなわち、グルコースまたはマルトースなどの糖類を、直接または間接的
に所望の脂肪酸に転換できる。発酵する微生物の例としては、酵母などの真菌生物が挙げ
られる。本明細書で使用されるとき、「酵母」は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、
クルベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ
ｓｐｐ．）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．）、トリコデルマ属（Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、リポミセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａ
ｒｋｅｙ）、及び好ましくは、アルカン資化性酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔ
ｉｃａ）が挙げられる。

【0089】

さらなる態様では、本発明は、本発明の方法を用いて、本発明の細胞、本発明の油料種
子、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓ
ｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇ． ｍａｘ）また
はカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、本発
明の種子、または本発明の植物、植物細胞、植物部分もしくは種子により産生された、ま
たはそれから得られた脂肪酸を提供する。好ましくは、脂肪酸は、ＤＰＡである。脂肪酸
は、本明細書に記載の脂肪酸組成を有する脂肪酸混合物であってよく、または脂肪酸、好
ましくはＤＰＡが混合物中の脂肪酸含有物の少なくとも４０％または少なくとも９０％を
含むように濃縮されてもよい。実施形態では、脂肪酸は、エステル化されていない。ある
いは、脂肪酸は、例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチル基になど、エステル化
されている。

【0090】

本発明の種子から得られる、または本発明の植物から得られるシードミール（ｓｅｅｄ
ｍｅａｌ）も提供される。好ましいシードミールとしては、これに限定されないが、アブ
ラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕ
ｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ． ｍａｘ）シードミ
ールが挙げられる。実施形態では、該シードミールは、本明細書で定義した外来性ポリヌ
クレオチド及び／または遺伝子構築物を含む。好ましい実施形態では、該シードミールは
、シードミールが得られるが、ほとんどの脂質またはオイルの抽出後低レベル（例えば、
２重量％未満）である種子内で産生された脂質またはオイルのいくらかを保持する。該シ
ードミールを、動物用飼料または食料製品の成分として使用してもよい。

【0091】

別の態様では、本発明は、１つ以上の本発明の脂質またはオイル、本発明の脂肪酸、本
発明に記載の細胞、本発明の油料種子植物、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓ
ｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎ
ｃｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ． ｍａｘ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉ
ｎａ ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、本発明の種子、または本発明のシードミ
ールを含む組成物を提供する。実施形態では、該組成物は、医薬品、食物もしくは農業用
途、種子処理化合物、肥料、別の食物もしくは飼料成分、または添加タンパク質もしくは
ビタミン類に適切な担体を含む。

【0092】

１つ以上の本発明の脂質またはオイル、本発明の脂肪酸、本発明に記載の細胞、本発明
の油料種子植物、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、セイヨウアブラナ
（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙ
ｃｉｎｅ． ｍａｘ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物
、本発明の植物部分、本発明の種子、または本発明のシードミール、または本発明の組成
物を含む飼料、化粧品または化学薬品も提供する。好ましい飼料は、本発明の脂質または
オイルを含む乳児用調製粉乳である。

【0093】

別の態様では、本発明は、飼料、好ましくは乳児用調製粉乳の製造方法を提供し、該方
法は、１つ以上の本発明の脂質またはオイル、本発明の脂肪酸、本発明に記載の細胞、本
発明の油料種子植物、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、セイヨウアブ
ラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇ
ｌｙｃｉｎｅ． ｍａｘ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）
植物、本発明の植物部分、本発明の種子、または本発明のシードミール、または本発明の
組成物を、少なくとも１つの他の食物成分と混合することを含む。該方法は、配合、料理
、ベーキング、押出、乳化、さもなければ飼料の処方、または飼料の包装、または試料中
の脂質もしくはオイルの量の分析の工程を含んでもよい。

【0094】

別の態様では、本発明は、ＰＵＦＡ、好ましくはＤＰＡから効果を得るだろう病状の治
療または予防方法を提供し、該方法は、対象に、１つ以上の本発明の脂質またはオイル、
本発明の脂肪酸、本発明に記載の細胞、本発明の油料種子植物、本発明のアブラナ属（Ｂ
ｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラ
シナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ． ｍａｘ）またはカメリナサテ
ィバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、本発明の種子、また
は本発明のシードミール、本発明の組成物、または本発明の飼料を投与することを含む。
好ましい実施形態では、ＰＵＦＡを、ＰＵＦＡのエチルエステルを含む医薬組成物の形態
で投与する。対象は、ヒトまたはヒト以外の動物であり得る。

【0095】

ＰＵＦＡから効果を得られるだろう病状の例としては、これに限定されないが、血清ト
リグリセリド値上昇、ＬＤＬコレステロール値上昇などの血清コレステロール値上昇、不
整脈、血管形成、炎症、喘息、乾癬、骨粗鬆症、腎臓結石、ＡＩＤＳ、多発性硬化症、関
節リウマチ， クローン病、統合失調症、がん、胎児アルコール症候群、注意不足多動性
障害、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、単極性うつ病、攻撃的な敵意、アドレノロイ
コジストフィー、冠動脈心疾患、高血圧症、糖尿病、肥満症、アルツハイマー病、慢性閉
塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、血管形成術後の再狭窄、湿疹、高血圧、血小板凝集、胃腸出
血、子宮内膜症、月経前緊張症、筋痛性脳脊髄炎、ウイルス性感染後の慢性疲労または眼
疾患が挙げられる。

【0096】

１つ以上の本発明の脂質またはオイル、本発明の脂肪酸、本発明に記載の細胞、本発明
の油料種子植物、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、セイヨウアブラナ
（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙ
ｃｉｎｅ． ｍａｘ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物
、本発明の植物部分、本発明の種子、または本発明のシードミール、本発明の組成物、ま
たは本発明の飼料を、ＰＵＦＡ、好ましくはＤＰＡから効果を得られるだろう病状を治療
用または予防用医薬品製造のための使用も提供される。

【0097】

該医薬品製造は、本明細書に記載の病状の治療のため、本発明のオイルを薬剤的に許容
可能な担体と混合することを含んでもよい。該方法は、オイルを先ず精製し、及び／また
はエステル交換し、及び／または該オイルの分取をしてＤＰＡのレベルを増加することを
含んでもよい。特定の実施形態では、該方法は、キャノーラオイルなどの脂質またはオイ
ルを処理して、オイル中の脂肪酸をメチルまたはエチルなどのアルキル エステルに転換
することを含む。分取または蒸留などのさらなる処理を、脂質またはオイルのＤＰＡを濃
縮するために適用してもよい。好ましい実施形態では、該医薬品は、ＤＰＡのエチルエス
テルを含む。さらにより好ましい実施形態では、医薬品中のＤＰＡのエチルエステルのレ
ベルは、３０％から５０％の間、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、ま
たは少なくとも９０％、または少なくとも約９５％である。該医薬品は、医薬品中総脂肪
酸含有率の３０％から５０％の間、または少なくとも９０％などのＥＰＡのエチルエステ
ルをさらに含む。かかる医薬品は、本明細書に記載の病状の治療のため、ヒトまたは動物
対象に投与するのに適切である。

【0098】

別の態様では、本発明は、本発明の種子を得ること、及び得られた種子を金銭利益のた
め取引きすることを含む種子の取引き方法を提供する。

【0099】

実施形態では、種子を得ることは、本発明の植物を栽培すること、及び／または該植物
から種子を収穫することを含む。

【0100】

別の実施形態では、種子を得ることは、該種子を容器に入れること、及び／または該種
子を貯蔵することをさらに含む

【0101】

さらなる実施形態では、種子を得ることは、該種子を異なる場所に輸送することをさら
に含む。

【0102】

さらに別の実施形態では、該方法は、該種子を取り引き後、該種子を異なる場所に輸送
することをさらに含む。

【0103】

さらなる実施形態では、該取り引きを、コンピューターなどの電子的手段を用いて実行
する。

【0104】

その上、さらなる態様では、本発明は、
ａ）本発明の種子を含む植物の地上部を包む、引き抜く及び／または刈り取ること
ｂ）植物の部分を脱穀及び／または選穀して、植物部分の残部から種子を分離すること
、及び
ｃ）工程ｂ）で分離した種子を篩い分け及び／または選別し、篩い分け及び／または選
別した種子を貯蔵箱に充填し、それにより、種子の箱を製造すること、を含む種子の箱の
製造方法を提供する。

【0105】

実施形態では、関連する場合、本発明の、または本発明に有用な脂質またはオイル、好
ましくは、種子オイルは、実施例のセクション中の表中に提供したものについて脂肪レベ
ルを有する。

【0106】

本明細書中のいかなる実施形態も、特に別段の明記がない限り、いずれもの他の実施形
態に対して、変更すべきところは変更して適用されるべきである。

【0107】

本発明は、例証することのみを目的と意図された、本明細書に記載の特定の実施形態に
より、範囲を限定されない。機能的に均等な製品、組成物及び方法は、本明細書に記載の
ように、明白に、本発明の範囲内である。

【0108】

本明細書を通して、特に別段の明言がない、または文脈上別の意味を必要としない限り
、１つの工程、物質の組成物、工程の群または物質の組成物の群の参照は、１つ及び複数
（すなわち、１つ以上）のこれらの工程、物質の組成物、工程の群または物質の組成物の
群を包含すると解釈すべきである。

【0109】

以下、本発明を、以下の非限定的実施例として、及び添付の図を参照して説明する。

【図面の簡単な説明】

【0110】

【図1】好気的ＤＰＡ生合成経路。

【図2】ｐＪＰ３４１６－ＧＡ７の左右境界領域間のＴ－ＤＮＡ挿入領域のマップ。ＲＢは右境界領域を示し；ＬＢは左境界領域を示し、ＴＥＲは転写ターミネーター／ポリアデニル化領域を示し、ＰＲＯはプロモーターを示し；コード領域は矢印上に示され、プロモーター及びターミネーターは矢印の下に示される。Ｍｉｃｐｕ－Δ６Ｄはミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａ）Δ６－デサチュラーゼ；Ｐｙｒｃｏ－Δ６Ｅはピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａｔａ）Δ６－エロンガーゼ；Ｐａｖｓａ－Δ５Ｄはパブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ５－デサチュラーゼ；Ｐｉｃｐａ－ω３Ｄはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３－デサチュラーゼ；Ｐａｖｓａ－Δ４Ｄはパブロバ・サリナ（Ｐ． ｓａｌｉｎａ）Δ４－デサチュラーゼ；Ｌａｃｋｌ－Δ１２Ｄはラカンセア・クルイベリ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ Ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅはピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａｔａ）Δ５－エロンガーゼを示す。ＮＯＳはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノバリン合成転写ターミネーター／ポリアデニル化領域を示し；ＦＰ１はセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）短縮化ナピンプロモーターを示し；ＦＡＥ１はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＦＡＥ１プロモーターを示し；Ｌｅｃｔｉｎはダイス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）レクチン転写ターミネーター／ポリアデニル化領域；Ｃｎｌ１及びＣｎｌ２はアマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）コンリニン１またはコンリニン２プロモーターまたはターミネーターを示す。ＭＡＲはタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）Ｒｂ７マトリックス結合領域を示す。

【図3】（Ａ）は、環番号及び側鎖番号を伴う、基本的な植物ステロールの構造である。（Ｂ）は、一部の植物ステロールの化学構造である。

【図4】ｐＪＰ３６６２の左境界と右境界の間のＴ－ＤＮＡ挿入領域の地図である。ＲＢは、右境界を示す。ＬＢは左境界を示す。ＴＥＲは、転写ターミネーター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）／ポリアデニル化領域（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ）。ＰＲＯは、プロモーター。コード領域は、矢印の上に示され、プロモーター及びターミネーターは、は矢印の下に示される。Ｍｉｃｐｕ－Δ６Ｄは、ミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａ）のΔ６－デサチュラーゼ。Ｐｙｒｃｏ－Δ６Ｅは、ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａｔａ）のΔ６－エロンガーゼ。Ｐａｖｓａ－Δ５Ｄは、パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）のΔ５－デサチュラーゼ。Ｐｉｃｐａ－ω３Ｄは、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のω３－デサチュラーゼ。Ｌａｃｋｌ－Δ１２Ｄは、ラカンセア・クルイベリ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）のΔ１２－デサチュラーゼ。Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅは、ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａｔａ）のΔ５－エロンガーゼ。ＮＯＳは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリン合成酵素転写ターミネーター／ポリアデニル化領域を示す。ＦＰ１は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）短縮化ナピンプロモーターを示す。ＦＡＥ１は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＦＡＥ１プロモーターを示す。Ｌｅｃｔｉｎは、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）レクチン転写ターミネーター／ポリアデニル化領域。Ｃｎｌ１は、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）コンリニン１プロモーターまたはターミネーターを示す。ＭＡＲはタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来のＲｂ７マトリックス結合領域を示す。

【0111】

配列表のキー
配列番号１－ｐＪＰ３４１６－ＧＡ７ヌクレオチド配列。
配列番号２－ｐＧＡ７－ｍｏｄ＿Ｂヌクレオチド配列。
配列番号３－植物のラカンセア・クルイベリ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ Ｋｌｕｙｖｅｒｉ
）Δ１２デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号４－ラカンセア・クルイベリ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ Ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Δ１
２デサチュラーゼ。
配列番号５－植物のピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３デサ
チュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号６－ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３デサチュラ
ーゼ。
配列番号７－ミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａ）Δ６
－デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号８－植物のミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａ
）Δ６－デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号９－ミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａ）Δ６
－デサチュラーゼ。
配列番号１０－オストレオコッカス・ルシマリヌス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕ
ｃｉｍａｒｉｎｕｓ）Δ６－デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム
。
配列番号１１－植物のオストレオコッカス・ルシマリヌス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ
ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ）Δ６－デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーデ
ィングフレーム。
配列番号１２－オストレオコッカス・ルシマリヌス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕ
ｃｉｍａｒｉｎｕｓ）Δ６－デサチュラーゼ。
配列番号１３－オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉ
）Δ６－デサチュラーゼ。
配列番号１４－ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａｔａ）
Δ６－エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１５－植物のピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａ
ｔａ）Δ６－エロンガーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム（３’末
端で短縮化され、機能的エロンガーゼをコードする）。
配列番号１６－ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａｔａ）
Δ６－デサチュラーゼ。
配列番号１７－短縮化ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａ
ｔａ）Δ６－デサチュラーゼ。
配列番号１８－パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ５－デサチュラ
ーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１９－植物のパブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ５－デサ
チュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号２０－パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ５－デサチュラ
ーゼ。
配列番号２１－ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａｔａ）
Δ５－デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２２－ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａｔａ）
Δ５－デサチュラーゼ。
配列番号２３－ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａｔａ）
Δ５－エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２４－植物のピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａ
ｔａ）Δ５－エロンガーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号２５－ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａｔａ）
Δ５－エロンガーゼ。
配列番号２６－パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ４－デサチュラ
ーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２７－植物のパブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ４－デサ
チュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号２８－パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ４－デサチュラ
ーゼ。
配列番号２９－イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ
９－エロンガーゼ。
配列番号３０－植物のエミリアニア・ハクスレイ（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ ｈｕｘｌｅｙ
ｉ）Δ９－エロンガーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号３１－エミリアニア・ハクスレイ（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ ｈｕｘｌｅｙｉ）Ｃ
ＣＭＰ１５１６Δ９－エロンガーゼ。
配列番号３２－パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｐｉｎｇｕｉｓ）Δ９－エロンガ
ーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号３３－パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｐｉｎｇｕｉｓ）Δ９－エロンガ
ーゼ。
配列番号３４－パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ９－エロンガー
ゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号３５－パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ９－エロンガー
ゼ。
配列番号３６－パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ８－デサチュラ
ーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号３７－パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ８－デサチュラ
ーゼ。
配列番号３８－Ｖ２ウイルスサプレッサー。
配列番号３９－Ｖ２ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム
。
配列番号４０－シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＬＰＡ
ＡＴ２。
配列番号４１－リムナンテス・アルバ（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ ａｌｂａ）ＬＰＡＡＴ
。
配列番号４２－サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）ＬＰＡＡＴ。
配列番号４３－ミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａ）Ｌ
ＰＡＡＴ。
配列番号４４－モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）
ＬＰＡＡＴ。
配列番号４５－セイヨウアブラナ（Ｂｒａｃｃｉｓａ ｎａｐｕｓ）ＬＰＡＡＴ。
配列番号４６－セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＬＰＡＡＴ。
配列番号４７－フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆ
ｅｓｔａｎｓ）ω３－デサチュラーゼ。
配列番号４８－タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕ
ｄｏｎａｎａ） ω３－デサチュラーゼ。
配列番号４９－ピシリウム・イレグラーレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）
ω３－デサチュラーゼ。
配列番号５０～５８－オリゴヌクレオチドプライマー／プローブ。

【発明を実施するための形態】

【0112】

一般的方法及び定義
特に、別段の規定がない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、当業者
（例えば、細胞培養、分子遺伝学、脂肪酸合成、トランスジェニック植物、組換え細胞、
タンパク質化学、及び生化学）により共通に理解されるのと同じ意味を有すると解すべき
である。

【0113】

別段の指示がない限り、本発明に利用するタンパク質、細胞培養、及び免疫技術は当業
者に周知の標準的方法である。かかる技術を、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９），Ｔ．Ａ．
Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，Ｉ
ＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．．Ｈａｍｅ
ｓ （ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒ
ｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９５ ａｎｄ １９９
６），Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ
．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８
，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｌｌ ｕｐｄａｔｅｓ ｕｎｔｉｌ ｐｒｅｓｅｎｔ），Ｅｄ
Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ
ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （現在までの全最新版を含む）など
の資料中の文献により記載し説明する。

【0114】

「及び／または」という語、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「
ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解すべきであり、両方の意味またはどちらかの意
味を明示的に支持すると解する。

【0115】

本明細書で使用するとき、「約」という語は、そうでないと言及されない限り、指示値
の±１０％、より好ましくは、±５％、より好ましくは、±１％を表す

【0116】

本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐ
ｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、言及
した要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を含むが、他の要素、
整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を除外しないことを意味すると理
解されるだろう。

【0117】

選択された定義
本明細書で使用するとき、「抽出植物脂質」及び「単離植物脂質」という語は、例えば
、植物または種子などのその部分から、例えば、圧搾により抽出された脂質組成物を表す
。該抽出脂質は、例えば、植物種子の圧搾により得られた比較的粗製の組成物、または植
物材料由来の水、核酸、タンパク質及び炭水化物の１つ以上または各々の、もし全部でな
ければ、ほとんどを取り除いたより純粋な組成物であり得る。精製方法の例を以下に記載
する。実施形態では、抽出または単離植物脂質は、組成物の少なくとも約６０重量％、少
なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、または少な
くとも約９５重量％（ｗ／ｗ）の脂質を含む。脂質は、室温において、固体であっても液
体であってもよく、液体の時、オイルであると見なされる。実施形態では、本発明の抽出
脂質を、別原料（例えば、魚油のＤＰＡ）により産生されたＤＰＡなどの別の脂質と配合
していない。実施形態では、抽出後、ＤＰＡに対するオレイン酸、ＤＰＡに対するパルミ
チン酸、ＤＰＡに対するリノレン酸、及び総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の１つ以上または
全ての比を、無処置の種子または細胞中の比と比較したとき、有意に変化しなかった（例
えば、１０％または５％以下の変化）。別の実施形態では、抽出植物脂質を、無処置の種
子または細胞中の比と比較したとき、ＤＰＡに対するオレイン酸、ＤＰＡに対するパルミ
チン酸、ＤＰＡに対するリノレン酸、及び総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の１つ以上または
全ての比を変化させ得る水素化または分取などの方法にさらさなかった。本発明の抽出植
物脂質がオイル中に含まれるとき、該オイルは、ステロール類などの非脂肪酸分子をさら
に含んでもよい。

【0118】

本明細書で使用するとき、「抽出植物オイル」及び「単離植物オイル」という語は、抽
出植物脂質または単離植物脂質を含み、室温において液体である物質または組成物を表す
。該オイルは、植物または種子などのその部分から得られる。該抽出または単離オイルは
、例えば、植物種子の圧搾により得られた比較的粗製の組成物、または植物材料由来の水
、核酸、タンパク質及び炭水化物の１つ以上または各々の、もし全部でなければ、ほとん
どを取り除いたより純粋な組成物であり得る。該組成物は、脂質または非脂質であり得る
他の成分を含んでもよい。実施形態では、該オイルは、少なくとも約６０重量％、少なく
とも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、または少なくと
も約９５重量％（ｗ／ｗ）の抽出植物脂質を含む。実施形態では、本発明の抽出オイルを
、別原料（例えば、魚油のＤＰＡ）により産生されたＤＰＡなどの別のオイルと配合して
いない。実施形態では、抽出後、ＤＰＡに対するオレイン酸、ＤＰＡに対するパルミチン
酸、ＤＰＡに対するリノレン酸、及び総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の１つ以上または全て
の比を、無処置の種子または細胞中の比と比較したとき、有意に変化しなかった（例えば
、１０％または５％以下の変化）。別の実施形態では、抽出植物オイルを、無処置の種子
または細胞中の比と比較したとき、ＤＰＡに対するオレイン酸、ＤＰＡに対するパルミチ
ン酸、ＤＰＡに対するリノレン酸、及び総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の１つ以上または全
ての比を変化させ得る水素化または分取などの方法にさらさなかった。本発明の抽出植物
オイルは、ステロール類などの非脂肪酸分子を含んでもよい。

【0119】

本明細書で使用するとき、「抽出微生物脂質」または「抽出微生物オイル」などの語は
、主に異なる点が脂質またはオイルの原料であることで、それぞれ、対応する語「抽出植
物脂質」及び「抽出植物オイル」と類似の意味を有する。

【0120】

本明細書で使用するとき、「オイル」は、主に脂質を含み、室温において液体である組
成物である。例えば、本発明のオイルは、好ましくは、少なくとも７５重量％、少なくと
も８０重量％、少なくとも８５重量％または少なくとも９０重量％の脂質を含む。通常、
精製オイルは、該オイル中脂質の少なくとも９０重量％のトリアシルグリセロール（ＴＡ
Ｇ）を含む。ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、リン脂質及びス
テロール類などのオイルの少量成分は、本明細書に記載のように存在し得る。

【0121】

本明細書で使用するとき、「脂肪酸」という語は、飽和あるいは不飽和の長鎖脂肪族末
端をしばしば有するカルボン酸（または有機酸）を表す。通常、脂肪酸は、長さが少なく
とも８個の炭素原子、より好ましくは、長さが少なくとも１２個の炭素の炭素－炭素結合
鎖を有する。本発明の好ましい脂肪酸は、１８～２２個の炭素原子（Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ
２２脂肪酸）、より好ましくは、２０～２２個の炭素原子（Ｃ２０、Ｃ２２）及び最も好
ましくは、２２個の炭素原子（Ｃ２２）の炭素鎖を有する。ほとんどの天然脂肪酸は、そ
の生合成が２個の炭素原子を有するアセテートを取り込むので、偶数の炭素原子を有する
。脂肪酸は、遊離状態（非エステル化）またはトリグリセリド、ジアシルグリセリド、モ
ノアシルグリセリド、アシル－ＣｏＡ（チオエステル）結合または他結合体の部分などの
エステル化された形態であり得る。脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエ
タノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル
イノシトールまたはジホスファチジルグリセロール体などのリン脂質としてエステル化さ
れ得る。実施形態では、脂肪酸は、例えば、Ｃ２０またはＣ２２ＰＵＦＡのメチルまたは
エチルエステルなどのメチル基またはエチル基とエステル化される。好ましい脂肪酸は、
ＥＰＡ、またはＤＰＡ、またはＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡ、またはＥＰＡ及びＤＰＡのメ
チルまたはエチルエステルである。

【0122】

「飽和脂肪酸」は、鎖上に二重結合も他の官能基も含まない。「飽和」という語は、全
ての炭素（カルボン酸［－ＣＯＯＨ］基は別として）が可能な限り多くの水素を含むとい
う点において、水素を表す。言い換えれば、オメガ（ω）末端は、３個の水素（－ＣＨ３
－）を含み、鎖内の各炭素は２個の水素（－ＣＨ２－）を含む。

【0123】

「不飽和脂肪酸」は、１つ以上のアルケン官能基が鎖上に存在し、各アルケンが鎖の一
重結合「－ＣＨ２－ＣＨ２－」部分を二重結合「－ＣＨ＝ＣＨ－」部分（すなわち、別炭
素と二重結合した炭素）により置換されていることを除いて、飽和脂肪酸と類似の形態で
ある。二重結合のどちらかの側と結合している、鎖中の２つの隣接炭素原子は、ｃｉｓま
たはｔｒａｎｓ配置、好ましくは、ｃｉｓ配置になることができる。実施形態では、脂質
またはオイルまたは本発明は、１％未満のｔｒａｎｓ配置の炭素－炭素二重結合を有する
脂肪酸（ｔｒａｎｓ脂肪酸）を含む脂肪酸組成物を有する。

【0124】

本明細書で使用するとき、「一価不飽和脂肪酸」という語は、その炭素鎖中少なくとも
１２個の炭素原子及び鎖中１個のみのアルケン基（炭素－炭素二重結合）を含む脂肪酸を
表す。本明細書で使用するとき、「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」という語は、
その炭素鎖中少なくとも１２個の炭素原子及び鎖中少なくとも２個のアルケン基（炭素－
炭素二重結合）を含む脂肪酸を表す。

【0125】

本明細書で使用するとき、「長鎖多価不飽和脂肪酸」または「ＬＣ－ＰＵＦＡ」という
語は、その炭素鎖中少なくとも２０個の炭素原子及び鎖中少なくとも２個の炭素－炭素二
重結合を含む脂肪酸を表し、それ故、ＶＬＣ－ＰＵＦＡを含む。本明細書で使用するとき
、「超長鎖多価不飽和脂肪酸」または「ＶＬＣ－ＰＵＦＡ」という語は、その炭素鎖中少
なくとも２２個の炭素原子及び鎖中少なくとも３個の炭素－炭素二重結合を含む脂肪酸を
表す。通常、脂肪酸の炭素鎖中の炭素原子数は、分岐していない炭素鎖を表す。もし、炭
素鎖が分岐しているならば、炭素原子数は、側鎖基のものを除外する。１つの実施形態で
は、長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω３脂肪酸である、すなわち、該脂肪酸のメチル末端から
３つ目の炭素－炭素結合において不飽和化（炭素－炭素二重結合）を有する。別の実施形
態では、長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω６脂肪酸である、すなわち、該脂肪酸のメチル末端
から６つ目の炭素－炭素結合において不飽和化（炭素－炭素二重結合）を有する。さらな
る実施形態では、長鎖多価不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４Δ５、８、
１１、１４；ω６）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４Δ８、１１、１４、１７
；ω３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５Δ５、８、１１、１４、１７；ω３
）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５Δ７、１０、１３、１６、１９；ω３）、ま
たはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６Δ４、７、１０、１３、１６、１９；ω３）
から成る群から選択される。ＬＣ－ＰＵＦＡは、ジホモ－γ－リノール酸（ＤＧＬＡ）ま
たはエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ、２０：３Δ１１、１４、１７；ω３）であってもよ
い。本発明に従って産生されるＬＣ－ＰＵＦＡは、上記のいずれかまたは全ての混合物で
あってよく、他のＬＣ－ＰＵＦＡまたはこれらのＬＣ－ＰＵＦＡのいずれかの誘導体を含
んでもよいことは、容易に分かるだろう。好ましい実施形態では、ω３脂肪酸は、少なく
ともＤＰＡ、またはＤＰＡ及びＤＨＡ、またはＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡ、またはＥＰＡ
及びＤＰＡである。実施形態では、ＤＰＡは、総脂肪酸組成物の約７％から３０％または
３５％の間のレベルで存在し、ＤＨＡは存在しないか、もし存在するならば、２．０％未
満、好ましくは１．０％未満、より好ましくは０．５％未満のレベルで存在し、最も好ま
しくは、存在しないか検出不可である。これは、細胞内にΔ４－デサチュラーゼが存在し
ないことにより達成され得る。実施形態では、ＤＰＡレベルは、ＥＰＡレベルより多く、
より好ましくは、ＥＰＡ及びＤＨＡの各々のレベルより多く、最も好ましくは、ＥＰＡ及
びＤＨＡを合わせたレベルより多い。この実施形態では、ＤＨＡは、存在しなくてよく、
もし存在するならば、総脂肪酸組成物の０．５％未満のレベルで存在する。

【0126】

さらに、本明細書で使用するとき、「長鎖多価不飽和脂肪酸」（ＬＣ－ＰＵＦＡ）及び
「超長鎖多価不飽和脂肪酸」（ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）は、遊離状態（非エステル化）または
トリグリセリド（トリアシルグリセロール）、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリ
ド、アシル－ＣｏＡ結合または他結合体の部分などのエステル化された形態である脂肪酸
を表す。トリグリセリドでは、ＤＰＡなどのＬＣ－ＰＵＦＡまたはＶＬＣ－ＰＵＦＡは、
ｓｎ－１／３位またはｓｎ－２位においてエステル化されていてもよく、または該トリグ
リセリドは、ＬＣ－ＰＵＦＡ及びＶＬＣ－ＰＵＦＡアシル基から選択される２つまたは３
つのアシル基を含んでもよい。例えば、トリグリセリドは、ｓｎ－１位及びｓｎ－３位の
両方において、ＤＰＡを含んでもよい。脂肪酸は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホス
ファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホ
スファチジルイノシトールまたはジホスファチジルグリセロール体などのリン脂質として
エステル化され得る。このように、ＬＣ－ＰＵＦＡは、細胞の脂質または細胞、組織また
は生物から抽出した精製オイルもしくは脂質の形態の混合物として存在し得る。好ましい
実施形態では、本発明は、ＬＣ－ＰＵＦＡを含む少なくとも前記トリアシルグリセロール
を含む、言及したものなどの脂質の他の形態として存在する残部と、少なくとも７５％ま
たは少なくとも８５％のトリアシルグリセロールを含むオイルを提供する。オイルは、引
き続き、例えば、強塩基を用いて加水分解して遊離脂肪酸を遊離することにより、または
エステル交換、蒸留などにより、さらに精製または処理してもよい。

【0127】

本明細書で使用するとき、「総ω６脂肪酸」または「総ω６脂肪酸含有率」などは、状
況に応じて、該総脂肪酸含有物のパーセントとして表され、抽出脂質、オイル、組換え細
胞、植物部分または種子中のエステル化された、及びエステル化されていない全てのω６
脂肪酸の総和を表す。これらのω６脂肪酸は、（もし存在するならば）ＬＡ、ＧＬＡ、Ｄ
ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ及びω６－ＤＰＡを含み、ω３脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸を含
まない。本発明の植物、種子またはオイル中に存在するω６脂肪酸は、全て、多価不飽和
脂肪酸（ＰＵＦＡ）の分類に含まれる。

【0128】

本明細書で使用するとき、「新ω６脂肪酸」または「新ω６脂肪酸含有率」などは、状
況に応じて、該総脂肪酸含有物のパーセントとして表され、抽出脂質、オイル、組換え細
胞、植物部分または種子中のエステル化された、及びエステル化されていない、ＬＡを除
いた全てのω６脂肪酸の総和を表す。これらの新ω６脂肪酸は、細胞中に導入された遺伝
子構築物（外来性ポリヌクレオチド）の発現により、本発明の細胞、植物、植物部分及び
種子内で産生された脂肪酸であり、（もし存在するならば）ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、
ＥＤＡ及びω６－ＤＰＡを含むが、ＬＡ及びω３脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸を含まない
。実例となる総ω６脂肪酸含有率及び新ω６脂肪酸含有率を、実施例１に記載のように、
試料中の脂肪酸をＦＡＭＥに転換して、ＧＣにより分析することによって決定する。

【0129】

本明細書で使用するとき、「総ω３脂肪酸」または「総ω３脂肪酸含有率」などは、状
況に応じて、該総脂肪酸含有物のパーセントとして表され、抽出脂質、オイル、組換え細
胞、植物部分または種子中のエステル化された、及びエステル化されていない全てのω３
脂肪酸の総和を表す。これらのω３脂肪酸は、（もし存在するならば）ＡＬＡ、ＳＤＡ、
ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡを含み、ω６脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸
を含まない。本発明の植物、種子またはオイル中に存在するω３脂肪酸は、全て、多価不
飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の分類に含まれる。

【0130】

本明細書で使用するとき、「新ω３脂肪酸」または「新ω３脂肪酸含有率」などは、状
況に応じて、該総脂肪酸含有物のパーセントとして表され、抽出脂質、オイル、組換え細
胞、植物部分または種子中のエステル化された、及びエステル化されていない、ＡＬＡを
除いた全てのω３脂肪酸の総和を表す。これらの新ω３脂肪酸は、細胞中に導入された遺
伝子構築物（外来性ポリヌクレオチド）の発現により、本発明の細胞、植物、植物部分及
び種子内で産生されたω３脂肪酸であり、（もし存在するならば）ＳＤＡ、ＥｔｒＡ、Ｅ
ＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡを含むが、ＡＬＡ及びω６脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸
を含まない。実例となる総ω３脂肪酸含有率及び新ω３脂肪酸含有率を、実施例１に記載
のように、試料中の脂肪酸をＦＡＭＥに転換して、ＧＣにより分析することによって決定
する。

【0131】

当業者が認識する通り、本発明の方法の工程として「植物部分を得ること」は、該方法
用途の１つ以上の植物部分を得ることを含み得る。植物部分を得ることは、機械的収穫機
を用いて、または植物部分を購入、または供給者から植物部分を受け取るなどの植物から
の植物部分を収穫することを含む。別の例では、植物部分を得ることは、植物部分を収穫
した誰か他の者から植物を取得することであってよい。

【0132】

本発明で使用され得る、デサチュラーゼ、エロンガーゼ並びにアシルトランスフェラー
ゼタンパク質及びそれをコードする遺伝子は、当技術分野で公知のもの、またはそのホモ
ログもしくは誘導体のいずれかである。かかる遺伝子及びコードされたタンパク質サイズ
の例を、表１にリストする。ＬＣ－ＰＵＦＡ生合成に関与することが分かっているデサチ
ュラーゼ酵素は全て、いわゆる「フロントエンド」デサチュラーゼの群に属する。好まし
いタンパク質、またはタンパク質の組合せは、 本明細書で提供された配列番号１及び２
の遺伝子構築物によりコードされたものである。

【0133】

本明細書で使用するとき、「フロントエンドデサチュラーゼ」という語は、３つの高度
に保存されたヒスチジンボックスを含む典型的な脂肪酸デサチュラーゼドメインと共に、
Ｎ－末端チトクロームｂ５ドメインの存在により、構造的に特徴付けられる、脂質のアシ
ル鎖のカルボン酸基と既存の不飽和部分との間に二重結合を導入する酵素分類のメンバー
を表す（Ｎａｐｉｅｒら、１９９７）。

【0134】

本発明に使用するためのいずれかのエロンガーゼまたはデサチュラーゼの活性を、例え
ば、植物細胞などの細胞内、または好ましくは、体細胞胚もしくはトランスジェニック植
物内で、該酵素をコードする遺伝子を発現し、該細胞、胚または植物が該酵素を発現しな
い同等の細胞、胚または植物と比較して、ＬＣ－ＰＵＦＡを産生する能力の増強を有する
かどうかを決定することにより試験し得る。

【0135】

１つの実施形態では、本発明に使用するための１つ以上のデサチュラーゼ及び／または
エロンガーゼを、微細藻類から精製できる、すなわち、微細藻類から精製できるポリペプ
チドとアミノ酸配列が同一である。

【0136】

特定の酵素を本明細書で、「二元機能性」と具体的に説明している一方、そうような語が
ないからといって、必ずしも、特定の酵素が具体的に定義された以外の活性を有しないと
意味するわけではない。

【表1】

本明細書で使用するとき、「デサチュラーゼ」という語は、例えば、アシル－ＣｏＡエ
ステルなどの通常エステル化された形態の脂肪酸基質のアシル基に炭素－炭素二重結合を
導入可能な酵素を表す。アシル基を、ホスファチジルコリン（ＰＣ）などのリン脂質に、
またはアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）に、または好ましい実施形態では、ＣｏＡ
にエステル化してもよい。デサチュラーゼは、それによって、３つの群に通常分類され得
る。１つの実施形態では、デサチュラーゼは、フロントエンドデサチュラーゼである。

【0137】

本明細書で使用するとき、「Δ４－デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末端
から４番目の炭素－炭素結合に炭素－炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行う
タンパク質を表す。「Δ４－デサチュラーゼ」は、少なくとも、ＤＰＡをＤＨＡに転換可
能である。好ましくは、「Δ４－デサチュラーゼ」は、少なくとも、ＤＰＡ－ＣｏＡをＤ
ＨＡ－ＣｏＡに転換可能である、すなわち、アシル－ＣｏＡデサチュラーゼである。実施
形態では、「Δ４－デサチュラーゼ」は、ＰＣのｓｎ－２位においてエステル化されたＤ
ＰＡを、ＤＨＡ－ＰＣに転換可能である。好ましくは、Δ４－デサチュラーゼは、ＤＰＡ
－ＰＣに対してより、ＤＰＡ－ＣｏＡに対して大きな活性を有する。ＤＰＡからＤＨＡを
産生する不飽和化工程は、哺乳類以外の生物内のΔ４－デサチュラーゼにより触媒され、
この酵素をコードする遺伝子は、淡水原生生物種ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃ
ｉｌｉｓ）及び海産種スラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓ
ｐ．）から単離された（Ｑｉｕら、２００１；Ｍｅｙｅｒら、２００３）。１つの実施形
態では、Δ４－デサチュラーゼは、配列番号２８の配列をを有するアミノ酸、またはスラ
ウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）Δ４－デサチュラー
ゼ、その生物活性フラグメント、または配列番号２８と少なくとも８０％同一なアミノ酸
配列を含む。実施形態では、総抽出可能脂肪酸含有物の５％～３５％がＤＰＡであるよう
な高レベルのＤＰＡを産生する、本発明の、または本発明で使用される植物、植物部分（
種子など）または細胞は、機能的Δ４－デサチュラーゼをコードする遺伝子を含まない。

【0138】

本明細書で使用するとき、「Δ５－デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末端
から５番目の炭素－炭素結合に炭素－炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行う
タンパク質を表す。実施形態では、脂肪酸基質はＥＴＡであり、該酵素はＥＰＡを産生す
る。好ましくは、「Δ５－デサチュラーゼ」は、ＥＴＡ－ＣｏＡをＥＰＡ－ＣｏＡに転換
可能である、すなわち、アシル－ＣｏＡデサチュラーゼである。実施形態では、「Δ５－
デサチュラーゼ」は、ＰＣのｓｎ－２位においてエステル化されたＥＴＡを転換可能であ
る。好ましくは、Δ５－デサチュラーゼは、ＥＴＡ－ＰＣに対してより、ＥＴＡ－ＣｏＡ
に対して大きな活性を有する。Δ５－デサチュラーゼの例は、Ｒｕｉｚ－Ｌｏｐｅｚら（
２０１２）及びＰｅｔｒｉｅら（２０１０ａ）及び本明細書の表１にリストされている。
１つの実施形態では、Δ５－デサチュラーゼは、配列番号２０の配列を有するアミノ酸、
その生物活性フラグメント、または配列番号２０と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列
を含む。別の実施形態では、Δ５－デサチュラーゼは、配列番号２２の配列を有するアミ
ノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号２２と少なくとも５３％同一なアミノ
酸配列を含む。別の実施形態では、Δ５－デサチュラーゼは、スラウストキトリウム属（
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）またはエミリアニア・ハクスレイ（Ｅｍｉ
ｌｉａｎｉａ ｈｕｘｌｅｙｉ）由来である。

【0139】

本明細書で使用するとき、「Δ６－デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末端
から６番目の炭素－炭素結合に炭素－炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行う
タンパク質を表す。実施形態では、脂肪酸基質はＡＬＡであり、該酵素はＳＤＡを産生す
る。好ましくは、「Δ６－デサチュラーゼ」は、ＡＬＡ－ＣｏＡをＳＤＡ－ＣｏＡに転換
可能である、すなわち、アシル－ＣｏＡデサチュラーゼである。実施形態では、「Δ６－
デサチュラーゼ」は、ＰＣのｓｎ－２位においてエステル化されたＡＬＡを転換可能であ
る。好ましくは、Δ６－デサチュラーゼは、ＡＬＡ－ＰＣに対してより、ＡＬＡ－ＣｏＡ
に対して大きな活性を有する。Δ６－デサチュラーゼは、Δ５－デサチュラーゼとしての
活性も有し得、ＥＴＡに対するΔ５－デサチュラーゼ活性より、大きなＡＬＡに対するΔ
６－デサチュラーゼ活性を有する限り、Δ５／Δ６－二元機能性デサチュラーゼと呼ばれ
る。Δ６－デサチュラーゼの例は、Ｒｕｉｚ－Ｌｏｐｅｚら（２０１２）及びＰｅｔｒｉ
ｅら（２０１０ａ）及び本明細書の表１にリストされている。好ましいΔ６－デサチュラ
ーゼは、ミクロモナス・プシラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａ）、ピシウム・
イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）またはオストレオコッカス・タウ
リ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉｉ）由来である。

【0140】

実施形態では、Δ６－デサチュラーゼは、以下：ｉ）脂肪酸基質として、リノール酸（
ＬＡ、１８：２Δ９，１２，，ω６）よりα－リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３Δ９，１２
，１５，ω３）に対して大きなΔ６デサチュラーゼ活性；ｉｉ）脂肪酸基質としてＰＣの
ｓｎ－２位と結合したＡＬＡに対してより、脂肪酸基質としてＡＬＡ－ＣｏＡに対して大
きなΔ６－デサチュラーゼ活性；及びｉｉｉ）ＥＴｒＡに対するΔ８－デサチュラーゼ活
性のうち少なくとも２つ、好ましくは３つ全て、及び好ましくは植物細胞内で、有するこ
とによりさらに特徴付けられる。そのようなΔ６－デサチュラーゼを表２に示す。

【0141】

実施形態では、Δ６－デサチュラーゼは、対応するω６基質より、ω３基質に対して高
い活性を有し、植物細胞などの組換え細胞内の外来性ポリヌクレオチドから発現されると
き、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、もしくは最も好ましくは少な
くとも５０％、または酵母細胞内で発現されるとき、少なくとも３５％の効率で、ＡＬＡ
に対して、オクタデカテトラエン酸（ステアリドン酸、ＳＤＡ、１８：４Δ６，９，１２
，１５，ω３）を産生する活性をＡＬＡに対して有する。１つの実施形態では、Δ６－デ
サチュラーゼは、脂肪酸基質としてＬＡより、ＡＬＡに対して高い活性、例えば、少なく
とも約２倍高いΔ６－デサチュラーゼ活性を有する。別の実施形態では、Δ６－デサチュ
ラーゼは、脂肪酸基質としてＰＣのｓｎ－２位と結合したＡＬＡに対してより、脂肪酸基
質としてＡＬＡ－ＣｏＡに対して高い活性、例えば、少なくとも約５倍高いΔ６－デサチ
ュラーゼ活性または少なくとも約１０倍高い活性を有する。さらなる実施形態では、Δ６
－デサチュラーゼは、ＰＣのｓｎ－２位と結合した脂肪酸基質ＡＬＡ－ＣｏＡ及びＡＬＡ
の両方に対して活性を有する。

【表2】

【0142】

１つの実施形態では、Δ６－デサチュラーゼは、ＥＴＡに対して、検出可能なΔ５－デ
サチュラーゼ活性を有しない。別の実施形態では、Δ６－デサチュラーゼは、配列番号９
、配列番号１２または配列番号１３の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント
、または配列番号９、配列番号１２または配列番号１３と少なくとも７７％同一であるア
ミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ６－デサチュラーゼは、配列番号１２または配
列番号１３の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号１２ま
たは配列番号１３の１つまたは両方と少なくとも６７％同一であるアミノ酸配列を含む。
Δ６－デサチュラーゼは、Δ８－デサチュラーゼ活性も有し得る。

【0143】

本明細書で使用するとき、「Δ８－デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末端
から８番目の炭素－炭素結合に炭素－炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行う
タンパク質を表す。Δ８－デサチュラーゼは、少なくとも、ＥＴｒＡをＥＴＡに転換可能
である。好ましくは、Δ８－デサチュラーゼは、ＥＴｒＡ－ＣｏＡをＥＴＡ－ＣｏＡに転
換可能である、すなわち、アシル－ＣｏＡデサチュラーゼである。実施形態では、Δ８－
デサチュラーゼは、ＰＣのｓｎ－２位においてエステル化されたＥＴｒＡを転換可能であ
る。好ましくは、Δ８－デサチュラーゼは、ＥｔｒＡ－ＰＣに対してより、ＥＴｒＡ－Ｃ
ｏＡに対して大きな活性を有する。Δ８－デサチュラーゼは、Δ６－デサチュラーゼとし
ての活性も有し得、ＡＬＡに対するΔ６－デサチュラーゼ活性より、大きなＥＴｒＡに対
するΔ８－デサチュラーゼ活性を有する限り、Δ６／Δ８二元機能性デサチュラーゼと呼
ばれる。Δ８－デサチュラーゼの例を、表１にリストする。１つ実施形態では、Δ８－デ
サチュラーゼは、配列番号３７の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、ま
たは配列番号３７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0144】

本明細書で使用するとき、「ω３－デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のメチル末端から
３番目の炭素－炭素結合に炭素－炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタン
パク質を表す。従って、ω３－デサチュラーゼは、ＬＡをＡＬＡに、ＧＬＡをＳＤＡ（全
てＣ１８脂肪酸）、またはＤＧＬＡをＥＴＡに、及び／またはＡＲＡをＥＰＡ（Ｃ２０脂
肪酸）に転換し得る。いくつかのω３－デサチュラーゼ（グループＩ）は、植物及びシア
ノバクテリアω３－デサチュラーゼなどのＣ１８基質に対してのみ活性を有する。そのよ
うなω３－デサチュラーゼは、Δ１５－デサチュラーゼでもある。他のω３－デサチュラ
ーゼは、Ｃ１８基質に対して活性を有しない（グループＩＩ）または活性有して（グルー
プＩＩＩ）、Ｃ２０基質に対する活性を有する。そのようなω３－デサチュラーゼは、Δ
１７－デサチュラーゼでもある。好ましいω３－デサチュラーゼは、ピキア・パストリス
（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３－デサチュラーゼ（配列番号６）など、ＬＡを
ＡＬＡに、ＧＬＡをＳＤＡに、ＤＧＬＡをＥＴＡに、及びＡＲＡをＥＰＡに転換するグル
ープＩＩＩ型である。ω３－デサチュラーゼの例としては、Ｐｅｒｅｉｒａら（２００４
ａ）（サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）ω３－
デサチュラーゼ、グループＩＩ）、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉら（１９９８）、Ｂｅｒｂｅｒｉ
ｃｈら（１９９８）及びＳｐｙｃｈａｌｌａら（１９９７）（カエノラブディティス・エ
レガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ω３－デサチュラーゼ、グループＩＩＩ）により記載さ
れたものが挙げられる。好ましい実施形態では、ω３－デサチュラーゼは、真菌ω３－デ
サチュラーゼである。本明細書で使用するとき、「真菌ω３－デサチュラーゼ」は、卵菌
起源、またはアミノ酸配列が少なくとも９５％同一であるその変異体を含む真菌起源由来
のω３－デサチュラーゼを表す。多数のω３－デサチュラーゼをコードする遺伝子は、例
えば、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎ
ｓ）（受託番号ＣＡＪ３０８７０、ＷＯ２００５０８３０５３；配列番号４７）、サプロ
レグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）（受託番号ＡＡＲ２
０４４４、Ｐｅｒｅｉｒａら、２００４ａ及びＵＳ７２１１６５６）、ピシウム・イレグ
ラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）（ＷＯ２００８０２２９６３、グループ
ＩＩ；配列番号４９）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉ
ｎａ）（Ｓａｋｕｒａｄａｎｉら、２００５；受託番号ＢＡＤ９１４９５；ＷＯ２００６
０１９１９２）、タラッシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅ
ｕｄｏｎａｎａ）（Ａｒｍｂｒｕｓｔら、２００４；受託番号ＸＰ＿００２２９１０５７
；ＷＯ２００５０１２３１６、配列番号４８）、ラカンセア・クルイベリ（Ｌａｃｈａｎ
ｃｅａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）（サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）としても公知；Ｏｕｒａら、２００４；受託番号ＡＢ１１８６
６３）など、真菌起源から単離された。Ｘｕｅら（２０１２）は、Ｃ２０基質を好んで、
ω６脂肪酸基質を、対応するω３脂肪酸に効率的に転換できる卵菌ピシウム・アファニデ
ルマータム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、フィトフトラ・ソジャ
エ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ）、及びフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔ
ｏｐｈｔｈｏｒａ ｒａｍｏｒｕｍ）由来のω３－デサチュラーゼを記載しており、すな
わち、それらは、Δ１５－デサチュラーゼ活性より、強力なΔ１７－デサチュラーゼ活性
を有した。これらの酵素は、Δ１２－デサチュラーゼ活性がないが、基質として、アシル
－ＣｏＡ及びリン脂質画分の両方の脂肪酸を使用できる。

【0145】

より好ましい実施形態では、真菌ω３－デサチュラーゼは、ピキア・パストリス（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３－デサチュラーゼ／Δ１５－デサチュラーゼ（Ｚｈａ
ｎｇら、２００８；受託番号ＥＦ１１６８８４；配列番号６）、または少なくとも９５％
同一であるポリペプチドである。

【0146】

実施形態では、ω３－デサチュラーゼは、ＡＲＡからＥＰＡ、ＤＧＬＡからＥＴＡ、Ｇ
ＬＡからＳＤＡ、ＡＲＡからＥＰＡとＤＧＬＡからＥＴＡの両方、ＡＲＡからＥＰＡとＧ
ＬＡからＳＤＡの両方、またはこれら３つ全てのうち１つの転換を少なくとも可能である
。

【0147】

１つの実施形態では、ω３－デサチュラーゼは、少なくとも３つの炭素－炭素二重結合
を有するＣ２０脂肪酸、好ましくはＡＲＡに対するΔ１７－デサチュラーゼ活性を有する
。別の実施形態では、ω３－デサチュラーゼは、３つの炭素－炭素二重結合を有するＣ１
８脂肪酸、好ましくはＧＬＡに対するΔ１５－デサチュラーゼ活性を有する。好ましくは
、両方の活性が存在する。

【0148】

本明細書で使用するとき、「Δ１２－デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末
端から１２番目の炭素－炭素結合に炭素－炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を
行うタンパク質を表す。Δ１２－デサチュラーゼは、通常、オレオイル－ホスファチジル
コリンまたはオレオイル－ＣｏＡのいずれかを、それぞれ、リノレオイル－ホスファチジ
ルコリン（１８：１－ＰＣ）またはリノレオイル－ＣｏＡ（１８：１－ＣｏＡ）に転換す
る。ＰＣ結合基質を使用するサブクラスは、リン脂質依存性Δ１２－デサチュラーゼと呼
ばれ、後者のサブクラスは、アシル－ＣｏＡ依存性Δ１２－デサチュラーゼと呼ばれる。
植物及び真菌Δ１２－デサチュラーゼは、概して、前者のサブクラスであり、一方、動物
Δ１２－デサチュラーゼは、後者のサブクラスであり、例えば、Ｚｈｏｕら（２００８）
による、昆虫からクローンした遺伝子によりコードされたΔ１２－デサチュラーゼがある
。多くの他のΔ１２－デサチュラーゼ配列を、配列データベースの検索により容易に同定
できる。

【0149】

本明細書で使用するとき、「Δ１５－デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末
端から１５番目の炭素－炭素結合に炭素－炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を
行うタンパク質を表す。Δ１５－デサチュラーゼをコードする多数の遺伝子は、植物及び
真菌種からクローンされた。例えば、ＵＳ５９５２５４４は、植物Δ１５－デサチュラー
ゼをコードする核酸について記載している（ＦＡＤ３）。これらの酵素は、植物Δ１５－
デサチュラーゼの特徴であったアミノ酸モチーフを含む。ＷＯ２００１１４５３８は、ダ
イズＦＡＤ３をコードする遺伝子について記載している。多くの他のΔ１５－デサチュラ
ーゼ配列を、配列データベースの検索により容易に同定できる。

【0150】

本明細書で使用するとき、「Δ１７－デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末
端から１７番目の炭素－炭素結合に炭素－炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を
行うタンパク質を表す。Δ１７－デサチュラーゼは、もし、Ｃ２０基質に作用してω３結
合に不飽和化を導入するならば、ω３－デサチュラーゼとも見なされる。

【0151】

好ましい実施形態では、Δ１２－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ
は、真菌Δ１２－デサチュラーゼまたは真菌Δ１５－デサチュラーゼである。本明細書で
使用するとき、「真菌Δ１２－デサチュラーゼ」または「真菌Δ１５－デサチュラーゼ」
は、卵菌起源を含む真菌起源、またはそのアミノ酸配列が少なくとも９５％同一である変
異体由来であるΔ１２－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼを表す。多数のデ
サチュラーゼをコードする遺伝子は、真菌起源から単離された。ＵＳ７２１１６５６は、
サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）のΔ１２－デ
サチュラーゼについて記載している。ＷＯ２００９０１６２０２は、Ｈｅｌｏｂｄｅｌｌ
ａ ｒｏｂｕｓｔａ、Ｌａｃｃａｒｉａ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｌｏｔｔｉａ ｇｉｇａｎｔ
ｅａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｍｏｎｏｓｉｇａ ｂ
ｒｅｖｉｃｏｌｌｉｓ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏ
ｓｐａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｇｒｕｂｅｎ、Ｎ
ｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ、Ｎｅｍａｔｏｓｔｅｌｌａ ｖｅｃｔｅｎｓ
ｉｓ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｒｅｓｉｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ、Ｐｏｓｔｉａ ｐｌａｃｅ
ｎｔａ、Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ及びＭｉｃｒｏｄｏｃ
ｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅの真菌デサチュラーゼについて記載している。ＷＯ２００５／０
１２３１６は、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ及び他の真菌のΔ１
２－デサチュラーゼについて記載している。ＷＯ２００３／０９９２１６は、Ｎｅｕｒｏ
ｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｂｏｔｒｙｔ
ｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ及びＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａから単離された真菌Δ
１２－デサチュラーゼ及びΔ１５－デサチュラーゼをコードする遺伝子について記載して
いる。ＷＯ２００７１３３４２５は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆ
ｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａか
ら単離された真菌Δ１５－デサチュラーゼについて記載している。好ましいΔ１２－デサ
チュラーゼは、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ由来のものである（Ｒｕｉｚ－Ｌ
ｏｐｅｚら、２０１２）。

【0152】

真菌Δ１２－デサチュラーゼ、及び真菌Δ１５－デサチュラーゼの別のサブクラスは、
二元機能性真菌Δ１２／Δ１５－デサチュラーゼである。これらをコードする遺伝子は、
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｏｌｉｆｏｒｍｅ（受託番号ＤＱ２７２５１６、Ｄａｍｕｄｅ
ら、２００６）、アカントアメーバ・カステラーニ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｃａｓ
ｔｅｌｌａｎｉｉ）（受託番号ＥＦ０１７６５６、Ｓａｙａｎｏｖａら、２００６）、パ
ーキンサス・マリヌス（Ｐｅｒｋｉｎｓｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）（ＷＯ２００７０４２５
１０）、クラビセプス・プルプレア（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）（受託番
号ＥＦ５３６８９８、Ｍｅｅｓａｐｙｏｄｓｕｋら、２００７）及びコプリナス・シネレ
ウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）（受託番号ＡＦ２６９２６６、Ｚｈａｎｇ
ら、２００７）からクローンされた。

【0153】

別の実施形態では、ω３－デサチュラーゼは、少なくともいくらかの活性を有し、好ま
しくは、対応するアシル－ＰＣ基質より、アシル－ＣｏＡ基質に対して大きな活性を有す
る。本明細書で使用するとき、「対応するアシル－ＰＣ基質」は、脂肪酸が該アシル－Ｃ
ｏＡ基質中と同じ脂肪酸であるホスファチジルコリン（ＰＣ）のｓｎ－２位においてエス
テル化された脂肪酸を表す。例えば、アシル－ＣｏＡ基質は、ＡＲＡ－ＣｏＡであってよ
く、対応するアシル－ＰＣ基質はｓｎ－２ＡＲＡ－ＰＣである。実施形態では、活性は、
少なくとも２倍大きい。好ましくは、ω３－デサチュラーゼは、アシル－ＣｏＡ基質とそ
の対応するアシル－ＰＣ基質との両方に対して少なくともいくらかの活性を有し、Ｃ１８
とＣ２０基質の両方に対して活性を有する。そのようなω３－デサチュラーゼの例は、上
記クローンされた真菌デサチュラーゼの中で公知である。

【0154】

さらなる実施形態では、ω３－デサチュラーゼは、配列番号６の配列を有するアミノ酸
、その生物活性フラグメント、または配列番号６と少なくとも６０％同一である、好まし
くは、配列番号６と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を
含む。

【0155】

その上、さらになる実施形態では、本発明で使用するためのデサチュラーゼは、対応す
るアシル－ＰＣ基質より、アシル－ＣｏＡ基質に対して大きな活性を有する。別の実施形
態では、本発明で使用するためのデサチュラーゼは、対応するアシル－ＣｏＡ基質より、
アシル－ＰＣ基質に対して大きな活性を有するが、両方の基質に対していくらかの活性を
有する。上記のように、「対応するアシル－ＰＣ基質」は、脂肪酸が該アシル－ＣｏＡ基
質中と同じ脂肪酸であるホスファチジルコリン（ＰＣ）のｓｎ－２位においてエステル化
された脂肪酸を表す。実施形態では、該より大きな活性は、少なくとも２倍の大きさであ
る。実施形態では、デサチュラーゼは、Δ５もしくはΔ６－デサチュラーゼ、またはω３
－デサチュラーゼであり、この例は、これに限定されないが、表２にリストしたものであ
る。デサチュラーゼがどの基質に対して作用するか、例えば、アシル－ＣｏＡまたはアシ
ル－ＰＣ基質についてテストするため、Ｄｏｍｅｒｇｕｅら（２００３及び２００５）に
記載の酵母細胞内で、アッセイを実行できる。デサチュラーゼと一緒に発現される際、エ
ロンガーゼが該デサチュラーゼの産生の伸長を触媒する場合に、該エロンガーゼが少なく
とも約９０％の植物細胞内酵素転換効率を有するとき、該デサチュラーゼに対するアシル
－ＣｏＡ基質の能力も推測できる。これの基づき、ＧＡ７構築物（実施例２、図２及び配
列番号１を参照のこと）及びその変異体（実施例３）から発現されたΔ５－デサチュラー
ゼ及びΔ４－デサチュラーゼは、それらのそれぞれのアシル－ＣｏＡ基質、ＥＴＡ－Ｃｏ
Ａ及びＤＰＡ－ＣｏＡを不飽和化可能である。

【0156】

エロンガーゼ
脂肪酸伸長が４工程：縮合反応、還元反応、脱水反応及び第二還元反応から成ることは
生化学的証拠が示唆している。本発明に関連して、「エロンガーゼ」は、適切な生理条件
下、伸長複合体の他のメンバーの存在で、縮合工程を触媒するポリペプチドを表す。伸長
タンパク質複合体の縮合成分（「エロンガーゼ」）のみの細胞内非相同発現または相同的
発現は、それぞれのアシル鎖の伸長に必要であることが分かっている。このように、導入
されたエロンガーゼは、トランスジェニック宿主から還元及び脱水活性を首尾良く補充で
き、アシル伸長を上手く実行する。脂肪酸基質の鎖長及び不飽和度に対する伸長反応の特
異性は、縮合成分に属すると考えられる。この成分は、伸長反応に律速であるとも考えら
れる。

【0157】

本明細書で使用するとき、「Δ５－エロンガーゼ」は、ＥＰＡをＤＰＡに少なくとも転
換可能である。Δ５－エロンガーゼの例としては、ＷＯ２００５／１０３２５３に開示さ
れたものが挙げられる。１つの実施形態では、Δ５－エロンガーゼは、ＥＰＡに対して、
少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％
、最も好ましくは少なくとも８０％または９０％の効率でＤＰＡを産生する活性を有する
。さらなる実施形態では、Δ５－エロンガーゼは、配列番号２５のアミノ酸配列、その生
物活性フラグメント、または配列番号２５と少なくとも４７％同一であるアミノ酸配列を
含む。さらなる実施形態では、Δ６－エロンガーゼは、オストレオコッカス・タウリ（Ｏ
ｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉｉ）またはオストレオコッカス ・ルシマリヌス（
Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ）由来である（ＵＳ２０１０／０８
８７７６）。

【0158】

本明細書で使用するとき、「Δ６－エロンガーゼ」は、ＳＤＡをＥＴＡに少なくとも転
換可能である。Δ６－エロンガーゼの例としては、表１にリストしたものが挙げられる。
１つの実施形態では、Δ６－エロンガーゼは、配列番号１６の配列を有するアミノ酸、そ
の生物活性フラグメント（配列番号１７のフラグメントなど）、または配列番号１６また
は配列番号１７の１つまたは両方と少なくとも５５％同一であるアミノ酸配列を含む。実
施形態では、Δ６－エロンガーゼは、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔ
ｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）（Ｚａｎｋら、２００２；受託番号ＡＦ４２８２４３）また
はＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ（Ｒｕｉｚ－Ｌｏｐｅｚら、２０
１２）由来である。

【0159】

本明細書で使用するとき、「Δ９－エロンガーゼ」は、ＡＬＡをＥＴｒＡに少なくとも
転換可能である。Δ９－エロンガーゼの例としては、表１にリストしたものが挙げられる
。１つの実施形態では、Δ９－エロンガーゼは、配列番号２９の配列を有するアミノ酸、
その生物活性フラグメント、または配列番号２９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸
配列を含む。別の実施形態では、Δ９－エロンガーゼは、配列番号３１の配列を有するア
ミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号３１と少なくとも８１％同一である
アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ９－エロンガーゼは、配列番号３３の配列を
有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号３３と少なくとも５０％同
一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ９－エロンガーゼは、配列番号３５
の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号３５と少なくとも
５０％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Δ９－エロンガーゼは、
対応するω３基質より、ω６基質に対して大きな活性を有する、またはその逆である。

【0160】

本明細書で使用するとき、「対応するω３基質より、ω６基質に対して大きな活性を有
する」という語は、ω３デサチュラーゼの作用と異なる基質に対する酵素の相対的作用を
表す。好ましく、ω６基質はＬＡであり、ω３基質はＡＬＡである。

【0161】

Δ６－エロンガーゼ及びΔ９－エロンガーゼ活性を有するエロンガーゼは、少なくとも
（ｉ）ＳＤＡをＥＴＡに転換、及び（ｉｉ）ＡＬＡをＥＴｒＡに転換可能であり、Δ９－
エロンガーゼ活性より大きなΔ６－エロンガーゼ活性を有する。１つの実施形態では、エ
ロンガーゼは、ＳＤＡに対して、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％で
あるＥＴＡを産生する転換効率、及び／またはＡＬＡに対して、少なくとも６％、より好
ましくは少なくとも９％であるＥＴｒＡを産生する転換効率を有する。別の実施形態では
、エロンガーゼは、Δ９－エロンガーゼ活性より、少なくとも約６．５倍大きなΔ６－エ
ロンガーゼ活性を有する。さらなる実施形態では、エロンガーゼは、検出可能なΔ５－エ
ロンガーゼ活性を有しない。

【0162】

他の酵素
微生物細胞などの組換え細胞、またはトランスジェニック植物もしくはその部分に導入
された導入遺伝子は、ＬＰＡＡＴもコードし得る。本明細書で使用するとき、リゾホスフ
ァチジン酸アシルトランスフェラーゼまたはアシル－ＣｏＡ－リゾホスファチジン酸アシ
ルトランスフェラーゼとも呼ばれる「１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトラ
ンスフェラーゼ」（ＬＰＡＡＴ）という語は、ｓｎ－１－アシル－グリセロール－３－リ
ン酸（ｓｎ－１Ｇ－３－Ｐ）を、ｓｎ－２位でアシル化してホスファチジン酸（ＰＡ）を
生成するタンパク質を表す。従って、「１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルト
ランスフェラーゼ活性」という語は、ｓｎ－２位において、ｓｎ－１ Ｇ－３－Ｐをアシ
ル化してＰＡ（ＥＣ２．３．１．５１）を産生することを表す。好ましいＬＰＡＡＴは、
基質として多価不飽和Ｃ２２アシル－ＣｏＡを使用して多価不飽和Ｃ２２アシル基をＬＰ
Ａのｓｎ－２位に転移してＰＡを生成することができるものである。実施形態では、多価
不飽和Ｃ２２アシル－ＣｏＡは、ＤＰＡ－ＣｏＡである。そのようなＬＰＡＡＴを実施例
６に例示しており、そこに記載のように試験できる。実施形態では、本発明の有用なＬＰ
ＡＡＴは、配列番号４０～４６のいずれか１つの配列を有するアミノ酸、その生物活性フ
ラグメント、またはいずれか１つ以上の配列番号４０～４６と少なくとも４０％同一であ
るアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＬＰＡＡＴは、配列番号４４のいずれか１つ
の配列を有するアミノ酸を有しない。好ましい実施形態では、Ｃ２２多価不飽和脂肪アシ
ル－ＣｏＡ基質、好ましくは、ＤＰＡ－ＣｏＡを使用できる、本発明に有用なＬＰＡＡＴ
は、配列番号４１、４２及び４４のいずれか１つの配列を有するアミノ酸、その生物活性
フラグメント、またはいずれか１つ以上の配列番号４１、４２及び４４と少なくとも４０
％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、Ｃ２２多価不飽和脂肪アシル
－ＣｏＡ基質、好ましくは、ＤＰＡ－ＣｏＡを使用できる、本発明に有用なＬＰＡＡＴは
、配列番号４１または４２のいずれか１つの配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグ
メント、またはいずれか１つ以上の配列番号４１または４２と少なくとも４０％同一であ
るアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＬＰＡＡＴは、好ましくは、そのアミノ酸配列が
配列番号４４で記載されるモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐ
ｉｎａ）ＬＰＡＡＴ、または基質としてＤＰＡ－ＣｏＡを使用して、ＤＰＡをＬＰＡに転
移し、ｓｎ－２位においてＤＰＡを有するＰＡを生成できる別のＬＰＡＡＴである。

【0163】

組換え細胞、トランスジェニック細胞、トランスジェニック植物もしくはその部分に導
入された導入遺伝子は、ＤＧＡＴもコードし得る。本明細書で使用するとき、「ジアシル
グリセロールアシルトランスフェラーゼ」（ＥＣ ２．３．１．２０；ＤＧＡＴ）という
語は、脂肪アシル基を、アシル－ＣｏＡからジアシルグリセロール基質に転移してトリア
シルグリセロールを産生するタンパク質を表す。従って、「ジアシルグリセロールアシル
トランスフェラーゼ活性」という語は、アシル－ＣｏＡからジアシルグリセロールへ転移
してトリアシルグリセロールを産生することを表す。それぞれ、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２
及びＤＧＡＴ３と呼ばれる３つの既知タイプのＤＧＡＴがある。ＤＧＡＴ１ポリペプチド
は、通常、１０個の膜貫通型ドメインを有し、ＤＧＡＴ２は、通常、２個の膜貫通型ドメ
インを有し、一方、ＤＧＡＴ３は、通常、可溶性である。ＤＧＡＴ１ポリペプチドの例と
しては、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
）（受託番号ＸＰ＿７５５１７２）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａ
ｌｉａｎａ）（ＣＡＢ４４７７４）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（
ＡＡＲ１１４７９）、シナアブラギリ（Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉ）（ＡＢＣ９４
４７２）、ベルノニア・ガラメンシス（Ｖｅｒｎｏｎｉａ ｇａｌａｍｅｎｓｉｓ）（Ａ
ＢＶ２１９４５、ＡＢＶ２１９４６）、ニシキギ（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ａｌａｔｕｓ）（
ＡＡＶ３１０８３）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）（ＡＡＦ
８２４１０）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ＮＰ＿４４５８８
９）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ＮＰ＿０３６２１１）、並びにそ
の変異体及び／または突然変異体のＤＧＡＴ１遺伝子によりコードされたポリペプチドが
挙げられる。ＤＧＡＴ２ポリペプチドの例としては、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（受託番号ＮＰ＿５６６９５２）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕ
ｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（ＡＡＹ１６３２４）、シナアブラギリ（Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆ
ｏｒｄｉｉ）（ＡＢＣ９４４７４）、モルティエレラ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌ
ｌａ ｒａｍａｎｎｉａｎａ）（ＡＡＫ８４１７９）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａ
ｐｉｅｎｓ）（Ｑ９６ＰＤ７、Ｑ５８ＨＴ５）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）（Ｑ７０
ＶＤ８）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＡＡＫ８４１７５）、ミクロモ
ナス属 （Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ）ＣＣＭＰ１５４５、並びにその変異体及び／または突
然変異体のＤＧＡＴ２遺伝子によりコードされたポリペプチドが挙げられる。ＤＧＡＴ３
ポリペプチドの例としては、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ、Ｓａｈａ
ら、２００６）並びにその変異体及び／または突然変異体のＤＧＡＴ３遺伝子によりコー
ドされたポリペプチドが挙げられる。

【0164】

ポリペプチド／ペプチド
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という語は、概して、互換的に使用される。

【0165】

ポリペプチドまたはポリペプチドの分類を、基準アミノ酸配列に対するそのアミノ酸配
列の同一性の程度（同一性％）により、または１つの基準アミノ酸配列に対して、別のも
のに対するより大きな％の同一性を有することにより、規定し得る。基準アミノ酸配列に
対するポリペプチドの同一性％は、通常、ギャップクリエーションペナルティ＝５、及び
ギャップエクステンションペナルティ＝０．３のパラメーターを用いて、ＧＡＰ解析（Ｎ
ｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０；ＧＣＧプログラム）により決定される。
クエリシーケンスは、少なくとも１５アミノ酸長であり、ＧＡＰ解析は、少なくとも１５
アミノ酸の領域に渡って２つの配列を配置する。より好ましくは、クエリシーケンスは、
少なくとも５０アミノ酸長であり、ＧＡＰ解析は、少なくとも５０アミノ酸の領域に渡っ
て２つの配列を配置する。より好ましくは、クエリシーケンスは、少なくとも１００アミ
ノ酸長であり、ＧＡＰ解析は、少なくとも１００アミノ酸の領域に渡って２つの配列を配
置する。さらにより好ましくは、クエリシーケンスは、少なくとも２５０アミノ酸長であ
り、ＧＡＰ解析は、少なくとも２５０アミノ酸の領域に渡って２つの配列を配置する。さ
らにより好ましくは、ＧＡＰ解析はその完全長に渡って２つの配列を配置する。ポリペプ
チドまたはポリペプチドの分類は、基準のポリペプチドと同じ酵素活性を有してもよく、
異なる活性を有してもよく、または活性を有しなくてもよい。好ましくは、ポリペプチド
は、基準のポリペプチドの少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％また
は少なくとも９０％の酵素活性を有する。

【0166】

本明細書で使用するとき、「生物活性」フラグメントは、例えば、デサチュラーゼ及び
／またはエロンガーゼ活性または他の酵素活性を有する完全長基準ポリペプチドの定義さ
れた活性を維持する、本明細書で定義されたポリペプチドの部分である。本明細書で使用
するとき、生物活性フラグメントは、完全長ポリペプチドを除外する。生物活性フラグメ
ントは、それらが定義された活性を維持する限り、いかなるサイズの部分でもあり得る。
好ましくは、生物活性フラグメントは、完全長タンパク質の少なくとも１０％、少なくと
も５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％の活性を維持する。

【0167】

定義されたポリペプチドまたは酵素に関して、本明細書で提供されたものより高い同一
性％の数字は、好ましい実施形態を包含することは理解されるだろう。従って、適用可能
な場合、最小の同一性％の数字に照らして、ポリペプチド／酵素が、関連する指定配列番
号と、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましく
は７５％、より好ましくは７６％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より
好ましくは９０％、より好ましくは９１％、より好ましくは９２％、より好ましくは９３
％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好まし
くは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％、より好ましくは９９．１％
、より好ましくは９９．２％、より好ましくは９９．３％、より好ましくは９９．４％、
より好ましくは９９．５％、より好ましくは９９．６％、より好ましくは９９．７％、よ
り好ましくは９９．８％、さらにより好ましくは９９．９％同一であるアミノ酸配列を含
むことは好ましい。

【0168】

本明細書で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列変異体／突然変異体を、本明細書で
定義された核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、または所望のポリペプ
チドのインビトロ合成により、準備できる。かかる変異体／突然変異体としては、例えば
、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の組
合せを行って、最終構築物に到達できるが、但し、最終ペプチド構築物は、所望の酵素活
性を有する。

【0169】

突然変異（変化した）ペプチドを、当技術分野で公知のいずれかの技術を用いて、準備
できる。例えば、本明細書で定義されたポリヌクレオチドに対して、インビトロ突然変異
誘発またはＨａｒａｙａｍａ（１９９８）により広範に記載されているＤＮＡシャフリン
グ技術を行うことができる。突然変異／変化したＤＮＡ由来の生成物を、本明細書に記載
の技術を用いて容易にスクリーニングし、それらが、例えば、デサチュラーゼまたはエロ
ンガーゼ活性を有しているかどうかを決定できる。

【0170】

アミノ酸配列突然変異体の設計では、突然変異部位の位置及び突然変異体の性質は、修
飾される特徴に依存するだろう。突然変異の部位を、例えば、（１）先ず、保存的アミノ
酸の選択により、次いで得られた結果に依ってより多くのラジカルの選択により置換し、
（２）対象の残基を欠失し、または（３）その位置に隣接して他の残基を挿入することに
より、個別にまたは連続して修飾できる。

【0171】

アミノ酸配列の欠失は、概して、約１～１５残基、より好ましくは約１～１０残基、典
型的には約１～５隣接残基の範囲である。

【0172】

置換突然変異体は、除去したポリペプチド分子中に少なくとも１つのアミノ酸残基及び
その位置に挿入した異なる残基を有する。置換突然変異誘発の最も対象の部位としては、
天然デサチュラーゼまたはエロンガーゼ中に保存されない部位が挙げられる。これらの部
位は、好ましくは、酵素活性を維持するため、比較的保存的方法で置換される。このよう
な保存的置換を、「実例となる置換」の表題の表３に示す。

【0173】

好ましい実施形態では、突然変異／変異ポリペプチドは、天然ポリペプチドと比較した
とき、保存的アミノ酸変化のみ有する、または１つもしくは２つもしくは３つもしくは４
つ以下の保存的アミノ酸変化を有する。保存的アミノ酸変化の詳細を表３に示す。当業者
が認識するように、かかる少しの変化を、組換え細胞内で発現するとき、ポリペプチドの
活性を変化させないで、合理的に予測できる。

【表3】

【0174】

ポリヌクレオチド
本発明は、例えば、遺伝子、単離ポリヌクレオチド、Ｔ－ＤＮＡ分子などのキメラ遺伝
子構築物、またはキメラＤＮＡであり得るポリヌクレオチドの使用も提供する。ポリヌク
レオチドは、ゲノム起源もしくは合成起源、二本鎖もしくは一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ
であってよく、本明細書で定義された特定の活性を行うために炭水化物、脂質、タンパク
質または他の物質と結合していてもよい。「ポリヌクレオチド」という語は、本明細書中
、「核酸分子」という語と互換的に使用される。

【0175】

実施形態では、ポリヌクレオチドは非天然である。非天然ポリヌクレオチドの例として
は、これに限定されないが、突然変異したもの（本明細書に記載の方法を用いてなど）、
及びタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが自然の状態では関連しない
プロモーター（本明細書に記載の構築物など）と作動可能に結合しているポリヌクレオチ
ドが挙げられる。

【0176】

本明細書で使用するとき、「遺伝子」という語は、広義に考えるべきであり、転写され
た領域を含むデオキシリボヌクレオチド配列及び、もし翻訳されたならば、構造的遺伝子
のタンパク質コード領域を含み、いずれかの末端の少なくとも約２ｋｂの距離に対して、
５’と３’末端の双方上のコード領域と隣接する位置の配列を含み、該遺伝子の発現に関
係する。この点では、遺伝子は、プロモーター、エンハンサー、停止などの制御シグナル
及び／または所与の遺伝子と自然に関連するポリアデニル化シグナル、または該遺伝子が
「キメラ遺伝子」と呼ばれる場合の非相同制御シグナルを含む。タンパク質コード領域の
５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。タンパク質コ
ード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼
ばれる。「遺伝子」という語は、ｃＤＮＡ及び遺伝子のゲノム体の両方を包含する。遺伝
子のゲノム体またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」
と呼ばれる非コード配列により分断され得るコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ
（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントである。イントロンは、エンハンサーな
どの調節エレメントを含み得る。イントロンを、核または一次転写産物から除去または「
スプライシング」し；従って、イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物
中に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳中、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序
を指定する働きをする。「遺伝子」という語は、本明細書に記載のタンパク質の全てまた
は部分をコードする合成または融合分子及び上記のいずれか１つに対する相補ヌクレオチ
ド配列を含む。

【0177】

本明細書で使用するとき、「キメラＤＮＡ」または「キメラ遺伝子構築物」または類似
物は、その天然部位の天然ＤＮＡ分子でないＤＮＡ分子を表し、本明細書で、「ＤＮＡ構
築物」と呼ぶ。通常、キメラＤＮＡまたはキメラ遺伝子は、天然で、作動可能に一緒に結
合したものが見つからない、すなわち、互いに非相同である調節及び転写またはタンパク
質コード配列を含む。従って、キメラＤＮＡまたはキメラ遺伝子は、異なる起源由来の調
節配列及びコード配列、または同じ起源由来だが、天然で見られるものと異なるように配
置されている調節配列及びコード配列を含んでもよい。

【0178】

「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中のその天然の位置の天然遺伝子を表す。本明細書
で使用するとき、「組換え核酸分子」、「組換えポリヌクレオチド」またはその変異体は
、組換えＤＮＡ技術により構築または修飾された核酸分子を表す。「外来性（ｆｏｒｅｉ
ｇｎ）ポリヌクレオチド」または「外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）ポリヌクレオチド」ま
たは「非相同ポリヌクレオチド」等は、実験操作により細胞のゲノム中に導入された核酸
を表す。外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）または外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子は、非天
然生物中に挿入された遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、または
キメラ遺伝子であってよい。「導入遺伝子」は、形質転換方法によりゲノム中に導入され
た遺伝子である。「遺伝子的修飾」、「トランスジェニック」という語及びその変化形は
、形質転換または形質導入により細胞中に遺伝子を導入すること、細胞内の遺伝子を突然
変異させること、及びこれらの作用が起こった細胞または生物またはその子孫内の遺伝子
の調節を変更または調節することを含む。本明細書で使用するとき、「ゲノム領域」は、
導入遺伝子、または導入遺伝子群（本明細書中、クラスターとも呼ばれる）が細胞、また
はその祖先中に挿入されたゲノム内の位置を表す。そのような領域は、本明細書に記載の
方法などにより人の介在によって組み込まれたヌクレオチドのみ含む。

【0179】

ポリヌクレオチドに関連した「外来性」という語は、その自然状態と比較して、変化し
た量で細胞内に存在するときのポリヌクレオチドを表す。１つの実施形態では、細胞は、
自然に、ポリヌクレオチドを含まない細胞である。しかしながら、該細胞は、コードされ
たポリペプチドの変化した産生量で得られる非内在性ポリヌクレオチドを含む細胞であっ
てよい。外来性ポリヌクレオチドは、トランスジェニック（組換え）細胞、または存在す
る場合、無細胞発現系の他成分から分離していないポリヌクレオチド、及びそのような細
胞または少なくともいくつかの他成分から離して引き続き精製した無細胞系で産生された
ポリヌクレオチドを含む。外来性ポリヌクレオチド（核酸）は、天然に存在するヌクレオ
チドの隣接伸長（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）であり得、または結合して一
本鎖ポリヌクレオチドを生成する異なる起源（天然及び／または合成）からのヌクレオチ
ドの２つ以上の隣接伸長を含む。通常、このようなキメラポリヌクレオチドは、対象とな
る細胞内のオープンリーディングフレームの転写の駆動に適切なプロモーターと作動可能
に結合したポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを少なくとも含む。

【0180】

定義されたポリヌクレオチドに関して、上記のものより高い同一性％の特徴は、好まし
い実施形態を包含することは認識されるだろう。このように、適用可能な場合、最小の同
一性％の数字に照らして、ポリヌクレオチドが、関連する指定配列番号と、少なくとも６
０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ま
しくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９１％、
より好ましくは９２％、より好ましくは９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは
９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好
ましくは９９％、より好ましくは９９．１％、より好ましくは９９．２％、より好ましく
は９９．３％、より好ましくは９９．４％、より好ましくは９９．５％、より好ましくは
９９．６％、より好ましくは９９．７％、より好ましくは９９．８％、さらにより好まし
くは９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むことは好ましい。

【0181】

ポリヌクレオチドは、天然分子と比較したとき、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、また
は置換である１つ以上の突然変異を有してもよい。基準配列と比較して突然変異を有する
ポリヌクレオチドは、天然（すなわち、天然起源から単離）または合成（例えば、上記核
酸に対して部位特異的突然変異誘発またはＤＮＡシャフリングを行うことにより）のいず
れかであり得る。従って、ポリヌクレオチドが天然起源または組換えのいずれかからであ
り得ることは明白である。好ましいポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の、植物細胞
内の翻訳にコドン最適化したコード領域を有するものである。

【0182】

組換えベクター
組換え発現を、本発明の組換え細胞、または植物もしくは植物部分の産生するため使用
できる。組換えベクターは、非相同ポリヌクレオチド配列、すなわち、好ましくは、該ポ
リヌクレオチド分子が誘導された種以外の種由来の、本明細書で定義されたポリヌクレオ
チド分子と隣接して、天然に見られないポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、ＲＮ
ＡあるいはＤＮＡのいずれかであり得、通常、プラスミドである。プラスミドベクターは
、通常、原核細胞内の発現カセット、例えば、ｐＵＣ誘導ベクター、ｐＳＫ誘導ベクター
、ｐＧＥＭ誘導ベクター、ｐＳＰ誘導ベクター、ｐＢＳ誘導ベクター、または好ましくは
、１つ以上のＴ－ＤＮＡ領域を含むバイナリーベクターの容易な選択、増幅、及び形質転
換を提供する付加的核酸配列を含む。付加的核酸配列は、ベクターの自律的複製を提供す
る複製開始点、好ましくは、抗菌剤または除草剤耐性をコードする選択可能なマーカー遺
伝子、核酸配列または核酸構築物内でコードされた遺伝子を挿入する多重部位を提供する
固有の多重クローニング部位、及び原核細胞及び真核細胞（特に植物）の形質転換を促進
する配列を含む。組換えベクターは、好ましくは、本明細書で定義されたキメラ遺伝子構
築物と組み合わせて、本明細書で定義された１つより多いポリヌクレオチド、例えば、３
つ、４つ、５つまたは６つの本明細書で定義されたポリヌクレオチドを含んでもよく、各
ポリヌクレオチドは、対象となる細胞内で作働可能な発現制御配列と作動可能に結合して
いる。好ましくは、該発現制御配列は、非相同プロモーターを含む、または全てである、
すなわち、それらが制御するコード領域に関して非相同である。本明細書で定義された１
つより多いポリヌクレオチド、例えば、３つ、４つ、５つまたは６つのポリヌクレオチド
、好ましくは、各々が異なるポリペプチドをコードする７つまたは８つのポリヌクレオチ
ドを、好ましくは、１つのＴ－ＤＮＡ分子内の１つの組換えベクター中で好適に共有結合
し、それから、細胞内に１つの分子として導入して本発明に記載の組換え細胞を生成し、
好ましくは、組換え細胞のゲノム内に、例えば、トランスジェニック植物内に組み込んで
もよい。ゲノム内への組込みは、核のゲノムまたはトランスジェニック植物のプラスチド
ゲノム内への組込みであってよい。それにより、そのように結合したポリヌクレオチドは
、組換え細胞または植物の子孫の単一遺伝子座として一緒に遺伝するだろう。組換えベク
ターまたは植物は、２つ以上のそのような組換えベクターを含んでもよく、各々は、例え
ば、各々の組換えベクターが３つ、４つ、５つまたは６つのポリヌクレオチドを含む、複
数のポリヌクレオチドを含む。

【0183】

本明細書で使用するとき、「作動可能に結合」は、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）
セグメント間の機能的関係性を表す。通常、転写された配列に対する転写調節エレメント
（プロモーター）の機能的関係性を表す。例えば、プロモーターは、もし、適切な細胞内
のコード配列の転写を刺激または調節するならば、本明細書で定義されたポリヌクレオチ
ドなどのコード配列と作動可能に結合する。概して、転写配列と作動可能に結合している
プロモーター転写調節エレメントは、転写配列と物理的に隣接している、すなわち、それ
らはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写調節エレメン
トは、それらがその転写を促進するコード配列と物理的に隣接または近接近して配置して
いる必要がない。

【0184】

複数のプロモーターが存在するとき、各プロモーターは、独立して、同じであっても異
なっていてもよい。好ましくは、６つの異なるプロモーター配列のうち少なくとも３つか
ら最大値までを、組換えベクター内で使用して、外来性ポリヌクレオチドの発現を制御す
る。

【0185】

キメラＤＮＡまたは遺伝子構築物などの組換え分子は、（ａ）単一ペプチド配列をコー
ドして、本明細書で定義された発現されたポリペプチドが該ポリペプチドを産生または該
発現されたポリペプチドの局在化、例えば、細胞内の小胞体（ＥＲ）中のポリペプチドの
保持を提供する１つ以上の分泌シグナル、及び／または（ｂ）融合タンパク質として核酸
分子の発現をもたらす融合配列も含んでもよい。適切な単一セグメントの例としては、本
明細書で定義されたポリペプチドの分泌または局在化を誘導可能ないずれかのシグナルセ
グメントが挙げられる。組換え分子は、本明細書で定義された核酸分子の核酸配列周囲及
び／または内の介在及び／または非翻訳配列も含んでもよい。

【0186】

形質転換体の同定を容易にするため、核酸構築物は、外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）または
外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）ポリヌクレオチドとして、またはそれに加えて、選択可能
またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を望ましく含む。「マーカー遺伝子」は、カ
ーカー遺伝子を発現する細胞に別のフェノタイプを付与して、それ故、そのような形質転
換された細胞を、マーカーを有しない細胞と区別することを可能とする遺伝子を意味する
。選択可能なマーカー遺伝子は、選択剤（例えば、除草剤、抗菌剤、放射線、熱、または
形質転換していない細胞にダメージを与える他の処理）に対する耐性に基づいて「選択」
できる特色を与える。スクリーニング可能なマーカー遺伝子（またはリポーター遺伝子）
は、観察または試験により、すなわち、「スクリーニング」（例えば、β－グルクロニダ
ーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰまたは形質転換していない細胞内に存在しない他の酵素活
性）により、同定できる特色を与える。マーカー遺伝子及び対象となるヌクレオチド配列
は、結合している必要がない。マーカーの実際の選択は、植物細胞などの選択の細胞と組
み合わせて機能的（すなわち、選択的）である限り、重大ではない。

【0187】

選択可能なマーカーの例は、アンピシリン、クロラムフェニコールまたはテトラサイク
リン耐性、好ましくは、カナマイシン耐性などの抗菌耐性を与えるマーカーである。植物
形質転換体の選択のための実例となる選択可能なマーカーとしては、これに限定されない
が、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするｈｙｇ遺伝子；カナマイシン、パロモマイシン
、Ｇ４１８に対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）
遺伝子；例えば、ＥＰ２５６２２３に記載のグルタチオン誘導除草剤に対する耐性を与え
るラット肝臓のグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ；例えば、過剰発現時、ＷＯ８７／
０５３２７に記載のホスフィノトリシンなどのグルタミンシンセターゼインヒビターに対
する耐性、例えば、ＥＰ２７５９５７に記載の選択剤ホスフィノトリシンに対する耐性を
与えるストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄ
ｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、例えば、Ｈｉｎｃｈ
ｅｅら（１９８８）により記載されたＮ－ホスホノメチルグリシンに対する耐性を与える
５－エノールシキメート－３－ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝
子、または好ましくは、例えば、ＷＯ９１／０２０７１に記載のビアラホスに対する耐性
を与えるｂａｒ遺伝子が挙げられる。

【0188】

好ましくは、核酸構築物を、植物細胞などの細胞のゲノム内に安定に組み込む。従って
、核酸は、分子がゲノム内に組み込まれることを可能とする適切なエレメントを含んでも
よく、好ましくは、Ｔ－ＤＮＡ分子または構築物の左右境界配列を、細胞の染色体中に組
み込むことができる適切なベクター内に配置する。

【0189】

発現
本明細書で使用するとき、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換すること及び１つ以上
の特異的ポリヌクレオチド分子の発現に影響することが可能であるＤＮＡベクターである
。本発明の発現ベクターは、植物細胞内または微生物細胞などの組換え細胞内で遺伝子発
現を誘導できる。本発明に有用な発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製開
始点、及び組換え細胞と互換性があり、本発明のポリヌクレオチド分子の発現を制御する
他の調節配列などの調節配列を含む。特に、本発明に有用なポリヌクレオチドまたはベク
ターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、及び停止を制御する
配列である。特に、重要な転写制御配列は、プロモーター及びエンハンサー配列などの転
写開始を制御するものである。適切な転写制御配列は、本発明の少なくとも１つの組換え
細胞内で機能できるいずれかの転写制御配列を含む。使用される調節配列の選択は、対象
となる植物及び／または器官または組織などの対象生物体に依存する。かかる調節配列を
、植物または植物ウイルスなどの真核生物から得てもよく、化学的に合成してもよい。様
々なそのような転写制御配列は、当業者に公知である。特に、好ましい転写制御配列は、
恒常的にあるいは植物もしくその部分の使用に依存して特異的な段階及び／または組織の
いずれかに、植物内の転写を誘導する活性のあるプロモーターである。

【0190】

植物細胞の安定なトランスフェクトまたはトランスジェニック植物の確立に適切ないく
つかのベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８５、ｓｕｐｐ． １９８７；Ｗｅｉｓｓ
ｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；及びＧｅｌｖｉｎ
ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｋｌｕｗｅｒ
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９０に記載されている。通常、植物発現
ベクターとしては、例えば、５’及び３’調節配列及び優性選択可能マーカーの転写制御
下の１つ以上のクローン植物遺伝子が挙げられる。かかる植物発現ベクターは、プロモー
ター調節領域（例えば、誘導的もしくは恒常的、環境的に調節もしくは発生的に調節、ま
たは細胞特異的もしくは組織特異的発現を制御する調節領域）、転写開始部位、リボソー
ム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写停止部位、及び／またはポリアデニル化
シグナルも含み得る。

【0191】

植物細胞で活性ないくつかの構成的プロモーターを説明した。植物の構成的発現に適切
なプロモーターとしては、これに限定されないが、カリフラワーモザイクウイルス（Ｃａ
ＭＶ）３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ、及びリブ
ロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットからの光誘導プロモーター
が挙げられる。

【0192】

葉、種子、根または幹などの植物の源組織の発現の目的のため、本発明で利用されるプ
ロモーターがこれらの特異的組織内で比較的高い発現を有することは好ましい。多くの例
が当技術分野で周知である。環境、ホルモン、化学的、及び／または発生のシグナルに応
答して調節される様々な植物遺伝子プロモーターを、植物細胞内で遺伝子発現のためにも
使用でき、または器官特異的プロモーターを使用することも有利であり得る。

【0193】

本明細書で使用するとき、「種子特異的プロモーター」という語またはその変化形は、
他の植物組織と比較したとき、優先的に、植物、好ましくは、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉ
ｃａ ｓｐ．）、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）またはダイズ（
Ｇ． ｍａｘ）の植物の発育種子の遺伝子転写を誘導するプロモーターを表す。実施形態
では、種子特異的プロモーターを、植物の葉及び／または幹と比較して、植物の発育種子
中で、少なくとも５倍強力に発現し、他の植物組織と比較して、発育種子の胚中でより強
力に好適に発現する。好ましくは、プロモーターのみが、発育種子中の対象となる遺伝子
の発現を誘導し、及び／または葉などの植物の他の部分中の対象となる遺伝子の発現はノ
ーザンブロット解析及び／またはＲＴ－ＰＣＲにより検出できない。通常、プロモーター
は、種子の成長及び発育中、特に、種子内の貯蔵化合物の合成フェーズ及び蓄積中、遺伝
子の発現を駆動する。かかるプロモーターは、植物貯蔵器官全体もしくは種皮、もしくは
子葉などのその部分のみ、好ましくは、双子葉植物の種子中の胚、または単子葉植物の種
子の胚乳もしくはアリューロン層中の遺伝子発現を駆動し得る。

【0194】

種子特異的発現のための好ましいプロモーターとしては、ｉ）脂肪酸デサチュラーゼ及
びエロンガーゼなどの、種子内の脂肪酸生合成及び蓄積に関連する酵素をコードする遺伝
子からのプロモーター、ｉｉ）種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子からのプロモータ
ー、及びｉｉｉ）種子内の炭水化物生合成及び蓄積に関連する酵素をコードする遺伝子か
らのプロモーターが挙げられる。適切な種子特異的プロモーターは、アブラナナピン遺伝
子プロモーター（ＵＳ５，６０８，１５２）、ソラマメＵＳＰプロモーター（Ｂａｕｍｌ
ｅｉｎら、１９９１）、アラビドプシス・オレオシン（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｏｌｅ
ｏｓｉｎ）プロモーター（ＷＯ９８／４５４６１）、ファセオラス・ブルガリス（Ｐｈａ
ｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ファゼオリンプロモーター（ＵＳ５，５０４，２００
）、ブラシカＢｃｅ４プロモーター（ＷＯ９１／１３９８０）またはソラマメからのレグ
ミンＬｅＢ４プロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎら、１９９２）及びトウモロコシ、オオム
ギ、コムギ、ライムギ、コメなどの単子葉植物中の種子特異的発現をもたらすプロモータ
ーである。適切な注目すべきプロモーターは、オオムギｌｐｔ２またはｌｐｔ１遺伝子プ
ロモーター（ＷＯ９５／１５３８９及びＷＯ９５／２３２３０）またはＷＯ９９／１６８
９０に記載のプロモーター（オオムギホルデイン遺伝子、コメグルテリン遺伝子、コメオ
リジン遺伝子、コメプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝
子、トウモロコシゼイン遺伝子、カラスムギグルテリン遺伝子、モロコシカシリン（ｋａ
ｓｉｒｉｎ）遺伝子、ライムギセカリン遺伝子からのプロモーター）である。他のプロモ
ーターとしては、Ｂｒｏｕｎら（１９９８）、Ｐｏｔｅｎｚａら（２００４）、ＵＳ２０
０７０１９２９０２及びＵＳ２００３０１５９１７３に記載されたものが挙げられる。実
施形態では、種子特異的プロモーターを、優先的に、胚、子葉または胚乳などの画定され
た種子部分内で発現する。そのような特異的プロモーターの例としては、これに限定され
ないが、ＦＰ１プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍら、１９９６）、エンドウマメレグ
ミンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎら、２０００）、マメフィトヘマグルトニンプロモータ
ー（Ｐｅｒｒｉｎら、２０００）、アマ２Ｓ貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のコンリ
ニン１及びコンリニン２プロモーター（Ｃｈｅｎｇら、２０１０）、シロイヌナズナ（Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＦＡＥ１遺伝子のプロモーター、セイ
ヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）のグロブリン様タンパク質遺伝子のＢｎ
ＧＬＰプロモーター、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）からのペルオキ
シレドキシン遺伝子のＬＰＸＲプロモーターが挙げられる。

【0195】

５’非翻訳リーダー配列を、本発明のポリヌクレオチドの非相同遺伝子配列を発現する
ため選択されたプロモーターから誘導でき、または好ましくは、産生される酵素のコード
領域に関して非相同であり、ｍＲＮＡの翻訳を増強するように、必要に応じて、特異的に
修飾できる。導入遺伝子の最適発現をレビューするため、Ｋｏｚｉｅｌら（１９９６）参
照。５’非翻訳領域を、植物ウイルスＲＮＡ（とりわけ、タバコモザイクウイルス、タバ
コエッチウイルス、トウモロコシドワーフモザイクウイルス、アルファルファモザイクウ
イルス）から、適切な真核遺伝子、植物遺伝子（コムギ及びトウモロコシクロロフィルａ
／ｂ結合タンパク質遺伝子リーダー）から、または合成遺伝子配列からも得ることができ
る。本発明は、非翻訳領域がプロモーター配列を付随する５’非翻訳配列から誘導される
構築物に限定されない。リーダー配列を、関連しないプロモーターまたはコード配列から
も誘導できる。本発明との関連で有用なリーダー配列は、トウモロコシＨｓｐ７０リーダ
ー（ＵＳ５，３６２，８６５及びＵＳ５，８５９，３４７）、及びＴＭＶオメガエレメン
トを含む。

【0196】

転写停止を、キメラベクター中で対象となるポリヌクレオチドと作動可能に結合した３
’非翻訳ＤＮＡ配列により実行する。組換えＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、植物内で、
アデニル酸ヌクレオチドのＲＮＡの３’末端への付加を引き起こす機能をするポリアデニ
ル化シグナルを含む。３’非翻訳領域を、植物細胞内で発現される様々な遺伝子から得る
ことができる。ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域、エンドウマメ小サブユニットルビス
コ遺伝子からの３’非翻訳領域は、ダイズ７Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子またはアマコン
リニン遺伝子からの３’非翻訳領域が、この目的で、共通に使用される。アグロバクテリ
ウム腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドのポリアデニル化シグナルを含む３’転写された非翻訳
領域も適切である。

【0197】

組換えＤＮＡ技術を、例えば、宿主細胞内のポリヌクレオチド分子の複製数、これらの
ポリヌクレオチド分子が転写される効率、得られた転写産物が翻訳される効率、及び翻訳
後修飾の効率の操作により、形質転換されたポリヌクレオチド分子の発現を改良するため
に使用できる。本明細書で定義されたポリヌクレオチド分子の発現の増加に有用な組換え
技術としては、これに限定されないが、ポリヌクレオチド分子の１つ以上の宿主細胞染色
体への組込み、ｍＲＮＡへの安定配列の付加、転写制御シグナルの置換または修飾（例え
ば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）、翻訳制御シグナルの置換または修飾
（例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガノ配列）、宿主細胞のコドン使用頻度
に対応するためのポリヌクレオチド分子の修飾、及び転写を不安定化する配列の欠失が挙
げられる。

【0198】

トランスジェニック植物
本明細書で名詞として使用するとき、「植物」という語は、植物全体を表すが、形容詞
として使用するとき、例えば、植物器官（例えば、葉、幹、根、花）、１つの細胞（例え
ば、花粉）、種子、植物細胞など、植物中に存在、植物から得られる、植物由来、または
植物に関連する物質を表す。「植物部分」という語は、該植物部分が本発明に記載の脂質
を合成する限り、例えば、葉もしくは幹、根、花器もしくは花の構造物、花粉、種子、胚
などの種子部分、胚乳、胚盤もしくは種皮、例えば、維管束組織などの植物組織、その細
胞と子孫などの植物性構造物を含む植物ＤＮＡを含む全ての植物部分を表す。

【0199】

概して、「トランスジェニック植物」、「遺伝子的に修飾された植物」またはその変化
形は、同じ種、変種または栽培品種の野生型植物に見られない遺伝子構築物（「導入遺伝
子」）を含む植物を表す。本発明に関連して定義されたトランスジェニック植物は、組換
え技術を用いて遺伝子的に修飾して、所望の植物または植物器官内で本明細書中に定義さ
れた脂質または少なくとも１つのポリペプチドの産生を引き起こした植物またはその子孫
を含む。トランスジェニック植物細胞及びトランスジェニック植物部分は、対応する意味
を有する。本明細書で呼ぶ「導入遺伝子」は、バイオテクノロジーの技術分野における通
常の意味を有し、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術により産生または変更され、植物細胞内
に導入された遺伝子配列を含む。導入遺伝子は、該導入遺伝子が植物細胞以外の細胞に導
入された、または異なる種、変種もしくは栽培品種、または由来である植物細胞と同じ種
、変種もしくは栽培品種であり得る植物細胞由来の遺伝子配列を含む。通常、導入遺伝子
は、植物などの細胞内に、例えば、形質転換などのヒトの操作により導入されるが、いず
れの方法も、当業者が認識する通りに使用できる。

【0200】

「種子」及び「穀物」という語は、本明細書で互換的に使用される。「穀物」は、収穫
された穀物またはまだ植物上にあるがいつでも収穫する状態になっている穀物などの成熟
した穀物を表すが、文脈により吸水または発芽後の穀物も表し得る。成熟した穀物または
種子は、通常、約１８～２０％未満、好ましくは、１０％未満の含水率を有する。キャノ
ーラ種子などのアブラナ属種子は、通常、成熟時、約４～８％または６～８％、好ましく
は、約４％～約６％の含水率を有する。本明細書で使用するとき、「発育種子」は、成熟
前、通常、受精または開花後の植物の生殖構造物内で見られる種子を表すが、植物から単
離された成熟前のそのような種子も表し得る。

【0201】

本明細書で使用するとき、「植物部分を得ること」または「種子を得ること」という語
は、畑または温室もしくはグロースチャンバーなどのコンテインメントの植物から植物部
分または種子を収穫することを含み、または該植物部分もしくは種子の供給者から購入も
しくは受け取ることにより、それぞれ、植物部分または種子を得るいずれかの手段を表す
。室温における標準的生育条件は、自然光の射す、２２～２４℃の日中温度及び１６～１
８℃の夜間温度を含む。種子は、呈色に適切であり得る、すなわち、子孫植物を発芽また
は産生できる、あるいは、もはや発芽できないように処理した、例えば、食物もしくは飼
料用途、または本発明の脂質の抽出に有用である、粉砕、研磨もしくは製粉した種子であ
り得る。

【0202】

本明細書で使用するとき、「植物貯蔵器官」という語は、例えば、タンパク質、炭水化
物、脂肪酸及び／またはオイルの形態でエネルギーを貯蔵するために特殊化した植物の部
分を表す。植物貯蔵器官の例としては、種子、果実、塊根、及び塊茎が挙げられる。好ま
しい植物貯蔵器官は種子である。

【0203】

本発明のまたは本発明で使用される植物または植物部分は、好ましくは、表現型的に正
常である。本明細書で使用するとき、「表現型的に正常」という語は、遺伝的に修飾され
た植物または植物器官、特に、未修飾の植物または植物器官と比較したとき、生育及び繁
殖する能力を著しく低下していない種子、塊茎または果実などの貯蔵器官を表す。実施形
態では、表現型的に正常である遺伝的に修飾された植物または植物器官は、外来性ポリヌ
クレオチドを含まないアイソジェニックな植物または器官と本質的に同じである生育また
は繁殖する能力を有する。好ましくは、バイオマス、生育速度、発芽速度、貯蔵器官サイ
ズ、花粉生存率、雌雄受精、種子サイズ及び／または産生された生存種子数は、同一条件
下で生育したとき、前記外来性ポリヌクレオチドを含まない植物の９０％以上である。好
ましくは、本発明の植物、または本発明の種子から産生した植物の花粉生存率は、対応す
る野生型植物の花粉生存率と比較して約１００％である。この語は、野生型植物と異なり
得るが、例えば、子葉（ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｌｅａｖｅｓ）のバレリーナ表現型などの商
業目的用植物の有用性に影響しない、植物の特徴を包含しない。

【0204】

本発明により提供される、または本発明の実践での使用を考慮した植物としては、単子
葉植物及び双子葉植物の両方が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の植物は、作
物（例えば、穀類及び豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、コメ、モロ
コシ、アワ、キャッサバ、オオムギ、またはエンドウマメ）、または他のマメ科植物であ
る。植物を、食用根、塊茎、葉、幹、花または果実の産生のため生育してもよい。植物は
、野菜植物または観賞植物であってよい。本発明の、または本発明に有用な植物は：トウ
モロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｂ
ｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ．）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）
、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇ
ｏ ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃ
ｅｒａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｕｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌ
ｇａｒｅ）ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｕｍ
ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ
（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ
）、サツマイモ（Ｌｏｐｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅ
ｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ ｓｐｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕ
ｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａ ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘系樹木（ｃｉｔｒ
ｉｓ ｔｒｅｅ）（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａ
ｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｅｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）アボ
カド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、
グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴ（Ｍａｎｇｉｆｅｒ ｉｎｄｉｃａ
）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ
）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃ
ａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄ
ａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、カラスムギ、またはオオ
ムギであってよい。

【0205】

好ましい実施形態では、植物は被子植物である。

【0206】

実施形態では、植物は、油料種子植物、好ましくは、油料種子作物である。本明細書で
使用するとき、「油料種子植物」という語は、該植物の種子からオイルの商業的産生のた
めに使用される植物種である。油料種子植物は、油料種子用セイヨウアブラナ（ｒａｐｅ
）（セイヨウアブラナ（ｃａｎｏｌａ）など）、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、モロ
コシ、アマ（亜麻仁）またはサトウダイコンであってよい。さらに、油料種子植物は、他
のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａｓ）、ワタ、ピーナッツ、ポピー、カラシナ、トウゴマ
、ゴマ、ヒマワリ、ベニバナ、アマナズナ属（Ｃａｍｅｌｉｎａ）、クランベ属（Ｃｒａ
ｍｂｅ）または木の実を産生する植物であってよい。植物は、オリーブ、油ヤシまたはコ
コナッツなどのその果実中に高レベルのオイルを産生し得る。本発明を適用し得る園芸植
物は、レタス、エンダイブ、またはキャベツ、ブロッコリー、またはカリフラワーを含む
野菜のアブラナ属である。本発明を、タバコ、ウリ科植物、ニンジン、イチゴ、トマト、
またはコショウに適用してもよい。

【0207】

さらに好ましい実施形態では、本発明のトランスジェニック植物を産生するために使用
される非トランスジェニック植物は、特に種子中に、ｉ）２０％未満、１０％未満または
５％未満の１８：２脂肪酸及び／またはｉｉ）１０％未満または５％未満の１８：３脂肪
酸を有するオイルを産生する。

【0208】

好ましい実施形態では、トランスジェニック植物またはその部分は、その子孫が所望の
表現型に対して分離しないように導入された（導入遺伝子）各々及び全ての遺伝子（外来
性ポリヌクレオチド）について相同である。トランスジェニック植物は、導入された導入
遺伝子について非相同であってもよく、好ましくは、例えば、ハイブリッド種子から生育
したＦ１子孫など、導入遺伝子について一律に非相同であってよい。そのような植物は、
当技術分野で周知の雑種強勢などの長所を備え得、または植物育種もしくは戻し交配で使
用され得る。

【0209】

関連する場合、トランスジェニック植物またはその部分は、これに限定されないが、Δ
６－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ
、Δ５－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ、Δ５－エロンガーゼ、ジアシルグリセ
ロールアシルトランスフェラーゼ、ＬＰＡＡＴ、Δ１７－デサチュラーゼ、Δ１５－デサ
チュラーゼ及び／またはΔ１２－デサチュラーゼなどＬＣ－ＰＵＦＡの産生に関連する酵
素をコードする付加的導入遺伝子も含んでよい。１つ以上のこれらの活性を有するそのよ
うな酵素の例は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載のものが挙げられる。具体例
では、トランスジェニック植物は；
ａ）Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－エロンガーゼ、及びΔ６－
エロンガーゼ、
ｂ）Δ５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－エロンガーゼ、及びΔ９－
エロンガーゼ、
ｃ）Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－エロンガーゼ、Δ６－エロ
ンガーゼ、及びΔ１５－デサチュラーゼ、
ｄ）Δ５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－エロンガーゼ、Δ９－エロ
ンガーゼ、及びΔ１５－デサチュラーゼ、
ｅ）Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－エロンガーゼ、Δ６－エロ
ンガーゼ、及びΔ１７－デサチュラーゼ、
ｆ）Δ５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－エロンガーゼ、Δ９－エロ
ンガーゼ、及びΔ１７－デサチュラーゼ、
ｇ）ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ
５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｈ）ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ
５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、
Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガ
ーゼ、
ｊ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、
Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガ
ーゼ、
ｋ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
、ω３－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロン
ガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｌ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
、Δ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロ
ンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｍ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
、Δ１２－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロ
ンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｎ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
、Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ
、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロン
ガーゼ、
ｏ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
、ω３－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロン
ガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｐ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
、Δ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロ
ンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、
ｑ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
、Δ１２－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロ
ンガーゼ、及びΔ５－エロンガーゼ、または
ｒ）１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
、Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ
、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ、及びΔ５－エロ
ンガーゼ、
をコードする外来性ポリヌクレオチドのセットを少なくとも含む。

【0210】

実施形態では、外来性ポリヌクレオチドは、ピシリウム・イレグラーレ（Ｐｙｔｈｉｕ
ｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）Δ６－エロンガーゼ、スラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓ
ｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）Δ５－デサチュラーゼまたはエミリアナ ・ハックスレイ（Ｅｍｉ
ｌｉａｎａ ｈｕｘｌｅｙｉ）Δ５－デサチュラーゼ、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏ
ｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）Δ６－エロンガーゼ、スラウストキトリッド（Ｔｈｒ
ａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）Δ５－エロンガーゼまたはオストレオコッカス・タウリ（Ｏ
ｓｔｒｅｏｃｃｃｕｓ ｔａｕｒｉｉ）Δ５－エロンガーゼ、及びフィトフトラ・インフ
ェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）ω３－デサチュラーゼま
たはピシリウム・イレグラーレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）ω３－デサチ
ュラーゼであるポリペプチドのセットをコードする。

【0211】

実施形態では、本発明の、または本発明に使用される植物を、畑、好ましくは、本質的
に同じ、または少なくとも１ヘクタールまたは２ヘクタールの面積である少なくとも１，
０００、１，０００，０００または２，０００，０００の植物の集団として生育する。栽
植密度は、植物種、植物品種、天候、土壌条件、肥料割合及び当技術分野で公知の他の因
子に応じて異なる。例えば、セイヨウアブラナは、通常、ヘクタール当たり１．２～１．
５百万植物の栽植密度で生育される。当技術分野で公知のように、植物を収穫し、植物を
刈取り（ｓｗａｔｈｉｎｇ）、引抜き及び／または刈取り（ｒｅａｐｉｎｇ）し、次いで
、植物素材を脱穀及び／または風選して、しばしばもみ殻の形態である植物部分の残部か
ら種子を分離することを含み得る。あるいは、種子を、１回の処理、例えば、コンバイン
収穫機で、畑の植物から収穫してもよい。

【0212】

植物の形質転換
トランスジェニック植物を、Ａ．Ｓｌａｔｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ－Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｏ
ｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００３）、及びＰ．Ｃｈｒｉｓｔｏ
ｕ ａｎｄ Ｈ．Ｋｌｅｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（２００４）に全般的に記載された
ものなど、当技術分野で公知の技術を用いて産生できる。

【0213】

本明細書で使用するとき、「安定に形質転換すること」、「安定に形質転換された」及
びその変化形は、それらの存在について積極的に選択する必要なく、細胞分裂中の子孫細
胞に転移されるように、該細胞のゲノム中に、外来性核酸分子を組み込むことを表す。安
定な形質転換、またはその子孫を、染色体ＤＮＡに対するサザンブロットまたはゲノムＤ
ＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの当技術分野で公知のいずれかの方法
により選択できる。好ましくは、植物形質転換を、本明細書の実施例で記載の通り実施す
る。

【0214】

アグロバクテリウム介在転移は、植物細胞ゲノム中のＤＮＡの一過性発現または安定な
組込みのいずれかのため、全植物組織または植物器官または組織培養中の移植片中の細胞
に、ＤＮＡを導入できるので、植物細胞中に遺伝子を導入するために広範に応用できるシ
ステムである。ＤＮＡを植物細胞に導入するためのアグロバクテリウム介在植物組込みベ
クターの使用は、アグロバクテリウムまたはＤＮＡを植物細胞に導入できる他の細菌を用
いたフローラルディップ法を含み、当技術分野で周知である（例えば、ＵＳ５１７７０１
０、ＵＳ５１０４３１０、ＵＳ５００４８６３またはＵＳ５１５９１３５参照）。転移さ
れるＤＮＡ領域は、境界配列により画定され、介在ＤＮＡ（Ｔ－ＤＮＡ）は、通常、植物
ゲノムに挿入される。さらに、Ｔ－ＤＮＡの組込みは、ほとんど再転位のない比較的正確
な処理である。アグロバクテリウム介在形質転換が効率的である場合のこれらの植物品種
では、遺伝子導入の容易且つ定義された性質から、選択の方法となる。好ましいアグロバ
クテリウム形質転換ベクターは、記載のように便利な操作を可能とする、アグロバクテリ
ウムだけでなく大腸菌内で複製可能である（Ｋｌｅｅら、Ｉｎ：Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ、Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７９～２０３（１９８５））
。

【0215】

使用され得る加速法としては、例えば、微粒子銃などが挙げられる。形質転換する核酸
分子を植物細胞に送達する方法の１つの例は、微粒子銃である。この方法は、Ｙａｎｇら
．Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１
９９４）に概説されている。非生物粒子（微粒子噴出体）を核酸で被覆し、推進力により
細胞に送達し得る。例証となる粒子としては、タングステン、近、プラチナ等から成るも
のが挙げられる。単子葉植物を再現性よく形質転換する効率的手段であることに加えて、
微粒子銃の特定の利点は、プロトプラストの単離もアグロバクテリウム感染の感受性も必
要ないことである。

【0216】

別の代替の実施形態では、プラスチドを、安定に形質転換できる。高等植物のプラスチ
ド形質転換について開示された方法としては、選択可能なマーカーを含み、ＤＮＡを相同
組換えによるプラスチドゲノムに標的化するＤＮＡのパーティクルガン送達が挙げられる
（ＵＳ５，４５１，５１３、ＵＳ５，５４５，８１８、ＵＳ５，８７７，４０２、ＵＳ５
，９３２４７９、及びＷＯ９９／０５２６５）。

【0217】

細胞形質転換の他の方法も使用でき、これに限定されないが、花粉への直接ＤＮＡ転移
により、植物の生殖器中へのＤＮＡの直接注入により、または未成熟胚の細胞中にＤＮＡ
を直接注入して、次いで、乾燥胚に水分補給して戻すことにより、ＤＮＡを植物に導入す
ることが挙げられる。

【0218】

単一の植物プロトプラスト形質転換から、または様々な形質転換移植片からの植物の再
生、発育、及び栽培は、当技術分野で周知である（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈら，Ｉｎ：Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，（１９８８））。この再生及び生
育過程としては、形質転換細胞の選択工程、定着小植物期を通して胚発育の通常期にわた
るこれらの個別化細胞の培養工程を通常含む。トランスジェニック胚及び種子を同様に再
生する。得られたトランスジェニック定着新芽を、その後に、土壌などの適切な植物生育
培地で栽培する。

【0219】

外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子を含む植物の発育ま
たは再生は、当技術分野で周知である。好ましくは、再生された植物を、相同トランスジ
ェニック植物を得るため自家受粉する。さもなければ、再生植物から得られた花粉を、農
学的に重要な系統の種子から生育する植物と交雑する。逆に、所望の外来性核酸を含む本
発明のトランスジェニック植物を、当業者に周知の方法を用いて栽培する。所望の外来性
核酸を含む本発明のトランスジェニック植物を、当業者に周知の方法を用いて培養する。

【0220】

トランスジェニック細胞及び植物内の導入遺伝子の存在を確認するため、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法またはサザンブロット解析を、当業者に公知の方法を用いて実
施できる。導入遺伝子の発現産生物を、該産生物の性質に依存して、様々な方法のいずれ
かで検出でき、ウェスタンブロット法及び酵素アッセイを含む。一旦、トランスジェニッ
ク植物を得たならば、それらを、所望の表現型を有する植物組織または部分を産生するよ
うに生育し得る。該植物組織または部分を収穫、及び／または種子を採取し得る。種子は
、所望の特徴を有する組織または部分を含む追加の植物を成長源の役割をし得る。

【0221】

アグロバクテリウムまたは他の形質転換方法を用いて作成したトランスジェニック植物
は、１つ染色体上に単一の遺伝子座を通常含む。かかるトランスジェニック植物を、付加
遺伝子についてヘミ接合であると言うことができる。より好ましくは、付加遺伝子につい
てホモ接合であるトランスジェニック植物、すなわち、２つの付加遺伝子を含むトランス
ジェニック植物、染色体対の各染色体上の同じ坐位に１つの遺伝子である。ホモ接合トラ
ンスジェニック植物を、ヘミ接合トランスジェニック植物の自家受粉、産生種子のいくつ
かの発芽、及び対象となる遺伝子のため得られた植物の分析により得ることができる。

【0222】

２つの、独立して分離する外来性遺伝子または遺伝子座を含む２つの異なるトランスジ
ェニック植物も、遺伝子または遺伝子座の両セットを含む子孫を産生するため交雑（交配
）できる。適切なＦ１子孫の自家受粉は、外来性遺伝子または遺伝子座の両方についてホ
モ接合である植物を産生できる。親植物との戻し交配及び非トランスジェニック植物との
外交配も、植物性繁殖であると考えられる。異なる特色及び作物のため通常使用される他
の繁殖方法の説明を、Ｆｅｈｒ，Ｉｎ：Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃ
ｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ Ｊ．ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．（１９８７）
に見ることができる。

【0223】

外来性ＲＮＡレベルの増強及び安定化した発現
サイレンシングサプレッサー
実施形態では、植物細胞、植物または植物部分は、サイレンシングサプレッサータンパ
ク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む。

【0224】

転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、細胞及びウイルスｍＲＮＡを分解ＰＴＧ
Ｓの標的にし、外来性（非相同）または内在性ＤＮＡを安定にまたは一過性に形質転換さ
れた植物または真菌内で発生し、導入された核酸と配列類似性を有するＲＮＡ分子の蓄積
減少をもたらすことができるヌクレオチド配列特異的生体防御機構である。

【0225】

対象となる導入遺伝子とサイレンシングサプレッサーの同時発現が、該導入遺伝子から
転写される細胞内に存在するＲＮＡレベルを増加させるだろうと広く考えられてきた。こ
のことがインビトロ細胞について真実であると証明した一方、著しい副作用が多くの全植
物同時発現試験で観察された。より具体的には、Ｍａｌｌｏｒｙら（２００２）、Ｃｈａ
ｐｍａｎら（２００４）、Ｃｈｅｎら（２００４）、Ｄｕｎｏｙｅｒら（２００４）、Ｚ
ｈａｎｇら（２００６）、Ｌｅｗｓｅｙら（２００７）及びＭｅｎｇら（２００８）に記
載のように、概して構造的プロモーター下、植物発現サイレンシングサプレッサーは、し
ばしば、それらが商業生産に有用でなくなる程度まで表現型的に異常である。

【0226】

近年、ＲＮＡ分子レベルを増加できる、及び／またはＲＮＡ分子レベルを、サイレンシ
ングサプレッサーの発現を植物またはその部分の種子に限定することにより、何世代にも
わたって安定化できることが分かった（ＷＯ２０１０／０５７２４６）。本明細書で使用
するとき、「サイレンシングサプレッサータンパク質」またはＳＳＰは、特に、初めに形
質転換された植物から反復世代にわたって、植物細胞内の異なる導入遺伝子からの発現産
生物レベルを増強する植物細胞内で発現され得るポリペプチドである。実施形態では、Ｓ
ＳＰは、ウイルスサイレンシングサプレッサーまたはその突然変異体である。大多数のウ
イルスサイレンシングサプレッサーは、当技術分野で公知であり、これに限定されないが
、Ｐ１９、Ｖ２、Ｐ３８、Ｐｅ－Ｐｏ及びＲＰＶ－Ｐ０が挙げられる。実施形態では、ウ
イルスサイレンシングサプレッサーは、配列番号３８の配列を有するアミノ酸、その生物
活性フラグメント、または配列番号３８と少なくとも５０％同一でありサイレンシングサ
プレッサーとしての活性を有するアミノ酸配列を含む。

【0227】

本明細書で使用するとき、「安定発現」、「安定に発現された」、「安定化された発現
」及びその変化形は、ＲＮＡ分子レベルが、サイレンシングサプレッサーをコードする外
来性ポリヌクレオチドを含まないアイソジェニック植物と比較したとき、反復世代、例え
ば、少なくとも３世代、少なくとも５世代または少なくとも１０世代にわたって、子孫植
物内で本質的に同じまたはより高いことを表す。しかしながら、この語は、反復世代にわ
たって、ＲＮＡ分子レベルのいくらかのロス、前の世代と比較したとき、例えば、世代当
たり１０％以上のロスがある可能性を除外しない。

【0228】

該サプレッサーを、いずれかの起源、例えば、植物、ウイルス、哺乳類、その他から選
択できる。該サプレッサーを得ることができるウイルス、及び各特定のウイルスからのサ
プレッサーのタンパク質（例えば、Ｂ２、Ｐ１４、その他）またはコード領域指定の一覧
は、ＷＯ２０１０／０５７２４６参照。サプレッサーの多重コピーを使用してもよい。異
なるサプレッサーを一緒に使用してもよい（例えば、直列に）。

【0229】

ＲＮＡ分子
本質的に、植物種子内で発現されるのが望ましいいずれかのＲＮＡを、サイレンシング
サプレッサーと同時発現できる。コードされたポリペプチドは、オイル、デンプン、炭水
化物、栄養素、その他の代謝と関連し得る、またはタンパク質、ペプチド類、脂肪酸類、
脂質類、ワックス類、オイル類、デンプン類、糖類、炭水化物、香料、匂い、毒素類、カ
ロテノイド類、ホルモン類、高分子類、フラボノイド類、貯蔵タンパク質、フェノール酸
類、アルカロイド類、リグニン類、タンニン類、セルロース類、糖タンパク質、糖脂質、
他、好ましくは、ＴＡＧの生合成または会合体の合成に関与し得る。

【0230】

特定の例では、産生された植物は、アブラナ属、例えば、セイヨウアブラナまたはヒマ
ワリ、ベニバナ、アマ、ワタ、ダイズ、カメリナ（Ｃａｍｅｌｉｎａ）またはトウモロコ
シなどの植物内のオイル産生のための酵素レベルを増加させた。

【0231】

産生されたＬＣ－ＰＵＦＡレベル
組換え細胞または種子などの植物部分内で産生されたＬＣ－ＰＵＦＡまたは複数のＬＣ
－ＰＵＦＡの組合せのレベルは重要である。特定のＬＣ－ＰＵＦＡまたは関連するＬＣ－
ＰＵＦＡ群、例えば、ω３ＬＣ－ＰＵＦＡもしくはω６ＬＣ－ＰＵＦＡ、もしくはＶＬＣ
－ＰＵＦＡ、もしくは当技術分野で公知の方法により決定され得るその他である総脂肪酸
の組成（％）として、レベルを表してよい。例えば、組換え細胞を含む物質の乾燥重量に
おけるＬＣ－ＰＵＦＡのパーセント、例えば、ＬＣ－ＰＵＦＡである種子の重量のパーセ
ントなど、ＬＣ－ＰＵＦＡ含有率として、レベルを表してもよい。油料種子内で産生され
たＬＣ－ＰＵＦＡが、オイル産生物のために生育されない野菜または穀類におけるより、
ＬＣ－ＰＵＦＡ含有率の点でかなり高く、さらにどちらも類似のＬＣ－ＰＵＦＡ組成を有
し、どちらもヒトまたは動物の食用ＬＣ－ＰＵＦＡの供給源として使用してもよいことは
認識されるだろう。

【0232】

ＬＣ－ＰＵＦＡレベルを、当技術分野で公知の方法のいずれかにより決定してもよい。
好ましい方法では、総脂質を細胞、組織または生物体から抽出し、ガスクロマトグラフィ
（ＧＣ）による分析前に、脂肪酸をメチルエステルに転換する。そのような技術を実施例
１に記載している。クロマトグラフィーのピーク位置を使用して各特定の脂肪酸を同定し
、各ピーク下の積算面積で量を決定し得る。本明細書で使用するとき、反対に明示されな
い限り、試料中の特定の脂肪酸のパーセントを、クロマトグラム中の脂肪酸の総面積パー
セントとして、この脂肪酸のピーク下面積から決定する。これは本質的に重量パーセント
（ｗ／ｗ）に対応する。脂肪酸の同定を、ＧＣ－ＭＳにより確認し得る。総脂質を、当技
術分野で公知の技術により分離してＴＡＧフラクションなどのフラクションを精製し得る
。例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、分析スケールで行って、ＴＡＧの脂肪
酸組成特異的に決定するために、ＤＡＧ、アシル－ＣｏＡまたはリン脂質などの他の脂質
フラクションからＴＡＧを分離し得る。

【0233】

１つの実施形態では、抽出脂質中の脂肪酸のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの合計
は、細胞内の総脂肪酸の約２１％から約４０％の間である。さらなる実施形態では、細胞
内の総脂肪酸は、１％未満のＣ２０：１を有する。好ましい実施形態では、細胞内の抽出
可能なＴＡＧは、本明細書に示されたレベルで脂肪酸を含む。本明細書に記載の脂質を定
義する特徴の各可能な組合せも包含する。

【0234】

組換え細胞、植物または種子などの植物部分内のＬＣ－ＰＵＦＡ産生レベルを、本明細
書中、「転換効率」または「酵素効率」とも呼ぶ、１つ以上の産生脂肪酸に対する特異的
基質脂肪酸の転換パーセントとしても表してもよい。このパラメーターは、細胞、植物、
植物部分または種子から抽出された脂質の脂肪酸組成、すなわち、１つ以上の基質脂肪酸
（それ由来の全ての他脂肪酸を含む）のパーセントとして生成されたＬＣ－ＰＵＦＡ（そ
れ由来の全ての他ＬＣ－ＰＵＦＡを含む）の量に基づく。転換パーセントの一般式は：１
００ｘ（産生ＬＣ－ＰＵＦＡ及びそれ由来の全産生物のパーセント総和）／（基質脂肪酸
及びそれ由来の全産生物のパーセント総和）である。ＤＰＡに関して、例えば、基質脂肪
酸（例えば、ＯＡ、ＬＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴＡまたはＥＰＡ）及び該基質由来のＤＰ
Ａを含む全産生物のレベルに対するＤＰＡレベルの比として（脂質中の総脂肪酸含有率の
パーセントとして）、これを表してよい。転換パーセントまたは転換効率を、経路内の単
一酵素工程、または経路の部分もしくは全体について表すことができる。

【0235】

具体的転換効率を式に従って本明細書中算出する：
１． ＯＡからＤＰＡ＝１００ｘ（ＤＨＡ％＋ＤＰＡ％）／（ＯＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、Ｄ
ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨ
Ａの％総和）。
２． ＬＡからＤＰＡ＝１００ｘ（ＤＨＡ％＋ＤＰＡ）／（ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、
ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総
和）。
３． ＡＬＡからＤＰＡ＝１００ｘ（ＤＨＡ％＋ＤＰＡ％）／（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴ
ｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
４． ＥＰＡからＤＰＡ＝１００ｘ（ＤＨＡ％＋ＤＰＡ）／（ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨ
Ａの％総和）。
５． ＤＰＡからＤＨＡ（Δ４－デサチュラーゼ効率）＝１００Ｘ（ＤＨＡ％）／（Ｄ
ＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
６． Δ１２－デサチュラーゼ効率＝１００ｘ（ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、Ｅ
ＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）／（Ｏ
Ａ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、Ｅ
ＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
７．ω３－デサチュラーゼ効率＝１００ｘ（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰ
Ａ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）／（ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ
、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
８． ＯＡからＡＬＡ＝１００ｘ（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰ
Ａ及びＤＨＡの％総和）／（ＯＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、
ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
９． Δ６－デサチュラーゼ効率（ω３基質ＡＬＡ）＝１００ｘ（ＳＤＡ、ＥＴＡ、Ｅ
ＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）／（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、Ｄ
ＰＡ及びＤＨＡの％）
１０． Δ６－エロンガーゼ効率（ω３基質ＳＤＡ）＝１００ｘ（ＥＴＡ、ＥＰＡ、Ｄ
ＰＡ及びＤＨＡの％総和）／（ＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
１１． Δ５－デサチュラーゼ効率（ω３基質ＥＴＡ）＝１００ｘ（ＥＰＡ、ＤＰＡ及
びＤＨＡの％総和）／（ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
１２． Δ５－エロンガーゼ効率（ω３基質ＥＰＡ）＝１００ｘ（ＤＰＡ及びＤＨＡの
％総和）／（ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。

【0236】

本発明の脂質、好ましくは、種子オイルの脂肪酸組成は、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸
または新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸のいずれかについて、総脂肪酸含有量におけるω６脂
肪酸：ω３脂肪酸の比によっても特徴付けられる。総ω６脂肪酸、総ω３脂肪酸、新ω６
脂肪酸及び新ω３脂肪酸という語は、本明細書で定義した意味を有する。本明細書で例証
された方法で、細胞、植物、植物部分または種子から抽出された脂質の脂肪酸組成から、
比を算出する。脂質中のω６脂肪酸より大きなω３レベルを有することが望ましく、従っ
て、１．０未満のω６：ω３比は好ましい。０．０の比は、定義されたω６脂肪酸が全く
存在しないことを示し；０．０３の比を得た。このような低い比を、ω３－デサチュラー
ゼ、特に、本明細書に例証のピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω
３－デサチュラーゼなどの真菌ω３－デサチュラーゼと一緒にω３基質選択性を有するΔ
６－デサチュラーゼの併用により達成できる。

【0237】

種子の重量当たりのＬＣ－ＰＵＦＡの収量を、種子中の総オイル含有率及び該オイル中
のＤＰＡ％に基づいて算出してもよい。例えば、もし、キャノーラ種子のオイル含有率が
約４０％（ｗ／ｗ）及びオイル中の総脂肪酸含有量の約１２％がＤＰＡであるならば、種
子のＤＰＡ含有率は、約４．８％または種子グラム当たり約４８ｍｇである。約２１％の
ＤＰＡ含有率において、キャノーラ種子またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓ
ａｔｉｖａ）種子は、種子グラム当たり約８４ｍｇのＤＰＡ含有量を有する。従って、本
発明は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎ
ｃｅａ）及びカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物、及び種子グラ
ム当たり少なくとも約８０ｍｇまたは少なくとも約８４ｍｇのＤＰＡを含む、該植物から
得られた該種子を提供する。種子は、乾燥後（４～１５％の含水）の収穫された成熟種子
について標準的に、水分を含有している。本発明は、種子を得ること及び該種子からオイ
ルを抽出することを含むオイルを得る方法、及び該オイルの使用及び本発明に記載の植物
から種子を収穫することを含む種子を得る方法も提供する。

【0238】

ヘクタール当たり産生されたＤＰＡの量も、もし、ヘクタール当たりの種子の収量が既
知または推定できるならば算出できる。例えば、オーストラリアにおけるセイヨウアブラ
ナは、通常、ヘクタール当たり約２．５トンの種子を産生し、４０％のオイル含有率にお
いて、約１０００ｋｇのオイルを産生する。総オイル中２０．１％のＤＰＡにおいて、こ
れは、ヘクタール当たり約２００ｋｇのＤＰＡを得る。もし、オイル含有率が５０％低下
すれば、これは、それでも、ヘクタール当たり約１００ｋｇのＤＰＡを得る。

【0239】

現在までの証拠は、酵母または植物内で非相同に発現された、いくつかのデサチュラー
ゼは、いくつかのエロンガーゼとの併用で比較的低活性であることを示唆している。これ
を、ＬＣ－ＰＵＦＡ合成における基質としての脂肪酸のアシル－ＣｏＡ形態を使用する能
力を有するデサチュラーゼの提供により軽減してもよく、これは、組換え細胞、特に、植
物細胞内で利点があると思われる。効率的ＤＰＡ合成のための特に有益な組合せは、例え
ば、ミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａ）Δ６－デサチュ
ラーゼ（配列番号９）などのω３アシル基質に対する優先性を有するΔ６－デサチュラー
ゼ、または少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有するその変異体と、例えば、ピ
キア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３－デサチュラーゼ（配列番号
６）などの真菌ω３－デサチュラーゼとである。

【0240】

本明細書で使用するとき、「本質的に含まない」という語は、組成物（例えば、液体ま
たはオイル）が規定の成分をほとんど（例えば、約０．５％未満、約０．２５％未満、約
０．１％未満、または約０．０１％未満）または全く含まないことを意味する。実施形態
では、「本質的に含まない」は、ルーチンの分析技術、例えば、特定の脂肪酸（ω６－ド
コサペンタエン酸など）を、実施例１で概要を述べたガスクロマトグラフィを用いて、成
分を検出できないことを意味する。

【0241】

実施形態では、（本発明の、または本発明のプロセス／方法で用いられる）本発明の抽
出脂質、抽出オイル、植物、もしくはたとえば種子など植物の一部、飼料、または本発明
の組成物は、全シス－６，９，１２，１５，１８－ヘネイコサペンタエン酸（ｎ－３ Ｈ
ＰＡ）を含まない。

【0242】

オイルの製造
当技術分野においてルーチンに実施される技術を、本発明の細胞、植物、種子、その他
により産生されたオイルを抽出、処理、及び分析するために使用できる。通常、植物種子
を調理し、圧力をかけ、抽出して粗オイルを製造し、それから該オイルを脱ガムし、精製
し、脱色し、脱臭する。概して、種子を粉砕する技術は、当技術分野において公知である
。例えば、油料種子を、水との噴霧により適度な柔らかさにして、例えば、含水率を８．
５％まで上げることができ、０．２３～０．２７ｍｍのギャップ設定した平滑ローラーを
用いてフレーク状にする。種子のタイプに応じて、粉砕前に水を添加しなくてもよい。加
熱は酵素を不活性化させ、さらなる細胞破壊を促進し、油滴を凝集させ、タンパク質粒子
を凝集させる。これらの全ては、抽出処理を促進する。

【0243】

実施形態では、種子オイルの大部分を、スクリュープレスを通過させることにより遊離
する。それから、スクリュープレスから追い出されたケーキを、熱追跡カラム（ｈｅａｔ
ｔｒａｃｅｄ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて、例えば、ヘキサンで溶媒抽出する。あるいは
、圧搾操作により製造された粗オイルを、溝付きワイヤー排液上蓋を有する沈降タンクを
通過させて、圧搾操作中のオイルで発現された固形物を除去できる。澄ませたオイルを板
枠式圧濾機を通過させて、残った微細な固形粒子を除去できる。必要に応じて、抽出処理
から回収されたオイルを、澄ませたオイルと合わせて、配合粗オイルを製造できる。

【0244】

一旦、溶媒を粗オイルから取り除くと、圧搾及び抽出部分を合わせたものに対して、通
常のオイル処理方法を行う。本明細書で使用するとき、本発明の脂質またはオイルと組み
合わせて使用されるとき、「精製された」という語は、抽出脂質またはオイルに対して、
脂質／オイル成分の純度を上げる１つ以上の処理工程を行うことを意味する。例えば、精
製工程は、脱ガム、脱臭、脱色、乾燥及び／または抽出オイルの分取から成る群の１つ以
上または全てを含み得る。しかしながら、本明細書で使用するとき、「精製された」とい
う語は、総脂肪酸含有物のパーセントとしてＤＰＡ含有率を増加させるように、本発明の
脂質またはオイルの脂肪酸組成を変更するエステル交換反応処理または他の処理を含まな
い。言い換えれば、精製された脂質またはオイルの脂肪酸組成は、未精製の脂質またはオ
イルと本質的に同じである。

【0245】

脱ガム
脱ガムはオイル精製の初期工程であり、その主な目的は、総抽出脂質の約１～２％存在
し得る、該オイルからリン脂質のほとんどを除去することである。７０～８０℃において
、リン酸を通常含む、約２％の水を粗オイルに添加すると、微量金属及び顔料と会合した
リン脂質のほとんどが分離する。除去された不溶性物質は、主に、リン脂質及びトリアシ
ルグリセロールの混合物であり、レクチンとしても公知である。濃縮リン酸を粗種子オイ
ルに添加することにより、脱ガムを実行し、水和可能でないホスファチド類を水和可能な
形態に転換して、存在する少量の金属をキレート化できる。ガムを遠心分離により種子オ
イルから分離する。

【0246】

アルカリ精製
アルカリ精製は、時折、中和とも呼ばれる、粗オイルの処理の精製方法の１つである。
通常、脱ガム後、脱色前に行う。脱ガム後、十分量のアルカリ溶液の添加により、種子オ
イルを処理して、脂肪酸及びリン酸の全てを滴定し、こうして生成した石鹸を除去し得る
。適切なアルカリ物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、
水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム及び水酸化アンモニウムが挙げられ
る。この方法は、通常、室温において実行され、遊離脂肪酸部分を除去する。石鹸を遠心
分離または石鹸を溶媒に抽出することにより除去し、中和オイルを水で洗浄する。必要で
あれば、オイル中の過剰アルカリを、塩酸または硫酸などの適切な酸で中和してもよい。

【0247】

脱色
脱色は、漂白土（０．２～２．０％）の存在下、酸素の非存在下、窒素または蒸気でま
たは真空中での操作により、９０～１２０℃において、１０～３０分間、オイルを加熱す
る精製方法である。オイル処理のこの工程は、望まれない顔料（カロテノイド、クロロフ
ィル、ゴシポール、他）を除去するように設計されており、この方法は、酸化生成物、微
量金属、イオウ化合物及び微量の石鹸も除去する。

【0248】

脱臭
脱臭は、高温（２００～２６０℃）及び低圧（０．１～１ｍｍＨｇ）におけるオイル及
び脂肪の処理である。通常、約０．１ｍｌ／分／１００ｍｌの種子オイルの速度で種子オ
イル中に蒸気を導入することにより、これを実施する。約３０分のスパージ後、種子オイ
ルを真空下冷却させる。種子オイルを、通常、ガラス容器に移動して、冷蔵貯蔵する前に
アルゴンを流す。この処理により、種子オイルの色を改善し、揮発性物質または残ってい
る遊離脂肪酸、モノアシルグリセロール及び酸化生成物を含む臭気化合物の大部分を除去
する。

【0249】

脱ろう
脱ろうは、オイル及び脂肪を、周囲以下の温度における結晶化により固体（ステアリン
）及び液体（オレイン）フラクションに分離するため、オイルの商業生産で時々使用され
る方法である。最初に、綿実油に応用され、固形分のない製品を製造した。オイルの飽和
脂肪酸含有量を減少させるために、通常使用される。

【0250】

エステル交換反応
本明細書で使用するとき、「エステル交換反応」は、ＴＡＧ内及びＴＡＧ間で脂肪酸を
交換または脂肪酸を別のアルコールに転移してエステルを生成する方法を意味する。これ
は、遊離脂肪酸としてＴＡＧから脂肪酸を遊離することを最初に含み得る、または直接、
脂肪酸エステル、好ましくは、脂肪酸メチルエステルまたはエチルエステルを生成し得る
。メタノールまたはエタノールなどのアルコールとＴＡＧとのエステル交換反応では、ア
ルコールのアルキル基は、ＴＡＧのアシル基（ＤＰＡを含む）とのエステル結合を生成す
る。分取方法と合わせたとき、エステル交換反応を、脂質の脂肪酸組成の修飾のため使用
できる（Ｍａｒａｎｇｏｎｉら、１９９５）。エステル交換反応は、化学的（例えば、強
酸または塩基触媒）または酵素的手段のいずれかを使用でき、後者は、ＴＡＧの脂肪酸に
対して位置特異的（ｓｎ－１／３またはｓｎ－２特異的）であり得る、または他よりいく
つかの脂肪酸に対して選択性を有するリパーゼを使用する（Ｓｐｅｒａｎｚａら、２０１
２）。オイル中のＬＣ－ＰＵＦＡ濃度を上昇させる脂肪酸分取を、例えば、凍結結晶化、
尿素を用いた複合体形成、分子蒸留、超臨界流体抽出法、カウンターカレントクロマトグ
ラフィー及び銀イオン錯体化などの、当技術分野で公知の方法のいずれかにより実施でき
る。尿素との複合体形成は、オイル中の飽和及び一価不飽和脂肪酸レベルを低下するのに
その簡便さ及び効率のため、好ましい方法である（Ｇａｍｅｚら、２００３）。初めに、
オイルのＴＡＧを、酸または塩基触媒反応条件下のいずれかで加水分解により、しばしば
、脂肪酸エステルの形態で、その構成脂肪酸に分割し、それにより、生成したアルキルア
ステルと生成されたまたはリパーゼによるグリセロールとの分離が可能であるように過剰
のアルコールを含む、少なくとも３モルのアルコール（例えば、エチルエステルにはエタ
ノールまたはメチルエステルにはメタノール）と、ＴＡＧの１モルを反応する。それから
、処理により脂肪酸組成が通常変更されない、これらの遊離脂肪酸または脂肪酸エステル
を複合体生成のため、尿素のエタノール溶液と混合してもよい。飽和及び一価不飽和脂肪
酸は、容易に尿素と複合体を形成し、冷却により晶出し、その後、濾過により除去しても
よい。非尿素複合フラクションは、それにより、ＬＣ－ＰＵＦＡが豊富となる。

【0251】

飼料
本発明は、飼料として使用できる組成物を含む。本発明の目的のため、「飼料」は、体
に取り込まれたとき、（ａ）栄養を与えるまたは組織を蓄積するまたはエネルギーを供給
する役割をし；及び／または（ｂ）充分な栄養状態または代謝機能を維持、回復または支
持するヒトまたは動物の食用の食物または製剤を含む。本発明の飼料としては、例えば、
乳児用調整粉乳、及び本発明のシードミールなどの乳児及び／または幼児のための栄養組
成物が挙げられる。

【0252】

本発明の飼料は、例えば、本発明の細胞、本発明の植物、本発明の植物部分、本発明の
種子、本発明の抽出物、本発明の方法の産生物、本発明の発酵処理産生物、または適切な
担体を伴う組成物を含む。「担体」という語は、栄養価値を有していても有していなくて
もよいいずれかの成分を包含するという広義の意味で使用される。熟練者が認識するよう
に、担体は、飼料を消費する生物に対して有害な影響を有しないように、該飼料中に使用
に適切（または充分に低濃度で使用される）でなければならない。

【0253】

本発明の飼料は、本明細書に記載の方法の使用、細胞または植物により直接または間接
的に産生されたオイル、脂肪酸エステル、または脂肪酸を含む。組成物は、固体または液
体のいずれかであってよい。加えて、組成物は、特定の使用に望ましい量で、食用多量栄
養素、タンパク質、炭水化物、ビタミン類、及び／またはミネラル類を含んでもよい。こ
れらの成分量は、該組成物が、正常な個体が使用するのか、代謝障害等に患っている個体
などの専門的ニーズを有する個体が使用するのか、どちらを意図するかに依って異なるだ
ろう。

【0254】

栄養価値を有する適切な担体の例としては、これに限定されないが、食用脂肪などの多
量栄養素、炭水化物及びタンパク質が挙げられる。かかる食用脂肪の例としては、これに
限定されないが、ココナツオイル、ルリジサオイル、真菌オイル、黒潮オイル、ダイズオ
イル、及びモノ－及びジグリセリドが挙げられる。かかる炭水化物の例としては（これに
限定されないが）：グルコース、食用ラクトース、及び加水分解デンプンが挙げられる。
さらに、本発明の栄養組成物で利用され得るタンパク質の例としては、（これに限定され
ないが）ダイズタンパク質、電気透析ホエー、電気透析スキムミルク、ミルクホエー、ま
たはこれらのタンパク質の加水分解産物が挙げられる。

【0255】

ビタミン類及びミネラル類に関して、本発明の飼料組成物に、以下のものを添加しても
よい：カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄
、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、及びビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、及びビタミンＢ複合体が挙
げられる。他のかかるビタミン類及びミネラル類も添加してよい。

【0256】

本発明の飼料組成物で利用される成分は、半精製または精製された原料であり得る。半
精製または精製というのは、天然物質の精製またはデノボ合成により準備された物質を意
味する。

【0257】

本発明の飼料組成物を、食事補給を必要としないときでさえ、食物に添加してもよい。
例えば、該組成物を、（これに限定されないが）：マーガリン、モディファイドバター、
チーズ、牛乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディー、スナック類、サラダオイル、
料理用油、料理用油脂、肉類、魚及び野菜類を含む、いずれかのタイプの食物に添加して
よい。

【0258】

加えて、本発明に従って産生された脂肪酸または対象遺伝子を含み発現するように形質
転換された宿主細胞を、ヒトまたは動物の食用により望ましいものに、動物の蘇生器、卵
または乳脂肪酸組成物を変えるための動物用栄養補助食品としても使用してよい。かかる
動物の例としては、ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリ等の家禽類が挙げられる。

【0259】

さらに、本発明の飼料を、例えば、ヒトまたは動物の食用エビなどの魚または甲殻類の
脂肪酸レベルの増加させるように水産養殖で使用できる。好ましい魚はサケである。

【0260】

本発明の好ましい飼料は、ヒトまたは他の動物用食物または餌として直接使用され得る
葉及び幹などの植物、種子及び他の植物部分である。例えば、動物は、畑で成育したその
ような植物を直接食べてもよい、または制御された給餌でより計量された量を与えられて
もよい。本発明は、ヒトまたは他の動物のＬＣ－ＰＵＦＡレベルを増加するために食料と
してかかる植物及び植物部分の使用を含む。

【0261】

実施形態では、飼料は、本発明の脂質またはオイルを含む乳児用調製粉乳である。本明
細書において用いられる場合、「乳児用調製粉乳」とは、乳児の栄養要求の少なくとも一
部を満たす非天然組成物を意味する。「乳児」とは、出生時から、１歳を超えない範囲の
年齢のヒト対象を意味し、０から１２か月の間の補正年齢の乳児を含む。「補正年齢」と
いう文言は、乳児が未熟児であった期間を引いた乳児の実年齢を意味する。従って、補正
年齢は、もしその乳児が正期産で生まれた場合の乳児の年齢である。本明細書において用
いられる場合「非天然」とは、その生成物は自然界には存在しないが、ヒトの介入により
生成されることを意味する。本明細書において用いられる場合、本発明の乳児用調製粉乳
は、純粋なヒトの母乳（Ｋｏｌｅｔｚｋｏら、１９８８）及び非ヒト動物により産生され
た純粋な乳は含まないが、本発明の乳児用調製粉乳は、たとえばホエータンパク質もしく
はラクトースなどの、乳のタンパク質または炭水化物などの、乳由来の成分は含みうる。
本発明の乳児用調製粉乳は、たとえば牛肉、海獣肉、鯨肉または魚類などの天然の食肉は
含まないが、本発明の乳児用調製粉乳は、たとえばこれらの源由来のタンパク質などの成
分は含みうる。本発明の乳児用調製粉乳は、総脂肪酸含有量の好ましくは０．０５重量％
から約０．５重量％の間のレベルで本発明のＤＰＡを含む脂質を常に含有する。該ＤＰＡ
は、ＴＡＧとして、リン脂質として、または非エステル化脂肪酸として、またはそれらの
混合物として存在しうる。本発明の脂質またはオイルは、当分野に公知の方法を用いて乳
児用調製粉乳に混合されてもよい。たとえば、当業者であれば、ＤＰＡが、下記文献中に
記載されている１つ以上の多価不飽和脂肪酸に加えて添加されている、または代わりに添
加されている、ＷＯ２００８／０２７９９１、ＵＳ２０１５０１５７０４８、ＵＳ２０１
５０９４３８２及びＵＳ２０１５０１４８３１６に記載されている方法を一般的に用いて
、本発明の乳児用調製粉乳を容易に製造することができる。

【0262】

１つの例において、乳児用調製粉乳は、ＤＰＡ（すなわち、本明細書に記載されるオメ
ガ－３ ＤＰＡ）を、任意選択的にプレバイオティクス、特にポリデキストロース（ＰＤ
Ｘ）及びガラクト－オリゴ糖（ＧＯＳ）、非ヒト源由来のラクトフェリン、ならびに他の
長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）と共に含む。一部の実施形態では、栄養組成物
は、ＳＤＡ及び／またはガンマ－リノレン酸（ＧＬＡ）をさらに含む。ある実施形態では
、乳児用調製粉乳は、約７ｇ／１００ｋｃａｌ以下の脂肪源または脂質源、より好ましく
は約３ｇ／１００ｋｃａｌ～約７ｇ／１００ｋｃａｌの脂肪源または脂質源を含み、この
場合において、該脂肪源または脂質源は、少なくとも約０．５ｇ／１００ｋｃａｌ、より
好ましくは約１．５ｇ／１００ｋｃａｌ～約７ｇ／１００ｋｃａｌ；約７ｇ／１００ｋｃ
ａｌ以下のタンパク質源またはタンパク質相当の源、より好ましくは約１ｇ／１００ｋｃ
ａｌ～約７ｇ／１００ｋｃａｌのタンパク質源またはタンパク質相当の源；及び少なくと
も約５ｇ／１００ｋｃａｌの炭水化物、より好ましくは約５ｇ～約２５ｇ／１００ｋｃａ
ｌの炭水化物を含む。乳児用調製粉乳は、１）少なくとも約１０ｍｇ／１００ｋｃａｌの
ラクトフェリン、より好ましくは約１０ｍｇ／１００ｋｃａｌ～約２００ｍｇ／１００ｋ
ｃａｌのラクトフェリン；２）約０．１ｇ／１００ｋｃａｌ～約１ｇ／１００ｋｃａｌの
ＰＤＸ及びＧＯＳを含有するプレバイオティクス組成物；及び３）ＤＨＡを含有する少な
くとも約５ｍｇ／１００ｋｃａｌの追加のＬＣ－ＰＵＦＡ（すなわち、ＤＰＡ以外のＬＣ
－ＰＵＦＡ）、より好ましくはＤＨＡを含有する５ｍｇ／１００ｋｃａｌ～約７５ ｍｇ
／１００ｋｃａｌの追加のＬＣ－ＰＵＦＡ、のうちの１つ以上、またはすべてをさらに含
んでもよい。

【0263】

実施形態では、乳児用調製粉乳の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡ：ＤＨＡの比率は、１
：３と２：１の間である。ＥＰＡが存在してもよいが、存在しないほうが好ましい。もし
存在する場合、総脂肪酸含有量におけるＥＰＡ：ＤＰＡの比率は、好ましくは１：２未満
、より好ましくは１：５未満である。ＡＲＡが存在しなくてもよいが、存在するほうが好
ましく、総脂肪酸含有量におけるＡＲＡ：ＤＰＡの比率は、好ましくは、１：３と２：１
の間である。最も好ましくは、乳児用調製粉乳中の各ＬＣ－ＰＵＦＡのレベルは、任意の
ヒト母乳中に見られるレベルとほぼ同じであり、ヒト母乳は、自然状態で、母体の年齢、
遺伝的素因、食事摂取量、及び栄養状態により変動を示す。たとえば、Ｋｏｌｅｔｚｋｏ
ら、（１９８８）を参照のこと。好ましい実施形態では、乳児用調製粉乳は、検出可能レ
ベルのヘネイコサペンタエン酸（ＨＰＡ、２１：５ω３）を含まない。

【0264】

たとえば、乳児用調製粉乳とは、液体、粉末、ゲル、ペースト、固形物、濃縮物、懸濁
液、またはすぐに使用可能な形態の経腸調製物、経口調製物、乳児用の調製物を指し得る
。

【0265】

本開示において有用なプレバイオティクスは、ポリデキストロース、ポリデキストロー
ス粉末、ラクツロース、ラクトスクロース、ラフィノース、グルコ－オリゴ糖、イヌリン
、フルクト－オリゴ糖、イソマルト－オリゴ糖、ダイズオリゴ糖、ラクトスクロース、キ
シロ－オリゴ糖、キト－オリゴ糖、マンノ－オリゴ糖、アリビノ－オリゴ糖、シアリル－
オリゴ糖、フコ－オリゴ糖、ガラクト－オリゴ糖、及びゲンチオ－オリゴ糖を含んでもよ
い。

【0266】

また、本開示の栄養組成物にラクトフェリンが含まれてもよい。ラクトフェリンは種に
よって１～４個のグリカンを含有する約８０ｋＤの単鎖ポリペプチドである。異種のラク
トフェリンの３Ｄ構造は非常に似ているが、同じではない。各ラクトフェリンはＮローブ
及びＣローブと呼ばれる２つの対応するローブを含有し、それぞれ該分子のＮ末端部分と
Ｃ末端部分を指す。

【0267】

タンパク質源またはタンパク質相当の源は、たとえば無脂肪乳、ホエータンパク質、カ
ゼイン、大豆タンパク質、タンパク質加水分解物、アミノ酸などの当分野で用いられてい
る任意のものであってもよい。本開示の実施に有用なウシの乳タンパク質源としては、限
定されないが、乳タンパク質粉末、乳タンパク質濃縮物、乳タンパク質単離物、無脂肪乳
固形物、無脂肪乳、脱脂粉乳、ホエータンパク質、ホエータンパク質単離物、ホエータン
パク質濃縮物、スイートホエー、酸ホエー、カゼイン、酸カゼイン、カゼイン塩（たとえ
ばカゼインナトリウム、カゼインナトリウムカルシウム、カゼインカルシウムなど）、及
びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0268】

適切な炭水化物源は、たとえばラクトース、グルコース、フルクトース、コーンシロッ
プ固形物、マルトデキストリン、スクロース、デンプン、ライスシロップ固形物などの当
分野で用いられる任意のものであってもよい。栄養組成物中の炭水化物成分の量は、少な
くとも約５ｇ／１００ｋｃａｌであり、一般的には約５ｇと約２５ｇ／１００ｋｃａｌの
間で変化し得る。一部の実施形態では、該炭水化物の量は、約６ｇと約２２ｇ／１００ｋ
ｃａｌの間である。他の実施形態では、該炭水化物の量は、約１２ｇと約１４ｇ／１００
ｋｃａｌの間である。一部の実施形態では、コーンシロップ固形物が好ましい。さらに、
加水分解された、部分的に加水分解された、及び／または十分に加水分解された炭水化物
が、その消化の容易さを理由として、栄養組成物中での含有に望ましい場合がある。具体
的には、加水分解された炭水化物は、アレルゲンとなるエピトープを含有する可能性が低
い。本明細書における使用に適した炭水化物性物質の非限定的な例としては、トウモロコ
シ、タピオカ、コメ、またはジャガイモを源とする、加水分解されたまたは損なわれてい
ない、天然または化学修飾された、ワックス形態または非ワックス形態のデンプンが挙げ
られる。適切な炭水化物の非限定的な例としては、加水分解されたコーンスターチ、マル
トデキストリン、マルトース、コーンシロップ、デキストロース、コーンシロップ固形物
、グルコース、及び様々な他のグルコースポリマー、ならびにそれらの組み合わせとして
特徴づけられる様々な加水分解されたデンプンが挙げられる。他の適切な炭水化物の非限
定的な例としては、スクロース、ラクトース、フルクトース、高フルクトースコーンシロ
ップとしばしば呼称されるもの、たとえばフルクトオリゴ糖などの消化しにくいオリゴ糖
、及びそれらの組み合わせ、が挙げられる。

【0269】

好ましくは、対象の１日栄養所要量を供給するのに十分な量の１つ以上のビタミン及び
／またはミネラルが乳児用調製粉乳に加えられていてもよい。当分野の当業者であれば、
該ビタミン及びミネラル要求量は、たとえば小児の年齢に基づき変化することが理解され
るであろう。栄養組成物は、任意選択的に、限定されないが、以下のビタミンまたはその
誘導体を１つ以上含みうる：ビタミンＢ１（チアミン、チアミンピロリン酸、ＴＰＰ、チ
アミン三リン酸、ＴＴＰ、チアミン塩酸塩、チアミン硝酸塩）、ビタミンＢ２（リボフラ
ビン、フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮ、フラビンアデニンジヌクレオチド、ＦＡＤ、
ラクトフラビン、オボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ニコチン酸、ニコチンア
ミド、ナイアシンアミド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤ、ニコチン酸
モノヌクレオチド、ＮｉｃＭＮ、ピリジン－３－カルボン酸）、ビタミンＢ３前駆体トリ
プトファン、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、塩酸ピリ
ドキシン）、パントテン酸（パントテン酸塩、パンテノール）、葉酸塩（葉酸、フォラシ
ン、プテロイルグルタミン酸）、ビタミンＢ１２（コバラミン、メチルコバラミン、デオ
キシアデノシルコバラミン、シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、アデノシルコバ
ラミン）、ビオチン、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＡ（レチノール、酢酸レ
チニル、パルミチン酸レチニル、他の長鎖脂肪酸を有するレチニルエステル、レチナール
、レチノイン酸、レチノールエステル）、ビタミンＤ（カルシフェロール、コレカルシフ
ェロール、ビタミン３、１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ）、ビタミンＥ（α－トコフ
ェロール、α－酢酸トコフェロール、α－コハク酸トコフェロール、α－ニコチン酸トコ
フェロール、α－トコフェロール）、ビタミンＫ（ビタミンＫ１、フィロキノン、ナフト
キノン、ビタミンＫ２、メナキノン－７、ビタミンＫ３、メナキノン－４、メナジオン、
メナキノン－８、メナキノン－８Ｈ、メナキノン－９、メナキノン－９Ｈ、メナキノン－
１０、メナキノン－１１、メナキノン－１２、メナキノン－１３）、コリン、イノシトー
ル、β－カロテン、及びそれらの任意の組み合わせ。さらに、栄養組成物は、任意選択的
に、限定されないが、以下のミネラルまたはその誘導体を１つ以上含み得る：ホウ素、カ
ルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、
リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、塩素、クロム、塩化クロム、クロミウムピコロネー
ト、銅、硫酸銅、グルコン酸銅、硫酸銅、フッ素、鉄、カルボニル鉄、第二鉄、フマル酸
第一鉄、リン酸第二鉄、鉄粉砕物（ｉｒｏｎ ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）、多糖鉄、ヨウ
化物、ヨウ素、マグネシウム、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウ
ム、ステアリン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリ
ウム、リン酸カリウム、ヨウ化カリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、セレニウム、硫
黄、ナトリウム、ドキュセートナトリウム、塩化ナトリウム、セレン酸ナトリウム、モリ
ブデン酸ナトリウム、亜鉛、酸化亜鉛、硫酸亜鉛、及びそれらの混合物。ミネラル化合物
の非限定的な誘導体例としては、塩、アルカリ塩、エステル、及び任意のミネラル化合物
のキレートが挙げられる。ミネラルは、たとえばリン酸カルシウム、グリセロールリン酸
カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム
、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガン、及びセレン酸ナトリウムなどの塩の形態で
栄養組成物に添加されてもよい。当分野内で公知の追加のビタミン及びミネラルが添加さ
れてもよい。

【0270】

実施形態では、本発明の乳児用調製粉乳、または本発明を用いて作製される乳児用調製
粉乳は、ＤＰＡを含有するヒトの乳もしくは動物の乳またはそれらの抽出物を含まない。

【0271】

他の実施形態では、乳児用調製粉乳の総脂肪酸含有量におけるオメガ－６ＤＰＡのレベ
ルは２％未満であり、好ましくは１％未満であり、または０．１％～２％の間であり、よ
り好ましくは含まれていない。

【0272】

組成物
本発明は、組成物、特に、１つ以上の脂肪酸及び／または好ましくは、脂肪酸のエチル
エステルの形態の、本発明の方法を用いて産生され得られたオイルを含む医薬組成物も包
含する。

【0273】

医薬組成物は、標準的で周知の無毒性薬剤的に許容可能な担体、賦形剤またはリン酸緩
衝食塩水、水、エタノール、ポリオール類、植物油類、湿潤剤または、水／油エマルジョ
ンなどの、エマルジョンなどの媒体と組み合わせて、１つ以上の脂肪酸及び／またはオイ
ルを含んでよい。組成物は、液体または固体のいずれかであってよい。例えば、組成物は
、錠剤、カプセル剤、接種可能な液体もしくは散剤、注射剤、または局所軟膏剤もしくは
クリーム剤の形態であってよい。適切な流動性を、例えば、分散剤の場合では必要な粒径
の維持及び界面活性剤の使用により維持できる。等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウム
等を含むことも望ましい場合がある。そのような不活性希釈剤に加えて、組成物は、湿潤
剤、乳化及び懸濁剤、甘味料、香味料及び芳香剤などのアジュバントも含むことができる
。

【0274】

活性化合物に加えて、懸濁剤は、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエ
チレンソルビトール及びソルビタンエステル、結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロ
キシド、ベントナイト、寒天、及びトラガカントまたはこれらの物質の混合物を含んでよ
い。

【0275】

錠剤及びカプセル剤などの固体剤形を、当技術分野で周知の技術を用いて製剤できる。
例えば、本発明に従って産生された脂肪酸を、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン
などの結合剤、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸などの崩壊剤、及びステアリン酸ま
たはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤と組み合わせて、ラクトース、ショ糖、及び
コーンスターチなどの従来の錠剤用基材で打錠できる。カプセル剤を、酸化防止剤及び関
連する脂肪酸と共に、ゼラチンカプセル中にこれらの賦形剤を組み込むことにより製剤で
きる。

【0276】

静脈内投与のため、本発明に従って産生した脂肪酸またはその誘導体を、市販製剤中に
組み入れてもよい。

【0277】

特定の脂肪酸の典型的投与量は、１日１～５回の服用で、０．１ｍｇ～２０ｇ（１日１
００ｇまで）であり、好ましくは、１日約１０ｍｇ～約１、２、５、または１０ｇの範囲
（１回または複数回投与で服用）である。当技術分野で公知のように、最小約３００ｍｇ
／日の脂肪酸、特にＬＣ－ＰＵＦＡが望ましい。しかしながら、いずれの量の脂肪酸も対
象に有益であろうと考えられる。

【0278】

本発明の医薬組成物の可能な投与経路としては、例えば、経腸（例えば、経口及び直腸
）及び非経口が挙げられる。例えば、液体製剤を、経口または直腸投与してよい。加えて
、均一混合物を無菌条件下で、生理学的に許容可能な希釈剤、防腐剤、緩衝剤またはスプ
レー剤もしくは吸入剤を作成するための噴霧剤と混合した水中に完全に分散できる。

【0279】

患者に投与される組成物の投与量を、当業者が決定してよく、患者の体重、患者の年齢
、患者の健康全般、患者の病歴、患者の免疫状態、他に依存する。

【0280】

加えて、本発明の組成物を、化粧品目的用に利用してもよい。混合物を生成または対象
となる発明に従って産生した脂肪酸を化粧品組成物中の単独「活性」成分として使用して
もよいように、既に存在する化粧品組成物に添加してよい。

【実施例0281】

実施例１．物質及び方法
一過性発現系の植物細胞内の遺伝子の発現
外来性遺伝子構築物を、Ｖｏｉｎｎｅｔら（２００３）及びＷｏｏｄら（２００９）に
より記載されたように、本質的に一過性発現系の植物細胞内で発現した。

【0282】

脂肪酸のガスクロマトグラフィ（ＧＣ）分析
３０ｍ ＳＧＥ－ＢＰＸ７０カラム（７０％シアノプロピルポリシルフェニレン－シロ
キサン、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５ｍｍ）、ＦＩＤ、スプリット／スプリットレス
インジェクター及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ７６９３シリーズオート
サンプラー及びインジェクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ７８
９０Ａ ＧＣ（米国カリフォルニア州パロアルト）を用いてガスクロマトグラフィにより
、ＦＡＭＥを分析した。キャリアガスとしてヘリウムを使用した。１５０℃のオーブン温
度において、スプリットモード（比５０：１）で試料を注入した。注入後、オーブン温度
を１分間１５０℃で保持し、その後、３℃／分で２１０℃まで上昇させ、再度、５０℃／
分で２４０℃まで上昇させ、最終的に２４０℃で１．４分保持した。外部標準ＧＬＣ－４
１１（Ｎｕｃｈｅｃｋ）及びＣ１７：０－ＭＥ内部標準の既知量の応答に基づいて、Ａｇ
ｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｒｅｖ
Ｂ．０４．０３（１６）、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて、ピークを定量
化した。

【0283】

脂質の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）
開花後１２日目（ｄａｆ）、凍結乾燥した発育種子及び内部定量標準としてトリ－Ｃ１
７：０－ＴＡＧの既知量を添加後の成熟種子から総脂質を抽出した。乾燥物質５ｍｇ当た
りブタノール：メタノール（１：１ｖ／ｖ）中の１０ｍＭブチル化ヒドロキシトルエン１
ｍＬ中に抽出脂質を溶解し、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＬＣ及び６４１０ｂエレク
トロスプレーイオン化トリプル四重極ＬＣ－ＭＳを用いて分析した。流速０．２ｍＬ／分
でバイナリーグラジエントを用いて、Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＰ－アミド
カラム（５０ｍｍ ｘ ２．１ｍｍ、２．７μｍ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いて、液体をク
ロマトグラフィー法で分離した。移動相は：Ａ．１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液：メタ
ノール：テトラヒドロフラン（５０：２０：３０ｖ／ｖ／ｖ）；Ｂ．１０ｍＭギ酸アンモ
ニウム水溶液：メタノール：テトラヒドロフラン（５：２０：７５ｖ／ｖ／ｖ）。多重反
応モニタリング（ＭＲＭ）リストは、コリジョンエネルギー３０Ｖ及びフラグメンタ６０
Ｖを用いて、次の主要脂肪酸：１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、１
８：４、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４、２０：５、２２：４、２２：５、２
２：６に基づいた。２２：６のニュートラルロスからアンモニアと化合したプリカーサ－
イオンとプロダクトイオンに基づいて、個々のＭＲＭ ＴＡＧを同定した。１０μＭトリ
ステアリン外部標準を用いて、ＴＡＧを定量化した。

【0284】

ＬＣ－ＭＳを用いた脂質プロファイリング
Ａｇｉｌｅｎｔ６４１０Ｂエレクトロスプレーイオン化ＱＱＱ－ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ
、米国カリフォルニア州パロアルト）と連結したＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＬＣを
用いて、抽出した総脂質を分析した。流速０．２ｍＬ／分でバイナリーグラジエントを用
いたＡｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＰ－アミド ５０ｍｍ ｘ ２．１ｍｍ、２
．７μｍ ＨＰＬＣカラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、オーストラリア、キャッスル
ヒル）を用いて、各総脂質抽出物５μＬを注入して、クロマトグラフィー法で分離した。
移動相は：Ａ．１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液：メタノール：テトラヒドロフラン（５
０：２０：３０ｖ／ｖ／ｖ）；Ｂ．１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液：メタノール：テト
ラヒドロフラン（５：２０：７５ｖ／ｖ／ｖ）。コリジョンエネルギー３０Ｖ及びフラグ
メンテーションエネルギー６０Ｖを用いて、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）により、選
択した中性脂質（ＴＡＧ及びＤＡＧ）及びリン脂質（ＰＣ、ＰＥ、ＰＩ、ＰＳ、ＰＡ、Ｐ
Ｇを含むＰＬ）を分析した。次の主要脂肪酸：１６：０（パルミチン酸）、１８：０（ス
テアリン酸）、１８：１ω９（オレイン酸、ＯＡ）、１８：２ω６（リノール酸、ＬＡ）
、１８：３ω３（α－リノレン酸、ＡＬＡ）、１８：４ω３（ステアリドン酸、ＳＤＡ）
、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４ω３、２０：５ω３、２２：４ω３、２２：
５ω３、２２：６ω３に、中性脂質を標的とし、一方、それぞれ、０－３、０－４、０－
５、４－６の二重結合を有するＣ_１６、Ｃ_１８、Ｃ_２０及びＣ_２２化学種を含めてリン脂
質をスキャンした。

【0285】

２０：１、ＳＤＡ、ＥＰＡ及びＤＨＡのニュートラルロスからアンモニアと化合したプ
リカーサ－イオンとプロダクトイオンに基づいて、個々のＭＲＭ ＴＡＧを同定した。外
部標準として５０μＭトリステアリン及びジステアリンを用いて、ＴＡＧ及びＤＡＧを定
量化した。１０μＭのジ－１８：０－ＰＣ、ジ－１７：０－ＰＡ、ジ－１７：０－ＰＥ、
１７：０－１７：１－ＰＧ、ジ－１８：１－ＰＩ及びジ－１７：０－ＰＳ外部標準（Ａｖ
ａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、米国アラバマ州アラバスター）を日いて、ＰＬを
定量化した。選択したＴＡＧ、ＤＡＧ及びＰＬ化学種を、Ａｇｉｌｅｎｔ６５２０Ｑ－Ｔ
ＯＦ ＭＳ／ＭＳによりさらに確認した。

【0286】

種子脂肪酸プロファイル及びオイル含有率の決定
種子オイル含有率を決定する場合、種子を、２４時間デシケーター内で乾燥し、種子約
４ｍｇを、テフロン加工スクリューキャップを含む２ｍｌガラスバイアル中に移動した。
トルエン０．１ｍｌ中に溶解したトリヘプタデカノイン０．０５ｍｇを内部標準としてバ
イアルに添加した。

【0287】

種子ＦＡＭＥを、種子物質を含むバイアルに、１Ｎ ＨＣｌメタノール溶液（Ｓｕｐｅ
ｌｃｏ）０．７ｍｌを添加することにより調製し、短時間ボルテックスし、８０℃で２時
間インキュベートした。室温まで冷却後、０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）０．３ｍｌ及びヘ
キサン０．１ｍｌを該バイアルに添加し、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｖｉｂｒａｍａｘ １１０
で、１０分間よく混合した。ＦＡＭＥを、０．３ｍｌガラスインサート中に集め、前述の
ように水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＧＣにより分析した。

【0288】

市販標準品ＧＬＣ－４１１（ＮＵ－ＣＨＥＫ ＰＲＥＰ，ＩＮＣ．、米国）中に存在す
る同じＦＡＭＥの既知量のピーク面積応答に基づき、個々のＦＡＭＥのピーク面積を、先
ず補正した。ＧＬＣ－４１１は、Ｃ８：０～Ｃ２２：６の範囲の等量の３１種の脂肪酸（
重量％）を含む。標準品中に存在しなかった脂肪酸の場合、本発明者らは、最も類似のＦ
ＡＭＥのピーク面積応答を利用した。例えば、１６：１ｄ９のＦＡＭＥのピーク面積応答
を１６：１ｄ７に使用し、Ｃ２２：６のＦＡＭＥ応答をＣ２２：５に使用した。内部標準
質量との比較により、補正面積を使用して、試料中の各ＦＡＭＥの質量を算出した。オイ
ルを、主に、ＴＡＧの形態で貯蔵し、その重量を、ＦＡＭＥの重量に基づいて算出した。
各ＦＡＭＥのモル数を計算し、ＦＡＭＥの総モル数を３で割ることにより、グリセロール
の総モル数を決定した。関係：オイルの重量％＝１００ ｘ （（４１ ｘ ＦＡＭＥ総
モル数／３）＋（ＦＡＭＥ総ｇ数－（１５ ｘ ＦＡＭＥ総モル数）））／種子ｇ数（式
中、４１及び１５は、それぞれ、グリセロール部分とメチル基のモル重量である）を用い
て、グリセロール及び脂肪アシル部分の総和として、ＴＡＧを算出した。

【0289】

オイル試料のステロール含有率の分析
内部標準としてＣ２４：０モノオールのアリコットを添加して一緒にオイル約１０ｍｇ
の試料を、８０％ＭｅＯＨ中５％ＫＯＨ４ｍＬを用いてけん化し、テフロン加工スクリュ
ーキャップしたガラスチューブ内で８０℃２時間加熱した。反応混合物を冷却後、ミリＱ
水２ｍＬを添加し、ステロールを、振盪及びボルテックスすることにより、ヘキサン：ジ
クロロメタン（４：１ｖ／ｖ）２ｍＬ中に抽出した。混合物を遠心分離し、ステロール抽
出物を除去し、ミリＱ水２ｍＬで洗浄した。それから、該ステロール抽出物を振盪及び遠
心分離後に除去した。該抽出物を窒素ガス気流中で蒸発し、ＢＳＴＦＡ２００ｍＬを用い
て、ステロールをシリル化し、８０℃で２時間加熱した。

【0290】

ステロールのＧＣ／ＧＣ－ＭＳ分析のため、ステロール－ＯＴＭＳｉ誘導体を４０℃に
おいてヒートブロック上で窒素ガス気流下乾燥し、それから、ＧＣ／ＧＣ－ＭＳ分析直前
に、クロロホルムまたはヘキサン中に再溶解した。Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｅｑｕｉｔｙ（商標
）－１フューズドシリカキャピラリーカラム（１５ｍ ｘ ０．１ｍｍ（内径）、膜厚０
．１μｍ）、ＦＩＤ、スプリット／スプリットレスインジェクター及びＡｇｉｌｅｎｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ７６８３Ｂシリーズオートサンプラー及びインジェクターを備
えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６８９０Ａ ＧＣ（米国カリフォルニ
ア州パロアルト）を用いたガスクロマトグラフィ（ＧＣ）により、ステロール－ＯＴＭＳ
誘導体を分析した。キャリアーガスはヘリウムだった。オーブン温度１２０℃においてス
プリットレスモードで試料を注入した。注入後、オーブン温度を、１０℃／分で２７０℃
まで、最終的に、５℃／分で３００℃まで上昇させた。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（米国カリフォルニア州パロアルト）
を用いて、ピークを定量化した。ＧＣ結果には、個々の成分面積の±５％の誤差がある。

【0291】

ＧＣ－質量分光（ＧＣ－ＭＳ）分析を、Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ
ＧＣＱ ＧＣ＝ＭＳ及びＦｉｎｎｉｇａｎ Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ ＧＣ－ＭＳで行った；両システムは、オンカラムインジェクター及びＴ
ｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（米国テキサス州オースチン）を
備えていた。各ＧＣは、上記のものと同様な極性のキャピラリーカラムを装着していた。
質量分析データを用いて、且つ信頼ある基準及び実験室基準で得られたものと保持時間デ
ータを比較することにより、個々の成分を同定した。試料バッチと同時に、全工程のブラ
ンク分析を行った。

【0292】

ＲＴ－ＰＣＲ条件
順方向プライマー１０ｐｍｏｌ（ピコモル）及び逆方向プライマー３０ｐｍｏｌ、最終
濃度２．５ｍＭまでのＭｇＳＯ_４、緩衝剤を含むＲＮＡ合計４００ｎｇ（ナノグラム）及
び製造者説明書に従ったヌクレオチド成分を用いた、体積２５μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉ
ｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用
いて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）増幅を通常に行った。典型的な温度状況は、４５℃
、３０分間の１サイクルで逆転写を起こし、；それから、９４℃、２分の１サイクル、次
いで、９４℃、３０秒の４０サイクル、５２℃、３０秒間、７０℃、１分間；それから、
７２℃、２分間の１サイクル後、反応混合物を５℃まで冷却した。

【0293】

デジタルＰＣＲによる導入遺伝子のコピー数の決定
トランスジェニック植物内の導入遺伝子のコピー数を決定するため、次のように、デジ
タルＰＣＲ法を使用した。この方法を、植物が、本明細書に記載の遺伝子構築物のトラン
スジェニックであるかどうかを決定するためにも使用できるはずである。約１平方センチ
メートルの葉組織を、各個々の植物から収穫し、コレクションマイクロチューブ（Ｑｉａ
ｇｅｎ）に入れた。それから、試料を２４～４８時間凍結乾燥した。ＤＮＡ抽出物の試料
を解氷のため、ステンレススチールボールベアリングを各乾燥試料に添加し、Ｑｉａｇｅ
ｎ Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒでチューブを振盪した。抽出緩衝液３７５μＬ（０．１Ｍ
トリス－ＨＣｌ ｐＨ８、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８及び１．２５％ＳＤＳ）を各チ
ューブに添加し、混合物を６５℃で１時間インキュベートし、それから、冷却後、６Ｍ酢
酸アンモニウム（４℃）１８７μＬを徹底的に混合しながら各チューブに添加した。それ
から、試料を３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。各チューブの上澄みを、室温で５
分間ＤＮＡ沈降のためイソプロパノール２２０μＬを各々含む新しいマイクロチューブ中
に取り出した。ＤＮＡを、３０００ｒｐｍで３０分間チューブを遠心分離することにより
集め、ＤＮＡペレットを、７０％エタノール３２０μＬで洗浄し、乾燥後、水２２５μＬ
中にＤＮＡを再懸濁した。不溶解性物質を３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することに
よりペレット化し、各上澄み１５０μＬを長期貯蔵用９６ウェルプレートに移動した。

【0294】

効率的且つ定量的デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）のため、ＤＮＡを導入遺伝子または複
数挿入の複数のコピーが物理的に分離していることを保証するため、増幅反応前に制限酵
素で消化した。従って、ＤＮＡ製剤のアリコットを１０ｘＥｃｏＲＩ緩衝剤、ＤＮＡ５μ
Ｌ及び試料当たり各酵素４単位を用いて、２０μＬ体積において、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍ
ＨＩと一緒に、３７℃で一夜インキュベートして消化した。

【0295】

これらのＰＣＲ反応で使用したプライマーを、参照及び標的遺伝子用プライマーが相互
作用すると予測されない、またはかかる相互作用が使用条件下問題とならないと確認する
ため、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアを用いて設計した。アッセイに使用する参照遺伝子は
、セイヨウアブラナゲノム当たり１つの遺伝子に存在するアブラナＨｍｇ（高移動度群）
遺伝子であった（Ｗｅｎｇら、２００４）。セイヨウアブラナは異質四倍体であるので、
セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）において、Ｈｍｇ遺伝子の４コピー
、すなわち、２つの遺伝子の各々の２つのアレルがあると分かった。参照遺伝子反応は、
プライマー対及び以下の二重標識プローブを使用した：センスプライマー、Ｃａｎ１１
ＧＣＧＡＡＧＣＡＣＡＴＣＧＡＧＴＣＡ（配列番号５０）；アンチセンスプライマー、Ｃ
ａｎ１２ ＧＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＡＧＧ（配列番号５１）；プローブ、Ｈ
ｍｇ－Ｐ３ ５’－Ｈｅｘ／ＴＣＴＣＴＡＣ／ｚｅｎ／ＣＣＧＴＣＴＣＡＣＡＴＧＡＣＧ
Ｃ／３ＩＡＢｋＦＱ／－３’（配列番号５２）。増幅産生物サイズは７３ｂｐであった。

【0296】

全てのトランスジェニック植物をスクリーニングするため、ＰＰＴ選択マーカー遺伝子
領域を検出した１つの標的遺伝子増幅反応では、センスプライマーは、Ｃａｎ１７、ＡＴ
ＡＣＡＡＧＣＡＣＧＧＴＧＧＡＴＧＧ（配列番号：５３）；アンチセンスプライマーは、
Ｃａｎ１８ ＴＧＧＴＣＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号：５４）；プロ
ーブは、ＰＰＴ－Ｐ３ ５’－／ＦＡＭ／ＴＧＧＣＡＡＡＧＡ／ｚｅｎ／ＧＡＴＴＴＣＧ
ＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／－３’（配列番号：５５）であった。この標的
遺伝子増幅産生物は８２ｂｐであった。時として、第二標的遺伝子アッセイを、Ｔ－ＤＮ
Ａの部分的挿入を検出するため平行して行った。この第二アッセイはセンスプライマー、
Ｃａｎ２３ ＣＡＡＧＣＡＣＣＧＴＡＧＴＡＡＧＡＧＡＧＣＡ（配列番号：５６）、アン
チセンスプライマー、Ｃａｎ２４ ＣＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＴＴＡＧＣＡ（配列番
号：５７）；プローブ、Ｄ６ｄｅｓ－Ｐ３ ５’－／ＦＡＭ／ＴＣＣＣＣＡＣＴＴ／ｚｅ
ｎ／ＣＴＴＡＧＣＧＡＡＡＧＧＡＡＣＧＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／－３’（配列番号：５８）
を用いて、Δ６－デサチュラーゼ遺伝子領域を検出した。この標的遺伝子増幅産生物のサ
イズは８９ｂｐであった。反応は、ルーチンに消化ＤＮＡ製剤２μＬを使用した。試料当
たりの反応組成；総体積２５μＬ中、参照センスプライマー（１０ｐＭ）、１μＬ；参照
アンチセンスプライマー（１０ｐＭ）、１μＬ；参照遺伝子プローブ（１０ｐＭ）、０．
５μＬ；標的遺伝子センスプライマー（１０ｐＭ）、１μＬ；標的遺伝子アンチセンスプ
ライマー（１０ｐＭ）、１μＬ；標的遺伝子プローブ（１０ｐＭ）、０．５μＬ；ｄｄＰ
ＣＲ試薬混合物、１２．５μＬ；水５．５μＬ。

【0297】

それから、各試料を２００００ナノリットルサイズ液滴に分割するＱＸ１００ドロプレ
ットジェネレーター中に入れた。全ての試料を処理して９６ウェルＰＣＲプレートに移動
するまで、８ウェルカートリッジ中でこれを行った。それから、このプレートを、プレー
トシーラー機を用いて、突き刺し可能な箔（ｐｉｅｒｃｅａｂｌｅ ｆｏｉｌ）で熱シー
ルした。それから、試料を以下の反応条件下で処理した：９５℃、１０分間、２．５℃／
秒でランピング；その後、２．５℃／秒でランピングしながら９４℃、３０秒間を３９サ
イクル；２．５℃／秒でランピングしながら６１℃、１分間；９８℃、１０分間、次いで
、１２℃に冷却。液滴中のＤＮＡの増幅反応後、プレートを、二色検出システムを用いて
個々に各液滴を分析するＱＸ１００ドロプレットリーダーに入れた（ＦＡＭまたはＨｅｘ
検出に設定）。液滴デジタルＰＣＲデータを、蛍光強度グラフ上にプロットした試料の各
液滴の１－Ｄプロット、または蛍光（ＦＡＭ）を各液滴の蛍光（Ｈｅｘ）に対してプロッ
トする２－Ｄプロットのいずれかとして見る。ソフトウェアは、各試料の各フルオロフォ
ア（ＦＡＭまたはＨｅｘ）について、正及び負の液滴の数を測定した。それから、ソフト
ウェアは、入力された、コピー／μＬの単位で標的ＤＮＡ分子濃度を決定するため、正の
液滴に分画をポワソンアルゴリズムにフィットさせた。コピー数の変動を、式：ＣＮＶ＝
（Ａ／Ｂ）＊Ｎｂ（式中、Ａ＝標的遺伝子濃度、Ｂ＝参照遺伝子濃度、及びＮｂ＝４、ゲ
ノム中の参照遺伝子のコピー数）を用いて算出した。

【0298】

花粉生存率の評価
フルオレセイン二酢酸エステル（ＦＤＡ）を、アセトン中に２ｍｇ／ｍｌで溶解して原
液を得た。持続的白濁の外観により示される飽和に達するまで、ショ糖溶液（０．５Ｍ）
２ｍｌにＦＤＡ原液を滴下することにより使用直前に、ＦＤＡ希釈液を調製した。

【0299】

ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を滅菌蒸留水中１ｍｇ／ｍｌで溶解して原液を得た。使用
直前に、原液１００μｌを、滅菌蒸留水１０ｍｌに添加して、使用液を作製した。生存花
粉と非生存花粉の比をチェックするため、ＰＩ及びＦＤＡ原液を２：３の比で混合した。

【0300】

１日１６時間の光周期で、２２±２℃の温室内の標準条件下、トランスジェニック及び
野生型セイヨウアブラナ及びカラシナ植物を生育した。翌日開花する状態の成熟した花蕾
を標識し、翌朝９～１０時ａｍに集めた。開花した花の花粉をＦＤＡ／ＰＩ混合物で染色
し、Ｌｅｉｃａ ＭＺＦＬＩＩＩ蛍光顕微鏡を用いて可視化した。ＧＦＰ－２、４８０／
４０ｎｍ励起フィルターを備えた５１０ｎｍロングパス発光フィルター（赤と緑の光を透
過する）を使用して、生存及び非生存花粉を検出した。ＰＩ染色した非生存花粉は、蛍光
顕微鏡下、赤く見えたが、生存花粉は、ＰＩ及びＦＤＡで染色したとき、鮮緑色に見えた
。

【0301】

実施例２．カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）種子内のトランスジェ
ニックＤＨＡ経路の安定発現

【0302】

バイナリーベクターｐＪＰ３４１６－ＧＡ７（図２及び配列番号１を参照のこと）を、
アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１及び形質転換のためのフローラルディ
ップ法を用いたカメリナサティバ顕花植物の処理に使用した形質転換アグロバクテリウム
の培養液からの細胞中に導入した（Ｌｕ及びＫａｎｇ、２００８）。植物の生育及び成熟
後、処理した植物のＴ_１種子を収穫し、土壌に播種し、得られた植物を、ｐＪＰ３４１６
－ＧＡ７のＴ－ＤＮＡに存在するｂａｒ選択マーカー遺伝子のトランスジェニックであり
、これを発現する植物について選択するため、除草剤ＢＡＳＴＡをスプレー処理した。除
草剤に耐性のある生存Ｔ_１植物を、自家受粉させて後、成熟するまで生育し、得られたＴ
_２種子を収穫した。５種のトランスジェニック植物を得て、これらの３種は全部そろった
Ｔ－ＤＮＡを含んでいた。

【0303】

脂質を、全部そろったＴ－ＤＮＡを含む各３種の植物からの約２０個の種子プールから
抽出した。プール試料の２種は非常に低く、かろうじて検出できるレベルのＤＨＡを含有
していたが、３番目のプールは、約４．７％のＤＨＡを含有していた。従って、この植物
からの１０個の個々のＴ_２種子から、脂質を抽出し、脂肪酸組成をＧＣにより分析した。
この形質転換系統について個々の種子の脂肪酸組成データも表４に示す。総種子脂質プロ
ファイル（表４）から集めたデータを表５に示す。

【0304】

ＤＨＡは、１０個の個々の種子のうち６個中に存在した。４個の他の種子は、ＤＨＡを
含まず、親植物のＴ－ＤＮＡインサーションのヘミ接合に基づいて、Ｔ－ＤＮＡを有しな
いヌルな分離個体であると推定された。最高レベルのＤＨＡを含む単一種子から抽出した
脂質は９．０％のＤＨＡを含み、一方、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡのパーセント合計は１
１．４％であった。

【表4】

【表5】

【0305】

この系統からのホモ接合種子を、Ｔ４世代で得た。全部のＴ４世代にわたって観察され
た平均７．３％のＤＨＡであったイベントＦＤ５－４６－１８－１１０で、１０．３％ま
でのＤＨＡが産生された。その後の世代（Ｔ５）を、何世代かにわたって、ＰＵＦＡ産生
、特に、ＤＨＡの安定性についてさらなる試験をするため確立した。プール種子ＤＨＡ含
有率が、複数トランスジェニック遺伝子座の存在のため、Ｔ_４世代まで安定化されなかっ
たにもかかわらず、観察された最大ＤＨＡレベルは、５世代目で安定であると分かった。
Ｔ_５種子バッチも、発芽効率または速度で明らかな差が観察されない親カメリナサティバ
種子と並べて、インビトロＭＳ培地上で発芽させた。トランスジェニック系統のさらなる
世代（Ｔ６、Ｔ７世代、他）は、種子ＤＨＡレベルの低下を示さなかった。トランスジェ
ニック植物は、完全に雌雄生殖能力があり、花粉は、野生型植物同様、約１００％生存率
を示した。異なるレベルのＤＨＡを含む種子のオイル含有率の分析では、シロイヌナズナ
で見られた相関と対照的に、ＤＨＡレベルとオイル含有率との間の相関は確認されなかっ
た。

【0306】

いくつかのさらなるトランスジェニック系統では、独立イベントからの単一種子のＤＨ
Ａ含有率は１２％を超えた。これらの系統のトランスジェニック：ヌル比は、おおよそ、
３：１から１５：１の間であると分かった。各構築物からのトップＤＨＡ試料の代表的脂
肪酸プロファイルの分析で、他の新ω６ＰＵＦＡは検出されず、１．２～１．４％のみの
ＧＬＡであると分かった。対照的に、新ω３ＰＵＦＡ（ＳＤＡ）、ω３ＬＣ－ＰＵＦＡ（
ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ）は、総脂肪酸含有物の９．６％のＤＨＡレベルで１８
．５％まで蓄積することが分かった。Δ６－不飽和化は３２％であり、ＥＰＡは総脂肪酸
含有物の０．８％であった。Δ５－エロンゲーション効率は９３％であり、Δ６－エロン
ゲーション効率は６０％であった。ＧＡ７系統の極性種子脂質フラクション中でＤＨＡを
検出した。

【0307】

なお、観察された分離比（約３：１～約１５：１）は、１つまたは、高々、２つのトラ
ンスジェニック遺伝子座がカメリナサティバの魚オイルの様なＤＨＡレベルを産生するの
に必要であることを示した。このことは、トランスジェニックの体質を導入遺伝子の安定
性だけでなく繁殖できる容易さについて重要な意味を有する。

【0308】

ホモ接合種子を、合計６００以上の個々の植物を生成するため、いくつかの温室にわた
って植え付けた。ソックスレー、アセトン及びヘキサン抽出を含む様々な方法を用いて、
種子からオイルを抽出した。

【0309】

ＴＡＧのω３ＬＣ－ＰＵＦＡの位置分布を決定するため、トランスジェニックカメリナ
サティバ種子オイルに対して、^１３Ｃ ＮＭＲ位置特異性分析を行った。おおよそ等しい
ＥＰＡ及びＤＨＡでのイベントを、これらの脂肪酸に対する応答を最大にするため選択し
、ｓｎ－２に対するｓｎ－１，３の比が、ＥＰＡについて０．７５：０．２５であり、Ｄ
ＨＡについて０．８６：０．１４であり、偏りがない分布は０．６６：０．３３であろう
と分かった。すなわち、ＥＰＡ７５％及びＤＨＡ８６％が、ＴＡＧのｓｎ－１，３位に位
置していた。このことは、ＥＰＡの優先度は、ＤＨＡより弱いが、両方の脂肪酸は、カメ
リナサティバＴＡＧのｓｎ－１，３位に優先的に位置することを示した。ＤＨＡがｓｎ－
１，３位に優先的に見られたという発見は、シロイヌナズナの種子で以前に報告された結
果と類似していた（Ｐｅｔｒｉｅら、２０１２）。

【0310】

少数の独立トランスジェニック系統が上記形質転換実験で得られたので、さらなるカメ
リナサティバ形質転換を、ＧＡ７－ｍｏｄＢ構築物を用いて行った（実施例３）。より多
くの形質転換体を得て、２０．１％を超えるＤＨＡを産生するホモ接合系統を確認した。

【0311】

実施例３．植物種子内のＤＨＡをコードするＴ－ＤＮＡの修飾経路
ＷＯ２０１３／１８５１８４に記載のレベルを超えるアブラナのＤＨＡ産生レベルを改
善するため、バイナリーベクターｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＡ、ｐＪＰ３４１６－
ＧＡ７－ｍｏｄＢ、ｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＣ、ｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏ
ｄＤ、ｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＥ及びｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＦを、Ｗ
Ｏ２０１３／１８５１８４に記載の通り構築し、トランスジェニック植物で試験した。こ
れらのバイナリーベクターは、ｐＪＰ３４１６－ＧＡ７構築物の変異体であり、特に、Δ
６－デサチュラーゼ及びΔ６－エロンガーゼ機能の改良により、植物種子内のＤＨＡ合成
をさらに増加するように設計した。ＳＤＡは、Δ５－エロンガーゼと比較して、比較的低
いΔ６－エロンガーゼ効率のによってＧＡ７構築物で形質転換されたいくつかの種子内に
蓄積されるので、他の修飾の中で、２つのエロンガーゼ遺伝子位置をＴ－ＤＮＡ中にスイ
ッチすることが観察された。

【0312】

ｐＪＰ３４１６－ＧＡ７中で配列をコードする２つのエロンガーゼを、Ｔ－ＤＮＡのそ
れらの位置でスイッチし、ピラミモナス・コルダタΔ５－エロンガーゼカセットを置換す
るためにｐＪＰ３４１６－ＧＡ７のＳｂｆ１部位間の新ピラミモナス・コルダタΔ６－エ
ロンガーゼカセットを先ずクローニングすることにより、ｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏ
ｄＡを得た。この構築物を、コンリニンＣｎｌ２プロモーター（ｐＬｕＣｎｌ２）でミク
ロモナス・プシーラΔ６－デサチュラーゼを駆動づるＦＰ１プロモーターを交換して、ｐ
ＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＢを得ることによりさらに修飾した。Δ６－デサチュラー
ゼ発現、それにより、酵素効率を増加する試みで、この修飾を行った。Ｃｎｌ２プロモー
ターは、短縮化ナピンプロモーターより、セイヨウアブラナの導入遺伝子のより高い発現
を得る可能性があるはずである。

【0313】

８つのトランスジェニックｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＢシロイヌナズナイベント
及び１５のトランスジェニックｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＧシロイヌナズナイベン
トを作成した。プールされたｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＢ種子内の３．４％から７
．２％の間のＤＨＡを観察し、プールされたＴ２ ｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＧ種
子内の０．６から４．１％の間のＤＨＡを観察した。最も高いｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－
ｍｏｄＢイベントのいくつかを、選択培地上に播種し、生存苗を次世代まで生育した。種
子をＤＨＡ含有率について分析する。プールされたＴ１種子は、導入遺伝子について分離
している集団を表し、いずれかのヌル分離個体を含んでいたので、子孫植物のホモ接合種
子が、種子オイル中の総脂肪酸含有物の３０％まで、ＤＨＡレベルを増加したはずだと期
待される。他の修飾された構築物を、シロイヌナズナを使用して形質転換した。少数のみ
の形質転換系統を得たにもかかわらず、ｍｏｄＢ構築物より高いレベルのＤＨＡを得るも
のはなかった。

【0314】

ｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＢ構築物も、品種オスカー及びＮＸ００２、ＮＸ００
３、ＮＸ００５、ＮＸ０５０、ＮＸ０５２及びＮＸ０５４と命名された一連の育成系統の
形質転換セイヨウアブラナ植物を使用して作成した。オスカー形質転換のための７７独立
形質転換植物（Ｔ０）、及びＦＡＤ２遺伝子中の突然変異の効果によってその種子オイル
中の高オレイン酸含有率を有する系統であるＮＸ００５のための１８９を含む育成系統の
ための１４８０独立植物を含む１５５８形質転換植物全体を得た。他の育成系統はより高
いレベルのＬＡ及びＡＬＡを有した。デジタルＰＣＲ法により決定するとき、Ｔ－ＤＮＡ
の４つより多いコピーを示すトランスジェニック植物（実施例１）を引抜き；Ｔ０植物の
約２５％をこの判断基準により処分した。Ｔ０トランスジェニック植物の約５３％は、デ
ジタルＰＣＲ法により決定するとき、Ｔ－ＤＮＡの１つまたは２つのコピーを有し、１２
％は約３つのコピー、２４％は、４つ以上のコピーを有した。種子（Ｔ１種子）を、自家
受粉後、約４５０のトランスジェニック系統から収穫し、異系交配を避けるために、開花
中植物に袋掛けすることにより行った。Ｔ１種子を、成熟したとき、トランスジェニック
植物の残りから収穫した。約１～２％の植物系統は、雄または雌繁殖不能のいずれかであ
り、生存可能な種子を産生せず、Ｔ０植物を処分した。

【0315】

種子のプール（各ポールで２０のＴ１種子）を、プールされた種子オイル中のＤＨＡレ
ベルについて試験し、最も高いレベルを示す系統を選択した。特に、プールされたＴ１種
子内の総脂肪酸含有物の少なくとも２％のＤＨＡ含有率を有する系統を選択した。約１５
％のトランスジェニック系統をこの方法で選択し；その他の８５％を処分した。これらの
いくつかを系統ＣＴ１３２－５（品種オスカー）、ＣＴ１３３－１５、－２４、－６３、
－７７、－１０３、－１２９及び－１３０（ＮＸ００５）と命名した。ＮＸ０５０の選択
系統は、ＣＴ１３６－４、－８、－１２、－１７、－１９、－２５、－２７、－４９及び
－５１を含んだ。ＣＴ１３２．５を含む選択系統の２０種子及びＣＴ１３３．１５の１１
種子を浸し、２日後、各個々の種子からの半分の子葉からオイルを抽出した。胚軸を含む
他の半分の子葉を残し、特異子孫系統を維持するために培地で培養した。オイル中の脂肪
酸組成を決定した；データをＣＴ１３２．５について表６に示す。分析した２０種子のう
ち１０のＤＨＡレベルは、ＧＣ分析により測定して、総脂肪酸含有物の７～２０％の範囲
であった。他の種子は、７％未満のＤＨＡを含み、ｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＢか
らのＴ－ＤＮＡの部分（不完全）コピーを含んでいた可能性がある。トランスジェニック
系統は、遺伝的に結合していない複数の導入遺伝子インサーションを含むように思われた
。トランスジェニック系統ＣＴ１３３．１５の種子は、０～５％の範囲のＤＨＡレベルを
示した。ＤＨＡを含まない種子は、ヌル分離個体であるようであった。これらのデータは
、ｍｏｄＢ構築物がキャノーラ種子内のＤＨＡ産生に対して十分に性能を発揮することを
確認した。

【0316】

選択された形質転換系統から自家受粉後に各複数のＴ１植物から得られた２０または４
０の個々の種子（Ｔ２種子）を、脂肪酸組成について個別に試験した。２０％より大きい
レベルでＤＨＡを含む種子を同定した（表７）。２つの代表的試料、ＣＴ１３６－２７－
１８－２及びＣＴ１３６－２７－１８－１９は、それぞれ、２１．２％及び２２．７％の
ＤＨＡを含んでいた。これらの種子内の総ω３脂肪酸含有率は、総脂肪酸含有物中のパー
セントで約６０％であり、ω６含有率は１０％未満であった。さらに、各Ｔ１植物の２０
または４０のＴ２種子のセットを、脂肪酸組成について試験した。３４．３％までのＤＨ
Ａを含む種子を、例えば、種子ＣＴ１３６－２７－４７－２５で確認した（表９）。ＣＴ
１３６－２７－４７－２５から得られた種子オイルの脂肪酸組成を表９に示す。脂肪酸組
成は、ＤＰＡ約１．５％、ＥＰＡ０．６％及びＥＴＡ０．５％と一緒にＤＨＡ３４．３％
を含んでいた。ＳＤＡレベルは約７．５％であり、ＡＬＡは約２１．９％、ＬＡは約６．
９％であった。新ω６ＰＵＦＡはＧＬＡ１．１％を示したが、ω６－Ｃ２０も－Ｃ２２
ＬＣ－ＰＵＦＡも検出されなかった。総飽和脂肪酸：９．６％；一価不飽和脂肪酸、１２
．５％；総ＰＵＦＡ、７５．２％；総ω６－ＰＵＦＡ（ＬＡを含む）、７．２％；総ω３
－ＰＵＦＡ、６６．９％；総ω６：ω３脂肪酸の比、９．３：１；新ω６：新ω３脂肪酸
、３７：１。オレイン酸からＤＨＡへの各酵素工程の効率は以下であった：Δ１２－デサ
チュラーゼ、９０％；Δ１５／ω３－デサチュラーゼ、８９％；Δ６－デサチュラーゼ、
６７％；Δ６－エロンガーゼ、８３％；Δ５－デサチュラーゼ、９９％；Δ５－エロンガ
ーゼ、９８％；Δ４－デサチュラーゼ、９６％。オレイン酸からＤＨＡへの転換の全体効
率は約５０％であった。従って、種子オイルの総脂肪酸含有物の２０．１～３５％の範囲
でＤＨＡを産生する種子が、総脂肪酸含有物中の２０．１％から３０％の間のＤＨＡまた
は３０％から３５％の間のＤＨＡを含む種子を含み確認され、選択されるとは明白であっ
た。

【0317】

いくつかの種子内のオイル含有率は、野生型種子の約４４％から、ＤＨＡ産生種子のい
くつかの約３１～３９％まで低下するが、他のＤＨＡ産生種子の野生型レベルと同様であ
った。

【0318】

Ｔ２種子の少なくとも１０％のレベルでＤＨＡを産生する様々な形質転換植物系統を交
配し、複数のＴ－ＤＮＡインサーションに対してホモ接合であるＦ２子孫を産生するため
、Ｆ１子孫を自家受粉させた。ホモ接合種子からの種子オイルを分析し、種子オイル中の
３０％までまたは３５％の総脂肪酸含有物はＤＨＡである。

【0319】

ＣＴ１３６－２７－１８－２及びＣＴ１３６－２７－１８－１９から得られたオイル中
のＴＡＧを、ＴＡＧ分子のグリセロール骨格上のＤＨＡの位置分布について、^１３Ｃ Ｎ
ＭＲ位置特異性アッセイにより分析した。ＤＨＡは、ｓｎ－１，３位において優先的に結
合していた。ＤＨＡの７０％より多く、実際、９０％より多くが、ｓｎ－１，３位であっ
た。

【0320】

いくつかのさらなるトランスジェニック系統では、独立イベントからの単一種子のＤＨ
Ａ含有率は１２％を超えた。これらの系統のトランスジェニック：ヌル比は、１つのトラ
ンスジェニック遺伝子座に対応して約３：１であり、２つのトランスジェニック遺伝子座
に対応して１５：１であることが分かった。最も高いレベルのＤＨＡを有する各構築物か
らの試料の代表的脂肪酸プロファイルの分析では、新ω６ＰＵＦＡを含まず、１．２～１
．４％のみのＧＬＡが検出された。対照的に、新ω３ＰＵＦＡ（ＳＤＡ）及びω３ＬＣ－
ＰＵＦＡ（ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ）は、ＧＡ７－形質転換種子について１８．
５％と比較して、ｍｏｄＦ構築物について２５．８％及びｍｏｄＧ構築物について２１．
９％の合計を蓄積した。これらの種子のオイル中のＤＨＡレベルは、それぞれ、９．６％
、１２．４％及び１１．５％であった。Δ６－不飽和化は、ｍｏｄＦ－及びｍｏｄＧ－形
質転換種子よりＧＡ７－形質転換種子で低く（３２％対４７％及び４３％）、これにより
、ＧＡ７と比較して、ｍｏｄＦ及びｍｏｄＧ内のＡＬＡの低下をもたらすことが分かった
。別の注目すべき差は、ｍｏｄＦ種子内のＥＰＡの蓄積であり（他の２つのトランスジェ
ニック種子内で３．３％対０．８％）、これは、ＧＡ７及びｍｏｄＧ種子（９３％及び９
４％）と比較して、ｍｏｄＦ（８０％）種子内で観察されたΔ５－エロンゲーションの低
下に反映された。わずかにより活性なΔ６－不飽和化によって、ＳＤＡ量が実際に増加し
たが、これらの種子内のΔ６－エロンゲーションのわずかな増加（６６％対６０％及び６
１％）があった。ＤＨＡを、ＧＡ７系統の極性種子脂質フラクションで検出した。

【0321】

ｍｏｄＢ構築物のＴ－ＤＮＡで形質転換されたセイヨウアブラナ育成系統ＮＸ５４の７
０の独立トランスジェニック植物のＴ１種子内の脂質の脂肪酸組成物を分析した。これら
のトランスジェニック植物の１つが、種子オイル中にＤＰＡを含むが、ＤＨＡを含まない
種子を産生することが観察された。この系統（ＣＴ－１３７－２）のＴ１種子は、Ｔ１プ
ール種子内に検出可能なＤＨＡを含まないで、ＤＰＡ約４％を産生した。本発明者らは、
このことが、自然な突然変異により、その特定の挿入Ｔ－ＤＮＡ中のΔ４－デサチュラー
ゼ遺伝子の不活性化が原因であるか否かを検証した。ＰＣＲ分析及びＤＮＡ配列解析によ
り欠失の存在が示され、ＧＡ７－ｍｏｄＢのＴ－ＤＮＡのヌクレオチド１２９８８－１５
３１７の欠失が明らかにされた（配列番号２）。該欠失ヌクレオチドは、Δ４－デサチュ
ラーゼコード領域の発現を駆動させるＬｉｎｕｓ Ｃｎｌ２プロモーター部分ならびにΔ
４－デサチュラーゼコード領域それ自体に相当し、これにより、該欠失を含むＴ－ＤＮＡ
で形質転換された種子がＤＨＡを産生しなかった理由が説明される。

【0322】

このトランスジェニック系統からの約５０のＴ１種子を発芽させ、各々からの１つの発
生した子葉を、残りのオイル中の脂肪酸組成について分析した。それから、５％より多い
ＤＰＡを示す選択された苗を成熟するまで生育し、Ｔ２種子を収穫した。プール種子脂肪
酸組成を、表８に示し、７％より多いＤＰＡを、これらの系統で観察した。Ｔ４種子はセ
イヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）ＤＰＡ系統ＣＴ－１３７－２から作製され、脂肪酸プ
ロファイルについて分析された。最大で１３％のＤＰＡが、集められた成熟種子試料にお
いて観察された。

【0323】

約１０％のＤＰＡを有する種子からのオイルを、弱アルカリで処置し、脂肪酸を加水分
解した。

【0324】

Ｂ０００３－５１４と指定される別のトランスジェニック系統は、Ｔ２種子において約
１０～１６％のＤＰＡを示した。１５．８％のＤＰＡ、０．２～０．９％のＤＨＡ、及び
０．１～２．５％のＥＰＡを含有する種子が選択された。Ｔ２種子群は、高ＤＰＡ：中Ｄ
ＰＡ：無ＤＰＡに関し、１：２：１の分離割り当てを示し、このことから、該トランスジ
ェニック系統において、ＤＰＡ産生に関し、単一遺伝子座の存在が示唆される。

【0325】

オイルは、ＬＣ－ＰＵＦＡを産生する種子試料からねじプレスにより抽出され、それに
よりシードミールを作製した。

【0326】

構築物の設計
この実験の焦点が油料種子作物種内のＤＨＡ及びＤＰＡの産生の実証であった一方、上
記の結果は、構築物設計展望からも興味があった。最初、ｍｏｄＦ構築物中のΔ６－及び
Δ５－エロンガーゼコード領域位置のスイッチは、より低いΔ５－エロンゲーションのた
めに蓄積されたより多いＥＰＡを含む意図されたプロファイル変化をもたらした。Δ６－
エロンゲーションの同時増加が観察されたが、これは、より低いＳＤＡレベルをもたらさ
なかった。これは、より高活性なアマコンリニン２プロモーターによる短縮化ナピンプロ
モーター（ＦＰ１）の置換だけでなく、余分にミクロモナス・プシーラΔ６－デサチュラ
ーゼ発現カセットの付加により引き起こされた、ｍｏｄＦ形質転換種子内のΔ６－不飽和
化の増加に起因した。ｍｏｄＧ構築物で観察されたΔ６－不飽和化のいくらか低い増加は
、ＧＡ７中の高発現Δ５－エロンガーゼカセットの利用に起因した。Δ６－デサチュラー
ゼ及びΔ５－エロンガーゼコード領域の位置のスイッチは、より大きなΔ６－不飽和化を
もたらした。Ｃｎｌ２プロモーターによるＦＰ１プロモーターの置換によって、この場合
では、Δ５－エロンガーゼ活性は減少しなかった。

【0327】

これらのデータは、ｍｏｄＢ、ｍｏｄＦ及びｍｏｄＧ構築物が、アラビドプシス属及び
セイヨウアブラナのように、カメリナ種子内のＤＨＡ産生に対して良い結果を出した。

【0328】

本発明者らは、概して、ＤＨＡ経路の律速酵素活性の効率が、単一コピーＴ－ＤＮＡ形
質転換体と比較して、多コピーＴ－ＤＮＡ形質転換体でより大きくあり得る、または経路
内で限定され得る酵素をコードするＴ－ＤＮＡ同義遺伝子中への挿入により増加し得ると
考えた。多コピー形質転換体の可能性ある重要性に対する証拠は、ＧＡ７構築物で形質転
換されたアラビドプシス属種子内で見られ、最高収率のＤＨＡイベントは、宿主ゲノム中
に挿入された３種のＴ－ＤＮＡを有した。同義遺伝子は同じであり得る、または、好適に
、同じポリペプチドをコードする異なる変異体である、または重複する発現パターンを有
する異なるプロモーターの制御下にある。例えば、同じタンパク質が産生される場合でも
、多重Δ６－デサチュラーゼコード領域の発現により、増加した発現を達成できるはずで
ある。ｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＦ及びｐＪＰ３４１６－ＧＡ７－ｍｏｄＣでは、
例えば、ミクロモナス・プシーラΔ６－デサチュラーゼの２つの変化形が存在し、異なる
プロモーターにより発現された。コード配列は、異なるコドン使用頻度、従って、異なる
ヌクレオチド配列を有し、可能性のあるサイレンシングまたは同時抑制効果を減少させた
が、同じタンパク質の産生をもたらした。

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【0329】

実施例４．ＤＨＡを産生するトランスジェニックシロイヌナズナ種子のＴＡＧの分析
形質転換シロイヌナズナ種子のＴＡＧ上のＤＨＡの位置分布を、ＮＭＲにより測定した
。総脂質を、ヘキサン１０ｍＬを含むガラスチューブに粉砕種子を移動する前に、ヘキサ
ン下に、種子を先ず粉砕することにより約２００ｍｇの種子から抽出した。チューブを水
浴で約５５℃に温めて、それから、ボルテックスして遠心分離した。ヘキサン溶液を取り
出し、さらに４ｘ１０ｍＬでこの手順を繰り返した。抽出物を合わせて、ロータリーエバ
ポレーターで濃縮し、抽出脂質中のＴＡＧを、２０ｍＬのヘキサン中７％ジエチルエーテ
ルを用いて、短いシリカカラムを通過させることにより極性脂質から分離して精製した。
精製ＴＡＧ上のアシル基位置分布を前述のように定量的に測定した（Ｐｅｔｒｉｅら、２
０１０ａ及びｂ）。

【0330】

分析は、総種子オイル中のＤＨＡの大部分がＴＡＧのｓｎ－１／３位に位置しており、
ｓｎ－２位においてはほとんど見られなかったことを示した。このことは、ＡＲＡ（２０
：４^{Δ５、８、１１、１４}）の５０％がトランスジェニックキャノーラオイルのｓｎ－２
位に位置する一方、３３％のみランダムな分布で期待されることを示したＡＲＡ産生種子
からのＴＡＧと対照的であった（Ｐｅｔｒｉｅら、２０１２）。

【0331】

トランスジェニックシロイヌナズナ種子の総脂質を、主要なＤＨＡ含有トリアシルグリ
セロール（ＴＡＧ）化学種を測定するため、トリプル四重極ＬＣ－ＭＳによっても分析し
た。最も豊富なＤＨＡ含有ＴＡＧ化学種は、ＤＨＡ－１８：３－１８：３（ＴＡＧ５８：
１２；位置分布を表現できない命名法）であり、２番目に最も豊富なのはＤＨＡ－１８：
３－１８：２（ＴＡｇ５８：１１）であることが分かった。トリＤＨＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ
６６：１８）を、たとえ低くても、検出可能レベルで、総種子オイル中に観察された。他
の主要ＤＨＡ含有ＴＡＧ種は、ＤＨＡ－３４：３（ＴＡＧ５６：９）、ＤＨＡ－３６：３
（ＴＡＧ５８：９）、ＤＨＡ－３６：４（ＴＡＧ５８：１０）、ＤＨＡ－３６：７（ＴＡ
Ｇ５８：１３）及びＤＨＡ－３８：４（ＴＡＧ６０：１０）を含んでいた。２つの主要Ｄ
ＨＡ含有ＴＡＧ種を、Ｑ－ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳによりさらに確認した。

【0332】

実施例５．オイルのステロール含有量及び組成のアッセイ
オーストラリアの商業的給源から購入した１２種の植物オイルからのフィトステロール
は、実施例１に記載のＯ－トリメチルシリルエーテル（ＯＴＭＳｉ－エーテル）誘導体と
してＧＣ及びＧＣ－ＭＳにより特徴付けられた。ステロールを、保持データ、質量スペク
トル解析及び文献と実験標準質量スペクトルデータとの比較により同定した。ステロール
を５β（Ｈ）－コラン－２４－オール内部標準の使用により定量化した。同定されたステ
ロールのフィトステロール基本構造及び化学構造を、図３及び表１０に示す。

【0333】

分析された植物オイルは：ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）、オリーブ（Ｏｌ
ｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ）、ヒマ（Ｒ
ｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ
）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈ
ｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）及びダイ
ズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）からであった。オイル試料全部にわたって、相対的存在比
の減少では、主要フィトステロールは：β－シトステロール（総ステロール含有物中２８
～５５％の範囲）、Δ５－アベナステロール（イソフコステロール）（３～２４％）、カ
ンペステロール（２～３３％）、Δ５－スチグマステロール（０．７～１８％）、Δ７－
スチグマステロール（１～１８％）及びΔ７－アベナステロール（０．１～５％）であっ
た。いくつかの他の少量ステロールを同定し、これらは：コレステロール、ブラシカステ
ロール、カリナステロール、カンペスタノール及びエブリコールであった。４種のＣ２９
：２及び２種のＣ３０：２ステロールも検出されたが、これらの少量成分の同定を完了す
るには、さらなる調査が必要である。加えて、いくつかの他の同定されたステロールは、
オイルのいくつか中に存在したが、その非常に低存在量のために、質量スペクトルは、そ
の構造を同定するには十分な強度でなかった。

【表10】

【0334】

減少量のオイルｍｇ／ｇとして表現したステロール含有量は：キャノーラオイル（６．
８ｍｇ／ｇ）、ゴマオイル（５．８ｍｇ／ｇ）、アマオイル（４．８～５．２ｍｇ／ｇ）
、ヒマワリオイル（３．７～４．１ｍｇ／ｇ）、ピーナッツオイル（３．２ｍｇ／ｇ）、
ベニバナオイル（３．０ｍｇ／ｇ）、ダイズオイル（３．０ｍｇ／ｇ）、オリーブオイル
（２．４ｍｇ／ｇ）、ヒマシオイル（１．９ｍｇ／ｇ）であった。ステロール組成％及び
総ステロール含有率を表１１に示す。

【0335】

全ての種子オイル試料の中で、主要フィトステロールは、概して、β－シトステロール
であった（総ステロール含有物の３０～５７％の範囲）。他の腫瘍ステロール：カンペス
テロール（２～１７％）、Δ５－スチグマステロール（０．７～１８％）、Δ５－アベナ
ステロール（４～２３％）、Δ７－スチグマステロール（１～１８％）の割合のオイルの
中で広範囲であった。異なる種のオイルは、全く異なるプロファイルを有するいくつかを
含む異なるステロールプロファイルを有した。キャノーラオイルの場合、カンペステロー
ルの最も高い比率（３３．６％）を有したが、他種の試料は、概して、ピーナッツオイル
中、例えば、１７％までの低レベルを有した。ベニバナオイルは、比較的高い割合のΔ７
－スチグマステロール（１８％）を有したが、このステロールは、ヒマワリオイル中９％
まで、他種オイル中、通常低かった。それらは、各種について特徴的であったので、従っ
て、ステロールプロファイルを特異的植物（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ）または植物（ｐｌａｎ
ｔ）オイルの同定の助け及びその真実性または他のオイルによる不純物混和のチェックの
ため使用できる。

【0336】

種子の冷間圧縮により製造され精製されていない各場合において、２つの試料の各ヒマ
ワリとベニバナを比較したが、一方、その他は冷間圧縮をせず精製した。いくつかの異な
る点が観察されたが、オイルの２つの源は、類似のステロール組成及び総ステロール含有
率を有し、処理及び精製がこれらの２つのパラメーターに対してほとんど影響がないこと
を示唆した。試料中のステロール含有量は、３倍変わり、１．９ｍｇ／ｇ～６．８ｍｇ／
ｇの範囲であった。キャノーラオイルは、最も高く、ヒマシオイルは最も低いステロール
含有率であった。

【0337】

実施例６．ＴＡＧのｓｎ－２位におけるＤＨＡ及びＤＰＡの蓄積増加
本発明は、ＴＡＧのｓｎ－２位におけるＤＨＡ及び／またはＤＰＡ蓄積を、１－アシル
－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をＧＡ７構築物ま
たはその変異体により与えられるなど、ＤＨＡまたはＤＰＡ生合成経路と一緒に同時発現
することにより増加できた。好ましいＬＰＡＡＴは、内在性ＬＰＡＡＴと比較して、ＬＰ
Ａのｓｎ－２位における多価不飽和Ｃ２２鎖の挿入増加をもたらし、ＰＡを生成する、基
質として多価不飽和Ｃ２２脂肪アシル－ＣｏＡ、好ましくはＤＨＡ－ＣｏＡ及び／または
ＤＰＡ－ＣｏＡに対して作用できるもの、特に基質としてＤＨＡ－ＣｏＡ及びＤＰＡ－Ｃ
ｏＡの両方を用いることができるものである。細胞質内ＬＰＡＡＴ酵素は、特に、該種が
合成及びＴＡＧ中の異常な脂肪酸を蓄積する場合、しばしば、多様な基質選択性を示す。
リムナンテス・ダグラシー（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）からのＬＰＡ
ＡＴ２を、Ｃ２２基質を利用できない同じ種からのＬＰＡＡＴ１との対照で、ＰＡ合成の
基質として、エルコイルＣｏＡ（Ｃ２２：１－ＣｏＡ）を使用することが分かった（Ｂｒ
ｏｗｎら、２００２）。

【表11】

【0338】

既知ＬＰＡＡＴを考慮し、コントロールとして、ｓｎ－２位におけるＤＨＡの組み込み
を増加すると期待されないいくつかを含み、試験のため数を選択した。既知のＬＰＡＡＴ
は：シロイヌナズナＬＰＡＡｔ２：（配列番号４０、受託番号ＡＢＧ４８３９２、Ｋｉｍ
ら、２００５）、リムナンテス・アルバＬＰＡＡＴ（配列番号４１、受託番号ＡＡＣ４９
１８５、Ｌａｓｓｎｅｒら、１９９５）、サッカロミセス・セレビシアＳｌｃ１ｐ（配列
番号４２、受託番号ＮＰ＿０１０２３１、Ｚｏｕら、１９９７）、モルティエレラ・アル
ピナＬＰＡＡＴ１（配列番号４４、受託番号ＡＥＤ３３３０５；ＵＳ７８７９５９１）及
びセイヨウアブラナＬＰＡＡＴ（配列番号４５及び配列番号４６、それぞれ、受託番号Ａ
ＤＣ９７４７９及びＡＤＣ９７４７８）を含んでいた。

【0339】

アラビドプシス属ＬＰＡＡＴ２（ＬＰＡＴ２とも命名）は、Ｃ１６及びＣ１８基質に対
する活性を有することが分かっている小胞体局在酵素であるが、しかしながら、Ｃ２０ま
たはＣ２２基質に対する活性は試験されなかった（Ｋｉｍら、２００５）。リムナンテス
・アルバＬＰＡＡＴ２は、基質としてＤＨＡまたはＤＰＡを使用する能力は試験されなか
ったが、ＰＡのｓｎ－２位中にＣ２２：１アシル鎖を挿入することが示された（Ｌａｓｓ
ｎｅｒら、１９９５）。選択されたサッカロミセス・セレビシアＬＰＡＡＴ Ｓｌｃ１ｐ
は、鎖長に関する広い基質特異性を示す、基質として１８：１－ＣｏＡに加えて、２２：
１－ＣｏＡを用いた活性を有することが分かった（Ｚｏｕら、１９９７）。また、ＤＨＡ
－ＣｏＡ、ＤＰＡ－ＣｏＡ及び他のＬＣ－ＰＵＦＡは、基質として試験されなかった。モ
ルティエレラ属ＬＰＡＡＴは、アルカン資化性酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔ
ｉｃａ）中でＥＰＡ及びＤＨＡ脂肪酸基質に対する活性を有することが以前に分かってい
る（ＵＳ７８７９５９１）が、植物細胞のその活性は未知であった。

【0340】

さらなるＬＰＡＡＴは、本発明者らにより同定された。ミクロモナス・プシーラは、こ
の種のＴＡＧ上のＤＨＡの位置分布を確認しなかったが、そのオイル中のＤＨＡを産生し
蓄積する微細藻類である。ミクロモナス・プシーラＬＰＡＡＴ（配列番号４３、受託番号
ＸＰ＿００２５０１９９７）を、ＢＬＡＳＴクエリー配列として、アラビドプシスＬＰＡ
ＡＴ２を用いた、ミクロモナス・プシーラゲノム配列の調査により同定した。いくつかの
候補配列が明らかになり、配列ＸＰ＿００２５０１９９７を、Ｃ２２ ＬＣ－ＰＵＦＡに
ついての試験のため合成した。トウゴマＬＰＡＡＴを、ヒマシゲノム配列中の推定ＬＰＡ
ＡＴとしてアノテートした（Ｃｈａｎら、２０１０）。ヒマシゲノムからの候補４つのＬ
ＰＡＡＴを合成し、湿潤されたベンサミアナタバコ葉組織の粗葉ライセートで試験した。
本明細書に記載の候補配列は、ＬＰＡＡＴ活性を示した。

【0341】

いくつかの候補ＬＰＡＡＴを、系統樹上の既知ＬＰＡＡＴで配置した。なお、推定ミク
ロモナスＬＰＡＡＴは、推定Ｃ２２ ＬＰＡＡＴとクラスター形成しなかったが、分岐（
ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）配列であった。

【0342】

基質としてＤＨＡ－ＣｏＡ及び／またはＤＰＡ－ＣｏＡを使用するその能力について様
々なＬＰＡＡＴの最初の試験として、キメラ遺伝子構築物を、ベンサミアナタバコ葉内の
外来性ＬＰＡＡＴの構成的発現のため作成し、３５Ｓプロモーターの制御下、各々は次の
ものであった：３５Ｓ：Ａｒａｔｈ－ＬＰＡＡＴ２（シロイヌナズナＥＲ ＬＰＡＡｔ）
；３５Ｓ：Ｌｉｍａｌ－ＬＰＡＡＴ（リムナンテス・アルバＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｓａ
ｃｃｅ－Ｓｌｃ１ｐ（サッカロミセス・セレビシアＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｍｉｃｐｕ－
ＬＰＡＡＴ（ミクロモナス・プシーラＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｍｏｒａｌ－ＬＰＡＡＴ１
（モルティエレラ・アルピナＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｂｒａｎａ－ＬＰＡＡＴ１．１３（
セイヨウアブラナＬＰＡＡＴ１．１３）；３５Ｓ：Ｂｒａｎａ－ＬＰＡＡＴ１．５（セイ
ヨウアブラナＬＰＡＡＴ１．５）。外来性ＬＰＡＡＴを含まない３５Ｓ：ｐ１９構築物を
、実験のコントロールとして使用した；該構築物は、各ベンサミアナタバコ（Ｎ． ｂｅ
ｎｔｈａｍｉａｎａ）接種物に含まれた。これらの構築物の各々を、実施例１に記載のよ
うに、アグロバクテリウムによりベンサミアナタバコ葉中に導入し、浸潤後５日目、処理
した葉のゾーンを切り取り粉砕して葉ライセートを作成した。各ライセートは、ＬＰＡを
合成する内在性酵素だけでなく、外来性ＬＰＡＡＴを含有した。該ライセートに、^１４Ｃ
標識－ＯＡ及び－ＤＨＡを別々に添加することにより、インビトロ反応を行った。反応物
を２５℃でインキュベートし、^１４Ｃ標識脂肪酸をＰＡに組み込んだレベルをＴＬＣによ
り決定した。ＡＲＡ及びＣ１８脂肪酸と比較した各ＬＰＡＡＴがＤＨＡを使用する能力を
評価した。メドウフォーム（リムナンテス・アルバ）、モルティエレラ及びサッカロミセ
スＬＰＡＡＴは、これらは見えるが、他のＬＰＡＡＴは見えない放射標識ＰＡを用いて、
ＤＨＡ基質に対する活性を有することが分かった。全てのＬＰＡＡＴを、オレイン酸コン
トロールフィードにより確認した。

【0343】

種子中のＬＰＡＡＴ活性を試験するため、いくつかのタンパク質コード配列またはＬＰ
ＡＡＴを、コンリニン（ｐＬｕＣｎｌ２）プロモーターの制御下、バイナリーベクター中
に挿入した。それから、それぞれ、キメラ遺伝子、Ｃｎｌ２：Ａｒａｔｈ－ＬＰＡＡＴ（
ネガティブコントロール）、Ｃｎｌ２：Ｌｉｍａｌ－ＬＰＡＡＴ、Ｃｎ２：Ｓａｃｃｅ－
Ｓｌｃ１ｐ、及びＣｎｌ２：Ｍｏｒａｌ－ＬＰＡＡＴを含む得られた遺伝子構築物を、そ
れらの種子内でＤＨＡを産生するシロイヌナズナ植物を使用し形質転換使用し、ＬＰＡＡ
Ｔ及びＴＡＧのｓｎ－２位へのＤＨＡの組み込みが増加するかどうかを試験するため、種
子特異的方法のトランスジェニックＤＨＡ経路を発現する安定な形質転換体を生成する。
ＧＡ７構築物及びその変異体（実施例２及び３）を既に含むセイヨウアブラナ及びカメリ
ナサティバ植物を使用し形質転換し、親及びＬＰＡＡＴ遺伝子構築物の両方を保有する子
孫を生成する。ＴＡＧのｓｎ－２位へのＤＨＡ及び／またはＤＰＡの組み込みの増加を、
導入遺伝子をコードするＬＰＡＡＴを含まない植物での組み込みと比較して試験した。オ
イル含有率も種子内で改善され、特に、より高いレベルのＤＨＡを産生する種子に対して
改善される。

【0344】

種子特異的ｐＣｎｌ２：Ｍｏｒａｌ－ＬＰＡＡＴ１構築物を使用して、ＧＡ７構築物か
らのＴ－ＤＮＡに対してホモ接合であり、その種子が種子脂質中にＤＨＡ約１５％をは含
有する既にトランスジェニックなシロイヌナズナ系統を形質転換した（Ｐｅｔｒｉｅら、
２０１２）。これのため、トランスジェニック系統中に既に存在するｂａｒ選択マーカー
遺伝子と異なるｐＣｎｌ２：Ｍｏｒａｌ－ＬＰＡＡＴ１構築物中のカナマイシン選択マー
カー遺伝子を使用した。カナマイシンに耐性があり、温室内で成熟するまで生育したトラ
ンスジェニック苗を選択した。Ｔ２種子を収穫し、その総種子脂質の脂肪酸組成をＧＣに
より分析した（表１２）。３３種の独立した形質転換された系統の中から、３種の表現型
を観察した。第一の群（６／３３系統）では、ＤＰＡは、総種子脂質の約１０．６％まで
、ＤＨＡレベルより実質的に大きいレベルで増加した。これは、この系統群の中で、強く
減少するＤＨＡの犠牲によって生じた。この第一の群の２つの系統では、ＤＰＡ＋ＤＨＡ
の合計は減少したが、他の４系統では減少しなかった。第二の群（５／３３）では、ＤＰ
ＡとＤＨＡのレベルはほぼ等しく、ＤＰＡ＋ＤＨＡの合計は親種子とほぼ同じであった。
第三の群では、ＤＰＡとＤＨＡのレベルは親種子のものと類似していた。第一及び第二群
でＤＰＡレベルの増加についての１つの可能な説明は、ＬＰＡＡＴがＤＰＡ－ＣｏＡ基質
に対するΔ４－デサチュラーゼとの競合に勝って、Δ４－デサチュラーゼと比較して、優
先的に、ＤＰＡをＰＡ中に、それから、ＴＡＧ中に組み込むというものである。２番目の
可能な説明は、Δ４－不飽和化が部分的に阻害されているものである。

【0345】

ｐＣｎｌ２：：Ｍｏｒａｌ－ＬＰＡＡＴベクターでさらに形質転換されたＧＡ７構築物
のＴ－ＤＮＡで形質転換されたアラビドプシス植物の種子を収穫し、オイルを種子から抽
出した。それから、ＴＡＧフラクションをＴＬＣ法により、抽出オイルから単離し、ＴＬ
Ｃプレートから回収した。これらのＴＡＧ試料及び分取前の種子オイルの試料を、リゾー
プス属リパーゼで消化することにより分析し、ＤＨＡの位置分布を決定した。該リパーゼ
は、ＴＡＧのｓｎ－１位またはｓｎ－３位においてエステル化されたアシル基に対して特
異的である。５ｍＭのＣａＣｌ_２を含む０．１ＭのトリスＨＣｌ ｐＨ７．７中のリゾー
プス属リパーゼ溶液を添加して、超音波を用いて、５％アラビアゴム中の各脂質試料を乳
化し、混合物を振盪し続けながら、３０℃でインキュベートすることによりこれを行った
。各反応を、クロロホルム：メタノール（２／１、ｖ／ｖ）及び１体積の０．１ＭのＫＣ
ｌを各混合物に添加することにより停止した。脂質をクロロホルムフラクション中に抽出
し、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（５０／５０／１、ｖ／ｖ）を用いて２．３％ホ
ウ酸含浸ＴＬＣでの分離により得られた脂質のｓｎ－２ ＭＡＧ、ｓｎ－１／３ ＦＦＡ
、ＤＡＧ及びＴＡＧ成分の相対量を決定した。脂質バンドを、ＴＬＣプレート上にアセト
ン／水（８０／２０、ｖ／ｖ）中の０．０１％プリムリンの噴霧により可視化し、ＵＶ光
下で可視化した。個々の脂質バンドを、同じＴＬＣプレート上に溶解された脂質の標準ス
ポットに基づいて同定した。ＴＬＣ脂質バンドをガラスバイアル中に集め、それらの脂肪
酸メチルエステルを、１Ｎメタノール性ＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いて合成し、８０
℃で２時間インキュベートした。個々の脂質の脂肪酸組成をＧＣにより分析した。

【0346】

このアッセイは、ＧＡ７（系統２２－２－１－１及び２２－２－３８－７）で形質転換
された親種子内のＤＨＡは、ＴＡＧのｓｎ－１位またはｓｎ－３位において優先的にエス
テル化したことを示した。対照的に、ＧＡ７構築物及びＬＰＡＡＴをコードする導入遺伝
子の両方で形質転換されたＮＹ１１及びＮＹ１５種子内のＤＨＡは、該系統の１つのＤＨ
Ａの３５％及びＴＡＧのｓｎ－２位においてエステル化される他系統のＤＨＡの４８％で
、ｓｎ－２位で、ＤＨＡは濃縮されていた、すなわち、リパーゼ消化後、ＤＨＡは、ｓｎ
－２－ＭＡＧとして存在していた（表１３）。ＧＡ７－ｍｏｄＢ構築物からのＴ－ＤＮＡ
及びＬＰＡＡＴコード遺伝子の両方で形質転換し、ＤＨＡを産生するセイヨウアブラナ及
びカラシナ種子について、類似の結果を得、ＤＰＡを産生するセイヨウアブラナ及びカラ
シナの種子も同様である。

【0347】

モルティエレラＬＰＡＡＴまたは別のＬＰＡＡＴがＤＰＡ－ＣｏＡまたはＤＨＡ－Ｃｏ
Ａのいずれかに対して優先的であるか否かを決定するため、上記構成的プロモーターの制
御下候補ＬＰＡＡＴを一過性に発現するベンサミアナタバコ葉のライセートに^１４Ｃ標識
ＤＰＡ－ＣｏＡまたは－ＤＨＡ－ＣｏＡを別々に添加することによりインビトロ反応を行
った。反応物を２５℃でインキュベートし、ＰＡへの^１４Ｃ標識脂肪酸の組み込みレベル
を脂質のＴＬＣ分析により決定した。ＤＰＡ－ＣｏＡと比較して、各ＬＰＡＡＴのＤＨＡ
－ＣｏＡを使用する能力を評価する。有効なＤＨＡを有し、ＬＰＡＡＴ活性を組み込んで
いることが確認されているＬＰＡＡＴをコードする遺伝子を使用し、形質転換ＤＨＡ産生
セイヨウアブラナ植物及び種子を産生する。

【0348】

ＤＰＡ－ＣｏＡを用いて強い活性を有するＬＰＡＡＴをコードする遺伝子を使用し、Ｄ
ＰＡ産生植物及び種子を形質転換し、ＴＡＧのｓｎ－２位においてエステル化されたＤＰ
Ａの量を増加させる。

【表12】

【表13】

【0349】

実施例７．トランスジェニックカメリナサティバ種子のさらなる分析
総脂質含有率
ＧＡ７構築物のＴ－ＤＮＡに対してホモ接合である及び総脂肪酸含有物中にＤＨＡを含
むカメリナサティバ種子を、以下の総脂質含有率及び組成について分析した。２つの連続
した溶媒抽出工程を、初め、ヘキサンを用いて、次に、クロロホルム／メタノールを用い
て、種子に対して行った。抽出または分析中、酸化防止剤は添加しなかった。脂質／溶媒
混合物の長時間加熱及び還流により種子脂質を抽出ために通常に使用されるソックスレー
抽出法は、ＤＨＡなどのω３ＰＵＦＡの分解または酸化の可能性があるので、使用しない
。

【0350】

油料種子に対して業界標準であるので、最初の抽出で、溶媒としてヘキサンを使用した
。また、ヘキサンは、その溶媒特性及び、特に室温において、極性脂質のその比較的貧溶
解性おかげでＴＡＧ含有オイルを優先的に抽出する。形質転換及びコントロールカメリナ
種子（それぞれ、１３０ｇ及び３０ｇ）をヘキサンで濡らし、電気めのう乳鉢と乳棒を用
いて粉砕した（Ｒｅｔｓｃｈ Ｍｕｈｌｅ、ドイツ）。混合物を、分液ロートに移動し、
総量８００ｍＬのヘキサンを用いて４回抽出し、３番目の抽出では、一夜静置して抽出し
た。各抽出では、微粉を取り除くため、真空下ＧＦＣガラス繊維フィルターを通して、抽
出物を濾過し、それから、真空下４０℃においてロータリーエバポレーターで蒸発させた
。抽出物はプールされ、ＴＡＧリッチなヘキサン抽出物であった。

【0351】

ヘキサンでの抽出後、残ったシードミールを、ヘキサン抽出と同様な方法で、クロロホ
ルム－メタノール（ＣＭ、１：１ｖ／ｖ）を用いてさらに抽出した。それから、ミールを
濾過により取り除き、合わせた抽出物をロータリーエバポレーターで蒸発させた。それか
ら、プールされたＣＭ総粗脂質抽出物を一相メタノール－クロロホルム－水混合物（２：
１：０．８ｖ／ｖ／ｖ）を用いて溶解した。クロロホルム－水の添加により相を分離した
（最終溶媒比、１：１：０．９ｖ／ｖ／ｖメタノール－クロロホルム－水）。各抽出物の
精製脂質を下層のクロロホルム相中に分配し、ロータリーエバポレーターで濃縮して、極
性脂質リッチＣＭ抽出物とした。これら各抽出物中の脂質含有物を重量測定法で決定した
。

【0352】

脂肪酸組成分析では、ヘキサンとＣＭの抽出物のアプリコットを、Ｃｈｒｉｓｔｉｅら
（１９８２）の方法に従って、トランスメチル化し、メタノール－クロロホルム－濃塩酸
（３ｍＬ、１０：１：１、８０℃、２時間）を用いて脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）
を生成した。ＦＡＭＥを、ヘキサン－クロロホルム（４：１、３ｘ１．８ｍＬ）中に抽出
した。ヘキサンとＣＭの抽出後の残ったシードミール試料（１～２ｇ）もトランスメチル
化して、重量測定法によりＦＡＭＥとして残渣の脂質を測定した。種子の総脂質含有率を
、ヘキサン及びＣＭ抽出物の脂質含有率及び溶媒抽出後のトランスメチル化したミールの
ＦＡＭＥ含有率を足すことにより算出した。

【0353】

トランスジェニック種子は、種子重量中４０．９％である野生型カメリナサティバ種子
と比較して、種子重量中３６．２％であり、わずかに少ない総脂質を含有していた。油料
種子を含む種子では、ヘキサン、それから、クロロホルム－メタノールを用いた連続抽出
により得られた溶媒抽出可能な脂質、及び本明細書に例証の溶媒抽出後の抽出ミールのメ
チル基転移により放出された残渣の脂質の合計として、総脂質を決定した。この総脂質は
、主に、トリアシルグリセロールなどの脂肪酸含有脂質及び極性脂質及び少量の非脂肪酸
脂質、例えば、フィトステロール及び遊離した非エステル化形態で存在または脂肪酸との
エステル化された脂肪アルコールから成った。加えて、いずれかのステロールエステル類
またはワックスエステル類及びカロテノイド、例えば、β－カロテンなどの炭化水素も、
存在するならば、溶媒抽出可能な脂質中に含まれていた。これらは、全体的に重量測定に
含まれ、ＴＬＣ－ＦＩＤ分析に含まれていた（表１４）。

【0354】

総脂質の種子重量当たりの脂質の３１～３８％を、ヘキサンにより抽出し、トランスジ
ェニック及びコントロール種子について、それぞれ、種子の総脂質の８６％及び９２％の
割合であった。ＣＭ抽出は、トランスジェニック及びコントロール種子から、それぞれ、
さらに４．８％及び２．４％（種子重量の）の主に極性な脂質リッチ抽出物を回収した。
残りの溶媒抽出された油料シードミールのメチル基転移反応により遊離された残渣の脂質
は、それぞれ、種子重量の０．３％及び０．４％であった。すなわち、第一及び第二の溶
媒抽出は一緒に、種子の総脂質含有物の９９％を抽出した（すなわち、トリグリセリドな
どの脂質及び糖脂質及びリン脂質から成る極性脂質を含む大部分脂肪酸であった、種子重
量の３６．２％または４０％（次セクション－脂質分類分析参照））。

【0355】

脂質分類分析
ヘキサン及びＣＭ抽出物の脂質分類を、石英ロッド上のＣｈｒｏｍａｒｏｄ Ｓ－ＩＩ
Ｉシリカと組み合わせて、展開溶媒系としてヘキサン／ジエチルエーテル／氷酢酸（７０
：１０：０．１、ｖ／ｖ／ｖ）を用いて、水素炎イオン化検出器を備えた薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ－ＦＩＤ；Ｉａｔｒｏｓｃａｎ Ｍａｒｋ Ｖ．Ｉａｔｒｏｎ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、日本、東京）により分析した。適切な補正曲線を、Ｎｕ－Ｃｈｅｋ
Ｐｒｅｐ．Ｉｎｃ．（米国ミネソタ州エリジアン）から得た代表的基準を用いて作成し
た。ＳＩＣ－４８０ＩＩソフトウェア（ＳＩＳＣバージョン：７．０－Ｅ）を用いて、デ
ータを処理した。リン脂質化学種をシリカカラムクロマトグラフィーから得られた精製リ
ン脂質フラクションの適用及びＦＩＤ検出前のクロロホルム／メタノール／氷酢酸／水（
８５：１７：５：２、ｖ／ｖ／ｖ）中、ロッドの展開により分離した。

【0356】

ＣＭ抽出物からＴＡＧ、糖脂質及びリン脂質フラクションを分離するため、短いガラス
カラム中のシリカゲル６０（１００～２００メッシュ）（０．３～１ｇ）またはグラスウ
ールを詰めたパスツールピペットを使用して、１０ｍｇの精製ＣＭ脂質抽出物を精製した
。ＣＭ抽出物の残渣のＴＡＧフラクションを、ヘキサン中１０％ジエチルエーテル２０ｍ
Ｌで溶離し、糖脂質を、アセトン２０ｍＬで溶離し、リン脂質を、最初メタノール１０ｍ
Ｌ、次いでメタノール－クロロホルム－水（５：３：２）１０ｍＬの２工程で溶離した。
この第二の溶離はリン脂質の回収を増加させた。各フラクションの収量を重量測定法によ
り決定し、純度をＴＬＣ－ＦＩＤにより確認した。全抽出物及びフラクションを、さらに
ＧＣ及びＧＣ－ＭＳ分析するまで、－２０℃においてジクロロメタン中で保管した。

【0357】

各トランスジェニック及びコントロール種子からのＴＡＧリッチヘキサン抽出物は、約９
６％のＴＡｇを含有していた。ＣＭ抽出物は、トランスジェニック及び野生型種子につい
て、それぞれ、該ＣＭ抽出物の４４重量％及び１３重量％になる残渣ＴＡＧを含有してい
た。ヘキサン抽出物と対照的に、ＣＭ抽出物は、トランスジェニック及びコントロール種
子について、それぞれ、該ＣＭ抽出物の５０重量％及び７６重量％になる極性脂質、即ち
、リン脂質及び糖脂質に富んでいた（表１４）。主なリン脂質は、ホスファチジルコリン
（ＰＣ）であり、総リン脂質の７０％～７９％を占め、次いで、ホスファチジルエタノー
ルアミン（ＰＥ、７％～１３％）、比較的低レベルのホスファチジン酸（ＰＡ、２％～５
％）及びホスファチジルセリン（ＰＳ、＜２％）であった。

【0358】

脂肪酸組成
概して、ＤＨＡ及び／またはＤＰＡを産生する種子では、本発明者らは、種子中の全脂
質の直接的メチル基転移反応により決定したとき、種子中の総脂質の脂肪酸組成が、ＴＡ
Ｇフラクショと類似していることを観察した。このことは、種子中に存在する総脂質の９
０％より多くが、ＴＡＧの形態で起こることに起因した。

【0359】

ヘキサン及びＣＭ抽出物の異なる脂質分類の脂肪酸組成を、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｅｑｕｉ
ｔｙ（商標）－１フューズドシリカキャピラリーカラム（１５ｍ ｘ 内径０．１ｍｍ、
膜厚０．１μｍ、米国ペンシルベニア州ベルフォント）、ＦＩＤ、スプリット／スプリッ
トレスインジェクター及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ７６８３Ｂシリ
ーズオートサンプラー及びインジェクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ ６８９０Ａ ＧＣ装置（米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて、ガスクロ
マトグラフィ（ＧＣ）及びＧＣ－ＭＳ分析により決定した。キャリアーガスはヘリウムで
あった。試料を１２０℃のオーブン温度において、スプリットレスモードで注入した。注
入後、オーブン温度を、１０℃／分で２７０℃まで上昇させ、最終的に５℃／分で３００
℃まで上昇させた。溶離した化合物を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃ
ｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（米国カリフォルニア州パロアルト）で定量化した。
ＧＣ結果には、個々の成分面積の±５％以下の誤差があった。

【表14】

【0360】

ＧＣ質量分光測定（ＧＣ－ＭＳ）分析を、Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｔｒａｃｅ ｕｌｔｒａ
Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＧＣ－ＭＳ（モデル：ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ Ｔｒａｃｅ
ＤＳＱ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で行った。Ｔｈｅ
ｒｍｏＱｕｅｓｔ Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（米国テキサス州オースチン）でデー
タを処理した。ＧＣにオンカラムインジェクター及び上記と類似極性のキャピラリーＨＰ
－５ Ｕｌｔｒａ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｊ＆ Ｗカラム（５０ｍ ｘ 内径０．３２ｍｍ、
膜厚０．１７μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州
サンタクララ）を装着した。個々の成分を、質量分析データを用いて、及び信頼できる標
準及び実験室基準として得たものを用いた保持時間データとの比較により同定した。試料
バッチと同時に、全過程のブランク分析を行った。

【0361】

抽出物中の異なる脂質分類の脂肪酸組成データを表１５に示す。ＤＨＡ産生カメリナ種
子では、ＤＨＡは、ＤＨＡ及びＡＬＡの比率と逆相関で、１．６％から６．８％の間の範
囲の比率で主要脂質フラクション（ＴＡＧ、リン脂質及び糖脂質）中に分布していた。ト
ランスジェニック種子からのＴＡＧリッチヘキサン抽出物は、６．８％のＤＨＡ及び４１
％のＡＬＡを含有していた（表１５）。極性脂質リッチＣＭ抽出物は、４．２％のＤＨＡ
及び５０％のＡＬＡ、すなわち、比較的より少ないＤＨＡ及びより多いＡＬＡを含有して
いた。極性脂質リッチＣＭ抽出物からの残渣ＴＡＧは、６％のＤＨＡ及び４０％のＡＬＡ
を含有していた。ＣＭ抽出物から単離された糖脂質フラクションは、３％のＤＨＡ及び３
９％のＡＬＡを含有し、リン脂質フラクションは、最低レベルのＤＨＡ（１．６％）及び
最高レベルのＡＬＡ（５４％）を含有していた。トランスジェニックカメリナ種子は、主
要脂質分類（ＴＡｇ、糖脂質及びリン脂質）のコントロール種子と比較して、より高いレ
ベルのＡＬＡ及びより低いレベルのＬＡ（リノール酸、１８：２ω６）を含有していた。
ＡＬＡ及びＬＡの比率は：トランスジェニック種子についてＡＬＡ３９～５４％及びＬＡ
４％～９％、並びに、コントロール種子についてＡＬＡ１２％～３２％及びＬＡ２０％～
２９％であった。エルカ酸（２２：１ω９）の相対レベルは、コントロール種子より、ト
ランスジェニック種子内の全フラクションで低く、例えば、ヘキサン抽出物では、１．３
％対２．７％であった（表１５）。

【0362】

種子内のステロール組成
抽出脂質中のステロール含有率及び組成を決定するため、ＴＡＧリッチヘキサン抽出物
及び極性脂質リッチＣＭ抽出物からの約１０ｍｇの総脂質試料を、８０％ＭｅＯＨ中５％
ＫＯＨ４ｍＬを用いてけん化し、テフロン加工スクリューキャップしたガラス試験チュー
ブ内で８０℃２時間加熱した。反応混合物を冷却後、ミリＱ水２ｍＬを添加し、ステロー
ル及びアルコールを、振盪及びボルテックスすることにより、ヘキサン：ジクロロメタン
（４：１ｖ／ｖ）２ｍＬ中に抽出した。混合物を遠心分離し、有機相の各抽出物を、振盪
及び遠心分離によりミリＱ水２ｍＬで洗浄した。上層のステロール含有有機層を抜き出し
た後、溶媒を、窒素気流を用いて蒸発させ、ステロール及びアルコールを、ビス（トリメ
チルシリル）－トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
２００μＬを用いて、密封ＧＣバイアル内で８０℃２時間加熱によりシリル化した。この
方法により、遊離ヒドロキシル基をトリメチルシリルエーテルに転換した。ステロール－
及びアルコール－ＯＴＭＳｉ誘導体を、窒素気流下、加熱ブロック（４０℃）で乾燥し、
上記ＧＣ／ＧＣ－ＭＳ分析直前に、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に再溶解した。

【表15】

【0363】

トランスジェニック及びコントロール種子両方の主要ステロールは、２４－エチルコレ
ステロール（シトステロール、総ステロールの４３％～５４％）、２４－メチルコレステ
ロール（カンペステロール、２０％～２６％）であり、より低レベルのコレステロール（
５％～８％）では、ブラシカステロール（２％～７％）、イソフコステロール（Δ５－ア
ベナステロール、４％～６％）、スチグマステロール（０．５％～３％）、コレスタ－７
－エン－３β－オール（０．２％～０．５％）、２４－メチルコレスタノール（カンペス
タノール、０．４％～１％）及び２４－デヒドロコレステロール（０．５％～２％）であ
った（表１６）。これらの９つのステロールは、総ステロールの８６％～９５％を占め、
残りの成分は、炭素及び二重結合数について部分的のみ同定されたステロールであった。
全ステロールプロファイルは、ヘキサン及びＣＭ抽出物両方について、トランスジェニッ
ク及びコントロール種子間で類似していた。

【0364】

脂肪アルコール分析
種子中の脂肪アルコールを誘導体化し、ステロールと同様に分析した。イソ分岐脂肪ア
ルコールを伴ったＣ_１６～Ｃ_２２の一連の脂肪アルコールを、ヘキサン及びＣＭ抽出物両
方で同定した。トランスジェニック及びコントロール種子について、観察された個々の成
分の比率のいくらかの差異を含む類似のプロファイルが観察された。クロロフィル由来の
フィトールは主要脂肪族アルコールであり、それぞれ、トランスジェニック及びコントロ
ール種子中のヘキサンフラクションの総脂肪アルコールの４７％及び３７％を占める。奇
数鎖アルコールは、ヘキサン抽出物中（１６％～２３％）より、ＣＭ抽出物中で高いレベ
ルで存在する（総脂肪アルコール含有物の３７％～３８％）。イソ－１７：０（１６％～
３８％）は、１７：０（０．３％～５．７％）に対して優勢であった。存在する別の奇数
鎖アルコールは、１９：０であった（４．５％～６．５％）。検出された他のアルコール
は、イソ－１６：０、１６：０、イソ－１８：０、１８：１、１８：０を含み、少量レベ
ルのイソ－２０：０、２０：１、２０：０、イソ－２２：０、２２：１及び２２：０も存
在した。

【0365】

考察
結果は、室温においてヘキサンで複数回抽出と電動式乳鉢及び乳棒を用いた粉砕は、ト
ランスジェニック種子からＴＡＧ含有オイルの大部分を回収するのに効果的であることを
示した。中程度レベルのＤＨＡを含むトランスジェニック種子からのオイルに加えて、ト
ランスジェニック種子は、コントロール種子と比較して、大部分の脂質分類（トリアシル
グリセロール、糖脂質及びリン脂質）中に著しく高いレベルのＡＬＡも含んでいた。この
ことは、Δ１５－デサチュラーゼ活性が、種子発育中に、トランスジェニック種子内で著
しく増強されることを示した。興味深いことに、様々な抽出物及びフラクション中の脂肪
酸組成及びＤＨＡの比率においていくらかのわずかな差があり、ＤＨＡレベルは、ＴＡＧ
リッチヘキサン抽出物及びＣＭ抽出からのＴＡＧ中でより高く（６％～６．８％）、極性
脂質フラクション中でより低かった（糖脂質中３％及びリン脂質中１．６％）。１６：０
のレベルは、ＴＡＧリッチヘキサン抽出物及びＣＭ抽出からのＴＡＧ（６％～７％）と比
較して、ＣＭ抽出物中の糖脂質及びリン脂質の極性脂質フラクション中でより高かった（
１９％～２１％）。

【表16】

【0366】

トランスジェニック種子及びコントロール種子のステロール組成は、同じ大部分のステ
ロールが存在する精製カメリナオイル（Ｓｈｕｋｌａら、２００２）中で見られたものと
同様であり、付加遺伝子が種子内のステロール合成に影響を及ぼさないことを示した。カ
メリナオイル中のコレステロールレベルは、大部分の植物オイルで生じるより高かった。
カメリナサティバを含むアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）ファミリー内で見られ
る特徴的ステロールであるブラシカステロールが存在していた。

【0367】

実施例８．カラシナ種子内のＬＣ－ＰＵＦＡの産生
トランスジェニックセイヨウアブラナ植物を、以下のように、ＤＨＡの産生のため、Ｇ
Ａ７－ｍｏｄＢ構築物（実施例３）を用いて産生した。長日反応性変種のカラシナ種子を
、Ｋｅｒｅｓｚｔら（２００７）に記載のように塩素ガスを用いて滅菌した。滅菌種子を
、ｐＨ５．８に調節した、０．８％寒天で固形化した１／２強化ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈ
ｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ、１９６２）で発芽させ、６～７日間、１６／８時間（明／暗）光
周期で、蛍光灯下（５０μＥ／ｍ２ｓ）、２４℃において生育した。２～４ｍｍ柄の子葉
柄を、これらの苗から無菌的に単離し、移植片として使用した。アグロバクテリウム・ツ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＡＧＬ１を
、バイナリーベクターＧＡ７で形質転換した。アグロバクテリウム培養を開始し、Ｂｅｌ
ｉｄｅら（２０１３）に記載のように感染処理した。全形質転換のため、約５０の新たに
単離した子葉柄を、６分間、アグロバクテリウム・ツメファシエンス１０ｍｌで感染させ
た。感染葉柄を、滅菌フィルターペーパー上で吸い取り、過剰なアグロバクテリウム・ツ
メファシエンスを除去して、共培養培地（１，５ｍｇ／ＬのＢＡ、０．０１ｍｇ／ＬのＮ
ＡＡ及び１００μＭアセトシリンゴンを含み、Ｌ－システイン（５０ｍｇ／Ｌ）、アスコ
ルビン酸（１５ｍｇ／Ｌ）及びＭＥＳ（２５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＭＳ）に移動した。
全プレートをマイクロポアテープで密封し、共培養４８時間２４℃において、暗所でイン
キュベートした。それから、移植片を、事前選択培地（１．５ｍｇ／ＬのＢＡ、０．０１
ｍｇ／ＬのＮＡＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ_３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム及び５０
ｍｇ／Ｌのチメンチンを含むＭＳ－寒天）に移動し、１６／８時間光周期で、２４℃にお
いて４～５日間培養した後、移植片を、事前選択培地（１．５ｍｇ／ＬのＢＡ、０．０１
ｍｇ／ＬのＮＡＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ_３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、５０ｍ
ｇ／Ｌのチメンチン及び５ｍｇ／ＬのＰＰＴを含むＭＳ－寒天）に移動し、１６／８時間
光周期で、２４℃において４週間培養した。緑色のカルスを有する移植片を、シュート形
成培地（２．０ｍｇ／ＬのＢＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ_３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキ
シム、５０ｍｇ／Ｌのチメンチン及び５ｍｇ／ＬのＰＰＴを含むＭＳ－寒天）に移動し、
さらに２週間培養した。小さな再分化シュート芽を、ホルモンフリーＭＳ培地（３ｍｇ／
ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌのチメンチン及び５ｍ
ｇ／ＬのＰＰＴを含むＭＳ－寒天）に移動し、さらに２～３週間培養した。

【0368】

少なくとも１．５ｃｍのサイズの可能性のあるトランスジェニックシュートを単離し、
発根誘導培地（０．５ｍｇ／ＬのＮＡＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ_３、２５０ｍｇ／Ｌのセ
フォタキシム及び５０ｍｇ／Ｌのチメンチンを含むＭＳ－寒天）に移動し、２～３週間培
養した。ＰＣＲにより確認し、繁茂した根を有するトランスジェニックシュートを、温室
内の土壌に移植し、２２℃において１６／８時間（明／暗）光周期下生育した。３つの確
認されたトランスジェニック植物を得た。形質転換植物を温室で生育し、自家受粉させて
、Ｔ１種子を収穫した。各Ｔ０形質転換植物からのＴ１種子のプールの脂質の脂肪酸組成
を分析し、ＪＴ１－４と命名された１つの系統で、２．８％のＤＰＡ及び７．２％のＤＨ
Ａの存在を示したが、ＪＴ１－６と命名された別の系統は２．６％のＤＰＡを示した。

【0369】

個々のＴ１種子の種子オイルを、脂肪酸組成について分析した；データのいくつかを表
１７に示す。ＪＴ１－４－Ａ－１３、ＪＴ１－４－Ａ－５及びＪＴ１－４－Ｂ－１３を含
むいくつかのＴ１種子は、総脂肪酸含有物の１０％～約２１％のレベルでＤＨＡを産生し
た。驚くべきことに且つ予想外に、Ｔ１種子のいくつかは、総脂肪酸含有物の１０％～約
１８％のレベルでＤＰＡを含み、検出可能なＤＨＡを含んでいなかった（＜０．１％）。
発明者らは、これらの植物中に挿入されたＴ－ＤＮＡのΔ４－デサチュラーゼ遺伝子が、
実施例２に記載されるものと類似した自然な突然変異により不活性であったと結論づけた
。Ｔ１種子を発芽し、各々からの１つの発生子葉を残りのオイル中の脂肪酸組成について
分析した。各苗の残りを維持し、成熟するまで生育しＴ２種子を得た。

【0370】

１つのＴ－ＤＮＡインサーションに対してホモ接合であるトランスジェニック植物を同
定し選択した。ＪＴ１－４－１７と命名された１つの選択系統の植物は、１つのＴ－ＤＮ
Ａインサーションを有し、ＤＨＡを産生し、同時に低レベルのみのＤＰＡを産生するが、
ＪＴ１－４－３４と命名された第二選択系統も１つのＴ－ＤＮＡインサーションを有する
が、ＤＰＡを産生し、ＤＨＡを産生しなかった。本発明者らは、最初の形質転換体は２つ
の別々のＴ－ＤＮＡを含んでいたが、１つはＤＨＡ産生を与えられ、他方はＤＨＡでなく
ＤＰＡの産生を与えられたと結論した。その種子内でＤＨＡを産生するカラシナ植物を、
その種子内でＤＰＡを産生する植物と交配した。Ｆ１子孫は、双方のＴ－ＤＮＡインサー
ションに対してヘテロ接合である植物を含んでいた。これらの子孫植物からの種子を観察
し、２６％の総ＤＨＡ＋ＤＰＡ含有率に対して、約２０％のＤＨＡ及び約６％のＤＰＡを
産生した。Ｆ１植物を自家受粉し、双方のＴ－ＤＮＡインサーションに対してホモ接合で
ある子孫は、３５％までのＤＨＡ及びＤＰＡを産生すると期待される。

【0371】

約１８％のＤＰＡを、ＪＴ１－４－３４－１１と命名されたＴ３子孫のプール種子の脂
質で観察した。同様に、約１７．５％のＤＨＡを、Ｔ３ ＪＴ１－４－１７－２０の子孫
のプール種子の脂質で観察した。ＪＴ１－４ Ｔ１プール種子、Ｔ１単一種子、Ｔ２プー
ル種子、Ｔ２単一種子、及びＴ３プール種子、Ｔ３単一種子の脂肪酸組成を、表１８～２
１に示す。ＪＴ１－４ Ｔ３分離個体ＪＴ－１－４－３４－１１は、１８％のプールＴ３
種子ＤＰＡ含有率を有し、この特定の分離個体からの単一種子は、各々、総脂肪酸含有物
のパーセントとして、約２６％のＤＰＡ含有率を有した。

【0372】

１７．９％のＤＰＡを有する種子のオイルについて、次のパラメーターを算出した：総
飽和脂肪酸、６．８％；総一価不飽和脂肪酸、３６．７％；総多価不飽和脂肪酸、５６．
６％、総ω６脂肪酸、７．１％；新ω６脂肪酸、０．４％、その全てはＧＬＡであった；
総ω３脂肪酸、４６．５％；新ω３脂肪酸、２４．０％；総ω６：総ω３脂肪酸の比、６
．５；新ω６：新ω３脂肪酸の比、６０；Δ１２－デサチュラーゼによるオレイン酸から
ＬＡへの転換効率、６１％；Δ６－デサチュラーゼによるＡＬＡからＳＤＡへの転換効率
、５１％；Δ６－エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡへの転換効率、９０％；Δ５－デ
サチュラーゼによるＥＴＡからＥＰＡへの転換効率、８７％；Δ５－エロンガーゼによる
ＥＰＡからＤＰＡへの転換効率、９８％。

【0373】

ｍｏｄＢ構築物で、カラシナのより多くのトランスジェニック植物を産生するため、形
質転換を５回繰り返し、１６の推定トランスジェニックシュート／苗を再生した。Ｔ１種
子分析を実行し、ＤＰＡ及びＤＨＡ含有率を決定する。

【0374】

ＤＰＡを含み、ＤＨＡを含まないさらなる種子を産生するため、以下のように、Δ４－
デサチュラーゼ遺伝子を欠く、ｍｏｄＢ構築物の変異体である遺伝子構築物を作製した。
２つのＤＮＡ断片、ＥＰＡ－ＤＰＡ断片１とＥＰＡ－ＤＰＡ断片２を、適切な制限酵素部
位を用いて合成した（Ｇｅｎｅａｒｔ、ドイツ）。中間クローニングベクター、ｐＪＰ３
６６０は、ＥＰＡ－ＤＰＡ断片１のＡａｔＩＩ－ＭｌｕＩ断片を、Δ６デサチュラーゼカ
セットを含むＧＡ７－ｍｏｄＢの構築において初期に使用したベクターである、１１ＡＢ
ＨＺＨＣ＿ＧＡ７－ｆｒａｇ＿ｄ６Ｄ＿ｐＭＳと指定されるベクター中のＡｓｃＩ－Ａａ
ｔＩＩ部位へとクローニングすることにより作製された。次いで、ｐＪＰ３６６１は、ｐ
ＪＰ３６６０のＰｍｅＩ－ＰｓｐＯＭＩ断片を、ｍｏｄＢのＰｍｅＩ－ＰｓｐＯＭＩ部位
へとクローニングすることにより作製した。次いで、ＤＰＡベクターであるｐＪＰ３６６
２（図４）を、ＥＰＡ－ＤＰＡ断片２のＢｓｉＷＩ－ＰｓｐＯＭＩ断片を、ｐＪＰ３６６
１のＢｓｉＷＩ－ＰｓｐＯＭＩ部位へとクローニングすることによりアセンブリした。こ
のベクターは、オレイン酸をＤＰＡω３及び対応するω６脂肪酸へと転換する酵素をコー
ドする脂肪酸生合成遺伝子を含有した。得られた構築物を使用し、カラシナ及びセイヨウ
アブラナを形質転換した。種子脂質の総脂肪酸含有物中３５％までのＤＰＡを含む子孫種
子を産生する。

【0375】

ＤＨＡを産生する植物の種子から抽出されたオイルをＮＭＲにより検査し、少なくとも
９５％のＤＨＡは、ＴＡＧ分子のｓｎ－１，３位に存在していることが観察された。

【表17】

【表18】

【表19】

【表20】

【表21】

【0376】

実施例９．形質転換植物のさらなる分析及び実地試験
サザンブロットハイブリダイゼーション解析を、ＧＡ７－ｍｏｄＢ構築物からのＴ－Ｄ
ＮＡで形質転換された選択Ｔ２セイヨウアブラナ植物に対して実行した。植物組織試料か
ら抽出されたＤＮＡを、サザンブロットハイブリダイゼーション解析のためいくつかの制
限酵素で消化した。Ｔ－ＤＮＡ部分に対応する放射活性プローブを、該ブロットにハイブ
リダイズし、ストリンジェントな条件下洗浄し、ブロットを膜に暴露してハイブリダイズ
するバンドを検出した。試料のいくつかは、植物の１つのＴ－ＤＮＡインサーションに対
応する各制限酵素の単一ハイブリダイズバンドを示したが、他は、２本のバンドを示し、
また、他は、４つ～６つのインサーションに対応する複数のＴ－ＤＮＡバンドを示した。
サザンブロット解析により観察されたハイブリダイズバンド数は、デジタルＰＣＲ法によ
り決定されるとき、約３または４のコピー数まで、トランスジェニック植物のＴ－ＤＮＡ
コピー数とよく相関した。約５より大きいコピー数においては、デジタルＰＣＲ法はあま
り信頼性ができなかった。

【0377】

選択系統のいくつかを、異なる遺伝子背景の一連の約３０種の異なるセイヨウアブラナ
変種との交配において花粉ドナーとして使用した。さらに、戻し交配を実行し、複数のＴ
－ＤＮＡインサーションが遺伝的に連鎖しているかどうかを示し、遺伝的に連鎖していな
いトランスジェニック遺伝子座の分離個体を可能とする。それにより、単一トランスジェ
ニック遺伝子座を含む系統を選択する。

【0378】

単一プライマーＰＣＲ反応を、Ｔ－ＤＮＡの左右境界と隣接するプライマーを用いて、
トランスジェニック系統に対して実行し、Ｔ－ＤＮＡの逆方向反復の存在を示すいずれも
の系統を処分する。

【0379】

トランスジェニック系統のいくつかは、遅い開花を示し、一方、他は結実を減少し、従
って、温室での生育後の植物当たりの種子収率が低下し、雌または雄生殖能力の低下と一
致していた。花の形態をこれらの植物で調査し、いくつかの場合、葯から花粉の裂開及び
放出が遅いので、裂開が起こる前に花柱が伸びて、それ故、柱頭から葯まで距離が遠ざか
った。完全な受精率は人為的受粉により回復できる。さらに、裂開におけるは分生存率を
、生体染色ＦＤＡ及びＰＩでの染色（実施例１）により決定し、系統のいくつかで減少し
ているが、トランスジェニック系統の大部分では、花粉生存率は、野生型コントロールの
ほぼ１００％であることが分かった。いくつかの植物での種子収率低下の可能性のある原
因についてさらなる試験として、いくつかのＴ３及びＴ４の葯及び柱頭／花柱を含む花芽
の脂肪酸含有率及び組成を試験した。抽出脂質中でＤＨＡは検出されず、遺伝子構築物の
遺伝子が植物の生育中に花芽内で発現されなかったことを示し、種子収率低下の原因とし
て、これを除外した。

【0380】

オイル含有率をＮＭＲにより測定し、総脂肪酸含有物中のＤＨＡレベルを、Ｔ２種子に
ついて決定した。６％未満のＤＨＡを含むトランスジェニック系統を処分した。Ｔ１、Ｔ
２及びＴ３世代の植物からの葉試料のＴ－ＤＮＡコピー数を、デジタルＰＣＲ法（実施例
１）により決定した。

【0381】

選択Ｔ３及びＴ４種子ロットを、オーストラリア、ビクトリアの２カ所の場所において
、各々、約１０種子／ｍの播種密度で、１０ｍ作条で、畑に播種した。選択種子ロットは
、約８～１１％のプール種子ＤＨＡレベル、約１９％までの個々のＴ２種子ＤＨＡレベル
を示し、Ｔ０植物Ｔ－ＤＮＡコピー数が３であるＢ００３－５－１４由来系統を含んでい
た。選択種子ロットは、２０％を超えるＴ２種子ＤＨＡレベル、及び１または２のＴ２植
物Ｔ－ＤＮＡコピー数を示したＢ００５０－２７由来系統も含んでいた。畑に播種された
種子は発芽し、小植物は、野生型種子と同じ速度で発生した。大部分だが、全てではない
播種された種子ロットから生育した植物は、表現的に正常であり、例えば、形態、生育速
度、草高、雌雄生殖能力、花粉生存率（１００％）、結実、長角果サイズ及び同条件下生
育した野生型コントロール植物と本質的に同じである形態を有した。植物当たりの種子収
率は、同条件下生育した野生型コントロールと同様であった。他の種子試料を、より大き
な面積で播種し、選択トランスジェニック系統を大きくした。収穫した種子中の総ＤＨＡ
含有量は、少なくとも３０ｍｇ／種子ｇであった。

【0382】

広範に記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的実施形態で示
したように、本発明に多数の変化形及び／または修飾が成され得ることを、当業者は認識
するであろう。従って、本実施形態は、あらゆる点で、例証であって、制限されるもので
はないと見なすべきである。

【0383】

本明細書中に含まれた文書、行為、物質、装置、物品などのいかなる考察も、本発明の
ための状況を提供する目的のためだけのものである。本願の各請求範囲の優先日前に存在
したので、いずれかまたは全てのこれらの物質が先行技術の基礎の部分を形成するまたは
本発明に関連する分野で共通する一般知識であったとの承認であると解釈するべきでない
。

【0384】

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Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１０１９～
１０２７。
Ｇａｍｅｚら（２００３）Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ３６：７２
１～７２７。
Ｇａｒｃｉａ－Ｍａｒｏｔｏら（２００２）Ｌｉｐｉｄｓ ３７：４１７～４２６。
Ｇｉｒｋｅら（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１５：３９～４８。
Ｈａｒａｙａｍａ（１９９８）．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７６～８
２。
Ｈａｓｔｉｎｇｓら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
９８：１４３０４～１４３０９。
Ｈｉｎｃｈｅｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９１５～９２２。
Ｈｏｆｆｍａｎｎら（２００８）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：２２３５２～２２３
６２。
Ｈｏｎｇら（２００２ａ）Ｌｉｐｉｄｓ ３７：８６３～８６８。
Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉら（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：５４
０～５４４。
Ｈｕａｎｇら（１９９９）Ｌｉｐｉｄｓ ３４：６４９～６５９。
Ｉｎａｇａｋｉら（２００２）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
６６：６１３～６２１。
Ｋａｊｉｋａｗａら（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５４：３３５～５２。
Ｋａｊｉｋａｗａら（２００６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５８０：１４９～１５４。
Ｋｅｒｅｓｚｔら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃ ２：９４８～９５２。
Ｋｉｍら（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．２００５ １０７３～８９。
Ｋｎｕｔｚｏｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０～６。
Ｋｏｌｅｔｚｋｏら（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．４７：９５４－９５９
。
Ｋｏｚｉｅｌら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：３９～４０５。
Ｌａｓｓｎｅｒ（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：１３８９～９４。
Ｌｅｏｎａｒｄら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４７：７１９～７２４。
Ｌｅｏｎａｒｄら（２０００ｂ）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５０：７６５～７７０。
Ｌｅｏｎａｒｄら（２００２）Ｌｉｐｉｄｓ ３７：７３３～７４０。
Ｌｅｗｓｅｙら（２００７）Ｐｌａｎｔ Ｊ．５０：２４０～２５２。
Ｌｏら（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：４５５～４６６。
Ｌｕ及びＫａｎｇ（２００８）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２７：２７３～８。
Ｍａｌｌｏｒｙら（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：６２２～６２５。
Ｍａｒａｎｇｏｎｉら（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎ
ｏｌ．６：３２９～３３５。
Ｍｅｅｓａｐｙｏｄｓｕｋら（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：２０１９１
～２０１９９。
Ｍｅｎｇら（２００８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８９：２３４９～２３５８。
Ｍｅｙｅｒら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２：９７７９～９７８８。
Ｍｅｙｅｒら（２００４）Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４５：１８９９～１９０９。
Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎら（１９９８ａ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１９０５５～
１９０５９。
Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎら（１９９８ｂ）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３９：２１５～２１８。
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａ
ｒｕｍ １５：４７３～４９７。
Ｎａｐｉｅｒら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３０：６１１～６１４．
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３
～４５３。
Ｐａｒｋｅｒ－Ｂａｒｎｅｓら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９７：８２８４～８２８９。
Ｐｅｒｅｉｒａら（２００４ａ）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７８：６６５～６７１。
Ｐｅｒｅｉｒａら（２００４ｂ）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８４：３５７～３６６。
Ｐｅｒｒｉｎら（２０００）Ｍｏｌ Ｂｒｅｅｄ ６：３４５～３５２。
Ｐｅｔｒｉｅら（２０１０ａ）Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．１２：２３３～２４０。
Ｐｅｔｒｉｅら（２０１０ｂ）Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：６：８。
Ｐｅｔｒｉｅら（２０１２）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２１：１３９～１４７。
Ｐｏｔｅｎｚａら（２００４）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ－Ｐｌａ
ｎｔ ４０：１～２２。
Ｑｉら（２００２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１０：１５９～１６５。
Ｑｉら（２００４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：７３９～７４５。
Ｑｉｕら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３１５６１～３１５６６。
Ｒｅｄｄｙ及びＴｈｏｍａｓ（１９９６） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：６３９～６
４２。
Ｒｅｄｄｙら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：２９３～３００。
Ｒｏｂｅｒｔら（２００５）Ｆｕｎｃ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．３２：４７３～－４７９
。
Ｒｏｂｅｒｔら（２００９）Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １１：４１０～－４１８。
Ｒｕｉｚ－Ｌｏｐｅｚら（２０１２）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２１：１３９～１
４７。
Ｓａｈａら（２００６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４１：１５３３～１５４３。
Ｓａｉｔｏら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：１８１３～１８１８。
Ｓａｋｕｒａｄａｎｉら（１９９９）Ｇｅｎｅ ２３８：４４５～４５３。
Ｓａｔｏら（２００４）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．４４：６４６～６５２。
Ｓａｋｕｒａｄａｎｉら（２００５）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．６６：６４８～６５４。
Ｓａｙａｎｏｖａら（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：３６５３３～３６５
４１。
Ｓａｙａｎｏｖａら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
９４：４２１１～４２１６。
Ｓａｙａｎｏｖａら（２００３）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４２：１００～１０４。
Ｓａｙａｎｏｖａら（２００６）Ｐｌａｎｔａ ２２４：１２６９～１２７７。
Ｓａｙａｎｏｖａら（２００７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １４４：４５５～４６７
。
Ｓｈｕｋｌａら（２００２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７９：９６５～
９６９。
Ｓｉｎｇｈら（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．８：１９
７～２０３。
Ｓｐｅｒａｎｚａら（２０１２）Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （印刷中
）。
Ｓｐｅｒｌｉｎｇら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：３８０１～３８
１１。
Ｓｐｅｒｌｉｎｇら（２００１）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８８：２
９３～８。
Ｓｐｒｅｃｈｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６：２４７１～２４７７。
Ｓｐｙｃｈａｌｌａら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ
．９４：１１４２～１１４７。
Ｔｏｎｏｎら（２００３）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５５３：４４０～４４４。
Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ（２００１）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｓｃｉ．ａｎｄ
Ｔｅｃｈ．１０３：４５～５５．
Ｔｖｒｄｉｋ（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４９：７０７～７１８。
Ｖｅｎｅｇａｓ－Ｃａｌｅｒｏｎら（２０１０）Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４９：
１０８～１１９。
Ｖｏｉｎｎｅｔら（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｊ．３３：９４９～９５６。
Ｗａｌｌｉｓ及びＢｒｏｗｓｅ（１９９９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．３６５：３０７～３１６。
Ｗａｔｔｓ及びＢｒｏｗｓｅ（１９９９ｂ）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．３６２：１７５～１８２。
Ｗｅｉｓｓら（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９３：９５：１
０６。
Ｗｅｎｇら（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒ
ｔｅｒ ２２：２８９～３００。
Ｗｈｉｔｎｅｙら（２００３）Ｐｌａｎｔａ ２１７：９８３～９９２。
Ｗｏｏｄ（２００９）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．７：９１４～２４。
Ｗｕら（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１０１３～１０１７。
Ｙａｎｇら（２００３）Ｐｌａｎｔａ ２１６：５９７～６０３。
Ｚａｎｋら（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｊ．３１：２５５～２６８。
Ｚａｎｋら（２００５）ＷＯ ２００５／０１２３１６。
Ｚｈａｎｇら（２００４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５５６：８１～８５。
Ｚｈａｎｇら（２００６）２０：３２５５～３２６８。
Ｚｈａｎｇら（２００７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８１：３１５～３１９。
Ｚｈａｎｇら（２００８）Ｙｅａｓｔ ２５：２１～２７。
Ｚｈｏｕら（２００７）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．６８：７８５～７９６。
Ｚｈｏｕら（２００８）Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １７：６６７～６７６。
Ｚｏｕら（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．９：９０９～２３。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2023075083000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-03-09

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

抽出植物脂質を産生する方法であって、
ｉ）少なくとも２，０００，０００のトランスジェニックセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）植物から種子を得る工程であって、前記種子は、脂質を含み、脂質は、エステル化された形態の脂肪酸を含み、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、
前記脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルが、重量で２％から１６％の間であり、前記脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、存在する場合、重量で１％未満であり、トリアシルグリレセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも７０％は、前記ＴＡＧのｓｎ－１位またはｓｎ－３位にあり、種子は、少なくとも、配列番号４で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ１２－デサチュラーゼ、配列番号６で提供されるアミノ酸の配列を有するω３－デサチュラーゼ、配列番号９で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ６－デサチュラーゼ、配列番号２０で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ５－デサチュラーゼ、配列番号１６で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ６－エロンガーゼ、および配列番号２５で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ５－エロンガーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドのトランスジェニックであり、
各ポリヌクレオチドが、トランスジェニックセイヨウアブラナ植物の発育種子中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合されている、工程と、
ｉｉ）前記種子から脂質を抽出する工程と、
を含む、方法。

【請求項2】

ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも８０％は、前記ＴＡＧのｓｎ－１位またはｓｎ－３位にある、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記脂質が、以下の特徴：
ｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、重量で３％から１０％の間であること、
ｉｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、重量で約０．１％であること、
ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸のレベルは、重量で３０％から６０％の間であること、
ｉｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸（ＬＡ）のレベルは、重量で４％から１７％の間であること、
ｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα－リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、重量で４％から４０％の間であること、
ｖｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるγ－リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルは、重量で４％未満であること、
ｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルは、重量で４％未満であること、
ｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレベルは、重量で４％未満であること、
ｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルは、重量で２％未満であること、
ｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルは、重量で２％未満であること、
ｘｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルは、重量で４％から２５％の間であること、
ｘｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸レベルは、重量で２０％から７５％の間であること、
ｘｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸レベルは、重量で４％から１０％の間であること、
ｘｉｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総新ω６脂肪酸のレベルは、重量で４％未満であり、該総新ω６脂肪酸のレベルは、前記抽出脂質中のＬＡを除いたω６脂肪酸の総量であること、
ｘｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸レベルは、重量で３０％から６０％の間であること、
ｘｖｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸の総ω３脂肪酸に対する比は、０．１から１．０の間であること、
ｘｖｉｉ）該抽出脂質中の総脂肪酸は、重量で１．５％未満のＣ２０：１を含むこと、
ｘｖｉｉｉ）該脂質のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率は、少なくとも７０％（重量／重量）であること、および
ｘｉｘ）該脂質は、ＤＰＡを含むジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含むこと、
の少なくとも１つを有する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＳＤＡのレベルが、重量で４％未満である、請求項１または２に記載の脂質。

【請求項5】

該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＥＴＡのレベルが、重量で４％未満である、請求項１、２、または４に記載の脂質。

【請求項6】

前記外来性ポリヌクレオチドが、前記種子の細胞の核のゲノムに組み込まれたＴ－ＤＮＡ分子内に共有結合しており、前記種子の細胞の核のゲノムに組み込まれたかかるＴ－ＤＮＡ分子の数が、１、２または３である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

抽出脂質を精製して、核酸、タンパク質、炭水化物、顔料、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）またはリン脂質を除去する工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記抽出脂質は、精製、脱色、および脱臭（ＲＢＤ）される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記抽出脂質を処理して、総脂肪酸含有物のパーセントとしてＤＰＡのレベルを増加させる工程であって、前記処理は、分別蒸留、蒸留、エステル交換、またはこれらの方法の組み合わせを含む、工程をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

抽出セイヨウアブラナ脂質であって、エステル化された形態の脂肪酸を含み、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、
前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルが、重量で２％から１６％の間であり、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、存在する場合、重量で１％未満であり、トリアシルグリレセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも７０％は、前記ＴＡＧのｓｎ－１位またはｓｎ－３位にあり、前記脂質は、少なくとも２，０００，０００のトランスジェニックセイヨウアブラナ植物からの種子から抽出されたものであり、種子は、少なくとも、配列番号４で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ１２－デサチュラーゼ、配列番号６で提供されるアミノ酸の配列を有するω３－デサチュラーゼ、配列番号９で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ６－デサチュラーゼ、配列番号２０で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ５－デサチュラーゼ、配列番号１６で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ６－エロンガーゼ、および配列番号２５で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ５－エロンガーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドのトランスジェニックであり、各ポリヌクレオチドが、トランスジェニックセイヨウアブラナ植物の発育種子中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合されている、脂質。

【請求項11】

ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも８０％は、前記ＴＡＧのｓｎ－１位またはｓｎ－３位にある、請求項１０に記載の脂質。

【請求項12】

該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＳＤＡのレベルが、重量で４％未満である、請求項１０または１１に記載の脂質。

【請求項13】

該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＥＴＡのレベルが、重量で４％未満である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の脂質。

【請求項14】

前記抽出脂質は、精製、脱色、および脱臭（ＲＢＤ）されている、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の脂質。

【請求項15】

脂質は、その脂肪酸含有量において、重量で、少なくとも４０％ＤＰＡを含む、請求項９に記載の方法により産生された脂質。

【請求項16】

少なくとも２，０００，０００のトランスジェニックセイヨウアブラナ植物、または、前記トランスジェニックセイヨウアブラナ植物から得られる種子の集団であって、各植物は、
ａ）種子中の脂質であって、エステル化された形態の脂肪酸を含む脂質、
及び
ｂ）配列番号４で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ１２－デサチュラーゼ、配列番号６で提供されるアミノ酸の配列を有するω３－デサチュラーゼ、配列番号９で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ６－デサチュラーゼ、配列番号２０で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ５－デサチュラーゼ、配列番号１６で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ６－エロンガーゼ、および配列番号２５で提供されるアミノ酸の配列を有するΔ５－エロンガーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドであって、前記植物は、前記外来性ポリヌクレオチドのトランスジェニックである、外来性ポリヌクレオチド
を含み、
各ポリヌクレオチドが、前記植物の発育種子中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上の種子特異的プロモーターと作動可能に結合されており、前記脂質の脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、前記脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルが、重量で２％から１６％の間であり、前記脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、存在する場合、重量で１％未満であり、ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも７０％は、前記ＴＡＧのｓｎ－１位またはｓｎ－３位にある、集団。

【請求項17】

トランスジェニックセイヨウアブラナ種子の産生方法であって、前記方法が、
ａ）請求項１６に記載の少なくとも２，０００，０００のトランスジェニックセイヨウアブラナ植物の集団を生育すること、および
ｂ）前記植物から種子を収穫すること
を含む、方法。

【請求項18】

請求項１６に記載の種子から得られるシードミールであって、前記シードミールは外来性ポリヌクレオチドを含む、シードミール。

【請求項19】

請求項１０～１５のいずれか一項に記載の脂質、請求項１６に記載の種子、または請求項１８に記載のシードミールを含む組成物。

【請求項20】

請求項１０～１５のいずれか一項に記載の脂質または請求項１８に記載のシードミールを含む家畜飼料。

【請求項21】

家畜飼料の製造方法であって、前記方法が、少なくとも１つの他の食物成分と、１つ以上の請求項１０～１５のいずれか一項に記載の脂質または請求項１８に記載のシードミールを混合することを含む、方法。

【請求項22】

他の食物成分は、タンパク質、炭水化物、ビタミン類、及びミネラル類の１つ以上を含む、請求項２１の方法。

【請求項23】

ＰＵＦＡから利益を受けることになる症状の治療または予防用医薬品製造のための、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の１つ以上の脂質の使用。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３８３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0383】

本明細書中に含まれた文書、行為、物質、装置、物品などのいかなる考察も、本発明のための状況を提供する目的のためだけのものである。本願の各請求範囲の優先日前に存在したので、いずれかまたは全てのこれらの物質が先行技術の基礎の部分を形成するまたは本発明に関連する分野で共通する一般知識であったとの承認であると解釈するべきでない。

本発明は次の実施態様を含む。
［１]
エステル化された形態の脂肪酸を含み、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合により、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のうち１つ以上を含んでもよく、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、７％から３５％の間である、抽出植物脂質または微生物脂質。
［２]
以下の特徴：
ｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、約２％から１５％の間、または約３％から１０％の間であること、
ｉｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、約０．１％であること、
ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸のレベルは、約１％から約３０％の間、約３％から約３０％の間、約６％から約３０％の間、約１％から約２０％の間、約３０％から約６０％の間、約４５％～約６０％、約３０％、または約１５％から約３０％の間であること、
ｉｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸（ＬＡ）のレベルは、約４％から約３５％の間、約４％から約２０％の間、約４％から約１７％の間、または約５％から約１０％の間であること、
ｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα－リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、約４％から約４０％の間、約７％から約４０％の間、約１０％から約３５％の間、約２０％から約３５％の間、約４％から約１６％の間、または約２％から約１６％の間であること、
ｖｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるγ－リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルは、４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％から７％の間、０．０５％から４％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間であること、
ｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルは、約１０％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約４％未満、約３％未満、約０．０５％から約７％の間、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、約０．０５％から約１０％の間、または約０．０５％から約２％の間であること、
ｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレベルは、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％から約６％の間、０．０５％から約５％の間、０．０５％から約４％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間であること、
ｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルは、４％未満、約２％未満、約１％未満、０．０５％から４％の間、０．０５％から３％の間、または０．０５％から約２％の間、または０．０５％から約１％の間であること、
ｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルは、４％から１５％の間、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から１０％の間、０．０５％から５％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間であること、
ｘｉ）もし、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＨＡのレベルが、２％未満、または０．０５％から約２％の間であること、
ｘｉｉ）該脂質は、その脂肪酸含有物中にω６－ドコサペンタエン酸（２２：５ ^{Δ４，７，１０，１３，１６} ）を含むこと、
ｘｉｉｉ）該脂質は、その脂肪酸含有物中に０．１％未満のω６－ドコサペンタエン酸（２２：５ ^{Δ４，７，１０，１３，１６} ）を含むこと、
ｘｉｖ）該脂質は、その脂肪酸含有物中に０．１％未満の１つ以上または全てのＳＤＡ、ＥＰＡ及びＥＴＡを含むこと、
ｘｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルは、約４％から約２５％の間、約４％から約２０％の間、約６％から約２０％の間、または約６％から約１２％の間であること、
ｘｖｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸レベルは、約４％から約４０％の間、約４％から約３５％の間、約８％から約２５％の間、８％から約２２％の間、約１５％から約４０％の間または約１５％から約３５％の間であること、
ｘｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸レベルは、約２０％から約７５％の間、３０％から７５％の間、約５０％から約７５％の間、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、または約６０％から約７５％の間であること、
ｘｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸レベルは、約３５％から約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から約２０％の間、２０％未満、約１６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の間、または約４％から約１０％の間であること、
ｘｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸レベルは、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％から約１０％の間、０．５％から約８％の間、または０．５％から４％の間であること、
ｘｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸レベルは、３６％から約６５％の間、３６％から約７０％の間、４０％から約６０％の間、約３０％から約６０％の間、約３５％から約６０％の間、４０％から約６５％の間、約３０％から約６５％の間、約３５％から約６５％の間、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％または約７０％であること、
ｘｘｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸レベルは、２１％から約４５％の間、２１％から約３５％の間、約２３％から約３５％の間、約２５％から約３５％の間、約２７％から約３５％の間、約２３％から約２５％の間、約２７％、約３０％、約３５％、約４０％または約４５％であること、
ｘｘｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約１．０未満、約０．１未満、約０．１０～約０．４、または約０．２であること、
ｘｘｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．０２から約０．１の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約０．０２、約０．０５、約０．１、約０．２または約１．０であること、
ｘｘｉｖ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約６０％から約９８％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５％から約９０％の間のΔ１２－デサチュラーゼによるオレイン酸からＬＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｖ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間のΔ６－デサチュラーゼによるＡＬＡからＳＤＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｖｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８８％の間、または約７５％から約８５％の間のΔ６－エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡ酸への転換効率に基づくこと、
ｘｘｖｉｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９９％の間、約７０％から約９９％の間、または約７５％から約９８％の間のΔ５－デサチュラーゼによるＥＴＡからＥＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｖｉｉｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、約５０％から約９９％の間、約８５％から約９９％の間、約５０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間のΔ５－エロンガーゼによるＥＰＡからＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｉｘ）前記脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、約２０％、約２５％、約３０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間または約２０％から約３０％の間のオレイン酸からＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｘ）前記脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間のＬＡからＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｘｉ）前記脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、少なくとも約３０％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約２２％から約７０％の間、約１７％から約５５％の間、約２２％から約４０％の間、または約２４％から約４０％の間のＡＬＡからＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｘｉｉ）該抽出脂質中の総脂肪酸は、１．５％未満のＣ２０：１、１％未満のＣ２０：１または約１％のＣ２０：１を有すること、
ｘｘｘｉｉｉ）該脂質のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率は、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約７０％から約９９％の間、または約９０％から約９９％の間であること、
ｘｘｘｉｖ）該脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含み、ＤＡＧは好ましくはＤＰＡを含むこと、
ｘｘｘｖ）該脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満または約０．００１％から約５％の間の遊離（非エステル化）脂肪酸及び／またはリン脂質を含む、または本質的にそれを含まないこと、
ｘｘｘｖｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも７０％、少なくとも７２％または少なくとも８０％は、前記ＴＡＧのｓｎ－１位またはｓｎ－３位であること、
ｘｘｘｖｉｉ）前記脂質において最も豊富なＤＰＡ含有ＴＡＧ種は、ＤＰＡ／１８：３／１８：３（ＴＡＧ５６：１２）であること、
ｘｘｘｖｉｉｉ）前記脂質は、トリＤＰＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含むこと、及び
ｘｘｘｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２２％、約２４％、約２６％、約２８％、約３１％、約７％から約３１％の間、約７％から約２８％の間、約１０％から約３５％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間、約１０％から約２２％の間、約１４％から約３５％の間、約１６％から約３５％の間、約１６％から約３０％の間、約１６％から約２５％の間、または約１６％から約２２％の間であり、場合により、ＤＨＡレベルは、該抽出脂質の総脂肪酸含有量の０．５％未満であること
の１つ以上を有する、［１］に記載の脂質。
［３]
前記脂質がオイル、好ましくは、油料種子から採れるオイルであり、より好ましくは、前記脂質が、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）オイルまたはカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）オイルなどのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）オイル、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）オイル、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）オイル、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．）オイル、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）オイル、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）オイル、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）オイル、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）オイル、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）オイル、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）オイル、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）オイル、クランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）オイル、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）オイル、またはススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）オイルを含むまたはである、［１］または［２］のいずれかに記載の脂質。
［４]
ｉ）脂質を含む植物部分または微生物細胞を得る工程であって、前記脂質がエステル化された形態の脂肪酸を含み、前記脂肪酸がオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合により、１つ以上のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含んでもよく、前記植物部分中の抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが７％から３５％の間である前記工程、及び
ｉｉ）前記植物部分または微生物細胞から脂質を抽出する工程
を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが７％から３５％の間である抽出植物脂質または微生物脂質の産生方法。
［５]
前記抽出脂質が［２］または［３］で定義された特徴の１つ以上を有する、［４記載の方法
［６]
前記植物部分が種子、好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）またはカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）などのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）、またはクランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）、好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃ． ｓａｔｉｖａ）の種子などの油料種子である、［４］または［５］に記載の方法。
［７]
前記植物部分または微生物細胞が、酵素の以下のセット：
ｉ）ω３－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖ）ω３－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｘ）ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、または
ｘ）ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、前記植物部分または微生物細胞の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合している、［４］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８]
前記植物部分または微生物細胞が、以下の特徴：
ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約９０％の間、または約７５％から約８５％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、オレイン酸をリノール酸に転換すること、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、約６５％から約９５％の間、約７５％から約９１％の間、または約８０％から約９１％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ω６脂肪酸をω３脂肪酸に転換すること、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＡＬＡをＳＤＡに転換すること、
ｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、約５％未満、約２．５％未満、約１％未満、約０．１％から約５％の間、約０．５％から約２．５％の間、または約０．５％から約１％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、リノール酸をγ‐リノレン酸に転換すること、
ｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８０％の間、または約７５％から約８０％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＳＤＡをＥＴＡに転換すること、
ｖｉ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５％から約９５％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＥＴＡをＥＰＡに転換すること、
ｖｉｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、約５０％から約９０％の間、または約８５％から約９５％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＥＰＡをＤＰＡに転換すること、
ｖｉｉｉ）前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、オレイン酸をＤＰＡに転換する効率が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、約２０％、約２５％、約３０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間、または約２０％から約３０％の間であること、
ｉｘ）前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＬＡをＤＰＡに転換する効率が、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、約２５％、約３０％、約３５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間であること、
ｘ）前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＡＬＡをＤＰＡに転換する効率が、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、少なくとも約３０％、約３０％、約３５％、約４０％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間であること、
ｘｉ）前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞は、前記外来性ポリヌクレオチドを含まない対応細胞より、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、約２５％から約４０％の間、または約２７．５％から約３７．５％の間で多いω３脂肪酸を含むこと、
ｘｉｉ）前記Δ６－デサチュラーゼは、リノール酸（ＬＡ）と比較してα－リノレン酸（ＡＬＡ）を優先的に不飽和化すること、
ｘｉｉｉ）前記Δ６－エロンガーゼは、Δ９－エロンガーゼ活性も有すること、
ｘｉｖ）前記Δ１２－デサチュラーゼは、Δ１５－デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖ）前記Δ６－デサチュラーゼは、Δ８－デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖｉ）前記Δ８－デサチュラーゼは、Δ６－デサチュラーゼ活性も有する、またはΔ６－デサチュラーゼ活性を有しないこと、
ｘｖｉｉ）前記Δ１５－デサチュラーゼは、ＧＬＡに対するω３－デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖｉｉｉ）前記ω３－デサチュラーゼは、ＬＡに対するΔ１５－デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｉｘ）前記ω３－デサチュラーゼは、ＬＡ及び／またはＧＬＡの両方を不飽和化すること、
ｘｘ）前記ω３－デサチュラーゼは、ＬＡと比較してＧＬＡを優先的に不飽和化すること、
ｘｘｉ）１つ以上または全ての前記デサチュラーゼは、対応するアシル‐ＰＣ基質より、アシル－ＣｏＡ基質に対して高い活性を有すること、
ｘｘｉｉ）前記Δ６－デサチュラーゼは、脂肪酸基質として、ＬＡより、ＡＬＡに対して高いΔ６－デサチュラーゼ活性を有すること、
ｘｘｉｉｉ）前記Δ６－デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ－２位と結合したＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ－ＣｏＡに対して高いΔ６－デサチュラーゼ活性を有すること、
ｘｘｉｖ）前記Δ６－デサチュラーゼは、ＬＡと比較して、基質としてのＡＬＡに対して、少なくとも約２倍高いΔ６－デサチュラーゼ活性、少なくとも３倍高い活性、少なくとも４倍高い活性、または少なくとも５倍高い活性を有すること、
ｘｘｖ）前記Δ６－デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのｓｎ－２位と結合したＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ－ＣｏＡに対して高い活性を有すること、
ｘｘｖｉ）前記Δ６－デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのｓｎ－２位に結合したＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ－ＣｏＡに対して、少なくとも約５倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性または少なくとも１０倍高い活性を有すること、
ｘｘｖｉｉ）前記デサチュラーゼは、フロントエンドデサチュラーゼであること、及び
ｘｘｖｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡに対する検出可能なΔ５‐デサチュラーゼ活性を有しないこと
の１つ以上または全てを有する、［７］記載の方法。
［９]
前記植物部分または微生物細胞が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、好ましくは、ＤＰＡ－ＣｏＡなどのＣ２２多価不飽和脂肪アシル－ＣｏＡ基質を使用できるＬＰＡＡＴ、アシル－ＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスホリパーゼＡ _２ （ＰＬＡ _２ ）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、ＣＤＰ－コリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、アシル－ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、またはその２つ以上の組合せをコードする外来性ポリヌクレオチドをさらに含む、［７］または［８］記載の方法。
［１０]
前記外来性ポリヌクレオチドが、前記植物部分または微生物細胞の細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡ分子、好ましくは、Ｔ－ＤＮＡ分子内に共有結合しており、好ましくは、前記植物部分または微生物細胞の細胞のゲノムに組み込まれたかかるＤＮＡ分子数が、１以下、２もしくは３以下であり、または２もしくは３である、［７］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１]
前記外来性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分または微生物細胞の総オイル含有率が、前記外来性ポリヌクレオチドを含まない対応する植物部分または微生物細胞の総オイル含有率の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約５０％から約８０％の間、または約８０％から約１００％の間である、［４］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２]
前記脂質を処理して、総脂肪酸含有率のパーセンテージとして、ＤＰＡのレベルを増加させることをさらに含み、前記処理が、１つ以上の分別蒸留、蒸留またはＤＰＡのメチルエステルまたはエチルエステルの生成などのエステル交換反応を含む、［４］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３]
その種子中に脂質を含む油料種子植物、もしくはその部分、または微生物細胞であって、
ａ）エステル化された形態の脂肪酸を含む脂質、及び
ｂ）酵素の以下のセット；
ｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ
ｉｉｉ）ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、または
ｉｖ）ω３－デサチュラーゼ及び／またはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチド
を含み、
各ポリヌクレオチドが、前記植物の発育種子中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上の種子特異的プロモーター、または前記微生物細胞中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合されており、前記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α－リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合によっては、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及び／またはエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含んでもよく、及び前記種子または微生物細胞の脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが７％から３５％の間である、
前記油料種子植物、もしくはその部分、または微生物細胞。
［１４]
ＤＰＡを含む種子を産生可能であるセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物であって、前記植物の成熟した収穫された種子が、種子１グラム当たり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約３２ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約３６ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約４４ｍｇまたは少なくとも４８ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約８０ｍｇ、または種子１グラム当たり約３０ｍｇから約８０ｍｇの間のＤＰＡ含有量を有する、前記植物。
［１５]
前記外来性ポリヌクレオチドを含む［１３］記載の植物細胞。
［１６]
以下の特徴：
ｉ）［１３］または１４］記載の植物由来であること、
ｉｉ）［１］～［３］のいずれかに記載の脂質を含むこと、
ｉｉｉ）［４］～［１２］のいずれかに記載の方法で使用できること
の１つ以上を有する植物部分、好ましくは種子、または微生物細胞。
［１７]
ＤＰＡ及び約４重量％から約１５重量％の間、好ましくは、約６重量％から約８重量％の間または約４重量％から約８重量％の間の水分を含む成熟して収穫されたセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）種子であって、前記種子のＤＰＡ含有量が種子１グラム当たり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約３２ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約３６ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約４４ｍｇまたは種子１グラム当たり少なくとも約４８ｍｇ、種子１グラム当たり約８０ｍｇ、または種子１グラム当たり約３０ｍｇから約８０ｍｇの間である、前記種子。
［１８]
［１］～［３］のいずれかに記載の抽出植物脂質または抽出微生物脂質の製造に使用できる植物または微生物細胞の産生方法であって、前記方法が、
ａ）複数の植物または微生物細胞からの１つ以上の植物部分または微生物細胞により産生された脂質中のＤＰＡのレベルをアッセイすることであって、各植物または微生物細胞が、酵素の以下のセット；
ｉ）ω３－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖ）ω３－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）Δ１２－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、
ｉｘ）ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ６－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ、または
ｘ）ω３－デサチュラーゼまたはΔ１５－デサチュラーゼ、Δ８－デサチュラーゼ、Δ５－デサチュラーゼ、Δ９－エロンガーゼ及びΔ５－エロンガーゼ
の１つをコードする１つ以上の外来性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドが、植物部分または微生物細胞の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合する、前記アッセイすること、と
ｂ）１つ以上のその部分の［１］～［３］のいずれかに記載の抽出植物脂質または微生物脂質の産生に使用できる複数の植物または微生物細胞から植物または微生物細胞を同定すること、と
ｃ）場合によっては、前記同定植物または微生物細胞、またはそれ由来の種子から後代植物または微生物細胞を産生すること
とを含む前記方法。
［１９]
種子の産生方法であって、前記方法が、
ａ）好ましくは、少なくとも１０００または２０００または３０００のかかる植物の集合部分としての耕地または標準栽植密度で植えられた少なくとも１ヘクタールまたは２ヘクタールまたは３ヘクタールの領域で、［１３］または１４］記載の植物、または［１６］記載の植物部分を産生、もしくは［１７］記載の種子を産生する植物を生育すること、
ｂ）前記１つまたは複数の植物から種子を収穫すること、及び
ｃ）場合によっては、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも６０ｋｇまたは７０ｋｇまたは８０ｋｇのＤＰＡ／ヘクタールの総ＤＰＡ収率でオイルを産生すること
を含む、前記方法。
［２０]
次の特徴：
ｉ）［２］または［３］に定義されるオイルを含むこと、及び
ｉｉ）前記植物部分または種子または微生物細胞が［４］～［１２］のいずれかに記載の方法で使用可能であること
の１つ以上を有する、［１３］～［１７］のいずれかに記載の植物、植物細胞、植物部分もしくは種子、または微生物細胞。
［２１]
［４］～［１２］のいずれかに記載の方法を用いて、［１５］記載の細胞、［１３］記載の油料種子植物、［１３］記載の微生物細胞、［１４］記載のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）もしくはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物、［１６］記載の植物部分、または［１７］記載の種子により産生、またはから得られる脂質、またはオイル。
［２２]
［１７］記載の種子から得られる、または［１３］または［１４］記載の植物から得られるシードミール。
［２３]
１つ以上の［２１］記載の脂質もしくはオイル、［１５］記載の細胞、［２０］記載の植物細胞または微生物細胞、［１７］記載の種子、または［２２］記載のシードミールを含む組成物。
［２４]
１つ以上の［２１］記載の脂質もしくはオイル、［１５］記載の細胞、［１３］記載の油料種子植物、［２０］記載の植物細胞もしくは微生物細胞、［１４］記載のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）もしくはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物、［２０］記載の植物部分、［１７］記載の種子、［２２］記載のシードミール、または［２３］記載の組成物を含む家畜飼料、化粧品または化学薬品。
［２５]
家畜飼料の製造方法であって、前記方法が、少なくとも１つの他の食物成分と、１つ以上の［１］～［３］のいずれかに記載の脂質もしくはオイル、［１５］記載の細胞、［１３］記載の油料種子植物、［２０］記載の植物細胞もしくは微生物細胞、［１４］記載のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）もしくはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ）植物、［２０］記載の植物部分、［１７］記載の種子、［２２］記載のシードミール、または［２３］記載の組成物を混合することを含む前記方法。
［２６]
ＰＵＦＡから利益を受けることになる症状の治療または予防用医薬品製造のための、［１］～［３］のいずれかに記載の１つ以上の脂質またはオイル、［１５］記載の細胞、［２０］記載の植物細胞もしくは微生物細胞、［２０］記載の植物部分、［１７］記載の種子、［２２］記載のシードミール、または［２３］記載の組成物の使用。