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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023007514
(43)【公開日】2023-01-19
(54)【発明の名称】インクレチン産生促進剤及び糖取り込み促進剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/59 20060101AFI20230112BHJP
A61K 31/592 20060101ALI20230112BHJP
A61K 31/593 20060101ALI20230112BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230112BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230112BHJP
【ＦＩ】
A61K31/59
A61K31/592
A61K31/593
A61P43/00 107
A61P3/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2019222759
(22)【出願日】2019-12-10
(71)【出願人】
【識別番号】511132074
【氏名又は名称】鍋島 陽一
(71)【出願人】
【識別番号】519440940
【氏名又は名称】稲田 明理
(71)【出願人】
【識別番号】519440951
【氏名又は名称】藤井 宣晴
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】鍋島 陽一
(72)【発明者】
【氏名】稲田 明理
(72)【発明者】
【氏名】藤井 宣晴
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086DA15
(57)【要約】
【課題】本発明は、より有効性が高く、安全性にも優れる新しいタイプの糖尿病治療薬を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、インクレチン産生促進剤である。上記インクレチンは、ＧＬＰ－１又はＧＩＰであることが好ましい。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、インクレチン産生促進剤である。上記インクレチンは、ＧＬＰ－１又はＧＩＰであることが好ましい。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、インクレチン産生促進剤。
【請求項2】
上記インクレチンが、ＧＬＰ－１又はＧＩＰである、請求項１に記載のインクレチン産生促進剤。
【請求項3】
小腸からのインクレチン産生を促進する、請求項１又は２に記載のインクレチン産生促進剤。
【請求項4】
（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物が、活性型ビタミンＤである、請求項１から３のいずれか１項に記載のインクレチン産生促進剤。
【請求項5】
糖尿病治療のために用いられる、請求項４に記載のインクレチン産生促進剤。
【請求項6】
（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、筋肉細胞における糖取り込み促進剤。
【請求項7】
（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物が、活性型ビタミンＤである、請求項６に記載の糖取り込み促進剤。
【請求項8】
糖尿病治療のために用いられる、請求項７に記載の糖取り込み促進剤。
【請求項9】
ＧＬＰ－１又はＧＩＰをさらに含む、請求項７又は８に記載の糖取り込み促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、インクレチン産生促進剤及び糖取り込み促進剤に関する。
【背景技術】
【0002】
血中のグルコース濃度（血糖値、血糖）は、様々なホルモン（インスリン、グルカゴン、コルチゾール等）の働きによって常に一定範囲内に調節されている。種々の理由によってこの調節機構が破綻すると、血液中の糖分が異常に増加して糖尿病になる。この糖尿病は、上記調節機構の破綻の様式の違いにより１型と２型に分類される。１型糖尿病では膵臓のβ細胞が何らかの理由によって破壊されることで、血糖値を調節するホルモンの一つであるインスリンが枯渇してしまい、高血糖、糖尿病へと至る。一方２型糖尿病では、肥満等を原因として、膵臓のランゲルハンス島（膵島）にあるβ細胞からのインスリン分泌量が減少し、筋肉、脂肪組織へのグルコースの取り込み能が低下し（インスリン抵抗性が増大し）、結果として血中のグルコースが肝臓や脂肪組織でグリコーゲンとして貯蔵されず、血中のグルコースが正常範囲を逸脱して高い血糖値となる。なお、糖尿病患者の約９０％は２型糖尿病である。
【0003】
糖尿病の治療としては、１型糖尿病においては、分泌できなくなったインスリンを補充するインスリン療法が行われている。また、２型糖尿病においては、食事療法と運動療法に加え、経口血糖降下薬、インスリン、ＧＬＰ－１作動薬等を用いて行う薬物療法が行われている。上記ＧＬＰ－１作動薬を用いる療法、即ちＧＬＰ－１補充療法やＧＬＰ－１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）アゴニストを利用した糖尿病治療法等は比較的新しい療法のひとつであり、注目されている。
【0004】
ＧＬＰ－１は、インクレチン（ｉｎｃｒｅｔｉｎ：Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ）に分類されるホルモンであり、食物の摂取が引き金となって血中に分泌され、膵臓β細胞に働きかけてインスリン分泌を促進し、血糖値を低下させる等、糖代謝において重要な役割を果たしている。ＧＬＰ－１はまた、膵臓α細胞からのグルカゴン分泌を抑制することにより、肝からのブドウ糖放出を低下させ、血糖値を低下させる。ＧＬＰ－１の他の作用として、膵β細胞の増殖促進、胃排泄や胃酸分泌の抑制、及び食欲と摂食の抑制等も知られている（非特許文献１）。従って、ＧＬＰ－１の産生を促進したり、ＧＬＰ－１の効果を増強したりすることは、肥満、糖尿病等の生活習慣病の改善に有用である。実際にＧＬＰ－１アナログ製剤が糖尿病治療薬として使用されており、インスリン抵抗性改善効果があることが報告されている（非特許文献１）。しかし、従来のＧＬＰ－１作動薬では、十分な効果が得られない患者も存在し（非特許文献２～４）、さらに有効性の高い糖尿病治療薬が常に求められているという現状がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】宮川、他１名、「インクレチンの糖尿病治療への応用」、日本内科学会雑誌、平成２０年４月２０日、第９７巻、第４号、ｐ．８２７－８３５
【非特許文献2】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２０１８、９（４）、ｐ．８２２－８３０
【非特許文献3】Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９５、ｖｏｌｕｍｅ ９、ｐ．２９９－３０４
【非特許文献4】Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１９、ｖｏｌｕｍｅ ５１、ｐ．３７９－３８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
このような状況の中、本発明は、より有効性が高く、安全性にも優れる新しいタイプの糖尿病治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、α―ｋｌｏｔｈｏノックアウトマウス（ｋｌｏｔｈｏマウス）において、インクレチンの産生が通常のマウスより顕著に亢進していること、その現象にビタミンＤが大きな影響を与えていることを見出し、さらに研究を進め、本発明を完成させた。すなわち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
【0008】
［１］（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、インクレチン産生促進剤。
［２］上記インクレチンが、ＧＬＰ－１又はＧＩＰである、［１］に記載のインクレチン産生促進剤。
［３］小腸からのインクレチン産生を促進する、［１］又は［２］に記載のインクレチン産生促進剤。
［４］（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物が、活性型ビタミンＤである、［１］から［３］のいずれかに記載のインクレチン産生促進剤。
［５］糖尿病治療のために用いられる、［４］に記載のインクレチン産生促進剤。
［６］（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、筋肉細胞における糖取り込み促進剤。
［７］（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物が、活性型ビタミンＤである、［６］に記載の糖取り込み促進剤。
［８］糖尿病治療のために用いられる、［７］に記載の糖取り込み促進剤。
［９］ＧＬＰ－１又はＧＩＰをさらに含む、［７］又は［８］に記載の糖取り込み促進剤。
［２］上記インクレチンが、ＧＬＰ－１又はＧＩＰである、［１］に記載のインクレチン産生促進剤。
［３］小腸からのインクレチン産生を促進する、［１］又は［２］に記載のインクレチン産生促進剤。
［４］（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物が、活性型ビタミンＤである、［１］から［３］のいずれかに記載のインクレチン産生促進剤。
［５］糖尿病治療のために用いられる、［４］に記載のインクレチン産生促進剤。
［６］（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、筋肉細胞における糖取り込み促進剤。
［７］（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物が、活性型ビタミンＤである、［６］に記載の糖取り込み促進剤。
［８］糖尿病治療のために用いられる、［７］に記載の糖取り込み促進剤。
［９］ＧＬＰ－１又はＧＩＰをさらに含む、［７］又は［８］に記載の糖取り込み促進剤。
【発明の効果】
【0009】
本発明によると、ビタミンＤ及び／又はビタミンＤ誘導体を使用することにより、ＧＬＰ－１等のインクレチンの産生を促進することができる。また、ビタミン及び／又はビタミンＤ誘導体を使用することにより筋肉細胞への糖取り込みを亢進することもできる。本発明のインクレチン産生促進剤、糖取り込み促進剤は、単独で、又は従来のインクレチン等の糖尿病薬と組み合わせて、新しいタイプの、より有効性の高い糖尿病薬として好適に用いられ得る。また、ビタミンＤ及び／又はビタミンＤ誘導体を有効成分とすることから、安全性にも優れている。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図12】下肢骨格筋組織における、ミオシンＴｙｐｅＩ、ミオシンＴｙｐｅＩＩＡ、ＧＬＰ－１Ｒの発現解析（組織染色）の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明のインクレチン産生促進剤及び筋肉細胞における糖取り込み促進剤について詳細に説明する。なお、本明細書において、免疫学、細胞生物学、分子生物学的手法は、特に明記しない限り、当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
【0012】
＜インクレチン産生促進剤＞
本発明のインクレチン産生促進剤は、（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物（以下、単に「（Ａ）化合物」ともいう）を有効成分として含有する。
本発明のインクレチン産生促進剤は、（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物（以下、単に「（Ａ）化合物」ともいう）を有効成分として含有する。
【0013】
ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体については、これまで多くの試験が行われ、種々の機能を有することが分かっている。例えば活性型ビタミンＤの一種であるカルシトリオールは、循環器系に放出され、リンパ液中の輸送物質であるビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）と結びついて様々な対象臓器に運ばれる。そして、対象細胞の細胞核内に主に所在するビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）と結びついて腸内でのカルシウム吸収等の生体効果を発現する。また、ビタミンＤ受容体は、ステロイド／甲状腺ホルモンの核内受容体の一群に属しており、脳、心臓、皮膚、生殖腺、前立腺及び乳房を含むほとんどの臓器の細胞で作用している。腸、骨、腎臓及び副甲状腺の細胞でのビタミンＤ受容体の活性化は、甲状腺ホルモン及びカルシトニンの補助により血中のカルシウム及びリン酸の濃度の維持及び骨密度の維持を司っている。さらに、ビタミンＤ受容体は、細胞の増殖と分化に関わっていること、免疫システムにも影響を及ぼしていることも知られている。しかしながら、ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体がインクレチンの産生を促進することは、本発明者らが初めて見出した知見であり、これまで知られていなかったことである。
【0014】
［インクレチン］
本発明において、インクレチンとは、腸管由来のインスリン分泌刺激因子「Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｉｎｃｒｅｔｉｎ）」に分類されるホルモンをいい、食物の摂取が引き金となって血中に分泌され、膵臓β細胞に働きかけてインスリン分泌を促進し、血糖値を低下させる等、糖代謝において重要な役割を果たしているものである。このようなインクレチンとしては、ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１）、ＧＩＰ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＤＰＰ－ＩＶ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ－ＩＶ）等が挙げられ、ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体による産生促進効果の観点から、ＧＬＰ－１、ＧＩＰが好ましく、ＧＬＰ－１がより好ましい。
本発明において、インクレチンとは、腸管由来のインスリン分泌刺激因子「Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｉｎｃｒｅｔｉｎ）」に分類されるホルモンをいい、食物の摂取が引き金となって血中に分泌され、膵臓β細胞に働きかけてインスリン分泌を促進し、血糖値を低下させる等、糖代謝において重要な役割を果たしているものである。このようなインクレチンとしては、ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１）、ＧＩＰ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＤＰＰ－ＩＶ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ－ＩＶ）等が挙げられ、ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体による産生促進効果の観点から、ＧＬＰ－１、ＧＩＰが好ましく、ＧＬＰ－１がより好ましい。
【0015】
［（Ａ）化合物］
本発明のインクレチン産生促進剤が含む（Ａ）化合物は、ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物である。
本発明のインクレチン産生促進剤が含む（Ａ）化合物は、ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物である。
【0016】
ビタミンＤは、ビタミンＡ、Ｅ及びＫと共に脂溶性ビタミン群に属する。ビタミンＤには、例えばビタミンＤ１、Ｄ２、Ｄ３またはビタミンＤ４等の種々の形態が存在し、中でも主な天然の形態としては、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロールともいう）及びビタミンＤ３（コレカルシフェロールともいう）が挙げられる。これらは、脂質に可溶性であり、かつ水に不溶性である。
【0017】
ビタミンＤ誘導体とは、ビタミンＤ受容体又はその誘導体に関してアゴニスト又はアンタゴニスト活性等、ビタミンＤと類似の生物学的特性、特にビタミンＤ応答配列（ＶＤＲＥ）に対してトランス活性化特性を示す化合物を意味する。これらの化合物は、ビタミンＤの天然代謝物に限定されない。このようなビタミンＤ誘導体としては、側鎖に対して修飾されたビタミンＤ骨格を含む化合物や、ビタミンＤ骨格内の修飾を含む化合物等が挙げられる。
【0018】
ここで、ビタミンＤの生物学的特性（活性）は多種類に及ぶが、例えば、各種細胞の増殖、分化に関与していることも知られている。ビタミンＤ受容体が単球を含むいくつかの白血球、マクロファージならびにＴ及びＢリンパ球において発現しているので、ビタミンＤはまた、免疫系に影響を与える。
【0019】
（Ａ）化合物としては、ビタミンＤ、ビタミンＤ誘導体のいずれでもよいが、ビタミンＤ誘導体の方が好ましく、特に例示するような活性型ビタミンＤがより好ましい。このような活性型ビタミンＤとしては、例えば、カルシトリオール（１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）、カルシポトリオール、ドキセルカルシフェロール、セカルシトール、マキサカルシトール、セオカルシトール、タカルシトール、パリカルシトール、ファレカルシトリオール、１α，２４Ｓ－ジヒドロキシビタミンＤ２、１（Ｓ），３（Ｒ）－ジヒドロキシ－２０（Ｒ）－［（（３－（２－ヒドロキシ－２－プロピル）フェニル）メトキシ）メチル］－９，１０－セコプレグナ－５（Ｚ），７（Ｅ），１０（１９）－トリエン等が挙げられる。これらのうち、インクレチン産生促進作用の観点から、カルシトリオール（１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）がさらに好ましい。
【0020】
本発明のインクレチン産生促進剤における（Ａ）化合物の含有量は、インクレチン産生促進剤の製剤形態に合わせて調整することができるが、概ね、インクレチン産生促進剤全重量に対して０．００００１重量％～１００重量％であり、０．０００１重量％～５０重量％であることが好ましく、０．０００３重量％～２０重量％であることがより好ましく、０．０００５重量％～１０重量％であることがさらに好ましい。
【0021】
本発明のインクレチン産生促進剤は、種々の投与経路をとることができ、経口的に又は非経口的（静脈投与、皮下投与、経皮投与、経肺投与、経粘膜投与（点鼻など）、直腸投与等）に投与され得る。本発明のインクレチン産生促進剤は、上記（Ａ）成分を、経口製剤または非経口製剤に通常用いられる薬学的に許容される担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊補助剤、滑沢剤、湿潤剤など）や添加剤などと混合し、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、バッカル剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、軟膏剤、点眼剤、注射剤、点滴剤、点鼻剤などの所望の形態に、当業者に周知の常法に従って、製剤化することにより調製することができる。
【0022】
本発明のインクレチン産生促進剤の投与においては、１回当たりの投与量が、（Ａ）成分換算で、０．００１μｇ～１ｇであり、０．０１μｇ～１００ｍｇであることが好ましく、０．０５μｇ～１０ｍｇであることがより好ましく、０．１μｇ～５ｍｇであることがさらに好ましく、１μｇ～５ｍｇであることがよりさらに好ましく、１０μｇ～３ｍｇであることが特に好ましく、５０μｇ～１ｍｇであることがより特に好ましい。
【0023】
本発明のインクレチン産生促進剤は、小腸からのＧＬＰ－１、ＧＩＰ等のインクレチンの分泌を促進する。そして、分泌が促進されたそれぞれの因子が、膵臓のランゲルハンス島のβ細胞表面に存在するそれぞれの受容体に結合することで、β細胞からのインスリンの分泌を効果的に促し、血糖値を調節することができる。したがって、本発明のインクレチン産生促進剤は、糖尿病、特に２型糖尿病の治療薬として、優れた効果を奏する。糖尿病患者のうちでも、特に、従来のインクレチン作動薬が効果を奏さない患者に対して、糖尿病、特に２型糖尿病の治療薬として有効に用いられ得る。このような従来のインクレチン作動薬が効果を奏さない患者としては、例えば膵β細胞の細胞数、機能が減弱している患者、ＧＬＰ－１受容体の機能低下を招く遺伝子多型を有する患者、ＧＬＰ－１受容体の機能促進を招く遺伝子多型を有さない患者等が挙げられる。
【0024】
本発明のインクレチン産生促進剤を、２型糖尿病の治療のために用いる場合の投与量は、使用する（Ａ）化合物の種類、患者の体重や年齢、対象とする疾患の状態及び投与方法等によっても異なるが、例えば、（Ａ）化合物の量に換算して、注射剤の場合は成人１日１回約０．０１μｇ～１００ｍｇ、錠剤等の経口製剤の場合は、成人１日数回、１回量約１μｇ～１０ｇ程度投与するのがよい。また、経粘膜投与の場合は、成人１日数回、１回数滴、濃度が０．００００１重量％～２０重量％の製剤を投与するのがよい。また、本発明のインクレチン産生促進剤は、必要に応じて、例えば血糖値が基準値を超えた際に投与してもよい。
【0025】
＜糖取り込み促進剤＞
本発明の糖取り込み促進剤は、（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する。本発明の糖取り込み促進剤は、上記（Ａ）化合物を含有することにより、筋肉細胞に直接又は間接的に作用して、筋肉細胞による糖取り込みを促進させ、血糖値をコントロールすることができる。本発明の糖取り込み促進剤によって糖取り込みが促進する上記筋肉細胞としては、骨格筋細胞が挙げられ、好ましい具体例としては下肢骨格筋のヒラメ筋細胞が挙げられる。
本発明の糖取り込み促進剤は、（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する。本発明の糖取り込み促進剤は、上記（Ａ）化合物を含有することにより、筋肉細胞に直接又は間接的に作用して、筋肉細胞による糖取り込みを促進させ、血糖値をコントロールすることができる。本発明の糖取り込み促進剤によって糖取り込みが促進する上記筋肉細胞としては、骨格筋細胞が挙げられ、好ましい具体例としては下肢骨格筋のヒラメ筋細胞が挙げられる。
【0026】
本発明の糖取り込み促進剤が含有する（Ａ）化合物、その他の成分、製剤形態、用法用量等については、上述のインクレチン産生促進剤の項の説明を適用できる。
【0027】
本発明の糖取り込み促進剤は、筋肉細胞に直接又は間接的に作用して、筋肉細胞による糖取り込みを促進させ、血糖値をコントロールすることができる。したがって、本発明の糖取り込み促進剤は、糖尿病、特に２型糖尿病の治療薬として、優れた効果を奏する。また、本発明の糖取り込み促進剤は、ＧＬＰ－１又はＧＩＰといったインクレチンをさらに含むこと、あるいはＧＬＰ－１又はＧＩＰといったインクレチンと併用することによって、糖取り込み促進効果をより向上させることができる。
【0028】
本発明は、（Ａ）ビタミンＤ及びビタミンＤ誘導体から成る群より選択される少なくとも１種の化合物を使用することを特徴とする、インクレチン産生促進方法、筋肉細胞による糖取り込み促進方法も含む。（Ａ）化合物、その他の成分、本方法を採用する場合の製剤形態、用法用量等については、上述のインクレチン産生促進剤の項の説明を適用することができる。
【実施例0029】
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定的に解釈されるものではない。
【0030】
１．ｋｌｏｔｈｏマウスの解析（体重及び血糖値の経時変化）
ｋｌｏｔｈマウス（ｋｌｏｔｈｏ発現欠如マウス；ｋｌ／ｋｌマウス）とは、ヒト老化で見られる現象に類似した複数の表現型を呈する、常染色体劣性ミュータントマウスであり、ヒト早発性老化症候群モデルとして知られている。「ｋｌｏｔｈｏ」と命名された遺伝子は、老化表現型の抑制に働き、ｉｎ ｖｉｖｏの老化や、老化関連疾患の罹患率を調節するｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ経路の一部として機能する。ｋｌｏｔｈｏマウスの多発性老化表現型は常染色体劣性で、遺伝的バックグラウンドの影響を受けることなく、すべての個体で認められる。ｋｌｏｔｈｏマウスの成長に伴う体重変化、血糖値の変化を調べ、同腹仔（－／－）正常マウスと比較した。結果を図１（体重変化）及び図２（血糖値）に示す。なお、図１において、黒丸は、ｋｌｏｔｈｏマウスを、白丸は、正常マウスの体重を示している。
ｋｌｏｔｈマウス（ｋｌｏｔｈｏ発現欠如マウス；ｋｌ／ｋｌマウス）とは、ヒト老化で見られる現象に類似した複数の表現型を呈する、常染色体劣性ミュータントマウスであり、ヒト早発性老化症候群モデルとして知られている。「ｋｌｏｔｈｏ」と命名された遺伝子は、老化表現型の抑制に働き、ｉｎ ｖｉｖｏの老化や、老化関連疾患の罹患率を調節するｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ経路の一部として機能する。ｋｌｏｔｈｏマウスの多発性老化表現型は常染色体劣性で、遺伝的バックグラウンドの影響を受けることなく、すべての個体で認められる。ｋｌｏｔｈｏマウスの成長に伴う体重変化、血糖値の変化を調べ、同腹仔（－／－）正常マウスと比較した。結果を図１（体重変化）及び図２（血糖値）に示す。なお、図１において、黒丸は、ｋｌｏｔｈｏマウスを、白丸は、正常マウスの体重を示している。
【0031】
図１に示すとおり、ｋｌｏｔｈｏマウスと正常マウスでは、３週令での体重は約６ｇとほぼ同程度であったが、ｋｌｏｔｈｏマウスは成長に伴う体重の増加が抑制されており６週令まで徐々に増加したものの、約１０ｇで体重増加が停止した。それに対して正常マウスでは、６週令以降も体重増加は継続し、２０ｇを超えるまで増加した。また、図２ａに示すとおり、正常マウスでは、３週令の時点の血糖値が約１５０ｍｇ／ｄＬと、ｋｌｏｔｈｏマウス（約１１０ｍｇ／ｄＬ）より高く、成長と共に徐々に増加した。ｋｌｏｔｈｏマウスでは、血糖値は成長するにつれて徐々に低下した。６週令での血糖値分布を示したのが図２ｂである。ｋｌｏｔｈｏマウスでは、オス、メスのいずれでも正常マウスより血糖値が顕著に低くなっていた。
【0032】
２．ｋｌｏｔｈｏマウスの解析（血中糖代謝パラメータの含有量）
ｋｌｏｔｈｏマウスと同腹仔（－／－）正常マウスにおける血中の糖代謝パラメータ（ＶＤ（活性型ビタミンＤ）、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ）の含有量を測定した。コントロールとして、糖代謝には関連のないＦＧＦ２１の測定も行った。結果を図３に示す。図３中、黒いマークはｋｌｏｔｈｏマウスを、白いマークは同腹仔（－／－）正常マウスを示している。
ｋｌｏｔｈｏマウスと同腹仔（－／－）正常マウスにおける血中の糖代謝パラメータ（ＶＤ（活性型ビタミンＤ）、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ）の含有量を測定した。コントロールとして、糖代謝には関連のないＦＧＦ２１の測定も行った。結果を図３に示す。図３中、黒いマークはｋｌｏｔｈｏマウスを、白いマークは同腹仔（－／－）正常マウスを示している。
【0033】
図３ａ～３ｃに示すとおり、ＶＤ、ＧＬＰ－１、ＧＩＰのいずれの血中含有量についても、ｋｌｏｔｈｏマウスでは正常マウスよりも顕著に高くなっていた。糖代謝に関連のないＦＧＦ２１の血中含有量は、両者で差が見られなかった。
【0034】
３．小腸インクレチン産生細胞におけるインクレチン遺伝子発現
Ｎａｇａｔａｋｅら（ＰＬＯＳ１、２０１４、９（６）：ｅ９０６３８）の方法に従い、ｋｌｏｔｈｏマウス及び正常マウス（Ｃ５７ＢＬ６）の小腸より、それぞれインクレチン産生細胞を単離回収した。具体的には、麻酔下で開腹し小腸全体（十二指腸、回腸、空腸を含む）を取り出し管腔を切開、洗浄後、腸管膜から細胞を単離し、さらに７０μｍ径のセルストレイナーに通して筋層等を取り除き、個々の細胞にして採取した後、ＦＡＣＳ解析用サンプルとした。蛍光色素のついた抗体を用いて氷上でインキュベートした後、ＦＡＣＳ Ａｒｉａに供し、死細胞、白血球、赤血球を除いた分画を腸管上皮細胞分画とし、さらにＣｌａｕｄｅｉｎ－４の発現とＵＥＡ－１の結合性により二次元展開し、４つの細胞分画に分離した。Ｃｌａｕｄｅｉｎ－４陽性及びＵＥＡ－１陽性の腸管内分泌細胞のｍＲＮＡを抽出し、各遺伝子（ＧＬＰ－１、ＧＩＰ、ＧＬＵＴ２、ＶＤＲ）の発現量を測定した。その結果を図４に示す。黒いバーは、ｋｌｏｔｈｏマウスの腸管内分泌細胞の結果であり、白いバーは、正常マウスの腸管内分泌細胞の結果である。
Ｎａｇａｔａｋｅら（ＰＬＯＳ１、２０１４、９（６）：ｅ９０６３８）の方法に従い、ｋｌｏｔｈｏマウス及び正常マウス（Ｃ５７ＢＬ６）の小腸より、それぞれインクレチン産生細胞を単離回収した。具体的には、麻酔下で開腹し小腸全体（十二指腸、回腸、空腸を含む）を取り出し管腔を切開、洗浄後、腸管膜から細胞を単離し、さらに７０μｍ径のセルストレイナーに通して筋層等を取り除き、個々の細胞にして採取した後、ＦＡＣＳ解析用サンプルとした。蛍光色素のついた抗体を用いて氷上でインキュベートした後、ＦＡＣＳ Ａｒｉａに供し、死細胞、白血球、赤血球を除いた分画を腸管上皮細胞分画とし、さらにＣｌａｕｄｅｉｎ－４の発現とＵＥＡ－１の結合性により二次元展開し、４つの細胞分画に分離した。Ｃｌａｕｄｅｉｎ－４陽性及びＵＥＡ－１陽性の腸管内分泌細胞のｍＲＮＡを抽出し、各遺伝子（ＧＬＰ－１、ＧＩＰ、ＧＬＵＴ２、ＶＤＲ）の発現量を測定した。その結果を図４に示す。黒いバーは、ｋｌｏｔｈｏマウスの腸管内分泌細胞の結果であり、白いバーは、正常マウスの腸管内分泌細胞の結果である。
【0035】
図４に示すとおり、ｋｌｏｔｈｏマウスの小腸の細胞においては、ＧＬＰ－１、ＧＩＰの遺伝子発現が、正常マウスの小腸の細胞と比較して、顕著に高くなっていた。一方、ＧＬＵＴ２、ＶＤＲについては、正常マウスと同程度であった。図３ａに示すとおり、ｋｌｏｔｈｏマウスでは血中ＶＤ濃度が非常に高く、インクレチンの産生が亢進し血中インクレチン濃度も高くなっていることから、ＶＤがインクレチンの産生・分泌を調節している可能性も考えられた。
【0036】
４．ＶＤ摂取によるインクレチン産生の促進
正常マウス（Ｃ５７ＢＬ６）に対し、１６時間絶食後、グルコース２ｍｇ／ｇ及びＶＤ４００ｎＭを経口投与した。２時間後に麻酔下で開腹し、小腸の３部位（十二指腸、回腸、空腸）を取り出し管腔を切開、洗浄後、腸管膜から細胞を単離し、さらに７０μｍ径のセルストレイナーに通して筋層等を取り除き個々の細胞にして採取した。ｍＲＮＡを抽出して、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ遺伝子の発現を解析した。コントロールとしては、絶食後、同濃度のグルコースのみを経口投与したマウスを用いた。結果を図５に示す。斜線入りのバーは、ｋｌｏｔｈｏマウスの、白いバーは、正常マウスの各部位での遺伝子発現の結果を示す。
正常マウス（Ｃ５７ＢＬ６）に対し、１６時間絶食後、グルコース２ｍｇ／ｇ及びＶＤ４００ｎＭを経口投与した。２時間後に麻酔下で開腹し、小腸の３部位（十二指腸、回腸、空腸）を取り出し管腔を切開、洗浄後、腸管膜から細胞を単離し、さらに７０μｍ径のセルストレイナーに通して筋層等を取り除き個々の細胞にして採取した。ｍＲＮＡを抽出して、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ遺伝子の発現を解析した。コントロールとしては、絶食後、同濃度のグルコースのみを経口投与したマウスを用いた。結果を図５に示す。斜線入りのバーは、ｋｌｏｔｈｏマウスの、白いバーは、正常マウスの各部位での遺伝子発現の結果を示す。
【0037】
図５に示すとおり、小腸のうち、胃に最も近い部分である十二指腸において、グルコースおよびＶＤ投与のマウスにおいてＧＬＰ－１及びＧＩＰ遺伝子発現の増強が見られた。この結果から、グルコース刺激及びＶＤ刺激は、小腸からのインクレチン産生を促進すると言える。
【0038】
５．ＶＤ／ＶＤＲによるインクレチン遺伝子の転写活性化；クロマチン免疫沈降法によるインクレチン産生遺伝子（ＧＬＰ－１、ＧＩＰ）のプロモーター領域へのビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の結合解析
インターネット上で利用可能なＣｈＩＰ－Ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐ：／／ｃｈｉｐ－ａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ｐｅａｋ＿ｂｒｏｗｓｅｒ）を利用して、ＧＬＰ－１およびＧＩＰ遺伝子の近傍で、ＶＤＲ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータとＶＤＲ結合モチーフ配列（ＶＤＲＥ：ＧＫＴＣＡＮＮＲＲＧＫＴＹＡのｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）がＯｖｅｒｌａｐする箇所を同定した。ＶＤＲが結合する遺伝子として既知のＣｙｐ２４ａ１遺伝子をポジティブコントロールとして同様に同定した。ＧＬＰ－１およびＧＩＰ遺伝子について、ＶＤＲＥを含む約１００ｂｐを増幅するようにＰＣＲプライマーを設計し、クロマチン免疫沈降法によるＶＤＲとの結合解析を行った。クロマチン免疫沈降はＣｈＩＰ－ＩＴ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆＣｈＩＰ－ＩＴ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓＣｈＩＰ－ＩＴ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ）を用いて行った。なお、クロマチン免疫沈降法は、ホルムアルデヒド等を用いて細胞内でＤＮＡとタンパク質を架橋し、目的のタンパク質に対する特異的な抗体を使った免疫沈降法と組み合わせることで、細胞内に実際に存在するクロマチンＤＮＡ上でのＤＮＡとタンパク質の相互作用を検出する方法である。ホルムアルデヒド等によりＤＮＡと目的のタンパク質の架橋を行い、目的のタンパク質に対する抗体で免疫沈降を行った後、可逆反応により架橋を外し、タンパク質を除き、ＤＮＡ断片を回収する。回収されたＤＮＡを鋳型にして、目的のＤＮＡ配列の特異的プライマーを用いてＰＣＲで解析を行う。本試験において反応に用いたゲノムＤＮＡは上記４（ＶＤ摂取によるインクレチン産生の促進）の項に記載した通りの方法で単離採取したマウス小腸細胞より抽出した。結果を図６に示す。ＧＬＰ－１およびＧＩＰ遺伝子近傍にはＶＤＲと結合する可能性のある配列があり、これらモチーフへのＶＤＲの結合が強く示唆された。
インターネット上で利用可能なＣｈＩＰ－Ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐ：／／ｃｈｉｐ－ａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ｐｅａｋ＿ｂｒｏｗｓｅｒ）を利用して、ＧＬＰ－１およびＧＩＰ遺伝子の近傍で、ＶＤＲ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータとＶＤＲ結合モチーフ配列（ＶＤＲＥ：ＧＫＴＣＡＮＮＲＲＧＫＴＹＡのｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）がＯｖｅｒｌａｐする箇所を同定した。ＶＤＲが結合する遺伝子として既知のＣｙｐ２４ａ１遺伝子をポジティブコントロールとして同様に同定した。ＧＬＰ－１およびＧＩＰ遺伝子について、ＶＤＲＥを含む約１００ｂｐを増幅するようにＰＣＲプライマーを設計し、クロマチン免疫沈降法によるＶＤＲとの結合解析を行った。クロマチン免疫沈降はＣｈＩＰ－ＩＴ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆＣｈＩＰ－ＩＴ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓＣｈＩＰ－ＩＴ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ）を用いて行った。なお、クロマチン免疫沈降法は、ホルムアルデヒド等を用いて細胞内でＤＮＡとタンパク質を架橋し、目的のタンパク質に対する特異的な抗体を使った免疫沈降法と組み合わせることで、細胞内に実際に存在するクロマチンＤＮＡ上でのＤＮＡとタンパク質の相互作用を検出する方法である。ホルムアルデヒド等によりＤＮＡと目的のタンパク質の架橋を行い、目的のタンパク質に対する抗体で免疫沈降を行った後、可逆反応により架橋を外し、タンパク質を除き、ＤＮＡ断片を回収する。回収されたＤＮＡを鋳型にして、目的のＤＮＡ配列の特異的プライマーを用いてＰＣＲで解析を行う。本試験において反応に用いたゲノムＤＮＡは上記４（ＶＤ摂取によるインクレチン産生の促進）の項に記載した通りの方法で単離採取したマウス小腸細胞より抽出した。結果を図６に示す。ＧＬＰ－１およびＧＩＰ遺伝子近傍にはＶＤＲと結合する可能性のある配列があり、これらモチーフへのＶＤＲの結合が強く示唆された。
【0039】
６．ＷＴマウスの耐糖能（ＯＧＴ）に対する１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ＶＤ３の効果（急性）
１６時間絶食させたＷＴマウス（Ｃ５７ＢＬ６）を２群に分け、試料投与群（ｎ＝１０）に２－ＤＧグルコース溶液（２００ｍｇ／ｍＬ；グルコースの投与用量 ２ｇ／ｋｇ）および１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ＶＤ３（４００ ｎＭ；１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ＶＤ３の投与量 約１．６７μｇ／ｋｇ）を同時経口投与した。対照群（ｎ＝７）には２－ＤＧグルコース（２ｇ／ｋｇ）および等量の試料を溶かしたＥｔＯＨ（最終濃度は０．１％）を経口投与した。試料投与直前及び糖投与後１５、３０、６０、１２０分後に尾静脈から採血を行い、血糖値を測定した（ＯＧＴＴ）。結果を図７に示す。血糖値の測定にはＯｎｅＴｏｕｃｈ ＵｌｔｒａＶｕｅ（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）を用いた。グルコース溶液投与１５分後に尾静脈から採血し、血液はヘマトクリット毛細管、あるいは分解阻害剤（アプロチニンＥＤＴＡ、ＤｉｐｒｏｔｉｎＡ）入りの血清分離用チューブに回収し、３０００ｒｐｍ（冷却遠心機 ＴＯＭＹ ＡＸ－３２０）、４℃、１５分間遠心分離して血漿を回収した。血漿インスリン、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ濃度の測定にはそれぞれＥＬＩＳＡ測定キット（モリナガ、ａｂｃａｍ、又は矢内原研究所）を用いて、製造者のインストラクションに従って測定した。その結果、図８に示すとおり、１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ＶＤ３溶液投与群は、溶媒（０．１％ ＥｔＯＨ）を投与したコントロールに比較して、グルコース経口投与１５分後の血漿インスリン、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ濃度をいずれも有意に亢進させ、図７に示すように血糖値の上昇を抑制していることが明らかとなった。なお、図７において、実線は１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ＶＤ３投与群、点線は非投与群の結果を示している。
１６時間絶食させたＷＴマウス（Ｃ５７ＢＬ６）を２群に分け、試料投与群（ｎ＝１０）に２－ＤＧグルコース溶液（２００ｍｇ／ｍＬ；グルコースの投与用量 ２ｇ／ｋｇ）および１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ＶＤ３（４００ ｎＭ；１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ＶＤ３の投与量 約１．６７μｇ／ｋｇ）を同時経口投与した。対照群（ｎ＝７）には２－ＤＧグルコース（２ｇ／ｋｇ）および等量の試料を溶かしたＥｔＯＨ（最終濃度は０．１％）を経口投与した。試料投与直前及び糖投与後１５、３０、６０、１２０分後に尾静脈から採血を行い、血糖値を測定した（ＯＧＴＴ）。結果を図７に示す。血糖値の測定にはＯｎｅＴｏｕｃｈ ＵｌｔｒａＶｕｅ（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）を用いた。グルコース溶液投与１５分後に尾静脈から採血し、血液はヘマトクリット毛細管、あるいは分解阻害剤（アプロチニンＥＤＴＡ、ＤｉｐｒｏｔｉｎＡ）入りの血清分離用チューブに回収し、３０００ｒｐｍ（冷却遠心機 ＴＯＭＹ ＡＸ－３２０）、４℃、１５分間遠心分離して血漿を回収した。血漿インスリン、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ濃度の測定にはそれぞれＥＬＩＳＡ測定キット（モリナガ、ａｂｃａｍ、又は矢内原研究所）を用いて、製造者のインストラクションに従って測定した。その結果、図８に示すとおり、１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ＶＤ３溶液投与群は、溶媒（０．１％ ＥｔＯＨ）を投与したコントロールに比較して、グルコース経口投与１５分後の血漿インスリン、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ濃度をいずれも有意に亢進させ、図７に示すように血糖値の上昇を抑制していることが明らかとなった。なお、図７において、実線は１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ＶＤ３投与群、点線は非投与群の結果を示している。
【0040】
７．１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ＶＤ３のインスリン分泌促進効果
マウスの単離膵島でのインスリン分泌実験を既報（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１６，１５７（１２）：４６９１－４７０５）に記載の通り行った。麻酔下のＣ５７ＢＬ６マウス（１０週齢）を開腹し、十二指腸開口部を結紮した膵管に肝臓側の総胆管よりコラゲナーゼ液を注入し（１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ液：コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）／Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ））膵臓を満たした。３７℃でインキュベーションして膵臓組織を消化した後、比重遠心分離にて膵島を単離し、実体顕微鏡下でｈａｎｄ ｐｉｃｋ ｕｐにて回収した。単離膵島を２日間培養後、３．３ｍＭのグルコースを含むＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＢＨ）バッファーにて３７℃３０分インキュベーションし、実体顕微鏡下で膵島５個ずつ選別し、３．３または１６．７ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）のグルコースを含むＫＲＢＨバッファーあるいはそれらに１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ＶＤ３（１００ｎＭ）を添加したものに３７℃３０分反応させた。反応終了後、上清を採取し、インスリンＥＬＩＳＡキット（モリナガ）にてインスリン量を定量した。その結果、ＶＤは低グルコース条件（３．３ｍＭ）ではインスリン分泌を促進しなかったが、高グルコース条件（１６．７ｍＭ）では有意にインスリン分泌を亢進した（図９）。ＶＤはグルコース濃度依存的に、高グルコース条件でのみインスリン分泌を促進することが明らかとなった。
マウスの単離膵島でのインスリン分泌実験を既報（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１６，１５７（１２）：４６９１－４７０５）に記載の通り行った。麻酔下のＣ５７ＢＬ６マウス（１０週齢）を開腹し、十二指腸開口部を結紮した膵管に肝臓側の総胆管よりコラゲナーゼ液を注入し（１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ液：コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）／Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ））膵臓を満たした。３７℃でインキュベーションして膵臓組織を消化した後、比重遠心分離にて膵島を単離し、実体顕微鏡下でｈａｎｄ ｐｉｃｋ ｕｐにて回収した。単離膵島を２日間培養後、３．３ｍＭのグルコースを含むＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＢＨ）バッファーにて３７℃３０分インキュベーションし、実体顕微鏡下で膵島５個ずつ選別し、３．３または１６．７ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）のグルコースを含むＫＲＢＨバッファーあるいはそれらに１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ＶＤ３（１００ｎＭ）を添加したものに３７℃３０分反応させた。反応終了後、上清を採取し、インスリンＥＬＩＳＡキット（モリナガ）にてインスリン量を定量した。その結果、ＶＤは低グルコース条件（３．３ｍＭ）ではインスリン分泌を促進しなかったが、高グルコース条件（１６．７ｍＭ）では有意にインスリン分泌を亢進した（図９）。ＶＤはグルコース濃度依存的に、高グルコース条件でのみインスリン分泌を促進することが明らかとなった。
【0041】
８．筋肉の糖取り込み試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
Ｃ５７ＢＬ６マウスよりヒラメ筋（Ｓｏｌｕｅｓ）と長趾伸筋（ＥＤＬ）を直ちに取り出し、既報（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００５，２８０：３９０３３－３９０４１）に記載の通りの処置を行った（ｎ＝６～１０／グループ）。各筋肉の両端にある腱を縫合糸で結び、インキュベーション装置に取り付け、２ｍＭピルビン酸を含むＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸（ＫＲＢ）バッファー６ｍＬ中で２０分間、プレインキュベートした。次に、４００μＵ／ｍＬのインシュリン、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ、ＶＤ（活性型ビタミンＤ）を上記既報中の図１２に示した組合せで添加し、ＫＲＢバッファー中で３０分間インキュベートした。実験中バッファーは３７℃に維持され、また、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２のガスを連続的に供給した。インキュベーション後すぐに筋肉は同濃度のインシュリンと、１ｍＭの２－デオキシ－グルコースを含むＫＲＢバッファーに移し、１０分間、既報（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００８，５７，２９５８－２９６６）のとおりにインキュベートした。インキュベート終了後、筋肉は液体窒素中で凍結保存した。糖取り込み量の定量時は、凍結した筋肉サンプルを圧縮破砕した後にｌｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５， １％ＮＰ－４０， １０ｍＭ β－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ５ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７， １０ｍＭ ＮａＦ， １ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４， １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０， ５μｇ／ｍＬ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ， １０μｇ／ｍＬ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ， ３ｍＭ Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ， １ｍＭ ＰＭＳＦ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ７５．４７％ ｄｄＨ２Ｏ）を加え、ポリトロンホモジェナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ）で完全破砕した。この懸濁液を遠心分離（１３０００Ｇ、１５分間、４℃）し、上清を組織溶解液として回収した。その回収液を、２－ＤＧ代謝速度測定キット（コスモバイオ）を用いた２－デオキシ－グルコースの定量に供し、筋肉の糖取り込み量とした。結果を図１０に示す。
Ｃ５７ＢＬ６マウスよりヒラメ筋（Ｓｏｌｕｅｓ）と長趾伸筋（ＥＤＬ）を直ちに取り出し、既報（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００５，２８０：３９０３３－３９０４１）に記載の通りの処置を行った（ｎ＝６～１０／グループ）。各筋肉の両端にある腱を縫合糸で結び、インキュベーション装置に取り付け、２ｍＭピルビン酸を含むＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸（ＫＲＢ）バッファー６ｍＬ中で２０分間、プレインキュベートした。次に、４００μＵ／ｍＬのインシュリン、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ、ＶＤ（活性型ビタミンＤ）を上記既報中の図１２に示した組合せで添加し、ＫＲＢバッファー中で３０分間インキュベートした。実験中バッファーは３７℃に維持され、また、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２のガスを連続的に供給した。インキュベーション後すぐに筋肉は同濃度のインシュリンと、１ｍＭの２－デオキシ－グルコースを含むＫＲＢバッファーに移し、１０分間、既報（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００８，５７，２９５８－２９６６）のとおりにインキュベートした。インキュベート終了後、筋肉は液体窒素中で凍結保存した。糖取り込み量の定量時は、凍結した筋肉サンプルを圧縮破砕した後にｌｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５， １％ＮＰ－４０， １０ｍＭ β－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ５ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７， １０ｍＭ ＮａＦ， １ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４， １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０， ５μｇ／ｍＬ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ， １０μｇ／ｍＬ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ， ３ｍＭ Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ， １ｍＭ ＰＭＳＦ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ７５．４７％ ｄｄＨ２Ｏ）を加え、ポリトロンホモジェナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ）で完全破砕した。この懸濁液を遠心分離（１３０００Ｇ、１５分間、４℃）し、上清を組織溶解液として回収した。その回収液を、２－ＤＧ代謝速度測定キット（コスモバイオ）を用いた２－デオキシ－グルコースの定量に供し、筋肉の糖取り込み量とした。結果を図１０に示す。
【0042】
図１０に示すとおり、ヒラメ筋においては、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ単独ではコントロールとの差が見られなかったものの、ＧＬＰ－１とＶＤ（活性型ビタミンＤ）を組合せて処理した場合には、糖取り込みが顕著に増加した。ＧＩＰの方は、ＶＤと組み合わせて処理しても、コントロールとの差が見られなかった。一方、長趾伸筋においては、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ単独ではコントロールとの差が見られなかったものの、ＧＬＰ－１とＶＤ（活性型ビタミンＤ）、或いはＧＩＰとＶＤ（活性型ビタミンＤ）を組合せて処理した場合には、糖取り込みが顕著に増加した。なお、いずれの試験においても、ポジティブコントロールでもあるインシュリンの処理では、コントロールと比較して、糖取り込みが顕著に増加しており、実験が正常に行われていることが示されている。
【0043】
以上のとおり、インクレチンにＶＤを組合せて直接筋肉に作用させることで、筋肉への糖取り込みを顕著に増加させることができることがわかった。
【0044】
９．筋肉細胞におけるＶＤＲ、ＧＬＰ－１Ｒ、ＧＩＰＲのｍＲＮＡ発現の解析
Ｃ５７ＢＬ６マウスの下肢よりヒラメ筋（Ｓｏｌｕｅｓ）と長趾伸筋（ＥＤＬ）を直ちに取り出した。それぞれから、常法に従ってｍＲＮＡを抽出し、ＶＤＲ、ＧＬＰ－１Ｒ、ＧＩＰＲのｍＲＮＡ発現量を測定した。その結果を図１１に示す。斜線のバーはヒラメ筋（Ｓｏｌｕｅｓ）、白いバーは長趾伸筋（ＥＤＬ）における各受容体のｍＲＮＡ発現レベルである。
Ｃ５７ＢＬ６マウスの下肢よりヒラメ筋（Ｓｏｌｕｅｓ）と長趾伸筋（ＥＤＬ）を直ちに取り出した。それぞれから、常法に従ってｍＲＮＡを抽出し、ＶＤＲ、ＧＬＰ－１Ｒ、ＧＩＰＲのｍＲＮＡ発現量を測定した。その結果を図１１に示す。斜線のバーはヒラメ筋（Ｓｏｌｕｅｓ）、白いバーは長趾伸筋（ＥＤＬ）における各受容体のｍＲＮＡ発現レベルである。
【0045】
図１１に示すとおり、ヒラメ筋（Ｓｏｌｕｅｓ）では、ＶＤＲ、ＧＬＰ－１ＲのｍＲＮＡ発現レベルが、長趾伸筋（ＥＤＬ）と比較して顕著に高いことがわかった。一方、ＧＩＰＲのｍＲＮＡ発現レベルは、両者で差が見られなかった。この結果は、上記筋肉の糖取り込み試験において、ヒラメ筋では、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ単独ではコントロールとの差が見られなかったものの、ＧＬＰ－１とＶＤ（活性型ビタミンＤ）を組合せて処理した場合には、糖取り込みが顕著に増加し、ＧＩＰの方は、ＶＤと組み合わせて処理しても、コントロールとの差が見られなかったという結果と整合している。
【0046】
１０．下肢骨格筋におけるミオシンＴｙｐｅＩ、ミオシンＴｙｐｅＩＩＡ、ＧＬＰ－１Ｒの発現解析（組織染色）
Ｃ５７ＢＬ６マウスより、下肢骨格筋を直ちに取り出して包埋し、凍結した。常法に従って凍結切片を作成し、４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）リン酸緩衝液で固定した。各切片を１次抗体（抗ミオシンＴｙｐｅＩ抗体、抗ミオシンＴｙｐｅＩＩＡ抗体（いずれもＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ（ＤＳＨＢ）社製）、抗ＧＬＰ－１Ｒ抗体（Ａｂｃａｍ社製））で処理した。引き続き、抗ミオシンＴｙｐｅＩ抗体、抗ミオシンＴｙｐｅＩＩＡ抗体に結合するＡｌｅｘａ４８８（Ｇｒｅｅｎ）標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、抗ＧＬＰ－１Ｒ抗体に結合するＡｌｅｘａ５９４（Ｒｅｄ）標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で処理した。得られた組織染色サンプルを蛍光顕微鏡で観察した結果を図１２に示す。
Ｃ５７ＢＬ６マウスより、下肢骨格筋を直ちに取り出して包埋し、凍結した。常法に従って凍結切片を作成し、４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）リン酸緩衝液で固定した。各切片を１次抗体（抗ミオシンＴｙｐｅＩ抗体、抗ミオシンＴｙｐｅＩＩＡ抗体（いずれもＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ（ＤＳＨＢ）社製）、抗ＧＬＰ－１Ｒ抗体（Ａｂｃａｍ社製））で処理した。引き続き、抗ミオシンＴｙｐｅＩ抗体、抗ミオシンＴｙｐｅＩＩＡ抗体に結合するＡｌｅｘａ４８８（Ｇｒｅｅｎ）標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、抗ＧＬＰ－１Ｒ抗体に結合するＡｌｅｘａ５９４（Ｒｅｄ）標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で処理した。得られた組織染色サンプルを蛍光顕微鏡で観察した結果を図１２に示す。
【0047】
骨格筋の筋線維は、収縮速度の遅い遅筋（主に長時間の持続的な運動に適す；ミオシンＴｙｐｅＩ）と収縮速度の速い速筋（瞬発的な運動を行うときに活躍する；ミオシンＴｙｐｅＩＩＡ、Ｂ、Ｘ）に分類され、異なるタイプの筋線維がモザイク状に分布している。図１２に示すとおり、ヒラメ筋（Ｓｏｌｅｕｓ：ＳＯＬ）には、主にミオシンＴｙｐｅＩと速筋線維の中でもやや持続的収縮に向いたＴｙｐｅＩＩＡが発現していることがわかる。一方、足底筋（Ｐｌａｎｔａｒｉｓ：ＰＬＡ）では、ミオシンＴｙｐｅＩよりミオシンＴｙｐｅＩＩＡの発現が強く、速筋が多いことがわかる。また、ヒラメ筋における各抗ＧＬＰ－１Ｒ抗体と各ミオシン抗体との二重染色の結果、筋線維ＴｙｐｅＩ及びＴｙｐｅＩＩＡのいずれもＧＬＰ－１Ｒを発現していることがわかった。以上より、骨格筋ではＧＬＰ－１Ｒが発現していること、特にヒラメ筋においては、筋線維ＴｙｐｅＩ及びＴｙｐｅＩＩＡのいずれにおいてもＧＬＰ－１Ｒの発現が顕著であることがわかり、図１１の試験結果でヒラメ筋においてＧＬＰ－１Ｒの発現が顕著であるという結果と整合する。糖尿病の治療では、運動療法（食後のウォーキングなどの有酸素運動）が糖取り込みを促進させるために良いと言われてきたが、これには、骨格筋（特に遅筋細胞）に発現しているＧＬＰ－１Ｒを介したＧＬＰ－１の作用と、ビタミンＤの作用が、筋肉を動かすことによってより活発化して糖取り込みを促進することが関係しているのではないかと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【0048】
本発明によると、ビタミンＤ及び／又はビタミンＤ誘導体を使用することにより、ＧＬＰ－１等のインクレチンの産生を促進することができる。また、ビタミン及び／又はビタミンＤ誘導体を使用することにより筋肉細胞への糖取り込みを亢進することもできる。本発明のインクレチン産生促進剤、糖取り込み促進剤は、単独で、又は従来の糖尿病薬と組み合わせて、新しいタイプの、より有効性の高い糖尿病薬として好適に用いられ得る。また、ビタミンＤ及び／又はビタミンＤ誘導体を有効成分とすることから、安全性にも優れている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
