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特開2023-75196結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染の診断および治療のための新規な抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭモノクローナル抗体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023075196
(43)【公開日】2023-05-30
(54)【発明の名称】結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染の診断および治療のための新規な抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭモノクローナル抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/12 20060101AFI20230523BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230523BHJP
A61P 31/06 20060101ALI20230523BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230523BHJP
【ＦＩ】
C07K16/12 ZNA
A61K39/395 N
A61P31/06
A61K45/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023031004
(22)【出願日】2023-03-01
(62)【分割の表示】P 2021063301の分割
【原出願日】2017-02-01
(31)【優先権主張番号】62/293,406
(32)【優先日】2016-02-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
２．ＳＰＡＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517349186
【氏名又は名称】ラトガース ザ ステイト ユニバーシティー オブ ニュージャージー
(74)【代理人】
【識別番号】110001302
【氏名又は名称】弁理士法人北青山インターナショナル
(72)【発明者】
【氏名】ピンター，アブラハム
(72)【発明者】
【氏名】チョードリー，アロック
(57)【要約】 （修正有）
【課題】結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染の診断および治療のための新規な抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を提供する。
【解決手段】Ａｒａ４構造、Ａｒａ６構造、またはそれらの組み合わせを含むＬＡＭエピトープに特異的に結合する、ヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分において、前記抗－ＬＡＭ抗体が、それぞれ特定の配列またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、ＣＤＲ２可変軽領域、ＣＤＲ３可変軽領域、ＣＤＲ１可変重領域、ＣＤＲ２可変重領域、およびＣＤＲ３可変重領域を含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗－リポアラビノマンナン抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】Ａｒａ４構造、Ａｒａ６構造、またはそれらの組み合わせを含むＬＡＭエピトープに特異的に結合する、ヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分において、前記抗－ＬＡＭ抗体が、それぞれ特定の配列またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、ＣＤＲ２可変軽領域、ＣＤＲ３可変軽領域、ＣＤＲ１可変重領域、ＣＤＲ２可変重領域、およびＣＤＲ３可変重領域を含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗－リポアラビノマンナン抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ａｒａ４構造、Ａｒａ６構造、またはそれらの組み合わせを含むＬＡＭエピトープに特異的に結合する、ヒトモノクローナル抗－リポアラビノマンナン（抗－ＬＡＭ）抗体、またはその抗原結合部分において、前記抗－ＬＡＭ抗体が、配列番号１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号３もしくは配列番号２６またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号４またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号５またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号６もしくは配列番号２３またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗－リポアラビノマンナン抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項2】
請求項１に記載のヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体が、配列番号２１および配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２４および配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項3】
請求項１に記載のヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分において、前記抗－ＬＡＭ抗体が、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、およびＩｇＧａまたはＩｇＭ抗体であることを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項4】
マンノースでキャッピングされたＡｒａ４構造およびマンノースでキャッピングされたＡｒａ６構造の少なくとも１つを含むＬＡＭエピトープに特異的に結合することを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項5】
請求項４に記載のヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分において、前記抗－ＬＡＭ抗体が、配列番号７またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号８またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号９もしくは配列番号３２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号１０またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号１１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号１２もしくは配列番号２９またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項6】
請求項５に記載のヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体が、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項7】
請求項５に記載のヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分において、前記抗－ＬＡＭ抗体がＩｇＭまたはＩｇＡ抗体であることを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項8】
Ａｒａ４またはＡｒａ６の非還元末端で付着されたα－Ｍａｎｐ（１→２）連結構造を含むＬＡＭエピトープに特異的に結合する、ヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分において、前記抗－ＬＡＭ抗体が、配列番号７またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号８またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号９またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号１０またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号１１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号１２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項9】
請求項８に記載のヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分において、前記抗－ＬＡＭ抗体がＩｇＭまたはＩｇＡ抗体であることを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項10】
少なくとも１つのポリマンノース構造を含む、ＬＡＭおよびＰＩＭ６中に存在するエピトープに特異的に結合することを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項11】
請求項１０に記載のヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分において、前記エピトープがＰＩＭ６マンナンドメイン内に存在し、かつマイコバクテリアのリポマンナン（ＬＭ）中にも存在することを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項12】
請求項１０に記載のヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分において、前記抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体が、配列番号１３またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号１４またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号１５またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号１６またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号１７またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号１８またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項13】
請求項１０に記載のヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分において、前記抗体が、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項14】
請求項１２に記載のヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分において、前記抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体がＩｇＭ抗体であることを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項15】
請求項１２に記載のヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分において、前記抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体がＩｇＡまたはＩｇＧ抗体であることを特徴とするヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項16】
少なくとも１つのＬＡＭエピトープを検出するためのキットにおいて、
（ａ）ＬＡＭエピトープに特異的に結合する少なくとも第１の抗－ＬＡＭ抗体；
（ｂ）前記少なくとも第１の抗－ＬＡＭ抗体が結合される支持体；
（ｃ）ＬＡＭに特異的に、または前記少なくとも第１の抗－ＬＡＭ抗体に特異的に結合する、レポーター分子で標識された検出抗体；および
（ｄ）緩衝液
を含み、ここで前記少なくとも第１の抗－ＬＡＭ抗体が請求項１、５または８に記載のヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体であることを特徴とするキット。
（ａ）ＬＡＭエピトープに特異的に結合する少なくとも第１の抗－ＬＡＭ抗体；
（ｂ）前記少なくとも第１の抗－ＬＡＭ抗体が結合される支持体；
（ｃ）ＬＡＭに特異的に、または前記少なくとも第１の抗－ＬＡＭ抗体に特異的に結合する、レポーター分子で標識された検出抗体；および
（ｄ）緩衝液
を含み、ここで前記少なくとも第１の抗－ＬＡＭ抗体が請求項１、５または８に記載のヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体であることを特徴とするキット。
【請求項17】
請求項１６に記載のキットにおいて、前記検出抗体がＬＡＭに特異的に結合する第２の抗－ＬＡＭ抗体であることを特徴とするキット。
【請求項18】
請求項１７に記載のキットにおいて、前記第１の抗－ＬＡＭ抗体および前記第２の抗－ＬＡＭ抗体の少なくとも１つがｓｃＦｖ－ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体であり、かつ配列番号１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号３もしくは配列番号２６またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号４またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号５またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号６もしくは配列番号２３またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含むことを特徴とするキット。
【請求項19】
請求項１８に記載のキットにおいて、前記第１の抗－ＬＡＭ抗体および前記第２の抗－ＬＡＭ抗体の少なくとも１つが、配列番号２１および配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２４および配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とするキット。
【請求項20】
個体における活動性結核感染を診断する方法において、
（ａ）ＬＡＭを含むかまたは含むことが疑われる個体から試料を得るステップと；
（ｂ）個体のＬＡＭエピトープを曝露するように前記試料を処理するステップと；
（ｃ）前記試料を、前記ＬＡＭ上の第１のエピトープに特異的に結合する少なくとも第１の抗体と接触させるステップと；
（ｄ）前記試料を、ＬＡＭに特異的に、または前記少なくとも第１の抗体に特異的に結合する検出抗体と接触させるステップと；
（ｅ）前記少なくとも第１の抗体のＬＡＭ上の前記第１のエピトープへの結合を検出するステップと；
（ｆ）前記患者を活動性結核感染を有すると診断するステップと、
を含むことを特徴とし、ここで前記少なくとも第１の抗体のＬＡＭ上の前記第１のエピトープへの前記結合が活動性結核感染を示し、かつ
前記少なくとも第１の抗体が、請求項１、５または８に記載のヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体、または請求項１２に記載のヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である、方法。
（ａ）ＬＡＭを含むかまたは含むことが疑われる個体から試料を得るステップと；
（ｂ）個体のＬＡＭエピトープを曝露するように前記試料を処理するステップと；
（ｃ）前記試料を、前記ＬＡＭ上の第１のエピトープに特異的に結合する少なくとも第１の抗体と接触させるステップと；
（ｄ）前記試料を、ＬＡＭに特異的に、または前記少なくとも第１の抗体に特異的に結合する検出抗体と接触させるステップと；
（ｅ）前記少なくとも第１の抗体のＬＡＭ上の前記第１のエピトープへの結合を検出するステップと；
（ｆ）前記患者を活動性結核感染を有すると診断するステップと、
を含むことを特徴とし、ここで前記少なくとも第１の抗体のＬＡＭ上の前記第１のエピトープへの前記結合が活動性結核感染を示し、かつ
前記少なくとも第１の抗体が、請求項１、５または８に記載のヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体、または請求項１２に記載のヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である、方法。
【請求項21】
請求項２０に記載の方法において、前記検出抗体がＬＡＭに特異的に結合する抗－ＬＡＭ抗体であることを特徴とする方法。
【請求項22】
請求項２１に記載の方法において、前記少なくとも第１の抗体および前記検出抗体が各々、配列番号１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号３もしくは配列番号２６またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号４またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号５またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号６もしくは配列番号２３またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項23】
請求項２１に記載の方法において、前記一次抗体および前記検出抗体の少なくとも１つが、ｓｃＦｖ－ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体であり、かつ配列番号１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有する可変軽領域を有するＣＤＲ１領域、配列番号２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号３もしくは配列番号２６またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号４またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号５またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号６もしくは配列番号２３またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含むことを特徴とする方法。
【請求項24】
請求項２０に記載の方法において、前記個体がヒトであることを特徴とする方法。
【請求項25】
個体における結核感染を治療する方法において、請求項１、５または８に記載の少なくとも１つのヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体、または請求項１２に記載のヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体を治療有効量で前記個体に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項26】
請求項２５に記載の方法において、少なくとも１つの抗生物質を治療有効量で前記個体に投与するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項27】
請求項２５に記載の方法において、前記結核感染が多剤耐性（ＭＤＲ－ＴＢ）結核感染であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２９３，４０６号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）に対する優先権を主張する。
本願は、２０１６年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２９３，４０６号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）に対する優先権を主張する。
【0002】
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染の診断、予防および治療のための、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）リポマンナン（ＬＭ）およびホスファチジル－ミオ－イノシトールマンノシド６（ＰＩＭ６）にて見出されるエピトープに特異的な抗体を含む組成物、キット、ベクター、および方法が本明細書に記載される。
【0003】
配列表
本願は、ＥＦＳ－ＷＥＢを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出されている配列表を含み、ここでその全体が参照により援用される。２０１７年２月１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０９６７４７．００３３７＿ＳＴ２５．ｔｘｔと称され、サイズは２９，０９７バイトである。
本願は、ＥＦＳ－ＷＥＢを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出されている配列表を含み、ここでその全体が参照により援用される。２０１７年２月１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０９６７４７．００３３７＿ＳＴ２５．ｔｘｔと称され、サイズは２９，０９７バイトである。
【背景技術】
【0004】
Ａ．結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
結核（ＴＢ）は、現在世界人口の約３分の１に感染する、世界的な史上最悪の感染性疾患の１つであり続けている。ＷＨＯ Ｇｌｏｂａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔ，２０１４：Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによると、２０１３年、推定上９００万人がＴＢを発症し、１，５００万人がその疾患で死亡した。現在、ＴＢに対する有効な薬物が利用可能であるが、これらは複数の抗生物質を用いた長期間の治療を必要とし、最近の感染の約３．５％に現在関与している多剤耐性（ＭＤＲ－ＴＢ）株の発生により易感染性が高まっている。これらの株は、治療がはるかに困難化し、有意に低下した治癒率を有している。また広範囲薬剤耐性ＴＢ（ＸＤＲ－ＴＢ）株が伝播しており、それは治療がＭＤＲ－ＴＢ株よりもさらに高価になりかつ困難化し、今や世界中１００か国で報告されている。結果的に、ＴＢ感染のより早期の診断および治療のための新しい手法が必要とされている。
結核（ＴＢ）は、現在世界人口の約３分の１に感染する、世界的な史上最悪の感染性疾患の１つであり続けている。ＷＨＯ Ｇｌｏｂａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔ，２０１４：Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによると、２０１３年、推定上９００万人がＴＢを発症し、１，５００万人がその疾患で死亡した。現在、ＴＢに対する有効な薬物が利用可能であるが、これらは複数の抗生物質を用いた長期間の治療を必要とし、最近の感染の約３．５％に現在関与している多剤耐性（ＭＤＲ－ＴＢ）株の発生により易感染性が高まっている。これらの株は、治療がはるかに困難化し、有意に低下した治癒率を有している。また広範囲薬剤耐性ＴＢ（ＸＤＲ－ＴＢ）株が伝播しており、それは治療がＭＤＲ－ＴＢ株よりもさらに高価になりかつ困難化し、今や世界中１００か国で報告されている。結果的に、ＴＢ感染のより早期の診断および治療のための新しい手法が必要とされている。
【0005】
Ｂ．リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）
糖脂質リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体のメンバーの細胞壁の主要な構成および抗原成分であり、それは増殖性感染および疾患の発生を促進する幾つかの重要な機能を媒介する。ＬＡＭはまた、特にＨＩＶ－１に同時感染した患者において、ＴＢによる活動性感染を検出するための重要な免疫診断標的、および有望なワクチン標的である。ＬＡＭの免疫診断標的としての重要性および結核菌（Ｍ．ｔｂ）感染の生理および病原性におけるその有意義な役割にもかかわらず、意外にもこの抗原に向けてのヒト体液性応答の性質についてはほとんど知られていない。以前に利用可能なＬＡＭに特異的なモノクローナル抗体は、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）または結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のいずれかから精製されたＬＡＭで免疫されたマウスから得られており、免疫または結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による感染のいずれかに応答して誘導されているＬＡＭに対するヒトモノクローナル抗体については全く記載がなされていない。
糖脂質リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体のメンバーの細胞壁の主要な構成および抗原成分であり、それは増殖性感染および疾患の発生を促進する幾つかの重要な機能を媒介する。ＬＡＭはまた、特にＨＩＶ－１に同時感染した患者において、ＴＢによる活動性感染を検出するための重要な免疫診断標的、および有望なワクチン標的である。ＬＡＭの免疫診断標的としての重要性および結核菌（Ｍ．ｔｂ）感染の生理および病原性におけるその有意義な役割にもかかわらず、意外にもこの抗原に向けてのヒト体液性応答の性質についてはほとんど知られていない。以前に利用可能なＬＡＭに特異的なモノクローナル抗体は、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）または結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のいずれかから精製されたＬＡＭで免疫されたマウスから得られており、免疫または結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による感染のいずれかに応答して誘導されているＬＡＭに対するヒトモノクローナル抗体については全く記載がなされていない。
【0006】
リポマンナン（ＬＭ）は、ＬＡＭに対する即時型前駆物質であり、アラビノース側鎖でなく、短いα（１→２）－マンノピラノシル側鎖と置換されたα（１→６）連結Ｍａｎｐ骨格からなるマンナンドメインにより修飾されたホスファチジル－ミオ－イノシトールドメインを有する。
【0007】
Ｃ．ホスファチジル－ミオ－イノシトールマンノシド６（ＰＩＭ６）
ＰＩＭ６は、ＬＭおよびＬＡＭに共通の前駆物質であるＰＩＭ２の産物である。これらの分子のコアは、２および６位でＭａｎｐ単位でグリコシル化されたミオ－イノシトール構造である。ＰＩＭ６では、６位でのＭａｎｐ単位は、ＭａｎＬＡＭ上のマンノースキャップに一致する２つの末端α－Ｍａｎｐ（１→２）連結糖によりさらに置換される。これらの分子は、４もの脂肪酸鎖によりアシル化され、イノシトール頭部基およびコアＭａｎ残基に付着され、これらの分子は細胞エンベロープの内膜および外膜に非共有結合的に固定される。ＰＩＭ６は、Ｃ型レクチンおよびＤＣ－ＳＩＧＮ（樹状細胞上の主要な受容体）に結合し、かつ強力な抗炎症活性を有するＨＩＶ複製の強力なＴＬＲ２作動薬およびエンハンサーであることが報告された。
ＰＩＭ６は、ＬＭおよびＬＡＭに共通の前駆物質であるＰＩＭ２の産物である。これらの分子のコアは、２および６位でＭａｎｐ単位でグリコシル化されたミオ－イノシトール構造である。ＰＩＭ６では、６位でのＭａｎｐ単位は、ＭａｎＬＡＭ上のマンノースキャップに一致する２つの末端α－Ｍａｎｐ（１→２）連結糖によりさらに置換される。これらの分子は、４もの脂肪酸鎖によりアシル化され、イノシトール頭部基およびコアＭａｎ残基に付着され、これらの分子は細胞エンベロープの内膜および外膜に非共有結合的に固定される。ＰＩＭ６は、Ｃ型レクチンおよびＤＣ－ＳＩＧＮ（樹状細胞上の主要な受容体）に結合し、かつ強力な抗炎症活性を有するＨＩＶ複製の強力なＴＬＲ２作動薬およびエンハンサーであることが報告された。
【発明の概要】
【0008】
本明細書に記載されるのは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染の診断および治療のための新規な抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の糖脂質に特異的なこれらの新規なヒト抗体、例えばＬＡＭエピトープに特異的なヒトｍＡｂ、およびＬＡＭおよびＰＩＭ６によって共有されるエピトープに特異的なヒトｍＡｂなどの単離および特徴づけが下記に記載される。
【0009】
したがって、本明細書に記載されるのは、Ａｒａ４構造、Ａｒａ６構造、またはそれらの組み合わせを含むＬＡＭエピトープに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－リポアラビノマンナン（抗－ＬＡＭ）抗体、またはその抗原結合部分であり、ここで抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号３もしくは配列番号２６またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号４またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号５またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号６もしくは配列番号２３またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含む。ヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２１および配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２４および配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。抗－ＬＡＭ抗体は、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、およびＩｇＧａまたはＩｇＭ抗体であり得る。抗－ＬＡＭ抗体の例として、Ａ１９４が挙げられる。
【0010】
さらに本明細書に記載されるのは、マンノースでキャッピングされたＡｒａ４構造およびマンノースでキャッピングされたＡｒａ６構造の少なくとも１つを含むＬＡＭエピトープに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはその抗原結合部分である。抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号７またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号８またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号９もしくは配列番号３２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号１０またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号１１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号１２もしくは配列番号２９またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含み得る。該抗体は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。抗－ＬＡＭ抗体は、例えばＩｇＭまたはＩｇＡ抗体であり得る。抗－ＬＡＭ抗体の例として、Ｐ３Ｂ０９が挙げられる。
【0011】
さらに本明細書に記載されるのは、Ａｒａ４またはＡｒａ６の非還元末端で付着されたα－Ｍａｎｐ（１→２）連結構造を含むＬＡＭエピトープに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分であり、ここで抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号７またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号８またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号９またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号１０またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号１１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号１２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含む。抗－ＬＡＭ抗体（例えばＰ３Ｂ０９）は、例えばＩｇＭまたはＩｇＡ抗体であり得る。
【0012】
さらに本明細書に記載されるのは、ＬＡＭおよびＰＩＭ６中に存在するエピトープに特異的に結合する、ヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分であり、ここでエピトープは、少なくとも１つのポリマンノース構造を含む。エピトープは、ＰＩＭ６マンナンドメイン内に存在し、かつマイコバクテリアのリポマンナン（ＬＭ）中にも存在する。抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、配列番号１３またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号１４またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号１５またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号１６またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号１７またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号１８またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含み得る。該抗体は、例えば、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＧ抗体であり得る。抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の例として、Ｐ９５Ｃ１が挙げられる。
【0013】
さらに本明細書に記載されるのは、少なくとも１つのＬＡＭエピトープを検出するためのキットである。キットは、（ａ）ＬＡＭエピトープに特異的に結合する少なくとも第１の抗－ＬＡＭ抗体；（ｂ）少なくとも第１の抗－ＬＡＭ抗体が結合される支持体；（ｃ）ＬＡＭに特異的に結合するか、または少なくとも第１の抗－ＬＡＭ抗体に特異的に結合する、レポーター分子で標識された検出抗体；および（ｄ）緩衝液、を含む。少なくとも第１の抗－ＬＡＭ抗体は、例えば本明細書に記載のようなヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体である。検出抗体は、例えばＬＡＭに特異的に結合する第２の抗－ＬＡＭ抗体であり得る。一部の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭ抗体および第２の抗－ＬＡＭ抗体の少なくとも１つは、ｓｃＦｖ－ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体であり、配列番号１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号３もしくは配列番号２６またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号４またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号５またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号６もしくは配列番号２３またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含む。キットの一部の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭ抗体および第２の抗－ＬＡＭ抗体の少なくとも１つは、配列番号２１および配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２４および配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0014】
さらに本明細書に記載されるのは、個体における活動性結核感染を診断する方法であって、（ａ）ＬＡＭを含むかまたは含むことが疑われる個体から試料を得るステップと；（ｂ）前記試料を個別のＬＡＭエピトープに曝露するように処理するステップと；（ｃ）前記試料を、前記ＬＡＭ上の第１のエピトープに特異的に結合する少なくとも第１の抗体と接触させるステップと；（ｄ）前記試料を、ＬＡＭに特異的に結合するか、または少なくとも第１の抗体に特異的に結合する検出抗体と接触させるステップと；（ｅ）少なくとも第１の抗体のＬＡＭ上の前記第１のエピトープへの結合を検出するステップと；（ｆ）前記患者を活動性結核感染を有するものとして診断するステップと、を含み、ここで少なくとも第１の抗体のＬＡＭ上の前記第１のエピトープへの結合が活動性結核感染を示す、方法である。少なくとも第１の抗体は、例えば、本明細書に記載のようなヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。検出抗体は、例えばＬＡＭに特異的に結合する抗－ＬＡＭ抗体であり得る。該方法の一部の実施形態では、少なくとも第１の抗体および検出抗体の各々は、配列番号１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号３もしくは配列番号２６またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号４またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号５またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号６もしくは配列番号２３またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含む。該方法の一部の実施形態では、一次抗体および検出抗体の少なくとも１つは、ｓｃＦｖ－ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体であり、配列番号１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有する可変軽領域を有するＣＤＲ１領域、配列番号２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号３もしくは配列番号２６またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号４またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号５またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号６もしくは配列番号２３またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含む。一部の実施形態では、個体はヒトである。
【0015】
さらに本明細書に記載されるのは、個体（例えばヒト）における結核感染を治療する方法である。該方法は、少なくとも１つの本明細書に記載のようなヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体を治療有効量で前記個体に投与するステップを含む。該方法は、少なくとも１つの抗生物質を治療有効量で前記個体に投与するステップをさらに含み得る。結核感染は、多剤耐性（ＭＤＲ－ＴＢ）結核感染であり得る。
【0016】
さらに本明細書に記載されるのは、本明細書に記載の抗体の重鎖および軽鎖（可変領域を含む）をコードするヌクレオチド配列である。
【0017】
Ａ．抗－ＬＡＭ抗体および抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体
一部の実施形態では、本発明は、抗－ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分を提供する。一部の実施形態では、本発明は、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分を提供する。本明細書に記載のような抗－ＬＡＭ抗体（またはその抗原結合部分）は、ＬＡＭエピトープに特異的に結合する。本明細書に記載のような抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体（またはその抗原結合部分）は、ＬＡＭエピトープおよびＰＩＭ６エピトープの双方に特異的に結合する。一部の実施形態では、ＬＡＭおよびＰＩＭ６エピトープは、様々なマイコバクテリア種に由来する。さらなる実施形態では、様々なマイコバクテリア種は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性メンバーである。さらなる実施形態では、マイコバクテリア種は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。さらなる実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は各々、ヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は各々、ヒト化モノクローナル抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、Ａｒａ４およびＡｒａ６構造に結合する。
一部の実施形態では、本発明は、抗－ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分を提供する。一部の実施形態では、本発明は、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体、またはその抗原結合部分を提供する。本明細書に記載のような抗－ＬＡＭ抗体（またはその抗原結合部分）は、ＬＡＭエピトープに特異的に結合する。本明細書に記載のような抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体（またはその抗原結合部分）は、ＬＡＭエピトープおよびＰＩＭ６エピトープの双方に特異的に結合する。一部の実施形態では、ＬＡＭおよびＰＩＭ６エピトープは、様々なマイコバクテリア種に由来する。さらなる実施形態では、様々なマイコバクテリア種は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性メンバーである。さらなる実施形態では、マイコバクテリア種は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。さらなる実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は各々、ヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体またはヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は各々、ヒト化モノクローナル抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、Ａｒａ４およびＡｒａ６構造に結合する。
【0018】
一部の実施形態では、ＬＡＭエピトープは、キャップのないアラビノース鎖である。一部の実施形態では、ＬＡＭエピトープは、末端ＭＴＸ置換の有無にかかわらず、キャップのないまたは単一のマンノースでキャッピングされたアラビノース鎖である。
【0019】
一部の実施形態では、ＬＡＭエピトープは、マンノースでキャッピングされたＡｒａ４構造およびマンノースでキャッピングされたＡｒａ６構造である。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、Ａｒａ４／Ａｒａ６構造またはポリマンノース構造のいずれかに連結され得るα（１→２）連結ジマンノース構造に特異的に結合する（図８）。一部の実施形態では、ＰＩＭ６エピトープは、マイコバクテリアのリポマンナン（ＬＭ）中にも存在する少なくとも１つのポリマンノース構造を含む。一部の実施形態では、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＰＩＭ６マンナンドメイン内に少なくとも１つのポリマンノース構造を含むＰＩＭ６エピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、ＬＡＭエピトープは、少なくとも１つのメチルチオキシロース（ＭＴＸ）またはメチルシルフィニルキシロフラノシル（ｍｅｔｈｙｌｓｙｌｆｉｎｙｌｘｙｌｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）（ＭＳＸ）置換を含む。一部の実施形態では、ＬＡＭエピトープは、少なくとも１つのホスファチジル－ミオ－イノシトール置換（ＰＩＬＡＭ）を含む。一部の実施形態では、ＬＡＭエピトープは、少なくとも１つのマンノースでキャッピングされたアラビノース鎖、すなわち、マンノシル化Ｍａｎ－ＬＡＭエピトープである。さらなる実施形態では、キャッピングされたアラビノース鎖は、Ａｒａ４および／またはＡｒａ６構造を含む。一部の実施形態では、Ｍａｎ－ＬＡＭエピトープは、モノマンノース置換アラビノース鎖、ジマンノース置換アラビノース鎖、トリマンノース置換アラビノース鎖、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、Ｍａｎ－ＬＡＭエピトープは、ジマンノースまたはトリマンノースでキャッピングされたＡｒａ４および／またはＡｒａ６構造を含む。一部の実施形態では、Ｍａｎ－ＬＡＭエピトープは、ジマンノースでキャッピングされたＡｒａ６である。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＩｇＧ抗体を含む。さらなる実施形態では、ＩｇＧ抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３のサブクラスを含む。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＩｇＧ抗体でない。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＩｇＡ抗体を含む。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＩｇＭ抗体を含む。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、最初に単離されたアイソタイプからスイッチしている第２のアイソタイプを含む。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、組換え抗体を含む。一部の実施形態では、組換え抗体は、多価ＩｇＭ抗体を含む。さらなる実施形態では、組換え抗体は、五価ＩｇＭ抗体を含む。他の実施形態では、組換え抗体は、ＳｃＦｖ－ＩｇＧ抗体を含み、ここで１つの抗体の一本鎖Ｆｖ断片は、それかまたは異なる抗－ＬＡＭ ｍＡｂの重鎖のＮ末端に連結される。さらなる実施形態では、組換え抗体は、多価ＳｃＦｖ－ＩｇＧ抗体を含む。さらなる実施形態では、組換え抗体は、ｓｃＦｖドメインが構築物中に存在するＩｇＧの可変領域から誘導された、相同な四価ＳｃＦｖ－ＩｇＧ抗体を含む。さらなる実施形態では、組換え抗体は、ｓｃＦｖ領域が、含まれるＩｇＧ領域と異なる抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体から誘導された、異種の四量体ｓｃＦｖ－ＩｇＧ抗体を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖドメインは、前記抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の可変軽（ＶＬ）ドメインに連結された第２の抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の可変重（ＶＨ）領域に連結されたリーダー配列を含む。他の実施形態では、ｓｃＦｖドメインは、第２の抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の可変重（ＶＨ）領域に連結された第１の抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の可変軽鎖領域に連結されたリーダー配列を含む。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、ＬＡＭエピトープ（例えば、Ａｒａ４およびＡｒａ６またはそれらの組み合わせの１つ、Ａｒａ４／Ａｒａ６構造、またはポリマンノース構造のいずれかに連結され得るα（１→２）連結ジマンノース構造）に特異的に結合する単離された抗－ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、ＣＳ－３５およびＦＩＮＤ２５と競合しない。一部の実施形態では、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、マイコバクテリアのリポマンナン（ＬＭ）中の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合する単離された抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。
【0020】
一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、可動性リンカーを含む。一部の実施形態では、可動性リンカーは、対応する重鎖および軽鎖ドメインを一本鎖分子に連結する。一部の実施形態では、可動性リンカーは、免疫グロブリン軽鎖（ＩｇＶＬ）を免疫グロブリン重鎖（ＩｇＶＨ）に接続する。さらなる実施形態では、可動性リンカーは、式（ＧＧＳＧＧ）ｎ（配列番号１９）（式中、ｎは、１～２００の間、例えば、１～５、１～１０、１～１５、１～２５、１～５０、５～１０、５～２５、１０～２５、１０～５０、１～１００、１～１５０の間の任意の範囲、およびあらゆる介在範囲の任意の正の整数である）からなる。
【0021】
一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体（例えば、Ｐ３０Ｂ９、Ａ１９４－０１）は、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ１の可変軽領域は、本質的に配列番号１またはその抗原断片からなる。他の実施形態では、ＣＤＲ１領域の可変軽領域は、本質的に配列番号７またはその抗原断片からなる。他の実施形態では、ＣＤＲ１領域の可変軽領域は、本質的に配列番号１３またはその抗原断片からなる。一部の実施形態では、ＣＤＲ１の可変重領域は、本質的に配列番号４またはその抗原断片からなる。他の実施形態では、ＣＤＲ１領域の可変重領域は、本質的に配列番号１０またはその抗原断片からなる。他の実施形態では、ＣＤＲ１領域の可変重領域は、本質的に配列番号１６またはその抗原断片からなる。
【0022】
一部の実施形態では、ＣＤＲ２の可変軽領域は、本質的に配列番号２またはその抗原断片からなる。他の実施形態では、ＣＤＲ２の可変軽領域は、本質的に配列番号８またはその抗原断片からなる。他の実施形態では、ＣＤＲ２の可変軽領域は、本質的に配列番号１４またはその抗原断片からなる。一部の実施形態では、ＣＤＲ２の可変重領域は、本質的に配列番号５またはその抗原断片からなる。他の実施形態では、ＣＤＲ２の可変重領域は、本質的に配列番号１１またはその抗原断片からなる。他の実施形態では、ＣＤＲ２の可変重領域は、本質的に配列番号１７またはその抗原断片からなる。
【0023】
一部の実施形態では、ＣＤＲ３の可変軽領域は、本質的に配列番号３またはその抗原断片からなる。他の実施形態では、ＣＤＲ３の可変軽領域は、本質的に配列番号９またはその抗原断片からなる。他の実施形態では、ＣＤＲ３の可変軽領域は、本質的に配列番号１５またはその抗原断片からなる。一部の実施形態では、ＣＤＲ３の可変重領域は、本質的に配列番号６またはその抗原断片からなる。他の実施形態では、ＣＤＲ３の可変重領域は、本質的に配列番号１２またはその抗原断片からなる。他の実施形態では、ＣＤＲ３の可変重領域は、本質的に配列番号１８またはその抗原断片からなる。
【0024】
一部の実施形態では、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体（例えばＰ９５Ｃ１）は、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ）のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ１の可変軽領域は、本質的に配列番号１３またはその抗原断片からなる。一部の実施形態では、ＣＤＲ１の可変重領域は、本質的に配列番号１６またはその抗原断片からなる。一部の実施形態では、ＣＤＲ２の可変軽領域は、本質的に配列番号１４またはその抗原断片からなる。一部の実施形態では、ＣＤＲ２の可変重領域は、本質的に配列番号１７またはその抗原断片からなる。一部の実施形態では、ＣＤＲ３の可変軽領域は、本質的に配列番号１５またはその抗原断片からなる。一部の実施形態では、ＣＤＲ３の可変重領域は、本質的に配列番号１８またはその抗原断片からなる。
【0025】
Ｂ．診断キットおよび方法
一部の実施形態では、本発明は、ヒト対象の生体液中でのＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６の存在を検出するためのキットを提供する。一部の実施形態では、このアッセイの構成成分は、側方流動装置内で構築される（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ２０１５， Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｕｒｉｎｅ ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ ａｓｓａｙ（ＬＦ－ＬＡＭ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎ ｐｅｏｐｌｅ ｌｉｖｉｎｇ ｗｉｔｈ ＨＩＶを参照）。一部の実施形態では、キットは、第１の抗－ＬＡＭ（例えば、Ａ１９４－０１、Ｐ３０Ｂ９）または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ（例えばＰ９５Ｃ１）捕捉抗体、レポーター分子で標識された第２の抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ検出器（検出）抗体、第１の抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体が結合される支持体、および緩衝液を含む。一部の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体および第２の抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の少なくとも１つは、Ａｒａ４およびＡｒａ６もしくはそれらの組み合わせの１つに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体、またはＬＡＭ（およびリポマンナン（ＬＭ））のマンナンドメインに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭ抗体および第２の抗－ＬＡＭ抗体は、単一のＬＡＭ分子上の複数のコピー中に存在する同じＬＡＭエピトープに結合する。他の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭ抗体および第２の抗－ＬＡＭ抗体は、単一のＬＡＭ分子上に存在する異なるエピトープに結合する。ＬＡＭおよびＰＩＭ６エピトープは、本明細書に記載のＬＡＭおよびＰＩＭ６エピトープのいずれかであってもよい。他の実施形態では、第２の抗体の非競合部位に結合する第３の検出器（検出）抗体が含まれる。一部の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、同じアイソタイプである。他の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、異なるアイソタイプである。捕捉アッセイの一部の実施形態では、単に捕捉抗体または検出抗体のいずれかは、本明細書に記載のような抗－ＬＡＭ抗体（例えば、Ａ１９４－０１、Ｐ３０Ｂ９）または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体（例えばＰ９５Ｃ１）である。
一部の実施形態では、本発明は、ヒト対象の生体液中でのＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６の存在を検出するためのキットを提供する。一部の実施形態では、このアッセイの構成成分は、側方流動装置内で構築される（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ２０１５， Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｕｒｉｎｅ ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ ａｓｓａｙ（ＬＦ－ＬＡＭ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎ ｐｅｏｐｌｅ ｌｉｖｉｎｇ ｗｉｔｈ ＨＩＶを参照）。一部の実施形態では、キットは、第１の抗－ＬＡＭ（例えば、Ａ１９４－０１、Ｐ３０Ｂ９）または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ（例えばＰ９５Ｃ１）捕捉抗体、レポーター分子で標識された第２の抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ検出器（検出）抗体、第１の抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体が結合される支持体、および緩衝液を含む。一部の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体および第２の抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の少なくとも１つは、Ａｒａ４およびＡｒａ６もしくはそれらの組み合わせの１つに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体、またはＬＡＭ（およびリポマンナン（ＬＭ））のマンナンドメインに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭ抗体および第２の抗－ＬＡＭ抗体は、単一のＬＡＭ分子上の複数のコピー中に存在する同じＬＡＭエピトープに結合する。他の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭ抗体および第２の抗－ＬＡＭ抗体は、単一のＬＡＭ分子上に存在する異なるエピトープに結合する。ＬＡＭおよびＰＩＭ６エピトープは、本明細書に記載のＬＡＭおよびＰＩＭ６エピトープのいずれかであってもよい。他の実施形態では、第２の抗体の非競合部位に結合する第３の検出器（検出）抗体が含まれる。一部の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、同じアイソタイプである。他の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、異なるアイソタイプである。捕捉アッセイの一部の実施形態では、単に捕捉抗体または検出抗体のいずれかは、本明細書に記載のような抗－ＬＡＭ抗体（例えば、Ａ１９４－０１、Ｐ３０Ｂ９）または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体（例えばＰ９５Ｃ１）である。
【0026】
本明細書に記載の抗体は、さらなる検出および診断用途に用いることができる。例えば、１つの診断アッセイでは、本明細書に記載の抗体（例えば、Ａ１９４－０１、Ｐ３０Ｂ９、Ｐ９５Ｃ１）の１つ以上は、患者から得られる組織を染色し、ＴＢまたはＴＢ感染細胞を含むことが疑われる病変（例えば肉芽腫）におけるＬＡＭの存在を検出するため、用いることができる。これは、例えば、高感度検出を可能にする標識とコンジュゲートされた本明細書に記載のような単一の抗体（例えば、Ａ１９４－０１、Ｐ３０Ｂ９、Ｐ９５Ｃ１）を用いて行うことができる。かかる方法またはアッセイでは、ＰＩＭ６または関連分子のＰ９５Ｃ１による検出は、感染組織内で行うことができる。別の例では、固定化されたＰ９５Ｃ１によるＰＩＭ６の標識形態の捕捉が被疑者の生体液（例えば血液または尿）中に存在する可溶性ＰＩＭ６により競合されるＰＩＭ６競合アッセイにおいて、Ｐ９５Ｃ１を用いることができる。可溶性ＰＩＭ６の不在下であれば、これはシグナルの捕捉をもたらすことになり、それは可溶性ＰＩＭ６の存在により競合されることになる（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ２０１５，ＰｏｌｉｃｙＧｕｉｄａｎｃｅ－Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｕｒｉｎｅ ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ ａｓｓａｙ（ＬＦ－ＬＡＭ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎ ｐｅｏｐｌｅ ｌｉｖｉｎｇ ｗｉｔｈ ＨＩＶを参照）。
【0027】
一部の実施形態では、本発明は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の病原性メンバーと結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の非病原性メンバーとの間で区別するためのキットを提供する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、ＭａｎもしくはＭＴＸ－Ｍａｎ置換の有無と無関係にＡｒａ４およびＡｒａ６構造もしくはそれらの組み合わせの１つに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体、またはＰＩＭ６中またはＬＡＭマンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合する抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、Ｍａｎ－ＬＡＭエピトープ、例えば、ジマンノース置換側鎖、トリマンノース置換側鎖、またはそれらに対する組み合わせに特異的に結合する。さらなる実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、Ｍａｎ－ＬＡＭエピトープ、例えば、ジマンノースまたはトリマンノースでキャッピングされたＡｒａ４および／またはＡｒａ６構造に特異的に結合する。さらなる実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、ジマンノースでキャッピングされたＡｒａ６構造に特異的に結合する。
【0028】
一部の実施形態では、本発明は、個体における活動性結核感染を診断するための方法を提供する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭまたは抗ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、高感度タグで修飾し、ＴＢ感染および局在化についての診断として組織試料中のマイコバクテリアのＰＩＭ６またはＬＡＭに関連した材料を同定するため、用いることができる。一部の実施形態では、該方法は、可溶性ＬＡＭの捕捉を包含し、かつ、（ａ）ＬＡＭを含む個体から試料を得るステップと；（ｂ）前記ＬＡＭを単離するかまたは曝露させるため、試料を処理するステップと、（ｃ）前記単離または曝露されたＬＡＭを、前記ＬＡＭ上の第１のエピトープに結合する第１の抗－ＬＡＭ抗体を用いて捕捉するステップと；（ｄ）前記単離または曝露されたＬＡＭを、前記ＬＡＭ上の第２のエピトープに結合する第２の抗－ＬＡＭ抗体と接触させるステップと；（ｅ）前記第１の抗－ＬＡＭ抗体および前記第２の抗－ＬＡＭ抗体の少なくとも１つの前記ＬＡＭへの結合を検出するステップと；（ｆ）前記患者を活動性結核感染を有するものとして診断するステップと、を含み、ここで前記第１の抗－ＬＡＭ抗体および前記第２の抗－ＬＡＭ抗体の少なくとも１つの前記ＬＡＭへの結合の前記存在は、活動性結核感染を示す。一部の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭ抗体および第２の抗－ＬＡＭ抗体の少なくとも１つは、Ａｒａ４およびＡｒａ６またはそれらの組み合わせの１つに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、第１および第２の抗体の少なくとも１つは、ＬＡＭマンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。さらなる実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、異なるアイソタイプである。一部の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体の少なくとも１つは、組換え抗体である。他の実施形態では、第１の抗体と第２の抗体のいずれもが組換え抗体でない。さらに他の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体の双方ともが組換え抗体である。
【0029】
一部の実施形態では、本発明は、試料中に存在するＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６の量を定量化する方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、（ａ）ＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６を含む試料を得るステップと；（ｂ）前記試料を抗－ＬＡＭ抗体および／または抗－ＰＩＭ６抗体と接触させるステップと；（ｃ）抗－ＬＡＭ抗体の前記ＬＡＭへの特異的結合および／または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の前記ＬＡＭまたは前記ＰＩＭ６への結合の存在を検出するステップと；（ｄ）前記試料中のＬＡＭまたはＰＩＭ６の量を定量化するステップと、を含む。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、Ａｒａ４およびＡｒａ６またはそれらの組み合わせの１つに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＰＩＭ６マンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造（例えば、マイコバクテリアのリポマンナン（ＬＭ）中の少なくとも１つのポリマンノース構造）に特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、ＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６の前記量の定量化は、そのシグナル強度を既知の濃度のＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６を有する連続希釈された対照試料のシグナル強度と比較することにより達成される。
【0030】
一部の実施形態では、本発明は、個体を結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染している者として診断するための方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、（ａ）ＬＡＭまたはＰＩＭ６を含む試料を得るステップと；（ｂ）前記試料を抗－ＬＡＭ抗体および／または抗－ＰＩＭ６抗体と接触させるステップと、（ｃ）抗－ＬＡＭ抗体の前記Ｍａｎ－ＬＡＭへの特異的結合の存在および／または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の前記ＰＩＭ６への特異的結合の存在を検出するステップと、を含み、ここで抗－ＬＡＭ抗体は、少なくとも１つの５－デオキシ－５－メチルチオペントフラノシル（ＭＴＸ）置換を有するＭａｎ－ＬＡＭを含むＬＡＭエピトープに特異的に結合し、また抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＬＡＭマンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造を含むエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、Ａｒａ４およびＡｒａ６またはそれらの組み合わせの１つに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＰＩＭ６マンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体（例えばＰ９５Ｃ１）である。
【0031】
一部の実施形態では、該方法は、検出方法の感度を高める増幅ステップを含む。例として、Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）の使用による追加的な標的部位の生成またはＥＬＩＳＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の使用による初期シグナルの増幅が包含される。
【0032】
一部の実施形態では、本発明は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の病原性メンバーと結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の非病原性メンバーとの間を区別する方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、（ａ）ＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６を含む試料を得るステップと；（ｂ）前記試料を、ジマンノース置換側鎖、トリマンノース置換側鎖、もしくはそれらの組み合わせを含むＭａｎ－ＬＡＭエピトープに特異的に結合する抗－ＬＡＭ抗体、またはＰＩＭ６マンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合する抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体と接触させるステップと；（ｃ）抗－ＬＡＭ抗体の前記Ｍａｎ－ＬＡＭへの特異的結合の存在、または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体のＰＩＭ６マンナンドメイン内の前記少なくとも１つのポリマンノース構造への特異的結合の存在を検出するステップと、を含み、ここで前記特異的結合の存在は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の病原性メンバーの存在を示す。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、Ａｒａ４およびＡｒａ６またはそれらの組み合わせの１つに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体である。さらなる実施形態では、Ｍａｎ－ＬＡＭエピトープは、ジマンノースまたはトリマンノースでキャッピングされたＡｒａ４および／またはＡｒａ６構造を含む。さらなる実施形態では、Ｍａｎ－ＬＡＭエピトープは、ジマンノースでキャッピングされたＡｒａ６である。一部の実施形態では、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＰＩＭ６マンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。
【0033】
Ｃ．治療組成物、方法、ワクチン、およびベクター
一部の実施形態では、本発明は、個体における結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性メンバーによる感染を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、少なくとも１つの抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体を治療有効量で感染性結核菌（Ｍ．ｔｂ）に曝露された個体に投与するステップを含む。さらなる実施形態では、該方法は、少なくとも１つの抗生物質の投与を含む。一部の実施形態では、ＴＢ感染は活動性である。他の実施形態では、ＴＢ感染は潜在性である。一部の実施形態では、感染は、結核の多剤耐性（ＭＤＲ）株を伴う。他の実施形態では、感染は、結核の広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ）株を伴う。
一部の実施形態では、本発明は、個体における結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性メンバーによる感染を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、少なくとも１つの抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体を治療有効量で感染性結核菌（Ｍ．ｔｂ）に曝露された個体に投与するステップを含む。さらなる実施形態では、該方法は、少なくとも１つの抗生物質の投与を含む。一部の実施形態では、ＴＢ感染は活動性である。他の実施形態では、ＴＢ感染は潜在性である。一部の実施形態では、感染は、結核の多剤耐性（ＭＤＲ）株を伴う。他の実施形態では、感染は、結核の広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ）株を伴う。
【0034】
一部の実施形態では、本発明は、個体における結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性メンバーによる感染を治療するための併用療法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、非置換ＬＡＭ、モノマンノシル化Ｍａｎ－ＬＡＭ、ＭＳＸ置換ＬＡＭ、およびそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む第１のＬＡＭエピトープに特異的に結合する第１の抗－ＬＡＭ抗体、またはＰＩＭ６およびＬＡＭマンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合する第１の抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体を治療有効量で投与するステップと；ジマンノース置換Ｍａｎ－ＬＡＭ、トリマンノース置換Ｍａｎ－ＬＡＭ、およびそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む第２のＬＡＭエピトープに特異的に結合する第２の抗－ＬＡＭ抗体を治療有効量で投与するステップと、を含む。一部の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、（例えば、単一の組成物中で、または同時に投与される２つの組成物中で）同時に投与される。他の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、異なる時点に投与される。一部の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭ抗体および第２の抗－ＬＡＭ抗体の少なくとも１つは、Ａｒａ４およびＡｒａ６またはそれらの組み合わせの１つに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＰＩＭ６中および／またはＬＡＭのＰＩＭ６交差反応性マンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６抗体である。一部の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭ抗体および第２の抗－ＬＡＭ抗体、または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、異なるアイソタイプである。一部の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭ抗体および第２の抗－ＬＡＭ抗体の少なくとも１つ、および抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、組換え抗体である。他の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭ抗体、第２の抗－ＬＡＭ抗体、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体のいずれもが組換え抗体でない。さらに他の実施形態では、第１の抗－ＬＡＭ抗体と第２の抗－ＬＡＭ抗体の双方、または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、組換え抗体である。さらなる実施形態では、該方法は、少なくとも１つの抗生物質の投与を含む。かかる実施形態では、少なくとも１つの抗生物質は、第１および第２の抗体と同時に投与（例えば同時投与）され得るか、または少なくとも１つの抗生物質は、第１および第２の抗体の投与の時点と異なる時点で投与され得る。一部の実施形態では、感染は活動性である。他の実施形態では、感染は潜在性である。一部の実施形態では、感染は、多剤耐性（ＭＤＲ）結核感染である。他の実施形態では、感染は、広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ）結核感染である。
【0035】
一部の実施形態では、本発明は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性メンバーによる感染を予防するためのワクチンまたは医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、患者における宿主免疫応答を刺激する方法であって、ＬＡＭ抗原および／またはＰＩＭ６抗原を治療有効量で前記患者に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、これらの抗原は、免疫原性タンパク質担体にコンジュゲートされ、かつ／または糖脂質抗原に対する免疫応答を強力に刺激するアジュバントと同時投与される。一部の実施形態では、ワクチンまたは医薬組成物は、Ｍａｎ－ＬＡＭエピトープに特異的に結合する抗－ＬＡＭ抗体、および／またはＰＩＭ６マンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合する抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体を誘導する。さらなる実施形態では、ワクチンまたは医薬組成物中に存在するＭａｎ－ＬＡＭエピトープは、ジマンノースまたはトリマンノースでキャッピングされたＡｒａ４および／またはＡｒａ６構造を含む。さらなる実施形態では、Ｍａｎ－ＬＡＭエピトープは、ジマンノースでキャッピングされたＡｒａ６である。一部の実施形態では、Ｍａｎ－ＬＡＭエピトープは、少なくとも１つのＭＴＸ置換を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体および／または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＩｇＭ抗体である。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体および／または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、組換え抗体である。
【0036】
一部の実施形態では、本発明は、個体における結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性メンバーによる感染を保護抗体の受動投与により予防する方法を提供する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、Ａｒａ４およびＡｒａ６またはそれらの組み合わせの１つに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＰＩＭ６およびＬＡＭマンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体である。一部の実施形態では、該方法は、Ｍａｎ－ＬＡＭエピトープに特異的に結合する抗－ＬＡＭ抗体、および／またはＰＩＭ６エピトープ（例えば、ＰＩＭ６およびＬＡＭによって共有されるエピトープ）に特異的に結合する抗－ＰＩＭ６抗体を治療有効量で個体に投与するステップを含む。さらなる実施形態では、標的化されるＭａｎＬＡＭエピトープは、ジマンノースまたはトリマンノースでキャッピングされたＡｒａ４および／またはＡｒａ６構造を含む。さらなる実施形態では、ＭａｎＬＡＭエピトープは、ジマンノースでキャッピングされたＡｒａ６である。一部の実施形態では、ＭａｎＬＡＭエピトープは、少なくとも１つのＭＴＸ置換を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、ＩｇＭ抗体である。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、組換え抗体である。
【0037】
一部の実施形態では、本発明は、組換えベクターを介した保護抗体の受動投与を提供する。一部の実施形態では、組換えベクターは、抗－ＬＡＭ抗体のＩｇＶＬをコードする第１の核酸および抗－ＬＡＭ抗体のＩｇＶＨをコードする第２の核酸を含み、ここで核酸の各々は、プロモーター領域に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ＩｇＶＬおよびＩｇＶＨの少なくとも１つは、Ａｒａ４およびＡｒａ６またはそれらの組み合わせの１つに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体から誘導される。他の実施形態では、組換えベクターは、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体のＩｇＶＬをコードする第１の核酸および抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体のＩｇＶＨをコードする第２の核酸を含み、ここで核酸の各々は、プロモーター領域に作動可能に連結される。一部の実施形態では、組換えベクターは、追加的な転写調節エレメントを含む。一部の実施形態では、第１の核酸配列および第２の核酸配列の少なくとも１つは、オペロン内に組織化される。一部の実施形態では、第１の核酸配列および第２の核酸配列の少なくとも１つは、発現カセット内に組織化される。一部の実施形態では、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、単一の発現カセット内に組織化される。一部の実施形態では、第１の核酸および第２の核酸は、同じクローニングベクター内に位置する。他の実施形態では、第１の核酸および第２の核酸は、異なるクローニングベクター内に位置する。一部の実施形態では、第１の核酸および第２の核酸の発現は、同時的であり得る。他の実施形態では、第１の核酸および第２の核酸の発現は、別々に誘導可能である。一部の実施形態では、第１の核酸の発現は、第２の核酸の発現と時間的に分離され得る。一部の実施形態では、組換えベクターは、プラスミドである。他の実施形態では、組換えベクターは、非増殖性ウイルスである。さらなる実施形態では、組換えベクターは、アデノ随伴ウイルスである。
【0038】
一部の実施形態では、本発明は、個体における結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性メンバーによる感染を治療する方法について提供する。一部の実施形態では、該方法は、抗－ＬＡＭ抗体のＩｇＶＨをコードする第１の核酸、および抗－ＬＡＭ抗体のＩｇＶＬをコードする第２の核酸を個体に投与するステップを含み、ここで核酸の各々は、プロモーター領域に作動可能に連結される。他の実施形態では、該方法は、抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体のＩｇＶＨをコードする第１の核酸、および抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体のＩｇＶＬをコードする第２の核酸を個体に投与するステップを含み、ここで核酸の各々は、プロモーター領域に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ＩｇＶＬおよびＩｇＶＨの少なくとも１つは、Ａｒａ４およびＡｒａ６またはそれらの組み合わせの１つに特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体から、またはＰＩＭ６マンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合するヒトモノクローナル抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体から誘導される。一部の実施形態では、第１の核酸および第２の核酸は、同じクローニングベクター内に位置する。他の実施形態では、第１の核酸および第２の核酸は、異なるクローニングベクター内に位置する。一部の実施形態では、組換えベクターは、プラスミドである。他の実施形態では、組換えベクターは、非増殖性ウイルスである。さらなる実施形態では、組換えベクターは、アデノ随伴ウイルスである。
【0039】
さらなる実施形態、特徴および利点は、本明細書に提供される開示に基づき、当業者に容易に理解されるであろう。他の特徴は、以下の説明および特許請求の範囲から、パッケージが関係する当業者により十分に理解されるであろう。本明細書に記載される場合に類似または相当する抗体、組成物、キットおよび方法が本発明の実行または試験において使用可能であるが、好適な抗体、組成物、キットおよび方法が以下に記載される。本明細書中で言及されるすべての出版物、特許出願、および特許は、それら全体が参照により援用される。コンフリクトの場合、定義を含む本明細書はコントロールする。以下に考察される特定の実施形態は、あくまで例示的なものであり、限定は意図されない。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】図１Ａは、結合競合アッセイにて用いられるＡ１９４－０１のＩｇＧ型およびその断片のモデルである。これらは、一価ｓｃＦｖおよびＦａｂ構造、ならびに二価ｓｃＦｖ二量体および天然ＩｇＧを含んだ。図１Ｂは、Ａ１９４－０１の一価形態が二価形態よりも大して有効に競合しなかったことを示す競合曲線である。図１Ｃは、Ａ１９４－０１のより高い結合価の形態の構造である。これは、正常な重鎖の各々のＮ末端に連結されたＡ１９４－０１ ｓｃＦｖドメインを有する、相同な四価Ａ１９４－０１ ｓｃＦｖ－ＩｇＧを表す。
【図2】図２Ａは、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＧおよびＩｇＭ型、ならびにＶＨ領域内の６つのアミノ酸挿入物が欠失されたか、またはＶＨ領域内の９つの体細胞突然変異が最も近い生殖系列配列、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＭａｎＬＡＭに復帰されたＩｇＭの結合活性である。６つのアミノ酸挿入物は、９つの体細胞突然変異よりも大きい程度で反応性に寄与した。図２Ｂおよび２Ｃは、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭおよびＩｇＧ型、ならびに結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＭａｎＬＡＭ（Ｂ）およびスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＰＩＬＡＭ（Ｃ）に対する重鎖における６つのアミノ酸欠失を伴う突然変異の反応性を比較する。ＩｇＭ型は、ＩｇＧ型と異なり、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＭａｎＬＡＭ（２Ｂ）と特異的に反応したが、ＰＩＬＡＭ（２Ｃ）とは特異的に反応せず、Δ６アミノ酸突然変異体のＭａｎＬＡＭに対する反応性は非常に低下し、ＰＩＬＡＭに対しては陰性であった。
【図3】図３は、２つのヒトｍＡｂおよび４つのマウスｍＡｂの、左パネルでのＰＩＬＡＭ、また右パネルでの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＨ３７Ｒｖ株から単離されたＭａｎＬＡＭに対する反応性を比較する。曲線は、これらの試薬の異なる分子量について制御するため、抗体のモル濃度を用いてプロットされた。
【図4A】図４Ａは、ＬＡＭ中に存在するモチーフに関係する微生物のグリカン構造を表す２５の合成オリゴ糖の構造である。これらの構造は、ＢＳＡ担体タンパク質にカップリングされ、エピトープ特異性を探索するために用いられた。
【図4B】図４Ｂは、２５の合成オリゴ糖のパネルに対する６つのＬＡＭに特異的なモノクローナル抗体における結合特性である。結合結果は、３つの濃度に対して示され、抗体のこれらの抗原に対する相対的親和性が適定パターンにより示される。
【図5】図５は、左側パネルが、ＩｇＡ１（Ａ）、ＩｇＡ２（Ｂ）および二量体ＩｇＡ１－Ｊ二量体複合体（Ｃ）の構造である。右側パネルが、ＤＴＴによる還元の前と後の双方での、精製されたＰ３０Ｂ９ ＩｇＡ１、ＩｇＡ２およびＩｇＡ３タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＡ３は、より長いヒンジ領域を伴うＰＣＲの人為的結果であることが後に示された。
【図7】図７は、指定濃度のＭａｎＬＡＭがＣＳ－３５により捕捉され、ビオチンで標識された指定のｍＡｂにより検出された、ＣＳ－３５捕捉アッセイにおける可溶性ＭａｎＬＡＭの検出時のビオチン化モノクローナル抗体プローブの効率の比較である。
【図8】図８は、様々なマンノースでキャッピングされたＡｒａ４構造、またはテトラおよびペンタマンノース構造へのＰ３０Ｂ９の結合曲線である。関連α－Ｍａｎｐ（１→２）－Ｍａｎｐ結合を有する構造３（ジマンノース－Ａｒａ４）および５９において優先的結合が見られた。
【図9】図９は、反応性に対する構造的要件を判定するための、様々なキャップのないＬＡＭ関連複合糖質に対するモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体の適定である。図９Ａは、Ａｒａ４配列の非還元末端からの最後から２番目の位置でのＡｒａ－α（１→５）－Ａｒａ結合の重要性の分析である。図９Ｂは、Ａｒａ４配列の末端位置でのＡｒａ－β（１→２）－Ａｒａ結合の依存性の分析である。
【図11】図１１は、個別の抗－ＬＡＭ抗体の、プローブ抗体のＭａｎＬＡＭ抗原への結合に対して競合する能力を測定するための結合競合試験である。抗体は、同じ種由来の抗体に対する試験時、ビオチン化された。Ａ１９４－０１がビオチン化Ｐ３０Ｂ９に対して競合できないことに注意されたい。
【図12】図１２は、抗－ＬＡＭモノクローナル抗体の結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＬＡＭ（ＭａｎＬＡＭ）およびスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＬＡＭ（ＰＩＬＡＭ）への結合の競合である。ＭａｎＬＡＭに対するＦＩＮＤ２５とＰ３０Ｂ９との間の効率的競合は、ジマンノース置換Ａｒａ６の支配に合致する一方で、これら２つのｍＡｂのＡ１９４による競合の欠如は、ジマンノースでキャッピングされた構造とのその低い反応性に合致する。ＦＩＮＤ２５対ＰＩＬＡＭに対するＡ１９４の効率的競合は、この構造中のジマンノースキャッピングの不在に合致する。
【図13】図１３は、ビオチン化プローブモノクローナル抗体と天然ＬＡＭ抗原および選択された複合糖質に対する余分な非修飾抗体との結合競合である。図１３Ａは、ビオチン化Ａ１９４－０１ ＩｇＧ、ＣＳ－３５およびＦＩＮＤ２５のＭＡｎＬＡＭへの結合の４つのｍＡｂによる競合であり；図１３Ｂは、ＦＩＮＤ２５のＭａｎＬＡＭとＰＩＬＡＭの双方への結合の３つのｍＡｂによる競合であり；図１３Ｃは、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭのＭＡｎＬＡＭおよび２つの合成複合糖質抗原への結合の４つのｍＡｂによる競合である。
【図14】Ａ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体は、Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプによって低く認識されるジおよびトリマンノース置換形態を含む、より広範囲の複合糖質と反応する。
【図15】図１５は、Ａ１９４－０１ ＩｇＧならびにＡ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体の、ＦＩＮＤ２５およびＰ３０Ｂ９ ＩｇＭのＭａｎＬＡＭへの結合に対する差次的競合である。Ａ１９４ ＩｇＧはＭａｎＬＡＭに対するＰ３０Ｂ９またはＦＩＮＤ２５と競合しないが、多量体形態は、これらの形態のより広範なエピトープ特異性に合致して確かに競合する。上で示されるように、Ａ１９４ ＩｇＧは、ＰＩＬＡＭに対してＦＩＮＤ２５と大して競合しない。
【図16】図１６は、ＣＳ－４０、Ａ１９４－０１およびＰ３０Ｂ９ ｍＡｂの反応性に対するマンノースキャッピングの効果の分析についての比較である。抗体結合特異性は、異なるマンノース置換を有する特定の複合糖質に対してＥＬＩＳＡにより測定された。抗体滴定は、図１６Ａに示され、マンノース含有グリカン抗原の構造は図１６Ｂに示される。
【図17】図１７Ａは、相同ｓｃＦｖ－ＩｇＧである。この例では、ＩｇＧおよびｓｃＦｖドメインの双方は同じ抗体に由来する。これは、増加した結合価（二価に対する四価）をもたらすが、標的特異性を直接的に修飾しない。図１７Ｂは、異種ｓｃＦｖ－ＩｇＧである。結合価における増加に加えて、広範化された特異性も導入され、それは、単一抗原分子中の異なるエピトープの認識を可能にし得る。図１７Ｃは、異種ｓｃＦｖ－ＩｇＭである。この製剤では、異なるｓｃＦｖがＩｇＭ構築物と組み合わされる。一例としては、Ａ１９４－０１ ｓｃＦｖとＰ３０Ｂ９ ＩｇＭとの連結が挙げられる。結合価における増加に加えて、この場合、追加的なエピトープ特異性を導入することになり、それは、相同ｓｃＦｖ－ＩｇＭによって認識されないことがある異なるエピトープの多価認識を可能にし、親和性の増加をもたらし得る。
【図18A】図１８は、新しいｍＡｂによって認識されるエピトープのマッピングである。Ｐ９５Ｃ１のエピトープ特異性が、２つの前述されたｍＡｂのＡ１９４－０１およびＰ３０Ｂ９、ならびに２つの前述されたｍＡｂに関連するエピトープを認識する２つの新しいｍＡｂのＰ６１Ｈ５およびＰ８３Ａ８の場合と比較された。図１８Ａは、ＬＡＭに特異的なｍＡｂのＬＡＭ前駆物質分子に対する反応性である。Ｐ３０Ｂ９およびＰ６１Ｈ５は、ＰＩＬＡＭよりもＭａｎＬＡＭに特異的であった一方で、Ａ１９４－０１、Ｐ８３Ａ８およびＰ９５Ｃ１は、ＬＡＭの両形態を認識した。Ｐ９５Ｃ１はまた、ＬＭおよびＰＩＭ６と効率的に結合した。他のｍＡｂのＬＭおよびＰＩＭ６に対する弱い反応性は、少なくとも一部にはＭａｎＬＡＭによるこれらの材料の汚染に起因する。
【図18C】図１８Ｃは、以前から公知のｍＡｂと対照的に、Ｐ９５Ｃ１は、ポリアラビノース構造のいずれも認識しない唯一の抗体であったが、ＰＩＭ６中ならびにＬＭおよびＬＡＭの塩基でのマンナンドメイン内に存在する構造に類似する、２つのポリマンノース構造ＹＢ－ＢＳＡ－０５およびＹＢ－ＢＳＡ－１１と特異的に反応した。
【図19】図１９は、Ｐ９５Ｃ１およびＰ３０Ｂ９のＭａｎＬＡＭおよびＰＩ－ＬＡＭへの結合に対するアイソタイプスイッチの効果である。Ｐ９５Ｃ１においては、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧアイソタイプはすべて、ＩｇＧとしてではなくＩｇＭおよびＩｇＡ型のみで専らＭａｎＬＡＭと反応するＰ３０Ｂ９と異なり、ＭａｎＬＡＭおよびＰＩＬＡＭの双方に対して同等の結合活性を有する。
【図20】図２０は、Ｐ９５Ｃ１とＬＡＭおよび追加的な結核菌（Ｍ．ｔｂ）糖脂質との交差反応性のウエスタンブロット解析である。図２０（Ａ）：精製されたＬＡＭに関連した糖脂質は、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離され、その後、過ヨウ素酸シッフ染色で糖分子の酸化および染色が行われ、反応性グリカンを含有する材料を呈した。図２０（Ｂ）：並行ブロットがｍＡｂのＡ１９４ ＩｇＧ１、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭ、およびＰ９５Ｃ１ ＩｇＭで探索され、その後、アルカリホスファターゼが抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ二次抗体にコンジュゲートされ、ｂｃｉｐ／ｎｂｔ発色基質で処理された。Ａ１９４－０１は、結核菌（Ｍ．ｔｂ）由来のＭａｎＬＡＭおよびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇ）由来のＰＩＬＡＭと交差反応する。Ｐ３０Ｂ９は、結核菌（Ｍ．ｔｂ）のＭａｎＬＡＭに特異的である。Ｐ９５Ｃ１は、ＬＡＭ、ならびに結核菌（Ｍ．ｔｂ）から単離されるＬＭおよびＰＩＭ６の両種を認識する。ＬＡＭと共遊走するＬＭおよびＰＩＭ６中のバンドのＡ１９４－０１による弱い染色は、明らかにこれらの試料のＬＡＭによる微量な汚染に起因する。
【図21】図２１は、Ａ１９４重鎖および軽鎖可変領域配列におけるアミノ酸配列の整列ならびにそれらの最も近い生殖系列配列とのそれらの比較である。上部の整列化では、上からの第１のアミノ酸配列（Ａ１９４－ＶＨ）は、ＣＤＲ３配列（配列番号２３）を有しないＡ１９４重鎖可変領域配列である。ＣＤＲ３を有しない重鎖可変領域配列は、配列番号２１である。上部の整列化では、第２のアミノ酸配列（生殖系列Ｈｏｍｓａｐ ＩＧＨＶ３－２０＊０１）は、配列番号２２である。上部の整列化では、第３のアミノ酸配列は、Ａ１９４重鎖可変領域のＣＤＲ３であり、配列番号２３である。下部の整列化では、上からの第１のアミノ酸配列（Ａ－１９４－Ｖｋ）は、ＣＤＲ３配列（配列番号２６）を有しないＡ１９４軽鎖可変領域である。ＣＤＲ３を有しない軽鎖可変領域配列は、配列番号２４である。下部の整列化では、第２のアミノ酸配列（生殖系列Ｈｏｍｓａｐ ＩＧＫＶ３－１５＊０１）は、配列番号２５である。下部の整列化では、第３の配列は、Ａ１９４軽鎖可変領域のＣＤＲ３であり、配列番号２６である。
【図22】図２２は、Ｐ３０Ｂ９－ＩｇＭ重鎖および軽鎖可変領域配列におけるアミノ酸配列ならびにそれらの最も近い生殖系列とのそれらの比較である。上部の整列化では、上からの第１のアミノ酸配列（Ｐ３０Ｂ９－Ｖｈ）は、ＣＤＲ３配列（配列番号２９）を有しないＰ３０Ｂ９－ＩｇＭ重鎖可変領域配列である。ＣＤＲ３を有しない重鎖可変領域配列は、配列番号２７である。第２のアミノ酸配列（Ｈｏｍｓａｐ ＩＧＨＶ４－３４＊０１Ｆ）は、配列番号２８である。第３のアミノ酸配列は、Ｐ３０Ｂ９－ＩｇＭ重鎖可変領域のＣＤＲ３であり、配列番号２９である。下部の整列化では、上からの第１のアミノ酸配列（Ｐ３０Ｂ９－Ｖｋ）は、ＣＤＲ３配列（配列番号３２）を有しないＰ３０Ｂ９軽鎖可変領域である。ＣＤＲ３を有しない軽鎖可変領域配列は、配列番号３０である。下部の整列化では、第２のアミノ酸配列（生殖系列Ｈｏｍｓａｐ ＩＧＫＶ１－５＊０３）は、配列番号３１である。下部の整列化では、第３の配列は、Ｐ３０Ｂ９軽鎖可変領域のＣＤＲ３であり、配列番号３２である。
【図23】図２３は、Ｐ９５Ｃ１－ＩｇＭ重鎖および軽鎖可変領域配列におけるアミノ酸配列の整列ならびにそれらの最も近い生殖系列配列とのそれらの比較である。上部の整列化では、上からの第１のアミノ酸配列（Ｐ９５Ｃ１－ＶＨ）は、ＣＤＲ３配列（配列番号１８）を有しないＰ９５Ｃ１重鎖可変領域配列である。ＣＤＲ３を有しない重鎖可変領域配列は、配列番号３３である。上部の整列化では、第２のアミノ酸配列（生殖系列Ｈｏｍｓａｐ ＩＧＨＶ４－４＊０２）は、配列番号３４である。上部の整列化では、第３のアミノ酸配列は、Ｐ９５Ｃ１－ｇＭ重鎖可変領域のＣＤＲ３であり、配列番号１８である。下部の整列化では、上からの第１のアミノ酸配列（Ｐ９５Ｃ１－Ｖｋ）は、ＣＤＲ３配列（配列番号１５）を有しないＰ９５Ｃ１軽鎖可変領域である。ＣＤＲ３を有しない軽鎖可変領域配列は、配列番号３６である。下部の整列化では、第２のアミノ酸配列（生殖系列Ｈｏｍｓａｐ ＩＧＫＶ４－１＊０１Ｆ）は、配列番号３７である。下部の整列化では、第３の配列は、Ｐ９５Ｃ１軽鎖可変領域のＣＤＲ３であり、配列番号１５である。
【発明を実施するための形態】
【0041】
詳細な説明
Ａ．定義
特段の定義がされていない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されている場合と同じ意味を有する。
Ａ．定義
特段の定義がされていない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されている場合と同じ意味を有する。
【0042】
抗－ＬＡＭ抗体は、本明細書で開示される通り、当該技術分野における極めて多数の形態の１つをとってもよい。抗体は、一部には、その結合対象の抗原によって規定され、故に「抗－ＬＡＭ抗体」は、本明細書に記載される、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するような任意の抗体である。抗体が、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分であることは当該技術分野で理解されている。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）からなる。軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。重鎖および軽鎖双方の可変領域は、フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。４つのＦＷＲ領域が比較的保存される一方で、ＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、超可変領域を表し、ＮＨ２末端からＣＯＯＨ末端にかけて、ＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３、ＦＷＲ４のように配列される。重鎖および軽鎖の可変領域が抗原と相互作用する結合ドメインを含む一方で、アイソタイプに応じて、定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介し得る。
【0043】
抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、本明細書で開示される通り、当該技術分野における極めて多数の形態の１つをとってもよい。「抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体」は、本明細書に記載される、ホスファチジルイノシトールマンノシド６（ＰＩＭ６）およびＬＡＭによって共有される少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するような任意の抗体である。本明細書に記載されるＬＡＭおよびＰＩＭ６によって共有されるエピトープに特異的なヒトｍＡｂは、ＰＩＭ６中ならびにＬＭおよびＬＡＭのＰＩＭ６関連マンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合するＰ９５Ｃ１である。Ｐ９５Ｃ１は、共通の（共有された）エピトープを認識することから、ＬＡＭおよびＰＩＭ６双方に結合し、それ故、本明細書中で「抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体」または「抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭモノクローナル抗体」、「ヒト抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体」または「ヒト抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭモノクローナル抗体」と称される。
【0044】
モノクローナルおよび他の抗体を操作し、組換えＤＮＡ技術の技法を用いて、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生することが可能であることは当該技術分野で公知である。かかる技法は、抗体の免疫グロブリン可変領域、またはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含んでもよい。
【0045】
用語「抗体」（Ａｂ）は、本明細書で用いられるとき、最も広義に用いられ、また詳細には、天然であるかまたは部分的もしくは全体的に合成により産生される任意の免疫グロブリン、例えば限定はされないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多選択性抗体（例えば、二重特異性抗体および多反応性抗体）、および抗体断片を含んでもよい。したがって、用語「抗体」は、本願中の任意の文脈で用いられるとき、限定はされないが、任意の特異的結合メンバー、免疫グロブリンクラスおよび／またはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）、ならびに生物学的に関連のある断片またはその特異的結合メンバー、例えば限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖または関連実体）および（ｓｃＦｖ）２を含むことを意味する。
【0046】
用語「抗体断片」は、本明細書で用いられるとき、本明細書で概説される通り、当業者にとって容易に理解され、利用可能な技術を用いて得られる抗体断片を含んでもよい。したがって、用語「抗体」は、インタクトな抗体の一部、例えばインタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質を表す。これらは、天然供給源から誘導され得るか、または部分的または全体的に合成により産生されてもよい。抗体断片の例として、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体、および直鎖抗体が挙げられる。特に、本明細書で用いられるとき、「一本鎖Ｆｖ」（「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」）は、単一のポリペプチド鎖内に接続されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドは、例えばｓｃＦｖが抗原結合にとって所望される構造形成することを可能にするＶＨおよびＶＬドメイン間の可動性ポリペプチドリンカーなどのリンカーをさらに含み得る。
【0047】
用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、本明細書で用いられるとき、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわちその集団を含む個別の抗体が、少量で存在し得る、天然に存在する可能性がある突然変異を除いて同一であることを指してもよい。
【0048】
用語「変異体」、「誘導体」、および／または「変異体および／または誘導体」は、本明細書で用いられるとき、前述の化合物が構造的に類似する、すなわち元の非修飾抗体と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の、またはそれより大きい配列同一性があるような同一性の程度を保持する、かつ／または、構造的同一性と無関係に元の非修飾抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体と機能的に類似し得る、すなわち、ＬＡＭの少なくとも１つのエピトープまたは共有されたＰＩＭ６／ＬＡＭエピトープに各々特異的に結合する能力を保持する限り、天然供給源から得られるかまたは部分的もしくは全体的に合成により産生される抗体、抗体断片、組換え抗体、ならびにタンパク質、タンパク質断片、およびポリペプチドを指してもよい。例えば、かかる変異体および／または誘導体は、変異体Ｆｃドメイン、キメラ抗体、融合タンパク質、二重特異性抗体、または他の組換え抗体を伴う抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体を含んでもよい。かかる変異体および／または誘導体抗体は、ＬＡＭ、またはＰＩＭ６の１つ以上のエピトープに対してより大きい結合特異性を必ずしも有する必要がなくてよく、かつ／またはさらなるＬＡＭまたはＰＩＭ６エピトープに結合可能であってもよい。
【0049】
用語「生体試料」は、生物（例えば患者）または生物の構成成分（例えば細胞）から得られる試料を指す。試料は、任意の生物学的組織、細胞または体液であってもよい。試料は、対象、例えばヒト患者由来の試料である「臨床試料」であってもよい。かかる試料は、限定はされないが、唾液、痰、血液、血球（例えば白色細胞）、羊水、血漿、精液、骨髄、および組織もしくは微小針生検試料、尿、腹水、および胸水、またはそれらに由来する細胞を含む。生体試料はまた、組織学的目的のために採取される凍結切片などの組織の切片を含んでもよい。生体試料はまた、「患者試料」と称されてもよい。生体試料はまた、実質的に精製または単離されたタンパク質、膜標本、または細胞培養液を含んでもよい。
【0050】
用語「有効量」または「治療有効量」は、本明細書で用いられるとき、治療対象における医学的に望ましい結果をもたらす能力がある化合物または薬剤の量を指してもよい。治療方法は、インビボまたは生体外で、単独でまたは他の薬物すなわち治療薬と併用して実施され得る。治療有効量は、１回以上の投与、適用または用量で投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されることは意図されない。
【0051】
用語「抗原結合断片」または「Ｆａｂ」は、本明細書で用いられるとき、抗原に結合する抗体上の領域を指してもよい。当業者は、Ｆａｂが抗体の重鎖および軽鎖の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインからなることを理解するであろう。
【0052】
本明細書で用いられるとき、用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」は、他の抗原でない、所定の抗原上のエピトープへの抗体の結合を指してもよい。典型的には、抗体は、（ｉ）例えば、分析物として所定の抗原、例えばＬＡＭエピトープ、またリガンドとしてその抗体を用いる、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴装置での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術、または抗体の抗原陽性細胞への結合のスキャッチャード分析により測定されるとき、約１０－６Ｍ未満、例えば約１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍのまたはさらに低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合し、かつ（ｉｉ）所定の抗原または密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合におけるその親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で所定の抗原に結合する。
【0053】
用語「保存的配列修飾」または「保存的置換」は、本明細書で用いられるとき、アミノ酸配列を有する抗体の結合特性を有意に影響または改変しないアミノ酸修飾を指してもよい。かかる保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当該技術分野で公知の標準的技術、例えば部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発により、本発明の抗体に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基と置換される場合である。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換され得、改変された抗体は、本明細書に記載の機能的アッセイを用いて、保持された機能について試験され得る。
【0054】
用語「同一性」は、本明細書で用いられるとき、２つの組成物間で共有される構造の存在を指してもよい。タンパク質との関連での用語「同一性」は、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチド配列間での重複の（例えば百分率で表される）量を指してもよい。核酸との関連では、該用語は、２つ以上の核酸配列間での重複の（例えば百分率で表される）量を指してもよい。本明細書で用いられるとき、２つの配列間のパーセント（％）同一性は、その２つの配列間のパーセント同一性に等しい。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数、および各ギャップの長さ（２つの配列の最適な整列化のために導入される必要がある）を考慮して、それら配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行われ得る。かかる同一性は、局所整列化ツールおよび／またはアルゴリズムを介して当該技術分野で十分に説明されており、ペアワイズアラインメント、複数の配列整列化法、構造的整列化法、および／または系統発生分析法を含んでもよい。特定例が以下に挙げられる。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１－１７（１９８８））を用い、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰプログラム中に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３（１９７０））アルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、もしくは４のギャップ重量および１、２、３、４、５、もしくは６の長さ重量を用いて決定され得る。追加的または代替的に、本発明のタンパク質配列は、例えば関連配列を同定するため、公的データベースに対する探索を実施するための「クエリー配列」としてさらに用いることができる。かかる探索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得るため、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて実施され得る。比較目的でギャップ化整列を得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載のように、ギャップ化ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。
【0055】
用語「同時投与」、「同時投与される」および「～と組み合わせた」は、本明細書で用いられるとき、少なくとも２つの薬剤すなわち治療薬の対象への投与を指してもよい。一部の実施形態では、２つ以上の薬剤／治療薬の同時投与は同時的である。他の実施形態では、第１の薬剤／治療薬は、第２の薬剤／治療薬に先立ち投与される。当業者は、用いられる様々な薬剤／治療薬の配合および／または投与経路が変動してもよいことを理解している。
【0056】
用語「担体」は、本明細書で用いられるとき、用いられる用量および濃度でそれに曝露されている細胞または哺乳動物に対して非毒性である薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤を含んでもよい。生理学的に許容できる担体は、水性ｐＨ緩衝液であることが多い。生理学的に許容できる担体の例として、限定はされないが、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；抗酸化剤、例えば限定はされないが、アスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば限定はされないが、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば限定はされないが、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば限定はされないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン；単糖、二糖、および他の炭水化物、例えば限定はされないが、グルコース、マンノース、またはデキストリン；キレート剤、例えば限定はされないが、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば限定はされないが、マンニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば限定はされないが、ナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えば限定はされないが、ＴＷＥＥＮ；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、が挙げられる。
【0057】
疾患の「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患の徴候または症状を緩和する努力において、１つ以上の薬剤を患者（ヒトまたはその他）に投与するステップを含んでもよいプロトコルを実行することを指す。軽減は、疾患の徴候または症状の出現前、ならびにそれらの出現後に生じ得る。したがって、疾患の「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患の「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」を含む。用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）および／または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置を指し、その目的は、標的化される病的状態または障害を予防または遅延化することである。例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株による感染の場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株による感染を例えば保護抗体のワクチン接種または受動投与を通じて予防するかまたは停止させるため、治療経過が進んだ状況下で行われてもよい。かかる「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」はまた、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による潜在的感染の場合に行われ、その場合の目的は、活動性感染を予防し、かつ／または患者から前記潜在的感染を排除することとなる。さらに、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、徴候または症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、詳細にはあくまで患者に対する限界効果を有するプロトコルを含む。
【0058】
用語「患者」、「対象」および「個体」は、本明細書中で交換可能に用いられ、治療薬が投与され得る生体系を指してもよい。生体系は、例えば、個別細胞、細胞セット（例えば細胞培養液）、臓器、組織、または多細胞生物を含み得る。「患者」、「対象」または「個体」は、ヒト患者、対象もしくは個体または非ヒト患者、対象もしくは個体を指し得る。
【0059】
用語「エピトープ」は、本明細書で用いられるとき、抗体またはＴ細胞が結合する抗原の領域を指してもよい。「抗原」は、免疫学的反応を誘発するかまたはその反応の生成物に結合する物質を指す。
【0060】
本明細書で用いられるとき、用語「ベクター」は、それが連結されている相手の別の核酸を輸送する能力がある核酸分子を意味する。ベクターが作動可能に連結される相手の遺伝子の発現を駆動する能力があるベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と称される。
【0061】
本明細書で用いられるとき、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾、例えばグリコシル化またはリン酸化と無関係に、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味するように同義的に用いられる。
【0062】
用語「標識される」は、抗体、核酸、ペプチド、ポリペプチド、細胞、またはプローブと関連して、検出可能な物質を抗体、核酸、ペプチド、ポリペプチド、細胞、またはプローブとカップリングする（すなわち物理的に連結する）ことによる、抗体、核酸、ペプチド、ポリペプチド、細胞、またはプローブの直接的標識を包含することが意図される。
【0063】
用語「精製された」または「単離された」ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、本明細書で用いられるようなペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指し、天然に会合される他のタンパク質、脂質、および核酸から分離されているペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指してもよい。ポリペプチド／タンパク質は、精製された調製物の乾燥重量で少なくとも１０％（すなわち、１０％～１００％の間の任意の百分率、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％）を構成し得る。純度は、任意の適切な標準的方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析により測定され得る。本発明に記載される単離されたポリペプチド／タンパク質（例えば抗－ＬＡＭ抗体）は、組換えＤＮＡ技術により産生され得る。
【0064】
Ｂ．結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
結核（ＴＢ）は、現在世界人口の約３分の１に感染する、世界的な史上最悪の感染性疾患の１つであり続けている。２０１３年、推定上９００万人がＴＢを発症し、推定上１，５００万人がその疾患で死亡した。現在、抗生物質治療が利用可能であるが、これらは長期間の治療を必要とし、最近の感染の約３．５％に現在関与している多剤耐性（ＭＤＲ－ＴＢ）株の発生により易感染性が高まっている。これらの株は、治療がはるかに困難化し、有意に低下した治癒率を有している。また広範囲薬剤耐性ＴＢ（ＸＤＲ－ＴＢ）株が伝播しており、それは治療がＭＤＲ－ＴＢ株よりもさらに高価になりかつ困難化し、今や世界中１００か国で報告されている。
結核（ＴＢ）は、現在世界人口の約３分の１に感染する、世界的な史上最悪の感染性疾患の１つであり続けている。２０１３年、推定上９００万人がＴＢを発症し、推定上１，５００万人がその疾患で死亡した。現在、抗生物質治療が利用可能であるが、これらは長期間の治療を必要とし、最近の感染の約３．５％に現在関与している多剤耐性（ＭＤＲ－ＴＢ）株の発生により易感染性が高まっている。これらの株は、治療がはるかに困難化し、有意に低下した治癒率を有している。また広範囲薬剤耐性ＴＢ（ＸＤＲ－ＴＢ）株が伝播しており、それは治療がＭＤＲ－ＴＢ株よりもさらに高価になりかつ困難化し、今や世界中１００か国で報告されている。
【0065】
ＴＢに対する免疫が専ら細胞防御機構に依存するという長く確立されたパラダイムがある。しかし、ＨＩＶ分野における試験では、ヒト体液性免疫系が著しい中和幅および効力を有する多様な抗体を産生する著しい能力が重視され、本発明では、体液性免疫系が複数のＬＡＭエピトープを認識する高親和性抗体を産生する能力が重視される。これは、ＴＢに対する抗体媒介性防御において重要な役割を示すことが過去困難であったことの多くが過去の試験で用いられた抗体の品質および供給源における制限に起因し得ることと、慢性的に感染したヒト患者からより高度に進化した抗体を産生することへの本発明の方法の適用が、ＴＢに対する免疫における体液性応答の重要な役割を例示し得ることを示唆する。
【0066】
本発明の一部の実施形態は、感染したヒトからのメモリーＢ細胞のインビトロ培養および単一細胞からのＩｇＧ重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖の可変領域の分子クローニングのための方法を対象とする。これらの方法は、主要表面抗原ＬＡＭに対するヒトモノクローナル抗体を産生するため、利用されてもよい。本発明は、固有のエピトープ特異性および結合特性を有するような抗体、およびこれらの抗体の改変された誘導体、ならびにこれらの抗体の免疫診断および免疫療法用途に関する。
【0067】
Ｃ．リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）
本発明の抗体の１つの顕著な抗原標的は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体メンバーの細胞壁の主要な構成成分である、表面糖脂質のリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）である。本発明では、ＬＡＭの抗原構造ならびに感染および免疫に応答したＬＡＭに対する体液性免疫応答における、以前は価値を認められてなかった異質性が同定される。ＬＡＭの構造は、Ｋｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｎｎｏｓｅ－ｃａｐｐｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ａｒａｂｉｎａｎ Ｍｏｔｉｆｓ ｏｆ Ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ ｆｒｏｍ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ２７６，Ｎｏ．６，Ｆｅｂ９，２００１（その全体が参照により本明細書中に援用される）に詳述されている。ＬＡＭの構造は、４つの異なる構造ドメイン；ホスファチジルイノシトール脂質アンカー（マンノシル－ホスファチジル－ミオ－イノシトール）、末端にα（１→２）－Ｍａｎｐ連結側鎖を有するα（１→６）連結Ｄ－マンナン骨格、複数のテトラ－／ヘキサ－アラビノフラノシド分枝を有するＤ－アラビナン鎖、および様々なキャッピングモチーフを伴う全体的な三者構造を呈する複合体である。ＬＡＭは、異なる生物学的特性を有する複数のアイソフォームに分解可能な分子の異質性集団からなる。この異質性は、様々な長さのマンナンおよびアラビノ鎖、異なる分岐パターン、様々な数のかかる分枝、ならびにマンノースキャッピング、ＭＴＸ付加、および脂肪酸、コハク酸および乳酸によるアシル化によるアラビノ側鎖の修飾に起因する。
本発明の抗体の１つの顕著な抗原標的は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体メンバーの細胞壁の主要な構成成分である、表面糖脂質のリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）である。本発明では、ＬＡＭの抗原構造ならびに感染および免疫に応答したＬＡＭに対する体液性免疫応答における、以前は価値を認められてなかった異質性が同定される。ＬＡＭの構造は、Ｋｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｎｎｏｓｅ－ｃａｐｐｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ａｒａｂｉｎａｎ Ｍｏｔｉｆｓ ｏｆ Ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ ｆｒｏｍ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ２７６，Ｎｏ．６，Ｆｅｂ９，２００１（その全体が参照により本明細書中に援用される）に詳述されている。ＬＡＭの構造は、４つの異なる構造ドメイン；ホスファチジルイノシトール脂質アンカー（マンノシル－ホスファチジル－ミオ－イノシトール）、末端にα（１→２）－Ｍａｎｐ連結側鎖を有するα（１→６）連結Ｄ－マンナン骨格、複数のテトラ－／ヘキサ－アラビノフラノシド分枝を有するＤ－アラビナン鎖、および様々なキャッピングモチーフを伴う全体的な三者構造を呈する複合体である。ＬＡＭは、異なる生物学的特性を有する複数のアイソフォームに分解可能な分子の異質性集団からなる。この異質性は、様々な長さのマンナンおよびアラビノ鎖、異なる分岐パターン、様々な数のかかる分枝、ならびにマンノースキャッピング、ＭＴＸ付加、および脂肪酸、コハク酸および乳酸によるアシル化によるアラビノ側鎖の修飾に起因する。
【0068】
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株は、モノ－、ジ－、およびトリ－α（１→２）－Ｄ－Ｍａｎｐ糖単位で広範にキャッピングされる一方で、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のような迅速に増殖する非病原性株は、キャップのない末端またはホスファチジル－ミオ－イノシトールキャップ（ＰＩＬＡＭ）を有する。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の病原性株からのＬＡＭの非還元末端の４０～７０％がマンノースでキャッピングされると推定されており、毒性ＭＴ１０３臨床株における異なるキャップモチーフの相対的存在量の分析によると、ジマンノシル単位が主要な構造モチーフである（７５～８０％）一方で、マンノシルおよびトリマンノシルモチーフがより低い濃度（１０～１３％）で存在することが示された。この広範なキャッピングは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株を非毒性／非病原性株、例えばスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）から分化させる上での固有のマーカーを提示し得、本発明の抗－ＬＡＭ抗体の治療的使用にとって有望な抗原標的をさらに提供し得る。さらに、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株中に見出されるＭａｎＬＡＭ中の末端マンノース糖の一部は、キャッピングモチーフに感受性を示す異なるｍＡｂ、例えばＡ１９４－０１およびＰ３０Ｂ９に対する免疫反応性に影響する、固有の構造５－デオキシ－５－メチル－チオ－ペントフラノース（ＭＴＸ）のα（１→４）付加によりさらに修飾され；ＭＴＸ付加は、Ａ１９４－０１との反応性を増強し、Ｐ３０Ｂ９に対する反応性を低下させる。この置換は、低存在量で存在し、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、潜在的にはさらに結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の他の毒性メンバー、例えばウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）およびマイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）から同定するための固有のマーカーを提示し得、本発明の抗－ＬＡＭ抗体の治療的使用にとって有望な抗原標的をさらに提供し得る。
【0069】
ＬＡＭの分泌型は、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の病原性メンバーによる感染の免疫診断アッセイにおける重要な標的である。さらに、大量な一連の証拠によると、ＬＡＭが増殖性感染および病原性を促進する幾つかの機能の重要なメディエーターであることが示される。ＬＡＭは、細胞壁の完全性およびβラクタム抗生物質に対する耐性を維持することに関与する。細菌表面上でのＬＡＭの発現低下は、欠損マクロファージの侵入、ファゴソーム－リソソーム融合の阻害、マクロファージにおける減衰、および獲得免疫に対する感受性増強と相関し、ＭａｎＬＡＭの末端マンノシル単位のマクロファージ表面上のマンノース受容体への結合については、マイコバクテリアの食細胞への取り込みにおける重要な段階として記載されている。理論に拘束されたくないが、ＭａｎＬＡＭが、樹状細胞上のＣ型レクチン、例えば、樹状細胞特異性の細胞間接着分子－３（ＩＣＡＭ－３）略奪性非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）およびデクチン２と相互作用すると考えられる。一旦マクロファージ内部にあれば、ＬＡＭは、細菌の破壊をもたらし、それにより細菌がマクロファージ内部で存続することを可能にするファゴソーム－リソソーム融合を阻害すると考えられる。
【0070】
ＬＡＭはまた、細菌の表面から分泌され、細胞外ＬＡＭは、ＤＣ－ＳＩＧＮおよびデクチン２を含む樹状細胞－表面受容体に結合する。これらの相互作用は、樹状細胞機能を抑制し、宿主免疫系に干渉することで、免疫回避に寄与すると考えられる。ＬＡＭが活動性感染中に比較的大量に存在することから、それは、例えば本発明の１つ以上の抗－ＬＡＭ抗体により、感染患者の血中および尿中で検出され得る。これらは、例えば診断キットおよび前記診断キットに関する方法にて用いられてもよい。
【0071】
Ｄ．抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体
本発明の抗－ＬＡＭ抗体は、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）上の少なくとも１つのエピトープを認識するヒトモノクローナル抗体の単離、培養、または改変された変異体および／または誘導体を含んでもよい。本明細書に記載のような抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体（例えばＰ９５Ｃ１）は、ＰＩＭ６中およびＬＡＭのＰＩＭ６交差反応性マンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合する。本発明の抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、当該技術分野で公知の方法に従って精製されてもよい。かかる方法は、例えば限定はされないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属キレートクロマトグラフィー、チオフィリック吸着、生理化学的分画（ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、または他の抗原特異的なアフィニティー法、例えばプロテインＡ、Ｇ、およびＬ抗体結合リガンドを含む方法を含んでもよい。かかる精製抗体は、精製されていないヒトモノクローナル抗体と異なる構造特徴を有する場合または有しない場合がある。例えば、精製時、ヒトモノクローナル抗体における立体構造エピトープの変化が生じることがある。抗体は、精製時に除去されるさらなる分子に結合されてもよい。したがって、かかる精製抗体は、異なる機能的活性を有する場合または有しない場合がある。本発明の抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、幾つかの構造修飾を有してもよい。例えば、本発明の抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、グリコシル化、ＰＥＧ化、またはその他として、安定性、機能、バイオアベイラビリティ、エピトープ認識、もしくは他の機能的活性に影響するような様式で化学修飾されてもよい。本発明の抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、以下に記載される抗体の改変された変異体および／または誘導体であってもよく、機能的または構造的等価物を有する場合もしくは有しない場合がある。したがって、かかる変異体および／または誘導体は、少なくとも一部には単離されたヒトモノクローナル抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体から誘導もしくは改変され、かつ／またはＬＡＭ上の少なくとも１つのエピトープを認識する限り、本発明の範囲内でさらに検討される。
本発明の抗－ＬＡＭ抗体は、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）上の少なくとも１つのエピトープを認識するヒトモノクローナル抗体の単離、培養、または改変された変異体および／または誘導体を含んでもよい。本明細書に記載のような抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体（例えばＰ９５Ｃ１）は、ＰＩＭ６中およびＬＡＭのＰＩＭ６交差反応性マンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造に特異的に結合する。本発明の抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、当該技術分野で公知の方法に従って精製されてもよい。かかる方法は、例えば限定はされないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属キレートクロマトグラフィー、チオフィリック吸着、生理化学的分画（ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、または他の抗原特異的なアフィニティー法、例えばプロテインＡ、Ｇ、およびＬ抗体結合リガンドを含む方法を含んでもよい。かかる精製抗体は、精製されていないヒトモノクローナル抗体と異なる構造特徴を有する場合または有しない場合がある。例えば、精製時、ヒトモノクローナル抗体における立体構造エピトープの変化が生じることがある。抗体は、精製時に除去されるさらなる分子に結合されてもよい。したがって、かかる精製抗体は、異なる機能的活性を有する場合または有しない場合がある。本発明の抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、幾つかの構造修飾を有してもよい。例えば、本発明の抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、グリコシル化、ＰＥＧ化、またはその他として、安定性、機能、バイオアベイラビリティ、エピトープ認識、もしくは他の機能的活性に影響するような様式で化学修飾されてもよい。本発明の抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、以下に記載される抗体の改変された変異体および／または誘導体であってもよく、機能的または構造的等価物を有する場合もしくは有しない場合がある。したがって、かかる変異体および／または誘導体は、少なくとも一部には単離されたヒトモノクローナル抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体から誘導もしくは改変され、かつ／またはＬＡＭ上の少なくとも１つのエピトープを認識する限り、本発明の範囲内でさらに検討される。
【0072】
１．Ａ１９４－０１
一部の実施形態では、本発明は、ヒトモノクローナル抗体Ａ１９４－０１、例えばその変異体および／または誘導体などを対象とする。Ａ１９４－０１はＬＡＭに特異的である。Ａ１９４－０１は、ＬＡＭに対して非常に高い結合活性を有し、例えば、Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプは、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で抗体の最大結合活性の５０％を示し、故にＬＡＭに対する高親和性を示し得る。Ａ１９４－０１は、最初に単離され、ＩｇＧとして精製されたが、Ａ１９４－０１は、幾つかのアイソタイプ、ならびに限定はされないが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、一価一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂタンパク質、二価ｓｃＦｖ断片、一本鎖ｓｃＦｖ断片（単量体）、および２つのｓｃＦｖ単量体が互いに連結された二量体ｓｃＦｖタンパク質を含む改変および組換えアイソタイプとして存在し得、ここで個別の可変軽および可変重領域は、例えば可動性リンカーによって連結される（図１Ａ）。Ａ１９４－０１の一部の特定の改変された変異体および／または誘導体は、限定はされないが、以下を含む。Ａ１９４－０１の１つの改変された変異体および／または誘導体は、Ａ１９４－０１ ｓｃＦｖ抗原をＡ１９４－０１ ＩｇＧのＮ末端に連結することによって形成される四価ｓｃＦｖ－ＩｇＧを含み（図１Ｂ、図１７）、それは結合親和性を増加させ、認識されるエピトープの範囲を拡大し得る（この例が図１４および１５に示される）。四価ｓｃＦｖ－ＩｇＧは、リーダー－ＶＨ－ＶＬ－ＩｇＧを含んでもよく、またはリーダー－ＶＬ－ＶＨ－ＩｇＧを含んでもよい。改変されたｓｃＦｖ－ＩｇＧ変異体および／または誘導体がまさに四価を超える結合価を有してもよいことを当業者は理解するであろう。Ａ１９４－０１の別の改変された変異体および／または誘導体は、二量体Ａ１９４－０１ ＩｇＧをヒトＩｇＭ含有ドメインに変換することによって作製される五価ＩｇＭを含み、かかる五価ＩｇＭは１０の結合部位を含む（図１Ｂ）。当業者は、Ａ１９４－０１抗原断片、特にＡ１９４－０１に特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）を呈する抗体断片のさらなる組み合わせが可能であり、本発明の範囲内で考えられることを理解するであろう。
一部の実施形態では、本発明は、ヒトモノクローナル抗体Ａ１９４－０１、例えばその変異体および／または誘導体などを対象とする。Ａ１９４－０１はＬＡＭに特異的である。Ａ１９４－０１は、ＬＡＭに対して非常に高い結合活性を有し、例えば、Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプは、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で抗体の最大結合活性の５０％を示し、故にＬＡＭに対する高親和性を示し得る。Ａ１９４－０１は、最初に単離され、ＩｇＧとして精製されたが、Ａ１９４－０１は、幾つかのアイソタイプ、ならびに限定はされないが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、一価一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂタンパク質、二価ｓｃＦｖ断片、一本鎖ｓｃＦｖ断片（単量体）、および２つのｓｃＦｖ単量体が互いに連結された二量体ｓｃＦｖタンパク質を含む改変および組換えアイソタイプとして存在し得、ここで個別の可変軽および可変重領域は、例えば可動性リンカーによって連結される（図１Ａ）。Ａ１９４－０１の一部の特定の改変された変異体および／または誘導体は、限定はされないが、以下を含む。Ａ１９４－０１の１つの改変された変異体および／または誘導体は、Ａ１９４－０１ ｓｃＦｖ抗原をＡ１９４－０１ ＩｇＧのＮ末端に連結することによって形成される四価ｓｃＦｖ－ＩｇＧを含み（図１Ｂ、図１７）、それは結合親和性を増加させ、認識されるエピトープの範囲を拡大し得る（この例が図１４および１５に示される）。四価ｓｃＦｖ－ＩｇＧは、リーダー－ＶＨ－ＶＬ－ＩｇＧを含んでもよく、またはリーダー－ＶＬ－ＶＨ－ＩｇＧを含んでもよい。改変されたｓｃＦｖ－ＩｇＧ変異体および／または誘導体がまさに四価を超える結合価を有してもよいことを当業者は理解するであろう。Ａ１９４－０１の別の改変された変異体および／または誘導体は、二量体Ａ１９４－０１ ＩｇＧをヒトＩｇＭ含有ドメインに変換することによって作製される五価ＩｇＭを含み、かかる五価ＩｇＭは１０の結合部位を含む（図１Ｂ）。当業者は、Ａ１９４－０１抗原断片、特にＡ１９４－０１に特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）を呈する抗体断片のさらなる組み合わせが可能であり、本発明の範囲内で考えられることを理解するであろう。
【0073】
Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプは、非修飾Ａｒａ４およびＡｒａ６側鎖ならびに単一のマンノースを有する側鎖で発現される固有の複合エピトープを認識する。Ａ１９４－０１はジまたはトリマンノース置換を有する側鎖を認識しないが、それら側鎖がＭＳＸ置換基でさらに修飾される場合、Ａ１９４－０１はかかる構造と確かに反応する。したがって、Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプは、ＰＩＬＡＭおよびＭａｎＬＡＭに高い親和性で結合し、ひいてはＡｒａ４およびＡｒａ６構造双方のキャップのないバージョンと強力に結合し、単一のマンノースでキャッピングされたＭＳＸ置換Ａｒａ４／Ａｒａ６構造への結合はいくらかあまり強力でないが、ジ置換およびトリ置換ＭａｎＬＡＭに対してはあるにしても弱い（図４）。理論に拘束されたくないが、モノマンノシル化Ａｒａ４構造の末端マンノースに対するマンノース対ＭＳＸの付着の顕著に異なる効果は、マンノースのα（１→２）結合とＭＳＸ置換α（１→４）結合との間の差異を反映し得る。Ａ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体、例えばより高い結合価を有するものは、Ａ１９４－０１ ＩｇＧアイソタイプよりも広範なエピトープ特異性を示し得（図１４）、ＬＡＭに対する増強された親和性をさらに示し得る（図１５）。例えば、四価ｓｃＦｖ－ＩｇＧで改変されたＡ１９４－０１ならびに改変されたＩｇＡおよびＩｇＭアイソタイプは、Ａ１９４－０１ ＩｇＧアイソタイプよりも高い親和性でＡｒａ４およびＡｒａ６構造双方に結合するだけでなく、さらに、ＩｇＧアイソタイプが弱く結合する、ジマンノースでキャッピングされた構造およびトリマンノースでキャッピングされた構造を認識する（図１４）。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の病原性種が主にジマンノースでキャッピングされた構造を示すことから、Ａ１９４－０１のこれらの改変された変異体および／または誘導体、例えばｓｃＦｖ－ＩｇＧおよびＩｇＭアイソタイプは、診断キットおよび方法、ならびに治療使用にとって特に有用であることが判明し得る。
【0074】
Ａ１９４－０１のさらに改変された変異体および／または誘導体は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインがよりオプソジェニック（ｏｐｓｏｇｅｎｉｃ）ＩｇＧ３に、すなわち多量体バージョンを作製することにより、ＩｇＧ１定常ドメインを二量体ＩｇＡまたは五量体もしくは六量体ＩｇＭにより置換することにより変換された抗体を含む。理論に拘束されたくないが、これは、抗－ＬＡＭ抗体の結合活性を、親和性に寄与する二価および多価結合の可動性および範囲を増加させることにより著しく増強し得る（図１）。これは、従来の抗生物質で有効に治療され得ない、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＭＤＲまたはＸ－ＭＤＲ株による曝露または感染の場合に治療が特に有用になると、潜在的な臨床的重要性がある。
【0075】
表１．Ａ１９４－０１の相補性決定領域（ＣＤＲ）
軽鎖
ＣＤＲ１－ＲＳＩＲＳＡ（配列番号１）
ＣＤＲ２－ＧＡＳ（配列番号２）
ＣＤＲ３－ＱＱＹＤＦＷＹＴＦ（配列番号３）
重鎖
ＣＤＲ１－ＧＦＮＦＥＤＦＧ（配列番号４）
ＣＤＲ２－ＩＳＷＮＧＡＮＩ（配列番号５）
ＣＤＲ３－ＩＤＷＹＲＤＤＹＹＫＭＤＶ（配列番号６）
軽鎖
ＣＤＲ１－ＲＳＩＲＳＡ（配列番号１）
ＣＤＲ２－ＧＡＳ（配列番号２）
ＣＤＲ３－ＱＱＹＤＦＷＹＴＦ（配列番号３）
重鎖
ＣＤＲ１－ＧＦＮＦＥＤＦＧ（配列番号４）
ＣＤＲ２－ＩＳＷＮＧＡＮＩ（配列番号５）
ＣＤＲ３－ＩＤＷＹＲＤＤＹＹＫＭＤＶ（配列番号６）
【0076】
当業者は、ＣＤＲが抗原特異性の多様性にとって重要であることを理解するであろう。当業者は、ＣＤＲ３がＣＤＲ領域で最も可変であり、それ故に最重要性を有し、可変重鎖のＣＤＲ３領域における多様性が大部分の抗体特異性にとって十分であることをさらに理解するであろう。したがって、一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域（各々、配列番号１、２および３で示される）を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、保存的配列修飾を伴う可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域（各々、配列番号１、２および３で示される）を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１、２、および３の各々と最大９５％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１、２、および３の各々と最大９０％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１、２、および３の各々と最大８５％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１、２、および３の各々と最大８０％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号３で示されるような可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、保存的配列修飾を伴う配列番号３で示されるような可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号３と最大９５％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号３と最大９０％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号３と最大８５％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号３と最大８０％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。
【0077】
一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号４、５および６の各々に示されるような可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、保存的配列修飾を伴う配列番号４、５および６の各々に示されるような可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号４、５および６の各々と最大９５％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号４、５および６の各々と最大９０％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号４、５および６の各々と最大８５％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号４、５および６の各々と最大８０％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号６で示されるような可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、保存的配列修飾を伴う配列番号６で示されるような可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号６と最大９５％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号６と最大９０％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号６と最大８５％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号６と最大８０％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。
【0078】
本明細書に記載の実験では、Ａ１９４－０１抗体は、Ｅｘｐｉ２９３細胞へのＨおよびＬ鎖ベクターの遺伝子導入により発現され、標準のＥｘｐｉ２９３無血清培地中で数日間培養された。分泌された抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧリガンドとコンジュゲートされたカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより培養上清から精製された。結合された抗体は、低ｐＨ緩衝液（０．２Ｍグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．５）による処理によりリガンドから放出され、１／５０体積の２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．８）で中和された。緩衝液は、透析または遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター、３０Ｋ ｍｗの限界）での数回の濃縮により、ＰＢＳと交換された。
【0079】
Ａ１９４重鎖および軽鎖配列におけるアミノ酸（ａａ）および核酸（ｎｔ）配列は以下の通りである。
Ａ１９４重鎖ｎｔ配列：
Ａ１９４重鎖ａａ配列：
Ａ１９４軽鎖ｎｔ配列（κ）：
Ａ１９４軽鎖ａａ配列（κ）：
Ａ１９４重鎖ｎｔ配列：
【0080】
２．Ｐ３０Ｂ９
一部の実施形態では、本発明は、組換えヒトモノクローナル抗体Ｐ３０Ｂ９、例えばその変異体および／または誘導体などを対象とする。Ｐ３０Ｂ９はＬＡＭに特異的である。Ｐ３０Ｂ９は、最初にＩｇＭとして単離および精製されたが、Ｐ３０Ｂ９は、幾つかのアイソタイプ、ならびに改変された組換えアイソタイプ、例えば限定はされないが、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ならびにそれらの抗原断片、例えば限定はされないが、一価一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂタンパク質、二価ｓｃＦｖ断片、一本鎖ｓｃＦｖ断片（単量体）（個別の可変軽および可変重領域は、例えば可動性リンカーにより連結される）２つのｓｃＦｖ単量体が相互に連結された二量体ｓｃＦｖタンパク質で存在してもよい。
一部の実施形態では、本発明は、組換えヒトモノクローナル抗体Ｐ３０Ｂ９、例えばその変異体および／または誘導体などを対象とする。Ｐ３０Ｂ９はＬＡＭに特異的である。Ｐ３０Ｂ９は、最初にＩｇＭとして単離および精製されたが、Ｐ３０Ｂ９は、幾つかのアイソタイプ、ならびに改変された組換えアイソタイプ、例えば限定はされないが、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ならびにそれらの抗原断片、例えば限定はされないが、一価一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂタンパク質、二価ｓｃＦｖ断片、一本鎖ｓｃＦｖ断片（単量体）（個別の可変軽および可変重領域は、例えば可動性リンカーにより連結される）２つのｓｃＦｖ単量体が相互に連結された二量体ｓｃＦｖタンパク質で存在してもよい。
【0081】
Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭアイソタイプは、Ｍａｎｐ－α（１→２）－Ｍａｎｐ－（１→５）－Ａｒａｆ構造を有するジマンノース置換Ａｒａ４およびＡｒａ６ ＬＡＭエピトープに最も強力に結合するが（図４、１６および１８）、他のＭａｎｐ－α置換構造（例えば、図８中の構造２、４および５９）についても、より低い親和性で認識され得る。ジマンノースでキャッピングされたＬＡＭに対するＰ３０Ｂ９の優先的認識は、ジマンノースキャップが結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株に対するドミナントなＬＡＭ修飾であることが報告されていることから、潜在的な臨床的意義を有する。理論に拘束されたくないが、末端のマンノシル単位が、免疫機能の攪乱および安定な感染の確立をもたらす、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株からのＬＡＭのヒトマクロファージおよび他の免疫細胞への結合を媒介すると考えられる。理論に拘束されたくないが、マンノースキャップのマンノース受容体への結合は、ファゴソーム－リソソーム（Ｐ－Ｌ）融合を制限し、かつ感染マクロファージにおける細菌の生存を促進すると考えられる。Ｐ３０Ｂ９のジマンノースでキャッピングされたＬＡＭに対する特異性は、このｍＡｂのこの構造を有する複合糖質に対する特異性により、また、Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭアイソタイプが、いずれかの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＬＡＭに特異的に結合するが、ジマンノースでキャッピングされたＬＡＭエピトープを有しないスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）またはライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）由来のＬＡＭに特異的に結合しないという事実において示される。これは、ＰＩＬＡＭ、キャップのないＡｒａ４／Ａｒａ６残基、およびモノマンノースでキャッピングされたＬＡＭエピトープ（これらのすべてはスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）およびライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）において共通である）に結合する、Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプと対照的である。Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭアイソタイプと同様、Ａ１９４－０１のＩｇＭアイソタイプは、おそらくは結合活性の増強に起因して、ジマンノースでキャッピングされたＬＡＭエピトープおよびトリマンノースでキャッピングされたＬＡＭエピトープに結合することができる（図１４）。
【0082】
したがって、Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭアイソタイプは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性メンバーによる感染を検出し、それがジマンノースでキャッピングされたＬＡＭに特異的であることから、前記毒性メンバーを他の非病原性マイコバクテリア種から区別するための重要な免疫診断試薬として役立ち得る。さらに、Ｐ３０Ｂ９抗体のＩｇＭアイソタイプならびにＡ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性メンバーの感染および病態形成を制限する免疫治療活性を有し得るか、伝統的な抗生物質、追加的な抗体との組み合わせまたは単独のいずれかでの治療における使用に適し得るか、または受動免疫療法薬として用いられ得る。Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭアイソタイプは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来するＭａｎＬＡＭに高い親和性で特異的に結合するが（図２Ａ、Ｂ）、スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）に由来するＰＩＬＡＭにはそうではない（図２Ｃ）。
【0083】
Ｐ３０Ｂ９の改変された変異体および／または誘導体は、例えば、二量体ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むＩｇＡアイソタイプにおいて発現されるＰ３０Ｂ９を含んでもよい。理論に拘束されたくないが、この抗体がＩｇＭとして単離され、ＩｇＧとして発現されるときに活性を示さないことから、多価性がＰ３０Ｂ９の機能に要求されると考えられる。本発明は、Ｐ３０Ｂ９が、二量体ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む改変されたＩｇＡアイソタイプにおいて活性があることを示す。これはＰ３０Ｂ９ ＶＨドメインをＩｇＡ１およびＩｇＡ２ベクターに移すことにより試験された。ＩｇＡ１は、プロリン、セリン、およびスレオニン中に豊富に存在する８個のアミノ酸のリピートからなり、かつ３～６個のＯ結合型オリゴ糖で修飾された１６のアミノ酸挿入の存在により、ＩｇＡ２と異なる［図５］。Ｐ３０Ｂ９の改変されたＩｇＡ型のＭａｎＬＡＭに対する結合活性が、ＩｇＧおよびＩｇＭ型の場合と比較された。ＩｇＭ型が最高の活性を有した一方で、ＩｇＡ型は双方ともＭａｎＬＡＭに結合することができ、ＩｇＡ２形態はＩｇＡ１形態よりも弱い活性を示し、ＩｇＧ型はＭａｎＬＡＭに対するＥＬＩＳＡにおいて不活性であった（図６）。
【0084】
表２．Ｐ３０Ｂ９の相補性決定領域（ＣＤＲ）
軽鎖
ＣＤＲ１－ＱＳＩＮＳＮ（配列番号７）
ＣＤＲ２－ＫＡＳ（配列番号８）
ＣＤＲ３－ＱＱＹＫＡＦＫＴＦ（配列番号９）
重鎖
ＣＤＲ１－ＧＧＳＦＳＧＹＹ（配列番号１０）
ＣＤＲ２－ＦＤＬＧＧＳＩＴＨＳＲＧＴ（配列番号１１）
ＣＤＲ３－ＲＧＬＡＭＧＧＴＫＥＦＤＳ（配列番号１２）
軽鎖
ＣＤＲ１－ＱＳＩＮＳＮ（配列番号７）
ＣＤＲ２－ＫＡＳ（配列番号８）
ＣＤＲ３－ＱＱＹＫＡＦＫＴＦ（配列番号９）
重鎖
ＣＤＲ１－ＧＧＳＦＳＧＹＹ（配列番号１０）
ＣＤＲ２－ＦＤＬＧＧＳＩＴＨＳＲＧＴ（配列番号１１）
ＣＤＲ３－ＲＧＬＡＭＧＧＴＫＥＦＤＳ（配列番号１２）
【0085】
当業者は、ＣＤＲが抗原特異性の多様性にとって重要であることを理解するであろう。当業者は、ＣＤＲ３がＣＤＲ領域で最も可変であり、それ故に最重要性を有し、可変重鎖のＣＤＲ３領域における多様性が大部分の抗体特異性にとって十分であることをさらに理解するであろう。したがって、一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域（各々、配列番号７、８および９で示される）を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、保存的配列修飾を伴う可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域（各々、配列番号７、８および９で示される）を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号７、８、および９の各々と最大９５％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号７、８、および９の各々と最大９０％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号７、８、および９の各々と最大８５％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号７、８、および９の各々と最大８０％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号９で示されるような可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、保存的配列修飾を伴う配列番号９で示されるような可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号９と最大９５％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号９と最大９０％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号９と最大８５％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号９と最大８０％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。
【0086】
一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１０、１１および１２の各々に示されるような可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、保存的配列修飾を伴う配列番号１０、１１および１２の各々に示されるような可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１０、１１および１２の各々と最大９５％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１０、１１および１２の各々と最大９０％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１０、１１および１２の各々と最大８５％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１０、１１および１２の各々と最大８０％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１２で示されるような可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、保存的配列修飾を伴う配列番号１２で示されるような可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１２と最大９５％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１２と最大９０％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１２と最大８５％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１２と最大８０％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。
【0087】
本明細書に記載の実験では、Ｐ３０Ｂ９抗体は、Ｅｘｐｉ２９３細胞へのＨおよびＬ鎖ベクターの遺伝子導入により発現され、標準のＥｘｐｉ２９３無血清培地中で数日間培養された。分泌された抗体は、プロテインＬリガンドとコンジュゲートされたカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより培養上清から精製された。結合された抗体は、低ｐＨ緩衝液（０．２Ｍグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．５）による処理によりリガンドから放出され、１／５０体積の２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．８）で中和された。緩衝液は、透析または遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター、３０Ｋ ｍｗの限界）での数回の濃縮により、ＰＢＳと交換された。
【0088】
Ｐ３０Ｂ９重鎖および軽鎖配列におけるアミノ酸配列ならびにその最も近い生殖系列とのそれらの比較は図２２に示される。ＣＤＲ３領域を含むＰ３０Ｂ９におけるアミノ酸およびヌクレオチド配列は以下に複写される。
Ｐ３０Ｂ９－重鎖可変領域：
Ｐ３０Ｂ９－軽鎖可変領域：
Ｐ３０Ｂ９－重鎖ＤＮＡ配列：
Ｐ３０Ｂ９－軽鎖：
Ｐ３０Ｂ９－重鎖可変領域：
【0089】
３．Ｐ９５Ｃ１
一部の実施形態では、本発明は、組換えヒトモノクローナル抗体Ｐ９５Ｃ１、例えばその変異体および／または誘導体などを対象とする。Ｐ９５Ｃ１は、ＬＡＭ、ＬＭおよびＰＩＭ６によって共有されるエピトープに特異的である。Ｐ９５Ｃ１は、最初にＩｇＭとして単離および精製されたが、Ｐ９５Ｃ１は、他のアイソタイプ、例えば限定はされないが、ＩｇＧおよびＩｇＡ型で発現されるとき、活性がある。
一部の実施形態では、本発明は、組換えヒトモノクローナル抗体Ｐ９５Ｃ１、例えばその変異体および／または誘導体などを対象とする。Ｐ９５Ｃ１は、ＬＡＭ、ＬＭおよびＰＩＭ６によって共有されるエピトープに特異的である。Ｐ９５Ｃ１は、最初にＩｇＭとして単離および精製されたが、Ｐ９５Ｃ１は、他のアイソタイプ、例えば限定はされないが、ＩｇＧおよびＩｇＡ型で発現されるとき、活性がある。
【0090】
当業者は、ＣＤＲが抗原特異性の多様性にとって重要であることを理解するであろう。当業者は、ＣＤＲ３がＣＤＲ領域で最も可変であり、それ故に最重要性を有し、可変重鎖のＣＤＲ３領域における多様性が大部分の抗体特異性にとって十分であることをさらに理解するであろう。したがって、一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域（各々、配列番号１３、１４および１５で示される）を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、保存的配列修飾を伴う可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域（各々、配列番号１３、１４および１５で示される）を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１３、１４および１５の各々と最大９５％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１３、１４および１５の各々と最大９０％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１３、１４および１５の各々と最大８５％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１３、１４および１５の各々と最大８０％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１５で示されるような可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、保存的配列修飾を伴う配列番号１５で示されるような可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１５と最大９５％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１５と最大９０％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１５と最大８５％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１５と最大８０％の同一性を有する可変軽鎖のＣＤＲ３領域を有する。
【0091】
一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１６、１７および１８の各々に示されるような可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、保存的配列修飾を伴う配列番号１６、１７および１８の各々に示されるような可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１６、１７および１８の各々と最大９５％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１６、１７および１８の各々と最大９０％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１６、１７および１８の各々と最大８５％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１６、１７および１８の各々と最大８０％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１８で示されるような可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。一部の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、保存的配列修飾を伴う配列番号１８で示されるような可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１８と最大９５％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１８と最大９０％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１８と最大８５％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。他の実施形態では、抗－ＬＡＭ抗体は、配列番号１８と最大８０％の同一性を有する可変重鎖のＣＤＲ３領域を有する。
【0092】
表３．Ｐ９５Ｃ１の相補性決定領域（ＣＤＲ）
軽鎖
ＣＤＲ１：ＱＮＶＬＤＳＡＮＮＲＮＹ（配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＷＡＳ（配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＴＱＹＨＲＬＰＨＴ（配列番号１５）
重鎖
ＣＤＲ１：ＧＧＳＩＮＴＮＮＷ（配列番号１６）
ＣＤＲ２：ＩＨＲＨＧＤＴ（配列番号１７）
ＣＤＲ３：ＣＰＬＧＹＣＳＧＤＤＣＨＲＶＡ（配列番号１８）
軽鎖
ＣＤＲ１：ＱＮＶＬＤＳＡＮＮＲＮＹ（配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＷＡＳ（配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＴＱＹＨＲＬＰＨＴ（配列番号１５）
重鎖
ＣＤＲ１：ＧＧＳＩＮＴＮＮＷ（配列番号１６）
ＣＤＲ２：ＩＨＲＨＧＤＴ（配列番号１７）
ＣＤＲ３：ＣＰＬＧＹＣＳＧＤＤＣＨＲＶＡ（配列番号１８）
【0093】
Ｐ９５Ｃ１ ＩｇＭ／κ抗体が、ＢＣＬ６／Ｂｃｌ－ｘＬが形質導入されたメモリーＢ細胞の上清中で最初に同定され、標準のＲＴ－ＰＣＲプロトコルを用いて、これらの細胞からＩｇＭ／κ発現ベクターにクローン化された。抗体は、ＨおよびＬ鎖ベクターのＥｘｐｉ２９３細胞への遺伝子導入により発現され、標準のＥｘｐｉ２９３無血清培地中で数日間培養された。分泌された抗体は、プロテインＬリガンドとコンジュゲートされたカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより培養上清から精製された。結合された抗体は、低ｐＨ緩衝液（０．２Ｍグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．５）による処理によりリガンドから放出され、１／５０体積の２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．８）で中和された。緩衝液は、透析または遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター、３０Ｋ ｍｗの限界）での数回の濃縮により、ＰＢＳと交換された。
【0094】
Ｐ９５Ｃ１重鎖および軽鎖におけるアミノ酸配列ならびにその最も近い生殖系列とのそれらの比較は図２３に示される。ＣＤＲ３領域を含むＰ９５Ｃ１におけるアミノ酸およびヌクレオチド配列は以下に複写される。
Ｐ９５Ｃ１－重鎖可変領域：
Ｐ９５Ｃ１－軽鎖可変領域：
Ｐ９５Ｃ１－重鎖：
Ｐ９５Ｃ１－軽鎖：
Ｐ９５Ｃ１－重鎖可変領域：
【0095】
Ｅ．さらなる変異体および／または誘導体
Ａ１９４－０１、Ｐ３０Ｂ９、およびＰ９５Ｃ１のＣＤＲ領域を考慮すると、本明細書に開示される抗－ＬＡＭ抗体の多数の改変された変異体および／または誘導体が構築され得ることを当業者は理解するであろう。例えば、本発明の抗－ＬＡＭ抗体は、１つ以上のＬＡＭエピトープに対して親和性を示すキメラ抗体、ヒト化抗体、およびキメラ／ヒト化抗体に改変されてもよい。抗体は、二重特異性抗体に改変されてもよく、または単一の抗体構築物が複数のＬＡＭエピトープに結合するように改変されてもよい。
Ａ１９４－０１、Ｐ３０Ｂ９、およびＰ９５Ｃ１のＣＤＲ領域を考慮すると、本明細書に開示される抗－ＬＡＭ抗体の多数の改変された変異体および／または誘導体が構築され得ることを当業者は理解するであろう。例えば、本発明の抗－ＬＡＭ抗体は、１つ以上のＬＡＭエピトープに対して親和性を示すキメラ抗体、ヒト化抗体、およびキメラ／ヒト化抗体に改変されてもよい。抗体は、二重特異性抗体に改変されてもよく、または単一の抗体構築物が複数のＬＡＭエピトープに結合するように改変されてもよい。
【0096】
本明細書に記載の通り、本発明の抗－ＬＡＭ抗体は、相同ｓｃＦｖ－ＩｇＧ構築物または異種ｓｃＦｖ－ＩｇＧ構築物として設計されてもよい。Ａ１９４－０１の相同ｓｃＦｖ－ＩｇＧ構築物は、本願中に詳述されている（図１７Ａ）。異種ｓｃＦｖ－ＩｇＧ構築物の一非限定例であれば、Ｐ３０Ｂ９のＶＨおよびＶＬ鎖がリンカーによりＡ１９４－０１ ＩｇＧに連結された場合となるが（図１７Ｂ）、他のＶＨ／ＶＬ鎖、例えばマウス抗－ＬＡＭ抗体などの他の抗－ＬＡＭ抗体を用いることができる。これは、単一抗原分子中の異なるエピトープの認識を可能にし得、多価結合を増強し、親和性の増加をもたらし得る。あるいは、異種ｓｃＦｖ－ＩｇＧ構築物は、さらなるＶＨ／ＶＬ鎖がＬＡＭ以外の抗原を標的にする場合、二重特異性抗体をもたらし得る。
【0097】
本発明の抗－ＬＡＭ抗体はまた、相同および異種ｓｃＦｖ－ＩｇＭ構築物の双方を含むｓｃＦｖ－ＩｇＭ構築物を作出するように改変されてもよい。相同ｓｃＦｖ－ＩｇＭの非限定例であれば、Ｐ３０Ｂ９ ＶＨ／ＶＬ鎖がＰ３０Ｂ９ ＩｇＭに連結される場合となる。この構築物中であれば、すべての結合部位が同じエピトープ特異性を有することになる。異種ｓｃＦｖ－ＩｇＭ構築物の非限定例は、Ａ１９４－０１ ｓｃＦｖが、ＩｇＧ定常ドメインとは対照的に、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭに連結される場合である［非限定［図１７Ｃ］。かかる改変された変異体および／または誘導体構築物であれば、親Ｐ３０Ｂ９ ｍＡｂのジマンノースエピトープのＩｇＭ依存性認識を保持し、Ａ１９４－０１ ｓｃＦｖのさらなる結合特異性を追加することになる。これは、固有のエピトープアレイの認識を可能にし、親和性の増加をもたらし得、その場合、ポイントオブケア抗原検出アッセイの改善にとって有用であり得る。
【0098】
Ｆ．診断キットおよび方法
本発明の一実施形態は、試料中のＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６の検出および／または定量化のための診断キットおよび方法に関する。本明細書に記載の通り、抗－ＬＡＭ抗体Ａ１９４－０１およびＰ３０Ｂ９、ならびに抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体Ｐ９５Ｃ１、例えばその改変された変異体および／または誘導体などは、試料中に存在するＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６の量の検出および／または定量化において有効であり得る。ＬＡＭまたはＰＩＭ６は、任意の供給源由来、例えば結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）もしくはスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来、または患者、例えば結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株に感染した患者からの血清もしくは尿試料由来であってもよい。ＬＡＭは、例えば、他のマイコバクテリア株、例えばらい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）からのＰＩＬＡＭ、ＭａｎＬＡＭ、または非キャッピング／非修飾ＡｒａＬＡＭであってもよい。これらの株は、発生するキャッピングの性質および程度が異なり、その場合、異なる抗体の組み合わせが異なる形態に対して異なる特異性を有することになり、幾らかのレベルでの分化またはタイピングが実施可能になる。特に、Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭおよび改変されたＩｇＡ１アイソタイプ、ならびにＡ１９４－０１の改変されたＩｇＭおよびｓｃＦｖ－ＩｇＧアイソタイプであれば、環境によっては前記ＬＡＭの８０％を含んでもよい、ＴＢ患者からの試料中のジマンノース置換ＭａｎＬＡＭを検出および／または定量化するのに十分に適することになり、Ｐ３０Ｂ９の様々なアイソタイプであれば、本明細書に記載のように、特に結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来するＬＡＭ上に広がるジマンノース置換Ａｒａ６残基を有するＬＡＭの検出および／または定量化時に特に有効となる。Ｐ９５Ｃ１エピトープがＬＡＭのすべての種において高度に保存されることから、この抗体は、適切な特異性を有する二次抗体とカップリングされる場合、試料中の様々なタイプのＬＡＭの検出および／または定量化に適することになる。Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプは、様々な形態のＬＡＭ、特に非置換ＬＡＭ、モノマンノシル化ＬＡＭ、およびＰＩＬＡＭに非常に有効に結合し、その場合、マイコバクテリアの様々な株に由来するＬＡＭの検出および／または定量化時、有効となる。改変されたＩｇＭおよびｓｃＦｖ－ＩｇＧアイソタイプであっても、非置換ＬＡＭ、モノマンノシル化ＬＡＭ、およびＰＩＬＡＭの量の検出および／または定量化時、かなり有効となり、加えてジおよびトリマンノース置換ＬＡＭに結合し得る。これは、Ａ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体に、Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプまたはＰ３０Ｂ９のＩｇＭアイソタイプよりも大きいエピトープ認識を授けるが、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の毒性株に特異的なＬＡＭエピトープのみに対する特異性を犠牲にする。一部の実施形態では、ＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６に対する前記特異性の定量化は、様々な直接的結合アッセイまたは抗原捕捉アッセイにおいて既知の濃度のＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６を有する連続希釈された対照試料のシグナル強度を比較することにより達成される。
本発明の一実施形態は、試料中のＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６の検出および／または定量化のための診断キットおよび方法に関する。本明細書に記載の通り、抗－ＬＡＭ抗体Ａ１９４－０１およびＰ３０Ｂ９、ならびに抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体Ｐ９５Ｃ１、例えばその改変された変異体および／または誘導体などは、試料中に存在するＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６の量の検出および／または定量化において有効であり得る。ＬＡＭまたはＰＩＭ６は、任意の供給源由来、例えば結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）もしくはスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来、または患者、例えば結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株に感染した患者からの血清もしくは尿試料由来であってもよい。ＬＡＭは、例えば、他のマイコバクテリア株、例えばらい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）からのＰＩＬＡＭ、ＭａｎＬＡＭ、または非キャッピング／非修飾ＡｒａＬＡＭであってもよい。これらの株は、発生するキャッピングの性質および程度が異なり、その場合、異なる抗体の組み合わせが異なる形態に対して異なる特異性を有することになり、幾らかのレベルでの分化またはタイピングが実施可能になる。特に、Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭおよび改変されたＩｇＡ１アイソタイプ、ならびにＡ１９４－０１の改変されたＩｇＭおよびｓｃＦｖ－ＩｇＧアイソタイプであれば、環境によっては前記ＬＡＭの８０％を含んでもよい、ＴＢ患者からの試料中のジマンノース置換ＭａｎＬＡＭを検出および／または定量化するのに十分に適することになり、Ｐ３０Ｂ９の様々なアイソタイプであれば、本明細書に記載のように、特に結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来するＬＡＭ上に広がるジマンノース置換Ａｒａ６残基を有するＬＡＭの検出および／または定量化時に特に有効となる。Ｐ９５Ｃ１エピトープがＬＡＭのすべての種において高度に保存されることから、この抗体は、適切な特異性を有する二次抗体とカップリングされる場合、試料中の様々なタイプのＬＡＭの検出および／または定量化に適することになる。Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプは、様々な形態のＬＡＭ、特に非置換ＬＡＭ、モノマンノシル化ＬＡＭ、およびＰＩＬＡＭに非常に有効に結合し、その場合、マイコバクテリアの様々な株に由来するＬＡＭの検出および／または定量化時、有効となる。改変されたＩｇＭおよびｓｃＦｖ－ＩｇＧアイソタイプであっても、非置換ＬＡＭ、モノマンノシル化ＬＡＭ、およびＰＩＬＡＭの量の検出および／または定量化時、かなり有効となり、加えてジおよびトリマンノース置換ＬＡＭに結合し得る。これは、Ａ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体に、Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプまたはＰ３０Ｂ９のＩｇＭアイソタイプよりも大きいエピトープ認識を授けるが、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の毒性株に特異的なＬＡＭエピトープのみに対する特異性を犠牲にする。一部の実施形態では、ＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６に対する前記特異性の定量化は、様々な直接的結合アッセイまたは抗原捕捉アッセイにおいて既知の濃度のＬＡＭおよび／またはＰＩＭ６を有する連続希釈された対照試料のシグナル強度を比較することにより達成される。
【0099】
Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプ、Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭ／ＩｇＡアイソタイプ、およびＰ９５Ｃ１の様々なアイソタイプは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の異なる株中で不定に発現される異なるＬＡＭエピトープに結合することから、ＬＡＭの供給源の始まりを区別するため、これらの特定のアイソタイプを用いることができ；ジマンノース置換ＬＡＭ、特にジマンノース置換Ａｒａ６残基は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の毒性株中のＬＡＭ残基の大部分を含む一方で、非置換ＬＡＭ／ＰＩＬＡＭ残基は、迅速に増殖する非毒性株、例えばスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）中のＬＡＭ残基の大部分を含む。例えば、Ａ１９４－０１ ＩｇＧのみに結合し、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭに結合しないＬＡＭを含む試料は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の毒性株に起源をもつ可能性が高い一方で、Ｐ３０Ｂ０ ＩｇＭおよびＡ１９４－０１ ＩｇＧ双方に結合する試料は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の毒性株または類似のキャッピングモチーフを導入するマイコバクテリアの種に起源をもつ可能性が高い。
【0100】
Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭ／ＩｇＡアイソタイプは、本明細書で詳述のように結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の毒性株におけるドミナントな形態である、ジマンノース置換ＭａｎＬＡＭに特異的であることから、Ｐ３０Ｂ９の前記アイソタイプは、患者を結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株の感染を受けているとして診断するのに用いられる診断キットおよび方法における候補として理想的である。さらに、Ａ１９４－０１の改変されたＩｇＭおよびｓｃＦｖ－ＩｇＧの変異体および／または誘導体は、ジマンノース置換ＭａｎＬＡＭエピトープおよびトリマンノース置換ＭａｎＬＡＭエピトープも認識する場合のような使用に適し得る。かかる患者の場合、進行性または活動性感染を有し得るか、または感染は潜在性であり得る。その株は、多剤耐性（ＭＤＲ）または広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ）であり得る。具体的には潜在的感染を有する患者に関しては、濃度の増加が活動性感染に対する変化を示し得ることから、血清または尿中のＬＡＭ濃度における変化は特に重要であり得る。あるいは、活動性感染を有する個体における濃度の減少は、治療が有効であり、継続されるべきであることを示し得、または治療中の濃度の増加は、現在の治療が有効でなく、排除、変更および／または修正されるべきであることを示し得る。
【0101】
感染を診断するための方法は、前記患者からの生体試料、例えば、血液、血漿、尿、痰、または他の体液を、本発明の少なくとも１つの抗－ＬＡＭ抗体および／または少なくとも１つの抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体、特にジマンノース置換ＭａｎＬＡＭを認識する抗－ＬＡＭ抗体およびＰＩＭ６マンナンドメイン内の少なくとも１つのポリマンノース構造を認識する抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体と接触させることを含んでもよい。これらは、例えば、Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭおよびＩｇＡアイソタイプ、Ａ１９４－０１の改変されたＩｇＡ、ＩｇＭおよびｓｃＦｖ－ＩｇＧアイソタイプ、ならびにＰ９５Ｃ１の様々なアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ）を含む。
【0102】
検出試薬として用いられる抗体は、レポーター分子、例えば当該技術分野で公知のものに結合されてもよい。抗体は、例えばサンドイッチアッセイの基質または一部に結合された、キットの一部であってもよい。キットは、第１の抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ捕捉抗体、レポーター分子に結合される第２の抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ検出器（検出）抗体、および捕捉抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の結合対象である支持体を含んでもよい。第１および第２の抗－ＬＡＭ抗体は、単一のＬＡＭ分子上の複数のコピー中の同じＬＡＭエピトープに結合してもよく、または好ましくは、それらは、単一のＬＡＭ分子上に存在する異なるエピトープに結合してもよい。ＬＡＭおよびＰＩＭ６エピトープは、本明細書に記載されるもののいずれかであってもよい。キットは、第１および第２の抗体の非競合部位に結合する第３の捕捉または検出器（検出）抗体を含んでもよい。これは、捕捉される分子の数および結合される検出器分子の数および対応するシグナルの強度を増加させ得る。
【0103】
キットは、使用説明書を含んでもよく、また様々な試薬、溶媒、希釈剤、および／または薬学的に許容できる保存剤をさらに含んでもよい。かかるアッセイでは、異なるビオチン標識抗－ＬＡＭモノクローナル抗体の感度について実行された［図７］。このアッセイでは、ＭａｎＬＡＭを溶液から捕捉するため、マウス抗－ＬＡＭ抗体ＣＳ－３５が用いられた。この抗体は、その広範な特異性を理由に選択された。ＭａｎＬＡＭを異なる濃度を有する溶液から捕捉するため、ＣＳ－３５（２５０ｎｇ／ウェル）が用いられ、次に捕捉ウェル中でのＭａｎＬＡＭの存在について探索するため、異なるビオチン化モノクローナル抗体が用いられた。バックグラウンドの３×ＳＤのカットオフを用いて、最も高感度のプローブはＡ１９４－０１ ＩｇＭであり、それはＭａｎＬＡＭの最高希釈（０．０１６ｎｇ／ウェル）に対して強力なシグナル（１．８ＯＤ）をもたらした。これは、このタイプのアッセイにおいて最も有用なプローブであると以前から考えられている２つのＦＩＮＤマウス抗体より優れていた。
【0104】
Ｇ．治療組成物、方法、ワクチン、およびベクター
本発明の一実施形態は、本発明の少なくとも１つの抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体を含む医薬組成物、ならびにそれを必要とする患者の治療におけるそれらの使用方法を対象とする。患者は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の毒性株による潜在性または活動性感染を有してもよく、特に有用には、その株は、伝統的な治療法／抗生物質に対して、多剤耐性（ＭＤＲ）または広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ）であってもよい。これらの組成物および方法において利用される抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、本発明の任意の抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体であってもよいが、特に有用には、ジマンノースでキャッピングされたＭａｎＬＡＭ、特にジマンノースでキャッピングされたＡｒａ６残基、例えば、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭまたはＩｇＡ１／ＩｇＡ２アイソタイプおよび五価Ａ１９４－０１ ＩｇＭまたは四価ｓｃＦｖ－ＩｇＧアイソタイプおよびＰ９５Ｃ１の様々なアイソタイプを認識する抗－ＬＡＭ抗体であってもよい。
本発明の一実施形態は、本発明の少なくとも１つの抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体を含む医薬組成物、ならびにそれを必要とする患者の治療におけるそれらの使用方法を対象とする。患者は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の毒性株による潜在性または活動性感染を有してもよく、特に有用には、その株は、伝統的な治療法／抗生物質に対して、多剤耐性（ＭＤＲ）または広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ）であってもよい。これらの組成物および方法において利用される抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、本発明の任意の抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体であってもよいが、特に有用には、ジマンノースでキャッピングされたＭａｎＬＡＭ、特にジマンノースでキャッピングされたＡｒａ６残基、例えば、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭまたはＩｇＡ１／ＩｇＡ２アイソタイプおよび五価Ａ１９４－０１ ＩｇＭまたは四価ｓｃＦｖ－ＩｇＧアイソタイプおよびＰ９５Ｃ１の様々なアイソタイプを認識する抗－ＬＡＭ抗体であってもよい。
【0105】
患者への投与に適した薬学的に許容できる抗－ＬＡＭ抗体および／または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体組成物は、有効量の抗－ＬＡＭもしくは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体または生物学的活性を保持するとともに、許容できる温度範囲内での貯蔵中に最大安定性を促進する製剤中の抗体を含有することになる。医薬組成物はまた、所望される製剤に依存し、薬学的に許容できる希釈剤、薬学的に許容できる担体および／または薬学的に許容できる賦形剤、または動物またはヒト投与用に医薬組成物を調合するために一般に用いられるような任意の溶媒を含み得る。希釈剤は、その組み合わせの生物学的活性に影響しないように選択される。かかる希釈剤の例として、蒸留水、生理学的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、およびハンクス溶液が挙げられる。本発明の医薬組成物または製剤において有用な賦形剤の量は、抗体を、それを必要とする対象に送達される必要があるときに均一に分散され得るように、組成物全体に均一に分布させる役割を果たす量である。それは、所望される有利な対症的または根治的結果をもたらすと同時に、高過ぎる濃度から生じ得る任意の有害な副作用を最小化する濃度に抗体を希釈する役割を果たし得る。それはまた、保存剤効果を有してもよい。したがって、高い生理学的活性を有する抗体においては、より多くの賦形剤が利用されることになる。他方、より低い生理学的活性を呈する任意の活性成分においては、より少量の賦形剤が利用されることになる。
【0106】
薬学的に許容できる抗－ＬＡＭ抗体および／または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体組成物は、液体形態または固体形態であってもよい。固体製剤は、単回または複数回投与いずれかでの投与前に、一般に凍結乾燥され、溶液にされる。製剤は、熱変性を回避するように、極端な温度またはｐＨに曝露されるべきではない。したがって、本発明の抗体組成物を生物学的に適切なｐＨ範囲内で調合することは必須である。貯蔵中に適切なｐＨ範囲を維持するために緩衝化される溶液は、特に調合と投与との間でより長期間貯蔵される液体製剤においては必要性がある。現在まで、液体および固体製剤の双方は、安定性をより長期間保持するため、より低い温度（通常、２～８℃）での貯蔵を必要とする。製剤化された抗体組成物、特に液体製剤は、貯蔵中にタンパク質加水分解を阻止または最小化するため、限定はされないが、有効濃度（通常、＜１％ｗ／ｖ）のベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン、および／またはプロピルパラベンを含む静菌剤を含有してもよい。静菌剤は、一部の患者に対して禁忌であってもよい。したがって、凍結乾燥製剤は、かかる成分を含有する溶液または含有しない溶液のいずれかで再構成されてもよい。追加的成分は、緩衝液または固形抗体製剤のいずれか、例えば限定はされないが、抗凍結剤としての糖（必ずしも限定はされないが、ソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびズルシトールなどのポリヒドロキシ炭化水素ならびに／またはスクロース、ラクトース、麦芽糖もしくはトレハロースなどの二糖を含む）や、場合によっては適切な塩（限定はされないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＬｉＣｌを含む）に添加されてもよい。かかる抗体製剤、特に長期貯蔵用に選出される液体製剤は、２～８℃またはそれより高い温度で長期安定性を促進するとともに、非経口注射にとって有用な製剤を作製するため、総モル浸透圧濃度の有用な範囲に依存することになる。総モル浸透圧濃度（溶液中の分子の総数）の有効範囲は、約２００ｍＯｓ／Ｌ～約８００ｍＯｓ／Ｌである。溶液の総モル浸透圧濃度を適切な範囲内に維持するため、抗凍結剤、例えばスクロースまたはソルビトールの量が製剤中の塩の量に依存することは明らかであろう。したがって、塩を含まない製剤は、約５％～約２５％のスクロースを含有してもよく、ここでスクロースの好ましい範囲は約７％～約１５％であり、塩を含まない製剤中での特に好ましいスクロース濃度は１０％～１２％である。あるいは、塩を含まないソルビトールに基づく製剤は、ソルビトールを約３％～約１２％の範囲内、約４％～７％の好ましい範囲で含有してもよく、特に好ましい範囲は、塩を含まない製剤中で約５％～約６％のソルビトールである。当然ながら、塩を含まない製剤では、有効なモル浸透圧濃度レベルを維持するため、各々の抗凍結剤の範囲の増加が認められることになる。これらの製剤はまた、二価カチオン（例えば必ずしも限定はされないが、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２）；および非３２イオン性界面活性剤（ｎｏｎ－３２ ｉｏｎｉｃ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（例えば必ずしも限定はされないが、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ８０（登録商標））、ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ６０（登録商標））、ポリソルベート４０（ＴＷＥＥＮ４０（登録商標））およびポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０（登録商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えば限定はされないが、Ｂｒｉｊ５８（登録商標）、Ｂｒｉｊ３５（登録商標）、ならびにその他、例えば、トリトンＸ１００（登録商標）、トリトンＸ１１４（登録商標）、ＮＰ４０（登録商標）、Ｓｐａｎ８５および非イオン性界面活性剤のＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズ（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１））を含有してもよい。静菌剤の考えられる封入を含む、かかる成分の任意の組み合わせは、本発明の抗体含有製剤を充填するのに有用であり得る。本発明の抗体組成物はまた、通常、免疫グロブリン分子の一部ではない追加的な化学的部分（例えばペグ化）を含有する抗体を示す「化学的誘導体」であってもよい。かかる部分は、塩基分子の溶解度、半減期、吸収などを改善し得る。あるいは、その部分は、塩基分子の望ましくない副作用を減弱させ得るかまたは塩基分子の毒性を低減し得る。
【0107】
具体的な実施形態は、本明細書で考察され、さらに当該技術分野で公知のようなＰＬＧＡマイクロスフェア、ならびにポリ（エチレン－コ－酢酸ビニル；ＰＥＶＡｃ）を含むポリマーに基づく非分解性の媒体を含む。加えて、抗体に基づく治療薬の徐放性および局在化送達が、Ｇｒａｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４（７）：１０２９－１０４４）（ここでその全体が参照により援用される）中にレビューされている。抗体を封入する能力がある好適なマイクロカプセルは、コアセルベーション技術または界面重合により調製されるヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメチルメタクリレートマイクロカプセルも含んでもよい。タンパク質がＰＬＧＡマイクロスフェア中に封入される、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＩＧＦ－１ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」という表題のＰＣＴ公開の国際公開第９９／２４０６１号パンフレット（この参照についてはその全体が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。さらに、マイクロエマルションまたはコロイド状薬物送達システム、例えばリポソームおよびアルブミンマイクロスフェアもまた用いてもよい。他の好ましい徐放性組成物としては、抗体を投与部位に保持するため、生体付着剤が用いられる。上述の通り、徐放性製剤は、抗体が内部処理される生分解性ポリマーを含んでもよく、それにより非即時型放出がもたらされ得る。非注射用デバイスは、「インプラント」、「薬物デポーインプラント」、「デポーインプラント」、「非注射用デポー」または何らかのかかる類似用語として本明細書に記載され得る。一般のデポーインプラントは、限定はされないが、固体の生分解性および非生分解性ポリマーデバイス（延伸ポリマーまたは同軸ロッド状デバイスなど）、ならびにやはり当該技術分野で公知の極めて多数のポンプシステムを含んでもよい。注射用デバイスはボーラス注射に分割され（注射後の薬物の放出および散逸）、貯蔵リザーバーを注射部位に提供する持続性またはデポー注射は、生物学的製剤の経時的徐放を可能にする。抗体の経時的な遷延性放出のための適切なリザーバーを提供するように、デポーインプラントが送達部位に外科的に繋留され得る。かかるデバイスは、予め選択された期間にわたる治療用に治療的または予防的に必要とされるような量で製剤を運搬できることになる。デポーインプラントはまた、製剤に対して治療の持続時間にわたる体内プロセス（プロテアーゼなど）による分解からの保護をもたらし得る。当該技術分野で公知の通り、用語「徐放」は、かかる薬剤の長期間にわたるブロックポリマーマトリックスからの逐次的な（連続的または不連続的）放出を指す。具体的なデバイスとは無関係に、抗－ＬＡＭ抗体および／または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体組成物の徐放は、抗体の局所的な生物学的有効濃度をもたらすことになる。生物学的製剤の徐放は、製剤に応じて、１日、数日、１週以上の期間にわたることになるが、１か月以上、または最大で約６か月間が最も可能性が高い。当該技術分野で公知の天然または合成高分子は、万能な分解動態、安全性、および生体適合性などの特性により、デポーインプラントとして有用となる。これらの共重合体は、活性成分の薬物動態を改良し、薬剤を酵素攻撃からシールドするとともに、付着または注射の部位で経時的に分解するように操作され得る。当業者は、これらの共重合体の特性、例えば、各々の産生プロセス、用いられる触媒、および徐放性デポーインプラントまたはデポー注射の最終分子量を操作するため、当該技術分野には十分な教示内容があることを理解するであろう。天然高分子は、限定はされないが、タンパク質（例えば、コラーゲン、アルブミンまたはゼラチン）；多糖（セルロース、デンプン、アルギン酸、キチン、キトサン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒアルロン酸）および脂質を含む。生分解性合成高分子は、限定はされないが、様々なポリエステル、Ｌ－グルタミン酸およびγエチル－Ｌ－グルタミン酸塩の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７－５５６）、ポリ乳酸（［ＰＬＡ］；米国特許第３，７７３，９１９号明細書および欧州特許第０５８，４８１号明細書）、ポリ乳酸ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）、例えば、ポリ乳酸－コ－グリコリド（例えば、米国特許第４，７６７，６２８号明細書および米国特許第５，６５４，００８号明細書を参照）、ポリグリコリド（ＰＧ）、ポリ（α－ヒドロキシ酸）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート、ポリオルトエステル、ポリアスピリン、ポリホスファゲン、ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ＰＶＡ－ｇ－ＰＬＧＡ、ＰＥＧＴ－ＰＢＴ共重合体（ポリアクティブ）、メタクリル酸、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＡＡ共重合体、ＰＬＧＡ－ＰＥＯ－ＰＬＧＡ、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）、またはそれらの任意の組み合わせ（上記の通り）（例えば、米国特許第６，９９１，６５４号明細書および米国特許出願第２００５０１８７６３１号明細書を参照（それらの各々はその全体が参照により本明細書中に援用される）、ハイドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７－２７７；Ｌａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５を参照、非分解性エチレン－酢酸ビニル（例えば、エチレン酢酸ビニルディスクおよびポリ（エチレン－コ－酢酸ビニル））、分解性乳酸－グリコール酸共重合体、例えば、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（商標）、ポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）、ヒアルロン酸ゲル（例えば、米国特許第４，６３６，５２４号明細書を参照）、アルギン酸懸濁液、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）などを含んでもよい。ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびそのグリコリドとの共重合体（ＰＬＧＡ）は、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（商標）の商品化がＰＬＡポリマーを用いる最初の非経口徐放性製剤として１９８９年に認可されたことから、当該技術分野でよく知られている。活性成分の徐放を達成するための賦形剤としてＰＬＡおよびＰＬＧＡを用いる製品のさらなる例として、Ａｍｉｄｏｘ（ＰＬＡ；歯周病）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ Ｄｅｐｏｔ（ＰＬＧＡ；ｈＧＨを伴う）、およびＴｒｅｌｓｔａｒ Ｄｅｐｏｔ（ＰＬＧＡ；前立腺がん）が挙げられる。他の合成高分子は、限定はされないが、ポリ（ｃ－カプロラクトン）、ポリ３－ヒドロキシ酪酸、ポリ（β－リンゴ酸）およびポリ（ジオキサノン）］；ポリ無水物、ポリウレタン（国際公開第２００５／０１３９３６号パンフレットを参照）、ポリアミド、 シクロデストラン（ｃｙｃｌｏｄｅｓｔｒａｎｓ）、ポリオルトエステル、ｎ－ビニルアルコール、ポリエチレンオキシド／ポリエチレンテレフタレート、ポリリン酸、ポリホスホン酸、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリレート、ポリエチレングリコール、ポリジヒドロピラン、およびポリアセタールを含んだ。非生分解性デバイスは、限定はされないが、様々なセルロース誘導体（カルボキシメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸酢酸セルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、シリコンベースのインプラント（ポリジメチルシロキサン）、アクリルポリマー、（ポリメタクレート、ポリメタクリル酸メチル、ポリヒドロキシ（エチルメチルアクリレート）、ならびにポリエチレン－コ－（酢酸ビニル）、ポロクサマー、ポリビニルピロリドン、ポロキサミン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル、ポリエチレン－クロロトリフルオロエチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥまたは「テフロン（商標）」）、スチレン・ブタジエンゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフェニレンオキシド－ポリスチレン、ポリ－ａ－クロロ－ｐ－キシレン、ポリメチルペンテン、ポリスルホンおよび他の関連する生物学的に安定なポリマーを含む。徐放デポー製剤に適した担体は、限定はされないが、マイクロスフェア、フィルム、カプセル剤、粒子、ゲル剤、コーティング剤、マトリックス、ウェーハ、丸剤または他の医薬送達組成物を含む。かかる徐放性製剤の例が、上に記載される。米国特許第６，９５３，５９３号明細書；米国特許第６，９４６，１４６号明細書；米国特許第６，６５６，５０８号明細書；米国特許第６，５４１，０３３号明細書；および米国特許第６，４５１，３４６号明細書（それら各々の内容は参照により本明細書中に援用される）も参照のこと。剤形は、予め選択された期間にわたる治療用に治療的に必要とされるような量および濃度で製剤を運搬できる必要があり、かつ製剤に対して治療の持続時間にわたる体内プロセスによる分解からの十分な保護をもたらす必要がある。例えば、剤形は、代謝過程からの分解や、例えば、漏出、クラッキング、破損、または歪みのリスクに対して保護するための特性を有する材料からなる外側によって囲まれ得る。これは、例えば、対象による正常な関節およびその他の運動の結果として、薬剤放出デバイス上、すなわち例えば対流性薬物送達デバイス内で発揮される物理的力、リザーバー内部で生成される圧力に関連した物理的力に起因して使用中に受けることになるストレス下での制御されない様式での剤形内容物の排出を阻止し得る。薬剤リザーバーまたは薬物を保持もしくは含有するための他の手段はまた、活性製剤との意図されない反応を回避するような材料からなる必要があり、好ましくは生体適合性である（例えば、剤形が移植される場合、対象の身体または体液に対して実質的に非反応性である）。一般に、各々の生物学的製剤は、少なくとも１２時間から少なくとも１週間、個体に投与され、また必要に応じて、少なくとも１０、２０、３０、１００日間または少なくとも４か月間、または少なくとも６か月以上の間、薬剤を送達するように設計されたインプラントを介する可能性が最も高い。抗－ＬＡＭ抗体および／または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、製剤が放出される部位近傍での組織障害または外傷を最小化するような比較的低い体積速度、例えば約０．００１ｍｌ／日～１ｍｌ／日で送達され得る。製剤は、特定の生物学的製剤に応じて、低用量で、例えば、約０．０１μｇ／時間もしくは０．１μｇ／時間、０．２５μｇ／時間、１μｇ／時間、一般に最大で約２００μｇ／時間の速度で放出されてもよく、または製剤は、低い体積速度、例えば、約０．００１ｍｌ／日～約１ｍｌ／日、例えば０．０１μｇ／日、最大で約２０ｍｇ／日の体積速度で送達される。用量は、用いられる活性成分（例えばＩｇＧ抗体）の効力、バイオアベイラビリティ、および毒性、ならびに対象の要求などの幾つかの要素に依存する。
【0108】
ヒトおよび非ヒト患者のインビボ治療においては、患者に、本発明の少なくとも１つの抗－ＬＡＭ抗体および／または少なくとも１つの抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体を含む医薬製剤が投与または提供される。インビボ治療用に用いられるとき、本発明の抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、治療有効量（すなわち総細菌負荷を除去または低減する量）で患者に投与される。抗体は、公知の方法、例えば静脈内投与に従い、例えばボーラスとしてかまたは長期にわたる連続注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路により、ヒト患者に投与される。抗体は、非経口的に、可能であれば、標的細胞部位に、または静脈内に投与され得る。一部の実施形態では、抗体は、静脈内または皮下投与により投与される。本発明の治療組成物は、患者または対象に全身的に、非経口的に、または局所的に投与されてもよい。疾患における巧みな治療および改善を評価するための上記パラメータは、医師が精通した通常の手順により容易に測定可能である。
【0109】
非経口投与においては、抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、薬学的に許容できる非経口媒体と関連した単位用量の注射剤型（溶液、懸濁液、乳剤）で製剤化されてもよい。かかる媒体の例として、限定はされないが、水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。非水性媒体は、限定はされないが、不揮発性油およびオレイン酸エチルを含む。リポソームは、担体として用いることができる。媒体は、少量の添加剤、例えば等張性および化学安定性を増強する物質、例えば緩衝液および保存剤などを含有してもよい。
【0110】
本発明の抗－ＬＡＭおよび抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株による感染に対して治療的処置を施すのに十分な量で、当該技術分野で利用可能な任意の様式、方法および／または組み合わせで宿主に投与されてもよい。これらの組成物は、当該技術分野で公知の種々の経路、特に非経口経路、例えば限定はされないが、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）；または皮下（ＳＣ）投与などの非経口経路により個体に提供されてもよく、ここでＩＶ投与は治療抗体投与に関する当該技術分野の中の標準である。これらの組成物は、分割または複数回投与（すなわち、治療レジームを通じた製剤の滅菌状態を維持することによる時間差での抗体の投与）として投与されてもよい。
【0111】
用量および投与計画は、医師により容易に決定される種々の要素、例えば感染の性質、例えば、その治療指数、患者、および患者の病歴に依存する。一般に、治療有効量の抗体が患者に投与される。一部の実施形態では、投与される抗体の量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲内、およびその間の任意の範囲である。感染のタイプおよび重症度に応じて、抗体の約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、約０．１～１５ｍｇ／ｋｇ／用量）は、例えば、１回以上の分割投与によるか、または持続注入による、患者への投与のための初期候補用量である。この治療の進行は、通常の方法およびアッセイにより、また医師または他の当業者に公知の判断基準に基づき、容易に監視される。疾患における巧みな治療および改善を評価するための上記パラメータは、医師が精通した日常的手順により容易に測定可能である。
【0112】
これらの抗体はまた、所与の抗体の対合した重鎖および軽鎖を発現する遺伝子ベクターを介して投与されてもよい。これは、これらの遺伝子を効率的に発現するプラスミドまたはウイルスベクター、例えばアデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み得る。これらのベクターは、筋肉組織への注射により送達され得、また用量に応じて、比較的大量の分泌抗体を循環中に比較的長期間にわたり分泌し得る。
【0113】
他の治療計画は、本発明の抗－ＬＡＭおよび／または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の投与、例えば、別の抗－ＬＡＭ抗体、例えば限定はされないが、当該技術分野で公知の抗－ＬＡＭ抗体、例えばマウス抗－ＬＡＭ抗体またはそのヒト化バージョン、または医薬化合物、例えば限定はされないが抗生物質と組み合わされてもよい。本発明の抗－ＬＡＭおよび／または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体との同時投与に適した抗生物質は、限定はされないが、イソニアジド、リファンピン、リファペンチン、エタンブトール、ピラジナミド、ベダキリン、カプレオマイシン、シクロセリン、デキサメタゾン、カナマイシン、およびチノコルジン（ｔｉｎｏｃｏｒｄｉｎ）を含む。組み合わせ投与は、分割製剤または単一の医薬製剤を用いる同時投与、およびいずれかの順序での連続投与を含み、ここで好ましくは、双方の（またはすべての）活性薬剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する間にはある期間が存在する。かかる組み合わせ治療は、相乗的治療効果をもたらし得る。疾患における巧みな治療および改善を評価するための上記パラメータは、医師が精通した日常的手順により容易に測定可能である。
【0114】
別の実施形態によると、本発明は、本発明の少なくとも１つの抗－ＬＡＭおよび／または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体および薬学的に許容できる担体を含む受動的ワクチンまたは医薬組成物を提供する。一実施形態によると、ワクチンまたは医薬組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つの抗体および薬学的に許容できる担体を含む組成物である。ワクチンは、本明細書に記載の特性を任意の組み合わせで有する複数の抗体を含み得、他の抗－ＬＡＭ抗体、例えば本発明のものおよび当該技術分野で公知のもの、例えばマウス抗－ＬＡＭ抗体またはそのヒト化バージョンをさらに含み得る。受動的ワクチンは、当該技術分野で公知である、１つ以上の薬学的に許容できる保存剤、担体、および／または賦形剤を含んでもよい。
【0115】
別の実施形態によると、本発明は、少なくとも１つの抗原のＬＡＭまたはＰＩＭ６エピトープを患者に投与することを含む、能動的ワクチンまたは医薬組成物を包含する。利用されるべき特定のエピトープは、ＴＢ感染および／または病態形成に対する適切な動物モデルにおける本特許に記載の抗体の治療活性を試験することにより決定され得る。このモデル種は、マウス、またはモルモット、またはウサギ、または霊長類であり得る。例えば、Ａ１９４－０１が最も保護的である場合、Ａ１９４－０１エピトープの一形態を有するワクチンが用いられることになる一方、Ｐ３０Ｂ９が保護的である場合、ジマンノース置換Ａｒａ６残基が適切な体液性応答の生成に最も有効であり得る。能動的ワクチンは、当該技術分野で公知である１つ以上のアジュバント、例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、パラフィン油、およびサイトカイン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２を含んでもよい。能動的ワクチンは、当該技術分野で公知である１つ以上の薬学的に許容できる保存剤、担体、および／または賦形剤を含んでもよい。
【0116】
一部の実施形態では、本発明は、組換えベクター、例えば、抗－ＬＡＭ抗体または抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の免疫グロブリン重鎖（Ｉｇ ＶＨ）をコードする核酸、および免疫グロブリン軽鎖（Ｉｇ ＶＬ）をコードする第２の核酸を含むプラスミドを対象とする。他の実施形態では、第１の核酸および第２の核酸は、２つの異なる組換えベクター内に存在する。別の実施形態によると、本発明は、個体における結核感染を治療する方法であって、抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の免疫グロブリン重鎖（Ｉｇ ＶＨ）をコードする第１の核酸および抗－ＬＡＭまたは抗－ＰＩＭ６／ＬＡＭ抗体の免疫グロブリン軽鎖（Ｉｇ ＶＬ）をコードする第２の核酸を前記個体に投与するステップを含み、核酸の各々はプロモーター領域に作動可能に連結される、方法を包含する。第１の核酸および第２の核酸は、同じ組換えベクター内または２つの異なる組換えベクター内に存在してもよい。組換えベクターは、非複製ウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であってもよく、またはプラスミドであってもよい。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される１つ以上のベクターで形質転換される細胞を対象とする。
【0117】
上記の抗体および抗体組成物、ワクチン組成物、およびベクターは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株による感染の予防的および治療的処置のため、投与され得る。
【0118】
Ｈ．均等物
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈上別途明確な断りがない限りは下限の単位の１０分の１までの各介在値と、その記述範囲内の任意の他の記述値または介在値が本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限（そのより小さい範囲内に独立して含まれ得る）もまた、記述範囲内でいずれかの限界が具体的に除かれることを条件として、本発明の範囲内に包含される。記述範囲がそれら限界の一方または双方を含む場合、それらに含まれる限界のいずれかまたは双方を除く範囲もまた本発明に含まれる。
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈上別途明確な断りがない限りは下限の単位の１０分の１までの各介在値と、その記述範囲内の任意の他の記述値または介在値が本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限（そのより小さい範囲内に独立して含まれ得る）もまた、記述範囲内でいずれかの限界が具体的に除かれることを条件として、本発明の範囲内に包含される。記述範囲がそれら限界の一方または双方を含む場合、それらに含まれる限界のいずれかまたは双方を除く範囲もまた本発明に含まれる。
【0119】
特に規定されない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されている場合と同じ意味を有する。本明細書に記載の場合に類似するかまたは等しい任意の方法および材料が本発明の実施または試験においても用いることができるが、ここでは好ましい方法および材料が記載される。本明細書中で言及されるすべての出版物は、それら全体が参照により本明細書中に援用される。
【0120】
本明細書で用いられるとき、また添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確な断りがない限り、複数の参照物を含む。
【0121】
用語「約」は、当業者によりベースライン値と実質的に異なると考えられることのない値の範囲を指す。例えば、用語「約」は、記述値の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％の範囲内に含まれる値、ならびにかかる記述値に介在する値を指してもよい。
【0122】
本明細書中に開示される出版物は、あくまで本発明の出願日に先立つそれらの開示のために提供される。本明細書中のいずれも、先行発明の理由から本発明にかかる出版物に先行する権利が与えられないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行日は、独立して確認される必要があり得る実際の刊行日と異なることがある。
【0123】
本文書中で引用される出願および特許の各々、ならびに出願および特許（発行された各特許の審査中；「出願に引用される文書」を含む）の各々に引用される各々の文書または参考文献、患者または非患者の文献、ならびにこれらの出願および特許のいずれかに対応するかつ／またはそれから優先権を主張するＰＣＴおよび外国出願または特許の各々、ならびに出願に引用される文書の各々の中で引用または参照される文書の各々は、ここでそれら全体が参照により本明細書中に明確に援用される。より一般的には、文書または参考文献は、このテキスト中で特許請求の範囲の前の参考文献リスト中；またはテキスト自体の中のいずれかで引用され；かつ、これらの文書または参考文献の各々（「本明細書中に引用される参考文献」）、ならびに本明細書中に引用される参考文献の各々の中に引用される各々の文書または参考文献（任意の製造業者の仕様、使用説明書などを含む）は、ここで参照により本明細書中に明確に援用される。
【0124】
以下の非限定例が、本発明をさらに例示するのに役立つ。
【実施例0125】
実施例１－本明細書に記載の方法を利用して、メモリーＢ細胞をインビトロで培養し、免疫グロブリン可変領域遺伝子を分子的にクローン化し、ＬＡＭに特異的な幾つかの新規なヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を単離した。当業者は、本明細書に記載のこれらの方法を調整することで、患者の血液中を循環するメモリーＢ細胞１００，０００個からわずか１個存在し得る、非常に高い親和性を有する希少な抗体を選択的に同定できることを理解するであろう。
【0126】
モノクローナル抗体
マウスモノクローナル抗体：Ｄｒ．Ｄｅｌｐｈｉ Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ’ｓ ｌａｂから得られる、ＬＡＭに特異的なマウスモノクローナル抗体ＣＳ－３５およびＣＳ－４０を産生するハイブリドーマ細胞株を再クローン化して均一化し、抗体をプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。
マウスモノクローナル抗体：Ｄｒ．Ｄｅｌｐｈｉ Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ’ｓ ｌａｂから得られる、ＬＡＭに特異的なマウスモノクローナル抗体ＣＳ－３５およびＣＳ－４０を産生するハイブリドーマ細胞株を再クローン化して均一化し、抗体をプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。
【0127】
抗体９０６．４１、９０６．７、９０８．１および９２２．５は、Ｄｒ．Ｊｏｈｎ Ｓｐｅｎｃｅｒによって提供され、ＦＩＮＤ２５およびＦＩＮＤ１７０は、ＦＩＮＤでＴｏｂｉａｓ Ｂｒｏｇｅｒによって提供された。
【0128】
抗原
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＨ３７Ｒｖリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）（ＮＲ－１４８４８）およびスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＬＡＭ（ＮＲ－１４８６０）は、ＢＥＩ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓを通じてＣｏｌｏｒａｄｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手した。ＬＡＭ由来の複合糖質は、Ｌｏｗａｒｙ ｌａｂにて合成した。
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＨ３７Ｒｖリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）（ＮＲ－１４８４８）およびスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＬＡＭ（ＮＲ－１４８６０）は、ＢＥＩ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓを通じてＣｏｌｏｒａｄｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手した。ＬＡＭ由来の複合糖質は、Ｌｏｗａｒｙ ｌａｂにて合成した。
【0129】
ＥＬＩＳＡアッセイ
Ｍａｎ－ＬＡＭ（Ｈ３７Ｒｖ）およびＰＩ－ＬＡＭ（スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来）をＣＢＣ緩衝液（７．５ｍＭ炭酸ナトリウム、１７．４ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０）で希釈し、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート内、１００ｎｇ／ウェルの濃度で蒔いた。プレートの４℃で一晩のインキュベーション後、ウェルを０．０５％ＴＷＥＥＮ－２０を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、次にＰＢＳ緩衝液中１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄したプレートを、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染した個体に由来する血漿および対照血漿（２％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地で希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートした。次にＰＢＳＴで洗浄したプレートを、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ特異的）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、またはＩｇＭ（μ特異的）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、またはＩｇＡ（α特異的）の１：１０００希釈物とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ洗浄後、ＤＥＡ緩衝液５０μＬで発色させた。分光光度計により、ＯＤを４０５ｎｍで測定した。力価は、ＢＳＡでコーティングしたプレートで取得したバックグラウンドＯＤの減算後にＯＤをもたらす相互希釈と定義し、指数関数的内挿により決定した。
Ｍａｎ－ＬＡＭ（Ｈ３７Ｒｖ）およびＰＩ－ＬＡＭ（スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来）をＣＢＣ緩衝液（７．５ｍＭ炭酸ナトリウム、１７．４ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０）で希釈し、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート内、１００ｎｇ／ウェルの濃度で蒔いた。プレートの４℃で一晩のインキュベーション後、ウェルを０．０５％ＴＷＥＥＮ－２０を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、次にＰＢＳ緩衝液中１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄したプレートを、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染した個体に由来する血漿および対照血漿（２％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地で希釈）とともに３７℃で１時間インキュベートした。次にＰＢＳＴで洗浄したプレートを、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ特異的）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、またはＩｇＭ（μ特異的）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、またはＩｇＡ（α特異的）の１：１０００希釈物とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ洗浄後、ＤＥＡ緩衝液５０μＬで発色させた。分光光度計により、ＯＤを４０５ｎｍで測定した。力価は、ＢＳＡでコーティングしたプレートで取得したバックグラウンドＯＤの減算後にＯＤをもたらす相互希釈と定義し、指数関数的内挿により決定した。
【0130】
血漿滴定
２つの精製した抗原は、ＢＥＩ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手し、２μｇ／ｍｌの濃度での９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上、４℃で一晩蒔き、次にプレートを１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロッキングした。血漿のＬＡＭに特異的な力価を、連続希釈試料を３７℃で１時間インキュベートすることによって試験し、それに続いてプレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。結合抗体を、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ヒトκおよびヤギ抗ヒトλのＰＢＳ中１％ＢＳＡで１：１，０００希釈時の混合物を用いて検出し、アルカリ性リン酸塩基質をＤＥＡ緩衝液に添加することによりシグナルを展開した。３０分後、反応性をＯＤ４０５で測定した。
２つの精製した抗原は、ＢＥＩ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手し、２μｇ／ｍｌの濃度での９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上、４℃で一晩蒔き、次にプレートを１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロッキングした。血漿のＬＡＭに特異的な力価を、連続希釈試料を３７℃で１時間インキュベートすることによって試験し、それに続いてプレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。結合抗体を、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ヒトκおよびヤギ抗ヒトλのＰＢＳ中１％ＢＳＡで１：１，０００希釈時の混合物を用いて検出し、アルカリ性リン酸塩基質をＤＥＡ緩衝液に添加することによりシグナルを展開した。３０分後、反応性をＯＤ４０５で測定した。
【0131】
ヒト対象
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による活動性感染を有する患者を、Ｇｌｏｂａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＬａｔｔｉｍｏｒｅ ｐｒａｃｔｉｃｅに登録した。活動性感染は、培養証明された結核疾患または臨床結核の診断により定義した。このグループは、最近結核と診断された患者、治療２か月目の患者を含んだ。非感染患者は、ＨＩＶ血清陰性、ツベルクリン皮膚検査陰性で、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン接種の履歴を有さず、インターフェロンγ放出アッセイ（ＩＧＲＡ）陰性の健常ボランティアであった（Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ Ｇｏｌｄ Ｉｎ－Ｔｕｂｅ，Ｃｅｌｌｅｓｔｉｓ Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。インフォームドコンセント文書は参加者から得て、試験はＲｕｔｇｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより認可された。
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による活動性感染を有する患者を、Ｇｌｏｂａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＬａｔｔｉｍｏｒｅ ｐｒａｃｔｉｃｅに登録した。活動性感染は、培養証明された結核疾患または臨床結核の診断により定義した。このグループは、最近結核と診断された患者、治療２か月目の患者を含んだ。非感染患者は、ＨＩＶ血清陰性、ツベルクリン皮膚検査陰性で、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン接種の履歴を有さず、インターフェロンγ放出アッセイ（ＩＧＲＡ）陰性の健常ボランティアであった（Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ Ｇｏｌｄ Ｉｎ－Ｔｕｂｅ，Ｃｅｌｌｅｓｔｉｓ Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。インフォームドコンセント文書は参加者から得て、試験はＲｕｔｇｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより認可された。
【0132】
表４．ヒト対象の人口統計
１．Ａ１９４－０１（ＩｇＧアイソタイプ）の培養および単離
ヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体Ａ１９４－０１（アイソタイプＩｇＧ）を、ＴＢ感染患者ＴＢ－１９４から得た培養したメモリーＢ細胞から単離した。インビトロ培養系の重要な構成要素は、Ｂ細胞の表面上に発現され、Ｔ細胞依存性免疫グロブリンのクラススイッチおよびメモリーＢ細胞の発達を媒介するのに必須の役割を担うＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるＣＤ４０のリガンドＣＤ４０Ｌにより刺激をもたらし得る好適な支持細胞の存在である。メモリーＢ細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現するＭＳ４０Ｌ低細胞の支持細胞層上に播種した。これらの細胞は、ＣＤ４０Ｌを低レベルで発現し、メモリーＢ細胞の複製およびそれらの形質細胞への成熟を効率的に支持することが以前に示されている（Ｌｕｏ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００９．１１３（７）。これらの細胞は、Ｂ系統成長因子ＩＬ－７を提供するマウス間質性ＭＳ５細胞を、最初にＯｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手したヒトＣＤ４０Ｌを形質導入するウイルスＦＵＷ－ＣＤ４０Ｌに感染させることにより作製した。メモリーＢ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のＭＡＣＳヒトメモリーＢ細胞単離キット（カタログ番号１３０－０９３－５４６）を用いて単離した。非Ｂ細胞は、細胞表面マーカーＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ４３、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂおよびグリコホリンＡに対する抗体を含有する磁気ビーズを用いる陰性選択により、ＰＢＭＣから排除した。ナイーブＢ細胞をさらに除去するため、メモリーＢ細胞亜集団を、ナイーブＢ細胞上でなく形質細胞上で低レベルで発現されるメモリーＢ細胞に対するマーカーである細胞表面マーカーＣＤ２７に対する抗体にカップリングされた磁気ビーズを用いて陽性選択した。ＣＤ４０Ｌを発現する支持細胞の存在下で、これらの条件は、メモリーＢ細胞の複製およびそれらの形質芽細胞への分化を支持し、Ｉｇを比較的高い力価で培養上清中に分泌する。
１．Ａ１９４－０１（ＩｇＧアイソタイプ）の培養および単離
ヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体Ａ１９４－０１（アイソタイプＩｇＧ）を、ＴＢ感染患者ＴＢ－１９４から得た培養したメモリーＢ細胞から単離した。インビトロ培養系の重要な構成要素は、Ｂ細胞の表面上に発現され、Ｔ細胞依存性免疫グロブリンのクラススイッチおよびメモリーＢ細胞の発達を媒介するのに必須の役割を担うＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるＣＤ４０のリガンドＣＤ４０Ｌにより刺激をもたらし得る好適な支持細胞の存在である。メモリーＢ細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現するＭＳ４０Ｌ低細胞の支持細胞層上に播種した。これらの細胞は、ＣＤ４０Ｌを低レベルで発現し、メモリーＢ細胞の複製およびそれらの形質細胞への成熟を効率的に支持することが以前に示されている（Ｌｕｏ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００９．１１３（７）。これらの細胞は、Ｂ系統成長因子ＩＬ－７を提供するマウス間質性ＭＳ５細胞を、最初にＯｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手したヒトＣＤ４０Ｌを形質導入するウイルスＦＵＷ－ＣＤ４０Ｌに感染させることにより作製した。メモリーＢ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のＭＡＣＳヒトメモリーＢ細胞単離キット（カタログ番号１３０－０９３－５４６）を用いて単離した。非Ｂ細胞は、細胞表面マーカーＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ４３、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂおよびグリコホリンＡに対する抗体を含有する磁気ビーズを用いる陰性選択により、ＰＢＭＣから排除した。ナイーブＢ細胞をさらに除去するため、メモリーＢ細胞亜集団を、ナイーブＢ細胞上でなく形質細胞上で低レベルで発現されるメモリーＢ細胞に対するマーカーである細胞表面マーカーＣＤ２７に対する抗体にカップリングされた磁気ビーズを用いて陽性選択した。ＣＤ４０Ｌを発現する支持細胞の存在下で、これらの条件は、メモリーＢ細胞の複製およびそれらの形質芽細胞への分化を支持し、Ｉｇを比較的高い力価で培養上清中に分泌する。
【0133】
培養上清の半分を新しい培地と交換することにより、培養物を１週間隔で再栄養した。２～３週後、分泌された抗体を約１～５μｇ／ｍｌ産生するための十分なＢ細胞が存在した。各ウェル内に１００～１，０００個の異なるクローンの存在を仮定すると、これは、平均濃度１～１０ｎｇ／ｍＬのＩｇ／Ｂ細胞クローンに対応した。この濃度はかなり低いことから、この方法は、標的抗原に対して比較的高い親和性を有する抗体にバイアスした。約８０，０００細胞のメモリーＢ細胞は、この患者の血液から精製し、約８００細胞／ウェルの初期密度において９６ウェル培養プレートの９６ウェル内で培養した。
【0134】
培養上清における結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＬＡＭに対する抗体の存在について、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＬＡＭを、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートの炭酸水素塩コーティング緩衝液５０μＬ／ウェル中、２μｇ／ｍＬの濃度でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ中０．１％ＴＷＥＥＮ２０）で４回洗浄し、１×ＰＢＳ中２％脱脂乳２００μＬ、３７℃で１時間ブロッキングした。培養上清１００μｌを、ＬＡＭを含有するＥＬＩＳＡプレートの対応するウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。追加的な洗浄ステップ後、ＡＰコンジュゲートマウス抗ヒトＦａｂ抗体を添加し、結合されたヒト抗体を検出した。３７℃でのインキュベーションの３０分後、ＤＥＡ緩衝液中のＡＰ基質１００μＬをＥＬＩＳＡウェルに添加し、反応性を、４０５ｎｍで吸光度を測定することにより比色測定的に測定した。
【0135】
陽性シグナル（１時間で約１のＯＤ）が９６ウェル中の１ウェルのみで検出され、これはこの試料中のこれらの細胞が希少であることを示す。陽性細胞からの細胞を、９６ウェルプレートの１０ウェル内で、５～１０細胞／ウェルの密度で再培養し、ＬＡＭに対する活性について再スクリーニングした。この結果、約６の陽性ウェル（１時間で約１のＯＤ）が得られ、ＬＡＭ反応性細胞が低頻度であることに再び合致し、これは最初の陽性ウェルが単一のＬＡＭ陽性Ｂ細胞クローンのみを含有したことを示唆する。幾つかの陽性サブクローンからの細胞を溶解させ、ＨおよびＬ鎖の可変領域を単離するように用い、次にＨおよびＬ鎖発現ベクターにクローン化した。全部で１０の多様なＶＨおよび９のＶＬ配列をこれらのウェルから単離し、次にこれらを、個別の組み合わせを２９３細胞に遺伝子導入することにより活性について試験した。試験した９０の組み合わせの内、重鎖（ｐ９０４５－ＩｇＧ１－ＶＨ）および軽鎖（ｐ９０４４－Ｖｋ）の単一の組み合わせのみがＬＡＭに対する陽性シグナルをもたらした。抗体は、製造業者によって記載される通り、Ｅｘｐｉ－２９２細胞内の対応する重鎖および軽鎖プラスミドの同時導入により発現させ、無血清培地中で増殖した。抗体は、プロテインＡビーズ（ＩｇＧ用）またはプロテインＬビーズ（ＩｇＧ用）のいずれかに対するアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、低ｐＨ緩衝液で溶出した。精製抗体を濃縮し、サイズおよび純度についてＳＳ－ＰＡＧＥにより特徴づけた。
【0136】
２．Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭアイソタイプの単離および培養
ヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体Ｐ３０Ｂ９、アイソタイプＩｇＭを、ＴＢ感染患者ＴＢ－３１４から得た培養したメモリーＢ細胞から単離した。ＰＢＭＣは、患者ＴＢ－３１４の血液からフィコール密度勾配での遠心分離により単離し、約３０，０００個のメモリーＢ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のＭＡＣＳヒトメモリーＢ細胞単離キットを用いて上記のように精製した。精製したメモリーＢ細胞を、ＩＬ－２１（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１０（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）、およびＣｐＧ（１μＭ）の存在下で、９６ウェルプレート内で増殖したＭＳ４０－Ｌ細胞の単層上に４００細胞／ウェルで蒔くことにより１４日間培養し、細胞上清を、Ｈ３７Ｒｖ ＭａｎＬＡＭへの結合についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＭａｎＬＡＭを、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートの炭酸水素塩コーティング緩衝液５０μＬ／ウェル中、２μｇ／ｍＬの濃度でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ中０．１％ＴＷＥＥＮ２０）で４回洗浄し、１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡ１００μＬ、３７℃で１時間ブロッキングした。５０μｌの培養上清または希釈抗体を、ＬＡＭを含有するＥＬＩＳＡプレートの対応するウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。追加的な洗浄ステップ後、ＡＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を添加し、結合されたヒト抗体を検出した。３７℃でのインキュベーションの３０分後、ＤＥＡ緩衝液中のＡＰ基質５０μＬをＥＬＩＳＡウェルに添加し、反応性を、４０５ｎｍで黄色を測定することにより測定した。二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、κ鎖試薬による探索時、７８ウェル中の１ウェルのみが陽性シグナルを生成した。増殖後、このウェルに、自己切断型ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）ペプチド配列によって連結されたＢＣＬ６およびＢｃｌ－ｘＬを形質導入し、その後、ＧＦＰレポーター遺伝子をＩＲＥＳにより駆動させる。これら２つの遺伝子は、メモリーＢ細胞における長期複製を安定化させ、ＢＣＲの会合による抗原陽性細胞の選択後であっても細胞の培養を可能にする。レトロウイルスベクターを、ＲペプチドがＣ末端ＴＭドメインから欠失したテナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）のエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化した。一次Ｂ細胞の巧みな形質導入により、ＢＣＬ－６、Ｂｃｌ－ｘＬおよびマーカータンパク質ＧＦＰの発現がもたらされた。蛍光顕微鏡下でＧＦＰ陽性２９３Ｔ細胞を計数することにより、ウイルス力価を判定した。ポリブレン／レトロネクチンの存在下で、活性化されたＢ細胞にレトロウイルスベクターを形質導入した。
ヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体Ｐ３０Ｂ９、アイソタイプＩｇＭを、ＴＢ感染患者ＴＢ－３１４から得た培養したメモリーＢ細胞から単離した。ＰＢＭＣは、患者ＴＢ－３１４の血液からフィコール密度勾配での遠心分離により単離し、約３０，０００個のメモリーＢ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のＭＡＣＳヒトメモリーＢ細胞単離キットを用いて上記のように精製した。精製したメモリーＢ細胞を、ＩＬ－２１（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１０（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）、およびＣｐＧ（１μＭ）の存在下で、９６ウェルプレート内で増殖したＭＳ４０－Ｌ細胞の単層上に４００細胞／ウェルで蒔くことにより１４日間培養し、細胞上清を、Ｈ３７Ｒｖ ＭａｎＬＡＭへの結合についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＭａｎＬＡＭを、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートの炭酸水素塩コーティング緩衝液５０μＬ／ウェル中、２μｇ／ｍＬの濃度でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ中０．１％ＴＷＥＥＮ２０）で４回洗浄し、１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡ１００μＬ、３７℃で１時間ブロッキングした。５０μｌの培養上清または希釈抗体を、ＬＡＭを含有するＥＬＩＳＡプレートの対応するウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。追加的な洗浄ステップ後、ＡＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を添加し、結合されたヒト抗体を検出した。３７℃でのインキュベーションの３０分後、ＤＥＡ緩衝液中のＡＰ基質５０μＬをＥＬＩＳＡウェルに添加し、反応性を、４０５ｎｍで黄色を測定することにより測定した。二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、κ鎖試薬による探索時、７８ウェル中の１ウェルのみが陽性シグナルを生成した。増殖後、このウェルに、自己切断型ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）ペプチド配列によって連結されたＢＣＬ６およびＢｃｌ－ｘＬを形質導入し、その後、ＧＦＰレポーター遺伝子をＩＲＥＳにより駆動させる。これら２つの遺伝子は、メモリーＢ細胞における長期複製を安定化させ、ＢＣＲの会合による抗原陽性細胞の選択後であっても細胞の培養を可能にする。レトロウイルスベクターを、ＲペプチドがＣ末端ＴＭドメインから欠失したテナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）のエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化した。一次Ｂ細胞の巧みな形質導入により、ＢＣＬ－６、Ｂｃｌ－ｘＬおよびマーカータンパク質ＧＦＰの発現がもたらされた。蛍光顕微鏡下でＧＦＰ陽性２９３Ｔ細胞を計数することにより、ウイルス力価を判定した。ポリブレン／レトロネクチンの存在下で、活性化されたＢ細胞にレトロウイルスベクターを形質導入した。
【0137】
さらなる増殖後、形質導入細胞を、ＩＬ－２１（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で限界希釈で継代した。プレート３０上のウェルＢ９（Ｐ３０Ｂ９）を、その強力なＬＡＭ結合活性および単クローンの存在の顕微鏡的実証に基づいて選択した。Ｐ３０Ｂ９の上清は、スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＬＡＭまたはαクリスタリンでコーティングしたウェルではなく、Ｈ３７Ｒｖ－ＬＡＭでコーティングしたウェルに排他的に結合した。このウェルからの細胞を溶解し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを単離し、次いでｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃＤＮＡ合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてオリゴ（ｄＴ）でｃＤＮＡ合成した。Ｓｍｉｔｈ－Ｔｉｌｌｅｒのプライマーを用いて抗体重鎖および軽鎖可変領域を増幅し、ヒト重鎖および軽鎖発現ベクターにクローン化した。重鎖可変領域を最初に標準のＩｇＧベクターにクローン化した。しかし、ヒトκ鎖発現ベクターにクローン化した軽鎖配列と組み合わせるとき、ＬＡＭ結合活性は検出されなかった。その時点で、最初の安定に形質導入されたポリクローナルウェル内で産生されるＭａｎＬＡＭ反応性抗体は、アイソタイプに特異的な試薬で再探索し、排他的にＩｇＭであることが判明した。その後、Ｐ３０Ｂ９ ＶＨ配列をＩｇＭ Ｈ鎖定常領域発現ベクターにクローン化し、対応するκ鎖との同時導入時、良好な結合活性が得られた。
【0138】
３．Ａ１９４－０１ ＩｇＧおよびＰ３０Ｂ９ ＩｇＭおよびＬＡＭに対するマウス抗－ＬＡＭ抗体のエピトープ特異性の特徴づけ
Ａ．Ａ１９４－０１ ＩｇＧおよびＰ３０Ｂ９ ＩｇＭによって認識されるエピトープを規定するため、前記抗体の結合活性を、ＬＡＭ中に存在する異なる構造を表す合成グリカンがウシ血清アルブミンにコンジュゲートされた一連の２５の複合糖質に対する、幾つかのマウスＬＡＭに特異的なモノクローナル抗体（ＣＳ－３５、ＣＳ－４０、ＦＩＮＤ２５、ＦＩＮＤ１７０、および９０８．１によって表されるモノクローナル抗体の９００シリーズ）の場合と比較した（図４Ａ）。これらはサイズが４～２６の炭水化物環の範囲であり、様々なマイコバクテリアのＬＡＭ中に存在することが知られる構造モチーフの範囲、例えば、キャップのない幾つかのポリアラビノース構造とホスホイノシトールでキャッピングされたものとの双方、α（１→２）連結モノ、ジ－およびトリ－Ｍａｎｐマンノース構造、および５－デオキシ－５－メチルチオペントフラノシル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｐｅｎｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）（ＭＴＸ）モチーフ、ならびに様々なキャッピングされたＡｒａ４およびＡｒａ６構造を表した。
Ａ．Ａ１９４－０１ ＩｇＧおよびＰ３０Ｂ９ ＩｇＭによって認識されるエピトープを規定するため、前記抗体の結合活性を、ＬＡＭ中に存在する異なる構造を表す合成グリカンがウシ血清アルブミンにコンジュゲートされた一連の２５の複合糖質に対する、幾つかのマウスＬＡＭに特異的なモノクローナル抗体（ＣＳ－３５、ＣＳ－４０、ＦＩＮＤ２５、ＦＩＮＤ１７０、および９０８．１によって表されるモノクローナル抗体の９００シリーズ）の場合と比較した（図４Ａ）。これらはサイズが４～２６の炭水化物環の範囲であり、様々なマイコバクテリアのＬＡＭ中に存在することが知られる構造モチーフの範囲、例えば、キャップのない幾つかのポリアラビノース構造とホスホイノシトールでキャッピングされたものとの双方、α（１→２）連結モノ、ジ－およびトリ－Ｍａｎｐマンノース構造、および５－デオキシ－５－メチルチオペントフラノシル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｐｅｎｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）（ＭＴＸ）モチーフ、ならびに様々なキャッピングされたＡｒａ４およびＡｒａ６構造を表した。
【0139】
６つの異なる反応性パターンが、これらのモノクローナル抗体に対するこの抗原パネルで得られた（図４Ｂ）。これらの抗原に対するモノクローナル抗体の相対的親和性を適定特性により示し；高い親和性反応が中間希釈で高い反応性を保持する一方で、低い親和性が反応性における急速な低下によって示される。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＬＡＭおよびスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＬＡＭと中程度の親和性で反応し、塩基性Ａｒａ４およびＡｒａ６モチーフを有するキャッピングされた構造またはキャップのない構造の双方を認識するマウスｍＡｂ ＣＳ－３５において、最も広範なパターンが見られ、これはこのｍＡｂのβ－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→２）－α－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→５）－α－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→５）－α－Ｄ－Ａｒａｆモチーフに対する既知の特異性に合致した。
【0140】
ヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体Ａ１９４－０１ ＩｇＧはまた、これらの構造の大きい画分を認識し、多くの場合、最強の親和性を有した。Ａ１０９－０１ ＩｇＧは、すべてのキャップのないＡｒａ４およびＡｒａ６構造およびホスホイノシトールでキャッピングされたＡｒａ４構造に強力に結合し、マンノースでキャッピングされた構造のサブセットには大して強力に結合しなかった。Ａ１０９－０１ ＩｇＧは、モノマンノースでキャッピングされた構造と十分に結合した反面、ジおよびトリマンノース構造とは非常に弱く結合したが、後者の構造との反応性は、ＭＴＸ置換が存在したときには増強された。（９０８．１によって表される）マウスモノクローナル抗体の９００シリーズの４つは、すべてのキャップのないＡｒａ４およびＡｒａ６構造と比較的弱い親和性で反応したが、キャッピングされた構造のいずれとも反応しなかった。ＦＩＮＤ（ＦＩＮＤ２５、ＫＩ２５とも称される）からの２つのマウスモノクローナル抗体は、すべてのＡｒａ６構造とキャッピングの存在または不在とは無関係に強力に結合したが、Ａｒａ４構造を全く認識しなかった。ＭａｎＬＡＭと特異的に反応することで知られるＣＳ－４０は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＬＡＭと弱く反応し、モノマンノースでキャッピングされたＡｒａ４およびＡｒａ６構造と優先的に結合した。
【0141】
ヒトモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＭａｎＬＡＭや、ジマンノースでキャッピングされたＡｒａ４およびＡｒａ６構造と強力にかつ高い特異性で反応し、また他のマンノース含有構造とは大幅により弱い活性を示した。この残基の活性の可視化は、アッセイ条件に依存し、一部のアッセイ形式で見られるが（例えば、図４ｂ、８）、その他では見られない（例えば、図１６、１８）。理論に拘束されたくないが、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭのジマンノースでキャッピングされた構造に対する相対的特異性は、末端マンノシル単位が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株からのリポアラビノマンナンのヒトマクロファージへの結合を媒介することが公知であり、さらにジマンノースキャップが、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＬＡＭのドミナントな修飾であることが公知であることから、潜在的には臨床的に意義がある。
【0142】
Ａ１０４－０１ ＩｇＧおよびＰ３０Ｂ９ ＩｇＭのエピトープ特異性をより大きい炭水化物抗原パネルに対するマイクロアレイアッセイにおいてさらにマッピングした時、同様の結果が得られた。このパネルは、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭによって認識されるが他の試験抗体のいずれによっても認識されない、幾つかのさらなるポリマンノース構造を含んだ（図８）。これは、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭのジマンノースでキャッピングされたＡｒａ４およびＡｒａ６構造、特に（必ずではないが）末端アラビノースに連結されたＭａｎ－α（１→２）－Ｍａｎ－α（１→５）を有するものに対する優先度に一致した。Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭはまた、Ｍａｎ－α（１→２）－Ｍａｎ－α（１→６）を有するペンタマンノース構造（５９．ＡＳ－３－７１）に強力に反応したが、Ｍａｎ－α（１→３）－Ｍａｎ－α（１→６）（５０．ＹＢ－ＢＳＡ－１８）を有する類似構造に対してはわずかであった。α（１→２）結合に対するその優先度にもかかわらず、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭは、２番目のマンノースに対する追加的なマンノース結合α（１→６）とともにＭａｎ－α（１→２）結合を有するテトラマンノース構造ＡＳ－２－９１と反応しなかった。理論に拘束されたくないが、これは、Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭアイソタイプの特異性では、ジマンノースモチーフの両糖が追加的置換を全く含まないことが必要であり得ることを示唆する。
【0143】
Ｂ．これらのモノクローナル抗体のＬＡＭ由来のグリカンに対する精密な特異性をマッピングするためのより正確な適定により、Ａｒａ４構造の抗体認識における末端β－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→２）－α－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→５）二糖の重要な役割が実証された。Ａｒａ４構造は、β－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→２）－α－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→５）－α－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→５）－α－Ｄ－Ａｒａｆ四糖からなる一方で、Ａｒａ６構造は、２番目の糖に追加的なβ－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→２）－α－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→３）二糖分岐を有する。モノクローナル抗体の３つは、マンノースキャッピングと無関係に、Ａｒａ４およびＡｒａ６構造双方に結合した。３つ全部のモノクローナル抗体が、Ａｒａ４構造（ＹＢ－８－０９９）と、還元末端に４つの追加的なα－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→５）糖を伴うＡｒａ４構造に対応するＹＢ－ＢＳＡ－０３に結合した（図９Ａ）。しかし、モノクローナル抗体の中で、Ａｒａ６構造の低級分岐に対応する末端β－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→２）－α－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→３）二糖を有する、関連の八糖（ＭＪ－ＬＺ－２）に結合するものはなかった。これは、β－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→２）－α－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→５）結合を有するＡｒａ６構造の高級分岐がこれらのモノクローナル抗体によって認識され、β－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→２）－α－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→３）二糖を有する低級分岐が認識されないことを示した。
【0144】
抗体認識における末端β－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→２）結合の役割を、これらのモノクローナル抗体およびＡｒａ６依存性ＦＩＮＤ２５抗体の末端二糖の切断形態を有する３つの関連するポリα－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→５）構造に対する反応性を探索することによって試験した（図９Ｂ）。３つ全部の構造はまた、内部α－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→３）分岐を有した。ＹＢ－ＢＳＡ－０７は、線状α－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→５）構造内で終結し、抗－ＬＡＭ抗体のすべてと完全に反応性を示さなかった。ＹＢ－ＢＳＡ－０９は、Ａｒａ６分岐の構造に似ている、２つのより長い分枝の最後から２番目の糖での（１→３）分岐を介して付着された追加的なα－Ｄ－Ａｒａｆ糖を有した。この構造は、試験されるより高濃度のＡ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプおよびＣＳ－３５により、わずかに認識された。ＹＢ－ＢＳＡ－１０は、多糖の非還元末端で２つの完全なＡｒａ６構造を形成する分枝の各々に末端β－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→２）糖を含んだ。この構造は、モノクローナル抗体の全部により、天然ＬＡＭ抗原に対するそれらの親和性に一致する相対的結合強度で認識された。これらのアッセイでは、末端β－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→２）－α－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→５）二糖が、利用可能なアラビノース反応性のＬＡＭに特異的なモノクローナル抗体すべての重要な成分であることが示された。
【0145】
Ｃ．結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）などの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の病原性株とスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）などの急速に増殖する非病原性株との決定的差異は、病原性株におけるマンノースでキャッピングされた末端の存在である。そうであれば、異なるマンノシル化構造に特異的なモノクローナル抗体は、構造試験にとって、またこれらの修飾の機能的寄与を判定するのに有用であり得る。この試験で特徴づけられるモノクローナル抗体の２つであるＣＳ－３５およびＦＩＮＤ２５／１７０の活性は、マンノースキャップの存在または不在による影響を全く受けなかった。他方で、モノクローナル抗体の９００シリーズの結合は、任意の種類のマンノシル化により完全に抑制された（図４）。
【0146】
他方、ＣＳ－４０は、非修飾Ａｒａ４グリカン（ＹＢ－８－０９９）とわずかに結合したが、単一のマンノースキャップを有するＡｒａ４（ＹＢ－８－１０１）およびＡｒａ６（ＹＢ－８－１４９）構造と強く結合した。この実験では、図４で用いる天然マウス抗体と比べてより高感度な結合の検出をもたらすことから、マウス重鎖ドメインがヒトＩｇＧ１定常配列と置換された修飾ＣＳ－４０を用いた。ＣＳ－４０とキャップのないアラビノフラノース構造との弱い反応性は、そのスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ＬＡＭとの結核菌（Ｍ．ｔｂ）ＬＡＭと比べての弱い反応性に反映された。α（１→４）連結ＭＳＸ糖の末端マンノースへの付着（すなわち、ＹＢ－８－１４１およびＹＢ－８－１４９）は、結合親和性に対する効果を有しなかった一方、ジマンノースキャップを作製するための２番目のα（１→２）連結マンノース糖の付着（ＹＢ－８－１１１およびＹＢ－８－１２５）は、ＣＳ－４０の反応性を完全に抑制した（図１６）。
【0147】
Ａ１９４－０１は、より複雑な反応性パターンを有した。Ａ１９４－０１は、キャップのないアラビノフラノシル側鎖ならびにモノマンノースでキャッピングされたＡｒａ４（ＹＢ－８－１０１）およびＡｒａ６（ＹＢ－８－１２３）構造と強力に結合したが、このｍＡｂは、ジマンノースでキャッピングされたＡｒａ４（ＹＢ－８－１１１）とはわずかに、またトリマンノースでキャッピングされたＡｒａ４（ＹＢ－８－１１３）とはさらにより弱く反応し、ジマンノースでキャッピングされたＡｒａ６（ＹＢ－８－１２５）とはほとんど反応しなかった。ＣＳ－４０において見られたように、モノマンノース構造に対するＭＴＸ置換（ＹＢ－８－１４１、ＹＢ－８－１４９）は、Ａ１０４－０１の結合を阻害せず、特に興味深いことに、ＭＳＸ付加は、ジマンノースでキャッピングされたＡｒａ４構造およびトリマンノースでキャッピングされたＡｒａ４構造（ＹＢ－８－１３３、ＹＢ－８－１４３）の認識を有意に改善した。Ｐ３０Ｂ９のＭａｎＬＡＭに対する高い選択性に一致して、ｍＡｂは、ジマンノースでキャッピングされたＡｒａ４（ＹＢ－１１１）およびＡｒａ６（ＹＢ－８－１２５）構造と特異的に結合した。ＣＳ－４０およびＡ１９４－０１の結合に対するＭＳＸ置換の良好または有益な効果と対照的に、この置換は、追加的なマンノースの付加によりトリマンノースでキャッピングされた構造が形成されたことから、Ｐ３０Ｂ９の反応性の完全な欠如をもたらした。これらの結果は、異なるモノクローナル抗体がＬＡＭ構造の異なる領域および構造的態様を認識し、一部が専らアラビノフラノース側鎖に結合し、それ以外がキャッピングモチーフに異なるレベルの特異性で結合することを示唆した。
【0148】
Ａｒａ６反応性抗体の相対的な結合特異性および親和性を、代表的な複合糖質について比較した（図１１）。全体的パターンは、天然抗原のＰＩＬＡＭおよびＭａｎＬＡＭにおいて得られたもの（図３）および複合糖質に対する予備適定において得られたもの（図４）に一致した。ヒトＡ１９４－０１ ＩｇＧは、キャップのない構造のすべておよびＭＳＸ置換Ａｒａ６モノマンノース構造（ＹＢ－８－１４９）に対してより高い相対的親和性を有し、単一のマンノースキャップを有するＡｒａ６構造と等価な親和性で反応したが、ジマンノースまたはトリマンノースキャップを有する構造を認識しなかった。ＦＩＮＤ２５は、標準のＡｒａ６構造を有するすべての構造（いずれもキャッピングされた形態またはキャップのない形態）に、ＣＳ－３５と同様のまたはＣＳ－３５よりもやや高い親和性で結合したが、分枝の１つが分岐点から離れた非還元末端で伸びた、２つの構造（ＹＢ－ＢＳＡ－０６およびＹＢ－ＢＳＡ－０８）に結合しなかった。９０８．１は、後者２つを含む、キャップのない構造のすべてにより弱い親和性で結合したが、マンノースでキャッピングされた構造４のいずれも認識しなかった。
【0149】
抗－ＬＡＭモノクローナル抗体Ａを含む競合試験、概要
個別抗体がビオチン化プローブｍＡｂのＬＡＭへの結合に対して競合する能力をＥＬＩＳＡにより滴定した。抗－ＬＡＭ抗体Ａ１９４－０１、ＣＳ－３５、ＦＩＮＤ２５およびＰ３０Ｂ９の４つについての典型的な競合曲線を図１６に示す。予想通り、ビオチン化抗体はすべて、それらの過剰量のそれらの非標識バージョンによって競合された。マウス抗－ＬＡＭ抗体９０８．６は、その他の抗体に対して、仮に競合したとしても弱く競合した。これは、ある程度、この抗体の弱い親和性に起因したが、９０８．６のキャップのない構造に対する結合上の制限も反映し、またキャッピングされた構造がＣＳ－３５およびＦＩＮＤ２５によって認識されるＭａｎＬＡＭ中のドミナントな標的であったことを示唆する。
個別抗体がビオチン化プローブｍＡｂのＬＡＭへの結合に対して競合する能力をＥＬＩＳＡにより滴定した。抗－ＬＡＭ抗体Ａ１９４－０１、ＣＳ－３５、ＦＩＮＤ２５およびＰ３０Ｂ９の４つについての典型的な競合曲線を図１６に示す。予想通り、ビオチン化抗体はすべて、それらの過剰量のそれらの非標識バージョンによって競合された。マウス抗－ＬＡＭ抗体９０８．６は、その他の抗体に対して、仮に競合したとしても弱く競合した。これは、ある程度、この抗体の弱い親和性に起因したが、９０８．６のキャップのない構造に対する結合上の制限も反映し、またキャッピングされた構造がＣＳ－３５およびＦＩＮＤ２５によって認識されるＭａｎＬＡＭ中のドミナントな標的であったことを示唆する。
【0150】
ＣＳ－３５は、その広範な反応性に一致して、プローブ抗体のすべての結合に対して完全に競合したが、そのビオチン化Ａ１９４－０１との競合は、ＣＳ－３５のＬＡＭに対するより低い親和性に一致して、Ａ１９４－０１単独よりも大して強力でなかった。ＣＳ－３５は、ビオチン化ＦＩＮＤ２５に対して完全に競合したが、ＦＩＮＤ２５は、標識ＣＳ－３５に対して単に部分的に競合し（約７４％の最大競合）、Ａ１９４－０１に対してはさらに大して有効的でなかった（約５０％）。理論に拘束されたくないが、この結果は、おそらくは、Ａｒａ６モチーフに排他的に結合する、ＦＩＮＤ２５によらず、Ａ１９４－０１およびＣＳ－３５によって認識されるＡｒａ４構造の存在を反映する。ＦＩＮＤ２５がＣＳ－３５の結合の大半と競合したという事実は、Ａｒａ６構造がＡｒａ４構造よりも一般的であることを示唆した。Ａ１９４－０１は、その高い親和性にもかかわらず、それ自身に対してのみ競合し、ＣＳ－３５またはＦＩＮＤ２５のいずれに対しても競合せず、これはさらに、後の２つの抗体によって認識されるＬＡＭ中の標的が主にＡ１９４－０１によって認識されない構造（例えば、ジマンノースでキャッピングされた構造およびトリマンノースでキャッピングされた構造）からなることを示唆した。この結果と対照的に、Ａ１９４－０１は、ＭａｎＬＡＭにおける競合の欠如におけるＡｒａ６構造の効率的なマンノースキャッピングにおける役割に一致して、ＦＩＮＤ２５の非マンノシル化ＰＩＬＡＭへの結合に対してまさに完全かつ効率的に競合した。
【0151】
抗体Ｐ３０Ｂ９を用いる競合試験は、さらに、ＭａｎＬＡＭ中のＡｒａ６構造の大半がジマンノースでキャッピングされ、かつジマンノースキャップの大部分がＡｒａ６構造上に存在するという結論を支持した。Ｐ３０Ｂ９は、ＭａｎＬＡＭに対するＦＩＮＤ２５の結合の約７０％およびＣＳ－３５の結合の約８０％と競合し、これらのマウスｍＡｂによって認識される構造の大半がまた、Ｐ３０Ｂ９によって認識されることが確認された。Ｐ３０Ｂ９のＭａｎＬＡＭへの結合は、それ自身により、またＣＳ－３５およびＦＩＮＤ２５双方により効率的に競合された。ＦＩＮＤ２５によるＰ３０Ｂ９との競合のレベルは１００％に近く、ジマンノース依存性Ｐ３０Ｂ９結合部位の本質的にすべてがＡｒａ６部位上に位置し、Ａｒａ４構造上にほとんど位置しないことが示された。予想通り、これらの抗体によるジマンノースでキャッピングされた構造の不十分な認識に一致し、Ａ１９４－０１は、Ｐ３０Ｂ９のＭａｎＬＡＭへの結合に対して非常に弱く競合し、９０８．７は全く競合しなかった。後者の抗体がＰ３０Ｂ９の結合に対して効率的に競合できないことにより、この効果が、競合するｍＡｂのプローブｍＡｂと同じ分岐への結合を必要とし、かつ同じ分子の隣接した分岐上に位置する異種エピトープに対する結合が有効な競合をもたらさないことが確認された。
【0152】
Ｂ．競合アッセイによる相対的なＡ１９４－０１ ＩｇＧおよびＰ３０Ｂ９ ＩｇＭ親和性
Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプおよびＰ３０Ｂ９のＩｇＭアイソタイプを含む個別のモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体の特異的なグリカン構造に対する反応性をマッピングすることは、抗体競合試験によるＬＡＭ中の前記特異的なグリカン構造の分布の特徴づけを可能にした（図１０）。これらの競合アッセイでは、１つの抗体が第２の（それらが同じ種に由来する場合にはビオチン化された）抗体の結合に対して競合するため、天然分子中で２つのエピトープが潜在的には（必ずではないが）同じまたは隣接するアラビナン分岐上で相互に近接している必要があることを仮定した。このモデルは、例えば、キャップのない、モノマンノシル化、またＭＳＸ置換Ａｒａ４およびＡｒａ６構造のいずれにも結合するビオチン化ＩｇＧ Ａ１９４－０１が、それ自身により、またＡ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体により効率的に競合しても、Ａｒａ６構造にのみ結合するマウスモノクローナル抗体ＦＩＮＤ２５によっては部分的にすぎない場合での非対照な競合パターンによって支持された。他方、すべてのＡｒａ４およびＡｒａ６構造に結合するマウスモノクローナル抗体ＣＳ－３５は、より完全な競合をもたらすが、おそらくはその比較的低い親和性に起因して大して効率的でない。
Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプおよびＰ３０Ｂ９のＩｇＭアイソタイプを含む個別のモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体の特異的なグリカン構造に対する反応性をマッピングすることは、抗体競合試験によるＬＡＭ中の前記特異的なグリカン構造の分布の特徴づけを可能にした（図１０）。これらの競合アッセイでは、１つの抗体が第２の（それらが同じ種に由来する場合にはビオチン化された）抗体の結合に対して競合するため、天然分子中で２つのエピトープが潜在的には（必ずではないが）同じまたは隣接するアラビナン分岐上で相互に近接している必要があることを仮定した。このモデルは、例えば、キャップのない、モノマンノシル化、またＭＳＸ置換Ａｒａ４およびＡｒａ６構造のいずれにも結合するビオチン化ＩｇＧ Ａ１９４－０１が、それ自身により、またＡ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体により効率的に競合しても、Ａｒａ６構造にのみ結合するマウスモノクローナル抗体ＦＩＮＤ２５によっては部分的にすぎない場合での非対照な競合パターンによって支持された。他方、すべてのＡｒａ４およびＡｒａ６構造に結合するマウスモノクローナル抗体ＣＳ－３５は、より完全な競合をもたらすが、おそらくはその比較的低い親和性に起因して大して効率的でない。
【0153】
これらのアッセイの結果は、一部では意外かつ想定外の特性を示した。例えば、すべてのジマンノースでキャッピングされたＭａｎＬＡＭ構造に結合する、Ｐ３０Ｂ９のＩｇＭアイソタイプは、それ自身、ＣＳ－３５およびＦＩＮＤ１７０により強力かつ完全に競合された。理論に拘束されたくないが、マウスモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体ＦＩＮＤ２５によるＰ３０Ｂ９の効率的競合は、天然ＬＡＭ中のジマンノースでキャッピングされた構造が、ＦＩＮＤ抗体によって認識されるＡｒａ６構造に主に局在化され、Ａｒａ４構造上に明確に発現されないことを示唆する。これにより、ジマンノースキャッピングが結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の毒性株中に見出されるＬＡＭのドミナントな形態と考えられることから、ジマンノースでキャッピングされたＡｒａ６残基に対して標的化し、特異的に結合することができることの重要性が強調される。ビオチン化ＦＩＮＤ２５のＡ１９４－０１の改変された変異体であるＩｇＭアイソタイプによる高度に効率的な競合は、Ａ１９４－０１のＩｇＭアイソタイプによるマンノシル化された構造の認識増加についてのさらなる証拠である。
【0154】
Ｃ．ＭａｎＬＡＭおよびＰＩＬＡＭに対するＡ１９４－０１ ＩｇＧおよびＰ３０Ｂ９ ＩｇＭおよびマウス抗－ＬＡＭ抗体の競合試験
異なる抗－ＬＡＭモノクローナル抗体間の結合競合アッセイを用いて、ＬＡＭ中の様々な構造形態の分布を分析した。Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプは、非修飾Ａｒａ４およびＡｒａ６側鎖の双方または単一のマンノースキャップを有する鎖を認識したが、ジマンノースまたはトリマンノースキャッピングモチーフのいずれかを有する側鎖に結合しなかった。２つのＦＩＮＤマウス抗体は、Ａｒａ６のすべての形態と反応したが、任意のＡｒａ４構造と反応しなかった。Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭは、ジマンノースキャップを有するＡｒａ４およびＡｒａ６構造に対して比較的特異的であった。
異なる抗－ＬＡＭモノクローナル抗体間の結合競合アッセイを用いて、ＬＡＭ中の様々な構造形態の分布を分析した。Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプは、非修飾Ａｒａ４およびＡｒａ６側鎖の双方または単一のマンノースキャップを有する鎖を認識したが、ジマンノースまたはトリマンノースキャッピングモチーフのいずれかを有する側鎖に結合しなかった。２つのＦＩＮＤマウス抗体は、Ａｒａ６のすべての形態と反応したが、任意のＡｒａ４構造と反応しなかった。Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭは、ジマンノースキャップを有するＡｒａ４およびＡｒａ６構造に対して比較的特異的であった。
【0155】
増加した結合価を有するＡ１９４－０１構築物に対する反応性における広範化に一致して、これらの構築物は、抗体競合活性における効力の増強を示した。ＭａｎＬＡＭに対するビオチン化Ａ１９４－０１ ＩｇＧの結合に対して競合する能力について試験するとき、十量体Ａ１９４－０１ ＩｇＭおよび四量体ｓｃＦｖ－ＩｇＧ変異体は、Ａ１９４－０１ ＩｇＧアイソタイプ自身よりも効率的に競合し（図１１）、それ故、潜在的な治療的および診断的有用性の増大を示した一方で、単量体ＦａｂおよびｓｃＦｖ形態は、大して効果的に競合しなかった（図１）。Ａ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体の二量体ｓｃＦｖは、Ａ１９４－０１ ＩｇＧアイソタイプと同様、等しく競合した。
【0156】
Ａ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体のエピトープ特異性をＡ１９４－０１ ＩｇＧの場合と比較したとき、それらがより広範な反応性を有することが認められた（図１４）。一方ではＩｇＧアイソタイプがジマンノース（ＹＢ－８－１２３、ＹＢ－８－１２５）およびトリマンノース（ＹＢ－ＢＳＡ－１１３、ＹＢ－ＢＳＡ－１３）で置換された構造に明確には結合しなかったが、ＩｇＭはこれらの構造を認識し、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ型は、同様にこれらの構造の一部に対して増強された活性を有した。ジマンノースキャッピング、特にジマンノースでキャッピングされたＡｒａ６が毒性結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中のドミナントなＬＡＭモチーフであることから、これは潜在的には、治療および診断用途におけるＡ１９４－０１のこれらの改変形態の高められた有用性を示唆する。
【0157】
非標識Ａ１９４－０１ ＩｇＧは、ビオチン化Ａ１９４－０１ ＩｇＧの、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＬＡＭ（ＭａｎＬＡＭ）（図１２Ａ）またはスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＬＡＭ（ＰＩＬＡＭ）（図１２Ｄ）のいずれかへの結合に対して競合した一方で、マウスモノクローナル抗体ＦＩＮＤ１７０およびＰ３０Ｂ９は、Ａ１９４－０１のいずれかの抗原への結合に対して競合することができなかった（図１２Ａ、Ｄ）。これは、Ａｒａ６に特異的なＦＩＮＤ１７０、またはジマンノースキャッピング残基に依存したＰ３０Ｂ９ ＩｇＭのいずれかでなく、Ａ１９４－０１ ＩｇＧアイソタイプによって認識されるＡｒａ４構造のドミナントな認識に一致した。同様に、Ａ１９４－０１は、ビオチン化ＦＩＮＤ２５（図１２Ｂ）またはＰ３０Ｂ９ ＩｇＭ（図１２Ｃ）のいずれかのＭａｎＬＡＭへの結合と競合せず、これはこれらの抗体に対する異なるエピトープ特異性に合致した。Ａ１９４－０１ ＩｇＧがＦＩＮＤ２５のＭａｎＬＡＭへの結合に対して競合できないことと対照的に、Ａ１９４－０１ ＩｇＧは、ＦＩＮＤ２５のＰＩＬＡＭへの結合の約９０％と強力に競合し（図１２Ｅ）、これは公知のＰＩＬＡＭ中でのマンノースキャッピングの不在およびＡ１９４－０１のキャップのないＡｒａ４およびＡｒａ６構造に対する高親和性に合致した。
【0158】
Ａ１９４－０１ ＩｇＧによる非効率的な競合と対照的に、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭは、ＦＩＮＤ２５の結合の約８０％と競合し、ＦＩＮＤ１７０は、Ｐ３０Ｂ９の結合とほぼ完全に競合した（図１２Ｂ、Ｃ）。これは、ＦＩＮＤマウス抗体によって認識されるＡｒａ６構造の大半がジマンノースキャップを有し、ひいてはＰ３０Ｂ９ ＩｇＭによっても認識され、またＰ３０Ｂ９によって認識されるジマンノースでキャッピングされた構造の大半がＡｒａ６構造上に存在することを強く示唆した。これは、ジマンノースでキャッピングされたＡｒａ６が、毒性結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＬＡＭモチーフ中のドミナントな免疫学的モチーフであることを示唆する。
【0159】
Ｄ．さらなる競合試験
ＬＡＭが不確実な異質性のある複合抗原であるという事実に光を当てるため、さらなる競合試験を行った。ＬＡＭ反応性モノクローナル抗体の異なるエピトープ特異性の決定は、天然ＬＡＭ中の様々なエピトープの分布を調べるための結合競合アッセイの使用を可能にした。様々な抗体がビオチン化プローブモノクローナル抗体のＬＡＭおよび合成複合糖質への結合に対して競合する能力をＥＬＩＳＡにより滴定した。３つのモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体Ａ１９４－０１ ＩｇＧ、ＣＳ－３５、およびＦＩＮＤ２５についての典型的な競合曲線を図１３Ａに示す。ビオチン化プローブモノクローナル抗体は、十分過剰に存在するときのそれらの非標識バージョンによって競合された。マウスモノクローナル抗体９０８．６は、その他の抗体に対して、仮に競合したとしても弱く競合した。これは、ある程度、この抗体の弱い親和性に起因したが、９０８．６のキャップのない構造に対する結合上の制限も反映し、またマンノースでキャッピングされた構造がＣＳ－３５およびＦＩＮＤ２５によって認識されるＭａｎＬＡＭ中のドミナントな標的であることをさらに示唆した。ＣＳ－３５は、その広範な反応性に一致して、ビオチン化Ａ１９４－０１ ＩｇＧの結合に対して競合したが、Ａ１０４－０１ ＩｇＧのＬＡＭに対するより高い親和性に一致して、Ａ１９４－０１ ＩｇＧ単独の場合よりも大して効率的でなかった。ＣＳ－３５はまた、ビオチン化ＦＩＮＤ２５に対して完全に競合した一方で、ＦＩＮＤ２５は、標識ＣＳ－３５に対して単に部分的に競合し（約７４％の最大競合）、Ａ１９４－０１ ＩｇＧに対してはさらに大して有効的でなかった（約５０％）。この結果は、おそらくは、Ａｒａ６骨格を有する構造に排他的に結合する、ＦＩＮＤ２５によらず、Ａ１９４－０１ ＩｇＧおよびＣＳ－３５によって認識されるＡｒａ４構造の存在を反映する。Ａ１９４－０１ ＩｇＧは、そのＬＡＭに対する全体的に高い親和性にもかかわらず、それ自身に対してのみ競合し、ＣＳ－３５またはＦＩＮＤ２５のいずれに対しても競合しなかった。これは、マウスモノクローナル抗体によって認識されるＬＡＭ中の部位が、Ａ１９４－０１ ＩｇＧによって認識されないジマンノースでキャッピングされた構造およびトリマンノースでキャッピングされた構造によって支配されることを示唆した。
ＬＡＭが不確実な異質性のある複合抗原であるという事実に光を当てるため、さらなる競合試験を行った。ＬＡＭ反応性モノクローナル抗体の異なるエピトープ特異性の決定は、天然ＬＡＭ中の様々なエピトープの分布を調べるための結合競合アッセイの使用を可能にした。様々な抗体がビオチン化プローブモノクローナル抗体のＬＡＭおよび合成複合糖質への結合に対して競合する能力をＥＬＩＳＡにより滴定した。３つのモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体Ａ１９４－０１ ＩｇＧ、ＣＳ－３５、およびＦＩＮＤ２５についての典型的な競合曲線を図１３Ａに示す。ビオチン化プローブモノクローナル抗体は、十分過剰に存在するときのそれらの非標識バージョンによって競合された。マウスモノクローナル抗体９０８．６は、その他の抗体に対して、仮に競合したとしても弱く競合した。これは、ある程度、この抗体の弱い親和性に起因したが、９０８．６のキャップのない構造に対する結合上の制限も反映し、またマンノースでキャッピングされた構造がＣＳ－３５およびＦＩＮＤ２５によって認識されるＭａｎＬＡＭ中のドミナントな標的であることをさらに示唆した。ＣＳ－３５は、その広範な反応性に一致して、ビオチン化Ａ１９４－０１ ＩｇＧの結合に対して競合したが、Ａ１０４－０１ ＩｇＧのＬＡＭに対するより高い親和性に一致して、Ａ１９４－０１ ＩｇＧ単独の場合よりも大して効率的でなかった。ＣＳ－３５はまた、ビオチン化ＦＩＮＤ２５に対して完全に競合した一方で、ＦＩＮＤ２５は、標識ＣＳ－３５に対して単に部分的に競合し（約７４％の最大競合）、Ａ１９４－０１ ＩｇＧに対してはさらに大して有効的でなかった（約５０％）。この結果は、おそらくは、Ａｒａ６骨格を有する構造に排他的に結合する、ＦＩＮＤ２５によらず、Ａ１９４－０１ ＩｇＧおよびＣＳ－３５によって認識されるＡｒａ４構造の存在を反映する。Ａ１９４－０１ ＩｇＧは、そのＬＡＭに対する全体的に高い親和性にもかかわらず、それ自身に対してのみ競合し、ＣＳ－３５またはＦＩＮＤ２５のいずれに対しても競合しなかった。これは、マウスモノクローナル抗体によって認識されるＬＡＭ中の部位が、Ａ１９４－０１ ＩｇＧによって認識されないジマンノースでキャッピングされた構造およびトリマンノースでキャッピングされた構造によって支配されることを示唆した。
【0160】
ジマンノースでキャッピングされたＭａｎＬＡＭに特異的に結合するＰ３０Ｂ９ ＩｇＭを用いる追加的な競合試験は、ＭａｎＬＡＭ中のＡｒａ６構造の大半がジマンノースでキャッピングされ、かつジマンノースキャップの大部分が結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＭａｎＬＡＭ中のＡｒａ６構造上に存在するという臨床的に有意な結論をさらに支持した。Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭは、ＦＩＮＤ２５のＭａｎＬＡＭへの結合の約８０％と競合し（図１３Ｂ）、これはＦＩＮＤ２５によって認識されるＡｒａ６構造の大半がＰ３０Ｂ９ ＩｇＭによっても認識されることに合致した。Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭは、ＦＩＮＤ２５のＰＩＬＡＭへの結合に対して競合せず、これは、ＰＩＬＡＭにおけるマンノシル化の欠如に起因する、ＰＩＬＡＭ中でのＰ３０Ｂ９ジマンノースエピトープの不在に合致した。さらに、Ａ１９４－０１ ＩｇＧは、ＦＩＮＤ２５のＭａｎＬＡＭへの結合に対して競合せず、これはさらに、ジマンノースキャップを有するＡｒａ６構造の大半がＡ１９４－０１ ＩｇＧによって認識されないことに合致した。この効果におけるマンノシル化の役割を確認すると、Ａ１９４－０１ ＩｇＧは、ＦＩＮＤ２５のＰＩＬＡＭへの結合に対して非常に効率的に競合し、これは、Ａ１９４－０１のＰＩＬＡＭに対する高い親和性およびこの抗原中でのマンノースキャッピングの不在に合致した。
【0161】
ビオチン化Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭの結合についての競合データは、この結論をさらに支持した。ビオチン化Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭの結合は、それ自身により、また等しい効率でＣＳ－３５およびＦＩＮＤ２５により、最も効率的に競合されたが、Ａ１９４－０１ ＩｇＧによってはわずかに不完全であった（図１３Ｃ）。ＦＩＮＤ２５による競合のレベルは１００％に近く、これはジマンノース依存性Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭ結合部位の本質的にすべてがＡｒａ６構造上に位置することを示した。この解釈に合致して、ＣＳ－３５はまた、Ｐ３０Ｂ９のジマンノースでキャッピングされたＡｒａ４（ＹＢ－８－１１１）およびジマンノースでキャッピングされたＡｒａ６（ＹＢ－８－１２５）への結合に対して競合した一方で、ＦＩＮＤ１７０は後者の抗原に対してのみ競合し、Ａ１９４－０１ ＩｇＧはいずれに対しても競合しなかった。ＭａｎＬＡＭおよび均一なＹＢ－８－１２５複合糖質における競合曲線間の一般的類似性は、競合結果が単一の炭水化物側鎖上での関連エピトープの存在または不在と相関し、かつ抗体のより離れた異種部位への結合に起因する間接的な立体的効果が競合における役割を（もしあるにしても）ほとんど果たさないことを示した。
【0162】
１つの意外かつ想定外の結果は、Ａ１９４－０１ ＩｇＧ対ＣＳ－３５およびＦＩＮＤ２５の間での競合の完全な欠如である。ＣＳ－３５がＡ１９４－０１ ＩｇＧのＭａｎＬＡＭへの結合に対して競合する能力は、ＣＳ－３５によるすべてのＡ１９４－０１ ＩｇＧ標的の認識に基づいて予想され、Ａ１９４－０１ ＩｇＧ自身によるよりもＣＳ－３５による大して効率的でない競合は、これらの抗体のＭａｎＬＡＭに対する相対的親和性に合致する（図３）。同様に、Ａ１９４－０１ ＩｇＧの結合のＦＩＮＤ２５による不完全な競合は、後者の抗体ではなく前者の抗体によって認識されるＡｒａ４標的の存在により説明され得る。
【0163】
ビオチン化Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭの結合のＣＳ－３５およびＦＩＮＤ１７０の双方による効率的かつ完全な競合は、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭによって認識されるジマンノースキャップが、臨床的および診断的有意性がある、ＦＩＮＤ ｍＡｂによって認識されるＡｒａ６構造とほぼ排他的に存在したことを示唆する。これは、ＦＩＮＤ２５のＭａｎＬＡＭへの結合活性の約８０％を遮断するがＰＩＬＡＭに対する効果を有しない、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭによるＦＩＮＤ２５の結合の比較的効率的な競合により支持された。これは、ＦＩＮＤ２５によって認識されるＭａｎＬＡＭ中のＡｒａ６部位の約８０％がジマンノースキャップを有し、かつジマンノースキャップの本質的にすべてがＡｒａ６上に存在し、Ａｒａ４構造上に存在しないことを強く示唆する。Ａ１９４－０１ ＩｇＧがＣＳ－３５またはＦＩＮＤ２５と競合できないことと相まって、これらの結果は、ジマンノース置換Ａｒａ６が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＭａｎＬＡＭに対するドミナントな免疫原性構造であり、ひいては非常に重要な抗原標的を表すことを示す。
【0164】
患者血漿中でのＬＡＭに特異的な抗体応答に関する試験は、マッピングと無関係に、応答が線状Ａｒａ４／Ａｒａ６構造に特異的なＩｇＧ２アイソタイプによって支配されることを示す。ＣＳ－３５およびＦＩＮＤ２５などのアラビノフラノース依存性エピトープに特異的なＩｇＧモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体によるＰ３０Ｂ９ ＩｇＭの効率的競合は、患者血漿中のかかるエピトープに対するドミナントなＩｇＧ２応答であれば、より低い力価で産生され得る、ジマンノース依存性の任意のＭａｎＬＡＭに特異的な抗体に対しても競合することになることを示唆する。したがって、たとえ抗体の後者のクラスがより有効な抗菌活性を有し得るとしても、これらの効果が、患者血清中に存在するアラビノース依存性エピトープに特異的なドミナントな非機能的ＩｇＧ２抗体による結合に対する競合により制限され得る可能性が高い。理論に拘束されたくないが、ドミナントな体液性応答は、実際には、より希少な抗体、例えばＰ３０Ｂ９ ＩｇＭのような多価抗体、またはＡ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体、例えば感染および病原性に対する免疫調節を提供し得る五価ＩｇＭアイソタイプまたは四価ｓｃＦｖ－ＩｇＧの潜在的効果に対して細菌を保護し得る。
【0165】
５．Ａ１９４－０１の結合に対する結合価の効果
ジマンノース反応性Ｐ３０Ｂ９のそのＩｇＭアイソタイプに依存した反応性についての発見が、多価が抗体のＬＡＭに対する親和性に寄与し得ることを示唆した。理論に拘束されたくないが、これは、単一のＬＡＭ分子がＬＡＭの既知の分岐構造および複雑性に合致して複数の抗体結合部位またはエピトープを有し、かつより高い結合価を有する抗体が二価抗体よりも多い部位に結合でき、より高い親和性をもたらすことを示唆した。ＬＡＭに対する結合効率への抗体結合価の効果を、ビオチン化Ａ１９４－０１ ＩｇＧを標的として用いる結合競合アッセイにおいて、ヒトモノクローナル抗体Ａ１９４－０１の様々な改変された変異体および／または誘導体形態および／またはアイソタイプについて試験した。抗体形態は、ＶＨおよびＶＬ領域が可動性ペプチドリンカーによって連結された一価一本鎖ｓｃＦｖ、一価Ｆａｂタンパク質、２つのｓｃＦｖドメインが可動性リンカーによって連結された二量体ｓｃＦｖタンパク質、天然二量体ＩｇＧ（図１Ａ）、および２つのより高い結合価形態の四価Ａ１９４－０１ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、および五価（結合部位に対して十価）ＩｇＭアイソタイプ（図１Ｂ）を含んだ。インタクトな二価ＩｇＧを一価Ｆａｂに変換した結果、結合活性の非常に大きな低下がもたらされ、ＩｇＧのそれ自身に対する場合と比べて、濃度における＞１００倍の増加がビオチン化Ａ１９４－０１ ＩｇＧの結合活性の５０％に対して競合するのに必要であった（図１Ｃ）。一本鎖はまた、非効率に競合し、活性が３３倍低下した。他方、ｓｃＦｖ二量体は、Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプと同様の効率で競合した。理論に拘束されたくないが、これは、Ａ１９４－０１の二価形態のＬＡＭへの効率的結合には、抗原の単一分子中の隣接した標的への両結合部位の付着が必要であることを示唆した。より高い結合価形態は、モルベースでより効率的に競合した。これは単純に、追加的な結合部位の存在に起因し得るが、より高い結合価形態の増加した親和性をさらに反映し得る。
ジマンノース反応性Ｐ３０Ｂ９のそのＩｇＭアイソタイプに依存した反応性についての発見が、多価が抗体のＬＡＭに対する親和性に寄与し得ることを示唆した。理論に拘束されたくないが、これは、単一のＬＡＭ分子がＬＡＭの既知の分岐構造および複雑性に合致して複数の抗体結合部位またはエピトープを有し、かつより高い結合価を有する抗体が二価抗体よりも多い部位に結合でき、より高い親和性をもたらすことを示唆した。ＬＡＭに対する結合効率への抗体結合価の効果を、ビオチン化Ａ１９４－０１ ＩｇＧを標的として用いる結合競合アッセイにおいて、ヒトモノクローナル抗体Ａ１９４－０１の様々な改変された変異体および／または誘導体形態および／またはアイソタイプについて試験した。抗体形態は、ＶＨおよびＶＬ領域が可動性ペプチドリンカーによって連結された一価一本鎖ｓｃＦｖ、一価Ｆａｂタンパク質、２つのｓｃＦｖドメインが可動性リンカーによって連結された二量体ｓｃＦｖタンパク質、天然二量体ＩｇＧ（図１Ａ）、および２つのより高い結合価形態の四価Ａ１９４－０１ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、および五価（結合部位に対して十価）ＩｇＭアイソタイプ（図１Ｂ）を含んだ。インタクトな二価ＩｇＧを一価Ｆａｂに変換した結果、結合活性の非常に大きな低下がもたらされ、ＩｇＧのそれ自身に対する場合と比べて、濃度における＞１００倍の増加がビオチン化Ａ１９４－０１ ＩｇＧの結合活性の５０％に対して競合するのに必要であった（図１Ｃ）。一本鎖はまた、非効率に競合し、活性が３３倍低下した。他方、ｓｃＦｖ二量体は、Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプと同様の効率で競合した。理論に拘束されたくないが、これは、Ａ１９４－０１の二価形態のＬＡＭへの効率的結合には、抗原の単一分子中の隣接した標的への両結合部位の付着が必要であることを示唆した。より高い結合価形態は、モルベースでより効率的に競合した。これは単純に、追加的な結合部位の存在に起因し得るが、より高い結合価形態の増加した親和性をさらに反映し得る。
【0166】
Ａ１９４－０１の四量体ｓｃＦｖ－ＩｇＧ変異体および／または誘導体とＡ１９４－０１の十量体ＩｇＭアイソタイプの双方の特異性を、上記の合成複合糖質パネルに対するＡ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプの場合と比較した（図１４）。これは、改変されたｓｃＦｖ－ＩｇＧ変異体および改変されたＩｇＭアイソタイプの双方が、ＩｇＧアイソタイプがわずかに認識するかまたは全く認識しないグリカンの一部とのより広範な反応性を有することを示した。ジマンノースでキャッピングされた構造（ＹＢ－８－１１１、ＹＢ－８－１２５、ＹＢ－８－１３３）およびトリマンノースでキャッピングされた構造（ＹＢ－８－１１３、ＹＢ－８－１４３、ＹＢ－ＢＳＡ－１３）の一部との増強された結合が見られ、Ａ１９４－０１の改変されたＩｇＭアイソタイプは最も広範な反応性パネルを有した。ジマンノースキャッピングの有意性を仮定すると、これは有意な診断および治療可能性を有する。興味深いことに、増強された反応性はまた、試験したモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体にいずれによっても認識されない、末端β－Ｄ－Ａｒａｆ－（１→２）結合（ＹＢ－ＢＳＡ－０９）が欠損しているアラビノース構造を有するＡ１９４－０１ ＩｇＭアイソタイプにおいて見られた。理論に拘束されたくないが、これは、結合価の増加により、Ａ１９４－０１のＩｇＭアイソタイプのその塩基性アラビノース含有エピトープに対する結合活性の増強が、末端置換の阻害効果が克服されるに至るまで生じることを示唆した。
【0167】
Ａ１９４－０１ ＩｇＧならびにＡ１９４－０１の改変されたＩｇＭおよびｓｃＦｖ－ＩｇＧ型の反応性特性を、ＭａｎＬＡＭまたはＰＩＬＡＭのいずれかに対する相互の結合競合実験によりさらに分析した。３つすべての形態がビオチン化抗体のＰＩＬＡＭへの結合およびＡ１９４－０１ ＩｇＧのＭａｎＬＡＭへの結合に対して交差競合した一方で、Ａ１９４－０１のより高い結合価のｓｃＦｖ－ＩｇＧおよびＩｇＭ型のみが修飾抗体のＭａｎＬＡＭへの結合と効率的に競合した。競合活性におけるこれらの差異は、改変された形態のより広範な結合特性に一致し、それらがＩｇＧ型によって認識されないＬＡＭ上の部位に結合することを示唆した。
【0168】
この結論は、Ａ１９４－０１の異なるアイソタイプがビオチン化ＦＩＮＤ２５ ＩｇＧおよびＰ３０Ｂ９ ＩｇＭのＭａｎＬＡＭへの結合と競合した相互の競合試験によりさらに支持された。Ａ１９４－０１ ＩｇＧがＰ３０Ｂ９ ＩｇＭおよびＦＩＮＤ２５のＭａｎＬＡＭへの結合と競合しなかった一方で、Ａ１９４－０１のｓｃＦｖ－ＩｇＧおよびＩｇＭ型の双方は、これら２つのモノクローナル抗体の結合とほぼ完全に競合した（図１５Ａ、Ｂ）。予想通り、Ａ１９４－０１の３つすべての形態がＦＩＮＤ２５のＰＩＬＡＭへの結合と競合し（図１５Ｃ）、これはＰＩＬＡＭ中でのマンノシル化の不在に合致した。この増強された活性は、これらの修飾がこの抗体の免疫診断用途における潜在的有用性を高めることになるとともに、免疫療法を目的として、これらの試薬の有効性をさらに高め得ることを示唆した。
【0169】
実施例２－結核菌（Ｍ．ｔｂ）の糖脂質に特異的な新規なヒトモノクローナル抗体の単離および特徴づけ－ＬＡＭおよびＰＩＭ６によって共有されるエピトープに特異的な第１のｍＡｂの単離
Ｐ９５Ｃ１抗体重鎖および軽鎖は、潜在性結核感染（ＬＴＢＩ）を有する患者から、ＭａｎＬＡＭとの反応性をスクリーニングすることにより、単一のＢ細胞クローンから単離した。Ｐ９５Ｃ１は、ＭａｎＬＡＭおよびＰＩＬＡＭの双方に結合するＩｇＭアイソタイプ抗体である。これは、Ｐ９５Ｃ１がキャップのないまたは様々なマンノース構造でキャッピングされた様々なアラビノース側鎖を発現するいずれの分子にも結合しないことを示す複合糖質結合試験により示された。認識される唯一の構造は、ＰＩＭ６と様々なＬＡＭとの間に保存されるマンナン塩基中に存在する構造モチーフを有する２つのポリマンノース構造であった（図１８（Ａ）、１８（Ｂ）、１８（Ｃ））。このＬＡＭ－ＰＩＭ６交差反応は、Ａ１９４－０１およびＰ３０Ｂ９がＬＡＭのみに結合する一方で、Ｐ９５Ｃ１がＬＡＭ前駆物質の糖脂質分子ＬＭおよびＰＩＭ６とも反応することを示すウエスタンブロットアッセイにより確認した（図２０（Ａ）、２０（Ｂ））。
Ｐ９５Ｃ１抗体重鎖および軽鎖は、潜在性結核感染（ＬＴＢＩ）を有する患者から、ＭａｎＬＡＭとの反応性をスクリーニングすることにより、単一のＢ細胞クローンから単離した。Ｐ９５Ｃ１は、ＭａｎＬＡＭおよびＰＩＬＡＭの双方に結合するＩｇＭアイソタイプ抗体である。これは、Ｐ９５Ｃ１がキャップのないまたは様々なマンノース構造でキャッピングされた様々なアラビノース側鎖を発現するいずれの分子にも結合しないことを示す複合糖質結合試験により示された。認識される唯一の構造は、ＰＩＭ６と様々なＬＡＭとの間に保存されるマンナン塩基中に存在する構造モチーフを有する２つのポリマンノース構造であった（図１８（Ａ）、１８（Ｂ）、１８（Ｃ））。このＬＡＭ－ＰＩＭ６交差反応は、Ａ１９４－０１およびＰ３０Ｂ９がＬＡＭのみに結合する一方で、Ｐ９５Ｃ１がＬＡＭ前駆物質の糖脂質分子ＬＭおよびＰＩＭ６とも反応することを示すウエスタンブロットアッセイにより確認した（図２０（Ａ）、２０（Ｂ））。
【0170】
Ｐ９５Ｃ１が、Ｐ３０Ｂ９と同様、ＩｇＭとして天然に発現された一方で、Ｐ３０Ｂ９と対照的にそれは、ＩｇＡまたはＩｇＧアイソタイプのいずれかに変換されるとき、反応性を保持した（図１９）。これは、ＬＡＭ分子のマンナン領域内のエピトープまたはｏｔｓ位置の性質の反映であり得るか、またはより成熟した抗体配列に合致した、Ｐ９５Ｃ１可変領域内でのより多くの数の突然変異に関連し得る。Ｐ９５Ｃ１重鎖および軽鎖の可変領域は、その最も近い生殖系列抗体配列からの１９および１３のアミノ酸点突然変異を各々有する。
【0171】
近年、潜在性疾患を有する個体によって作製される抗体が、ファゴリソソーム融合、インフラマソーム活性化、および内部移行されるマイコバクテリアのマクロファージ殺傷を促進する上で、活動性結核を有する個体よりも機能的に優れていることが示されている（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．２０１６）。それ故、Ｐ９５Ｃ１がＬＴＢＩ患者から単離されたことと、その可変領域内に、Ｐ３０Ｂ９および異なるＭａｎＬＡＭエピトープ特異性を有する同じＬＴＢＩ患者から単離された２つの他のＬＡＭに特異的なｍＡｂよりも多くの突然変異を有することは興味深い。
【0172】
結核菌（Ｍ．ｔｂ）感染に対するヒト体液性免疫応答の性質についてはほとんど知られていない。結核菌（Ｍ．ｔｂ）の表面糖脂質がマクロファージおよび樹状細胞の活性の阻害に寄与することは周知であるが、マンノースでキャッピングされたリポアラビノマンナン（ＭａｎＬＡＭ）またはホスファチジルイノシトールマンノシド６（ＰＩＭ６）が結核菌（Ｍ．ｔｂ）の主要な免疫抑制性表面成分であるか否かについて、矛盾した情報がある。この問題は、ＰＩＭ６の精製製剤のＭａｎＬＡＭによる（およびその逆）一般的な汚染により、さらに複雑化される。この問題に対処する一方法は、これら２つの修飾物質に特異的な抗体がこれらの阻害活性を阻害する能力を試験することである。しかし、これは、これら２つの抗原に特異的である十分に特徴づけられた抗体の不在が原因で可能でなかった。現在まで、ＰＩＭ６を認識する抗体は報告されておらず、本発明はＰＩＭ６を認識する第１の高親和性ｍＡｂを記載する。ＰＩＭ（ＰＩＭ２およびＰＩＭ４）は、ＭａｎＬＡＭに対する前駆物質であり、ＭａｎＬＡＭのマンナンドメインとＰＩＭ６のポリマンノース構造との間に何らかの構造的関係が存在する。
【0173】
抗体は、１）宿主細胞侵入の直接的遮断および細菌産物の中和による、また２）間接的にＦｃ媒介性補体およびＦｃ受容体を通じた細胞活性化機構による２つの方法で、その機能を発揮し得る。抗体介在性エフェクター機能は、主に抗体アイソタイプにより冒される。最近の試験によると、結核菌（Ｍ．ｔｂ）に対するヒトアイソタイプ依存性の阻害抗体応答が示され、異なる結核菌（Ｍ．ｔｂ）表面抗原に特異的なＩｇＡ（ＩｇＧでない）抗体が、肺上皮細胞による結核菌（Ｍ．ｔｂ）の取り込みを、ＩｇＡ Ｆｃ受容体の発現と無関係に遮断し得ることが示された。ＬＡＭの結合に対するＰ９５Ｃ１アイソタイプの効果を試験するため、Ｐ９５Ｃ１－ＩｇＭ重鎖の定常領域をＣＨ－ＩｇＡおよびＣＨ－ＩｇＧと置換し、Ｐ９５Ｃ１－ＩｇＡおよびＰ９５Ｃ１－ＩｇＧを作製した。Ｐ９５Ｃ１アイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ）とＭａｎＬＡＭおよびＰＩＬＡＭとの結合親和性は同等であった（図１９）。
【0174】
他の実施形態
抗体、組成物、キットおよび方法の一部または全部においては、任意の改善を行ってもよい。本明細書で引用される出版物、特許出願、および特許を含むすべての参考文献は、ここで参照により援用される。ありとあらゆる例、または本明細書に提供される例示的用語（例えば、「～など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明を例示することが意図され、特に要求されない限り、本発明の範囲に対して制限を設けることはない。本発明のまたは好ましい実施形態の性質または利益に関しての本明細書中の任意の記載内容は、限定されることが意図されず、添付の特許請求の範囲は、かかる記載内容によって限定されるものとみなされるべきではない。より一般的には、本明細書中の用語は、任意の請求されない要素を本発明の実施にとって必須なものとして示すように解釈されるべきではない。本発明は、本明細書に添付される特許請求の範囲中に挙げられる主題のすべての修飾および均等物を適用法によって許容されるものとして含む。さらに、そのあらゆる可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組み合わせは、本明細書中で別段の指示がないか、またはそれ以外として文脈により明確に禁忌とされない限り、本発明によって包含される。
抗体、組成物、キットおよび方法の一部または全部においては、任意の改善を行ってもよい。本明細書で引用される出版物、特許出願、および特許を含むすべての参考文献は、ここで参照により援用される。ありとあらゆる例、または本明細書に提供される例示的用語（例えば、「～など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明を例示することが意図され、特に要求されない限り、本発明の範囲に対して制限を設けることはない。本発明のまたは好ましい実施形態の性質または利益に関しての本明細書中の任意の記載内容は、限定されることが意図されず、添付の特許請求の範囲は、かかる記載内容によって限定されるものとみなされるべきではない。より一般的には、本明細書中の用語は、任意の請求されない要素を本発明の実施にとって必須なものとして示すように解釈されるべきではない。本発明は、本明細書に添付される特許請求の範囲中に挙げられる主題のすべての修飾および均等物を適用法によって許容されるものとして含む。さらに、そのあらゆる可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組み合わせは、本明細書中で別段の指示がないか、またはそれ以外として文脈により明確に禁忌とされない限り、本発明によって包含される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-03-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ａｒａ４構造、Ａｒａ６構造、またはそれらの組み合わせを含むＬＡＭエピトープに特異的に結合する、ヒトモノクローナル抗－リポアラビノマンナン（抗－ＬＡＭ）抗体、またはその抗原結合部分において、前記抗－ＬＡＭ抗体が、配列番号１またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変軽領域、配列番号２またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変軽領域、配列番号３もしくは配列番号２６またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変軽領域、配列番号４またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ１可変重領域、配列番号５またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ２可変重領域、および配列番号６もしくは配列番号２３またはその抗原断片との少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ３可変重領域を含むことを特徴とするヒトモノクローナル抗－リポアラビノマンナン抗体、またはその抗原結合部分。
【外国語明細書】