特開 2023-78173 レーベル遺伝性視神経症を治療するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023078173

(43)【公開日】2023-06-06

(54)【発明の名称】レーベル遺伝性視神経症を治療するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20230530BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023029170

(22)【出願日】2023-02-28

(62)【分割の表示】P 2021521870の分割

【原出願日】2019-07-01

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2018/095023

(32)【優先日】2018-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2018/103937

(32)【優先日】2018-09-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201810703168.7

(32)【優先日】2018-06-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201810702492.7

(32)【優先日】2018-06-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2018/113799

(32)【優先日】2018-11-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201811230856.2

(32)【優先日】2018-10-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2018/118662

(32)【優先日】2018-11-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201811221305.X

(32)【優先日】2018-10-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/070461

(32)【優先日】2019-01-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201810948193.1

(32)【優先日】2018-08-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】521001087

【氏名又は名称】ウーハン ニューロフス バイオテクノロジー リミテッド カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＷＵＨＡＮ ＮＥＵＲＯＰＨＴＨ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＩＭＩＴＥＤ ＣＯＭＰＡＮＹ

【住所又は居所原語表記】Ｃ２７０－２７１ Ｂ１，Ｎｏ．６６６ Ａｖｅ Ｇａｏｘｉｎ，Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ ４３００６０（ＣＮ）

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リー，ビン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】より高いトランスフェクション効率及び治療有効性を有する、ＬＨＯＮを治療するための組成物及び方法を提供する。
【解決手段】組換え核酸であって、ミトコンドリア指向性配列；ミトコンドリアタンパク質コード配列であってミトコンドリアタンパク質を含むポリペプチドをコードする上記ミトコンドリアタンパク質コード配列；及び３’ＵＴＲ核酸配列を含む、当該組換え核酸を本明細書に開示する。また、組換え核酸を含む医薬組成物、及び医薬組成物を使用してレーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）を治療する方法も開示する。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換え核酸であって、
ミトコンドリア指向性配列；
配列番号７、８、１０及び１２からなる群から選択される配列と少なくとも９９％同一
である配列を含むミトコンドリアタンパク質コード配列；ならびに
３’ＵＴＲ核酸配列
を含む、前記組換え核酸。

【請求項2】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号１２９～１５９からなる群から選択される
配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、ま
たは１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載
の組換え核酸。

【請求項3】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号２に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項１に記載の組換え核酸。

【請求項4】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項１に記載の組換え核酸。

【請求項5】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項１に記載の組換え核酸。

【請求項6】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項１に記載の組換え核酸。

【請求項7】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号７または配列番号８に示される
配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、ま
たは１００％同一である配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。

【請求項8】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１０に示される配列と少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同
一である配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。

【請求項9】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１２に示される配列と少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同
一である配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。

【請求項10】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１１１～１２５からなる群から選択される配列と
少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１
００％同一である配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。

【請求項11】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なく
とも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％
同一である配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。

【請求項12】

前記組換え核酸が、
配列番号１７～２０、２３～２４、２７～２８、３１～３４、３７～３８、４１～４２
、４５～４８、５１～５２、５５～５６、５９～６２、６５～６６、６９～７０、７３～
７６、７９～８０、及び８３～８４
からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７
％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、請求項１に記載の組換え
核酸。

【請求項13】

組換え核酸であって、
配列番号２、３、４及び５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であ
る配列を含むミトコンドリア指向性配列；
ミトコンドリアタンパク質コード配列であってミトコンドリアタンパク質を含むポリペ
プチドをコードする前記ミトコンドリアタンパク質コード配列；ならびに
３’ＵＴＲ核酸配列
を含む、前記組換え核酸。

【請求項14】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号２に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項１３に記載の組換え核酸。

【請求項15】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項１３～１４のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項16】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項17】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項18】

前記ミトコンドリアタンパク質が、ＮＡＤＨ脱水素酵素４（ＮＤ４）、ＮＡＤＨ脱水素
酵素６（ＮＤ６）、ＮＡＤＨ脱水素酵素１（ＮＤ１）及びそれらの変異体からなる群から
選択される、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項19】

前記ミトコンドリアタンパク質がＮＡＤＨ脱水素酵素４（ＮＤ４）またはその変異体を
含む、請求項１８に記載の組換え核酸。

【請求項20】

前記ミトコンドリアタンパク質が、配列番号１６０に示される配列と少なくとも９０％
、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である
ペプチド配列を含む、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項21】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号６、７または８に示される配列
と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または
１００％同一である配列を含む、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項22】

前記ミトコンドリアタンパク質がＮＡＤＨ脱水素酵素６（ＮＤ６）またはその変異体を
含む、請求項１８に記載の組換え核酸。

【請求項23】

前記ミトコンドリアタンパク質が、配列番号１６１に示される配列と少なくとも９０％
、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である
配列を含む、請求項１３～２２のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項24】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号９または配列番号１０に示され
る配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、
または１００％同一である配列を含む、請求項１３～２３のいずれか１項に記載の組換え
核酸。

【請求項25】

前記ミトコンドリアタンパク質がＮＡＤＨ脱水素酵素１（ＮＤ１）またはその変異体を
含む、請求項１３～２４のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項26】

前記ミトコンドリアタンパク質が、配列番号１６２に示される配列と少なくとも９０％
、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である
配列を含む、請求項１３～２５のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項27】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１１または配列番号１２に示さ
れる配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％
、または１００％同一である配列を含む、請求項１３～２６のいずれか１項に記載の組換
え核酸。

【請求項28】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が前記ミトコンドリア指向性配列の３’に位置する、請求項１
３～２７のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項29】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、
ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓ
ＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓＣＯＸ６ｃ
、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２、ｒｎＳＯＤ２及びｈｓＯＸＡ１
Ｌ
からなる群から選択される配列を含む、請求項１３～２８のいずれか１項に記載の組換え
核酸。

【請求項30】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１１１～１２５からなる群から選択される配列と
少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１
００％同一である配列を含む、請求項１３～２９のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項31】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なく
とも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％
同一である配列を含む、請求項１３～２９のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項32】

前記ミトコンドリア指向性配列が前記３’ＵＴＲ核酸配列の５’に位置する、請求項１
３～３１のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項33】

前記ミトコンドリア指向性配列が前記ミトコンドリア指向性配列の３’に位置する、請
求項１３～３２のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項34】

前記組換え核酸が、配列番号２９～８４からなる群から選択される配列と少なくとも９
０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一で
ある配列を含む、請求項１３～３３のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項35】

組換え核酸であって、
ミトコンドリア指向性配列；
配列番号７、８、１０及び１２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含むミトコンドリアタンパク質コード配列；ならびに
３’ＵＴＲ核酸配列
を含む、前記組換え核酸。

【請求項36】

前記ミトコンドリア指向性配列が、
ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＣＯＸ８、ｓｃＲＰＭ２、ｌｃＳｉｒｔ５、ｔｂＮＤＵＳ７、ｎ
ｃＱＣＲ２、ｈｓＡＴＰ５Ｇ２、ｈｓＬＡＣＴＢ、ｓｐｉｌｖ１、ｇｍＣＯＸ２、ｃｒＡ
ＴＰ６、ｈｓＯＰＡ１、ｈｓＳＤＨＤ、ｈｓＡＤＣＫ３、ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－
２、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＡＴＰ９（ｎｃＡＴＰ９）、ｈｓＧＨＩＴＭ
、ｈｓＮＤＵＦＡＢ１、ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３、ｎｃＡＴＰ
９＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２
８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣ
Ｋ３＿ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ
３＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３
＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈ
ｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚ
ｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡ
ＴＰ６、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ＧＮＦＰ＿ｎｃ
ＡＴＰ９、及びｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｌｃＳｉ
ｒｔ５＿ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ２＿ｎｃＡＴＰ９
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする配列を含む、請求項３５に記載の組
換え核酸。

【請求項37】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号１２９～１５９からなる群から選択される
配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、ま
たは１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする、請求項３５～３
６のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項38】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号２または配列番号３に示される配列と少な
くとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００
％同一である配列を含む、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項39】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項40】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項３５～３９のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項41】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号７または配列番号８に示される
配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、ま
たは１００％同一である配列を含む、請求項３５～４０のいずれか１項に記載の組換え核
酸。

【請求項42】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１０に示される配列と少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同
一である配列を含む、請求項３５～４１のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項43】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１２に示される配列と少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同
一である配列を含む、請求項３５～４２のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項44】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が前記ミトコンドリア指向性配列の３’に位置する、請求項３
５～４３のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項45】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、
ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓ
ＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓＣＯＸ６ｃ
、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２、ｒｎＳＯＤ２及びｈｓＯＸＡ１
Ｌ
からなる群から選択される配列を含む、請求項３５～４４のいずれか１項に記載の組換え
核酸。

【請求項46】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１１１～１２５からなる群から選択される配列と
少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１
００％同一である配列を含む、請求項３５～４５のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項47】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なく
とも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％
同一である配列を含む、請求項３５～４６のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項48】

前記ミトコンドリア指向性配列が前記３’ＵＴＲ核酸配列の５’に位置する、請求項３
５～４７のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項49】

前記ミトコンドリア指向性配列が前記ミトコンドリア指向性配列の３’に位置する、請
求項３５～４８のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項50】

前記組換え核酸が、
配列番号１７～２０、２３～２４、２７～２８、３１～３４、３７～３８、４１～４２
、４５～４８、５１～５２、５５～５６、５９～６２、６５～６６、６９～７０、７３～
７６、７９～８０、及び８３～８４
からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７
％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、請求項３５～４９のいず
れか１項に記載の組換え核酸。

【請求項51】

組換え核酸であって、
配列番号２、３及び４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも
９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるミトコンドリ
ア指向性配列
を含む、前記組換え核酸。

【請求項52】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号２に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項５１に記載の組換え核酸。

【請求項53】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項５１～５２のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項54】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項55】

ミトコンドリアタンパク質コード配列をさらに含み、前記ミトコンドリアタンパク質コ
ード配列が、ミトコンドリアタンパク質を含むポリペプチドをコードする、請求項５１～
５４のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項56】

前記ミトコンドリアタンパク質が、ＮＡＤＨ脱水素酵素４（ＮＤ４）、ＮＡＤＨ脱水素
酵素６（ＮＤ６）、ＮＡＤＨ脱水素酵素１（ＮＤ１）及びそれらの変異体からなる群から
選択される、請求項５１～５５のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項57】

前記ミトコンドリアタンパク質がＮＡＤＨ脱水素酵素４（ＮＤ４）またはその変異体を
含む、請求項５１～５６のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項58】

前記ミトコンドリアタンパク質が、配列番号１６０に示される配列と少なくとも９０％
、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である
ペプチド配列を含む、請求項５１～５７のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項59】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号６、７または８に示される配列
と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または
１００％同一である配列を含む、請求項５１～５８のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項60】

前記ミトコンドリアタンパク質がＮＡＤＨ脱水素酵素６（ＮＤ６）またはその変異体を
含む、請求項５１～５９のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項61】

前記ミトコンドリアタンパク質が、配列番号１６１に示される配列と少なくとも９０％
、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である
配列を含む、請求項５１～６０のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項62】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号９または配列番号１０に示され
る配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、
または１００％同一である配列を含む、請求項５１～６１のいずれか１項に記載の組換え
核酸。

【請求項63】

前記ミトコンドリアタンパク質がＮＡＤＨ脱水素酵素１（ＮＤ１）またはその変異体を
含む、請求項５１～６２のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項64】

前記ミトコンドリアタンパク質が、配列番号１６２に示される配列と少なくとも９０％
、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である
配列を含む、請求項５１～６３のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項65】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１１または配列番号１２に示さ
れる配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％
、または１００％同一である配列を含む、請求項５１～６４のいずれか１項に記載の組換
え核酸。

【請求項66】

３’ＵＴＲ核酸配列をさらに含む、請求項５１～６５のいずれか１項に記載の組換え核
酸。

【請求項67】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が前記ミトコンドリア指向性配列の３’に位置する、請求項５
１～６６のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項68】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、
ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓ
ＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓＣＯＸ６ｃ
、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２、ｒｎＳＯＤ２及びｈｓＯＸＡ１
Ｌ
からなる群から選択される配列を含む、請求項５１～６７のいずれか１項に記載の組換え
核酸。

【請求項69】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１１１～１２５からなる群から選択される配列と
少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１
００％同一である配列を含む、請求項５１～６８のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項70】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なく
とも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％
同一である配列を含む、請求項５１～６９のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項71】

前記ミトコンドリア指向性配列が前記３’ＵＴＲ核酸配列の５’に位置する、請求項５
１～７０のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項72】

前記ミトコンドリア指向性配列が前記ミトコンドリア指向性配列の３’に位置する、請
求項５１～７１のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項73】

前記組換え核酸が、配列番号２９～７０からなる群から選択される配列と少なくとも９
０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一で
ある配列を含む、請求項５１～７２のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項74】

組換え核酸であって、ミトコンドリアタンパク質コード配列を含み、前記ミトコンドリ
アタンパク質コード配列が、ミトコンドリアタンパク質を含むポリペプチドをコードし、
前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、
配列番号７、８、１０及び１２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、前記組換え核酸。

【請求項75】

ミトコンドリア指向性配列をさらに含む、請求項７４に記載の組換え核酸。

【請求項76】

前記ミトコンドリア指向性配列が、
ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＣＯＸ８、ｓｃＲＰＭ２、ｌｃＳｉｒｔ５、ｔｂＮＤＵＳ７、ｎ
ｃＱＣＲ２、ｈｓＡＴＰ５Ｇ２、ｈｓＬＡＣＴＢ、ｓｐｉｌｖ１、ｇｍＣＯＸ２、ｃｒＡ
ＴＰ６、ｈｓＯＰＡ１、ｈｓＳＤＨＤ、ｈｓＡＤＣＫ３、ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－
２、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＡＴＰ９（ｎｃＡＴＰ９）、ｈｓＧＨＩＴＭ
、ｈｓＮＤＵＦＡＢ１、ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３、ｎｃＡＴＰ
９＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２
８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣ
Ｋ３＿ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ
３＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３
＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈ
ｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚ
ｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡ
ＴＰ６、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ＧＮＦＰ＿ｎｃ
ＡＴＰ９、及びｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｌｃＳｉ
ｒｔ５＿ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ２＿ｎｃＡＴＰ９
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする配列を含む、請求項７４～７５のい
ずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項77】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号１２９～１５９からなる群から選択される
配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、ま
たは１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする、請求項７４～７
６のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項78】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号２に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項７４～７７のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項79】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項７４～７８のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項80】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項７４～７９のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項81】

前記ミトコンドリア指向性配列が、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列
を含む、請求項７４～８０のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項82】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号７または配列番号８に示される
配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、ま
たは１００％同一である配列を含む、請求項７４～８１のいずれか１項に記載の組換え核
酸。

【請求項83】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１０に示される配列と少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同
一である配列を含む、請求項７４～８０のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項84】

前記ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号１２に示される配列と少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同
一である配列を含む、請求項７４～８３のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項85】

３’ＵＴＲ核酸配列をさらに含む、請求項７４～８４のいずれか１項に記載の組換え核
酸。

【請求項86】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が前記ミトコンドリア指向性配列の３’に位置する、請求項７
４～８５のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項87】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、
ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓ
ＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓＣＯＸ６ｃ
、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２、ｒｎＳＯＤ２及びｈｓＯＸＡ１
Ｌ
からなる群から選択される配列を含む、請求項７４～８６のいずれか１項に記載の組換え
核酸。

【請求項88】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１１１～１２５からなる群から選択される配列と
少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１
００％同一である配列を含む、請求項７４～８７のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項89】

前記３’ＵＴＲ核酸配列が、配列番号１３または配列番号１４に示される配列と少なく
とも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％
同一である配列を含む、請求項７４～８８のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項90】

前記ミトコンドリア指向性配列が前記３’ＵＴＲ核酸配列の５’に位置する、請求項７
４～８９のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項91】

前記ミトコンドリア指向性配列が前記ミトコンドリア指向性配列の３’に位置する、請
求項７４～９０のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項92】

前記組換え核酸が、
配列番号１７～２０、２３～２４、２７～２８、３１～３４、３７～３８、４１～４２
、４５～４８、５１～５２、５５～５６、５９～６２、６５～６６、６９～７０、７３～
７６、７９～８０、及び８３～８４
からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７
％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、請求項７４～９１のいず
れか１項に記載の組換え核酸。

【請求項93】

請求項１～９２のいずれか１項に記載の前記組換え核酸を含む、ウイルスベクター。

【請求項94】

前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項９３に
記載のウイルスベクター。

【請求項95】

前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ
６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３
、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６ベクターからなる群から選択される、請求項９
４に記載のウイルスベクター。

【請求項96】

前記ＡＡＶベクターが組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項９３～９５の
いずれか１項に記載のウイルスベクター。

【請求項97】

前記ｒＡＡＶベクターがｒＡＡＶ２ベクターである、請求項９６に記載のウイルスベク
ター。

【請求項98】

請求項１～９２のいずれか１項に記載の前記組換え核酸を含むアデノ随伴ウイルス（Ａ
ＡＶ）を含む、医薬組成物。

【請求項99】

請求項９８に記載の医薬組成物であって、その薬学的に許容される賦形剤をさらに含む
、前記医薬組成物。

【請求項100】

医薬組成物であって、請求項９３～９７のいずれか１項に記載の前記ウイルスベクター
と、その薬学的に許容される賦形剤とを含み、前記ウイルスベクターが、請求項１～９２
のいずれか１項に記載の前記組換え核酸を含むものである、前記医薬組成物。

【請求項101】

医薬組成物であって、
請求項１～９２のいずれか１項に記載の組換え核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ
）
を含み、前記組換え核酸が、配列番号１５に示される配列と少なくとも９０％、少なくと
も９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む
ものであり、さらに、
薬学的に許容される賦形剤
を含む、前記医薬組成物。

【請求項102】

前記薬学的に許容される賦形剤が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、α，α－トレハ
ロース二水和物（α，α－ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、Ｌ－ヒスチジン
一塩酸塩一水和物、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、
ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ポロキサマー１８８またはそれらの任意の組合せを含む、
請求項９８～１０１のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項103】

前記薬学的に許容される賦形剤が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、α，α－トレハ
ロース二水和物（α，α－ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、Ｌ－ヒスチジン
一塩酸塩一水和物、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、
ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ポロキサマー１８８及びそれらの任意の組合せから選択さ
れる、請求項９８～１０２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項104】

前記薬学的に許容される賦形剤がポロキサマー１８８を含む、請求項１０２に記載の医
薬組成物。

【請求項105】

前記薬学的に許容される賦形剤が０．０００１～０．０１％のポロキサマー１８８を含
む、請求項１０４に記載の医薬組成物。

【請求項106】

前記薬学的に許容される賦形剤が０．００１％のポロキサマー１８８を含む、請求項１
０５に記載の医薬組成物。

【請求項107】

前記薬学的に許容される賦形剤が１つ以上の塩をさらに含む、請求項９８～１０６のい
ずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項108】

前記１つ以上の塩が、ＮａＣｌ、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４及びＫＨ_２ＰＯ_４を
含む、請求項１０７に記載の医薬組成物。

【請求項109】

前記１つ以上の塩が、８０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、４０ｍＭのＮａ
_２ＨＰＯ_４、及び５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４を含む、請求項１０７に記載の医薬組成物。

【請求項110】

前記医薬組成物のｐＨが６～８である、請求項９８～１０９のいずれか１項に記載の医
薬組成物。

【請求項111】

前記医薬組成物のｐＨが７．２～７．４である、請求項１１０に記載の医薬組成物。

【請求項112】

前記医薬組成物のｐＨが７．３である、請求項１１１に記載の医薬組成物。

【請求項113】

前記医薬組成物のウイルス力価が少なくとも１．０×１０^１０ｖｇ／ｍＬである、請求
項９８～１１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項114】

前記医薬組成物のウイルス力価が少なくとも５．０×１０^１０ｖｇ／ｍＬである、請求
項１１３に記載の医薬組成物。

【請求項115】

前記医薬組成物を５回の凍結／解凍サイクルに供したとき、前記医薬組成物が前記５回
の凍結／解凍サイクルの前のウイルス力価と比較して少なくとも６０％、７０％、８０％
または９０％のウイルス力価を保持している、請求項９８～１１４のいずれか１項に記載
の医薬組成物。

【請求項116】

前記医薬組成物が、レーベル遺伝性視神経症患者に投与された場合に、前記組換え核酸
を含まない同等の医薬組成物に比べてより高い平均視力回復を生じさせる、請求項９８～
１１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項117】

前記医薬組成物が、レーベル遺伝性視神経症患者に投与された場合に、配列番号１５に
示される組換え核酸を含む同等の医薬組成物に比べてより高い平均視力回復を生じさせる
、請求項９８～１１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項118】

眼障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項９８～１１７のいず
れか１項に記載の前記医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項119】

前記眼障害がレーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）である、請求項１１８に記載の方法
。

【請求項120】

前記医薬組成物を前記患者の片眼または両眼に投与することを含む、請求項１１８また
は請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

前記医薬組成物が眼内または硝子体内注射によって投与される、請求項１１８～１２０
のいずれか１項に記載の方法。

【請求項122】

前記医薬組成物が硝子体内注射によって投与される、請求項１２１に記載の方法。

【請求項123】

約０．０１～０．１ｍＬの前記医薬組成物が硝子体内注射によって投与される、請求項
１２２に記載の方法。

【請求項124】

約０．０５ｍＬの前記医薬組成物が硝子体内注射によって投与される、請求項１２３に
記載の方法。

【請求項125】

メチルプレドニゾロンを前記患者に投与することをさらに含む、請求項１１８～１２４
のいずれか１項に記載の方法。

【請求項126】

前記メチルプレドニゾロンが前記医薬組成物の前記硝子体内注射の前に投与される、請
求項１２５に記載の方法。

【請求項127】

前記メチルプレドニゾロンが経口投与される、請求項１２５～１２６のいずれか１項に
記載の方法。

【請求項128】

前記メチルプレドニゾロンが前記医薬組成物の前記硝子体内注射の前に少なくとも１、
２、３、４、５、６または７日間にわたって毎日投与される、請求項１２５～１２７のい
ずれか１項に記載の方法。

【請求項129】

前記メチルプレドニゾロンが毎日投与される、請求項１２５～１２８のいずれか１項に
記載の方法。

【請求項130】

約３２ｍｇ／６０ｋｇのメチルプレドニゾロンの１日投薬量が投与される、請求項１２
５～１２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項131】

前記メチルプレドニゾロンが前記医薬組成物の前記硝子体内注射の後に投与される、請
求項１２５～１３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項132】

クレアチンリン酸ナトリウムを前記患者に投与することをさらに含む、請求項１２５～
１３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項133】

前記クレアチンリン酸ナトリウムが静脈内投与される、請求項１３２に記載の方法。

【請求項134】

前記メチルプレドニゾロンが静脈内または経口投与される、請求項１２５～１３３のい
ずれか１項に記載の方法。

【請求項135】

メチルプレドニゾロンを少なくとも１日間にわたって静脈内投与し、その後、メチルプ
レドニゾロンを少なくとも１週間にわたって経口投与すること
を含む、請求項１２５～１３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項136】

メチルプレドニゾロンを約３日間にわたって静脈内投与し、その後、メチルプレドニゾ
ロンを少なくとも約６週間にわたって経口投与すること
を含む、請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

前記メチルプレドニゾロンが約８０ｍｇ／６０ｋｇの１日用量で静脈内投与される、請
求項１２５～１３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項138】

前記医薬組成物を前記投与することが、前記組換え核酸を含まない同等の医薬組成物に
比べてより高い平均視力回復を生じさせる、請求項１２５～１３７のいずれか１項に記載
の方法。

【請求項139】

前記医薬組成物を前記投与することが、配列番号１５に示される組換え核酸を含む同等
の医薬組成物に比べてより高い平均視力回復を生じさせる、請求項１２５～１３８のいず
れか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１８年７月９日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０９
５０２３号、２０１８年９月４日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０
３９３７号、２０１８年６月２９日に両方とも出願された中国出願第ＣＮ２０１８１０７
０３１６８．７号及び第ＣＮ２０１８１０７０２４９２．７号、２０１８年１１月２日に
出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１３７９９号、２０１８年１０月２２
日に出願された中国出願第ＣＮ２０１８１１２３０８５６．２号、２０１８年１１月３０
日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１８６６２号、２０１８年１０月
１９日に出願された中国出願第ＣＮ２０１８１１２２１３０５．Ｘ号、２０１９年１月４
日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０７０４６１号、２０１８年８月２
０日に出願された中国出願第ＣＮ２０１８１０９４８１９３．１号の利益を主張するもの
であり、参照によりこれらの全体を本明細書に援用する。

【0002】

配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じてＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、これを
もって参照によりその全体を援用する。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年６月３０日
に作成されたものであるが、名前が２０７２９８４７６＿１．ｔｘｔであり、サイズが３
０４，９１４バイトである。

【背景技術】

【0003】

レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）は、急性または亜急性中心視力喪失を招く、ミト
コンドリアに関する遺伝性の（母親から子に移される）網膜神経節細胞（ＲＧＣ）及びそ
の軸索の変性症であり、主に若年成人男性がこれに侵される。ＬＨＯＮは母親を通じての
み移される、というのも、その主因が（核ではなく）ミトコンドリアのゲノムの突然変異
であり、卵子のみが胚にミトコンドリアを与えるからである。ＬＨＯＮは大抵、３つの病
原性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）点突然変異のうちの１つに起因する。これらの
突然変異は、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化鎖の複合体ＩのＮＡＤＨ脱水素酵素
サブユニット４タンパク質（ＮＤ４）、ＮＡＤＨ脱水素酵素サブユニット１タンパク質（
ＮＤ１）及びＮＡＤＨ脱水素酵素サブユニット６タンパク質（ＮＤ６）のサブユニット遺
伝子のそれぞれヌクレオチド位置１１７７８のＧからＡ（Ｇ１１７７８Ａ）、３４６０の
ＧからＡ（Ｇ３４６０Ａ）、及び１４４８４のＴからＣ（Ｔ１４４８４Ｃ）にある。各突
然変異は永久的視力喪失の著しいリスクを有すると考えられている。それは通常、痛みを
伴うことなく数週間～数ヶ月のうちに進行し、ついには両眼の視力が０．１未満に低下す
るが、これは患者の生活の質に重大な影響を及ぼすものである。２つのＬＨＯＮ突然変異
体Ｇ３４６０Ａ及びＴ１４４８４Ｃは、患者の血小板から単離されるミトコンドリアのＮ
ＡＤＨ脱水素酵素活性を８０％減少させる。中国人のＬＨＯＮ患者の９０パーセントはＧ
１１７７８Ａ突然変異を保有している。Ｇ１１７７８Ａ突然変異はＮＤ４タンパク質にお
いてアルギニンをヒスチジンに変化させ、結果としてＬＨＯＮ患者に機能不全及び視神経
損傷をきたす。より高いトランスフェクション効率及び治療有効性を有する、ＬＨＯＮを
治療するための組成物及び方法を開発する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本明細書では、組換え核酸、医薬組成物、及びＬＨＯＮを治療する方法を開示する。一
態様において本明細書では、組換え核酸であって、ミトコンドリア指向性配列；配列番号
７、８、１０及び１２からなる群から選択される配列と少なくとも９９％同一である配列
を含むミトコンドリアタンパク質コード配列；ならびに３’ＵＴＲ核酸配列を含む、当該
組換え核酸を開示する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号１２９～１５９からなる群から
選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも
９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする。ある
場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号２に示される配列と少なくとも９０％
、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である
配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号３に示される配列と
少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１
００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号４
に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも
９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配
列は、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９
７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。

【0006】

ある場合には、ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号７または配列番号８
に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも
９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリアタンパク
質コード配列は、配列番号１０に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、
少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合
には、ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号１２に示される配列と少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同
一である配列を含む。

【0007】

ある場合には、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１１１～１２５からなる群から選択さ
れる配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％
、または１００％同一である配列を含む。ある場合には、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番
号１３または配列番号１４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少な
くとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。

【0008】

ある場合には、組換え核酸は、配列番号１７～２０、２３～２４、２７～２８、３１～
３４、３７～３８、４１～４２、４５～４８、５１～５２、５５～５６、５９～６２、６
５～６６、６９～７０、７３～７６、７９～８０、及び８３～８４からなる群から選択さ
れる配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％
、または１００％同一である配列を含む。

【0009】

別の態様において本明細書では、組換え核酸であって、配列番号２、３、４及び５から
なる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含むミトコンドリア指向
性配列；ミトコンドリアタンパク質コード配列であってミトコンドリアタンパク質を含む
ポリペプチドをコードする当該ミトコンドリアタンパク質コード配列；ならびに３’ＵＴ
Ｒ核酸配列を含む、当該組換え核酸を開示する。

【0010】

ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号２に示される配列と少なくとも
９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一
である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号３に示される
配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、ま
たは１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列
番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少な
くとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指
向性配列は、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なく
とも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。

【0011】

ある場合には、ミトコンドリアタンパク質は、ＮＡＤＨ脱水素酵素４（ＮＤ４）、ＮＡ
ＤＨ脱水素酵素６（ＮＤ６）、ＮＡＤＨ脱水素酵素１（ＮＤ１）及びそれらの変異体から
なる群から選択される。ある場合には、ミトコンドリアタンパク質はＮＡＤＨ脱水素酵素
４（ＮＤ４）またはその変異体を含む。ある場合には、ミトコンドリアタンパク質は、配
列番号１６０に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％
、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含む。ある場合には、ミ
トコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号６、７または８に示される配列と少なく
とも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％
同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリアタンパク質はＮＡＤＨ脱水素酵素
６（ＮＤ６）またはその変異体を含む。ある場合には、ミトコンドリアタンパク質は、配
列番号１６１に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％
、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンド
リアタンパク質コード配列は、配列番号９または配列番号１０に示される配列と少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同
一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリアタンパク質はＮＡＤＨ脱水素酵素１
（ＮＤ１）またはその変異体を含む。ある場合には、ミトコンドリアタンパク質は、配列
番号１６２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、
少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリ
アタンパク質コード配列は、配列番号１１または配列番号１２に示される配列と少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同
一である配列を含む。

【0012】

ある場合には、３’ＵＴＲ核酸配列はミトコンドリア指向性配列の３’に位置する。あ
る場合には、３’ＵＴＲ核酸配列は、ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓ
ＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ
２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓＣＯＸ６ｃ、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ
２、ｒｎＳＯＤ２及びｈｓＯＸＡ１Ｌからなる群から選択される配列を含む。ある場合に
は、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１１１～１２５からなる群から選択される配列と少
なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１０
０％同一である配列を含む。ある場合には、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１３または
配列番号１４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％
、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。

【0013】

ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は３’ＵＴＲ核酸配列の５’に位置する。あ
る場合には、ミトコンドリア指向性配列はミトコンドリア指向性配列の３’に位置する。

【0014】

ある場合には、組換え核酸は、配列番号２９～８４からなる群から選択される配列と少
なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１０
０％同一である配列を含む。

【0015】

別の態様において本明細書では、組換え核酸であって、ミトコンドリア指向性配列；配
列番号７、８、１０及び１２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なく
とも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含
むミトコンドリアタンパク質コード配列；ならびに３’ＵＴＲ核酸配列を含む、当該組換
え核酸を開示する。

【0016】

ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＣＯＸ８、ｓｃＲ
ＰＭ２、ｌｃＳｉｒｔ５、ｔｂＮＤＵＳ７、ｎｃＱＣＲ２、ｈｓＡＴＰ５Ｇ２、ｈｓＬＡ
ＣＴＢ、ｓｐｉｌｖ１、ｇｍＣＯＸ２、ｃｒＡＴＰ６、ｈｓＯＰＡ１、ｈｓＳＤＨＤ、ｈ
ｓＡＤＣＫ３、ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ
ＡＴＰ９（ｎｃＡＴＰ９）、ｈｓＧＨＩＴＭ、ｈｓＮＤＵＦＡＢ１、ｈｓＡＴＰ５Ｇ３
、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８
２１７４、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｎｃＡＴＰ９
、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、
ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｚ
ｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡ
ＴＰ６＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１
７４＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣ
Ｋ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００
２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ＧＮＦＰ＿ｎｃＡＴＰ９、及びｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ
１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｌｃＳｉｒｔ５＿ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２
＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ２＿ｎｃＡＴＰ９からなる群から選択されるポリペプチドをコードする
配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号１２９～１５９から
なる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、
少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコード
する。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号２または配列番号３に示さ
れる配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％
、または１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、
配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、
少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリ
ア指向性配列は、配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少
なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。

【0017】

ある場合には、ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号７または配列番号８
に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも
９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリアタンパク
質コード配列は、配列番号１０に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、
少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合
には、ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号１２に示される配列と少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同
一である配列を含む。

【0018】

ある場合には、３’ＵＴＲ核酸配列はミトコンドリア指向性配列の３’に位置する。あ
る場合には、３’ＵＴＲ核酸配列は、ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓ
ＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ
２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓＣＯＸ６ｃ、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ
２、ｒｎＳＯＤ２及びｈｓＯＸＡ１Ｌからなる群から選択される配列を含む。ある場合に
は、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１１１～１２５からなる群から選択される配列と少
なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１０
０％同一である配列を含む。ある場合には、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１３または
配列番号１４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％
、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。

【0019】

ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は３’ＵＴＲ核酸配列の５’に位置する。あ
る場合には、ミトコンドリア指向性配列はミトコンドリア指向性配列の３’に位置する。

【0020】

ある場合には、組換え核酸は、配列番号１７～２０、２３～２４、２７～２８、３１～
３４、３７～３８、４１～４２、４５～４８、５１～５２、５５～５６、５９～６２、６
５～６６、６９～７０、７３～７６、７９～８０、及び８３～８４からなる群から選択さ
れる配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％
、または１００％同一である配列を含む。

【0021】

別の態様において本明細書では、組換え核酸であって、配列番号２、３及び４からなる
群から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少な
くとも９９％、または１００％同一であるミトコンドリア指向性配列を含む、当該組換え
核酸を開示する。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号２に示される配
列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、また
は１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番
号３に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なく
とも９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向
性配列は、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくと
も９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。

【0022】

ある場合には、組換え核酸は、ミトコンドリアタンパク質コード配列をさらに含み、当
該ミトコンドリアタンパク質コード配列は、ミトコンドリアタンパク質を含むポリペプチ
ドをコードする。ある場合には、ミトコンドリアタンパク質は、ＮＡＤＨ脱水素酵素４（
ＮＤ４）、ＮＡＤＨ脱水素酵素６（ＮＤ６）、ＮＡＤＨ脱水素酵素１（ＮＤ１）及びそれ
らの変異体からなる群から選択される。ある場合には、ミトコンドリアタンパク質はＮＡ
ＤＨ脱水素酵素４（ＮＤ４）またはその変異体を含む。ある場合には、ミトコンドリアタ
ンパク質は、配列番号１６０に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少
なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチド配列を含む。あ
る場合には、ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号６、７または８に示され
る配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、
または１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリアタンパク質はＮＡ
ＤＨ脱水素酵素６（ＮＤ６）またはその変異体を含む。ある場合には、ミトコンドリアタ
ンパク質は、配列番号１６１に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少
なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合に
は、ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号９または配列番号１０に示される
配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、ま
たは１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリアタンパク質はＮＡＤ
Ｈ脱水素酵素１（ＮＤ１）またはその変異体を含む。ある場合には、ミトコンドリアタン
パク質は、配列番号１６２に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少な
くとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合には
、ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号１１または配列番号１２に示される
配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、ま
たは１００％同一である配列を含む。

【0023】

ある場合には、組換え核酸は３’ＵＴＲ核酸配列をさらに含む。ある場合には、３’Ｕ
ＴＲ核酸配列はミトコンドリア指向性配列の３’に位置する。ある場合には、３’ＵＴＲ
核酸配列は、ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ
１０、ｈｓＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓ
ＣＯＸ６ｃ、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２、ｒｎＳＯＤ２及びｈ
ｓＯＸＡ１Ｌからなる群から選択される配列を含む。ある場合には、３’ＵＴＲ核酸配列
は、配列番号１１１～１２５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なく
とも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含
む。ある場合には、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１３または配列番号１４に示される
配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、ま
たは１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は３’Ｕ
ＴＲ核酸配列の５’に位置する。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列はミトコンド
リア指向性配列の３’に位置する。

【0024】

ある場合には、組換え核酸は、配列番号２９～７０からなる群から選択される配列と少
なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１０
０％同一である配列を含む。

【0025】

別の態様において本明細書では、組換え核酸であって、ミトコンドリアタンパク質コー
ド配列を含み、ミトコンドリアタンパク質コード配列が、ミトコンドリアタンパク質を含
むポリペプチドをコードし、ミトコンドリアタンパク質コード配列が、配列番号７、８、
１０及び１２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少
なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、当該組換え
核酸を開示する。

【0026】

ある場合には、組換え核酸はミトコンドリア指向性配列をさらに含む。ある場合には、
ミトコンドリア指向性配列は、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＣＯＸ８、ｓｃＲＰＭ２、ｌｃＳｉ
ｒｔ５、ｔｂＮＤＵＳ７、ｎｃＱＣＲ２、ｈｓＡＴＰ５Ｇ２、ｈｓＬＡＣＴＢ、ｓｐｉｌ
ｖ１、ｇｍＣＯＸ２、ｃｒＡＴＰ６、ｈｓＯＰＡ１、ｈｓＳＤＨＤ、ｈｓＡＤＣＫ３、ｏ
ｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＡＴＰ９（ｎｃ
ＡＴＰ９）、ｈｓＧＨＩＴＭ、ｈｓＮＤＵＦＡＢ１、ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿
ｈｓＡＤＣＫ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｎｃＡ
ＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１０
０２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｚｍＬＯＣ１００
２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２
８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＴ
Ｐ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＴＰ
５Ｇ３、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ
１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓ
ｐｉｌｖ１＿ＧＮＦＰ＿ｎｃＡＴＰ９、及びｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７
４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｌｃＳｉｒｔ５＿ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ
２＿ｎｃＡＴＰ９からなる群から選択されるポリペプチドをコードする配列を含む。ある
場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号１２９～１５９からなる群から選択さ
れる配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％
、または１００％同一であるペプチド配列を含むポリペプチドをコードする。ある場合に
は、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号２に示される配列と少なくとも９０％、少な
くとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を
含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号３に示される配列と少なく
とも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％
同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、配列番号４に示さ
れる配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％
、または１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は、
配列番号５に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、
少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。

【0027】

ある場合には、ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号７または配列番号８
に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも
９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリアタンパク
質コード配列は、配列番号１０に示される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、
少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ある場合
には、ミトコンドリアタンパク質コード配列は、配列番号１２に示される配列と少なくと
も９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同
一である配列を含む。

【0028】

ある場合には、組換え核酸は３’ＵＴＲ核酸配列をさらに含む。ある場合には、３’Ｕ
ＴＲ核酸配列はミトコンドリア指向性配列の３’に位置する。ある場合には、３’ＵＴＲ
核酸配列は、ｈｓＡＣＯ２、ｈｓＡＴＰ５Ｂ、ｈｓＡＫ２、ｈｓＡＬＤＨ２、ｈｓＣＯＸ
１０、ｈｓＵＱＣＲＦＳ１、ｈｓＮＤＵＦＶ１、ｈｓＮＤＵＦＶ２、ｈｓＳＯＤ２、ｈｓ
ＣＯＸ６ｃ、ｈｓＩＲＰ１、ｈｓＭＲＰＳ１２、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２、ｒｎＳＯＤ２及びｈ
ｓＯＸＡ１Ｌからなる群から選択される配列を含む。ある場合には、３’ＵＴＲ核酸配列
は、配列番号１１１～１２５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なく
とも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含
む。ある場合には、３’ＵＴＲ核酸配列は、配列番号１３または配列番号１４に示される
配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、ま
たは１００％同一である配列を含む。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列は３’Ｕ
ＴＲ核酸配列の５’に位置する。ある場合には、ミトコンドリア指向性配列はミトコンド
リア指向性配列の３’に位置する。

【0029】

ある場合には、組換え核酸は、配列番号１７～２０、２３～２４、２７～２８、３１～
３４、３７～３８、４１～４２、４５～４８、５１～５２、５５～５６、５９～６２、６
５～６６、６９～７０、７３～７６、７９～８０、及び８３～８４からなる群から選択さ
れる配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％
、または１００％同一である配列を含む。

【0030】

別の態様において本明細書では、本明細書に開示される組換え核酸を含むウイルスベク
ターを開示する。ある場合には、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベク
ターである。ある場合には、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ
４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ａ
ＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６ベクターからなる群から
選択される。ある場合には、ＡＡＶベクターは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである
。ある場合には、ｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶ２ベクターである。

【0031】

別の態様において本明細書では、本明細書に開示される組換え核酸を含むアデノ随伴ウ
イルス（ＡＡＶ）を含む、医薬組成物を開示する。ある場合には、医薬組成物は、その薬
学的に許容される賦形剤をさらに含む。また、医薬組成物であって、本明細書に開示され
るウイルスベクターと、その薬学的に許容される賦形剤とを含み、ウイルスベクターが、
本明細書に開示される任意の組換え核酸を含むものである、当該医薬組成物も開示する。
また、医薬組成物であって、本明細書に開示される任意の組換え核酸を含むアデノ随伴ウ
イルス（ＡＡＶ）を含み、組換え核酸が、配列番号１５に示される配列と少なくとも９０
％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であ
る配列を含むものであり、さらに、薬学的に許容される賦形剤を含む、当該医薬組成物も
開示する。

【0032】

ある場合には、薬学的に許容される賦形剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、α，
α－トレハロース二水和物（α，α－ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、Ｌ－
ヒスチジン一塩酸塩一水和物、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２
ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ポロキサマー１８８またはそれらの任意の組合
せを含む。ある場合には、薬学的に許容される賦形剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ
）、α，α－トレハロース二水和物（α，α－ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ
）、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、ＮａＨ_２ＰＯ_４
、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ポロキサマー１８８及びそれらの任意
の組合せから選択される。ある場合には、薬学的に許容される賦形剤はポロキサマー１８
８を含む。ある場合には、薬学的に許容される賦形剤は０．０００１～０．０１％のポロ
キサマー１８８を含む。ある場合には、薬学的に許容される賦形剤は０．００１％のポロ
キサマー１８８を含む。ある場合には、薬学的に許容される賦形剤は１つ以上の塩をさら
に含む。ある場合には、１つ以上の塩は、ＮａＣｌ、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４及
びＫＨ_２ＰＯ_４を含む。ある場合には、１つ以上の塩は、８０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの
ＮａＨ_２ＰＯ_４、４０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、及び５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４を含む。ある場
合には、医薬組成物のｐＨは６～８である。ある場合には、医薬組成物のｐＨは７．２～
７．４である。ある場合には、医薬組成物のｐＨは７．３である。ある場合には、医薬組
成物のウイルス力価は少なくとも１．０×１０^１０ｖｇ／ｍＬである。ある場合には、医
薬組成物のウイルス力価は少なくとも５．０×１０^１０ｖｇ／ｍＬである。

【0033】

ある場合には、医薬組成物を５回の凍結／解凍サイクルに供し、医薬組成物は５回の凍
結／解凍サイクルの前のウイルス力価と比較して少なくとも６０％、７０％、８０％また
は９０％のウイルス力価を保持している。ある場合には、医薬組成物は、レーベル遺伝性
視神経症患者に投与された場合に、組換え核酸を含まない同等の医薬組成物に比べてより
高い平均視力回復を生じさせる。ある場合には、医薬組成物は、レーベル遺伝性視神経症
患者に投与された場合に、配列番号１５に示される組換え核酸を含む同等の医薬組成物に
比べてより高い平均視力回復を生じさせる。

【0034】

別の態様において本明細書では、眼障害を治療する方法であって、それを必要とする患
者に、本明細書に開示される任意の医薬組成物を投与することを含む、当該方法を開示す
る。ある場合には、眼障害はレーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）である。ある場合には
、方法は、医薬組成物を患者の片眼または両眼に投与することを含む。ある場合には、医
薬組成物は眼内または硝子体内注射によって投与される。ある場合には、医薬組成物は硝
子体内注射によって投与される。ある場合には、約０．０１～０．１ｍＬの医薬組成物が
硝子体内注射によって投与される。ある場合には、約０．０５ｍＬの医薬組成物が硝子体
内注射によって投与される。

【0035】

ある場合には、方法は、メチルプレドニゾロンを患者に投与することをさらに含む。あ
る場合には、メチルプレドニゾロンは医薬組成物の硝子体内注射の前に投与される。ある
場合には、メチルプレドニゾロンは経口投与される。ある場合には、メチルプレドニゾロ
ンは医薬組成物の硝子体内注射の前に少なくとも１、２、３、４、５、６または７日間に
わたって毎日投与される。ある場合には、メチルプレドニゾロンは毎日投与される。ある
場合には、約３２ｍｇ／６０ｋｇのメチルプレドニゾロンの１日投薬量が投与される。あ
る場合には、メチルプレドニゾロンは医薬組成物の硝子体内注射の後に投与される。ある
場合には、方法は、クレアチンリン酸ナトリウムを患者に投与することをさらに含む。あ
る場合には、クレアチンリン酸ナトリウムは静脈内投与される。ある場合には、メチルプ
レドニゾロンは静脈内または経口投与される。ある場合には、方法は、メチルプレドニゾ
ロンを少なくとも１日間にわたって静脈内投与し、その後、メチルプレドニゾロンを少な
くとも１週間にわたって経口投与することを含む。ある場合には、方法は、メチルプレド
ニゾロンを約３日間にわたって静脈内投与し、その後、メチルプレドニゾロンを少なくと
も約６週間にわたって経口投与することを含む。ある場合には、メチルプレドニゾロンは
約８０ｍｇ／６０ｋｇの１日用量で静脈内投与される。ある場合には、医薬組成物を投与
することは、組換え核酸を含まない同等の医薬組成物に比べてより高い平均視力回復を生
じさせる。ある場合には、医薬組成物を投与することは、配列番号１５に示される組換え
核酸を含む同等の医薬組成物に比べてより高い平均視力回復を生じさせる。

【0036】

参照による援用
本明細書中に言及される全ての刊行物、特許及び特許出願を参照により本明細書に、あ
たかも個々の刊行物、特許または特許出願を参照により援用すると具体的かつ個別に示し
たかのように援用する。

【0037】

本発明の新規な特徴は、別記の特許請求の範囲に詳細に明記されている。本発明の特徴
及び利点についてのよりよい理解は、本発明の原理を利用する例示的実施形態を示した以
下の詳細な説明、及び添付されるその図面を参照することによって得られるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】ＮＤ４（レーンＡ）及び最適化ＮＤ４（レーンＢ）遺伝子クローニング結果のＰＣＲ核酸電気泳動による証拠を示す。

【図2】ｑＰＣＲを用いてｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４（左の黒色柱）とｒＡＡＶ２－ＮＤ４（右の黒色柱）との相対発現レベル比較を示す。β－アクチンが内部標準遺伝子である（白色柱）。

【図3】イムノブロッティングを用いてｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４（左の黒色柱）とｒＡＡＶ２－ＮＤ４（右の黒色柱）との相対発現レベル比較を示す。β－アクチンが内部標準遺伝子である（白色柱）。

【図4】ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４（右）及びｒＡＡＶ２－ＮＤ４（左）をそれぞれ注射したウサギの眼底撮影結果を示す。

【図5】ｒＡＡＶ２最適化ＮＤ４を注射する前（左）及び後（右）での患者の眼底撮影結果を示す。

【図6】ｒＡＡＶ２－ＮＤ４（左）及びｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊（右）のＥＧＦＰ発現レベルを示す。

【図7】２９３Ｔ細胞におけるＮＤ４発現を示す：ｒＡＡＶ２－ＮＤ４（左）及びｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊（右）。

【図8】２９３Ｔ細胞における相対ＮＤ４発現を示す：ｒＡＡＶ２－ＮＤ４（左）及びｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊（右）。

【図9】ウサギ視神経細胞におけるＮＤ４発現を示す：ｒＡＡＶ２－ＮＤ４（左）及びｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊（右）。

【図10】ウサギ視神経細胞における相対ＮＤ４発現を示す：ｒＡＡＶ２－ＮＤ４（左）及びｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊（右）。

【図11】ｒＡＡＶ２－ＮＤ４（左）及びｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊（右）についての眼底撮影結果を示す。

【図12】ｒＡＡＶ２－ＮＤ４（左）及びｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊（右）についての顕微鏡検査（ＨＥ染色）結果を示す。

【図13】ｒＡＡＶ２－ＮＤ６（Ａ）、ｒＡＡＶ－ＧＦＰ（Ｂ）及びＰＢＳをそれぞれ注射したウサギの眼底撮影結果を示す。

【図14】ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ６（Ａ）、ｒＡＡＶ２－ＮＤ６（Ｂ）、ｒＡＡＶ－ＥＧＦＰ（Ｃ）をそれぞれ注射したウサギの眼底撮影結果を示す。

【図15】ウサギ視神経細胞における相対ＮＤ６発現を示す：ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ６（Ａ）、ｒＡＡＶ２－ＮＤ６（Ｂ）及びｒＡＡＶ－ＥＧＦＰ（Ｃ）。

【図16】相対ＮＤ６発現をウェスタンブロットによって示す：ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ６（Ａ）、ｒＡＡＶ２－ＮＤ６（Ｂ）及びｒＡＡＶ－ＥＧＦＰ（Ｃ）。

【図17】ウサギ視神経細胞における相対ＮＤ１発現を示す：ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ１（Ａ）、ｒＡＡＶ２－ＮＤ１（Ｂ）及びｒＡＡＶ－ＥＧＦＰ（Ｃ）。

【図18】相対ＮＤ１発現をウェスタンブロットによって示す：ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ１（Ａ）、ｒＡＡＶ２－ＮＤ１（Ｂ）及びｒＡＡＶ－ＥＧＦＰ（Ｃ）。

【発明を実施するための形態】

【0039】

定義
特に規定されない限り、本明細書中で使用する全ての科学技術用語は、本開示が属する
分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のもの
と類似する、または等価である任意の方法及び材料を本明細書中の製剤または単位用量の
実施または試験に用いることができるが、ここではいくつかの方法及び材料を記載する。
特に言及されない限り、本明細書中で使用または企図される技術は標準的な技法である。
材料、方法及び例は例示的なものであるにすぎず、限定するものではない。

【0040】

本明細書及び別記の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」
及び「ｔｈｅ」は複数形での意味を含むが、但し、そうでないことが文脈から明らかであ
る場合を除く。したがって、例えば「化合物」への言及は、複数のそのような薬剤を含み
、「塩」への言及は、１つ以上の塩（または複数の塩）及び当業者に知られているその等
価体への言及を含む、といった具合である。

【0041】

本明細書中で使用する場合、「または」という用語は、別段の指示がない限り結合的ま
たは非結合的であり得る。本明細書中で用いる場合、別段の指示がない限り、任意の実施
形態を他の任意の実施形態と組み合わせることができる。

【0042】

本明細書中で用いる場合、本明細書中の本発明のいくつかの実施形態は、別段の指示が
ない限り、数値範囲を企図している。範囲が存在する場合、範囲は端点を包含する。加え
て、範囲内のあらゆる小範囲及び値は、あたかも明示的に書き出されているかのように存
在している。

【0043】

参照数値及びその文法的均等物に関して「約」という用語、及びその文法的均等物は、
本明細書中で使用される場合、その値から上下１０％の値の範囲、例えば、その値から上
下１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の値の範囲を含
み得る。例えば、「約１０」には９～１１の量が含まれる。

【0044】

「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語（及び関連する用語、例えば、「
含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「有している
（ｈａｖｉｎｇ）」または「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」）によって、他の特定
の実施形態において例えば本明細書に記載の何らかの組成物、組成、方法またはプロセス
などの実施形態が記載の特徴「からなり」得る、またはそれ「から本質的になり」得るこ
とを排除する意図はない。

【0045】

「対象」という用語は、治療対象、観察対象もしくは実験対象にされていた、またはそ
れにされる、哺乳動物を指す。「哺乳動物」という用語はその標準的な意味を有すること
を意図しており、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ及びウシを包含する。本明細書に記
載の方法は、ヒトの療法及び獣医学的用途の両方において有用であり得る。いくつかの実
施形態では、対象はヒトである。

【0046】

「治療すること」または「治療」という用語は、本明細書に開示される少なくとも１つ
の化合物またはその薬学的に許容される塩の投与を、そのような投与を必要とする哺乳動
物対象、特にヒト対象において行うことを包含し、（ｉ）がんなどの疾患の臨床症候の進
展を阻止すること、（ｉｉ）がんなどの疾患の臨床症候の消退をもたらすこと、及び／ま
たは（ｉｉｉ）がんなどの疾患の発症を予防するための予防的処置を含む。

【0047】

本明細書に記載の化学的実体の「治療的有効量」という用語は、ヒトまたは非ヒト対象
に投与された場合に症候の改善、疾患進行の減速、または疾患の予防などの治療的利益を
提供するのに有効な量を指す。

【0048】

本明細書中で使用する場合、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、別段の
指示がない限り交換可能に使用され得る。

【0049】

核酸及びポリペプチド配列
表１は、本明細書に開示される全ての核酸及びポリペプチド配列を開示する。第１列は
、各配列の配列番号を示す。第２列は核酸またはポリペプチド構築物を表記する。例えば
、構築物ＣＯＸ１０－ＮＤ６－３’ＵＴＲは、（核酸配列間にリンカーを有さずに５’か
ら３’に向かって、ＣＯＸ１０（配列番号１）、ＮＤ６（配列番号９）及び３’ＵＴＲ（
配列番号１３）の核酸配列を組み合わせた核酸である。

【表1】

【0050】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト及び他のいくつかの霊長類種に感染する小型の
ウイルスである。本明細書に開示される組成物は、第一に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ
）ゲノムまたはその派生体を含む。

【0051】

ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶウイルス粒子の産生に必要とされる機能をコードするポリヌク
レオチド配列である。これらの機能には、ＡＡＶウイルス粒子内へのＡＡＶゲノムのカプ
シド封入を含めた宿主細胞におけるＡＡＶの複製及びパッケージングサイクルにおいて働
くものが含まれる。天然に存在するＡＡＶウイルスは増殖能欠損型であり、複製及びパッ
ケージングサイクルの完遂に関してはトランスでのヘルパー機能の提供に依存している。
それゆえ、本発明のベクターのＡＡＶゲノムは典型的には増殖能欠損型である。

【0052】

ＡＡＶゲノムは、プラスセンスかマイナスセンスかのどちらかの一本鎖形態、あるいは
二本鎖形態であり得る。二本鎖形態を用いることで、標的細胞におけるＤＮＡ複製段階を
回避することが可能になり、それゆえに導入遺伝子発現が加速され得る。

【0053】

ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのいかなる天然由来の血清型または単離物またはグレード（Ｇ
ｌａｄｅ）からのものであってもよい。したがって、ＡＡＶゲノムは、天然に存在するＡ
ＡＶウイルスの全ゲノムであってもよい。当業者には知られていることであるが、天然に
存在するＡＡＶウイルスは、様々な生物学的体系に従って分類され得る。

【0054】

一般に、ＡＡＶウイルスはその血清型によって呼称される。血清型は、カプシド表面抗
原の発現のプロファイルゆえに他の変異体亜種との区別に用いられ得る独特の反応性を有
するＡＡＶの変異体亜種に相当する。通常、特定のＡＡＶ血清型を有するウイルスは、他
の任意のＡＡＶ血清型に特異的な中和抗体とは効率的な交差反応をしない。ＡＡＶ血清型
としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、
ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、
ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、さらには近年に霊長類の脳から同定された組換え血清型、例
えばＲｅｃ２及びＲｅｃ３が挙げられる。

【0055】

本発明に使用するための望ましいＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ２である。本発明に使用す
るための特に興味深い他の血清型としては、網膜色素上皮などの眼内組織に効率的に形質
導入をするＡＡＶ４、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８が挙げられる。使用されるＡＡＶの血清型は
、ＡＡＶ４でないＡＡＶ血清型であることがある。ＡＡＶ血清型の総説は、Ｃｈｏｉ ｅ
ｔ ａｌ（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５；５（３）；２９９－３１０）、及
びＷｕ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００６；１４（３），３
１６－３２７）に見出され得る。本発明に使用するための、ＡＡＶゲノムの配列、または
ＩＴＲ配列、ｒｅｐもしくはｃａｐ遺伝子を含めたＡＡＶゲノムのエレメントの配列は、
ＡＡＶ全ゲノム配列の以下の受託番号に由来するものであり得る：アデノ随伴ウイルス１
ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３４９７；アデノ随伴ウイルス２ ＮＣ＿００１４０１
；アデノ随伴ウイルス３ ＮＣ＿００１７２９；アデノ随伴ウイルス３Ｂ ＮＣ＿００１
８６３；アデノ随伴ウイルス４ ＮＣ＿００１８２９；アデノ随伴ウイルス５ Ｙ１８０
６５、ＡＦ０８５７１６；アデノ随伴ウイルス６ ＮＣ＿００１８６２；トリＡＡＶ Ａ
ＴＣＣ ＶＲ－８６５ ＡＹ１８６１９８、ＡＹ６２９５８３、ＮＣ＿００４８２８；ト
リＡＡＶ株ＤＡ－１ ＮＣ＿００６２６３、ＡＹ６２９５８３；ウシＡＡＶ ＮＣ＿００
５８８９、ＡＹ３８８６１７。

【0056】

ＡＡＶウイルスはクレードまたはクローンによって呼称されることもある。これは天然
由来のＡＡＶウイルスの系統発生学的関係性を表し、典型的には、共通祖先に遡ることが
できる系統学的ＡＡＶウイルス群を表し、その全ての子孫を含む。加えて、ＡＡＶウイル
スは、特定の単離物、すなわち天然にみられる特定ＡＡＶウイルスの遺伝学的単離物によ
って呼称されることがある。遺伝学的単離物という用語は、他の天然に存在するＡＡＶウ
イルスとの限られた遺伝学的混合を経たＡＡＶウイルスの集団を表し、それによって遺伝
子レベルで識別可能に異なった集団が定義される。

【0057】

本発明に使用され得るＡＡＶのクレード及び単離物の例としては、クレードＡ：ＡＡＶ
１ ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３４９７、ＡＡＶ６ ＮＣ＿００１８６２、Ｈｕ．４
８ ＡＹ５３０６１１、Ｈｕ４３ ＡＹ５３０６０６、Ｈｕ４４ ＡＹ５３０６０７、Ｈ
ｕ４６ ＡＹ５３０６０９；クレードＢ：Ｈｕ．１９ ＡＹ５３０５８４、Ｈｕ．２０
ＡＹ５３０５８６、Ｈｕ２３ ＡＹ５３０５８９、Ｈｕ２２ ＡＹ５３０５８８、Ｈｕ２
４ ＡＹ５３０５９０、Ｈｕ２１ ＡＹ５３０５８７、Ｈｕ２７ ＡＹ５３０５９２、Ｈ
ｕ２８ ＡＹ５３０５９３、Ｈｕ２９ ＡＹ５３０５９４、Ｈｕ６３ ＡＹ５３０６２４
、Ｈｕ６４ ＡＹ５３０６２５、Ｈｕ１３ ＡＹ５３０５７８、Ｈｕ５６ ＡＹ５３０６
１８、Ｈｕ５７ ＡＹ５３０６１９、Ｈｕ４９ ＡＹ５３０６１２、Ｈｕ５８ ＡＹ５３
０６２０、Ｈｕ３４ ＡＹ５３０５９８、Ｈｕ３５ ＡＹ５３０５９９、ＡＡＶ２ ＮＣ
＿００１４０１、Ｈｕ４５ ＡＹ５３０６０８、Ｈｕ４７ ＡＹ５３０６１０、Ｈｕ５１
ＡＹ５３０６１３、Ｈｕ５２ ＡＹ５３０６１４、Ｈｕ Ｔ４１ ＡＹ６９５３７８、
Ｈｕ Ｓ１７ ＡＹ６９５３７６、Ｈｕ Ｔ８８ ＡＹ６９５３７５、Ｈｕ Ｔ７１ Ａ
Ｙ６９５３７４、Ｈｕ Ｔ７０ ＡＹ６９５３７３、Ｈｕ Ｔ４０ ＡＹ６９５３７２、
Ｈｕ Ｔ３２ ＡＹ６９５３７１、Ｈｕ Ｔ１７ ＡＹ６９５３７０、Ｈｕ ＬＧ１５
ＡＹ６９５３７７；クレードＣ：Ｈｕ９ ＡＹ５３０６２９、Ｈｕ１０ ＡＹ５３０５７
６、Ｈｕ１１ ＡＹ５３０５７７、Ｈｕ５３ ＡＹ５３０６１５、Ｈｕ５５ ＡＹ５３０
６１７、Ｈｕ５４ ＡＹ５３０６１６、Ｈｕ７ ＡＹ５３０６２８、Ｈｕ１８ ＡＹ５３
０５８３、Ｈｕ１５ ＡＹ５３０５８０、Ｈｕ１６ ＡＹ５３０５８１、Ｈｕ２５ ＡＹ
５３０５９１、Ｈｕ６０ ＡＹ５３０６２２、Ｃｈ５ ＡＹ２４３０２１、Ｈｕ３ ＡＹ
５３０５９５、Ｈｕ１ ＡＹ５３０５７５、Ｈｕ４ ＡＹ５３０６０２ Ｈｕ２、ＡＹ５
３０５８５、Ｈｕ６１ ＡＹ５３０６２３；クレードＤ：Ｒｈ６２ ＡＹ５３０５７３、
Ｒｈ４８ ＡＹ５３０５６１、Ｒｈ５４ ＡＹ５３０５６７、Ｒｈ５５ ＡＹ５３０５６
８、Ｃｙ２ ＡＹ２４３０２０、ＡＡＶ７ ＡＦ５１３８５１、Ｒｈ３５ ＡＹ２４３０
００、Ｒｈ３７ ＡＹ２４２９９８、Ｒｈ３６ ＡＹ２４２９９９、Ｃｙ６ ＡＹ２４３
０１６、Ｃｙ４ ＡＹ２４３０１８、Ｃｙ３ ＡＹ２４３０１９、Ｃｙ５ ＡＹ２４３０
１７、Ｒｈ１３ ＡＹ２４３０１３；クレードＥ：Ｒｈ３８ ＡＹ５３０５５８、Ｈｕ６
６ ＡＹ５３０６２６、Ｈｕ４２ ＡＹ５３０６０５、Ｈｕ６７ ＡＹ５３０６２７、Ｈ
ｕ４０ ＡＹ５３０６０３、Ｈｕ４１ ＡＹ５３０６０４、Ｈｕ３７ ＡＹ５３０６００
、Ｒｈ４０ ＡＹ５３０５５９、Ｒｈ２ ＡＹ２４３００７、Ｂｂ１ ＡＹ２４３０２３
、Ｂｂ２ ＡＹ２４３０２２、Ｒｈ１０ ＡＹ２４３０１５、Ｈｕ１７ ＡＹ５３０５８
２、Ｈｕ６ ＡＹ５３０６２１、Ｒｈ２５ ＡＹ５３０５５７、Ｐｉ２ ＡＹ５３０５５
４、Ｐｉ１ ＡＹ５３０５５３、Ｐｉ３ ＡＹ５３０５５５、Ｒｈ５７ ＡＹ５３０５６
９、Ｒｈ５０ ＡＹ５３０５６３、Ｒｈ４９ ＡＹ５３０５６２、Ｈｕ３９ ＡＹ５３０
６０１、Ｒｈ５８ ＡＹ５３０５７０、Ｒｈ６１ ＡＹ５３０５７２、Ｒｈ５２ ＡＹ５
３０５６５、Ｒｈ５３ ＡＹ５３０５６６、Ｒｈ５１ ＡＹ５３０５６４、Ｒｈ６４ Ａ
Ｙ５３０５７４、Ｒｈ４３ ＡＹ５３０５６０、ＡＡＶ８ ＡＦ５１３８５２、Ｒｈ８
ＡＹ２４２９９７、Ｒｈ１ ＡＹ５３０５５６；クレードＦ：Ｈｕ１４（ＡＡＶ９）ＡＹ
５３０５７９、Ｈｕ３１ ＡＹ５３０５９６、Ｈｕ３２ ＡＹ５３０５９７、クローン単
離物ＡＡＶ５ Ｙ１８０６５、ＡＦ０８５７１６、ＡＡＶ３ ＮＣ＿００１７２９、ＡＡ
Ｖ３Ｂ ＮＣ＿００１８６３、ＡＡＶ４ ＮＣ＿００１８２９、Ｒｈ３４ ＡＹ２４３０
０１、Ｒｈ３３ ＡＹ２４３００２、Ｒｈ３２ ＡＹ２４３００３が挙げられる。

【0058】

当業者であれば、本発明に使用するのに適したＡＡＶの血清型、グレード（Ｇｌａｄｅ
）、クローンまたは単離物を彼らの共通一般知識に基づいて選択することができる。例え
ば、ＡＡＶ５カプシドは、遺伝性色覚異常の矯正の成功を証拠として、霊長類の錐体光受
容器に効率的に形質導入をすることが示されている（Ｍａｎｃｕｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ ２００９，４６１：７８４－７）。

【0059】

しかしながら、本発明が、未だ同定または特性評価されていない可能性がある他の血清
型のＡＡＶゲノムの使用も包含することは、理解されるべきである。ＡＡＶ血清型は、Ａ
ＡＶウイルスの感染の組織特異性（または向性）を決定付ける。それゆえ、本発明に従っ
て患者に投与されるＡＡＶウイルスに使用するための望ましいＡＡＶ血清型は、ＬＨＯＮ
において眼内の標的細胞に対する天然の向性、またはそれの高い感染効率を有するもので
ある。したがって、患者に投与されるＡＡＶウイルスに使用するためのＡＡＶ血清型は、
神経感覚網膜及び網膜色素上皮の細胞に感染するものであり得る。

【0060】

通常、ＡＡＶの天然由来の血清型または単離物またはグレード（Ｇｌａｄｅ）のＡＡＶ
ゲノムは少なくとも１つの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲ配列は、シスで作
用して機能的複製起点を提供し、細胞のゲノムからのベクターの組込み及び切出しを可能
にする。望ましい実施形態では、１つ以上のＩＴＲ配列が、ＮＤ４、ＮＤ６もしくはＮＤ
１またはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド配列に隣接している。望ましいＩ
ＴＲ配列は、ＡＡＶ２のもの及びその変異体である。ＡＡＶゲノムは、パッケージング遺
伝子、例えば、ＡＡＶウイルス粒子のためのパッケージング機能をコードするｒｅｐ及び
／またはｃａｐ遺伝子も含んでいるのが典型的である。ｒｅｐ遺伝子は、タンパク質Ｒｅ
ｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０またはその変異体のうちの１つ以上をコ
ードする。ｃａｐ遺伝子は、１つ以上のカプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及
びＶＰ３またはその変異体をコードする。これらのタンパク質はＡＡＶウイルス粒子のカ
プシドを構成する。カプシド変異体については以下に述べている。

【0061】

パッケージング遺伝子の各々にはプロモーターが機能可能に連結されることになる。そ
のようなプロモーターの具体例としては、ｐ５、ｐ１９及びｐ４０プロモーターが挙げら
れる（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９，ＰＮＡＳ，７６：５５６７－５５７
１）。例えば、ｒｅｐ遺伝子を発現させるためにはｐ５及びｐ１９プロモーターが大抵使
用される一方、ｃａｐ遺伝子を発現させるためにはｐ４０プロモーターが大抵使用される
。

【0062】

それゆえ、本発明のベクターに使用されるＡＡＶゲノムは、上に述べたとおり、天然に
存在するＡＡＶウイルスの全ゲノムであってもよい。例えば、ＡＡＶ全ゲノムを含むベク
ターを使用して試験管内でＡＡＶウイルスを作製してもよい。しかしながら、そのような
ベクターが原理的には患者に投与され得るものであるとはいえ、これは滅多に実施されな
いことであろう。患者への投与の目的のためにＡＡＶゲノムを誘導体化することが好まし
かろう。そのような誘導体化は当技術分野では標準的であり、本発明は、ＡＡＶゲノムの
任意の既知の誘導体、及び当技術分野で知られている技術を適用することで生み出すこと
ができるであろう誘導体の使用を包含する。ＡＡＶゲノムの、及びＡＡＶカプシドの誘導
体化については、Ｃｏｕｒａ ａｎｄ Ｎａｒｄｉ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ
，２００７，４：９９）、ならびに上に参照したＣｈｏｉ ｅｔ ａｌ及びＷｕ ｅｔ
ａｌに総説されている。

【0063】

ＡＡＶゲノムの誘導体としては、生体内での本発明のベクターからのＮＤ４、ＮＤ６ま
たはＮＤ１導入遺伝子の発現を可能にする任意の切詰め形態または改変形態のＡＡＶゲノ
ムが挙げられる。通常は、上記機能を保持しながら最小限のウイルス配列を含むようにＡ
ＡＶゲノムを大幅に切り詰めることが可能である。これは、野生型ウイルスによるベクタ
ーの組換えのリスクを軽減し、さらには標的細胞内のウイルス遺伝子タンパク質の存在に
よる細胞性免疫応答の誘発を回避する、という安全上の理由から望ましいことである。

【0064】

典型的には、誘導体は、少なくとも１つの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、好ましくは１
つよりも多いＩＴＲ、例えば２つ以上のＩＴＲを含むことになる。ＩＴＲの１つ以上が、
異なる血清型を有するＡＡＶゲノムに由来していてもよいし、またはキメラＩＴＲもしく
は突然変異ＩＴＲであってもよい。望ましい突然変異ＩＴＲは、ｔｒｓ（末端分解部位）
が欠失しているものである。この欠失はゲノムの継続的複製を可能にして、コード配列及
び相補的配列を両方とも含有する一本鎖ゲノム、すなわち自己相補的ＡＡＶゲノムを生成
する。これは、標的細胞におけるＤＮＡを回避することを可能にし、それゆえに導入遺伝
子発現の加速を可能にする。

【0065】

１つ以上のＩＴＲは、ＮＤ４、ＮＤ６、ＮＤ１またはそれらの変異体をコードするポリ
ヌクレオチド配列の各末端に隣接していることが好ましかろう。１つ以上のＩＴＲを含む
ことは、例えば宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼの作用による一本鎖ベクターＤＮＡから二本
鎖ＤＮＡへの変換に従って、宿主細胞の核における本発明のベクターのコンカテマー形成
を助ける上で望ましいことである。そのようなエピソームコンカテマーの形成によってベ
クター構築物は宿主細胞の寿命にわたって保護され、それによって生体内での導入遺伝子
の長期的発現が可能になる。

【0066】

望ましい実施形態では、ＩＴＲエレメントを、誘導体において天然ＡＡＶゲノムから保
持されている唯一の配列にすることとなる。このように、誘導体は、天然ゲノムのｒｅｐ
及び／またはｃａｐ遺伝子ならびに天然ゲノムの他の任意の配列を含まないことが好まし
かろう。これが望ましいのは、上記理由のためであり、さらには宿主細胞ゲノム中へのベ
クターの組込みの可能性を低減するためでもある。加えて、ＡＡＶゲノムの大きさを低減
することで、導入遺伝子に加えて他の配列エレメント（例えば調節エレメント）をベクタ
ー内に組み込む際の融通性の向上が可能になる。

【0067】

したがって、ＡＡＶ２ゲノムに関しては、本発明の誘導体において以下の部分が除去さ
れ得る：１つの末端逆位反復（ＩＴＲ）配列、複製（ｒｅｐ）及びカプシド（ｃａｐ）遺
伝子（注意：野生型ＡＡＶゲノム中のｒｅｐ遺伝子を、ＬＨＯＮで侵されるヒト遺伝子Ｎ
Ｄ４、ＮＤ６またはＮＤ１と混同してはならない）。しかしながら、試験管内での実施形
態を含めていくつかの実施形態では、誘導体が１つ以上のｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝
子またはＡＡＶゲノムの他のウイルス配列をさらに含んでいてもよい。天然に存在するＡ
ＡＶウイルスは高頻度でヒト１９番染色体上の特定部位に組み込まれ、ベクターの組込み
能力の保持が治療場面で許容され得るような無視できるほど低い頻度のランダム組込みを
示す。

【0068】

誘導体ゲノムがカプシドタンパク質、すなわちＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３をコ
ードする遺伝子を含む場合、誘導体は、１つ以上の天然に存在するＡＡＶウイルスのキメ
ラ型、シャフリング型またはカプシド改変型誘導体であり得る。特に、本発明は、同じベ
クターの中にＡＡＶの異なる血清型、クレード、クローンまたは単離物からのカプシドタ
ンパク質配列を提供すること、すなわち偽型化を包含する。

【0069】

キメラ型、シャフリング型またはカプシド改変型誘導体は、典型的には、１つ以上の所
望の機能性をウイルスベクターに提供するように選択されることになる。かくして、これ
らの誘導体は、天然に存在するＡＡＶゲノム、例えばＡＡＶ２のものを含むＡＡＶウイル
スベクターと比較して、遺伝子送達効率の向上、（体液性または細胞性）免疫原性の低下
、向性範囲の変化、及び／または特定細胞種指向性の改善を呈し得る。遺伝子送達効率の
向上は、細胞表面での受容体または共受容体の結合性の改善、内在化の改善、細胞内での
、及び核内への輸送の改善、ウイルス粒子の脱殻の改善、ならびに一本鎖ゲノムから二本
鎖形態への変換の改善によってもたらされ得る。効率の向上は、ベクター用量がそれを必
要としない組織への投与によって希釈されないといった具合に、向性範囲または特定細胞
集団指向性の変化に関係することでもあり得る。

【0070】

キメラ型カプシドタンパク質としては、天然に存在するＡＡＶ血清型の２つ以上のカプ
シドコード配列の間での組換えによって生成するものが挙げられる。これは例えば、ある
血清型の非感染性カプシド配列を異なる血清型のカプシド配列と共トランスフェクトし、
特異的選抜を用いて所望の特性を有するカプシド配列を選抜する、マーカー救出手法によ
って実施され得る。異なる血清型のカプシド配列を細胞内での相同組換えによって変化さ
せて新規キメラ型カプシドタンパク質を生成することができる。

【0071】

キメラ型カプシドタンパク質としてはまた、２つ以上のカプシドタンパク質の間で、例
えば異なる血清型の２つ以上のカプシドタンパク質の間で特定のカプシドタンパク質ドメ
イン、表面ループまたは特定アミノ酸残基を移動させるカプシドタンパク質配列操作によ
って生み出されるものも挙げられる。

【0072】

シャフリング型またはキメラ型カプシドタンパク質はまた、ＤＮＡシャフリングによっ
て、またはエラープローンＰＣＲによって生み出され得る。ハイブリッドＡＡＶカプシド
遺伝子は、関係するＡＡＶ遺伝子の配列、例えば複数の異なる血清型のカプシドタンパク
質をコードするものをランダムに断片化してから、続いて断片を、同じく配列相同領域に
おける交差を引き起こし得るものであるセルフプライミングポリメラーゼ反応において再
組立てすることによって作り出され得る。このようにしていくつかの血清型のカプシド遺
伝子のシャフリングによって作り出されたハイブリッドＡＡＶ遺伝子のライブラリーをス
クリーニングして、所望の機能性を有するウイルスクローンを同定することができる。同
様に、エラープローンＰＣＲを用いてＡＡＶカプシド遺伝子をランダムに突然変異させて
、所望の特性の選抜が後になされ得る多様な変異体ライブラリーを作り出してもよい。

【0073】

また、カプシド遺伝子の配列に遺伝子組換えを行って、天然野生型配列に関して特異的
な欠失、置換または挿入を導入してもよい。特に、カプシドコード配列のオープンリーデ
ィングフレーム内、またはカプシドコード配列のＮ及び／またはＣ末端で無関係なタンパ
ク質またはペプチドの配列を挿入することによってカプシド遺伝子を改変してもよい。

【0074】

無関係なタンパク質またはペプチドは、特定細胞種のリガンドとして作用するものであ
ることが好都合であり得、それによって標的細胞との結合性の改善、または特定細胞集団
に対するベクターの指向特異性の改善がもたらされ得る。一例には、網膜色素上皮での取
り込みを遮断してそれによって周囲の網膜組織の形質導入を強化するＲＧＤペプチドの使
用が含まれ得る（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００８ ＡＲＶＯ Ａｂｓｔｒａｃｔ
：Ｄ１０４８）。無関係なタンパク質はまた、製造プロセスの一部としてウイルス粒子の
精製を支援するもの、すなわちエピトープまたは親和性タグであってもよい。挿入の部位
は、ウイルス粒子の他の機能、例えば、内在化、ウイルス粒子の輸送を妨害しないように
選択されるのが典型的であろう。当業者であれば、彼らの共通一般知識に基づいて挿入に
適する部位を同定することができる。上に参照したＣｈｏｉ ｅｔ ａｌに特定の部位が
開示されている。

【0075】

本発明はさらに、ＡＡＶゲノムの配列を天然ＡＡＶゲノムのものとは異なる順序及び構
成で提供することを包含する。本発明は、１つ以上のＡＡＶ配列または遺伝子を別のウイ
ルスからの配列で、または１つよりも多いウイルスからの配列からなるキメラ遺伝子で置
き換えることも包含する。そのようなキメラ遺伝子は、異なるウイルス種の２つ以上の関
連ウイルスタンパク質からの配列からなっていてもよい。

【0076】

本発明のベクターは、ＡＡＶゲノムまたはその誘導体と、ＮＤ４、ＮＤ６、ＮＤ１また
はその変異体をコードする配列とを含むポリヌクレオチド配列の形態を取る。

【0077】

誤解を避けるために記すと、本発明は、本発明のベクターを含むＡＡＶウイルス粒子も
提供する。本発明のＡＡＶ粒子には、ある血清型のＩＴＲを有するＡＡＶゲノムまたは誘
導体が異なる血清型のカプシドの中にパッケージングされたものであるトランスカプシド
化形態が含まれる。本発明のＡＡＶ粒子には、ウイルスエンベロープを２つ以上の異なる
血清型からの非改変型カプシドタンパク質の混合物で構成したものであるモザイク形態も
含まれる。ＡＡＶ粒子には、カプシド表面に吸着したリガンドを保有している化学修飾形
態も含まれる。例えば、そのようなリガンドには、特定の細胞表面受容体を指向するため
の抗体が含まれ得る。

【0078】

本発明はさらに、本発明のベクターまたはＡＡＶウイルス粒子を含む宿主細胞を提供す
る。

【0079】

組換え核酸配列
本明細書ではまた、ＮＡＤＨ脱水素酵素サブユニット４（ＮＤ４）、ＮＡＤＨ脱水素酵
素サブユニット１（ＮＤ１）及びＮＡＤＨ脱水素酵素サブユニット６（ＮＤ６）ポリペプ
チドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸配列も開示す
る。

【0080】

ＮＤ４のポリヌクレオチド配列は配列番号６に示され、配列番号１６０に示されるタン
パク質をコードする。ＮＤ４のさらなる核酸配列は配列番号７及び配列番号８である。Ｎ
Ｄ６のポリヌクレオチド配列は配列番号９に示され、配列番号１６１に示されるタンパク
質をコードする。ＮＤ６のさらなる核酸配列は配列番号１０である。ＮＤ１のポリヌクレ
オチド配列は配列番号１１に示され、配列番号１６２に示されるタンパク質をコードする
。ＮＤ１のさらなる核酸配列は配列番号１２である。

【0081】

配列番号１６０、１６１または１６２のいずれか１つの変異体には、機能性ＮＤ４、Ｎ
Ｄ６またはＮＤ１ポリペプチドをコードする切詰め体、突然変異体またはその相同体、及
びその任意の転写産物変異体が含まれ得る。本明細書中で言及されるいかなる相同体も、
ＮＤ４、ＮＤ６またはＮＤ１の該当領域と少なくとも７０％相同であることが典型的であ
り、ポリペプチド欠乏に対して機能的に埋め合わせをすることができる。

【0082】

相同性は、既知の方法を用いて測定され得る。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同
性を計算するために使用することができる（例えば、そのデフォルト設定で使用される）
ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供している（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｔ（１９８４）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７－３９５）。ＰＩＬＥＵ
Ｐ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して（典型的にはそれらのデフォルト設定で）、例
えばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ３６：２９０－３０
０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ ｅｔ ａｔ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５
：４０３－１０に記載されているように、相同性を計算する、または配列を用意すること
ができる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは国立生物工学情報センター（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能
である。

【0083】

望ましい実施形態では、組換え核酸配列は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３
０、例えば少なくとも４０、６０、１００、２００、３００、４００またはそれより多い
連続アミノ酸にわたって、ひいては組換え核酸の配列全体にわたってＮＤ４、ＮＤ６また
はＮＤ１（配列番号１６０、１６１または１６２）の該当領域と少なくとも５５％、６５
％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７
％、９９％、９９．５％または１００％相同であるポリペプチドをコードし得る。該当領
域は、ＮＤ４、ＮＤ６またはＮＤ１の機能的活性を提供するものとされよう。

【0084】

あるいは、及び好ましくは、組換え核酸配列は、その配列全体にわたって完全長ＮＤ４
、ＮＤ６またはＮＤ１（配列番号１６０、１６１または１６２）と少なくとも７０％、７
５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、９９％、９
９．５％または１００％相同であるポリペプチドをコードし得る。典型的には、組換え核
酸配列は、ＮＤ４、ＮＤ６またはＮＤ１（配列番号１６０、１６１または１６２）の該当
領域とは２、５、１０、２０、４０、５０または６０個以上または未満の（各々置換、挿
入または欠失であり得る）突然変異の分だけ異なっている。

【0085】

組換え核酸のＮＤ４、ＮＤ６またはＮＤ１ポリペプチドは、配列番号１６０、１６１ま
たは１６２の特定領域との同一性百分率が、上記の配列の長さのいずれかにわたる特定の
相同性百分率値のいずれかと同じであり得る（つまり、それは同一性が少なくとも７０％
、８０％または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、９９％であり得る）
。

【0086】

ＮＤ４、ＮＤ６またはＮＤ１（配列番号１６０、１６１または１６２）の変異体は切詰
めも含む。変異体がなおも機能的である限り、任意の切詰めを用いてよい。切詰めは、典
型的には、タンパク質活性に必須でない、及び／または折りたたまれたタンパク質の配座
、特に活性部位の折りたたみに影響を与えない配列を、除去するようになされることとな
る。適切な切詰めは、ＮまたはＣ末端からの様々な長さの配列の体系的切捨てによって慣
例的に同定され得る。好ましい切詰めはＮ末端側で行なわれ、触媒ドメインを除く他の全
ての配列を除去するものであってもよい。

【0087】

ＮＤ４、ＮＤ６またはＮＤ１（配列番号１６０、１６１または１６２）の変異体は、Ｎ
Ｄ４、ＮＤ６またはＮＤ１（配列番号１６０、１６１または１６２）の特定領域に関して
１つ以上の、例えば、２、３、４、５～１０、１０～２０、２０～４０個またはそれより
も多いアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する突然変異体をさらに含む。欠失及び挿入
は、以下に記載される触媒ドメインの外側でなされることが好ましい。置換も、典型的に
は、プロテアーゼ活性に必須でない、及び／または折りたたまれたタンパク質の配座に影
響を与えない領域で行なわれる。

【0088】

置換は、アミノ酸を他の類似する化学構造、類似する化学特性または類似する側鎖量の
アミノ酸で置き換えるものである保存的変化を１つ以上導入するものであることが好まし
い。導入されたアミノ酸は、それが置き換えたアミノ酸と類似する極性、親水性、疎水性
、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有し得る。あるいは、保存的変化は、既存の芳
香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入する
ものであってもよい。保存的アミノ酸変化は当技術分野でよく知られており、アミノ酸の
特性に応じて選択され得る。

【0089】

同様に、ＮＤ４、ＮＤ６またはＮＤ１のポリヌクレオチド配列（配列番号６、９または
１１）の望ましい変異体には、ＮＤ４、ＮＤ６またはＮＤ１（配列番号６、９または１１
）の該当領域との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは
少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の相同性を有す
るポリヌクレオチドが含まれる。好ましくは、変異体はその配列全体にわたってこれらの
レベルで完全長ＮＤ４、ＮＤ６またはＮＤ１（配列番号６、９または１１）との相同性を
呈する。

【0090】

ミトコンドリア指向性配列（ＭＴＳ）及び３プライム非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を使用
して標的タンパク質またはｍＲＮＡをミトコンドリアに指向することができる。ＭＴＳの
電荷、長さ及び構造はミトコンドリア内へのタンパク質移入において重要であり得る。特
定の３’ＵＴＲはｍＲＮＡ局在化をミトコンドリア表面へと促し得、それゆえにミトコン
ドリア内への翻訳時タンパク質移入を促進し得る。

【0091】

ミトコンドリア指向性配列のためのポリヌクレオチド配列は、ｈｓＣＯＸ１０、ｈｓＣ
ＯＸ８、ｓｃＲＰＭ２、ｌｃＳｉｒｔ５、ｔｂＮＤＵＳ７、ｎｃＱＣＲ２、ｈｓＡＴＰ５
Ｇ２、ｈｓＬＡＣＴＢ、ｓｐｉｌｖ１、ｇｍＣＯＸ２、ｃｒＡＴＰ６、ｈｓＯＰＡ１、ｈ
ｓＳＤＨＤ、ｈｓＡＤＣＫ３、ｏｓＰ０６４４Ｂ０６．２４－２、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ
ｃｒａｓｓａ ＡＴＰ９（ｎｃＡＴＰ９）、ｈｓＧＨＩＴＭ、ｈｓＮＤＵＦＡＢ１、ｈ
ｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３、ｎｃＡＴＰ９＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬ
ＯＣ１００２８２１７４、ｎｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１
＿ｎｃＡＴＰ９、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓ
ＡＴＰ５Ｇ３、ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｎ
ｃＡＴＰ９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２
１７４＿ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｃｒＡＴＰ６＿ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ
１００２８２１７４＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ３、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７
４、ｈｓＡＤＣＫ３＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｃｒＡＴＰ６、ｎｃＡＴＰ９＿ｚ
ｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ＧＮＦＰ＿ｎｃＡＴＰ９、及びｎｃＡＴＰ
９＿ｚｍＬＯＣ１００２８２１７４＿ｓｐｉｌｖ１＿ｌｃＳｉｒｔ５＿ｏｓＰ０６４４Ｂ
０６．２４－２＿ｈｓＡＴＰ５Ｇ２＿ｎｃＡＴＰ９から選択されるポリペプチドをコード
し得る（配列番号については表１を参照されたい）。一例において、ポリヌクレオチド配
列ＣＯＸ１０（配列番号１、２または３）はミトコンドリア指向性配列ＭＴＳ－ＣＯＸ１
０（配列番号１２６）をコードし得る。別の例において、ポリヌクレオチド配列ＣＯＸ８
（配列番号４）はミトコンドリア指向性配列ＭＴＳ－ＣＯＸ８（配列番号１２７）をコー
ドし得る。別の例において、ポリヌクレオチド配列ＯＰＡ１（配列番号５）はミトコンド
リア指向性配列ＭＴＳ－ＯＰＡ１（配列番号１２８）をコードし得る。

【0092】

３’ＵＴＲ核酸配列は、ｈｓＡＣＯ２（配列番号１１１）、ｈｓＡＴＰ５Ｂ（配列番号
１１２）、ｈｓＡＫ２（配列番号１１３）、ｈｓＡＬＤＨ２（配列番号１１４）、ｈｓＣ
ＯＸ１０（配列番号１１５）、ｈｓＵＱＣＲＦＳ１（配列番号１１６）、ｈｓＮＤＵＦＶ
１（配列番号１１７）、ｈｓＮＤＵＦＶ２（配列番号１１８）、ｈｓＳＯＤ２（配列番号
１１９）、ｈｓＣＯＸ６ｃ（配列番号１２０）、ｈｓＩＲＰ１（配列番号１２１）、ｈｓ
ＭＲＰＳ１２（配列番号１２２）、ｈｓＡＴＰ５Ｊ２（配列番号１２３）、ｒｎＳＯＤ２
（配列番号１２４）及びｈｓＯＸＡ１Ｌ（配列番号１２５）から選択され得る。３’ＵＴ
Ｒ核酸配列はまた、本明細書に掲載される任意の３’ＵＴＲ核酸配列との少なくとも７０
％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％、９９．５％または１００％の相同性を有する変異体であってもよい
。例えば、３’ＵＴＲ核酸配列は配列番号１３または配列番号１４であり得る。

【0093】

本明細書ではさらに、ミトコンドリア指向性配列、ミトコンドリアタンパク質コード配
列及び３’ＵＴＲ核酸配列を含む組換え核酸配列を開示する。例えば、組換え核酸配列は
、配列番号１５～８４から選択され得る。組換え核酸配列はまた、本明細書に掲載される
任意の組換え核酸配列との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好
ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００
％の相同性を有する変異体であってもよい。

【0094】

プロモーター及び調節配列
本発明のベクターは、開示される導入遺伝子の試験管内または生体内での発現を可能に
するエレメントも含む。よって、ベクターは、典型的には、ＮＤ４、ＮＤ６もしくはＮＤ
１導入遺伝子またはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド配列に機能可能に連結
されたプロモーター配列を含む。

【0095】

任意の好適なプロモーターを使用してよい。プロモーター配列は、任意の宿主細胞背景
の下で恒常的に活性な、つまり機能的なものであってもよいし、あるいは、特定の宿主細
胞環境においてのみ活性でありそれゆえに特定細胞種における導入遺伝子の指向的発現を
可能とするものであってもよい。プロモーターは、別の因子、例えば宿主細胞に存在して
いる因子に応答した誘導的発現を示すものであってもよい。いずれにせよ、ベクターを療
法のために投与する場合にはプロモーターは網膜細胞背景下において機能的でなければな
らない。

【0096】

いくつかの実施形態では、網膜細胞集団においてのみ導入遺伝子が発現することを可能
にするために、プロモーターが網膜細胞特異的な発現を示すことが望ましい。したがって
、プロモーターからの発現は網膜細胞特異的であり得、例えば、神経感覚網膜及び網膜色
素上皮の細胞のみに制限され得る。

【0097】

ＮＤ４、ＮＤ６またはＮＤ１導入遺伝子のための望ましいプロモーターとしては、任意
選択的にサイトメガロウイルス（ＣＭＥ）エンハンサーエレメントと組み合わせたニワト
リベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターが挙げられる。ある場合には、ＮＤ４、ＮＤ
６またはＮＤ１導入遺伝子のための望ましいプロモーターはＣＡＧプロモーターを含む。
特に望ましいプロモーターは、ハイブリッドＣＢＡ／ＣＡＧプロモーター、例えば、ｒＡ
ＶＥ発現カセットに使用されるプロモーターである。網膜特異的な遺伝子発現を誘導する
であろうヒト配列に基づくプロモーターの例としては、桿体及び錐体のためのロドプシン
キナーゼ（Ａｌｌｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｖｉｏｌ ８１：１１３７２
－８０）、錐体のみのためのＰＲ２．１（Ｍａｎｃｕｓｏ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｎａ
ｔｕｒｅ）、及び網膜色素上皮のためのＲＰＥ６５（Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ
．，２００８，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ）が挙げられる。

【0098】

本発明のベクターはまた、転写の前または後に作用し得る１つ以上の追加的な調節配列
を含んでいてもよい。調節配列は、天然ＮＤ４、ＮＤ６またはＮＤ１遺伝子座の一部であ
ってもよいし、または異種調節配列であってもよい。本発明のベクターは、天然ＮＤ４、
ＮＤ６またはＮＤ１転写産物からの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの一部を含み得る。

【0099】

調節配列は、導入遺伝子の発現を促進する、つまり、転写産物の発現を増加させるよう
に作用する、ｍＲＮＡ核内移入を改善する、またはその安定性を強化する、任意の配列で
ある。そのような調節配列としては、例えば、エンハンサーエレメント、後調節エレメン
ト、及びポリアデニル化部位が挙げられる。望ましいポリアデニル化部位は、ウシ成長ホ
ルモンポリＡシグナルである。本発明のベクターとの関連において、そのような調節配列
はシス作用性のものとされよう。しかしながら、本発明は、追加的遺伝子構築物上に位置
するトランス作用性の調節配列の使用も包含する。

【0100】

本発明のベクターに使用するための望ましい後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎
後調節エレメント（ＷＰＲＥ）またはその変異体である。本発明のベクターに使用され得
る別の調節配列は、足場付着領域（ＳＡＲ）である。追加的調節配列は、当業者によって
彼らの共通一般知識に基づいて選択され得る。

【0101】

ベクターの作製
本発明のベクターは、遺伝子療法のためのベクターを提供するための当技術分野で知ら
れている標準的手段によって作製され得る。したがって、十分に確立された公知のトラン
スフェクション、パッケージング及び精製方法を用いて好適なベクター作製物を作製する
ことができる。

【0102】

上に述べたとおり、本発明のベクターは、ＮＤ４、ＮＤ６もしくはＮＤ１をコードする
ポリヌクレオチド配列またはそれらの変異体に加えて、天然に存在するＡＡＶウイルスの
完全ゲノムを含んでいてもよい。しかしながら、一般的には、誘導体化されたゲノム、例
えば、少なくとも１つの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を有するがｒｅｐまたはｃａｐなど
の任意のＡＡＶ遺伝子を欠き得る誘導体を使用することとなる。

【0103】

そのような実施形態では、誘導体化ゲノムからＡＡＶウイルス粒子への組立てをもたら
すために、ＡＡＶ及び／またはヘルパーウイルス機能を提供する追加の遺伝子構築物を誘
導体化ゲノムと組み合わせて宿主細胞内に提供することになる。これらの追加的構築物は
、構造ＡＡＶカプシドタンパク質、すなわちｃａｐ、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３をコードす
る遺伝子、及びＡＡＶ生活環に必要とされる他の機能をコードする遺伝子、例えばｒｅｐ
を含有することが典型的であろう。追加的構築物に具備させる構造カプシドタンパク質の
選択によって、パッケージングされるウイルスベクターの血清型が決まるであろう。

【0104】

本発明に使用するためのパッケージングされる特に望ましいウイルスベクターとしては
、ＡＡＶ５またはＡＡＶ８カプシドタンパク質と組み合わせたＡＡＶ２の誘導体化ゲノム
が挙げられる。このパッケージングされたウイルスベクターは典型的には１つ以上のＡＡ
Ｖ２ ＩＴＲを含む。

【0105】

上に述べたとおり、ＡＡＶウイルスは増殖能欠損型であり、それゆえ、典型的には、Ａ
ＡＶ複製を可能にするために１つ以上の追加的構築物にヘルパーウイルス機能、好ましく
はアデノウイルスヘルパー機能も具備させることになる。

【0106】

上記の追加的構築物の全てをプラスミドまたは他のエピソームエレメントとして宿主細
胞内に提供してもよいし、あるいは１つ以上の構築物を宿主細胞のゲノムに組み込んでも
よい。

【0107】

これらの態様において、本発明は、本発明のベクターを製造する方法を提供する。方法
は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムまたはその誘導体、及びＮＤ４、ＮＤ６もしく
はＮＤ１またはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを宿主
細胞内に提供すること、ならびにベクターからＡＡＶウイルス粒子への複製及び組立ての
ための手段を提供することを含む。好ましくは、方法は、ＡＡＶゲノムの誘導体を含むベ
クター、及びＮＤ４、ＮＤ６もしくはＮＤ１またはそれらの変異体をコードするポリヌク
レオチド配列を、ＡＡＶ及び／またはヘルパーウイルス機能をコードする１つ以上の追加
的遺伝子構築物と一緒に提供することを含む。典型的には、ＡＡＶゲノムの誘導体は少な
くとも１つのＩＴＲを含む。任意選択的に、方法は、組み立てられたウイルス粒子を精製
するステップをさらに含む。加えて、方法は、ウイルス粒子を治療用途のために製剤化す
るステップを含み得る。

【0108】

治療方法及び医学的用途
上に述べたとおり、本発明者らは、驚くべきことに、ＬＨＯＮの根底にある細胞機能不
全に対処するために本発明のベクターが使用され得ることを実証した。詳しくは、彼らは
、ベクターの使用によってＬＨＯＮに関連する欠損症を矯正することができることを示し
た。これは、疾患の変性プロセスを治療、阻止、緩和または予防することができる手段を
提供する。

【0109】

したがって、本発明は、ＬＨＯＮの治療または予防を、それを必要とする患者において
行なう方法であって、治療的有効量の本発明のベクターを患者に網膜、網膜下または硝子
体内への直接注射によって投与することを含む、当該方法を提供する。したがって、患者
においてＬＨＯＮがそれによって治療または予防される。

【0110】

関連する態様において、本発明は、本発明のベクターを患者に網膜、網膜下または硝子
体内への直接注射によって投与することによってＬＨＯＮを治療または予防する方法にお
ける上記ベクターの用途を提供する。加えて、本発明は、網膜、網膜下または硝子体内へ
の直接注射によってＬＨＯＮを治療または予防するための医薬の製造における本発明のベ
クターの用途を提供する。

【0111】

これら全ての実施形態において、本発明のベクターは、ＬＨＯＮの１つ以上の症候の発
症を予防するために投与され得る。患者は無症候者であってもよい。対象は、疾患の素因
を有する者であってもよい。方法または用途は、対象がＬＨＯＮを進展させる、または有
するリスクを有しているか否かを同定するステップを含み得る。そのような対象には予防
的有効量のベクターを投与する。予防的有効量は、疾患の１つ以上の症候の発症を予防す
る量である。

【0112】

あるいは、対象に疾患の症候が出現した時点で、つまり、疾患の既存症候を治癒させる
ために、ベクターを投与してもよい。そのような対象には治療的有効量のアンタゴニスト
を投与する。治療的有効量は、疾患の１つ以上の症候を改善するのに有効な量である。そ
のような量はまた、ＬＨＯＮに関連するいくらかの周辺視力喪失を阻止する、減速させる
、または逆転させるものであってもよい。そのような量はまた、ＬＨＯＮの発症を阻止す
る、減速させる、または逆転させるものであってもよい。

【0113】

典型的な単回用量は、形質導入を必要とする残存網膜組織の量にもよるが１０^１０～１
０^１２ゲノム粒子である。本明細書においてゲノム粒子は、配列特異的な方法（例えばリ
アルタイムＰＣＲ）で定量され得る一本鎖ＤＮＡ分子を含有するＡＡＶカプシドと定義さ
れる。その用量は単回用量として提供されてもよいが、僚眼のために、またはベクターが
何らか（例えば手術の合併症）の理由で網膜の正しい領域を指向しなかった可能性がある
場合に、繰り返されてもよい。治療は各眼に対する単回永久治療であることが好ましいが
、注射を例えば後年及び／または異なるＡＡＶ血清型で繰り返すことを検討してもよい。

【0114】

本発明はまた、患者におけるＬＨＯＮの治療または予防を追跡評価する方法であって、
本発明のＡＡＶベクターを網膜、網膜下または硝子体内への直接注射によって投与した後
に上記患者から得られた網膜細胞における活性を生体外で測定することを含む、当該方法
も提供する。この方法は治療の有効性の判定を可能にし得る。

【0115】

医薬組成物
本発明のベクターは医薬組成物に製剤化され得る。これらの組成物は、ベクターに加え
て、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤または当業者によく知られてい
る他の材料を含み得る。そのような材料は無毒でなければならず、有効成分の有効性を妨
害するものであってはならない。担体または他の材料の厳密な性質は、投与経路に応じて
、つまり本明細書では網膜、網膜下または硝子体内への直接注射に応じて当業者によって
判定され得る。

【0116】

医薬組成物は典型的には液体形態にある。液体医薬組成物は一般に、液体担体、例えば
、水、石油、動物性もしくは植物性油、鉱油または合成油を含む。生理食塩水、塩化マグ
ネシウム、デキストロースもしくは他の糖類溶液、またはグリコール、例えばエチレング
リコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールを含ませてもよい。あ
る場合には、界面活性剤、例えばプルロニック酸（ＰＦ６８）０．００１％が使用され得
る。

【0117】

患部への注射の場合、有効成分は、発熱物質を含まず好適なｐＨ、等張性及び安定性を
有する水性液剤の形態を取ることになる。当業者であれば、例えば等張ビヒクル、例えば
、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸リンガー注射液を使用して好適な液剤を
調製することが十分に可能である。保存剤、安定化剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／または
他の添加剤を必要に応じて含ませてもよい。

【0118】

遅延放出のためにはベクターを、当技術分野で知られている方法に従って、緩徐な放出
のために製剤化される医薬組成物の中、例えば、生体適合性ポリマーから形成されたマイ
クロカプセルの中、またはリポソーム担体システム中に含ませてもよい。

【0119】

試料
本明細書に記載の方法に使用するのに適する試料は、対象からの核酸試料であり得る。
本明細書中で使用される「核酸試料」には、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの組合
せが含まれ得る。別の実施形態では、「ポリペプチド試料」（例えば、ペプチドもしくは
タンパク質、またはそれらからの断片）を使用して、遺伝子変異体の結果であるアミノ酸
変化が起きたという情報を確認することができる。核酸及びポリペプチドは、血液、唾液
、尿、口腔内壁の粘膜擦過物、去痰薬、血清、涙液、皮膚、組織または毛髪を含むがこれ
らに限定されない１つ以上の試料から抽出され得る。核酸試料は、核酸情報を得るために
アッセイされ得る。本明細書中で使用される「核酸情報」には、核酸配列自体、核酸配列
における遺伝子変異体の存在／非存在、核酸配列に応じて変動する物理特性（例えばＴｍ
）、及び核酸の量（例えばｍＲＮＡコピー数）が含まれる。「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ
、人工ヌクレオチドを含むＤＮＡ、または人工ヌクレオチドを含むＲＮＡのいずれか１つ
を意味する。本明細書中で使用する場合、「精製核酸」には、ｃＤＮＡ、ゲノム核酸の断
片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて生成された核酸、ゲノム核酸の制限酵素処
理によって形成された核酸、組換え核酸、及び化学合成核酸分子が含まれる。「組換え」
核酸分子としては、状況が違えば別個であったはずの２つの配列セグメントを例えば化学
合成によって、または遺伝子工学技術による単離核酸セグメントの操作によって人工的に
組み合わせることによって作られた核酸分子が挙げられる。本明細書中で使用する場合、
「ポリペプチド」にはタンパク質、タンパク質の断片、及びペプチドが、天然供給源から
単離されたか、組換え技術によって製造されたか、または化学的に合成されたかにかかわ
らず含まれる。ポリペプチドは、１つ以上の修飾、例えば、翻訳後修飾（例えば、グリコ
シル化、リン酸化など）または他の任意の修飾（例えばペグ化など）を有し得る。ポリペ
プチドは、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸（例えば、側鎖修飾を有するアミノ酸な
ど）を含有し得る。

【0120】

いくつかの実施形態では、核酸試料は、細胞または組織、例えば細胞株を含み得る。本
明細書に記載の方法を用いて核酸を得ることができる例示的な細胞種としては、限定され
ないが、以下が挙げられる：血球、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、白血球、赤血球、
マクロファージもしくは好中球；筋細胞、例えば、骨格細胞、平滑筋細胞もしくは心筋細
胞；胚細胞、例えば精子もしくは卵子；上皮細胞；結合組織細胞、例えば、脂肪細胞、軟
骨組織；線維芽細胞もしくは骨芽細胞；ニューロン；アストロサイト；間質細胞；臓器特
異的細胞、例えば、腎細胞、膵臓細胞、肝細胞もしくは角化細胞；幹細胞；またはそれら
から発達する任意の細胞。核酸を得ることができる細胞は、血球、または特定タイプの血
球、例えば、造血幹細胞、または造血幹細胞から生まれる細胞、例えば、赤血球、Ｂリン
パ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロフ
ァージもしくは血小板であり得る。大抵は、胚性幹細胞、成体幹細胞または多能性幹細胞
を含むがこれらに限定されない任意のタイプの幹細胞を使用することができる。

【0121】

いくつかの実施形態では、核酸試料はＲＮＡまたはＤＮＡ単離のために処理され得、例
えば、細胞または組織試料中のＲＮＡまたはＤＮＡが核酸試料の他の成分から分離され得
る。細胞は、標準的技術を用いて、例えば、細胞試料を遠心分離に掛けてペレット化した
細胞を例えば緩衝液中、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させることに
よって、核酸試料から採集され得る。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液を遠心分離に
掛けて細胞ペレットを得た後、細胞を溶解させてＤＮＡを抽出することができる。いくつ
かの実施形態では、核酸試料を濃縮及び／または精製してＤＮＡを単離することができる
。対象から得られた全ての核酸試料は、任意の種類のさらなる処理に供されるものを含め
て、対象から得られたものとみなされる。いくつかの実施形態では、例えば、フェノール
抽出法、ＱＩＡＡＭＰ（登録商標）組織キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，
Ｃａｌｉｆ．）、ＷＩＺＡＲＤ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）
、または長期保存に十分適した高度に安定なＤＮＡの精製を可能にし得るものであるＰｕ
ｒｅｇｅｎｅ化学を用いるＱｉａｇｅｎ Ａｕｔｏｐｕｒｅ法を含めて当技術分野で知ら
れている標準的技術及びキットを用いてＲＮＡまたはＤＮＡを核酸試料から抽出すること
ができる。

【0122】

いくつかの実施形態では、対立遺伝子の同一性の判定、またはコピー数の決定は、必ず
というわけではないが、ＲＮＡ及び／またはＤＮＡを含む核酸試料を対象から得ること、
及び／または同一性、コピー数、１つ以上の遺伝子変異体の存在もしくは非存在、及び核
酸試料に由来するゲノムＤＮＡ（すなわち対象のゲノム）の中でのそれらの染色体位置を
評価することを含み得る。

【0123】

判定を実施する個人または組織は、対象からの核酸試料の物理学的分析を実際に行なう
必要はない。いくつかの実施形態では、方法は、第三者による核酸試料の分析によって得
られた情報を使用することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、１つよりも多
い場所で起こるステップを含み得る。例えば、核酸試料は対象から第１の場所で、例えば
、医療機関で、または自己検査キットの場合には対象の自宅で得られ得る。核酸試料は、
同じ場所で、または第２の場所、例えば研究所もしくは他の試験施設で分析され得る。

【0124】

核酸
本明細書に記載の核酸及びポリペプチドは本開示の方法及びキットに使用され得る。い
くつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸及びポリペプチドに特異的に結合するアプ
タマーが本開示の方法及びキットに使用され得る。本明細書中で使用する場合、核酸には
デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）が、単体である
かポリマー中にあるかにかかわらず、天然に存在するか天然に存在しないかにかかわらず
、二本鎖であるか一本鎖であるかにかかわらず、例えば被翻訳遺伝子をコードするか例え
ば調節領域またはその任意の断片、誘導体、模倣体もしくは相補体をコードしないかにか
かわらず含まれ得る。いくつかの実施形態では、核酸は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオ
チド、ポリヌクレオチド、核酸配列、ゲノム配列、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、アンチセ
ンス核酸、ＤＮＡ領域、プローブ、プライマー、遺伝子、調節領域、イントロン、エクソ
ン、オープンリーディングフレーム、結合部位、標的核酸及び対立遺伝子特異的核酸を含
み得る。

【0125】

本明細書中で使用される「プローブ」は、核酸の相補性に基づくハイブリダイゼーショ
ン反応を用いて検体中の核酸を調べるための核酸断片を含む。

【0126】

本明細書中で使用される「ハイブリッド」には、同じ種類の中で、または異なる種類を
またいで、上記核酸のいずれか１つとの間で形成された二本鎖、例えば、ＤＮＡ－ＤＮＡ
、ＤＮＡ－ＲＮＡ、ＲＮＡ－ＲＮＡまたは同様のものが含まれる。

【0127】

本明細書中で使用される「単離」核酸は、（ゲノム配列にみられるような）遺伝子また
はヌクレオチド配列に通常隣接している核酸から分離されており、及び／または（例えば
ＲＮＡライブラリーにみられるような）他の被転写配列を完全もしくは部分的に取り去る
精製がなされている。例えば、本開示の単離核酸は、天然にそれが存在している複雑な細
胞環境に関して、または組換え技術によって生成した場合には培養培地に関して、または
化学合成された場合には化学前駆体もしくは他の化学物質に関して、実質的に単離された
ものであり得る。場合によっては、単離された材料は、組成物、例えば、他の物質を含有
する粗抽出物、緩衝系または試薬混合物の一部を形成していることがある。いくつかの実
施形態では、当技術分野で知られている方法を用いて、例えばポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＰＡＧＥ）またはカラムクロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）によって、材料
を本質的に同質になるまで精製し得る。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に関して、「単離され
た」という用語は、天然にゲノムＤＮＡが会合している染色体から分離した核酸を指すこ
ともある。例えば、単離核酸分子は、当該核酸分子を得る元となる細胞のｇＤＮＡで当該
核酸分子に隣接しているヌクレオチドを約２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１５０ｋｂ、１００
ｋｂ、７５ｋｂ、５０ｋｂ、２５ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１
ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂよりも少なく含有し得る。

【0128】

核酸は他のコード配列または調節配列と融合していてもよく、これは単離されていると
みなされ得る。例えば、ベクター中に含まれている組換えＤＮＡは、本明細書中で使用さ
れる「単離された」の定義に含まれる。いくつかの実施形態では、溶液中の部分的または
実質的に精製されたＤＮＡ分子は勿論のこと、異種宿主細胞または異種生物の中の組換え
ＤＮＡ分子も、単離核酸に含まれ得る。単離核酸はまた、本開示のＤＮＡ分子の生体内及
び試験管内ＲＮＡ転写産物も包含する。単離核酸分子またはヌクレオチド配列は化学的に
、または組換え的手段によって合成され得る。そのような単離ヌクレオチド配列は、例え
ば、コードされるポリペプチドの製造における有用性、（例えば他の哺乳動物種から）相
同配列を単離するためのプローブとしての有用性、（例えば染色体とのｉｎ ｓｉｔｕハ
イブリダイゼーションによる）遺伝子マッピングにおける有用性、または組織（例えばヒ
ト組織）での遺伝子発現の例えばノーザンブロット分析もしくは本明細書に開示される他
のハイブリダイゼーション技術による検出における有用性を有し得る。本開示はまた、選
択的ハイブリダイゼーションなどのために高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーショ
ン条件の下で本明細書に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズする核酸配列にも関す
る。そのような核酸配列は、（例えば高ストリンジェンシー条件下で）対立遺伝子または
配列に特異的なハイブリダイゼーションによって検出及び／または単離され得る。核酸ハ
イブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件及び方法は当業者によく知られて
いる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，
（１９９８）、及びＫｒａｕｓ，Ｍ．ａｎｄ Ａａｒｏｎｓｏｎ，Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２００：５４６－５５６（１９９１）を参照されたく、参照により
これらの教示内容全体を本明細書に援用する。

【0129】

２つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の「同一性」または「同一性パーセン
ト」の計算値は、最適な比較の目的のために配列を整列させる（例えば、第１配列の配列
中にギャップが導入され得る）ことによって決定され得る。対応する位置にあるヌクレオ
チドをその後に比較し、２つの配列の間の同一性パーセントは、配列が共有している同一
位置の数の関数である（つまり、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。例え
ば、第１配列中の位置が第２配列中の対応する位置と同じヌクレオチドで占有されている
場合、分子はその位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つ
の配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数及び各ギャッ
プの長さを考慮に入れた、配列によって共有されている同一位置の数の関数である。

【0130】

いくつかの実施形態では、比較目的のために整列させる配列の長さは、基準配列の長さ
の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なく
とも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。２
つの配列の実際の比較は、よく知られている方法、例えば数学的アルゴリズムを用いるも
のによって成し遂げられ得る。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒ
ｌｉｎ，Ｓ．ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，９０－５８７３－５８７７（１９９３）に記載されている。そのようなアルゴ
リズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．，２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されているようにＮＢＬＡＳＴ及びＸ
ＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴ及びギャッ
プ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えばＮＢＬＡＳＴ）の任
意の該当パラメータを使用することができる。例えば、配列比較のためのパラメータは、
スコア＝１００、ワード長さ＝１２に設定され得るか、または変更され得る（例えば、Ｗ
＝５またはＷ＝２０）。他の例としては、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム、
ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）、ＡＤＶＡＮＣＥ、ＡＤＡＭ、ＢＬＡＴ及びＦＡＳＴＡが挙げ
られる。いくつかの実施形態では、例えばＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒ
ｙｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）の中のＧＡＰプログラムを用いて、２つのアミノ酸配
列の間の同一性パーセントを得ることができる。

【0131】

「プローブ」または「プライマー」は、塩基特異的な様式で核酸分子の相補鎖にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドであり得る。プローブにはプライマーが含まれ得るが、
これは、標的配列の増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応
（ＬＣＲ）を含むがこれらに限定されない方法を用いた鋳型特異的ＤＮＡ合成の開始点と
して働き得る一本鎖オリゴヌクレオチドプローブであり得る。オリゴヌクレオチドは、本
明細書に記載される場合、核酸配列のセグメントもしくは断片、またはそれらの相補体を
含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡセグメントは５～１０，０００連続塩基であ
り得、５、１０、１２、１５、２０または２５ヌクレオチドから１０、１５、２０、２５
、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００または１０，０００ヌクレオチ
ドまでの範囲であり得る。プローブ及びプライマーには、ＤＮＡ及びＲＮＡの他にも、Ｎ
ｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７－１５００（１９
９１）に記載されているようなポリペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれ得る。プローブまた
はプライマーは、核酸分子の少なくとも約１５、典型的には約２０～２５、特定の実施形
態では約４０、５０、６０または７５連続ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチ
ド配列の領域を含み得る。

【0132】

本開示はまた、ヌクレオチド配列であって、本明細書に記載の遺伝子変異体が含有して
いる少なくとも１つの多型性もしくは多型対立遺伝子、または同じ位置に位置する野生型
ヌクレオチド、またはその相補体を含み得るものである当該ヌクレオチド配列を含むかま
たはそれからなる核酸に選択的にハイブリダイズすることができる断片または部分を含有
する、単離核酸、例えばプローブまたはプライマーも提供する。いくつかの実施形態では
、プローブまたはプライマーは、連続ヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列の相
補体と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくと
も９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得る。

【0133】

いくつかの実施形態では、核酸プローブは、本明細書に記載の遺伝子変異体を含有する
症状（例えばＬＨＯＮ）関連遺伝子の相補的領域にハイブリダイズすることができるオリ
ゴヌクレオチドであり得る。本開示の核酸断片は、本明細書に記載されているようなアッ
セイにおいてプローブまたはプライマーとして使用され得る。

【0134】

本開示の核酸、例えば上記のものは、当業者によく知られている標準的な分子生物学技
術を用いて同定及び単離され得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡが増幅され得、及び
／または標識（例えば、放射性標識、蛍光標識）されて例えば生物に由来するｃＤＮＡラ
イブラリーに対するスクリーニングのためのプローブとして使用され得る。ｃＤＮＡはｍ
ＲＮＡから得ることができ、好適なベクターの中に含ませられ得る。例えば、対応するク
ローンを単離してＤＮＡを生体内での切出しの後に得ることができ、クローニングされた
インサートは、適切な分子量のポリペプチドをコードする正しいリーディングフレームを
同定するための当技術分野で認識される方法によって、一方または両方の配向で配列決定
され得る。これらの、または類似する方法を用いて、ポリペプチド、及びポリペプチドを
コードするＤＮＡの単離、配列決定、さらには特性評価を行うことができる。

【0135】

いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の多型性、変異または突然変異、例えば、
一塩基多型（ＳＮＰ）、一塩基変異（ＳＮＶ）、コピー数変異（ＣＮＶ）、例えば、挿入
、欠失、逆位及び転座を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、類縁体、例えば、
ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネ
ート、２－０－メチルリボヌクレオチド、または修飾核酸、例えば修飾された主鎖残基も
しくは結合、または炭水化物、脂質、ポリペプチドもしくは他の材料と組み合わさった核
酸、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）、例えば、クロマチン、リボソーム及びトランスクリ
プトソーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｓｏｍｅｓ）を含み得る。いくつかの実施形態では
、核酸は、様々な構造の核酸、例えば、Ａ型ＤＮＡ、Ｂ型ＤＮＡ、Ｚ体ＤＮＡ、ｓｉＲＮ
Ａ、ｔＲＮＡ及びリボザイムを含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、基準配列と
比較して例えば配列の１つ以上の差異、例えば、付加、欠失及び／または置換を有する、
天然または非天然の多型であり得る。いくつかの実施形態では、基準配列は、公的に入手
できる情報、例えば、Ｕ．Ｃ．Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒ
ｏｗｓｅｒ Ｇａｔｅｗａｙ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇ
Ｇａｔｅｗａｙ）、またはＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ）に基づくものであり得る。いくつかの実施形態では、基準配列は、当技術分野で
よく知られている方法を用いて、例えば基準核酸の配列決定を行うことによって、本開示
の実施者によって決定され得る。

【0136】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の対立遺伝子、ＳＮＰ、ＳＮＶまたはＣＮＶ
にプローブをハイブリダイズさせることができる。いくつかの実施形態では、プローブは
、本明細書に記載のＬＨＯＮに関連する別のマーカー配列に結合し得る。

【0137】

当業者であれば、試験核酸試料からのゲノム配列中に特定の対立遺伝子が存在する場合
にだけ配列特異的ハイブリダイゼーションが起こり得るようなプローブを設計する方法を
知っているであろう。特定の遺伝子変異の遺伝子型判定を行うための市販の技術及び方法
を含めた任意の簡便な遺伝子型判定方法を用いる実施に本開示を単純化することもできる
。

【0138】

対照プローブを使用することもでき、例えば、より変化しにくい配列、例えば染色体の
セントロメアに関連する反復ＤＮＡに結合するプローブを対照として使用することができ
る。いくつかの実施形態では、プローブを商業的供給元から入手することができる。いく
つかの実施形態では、プローブを例えば化学的にもしくは試験管内で合成すること、また
は染色体もしくはゲノムＤＮＡから標準的技術によって作ることができる。いくつかの実
施形態では、使用され得るＤＮＡの供給源には、ゲノムＤＮＡ、クローニングされたＤＮ
Ａ配列、１つのヒト染色体またはその一部を宿主の正常な染色体相補体と併せて含有する
体細胞ハイブリッド、及びフローサイトメトリーまたは顕微切断によって精製された染色
体が含まれる。関心対象の領域は、クローニングによって、またはＰＣＲを用いる部位特
異的増幅によって単離され得る。

【0139】

１つ以上の核酸、例えばプローブまたはプライマーは、例えば直接標識によって標識さ
れて、検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識には、物理的、化学的または生物学的
プロセスによる検出が可能な任意の標識、例えば、放射性標識、例えば３２Ｐまたは３Ｈ
、蛍光標識、例えばＦＩＴＣ、発色団標識、親和性リガンド標識、酵素標識、例えば、ア
ルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはＩ２ガラクトシダーゼ、酵素
補因子標識、ハプテン複合体標識、例えばジゴキシゲニンまたはジニトロフェニル、ラマ
ン信号生成標識、磁気標識、スピン標識、エピトープ標識、例えばＦＬＡＧまたはＨＡエ
ピトープ、発光標識、重原子標識、ナノ粒子標識、電気化学的標識、光散乱標識、球殻標
識、半導体ナノ結晶標識、例えば（米国特許第６，２０７，３９２号に記載される）量子
ドット、及び当業者に知られている他の任意の信号生成ラベルで標識されたプローブが含
まれ得、標識は、二次検出分子を使用してまたは使用せずにプローブを可視化することが
できるものである。ヌクレオチドは、標準的技術、例えば、ニックトランスレーション、
ランダムプライミング及びＰＣＲ標識によってプローブ中に直接組み込まれ得る。本明細
書中で使用する場合、「信号」には、適切な手段で好適に検出及び測定できる蛍光、放射
線、化学発光などを含めた信号が含まれる。

【0140】

検出に有用となる標識部分の非限定的な例としては、限定されないが、好適な酵素、例
えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダー
ゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ；複合物を形成することができる結合対のメンバ
ー、例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、または抗原／抗体複
合物、例えばウサギＩｇＧと抗ウサギＩｇＧ；蛍光団、例えば、ウンベリフェロン、フル
オレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン
、エオジン、緑色蛍光タンパク質、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、
マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー、Ｔｅｘａｓ
Ｒｅｄ、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリ
スリン、蛍光ランタニド錯体、例えば、ユーロピウム及びテルビウムを含むもの、シアニ
ン色素ファミリーメンバー、例えばＣｙ３及びＣｙ５、モレキュラービーコン及びその蛍
光誘導体、ならびに当技術分野で知られている他のもの、例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｌ
ａｋｏｗｉｃｚ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ Ｃｏｒｐ，２ｎｄ ｅｄｉｔ
ｉｏｎ（Ｊｕｌｙ １９９９）、及びｔｈｅ ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈ
ｏａｇｌａｎｄに記載されているもの；ルミノールなどの発光性材料；光散乱またはプラ
ズモン共鳴材料、例えば、金もしくは銀粒子、もしくは量子ドット；または１４Ｃ、１２
３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、Ｔｃ９９ｍ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓもしくは３Ｈを含む放
射性材料が挙げられる。

【0141】

他の標識、例えば主鎖標識を本開示の方法に使用することもできる。主鎖標識は、配列
に無関係に核酸に結合する核酸染色剤を含む。非限定的な例としては、インターカレート
色素、例えばフェナントリジン及びアクリジン（例えば、臭化エチジウム、ヨウ化プロピ
ジウム、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、エチジウムホモダイマー１及び２、
エチジウムモノアジド、ならびにＡＣＭＡ）；いくつかの副溝結合剤、例えばインドール
及びイミダゾール（例えば、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ヘキスト３４５
８０及びＤＡＰＩ）；ならびに幾多の核酸染色剤、例えば、（インターカレートすること
もできる）アクリジンオレンジ、７－ＡＡＤ、アクチノマイシンＤ、ＬＤＳ７５１及びヒ
ドロキシスチルバミジンが挙げられる。上記核酸染色剤は全て、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃなどの供給業者から市販されている。核酸染色剤のさらに他の例とし
ては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ提供の以下の色素が挙げられる：シアニン色素
、例えば、ＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ
、ＰＯＰＯ－１、ＰＯＰＯ－３、ＹＯＹＯ－１、ＹＯＹＯ－３、ＴＯＴＯ－１、ＴＯＴＯ
－３、ＪＯＪＯ－１、ＬＯＬＯ－１、ＢＯＢＯ－１、ＢＯＢＯ－３、ＰＯ－ＰＲＯ－１、
ＰＯ－ＰＲＯ－３、ＢＯ－ＰＲＯ－１、ＢＯ－ＰＲＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－１、ＴＯ－Ｐ
ＲＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－５、ＪＯ－ＰＲＯ－１、ＬＯ－ＰＲＯ－１、ＹＯ－ＰＲＯ－１
、ＹＯ－ＰＲＯ－３、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、Ｓ
ＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＳＹＢＲ
ＤＸ、ＳＹＴＯ－４０、－４１、－４２、－４３、－４４、－４５（青色）、ＳＹＴＯ
－１３、－１６、－２４、－２１、－２３、－１２、－１１、－２０、－２２、－１５、
－１４、－２５（緑色）、ＳＹＴＯ－８１、－８０、－８２、－８３、－８４、－８５（
橙色）、ＳＹＴＯ－６４、－１７、－５９、－６１、－６２、－６０、－６３（赤色）。

【0142】

いくつかの実施形態では、組になっているかまたはなっていない各プローブが個別に可
視化され得るように、異なる色の蛍光団、例えば、７－アミノ－４－メチルクマリン－３
－酢酸（ＡＭＣＡ）、５－（及び－６）－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、リサミンローダ
ミンＢ、５－（及び－６）－カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン－５－イソチオ
シアネート（ＦＩＴＣ）、７－ジエチルアミノクマリン－３－カルボン酸、テトラメチル
ローダミン－５－（及び－６）－イソチオシアネート、５－（及び－６）－カルボキシテ
トラメチルローダミン、７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸、６－［フルオレセイ
ン５－（及び－６）－カルボキサミド］ヘキサン酸、Ｎ－（４，４－ジフルオロ－５，７
－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａジアザ－３－インダセンプロピオン酸、エオジン－５
－イソチオシアネート、エリスロシン－５－イソチオシアネート、ＴＲＩＴＣ、ローダミ
ン、テトラメチルローダミン、Ｒ－フィコエリスリン、Ｃｙ－３、Ｃｙ－５、Ｃｙ－７、
Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｐｈａｒ－Ｒｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ならびにカス
ケードＴＭブルーアセチルアジドが選択され得る。いくつかの実施形態では、蛍光標識プ
ローブは、蛍光顕微鏡と、各蛍光団に適したフィルターで、または複数の蛍光団を観察す
るためのデュアルもしくはトリプルバンドパスフィルタセットを使用することで見ること
ができる。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーなどの技術を用いてプローブ
のハイブリダイゼーション様式を調べることができる。

【0143】

他の実施形態では、プローブは、例えばビオチンもしくはジゴキシゲニンで間接的に標
識され得るか、または放射性同位体、例えば３２Ｐ及び／または３Ｈで標識され得る。非
限定的な例を挙げると、ビオチンで間接的に標識されたプローブは、検出可能マーカーに
結合しているアビジンによって検出され得る。例えば、アビジンを酵素マーカー、例えば
アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させてもよい。いくつ
かの実施形態では、酵素マーカーは、基質及び／または酵素の触媒を使用する比色反応を
用いて検出され得る。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼのための触媒、
例えば５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾ
リウムが使用され得る。いくつかの実施形態では、西洋ワサビペルオキシダーゼのための
触媒、例えばジアミノベンゾエートが使用され得る。

【0144】

製剤、投与経路及び有効用量
本開示のさらに別の態様は、本開示の薬剤または薬剤の合剤を含む医薬組成物のための
製剤、投与経路及び有効用量に関する。そのような医薬組成物は、上記の症状（例えばＬ
ＨＯＮ）を治療するために使用され得る。

【0145】

本開示の化合物は、経口（頬側及び舌下を含む）、直腸、鼻腔、局所、経皮パッチ、肺
、膣、坐剤または非経口（眼内、硝子体内、筋肉内、関節内、クモ膜下腔内、皮内、腹膜
腔内、皮下及び静脈内を含む）投与に適するもの、またはエアゾール化、吸入または通気
による投与に適する形態にあるものを含めた医薬製剤として投与され得る。薬物送達につ
いての全般的情報は、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏ
ｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｐ
ｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍｄ．（
１９９９）の中に見つかり得る。

【0146】

様々な実施形態において、医薬組成物は、担体及び賦形剤（限定されないが、緩衝剤、
炭水化物、マンニトール、ポリペプチド、アミノ酸、酸化防止剤、静菌薬、キレート剤、
懸濁化剤、増粘剤及び／または保存剤を含む）、水、石油由来、動物由来、植物由来また
は合成由来のものを含めた油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、生理
食塩水、デキストロース及びグリセロール水溶液、着香剤、着色剤、減粘剤、ならびに他
の許容される添加剤、アジュバントまたは結合剤、生理学的条件に近づけるための他の薬
学的に許容される補助物質、例えばｐＨ緩衝剤、等張化剤、乳化剤、湿潤剤などを含む。
賦形剤の例としては、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米
、小麦、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、
タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、
水、エタノールなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬調合剤は保存剤を実質
的に含まない。他の実施形態では、医薬調合剤は、少なくとも１つの保存剤を含有し得る
。医薬剤形についての一般的方法論は、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ（Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍ
ｏｒｅ Ｍｄ．（１９９９））の中に見出される。当業者に知られている任意の好適な担
体を採用して本開示の組成物を投与することができるが、担体の種類は投与様式に応じて
様々であり得る、ということは認識され得る。

【0147】

よく知られている技術を用いて化合物をリポソームの中にカプセル封入することもでき
る。生分解性マイクロスフェアを本開示の医薬組成物のための担体として採用することも
できる。好適な生分解性マイクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号
、第５，０７５，１０９号、第５，９２８，６４７号、第５，８１１，１２８号、第５，
８２０，８８３号、第５，８５３，７６３号、第５，８１４，３４４号及び第５，９４２
，２５２号の中に開示されている。

【0148】

化合物はリポソームまたはマイクロスフェア（または微粒子）の中に入った状態で投与
され得る。対象への投与のためのリポソーム及びマイクロスフェアを調製する方法は当業
者によく知られている。米国特許第４，７８９，７３４号には、生物学的材料をリポソー
ムの中にカプセル封入する方法が記載されており、これをもって参照によりその内容を援
用する。本質的には材料を水溶液に溶解させ、適切なリン脂質及び脂質を、必要ならば界
面活性剤と共に添加し、材料を必要に応じて透析または超音波処理する。既知の方法につ
いての総説は、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，“Ｌｉｐｏｓｏｍ
ｅｓ，”Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ，ｐｐ．２．ｓｕｐ．８７－３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７９）によ
って提供されている。

【0149】

ポリマーまたはポリペプチドで形成されたマイクロスフェアは当業者によく知られてお
り、消化管を通ってそのまま血流中に入るように適合させることができる。あるいは、化
合物を組み込んだマイクロスフェアまたはマイクロスフェアの複合材料を数日～数ヶ月の
範囲の期間にわたる緩徐な放出のために埋植することができる。例えば、米国特許第４，
９０６，４７４号、第４，９２５，６７３号及び第３，６２５，２１４号、ならびにＪｅ
ｉｎ，ＴＩＰＳ １９：１５５－１５７（１９９８）を参照されたく、これをもって参照
によりこれらの内容を援用する。

【0150】

眼内または硝子体内注射に適合するように、薬物の濃度が調整され得、溶液のｐＨが緩
衝され得、等張性が調整され得る。

【0151】

本開示の化合物は、好適なビヒクルで無菌液剤または懸濁剤として製剤化され得る。医
薬組成物は、従来のよく知られている滅菌技術で滅菌され得るか、または滅菌濾過され得
る。得られた水溶液を、そのまま使用するために包装してもよいし、または凍結乾燥させ
てもよく、凍結乾燥させた調合剤は投与前に無菌溶液と混ぜ合わされ得る。好適な配合組
成及びさらなる担体については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ“Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏ
ｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ＭＤ）に記載されて
おり、参照によりその教示内容全てを本明細書に援用する。

【0152】

薬剤またはその薬学的に許容される塩は、単独で、または１つ以上の他の薬剤もしくは
１つ以上の他の形態と組み合わせて提供され得る。例えば、製剤は、各薬剤の相対力価、
及び意図する適応症に応じて１つ以上の薬剤を特定の割合で含み得る。例えば、２つの異
なる宿主標的を指向するための組成物において、力価が類似している場合、約１：１の比
率で薬剤が使用され得る。２つの形態を一緒に同一投薬単位、例えば、１つのクリーム剤
、坐剤、錠剤、カプセル剤、エアゾールスプレー剤、もしくは飲料に溶かされる散剤の分
包品に製剤化してもよいし、または各形態を別個の単位、例えば、２つのクリーム剤、２
つの坐剤、２つの錠剤、２つのカプセル剤、錠剤と当該錠剤を溶かすための液剤、２つの
エアゾールスプレー剤、または散剤の分包品と当該散剤を溶かすための液剤などに製剤化
してもよい。

【0153】

「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示に使用される薬剤の生物学的有効性及
び特性を保持しており、生物学またはその他に関して望ましくなくはない塩を意味する。

【0154】

典型的な塩は、無機イオンのもの、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグ
ネシウムイオン及び同類のものなどである。そのような塩としては、塩酸、臭化水素酸、
リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐトルエンスルホン酸、酢酸、フマル酸、コハ
ク酸、乳酸、マンデル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸またはマレイン酸などの無機また
は有機酸との塩が挙げられる。加えて、薬剤（複数可）がカルボキシル基または他の酸性
基を含有する場合、それを無機または有機塩基との薬学的に許容される付加塩に変換する
ことができる。好適な塩基の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニ
ア、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノール
アミン、トリエタノールアミンなどが挙げられる。

【0155】

薬学的に許容されるエステルまたはアミドは、本開示に使用される薬剤の生物学的有効
性及び特性を保持しており、生物学またはその他に関して望ましくなくはないものを指す
。典型的なエステルとしては、エチル、メチル、イソブチル、エチレングリコールなどが
挙げられる。典型的なアミンとしては、無置換アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミ
ドなどが挙げられる。

【0156】

いくつかの実施形態では、薬剤は、１つ以上の例えば上記のような他の化合物、形態及
び／または薬剤と組み合わせて投与され得る。１つ以上の他の活性剤を含む医薬組成物は
、特定のモル比を有するように製剤化され得る。例えば、第１活性剤と他の活性剤との約
９９：１～約１：９９のモル比が用いられ得る。実施形態のある部分集団において、第１
活性剤：他の活性剤のモル比の範囲は、約８０：２０～約２０：８０、約７５：２５～約
２５：７５、約７０：３０～約３０：７０、約６６：３３～約３３：６６、約６０：４０
～約４０：６０、約５０：５０、及び約９０：１０～約１０：９０から選択される。第１
活性剤：他の活性剤のモル比は約１：９であってもよく、いくつかの実施形態では約１：
１であってもよい。２つの薬剤、形態及び／または化合物を一緒に同一投薬単位、例えば
、１つのクリーム剤、坐剤、錠剤、カプセル剤、もしくは飲料に溶かされる散剤の分包品
に製剤化してもよいし、または各々の薬剤、形態及び／または化合物を別個の単位、例え
ば、２つのクリーム剤、坐剤、錠剤、２つのカプセル剤、錠剤と当該錠剤を溶かすための
液剤、エアゾールスプレー剤 散剤の分包品と当該散剤を溶かすための液剤などに製剤化
してもよい。

【0157】

必要または望ましいとされる場合には、薬剤及び／または薬剤の合剤は、さらに他の薬
剤と共に投与され得る。本開示の薬剤及び／または薬剤の合剤と共投与され得る薬剤の選
択は、治療する症状に少なくとも部分的に依拠し得る。

【0158】

薬剤（複数可）（またはその薬学的に許容される塩、エステルまたはアミド）は、それ
自体で、または混和物もしくは混合物の中に活性薬剤（複数可）が１つ以上の薬学的に許
容される担体と共に入っている医薬組成物の形態で、投与され得る。医薬組成物は、本明
細書中で使用される場合、対象への投与のために調製される任意の組成物であり得る。本
開示に係る用途のための医薬組成物は、賦形剤、希釈剤及び／または助剤、例えば投与さ
れ得る調合剤に活性剤を加工するのを容易にするものを含ませて、１つ以上の生理学的に
許容される担体を使用する従来の方法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与
形態によって少なくとも部分的に決まり得る。本開示において有用となる薬剤（複数可）
またはその薬学的に許容される塩、エステルもしくはアミドは、経口、頬側、局所、直腸
、経皮、経粘膜、皮下、静脈内、眼内、硝子体内及び筋肉内への適用ならびに吸入による
ものを含めた複数の投与経路または投与様式を用いて対象に送達され得る。

【0159】

いくつかの実施形態では、薬剤を液剤にするのに油または非水性溶媒を、例えば大きな
親油性部分の存在ゆえに使用することがある。あるいは、乳剤、懸濁剤または他の調合剤
、例えばリポソーム調合剤が用いられ得る。リポソーム調合剤に関しては、症状の治療の
ためのリポソームを調合する任意の既知の方法を用いることができる。例えば、参照によ
り本明細書に援用されるＢａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：
２３８－２５２（１９６５）、及びＳｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４－４１９８（１９７８）を参照されたい。リポ
ソームにリガンドを結合させてこれらの組成物を特定の作用部位へ差し向けることもでき
る。本開示の薬剤を食品、例えば、クリームチーズ、バター、サラダドレッシングまたは
アイスクリームの中に組み込んで可溶化、投与、及び／または特定対象集団におけるコン
プライアンスを容易にすることもできる。

【0160】

本開示の化合物は、（例えば、注射、例えば眼内または硝子体内注射による）非経口投
与のために製剤化され得、アンプル、プレフィルドシリンジ、少量点滴液の単位用量形態
で、または保存剤を添加して複数回用量容器で、提供され得る。組成物は、油性または水
性ビヒクルによる懸濁剤、液剤または乳剤など、例えば水性ポリエチレングリコールによ
る液剤の形態を取り得る。

【0161】

注射製剤の場合、ビヒクルは、水溶液または油懸濁液、またはゴマ油、トウモロコシ油
、綿実油もしくはピーナッツ油を使用したエマルジョン、さらにはエリキシル、マンニト
ール、デキストロース、または無菌水溶液及び類似する医薬ビヒクルを含めた、当技術分
野で好適であると知られているものから選択され得る。製剤は、ポリ（乳酸－コ－グリコ
ール酸）などの生体適合性、生分解性であるポリマー組成物を含むこともある。これらの
材料を、薬物が装填されてさらに被覆または誘導体化がなされたマイクロまたはナノスフ
ェアに作り替えて、優れた持続放出性能を提供することができる。眼周囲または眼内注射
に適するビヒクルとしては、例えば、注射グレード水による治療剤の懸濁液、リポソーム
、及び親油性物質に適するビヒクルが挙げられる。眼周囲または眼内注射のための他のビ
ヒクルは当技術分野でよく知られている。

【0162】

いくつかの実施形態では、組成物は、慣例的手順に従って人間への静脈内投与に適合し
た医薬組成物として製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張
緩衝水による液剤である。必要な場合には組成物は、可溶化剤、及び注射部位の疼痛を和
らげるためのリドカインなどの局所麻酔薬をさらに含み得る。一般的には成分を、別個に
、あるいは混ぜ合わせて単位剤形で、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物を密封容器、例えばアンプルまたは小袋に入れて活性剤の量を表示したものとして
供給する。組成物を輸注によって投与することになる場合、それは、無菌医薬品グレード
水または生理食塩水を含有する輸注ボトルを使用して分注され得る。組成物を注射によっ
て投与する場合、成分が投与前に混合され得るように、注射用無菌水または生理食塩水の
アンプルが提供され得る。

【0163】

投与を注射によって行う場合、活性化合物は、水溶液、具体的には生理学的に適合する
緩衝液、例えば、ハンクス液、リンガー液または緩衝生理食塩水で製剤化され得る。液剤
は、製剤用剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤及び／または分散剤を含有し得る。あるいは
、活性化合物を、使用前に好適なビヒクル、例えば発熱物質を含まない無菌水で戻すため
の粉末形態とすることもできる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アジュバント
、またはペプチドによって刺激された免疫応答を増強するために添加される他の任意の物
質を含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ペプチドに対する免疫応答を阻
害する物質を含む。製剤化の方法は当技術分野で知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔ
ｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ Ｐに開示されている
。

【0164】

いくつかの実施形態では、眼障害は、本開示の薬剤または薬剤の合剤を含む眼科用の液
剤、懸濁剤、軟膏剤または挿入剤によって効果的に治療され得る。点眼薬は、有効成分を
無菌水溶液、例えば、生理食塩水、緩衝液などに溶解させること、または使用前に溶かす
粉末組成物と混ぜ合わせることによって調製され得る。当技術分野で知られている他のビ
ヒクル、例えば、限定されないが、平衡塩溶液、生理食塩水、水溶性ポリエーテル、例え
ばポリエチレングリコール、ポリビニル、例えばポリビニルアルコール及びポビドン、セ
ルロース誘導体、例えばメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース、石
油誘導体、例えば鉱油及び白色ワセリン、動物性油脂、例えばラノリン、アクリル酸のポ
リマー、例えばカルボキシポリメチレンゲル、植物性油脂、例えばピーナッツ油、及び多
糖類、例えばデキストラン、及びグリコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸ナトリウム
を選択してもよい。所望により、点眼薬に通常使用される添加剤を使用してもよい。その
ような添加剤としては、等張化剤（例えば塩化ナトリウムなど）、緩衝剤（例えば、ホウ
酸、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、保存剤（例えば、塩化ベ
ンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノールなど）、増粘剤（例えば糖類、
例えばラクトース、マンニトール、マルトースなど；例えばヒアルロン酸またはその塩、
例えばヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウムなど；例えばムコ多糖、例えば硫
酸コンドロイチンなど；例えばポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、
架橋ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、または当業者に知られている他の薬剤
）が挙げられる。

【0165】

本発明の組成物の成分の溶解性を界面活性剤、または組成物中の他の適切な共溶媒によ
って向上させることができる。そのような共溶媒としては、ポリソルベート２０、６０及
び８０、プルロニックＦ６８、Ｆ－８４及びＰ－１０３、シクロデキストリン、または当
業者に知られている他の薬剤が挙げられる。そのような共溶媒は、重量表示で約０．０１
％～２％のレベルで使用され得る。

【0166】

本開示の組成物は複数回用量形態で包装され得る。使用中の微生物汚染を防ぐためには
保存剤が好まれ得る。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、ク
ロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデ
ト酸二ナトリウム、ソルビン酸、Ｏｎａｍｅｒ Ｍ、または当業者に知られている他の薬
剤が挙げられる。従来の眼用製品においてそのような保存剤は０．００４～０．０２％の
レベルで使用され得る。本出願の組成物において保存剤、好ましくは塩化ベンザルコニウ
ムは、重量表示で０．００１％から０．０１％未満まで、例えば０．００１～０．００８
％、好ましくは約０．００５％のレベルで使用され得る。塩化ベンザルコニウムの０．０
０５％の濃度は本開示の組成物を微生物による攻撃から守るのに十分であり得ることが見
出された。

【0167】

いくつかの実施形態では、本開示の薬剤は、懸濁形態ではなく可溶性形態で送達される
が、これによって作用部位へのより迅速で定量的な吸収が可能になる。概して、ゼリー剤
、クリーム剤、ローション剤、坐剤及び軟膏剤などの製剤が面に本開示の薬剤へのより長
い間の曝露を提供し得る一方、液体製剤、例えばスプレー剤はより迅速な短期間の曝露を
提供する。

【0168】

加えて、局所、眼内、眼周囲または全身投与のための挿入剤に付着した、含まれた、ま
たは結合した持続放出製剤に使用するために、本開示の化合物を放出可能に生体適合性ポ
リマーに結合させ得ることが考えられる。生体適合性ポリマーからの制御放出を水溶性ポ
リマーと共に利用して点眼用製剤を形成することもできる。生体適合性ポリマー、例えば
ＰＬＧＡマイクロスフェアまたはナノスフェアなどからの制御放出を、持続放出投与のた
めの眼内への埋植または注射に適した製剤に利用することができ、また、任意の好適な生
分解性及び生体適合性ポリマーを使用することができる。

【実施例0169】

以下の例示的実施形態によって本発明をさらに説明する。これらの実施例が、本発明を
例示するが本発明の範囲を限定しないことを意図したものであるにすぎないことは理解さ
れるべきである。以下の実施例では、別段の指示がない限り、例えばｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎ
ｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ｐｒｅｓｓ，１９８９）の中で開示されている方法及び条件、または製造業者によ
って推奨される条件が使用され得る。

【0170】

実施例１－ＮＤ４プラスミド及びウイルスの作製
１．１ プラスミド作製

【0171】

ヒトＮＤ４のヌクレオチド配列（配列番号６）を、米国国立生物工学情報センターの基
準配列ｙｐ＿００３０２４０３５．１に基づいて得た。非最適化ミトコンドリア指向性配
列ＣＯＸ１０のための配列は配列番号１である。転写効率及び翻訳効率を改善すべく、ミ
トコンドリア指向性配列ＣＯＸ１０のための最適化配列（ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０、配列番号
２）、及びヒトＮＤ４のコード配列（ｏｐｔ＿ＮＤ４、配列番号７）を設計した。非最適
化ＣＯＸ１０－ＮＤ４との相同性が約７５．８９％である最適化ＣＯＸ１０－ＮＤ４配列
に３プライム非翻訳領域（すなわち３’ＵＴＲ、配列番号１３）を続けて、（配列番号３
１に示される）組換え核酸ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ４－３’ＵＴＲを得た。

【0172】

合成された組換え核酸ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ４－３’ＵＴＲをＰＣＲ増幅
によってアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに組み込んだ（図１）。ｏｐｔ＿ＣＯＸ
１０－ｏｐｔ＿ＮＤ４－３’ＵＴＲをＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ制限酵素で切断して付着末端
を形成し、次いでＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ制限部位を有するＡＡＶベクター、例えばｐＳＮ
ａＶベクターの中に埋め込んで、ｐＳＮａＶ／ｒＡＡＶ２／２－ＮＤ４プラスミド（すな
わち、ｐＡＡＶ２最適化ＮＤ４プラスミド）を生成した。ｐＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４プ
ラスミドを非最適化ｐＡＡＶ２－ＮＤ４プラスミドと比較した。

【0173】

予備スクリーニング及び同定ステップはＣＮ１０２６３４５２７Ｂと同様とし、ＬＢプ
レート内でプラスミドを３７℃で培養した。青色コロニー及び白色コロニーが出現し、白
色コロニーは組換えクローンであった。白色コロニーを採集し、１００ｍｇ／Ｌのアンピ
シリン含有ＬＢ培養培地を添加し、３７℃で８時間、２００ｒｐｍで培養し、その後、Ｂ
ｉｏｍｉｇａプラスミド抽出プロトコールに従ってプラスミドを培養細菌培地から抽出し
た。プラスミドの同定はＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ制限酵素を使用して裏付けられた。

【0174】

１．２ 細胞トランスフェクション

【0175】

トランスフェクションの前日にＨＥＫ２９３細胞を２２５ｃｍ^２の細胞培養ボトルに３
．０×１０^７細胞／ｍｌの播種密度で播種し、１０％ウシ血清を含むダルベッコ改変イー
グル培地（ＤＭＥＭ）を培養培地として３７℃で５％ＣＯ_２のインキュベータ内で一晩経
過させた。トランスフェクションの日に培養培地を、１０％のウシ血清を含む新しいＤＭ
ＥＭに替えた。

【0176】

細胞が８０～９０％に成長してから、培養培地を捨て、ＰｌａｓｍｉｄＴｒａｎｓ（Ｖ
ＧＴＣ）トランスフェクションキットを使用して細胞にｐＡＡＶ２－ＮＤ４、及びｐＡＡ
Ｖ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４プラスミドをトランスフェクトした。詳細なトランスフェクション
プロトコールはＣＮ１０２６３４５２７Ｂの実施例１に記載されていた。トランスフェク
ションの４８時間後に細胞を回収した。

【0177】

１．３ 組換えアデノ随伴ウイルスの回収、濃縮及び精製

【0178】

ウイルス回収：１）ドライアイスエタノール（または液体窒素）槽及び３７℃の水槽を
用意し、２）トランスフェクトされた細胞を培地と一緒に１５ｍｌ遠心分離チューブに回
収し、３）細胞を１０００ｒｐｍ／分で３分間遠心分離に掛け、細胞及び上清を分離し、
上清を別に保存し、細胞を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、４）細胞懸濁液をドライアイス
－エタノール槽及び３７℃の水槽に交互に繰り返し移して４回の凍結乾燥を各々１０分間
行い、各解凍後には軽く振盪を行った。

【0179】

ウイルス濃縮：１）細胞破片を１０，０００ｇ遠心分離によって除去し、遠心分離後の
上清を新しい遠心分離チューブへ移し、２）不純物を０．４５μｍフィルターによる濾過
で除去し、３）各々容積の１／２の１Ｍ ＮａＣｌ及び１０％ ＰＥＧ８０００溶液を試
料に添加し、均一に混合し、４℃で一晩保存し、４）遠心分離を１２，０００ｒｐｍで２
時間行った後に上清を捨て、ウイルス沈澱物を適量のＰＢＳ溶液に完全溶解させてから０
．２２μｍのフィルターで試料を滅菌し、５）ｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼを添加し
て残留プラスミドＤＮＡを除去した（終濃度５０Ｕ／ｍｌ）。チューブを数回逆さまにし
て完全に混合し、その後、３７℃で３０分間インキュベートし、６）試料を０．４５μｍ
の濾過ヘッドで濾過し、濾液は濃縮ｒＡＡＶ２ウイルスである。

【0180】

ウイルス精製：１）濃縮ウイルス溶液にＣｓＣｌを１．４１ｇ／ｍｌの密度（屈折率１
．３７２）になるまで添加し、２）超遠心分離チューブに試料を加え、予め調製しておい
た１．４１ｇ／ｍｌのＣｓＣｌ溶液をチューブに充填し、３）遠心分離を１７５，０００
ｇで２４時間行って密度勾配を形成した。異なる密度の試料の逐次回収を実施した。濃縮
されたｒＡＡＶ２粒子を回収し、４）プロセスをもう１回繰り返した。ウイルスを１００
ｋＤａの透析バッグに装填し、４℃で一晩、透析／脱塩した。濃縮及び精製された組換え
アデノ随伴ウイルスはｒＡＡＶ２－ＮＤ４及びｒＡＡＶ２最適化ＮＤ４であった。

【0181】

同様に、他のミトコンドリア指向性配列（ＭＴＳ）、例えばＯＰＡ１（配列番号５）を
使用して上記実施例のＣＯＸ１０を置き換えて、組換えプラスミドを有するＡＡＶを作り
出すことができる。

【0182】

実施例２－ウサギの眼におけるｒＡＡＶ２の硝子体内注射
１２羽のウサギを２つの群：ｒＡＡＶ２－ＮＤ４、及びｒＡＡＶ２最適化ＮＤ４に分け
た。毛様体扁平部で角膜縁の３ｍｍ外側から穿刺して硝子体腔内にウイルス溶液（１×１
０^１０ｖｇ／０．０５ｍＬ）を注入した。硝子体内注射後に細隙灯検査及び眼底撮影検査
を用いて眼を調べた。注射は３０日間とした。各群においてＲＴ－ＰＣＲ検出及びイムノ
ブロッティングをそれぞれ行った。

【0183】

実施例３－ＮＤ４の発現に関するリアルタイムＰＣＲ
トランスフェクトされたｒＡＡＶ２－ＮＤ４及びｒＡＡＶ２最適化ＮＤ４ウサギ視神経
細胞からのＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ全ＲＮＡ抽出キットを使用して抽出した。抽出された
ＲＮＡの逆転写によってｃＤＮＡ鋳型を合成した。

【0184】

ＮＣＢＩ保存構造ドメイン解析ソフトウェアを使用してＮＤ４の保存構造を解析して、
設計プライマーによって増幅される断片が非保存領域に位置することを確保し、その後、
蛍光定量的ＰＣＲプライマー設計原理に従ってプライマーを設計した：
β－アクチン－Ｓ：ＣＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＧＡＣＡＴ（配列番号８５）、
β－アクチン－Ａ：ＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＣ（配列番号８６）、
ＮＤ４－Ｓ：ＣＴＧＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣ（配列番号８７）、
ＮＤ４－Ａ：ＡＧＴＧＣＧＴＴＣＧＴＡＧＴＴＴＧＡＧ（配列番号８８）。

【0185】

蛍光定量的ＰＣＲ反応及びプロトコール：リアルタイムＰＣＲ検出システムで蛍光定量
的ＰＣＲを測定した。０．２ｍｌのＰＣＲ反応チューブに１２．５μｌのＳＹＢＲ Ｇｒ
ｅｅｎ、８μｌのｄｄＨ_２Ｏ、１μｌの各プライマー、及び２．５μｌのｃＤＮＡ試料を
入れて２５μｌの総体積にした。各試料を標的遺伝子の増幅及び基準遺伝子β－アクチン
の増幅のために使用し、各増幅を３回繰り返した。取扱いによる変動を最小限に抑えるた
めに、共通の試薬を一緒に添加し、その後、別々に分けた。蛍光定量的ＰＣＲを行った：
予備変性を９５℃で１秒間とし、変性を９４℃で１５秒間とし、アニーリングを５５℃で
１５秒間とし、伸長を７２℃で４５秒間とした。合計４０サイクルの増幅反応を実施し、
各サイクルの伸長期に蛍光信号取得を行った。反応後、９４℃から５５℃までの融解曲線
分析を行った。相対定量法を採用することによってベータ－アクチンとの遺伝子発現レベ
ルの差の研究を内部標準遺伝子として用いた。

【0186】

図２に示すように、ｒＡＡＶ２－ＮＤ４及びｒＡＡＶ２最適化ＮＤ４の相対発現レベル
（ｍＲＮＡレベル）はそれぞれ、０．４２±０．２３、及び０．５７±０．６２であった
（ｐ＜０．０５、図２）。結果は、予想外なことに、最適化ＮＤ４（ｏｐｔ＿ＮＤ４、配
列番号７）コード核酸配列及び対応する組換え核酸（ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ
４－３’ＵＴＲ、配列番号３１）が転写効率を驚くほど向上させてｒＡＡＶ２最適化ＮＤ
４の発現を約３６％増強したことを示している。結果は、ｒＡＡＶ２最適化ＮＤ４の転写
効率が有意により高いことを示していた。

【0187】

実施例４－ＮＤ４発現のイムノブロッティング検出
ｒＡＡＶ２最適化ＮＤ４及びｒＡＡＶ２－ＮＤ４をトランスフェクトされたそれぞれの
ウサギ神経細胞からＮＤ４タンパク質を精製した。１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動の後、免疫検出のためにポリフッ化ビニリデン膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＨＥＲ－ｈｅｒｃ
ｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）に転写した。β－アクチンを内部標準遺伝子として使用した。
フィルム片を自動画像解析機（Ｌｉ－Ｃｏｒ、Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）で観察し
、同試料の対応光学濃度値を得るべく積分正規化法によるタンパク質バンドの積分光学濃
度を用いて解析した。統計解析ソフトウェアＳＰＳＳ１９．０をデータ解析のために用い
た。

【0188】

結果を図３に示した。ｒＡＡＶ２最適化ＮＤ４（左黒色柱）及びｒＡＡＶ２－ＮＤ４に
ついて、ＮＤ４の平均相対タンパク質発現レベルはそれぞれ０．３２±０．１１及び０．
６８±０．２０であった（ｐ＜０．０１、図３）。結果は、予想外なことに、最適化ＮＤ
４コード核酸配列（ｏｐｔ＿ＮＤ４、配列番号７）及び対応する組換え核酸（ｏｐｔ＿Ｃ
ＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ４－３’ＵＴＲ、配列番号３１）が翻訳効率を驚くほど向上させ
てｒＡＡＶ２最適化ＮＤ４の発現を約１１２％増強したことを示している。結果は、ｒＡ
ＡＶ２最適化ＮＤ４の翻訳効率が有意により高いことも示していた。

【0189】

実施例５－ウサギ眼圧及び眼底撮影
手術から１、３、７及び３０日目にウサギの両群に細隙灯検査及び眼圧測定を実施した
。全てのウサギにおいて、明らかな異常、結膜充血、分泌物または眼内炎は認められず、
眼圧は上昇しなかった。

【0190】

眼底撮影結果を図４に示した。ウサギの視神経及び網膜血管に明らかな損傷または合併
症はなく、標準的な硝子体内注射が顕著な炎症反応または他の合併症を伴わない安全なも
のであることが示唆された。

【0191】

実施例６－ヒト臨床試験
患者の２つの群を試験した：１）対照群として、２０１１年～２０１２年に９名の患者
の片眼に１×１０^１０ｖｇ／０．０５ｍＬのｒＡＡＶ２－ＮＤ４の硝子体内注射を行い、
２）実験群として、２０１７年～２０１８年１月に２０名の患者の片眼に１×１０^１０ｖ
ｇ／０．０５ｍＬのｒＡＡＶ２最適化ＮＤ４の硝子体内注射を行った。統計解析ＳＰＳＳ
１９．０を用いて臨床試験の結果を解析した。

【0192】

２つの群の比較を表２に示す。最速視力改善時間は実験群では１ヶ月であったが、これ
は対照群の３ヶ月よりも有意に速く（ｐ＜０．０１）；実験群での最適視力回復は１．０
であったが、これは対照群の０．８よりも明らかに高く（ｐ＜０．０１）；実験群での平
均視力回復は０．５８２±０．０８６であったが、これは対照群の０．３４４±０．０６
２よりも明らかに高かった（ｐ＜０．０１）。眼底撮影結果を図５に示した。実験群及び
対照群において患者の視神経及び網膜血管に明らかな損傷または合併症はなく、ｒＡＡＶ
２最適化ＮＤ４及びｒＡＡＶ２－ＮＤ４の硝子体内注射の安全性が示唆された。

【表2】

【0193】

実施例７－ミトコンドリア指向性配列としてのＯＰＡ１
実施例１～６の組換え核酸（ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ４－３’ＵＴＲ、配列
番号３１）中のＣＯＸ１０及び３’ＵＴＲ配列をそれぞれ、別のミトコンドリア標的配列
であるＯＰＡ１（配列番号５）、及び別の３’ＵＴＲ配列である３’ＵＴＲ^＊（配列番号
１４）で置き換えて新たな組換え核酸ＯＰＡ１－ｏｐｔ＿ＮＤ４－３’ＵＴＲ^＊（配列番
号７４）を生成した。

【0194】

実験方法は実施例１～６と同じとし、組換え核酸ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０－ｏｐｔ＿ＮＤ４
－３’ＵＴＲ（配列番号３１）をＯＰＡ１－ｏｐｔ＿ＮＤ４－３’ＵＴＲ^＊（配列番号７
４）で置き換えた。最適化ＮＤ４配列は、非最適化ＮＤ４（ＣＯＸ１０－ＮＤ４－３’Ｕ
ＴＲ、配列番号１５）と比較して有意に改善された転写及び翻訳効率、発現レベル、なら
びにＬＨＯＮの治療におけるより高い有効性及び安全性を有することが分かった。

【0195】

実施例８－最適化ＮＤ４配列ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊
核酸ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０^＊－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊－３’ＵＴＲ（配列番号４７）を使用し
て実施例１～６と同様の実験方法に従った。実施例１と同様の手順に従って、蛍光タンパ
ク質ＥＧＦＰで標識されたウイルスを、ｒＡＡＶ２－ＮＤ４－ＥＧＦＰ、及びｒＡＡＶ２
－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊－ＥＧＦＰとして作製した。

【0196】

凍結２９３Ｔ細胞を起こし、Ｔ７５フラスコ内で約９０％に成長させた。細胞をＤＭＥ
Ｍ完全培地で沈降及び再懸濁させて５×１０^４細胞／ｍＬの細胞密度にした。約１００μ
ｌの細胞懸濁液（約５０００細胞）を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。３７℃及
び５％ＣＯ_２の下で細胞を培養し、５０％に成長させた。約０．０２μｌのＰＢＳを２×
１０^１０ｖｇ／０．０２μｌのウイルスｒＡＡＶ２－ＮＤ４－ＥＧＦＰ及びｒＡＡＶ２－
ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊－ＥＧＦＰとそれぞれ混合した。４８時間後、蛍光顕微鏡観察及びＲＴ
－ＰＣＲ検出及びイムノブロッティング実験を実施した。図６に示すように、ＥＧＦＰの
発現は好結果であり、ＥＧＦＰ遺伝子を保有するｒＡＡＶを２９３Ｔ細胞にトランスフェ
クトすることに成功したこと、ならびにｒＡＡＶ２－ＮＤ４－ＥＧＦＰ及びｒＡＡＶ２－
ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊－ＥＧＦＰの発現が好結果であったことを示唆していた。

【0197】

以下のプライマーを使用して実施例３と同様のリアルタイムＰＣＲ試験に従った：
β－アクチン－Ｓ：ＣＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＧＡＣＡＴ（配列番号８５）、
β－アクチン－Ａ：ＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＣ（配列番号８６）、
ＮＤ４－Ｓ：ＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧＣ（配列番号１０７）、
ＮＤ４－Ａ：ＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧ（配列番号１０８）。

【0198】

結果は、予想外なことに、最適化ＮＤ４^＊（ｏｐｔ＿ＮＤ４、配列番号８）コード核酸
配列及び対応する組換え核酸（ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０^＊－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊－３’ＵＴＲ、
配列番号４７）が転写効率を驚くほど向上させてｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４の発現を約
２０％増強したことを示している。結果は、ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４の転写効率が有
意により高いことを示していた。

【0199】

図７は、２９３Ｔ細胞におけるＮＤ４発現を示す。ｒＡＡＶ２＿ＮＤ４ではＮＤ４タン
パク質の平均発現が０．３６である一方、ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊ではＮＤ４タン
パク質の平均発現が１．６５であり、これはｒＡＡＶ２－ＮＤ４群よりも約４．６倍高い
（ｐ＜０．０１）（図８参照）。

【0200】

図９は、ウサギ視神経細胞におけるＮＤ４発現を示す。ｒＡＡＶ２－ＮＤ４ではＮＤ４
タンパク質の平均発現が０．１６である一方、ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊ではＮＤ４
タンパク質の平均発現が０．４８であり、これはｒＡＡＶ２－ＮＤ４群よりも約３倍高い
（ｐ＜０．０１）（図１０参照）。

【0201】

実施例５と同様に、手術から１、３、７及び３０日目にウサギの両群に細隙灯検査及び
眼圧測定を実施した。全てのウサギにおいて、明らかな異常、結膜充血、分泌物または眼
内炎は認められず、眼圧は上昇しなかった。

【0202】

ｒＡＡＶ２－ＮＤ４及びｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊についての眼底撮影結果を図１
１に示した。ウサギの視神経及び網膜血管に明らかな損傷または合併症はなく、標準的な
硝子体内注射が顕著な炎症反応または他の合併症を伴わない安全なものであることが示唆
された。

【0203】

細隙灯検査及び眼圧測定の後に両方のウサギ群からの眼球を取り出した。眼球を固定し
、パラフィンを使用して脱水した。組織を視神経の方向に沿って病理学的に薄片にした。
さらなる脱水の後、ヘマトキシリン及びエオジンを使用して組織試料を染色した。顕微鏡
検査結果を図１２に示す。ＨＥ染色結果に示されるとおり、ウサギ網膜神経節線維層は損
傷を受けず、神経節細胞の数は減少せず、硝子体内注射が網膜毒性または神経損傷を生じ
ず安全に用いられ得ることが示唆された。

【0204】

実験方法は実施例８と同じとし、組換え核酸ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０^＊－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊
－３’ＵＴＲ（配列番号４７）をＯＰＡ１－ｏｐｔ＿ＮＤ４^＊－３’ＵＴＲ^＊（配列番号
７６）で置き換えた。最適化ＮＤ４配列は、非最適化ＮＤ４（ＣＯＸ１０－ＮＤ４－３’
ＵＴＲ、配列番号１５）と比較して有意に改善された転写及び翻訳効率、発現レベル、な
らびにＬＨＯＮの治療におけるより高い有効性及び安全性を有することが分かった。

【0205】

実施例９－ＮＤ６配列
（５’から３’に向かって）ＣＯＸ１０（配列番号１）、ＮＤ６（配列番号９）及び３
’ＵＴＲ（配列番号１３）の組合せである核酸ＣＯＸ１０－ＮＤ６－３’ＵＴＲ（配列番
号２１）を使用して実施例１～６と同様の実験方法に従った。

【0206】

ＣＯＸ１０－ＮＤ６－３’ＵＴＲ（配列番号２１）のためのプラスミドスクリーニング
には以下のプライマーを使用した：
ＮＤ６－Ｆ：ＡＴＧＡＴＧＴＡＴＧＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧ（配列番号８９）、
ＮＤ６－Ｒ：ＣＴＡＡＴＴＣＣＣＣＣＧＡＧＣＡＡＴＣＴＣ（配列番号９０）。

【0207】

トランスフェクトされスクリーニングされたウイルスｒＡＡＶ２－ＮＤ６は２．０×１
０^１１ｖｇ／ｍＬのウイルス力価を有していた。実施例５と同様に、手術から１、７及び
３０日目にウサギの３つの群（Ａ：ｒＡＡＶ２－ＮＤ６、Ｂ：ｒＡＡＶ－ＧＦＰ、Ｃ：Ｐ
ＢＳ）に細隙灯検査及び眼圧測定を実施した（図１３）。全てのウサギにおいて、明らか
な異常、結膜充血、分泌物または眼内炎は認められず、眼圧は上昇しなかった。

【0208】

以下のプライマーを使用して実施例３と同様のリアルタイムＰＣＲ試験に従った：
β－アクチン－Ｓ：ＣＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＧＡＣＡＴ（配列番号８５）、
β－アクチン－Ａ：ＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＣ（配列番号８６）、
ＮＤ６－Ｓ：ＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＴＡＧＴＡＡＴＧ（配列番号９１）、
ＮＤ４－Ａ：ＴＧＣＣＴＣＡＧＧＡＴＡＣＴＣＣＴＣ（配列番号９２）。

【0209】

結果は、ｒＡＡＶ２－ＮＤ６及び対照（ＰＢＳ）においてＮＤ６の発現がそれぞれ、０
．５９±０．０６、及び０．４１±０．０３であったことを示している。結果は、ｒＡＡ
Ｖ２－ＮＤ６の転写効率が対照群よりも高いことを示した（ｐ＜０．０１）。

【0210】

実施例１０－最適化ｏｐｔ＿ＮＤ６配列
（５’から３’に向かって）ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０^＊（配列番号３）、ｏｐｔ＿ＮＤ６（
配列番号１０）及び３’ＵＴＲ（配列番号１３）の組合せである核酸ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０
^＊－ｏｐｔ＿ＮＤ６－３’ＵＴＲ（配列番号５１）を使用して実施例１～６と同様の実験
方法に従った。

【0211】

ウサギの３つの群に、Ａ：１０^１０ｖｇ／５０μｌのｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ６、Ｂ
：１０^１０ｖｇ／５０μｌのｒＡＡＶ２－ＮＤ６（実施例９）、及びＣ：１０^１０ｖｇ／
５０μｌのｒＡＡＶ２－ＥＧＦＰを注射した。図１４は、ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ６（
Ａ）、ｒＡＡＶ２－ＮＤ６（Ｂ）、ｒＡＡＶ－ＥＧＦＰ（Ｃ）を注射したウサギの眼底撮
影結果をそれぞれ示す。全てのウサギにおいて、明らかな異常、結膜充血、分泌物または
眼内炎は認められず、眼圧は上昇しなかった。

【0212】

以下のプライマーを使用して実施例３と同様のリアルタイムＰＣＲ試験に従った：
β－アクチン－Ｆ：ＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＴＧＴ（配列番号９３）、
β－アクチン－Ｒ：ＧＣＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣ（配列番号９４）、
ＮＤ６－Ｆ：ＧＧＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣ（配列番号９５）、
ＮＤ６－Ｒ：ＣＣＡＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＴＣＡＣＣＣＡＣＡＧ（配列番号９６）、
ｏｐｔ＿ＮＤ６－Ｆ：ＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＴＧＣＧＴ（配列番号９７）、
ｏｐｔ＿ＮＤ６－Ｒ：ＣＣＡＧＧＣＣＴＣＧＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴ（配列番号９８）。

【0213】

図１５に示すように、ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ６（Ａ）、及びｒＡＡＶ２－ＮＤ６（
Ｂ）は両方とも、対照群（Ｃ）に比べてより高い（ｐ＜０．０５）相対ＮＤ６発現レベル
を有していた。ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ６（Ａ）はｒＡＡＶ２－ＮＤ６（Ｂ）よりも少
し高い相対ＮＤ６発現レベルを有していた。図１６のウェスタンブロットに示されるとお
り、ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ６（Ａ）はｒＡＡＶ２－ＮＤ６（Ｂ）の３倍を上回る高さ
の相対ＮＤ６発現レベルを有していた。

【0214】

実験方法は実施例８と同じとし、組換え核酸ＣＯＸ１０－ＮＤ６－３’ＵＴＲ（配列番
号２１）及びｏｐｔ＿ＣＯＸ１０^＊－ｏｐｔ＿ＮＤ６－３’ＵＴＲ（配列番号５１）を、
ＯＰＡ１－ＮＤ６－３’ＵＴＲ（配列番号７７）及びＯＰＡ１－ｏｐｔ＿ＮＤ６－３’Ｕ
ＴＲ（配列番号７９）で置き換えた。最適化ＮＤ６配列は、有意に改善された転写及び翻
訳効率、発現レベル、ならびにＬＨＯＮの治療におけるより高い有効性及び安全性を有す
ることが分かった。

【0215】

実施例１１－ＮＤ１及びｏｐｔ＿ＮＤ１配列
（５’から３’に向かって）ＣＯＸ１０（配列番号１）とＮＤ１（配列番号１１）と３
’ＵＴＲ（配列番号１３）との組合せであるＣＯＸ１０－ＮＤ１－３’ＵＴＲ（配列番号
２５）、ｒＡＡＶ２－ＮＤ１；ならびに（５’から３’に向かって）ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０
^＊（配列番号３）とｏｐｔ＿ＮＤ１（配列番号１２）と３’ＵＴＲ（配列番号１３）との
組合せであるｏｐｔ＿ＣＯＸ１０^＊－ｏｐｔ＿ＮＤ１－３’ＵＴＲ（配列番号５５）、ｒ
ＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ１を使用して、実施例１～６と同様の実験方法に従った。

【0216】

ＣＯＸ１０－ＮＤ１－３’ＵＴＲ（配列番号２５）のためのプラスミドスクリーニング
には以下のプライマーを使用した：
ＮＤ１－Ｆ：ＡＴＧＧＣＣＧＣＡＴＣＴＣＣＧＣＡＣＡＣＴ（配列番号９９）、
ＮＤ１－Ｒ：ＴＴＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＧＧＧＡＡＴＧＣＴ（配列番号１００）。

【0217】

ｏｐｔ＿ＣＯＸ１０^＊－ｏｐｔ＿ＮＤ１－３’ＵＴＲ（配列番号５５）のためのプラス
ミドスクリーニングには以下のプライマーを使用した：
ＮＤ１－Ｆ：ＡＡＣＣＴＣＡＡＣＣＴＡＧＧＣＣＴＣＣＴＡ（配列番号１０１）、
ＮＤ１－Ｒ：ＴＧＧＣＡＧＧＡＧＴＡＡＣＣＡＧＡＧＧＴＧ（配列番号１０２）。

【0218】

ウサギの３つの群に、Ａ：１０^１０ｖｇ／５０μｌのｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ１、Ｂ
：１０^１０ｖｇ／５０μｌのｒＡＡＶ２－ＮＤ１（実施例９）、及びＣ：１０^１０ｖｇ／
５０μｌのｒＡＡＶ２－ＥＧＦＰを注射した。全てのウサギにおいて、明らかな異常、結
膜充血、分泌物または眼内炎は認められず、眼圧は上昇しなかった。

【0219】

以下のプライマーを使用して実施例３と同様のリアルタイムＰＣＲ試験に従った：
ＮＤ１－Ｆ：ＡＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＧＴＡＴＣＴＴＧ（配列番号１０３）、
ＮＤ１－Ｒ：ＴＴＴＴＡＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＧＧＴＧＡＡ（配列番号１０４）、
ｏｐｔ＿ＮＤ１－Ｆ：ＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＴＧＣＧＴ（配列番号１０
５）、
ｏｐｔ＿ＮＤ１－Ｒ：ＴＧＡＴＧＴＡＣＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧ（配列番号
１０６）。

【0220】

図１７に示すように、ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ１（Ａ）及びｒＡＡＶ２－ＮＤ１（Ｂ
）は両方とも、対照群（Ｃ）に比べてより高い（ｐ＜０．０５）相対ＮＤ１発現レベルを
有していた。図１８のウェスタンブロットに示されるとおり、ｒＡＡＶ２－ｏｐｔ＿ＮＤ
１（Ａ）はｒＡＡＶ２－ＮＤ１（Ｂ）の２倍を上回る高さの相対ＮＤ６発現レベルを有し
ていた。

【0221】

実験方法は実施例８と同じとし、組換え核酸ＣＯＸ１０－ＮＤ１－３’ＵＴＲ（配列番
号２５）及びｏｐｔ＿ＣＯＸ１０^＊－ｏｐｔ＿ＮＤ１－３’ＵＴＲ（配列番号５５）を、
ＯＰＡ１－ＮＤ１－３’ＵＴＲ（配列番号８１）及びＯＰＡ１－ｏｐｔ＿ＮＤ１－３’Ｕ
ＴＲ（配列番号８３）で置き換えた。最適化ＮＤ１配列は、有意に改善された転写及び翻
訳効率、発現レベル、ならびにＬＨＯＮの治療におけるより高い有効性及び安全性を有す
ることが分かった。

【0222】

実施例１２－他の融合タンパク質
配列番号１５～８４に示される他の融合タンパク質を使用して実施例１～６と同様の実
験方法に従うことができる。そして、同様の結果が得られることが予想される。

【0223】

実施例１３－製剤開発
ＡＡＶ２ウイルス試料を使用して種々のＡＡＶ製剤をスクリーニングした。種々のＡＡ
Ｖ製剤の安定性を、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムを使用して評価
した。凍結／解凍サイクル条件下での各製剤のウイルス力価を測定した。

【0224】

まず、３つの異なる製剤を１、２、３、４及び５回の凍結／解凍サイクルの下で試験し
、ウイルス力価を測定し、表３にまとめた。試験した３つの製剤は、Ａ：リン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）；Ｂ：１％のα，α－トレハロース二水和物（α，α－ｔｒｅｈａｌｏ
ｓｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、１％のＬ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物、及び１％のポリ
ソルベート２０；ならびにＣ：１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ
_２ＨＰＯ_４、及び０．００１％のポロキサマー１８８、ｐＨ７．３であった。表３に示す
ように、製剤Ｃは５回の凍結／解凍サイクルの後に最も低い相対標準偏差（ＲＳＤ）を有
し、ＡＡＶ製剤としての安定性が優れていることが示唆される。

【表3】

【0225】

表３に示すように、製剤Ｃは５回の凍結／解凍サイクルの後に最も低い相対標準偏差（
ＲＳＤ）を有し、ＡＡＶ製剤としての安定性が優れていることが示唆される。

【0226】

次に、別の３つの異なる製剤の群を１、２、３、４及び５回の凍結／解凍サイクルの下
で試験し、ウイルス力価を測定し、表４にまとめた。試験した３つの製剤は、Ｄ：リン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２～７．４；Ｅ：ＰＢＳ及び０．００１％のポロキ
サマー１８８、ｐＨ７．２～７．４；ならびにＦ：８０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＮａＨ
_２ＰＯ_４、４０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、及び０．００１％のポロ
キサマー１８８、７．２～７．４であった。

【表4】

【0227】

表４に示すように、製剤Ｆは５回の凍結／解凍サイクルの後に最も低い相対標準偏差（
ＲＳＤ）を有し、ＡＡＶ製剤としての安定性が優れていることが示唆される。全体的に見
て、製剤Ｆは、試験した全ての製剤の中でも最も低いＲＳＤを有し、今後の開発のための
ＡＡＶ製剤として使用され得る。

【0228】

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し記載してきたが、そのような実施形態が例
としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。今や当業者は本発明から逸
脱することなく幾多の変形形態、変更及び置換えを思い付くであろう。本発明の実施にお
いて、本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替形態が採用され得るこ
とは、理解されるべきである。以下の請求項によって本発明の範囲を定義すること、なら
びにそれによってこれらの請求項の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物を包含
することを意図する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

2023078173000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2023-03-29

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

組換え核酸であって、
ミトコンドリア指向性配列；
配列番号７、８、１０及び１２からなる群から選択される配列と少なくとも９９％同一である配列を含むミトコンドリアタンパク質コード配列；ならびに
３’ＵＴＲ核酸配列
を含む、前記組換え核酸。

【外国語明細書】