特開 2023-82302 プロトテカ・ボビス検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023082302

(43)【公開日】2023-06-14

(54)【発明の名称】プロトテカ・ボビス検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/689 20180101AFI20230607BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20230607BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20230607BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/689 Z

C12Q1/02 ZNA

C12Q1/6844 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021195972

(22)【出願日】2021-12-02

(71)【出願人】

【識別番号】504300088

【氏名又は名称】国立大学法人北海道国立大学機構

(72)【発明者】

【氏名】豊留 孝仁

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR56

4B063QR62

4B063QS24

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】 本発明は、プロトテカ・ボビスをＬＡＭＰ法にて検出するプライマーとその検出法を提供することを目的とするものである。
【解決手段】 本発明で開発したＰｂＦ３ｖ１ｂ、ＰｂＢ３ｖ１ｂ、ＰｂＦＩＰｖ１ｂ、ＰｂＢＩＰｖ１ｂのプライマーを開示する。
このプライマーを用いて、ＬＡＭＰ法によるプロトテカ・ボビスＤＮＡの特異的検出を行う。抽出ＤＮＡは単離された菌株から抽出されたＤＮＡでも生乳から抽出されたＤＮＡでもよい。検出法は濁度や色の変化などで検出が可能であり、吸光度計などの検出機器や目視で検出が可能である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下に示す塩基配列のポリヌクレオチドをそれぞれに含むＬＡＭＰ法プライマーのセット。
ＰｂＦ３ｖ１ｂ：５'－ＧＧＡＴＣＧＣＧＣＧＡＣＴＣＣＴＣＴＣ－３’
ＰｂＢ３ｖ１ｂ:５’－ＧＴＧＣＧＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＧ－３’
ＰｂＦＩＰｖ１ｂ：５’－ＴＣＧＡＴＧＣＧＧＧＡＧＣＣＴＡＧＴＣＧＧＧＣＧＴＣＣＧＣＡＣＣＣＡＴＡＡＡＣＣ－３’
ＰｂＢＩＰｖ１ｂ：５’－ＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＧＣＣＣＧＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＧＡＡＧＣ－３’

【請求項2】

請求項１に記載のプライマーセットを内容に含むウシ乳房炎原因微生物の検出用キット。

【請求項3】

請求項１のプライマーセットまたは請求項２の検出用キットを用いて、ＬＡＭＰ法によりウシ乳房炎原因微生物を検出する方法。

【請求項4】

ウシ乳房炎原因微生物がプロトテカ・ボビス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｂｏｖｉｓ）である請求項３に記載の方法

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はウシ乳房炎の最も重要な病原藻類であるプロトテカ・ボビス（プロトテカ・ゾフィ ジェノタイプ２と同じ）をＬＡＭＰ法により検出するためのプライマーに関するものである。

【背景技術】

【0002】

プロトテカ・ボビス（プロトテカ・ゾフィ ジェノタイプ２と同じ）は藻類の一種である。藻類でありながら、葉緑体を欠いている。プロトテカ・ボビスはウシ乳房炎の最も重要な病原藻類である。世界中で見られる病原藻類であり、プロトテカ・ボビスが原因となるウシ乳房炎も世界中で見られる。

【0003】

プロトテカ・ボビス以外のプロトテカ・シフェリ、プロトテカ・ブラシュキアエは牛舎内環境の常在菌であるが、乳房炎との関連性が低いことが想定されている。

【0004】

プロトテカ・ボビスが起こす乳房炎は症状に乏しいことがあり、また通常の抗生物質が効果を示さず、難治性でもある。その検出やそれに基づく早期の摘発は他個体への影響を抑える意味でも重要である。

【0005】

検出の既存技術として主なものとして、次のものが挙げられる。通常の検査では培養法によって、プロトテカを検出している。ＰＣＲおよび続く塩基配列決定によって同定が行える。本発明と類似するキットとして海外メーカー製リアルタイムＰＣＲキットが商品化されている。また、プロトテカ・ゾフィのＬＡＭＰ増幅プライマーはＫａｗａｉらにより報告されている（特許文献１、非特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２０１５－１００２８２

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ（２０１７）７９：１９７３－１９７７．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、培養法のみではプロトテカ・ゾフィであるかどうかはわからない。

【0009】

またＰＣＲおよびそれに続く塩基配列決定法では塩基配列決定のための機器が必要であり、操作も非常に煩雑である。さらに、本発明と類似するリアルタイムＰＣＲキットは、高額な機器が必要となる。

【0010】

Ｋａｗａｉらの報告にあるプライマーの配列はほぼ全てのプロトテカ乳房炎原因菌であるプロトテカ・ボビス（プロトテカ・ゾフィ ジェノタイプ２）のみならず、環境中に見られるプロトテカ・シフェリ（プロトテカ・ゾフィ ジェノタイプ１）とも結合およびＬＡＭＰ増幅反応が生じると推定される。

【0011】

このように既存技術には、いずれも課題が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0012】

発明者はプロトテカ・ボビス検出用ＬＡＭＰプライマーを開発し、以下の本発明を完成させた。

【0013】

（１）以下に示す塩基配列のポリヌクレオチドをそれぞれに含むＬＡＭＰ法プライマーのセット。
ＰｂＦ３ｖ１ｂ：５’－ＧＧＡＴＣＧＣＧＣＧＡＣＴＣＣＴＣＴＣ－３’
ＰｂＢ３ｖ１ｂ：５’－ＧＴＧＣＧＧＧＡＣＡＣＴＧＡＧＧ－３’
ＰｂＦＩＰｖ１ｂ：５’－ＴＣＧＡＴＧＣＧＧＧＡＧＣＣＴＡＧＴＣＧＧＧＣＧＴＣＣＧＣＡＣＣＣＡＴＡＡＡＣＣ－３’
ＰｂＢＩＰｖ１ｂ：５’－ＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＧＣＣＣＧＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＧＡＡＧＣ－３’
（２）（１）に記載のプライマーセットを内容に含むウシ乳房炎原因微生物の検出用キット。
（３）（１）のプライマーセットまたは請求項２の検出用キットを用いて、ＬＡＭＰ法によりウシ乳房炎原因微生物を検出する方法。
（４）ウシ乳房炎原因微生物がプロトテカ・ボビス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｂｏｖｉｓ）である（３）に記載の方法

【発明の効果】

【0014】

本発明のプロトテカ・ボビス検出用ＬＡＭＰプライマーはＩｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ領域を標的として開発した。これはＫａｗａｉらの既報の領域とは異なる。また、特異的な配列を標的としている。プロトテカ・ボビスではＬＡＭＰ増幅反応が起こり、プロトテカ・シフェリではＬＡＭＰ増幅反応が起こらないことを確認した。

【0015】

本発明は菌体を熱処理して抽出する方法により得られたＤＮＡ検体でも実施可能である。また、生乳から抽出されたＤＮＡ検体でも実施可能である。

【0016】

本発明は生乳検体を用いた場合には培養を要せず、短時間で結果を得ることができる。

【0017】

検出感度を高める目的で、生乳に１００μｇ／ｍＬとなるようにクロラムフェニコールを添加して、３５℃で数時間から一晩静置して増菌させることもできる。

【0018】

ＬＡＭＰ増幅反応は等温増幅によるため、定温を維持できる低額な機器での実施が可能である。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】本発明のプライマーを用いた標的領域増幅の概要１（４本のプライマーにより標的領域が増幅される）

【図2】本発明のプライマーを用いた標的領域増幅の概要２（ダンベル構造を作りながら連続的に増幅する）

【図3】検出イメージ（目視）

【図4】検出イメージ（検出機器）

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明のプライマーを用いて、等温増幅によるＬＡＭＰ法により標的塩基配列を増幅し、その増幅を検出する方法を開示するものであり、以下にその方法を説明する。

【0021】

本発明ではＰｂＦ３ｖ１ｂ、ＰｂＢ３ｖ１ｂ、ＰｂＦＩＰｖ１ｂ、ＰｂＢＩＰｖ１ｂの4つのプライマーからなるセットを用いる。

【0022】

これらプライマーセットを抽出ＤＮＡ溶液とＬＡＭＰ法に利用できる反応溶液もしくはキットとともに用いて、チューブ内で増幅反応を行う。

【0023】

検出感度を高めるために別途ループプライマーを設計して、利用することも可能である。

【0024】

抽出ＤＮＡは単離された菌体や培養液中で培養された菌体を９５℃にて１０分間処理して抽出されたＤＮＡを使用可能である。

【0025】

ＰＵＲＥ ＤＮＡ抽出キット（栄研化学）を用いて、生乳から抽出したＤＮＡを用いることもできる。

【0026】

増菌のために一晩３５℃にて保温された生乳を利用することもできる。

【0027】

増幅反応はＬｏｏｐＡｍｐＥＸＩＡ等の等温増幅が可能な装置を用いて行う。

【0028】

ＰＣＲ装置や恒温槽などの定温で保温できる装置を利用することも可能である。

【0029】

増幅の有無は、ＬｏｏｐＡｍｐＥＸＩＡ等のリアルタイム濁度測定装置により判定することができる

【0030】

増幅の有無は、濁度や色の変化を目視や吸光度計で観察することによっても判定できる。

【実施例0031】

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【0032】

生乳より、ＰＵＲＥ ＤＮＡ抽出キット（栄研化学）を用いて、Ｉｔｏｈらの方法（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ（２０２０）８２：８７５－８８０）に従ってＤＮＡを抽出する。

【0033】

抽出したＤＮＡ溶液１μＬ、ＰｂＦ３ｖ１ｂ（配列番号１）とＰｂＢ３ｖ１ｂ（配列番号２）を５ｐｍｏｌ、ＰｂＦＩＰｖ１ｂ（配列番号３）とＰｂＢＩＰｖ１ｂ（配列番号４）を４０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰｓがそれぞれ１．４ｍＭ、Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１ＸＢｓｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒとなるように反応液に添加し、合計２５μＬとなるように超純水を加える。

【0034】

反応液を６３℃で６０分保持する。

【0035】

増幅の有無をＬｏｏｐＡｍｐＥＸＩＡ（栄研化学）もしくは目視で判定する。

【0036】

配列番号１ プライマーＰｂＦ３ｖ１ｂの塩基配列
配列番号２ プライマーＰｂＢ３ｖ１ｂの塩基配列
配列番号３ プライマーＰｂＦＩＰ３ｖ１ｂの塩基配列
配列番号４ プライマーＰｂＢＩＰ３ｖ１ｂの塩基配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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