特開 2023-78454 調節性ポリヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023078454

(43)【公開日】2023-06-06

(54)【発明の名称】調節性ポリヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20230530BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20230530BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20230530BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20230530BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/864 100Z

C12N7/01

【審査請求】有

【請求項の数】18

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023055041

(22)【出願日】2023-03-30

(62)【分割の表示】P 2021062812の分割

【原出願日】2015-11-13

(31)【優先権主張番号】62/079,590

(32)【優先日】2014-11-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/212,004

(32)【優先日】2015-08-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/234,477

(32)【優先日】2015-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】517157204

【氏名又は名称】ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＶＯＹＡＧＥＲ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】ホウ、ジンジャオ

(72)【発明者】

【氏名】ノネンマッハ、マチュー イー．

(72)【発明者】

【氏名】ジョウ、ペンチェン

(57)【要約】

【課題】特異性が高く、オフターゲット効果が少ない改良された調節性ポリヌクレオチドを提供する。
【解決手段】調節性ポリヌクレオチドは、（ａ）ステム－ループ構造を形成するステムおよびループであって、５’から３’の方向に；（ｉ）パッセンジャー鎖およびパッセンジャー鎖の５’側に位置する５’スペーサー配列を含む５’ステムアームと；（ｉｉ）４～２０ヌクレオチドの長さのループ領域と；（ｉｉｉ）ガイド鎖およびガイド鎖の３’側に位置する３’スペーサー配列を含む３’ステムアームとを含むステムおよびループと；（ｂ）上記パッセンジャー鎖の５’側に位置する第１の隣接領域であって、上記５’スペーサー配列および５’隣接配列を含む第１の隣接領域と；（ｃ）上記ガイド鎖の３’側に位置する第２の隣接領域であって、上記３’スペーサー領域および３’隣接配列を含み、かつ所定配列のヌクレオチド配列を含む第２の隣接領域とを含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
この出願は、２０１４年１１月１４日に出願されたＭｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅと題された米国仮特許出願第６２／０７９，５９０号、２０１５年８月３１日に出願されたＭｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅと題された米国仮特許出願第６２／２１２，００４号、２０１５年９月２９日に出願されたＭｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅと題された米国仮特許出願第６２／２３４，４７７号の権利を主張しており、その各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に提出されている。当該配列表は、２０１５年１１月１２日に作成された１０１４ＰＣＴＳＬ．ｔｘｔと題されたファイルとして提供されており、そのサイズは２３５，３３０バイトである。配列表の電子フォーマットでの情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

発明の分野
本発明は、調節性ポリヌクレオチドの設計、調製、製造および／または製剤化するための組成物、方法、プロセス、キットおよびデバイスに関する。いくつかの実施形態では、このような調節性ポリヌクレオチドは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によってまたはそのウィルス内にコードされていてもよく、人工のｍｉｃｒｏＲＮＡ、人工のｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ、および／または人工のｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡを含んでいてもよい。

【背景技術】

【0004】

マイクロＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、小型、ノンコーディング、一本鎖リボ核酸分子（ＲＮＡ）であり、通常、その長さは１９～２５ヌクレオチドである。哺乳動物のゲノムでは、１０００を超えるマイクロＲＮＡが同定されている。成熟したマイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの相補的配列と部分的または完全に対形成することにより、主に、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）に結合し、転写後レベルでの標的ｍＲＮＡの分解を促進し、場合によっては翻訳の開始を阻害する。マイクロＲＮＡは、細胞周期および成長の調節、アポトーシス、細胞増殖および組織発生などの多くの重要な生物学的過程において重要な役割を果たしている。

【0005】

ｍｉＲＮＡ遺伝子は、一般に、ｍｉＲＮＡの長い一次転写物（すなわちｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）として転写される。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの前駆体（すなわちｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）に切断され、成熟した機能的なｍｉＲＮＡを生成するようにさらに処理される。

【0006】

多くの標的発現ストラテジーが核酸ベースの創薬技術を使用しているが、特異性が高く、オフターゲット効果が少ない改良された核酸創薬技術の必要性が依然として存在する。
本発明は、人工のｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡおよび成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡ構築物の形態におけるそのような改良創薬技術、およびそれらを設計する方法を提供する。これらの新規な構築物は、合成されたスタンドアロン分子であってもよく、または細胞に投与するためのプラスミドまたは発現ベクターにコードされてもよい。そのようなベクターは、アデノ関連ウイルスベクター、例えばＡＡＶ血清型のいずれかのベクターゲノムまたはレンチウイルスなどの他のウイルス投与ビヒクルを含むが、これに限定されない。

【発明の概要】

【0007】

本明細書には、調節性ポリヌクレオチドを設計、調製、製造、および／または製剤化するのための組成物、方法、プロセス、キットおよびデバイスが記載されている。
いくつかの実施形態では、このような調節性ポリヌクレオチドは、プラスミドまたはベクターまたは組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によってコードされるか、またはそれらに含まれていてもよく、当該調節性ポリヌクレオチドは、人工のマイクロＲＮＡ、人工のｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ、および／または人工のｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡを含み得る。

【0008】

本発明の様々な実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、明細書および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【0009】

本発明の前述及び他の目的、特徴および利点は、添付の図面に示されるように、本発明の特定の実施形態の以下の説明から明らかにする。添付の図面では、記載されている類似の参照符号が、異なる視点を通して同じ部分を表している。図面は必ずしも縮尺通りではなく、本発明の様々な実施形態の原理を例示することに重点を置いている。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明によるＡＡＶベクターにコードされた人工のｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡの概略図である。

【図2】ＡＡＶベクターにコードされたｐｒｉ－ｍＲＮＡ構築物の活性を示すヒストグラムである。

【図3】ＡＡＶベクターにコードされた調節性ポリヌクレオチドのガイド鎖のＨＥＫ２９３Ｔ細胞における活性を示すヒストグラムである。

【図4】ＡＡＶベクターにコードされた調節性ポリヌクレオチドのパッセンジャー鎖のＨＥＫ２９３Ｔ細胞における活性を示すヒストグラムである。

【図5】ＡＡＶベクターにコードされた調節性ポリヌクレオチドのガイド鎖のＨｅＬａ細胞における活性を示すヒストグラムである。

【図6】ＡＡＶベクターにコードされた調節性ポリヌクレオチドのパッセンジャー鎖のＨｅＬａ細胞における活性を示すヒストグラムである。

【図7】発現された細胞内ＡＡＶ ＤＮＡの定量のヒストグラムである。

【図8】ＡＡＶベクターにコードされた構築物のヒト運動ニューロンにおける活性を示すヒストグラムである。

【図9】Ｕ２５１ＭＧ細胞におけるＳＯＤ１の用量依存性サイレンシングを示すチャートである。

【図10】ヒト星状細胞におけるＳＯＤ１の用量依存的サイレンシングを示すチャートである。

【図11】Ｕ２５１ＭＧ細胞におけるＳＯＤ１のサイレンシングの経時変化を示すチャートである。

【図12】図１２は、図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃからなり、これらはそれぞれは、構築物の用量依存性効果を示すチャートである。図１２Ａは、相対ＳＯＤ１発現を示す。図１２Ｂは、ガイド鎖のパーセントを示す。図１２Ｃは、パッセンジャー鎖のパーセントを示す。

【図13】ＩＴＲ、イントロン（Ｉ）及びｐｏｌｙＡ（Ｐ）に対する調節性ポリヌクレオチド（ＭＰ）の位置を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

発明の組成物
本発明によれば、人工のマイクロＲＮＡとして機能する調節性ポリヌクレオチドが提供される。本明細書中で使用される場合、「調節性ポリヌクレオチド」は、標的遺伝子のレベルまたは量を調節する（増加させるか、減少させる）ように機能する任意の核酸ポリマーである。調節性ポリヌクレオチドは、調節に先立って、細胞内でプロセシングされる前駆体分子を含む。調節性ポリヌクレオチドまたはそのプロセシングされた形態は、細胞に投与するためのプラスミド、ベクター、ゲノム、またはその他の核酸発現ベクターにコードされてもよい。

【0012】

いくつかの実施形態において、調節性ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ転写物（ｐｒｉ－ｍｉＲ）またはマイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲ）として設計され、それらが細胞内でプロセシングされ、高度に特異的な人工のマイクロＲＮＡを産生する。

【0013】

調節性ポリヌクレオチド、特に本発明の人工のマイクロＲＮＡは、古典的配列または構造骨格に基づいて、または既知のマイクロＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡあるいはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡに基づいて、設計することができる。このような配列は、米国特許公報ＵＳ２００５／０２６１２１８および米国特許公報ＵＳ２００５／００５９００５に教示されているような任意の既知のマイクロＲＮＡまたはその前駆体に対応し得る（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0014】

マイクロＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、１９～２５ヌクレオチド長のノンコーディングＲＮＡであり、これは、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子の安定性を低下させるかまたは翻訳を阻害することによって、遺伝子発現を下方制御する。本発明の調節性ポリヌクレオチドは、１つまたはそれ以上のマイクロＲＮＡ配列、マイクロＲＮＡシード、または人工のマイクロＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡとして機能する配列）を含み得る。

【0015】

マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域を含む。シード領域とは、すなわち、成熟したマイクロＲＮＡの２～９位の領域の配列であり、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対し完全なワトソン・クリック型相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟したマイクロＲＮＡの２～８位または２～７位または２～９位を含み得る。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡシードは７ヌクレオチド（例えば、成熟したマイクロＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、当該のマイクロＲＮＡシードでは、対応するｍｉＲＮＡ標的のシード相補的部位が、マイクロＲＮＡの１位に対向するアデニン（Ａ）に隣接している。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡシードは６ヌクレオチド（例えば、成熟したマイクロＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、当該のマイクロＲＮＡシードでは、対応するｍｉＲＮＡ標的のシード相補的部位が、マイクロＲＮＡの１位に対向するアデニン（Ａ）に隣接している。例えば、以下を参照せよ：Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ，Ｆａｒｈ ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ，Ｌｉｍ ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００７ Ｊｕｌ ６；２７（１）：９１－１０５；（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。天然に存在するマイクロＲＮＡにおいては、マイクロＲＮＡシードの塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。

【0016】

本明細書で教示しているように、設計パラメータまたはルールが同定されており、それらを適用して、オフターゲット効果が少ない優れた標的遺伝子調節特性を有する調節性ポリヌクレオチド（例えば、人工のマイクロＲＮＡ）を設計する。

【0017】

一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドの分子骨格は、所望の標的遺伝子調節特性を有する調節性ポリヌクレオチドを作製するように設計および最適化することができる。非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、オフターゲット効果が少ない優れた標的遺伝子調節特性を有し得る。

【0018】

一実施形態では、人工ｍｉＲなどの本発明の調節性ポリヌクレオチドは、高度に特異的な標的認識および低いガイド／パッセンジャー比をもたらす一組の規則に従ってアセンブルされたモジュラーエレメントまたは配列モチーフから構成される。そのようなモジュールまたは配列モチーフには、以下が含まれるが、それらに限定されない：二重鎖領域；隣接領域；ループ；最適化ループ；ＵＧＵＧループ；ＧＵドメイン；スペーサー（近位および遠位モチーフまたはモジュール間隔を制御するためのスペーサー、またはターン、ループまたはバルジなどの構造エレメントを導入するためのスペーサー）；ＣＮＮＣモチーフ；およびループ、バルジ、ミスマッチ、ウォブルおよび／またはそれらの組み合わせを包含する熱力学的非対称領域。人工ｍｉＲを構築する際に、単独でまたは組み合わせて適用され得る規則の非限定的な例には、以下で教示されているものが含まれる：Ｓｉｌｅｎｃｅ ２０１１，２：４；Ｇｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５１，９００－９１１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ９，２０１２；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１１５，１９９－２０８，Ｏｃｔｏｂｅｒ １７，２００３；Ｐａｒｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４７５，１０１，１４ Ｊｕｌｙ ２０１１；Ｋｅｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（６）；Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．９ ２８１１－２８２４；Ｄｏｗ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．；７（２）：３７４－３９３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１１．４４６；Ａｕｙｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５２，８４４－８５８，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４，２０１３；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１２ Ｎｏｖ ９，１５１（４）：９００－１１；Ｆｅｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ４１，７３３－７４６，２０１１；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １２５，８８７－９０７，２００６；Ｂｅｔａｎｃｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３，Ａｒｔ．１２７，１－６ Ｊｕｌｙ ２０１２；Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ １１５，１９９－２０８，２００３（これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0019】

上記のモジュールまたは配列モチーフに加えて、調節性ポリヌクレオチドは、パッセンジャー鎖およびガイド鎖の少なくとも１つまたは双方を含む。パッセンジャー鎖およびガイド鎖は、調節性ポリヌクレオチドのステムループ構造の５’アームまたは３’アーム上に配置され得るか、または位置し得る。

【0020】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドの３’ステムアームは、ガイド鎖の３’末端の下流に１１ヌクレオチドを有し得、これらの１１ヌクレオチドは、５’ステムアームのパッセンジャー鎖の５’末端の上流の１３ヌクレオチドのうちの１１ヌクレオチドと相補性を有する。

【0021】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、６ヌクレオチドであるシステインを有し得、これらの６ヌクレオチドは、調節性ポリヌクレオチドの３’ステムアームの３’末端の下流の６ヌクレオチドである。

【0022】

一実施形態において、調節性ポリヌクレオチドは、ガイド鎖のｍｉＲＮＡシードマッチを含む。別の実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、パッセンジャー鎖のｍｉＲＮＡシードマッチを含む。さらに別の実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖のシードマッチを含まない。

【0023】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、ガイド鎖に対して顕著な全長オフターゲットをほとんど有さない場合がある。別の実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、パッセンジャー鎖に対して顕著な全長オフターゲットをほとんど有さない場合がある。さらに別の実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドは、ガイド鎖に対しても、パッセンジャー鎖に対しても、顕著な全長オフターゲットをほとんど有さない場合がある。

【0024】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性が高い場合がある。別の実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性を低い場合がある。さらに別の実施形態では、調節性ポリヌクレオチドはｉｎ ｖｉｔｒｏで、ガイド鎖活性が高く、パッセンジャー鎖活性が低い場合がある。

【0025】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドはｉｎ ｖｉｔｒｏで、ガイド鎖活性が高く、パッセンジャー鎖活性が低い。ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％または１００％であり得る。ガイド鎖による標的ノックダウンは、６０～６５％、６０～７０％、６０～７５％、６０～８０％、６０～８５％、６０～９０％、６０～９５％、６０～９９％、６０～９９．５％、６０～１００％、６５～７０％、６５～７５％、６５～８０％、６５～８５％、６５～９０％、６５～９５％、６５～９９％、６５～９９．５％、６５～１００％、７０～７５％、７０～８０％、７０～８５％、７０～９０％、７０～９５％、７０～９９％、７０～９９．５％、７０～１００％、７５～８０％、７５～８５％、７５～９０％、７５～９５％、７５～９９％、７５～９９．５％、７５～１００％、８０～８５％、８０～９０％、８０～９５％、８０～９９％、８０～９９．５％、８０～１００％、８５～９０％、８５～９５％、８５～９９％、８５～９９．５％、８５～１００％、９０～９５％、９０～９９％、９０～９９．５％、９０～１００％、９５～９９％、９５～９９．５％、９５～１００％、９９～９９．５％、９９～１００％、または９９．５～１００％であり得る。非限定的な例として、ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は７０％より大きい。

【0026】

一実施形態では、最寄りのオフターゲットのパッセンジャー鎖のＩＣ５０は、標的のガイド鎖のＩＣ５０を１００倍したものより大きい。非限定的な一例として、最寄りのオフターゲットのパッセンジャー鎖のＩＣ５０が、標的のガイド鎖のＩＣ５０を１００倍したものより大きい場合、調節性ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ガイド鎖活性が高く、パッセンジャー鎖活性が低いと言われている。

【0027】

一実施形態では、ガイド鎖の５’プロセシングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の割合で、５’末端での正確な開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、少なくとも９９％の割合で５’末端での正確な開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、少なくとも９９％の割合で、５’末端における正確な開始（ｎ）を有する。

【0028】

一実施形態では、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）の比は、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏで、１：９９，５：９５，１０：９０，１５：８５，２０：８０，２５：７５，３０：７０，３５：６５，４０：６０，４５：５５，５０：５０，５５：４５，６０：４０，６５：３５，７０：３０，７５：２５，８０：２０，８５：１５，９０：１０，９５：５，または９９：１である。非限定的な例として、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ガイド鎖とパッセンジャー鎖の比は、８０：２０である。非限定的な例として、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ガイド鎖とパッセンジャー鎖の比は、８０：２０である。

【0029】

一実施形態では、ベクターゲノムの完全性は、構築物の全長の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９％以上である。

【0030】

調節性ポリヌクレオチド
一実施形態では、既知のＲＮＡｉ構築物またはＲＮＡｉ剤のいずれも、本発明の調節性ポリヌクレオチドまたは人工のマイクロＲＮＡのパッセンジャー鎖および／またはガイド鎖のを設計するための出発構築物として機能し得る。これらには、以下が含まれる：古典的ｓｉＲＮＡ；低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）；逆方向反復；短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；小さな一時的に制御されるＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；放射状クラスター化阻害ＲＮＡ、非対称クラスター化阻害ＲＮＡ、線形クラスター化抑制ＲＮＡ、および複合型または化合物クラスター化阻害ＲＮＡを含むクラスター化阻害ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）；ダイサー基質；ＤＮＡ指向性ＲＮＡｉ（ｄｄＲＮＡｉ）；一本鎖ＲＮＡｉ（ｓｓＲＮＡｉ）；マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）アンタゴニスト；マイクロＲＮＡ模倣物；マイクロＲＮＡアゴニスト；ブロックミル（別名、エクスマリウス）；マイクロＲＮＡ擬態物；マイクロＲＮＡ加減物；スーパーｍｉＲ；ＰＣＴ公開ＷＯ／２００５／０１３９０１に開示されるオリゴマー構築物（その内容が全体として本明細書に組み込まれる）；米国特許第２００９０１３１３６０号に開示されているような３成分ＲＮＡｉ構築物（その内容はその全体が本明細書に組み込まれる）；ＰＣＴ公開ＷＯ／２０１０／０１１３４６に開示されたソロ－ｒｘＲＮＡ構築物（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）；ＰＣＴ公開ＷＯ／２０１０／０３３２４７に開示されているｓｄ－ｒｘＲＮＡ構築物（その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）；ＰＣＴ公開ＷＯ／２０１０／００２８５１およびＷＯ／２００９／１４１１４６に開示されているような、ＲＮＡレベルを低下させ、免疫応答を調節する二重作用ＲＮＡｉ構築物（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）；およびＰＣＴ公開ＷＯ／２００６／１３０２０１、ＷＯ／２００７／０８６９９０、ＷＯ／２００９／０４６３９７、ＷＯ／２００９／１４９１８２、ＷＯ／２００９／０８６４２８に開示されているような、設計上の標的の発現を増加させる抗ＲＮＡ（ａｇＲＮＡ）または小型活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0031】

同様に、上に列挙したマイクロＲＮＡのいずれかのｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡはまた、本発明の調節性ポリヌクレオチドの分子骨格として機能し得る。

【0032】

一実施形態では、出発構築物は、マウス、ラット、イヌ、サル、またはヒトなどの任意の関連種に由来し得る。
一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、ＣＭＶ、Ｕ６、ＣＢＡ、またはＳＶ４０イントロンを有するＣＢＡプロモーターを含むがそれらに限定されないプロモーターの下流の発現ベクター中に位置していてもよい。さらに、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置していてもよい。非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、１，２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３０以上のヌクレオチドだけ、プロモーターより下流に位置しているか、および／または発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置していてもよい。別の非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０または２５～３０ヌクレオチドだけ、プロモーターより下流に位置しているか、および／または発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置していてもよい。非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、あるいは２５％以上だけ、プロモーターより下流に位置しているか、および／または発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置していてもよい。別の非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％、あるいは２０～２５％だけ、プロモーターより下流に位置しているか、および／または発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置していてもよい。

【0033】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置していてもよい。さらに、調節性ポリヌクレオチドは、ＣＭＶ、Ｕ６、ＣＢＡ、またはＳＶ４０イントロンを有するＣＢＡプロモーターを含むがそれらに限定されないプロモーターの下流の発現ベクター中に位置していてもよい。非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、１，２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３０以上のヌクレオチドだけ、プロモーターより下流に位置しているか、および／または発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置していてもよい。別の非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０または２５～３０ヌクレオチドだけ、プロモーターより下流に位置しているか、および／または発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置していてもよい。非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、あるいは２５％以上だけ、プロモーターより下流に位置しているか、および／または発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置していてもよい。別の非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％、あるいは２０～２５％だけ、プロモーターより下流に位置しているか、および／または発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置していてもよい。

【0034】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドはｓｃＡＡＶ中に位置していてもよい。
一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドはｓｓＡＡＶ中に位置していてもよい。
一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のフリップＩＴＲの５’末端近くに位置していてもよい。別の実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のフリップＩＴＲの３’末端近くに位置していてもよい。さらに別の実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のフロップＩＴＲの５’末端近くに位置していてもよい。さらに別の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のフロップＩＴＲの３’末端近くに位置していてもよい。一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のフリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との間に位置していてもよい。一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のフリップＩＴＲの３’末端とフリップＩＴＲの５’末端の間に（例えば、フリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との間に、またはフロップＩＴＲの３’末端とフリップＩＴＲの５’末端の間に）位置していてもよい。非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）の５’末端または３’末端から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド、または３０ヌクレオチド以上だけ、下流に位置していてもよい。非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）の５’末端または３’末端から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド、または３０ヌクレオチド以上だけ、上流に位置していてもよい。別の非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）の５’末端または３’末端から、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０、または２５～３０ヌクレオチドだけ、下流に位置していてもよい。別の非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）の５’末端または３’末端から、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０、または２５～３０ヌクレオチドだけ、上流に位置していてもよい。非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）の５’末端または３’末端から、ヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、または２５％以上だけ、上流に位置していてもよい。別の非限定的な一例として、調節性ポリヌクレオチドは、発現ベクター中のＩＴＲ（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）の５’末端または３’末端から、ヌクレオチドの最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％、または２０～２５％だけ、下流に位置していてもよい。

【0035】

分子骨格
いくつかの実施形態では、調節性ポリヌクレオチドの出発分子骨格は、既知または野生型のｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡである。その他の実施形態では、調節性ポリヌクレオチドの分子骨格は、最初に設計される（以下を参照せよ：Ｃｕｌｌｅｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６）１３，５０３－５０８ ｗｏｒｋ ｗｉｔｈ ｍｉＲ３０；Ｃｈｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．７ ｗｏｒｋｉｎｇ ｗｉｔｈ ｍｉＲ－１５５；（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0036】

本明細書中で使用される場合、「分子骨格」は、それに続く分子を設計または作製するための配列または構造的基礎を形成するフレームワークまたは出発分子を指す。
図１参照。本発明の調節性ポリヌクレオチドは、図示されているように、ｐｒｉ－ｍｉＲとして設計され得る。この図には、ｐｒｉ－ｍｉＲ分子骨格が示されている。ペイロード（例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはその他のＲＮＡｉ剤）を含む調節性ポリヌクレオチドは、先行する５’隣接配列を含み、この５’隣接配列は、任意の長さを有し、野生型マイクロＲＮＡ配列にその全体がまたは一部分が由来するものであってもよいし、また完全に人工的であってもよい。

【0037】

同様に、この図に示されているる３’隣接配列は、５’隣接配列とサイズおよび起点が同じであってよい。どちらかの隣接配列が存在しなくてもよい。この３’隣接配列は、１つまたはそれ以上のＣＮＮＣモチーフを任意に含むことができ、このＣＮＮＣモチーフでは、「Ｎ」は任意のヌクレオチドを表す。

【0038】

図示されたステムループ構造のステムを形成することは、少なくとも１つのペイロード配列の最小値である。いくつかの実施形態では、ペイロード配列は、部分的に相補的であるかまたは標的配列にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは野生型マイクロＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子の断片である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つまたはそれ以上のマイクロＲＮＡ、人工マイクロＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡを含み得る実質的に二重鎖の構築物である。

【0039】

いくつかの実施形態において、ステムループの５’アームはパッセンジャー鎖を含む。この鎖は、標的との同一性を反映する点でセンス鎖としても知られている。パッセンジャー鎖は、１５～３０ヌクレオチドの長さであり得る。パッセンジャー鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さであり得る。

【0040】

いくつかの実施形態において、ステムループの３’アームは、ガイド鎖を含む。この鎖は、標的との相同性を反映する点でアンチセンス鎖としても知られている。ガイド鎖は、１５～３０ヌクレオチドの間の長さ、２１～２５ヌクレオチドの間の長さ、または２２ヌクレオチドの長さであってよい。パッセンジャー鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの例では、ガイド鎖は、５’末端の「Ｇ」ヌクレオチドを含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、ガイド鎖がマイクロＲＮＡまたは人工マイクロＲＮＡを含む場合、ガイド鎖は１つまたはそれ以上のマイクロＲＮＡシード配列を含み得る。このシード配列は、ガイド鎖の最初の５’ヌクレオチドに対して、またはダイサー切断部位に対して、ガイド鎖の２～７位、２～８位、または２～９位に位置していてよい。

【0042】

その他の実施形態では、パッセンジャー鎖は３’アーム上に存在し、ガイド鎖はステムループ構造のステムの５’アーム上に存在する。
パッセンジャー鎖およびガイドス鎖は、その長さの実質的な部分にわたって完全に相補的であり得る。その他の実施形態では、パッセンジャー鎖およびガイド鎖は、鎖の長さの少なくとも５０，６０，７０，８０，８５，９０，９５、または９９％独立して、少なくとも７０，８０，９０，９５、または９９％相補的であり得る。

【0043】

パッセンジャー鎖の同一性もガイド鎖の相同性も、標的に対して１００％相補的である必要はない。
ステムループ構造のパッセンジャー鎖とガイド鎖とを分離することは、ループ（ループモチーフとしても知られている）である。ループは、いかなる長さであってもよく、４～３０ヌクレオチドの間の長さ、４～２０ヌクレオチドの間の長さ、４～１５ヌクレオチドの間の長さ、５～１５ヌクレオチドの間の長さ、６～１２ヌクレオチドの間の長さ、６ヌクレオチドの長さ、７ヌクレオチドの長さ、８ヌクレオチドの長さ、９ヌクレオチドの長さ、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチドの長さ、および／または１２ヌクレオチドの長さである。

【0044】

いくつかの実施形態では、ループは、少なくとも１つのＵＧＵＧモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＵＧモチーフは、ループの５’末端に位置する。
１つまたはそれ以上のモジュールを互いに分離するために、調節性ポリヌクレオチドにスペーサー領域が存在してもよい。そのようなスペーサー領域は、１つまたはそれ以上存在してもよい。

【0045】

一実施形態では、８～２０個、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のヌクレオチドの長さのスペーサー領域が、パッセンジャー鎖と隣接配列の 間に存在していてよい。

【0046】

一実施形態では、スペーサーは１３ヌクレオチドであり、パッセンジャー鎖の５’末端と隣接配列との間に位置する。一実施形態において、スペーサーは、配列のヘリックス・ターン１個を形成するのに十分な長さである。

【0047】

一実施形態では、８～２０個（すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、あるいは２０個）のヌクレオチドのスペーサー領域が、ガイド鎖と隣接配列に間に存在し得る。

【0048】

一実施形態では、スペーサー配列は１０～１３個（すなわち１０，１１，１２または１３個）のヌクレオチドであり、ガイド鎖の３’末端と隣接配列の間に位置し得る。一実施形態において、スペーサーは、配列のヘリックス・ターン１個を形成するのに十分な長さである。

【0049】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、ステムの基部にある少なくとも１つのＵＧモチーフを含み、それによってＧヌクレオチドが対になっており、Ｕヌクレオチドは対になっていない。いくつかの実施形態では、対になっていないＵヌクレオチドは隣接配列に位置している。

【0050】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、それぞれ１個の５’隣接配列、５’アーム、ループモチーフ、３’アームおよび３’隣接配列を含む。非限定的な一例として、５’アームはパッセンジャー鎖を含み、３’アームはガイド鎖を含む。別の非限定的な一例において、５’アームはガイド鎖を含み、３’アームはパッセンジャー鎖を含む。

【0051】

一実施形態では、５’アーム、ペイロード（例えば、パッセンジャー鎖および／またはガイド鎖）、ループモチーフおよび／または３’アーム配列を改変することができる（例えば、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを置換したり、および／またはヌクレオチドを付加したり欠損させたりする）。改変は、構築物の機能に有益な変化を引き起こし得る（例えば、標的配列のノックダウンを増加させる、構築物の分解を減少させる、オフターゲット効果を低下させる、ペイロードの効率を高める、ペイロードの分解を減少させる）。

【0052】

一実施形態では、パッセンジャー鎖配列を改変することができる（例えば、１つ以上のヌクレオチドを置換する、ヌクレオチドを付加する、および／またはヌクレオチドを削除する）。非限定的な一例として、パッセンジャー鎖配列は、配列の最後の４個のヌクレオチド内に１個または２個の置換を含み得る（例えば、ＣがＧに置換されている）。別の非限定的な一例として、パッセンジャー鎖配列は、配列の５’末端から７～１５ヌクレオチド以内に、１個または２個の置換を含み得る（例えば、ＵがＡに置換されている、またはＣがＧに置換されている）。

【0053】

一実施形態では、３’アーム鎖配列を改変することができる（例えば、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを置換する、ヌクレオチドを付加する、および／またはヌクレオチドを削除する）。非限定的な一例として、’アームの配列は、配列の最初の４ヌクレオチド内に、１個または２個の置換を含み得る（例えば、ＡがＵに置換されている）。

【0054】

一実施形態では、ペイロード構築物の分子骨格は、５’隣接領域、ループモチーフおよび３’隣接領域を含む。５’隣接領域とループモチーフとの間に、第１のペイロード領域が存在し、ループモチーフと３’隣接領域との間には、第２のペイロード領域が存在し得る。第１および第２のペイロード領域は、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはその他のＲＮＡｉ剤、断片または変異体を含み得る。第１および第２のペイロード領域はまた、互いに同じ、異なる、または相補的な配列を含み得る。非限定的な一例として、第１ペイロード領域配列は、ｓｉＲＮＡ構築物のパッセンジャー鎖であり得、第２ペイロード領域配列は、ｓｉＲＮＡ構築物のガイド鎖であり得る。パッセンジャー配列とガイド配列とは、互いに実質的に相補的であり得る。別の非限定的な一例として、第１のペイロード領域配列は、ｓｉＲＮＡ構築物のガイド鎖であり得、第２のペイロード領域配列は、ｓｉＲＮＡ構築物のパッセンジャー鎖であり得る。パッセンジャー配列とガイド配列とは、互いに実質的に相補的であり得る。

【0055】

一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドの分子骨格は、５’隣接領域、ループ領域および３’隣接領域を含む。本明細書に記載される分子骨格に使用され得る５’隣接領域、ループ領域および３’隣接領域の配列の非限定的な例を表１～３に示す。

【0056】

【表1】

【0057】

【表2】

【0058】

【表3】

【0059】

表１～３に記載されている領域のいずれも、本明細書に記載されている分子骨格に使用することができる。
一実施形態では、分子骨格は、表１に表示されている１つの５’隣接領域を含み得る。非限定的な一例として、分子骨格は、５’隣接領域５Ｆ１，５Ｆ２，５Ｆ３または５Ｆ４を含み得る。

【0060】

一実施形態では、分子骨格は、表２に表示されている１つのループモチーフ領域を含み得る。非限定的な一例として、分子骨格は、ループモチーフ領域Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５を含み得る。

【0061】

一実施形態では、分子骨格は、表３に表示されている１つの３’隣接領域を含み得る。非限定的な一例として、分子骨格は、３’隣接領域３Ｆ１，３Ｆ２，３Ｆ３，３Ｆ４，３Ｆ５または３Ｆ６を含み得る。

【0062】

一実施形態では、分子骨格は、表１および表２に記載されているように、少なくとも１つの５’隣接領域および少なくとも１つのループモチーフ領域を含み得る。非限定的な一例として、分子骨格は、５Ｆ１とＬ１、５Ｆ１とＬ２、５Ｆ１とＬ３，５Ｆ１とＬ４，５Ｆ１とＬ５、５Ｆ２とＬ１、５Ｆ２とＬ２、５Ｆ２とＬ３、５Ｆ２とＬ４、５Ｆ２およびＬ５、５Ｆ３とＬ１、５Ｆ３とＬ２、５Ｆ３とＬ３、５Ｆ３とＬ４、５Ｆ３とＬ５、５Ｆ４とＬ１、５Ｆ４とＬ２、５Ｆ４とＬ３，５Ｆ４とＬ４、または５Ｆ４とＬ５を含み得る。

【0063】

一実施形態では、分子骨格は、表２および３に記載されているように、少なくとも１つの３’隣接領域および少なくとも１つのループモチーフ領域を含み得る。非限定的な一例として、分子骨格は、３Ｆ１とＬ１、３Ｆ１とＬ２、３Ｆ１とＬ３、３Ｆ１とＬ４、３Ｆ１とＬ５、３Ｆ２とＬ１、３Ｆ２とＬ２、３Ｆ２とＬ３、３Ｆ２とＬ４、３Ｆ２とＬ５、３Ｆ３とＬ１，３Ｆ３とＬ２、３Ｆ３とＬ３，３Ｆ３とＬ４，３Ｆ３とＬ５、３Ｆ４とＬ１、３Ｆ４とＬ２、３Ｆ４とＬ３、３Ｆ４とＬ４、３Ｆ４とＬ５、３Ｆ５とＬ１、３Ｆ５とＬ２、３Ｆ５とＬ３、３Ｆ５とＬ３、３Ｆ５とＬ４、３Ｆ５とＬ５、３Ｆ６とＬ１、３Ｆ６とＬ２、３Ｆ６とＬ３、３Ｆ６とＬ４、３Ｆ６とＬ５を含み得る。

【0064】

一実施形態では、分子骨格は、表１および表３に記載されているように、少なくとも１つの５’隣接領域および少なくとも３’隣接領域を含み得る。非限定的な一例として、分子骨格は、５Ｆ１と３Ｆ１，５Ｆ１と３Ｆ２，５Ｆ１と３Ｆ３，５Ｆ１と３Ｆ４，５Ｆ１と３Ｆ５，５Ｆ１と３Ｆ６、５Ｆ２と３Ｆ１，５Ｆ２と３Ｆ２，５Ｆ２と３Ｆ３，５Ｆ２と３Ｆ４，５Ｆ２と３Ｆ５，５Ｆ２と３Ｆ６、５Ｆ３と３Ｆ１，５Ｆ３と３Ｆ２，５Ｆ３と３Ｆ３，５Ｆ３と３Ｆ４，５Ｆ３と３Ｆ５，５Ｆ３と３Ｆ６、５Ｆ４と３Ｆ１，５Ｆ４と３Ｆ２，５Ｆ４と３Ｆ３，５Ｆ４と３Ｆ４，５Ｆと３Ｆ５，５Ｆ４と３Ｆ６を含み得る。

【0065】

一実施形態では、分子骨格は、少なくとも１つの５’隣接領域、少なくとも１つのループモチーフ領域および少なくとも１つの３’隣接領域を含み得る。非限定的な一例として、分子骨格は、５Ｆ１、Ｌ１および３Ｆ１；５Ｆ１、Ｌ１および３Ｆ２；５Ｆ１、Ｌ１および３Ｆ３；５Ｆ１、Ｌ１および３Ｆ４；５Ｆ１、Ｌ１および３Ｆ５；５Ｆ１、Ｌ１および３Ｆ６；５Ｆ２、Ｌ１および３Ｆ１；５Ｆ２、Ｌ１および３Ｆ２；５Ｆ２、Ｌ１および３Ｆ３；５Ｆ２、Ｌ１および３Ｆ４；５Ｆ２、Ｌ１および３Ｆ５；５Ｆ２、Ｌ１および３Ｆ６；５Ｆ３、Ｌ１および３Ｆ１；５Ｆ３、Ｌ１および３Ｆ２；５Ｆ３、Ｌ１および３Ｆ３；５Ｆ３、Ｌ１および３Ｆ４；５Ｆ３、Ｌ１および３Ｆ５；５Ｆ３、Ｌ１および３Ｆ６；５Ｆ４、Ｌ１および３Ｆ１；５Ｆ４、Ｌ１および３Ｆ２；５Ｆ４、Ｌ１および３Ｆ３；５Ｆ４、Ｌ１および３Ｆ４；５Ｆ４、Ｌ１および３Ｆ５；５Ｆ４、Ｌ１および３Ｆ６；５Ｆ１、Ｌ２および３Ｆ１；５Ｆ１、Ｌ２および３Ｆ２；５Ｆ１、Ｌ２および３Ｆ３；５Ｆ１、Ｌ２および３Ｆ４；５Ｆ１、Ｌ２および３Ｆ５；５Ｆ１、Ｌ２および３Ｆ６；５Ｆ２、Ｌ２および３Ｆ１；５Ｆ２、Ｌ２および３Ｆ２；５Ｆ２、Ｌ２および３Ｆ３；５Ｆ２、Ｌ２および３Ｆ４；５Ｆ２、Ｌ２および３Ｆ５；５Ｆ２、Ｌ２および３Ｆ６；５Ｆ３、Ｌ２および３Ｆ１；５Ｆ３、Ｌ２および３Ｆ２；５Ｆ３、Ｌ２および３Ｆ３；５Ｆ３、Ｌ２および３Ｆ４；５Ｆ３、Ｌ２および３Ｆ５；５Ｆ３、Ｌ２および３Ｆ６；５Ｆ４、Ｌ２および３Ｆ１；５Ｆ４、Ｌ２および３Ｆ２；５Ｆ４、Ｌ２および３Ｆ３；５Ｆ４、Ｌ２および３Ｆ４；５Ｆ４、Ｌ２および３Ｆ５；５Ｆ４、Ｌ２および３Ｆ６；５Ｆ１、Ｌ３および３Ｆ１；５Ｆ１、Ｌ３および３Ｆ２；５Ｆ１、Ｌ３および３Ｆ３；５Ｆ１、Ｌ３および３Ｆ４；５Ｆ１、Ｌ３および３Ｆ５；５Ｆ１、Ｌ３および３Ｆ６；５Ｆ２、Ｌ３および３Ｆ１；５Ｆ２、Ｌ３および３Ｆ２；５Ｆ２、Ｌ３および３Ｆ３；５Ｆ２、Ｌ３および３Ｆ４；５Ｆ２、Ｌ３および３Ｆ５；５Ｆ２、Ｌ３および３Ｆ６；５Ｆ３、Ｌ３および３Ｆ１；５Ｆ３、Ｌ３および３Ｆ２；５Ｆ３、Ｌ３および３Ｆ３；５Ｆ３、Ｌ３および３Ｆ４；５Ｆ３、Ｌ３および３Ｆ５；５Ｆ３、Ｌ３および３Ｆ６；５Ｆ４、Ｌ３および３Ｆ１；５Ｆ４、Ｌ３および３Ｆ２；５Ｆ４、Ｌ３および３Ｆ３；５Ｆ４、Ｌ３および３Ｆ４；５Ｆ４、Ｌ３および３Ｆ５；５Ｆ４、Ｌ３および３Ｆ６；５Ｆ１、Ｌ４および３Ｆ１；５Ｆ１、Ｌ４および３Ｆ２；５Ｆ１、Ｌ４および３Ｆ３；５Ｆ１、Ｌ４および３Ｆ４；５Ｆ１、Ｌ４および３Ｆ５；５Ｆ１、Ｌ４および３Ｆ６；５Ｆ２、Ｌ４および３Ｆ１；５Ｆ２、Ｌ４および３Ｆ２；５Ｆ２、Ｌ４および３Ｆ３；５Ｆ２、Ｌ４および３Ｆ４；５Ｆ２、Ｌ４および３Ｆ５；５Ｆ２、Ｌ４および３Ｆ６；５Ｆ３、Ｌ４および３Ｆ１；５Ｆ３、Ｌ４および３Ｆ２；５Ｆ３、Ｌ４および３Ｆ３；５Ｆ３、Ｌ４および３Ｆ４；５Ｆ３、Ｌ４および３Ｆ５；５Ｆ３、Ｌ４および３Ｆ６；５Ｆ４、Ｌ４および３Ｆ１；５Ｆ４、Ｌ４および３Ｆ２；５Ｆ４、Ｌ４および３Ｆ３；５Ｆ４、Ｌ４および３Ｆ４；５Ｆ４、Ｌ４および３Ｆ５；５Ｆ４、Ｌ４および３Ｆ６；５Ｆ１、Ｌ５および３Ｆ１；５Ｆ１、Ｌ５および３Ｆ２；５Ｆ１、Ｌ５および３Ｆ３；５Ｆ１、Ｌ５および３Ｆ４；５Ｆ１、Ｌ５および３Ｆ５；５Ｆ１、Ｌ５および３Ｆ６；５Ｆ２、Ｌ５および３Ｆ１；５Ｆ２、Ｌ５および３Ｆ２；５Ｆ２、Ｌ５および３Ｆ３；５Ｆ２、Ｌ５および３Ｆ４；５Ｆ２、Ｌ５および３Ｆ５；５Ｆ２、Ｌ５および３Ｆ６；５Ｆ３、Ｌ５および３Ｆ１；５Ｆ３、Ｌ５および３Ｆ２；５Ｆ３、Ｌ５および３Ｆ３；５Ｆ３、Ｌ５および３Ｆ４；５Ｆ３、Ｌ５および３Ｆ５；５Ｆ３、Ｌ５および３Ｆ６；５Ｆ４、Ｌ５および３Ｆ１；５Ｆ４、Ｌ５および３Ｆ２；５Ｆ４、Ｌ５および３Ｆ３；５Ｆ４、Ｌ５および３Ｆ４；５Ｆ４、Ｌ５および３Ｆ５；または５Ｆ４、Ｌ５および３Ｆ６を含み得る。

【0066】

一実施形態では、分子骨格は、当該分野で公知の１つまたはそれ以上のリンカーを含み得る。リンカーは、領域間を、または１つの分子骨格を別の分子骨格から分離し得る。非限定的な一例として、分子骨格はポリシストロニックであり得る。

【0067】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、以下の特性の少なくとも１つを用いて設計される：ループ変異体、シードミスマッチ／バルジ／ウォブル型変異体、ステムミスマッチ、ループ変異体および基底ステムミスマッチ変異体、シードミスマッチおよび基底ステムミスマッチ変異体、ステムミスマッチおよび基底ステムミスマッチ変異体、シードウォブル型および基底ステムウォブル型変異体、あるいはステム配列変異体。

【0068】

一実施形態では、分子骨格は、プロモーター（例えば、ＣＭＶ、Ｕ６、ＣＢＡ、またはＳＶ４０イントロンを有するＣＢＡプロモーターを含むが、これらに限定されない）の下流に位置し得る。さらに、分子骨格は、ポリアデニル化配列の上流に位置し得る。非限定的な一例として、分子骨格は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以内にまたは３０ヌクレオチド以上だけ、前記プロモーターから下流に、および／または前記ポリアデニル化配列の上流に位置し得る。非限定的な一例として、分子骨格は、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０あるいは２５～３０ヌクレオチド以内の、前記プロモーターから下流に、および／または前記ポリアデニル化配列の上流に位置し得る。非限定的な一例として、分子骨格は、ヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％以内または２５％以上の、プロモーターから下流に、および／またはポリアデニル化配列の上流に位置し得る。別の非限定的な例として、分子骨格は、最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％、または２０～２５％以内の、プロモーターから下流に、および／またはポリアデニル化配列の上流に位置し得る。

【0069】

一実施形態では、分子骨格は、ポリアデニル化配列の上流に位置し得る。さらに、分子骨格は、プロモーター（例えば、ＣＭＶ、Ｕ６、ＣＢＡ、またはＳＶ４０イントロンを有するＣＢＡプロモーターを含むが、これらに限定されない）の下流に位置し得る。非限定的な一例として、分子骨格は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以内にまたは３０ヌクレオチド以上だけ、前記プロモーターから下流に、および／または前記ポリアデニル化配列の上流に位置し得る。非限定的な一例として、分子骨格は、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０あるいは２５～３０ヌクレオチド以内の、前記プロモーターから下流に、および／または前記ポリアデニル化配列の上流に位置し得る。非限定的な一例として、分子骨格は、ヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％以内または２５％以上の、プロモーターから下流に、および／またはポリアデニル化配列の上流に位置し得る。別の非限定的な例として、分子骨格は、最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％、または２０～２５％以内の、プロモーターから下流に、および／またはポリアデニル化配列の上流に位置し得る。

【0070】

一実施形態では、分子骨格はｓｃＡＡＶに位置し得る。
一実施形態では、分子骨格はｓｓＡＡＶに位置し得る。
一実施形態では、分子骨格は、フリップＩＴＲの５’末端近くに位置し得る。別の実施形態において、分子骨格は、フリップＩＴＲの３’末端の近くに位置し得る。さらに別の実施形態では、分子骨格は、フロップＩＴＲの５’末端近くに位置し得る。さらに別の実施形態では、分子骨格は、フロップＩＴＲの３’末端近くに位置し得る。一実施形態では、分子骨格は、フリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との間に位置し得る。一実施形態では、分子骨格は、フリップＩＴＲの３’末端およびフリップＩＴＲの５’末端の間に（例えば、フリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との間に、または、フロップＩＴＲの３’末端およびフリップＩＴＲの５’末端の間に）位置し得る。非限定的な一例として、分子骨格は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以内にまたは３０ヌクレオチド以上だけ、ＩＴＲ（例えば、フリップあるいはフロップＩＴＲ）の５’末端あるいは３’末端から下流に、位置し得る。非限定的な一例として、分子骨格は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以内にまたは３０ヌクレオチド以上だけ、ＩＴＲ（例えば、フリップあるいはフロップＩＴＲ）の５’末端あるいは３’末端から上流に、位置し得る。非限定的な一例として、分子骨格は、１～５，１～１０，１～１５，１～２０，１～２５，１～３０，５～１０，５～１５，５～２０，５～２５，５～３０，１０～１５，１０～２０，１０～２５，１０～３０，１５～２０，１５～２５，１５～３０，２０～２５，２０～３０あるいは２５～３０ヌクレオチド以内の、ＩＴＲ（例えば、フリップあるいはフロップＩＴＲ）の５’末端あるいは３’末端から下流に、位置し得る。非限定的な一例として、分子骨格は、１～５，１～１０，１～１５，１～２０，１～２５，１～３０，５～１０，５～１５，５～２０，５～２５，５～３０，１０～１５，１０～２０，１０～２５，１０～３０，１５～２０，１５～２５，１５～３０，２０～２５，２０～３０あるいは２５～３０ヌクレオチド以内の、ＩＴＲ（例えば、フリップあるいはフロップＩＴＲ）の５’末端あるいは３’末端から上流に、位置し得る。非限定的な一例として、分子骨格は、ヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％以内または２５％以上の、ＩＴＲ（例えば、フリップあるいはフロップＩＴＲ）の５’末端あるいは３’末端から上流に、位置し得る。別の非限定的な例として、分子骨格は、最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％、または２０～２５％以内の、プロモーターから下流に、および／またはポリアデニル化配列の上流に位置し得る。

【0071】

発現ベクター
一実施形態では、発現ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、本明細書に記載の分子骨格の少なくとも１つを含む調節性ポリヌクレオチドの少なくとも１つを含み得る。

【0072】

一実施形態では、発現ベクターは、ＩＴＲからＩＴＲ５’から３’まで、ＩＴＲ、プロモーター、イントロン、調節ポリヌクレオチド、ポリＡ配列およびＩＴＲを含み得る。
ゲノムサイズ
一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むベクターゲノムは、一本鎖または二重鎖ベクターゲノムであり得る。ベクターゲノムのサイズは、小、中、大または最大であり得る。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。

【0073】

一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むベクターゲノムは、小さな一本鎖ベクターゲノムであり得る。小さな一本鎖ベクターゲノムは、サイズが約２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４および３．５ｋｂのように、サイズが２．７から３．５ｋｂであり得る。非限定的な例として、小さな一本鎖ベクターゲノムは、３．２ｋｂのサイズであり得る。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。

【0074】

一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むベクターゲノムは、小さな二本鎖ベクターゲノムであり得る。小さな二本鎖ベクターゲノムは、約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７ｋｂのサイズのように、サイズが１．３から１．７ｋｂであってもよい。非限定的な例として、小さな二本鎖ベクターゲノムは、１．６ｋｂのサイズであり得る。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。

【0075】

一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むベクターゲノムは、中型一本鎖ベクターゲノムであり得る。中程度の一本鎖ベクターゲノムは、サイズが約３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２および４．３ｋｂのように、サイズが３．６から４．３ｋｂであってもよい。非限定的な例として、中程度の一本鎖ベクターゲノムは、４．０ｋｂのサイズであり得る。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。

【0076】

一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むベクターゲノムは、中程度の二本鎖ベクターゲノムであり得る。中程度の二本鎖ベクターゲノムは、サイズが約１．８、１．９、２．０および２．１ｋｂのように、１．８から２．１ｋｂのサイズであり得る。非限定的な例として、中程度の二本鎖ベクターゲノムは、２．０ｋｂのサイズであり得る。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。

【0077】

一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むベクターゲノムは、大きな一本鎖ベクターゲノムであり得る。大きな一本鎖ベクターゲノムは、サイズが約４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９および６．０ｋｂのように、サイズが４．４から６．０ｋｂであってもよい。非限定的な例として、大きな一本鎖ベクターゲノムは、４．７ｋｂのサイズであり得る。別の非限定的な例として、大きな一本鎖ベクターゲノムは、４．８ｋｂのサイズであり得る。さらに別の非限定的な例として、大きな一本鎖ベクターゲノムは、サイズが６．０ｋｂであってもよい。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。

【0078】

一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むベクターゲノムは、大きな二本鎖ベクターゲノムであり得る。大きな二本鎖ベクターゲノムは、約２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９および３．０ｋｂのサイズのように、２．２から３．０ｋｂのサイズであり得る。非限定的な例として、大きな二本鎖ベクターゲノムは、２．４ｋｂのサイズであり得る。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。

【0079】

プロモーター
当業者は、標的細胞が、種特異的、誘導性、組織特異的または細胞周期特異的なプロモーターを含むがこれらに限定されるものではない特異的なプロモーターを必要とすることを認識するであろう（Ｐａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．３：１１４５－９（１９９７）；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｍｅｄ．３：１１４５－９（１９９７）；その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0080】

一実施形態では、プロモーターは、調節性ポリヌクレオチド中のペイロードに効率的であると考えられるプロモーターである。
一実施形態では、プロモーターは、標的とされる細胞に対して効率的であると考えられるプロモーターである。

【0081】

一実施形態では、プロモーターは、標的組織（神経系組織を含むが、これに限定されるものではない）において、ある期間中ペイロードの発現を提供する弱いプロモーターである。発現は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間後、１６時間後、１７時間後、１８時間後、１９時間後、２０時間後、２１時間後、２２時間後、２３時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、３週間、２２日、２３日、２４日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１１ヶ月、１年、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年、６年、７年、８年、９年、１０年、または１０年以上の期間、持続する。発現は、１～５時間、１～１２時間、１～２日、１～５日、１～２週間、１～３週間、１～４週間、１～２ヶ月、１～４ヶ月、１ ６～６ヶ月、３～６ヶ月、３～９ヶ月、４～８ヶ月、６～１２ヶ月、１～２年、１～５年、２～５年、３～６年、３～８、４～８年、または５～１０年の期間、持続する。非限定的な一例として、プロモーターは、神経組織におけるペイロードの持続的発現のための弱いプロモーターである。

【0082】

一実施形態では、プロモーターは、１ｋｂ未満のプロモーターであってよい。プロモーターは、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、あるいは８００以上の長さであってよい。プロモーターは、２００～３００，２００～４００，２００～５００，２００～６００，２００～７００，２００～８００，３００～４００，３００～５００，３００～６００，３００～７００，３００～８００、４００～５００，４００～６００，４００～７００，４００～８００，５００～６００，５００～７００，６００～８００，６００～７００，６００～８００，７００～８００の長さであってよい。

【0083】

一実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶおよびＣＢＡを含むがこれらに限定されない２つあるいはそれ以上の構成要素の組み合わせであってよい。各構成要素は、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００または８００以上の長さであってよい。各構成要素は、２００－３００、２００－４００、２００－５００、２００－６００、２００－７００、２００－８００、３００－４００、３００－５００、３００－６００、３００－７００、３００－８００、４００－５００、４００－６００、４００－７００、４００－８００、５００－６００、５００－７００、５００－８００、６００－７００、６００－８００、７００－８００の長さを有することができる。非限定的な一例として、プロモーターは、３８２ヌクレオチドのＣＭＶエンハンサー配列と２６０ヌクレオチドのＣＢＡプロモーター配列との組み合わせである。

【0084】

一実施形態では、ベクターゲノムは、導入遺伝子標的特異性および発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．参照 Ｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５；その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。導入遺伝子標的特異性および発現を増強するエレメントの非限定的な例には、プロモーター、内在性ｍｉＲＮＡ、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、ポリアデニル化（ＰｏｌｙＡ）シグナル配列および上流エンハンサー（ＵＳＥ）、ＣＭＶエンハンサーおよびイントロンがある。

【0085】

一実施形態では、ベクターゲノムは、導入遺伝子標的特異性および発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．参照 Ｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５；その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ほとんどの組織において発現を促進するプロモーターには、ヒト伸長因子１α－サブユニット（ＥＦ１α）、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）およびその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、またはユビキチンＣ（ＵＢＣ）が含まれるが、それらに限定されない。組織特異的発現要素を使用して、発現をニューロン、星状細胞、または希突起膠細胞に制限するために使用することができる特定の細胞型（神経系プロモーターを含むがこれに限定されない）に発現を制限することができる。ニューロンの組織特異的発現エレメントの非限定的な例には、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来成長因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ－β）、シナプシン（Ｓｙｎ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、ＣａＭＫＩＩ、ｍＧｌｕＲ２、ＮＦＬ、ＮＦＨ、ｎβ２、ＰＰＥ、ＥｎｋおよびＥＡＡＴ２プロモーターが含まれる。星状細胞の組織特異的発現エレメントの非限定的な例には、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびＥＡＡＴ２プロモーターが含まれる。希突起膠細胞に対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターである。

【0086】

一実施形態では、ベクターゲノムはユビキタスプロモーターを含む。ユビキタスプロモーターの非限定的な例には、ＣＭＶ、ＣＢＡ（誘導体ＣＡＧ、ＣＢｈなどを含む）、ＥＦ－１α、ＰＧＫ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ（ｈＧＢｐ）、およびＵＣＯＥ（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３のプロモーター）が挙げられる。Ｙｕら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｉｎ ２０１１，７：６３；その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ラットＤＲＧ細胞および一次ＤＲＧ細胞におけるＣＡＧ、ＥＦＩα、ＰＧＫおよびＵＢＣプロモーター下でのｅＧＦＰの発現をレンチウイルスベクターを用いて評価し、ＵＢＣがその他の３つのプロモーターよりも弱い発現しか示さず、すべてのプロモーターに対してわずか１０～１２％のグリア発現しか見られなかったことを見出した。Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍら（Ｅ．Ｎｅｕｒｏ ２０１５；この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、運動皮質に注入後のＡＡＶ８におけるＣＭＶおよびＵＢＣプロモーターによるｅＧＦＰの発現、およびＣＭＶプロモーターによるＡＡＶ２におけるｅＧＦＰの発現を評価した。ＵＢＣまたはＥＦＩαプロモーターを含むプラスミドの鼻腔内投与は、ＣＭＶプロモーターによる発現よりも長く持続した気道発現を示した（例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００１，Ｖｏｌ．８，１５３９－１５４６を参照せよ；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。Ｈｕｓａｉｎら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００９；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、ｈＧＵＳＢプロモーター、ＨＳＶ－１ＬＡＴプロモーターおよびＮＳＥプロモーターを用いてＨβＨ構築物を評価し、ＨβＨ構築物はマウスの脳においてＮＳＥよりも弱い発現を示すことを見出した。ＰａｓｓｉｎｉおよびＷｏｌｆｅ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００１，１２３８２－１２３９２；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、新生仔マウスの脳室内注射後のＨβＨベクターの長期効果を評価し、少なくとも１年間は持続的な発現があることを見いだした。（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００１，８，１３２３－１３３２；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、ＮＦ－ＬおよびＮＦ－Ｈプロモーターを使用した場合に、ＣＭＶ－ｌａｃＺ、ＣＭＶ－ｌｕｃ、ＥＦ、ＧＦＡＰ、ｈＥＮＫ、ｎＡＣｈＲ、ＰＰＥ、ＰＰＥ ＋ ｗｐｒｅ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）およびＮＳＥ（１．８ｋｂ ＋ ｗｐｒｅ）に比較して、Ｘｕらは、プロモーター活性の降順が、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）、ＥＦ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＧＦＡＰ、ＣＭＶ、ｈＥＮＫ、ＰＰＥ、ＮＦＬおよびＮＦＨであることを見出した。ＮＦＬは６５０ヌクレオチドのプロモーターであり、ＮＦＨは９２０ヌクレオチドのプロモーターである。いずれも肝臓には存在しないが、ＮＦＨは感覚固有受容性ニューロン、脳および脊髄に豊富であり、ＮＦＨは心臓に存在する。Ｓｃｎ８ａは、ＤＲＧ、脊髄および脳全体にわたって発現し、海馬ニューロンおよび小脳プルキンエ細胞、皮質、視床および視床下部に特に高い発現が見られる４７０ヌクレオチドのプロモーターである（例えば、Ｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．２００７およびＲａｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．２００４を参照せよ；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。

【0087】

一実施形態では、ベクターゲノムはＵＢＣプロモーターを含む。ＵＢＣプロモーターは、３００～３５０ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な一例として、ＵＢＣプロモーターは３３２ヌクレオチドの長さである。

【0088】

一実施形態では、ベクターゲノムはＧＵＳＢプロモーターを含む。ＧＵＳＢプロモーターは、３５０～４００ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な例として、ＧＵＳＢプロモーターは３７８ヌクレオチドの長さである。非限定的な一例として、構築物は、ＡＡＶ－プロモーター－ＣＭＶ／グロビンイントロンｈＦＸＮ－ＲＢＧであってよく、この構築物では、ＡＡＶが自己相補的であってよく、ＡＡＶがＤＪ血清型であってよい。

【0089】

一実施形態では、ベクターゲノムはＮＦＬプロモーターを含む。ＮＦＬプロモーターは、６００～７００ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な一例として、ＮＦＬプロモーターは６５０ヌクレオチドの長さである。非限定的な一例として、構築物は、ＡＡＶ－プロモーター－ＣＭＶ／グロビンイントロンｈＦＸＮ－ＲＢＧであってよく、この構築物では、ＡＡＶが自己相補的であってよく、ＡＡＶがＤＪ血清型であってよい。

【0090】

一実施形態では、ベクターゲノムはＮＦＨプロモーターを含む。前記ＮＦＨプロモーターは、９００～９５０ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な一例として、ＮＦＨプロモーターは９２０ヌクレオチドの長さである。非限定的な一例として、構築物は、ＡＡＶ－プロモーター－ＣＭＶ／グロビンイントロンｈＦＸＮ－ＲＢＧであってよく、この構築物では、ＡＡＶが自己相補的であってよく、ＡＡＶがＤＪ血清型であってよい。

【0091】

一実施形態では、ベクターゲノムはｓｃｎ８ａプロモーターを含む。ｓｃｎ８ａプロモーターは、４５０～５００ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な一例として、ｓｃｎ８ａプロモーターは４７０ヌクレオチドの長さである。非限定的な一例として、構築物は、ＡＡＶ－プロモーター－ＣＭＶ／グロビンイントロンｈＦＸＮ－ＲＢＧであってよく、この構築物では、ＡＡＶが自己相補的であってよく、ＡＡＶがＤＪ血清型であってよい。

【0092】

一実施形態では、ベクターゲノムはＦＸＮプロモーターを含む。
一実施形態では、ベクターゲノムはＰＧＫプロモーターを含む。
一実施形態では、ベクターゲノムはＣＢＡプロモーターを含む。

【0093】

一実施形態では、ベクターゲノムはＣＭＶプロモーターを含む。
一実施形態では、ベクターゲノムは、肝臓または骨格筋プロモーターを含む。肝臓プロモーターの非限定的な例には、ｈＡＡＴおよびＴＢＧが挙げられる。骨格筋プロモーターの非限定的な例には、Ｄｅｓｍｉｎ、ＭＣＫおよびＣ５－１２が挙げられる。

【0094】

一実施形態では、発現ベクターは、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび／または５’ＵＴＲイントロンを含む。エンハンサーには、ＣＭＶエンハンサーが含まれるがそれに限定されず、プロモーターには、ＣＭＶ、ＣＢＡ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＮＳＥ、シナプシン、ＭｅＣＰ２、およびＧＦＡＰプロモーターが含まれるがそれらに限定されず、５’ＵＴＲ／イントロンには、ＳＶ４０およびＣＢＡ－ＭＶＭが含まれるがそれらに限定されない。非限定的な例として、組み合わせて使用されるエンハンサー、プロモーターおよび／またはイントロンには以下が挙げられる：（１）ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０ ５’ＵＴＲイントロン；（２）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、ＳＶ４０ ５’ＵＴＲイントロン；（３）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、ＣＢＡ－ＭＶＭ ５’ＵＴＲイントロン；（４）ＵＢＣプロモーター；（５）ＧＵＳＢプロモーター；（６）ＮＳＥプロモーター；（７）シノプシンプロモーター；（８）ＭｅＣＰ２プロモーターおよび（９）ＧＦＡＰプロモーター。

【0095】

一実施形態では、発現ベクターは操作されたプロモーターを有する。
イントロン
一実施形態では、ベクターゲノムは、導入遺伝子標的特異性および発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．参照 Ｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、例えばイントロン。イントロンの非限定的な例には、ＭＶＭ（６７～９７ ｂｐｓ）、Ｆ．ＩＸ短縮イントロン１（３００ ｂｐｓ）、βグロビンＳＤ／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプター（２５０ ｂｐｓ）、アデノウイルススプライスドナー／免疫グロブリンスプライスアクセプター（５００ ｂｐｓ）、ＳＶ４０晩期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）（１８０ｂｐｓ）、およびハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプター（２３０ｂｐｓ）が挙げられる。

【0096】

一実施形態では、イントロンは１００～５００ヌクレオチドの長さを有し得る。イントロンは、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００の長さを有し得る。プロモーターは、８０－１００、８０－１２０、８０－１４０、８０－１６０、８０－１８０、８０－２００、８０－２５０、８０－３００、８０－３５０、８０－４００、８０－４５０、８０－５００、２００－３００、２００－４００、２００－５００、３００－４００、３００－５００または４００－５００の長さを有し得る。

【0097】

細胞への導入
本発明の調節性ポリヌクレオチドは、様々なアプローチのいずれかを用いて宿主細胞に導入することができる。調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターによる感染が影響され得る。適切なウイルスベクターの例には、複製欠損レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、およびレンチウイルスベクターが挙げられる。

【0098】

本発明によれば、治療および／または診断に使用するためのウイルスベクターは、目的の核酸ペイロードまたはカーゴの形質導入に必要な最小構成要素まで蒸留または還元されたウイルスを含む。

【0099】

このようにして、ウイルスベクターは特異的投与のための媒体として設計され、そのようなウイルスベクターは野生型ウイルスに見られる有害な複製および／または組み込みの特徴を欠いている。

【0100】

本明細書中で使用されている「ベクター」という語は、本発明の調節性ポリヌクレオチドのような異種分子を輸送、形質導入、またはそのキャリアとして作用する任意の分子または部分を指す。「ウイルスベクター」とは、関心の持たれているペイロード分子をコードするかまたはそれを含む１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド領域を含むベクターであり、その例には、導入遺伝子、ポリペプチドまたはマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは調節性核酸が挙げられる。本発明のウイルスベクターは、組換えにより産生されてよく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親または参照配列に基づくものであってもよい。本発明において有用であり得る血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ－ＤＪ８が含まれる。

【0101】

一実施形態において、本発明において有用であり得る血清型は、ＡＡＶ－ＤＪ８であり得る。ＡＡＶ－ＤＪ８のアミノ酸配列は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を除去するために、２つまたはそれ以上の突然変異を含んでいてよい。その全体が参照により本発明に組み込まれている内容である、米国特許第７，５８８，７７２号の１には、以下の２つの突然変異が含まれる：（１）アミノ酸５８７におけるアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変化しているＲ５８７Ｑ、および（２）アミノ酸５９０におけるアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がスレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変化しているＲ５９０Ｔ。別の非限定的な一例として、当該ＡＡＶ－ＤＪ配列は、以下に示す３つの突然変異を含んでいてよい：（１）アミノ酸４０６のリシン（Ｋ；Ｌｙｓ）がアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）に変化したＫ４０６Ｒ、（２）アミノ酸５８７のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変化したＲ５８７Ｑ、（３）アミノ酸５９０のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がスレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変化したＲ５９０Ｔ。

【0102】

ＡＡＶベクターはまた、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）を含んでいてよい。ｓｃＡＡＶベクターは、双方のＤＮＡ鎖を含み、それらが共にアニーリングし、二本鎖ＤＮＡを形成する。第二鎖合成をスキップすることにより、ｓｃＡＡＶは細胞内での迅速な発現を可能にする。

【0103】

一実施形態では、本発明で使用されるＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶである。
一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、任意の関連種（例えば、ヒト、イヌ、マウス、ラットまたはサルが含まれるが、それらに限定されない）から細胞に導入することができる。

【0104】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、治療される疾患に関連する細胞に導入することができる。非限定的な例として、その疾患はＡＬＳであり、標的細胞は運動ニューロンおよび星状細胞である。

【0105】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、標的配列の内在性発現が高い細胞に導入することができる。
別の実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、標的配列の内在性発現が低い細胞に導入することができる。

【0106】

一実施形態では、その細胞は、ＡＡＶ形質導入の高い効率を有するものであってよい。
１つの実施形態において、調節性ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析に使用され得る細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ヒト初代星状細胞、ヒト星状細胞株（Ｕ２５１ＭＧ）、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ニューロンおよびヒトｉＰＳＣ由来運動ニューロン前駆細胞が含まれるが、それらに限定されない。

【0107】

標的核酸
本発明の調節性ポリヌクレオチドは、コード遺伝子およびノンコーディング遺伝子を含む任意の遺伝子または核酸構築物を標的とすることができる。ヒトまたは霊長類のタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を標的とすることができる。さらに、ノンコーディング遺伝子（例えば、長ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ））も標的とすることができる。

【0108】

そのようなｌｎｃＲＮＡ分子およびそのようなｌｎｃＲＮＡを標的とするように設計されたＲＮＡｉ構築物の例（それらのすべてが、調節性ポリヌクレオチドによって標的化されている）は、それぞれ国際公開ＷＯ２０１２／０１８８８１Ａ２に教示されており、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0109】

一実施形態では、本発明の調節性ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の遺伝子を標的とすることができる。非限定的な一例として、遺伝子はＳＯＤ１であり得る。
一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、１５～１９ヌクレオチド長の配列を標的とすることができる。非限定的な一例として、標的は、表１に記載されている配列のいずれかであり得る。別の非限定的な一例として、標的は、ＮＭ＿０００４５４．４のヌクレオチド４０６～４２４であり得る。さらに別の非限定的な一例として、標的は、ＮＭ＿０００４５４．４のヌクレオチド６４５～６６１であり得る。

【0110】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、２１ヌクレオチド長の配列を標的とすることができる。一態様では、標的は、ＮＭ＿０００４５４．４の任意の２１ｍｅｒ配列または当該分野で公知の任意の遺伝子であり得る。非限定的な一例として、標的は、ＮＭ＿０００４５４．４のヌクレオチド５２１～５４１であり得る。別の非限定的な一例として、標的は、ＮＭ＿０００４５４．４のヌクレオチド６３９～６５９であり得る。別の非限定的な一例として、標的は、ＮＭ＿０００４５４．４のヌクレオチド６４０～６６０であり得る。別の非限定的な一例として、標的は、ＮＭ＿０００４５４．４のヌクレオチド６４５～６６５であり得る。別の非限定的な一例として、標的は、ＮＭ＿０００４５４．４のヌクレオチド６６４～６８４であり得る。

【0111】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドは、ヒトゲノム中の任意の遺伝子またはｍＲＮＡ（例えば、ハンチントン病、ＡＬＳなどを含むがこれらに限定されないＣＮＳ障害に関連する遺伝子）を標的とするように設計することができる。

【0112】

医薬組成物
本明細書の医薬組成物、すなわち投与されるペイロードを含む調節性ポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶなどのウイルスのようなコーディングプラスミドまたは発現ベクター）の記載は、主にヒトへの投与に適した医薬組成物に関するものであるけれども、当業者は、そのような組成物が、一般に、その他の動物（例えば、非ヒト哺乳動物などのヒト以外の動物）への投与に適していることを理解するであろう。医薬組成物を種々の動物への投与に適したものにするために、ヒトへの投与に適した医薬組成物の改変はよく理解されており、通常の熟練した獣医学の薬理学者は、もし実験を行なうとすれば、単に通常の実験でこのような改変を設計および／または実施することができる。当該医薬組成物の投与が企図される対象には、ヒトおよび／または他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウスおよび／またはラットのような商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳類；および／または家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウのような商業的に関連する鳥類を含むが、それらに限定されない。

【0113】

いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒトの患者、または対象に投与される。本開示の目的のために「有効成分」という語句は、一般に、ペイロードを担持するウイルスベクター、または本明細書に記載のウイルスベクターによって投与される調節性ポリヌクレオチドペイロード分子のいずれかを指す。

【0114】

本明細書に記載された医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において既知または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つまたはそれ以上の他の補助成分と会合させる工程を包含し、必要であればおよび／または望ましい場合には、生成物を所望の単回投与単位または複数回投与単位に、分割し、成形し、および／または包装する工程をも包含する。

【0115】

本発明による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤および／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズおよび／または状態に依存して変化し、さらに組成物が投与されるルートに依存して変化する。

【0116】

製剤化
調節性ポリヌクレオチドまたはそれらをコードするウイルスベクターは、以下の１つまたはそれ以上の賦形剤を用いて製剤化することができる：（１）安定性を高める；（２）細胞トランスフェクションまたは形質導入を高める；（３）持続放出または遅延放出を可能にする；（４）生体内分布を変化させる（例えば、ウイルスベクターを特定の組織または細胞型に標的化する）。

【0117】

本発明の製剤には、限定することなく、生理食塩水、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア－シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターでトランスフェクションした細胞（例えば、対象への移植のための細胞）、ナノ粒子模倣物、およびそれらの組み合わせを含めてよい。さらに、本発明のウイルスベクターは、自己組織化核酸ナノ粒子を用いて製剤化してよい。

【0118】

本明細書に記載された医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において既知または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、有効成分を賦形剤および／または１つまたはそれ以上の他の補助成分と会合させる工程を含む。

【0119】

本開示による医薬組成物は、バルクで、単一の単位用量として、および／または複数の単一単位用量として調製、包装および／または販売されてよい。本明細書では、「単位用量」という語は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。活性成分の量は、一般的に、対象に投与されるであろう活性成分の用量および／またはこのような用量の特定のニーズを満たす一部分（例えば、そのような用量の半分または三分の一）に等しい。

【0120】

本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤および／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズおよび／または状態に依存して変化し、さらに組成物が投与されるルートに依存して変化する。例えば、組成物は、０．１％～９９％（ｗ／ｗ）の有効成分を含んでいてよい。一例として、組成物は、０．１％～１００％（例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ））の活性成分を含んでいてよい。

【0121】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、少なくとも１つのペイロード分子を含み得る。非限定的な一例として、製剤は、１個、２個、３個、４個、または５個の調節性ポリヌクレオチドペイロード分子を含み得る。一実施形態では、該製剤は、以下を含むがこれらに限定されないカテゴリーから選択されたタンパク質を標的とする調節性ポリヌクレオチドペイロード構築物を含み得る：ヒトタンパク質、動物由来タンパク質、細菌タンパク質、生物学的タンパク質、抗体、免疫原性タンパク質、治療用ペプチドおよびタンパク質、分泌タンパク質、形質膜タンパク質、細胞質および細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連するタンパク質および／または非ヒト疾患に関連するタンパク質。一実施形態では、製剤は、少なくとも３つのペイロードコンストラクト標的タンパク質を含む。

【0122】

いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋であってよい。いくつかの実施形態において、賦形剤は、ヒトおよび獣医学のための使用が承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤が、米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、医薬グレードのものである。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方および／または国際薬局方の基準を満たす。

【0123】

本明細書では、賦形剤は、所望の特定の剤形に適したものである限り、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤などを含むが、これらに限定されない。医薬組成物を調製するための様々な賦形剤および組成物を調製するための技術は、当該分野で公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１^ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照せよ；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的効果を生じさせることによって、あるいは医薬組成物の他の成分（群）と有害に相互作用することによって、ある物質またはその誘導体と不適合でない限りにおいては、従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内で考えられてよい。

【0124】

希釈剤の例には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム乳糖、ショ糖、セルロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末糖等、および／またはそれらの組み合わせが含まれるが、それらの限定されない。

【0125】

不活性成分
いくつかの実施形態では、調節性ポリヌクレオチド製剤は、不活性成分である少なくとも１つの賦形剤を含み得る。本明細書中では、「不活性成分」という語は、製剤に含まれる１つ以上の不活性薬剤を指す。いくつかの実施形態では、本発明の処方物において使用され得る不活性成分の全てまたは一部は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されているか、あるいは承認されていない。

【0126】

本明細書に開示されている調節性ポリヌクレオチドを有するウイルスベクターの製剤は、カチオンまたはアニオンを含み得る。一実施形態では、製剤は、限定されないが、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ＋およびそれらの組み合わせなどの金属カチオンを含む。非限定的な例として、製剤は、金属カチオンと複合体を形成するポリマーおよび調節性ポリヌクレオチドを含み得る（例えば、米国特許第６，２６５，３８９および６，５５５，５２５を参照せよ；それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0127】

投与
本発明の調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、治療上有効な結果をもたらす任意の経路によって投与することができる。これらの経路には、腸内（腸内に）、胃腸内、硬膜外（硬膜内に）、経口（口を介して）、経皮、経皮、大脳内（大脳内）、脳室内（脳室に入る）、皮膚上への塗布（皮膚への塗布）、皮内（皮膚自体の中）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を通して）、静脈内（静脈内に）、静脈内ボーラス、静脈点滴（静脈内に）、動脈（動脈内）、筋肉内（筋肉内に）、心臓内（心臓内に）、骨髄内注入（骨髄内に）、くも膜下腔内（脊柱管内）、腹腔内、（腹腔への輸液または注射）、膀胱内注入、硝子体内、（眼を通して）、海綿内注入（病的腔に）、腔内（陰茎の基部に）、膣内投与、子宮内、追加の羊水投与、経皮（全身分布のために無傷の皮膚を通した拡散）、経粘膜（粘膜を通した拡散）、経膣、吹送（吸入）、舌下、唇下、浣腸、点眼（結膜上）、耳下腺内、耳介（耳の中または耳を介して）、口腔（頬に向かって）、結膜、皮膚、歯（１つの歯または複数）、電気浸透、子宮頸部、内皮内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質性、腹腔内、羊水内、関節内、胆道内、気管支内、気管内、軟骨内（軟骨内）、仙骨内（仙骨内）、大槽内（大槽内の小脳髄腔内）、角膜内（角膜内）、歯内膜内、冠状動脈（冠動脈内）、海綿体内（陰茎の海綿体の膨張可能な空間内）、椎間板内（椎間板内）、導管内（腺管内）、十二指腸内（十二指腸内）、硬膜内（硬膜内またはその下）、表皮内（表皮内に）、食道内（食道に）、胃内（胃の内部に）、歯内組織内（歯肉内）、腹腔内（小腸の遠位部分内）、病巣内（局所の病変内または直接の導入）、管腔内（管の内腔内）、胸腔内（リンパ内）、髄内（骨の骨髄腔内）、髄膜内（髄膜内）、眼内（眼内）、卵巣内（卵巣内）、心膜内（心膜内）、胸膜内（胸膜内）、前立腺内（前立腺内）、肺内（肺または気管支内）、内腔（鼻腔または眼窩洞内）、脊髄内（脊柱内）、滑膜内（関節の滑膜腔内）、肩甲骨内（腱内）、精巣内（睾丸内）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルの脳脊髄液内）、胸腔内（胸腔内）、管腔内（器官の細管内）、腫瘍内（腫瘍内）、中耳内（オーロス媒体内）、血管内（血管または血管内）、心室内（心室内）、イオントフォレシス（可溶性塩のイオンが身体の組織に移動する電流）、灌漑（開いた創傷または体腔を浸したり洗い流す）、喉頭（喉頭に直接）、経鼻胃（鼻から胃の中に）、閉塞性包帯技術（局所経路投与後その領域を閉塞する包帯によって覆われる）、眼科（外眼に）、口腔咽頭（口および咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、回神経、歯周病、直腸、呼吸器（局所的または全身的効果のために経口または鼻吸入によって気道内に）、眼球後ろ（眼窩の後ろ、または眼球の後ろ）軟組織、くも膜下腔、結膜下、粘膜下層、局所、経胎盤（胎盤を通してまたは胎盤を横切って）、経気管（気管の壁を通して）、胸腔鏡（横隔膜腔を横切って、またはそれを通って）、尿管（尿管内）、尿道（尿道内）、膣、尾骨ブロック、診断、神経ブロック、胆道灌流、心臓灌流、フォトフェレーシスまたは脊髄が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、それらが血液脳関門、血管関門、またはその他の上皮障壁を越えることができるように投与され得る。一実施形態では、投与経路のための製剤は、少なくとも１つの不活性成分を含んでいてよい。

【0128】

投薬
本発明は、本発明によるウイルスベクターおよびそれらの調節性ポリヌクレオチドペイロードまたは複合体を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。ウイルスベクターの医薬用、造影用、診断用、または予防用の組成物は、疾患、障害、および／または状態（例えば、作業記憶障害に関連する疾患、障害、および／または状態）を予防、治療、診断または造影するのに有効な任意の量および投与経路を用いて、対象に投与することができる。正確な必要量は、対象の動物種、年齢、および一般的な状態、疾患の重篤度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに依存して、対象によって異なるであろう。本発明による組成物は、典型的には、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位剤形で処方される。しかし、本発明の組成物の１日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する治療上有効な、予防上有効な、または適切なイメージング用量のレベルは、以下を含む様々な要因によって決まる：治療される障害およびその障害の重篤度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事；使用される特定の調節性ポリヌクレオチドペイロードの投与時間、投与経路、および排泄速度；治療の持続時間；使用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；医学分野でよく知られている同様の要因。

【0129】

特定の実施形態では、本発明によるウイルスベクター医薬組成物は、対象の体重に対し１日当たり投与量で、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇを投与するのに十分な調節性ポリヌクレオチド用量レベルで、１日に１回あるいはそれ以上の頻度で投与し、所望の治療効果、診断効果、予防効果、または造影効果を得ることができる（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０７８１９９号に記載されている単位用量の範囲を参照せよ；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。所望の調節性ポリヌクレオチド用量は、１回以上（例えば、１日に１回以上の投与）投与することができる。特定の実施形態では、所望の調節性ポリヌクレオチド用量は、複数の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回。１１回、１２回、１３回、１４回またはそれ以上の投与）を行なって投与することができる。複数の投与を行なう場合、本明細書に記載されているような分割投与計画を使用することができる。本明細書で使用される「分割投与量」は、単回用量または一日総用量の２つ以上の用量への分割、例えば単回用量の２回以上の投与である。本明細書で使用される「単一単位用量」は、１回分用量／一回／１つの経路／１つの接触点で投与される任意の調節ポリヌクレオチド治療剤の用量、すなわち単回投与である。本明細書中で使用される場合、「１日の総投与量」は、２４時間に与えられる、または処方される量である。それは単一単位用量として投与することができる。一実施形態では、本発明の調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、分割用量で被験者に投与される。それらは、緩衝液中でのみ、または本明細書に記載の製剤中で処方することができる。

【0130】

一実施形態では、本発明による組成物の細胞への投与は、ＶＧをウイルスゲノム、ＶＧ／ｍＬを組成物濃度、ｍＬ／時間を延長された投与の速度とするとき、［ＶＧ／時間 ＝ ｍＬ／時間 ＊ ＶＧ／ｍＬ］によって定義される送達速度を含む。

【0131】

一実施形態では、本発明による組成物の細胞への送達は、被験者あたりの総濃度が約１ｘ１０^６ ＶＧから約１ｘ１０^１６ＶＧの間であり得る。いくつかの実施形態では、送達は、約１ｘ１０^６、２ｘ１０^６、３ｘ１０^６、４ｘ１０^６、５ｘ１０^６、６ｘ１０^６、７ｘ１０^６、８ｘ１０^６、９ｘ１０^６、１ｘ１０^７、２ｘ１０^７、３ｘ１０^７、４ｘ１０^７、５ｘ１０^７、６ｘ１０^７、７ｘ１０^７、８ｘ１０^７、９ｘ１０^７、１ｘ１０^８、２ｘ１０^８、３ｘ１０^８、４ｘ１０^８、５ｘ１０^８、６ｘ１０^８、７ｘ１０^８、８ｘ１０^８、９ｘ１０^８、１ｘ１０^９、２ｘ１０^９、３ｘ１０^９、４ｘ１０^９、５ｘ１０^９、６ｘ１０^９、７ｘ１０^９、８ｘ１０^９、９ｘ１０^９、１ｘ１０^１０、２ｘ１０^１０、３ｘ１０^１０、４ｘ１０^１０、５ｘ１０^１０、６ｘ１０^１０、７ｘ１０^１０、８ｘ１０^１０、９ｘ１０^１０、１ｘ１０^１１、２ｘ１０^１１、２．１ｘ１０^１１、２．２ｘ１０^１１、２．３ｘ１０^１１、２．４ｘ１０^１１、２．５ｘ１０^１１、２．６ｘ１０^１１、２．７ｘ１０^１１、２．８ｘ１０^１１、２．９ｘ１０^１１、３ｘ１０^１１、４ｘ１０^１１、５ｘ１０^１１、６ｘ１０^１１、７ｘ１０^１１、７．１ｘ１０^１１、７．２ｘ１０^１１、７．３ｘ１０^１１、７．４ｘ１０^１１、７．５ｘ１０^１１、７．６ｘ１０^１１、７．７ｘ１０^１１、７．８ｘ１０^１１、７．９ｘ１０^１１、８ｘ１０^１１、９ｘ１０^１１、１ｘ１０^１２、１．１ｘ１０^１２、１．２ｘ１０^１２、１．３ｘ１０^１２、１．４ｘ１０^１２、１．５ｘ１０^１２、１．６ｘ１０^１２、１．７ｘ１０^１２、１．８ｘ１０^１２、１．９ｘ１０^１２、２ｘ１０^１２、３ｘ１０^１２、４ｘ１０^１２、４．１ｘ１０^１２、４．２ｘ１０^１２、４．３ｘ１０^１２、４．４ｘ１０^１２、４．５ｘ１０^１２、４．６ｘ１０^１２、４．７ｘ１０^１２、４．８ｘ１０^１２、４．９ｘ１０^１２、５ｘ１０^１２、６ｘ１０^１２、７ｘ１０^１２、８ｘ１０^１２、８．１ｘ１０^１２、８．２ｘ１０^１２、８．３ｘ１０^１２、８．４ｘ１０^１２、８．５ｘ１０^１２、８．６ｘ１０^１２、８．７ｘ１０^１２、８．８ｘ１０^１２、８．９ｘ１０^１２、９ｘ１０^１２、１ｘ１０^１３、２ｘ１０^１３、３ｘ１０^１３、４ｘ１０^１３、５ｘ１０^１３、６ｘ１０^１３、６．７ｘ１０^１３、７ｘ１０^１３、８ｘ１０^１３、９ｘ１０^１３、１ｘ１０^１４、２ｘ１０^１４、３ｘ１０^１４、４ｘ１０^１４、５ｘ１０^１４、６ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、９ｘ１０^１４、１ｘ１０^１５、２ｘ１０^１５、３ｘ１０^１５、４ｘ１０^１５、５ｘ１０^１５、６ｘ１０^１５、７ｘ１０^１５、８ｘ１０^１５、９ｘ１０^１５、または１ｘ１０^１６ ＶＧ／ｓｕｂｊｅｃｔの組成物濃度であり得る。

【0132】

一実施形態では、本発明による組成物の細胞への送達は、被験者あたりの総濃度が約１ｘ１０^６ ＶＧ／ｋｇから１ｘ１０^１６ ＶＧ／ｋｇの間である。いくつかの実施形態では、投与は、１ｘ１０^６、２ｘ１０^６、３ｘ１０^６、４ｘ１０^６、５ｘ１０^６、６ｘ１０^６、７ｘ１０^６、８ｘ１０^６、９ｘ１０^６、１ｘ１０^７、２ｘ１０^７、３ｘ１０^７、４ｘ１０^７、５ｘ１０^７、６ｘ１０^７、７ｘ１０^７、８ｘ１０^７、９ｘ１０^７、１ｘ１０^８、２ｘ１０^８、３ｘ１０^８、４ｘ１０^８、５ｘ１０^８、６ｘ１０^８、７ｘ１０^８、８ｘ１０^８、９ｘ１０^８、１ｘ１０^９、２ｘ１０^９、３ｘ１０^９、４ｘ１０^９、５ｘ１０^９、６ｘ１０^９、７ｘ１０^９、８ｘ１０^９、９ｘ１０^９、１ｘ１０^１０、２ｘ１０^１０、３ｘ１０^１０、４ｘ１０^１０、５ｘ１０^１０、６ｘ１０^１０、７ｘ１０^１０、８ｘ１０^１０、９ｘ１０^１０、１ｘ１０^１１、２ｘ１０^１１、２．１ｘ１０^１１、２．２ｘ１０^１１、２．３ｘ１０^１１、２．４ｘ１０^１１、２．５ｘ１０^１１、２．６ｘ１０^１１、２．７ｘ１０^１１、２．８ｘ１０^１１、２．９ｘ１０^１１、３ｘ１０^１１、４ｘ１０^１１、５ｘ１０^１１、６ｘ１０^１１、７ｘ１０^１１、７．１ｘ１０^１１、７．２ｘ１０^１１、７．３ｘ１０^１１、７．４ｘ１０^１１、７．５ｘ１０^１１、７．６ｘ１０^１１、７．７ｘ１０^１１、７．８ｘ１０^１１、７．９ｘ１０^１１、８ｘ１０^１１、９ｘ１０^１１、１ｘ１０^１２、１．１ｘ１０^１２、１．２ｘ１０^１２、１．３ｘ１０^１２、１．４ｘ１０^１２、１．５ｘ１０^１２、１．６ｘ１０^１２、１．７ｘ１０^１２、１．８ｘ１０^１２、１．９ｘ１０^１２、２ｘ１０^１２、３ｘ１０^１２、４ｘ１０^１２、４．１ｘ１０^１２、４．２ｘ１０^１２、４．３ｘ１０^１２、４．４ｘ１０^１２、４．５ｘ１０^１２、４．６ｘ１０^１２、４．７ｘ１０^１２、４．８ｘ１０^１２、４．９ｘ１０^１２、５ｘ１０^１２、６ｘ１０^１２、７ｘ１０^１２、８ｘ１０^１２、８．１ｘ１０^１２、８．２ｘ１０^１２、８．３ｘ１０^１２、８．４ｘ１０^１２、８．５ｘ１０^１２、８．６ｘ１０^１２、８．７ｘ１０^１２、８．８ｘ１０^１２、８．９ｘ１０^１２、９ｘ１０^１２、１ｘ１０^１３、２ｘ１０^１３、３ｘ１０^１３、４ｘ１０^１３、５ｘ１０^１３、６ｘ１０^１３、６．７ｘ１０^１３、７ｘ１０^１３、８ｘ１０^１３、９ｘ１０^１３、１ｘ１０^１４、２ｘ１０^１４、３ｘ１０^１４、４ｘ１０^１４、５ｘ１０^１４、６ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、９ｘ１０^１４、１ｘ１０^１５、２ｘ１０^１５、３ｘ１０^１５、４ｘ１０^１５、５ｘ１０^１５、６ｘ１０^１５、７ｘ１０^１５、８ｘ１０^１５、９ｘ１０^１５または１ｘ１０^１６ ＶＧ／ｋｇの組成物濃度であり得る。

【0133】

一実施形態では、１用量あたり約１０^５から１０^６ウイルスゲノム（単位）を投与することができる。
一実施形態では、本発明による組成物の細胞への投与は、総濃度が約１ｘ１０^６ ＶＧ／ｍＬから１ｘ１０^１６ ＶＧ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、投与は、約１ｘ１０^６、２ｘ１０^６、３ｘ１０^６、４ｘ１０^６、５ｘ１０^６、６ｘ１０^６、７ｘ１０^６、８ｘ１０^６、９ｘ１０^６、１ｘ１０^７、２ｘ１０^７、３ｘ１０^７、４ｘ１０^７、５ｘ１０^７、６ｘ１０^７、７ｘ１０^７、８ｘ１０^７、９ｘ１０^７、１ｘ１０^８、２ｘ１０^８、３ｘ１０^８、４ｘ１０^８、５ｘ１０^８、６ｘ１０^８、７ｘ１０^８、８ｘ１０^８、９ｘ１０^８、１ｘ１０^９、２ｘ１０^９、３ｘ１０^９、４ｘ１０^９、５ｘ１０^９、６ｘ１０^９、７ｘ１０^９、８ｘ１０^９、９ｘ１０^９、１ｘ１０^１０、２ｘ１０^１０、３ｘ１０^１０、４ｘ１０^１０、５ｘ１０^１０、６ｘ１０^１０、７ｘ１０^１０、８ｘ１０^１０、９ｘ１０^１０、１ｘ１０^１１、２ｘ１０^１１、３ｘ１０^１１、４ｘ１０^１１、５ｘ１０^１１、６ｘ１０^１１、７ｘ１０^１１、８ｘ１０^１１、９ｘ１０^１１、１ｘ１０^１２、１．１ｘ１０^１２、１．２ｘ１０^１２、１．３ｘ１０^１２、１．４ｘ１０^１２、１．５ｘ１０^１２、１．６ｘ１０^１２、１．７ｘ１０^１２、１．８ｘ１０^１２、１．９ｘ１０^１２、２ｘ１０^１２、２．１ｘ１０^１２、２．２ｘ１０^１２、２．３ｘ１０^１２、２．４ｘ１０^１２、２．５ｘ１０^１２、２．６ｘ１０^１２、２．７ｘ１０^１２、２．８ｘ１０^１２、２．９ｘ１０^１２、３ｘ１０^１２、３．１ｘ１０^１２、３．２ｘ１０^１２、３．３ｘ１０^１２、３．４ｘ１０^１２、３．５ｘ１０^１２、３．６ｘ１０^１２、３．７ｘ１０^１２、３．８ｘ１０^１２、３．９ｘ１０^１２、４ｘ１０^１２、４．１ｘ１０^１２、４．２ｘ１０^１２、４．３ｘ１０^１２、４．４ｘ１０^１２、４．５ｘ１０^１２、４．６ｘ１０^１２、４．７ｘ１０^１２、４．８ｘ１０^１２、４．９ｘ１０^１２、５ｘ１０^１２、６ｘ１０^１２、７ｘ１０^１２、８ｘ１０^１２、９ｘ１０^１２、１ｘ１０^１３、２ｘ１０^１３、３ｘ１０^１３、４ｘ１０^１３、５ｘ１０^１３、６ｘ１０^１３、６．７ｘ１０^１３、７ｘ１０^１３、８ｘ１０^１３、９ｘ１０^１３、１ｘ１０^１４、２ｘ１０^１４、３ｘ１０^１４、４ｘ１０^１４、５ｘ１０^１４、６ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、９ｘ１０^１４、１ｘ１０^１５、２ｘ１０^１５、３ｘ１０^１５、４ｘ１０^１５、５ｘ１０^１５、６ｘ１０^１５、７ｘ１０^１５、８ｘ１０^１５、９ｘ１０^１５、または１ｘ１０^１６ ＶＧ／ｍＬの組成物濃度であり得る。

【0134】

組み合わせ
調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、１つまたはそれ以上の他の治療剤、予防剤、診断剤または造影剤と組み合わせて使用することができる。「～と組み合わせて」とは、薬剤を同時に投与しなければならないこと、および／または共に投与するように処方しなければならないことを暗示することを意図するものではない。尤も、これらの投与方法は本開示の範囲内である。組成物は、１つまたはそれ以上の他の所望の治療または医療処置と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量および／または時間スケジュールで投与される。いくつかの実施形態では、本開示は、医薬組成物、予防組成物、診断組成物または画像形成組成物を、その生物学的利用能を改善し、その代謝を低減および／または修飾し、その排泄を阻害し、および／または身体内の分布を改変する薬剤と組み合わせて投与することができる。

【0135】

投与
一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、欧州特許出願第ＥＰ１８５７５５２号に記載されたＡＡＶビリオンの投与方法を用いて投与することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0136】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、欧州特許出願ＥＰ２６７８４３３に記載されたＡＡＶベクターを使用してタンパク質を投与するための方法を用いて投与することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0137】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、米国特許第５８５８３５１号に記載されているＡＡＶベクターを使用してＤＮＡ分子を投与するための方法を用いて投与することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0138】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、米国特許第６２１１１６３号に記載の血流にＤＮＡを投与するための方法を用いて投与することができ、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0139】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、米国特許第６３２５９９８号に記載されたＡＡＶビリオンを投与するための方法を用いて投与することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0140】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、米国特許第６３３５０１１号に記載されている筋肉細胞にＤＮＡを投与するための方法を用いて投与またすることができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0141】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、米国特許第６６１０２９０号に記載されている筋肉細胞および組織にＤＮＡを投与するための方法を用いて投与することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0142】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、米国特許第７７０４４９２号に記載されている筋肉細胞にＤＮＡを投与するための方法を用いて投与することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0143】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、米国特許第７１１２３２１号に記載されているペイロードを骨格筋に投与するための方法を用いて投与することができ、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0144】

一実施形態では、ウイルスベクターは、米国特許第７５８８７５７号に記載された中枢神経系にペイロードを投与するための方法を用いて投与することができ、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0145】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、米国特許第８２８３１５１号に記載されたペイロードを投与するための方法を用いて投与することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0146】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、米国特許第８３１８６８７号に記載されたアルツハイマー病の治療のためにペイロードを投与するための方法を用いて投与することができ、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0147】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、国際特許公開ＷＯ２０１２１４４４４６に記載されているペイロードを投与するための方法を用いて投与することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0148】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、国際特許公開第ＷＯ２００１０８９５８３号に記載のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）投与ベクターを使用してペイロードを投与する方法を用いて投与することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0149】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、国際特許公開第ＷＯ２００１０９６５８７号に記載されたペイロードを投与するための方法を用いて投与することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0150】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、国際特許公開第ＷＯ２００２０１４４８７号に記載されている筋肉組織にペイロードを投与する方法を用いて投与することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0151】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、国際特許公開番号ＷＯ２０１２０５７３６３に記載されているペイロードを神経細胞に投与する方法を用いて投与することができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0152】

本明細書に記載のウイルスベクターの医薬組成物は、バイオアベイラビリティ、治療許容域および／または分布容積の１つまたはそれ以上によって特徴付けられる。
一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを製剤化することができる。非限定的な例として、製剤の塩基性および／または浸透圧は、中枢神経系または中枢神経系の領域または成分における最適な薬物分布を確実にするように最適化され得る。

【0153】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、単一経路投与によって対象に投与され得る。
一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、多部位投与経路を介して対象に投与され得る。対象の２つ、３つ、４つ、５つ、または５つ以上の部位に、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを投与することができる。

【0154】

一実施形態では、対象に、ボーラス注入を用いて、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを投与し得る。
一実施形態では、対象に、数分、数時間または数日間にわたる持続的投与を用いて、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを投与することができる。注入速度は、対象、分布、処方または別の送達パラメータに応じて変化され得る。

【0155】

一実施形態では、複数部位への投与のために、カテーテルを脊椎の２つ以上の部位に配置され得る。調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、連続的および／またはボーラス注入で投与することができる。投与の各部位は異なる投薬レジメンであってもよく、または同じ投薬レジメンを投与部位ごとに使用してよい。非限定的な例として、投与部位は、頚部および腰部領域にあり得る。別の非限定的な例として、投与部位は子宮頸部領域にあり得る。別の非限定的な例として、投与部位は、腰部領域にあり得る。

【0156】

一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターの投与の前に、対象を脊髄の解剖学的構造および病状について分析し得る。非限定的な例として、脊柱側弯症を有する被験者は、脊柱側弯症を伴わない被験者と比較して、異なる投薬レジメンおよび／またはカテーテルの位置を有し得る。

【0157】

一実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターの投与中の対象の脊椎の向きは、地面に対して垂直であり得る。
別の実施形態では、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターの投与中の対象の脊椎の向きは、地面に対して水平であり得る。

【0158】

一実施形態では、対象の脊椎は、調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターの投与中に、地面に比してある角度を有し得る。地面と比較し、被験者の脊椎の角度は少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０または１８０度であり得る。

【0159】

一実施形態において、投与方法および持続時間は、脊髄における広範な形質導入を提供するように選択される。非限定的な例として、髄腔内投与は、脊髄の吻側－尾側の長さに沿って広い形質導入を提供するために使用される。別の非限定的な例として、複数部位注入は、脊髄の吻側－尾側の長さに沿ってより均一な形質導入を提供する。さらに別の非限定的な例として、長期の注入により、脊髄の吻側－尾側の長さに沿ってより均一な形質導入を提供する。

【0160】

バイオアベイラビリティ
本発明の調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、本明細書に記載の投与剤／製剤化剤またはビヒクルを含む組成物に製剤化された場合、本明細書に記載の投与剤を欠いている組成物と比較して生物学的利用能の増加を示し得る。本明細書で使用する「バイオアベイラビリティ」という語は、対象に投与される特定の薬剤の所定量の全身利用可能性を指す。バイオアベイラビリティは、化合物の哺乳動物への投与後の無変化体の化合物の曲線下面積（ＡＵＣ）または最大血清または血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）を測定することによって評価することができる。ＡＵＣは、横軸（Ｘ軸）に沿った時間に対する縦軸（Ｙ軸）に沿って、化合物の血清または血漿濃度をプロットした曲線下面積を定量するものである。一般に、特定の化合物のＡＵＣは、当業者に公知であり、Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｖ．７２，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．，１９９６（この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法により計算することができる。

【0161】

Ｃ_ｍａｘ値とは、対象への化合物の投与後に対象の血清または血漿中で観察される化合物の最大濃度を指す。特定の化合物のＣ_ｍａｘ値は、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。本明細書で使用される「バイオアベイラビリティの増加」または「薬物動態の改善」という語句は、対象における本発明のウイルスベクターの全身利用可能性（ＡＵＣ、Ｃ_ｍａｘ、またはＣ_ｍｉｎにより測定する）を増加させ得る作用を指す。いくつかの実施形態では、このような作用は、本明細書に記載の１つあるいはそれ以上の投与剤との同時投与を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターのバイオアベイラビリティは、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％ 約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０ 少なくとも約７５重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約８５重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、または約１００重量％である。

【0162】

治療許容域
本発明の調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、本明細書に記載されているような１つまたはそれ以上の投与剤と共に製剤化された場合、本明細書に記載の１つまたはそれ以上の投与剤なしで投与されたウイルスベクターの治療域と比較して、化合物および／または組成物の投与の治療域の増加を示し得る。本明細書で使用される「治療許容域」という語は、治療効果を引き出す可能性が高い、血漿濃度の範囲、または作用部位における治療活性物質のレベルの範囲を指す。いくつかの実施形態では、製剤中で投与された場合、ウイルスベクターの治療域は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％、増加し得る。

【0163】

分布容積
本発明の調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、本明細書に記載されているような１つまたはそれ以上の投与剤と共に製剤化された場合、本明細書に記載の１つまたはそれ以上の投与剤を欠いている製剤と比較して、分布容積（Ｖ_ｄｉｓｔ）が改善（例えば、減少または標的化）され得る。Ｖ_ｄｉｓｔは、血液または血漿中の薬剤の濃度に対する、体内の同一薬剤の量を指す。本明細書で使用される「分布容積」という語は、血液または血漿中の濃度と同じ濃度で、体内の薬剤の総量を含有するであろう流体容積を指す：Ｖ_ｄｉｓｔは、体内の薬剤の量を、血液または血漿中の薬剤の濃度で除したものに等しい。例えば、所定の薬剤の用量が１０ｍｇで、血漿濃度が１０ｍｇ／Ｌである場合は、分布容積は１リットルになる。分布容積は、薬剤が血管外組織に存在する程度を反映している。分布容積が大量である場合は、血漿タンパク質と比較して、薬剤が組織成分に結合する傾向を反映している。臨床現場では、Ｖ_ｄｉｓｔは、定常状態の濃度を達成するための負荷量を決定するために使用されることがある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つまたはそれ以上の投与剤と同時投与された場合の本発明のウイルスベクター組成物の分布容積は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％ 約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５ 少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、減少する。

【0164】

キットとデバイス
本発明は、本発明の方法を簡便および／または効果的に実施するための様々なキットを提供する。典型的に、キットは、ユーザが対象の複数回の治療を行い、および／または複数回の実験を行うのに十分な量および／または数の成分を含む。

【0165】

本発明のベクター、構築物、調節性ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれかをキットに含めることができる。いくつかの実施形態では、キットは、本発明の化合物および／または組成物を作製および／または合成するための試薬および／または指示書をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、１つまたはそれ以上のバッファも含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、タンパク質または核酸アレイまたはライブラリを作製するための成分を含み得るので、例えば、固体支持体を含み得る。

【0166】

いくつかの実施形態では、キット成分は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装され得る。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたはその他の容器手段を含み、その中に構成要素を配置し、好ましくは適切に分注する。複数のキット成分がある場合（標識試薬と標識は一緒に包装されてもよい）、キットは一般に第２、第３またはその他の追加の容器を含み、その中に追加の成分を別々に配置し得る。いくつかの実施形態では、キットはまた、滅菌した薬学的に許容される緩衝液および／またはその他の希釈剤を収容するための第２の容器手段を含み得る。いくつかの実施形態では、成分の様々な組み合わせを１つまたはそれ以上のバイアルに含めてよい。本発明のキットはまた、典型的には、本発明の化合物および／または組成物を収用する手段（例えば、商業的販売用に密閉された、タンパク質、核酸、およびその他の試薬を収用する容器）を含み得る。そのような容器は、所望のバイアルが保持される注入またはブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。

【0167】

いくつかの実施形態において、キット構成要素は、１つおよび／またはそれ以上の液体溶液で提供される。いくつかの実施形態では、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。いくつかの実施形態において、キット成分は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合は、そのような粉末は、適切な量の溶媒の添加によって再構成され得る。いくつかの実施形態では、溶媒は、別の容器手段で提供され得ることが想定される。いくつかの実施形態において、標識色素は、乾燥粉末として提供される。いくつかの実施形態では、１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１２０，１２０，１３０，１４０，１５０，１６０，１７０，１８０，１９０，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００マイクログラムの乾燥色素、または少なくともまたは最大限で、それらの量の乾燥色素が、本発明のキットで提供される。そのような実施形態では、次に、ＤＭＳＯなどの任意の適切な溶媒に色素を再懸濁させることができる。

【0168】

いくつかの実施形態では、キットは、キット構成要素の使用法、およびキットに含まれていないその他の試薬の使用法に関する説明書を含み得る。説明書は、実施可能な変形を含み得る。

【0169】

デバイス
いくつかの実施形態では、本発明の化合物および／または組成物は、デバイスと組み合わせるか、デバイスの上にコーティングするか、またはデバイス中に埋め込むことができる。デバイスには、歯科インプラント、ステント、骨置換、人工関節、弁、ペースメーカーおよび／またはその他の移植可能な治療デバイスを含み得るが、これらに限定されない。

【0170】

本発明は、１つまたはそれ以上の調節性ポリヌクレオチドペイロード分子をコードするウイルスベクターを組み込むことができるデバイスを提供する。これらの装置は、ヒト患者のようなそれを必要とする対象に直ちに投与され得るウイルスベクターを安定な製剤中に含む。

【0171】

投与用のデバイスを使用して、本明細書で教示される単回投与、複数回投与または分割投与計画に従って、本発明の調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを投与する。

【0172】

細胞、器官および組織への複数投与のための当技術分野で公知の方法およびデバイスを、本発明の実施形態として本明細書に開示された方法および組成物と組み合わせて使用することが考えられる。これらには、例えば、複数の針を有する方法及びデバイス、ルーメン又はカテーテルなどを使用するハイブリッドデバイス、並びに熱／電流／放射線駆動メカニズムを利用するデバイスが含まれる。

【0173】

本発明の調節性ポリヌクレオチドは、異常なまたは望ましくない標的発現によって特徴付けられる任意の疾患または障害の治療、予防または改善において使用され得る。
定義
本明細書中の様々な箇所において、本開示の化合物の置換基は、群でまたは範囲で開示される。本開示が、そのような群および範囲の構成員のそれぞれおよび全てのサブコンビネーションを含むことが、特に意図されている。

【0174】

約：本明細書で使用されている「約」という語は、列挙された値の＋／－１０％を意味する。
併用投与：本明細書中で使用されている「組み合わせて投与される」または「組み合わせ投与」という語句は、２つまたはそれ以上の薬剤を、患者に対する各薬剤の効果の重複が存在し得るように、同時にまたはある間隔内で対象に投与することを指す。いくつかの実施形態において、これらの薬剤は、相互間隔が約６０分、３０分、１５分、１０分、５分、または１分以内で投与される。いくつかの実施形態において、薬剤の投与は、短い間隔をあけて行なわれるので、コンビナトリアル（例えば、相乗）効果が達成される。

【0175】

動物：本明細書で使用されている「動物」という語は、動物界の任意の構成員を指す。いくつかの実施形態では、「動物」とは、任意の発達段階のヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」とは、任意の発生段階における非ヒト動物を指す。ある実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および虫類が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、またはクローンである。

【0176】

約：本明細書で使用されている「約」または「約」という語は、関心のもたれている１つまたはそれ以上の値に適用される場合に、記載された基準値に類似する値を指す。ある実施形態において、「約」または「約」という語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、あるいは記載された基準値のいずれかの方向（より大きいか、より小さい）を指す。

【0177】

と関連した：本明細書中で使用されている「と関連した」、「共役した」、「連結された」、「付着した」および「係留された」という語は、２つまたはそれ以上の部分に関して使用される場合、以下を意味する：当該部分が、直接的にまたは連結剤として機能する１つまたはそれ以上の追加の部分を介して、相互に物理的に会合しているかまたは結合して、当該部分が条件（当該構造が使用される、例えば、生理学的条件）の下で物理的に結合したままであるように、十分に安定した構造を形成する。「関連」は、厳密に直接共有化学結合によるものである必要はない。この語はまた、「関連する」存在が物理的に結合したままであるように、イオン結合または水素結合またはハイブリダイゼーションに基づく結合が十分に安定していることを示唆し得る。

【0178】

二官能性の：本明細書中で使用されている「二官能性の」という語は、少なくとも２つの官能を有し、またはそれらを維持する任意の物質、分子、または部分を指す。これらの官能は、同じ結果または異なる結果に影響を与える可能性がある。官能を生成する構造は、同じであっても異なっていてもよい。

【0179】

生体適合性：本明細書中で使用されている「生体適合性」という語は、免疫系による傷害、毒性または拒絶のリスクをほとんど呈しないかまたは全く呈しない生きた細胞、組織、器官または系と適合することを意味する。

【0180】

生分解性：本明細書にされている「生分解性」という語は、生物の作用によって無害な生成物に分解することができることを意味する。
生物学的に活性がある：本明細書中で使用されている「生物学的に活性」という語句は、生物学的系および／または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与された場合に、その生物に生物学的作用を及ぼす物質は、生物学的に活性であると考えられる。特定の実施形態では、本発明の調節性ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの一部でも生物学的に活性であるか、または生物学的に関連性があると考えられる活性を模倣している場合に、生物学的に活性であると考えられる。

【0181】

誘導された多能性ステム細胞：本明細書中で使用されている「誘導された多能性ステム細胞」という語句は、いくつかの異なる細胞型のいずれかを形成するように誘導され得る細胞である。

【0182】

化合物：本明細書で使用されている「化合物」という語は、説明されている構造のすべての立体異性体、幾何異性体、互変異性体および同位体を含むことを意味する。
本明細書に記載の化合物は、非対称（例えば、１つまたはそれ以上の立体中心を有する）であり得る。エナンチオマーおよびジアステレオマーなどのすべての立体異性体は、特に断りのない限り、意図されている。不斉炭素原子を含む本開示の化合物は、光学活性体またはラセミ体で単離することができる。光学的に活性な形態を光学活性出発物質から調製する方法に関する方法は、ラセミ混合物の分割または立体選択的合成など、当技術分野で公知である。オレフィンの多くの幾何異性体、Ｃ＝Ｎ二重結合などもまた、本明細書に記載の化合物中に存在することができ、このような安定した異性体は全て、本開示において考慮される。本開示の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が記載され、異性体の混合物として、または分離された異性体として単離され得る。

【0183】

本開示の化合物は、互変異性体も含む。互変異性体は、単結合が隣接する二重結合と交換され、それに付随してプロトンが移動することに起因する。互変異性体は、同じ実験式および全電荷を有する異性体プロトン化状態であるプロトン互変異性体を含む。

【0184】

本開示の化合物はまた、中間化合物または最終化合物中に存在する原子の同位体の全てを含む。「同位体」は、原子番号は同じであるが、核内の異なる数の中性子から生じる異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体には、トリチウムおよび重水素がある。

【0185】

本開示の化合物および塩は、通常の方法によって、溶媒分子または水分子と組み合わせて、溶媒和物および水和物を形成することにより、調製することができる。
保存された：本明細書中で使用されている「保存された」という語は、比較対象の２つまたはそれ以上の配列の同じ位置において、それぞれ改変されていない状態で発生するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列中のその他の場所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸に比べて、多くの関連配列の間で保存されているものである。

【0186】

いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の配列は、相互に１００％同一である場合に、「完全に保存されている」と言う。いくつかの実施形態において、２つまたはそれ以上の配列は、それらが少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合に、「高度に保存されている」と言う。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の配列は、それらが約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合に、「高度に保存されている」と言う。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の配列は、それらが少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合に、「保存されている」と言う。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の配列は、それらが約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％ ％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合に、「保存されている」と言う。配列の保存は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用され得るか、またはその一部、領域または特徴に適用され得る。

【0187】

除放性：本明細書で使用されている「除放性」という語は、治療結果を達成するために放出の特定のパターンに適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
環状あるいは環化：本明細書で使用されている「環状」という語は、連続したループの存在を指す。環状分子は、円形である必要はなく、連結されていて切れ目のないサブユニットの鎖を形成する。

【0188】

細胞増殖抑制性：本明細書中で使用されている「細胞増殖抑制性」という語は、細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオンの成長、分裂または増殖を、阻害、減少、抑制させること、またはそれらの組み合わせを指す。

【0189】

細胞毒性：本明細書中で使用されている「細胞毒性」とは、細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオンを殺傷すること、あるいは、有害、有毒、または致命的な影響をもたらすこと、またはそれらの組み合わせを指す。

【0190】

投与：本明細書で使用されている「投与」という語は、化合物、物質、存在、部分、カーゴまたはペイロードを投与する行為または様式を指す。
投与剤：本明細書中で使用されている「投与剤」という語は、標的細胞への調節性ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ投与を少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。

【0191】

不安定化：本明細書中で使用されている「不安定な」、「不安定化する」または「不安定化領域」という語句は、同じ領域または同じ分子の開始型、野生型または天然形態よりも安定性の低い領域または分子を意味する。

【0192】

検出可能な標識：本明細書中で使用されている「検出可能な標識」とは、当技術分野で公知の方法によって容易に検出される、別の存在に付着される、取り込まれる、または会合される１つまたはそれ以上のマーカーを指し、その例には、放射線、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などがある。検出可能な標識には、放射性同位体；フルオロフォア；発色団；酵素；色素；金属イオン；ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテンのようなリガンド；量子ドットなどがある。検出可能な標識は、本明細書に開示されるペプチドまたはタンパク質の任意の位置に位置し得る。これらは、アミノ酸、ペプチド、またはタンパク質内にあってもよく、またはＮ末端もしくはＣ末端に位置していてもよい。

【0193】

ジアステレオマー：本明細書で使用されている「ジアステレオマー」という語は、互いの鏡像ではなく、互いに重ね合わせることができない立体異性体を意味する。
消化する：本明細書で使用されている「消化する」という語は、より小さな断片または成分に分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、消化のよりペプチドの生産がもたらされる。

【0194】

遠位：本明細書で使用されている「遠位」という語は、中心から離れて位置している、または関心の持たれているポイントまたは領域から離れて位置していることを意味する。
投薬計画：本明細書で使用されている「投薬計画」は、治療、予防、または緩和ケアの投与スケジュールまたは医師により決定された投薬計画である。

【0195】

エナンチオマー：本明細書で使用されている「エナンチオマー」という語は、本発明の化合物の個々の光学活性形態を意味し、それらは、少なくとも８０％（すなわち、１つのエナンチオマーの少なくとも９０％、およびその他のエナンチオマーの多くとも１０％）、好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９８％の光学純度またはエナンチオマー過剰率（当該分野で標準的な方法によって決定される）を有する。

【0196】

カプセル化する：本明細書で使用されている「カプセル化する」という語は、封入、包囲または封入することを意味する。
操作された：本明細書中では、本発明の実施形態は、それらが構造的であってもまたは化学的であっても、出発点、野生型または天然型の分子から変化した特徴または特性を有するように設計されている場合、「操作されている」という。

【0197】

有効量：本明細書中で使用されている薬剤の「有効量」という語は、有益なまたは望ましい結果（例えば臨床結果）をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、薬剤が適用される状況に依存する。例えば、癌を治療する薬剤を投与する状況において、薬剤の有効量は、例えば、本明細書で定義されるように、薬剤の投与なしで得られる応答と比較して、癌の治療を達成するのに十分な量である。

【0198】

エキソソーム：本明細書で使用されている「エキソソーム」という語は、哺乳動物細胞によって分泌される小胞、またはＲＮＡ分解に関与する複合体である。
発現：本明細書中で使用されている核酸配列の「発現」という語は、以下の事象の１つまたはそれ以上を指す：（１）（例えば、転写により）ＤＮＡ配列からＲＮＡ鋳型を産生する；（２）（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングにより）、ＲＮＡ転写産物をプロセシングする；（３）ＲＮＡをポリペプチドまたはタンパク質へ翻訳する；（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。

【0199】

特徴：本明細書で使用されている「特徴」という語は、特質、特性、または特有の要素を指す。
製剤：本明細書中で使用されている「製剤」という語は、少なくとも１つの調節性ポリヌクレオチドおよび投与剤を含む。

【0200】

断片：本明細書中で使用されている「断片」という語は、ある部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドを含む。

【0201】

機能性：本明細書中で使用されている「機能的」生物学的分子は、それが特徴付けられる特性および／または活性を示す形態の生物学的分子である。
相同性：本明細書中で使用されている「相同性」という語は、ポリマー分子間の全体的な関連性を指し、例えば、核酸分子間（（ｅ．ｇ．、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）および／またはポリペプチド分子間の関連性を指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、その配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９９％同一または類似している場合に、互いに「相同性」を有すると考えられる。「相同性を有する」という語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列）の間の比較を指す。本発明によれば、２つのポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには９９％である場合に、これらのポリヌクレオチド配列は相同性を有すると考えられる。いくつかの実施形態では、相同性を有するポリヌクレオチド配列は、少なくとも４～５個の一意的に特定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力によって特徴付けられる。長さが６０ヌクレオチド未満のポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、少なくとも４個～５個の一意的に特定されるアミノ酸のストレッチをコードする能力によって決定される。本発明によれば、２つのタンパク質が、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％同一である場合に、これらのタンパク質配列は相同であるとみなされる。

【0202】

同一性：本明細書中で使用されている「同一性」という語は、例えば、ポリヌクレオチド分子間（例えば、ＤＮＡ分子間および／またはＲＮＡ分子間）、および／またはポリペプチド分子間などのポリマー分子間の全体的な関連性を指す。例えば、２つのポリヌクレオチド配列のパーセント同一性の計算は、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２の核酸配列の一方または双方にギャップを導入し、非同一配列は比較目的のために無視することができる）。特定の実施形態では、比較目的のために整列された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有される場合、当該分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列のために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、当該配列によって共有される同一位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、以下に記載されるような方法を用いて決定され得る：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７）を用いて決定することができる。これは、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。あるいは、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。配列間のパーセント同一性を決定するために一般的に用いられる方法には、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されているものが含まれるが、これに限定されない（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。同一性を決定する技法は、広く入手可能なコンピュータプログラムにまとめられている。２つの配列間の相同性を決定するためのコンピュータソフトウェアの例には、ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ａｎｄ ＦＡＳＴＡ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0203】

遺伝子の発現を阻害する：本明細書において、「遺伝子の発現を阻害する」という句は、遺伝子の発現産物の量を減少させることを意味する。発現産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ）から転写されたＲＮＡ、または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的には、ｍＲＮＡレベルの低下は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの低下をもたらす。発現レベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的な技術を用いて決定することができる。

【0204】

異性体：本明細書で使用されている「異性体」という語は、本発明のいずれかの化合物の任意の互変異性体、立体異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つまたはそれ以上のキラル中心および／または二重結合を有し得るので、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、エナンチオマー（すなわち、（＋）または（－））またはシス／トランス異性体）などの立体異性体として存在すると認識される。本発明によれば、本明細書に記載の化学構造（つまり、本発明の化合物）は、対応する立体異性体のすべてを包含する。立体異性体のすべてとは、立体的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋な形態、エナンチオマー的に純粋な形態、またはジアステレオマー的に純粋な形態）と、エナンチオマーと立体異性体との混合物（例えば、ラセミ体）との双方を指す。本発明の化合物のエナンチオマーと立体異性体との混合物は、典型的には、それらの成分であるエナンチオマーまたは立体異性体に、既知の方法によって分解することができ、そのような方法の例には、キラル相高速クロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中での化合物の結晶化が挙げられる。エナンチオマーおよび立体異性体は、立体異性的にまたは鏡像異性的に純粋な中間体、試薬および触媒から、周知の不斉合成法によっても得ることができる。

【0205】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書中で使用されている「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工的な環境で起こる事象を指し、その例には、例えば、試験管または反応容器中、細胞培養中、ペトリ皿中などがある。

【0206】

Ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書中で使用されている「ｉｎ ｖｉｖｏ」という語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物、あるいはそれらの細胞または組織）内で起こる事象を指す。

【0207】

単離された：本明細書中で使用されている「単離された」という語は、それが会合している成分の少なくともいくつかから分離された物質または存在を意味する（自然界であるか、実験的環境であるかにかかわらず）。単離された物質は、それらが結合していた物質に関して、様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質および／または存在は、それらが最初に結合していたその他のコンポーネントの少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離している。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％ ９８％、約９９％、または約９９％以上純粋である。本明細書中で使用されているように、物質が実質的にその他の成分を含まない場合に、その物質は「純粋」である。

【0208】

実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、化合物が、それが形成または検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的な分離には、例えば、本開示の化合物において豊化された組成物が含まれる。実質的な分離には、本開示の化合物またはその塩の重量で、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９重量％を含む組成物が含まれる。化合物およびその塩を単離するための方法は、当技術分野では日常的に行なわれている作業である。

【0209】

リンカー：本明細書で使用されているリンカーという語は、原子の群（例えば１０個～１０００個の原子）を指し、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニルおよびイミンなどの原子の群または基の群からなり得る。リンカーは、核酸塩基または糖部分上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドに第１の末端で、ペイロード（例えば、検出可能または治療剤）に第２の末端で、結合させることができる。リンカーは、核酸配列への取り込みを妨害しない程度の長さであってもよい。リンカーは、本明細書中に記載されるように、調節性ポリヌクレオチド多量体を形成する（例えば、２つまたはそれ以上の調節性ポリヌクレオチド分子の連結を介して）または調節性ポリヌクレオチド複合体を形成するため、ならびにペイロードを投与するためなど、任意の有用な目的のために使用され得る。リンカーに組み込むことができる化学基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリールまたはヘテロシクリルが含まれるがこれらに限定されず、これらのそれぞれが本明細書に記載されているように最適に置換されている。リンカーの例には、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコールなどのエチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位）、デキストランポリマーおよびその誘導体が含まれるがそれらに限定されない。その他の例には、例えばジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）またはアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）のようなリンカー内の開裂可能な部分が含まれるがこれらに限定されない。これらは還元剤または光分解を用いて切断することができる。選択的に開裂可能な結合の非限定的な例には、例えばトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはその他の還元剤の使用および／または光分解によって切断することができるアミノ結合、ならびに例えば酸性または塩基性加水分解により切断することができるエステル結合が挙げられる。

【0210】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位：本明細書中で使用されているマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位という語は、ｍｉＲＮＡの少なくとも「シード」領域が結合する核酸転写物のヌクレオチド位置または領域を表す。

【0211】

修飾された：本明細書で使用されている「修飾された」という語は、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的に多くの態様で修飾することができる。

【0212】

天然起源の：本明細書中で使用されている「天然に存在する」という語は、人工的に補助されずに、天然に存在することを意味する。
中和抗体：本明細書中で使用されている「中和抗体」という語は、その抗原に結合し、細胞が有する生物活性を中和または無効にすることによって抗原または感染因子から細胞を防御する抗体を指す。

【0213】

非ヒト脊椎動物：本明細書で使用されている「非ヒト脊椎動物」とは、野生および家畜種を含むホモサピエンスを除くすべての脊椎動物を含む。非ヒト脊椎動物の例には、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、ヤクなどの哺乳類が含まれるが、それらに限定されない。

【0214】

オフターゲット：本明細書中で使用される場合、「オフターゲット」とは、任意の１つ以上の標的、遺伝子または細胞転写産物に対する任意の意図しない効果をいう。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用されている「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」という語は、所与のリーディングフレームにおける終止コドンを含まない配列を指す。

【0215】

作動可能に連結された：本明細書中で使用されている「作動可能に連結された」という語句は、２つまたはそれ以上の分子、構築物、転写物、存在、部分などの間の機能的連結を指す。

【0216】

必要に応じて置換されている：本明細書では、「必要に応じて置換されたＸ」（例えば、必要に応じて置換されたアルキル）という句は、「Ｘが必要に応じて置換されているＸ」と同義であると意図される（例えば、アルキルが必要に応じて置換されているアルキル）。これは、特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）それ自体が随意であるということを意図するものではない。

【0217】

ペプチド：本明細書中で使用されている「ペプチド」という語は、５０アミノ酸の長さ未満（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸の長さ）である。

【0218】

患者：本明細書中で使用されている「患者」という語は、治療を求めているか、治療の必要性があるか、治療が必要であるか、治療を受けているか、治療を受けるであろう対象、または特定の疾患または状態について訓練を受けた専門家によって治療を受けている対象を指す。

【0219】

医薬的に許容される：「薬学的に許容される」という語句は、「薬学的に許容される」という句は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適しており、合理的な利益／リスク比に見合う、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症なしに投与することができる化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。

【0220】

薬学的に許容される賦形剤：本明細書で使用されている「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、本明細書に記載の化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解することができるビヒクル）であって、患者において実質的に非毒性で非炎症性であるという特性を有する成分を指す。賦形剤の例には、以下が挙げられる：抗癒着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、染料（色）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはコーティング剤、風味剤、香料、流動化剤（流動促進剤）、潤滑剤、保存剤、印刷インキ、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、および水和水。賦形剤の例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微晶質セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトール。

【0221】

薬学的に許容される塩：本開示は、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書中で使用されている「薬学的に許容される塩」という語句は、存在する酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって（例えば、遊離塩基を適切な有機酸と反応させることによって）親化合物を修飾する、開示化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、アミンのような塩基性残基の無機または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩；等が含まれるが、それらに限定されなるものではない。代表的な酸付加塩の例としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩の例には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンがあり、それらの例には、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、塩基性または酸性部分を含む親化合物から、従来の化学的方法によって合成することができる。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、適切な塩基または酸の化学量論量と、水中または有機溶媒中で、またはその２種の混合物中で反応させることによって調製することができる。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適切な塩のリストは、次を参照のこと。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７^ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８，ａｎｄ Ｂｅｒｇｅら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）；これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0222】

薬学的に許容される溶媒和物：本明細書で使用されている「薬学的に許容される溶媒和物」という語句は、適切な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている本発明の化合物を意味する。適切な溶媒は、投与される投与量で生理学的に許容される。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製することができる。適切な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物および三水和物）、Ｎメチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジル等が挙げられる。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。

【0223】

薬物動態学：本明細書中で使用されている「薬物動態学」という語は、分子または化合物の任意の１つまたはそれ以上の特性を指し、そのような特性は、生体に投与される物質の結果予測の決定に関連する。薬物動態は、吸収、分布、代謝および排泄の程度および速度を含むいくつかの領域に分けられる。これは一般に、以下を表すＡＤＭＥという略語で呼ばれている：（Ａ）吸収（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）とは、物質が血液循環に入る過程を指す；（Ｄ）（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）分布とは、身体の体液および組織全体に物質が分散または拡散することを指す；（Ｍ）代謝（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）（または生物変換）（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）とは、親化合物の娘代謝物への不可逆的変換を指す；（Ｅ）排泄（Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ）（または排除）（Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）とは、物質が身体から排除されることを指す。まれに、一部の薬物は、体組織に不可逆的に蓄積することがある。

【0224】

物理化学的：本明細書中で使用されている「物理化学的」という語は、物理的および／または化学的性質を意味するかまたはそれに関連していることを指す。
予防する：本明細書中で使用されている「予防する」という語は、感染、疾患、障害および／または状態の発症を部分的にまたは完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害および／または状態の１つまたはそれ以上の症状、特徴、または臨床症状の発症を部分的にまたは完全に遅延させること；特定の感染症、疾患、障害および／または状態の１つまたはそれ以上の症状、特徴、または兆候の発症を部分的にまたは完全に遅延させること；特定の疾患、障害および／または状態からの進行を部分的にまたは完全に遅延させること；および／または感染、疾患、障害、および／または状態に関連する病状を発症するリスクを減少させることを指す。

【0225】

プロドラッグ：本開示は、本明細書に記載の化合物のプロドラッグも含む。本明細書中で使用されている「プロドラッグ」という語は、それが化学的または物理的変化により治療剤として作用することが予測される形態の任意の物質、分子または存在をいう。プロドラッグは、何らかの方法で共有結合または隔離され、哺乳動物対象に投与する前に、投与中に、または投与後に活性薬物部分を放出するかまたは活性薬物部分に変換され得る。プロドラッグは、化合物中に存在する官能基を、通常の操作またはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかにより、修飾が切断されるような方法で修飾して親化合物にすることにより、調製することができる。プロドラッグには、哺乳動物対象に投与された時に、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が、開裂して遊離ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリルまたはカルボキシル基をそれぞれ形成する化合物が含まれる。プロドラッグの調製および使用は、Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ，“Ｐｒｏ－ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，” Ｖｏｌ．１４ ｏｆ ｔｈｅ Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、およびＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，ｅｄ．Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７（これらは双方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態において、本発明のｐｒｉ－ｍｉＲは、ｐｒｅ－ｍｉＲのプロドラッグであり得る。同様に、ｐｒｉ－ｍｉＲｓあるいはｐｒｅ－ｍｉＲｓのいずれかが、それらからプロセッシングされる人工のｍｉＲのプロドラッグであり得る。

【0226】

増殖する：本明細書中で使用されている「増殖する」という語は、成長、拡大または増加するか、または急速な成長、拡大または増加を引き起こすことを意味する。「増殖性」とは増殖能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖特性に対し正反対である特性、または不適切な特性を有することを意味する。

【0227】

予防法：本明細書中で使用されている「予防法」という語は、疾患の広がりを防ぐために使用される治療または治療経過を指す。
予防措置：本明細書において、「予防措置」とは、健康を維持し、疾患の広がりを防ぐためにとられる措置を指す。

【0228】

タンパク質開裂部位：本明細書中で使用されている「タンパク質切断部位」という語句は、化学的、酵素的または光化学的手段によってアミノ酸鎖の制御された開裂が達成され得る部位を指す。

【0229】

タンパク質開裂シグナル：本明細書中で使用されている「タンパク質切断シグナル」という語句は、開裂のためにポリペプチドをフラグ付けまたはマーキングする少なくとも１つのアミノ酸を指す。

【0230】

目的のタンパク質：本明細書中で使用されている語「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」という語には、本明細書で提供されるものおよびそのフラグメント、突然変異体、改変体、および改変が含まれる。

【0231】

近位：本明細書で使用されている「近位」という語は、中心または関心の持たれている点または領域の近くに位置していることを意味する。
精製された：本明細書で使用する「精製する」、「精製された」、「精製」とは、望ましくない成分、材料の脱脂、混和または不完全なものから実質的に純粋または異物がない状態にすることを意味する。

【0232】

試料：本明細書中で使用される場合、「サンプル」または「生物学的サンプル」という語は、その組織、細胞または構成要素のサブセット（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液および精液などを含むがそれらに限定されない体液）を指す。サンプルには、さらに、生物全体またはその組織、細胞もしくは構成部分のサブセット、またはその断片もしくは一部分から調製されたホモジネート、溶解物または抽出物を含み得、その例には、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器系、腸系および尿生殖路の外部切片、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官が含まれるが、これらに限定されない。サンプルは、さらに、タンパク質または核酸分子のような細胞成分を含み得る栄養培地またはゲルのような培地を指す。

【0233】

シグナル配列：本明細書中で使用されている「シグナル配列」という語句は、タンパク質の輸送または局在化を指図することができる配列を指す。
単一単位用量：本明細書で使用されている「単一単位用量」という語句は、１回の用量／１回の投与／単一の経路／単一の接触点（すなわち単一の投与事象）で投与される任意の治療剤の用量である。

【0234】

類似性：本明細書中で使用されている「類似性」という語は、例えば、ポリヌクレオチド分子間（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子など）および／またはポリペプチド分子間などのポリマー分子間の全体的な関連性を指す。パーセント類似性の計算が当技術分野で理解されるような保存的置換を考慮に入れていることを除いて、パーセント同一性の計算と同じ方法で、ポリマー分子の相互のパーセント類似性の計算を行うことができる。

【0235】

分割用量：本明細書で使用されている「分割用量」は、単一単位用量または１日総用量を２回またはそれ以上の用量に分割することを指す。
安定した：本明細書で使用されている「安定した」という語は、反応混合物から有用な程度の純度まで単離するのに十分に頑強であり、好ましくは有効な治療薬に製剤化することができる化合物を指す。

【0236】

安定化された：明細書中で使用されている「安定化する」、「安定化された」、「安定化された領域」は、安定した状態にする、または安定した状態になることを指す。
立体異性体：本明細書中で使用されている「立体異性体」という語は、化合物（例えば、本明細書に記載されている全ての化学式の化合物）が有し得るすべての可能な異なる異性体および配座異性体の形態を指し、特に、基本分子構造のすべての可能な立体化学的形態および立体配座的形態、すべてのジアステレオマー、エナンチオマーおよび／または配座異性体を指す。本発明のいくつかの化合物は、異なる互変異性体形態で存在してもよく、後者はすべて本発明の範囲内に含まれる。

【0237】

対象：本明細書中で使用されている「対象」または「患者」という語は、例えば、実験、診断、予防および／または治療の目的で、本発明による組成物を投与する任意の生体を指す。典型的な対象には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトなどの哺乳類）および／または植物が含まれる。

【0238】

実質的に：本明細書中で使用されている「実質的に」という語は、関心の持たれている特徴または特性の全体またはほぼ全体的な範囲または程度を示す定性的条件を指す。生物学的技術における当業者は、生物学的および化学的現象が、完了する、完全に進む、および／または絶対的な結果を達成あるかまたは回避することは極めてまれであることを、理解しているであろう。したがって、「実質的に」という語は、本明細書では、多くの生物学的および化学的現象に特有である完全性の潜在的な欠如を表すために使用されている。

【0239】

実質的に等しい：用量間の時間差に関連して本明細書で使用されているこの語は、プラスマイナス２％を意味する。
実質的に同時に：本明細書で使用される場合、および複数の用量に関連する場合、この語は２秒以内を意味する。

【0240】

～に罹患している：疾患、障害、および／または状態に「罹患している」個体は、疾患、障害および／または状態の１つまたはそれ以上の症状を有すると診断されているか、またはそれらを呈している。

【0241】

～に罹患しやすい：疾患、障害および／または状態「に罹患しやすい」個体は、疾患、障害および／または状態を有する診断されていないか、および／または疾患、障害および／または状態の症状を示していないが、疾患またはその症状を発症する傾向を有する。いくつかの実施形態では、疾患、障害および／または状態（例えば、癌）に罹患しやすい個体は、以下の１つまたはそれ以上によって特徴付けられ得る：（１）疾患、障害および／または状態の発症に関連する遺伝子変異；（２）疾患、障害および／または状態の発症に関連する遺伝的多型；（３）疾患、障害および／または状態に関連するタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増加および／または低下；（４）疾患、障害および／または状態の発症に関連する習慣および／またはライフスタイル；（５）疾患、障害および／または状態の家族歴；および（６）疾患、障害、および／または状態の発症に関連する微生物への曝露および／または感染。いくつかの実施形態では、疾患、障害および／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害および／または状態を発症する。いくつかの実施形態では、疾患、障害および／または状態に罹りやすい個体は、疾患、障害および／または状態を発症しない。

【0242】

徐放：本明細書で使用されている「徐放」という語は、特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。
合成された：「合成された」という語は、人間の手によって生み出された、調製された、および／または製造されたことを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはその他の分子の合成は、化学的または酵素的であってもよい。

【0243】

標的細胞：本明細書中で使用されている「標的細胞」という語は、関心のもたれている任意の１つまたはそれ以上の細胞を指す。このような細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、または生物の組織または臓器に存在する。このような生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者である。

【0244】

治療薬：「治療剤」という語は、対象に投与された場合に、治療的、診断的および／または予防的効果を有し、および／または所望の生物学的および／または薬理学的効果を引き出す任意の薬剤を指す。

【0245】

治療有効量：本明細書中で使用されている「治療有効量」という語は、疾患、障害、および／または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に投与された場合に、例えば、パーキンソン病などの感染症、疾患、障害および／または状態の発症を治療、症状改善、診断、予防、および／または遅延させるのに十分である投与薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を指す。疾患、障害および／または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に投与される場合に十分であり、感染症、疾患、障害および／または状態の治療を開始し、症状を改善し、診断し、予防し、および／または遅らせる量を意味する。

【0246】

治療上有効な転帰：本明細書中で使用されている「治療的に有効な転帰」という語は、感染、疾患、障害および／または状態に罹患しているかまたは感染、疾患、障害および／または状態に罹患しやすい対象において、感染症、疾患、障害および／または状態を治療、改善、診断、予防、および／またはその発症を遅延させるに十分である転帰を意味する。

【0247】

一日の用量の総量：本明細書中で使用される場合、「１日の総投与量」は、２４時間に与えられる、または処方される量である。それは単一単位用量として投与することができる。

【0248】

トランスフェクション：本明細書中で使用されている「トランスフェクション」という語は、外因性核酸を細胞に導入する方法を指す。トランスフェクションの方法には、化学的方法、物理的処理およびカチオン性脂質または混合物が含まれるが、これらに限定されない。

【0249】

治療する：本明細書で使用されている「治療する」という語は、特定の感染症の１つまたはそれ以上の症状または特徴の部分的または完全な緩和、改良、改善、軽減、発症の遅延、進行の阻害、重症度の軽減、および／または発生率 の減少を指す。例えば、癌を「治療する」とは、腫瘍の生存、成長および／または拡散を阻害することを指す。治療は、疾患、障害、および／または状態の徴候を呈していない対象に、および／または疾患、障害および／または状態の初期徴候のみを呈している対象に、疾病、障害、および／または状態に関連する病理を発症するリスクを減少させる目的で投与することができる。

【0250】

修飾されていない：本明細書中で使用されている「修飾されていない」という語は、いずれかの方法で変更される前の任意の物質、化合物、または分子を指す。未改変のものは、生体分子の野生型または天然型を指す場合があるが、必ずしもそうであるとは限らない。分子は、一連の修飾を受けてもよく、それにより、それぞれの修飾された分子は、その後の修飾のための「未修飾」の出発分子として機能し得る。

【0251】

同等のものおよび適用範囲
当業者であれば、本明細書に記載された本発明による特定の実施形態について多くの同等のものを認識するか、またはルーチンの実験のみを用いて確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるように意図されているのではなく、添付の特許請求の範囲に記載されている。

【0252】

特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの不定冠詞は、文脈からその逆であることあるいは明らかに示されていない限り、１つまたはそれ以上のものを意味する。ある群の１つまたはそれ以上の構成員の間に「ｏｒ」を含む請求項または説明は、文脈からその逆であることあるいは明らかに示されていない限り、群の構成員の１つ、１つ以上、またはすべてが所与の製品またはプロセスに存在しているか、使用されているか、または関連している場合に、満たされているとみなされる：本発明は、群の構成員の１つだけが所与の製品またはプロセスに存在しているか、使用されているか、または関連している実施形態を含む。本発明は、群の構成員の１つ以上またはすべてが所与の製品またはプロセスに存在しているか、使用されているか、または関連している実施形態を含む。

【0253】

「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、開かれていることを意図しており、追加の要素またはステップを含めることを許可するが、追加の要素またはステップを含めることを必要とはしていないことにも留意されたい。「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語が本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語もこのように包含され、明示される。

【0254】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本開示での使用のために本明細書に記載されており、当技術分野で公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。

【0255】

範囲が与えられている場合、エンドポイントが含まれる。さらに、別途示されない限り、あるいは文脈および当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、本発明の多様な実施形態において記載された範囲内の任意の特定の値または部分範囲、当該範囲の下限の単位の１０分の１までと想定される（文脈上明確に別途指示されている場合を除く）と理解されるべきである。

【0256】

さらに、先行技術に含まれる本発明の特定の実施形態はすべて、特許請求の範囲のいずれか１つまたはそれ以上から明白に除外され得ることが理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者に知られているとみなされるので、除外が明示的に本明細書に記載されていなくても除外されてよい。本発明の組成物の特定の実施形態（例えば、それによってコードされる任意の核酸またはタンパク質、任意の生産方法、任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関連しているか否かにかかわらず、何らかの理由で、１つまたはそれ以上以上の請求項から除外されることがある。

【0257】

引用文献に明示的に記載されていない場合でも、すべての出典（例えば、参考文献、出版物、データベース、データベースエントリー、およびここに引用された先行技術）は、参照により本出願に組み込まれる。引用された出典と本出願に矛盾する記述がある場合は、本出願の記述が優先するものとする。

【0258】

セクションおよび表の見出しは、限定することを意図していない。
実施例
実施例１：調節性ポリヌクレオチド（人工的なｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡあるいはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ）の設計
人工的なｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡあるいはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡは、標的核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）と少なくとも部分的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの鎖と、一つまたはそれ以上の以下の特徴とを有する人工ｍｉＲ（または人工ｓｉＲＮＡ）をコードするｓｈＲＮＡまたはステムループ構造として設計される：（ａ）基ステムの基部にあるＵＧモチーフ；（ｂ）ｍｉＲＮＡループの５’末端にあるＵＧＵＧモチーフ；（ｃ）ガイド鎖の５’末端にあるウリジン；（ｄ）例えばｍｉＲ－２２のような古典的マイクロＲＮＡに由来するループ構造；（ｅ）３’隣接配列にあるＣＮＮＣ；（ｆ）例えばｌｅｔ－７ｂのような古典的マイクロＲＮＡ由来の隣接領域；および／または（ｇ）パッセンジャー鎖とガイド鎖との間の１つまたはそれ以上のバルジおよびミスマッチ。

【0259】

設計された配列は、操作されるか、合成されるか、またはプラスミドまたはベクターに挿入されて、細胞または生物に投与される。適切なプラスミドまたはベクターは、標的細胞に形質導入またはトランスフェクトするものである。

【0260】

アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、ウイルス粒子またはウイルス全体を使用することができる。
投与により、調節性ポリヌクレオチドのプロセシングが起こり、標的核酸の発現レベルを変化させる人工のマイクロＲＮＡを生成する。

【0261】

標的の効果的なノックダウンは、当該技術分野の方法によって測定され、オフターゲット効果をほとんど示さない。
調節性ポリヌクレオチドの効果的なパッセンジャー／ガイド鎖の二重鎖（例えば、ｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡあるいはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ）は、プロセシングが測定された時に、パッセンジャー鎖に対するガイド鎖の比が９５％を超えることを示す。

【0262】

実施例２：パッセンジャー／ガイド鎖の最適化
特異的かつ強力な標的発現の標的ノックダウンまたは調節を達成するために、本発明のｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡあるいはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡのステムループ構造の二重鎖を形成するパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、例えばｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）として、別々に最適化し得る。

【0263】

ｓｉＲＮＡは、選択対象の標的核酸に対して、以下の特徴を有する古典的ｓｉＲＮＡとして設計される：二重鎖の３’末端に３’ジヌクレオチドオーバーハングを有する１９塩基対の中央二重鎖を有し、アンチセンス鎖が当該１９ヌクレオチド領域にわたって標的核酸に対して完全な相補性を有する。

【0264】

あるいは、ｓｉＲＮＡは、センス鎖（パッセンジャー鎖）が標的核酸に対して１９未満のヌクレオチド同一性を含むように、設計される。
センス－アンチセンス（パッセンジャー／ガイド）鎖二重鎖塩基対形成の改変は、バルジまたはミスマッチを導入するために行われる。挿入または欠失またはミスマッチは、センス鎖の５’末端または３’末端に組み込まれてもよく、これらの挿入または欠失は、ガイド鎖上に反映されてもされなくてもよい。

【0265】

得られたｓｉＲＮＡを、標的ノックダウンおよびその他の関連する生理学的および薬物動態学的特性およびオフターゲット効果の程度について、当該分野で公知の標準的な方法によって試験する。

【0266】

オフターゲット効果の少ない十分な標的ノックダウンを示すｓｉＲＮＡを、本発明のｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡあるいはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡのパッセンジャー鎖およびガイド鎖として、さらなる修飾を加えるか加えずに、操作する。

【0267】

実施例３：ＳＯＤ１のパッセンジャー鎖／ガイド鎖の設計
本発明のｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡあるいはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡのための最適なパッセンジャー鎖およびガイド鎖の設計において、一連の１９－ｍｅｒセンス鎖（パッセンジャー鎖）配列を、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１；ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＮＭ＿０００４５４．４）の配列から選択した。ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ（ＤＮＡとして示す）の配列は以下の通りである：ＧＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＡＴＡＡＡＧＴＡＧＴＣＧＣＧＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＴＴＧＣＧＴＣＧＴＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＧＧＴＴＴＣＣＧＴＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＧＧＣＧＴＧＧＣＣＴＡＧＣＧＡＧＴＴＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡＡＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＴＡＡＴＧＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＴＡＡＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＣＴＴＴＡＡＴＣＣＴＣＴＡＴＣＣＡＧＡＡＡＡＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＣＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＴＧＧＡＧＡＣＴＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＧＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＴＧＧＣＣＧＡＴＧＴＧＴＣＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＴＣＴＧＴＧＡＴＣＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＧＡＧＡＣＣＡＴＴＧＣＡＴＣＡＴＴＧＧＣＣＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＣＴＴＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＴＡＣＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＴＴＴＧＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＡＴＴＧＧＧＡＴＣＧＣＣＣＡＡＴＡＡＡＣＡＴＴＣＣＣＴＴＧＧＡＴＧＴＡＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＣＴＴＡＡＣＴＣＡＴＣＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＴＧＡＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＡＣＡＣＴＧＴＡＡＴＣＴＴＡＡＡＡＧＴＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴＴＴＣＡＧＡＧＴＴＧＣＴＴＴＡＡＡＧＴＡＣＣＴＧＴＡＧＴＧＡＧＡＡＡＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＴＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＡＧＴＴＡＡＡＡＴＧＴＣＴＧＴＴＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＧＡＣＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴＡＡＡＣＴＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＣＡＡＧＣＣＴＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＡＣＣＣＴＧＴＡＴＧＧＣＡＣＴＴＡＴＴＡＴＧＡＧＧＣＴＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ （配列番号：１５）。

【0268】

１９ｍｅｒは、センス鎖の最も５’側の位置、センス鎖の逆相補鎖であるアンチセンス鎖とともに、表４に示されている。
１９ｍｅｒを、試験対象のｓｉＲＮＡを設計するためのコア出発配列として使用した。

【0269】

【表4-1】

【0270】

【表4-2】

【0271】

【表4-3】

【0272】

【表4-4】

【0273】

【表4-5】

【0274】

【表4-6】

【0275】

上記の表４のコア開始センス－アンチセンス対を次に二重鎖ｓｉＲＮＡとして操作した。そうすることで、センス鎖の最も３’側のヌクレオチドは、全ての場合において、シチジン（Ｃ）ヌクレオチドに変化し、その後、標的と同一性を有する１８個のヌクレオチドのみ残った。

【0276】

次いで、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれの３’末端のジヌクレオチド末端を付加して、表５の二重鎖を作製した。

【0277】

【表5-1】

【0278】

【表5-2】

【0279】

【表5-3】

【0280】

【表5-4】

【0281】

【表5-5】

【0282】

【表5-6】

【0283】

【表5-7】

【0284】

次いで、ｓｉＲＮＡをアニールし、ＳＯＤ１ノックダウンについて試験する。
実施例４：ＳＯＤ１を標的とするｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡあるいはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ
実施例３の実験から有効であることが判明したＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡのパッセンジャー／ガイド鎖二重鎖を発現ベクターに操作し、中枢神経系または神経細胞系の細胞にトランスフェクトする。ｓｉＲＮＡノックダウン試験で利用されるオーバーハングは、ｓｉＲＮＡのための古典的ｄＴｄＴであるけれども、合成されたｐｒｉ－ｍｉＲあるいはｐｒｅ－ｍｉＲにおけるオーバーハングは、任意のジヌクレオチドオーバーハングを含み得る。

【0285】

使用される細胞は、初代細胞または多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来するものであってもよい。
ｖ次に、ＳＯＤ１ノックダウンを測定し、ディープシーケンスを行って、発現ベクターに投与された各ｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡあるいはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡからプロセッシングされたパッセンジャー鎖およびガイド鎖を決定する。

【0286】

ノックダウン、例えばＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）プロセッシングの有効性を明らかにするため、パッセンジャー鎖に対するガイド鎖比を算出する。
Ｎ末端を配列決定して分裂部位を決定し、標的の均質な分裂の割合を算出する。分裂率は９０％を上回ることが予想される。

【0287】

並行試験でＨｅＬａ細胞を同時にトランスフェクションし、ＳＯＤ１のｉｎ ｖｉｔｒｏノックダウンを分析する。オフターゲット効果を明らかにするため対照としてルシフェラーゼ構築物を用いる。

【0288】

ディープシーケンスを再度実施する。
実施例５：ＳＯＤ１を標的とするｐｒｉ－ｍｉｃｒｏＲＮＡあるいはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ
本発明によれば、ｐｒｉおよびｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡが設計された。これらを表６Ａ、６Ｂ、７Ａおよび７Ｂに示す。配列は５’から３’の方向で記述され、ステムループ構造の領域はその順序で表内で分割されている。表７Ａおよび７Ｂにおいて、配列の名称の「ｍｉＲ」成分は、必ずしもｍｉＲＮＡ遺伝子の配列番号付けに対応するわけではない（例えば、ＶＯＹｍｉＲ－１０１は配列の名称である場合に、ｍｉＲ－１０１がその配列の一部であることを必ずしも意味していない）。

【0289】

【表6A-1】

【0290】

【表6A-2】

【0291】

【表6B】

【0292】

【表7A-1】

【0293】

【表7A-2】

【0294】

【表7A-3】

【0295】

【表7B】

【0296】

実施例６：ＳＯＤ１を標的とするＰｒｉおよびｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ；ｉｎ ｖｉｖｏ試験
Ｉｎ ｖｉｖｏ試験を実施して、実施例５のｐｒｉ－ または ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ構築物の有効性を試験する。

【0297】

表８は、検討すべき実験的設計変数の概要を示している。
調節性核酸（ｐｒｉまたはｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ）の設計は、ｍｉＲ３０に由来するループ領域を含み、ステム領域は、ｌｅｔ７に由来するか、バルジ、ミスマッチおよびアシンメトリー領域が異なるパッセンジャー鎖の様々な組み合わせに由来する。

【0298】

【表8】

【0299】

実施例７：ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡベクターにおけるｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物
表７に記載のＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡのパッセンジャー／ガイド鎖二重鎖をＡＡＶ－ｍｉＲＮＡ発現ベクターに操作する。ＩＴＲからＩＴＲへの構築物（５’から３’）は、突然変異体ＩＴＲ、プロモーター（ＣＭＶｉｅ、Ｕ６またはＣＢ６プロモーターのいずれか；これらには、ＣＭＶｉｅエンハンサー、ＣＢＡプロモーターおよびＳＶ４０イントロンが含まれる）、表７記載のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物、ウサギグロビンポリＡおよび野生型ＩＴＲを含む。Ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験を実施し、ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡ発現ベクターの有効性を検証する。

【0300】

実施例８：ＨｅＬａ細胞におけるｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物の活性
実施例７に記載されたｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物の７つ（ＶＯＹｍｉＲ－１０３、ＶＯＹｍｉＲ－１０５、ＶＯＹｍｉＲ－１０８、ＶＯＹｍｉＲ－１１４、ＶＯＹｍｉＲ－１１９、ＶＯＹｍｉＲ－１２０、およびＶＯＹｍｉＲ－１２７）と二重鎖ｍＣｈｅｒｒｙ対照とをＨｅＬａにトランスフェクトし、構築物の活性を試験した。

【0301】

Ａ．パッセンジャーおよびガイド鎖の活性
これらの７つのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物と二重鎖ｍＣｈｅｒｒｙ対照とをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、内在性ｍＲＮＡ発現を評価した。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物の７つはすべて、ガイド鎖の活性が高く、７５～８０％のノックダウンを伴っていたが、パッセンジャー鎖の活性は低いかまたは無かった。ｍｉＲＮＡ候補ベクターのガイド鎖は高い活性を示し、ＳＯＤ１の７５～８０％ノックダウンをもたらしたが、パッセンジャー鎖はほとんど活性を示さなかった。

【0302】

Ｂ．ＳＯＤ１上のｍｉＲＮＡの活性
７つのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物および二重鎖ｍＣｈｅｒｒｙ（ｄｓｍＣｈｅｒｒｙ）対照を、ＨｅＬａ細胞に、１ｅ４ ｖｇ／細胞、１ｅ３ ｖｇ／細胞、または１ｅ２ ｖｇ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でトランスフェクトした。７２時間後、内在性ｍＲＮＡ発現を評価した。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物の７つ全てが、１ｅ３ ｖｇ／細胞の濃度で効率的なノックダウンを示した。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物の大部分は、図２に示すように、高い活性（７５～８０％ノックダウン）を示した。

【0303】

実施例９：ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物の活性
実施例７に記載されたｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物の３０個（ＶＯＹｍｉＲ－１０２．８６０，ＶＯＹｍｉＲ－１０２．８６１，ＶＯＹｍｉＲ－１０２．８６６，ＶＯＹｍｉＲ－１０２．８７０，ＶＯＹｍｉＲ－１０２．８２３，ＶＯＹｍｉＲ－１０４．８６０，ＶＯＹｍｉＲ－１０４．８６１，ＶＯＹｍｉＲ－１０４．８６６，ＶＯＹｍｉＲ－１０４．８７０，ＶＯＹｍｉＲ－１０４．８２３，ＶＯＹｍｉＲ－１０９．８６０，ＶＯＹｍｉＲ－１０９．８６１，ＶＯＹｍｉＲ－１０９．８６６，ＶＯＹｍｉＲ－１０９．８７０，ＶＯＹｍｉＲ－１０９．８２３，ＶＯＹｍｉＲ－１１４．８６０，ＶＯＹｍｉＲ－１１４．８６１，ＶＯＹｍｉＲ－１１４．８６６，ＶＯＹｍｉＲ－１１４．８７０，ＶＯＹｍｉＲ－１１４．８２３，ＶＯＹｍｉＲ－１１６．８６０，ＶＯＹｍｉＲ－１１６．８６１，ＶＯＹｍｉＲ－１１６．８６６，ＶＯＹｍｉＲ－１１６．８７０，ＶＯＹｍｉＲ－１１６．８２３，ＶＯＹｍｉＲ－１２７．８６０，ＶＯＹｍｉＲ－１２７．８６１，ＶＯＹｍｉＲ－１２７．８６６，ＶＯＹｍｉＲ－１２７．８７０，ＶＯＹｍｉＲ－１２７．８２３）と ＶＯＹｍｉＲ－１１４および二重鎖ｍＣｈｅｒｒｙの対照とを細胞にトランスフェクトし、構築物の活性を試験した。

【0304】

Ａ．ＨＥＫ２９３のパッセンジャーおよびガイド鎖の活性
３０個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物および２個の対照をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２４時間後、内在性ｍＲＮＡ発現を評価した。ｐｒｉ－ｍＲＮＡ構築物の大部分は、ガイド鎖の活性が高かったが（図３）、パッセンジャー鎖の活性は低いかまたは無かった（図４）。

【0305】

Ｂ．ＨｅＬａのパッセンジャーおよびガイド鎖の活性
３０個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物および２個の対照をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、内在性ｍＲＮＡ発現を評価した。ｐｒｉ－ｍＲＮＡ構築物の大部分は、ガイド鎖の活性が高かったが（図（図５）、パッセンジャー鎖の活性が低いかまたは無かった（図６）。

【0306】

Ｃ．ＨｅｌＡおよびＨＥＫ２９３の相関
３０個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡのノックダウン効果は、ＨｅＬａ細胞とＨＥＫ２９３細胞との間で同様であった。３０個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物は、構築物のガイド鎖についてのノックダウン効果を示した（図３および図５を参照せよ）。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物のガイド鎖の大部分は、７０～９０％のノックダウン効果を示した。

【0307】

Ｄ．カプシドの選択
ＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３由来の最良のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物を、ＡＡＶにパッケージングし、ＨｅＬａ感染に付した。当該構築物をパッケージするのに最適なＡＡＶを決定するために、ＡＡＶ２またはＡＡＶ－ＤＪ８のいずれかにパッケージングしたｍＣｈｅｒｒｙを、１０μｇ／細胞、１ｅ２ｖｇ／細胞、１ｅ３ｖｇ／細胞、１ｅ４ｖｇ／細胞または１ｅ５ｖｇ／細胞のＭＯＩでＨｅＬａ細胞に感染させ、発現を４０時間後に評価した。ＡＡＶ２を、最良のｐｒｉ－ｍｉＲ構築物をパッケージするためのカプシドとして選択した。

【0308】

Ｅ．ＡＡＶ２産生
ＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３由来の最良のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物をＡＡＶ２（１．６ｋｂ）にパッケージし、二重鎖ｍＣｈｅｒｒｙ（ｄｓｍＣｈｅｒｒｙ）対照もパッケージした。パッケージした構築物は、分析前にイドオキシアルカノール精製を行った。ＡＡＶの力価を表９に示す。

【0309】

【表9】

【0310】

ＨｅＬａ細胞におけるＳＯＤ１ノックダウンに対する形質導入の効果を図７に示す。さらに、ＨｅＬａ細胞において、より大きいＭＯＩ（１．０Ｅ＋０５に１．０Ｅ＋０４を比較）では、全ての構築物についてノックダウンの増加を示さなかった。

【0311】

Ｆ．ヒト運動ニューロン前駆細胞（ＨＭＮＰ）における構築物の活動
実施例９Ｅに記載された最良の１８個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物とｍＣｈｅｒｒｙの対照とを、１０Ｅ５のＭＯＩでヒト運動ニューロン前駆細胞（ＨＭＮＰ）細胞に感染させた。４８時間後、内在性ｍＲＮＡ発現を評価した。構築物の約半分が、ＨＭＮＰ中のＳＯＤ１の５０％以上のサイレンシングをもたらし、そのうちの４つは７０％以上のサイレンシングをもたらした（図８）。

【0312】

Ｇ．インビボ試験用の構築物の選抜
標的配列に大きな影響を及ぼし、カセットに軽微な影響しか及ぼさない上位１２個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡパッケージ化構築物を選択した。ＡＡＶ－ｒｈ１０カプシド内にパッケージングされた構築物を注射用に製剤し、構築物が及ぼすｉｎ ｖｉｖｏへの影響を試験するため哺乳類に投与した。

【0313】

Ｈ．種々の細胞株における活性
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡパッケージ化構築物の活性を、ＨｅＬａ、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ、Ｕ８７ＭＧおよび初代ヒト星状細胞において試験した。ＨｅＬａ細胞における活性は、１～５ｐＭの範囲であった。ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における活性は１３～１７ｐＭの範囲であった。Ｕ８７ＭＧ細胞における活性は約１ｐＭであった。初代ヒト星状細胞の活性は４９～１２３ｐＭの範囲であった。

【0314】

実施例１０：Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡのＩｎ Ｖｉｔｒｏ試験
実施例９Ｄに記載の１８個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡおよびｍＣｈｅｒｒｙ対照をＡＡＶ２にパッケージングし、この試験に使用した。この試験には、培地（５００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ－１２ ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）補充物（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃．１０５６５－０１８）、５０ｍｌのＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１６０００－０４４、ｌｏｔ：１３４７５５６）、５ｍｌのＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００ｘ）（Ｃａｔ．＃ １１１４０－０５０）、および５ｍｌのＨＥＰＥＳ（１Ｍ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１５６３０－０８０））中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．＃ ＨＣＬ４５１７）、培地（５００ ｍｌ のＤＭＥＭ／Ｆ－１２ ＧＬＵＴＡＭＡＸＴＭ補充物（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃．１５６３０－０８０）、５０ｍｌのＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１６０００－０４４、ｌｏｔ：１３４７５５６）、５ｍｌのＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００ｘ）（Ｃａｔ．＃ １１１４０－０５０）、および５ｍｌのＨＥＰＥＳ（１Ｍ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１５６３０－０８０））中で培養したＵ２５１ＭＧ細胞（Ｐ１８）（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃．０９０６３００１－１ＶＬ）、または、ＡＧＭ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ Ｋｉｔ Ｓｕｐｐｌ＆Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ＃ ＣＣ－４１２３）を補充した培地（ＡＢＭ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ ５００ ｍｌ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ＃ ＣＣ－３１８６））中の正常ヒトアストロサイト（ＨＡ）（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ＃ ＣＣ－２５６５）を用いて構築物を試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（９６ウェルプレートに５×１０Ｅ４細胞／ウェル）、Ｕ２５１ＭＧ細胞（９６ウェルプレートに２×１０Ｅ４細胞／ウェル）およびＨＡ細胞（９６ウェルプレートに２×１０Ｅ４細胞／ウェル）を播種し、細胞の感染に使用したＭＯＩは１．０Ｅ＋０５であった。４８時間後、細胞を分析した。その結果を表１０に示す。

【0315】

【表10-1】

【0316】

【表10-2】

【0317】

ほとんどの構築物について、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において８０％以上のノックダウンが観察された。Ｕ２５１ＭＧ細胞およびＨＡ細胞において、構築物の半分以上が８０％を超えるノックダウンを示した。

【0318】

実施例１１：用量依存性のＳＯＤ１の減少
実施例９Ｅに記載されている１８個のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物の４つとｍＣｈｅｒｒｙの対照を、１．０Ｅ＋０２、１．０Ｅ＋０３、１．０Ｅ＋０４、１．０Ｅ＋０５あるいは１．０Ｅ＋０６のＭＯＩで、ヒト星状細胞株（Ｕ２５１ＭＧ）または初代ヒト星状細胞（ＨＡ）にトランスフェクトした。４８時間後、内因性ｍＲＮＡ発現および用量依存性サイレンシングを評価し、その結果を図９（Ｕ２５１ＭＧ）および図１０（ＨＡ）に示す。すべての構築物について、用量の増加はまた、ノックダウンされたＳＯＤ１ ｍＲＮＡの量の増加と相関した。

【0319】

実施例１２：ＳＯＤ１ノックダウンの時間的経過
ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡの陰性対照および陽性対照である２つのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構築物（ＶＯＹｍｉＲ－１２０およびＶＯＹｍｉＲ－１２２）を、ヒト星状細胞株（Ｕ２５１ＭＧ）にトランスフェクトした。図１０に示すように、相対ＳＯＤ１ ｍＲＮＡを６０時間測定した。１１．ｈＳＯＤ１のノックダウンのうち７０～７５％は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒトランスフェクション後の両方のｐｒｉ－ｍｉＲ構築物について見られたが、中でも１２～２４時間の間に最大のノックダウンを示した。

【0320】

実施例１３：ＳＯＤ１ノックダウンと鎖のパーセント
ＶＯＹｍｉＲ－１０４を、５０ｐＭ、１００ ｐＭおよび１５０ ｐＭの濃度で、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、未処理（ＵＴ）細胞と比較した。相対的なＳＯＤ１ ｍＲＮＡ、ガイド鎖のパーセントおよびパッセンジャー鎖のパーセントを、図１１Ａ－１１Ｃに示すように、３６、７２、１０８および１４４時間で決定した。１２Ａ－１２Ｃ．最も高い濃度（１５０ｐＭ）は発現の最大低下を示したが、３つの用量すべてがＳＯＤ１の発現の有意な減少を示した。

【0321】

実施例１４：ＳＯＤ１を標的とするＰｒｉ－ｍｉＲＮＡ
Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、イヌＳＯＤ１のために設計され、その構築物を表１１に示す。イヌＳＯＤ１は、本発明で標的とする領域において、ヒトと１００％保存されている。配列は５’から３’の方向で記述され、ステムループ構造の領域はその順序で表内で分割されている。表１１において、配列名の「ｍｉＲ」成分は、必ずしもｍｉＲＮＡ遺伝子の配列番号に対応するとは限らない（例えば、ｄＶＯＹｍｉＲ－１０２が配列名である場合に、それは必ずしもｍｉＲ－１０２が配列の一部であることを意味しない）。

【0322】

【表11】

【0323】

実施例１５：調節ポリヌクレオチドの位置が及ぼす影響
Ａ．ウイルス力価への影響
調節性ポリヌクレオチド（ＶＯＹｍｉＲ－１１４またはＶＯＹｍｉＲ－１２６）を、発現ベクター（ゲノムサイズ約２４００ヌクレオチド；ｓｃＡＡＶ）の図１３に示す６つの異なる部位に挿入した。ここで、「ＩＴＲ」は逆方向末端反復を表し、「Ｉ」はイントロンを表し、「Ｐ」はポリＡを表し、「ＭＰ」は調節性ポリヌクレオチドを表す。図１３においてウイルス力価を、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲを用いて６つの部位および対照（調節性ポリヌクレオチドを含まない構築物；ｓｃＡＡＶ）について評価し、その結果を表１２に示す。

【0324】

【表12-1】

【0325】

【表12-2】

【0326】

Ｂ．ゲノムの完全性への影響
調節性ポリヌクレオチド（ＶＯＹｍｉＲ－１１４）を、発現ベクター（ゲノムサイズ約２４００ヌクレオチド；ｓｃＡＡＶ）の図１３に示す６つの異なる部位、および調節性ポリヌクレオチドを含まない対照（ｓｃＡＡＶ）に挿入した。図１３において精製されたＡＡＶ調製物からウイルスゲノムを抽出し、中性アガロースゲル上に流した。短縮型ゲノムが全ての構築物で見られた。短縮型ゲノムのおよそのパーセント（総数に対するパーセント）を表１３に示す。

【0327】

【表13】

【0328】

短縮型ゲノムは位置６が最大値であり位置４および５が最小値だった。
Ｃ．ノックダウン効率への影響
調節性ポリヌクレオチド（ＶＯＹｍｉＲ－１１４）を、発現ベクター（ＡＡＶ２）（ゲノムサイズ約２４００ヌクレオチド；ｓｃＡＡＶ）の図１３に示す６つの異なる部位に挿入した。図１３において１ｘ１０^４ｖｇ／ｃｅｌｌ，１ｘ１０^３ｖｇ／ｃｅｌｌおよび１ｘ１０^２ｖｇ／ｃｅｌｌでＨｅＬａ細胞の形質導入を実施した。ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現（対照ｅＧＦＰの％として）を感染７２時間後に測定した。その結果を表１４に示す。

【0329】

【表14-1】

【0330】

【表14-2】

【0331】

位置３は最も高いＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現を示し（対照の％として）、位置４は最も低いＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現を示した（対照の％として）。
実施例１６：ゲノムサイズの影響
Ａ．ウイルス力価への影響
調節性ポリヌクレオチド（ＶＯＹｍｉＲ－１１４）を、発現ベクター（ＡＡＶ２）（ゲノムサイズ約２４００ヌクレオチド；ｓｃＡＡＶ）の図１３に示す部位１、２、５、および６に挿入した。図１３において調節性ポリヌクレオチドを含まない二重鎖対照（ゲノムサイズ１．６ｋｂ；ｓｃＡＡＶ ｃｔｒｌ）と、二重鎖発現ベクター（ｓｃＡＡＶ ｍｉＲ１１４；ＩＴＲ（１０５ヌクレオチド）－プロモーター（～９００ヌクレオチド）－調節性ポリヌクレオチド（１５８ヌクレオチド）－ポリＡ配列（１２７ヌクレオチド）およびＩＴＲ）と、調節性ポリヌクレオチドを含まない対照（ｅＧＦＰ；ｓｃＡＡＶ）とを比較した。ウイルス力価をＴａｑＭａｎ ＰＣＲを用いて評価した。その結果を表１５に示す。

【0332】

【表15】

【0333】

位置５の構築物で最も低いウイルス力価、位置２の構築物で最も高いウイルス力価が観察された。
Ｂ．ゲノムの完全性への影響
調節性ポリヌクレオチド（ＶＯＹｍｉＲ－１１４）を、発現ベクター（ＡＡＶ２）（ゲノムサイズ約２４００ヌクレオチド；ｓｃＡＡＶ）の図１３に示す部位１、２、５、および６に挿入した。図１３において調節性ポリヌクレオチドを含まない二重鎖対照（ゲノムサイズ１．６ｋｂ；ｓｃＡＡＶ ｃｔｒｌ）と、二重鎖発現ベクター（ｓｃＡＡＶ ｍｉＲ１１４；ＩＴＲ（１０５ヌクレオチド）－プロモーター（～９００ヌクレオチド）－調節性ポリヌクレオチド（１５８ヌクレオチド）－ポリＡ配列（１２７ヌクレオチド）およびＩＴＲ）と、調節性ポリヌクレオチドを含まない対照（ｅＧＦＰ；ｓｃＡＡＶ）とを比較した。短縮型ゲノムはすべての構築物で見られるが、その短縮型ゲノムのおよそのパーセント（合計のパーセント）を表１６に示す。

【0334】

【表16】

【0335】

全ての構築物はいくつかの短縮型ゲノムを有することが断定された。
さらなる試験を行い、異なる調節性ポリヌクレオチドの効果を決定した。ＶＯＹｍｉＲ－１１４およびＶＯＹｍｉＲ－１２６を、３’ＩＴＲ（順方向）付近に調節性ポリヌクレオチドを有する別個の複数の発現ベクター（ゲノムサイズ１．６ｋｂ；ｓｃＡＡＶ）に挿入した。ＶＯＹｍｉＲ－１１４構築物の場合、ベクターゲノムの５’末端（１５２６ヌクレオチド）と調節ポリヌクレオチドの中心（可撓性ループの中央）の間の距離は１１１５ヌクレオチドである。ＶＯＹｍｉＲ－１２６構築物の場合、ベクターゲノムの５’末端（１６２６ヌクレオチド）と調節ポリヌクレオチドの中心（可撓性ループの中央）との間の距離は１１６４ヌクレオチドである。

【0336】

ＶＯＹｍｉＲ－１１４構築物について、ウイルス力価（１５ｃｍ培養皿当たりのＶＧ）は約１．１Ｅ＋１１であった。ＶＯＹｍｉＲ－１２６構築物について、イントロンプローブウイルス力価（１５ｃｍ培養皿当たりのＶＧ）は約１．２Ｅ＋１２であった。対照は約２．１Ｅ＋１１（１５ｃｍ培養皿当たりのＶＧ）であった。ＶＯＹｍｉｒ－１１４は約２０％の短縮型ゲノムを有し、ＶＯＹｍｉＲ－１２６は約１５％の短縮型ゲノムを有し、対照は約５％の短縮型ゲノムを有した。

【0337】

実施例１７：一本鎖構築物の影響
Ａ．ウイルス力価への影響
調節性ポリヌクレオチド（ＶＯＹｍｉＲ－１１４）を、発現ベクター（ゲノムサイズ４．７ ｋｂ；ｓｓＡＡＶ）の図１３に示す部位１、３、および５に挿入した。また、調節性ポリヌクレオチドを含まない対照（ゲノムサイズ２ｋｂ；ｓｓＡＡＶ）も試験した。図１３においてウイルス力価をＴａｑＭａｎ ＰＣＲを用いて評価した。その結果を表１７に示す。

【0338】

【表17】

【0339】

位置３が最も高いウイルス力価を示し、位置１そして位置５の順で続いた。
Ｂ．ゲノムの完全性への影響
調節性ポリヌクレオチド（ＶＯＹｍｉＲ－１１４）を、発現ベクター（ゲノムサイズ４．７ ｋｂ；ｓｓＡＡＶ）の図１３に示す部位１、３、および５に挿入した。また、調節性ポリヌクレオチドを含まない対照（ゲノムサイズ２ｋｂ；ｓｓＡＡＶ）も試験した。図１３において精製されたＡＡＶ調製物からウイルスゲノムを抽出し、中性アガロースゲル上に流した。短縮型ゲノムが全ての構築物で見られた。短縮型ゲノムのおよそのパーセント（総数に対するパーセント）を表１８に示す。

【0340】

【表18】

【0341】

短縮型ゲノムは位置５が最大値であり位置３が最小値であった。
Ｃ．ノックダウン効率への影響
調節性ポリヌクレオチド（ＶＯＹｍｉＲ－１１４）を、発現ベクター（ゲノムサイズ４．７ｋｂ；ｓｓＡＡＶ）の図１３に示す部位１、３、および５に挿入した。また、調節性ポリヌクレオチドを含まない対照（ゲノムサイズ２ｋｂ；ｓｓＡＡＶ）も試験した。さらに、調節性ポリヌクレオチドを含まない一本鎖対照（ゲノムサイズ２ｋｂ；ｓｓＡＡＶ ｃｔｒｌ）と、調節性ポリヌクレオチドを含まない二重鎖対照（ゲノムサイズ１．６ｋｂ；ｓｃＡＡＶ ｃｔｒｌ）と、二重鎖発現ベクター（ｓｃＡＡＶ ｍｉＲ１１４；ＩＴＲ（１０５ヌクレオチド）－プロモーター（～９００ヌクレオチド）－調節性ポリヌクレオチド（１５８ヌクレオチド）－ポリＡ配列（１２７ヌクレオチド）およびＩＴＲ）とを作成した。図１３において１ｘ１０^４ｖｇ／ｃｅｌｌ，１ｘ１０^３ｖｇ／ｃｅｌｌおよび１ｘ１０^２ｖｇ／ｃｅｌｌでＨｅＬａ細胞の形質導入を実施した。感染７２時間後のＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現（対照ｅＧＦＰの％として）を感染の７２時間後に測定した。その結果を表１９に示す。

【0342】

【表19】

【0343】

位置３は最も高いＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現（対照の％として）を有し、次いで位置１であり、最も低いＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現を有する一本鎖構築物（対照の％として）は位置５であった。一本鎖構築物のいずれも、調節性ポリヌクレオチドを含む二重鎖対照ほど低いノックダウン効率を有さなかった。

【0344】

実施例１８：ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＯＤ１ノックダウン
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの ｉｎ ｖｉｖｏ生体活動を測定するために、自己相補のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ（ＶＯＹｍｉＲ－１１４．８０６、ＶＯＹｍｉＲ１２７．８０６、ＶＯＹｍｉＲ１０２．８６０、ＶＯＹｍｉＲ１０９．８６０、ＶＯＹｍｉＲ１１４．８６０、ＶＯＹｍｉＲ１１６．８６０、ＶＯＹｍｉＲ１２７．８６０、ＶＯＹｍｉＲ１０２．８６１、ＶＯＹｍｉＲ１０４．８６１、ＶＯＹｍｉＲ１０９．８６１、ＶＯＹｍｉＲ１１４．８６１、ＶＯＹｍｉＲ１０９．８６６、ＶＯＹｍｉＲ１１６．８６６、またはＶＯＹｍｉＲ１２７．８６６）がＣＢＡプロモーターを有するＡＡＶ－ＤＪにパッケージングされた。

【0345】

マウスにおいて、これらのパッケージされたｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはビヒクルのみの対照（５％ソルビトールおよび０．００１％Ｆ－６８を含むリン酸緩衝化生理食塩水）を、１０分間の点鼻内注入によって投与した。ヒトＳＯＤ１を発現し、体重約２０～３０ｇの雌または雄のＴｇ（ＳＯＤ１）３Ｃｊｅ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、バーハーバー、メイン州）に線条体を標的とする５μＬの被験物質の片側注入をする（ブレグマに対し、前後＋０．５ｍｍ、中外＋２ｍｍ。頭蓋骨表面に対し、背腹３．８ｍｍ）。被験物質を、３３ゲージ針を用いて、予め充填されポンプ制御されたハミルトンマイクロシリンジ（１７０１モデル、１０μｌ）を用いて、毎分０．５ｕＬで注射する（被験物質当たり５匹の動物）。注射後１、２、３、４または６週間で動物を屠殺し、脳を摘出し、１ｍｍの冠状スラブからの注入部位を包含する同側の線条ならびに隣接する１ｍｍの冠状スラブからの線条体組織を解剖し、瞬間凍結させる。マウス組織サンプルを溶解し、ヒトＳＯＤ１タンパク質レベル、ＳＯＤ１およびマウスＧＡＰＤＨ（ｍＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡレベルを定量する。ＳＯＤ１タンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンディエゴ、カリフォルニア州））により定量し、全タンパク質レベルをＢＣＡ分析（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）によって定量する。各組織サンプルについて、全タンパク質に対して標準化されたＳＯＤ１タンパク質のレベルは、２回の測定の平均値で計算される。これら標準化したＳＯＤ１タンパク質レベルをビヒクル群に対してさらに標準化し、次に平均して群（治療群）の平均を得る。ＳＯＤ１およびｍＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって定量する。各組織サンプルについて、ＳＯＤ１／ｍＧＡＰＤＨ（標準化したＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベル）の比率を、３回の測定の平均値で計算する。次いで、これらの比率を平均して群（治療群）の平均値を得る。これらの群の平均は、ビヒクル群に対してさらに標準化される。

【0346】

ヒト以外の霊長類においては、被験物質（ＣＢＡプロモーターを有するＡＡＶ－ＤＪにパッケージされたｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの１×１０^１３－３ｘ１０^１３ｖｇ）またはビヒクルは、髄腔内腰椎ボーラスにより投与される。約２．５～８．５ｋｇの体重のメスのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、ＣＲ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｄｅｌ Ｈｏｕｓｔｏｎ、ヒューストン、テキサス州）には、腰椎に位置するカテーテルの先端を有する移植された単一髄腔内カテーテルを投与する。被験物質を、約６０分間隔で、１ｍＬボーラス注射（毎分１ｍＬ）を３回投与する（被験物質当たり４匹の動物）。投与後４～６週間で動物を屠殺し、選択した組織を採取して生物分析および組織学的評価を行う。ＳＯＤ１タンパク質およびｍＲＮＡレベルを、ビヒクル群に対してＣＢＡプロモーターを有するＡＡＶ－ＤＪにパッケージングされたｐｒｉ－ｍｉＲＮＡで治療した後の抑制について評価する。

【0347】

実施例１９：ＶＯＹｍｉＲ－１１４．８０６を用いたｉｎ ｖｉｖｏでのＳＯＤ１ノックダウン
Ｔｇ（ＳＯＤ１）３Ｃｊｅ／Ｊマウスにおいて、ＣＢＡプロモーターを含むＡＡＶＤＪにパッケージングされたＶＯＹｍｉＲ－１１４．８０６を、実施例１８に記載したように投与する。マウスに、一方向性線条体投与によって投与した。投与量は３．７ｘ１０^９ｖｇであった。１週間または２週間後、標準化したＳＯＤ１タンパク質レベルの有意な減少はなかった。ビヒクル対照群のＳＯＤ１タンパク質濃度は、１週間および２週間後にそれぞれ９８＋１１％（標準偏差）および９８＋１０％であった。第３週までに、ＶＯＹｍｉＲ－１１４．８０６は、標準化ＳＯＤ１タンパク質レベルをビヒクル対照群の８４±１％±２％９．０％に減少させたが、これは統計的に有意であった（ｐ＜０．０５、Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック分析による一元配置ＡＮＯＶＡ）。第４週および第６週までに、ＶＯＹｍｉＲ－１１４．８０６は、正常化ＳＯＤ１タンパク質レベルをそれぞれビヒクル対照グループの７３＋７．９％（ｐ＜０．０００１）および７５＋７．４％（ｐ＜０．０００１）減少させた。これらの結果は、ＣＢＡプロモーターを有するＡＡＶ－ＤＪにパッケージングされたＶＯＹｍｉＲ－１１４．８０６が、ＳＯＤ１タンパク質レベルをダウンモジュレーションするのにｉｎ ｖｉｖｏで有効であることを実証している。さらに、これらの結果は、ＣＢＡプロモーターを有するＡＡＶＤＪ中にパッケージングされたＶＯＹｍｉＲ－１１４．８０６の３．７ｘ１０^９ｖｇの総線条体用量がＳＯＤ１タンパク質レベルの有意なダウンモジュレーションをもたらしたことを実証する。

【0348】

本発明は、記載された幾つかの実施形態に関して、ある程度の長さで、ある程度の特殊性を以て説明されているが、本発明は、そのような特殊性、実施形態、または任意の特定の実施形態に限定されるように意図されておらず、本発明は、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。その理由は、先行技術を考慮してそのような請求の範囲を可能な限り広く解釈するためであり、また本発明の意図する範囲を効果的に包含するためである。

【0349】

本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。さらに、セクション見出し、材料、方法、および実施例は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図するものではない。

【0350】

以下、上記の実施形態から把握できる技術的思想を付記する。
（付記１）
調節性ポリヌクレオチドで次のものを含むもの
（ａ）ステム－ループ構造を形成するためのステムおよびループであって、前記ステム－ループ構造の配列は、５’から３’の方向に；
（ｉ）前記ステム－ループ構造の５’ステムの基部またはその近くに位置するＵＧモチーフと；
（ｉｉ）パッセンジャー鎖および随意的に５’スペーサー領域を含む５’ステムアーム（前記５’スペーサー領域は、それが存在する場合には、前記ＵＧモチーフと前記パッセンジャー鎖との間に位置している）と；
（ｉｉｉ）ループ領域の５’末端に位置するＵＧＵＧモチーフを含むループ領域と；
（ｉｖ）ガイド鎖および随意的に３’スペーサー領域を含む３’ステムアーム（前記３’ステムアームでは、ウリジンがガイド鎖の５’末端に存在し、前記３’スペーサー領域は、それが存在する場合には、１つのヘリカルターンを形成するのに十分な長さを有している）と
を含むステムおよびループと；
（ｂ）前記ステム－ループ構造の５’に位置する第１の隣接領域と；および
（ｃ）前記ステム－ループ構造の３’に位置する第２の隣接領域（前記第２の隣接領域はＣＮＮＣを含む）。

【0351】

（付記２）
前記ステム－ループ構造のループ領域が、古典的マイクロＲＮＡに由来する、付記１に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0352】

（付記３）
前記古典的マイクロＲＮＡがｍｉＲ－２２である、付記２に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0353】

（付記４）
前記第１または第２の隣接領域の少なくとも１つがｌｅｔ－７ｂに由来する、付記３に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0354】

（付記５）
前記第１の隣接領域が、表１に記載の５’隣接領域である、付記１に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0355】

（付記６）
前記ループ領域が、表２に記載のループ領域群の１つである、付記１に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0356】

（付記７）
前記第２の隣接領域が、表３に記載の３’隣接領域である、付記１に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0357】

（付記８）
前記ガイド鎖が、２位と１５位の間に位置するマイクロＲＮＡシード配列を含む、付記１に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0358】

（付記９）
前記ガイド鎖が、２～７位、２～８位または２～９位に位置するマイクロＲＮＡシード配列を含む、付記８に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0359】

（付記１０）
前記ガイド鎖が１５～３０ヌクレオチドの長さである、付記１に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0360】

（付記１１）
前記パッセンジャー鎖が、ガイド鎖と少なくとも７０％相補的である、付記１０に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0361】

（付記１２）
前記ガイド鎖が２１～２５ヌクレオチドの長さである、付記１０に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0362】

（付記１３）
前記ガイド鎖が２２ヌクレオチド長である、付記１２に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0363】

（付記１４）
前記ガイド鎖が２１ヌクレオチド長である、付記１２に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0364】

（付記１５）
前記ガイド鎖が、哺乳動物コーディングｍＲＮＡおよび哺乳動物ノンコーディングＲＮＡからなる群から選択される標的ＲＮＡと少なくとも７０％相補的である、付記１０に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0365】

（付記１６）
前記標的ＲＮＡが哺乳動物コーディングｍＲＮＡである、付記１５に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0366】

（付記１７）
前記コーディングｍＲＮＡが、神経細胞、組織または器官において発現される、付記１６に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【0367】

（付記１８）
人工のｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡであって、次のものを含むもの：
（ａ）ステム－ループ構造を形成するためのステムおよびループであって、前記ステム－ループ構造の配列は、５’から３’の方向に；
（ｉ）パッセンジャー鎖および５’スペーサー領域を含む５’ステムアーム（前記５’スペーサー領域が前記パッセンジャー鎖の５’側に位置している）と；
（ｉｉ）ループ領域の５’末端に位置するＵＧＵＧモチーフを含むループ領域と；
（ｉｉｉ）ガイド鎖および３’スペーサー領域を含む３’ステムアーム（前記３’ステムアームでは、ウリジンがガイド鎖の５’末端に存在し、前記３’スペーサー領域が１つのらせん状のターンを形成するのに十分な長さを有している）と；
（ｉｖ）随意的に、前記ステム－ループ構造の５’ステムの基部またはその近くに位置するＵＧモチーフ
を含むステムおよびループ。

【0368】

（付記１９）
人工のｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡであって、次のものを含むもの：
（ａ）ステム－ループ構造を形成するためのステムおよびループであって、前記ステム－ループ構造の配列は、５’から３’の方向に；
（ｉ）ガイド鎖および５’スペーサー領域を含む５’ステムアーム（前記５’スペーサー領域が前記ガイド鎖の５’側に位置している）と；
（ｉｉ）ループ領域の５’末端に位置するＵＧＵＧモチーフを含むループ領域と；
（ｉｉｉ）パッセンジャー鎖および３’スペーサー領域を含む３’ステムアーム（前記３’ステムアームでは、ウリジンがパッセンジャー鎖の５’末端に存在し、前記３’スペーサー領域が１つのらせん状のターンを形成するのに十分な長さを有している）と；
（ｉｖ）随意的に、前記ステム－ループ構造の５’ステムの基部またはその近くに位置するＵＧモチーフ
を含むステムおよびループ。

【0369】

（付記２０）
付記１～１９のいずれか一項に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードするプラスミドまたはベクター。

【0370】

（付記２１）
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物を含む、付記２０に記載のベクター。
（付記２２）
付記２１に記載のＡＡＶ構築物を含む組換えＡＡＶウイルス。

【0371】

（付記２３）
ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ＡＡＶ３，ＡＡＶ４，ＡＡＶ５，ＡＡＶ６，ＡＡＶ７，ＡＡＶ８，ＡＡＶ９，ＡＡＶ９．４７，ＡＡＶ９（ｈｕ１４），ＡＡＶ１０，ＡＡＶ１１，ＡＡＶ１２，ＡＡＶｒｈ８，ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶ－ＤＪからなる群から選択されるカプシド血清型を含む、付記２２に記載の組換えＡＡＶウイルス。

【0372】

（付記２４）
前記カプシド血清型が、ＡＡＶ２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ９．４７からなる群から選択される、付記２３に記載の組換えＡＡＶウイルス。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

2023078454000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-04-26

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

調節性ポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１～４のいずれかの配列を含む５’隣接領域と；
（ｂ）パッセンジャー鎖と；
（ｃ）配列番号５～９のいずれかの配列を含むループ領域と；
（ｄ）ガイド鎖と；
（ｅ）配列番号１０の配列を含む３’隣接領域と
を含み、
前記パッセンジャー鎖および前記ガイド鎖は、ステムループ構造の５’アームおよび３’アームにそれぞれ位置し、前記パッセンジャー鎖は前記５’隣接領域と前記ループ領域との間に配置され、前記ガイド鎖は前記ループ領域と前記３’隣接領域との間に配置されている、調節性ポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記パッセンジャー鎖が１５～３０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記ガイド鎖が１５～３０ヌクレオチドの長さである、請求項１又は２に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【請求項4】

前記パッセンジャー鎖が、前記ガイド鎖と少なくとも７０％相補的である、請求項１～３のいずれか一項に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【請求項5】

前記ガイド鎖が、標的ＲＮＡと少なくとも７０％相補的である、請求項１～４のいずれか一項に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【請求項6】

前記標的ＲＮＡが、神経細胞、組織、または器官で発現されるものである、請求項５に記載の調節性ポリヌクレオチド。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードするベクター。

【請求項8】

２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に配置されたヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスゲノムであって、前記ヌクレオチド配列は請求項１～６のいずれか一項に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードするＡＡＶウイルスゲノム。

【請求項9】

（ｉ）前記調節性ポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター、
（ｉｉ）エンハンサー、
（ｉｉｉ）イントロン領域、および
（ｉｖ）ポリＡシグナル領域
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項８に記載のＡＡＶウイルスゲノム。

【請求項10】

請求項８または９に記載のＡＡＶウイルスゲノムおよびＡＡＶカプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶウイルス。

【請求項11】

前記ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質またはその改変体、ＡＡＶ５カプシドタンパク質またはその改変体、あるいはＡＡＶ９カプシドタンパク質またはその改変体を含む、請求項１０に記載の組換えＡＡＶウイルス。

【請求項12】

請求項１～６のいずれか一項に記載の調節性ポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、請求項８または９に記載のＡＡＶウイルスゲノム、あるいは請求項１０または１１に記載の組換えＡＡＶウイルスを含む細胞。

【請求項13】

前記細胞は、ヒト細胞、ＨＥＫ２９３細胞、中枢神経系の細胞、運動ニューロン、または星状細胞である、請求項１２に記載の細胞。

【請求項14】

請求項１～６のいずれか一項に記載の調節性ポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、請求項８または９に記載のＡＡＶウイルスゲノム、あるいは請求項１０または１１に記載の組換えＡＡＶウイルスと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項15】

対象の中枢神経系の疾患の治療に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の調節性ポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、請求項８または９に記載のＡＡＶウイルスゲノム、あるいは請求項１０または１１に記載の組換えＡＡＶウイルスを含む組成物、もしくは請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記組成物は、静脈内投与、大槽内注射、血管内投与、および心室内投与のうちの少なくともいずれかによって投与されるものである、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

対象の中枢神経系の疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１～６のいずれか一項に記載の調節性ポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、請求項８または９に記載のＡＡＶウイルスゲノム、あるいは請求項１０または１１に記載の組換えＡＡＶウイルスを含む組成物、または請求項１４に記載の医薬組成物の使用。

【請求項18】

前記医薬は、静脈内投与、大槽内注射、血管内投与、および心室内投与のうちの少なくともいずれかによって投与されるものである、請求項１７に記載の使用。

【手続補正書】

【提出日】2023-05-26

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

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