【図1】 図１Ａは、結合競合アッセイにて用いられるＡ１９４－０１のＩｇＧ型およびその断片のモデルである。これらは、一価ｓｃＦｖおよびＦａｂ構造、ならびに二価ｓｃＦｖ二量体および天然ＩｇＧを含んだ。図１Ｂは、Ａ１９４－０１の一価形態が二価形態よりも大して有効に競合しなかったことを示す競合曲線である。図１Ｃは、Ａ１９４－０１のより高い結合価の形態の構造である。これは、正常な重鎖の各々のＮ末端に連結されたＡ１９４－０１ ｓｃＦｖドメインを有する、相同な四価Ａ１９４－０１ ｓｃＦｖ－ＩｇＧを表す。

【図2】 図２Ａは、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＧおよびＩｇＭ型、ならびにＶＨ領域内の６つのアミノ酸挿入物が欠失されたか、またはＶＨ領域内の９つの体細胞突然変異が最も近い生殖系列配列、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＭａｎＬＡＭに復帰されたＩｇＭの結合活性である。６つのアミノ酸挿入物は、９つの体細胞突然変異よりも大きい程度で反応性に寄与した。図２Ｂおよび２Ｃは、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭおよびＩｇＧ型、ならびに結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＭａｎＬＡＭ（Ｂ）およびスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＰＩＬＡＭ（Ｃ）に対する重鎖における６つのアミノ酸欠失を伴う突然変異の反応性を比較する。ＩｇＭ型は、ＩｇＧ型と異なり、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＭａｎＬＡＭ（２Ｂ）と特異的に反応したが、ＰＩＬＡＭ（２Ｃ）とは特異的に反応せず、Δ６アミノ酸突然変異体のＭａｎＬＡＭに対する反応性は非常に低下し、ＰＩＬＡＭに対しては陰性であった。

【図3】 図３は、２つのヒトｍＡｂおよび４つのマウスｍＡｂの、左パネルでのＰＩＬＡＭ、また右パネルでの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＨ３７Ｒｖ株から単離されたＭａｎＬＡＭに対する反応性を比較する。曲線は、これらの試薬の異なる分子量について制御するため、抗体のモル濃度を用いてプロットされた。

【図4A】 図４Ａは、ＬＡＭ中に存在するモチーフに関係する微生物のグリカン構造を表す２５の合成オリゴ糖の構造である。これらの構造は、ＢＳＡ担体タンパク質にカップリングされ、エピトープ特異性を探索するために用いられた。

【図4B】 図４Ｂは、２５の合成オリゴ糖のパネルに対する６つのＬＡＭに特異的なモノクローナル抗体における結合特性である。結合結果は、３つの濃度に対して示され、抗体のこれらの抗原に対する相対的親和性が適定パターンにより示される。

【図5】 図５は、左側パネルが、ＩｇＡ１（Ａ）、ＩｇＡ２（Ｂ）および二量体ＩｇＡ１－Ｊ二量体複合体（Ｃ）の構造である。右側パネルが、ＤＴＴによる還元の前と後の双方での、精製されたＰ３０Ｂ９ ＩｇＡ１、ＩｇＡ２およびＩｇＡ３タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＡ３は、より長いヒンジ領域を伴うＰＣＲの人為的結果であることが後に示された。

【図6】 図６は、ＩｇＭ型、次いでＩｇＡ型に対して最大活性を示し、ＩｇＧ型に対して反応性を有しない、Ｐ３０Ｂ９の異なるアイソタイプのＭａｎＬＡＭへの結合曲線である。

【図7】 図７は、指定濃度のＭａｎＬＡＭがＣＳ－３５により捕捉され、ビオチンで標識された指定のｍＡｂにより検出された、ＣＳ－３５捕捉アッセイにおける可溶性ＭａｎＬＡＭの検出時のビオチン化モノクローナル抗体プローブの効率の比較である。

【図8】 図８は、様々なマンノースでキャッピングされたＡｒａ４構造、またはテトラおよびペンタマンノース構造へのＰ３０Ｂ９の結合曲線である。関連α－Ｍａｎｐ（１→２）－Ｍａｎｐ結合を有する構造３（ジマンノース－Ａｒａ４）および５９において優先的結合が見られた。

【図9】 図９は、反応性に対する構造的要件を判定するための、様々なキャップのないＬＡＭ関連複合糖質に対するモノクローナル抗－ＬＡＭ抗体の適定である。図９Ａは、Ａｒａ４配列の非還元末端からの最後から２番目の位置でのＡｒａ－α（１→５）－Ａｒａ結合の重要性の分析である。図９Ｂは、Ａｒａ４配列の末端位置でのＡｒａ－β（１→２）－Ａｒａ結合の依存性の分析である。

【図10】 図１０は、抗体反応性に対する異なるキャッピングモチーフの効果を示す、様々なＡｒａ６を有する複合糖質に対するＡ１９４－０１ ＩｇＧおよび３つのマウス抗－ＬＡＭ抗体の結合曲線である。

【図11】 図１１は、個別の抗－ＬＡＭ抗体の、プローブ抗体のＭａｎＬＡＭ抗原への結合に対して競合する能力を測定するための結合競合試験である。抗体は、同じ種由来の抗体に対する試験時、ビオチン化された。Ａ１９４－０１がビオチン化Ｐ３０Ｂ９に対して競合できないことに注意されたい。

【図12】 図１２は、抗－ＬＡＭモノクローナル抗体の結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＬＡＭ（ＭａｎＬＡＭ）およびスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＬＡＭ（ＰＩＬＡＭ）への結合の競合である。ＭａｎＬＡＭに対するＦＩＮＤ２５とＰ３０Ｂ９との間の効率的競合は、ジマンノース置換Ａｒａ６の支配に合致する一方で、これら２つのｍＡｂのＡ１９４による競合の欠如は、ジマンノースでキャッピングされた構造とのその低い反応性に合致する。ＦＩＮＤ２５対ＰＩＬＡＭに対するＡ１９４の効率的競合は、この構造中のジマンノースキャッピングの不在に合致する。

【図13】 図１３は、ビオチン化プローブモノクローナル抗体と天然ＬＡＭ抗原および選択された複合糖質に対する余分な非修飾抗体との結合競合である。図１３Ａは、ビオチン化Ａ１９４－０１ ＩｇＧ、ＣＳ－３５およびＦＩＮＤ２５のＭＡｎＬＡＭへの結合の４つのｍＡｂによる競合であり；図１３Ｂは、ＦＩＮＤ２５のＭａｎＬＡＭとＰＩＬＡＭの双方への結合の３つのｍＡｂによる競合であり；図１３Ｃは、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭのＭＡｎＬＡＭおよび２つの合成複合糖質抗原への結合の４つのｍＡｂによる競合である。

【図14】 Ａ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体は、Ａ１９４－０１のＩｇＧアイソタイプによって低く認識されるジおよびトリマンノース置換形態を含む、より広範囲の複合糖質と反応する。

【図15】 図１５は、Ａ１９４－０１ ＩｇＧならびにＡ１９４－０１の改変された変異体および／または誘導体の、ＦＩＮＤ２５およびＰ３０Ｂ９ ＩｇＭのＭａｎＬＡＭへの結合に対する差次的競合である。Ａ１９４ ＩｇＧはＭａｎＬＡＭに対するＰ３０Ｂ９またはＦＩＮＤ２５と競合しないが、多量体形態は、これらの形態のより広範なエピトープ特異性に合致して確かに競合する。上で示されるように、Ａ１９４ ＩｇＧは、ＰＩＬＡＭに対してＦＩＮＤ２５と大して競合しない。

【図16】 図１６は、ＣＳ－４０、Ａ１９４－０１およびＰ３０Ｂ９ ｍＡｂの反応性に対するマンノースキャッピングの効果の分析についての比較である。抗体結合特異性は、異なるマンノース置換を有する特定の複合糖質に対してＥＬＩＳＡにより測定された。抗体滴定は、図１６Ａに示され、マンノース含有グリカン抗原の構造は図１６Ｂに示される。

【図17】 図１７Ａは、相同ｓｃＦｖ－ＩｇＧである。この例では、ＩｇＧおよびｓｃＦｖドメインの双方は同じ抗体に由来する。これは、増加した結合価（二価に対する四価）をもたらすが、標的特異性を直接的に修飾しない。図１７Ｂは、異種ｓｃＦｖ－ＩｇＧである。結合価における増加に加えて、広範化された特異性も導入され、それは、単一抗原分子中の異なるエピトープの認識を可能にし得る。図１７Ｃは、異種ｓｃＦｖ－ＩｇＭである。この製剤では、異なるｓｃＦｖがＩｇＭ構築物と組み合わされる。一例としては、Ａ１９４－０１ ｓｃＦｖとＰ３０Ｂ９ ＩｇＭとの連結が挙げられる。結合価における増加に加えて、この場合、追加的なエピトープ特異性を導入することになり、それは、相同ｓｃＦｖ－ＩｇＭによって認識されないことがある異なるエピトープの多価認識を可能にし、親和性の増加をもたらし得る。

【図18A】 図１８は、新しいｍＡｂによって認識されるエピトープのマッピングである。Ｐ９５Ｃ１のエピトープ特異性が、２つの前述されたｍＡｂのＡ１９４－０１およびＰ３０Ｂ９、ならびに２つの前述されたｍＡｂに関連するエピトープを認識する２つの新しいｍＡｂのＰ６１Ｈ５およびＰ８３Ａ８の場合と比較された。図１８Ａは、ＬＡＭに特異的なｍＡｂのＬＡＭ前駆物質分子に対する反応性である。Ｐ３０Ｂ９およびＰ６１Ｈ５は、ＰＩＬＡＭよりもＭａｎＬＡＭに特異的であった一方で、Ａ１９４－０１、Ｐ８３Ａ８およびＰ９５Ｃ１は、ＬＡＭの両形態を認識した。Ｐ９５Ｃ１はまた、ＬＭおよびＰＩＭ６と効率的に結合した。他のｍＡｂのＬＭおよびＰＩＭ６に対する弱い反応性は、少なくとも一部にはＭａｎＬＡＭによるこれらの材料の汚染に起因する。

【図18B】 図１８Ｂは、合成ＬＡＭ由来複合糖質の反応性である。

【図18C】 図１８Ｃは、以前から公知のｍＡｂと対照的に、Ｐ９５Ｃ１は、ポリアラビノース構造のいずれも認識しない唯一の抗体であったが、ＰＩＭ６中ならびにＬＭおよびＬＡＭの塩基でのマンナンドメイン内に存在する構造に類似する、２つのポリマンノース構造ＹＢ－ＢＳＡ－０５およびＹＢ－ＢＳＡ－１１と特異的に反応した。

【図19】 図１９は、Ｐ９５Ｃ１およびＰ３０Ｂ９のＭａｎＬＡＭおよびＰＩ－ＬＡＭへの結合に対するアイソタイプスイッチの効果である。Ｐ９５Ｃ１においては、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧアイソタイプはすべて、ＩｇＧとしてではなくＩｇＭおよびＩｇＡ型のみで専らＭａｎＬＡＭと反応するＰ３０Ｂ９と異なり、ＭａｎＬＡＭおよびＰＩＬＡＭの双方に対して同等の結合活性を有する。

【図20】 図２０は、Ｐ９５Ｃ１とＬＡＭおよび追加的な結核菌（Ｍ．ｔｂ）糖脂質との交差反応性のウエスタンブロット解析である。図２０（Ａ）：精製されたＬＡＭに関連した糖脂質は、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離され、その後、過ヨウ素酸シッフ染色で糖分子の酸化および染色が行われ、反応性グリカンを含有する材料を呈した。図２０（Ｂ）：並行ブロットがｍＡｂのＡ１９４ ＩｇＧ１、Ｐ３０Ｂ９ ＩｇＭ、およびＰ９５Ｃ１ ＩｇＭで探索され、その後、アルカリホスファターゼが抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ二次抗体にコンジュゲートされ、ｂｃｉｐ／ｎｂｔ発色基質で処理された。Ａ１９４－０１は、結核菌（Ｍ．ｔｂ）由来のＭａｎＬＡＭおよびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇ）由来のＰＩＬＡＭと交差反応する。Ｐ３０Ｂ９は、結核菌（Ｍ．ｔｂ）のＭａｎＬＡＭに特異的である。Ｐ９５Ｃ１は、ＬＡＭ、ならびに結核菌（Ｍ．ｔｂ）から単離されるＬＭおよびＰＩＭ６の両種を認識する。ＬＡＭと共遊走するＬＭおよびＰＩＭ６中のバンドのＡ１９４－０１による弱い染色は、明らかにこれらの試料のＬＡＭによる微量な汚染に起因する。

【図21】 図２１は、Ａ１９４重鎖および軽鎖可変領域配列におけるアミノ酸配列の整列ならびにそれらの最も近い生殖系列配列とのそれらの比較である。上部の整列化では、上からの第１のアミノ酸配列（Ａ１９４－ＶＨ）は、ＣＤＲ３配列（配列番号２３）を有しないＡ１９４重鎖可変領域配列である。ＣＤＲ３を有しない重鎖可変領域配列は、配列番号２１である。上部の整列化では、第２のアミノ酸配列（生殖系列Ｈｏｍｓａｐ ＩＧＨＶ３－２０＊０１）は、配列番号２２である。上部の整列化では、第３のアミノ酸配列は、Ａ１９４重鎖可変領域のＣＤＲ３であり、配列番号２３である。下部の整列化では、上からの第１のアミノ酸配列（Ａ－１９４－Ｖｋ）は、ＣＤＲ３配列（配列番号２６）を有しないＡ１９４軽鎖可変領域である。ＣＤＲ３を有しない軽鎖可変領域配列は、配列番号２４である。下部の整列化では、第２のアミノ酸配列（生殖系列Ｈｏｍｓａｐ ＩＧＫＶ３－１５＊０１）は、配列番号２５である。下部の整列化では、第３の配列は、Ａ１９４軽鎖可変領域のＣＤＲ３であり、配列番号２６である。

【図22】 図２２は、Ｐ３０Ｂ９－ＩｇＭ重鎖および軽鎖可変領域配列におけるアミノ酸配列ならびにそれらの最も近い生殖系列とのそれらの比較である。上部の整列化では、上からの第１のアミノ酸配列（Ｐ３０Ｂ９－Ｖｈ）は、ＣＤＲ３配列（配列番号２９）を有しないＰ３０Ｂ９－ＩｇＭ重鎖可変領域配列である。ＣＤＲ３を有しない重鎖可変領域配列は、配列番号２７である。第２のアミノ酸配列（Ｈｏｍｓａｐ ＩＧＨＶ４－３４＊０１Ｆ）は、配列番号２８である。第３のアミノ酸配列は、Ｐ３０Ｂ９－ＩｇＭ重鎖可変領域のＣＤＲ３であり、配列番号２９である。下部の整列化では、上からの第１のアミノ酸配列（Ｐ３０Ｂ９－Ｖｋ）は、ＣＤＲ３配列（配列番号３２）を有しないＰ３０Ｂ９軽鎖可変領域である。ＣＤＲ３を有しない軽鎖可変領域配列は、配列番号３０である。下部の整列化では、第２のアミノ酸配列（生殖系列Ｈｏｍｓａｐ ＩＧＫＶ１－５＊０３）は、配列番号３１である。下部の整列化では、第３の配列は、Ｐ３０Ｂ９軽鎖可変領域のＣＤＲ３であり、配列番号３２である。

【図23】 図２３は、Ｐ９５Ｃ１－ＩｇＭ重鎖および軽鎖可変領域配列におけるアミノ酸配列の整列ならびにそれらの最も近い生殖系列配列とのそれらの比較である。上部の整列化では、上からの第１のアミノ酸配列（Ｐ９５Ｃ１－ＶＨ）は、ＣＤＲ３配列（配列番号１８）を有しないＰ９５Ｃ１重鎖可変領域配列である。ＣＤＲ３を有しない重鎖可変領域配列は、配列番号３３である。上部の整列化では、第２のアミノ酸配列（生殖系列Ｈｏｍｓａｐ ＩＧＨＶ４－４＊０２）は、配列番号３４である。上部の整列化では、第３のアミノ酸配列は、Ｐ９５Ｃ１－ｇＭ重鎖可変領域のＣＤＲ３であり、配列番号１８である。下部の整列化では、上からの第１のアミノ酸配列（Ｐ９５Ｃ１－Ｖｋ）は、ＣＤＲ３配列（配列番号１５）を有しないＰ９５Ｃ１軽鎖可変領域である。ＣＤＲ３を有しない軽鎖可変領域配列は、配列番号３６である。下部の整列化では、第２のアミノ酸配列（生殖系列Ｈｏｍｓａｐ ＩＧＫＶ４－１＊０１Ｆ）は、配列番号３７である。下部の整列化では、第３の配列は、Ｐ９５Ｃ１軽鎖可変領域のＣＤＲ３であり、配列番号１５である。