特開 2023-76471 キメラ抗原受容体及び他の受容体の発現に対するＴ細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023076471

(43)【公開日】2023-06-01

(54)【発明の名称】キメラ抗原受容体及び他の受容体の発現に対するＴ細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20230525BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230525BHJP

   C07K 14/55 20060101ALN20230525BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20230525BHJP

   C12N 15/867 20060101ALN20230525BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230525BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

C12N5/10

C07K14/55

C07K16/28

C12N15/867 Z

C12N15/13

【審査請求】有

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023035590

(22)【出願日】2023-03-08

(62)【分割の表示】P 2021101244の分割

【原出願日】2016-07-21

(31)【優先権主張番号】62/195,254

(32)【優先日】2015-07-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】598004424

【氏名又は名称】シティ・オブ・ホープ

【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100091214

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 進介

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン，クリスティーン イー．

(72)【発明者】

【氏名】フォーマン，スティーブン ジェイ．

(57)【要約】

【課題】
極めて長期にわたって活性があるＴ細胞集団が必要な様々な目的に有用なＴ細胞集団を調製する方法に関する。
【解決手段】
Ｔ細胞集団のうち、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、メモリー幹Ｔ細胞（ＴＳＣＭ）及びセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が濃縮される。これらの細胞集団は：１）ＣＤ１４発現骨髄細胞及びＣＤ２５発現細胞等の不要な細胞集団を枯渇させること；及び、２）ＣＤ６２Ｌ発現メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を濃縮させること；により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から獲得することができる。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

セントラルメモリーＴ細胞；メモリー幹Ｔ細胞、及びナイーブＴ細胞を含むヒト細胞の集団を調製する方法であって、前記方法は、以下の：
（ａ）Ｔ細胞を含むヒト細胞の試料を提供する工程；
（ｂ）前記Ｔ細胞を含むヒト細胞の試料を処理して、ＣＤ２５を発現する細胞及びＣＤ１４を発現する細胞を枯渇させ、かつ、前記枯渇された細胞の集団を調製する工程；かつ、
（ｃ）前記枯渇された細胞の集団を処理してＣＤ６２Ｌを発現する細胞を濃縮することにより、セントラルメモリーＴ細胞；メモリー幹Ｔ細胞、及びナイーブＴ細胞を含むヒト細胞の集団を調製する工程；
を含み、ここで、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞は枯渇されない、方法。

【請求項2】

さらに、前記Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を活性化し、前記活性化された細胞を導入又はトランスフェクションして、前記核酸分子を保有するＴ細胞を含むヒト細胞の集団を提供する工程、を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記Ｔ細胞を含むヒト細胞の試料はＰＢＭＣを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記核酸分子はベクターである、請求項２記載の方法。

【請求項5】

さらに、前記核酸分子を保有するＴ細胞を含む前記ヒト細胞の集団を培養する工程を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記培養する工程は、外因性ＩＬ－２及び外因性ＩＬ－１５の添加を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を活性化する工程は、前記細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体にさらす工程を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項8】

ベクターは、ウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。

【請求項9】

ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記核酸分子は、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２及び４～９のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に、Ｔ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団に関し、特に、Ｔ細胞が、セントラルメモリーＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞（ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ Ｔ ｃｅｌｌｓ）及びナイーブＴ細胞を含み、Ｔ細胞のうち４０％を超えるＴ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、Ｔ細胞のうち７０％を超えるＴ細胞がＣＤ６２Ｌ＋である、単離されたヒト細胞の集団に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｅｘ ｖｉｖｏで増殖された自己由来のＴ細胞及び同種異系のＴ細胞を利用する養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、ウイルス感染、がん及び自己免疫疾患の治療の魅力的な治療のアプローチである。多数の治療用Ｔ細胞を迅速に生成しうる方法は、ＡＣＴの効能及び安全性に極めて重要である。規定されたＴ細胞サブセットの選択並びに増殖の方法を含む様々なＴ細胞濃縮方法がＡＣＴに用いられてきた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】ＷＯ２０１６／０４４８１１

【特許文献2】ＷＯ２１０４／１４４６２２

【特許文献3】ＷＯ２００２／０７７０２９

【特許文献4】ＷＯ／ＵＳ２０１４／０２８８９６１

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１８：４８１７

【非特許文献2】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｂｌｏｏｄ １１７：１８８８

【非特許文献3】Ｗａｎｇ Ｘ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１２；３５：６８９。

【非特許文献4】Ｇｒａｅｆ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１：１１６

【非特許文献5】Ｇａｔｔｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１：７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

インビボでの活性が比較的高く、かつ、増殖能が比較的高いＴ細胞集団を用いるのが望ましい。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本明細書に記載されるのは、ＡＣＴ用にキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を発現するのに有用なＴ細胞集団を調製する方法である。Ｔ細胞集団は、活性が高くて寿命の長いＴ細胞集団が必要な様々な他の目的にも有用である。本明細書で記載される方法により調製されたＴ細胞集団は：ナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）、メモリー幹Ｔ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）及びセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）に対して濃縮される。従って、そのような細胞集団は、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団として記載することができる。これらの細胞集団は：１）ＣＤ１４発現骨髄細胞及びＣＤ２５発現細胞等の望ましくない細胞集団を枯渇させること；及び、２）ＣＤ６２Ｌ発現メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を濃縮させること；の両方によって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得ることができる。従って、結果として得られる細胞の集団には、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌを発現するナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）及びメモリー幹Ｔ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）が含まれ、また、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌを発現するセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）の集団も含まれる。Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団は、その調製がＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞の枯渇を伴わない点で、以前に記載されたＴ_ＣＭ細胞の集団とは異なる。Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団は、調製時に、エフェクターメモリー細胞（Ｔ_ＥＭ）及びエフェクター細胞（Ｔ_Ｅ）を比較的含まない。当然ながら、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団が増殖するに従い、分化が起こり、例えばＴ_Ｅ細胞が生じる。

【0007】

患者特異的な自己由来のＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞及び同種異系のＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞（又は同種異系のＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞）を操作して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現させることができ、さらに、操作した細胞を増殖し、ＡＣＴで用いることができる。

【0008】

本明細書で記載されるのは、Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ３又はＣＤ３＋細胞を発現する細胞）を含む単離されたヒト細胞の集団であり、Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞；メモリー幹Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、Ｔ細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、Ｔ細胞のうち７０％を超える（７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ６２Ｌ＋である。様々な実施形態では：Ｔ細胞のうち１５％未満（１２％、１０％、８％又は６％未満）がＣＤ１４＋であり、Ｔ細胞のうち５％未満（４％、３％又は２％未満）がＣＤ２５＋であり；Ｔ細胞のうち１０％を超える（１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％を超える）Ｔ細胞が、組換え核酸分子（例えば、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体をコードする組換え核酸分子；例えば、Ｔ細胞ベクター等のウイルスベクター）を宿し；Ｔ細胞のうち少なくとも４０％の（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋、又は、ＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；Ｔ細胞のうち少なくとも１０％の（１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；Ｔ細胞のうち６０％未満（５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２４％、２０％又は１５％未満）がＣＤ４５ＲＯ＋であり；さらに、Ｔ細胞を含む単離された細胞集団における細胞のうち少なくとも８０％の（８５％、９０％、９５％又は９８％を超える）細胞がＴ細胞である。

【0009】

また、本明細書で記載されるのは、ヒトＴ細胞（すなわち、ＣＤ３又はＣＤ３＋細胞を発現する細胞）を含む単離された細胞の集団であり、Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞及びメモリー幹Ｔ細胞を含み、Ｔ細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、Ｔ細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ６２Ｌ＋であり、Ｔ細胞のうち７０％を超える（７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ９５＋であり、Ｔ細胞のうち１０％を超える（１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％を超える）Ｔ細胞が、組換え核酸分子（例えばキメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体をコードする組換え核酸分子（例えばウイルスベクター等））を備える。様々な実施形態では：Ｔ細胞のうち１５％未満（１２％、１０％、８％、６％未満）がＣＤ１４＋であり、Ｔ細胞のうち５％未満（４％、３％又は２％未満）のＴ細胞がＣＤ２５＋であり；Ｔ細胞のうち少なくとも４０％の（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）Ｔ細胞が、ＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋、又は、ＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；Ｔ細胞のうち少なくとも１０％の（１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％を超える）がＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；Ｔ細胞のうち６０％未満（５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２４％、２０％又は１５％未満）がＣＤ４５ＲＯ＋であり；Ｔ細胞を含む単離された細胞の集団における細胞のうち少なくとも８０％の（８５％、９０％、９５％又は９８％を超える）細胞がＴ細胞である。

【0010】

本明細書で記載されるのは、組換え核酸分子を備えるＴ細胞（すなわち、ＣＤ３又はＣＤ３＋細胞を発現する細胞）を含むヒト細胞の集団を調製する方法であり：（ａ）Ｔ細胞を含むヒト細胞の試料を提供する工程であって、Ｔ細胞は：セントラルメモリーＴ細胞；メモリー幹Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、Ｔ細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、Ｔ細胞のうち７０％を超える（７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ６２Ｌ＋である、工程；（ｂ）Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を活性化する工程；及び（ｃ）Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団における細胞に、組換え核酸分子を形質導入又は遺伝子導入して、組換え核酸分子を備えるＴ細胞を含むヒト細胞の集団を提供する工程を含み、当該方法は、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を枯渇させる工程を含まない。様々な実施形態では：組換え核酸分子は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、ＣＡＲをコードするウイルスベクター、Ｔ細胞受容体をコードするウイルスベクター）であり；当該方法は、組換え核酸分子を備えるＴ細胞を含むヒト細胞の集団を培養する工程をさらに含み；培養する工程は、外因性ＩＬ－２及び外因性ＩＬ－１５の添加を含み；さらに、活性化する工程は、細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体に曝露する工程を含み；さらに、Ｔ細胞を含む単離された細胞の集団における細胞の少なくとも８０％の（８５％、９０％、９５％又は９８％を超える）細胞がＴ細胞である。

【0011】

本明細書で記載されるのは、Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ３又はＣＤ３＋細胞を発現する細胞）を含むヒト細胞の集団を調製する方法であり、Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞；メモリー幹Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、７０％を超える（７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）細胞がＣＤ６２Ｌ＋であり、当該方法は：（ａ）Ｔ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団を提供する工程；（ｂ）枯渇した細胞集団を調製するために、ＣＤ２５を発現する細胞及びＣＤ１４を発現する細胞を枯渇させるようにＴ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団を処理する工程；及び（ｃ）ＣＤ６２Ｌを発現する細胞を濃縮するように、枯渇した細胞集団を処理し、その結果、Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を調製する工程であって、Ｔ細胞はセントラルメモリーＴ細胞；メモリー幹Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、７０％を超える細胞がＣＤ６２Ｌ＋である、工程を含み、当該方法は、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を枯渇させる工程を含まない。様々な実施形態では：当該方法は、Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を活性化する工程、及び、活性化された細胞に、組換え核酸分子を形質導入又は遺伝子導入して、組換え核酸分子を備えるＴ細胞を含むＴ細胞の集団を提供する工程をさらに含み；Ｔ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団は、ＰＢＭＣを含むＴ細胞を含み；さらに、Ｔ細胞を含む単離された細胞の集団における細胞のうち少なくとも８０％の（８５％、９０％、９５％又は９８％を超える）細胞がＴ細胞である。

【0012】

また、本明細書で記載されるのは、Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ３又はＣＤ３＋細胞を発現する細胞）を含むヒト細胞の集団であり、Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞；メモリー幹Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、７０％を超える（７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）細胞がＣＤ６２Ｌ＋であり、集団は：Ｔ細胞（例えば、ドナー由来のＰＢＭＣ）を含む単離されたヒト細胞の集団を提供する工程；枯渇した細胞集団を調製するために、ＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させ、ＣＤ１４を発現する細胞を枯渇させるように、Ｔ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団を処理する工程；及び、ＣＤ６２Ｌを発現する細胞を濃縮するように枯渇した細胞集団を処理し、その結果、Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を調製する工程であって、Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞；メモリー幹Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、７０％を超える（７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）細胞がＣＤ６２Ｌ＋である、工程を含む方法によって調製され、当該方法は、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を枯渇させる工程を含まない。様々な実施形態では、ヒト細胞の集団におけるＴ細胞のうち１５％未満（１２％、１０％、８％、６％未満）がＣＤ１４＋であり、さらに、Ｔ細胞のうち５％未満（４％、３％又は２％未満）がＣＤ２５＋であり；Ｔ細胞のうち少なくとも４０％の（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）Ｔ細胞はＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋、又は、ＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；Ｔ細胞のうち少なくとも１０％の（１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；Ｔ細胞のうち６０％未満（５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２４％、２０％又は１５％未満）がＣＤ４５ＲＯ＋である。

【0013】

また、本明細書で記載されるのは、がん、自己免疫又は感染症の治療方法であり、当該方法は、その必要がある患者に、本明細書で記載されるヒト細胞集団を含む医薬組成物を投与する工程を含む。場合によっては、細胞は、治療患者に対して自己由来であり、場合によっては、治療患者に対して同種異系である。

【0014】

細胞集団は、特定のマーカー（例えば受容体等）を発現する細胞について、細胞の集団からそのマーカーを発現する細胞の一部、大部分又はほぼ全てを（例えば、選択的抗体及び細胞選別法を用いて）除去することで枯渇させうるため、そのマーカーを発現する集団における細胞の相対的比率が低下する。細胞集団は、特定のマーカー（例えば受容体等）を発現する細胞について、細胞の集団からそのマーカーを発現する細胞の一部、大部分又はほぼ全てを（例えば、選択的抗体及び細胞選別法を用いて）集め、さらに、そのマーカーを発現しない細胞を捨てることにより濃縮しうるため、そのマーカーを発現する集団における細胞の相対的比率が低下する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】様々なＴ細胞のサブセットに対する特定のマーカーの発現パターン、特に、Ｔ_ＮからＴ_ＳＣＭを区別する発現パターンを示す図である。

【図2】様々なＴ細胞のサブセットに対する特定のマーカーの発現データを示す図である。

【図3】ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯの発現に基づき、特定のＴ細胞のサブセット間の関係を示す図である。

【図4】Ｔ_ＣＭ細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞に対するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）による濃縮後の細胞の表面表現型分析の結果を示す図である。示された生成物からの細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ３及びＣＤ８、セントラルメモリーＴ細胞マーカーＣＤ６２Ｌ及びナイーブＴ細胞マーカーＣＤ４５ＲＡだけでなく、単核球マーカーＣＤ１４及び制御性Ｔ細胞マーカーＣＤ２４に特異的な蛍光色素結合抗体を用いて染色した。アイソタイプ対照染色（黒線）を越える免疫反応性細胞の割合（陰影がつけられたヒストグラム）が、各ヒストグラムにおいて示される。

【図5】Ｔ_ＣＭ細胞集団及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞集団の増殖における研究の結果を示す図である。レンチウイルス形質導入の日の開始時の生細胞数が、５人のドナーのうち４人から製造された細胞生成物について描かれており、Ｔ_ＣＭ由来の生成物は黒い丸で表され、さらに、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の生成物は、白い四角で表される。培養液中の細胞の倍加時間をよりよく示すため、Ｌｏｇ２スケールをＹ軸に対して用いた。

【図6】Ｔ_ＣＭ細胞集団及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞集団の表面表現型分析の結果を示す図である。Ｔ_ＣＭが濃縮された細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}が濃縮された細胞をビーズで刺激し、ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７又はＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７で形質導入し、さらに、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させた。次に、細胞を、ＥＧＦＲｔ又はＣＤ１９ｔ形質導入マーカーに特異的な、又は、Ｔ細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８、セントラルメモリーＴ細胞マーカーＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌ、及び、ナイーブＴ細胞マーカーＣＤ４５ＲＡに特異的な蛍光色素結合試薬で染色した後、フローサイトメトリーによって分析した（灰色のヒストグラム）。対照の染色（オープンヒストグラム）を超える免疫反応性細胞の割合が、代表的なＴ_ＣＭ／Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の対の各ヒストグラムにおいて示される（Ａ）か、又は、（Ｂ）において各細胞株に対するデータポイントとして示され、白い記号は、Ｔ_ＣＭ由来の生成物に対し、灰色の記号は、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の生成物に対する。赤棒は各群に対する平均値を描き、さらに、Ｔ_ＣＭ由来の細胞生成物対Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の細胞生成物の対応スチューデントｔ検定比較に対するｐ値が、各表面のマーカーに対して示される。*，Ｐ値は、少な過ぎる値のため、ＣＤ２７に対して計算しなかった。重複のため、（Ｂ）においてＣＤ３染色に対しては、細胞株特異的記号ではなく陰影のみが示されることに留意されたい。

【図7A】Ｓｕｐ－Ｂ１５腫瘍細胞を投与した場合のＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}前処置の治療効果を評価する研究の結果を示す図である。ＮＳＧマウスに照射を行った１日後に、マウスを群に分け（ｎ＝４）、未処置のままにしたか、又は、２．５ｘ１０^６偽（ｍｏｃｋ）形質導入ＰＢＭＣ（ＣＡＲなし）、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}（約０．５ｘ１０^６ＣＡＲ＋細胞）のいずれかを用いて静脈内処置した。２日目に、マウスに、ｆｆＬｕｃ＋Ｓｕｐ－Ｂ１５腫瘍細胞０．７～１．０×１０^６Ｍ，ｍｉｌｌｉｏｎを静脈内投与した。

【図7B】Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅを用いて、各郡からの代表的なマウスが、相対的な腫瘍の負荷量を示す。

【図7C】Ｘｅｎｏｇｅｎイメージングによってモニターされた時間の経過に伴うマウスの各郡における平均的なＳｕｐ－Ｂ１５腫瘍増殖及びｆｆＬｕｘ ｆｌｕｘ（光子／秒）の定量化が示される。

【図8A】ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}を用いた静脈内前処置の４１日後の血液中のヒトＴ細胞の存在を調べる研究の結果を示す図である。ＮＳＧマウスに照射を行った１日後に、マウスを群に分け（ｎ＝４）、未処置のままにしたか、又は、２．５ｘ１０^６偽形質導入ＰＢＭＣ（ＣＡＲなし）、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}（約０．５ｘ１０^６ＣＡＲ＋細胞）のいずれかを用いて静脈内処置した。２日目に、マウスに、腫瘍ＧＦＰ＋Ｓｕｐ－Ｂ１５腫瘍細胞０．７～１．０×１０^６を静脈内投与した。４１日目に、各マウスの血液を、フローサイトメトリーによってヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞（すなわちヒトＴ細胞）の存在について評価した。各マウスの代表的なフローサイトメトリーの分析が示される（マウス１及びマウス２）。ここでｈｕＣＤ４５依存性細胞を、ＣＤ３Ｔ細胞マーカー及びＥＧＦＲｔ形質導入マーカーの発現についてさらに分析した（右上象限（ｕｐｐｅｒ ｒｉｇｈｔ ｑｕａｄｒａｎｔ）に基づく％ＣＡＲ＋）。金のボックスは、ＧＦＰ＋ＳｕｐＢ１５集団を強調するために用いられる。

【図8B】ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}を用いた静脈内前処置の４１日後の血液中のヒトＴ細胞の存在を調べる研究の結果を示す図である。ＮＳＧマウスに照射を行った１日後に、マウスを群に分け（ｎ＝４）、未処置のままにしたか、又は、２．５ｘ１０^６偽形質導入ＰＢＭＣ（ＣＡＲなし）、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}（約０．５ｘ１０^６ＣＡＲ＋細胞）のいずれかを用いて静脈内処置した。２日目に、マウスに、腫瘍ＧＦＰ＋Ｓｕｐ－Ｂ１５腫瘍細胞０．７～１．０×１０^６を静脈内投与した。４１日目に、各マウスの血液を、フローサイトメトリーによってヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞（すなわちヒトＴ細胞）の存在について評価した。各マウスの代表的なフローサイトメトリーの分析が示される（マウス３及びマウス４）。ここでｈｕＣＤ４５依存性細胞を、ＣＤ３Ｔ細胞マーカー及びＥＧＦＲｔ形質導入マーカーの発現についてさらに分析した（右上象限（ｕｐｐｅｒ ｒｉｇｈｔ ｑｕａｄｒａｎｔ）に基づく％ＣＡＲ＋）。金のボックスは、ＧＦＰ＋ＳｕｐＢ１５集団を強調するために用いられる。

【図9】エフェクターとしてＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８ＺＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨ１Ｖ７、及び、標的としてＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞（白いバー）又はＣＤ１９＋ＳｕｐＢ１５細胞（黒いバー）で形質導入又は偽形質導入が行われたＴ_ＣＭ細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞を用いて行われた長期死滅アッセイの結果を示す図である。１００％に正規化された、偽エフェクター共培養と比較した場合の７２時間後に残存する生存可能な標的細胞（ＣＤ４５陰性、ＦＳＣ高）の割合が示される。

【図10】エフェクターとしてＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８ＺＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨ１Ｖ７、及び、刺激物質としてＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞（白いバー）又はＣＤ１９＋ＳｕｐＢ１５細胞（黒いバー）で形質導入又は偽形質導入が行われたＴ_ＣＭ細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞を用いて行われた５時間の脱顆粒アッセイの結果を示す図である。ＣＤ１０７ａに対して免疫反応性であったＣＤ４５／ＣＤ８／ＥＧＦＲｔ依存性細胞の割合が示される。

【図11】ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８ＺＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨ１Ｖ７で形質導入又は偽形質導入が行われたＴ_ＣＭ細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞によるＩＦＮγ生成の分析の結果を示す図である。エフェクターとしてＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８ＺＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨ１Ｖ７、及び、刺激物質としてＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞（白いバー）又はＣＤ１９＋ＳｕｐＢ１５細胞（黒いバー）で形質導入又は偽形質導入が行われたＴ_ＣＭ由来又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の細胞生成物を用いて５時間の共培養を行った。ＩＦＮγに対して免疫反応性であったＣＤ４５／ＣＤ８／ＥＧＦＲｔ依存性細胞の割合が示される。

【図12】様々なＴ細胞集団によって発現されるＩＬ１３ ＣＡＲの有効性の研究の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

Ｔ細胞のコンパートメントは、異なる分化段階にあるＴ細胞のサブセットを含む。これらのサブセットは、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋及びＣＤ９５－であるナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）の分化から生じる。幹細胞様サブセットの中には、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋及びＣＤ９５＋であるメモリー幹Ｔ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）がある。これらの細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋及びＣＤ９５＋であるセントラルメモリー細胞（Ｔ_ＣＭ）に分化する。Ｔ_ＣＭは、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ２８＋／－及びＣＤ９５＋であるエフェクターメモリー細胞（Ｔ_ＥＭ）に分化する。Ｔ_ＥＭは、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋及びＣＤ９５＋であるエフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）に分化する。

【0017】

メモリー幹Ｔ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）は、Ｔ細胞のコンパートメント内に低レベルで存在するが、有意な自己再生及び増殖の潜在能力を有しているように思われる。メモリー幹Ｔ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）は、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ６２Ｌ＋を発現する点でナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）に似ているけれども、そのＣＤ９５の発現によってＴ_Ｎから区別され得る（図１）。Ｔ_ＳＣＭは、ＩＬ－７及びＩＬ－１５の存在下でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた刺激によってＴ_Ｎから生成され得る。Ｔ_ＳＣＭはまた、Ｗｎｔ／β－カテニン経路活性化の存在下で増殖され得る。

【0018】

Ｔ_ＳＣＭよりもＰＢＭＣにおいてより豊富であるセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）は、自己再生及び増殖の潜在能力が高い、詳細に明らかにされたメモリーＴ細胞のサブセットである。Ｔ_ＣＭはエフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）よりも次の養子移入の間も持続するという証拠がある（非特許文献１；非特許文献２）。Ｔ_ＣＭは、そのＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋の表現型に基づくＴ細胞治療薬製造のためにＰＢＭＣから濃縮しうる（図２）（非特許文献３）。Ｔ_ＣＭは成体幹細胞様の態様をとるという証拠がいくつかある。Ｔ_ＣＭが、完全な免疫再構築を提供しうる、Ｔ_ＣＭが増殖してさらなるＴＣＭを生成する、及び、Ｔ_ＣＭが、Ｔ_ＥＭ／Ｔ_Ｅに分化するということを三世代に渡るＴ_ＣＭの単細胞伝達が実証された、ことがマウスにおける研究にて実証された（非特許文献４；非特許文献５）。

【0019】

以下に記載されるＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞集団は、ＣＡＲ－Ｔ治療における有効性を立証したＴ_ＣＭ、及び、Ｔ_ＣＭよりも幹細胞様であるＴ_ＮだけでなくＴ_ＳＣＭも含む。図３は、様々な細胞集団とＰＢＭＣとの関係を描く発現データを示す。

【0020】

本明細書で記載される細胞集団は、例えば、ＣＡＲ又はＴ細胞受容体を発現するように遺伝子操作することができる。ＣＡＲは、細胞外認識ドメイン、膜貫通領域及び１つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する組換え生体分子である。従って、用語「抗原」は、抗体に結合する分子に限定されないが、いかなる受容体にも特異的に結合することができるいかなる分子に限定される。従って、「抗原」は、ＣＡＲの認識ドメインを意味する。細胞外認識ドメイン（細胞外ドメインともいうか、又は、単に含有する認識要素によって言及される）は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は、膜内にＣＡＲを固定する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、場合によっては、１つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、ＭＨＣ制限とは無関係に、抗原に結合することも、Ｔ細胞活性化を伝達することもできる。従って、ＣＡＲは、そのＨＬＡ遺伝子型に無関係に、抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を治療しうる「普遍的な」免疫受容体である。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を用いた養子免疫療法は、がんの治療のための強力な治療戦略であり得る。

【0021】

ＣＡＲは、当技術分野において既知のいかなる手段によっても生成しうるが、好ましくは、組換えＤＮＡ技術を用いて生成される。有利には、当技術分野において既知の標準的な分子クローニングの技術（ゲノムライブラリースクリーニング、オーバーラップＰＣＲ、プライマー支援のライゲーション、部位特異的変異誘発等）によって、キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸を調製することができ、さらに、完全なコード配列を構築することができる。結果として生じるコード領域は、好ましくは、発現ベクターに挿入され、適した発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株を形質転換するために用いられる。

【0022】

Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞による発現に適した様々なＣＡＲとして、例えば、特許文献１～４に記載されたものが含まれる。

【実施例0023】

Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の調製
様々な方法を用いて、ヒトＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団を生成することができる。例えば、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団を、混合Ｔリンパ球集団から調製することができる。Ｔリンパ球の集団は、細胞を用いて最終的に処置された対象に対して同種異系又は自己由来であり得、さらに、白血球フェレーシス又は採血によって対象から得ることができる。

【0024】

以下の方法は、白血球フェレーシス又は他の手段によって得られたＴリンパ球からＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団を得るために用いることができる方法の一例である。末梢血は、白血球フェレーシス又は末梢血の採血によって採取される。通常、製造サイクルの１日目は、フィコール手順が行われる日である。対象の白血球フェレーシスの生成物がＥＤＴＡ／ＰＢＳで希釈され、さらに、その生成物は、最大のブレーキ（ｍａｘｉｍｕｍ ｂｒａｋｅ）をかけて室温で１０分間、１２００ＲＰＭで遠心分離される。遠心分離後、多血小板の上澄みが除去され、さらに、細胞ペレットが穏やかにボルテックスされる。ＥＤＴＡ／ＰＢＳは、各コニカルチューブにおいてボルテックスされた細胞ペレットを再懸濁するために用いられる。次に、各チューブの下にフィコールが敷かれ、室温にてブレーキをかけずに２０分間、２０００ＲＰＭで遠心分離される。遠心分離後、各チューブからのＰＢＭＣ層が別のコニカルチューブに移される。細胞は、４℃で最大のブレーキをかけて１５分間、１８００ＲＰＭで遠心分離される。

【0025】

遠心分離後、細胞のない上澄みが捨てられ、さらに、細胞ペレットが穏やかにボルテックスされる。細胞は、毎回ＥＤＴＡ／ＰＢＳを用いて２回、ＰＢＳを用いて３回洗浄される。細胞は、４℃にて最大ブレーキをかけて１０分間、１２００ＲＰＭで毎回遠心分離される。最後のＰＢＳ洗浄の後、ボルテックスされた細胞ペレットは、完全なＸ－Ｖｉｖｏｌ５の培地（１０％ＦＢＳを有するＸ－Ｖｉｖｏｌ５（商標）の培地）において再懸濁され、トランスファーバッグに移される。洗浄されたＰＢＭＣを有するバッグは、翌日の免疫磁気選択のためにベンチトップ上において室温にて回転子上で一晩放置される。

【0026】

次に、選択手順が、特定のマーカーを発現する細胞の細胞集団を枯渇させるためにも、特定の他のマーカーを発現する細胞に対する細胞集団を濃縮するためにも用いられる。これらの選択工程は、好ましくは、製造サイクルの２日目に生じる。細胞集団は、ＣＤ２５及びＣＤ１４を発現する細胞について実質的に枯渇している。重要なことに、細胞集団は、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞について実質的に枯渇していない。簡潔には、細胞は、ラベルバッファ（ＬＢ；０．５％ＨＳＡを有するＥＤＴＡ／ＰＢＳ）において再懸濁され、かつ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）による枯渇に対して抗ＣＤ１４及び抗ＣＤ２５ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗体と共にインキュベートされ、さらに、組成物は穏やかに混合され、次に、ベンチトップの上において室温にて回転子上で３０分間インキュベートされる。

【0027】

枯渇工程は、枯渇チューブセットを用いてＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置上で行われる。枯渇工程後の回収された細胞は、チューブに移され、さらに、４℃にて最大ブレーキをかけて１５分間１４００ ＲＰＭで遠心分離される。

【0028】

細胞のない上澄みが除去され、細胞ペレットが穏やかにボルテックスされ、さらに、再懸濁される。ＣＤ６２Ｌを発現する細胞を濃縮するために、細胞懸濁液は、抗ＣＤ６２Ｌ－ビオチン（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓにて作製）で処理され、穏やかに混合され、さらに、ベンチトップ上において室温にて回転子上で３０分間インキュベートされる。

【0029】

インキュベーション期間の後、ＬＢがチューブに添加され、さらに、細胞は、４℃にて最大ブレーキをかけて１５分間、１４００ＲＰＭで遠心分離される。細胞のない上澄みが除去され、さらに、細胞ペレットが穏やかにボルテックスされる。ＬＢが、チューブ内の細胞ペレットを再懸濁するために添加され、さらに、再懸濁された細胞は、新しいトランスファーバッグに移される。抗ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）試薬が添加され、混合物が穏やかに混合され、さらに、ベンチトップ上において室温にて回転子上で３０分間インキュベートされる。

【0030】

ＣＤ６２Ｌ濃縮工程が、チューブセットを用いてＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置上で行われる。この濃縮の生成物は、貯蔵用に凍結させることができ、その後、解凍し、活性化させうる。

【0031】

製造における中間の保持工程を提供するために、選択プロセスに続いて細胞を凍結させるオプションが存在する。細胞は、４℃にて最大ブレーキをかけて１５分間１４００ＲＰＭで遠心分離することによってペレット状にされる。細胞は、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）において再懸濁され、クライオバイアルに等分される。バイアルは、約１℃／分で冷却することができる制御された冷却装置（例えば、Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に移されることになり、冷却装置は直ちに－８０℃の冷凍庫に移される。－８０℃の冷凍庫で３日後、細胞は、貯蔵のためにＧＭＰ ＬＮ２フリーザーに移される。

【0032】

本発明者等は、凍結保存された細胞は良好な回復及び生存率を示し、凍結保存後８．５ヶ月まで解凍させられると適切な細胞表面表現型を維持し、解凍後にインビトロで首尾よく形質導入及び増殖することができるということがわかった。

【0033】

或いは、新たに濃縮されたＴｃｍ／ｓｃｍ／ｎ細胞は、以下の実施例３に記載されているように、活性化、形質導入又は増殖させうる。

【実施例0034】

Ｔ_ＣＭとＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の収率及び回収の比較
１）ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）細胞、及び、２）セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）集団も幹細胞様メモリー（Ｔ_ＳＣＭ）集団も、ナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）と共に含むＣＤ６２Ｌ＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞のＴ細胞集団のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ／ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による濃縮を受けたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の収率を評価するために研究を行った。生細胞数のＧｕａｖａ分析及び表現型のフローサイトメトリー分析を用いて評価を行った。

【0035】

＜実験設計＞：健康なヒトドナーから採取したＰＢＭＣからＴ_ＣＭ及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の細胞株を濃縮した。簡潔には、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞を、ＣＤ１４＋単球及びＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ／ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による枯渇後に、ＣＤ６２Ｌ＋メモリー集団のＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による選択を行って生成した。対照的に、Ｔ_ＣＭ細胞を、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞及びＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブ及びメモリー幹Ｔ細胞のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ／ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による枯渇後に、ＣＤ６２Ｌ＋集団のＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による選択を行うことによって生成した。選択プロセスの評価には、以下においてより詳細に記載される、生細胞数の列挙並びにフローサイトメトリー分析が含まれた。次に、細胞を将来の研究のために凍結保存した。

【0036】

＜濃縮プロセスの概要＞：血液製剤をフィコール処理し、結果として得られたＰＢＭＣにＰＢＳ／ＥＤＴＡにおける一連の洗浄を受けさせた。次に、ＰＢＭＣを完全なＸ－Ｖｉｖｏｌ５の培地において再懸濁させ、場合によっては、３００ｃｃのトランスファーバッグに移し、次に、３－Ｄ回転子上に一晩放置した。次に、ＣＤ１４^－／ＣＤ２５^－／ＣＤ４５ＲＡ^－／ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１４^－／ＣＤ２５^－／ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の集団のいずれかを濃縮するために、ＰＢＭＣに、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ／ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による枯渇及び選択の連続するラウンドを受けさせた。最初の工程は、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、及び、Ｔ_ＣＭのためにＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴ細胞を除去するために（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）又はＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）を介した）磁気による枯渇を含んだ。次に、残りの細胞に、抗ＣＤ６２Ｌ－ビオチン（Ｄｒｅｇ ５６）試薬を用いてＣＤ６２Ｌ＋集団に対して（ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）を介した）正の選択を受けさせた。濃縮の両方のラウンドの後の最終的な細胞数を記録した。最終的な選択された細胞集団の試料を、次に、フローサイトメトリーによって分析した。

【0037】

＜フローサイトメトリーアッセイ及び分析の概要＞：細胞集団のフローサイトメトリー分析を以下のように行った。試料を、テーブルトップ遠心分離機を用いてＦＡＣＳ染色液（ＦＳＳ）において洗浄し、ＦＳＳにおいて再懸濁し、さらに、１つの試料あたり１００μＬを、予め標識した１２×７５ｍｍ ＦＡＣＳチューブ（１つの条件あたり１つのチューブ）に等分した。必要量の抗体をそれぞれのＦＡＣＳチューブに添加し、次に、チューブを４℃の暗所で３０分間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、各チューブをＦＳＳにおいて２回洗浄し、さらに、２５０μｌのＦＳＳ又は生死判別色素としてＤＡＰＩを含有するＦＳＳのいずれかにおいて再懸濁させた。次に、試料を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）又はＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）機器に流して分析した。生存可能な免疫反応性細胞の割合を、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を介して計算した。

【0038】

＜濃縮後の収率＞：細胞生成物のそれぞれからのＣＤ３＋Ｔ細胞の回収が以下の表１において示される。全体的に見て、ＣＤ１４^－／ＣＤ２５^－／ＣＤ４５ＲＡ^－／ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ３^＋Ｔ_ＣＭの濃縮による回収は２～６％であり、ＣＤ１４^－／ＣＤ２５^－／ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ３^＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の濃縮による回収は４～３０％であった。実際、各一致対を比較すると、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞対Ｔ_ＣＭ細胞の回収率は１．６～１５倍高かった。

【0039】

【表1】

＜濃縮後のフローサイトメトリー分析＞：ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）による濃縮の両方のラウンドの後、濃縮された細胞の表現型をＦＡＣＳ分析によって決定した。３人の代表的なドナーから得られた細胞生成物の結果を図４に示す。各ドナー由来のＴ_ＣＭ及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の集団は、ＣＤ３＋及びＣＤ６２Ｌ＋細胞の濃縮レベルを示し、Ｔ_ＣＭはＣＤ４５ＲＡが枯渇し、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}は、予想通りにＣＤ４５ＲＡを発現した。ＣＤ１４＋及びＣＤ２５＋の集団の枯渇も、どちらも選択戦略を用いて予想通りに観察された。興味深いことに、ＣＤ８＋の細胞の割合は、そのドナーが一致したＴ_ＣＭの集団と比較した場合に、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の集団においてより高いことが多くあった（図４及び表１）。

【0040】

＜結果＞：この研究の結果は、臨床的に解釈可能なＧＭＰ製造方法を用いて、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ_ＣＭの細胞集団もＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の細胞集団も効率的に単離することができることが実証された。ＰＢＭＣから始まり、出発集団の２～６％がＣＤ３＋Ｔ_ＣＭとして回収される。ＣＤ４５ＲＡ枯渇工程を排除することにより、ＣＤ３＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞として出発集団を４～３０％回収しうる。Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の回収能は、Ｔ_ＣＭ細胞と比較して１．６～１５倍多いため、遺伝子操作の出発集団として用いうるＴ細胞の数を高めるであろう。さらに、本発明者等は、ＣＤ４５ＲＡ枯渇工程の排除も、濃縮された生成物中のＣＤ８ Ｔ細胞の割合を高めるようであるということを観察した。