特開2023-82328間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種の賦活化剤、培地、培養方法、ならびに凍結保存方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023082328
(43)【公開日】2023-06-14
(54)【発明の名称】間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種の賦活化剤、培地、培養方法、ならびに凍結保存方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/00 20060101AFI20230607BHJP
C12N 1/04 20060101ALI20230607BHJP
【ＦＩ】
C12N1/00 G
C12N1/04
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021196024
(22)【出願日】2021-12-02
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】遠山 絹華
(72)【発明者】
【氏名】田畑 泰彦
(72)【発明者】
【氏名】米田 圭三
(72)【発明者】
【氏名】山口 達哉
(72)【発明者】
【氏名】春日部 芳久
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BB12
4B065BC50
4B065BD09
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】 間葉系幹細胞や骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞を賦活化することができる賦活化剤や培地、培養方法、凍結保存方法を提供することである。
【解決手段】 間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種の賦活化剤は、スペルミジンおよびスペルミンの少なくとも一方、および／または、それらの少なくとも一方の塩を有効成分として含む。培地は、上記の賦活化剤を含有する。培養方法は、上記の培地で、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を培養することを含む。凍結保存方法は、上記の培地で、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を凍結保存することを含む。
【選択図】 図１
【解決手段】 間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種の賦活化剤は、スペルミジンおよびスペルミンの少なくとも一方、および／または、それらの少なくとも一方の塩を有効成分として含む。培地は、上記の賦活化剤を含有する。培養方法は、上記の培地で、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を培養することを含む。凍結保存方法は、上記の培地で、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を凍結保存することを含む。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
スペルミジンおよびスペルミンの少なくとも一方、および／または、それらの少なくとも一方の塩を有効成分として含む、
間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種の賦活化剤。
間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種の賦活化剤。
【請求項2】
培地添加用である、請求項１に記載の賦活化剤。
【請求項3】
請求項１または２に記載の賦活化剤を含有する培地。
【請求項4】
請求項３に記載の培地で、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を培養することを含む、培養方法。
【請求項5】
請求項３に記載の培地で、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を凍結保存することを含む、凍結保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種の賦活化剤と、培地と、培養方法と、凍結保存方法とに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、間葉系幹細胞や前骨芽細胞を用いた様々な研究開発、たとえば再生医療の研究開発が活発におこなわれている。間葉系幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞といった中胚葉に由来する組織を構成する細胞、すなわち中胚葉系細胞へ分化することができる。これに加えて、間葉系幹細胞は、外胚葉系細胞たる神経細胞や、内胚葉系細胞たる肝細胞などへも分化することもできる。間葉系幹細胞は、このような分化能を有するため、たとえば、細胞シートやオルガノイドの作製を含めた再生医療関連の研究開発に使用される。これに加えて、間葉系幹細胞は、脳機能障害や運動機能障害、自己免疫疾患の治療およびそれらの研究開発などにも使用される。いっぽう、前骨芽細胞は、骨芽細胞に分化することができる細胞である。このような分化能を前骨芽細胞が有するため、前骨芽細胞は、たとえば、骨再生医療の研究や、骨粗しょう症の研究、インプラント関連の研究などに使用される。また、前骨芽細胞は、これを神経細胞といった他の細胞に分化させる分化転換の研究にも利用されている。
【0003】
ところで、ポリアミンは、典型的には、第一級アミノ基を二つ以上もつ直鎖脂肪族炭化水素の総称である。ポリアミンは、さまざまな動物の組織に存在しており、ヒトには、たとえば、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンが存在する。
【0004】
ポリアミンは、生理的ｐＨでポリカチオンの状態をなす、すなわち正電荷をもつため、負電荷部をもつ核酸やタンパク質、リン脂質などと結合しやすく、生体内のさまざまな反応に関わると考えられている。たとえば、ポリアミンは、細胞の増殖や成長などに関わるタンパク質の翻訳制御において重要な役割を担うと考えられている。
【0005】
ポリアミンの細胞への作用に関して、特許文献１には、ポリアミンとしてプトレスシン、スペルミジン、またはスペルミンを添加した培地で、正常ヒト皮膚線維芽細胞やヒト毛乳頭細胞を培養することによって、これらの細胞を賦活化できたことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許５２１６２２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
特許文献１には、プトレスシン、スペルミジン、またはスペルミンで、正常ヒト皮膚線維芽細胞やヒト毛乳頭細胞を賦活化できたことが記載されているものの、これらとは分化の状態が異なる細胞、たとえば、間葉系幹細胞や前骨芽細胞をも賦活化できるかどうかまでは特許文献１から明らかではない。
【0008】
本発明は、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を賦活化することができる賦活化剤や培地、培養方法、凍結保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
この課題を解決するために本発明者は研究をすすめた結果、間葉系幹細胞において、賦活化の指標として設定した脱水素酵素活性をプトレスシンでは向上することが難しいものの、スペルミジンやスペルミンで脱水素酵素活性、具体的には、細胞一つあたりの脱水素酵素活性を向上できることを見出した。
【0010】
これに加えて、本発明者は、前骨芽細胞において、プトレスシンでは脱水素酵素活性を向上することが難しいものの、スペルミジンやスペルミンで脱水素酵素活性、具体的には、細胞一つあたりの脱水素酵素活性を向上できることも見出した。
【0011】
このような知見に基づき完成された本発明は、次の通りである。
項１
スペルミジンおよびスペルミンの少なくとも一方、および／または、それらの少なくとも一方の塩を有効成分として含む、
間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種の賦活化剤。
項２
培地添加用である、項１に記載の賦活化剤。
項３
項１または２に記載の賦活化剤を含有する培地。
項４
項３に記載の培地で、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を培養することを含む、培養方法。
項５
項３に記載の培地で、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を凍結保存することを含む、凍結保存方法。
項１
スペルミジンおよびスペルミンの少なくとも一方、および／または、それらの少なくとも一方の塩を有効成分として含む、
間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種の賦活化剤。
項２
培地添加用である、項１に記載の賦活化剤。
項３
項１または２に記載の賦活化剤を含有する培地。
項４
項３に記載の培地で、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を培養することを含む、培養方法。
項５
項３に記載の培地で、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を凍結保存することを含む、凍結保存方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を賦活化することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】マウス頭蓋冠由来骨芽細胞たるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１を用いた実施例１で測定した脱水素酵素活性を活性化率として示す図である。
【図2】ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１を用いた実施例２で測定した脱水素酵素活性を活性化率として示す図である。
【図3】ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１を用いた実施例３で測定した脱水素酵素活性を、細胞一つあたりの活性化率として示す図である。
【図4】ヒト脂肪由来間葉系幹細胞たるｈＡＤＳＣを用いた実施例４で測定した脱水素酵素活性を活性化率として示す図である。
【図5A】ｈＡＤＳＣを用いた実施例５で測定した脱水素酵素活性を活性化率として示す図である。
【図5B】ｈＡＤＳＣを用いた実施例５で測定した脱水素酵素活性を、細胞一つあたりの活性化率として示す図である。
【図6A】ｈＡＤＳＣを用いた実施例６で測定した脱水素酵素活性を活性化率として示す図である。
【図6B】ｈＡＤＳＣを用いた実施例６で測定した脱水素酵素活性を、細胞一つあたりの活性化率として示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【0015】
＜１．賦活化剤＞
本実施形態の賦活化剤は、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種の賦活化剤であり、スペルミジンおよびスペルミンの少なくとも一方、および／または、それらの少なくとも一方の塩を有効成分として含む。
本実施形態の賦活化剤は、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種の賦活化剤であり、スペルミジンおよびスペルミンの少なくとも一方、および／または、それらの少なくとも一方の塩を有効成分として含む。
【0016】
本明細書において、「賦活化」とは、細胞（具体的には、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種）の何らかの代謝活性の向上を意味する。「何らかの代謝活性」は、たとえば、脱水素酵素活性であり得る。具体的には、「何らかの代謝活性」は、細胞一つ当たりの脱水素酵素活性であり得る。これについて説明する。脱水素酵素は、細胞がエネルギーを獲得するうえで重要な酸化還元反応、たとえば、呼吸を構成する酸化還元反応に関わる。これによれば、細胞一つ当たりのエネルギー獲得能力は、細胞一つ当たりの脱水素酵素活性に反映されると考えることができる。したがって、「何らかの代謝活性」は、細胞一つ当たりの脱水素酵素活性であってもよい。
【0017】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、少なくとも、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞に分化することができる能力（すなわち分化能）を有する幹細胞であり得る。間葉系幹細胞は、これら以外の中胚葉系細胞、たとえば心筋細胞や腱細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞などに分化することができる能力（すなわち分化能）を有していてもよい。間葉系幹細胞は、中胚葉系細胞以外の細胞、たとえば、神経細胞や肝細胞などへの分化能を有していてもよい。なお、間葉系幹細胞は、典型的には、標準的な培養条件でプラスチックに接着性を有し得る。間葉系幹細胞は、たとえば、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現し得る。
【0018】
間葉系幹細胞は、たとえば、動物から取り出した細胞そのものであってもよく、動物から取り出した後に培養（たとえば初代培養や継代培養）を経た細胞（これは細胞株であり得る。）であってもよい。間葉系幹細胞は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などから分化誘導で作製された細胞であってもよい。
【0019】
間葉系幹細胞は、ヒト、チンパンジー、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタといった哺乳類、すなわち脊椎動物門の哺乳網に属する動物に由来してもよく、それ以外の動物に由来してもよい。つまり、間葉系幹細胞は哺乳類に由来してもよく、それ以外の動物に由来してもよい。なお、間葉系幹細胞は、上述の通り、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から分化誘導で作製された細胞であってもよいところ、本明細書では、間葉系幹細胞の元となるｉＰＳ細胞やＥＳ細胞が哺乳類に由来する場合、その間葉系幹細胞は哺乳類に由来することとされる。
【0020】
間葉系幹細胞が、動物から取り出した細胞そのもの、または、動物から取り出した後に培養を経た細胞である場合、間葉系幹細胞は、たとえば、脂肪組織、骨髄、歯髄、臍帯、胎盤羊膜、羊水に由来してもよい。なお、脂肪組織由来の間葉系幹細胞は、ヒトの脂肪吸引手術で吸引される脂肪から入手できる、つまり、比較的容易に入手できるため好ましい。
【0021】
前骨芽細胞（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）は、典型的には、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化の過程で生じる細胞である。この分化において、間葉系幹細胞は、典型的には、骨前駆細胞（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、前骨芽細胞（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の順に分化していく。そして、成熟した骨芽細胞が、最終的に骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）へと変化することができる。
【0022】
骨前駆細胞や、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞は、たとえば、動物から取り出した細胞そのものであってもよく、動物から取り出した後に培養（たとえば初代培養や継代培養）を経た細胞（これは細胞株であり得る。）であってもよい。前骨芽細胞は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などから分化誘導で作製された細胞であってもよい。
【0023】
これらの細胞（具体的には、骨前駆細胞や、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞）は、ヒト、チンパンジー、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタといった哺乳類、すなわち脊椎動物門の哺乳網に属する動物に由来してもよく、それ以外の動物に由来してもよい。つまり、これらの細胞は哺乳類に由来してもよく、それ以外の動物に由来してもよい。なお、これらの細胞は、上述の通り、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から分化誘導で作製された細胞であってもよいところ、本明細書では、これらの細胞の元となるｉＰＳ細胞やＥＳ細胞が哺乳類に由来する場合、それらの細胞は哺乳類に由来することとされる。
【0024】
これらの細胞（具体的には、骨前駆細胞や、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞）が、動物から取り出した細胞そのもの、または、動物から取り出した後に培養を経た細胞である場合、これらの細胞は、たとえば、頭蓋冠に由来してもよい。とりわけ、前骨芽細胞（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）は、頭蓋冠に由来してもよい。
【0025】
これらの細胞（具体的には、骨前駆細胞や、前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞）のなかでは、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞が好ましく、骨前駆細胞、前骨芽細胞がより好ましい。前骨芽細胞が好ましい理由は、後述の実施例で、前骨芽細胞の賦活化が実証されているためである。骨前駆細胞が好ましい理由は、後述の実施例で賦活化が実証されている間葉系幹細胞から、賦活化が実証されている前骨芽細胞までの分化の過程に骨前駆細胞があるので、骨前駆細胞の賦活化も十分になし得ると考えられるためである。なかでも、後述の実施例で、前骨芽細胞の賦活化が実証されていることから、前骨芽細胞がさらに好ましい。
【0026】
本実施形態の賦活化剤は、スペルミジンおよびスペルミンの少なくとも一方、および／または、それらの少なくとも一方の塩を有効成分として含む。このため、細胞の代謝活性、たとえば、脱水素酵素活性を向上することができる。より具体的には、細胞一つ当たりの脱水素酵素活性を向上することができる。なかでも、本実施形態の賦活化剤は、スペルミジンおよびスペルミンの少なくとも一方を含むことが好ましい。
【0027】
スペルミジンは、代表的なポリアミンの一つであり、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２で表される構造を有する化合物である。スペルミジンは、たとえば、化学合成されてもよく、生体（たとえば植物）から抽出されてもよい。ケミカリーディファインドな賦活化剤を得やすいことから、化学合成されたスペルミジンが好ましい。すなわち、スペルミジンは、植物由来よりも、化学合成品が好ましい。つまり、スペルミジンは、植物由来でないことが好ましい。なお、スペルミジンは、単純な構造を有するため、比較的安価に化学合成品を入手し得る。
【0028】
スペルミンも、代表的なポリアミンの一つであり、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２で表される構造を有する化合物である。スペルミンは、たとえば、化学合成されてもよく、生体（たとえば植物）から抽出されてもよい。ケミカリーディファインドな賦活化剤を得やすいことから、化学合成されたスペルミンが好ましい。すなわち、スペルミンは、植物由来よりも、化学合成品が好ましい。つまり、スペルミンは、植物由来でないことが好ましい。なお、スペルミンは、単純な構造を有するため、比較的安価に化学合成品を入手し得る。
【0029】
本実施形態の賦活化剤は、スペルミジンおよびスペルミン以外のポリアミンを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。そのようなポリアミンとして、たとえば、プトレスシンを挙げることができる。なお、本実施形態の賦活化剤は、プトレスシンを含まないことが好ましい。
【0030】
本実施形態の賦活化剤が含有するポリアミン１００質量％中、スペルミジンおよびスペルミンの合計含有量は、たとえば５０質量％以上が好ましく、６０質量％以上がより好ましく、７０質量％以上がさらに好ましく、８０質量％以上がさらに好ましく、９０質量％以上がさらに好ましく、９５質量％以上がさらに好ましく、９８質量％以上がさらに好ましく、１００質量％がさらに好ましい。スペルミジンの含有量の好適範囲や、スペルミンの含有量の好適範囲も同様である。すなわち、スペルミジンおよびスペルミンの合計含有量の説明を、スペルミジンの含有量やスペルミンの含有量の説明としても扱うことができる。
【0031】
本実施形態の賦活化剤は、上述の成分に加えて、一種または二種以上の他の成分をさらに含んでいてもよい。他の成分として、たとえば、賦形剤、担体、希釈剤などを挙げることができる。他の成分として、スペルミジンの塩およびスペルミンの塩以外のポリアミンの塩を挙げることもできる。
【0032】
本実施形態の賦活化剤１００質量％中、スペルミジンおよびスペルミンの合計含有量は、たとえば１０質量％以上が好ましく、２０質量％以上がより好ましく、３０質量％以上がさらに好ましく、４０質量％以上がさらに好ましく、５０質量％以上がさらに好ましく、６０質量％以上がさらに好ましく、７０質量％以上がさらに好ましく、８０質量％以上がさらに好ましく、９０質量％以上がさらに好ましく、９５質量％以上がさらに好ましく、９８質量％以上がさらに好ましく、１００質量％がさらに好ましい。スペルミジンの含有量の好適範囲や、スペルミンの含有量の好適範囲も同様である。すなわち、スペルミジンおよびスペルミンの合計含有量の説明を、スペルミジンの含有量やスペルミンの含有量の説明としても扱うことができる。
【0033】
本実施形態の賦活化剤は、上述の細胞（具体的には、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種）に使用する限り、その使用方法は特に限定されない。本実施形態の賦活化剤は、たとえば、上述の細胞を培養する際に、これらを培養するための培地に添加する、という方法で使用されることができる。これに加えて、本実施形態の賦活化剤は、たとえば、上述の細胞を凍結保存する際に、これらを凍結保存するための培地に添加する、という方法で使用されることができる。このように、本実施形態の賦活化剤は、培地（たとえば培養用の培地や、凍結保存用の培地）添加用の賦活化剤、すなわち培地添加剤であることができる。
【0034】
＜２．培地＞
本実施形態の培地は、上述の賦活化剤を含有する。すなわち、本実施形態の培地は、上述の賦活化剤が添加された培地である。
本実施形態の培地は、上述の賦活化剤を含有する。すなわち、本実施形態の培地は、上述の賦活化剤が添加された培地である。
【0035】
本実施形態の培地は、上述の細胞（具体的には、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種）を培養するための培地であってもよく、凍結保存するための培地、すなわち凍結保存液であってもよい。
【0036】
本実施形態の培地が、上述の細胞（具体的には、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種）を培養するための培地である場合、賦活化剤が添加される培地として、たとえば、Ａｌｐｈａ－ＭＥＭ、Ｄ－ＭＥＭ（たとえば、Ｐｏｗｅｒｅｄｂｙ１０（株式会社グライコテクニカ））、Ｐｌｕｓｏｉｄ－Ｍ（株式会社グライコテクニカ）、Ｇ０３１１０１（株式会社グライコテクニカ）、Ｍ０６１１０１（株式会社グライコテクニカ）などを挙げることができる。培地には、必要に応じて、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）や抗生物質、細胞増殖因子などを添加してもよい。
【0037】
本実施形態の培地が、上述の細胞（具体的には、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種）を凍結保存するための培地、すなわち凍結保存液である場合、凍結保護剤を含有することができる。凍結保護剤として、たとえば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールを挙げることができる。本実施形態の培地が凍結保存液である場合、必要に応じて、ウシ胎児血清などを含有していてもよい。
【0038】
なお、本実施形態の培地が、培養用の培地である場合でも、凍結保存用の培地（すなわち凍結保存液）である場合でも、ケミカリーディファインドという観点を踏まえるとウシ胎児血清を含有しないことが好ましい。
【0039】
培地中のスペルミジンおよびスペルミンの合計濃度は、０．１μＭ以上が好ましく、０．５μＭ以上がより好ましく、１．０μＭ以上がさらに好ましく、５．０μＭ以上がさらに好ましく、１０μＭ以上がさらに好ましい。合計濃度は、２０μＭ以上であってもよく、５０μＭ以上であってもよく、１００μＭ以上であってもよい。いっぽう、培地中のスペルミジンおよびスペルミンの合計濃度は、５０００μＭ以下が好ましく、３０００μＭ以下がより好ましく、１５００μＭ以下がさらに好ましく、１０００μＭ以下がさらに好ましく、８００μＭ以下がさらに好ましく、５００μＭ以下がさらに好ましい。合計濃度は、３００μＭ以下であってもよく、２００μＭ以下であってもよい。スペルミジンの濃度の好適範囲や、スペルミンの濃度の好適範囲も同様である。すなわち、スペルミジンおよびスペルミンの合計濃度の説明を、スペルミジンの濃度やスペルミンの濃度の説明としても扱うことができる。
【0040】
＜３．培養方法および凍結保存方法＞
本実施形態の培養方法は、上述の培地で、上述の細胞（具体的には、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種）を培養することを含む。たとえば、上述の培地で、上述の細胞を含む懸濁液を調製したうえで、その懸濁液を、細胞培養フラスコや細胞培養ディッシュなどの培養容器に入れ、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下でインキュベートすることができる。必要に応じて、上述の培地を用いて継代培養をおこなうことができる。なお、上述の細胞を培養する際に、これら以外の細胞が、培養対象の細胞集団に含まれていてもよい。
本実施形態の培養方法は、上述の培地で、上述の細胞（具体的には、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種）を培養することを含む。たとえば、上述の培地で、上述の細胞を含む懸濁液を調製したうえで、その懸濁液を、細胞培養フラスコや細胞培養ディッシュなどの培養容器に入れ、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下でインキュベートすることができる。必要に応じて、上述の培地を用いて継代培養をおこなうことができる。なお、上述の細胞を培養する際に、これら以外の細胞が、培養対象の細胞集団に含まれていてもよい。
【0041】
上述の細胞（具体的には、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種）を培養する際、スペルミジンおよびスペルミンの合計終濃度は、０．１μＭ以上が好ましく、０．５μＭ以上がより好ましく、１．０μＭ以上がさらに好ましく、５．０μＭ以上がさらに好ましく、１０μＭ以上がさらに好ましい。合計終濃度は、２０μＭ以上であってもよく、５０μＭ以上であってもよく、１００μＭ以上であってもよい。いっぽう、スペルミジンおよびスペルミンの合計終濃度は、５０００μＭ以下が好ましく、３０００μＭ以下がより好ましく、１５００μＭ以下がさらに好ましく、１０００μＭ以下がさらに好ましく、８００μＭ以下がさらに好ましく、５００μＭ以下がさらに好ましい。合計終濃度は、３００μＭ以下であってもよく、２００μＭ以下であってもよい。ここで、「合計終濃度」とは、スペルミジンの終濃度とスペルミンの終濃度との合計を指す。スペルミジンの終濃度の好適範囲や、スペルミンの終濃度の好適範囲も同様である。すなわち、スペルミジンおよびスペルミンの合計終濃度の説明を、スペルミジンの終濃度やスペルミンの終濃度の説明としても扱うことができる。
【0042】
本実施形態の凍結保存方法は、上述の培地で、上述の細胞（具体的には、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種）を凍結保存することを含む。たとえば、上述の培地で、上述の細胞を含む懸濁液を調製したうえで、その懸濁液を、チューブやバイアルなどの凍結保存容器に入れ、これを凍結したうえで保存することができる。この際、たとえば、ディープフリーザーで凍結したうえで、液体窒素下で保存してもよい。なお、上述の細胞を凍結保存する際に、これら以外の細胞が、凍結保存対象の細胞集団に含まれていてもよい。
【0043】
上述の細胞（具体的には、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種）を凍結保存する際の合計終濃度（すなわち、スペルミジンおよびスペルミンの合計終濃度）の説明は、これらを培養する際の合計終濃度の説明と重複するため省略する。よって、これらを培養する際の合計終濃度の説明を、これらを凍結保存する際の合計終濃度の説明としても扱うことができる。
【実施例0044】
以下、本発明を実施例でさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【0045】
＜実施例１＞
＜１．１．使用した細胞や試薬など＞
細胞：マウス頭蓋冠由来骨芽細胞 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１（１０ｃｍディッシュ、６０％コンフル）
培地：ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ （１ｘ） （ｇｉｂｃｏ）（断り書きがない限り、１０％ＦＣＳ、および１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（以下、「Ｐ－Ｓ」と言う。）含有）
細胞賦活化測定試薬：生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
＜１．１．使用した細胞や試薬など＞
細胞：マウス頭蓋冠由来骨芽細胞 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１（１０ｃｍディッシュ、６０％コンフル）
培地：ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ （１ｘ） （ｇｉｂｃｏ）（断り書きがない限り、１０％ＦＣＳ、および１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（以下、「Ｐ－Ｓ」と言う。）含有）
細胞賦活化測定試薬：生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
【0046】
＜１．２．前培養＞
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の培養上清をアスピレート除去してＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ添加して３７℃で３～５分間インキュベートした。培地を等量添加したのち細胞を５０ｍＬ遠心チューブへ合一し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地適量で懸濁し、細胞計数を行った。細胞計数結果をもとに、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地で４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製し、４８ウェルプレートへ２５０μＬずつ播種（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で一晩培養した。
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の培養上清をアスピレート除去してＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ添加して３７℃で３～５分間インキュベートした。培地を等量添加したのち細胞を５０ｍＬ遠心チューブへ合一し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地適量で懸濁し、細胞計数を行った。細胞計数結果をもとに、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地で４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製し、４８ウェルプレートへ２５０μＬずつ播種（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で一晩培養した。
【0047】
＜１．３．試料添加および培養＞
１．２で用意した細胞培養液中へ、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンをそれぞれ単独で終濃度１μＭ～１０００μＭとなるように添加（各条件ｎ＝２）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で３日間培養した。ポリアミンを何も添加しない条件をコントロールとした。すなわち、プトレスシンもスペルミジンもスペルミンも添加しない条件をコントロールとした。
１．２で用意した細胞培養液中へ、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンをそれぞれ単独で終濃度１μＭ～１０００μＭとなるように添加（各条件ｎ＝２）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で３日間培養した。ポリアミンを何も添加しない条件をコントロールとした。すなわち、プトレスシンもスペルミジンもスペルミンも添加しない条件をコントロールとした。
【0048】
＜１．４．脱水素酵素の活性測定＞
３日間培養したプレートを取り出して顕微鏡観察したのち、空ウェル３ウェルへ、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地を２５０μＬずつ添加した（Ｂｌａｎｋ）。各ウェルへ生細胞数測定試薬ＳＦを２０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２時間インキュベート後、４５０ｎｍと６００ｎｍとの吸光度を測定した。
３日間培養したプレートを取り出して顕微鏡観察したのち、空ウェル３ウェルへ、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地を２５０μＬずつ添加した（Ｂｌａｎｋ）。各ウェルへ生細胞数測定試薬ＳＦを２０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２時間インキュベート後、４５０ｎｍと６００ｎｍとの吸光度を測定した。
【0049】
＜１．５．データの整理＿活性化率の算出＞
細胞賦活化作用、すなわち活性化率を以下の式で算出した。
活性化率＝（Ａｓ－Ａｂ）／（Ａｃ－Ａｂ）×１００
この式において、Ａｂ、Ａｃ、およびＡｓは、次を表す。
Ａｂ： Ｂｌａｎｋの吸光度差（すなわちＡｂｓ４５０－Ａｂｓ６００）
Ａｃ： コントロールの吸光度差
Ａｓ： 各種サンプルの吸光度差
ここで、「吸光度差」は、波長４５０ｎｍの吸光度と波長６００ｎｍの吸光度との差（すなわち、波長４５０ｎｍの吸光度－波長６００ｎｍの吸光度）を意味する。
コントロールの活性化率を１００％として、ポリアミン添加条件の活性化率を図１に示す。
細胞賦活化作用、すなわち活性化率を以下の式で算出した。
活性化率＝（Ａｓ－Ａｂ）／（Ａｃ－Ａｂ）×１００
この式において、Ａｂ、Ａｃ、およびＡｓは、次を表す。
Ａｂ： Ｂｌａｎｋの吸光度差（すなわちＡｂｓ４５０－Ａｂｓ６００）
Ａｃ： コントロールの吸光度差
Ａｓ： 各種サンプルの吸光度差
ここで、「吸光度差」は、波長４５０ｎｍの吸光度と波長６００ｎｍの吸光度との差（すなわち、波長４５０ｎｍの吸光度－波長６００ｎｍの吸光度）を意味する。
コントロールの活性化率を１００％として、ポリアミン添加条件の活性化率を図１に示す。
【0050】
＜１．６．コメント＞
図１に示すように、プトレスシンでは、前骨芽細胞たるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の脱水素酵素活性を向上できなかったのに対して、スペルミジンやスペルミンでは脱水素酵素活性を向上することができた。
図１に示すように、プトレスシンでは、前骨芽細胞たるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の脱水素酵素活性を向上できなかったのに対して、スペルミジンやスペルミンでは脱水素酵素活性を向上することができた。
【0051】
＜実施例２＞
＜２．１．使用した細胞や試薬など＞
細胞：マウス頭蓋冠由来骨芽細胞 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１（１０ｃｍディッシュ、７０％コンフル）
培地：ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ （１ｘ）（ｇｉｂｃｏ）（断り書きがない限り、１０％ＦＣＳ、および１％Ｐ－Ｓ含有）
細胞賦活化測定試薬：生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
＜２．１．使用した細胞や試薬など＞
細胞：マウス頭蓋冠由来骨芽細胞 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１（１０ｃｍディッシュ、７０％コンフル）
培地：ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ （１ｘ）（ｇｉｂｃｏ）（断り書きがない限り、１０％ＦＣＳ、および１％Ｐ－Ｓ含有）
細胞賦活化測定試薬：生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
【0052】
＜２．２．前培養＞
１０ｃｍディッシュで６０～７０％コンフルエントまで培養したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の培養上清をアスピレート除去してＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ添加して３７℃で３～５分間インキュベートした。培地を等量添加したのち細胞を５０ｍＬ遠心チューブへ合一し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、培地適量で懸濁し、細胞計数を行った。細胞計数結果をもとに、培地で８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製し、４８ウェルプレートへ２５０μＬずつ播種（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で一晩培養した。
１０ｃｍディッシュで６０～７０％コンフルエントまで培養したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の培養上清をアスピレート除去してＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ添加して３７℃で３～５分間インキュベートした。培地を等量添加したのち細胞を５０ｍＬ遠心チューブへ合一し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、培地適量で懸濁し、細胞計数を行った。細胞計数結果をもとに、培地で８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製し、４８ウェルプレートへ２５０μＬずつ播種（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で一晩培養した。
【0053】
＜２．３．試料添加および培養＞
２．２．で前培養したプレートをＣＯ２インキュベーターから取り出し、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地で置換した。そこへ、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンをそれぞれ単独で終濃度１０μＭおよび１００μＭとなるように添加（各条件ｎ＝３）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２日間培養した。ポリアミンを何も添加しない条件をコントロールとした。すなわち、プトレスシンもスペルミジンもスペルミンも添加しない条件をコントロールとした。
２．２．で前培養したプレートをＣＯ２インキュベーターから取り出し、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地で置換した。そこへ、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンをそれぞれ単独で終濃度１０μＭおよび１００μＭとなるように添加（各条件ｎ＝３）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２日間培養した。ポリアミンを何も添加しない条件をコントロールとした。すなわち、プトレスシンもスペルミジンもスペルミンも添加しない条件をコントロールとした。
【0054】
＜２．４．脱水素酵素の活性測定＞
２日間培養したプレートを取り出して顕微鏡観察したのち、空ウェル３ウェルへ、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地を２５０μＬずつ添加した（Ｂｌａｎｋ）。各ウェルへ生細胞数測定試薬ＳＦを２０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２時間インキュベート後、４５０ｎｍと６００ｎｍとの吸光度を測定した。
２日間培養したプレートを取り出して顕微鏡観察したのち、空ウェル３ウェルへ、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地を２５０μＬずつ添加した（Ｂｌａｎｋ）。各ウェルへ生細胞数測定試薬ＳＦを２０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２時間インキュベート後、４５０ｎｍと６００ｎｍとの吸光度を測定した。
【0055】
＜２．５．データの整理＿活性化率の算出＞
細胞賦活化作用、すなわち活性化率を実施例１に記載の方法（すなわち、１．５．に記載の方法）で算出した。コントロールの活性化率を１００％として、ポリアミン添加条件の活性化率を図２に示す。
細胞賦活化作用、すなわち活性化率を実施例１に記載の方法（すなわち、１．５．に記載の方法）で算出した。コントロールの活性化率を１００％として、ポリアミン添加条件の活性化率を図２に示す。
【0056】
＜２．６．コメント＞
図２に示すように、プトレスシンでは、前骨芽細胞たるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の脱水素酵素活性を向上できなかったのに対して、スペルミジンやスペルミンでは脱水素酵素活性を向上することができた。
図２に示すように、プトレスシンでは、前骨芽細胞たるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の脱水素酵素活性を向上できなかったのに対して、スペルミジンやスペルミンでは脱水素酵素活性を向上することができた。
【0057】
＜実施例３＞
スペルミジン添加やスペルミン添加による脱水素酵素活性の増加が、細胞一つ当たりの脱水素酵素活性の増加であることを厳密に評価するために、実施例３では、脱水素酵素の活性測定だけでなく、細胞数を求めるためのＤＮＡアッセイも行い、それらの結果から細胞一つ当たりの脱水素酵素活性を求めた。
＜３．１．使用した細胞や試薬など＞
細胞：マウス頭蓋冠由来骨芽細胞 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１（１０ｃｍディッシュ、７０％コンフル）
培地：ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ （１ｘ）（ｇｉｂｃｏ）（断り書きがない限り、１０％ＦＣＳ、および１％Ｐ－Ｓ含有）
細胞賦活化測定試薬：生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
スペルミジン添加やスペルミン添加による脱水素酵素活性の増加が、細胞一つ当たりの脱水素酵素活性の増加であることを厳密に評価するために、実施例３では、脱水素酵素の活性測定だけでなく、細胞数を求めるためのＤＮＡアッセイも行い、それらの結果から細胞一つ当たりの脱水素酵素活性を求めた。
＜３．１．使用した細胞や試薬など＞
細胞：マウス頭蓋冠由来骨芽細胞 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１（１０ｃｍディッシュ、７０％コンフル）
培地：ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ （１ｘ）（ｇｉｂｃｏ）（断り書きがない限り、１０％ＦＣＳ、および１％Ｐ－Ｓ含有）
細胞賦活化測定試薬：生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
【0058】
＜３．２．前培養＞
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の培養上清をアスピレート除去してＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ添加して３７℃で３～５分間インキュベートした。培地を等量添加したのち細胞を５０ｍＬ遠心チューブへ合一し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、培地適量で懸濁し、細胞計数を行った。細胞計数結果をもとに培地で８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製し、４８ウェルプレートへ２５０μＬずつ播種（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で一晩培養した。
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の培養上清をアスピレート除去してＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ添加して３７℃で３～５分間インキュベートした。培地を等量添加したのち細胞を５０ｍＬ遠心チューブへ合一し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、培地適量で懸濁し、細胞計数を行った。細胞計数結果をもとに培地で８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製し、４８ウェルプレートへ２５０μＬずつ播種（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で一晩培養した。
【0059】
＜３．３．試料添加および培養＞
３．２．で前培養したプレートをＣＯ２インキュベーターから取り出し、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地で置換した。そこへ、スペルミジン、スペルミンをそれぞれ単独で終濃度１μＭ、１０μＭおよび１００μＭとなるように添加（各条件ｎ＝２）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２日間培養した。ポリアミンを何も添加しない条件をコントロールとした。すなわち、スペルミジンもスペルミンも添加しない条件をコントロールとした。また、アスコルビン酸を終濃度１μＭ、１０μＭ、１００μＭおよび１０００μＭとなるように添加した条件をポジティブコントロールとした。
３．２．で前培養したプレートをＣＯ２インキュベーターから取り出し、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地で置換した。そこへ、スペルミジン、スペルミンをそれぞれ単独で終濃度１μＭ、１０μＭおよび１００μＭとなるように添加（各条件ｎ＝２）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２日間培養した。ポリアミンを何も添加しない条件をコントロールとした。すなわち、スペルミジンもスペルミンも添加しない条件をコントロールとした。また、アスコルビン酸を終濃度１μＭ、１０μＭ、１００μＭおよび１０００μＭとなるように添加した条件をポジティブコントロールとした。
【0060】
＜３．４．脱水素酵素の活性測定＞
２日間培養したプレートを取り出して顕微鏡観察したのち、空ウェル３ウェルへ、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地を２５０μＬずつ添加した（Ｂｌａｎｋ）。各ウェルへ生細胞数測定試薬ＳＦを２０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２時間インキュベート後、４５０ｎｍと６００ｎｍとの吸光度を測定した。
なお、吸光度の測定後、上清除去し、各ウェル中の細胞数をＤＮＡアッセイにより見積もった（下記３．５．参照）。
２日間培養したプレートを取り出して顕微鏡観察したのち、空ウェル３ウェルへ、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地を２５０μＬずつ添加した（Ｂｌａｎｋ）。各ウェルへ生細胞数測定試薬ＳＦを２０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２時間インキュベート後、４５０ｎｍと６００ｎｍとの吸光度を測定した。
なお、吸光度の測定後、上清除去し、各ウェル中の細胞数をＤＮＡアッセイにより見積もった（下記３．５．参照）。
【0061】
＜３．５．ＤＮＡアッセイ＞
（ａ）各種溶液調製
２０×ＳＳＣ：塩化ナトリウム１８ｇ、クエン酸三ナトリウム二水和物８．８ｇ／ＭｉｌｌｉＱ１００ｍＬ（２０×ＳＳＣをＭｉｌｌｉＱで希釈することによって１×ＳＳＣを調製した）
２ｍＭ ＳＤＳ：（ドデシル硫酸ナトリウム５７．６ｍｇ）／（１×ＳＳＣ １００ｍＬ）
ヘキスト溶液：（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）（ナカライテスク株式会社製）５μＬ）／（１×ＳＳＣ ４ｍＬ）
（ｂ）検量線用の細胞の準備
１×１０６ｃｅｌｌｓの細胞懸濁液を調製後、遠心（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清を除去し、２ｍＭ ＳＤＳを１ｍＬ添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後遠心（１０，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して上清を採取し、検量線用の細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）とした。これを－２０℃で冷凍保存した。使用時は２ｍＭ ＳＤＳで希釈して希釈系列を作成した。
（ｃ）測定サンプルの準備
３．４．で上清を除去したプレート中の細胞を、ＰＢＳ３００μＬ／ｗｅｌｌで細胞をはがさないようにやさしく１回洗浄し、２ｍＭ ＳＤＳを２００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。
（ｄ）測定
９６穴ブラックプレート中に希釈系列またはサンプルを４０μＬ／ｗｅｌｌで添加したのち、ヘキスト溶液１６０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、励起光３５５ｎｍ、蛍光４６０ｎｍの蛍光スペクトルを測定した。希釈系列により縦軸：蛍光スペクトル測定値、横軸：細胞密度にとった直線の検量線を得た。検量線をもとに各ウェル中の細胞密度を算出した。測定の際、プレートとプレートリーダーは以下を使用した。
プレート：Ａｓｓａｙ Ｐｌａｔｅ ９６ Ｗｅｌｌ Ｎｏ Ｌｉｄ Ｂｌａｃｋ ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ（Ｃｏｓｔａｒ）
プレートリーダー：ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）
（ａ）各種溶液調製
２０×ＳＳＣ：塩化ナトリウム１８ｇ、クエン酸三ナトリウム二水和物８．８ｇ／ＭｉｌｌｉＱ１００ｍＬ（２０×ＳＳＣをＭｉｌｌｉＱで希釈することによって１×ＳＳＣを調製した）
２ｍＭ ＳＤＳ：（ドデシル硫酸ナトリウム５７．６ｍｇ）／（１×ＳＳＣ １００ｍＬ）
ヘキスト溶液：（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）（ナカライテスク株式会社製）５μＬ）／（１×ＳＳＣ ４ｍＬ）
（ｂ）検量線用の細胞の準備
１×１０６ｃｅｌｌｓの細胞懸濁液を調製後、遠心（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）して上清を除去し、２ｍＭ ＳＤＳを１ｍＬ添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後遠心（１０，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して上清を採取し、検量線用の細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）とした。これを－２０℃で冷凍保存した。使用時は２ｍＭ ＳＤＳで希釈して希釈系列を作成した。
（ｃ）測定サンプルの準備
３．４．で上清を除去したプレート中の細胞を、ＰＢＳ３００μＬ／ｗｅｌｌで細胞をはがさないようにやさしく１回洗浄し、２ｍＭ ＳＤＳを２００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。
（ｄ）測定
９６穴ブラックプレート中に希釈系列またはサンプルを４０μＬ／ｗｅｌｌで添加したのち、ヘキスト溶液１６０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、励起光３５５ｎｍ、蛍光４６０ｎｍの蛍光スペクトルを測定した。希釈系列により縦軸：蛍光スペクトル測定値、横軸：細胞密度にとった直線の検量線を得た。検量線をもとに各ウェル中の細胞密度を算出した。測定の際、プレートとプレートリーダーは以下を使用した。
プレート：Ａｓｓａｙ Ｐｌａｔｅ ９６ Ｗｅｌｌ Ｎｏ Ｌｉｄ Ｂｌａｃｋ ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ（Ｃｏｓｔａｒ）
プレートリーダー：ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）
【0062】
＜３．６．データの整理＿細胞一つあたりの活性化率の算出＞
まず、細胞賦活化作用、すなわち活性化率を実施例１に記載の方法（すなわち、１．５．に記載の方法）で算出した。次いで、３．５．より算出した細胞数で活性化率を割り、細胞一つあたりの活性化率を求めた。なお、この活性化率（すなわち、細胞一つあたりの活性化率）は、ミトコンドリア活性を反映すると考えられるため、以下では、この活性化率をミトコンドリア活性と呼ぶことがある。コントロールの活性化率（すなわち、細胞一つあたりの活性化率）を１００とした指数で、ポリアミン添加条件の活性化率やアスコルビン酸添加条件の活性化率を図３に示す。なお、指数が大きい程、細胞一つあたりの活性化率が高い。
まず、細胞賦活化作用、すなわち活性化率を実施例１に記載の方法（すなわち、１．５．に記載の方法）で算出した。次いで、３．５．より算出した細胞数で活性化率を割り、細胞一つあたりの活性化率を求めた。なお、この活性化率（すなわち、細胞一つあたりの活性化率）は、ミトコンドリア活性を反映すると考えられるため、以下では、この活性化率をミトコンドリア活性と呼ぶことがある。コントロールの活性化率（すなわち、細胞一つあたりの活性化率）を１００とした指数で、ポリアミン添加条件の活性化率やアスコルビン酸添加条件の活性化率を図３に示す。なお、指数が大きい程、細胞一つあたりの活性化率が高い。
【0063】
＜３．７．コメント＞
図３に示すように、スペルミジンやスペルミンで、細胞一つあたりの脱水素酵素活性（すなわちミトコンドリア活性）を向上することができた。また、スペルミジンやスペルミンによって、アスコルビン酸よりも、細胞一つあたりの脱水素酵素活性（すなわちミトコンドリア活性）を向上することができた。
図３に示すように、スペルミジンやスペルミンで、細胞一つあたりの脱水素酵素活性（すなわちミトコンドリア活性）を向上することができた。また、スペルミジンやスペルミンによって、アスコルビン酸よりも、細胞一つあたりの脱水素酵素活性（すなわちミトコンドリア活性）を向上することができた。
【0064】
＜実施例４＞
＜４．１．使用した細胞や試薬など＞
細胞：ヒト脂肪由来間葉系幹細胞 ｈＡＤＳＣ（継代数：Ｐ１３、１０ｃｍディッシュ、７０％コンフル）
培地：ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ （１ｘ）（ｇｉｂｃｏ）（断り書きがない限り、１０％ＦＣＳ、および１％Ｐ－Ｓ含有）
細胞賦活化測定試薬：生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
＜４．１．使用した細胞や試薬など＞
細胞：ヒト脂肪由来間葉系幹細胞 ｈＡＤＳＣ（継代数：Ｐ１３、１０ｃｍディッシュ、７０％コンフル）
培地：ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ （１ｘ）（ｇｉｂｃｏ）（断り書きがない限り、１０％ＦＣＳ、および１％Ｐ－Ｓ含有）
細胞賦活化測定試薬：生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
【0065】
＜４．２．前培養＞
ｈＡＤＳＣの培養上清をアスピレート除去してＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ添加して細胞をディッシュ底面からはがした。培地を等量添加したのち細胞を５０ｍＬ遠心チューブへ合一し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地適量で懸濁し、細胞計数を行った。細胞計数結果をもとに、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地で４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製し、４８ウェルプレートへ２５０μＬずつ播種（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で一晩培養した。
ｈＡＤＳＣの培養上清をアスピレート除去してＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ添加して細胞をディッシュ底面からはがした。培地を等量添加したのち細胞を５０ｍＬ遠心チューブへ合一し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地適量で懸濁し、細胞計数を行った。細胞計数結果をもとに、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地で４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製し、４８ウェルプレートへ２５０μＬずつ播種（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で一晩培養した。
【0066】
＜４．３．試料添加および培養＞
４．２．で前培養したプレートをＣＯ２インキュベーターから取り出し、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンをそれぞれ単独で終濃度１０μＭおよび１００μＭとなるように添加（各条件ｎ＝４）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で７日間培養した。ポリアミンを何も添加しない条件をコントロールとした。すなわち、プトレスシンもスペルミジンもスペルミンも添加しない条件をコントロールとした。
４．２．で前培養したプレートをＣＯ２インキュベーターから取り出し、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンをそれぞれ単独で終濃度１０μＭおよび１００μＭとなるように添加（各条件ｎ＝４）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で７日間培養した。ポリアミンを何も添加しない条件をコントロールとした。すなわち、プトレスシンもスペルミジンもスペルミンも添加しない条件をコントロールとした。
【0067】
＜４．４．脱水素酵素の活性測定＞
７日間培養したプレートを取り出して顕微鏡観察したのち、空ウェル３ウェルへ、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地を２５０μＬずつ添加した（Ｂｌａｎｋ）。各ウェルへ生細胞数測定試薬ＳＦを２０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で３時間インキュベート後、４５０ｎｍと６００ｎｍとの吸光度を測定した。
７日間培養したプレートを取り出して顕微鏡観察したのち、空ウェル３ウェルへ、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地を２５０μＬずつ添加した（Ｂｌａｎｋ）。各ウェルへ生細胞数測定試薬ＳＦを２０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で３時間インキュベート後、４５０ｎｍと６００ｎｍとの吸光度を測定した。
【0068】
＜４．５．データの整理＿活性化率の算出＞
細胞賦活化作用、すなわち活性化率を実施例１に記載の方法（すなわち、１．５．に記載の方法）で算出した。コントロールの活性化率を１００％として、ポリアミン添加条件の活性化率を図４に示す。
細胞賦活化作用、すなわち活性化率を実施例１に記載の方法（すなわち、１．５．に記載の方法）で算出した。コントロールの活性化率を１００％として、ポリアミン添加条件の活性化率を図４に示す。
【0069】
＜４．６．コメント＞
図４に示すように、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞たるｈＡＤＳＣにおいて、プトレスシンでは、脱水素酵素活性を向上できなかったのに対して、スペルミジンやスペルミンでは、脱水素酵素活性を向上することができた。
図４に示すように、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞たるｈＡＤＳＣにおいて、プトレスシンでは、脱水素酵素活性を向上できなかったのに対して、スペルミジンやスペルミンでは、脱水素酵素活性を向上することができた。
【0070】
＜実施例５＞
＜５．１．使用した細胞や試薬など＞
細胞：ヒト脂肪由来間葉系幹細胞 ｈＡＤＳＣ（継代数：Ｐ１７、１０ｃｍディッシュ、７０％コンフル）
培地：ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ （１ｘ）（ｇｉｂｃｏ）（断り書きがない限り、１０％ＦＣＳ、および１％Ｐ－Ｓ含有）
細胞賦活化測定試薬：生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
＜５．１．使用した細胞や試薬など＞
細胞：ヒト脂肪由来間葉系幹細胞 ｈＡＤＳＣ（継代数：Ｐ１７、１０ｃｍディッシュ、７０％コンフル）
培地：ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ （１ｘ）（ｇｉｂｃｏ）（断り書きがない限り、１０％ＦＣＳ、および１％Ｐ－Ｓ含有）
細胞賦活化測定試薬：生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
【0071】
＜５．２．前培養＞
ｈＡＤＳＣの培養上清をアスピレート除去してＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ添加して細胞をディッシュ底面からはがした。培地を等量添加したのち細胞を５０ｍＬ遠心チューブへ合一し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地適量で懸濁し、細胞計数を行った。細胞計数結果をもとに、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地で４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製し、４８ウェルプレートへ２５０μＬずつ播種（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で一晩培養した。
ｈＡＤＳＣの培養上清をアスピレート除去してＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ添加して細胞をディッシュ底面からはがした。培地を等量添加したのち細胞を５０ｍＬ遠心チューブへ合一し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地適量で懸濁し、細胞計数を行った。細胞計数結果をもとに、１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地で４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製し、４８ウェルプレートへ２５０μＬずつ播種（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で一晩培養した。
【0072】
＜５．３．試料添加および培養＞
５．２．で前培養したプレートをＣＯ２インキュベーターから取り出し、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンをそれぞれ単独で終濃度１０μＭおよび１００μＭとなるように添加（各条件ｎ＝３）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で７日間培養した。ポリアミンを何も添加しない条件をコントロールとした。すなわち、プトレスシンもスペルミジンもスペルミンも添加しない条件をコントロールとした。また、アスコルビン酸を終濃度１００μＭとなるように添加した条件をポジティブコントロールとした。
５．２．で前培養したプレートをＣＯ２インキュベーターから取り出し、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンをそれぞれ単独で終濃度１０μＭおよび１００μＭとなるように添加（各条件ｎ＝３）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で７日間培養した。ポリアミンを何も添加しない条件をコントロールとした。すなわち、プトレスシンもスペルミジンもスペルミンも添加しない条件をコントロールとした。また、アスコルビン酸を終濃度１００μＭとなるように添加した条件をポジティブコントロールとした。
【0073】
＜５．４．脱水素酵素の活性測定、およびＤＮＡアッセイ＞
７日間培養したプレートを取り出して顕微鏡観察したのち、空ウェル３ウェルへ１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地を２５０μＬずつ添加した（Ｂｌａｎｋ）。各ウェルへ生細胞数測定試薬ＳＦを２０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２時間インキュベート後、４５０ｎｍと６００ｎｍとの吸光度を測定した。吸光度の測定後、上清除去し、各ウェル中の細胞数を、実施例３に記載の方法（すなわち、３．５．に記載のＤＮＡアッセイ）により見積もった。
７日間培養したプレートを取り出して顕微鏡観察したのち、空ウェル３ウェルへ１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地を２５０μＬずつ添加した（Ｂｌａｎｋ）。各ウェルへ生細胞数測定試薬ＳＦを２０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２時間インキュベート後、４５０ｎｍと６００ｎｍとの吸光度を測定した。吸光度の測定後、上清除去し、各ウェル中の細胞数を、実施例３に記載の方法（すなわち、３．５．に記載のＤＮＡアッセイ）により見積もった。
【0074】
＜５．５．データの整理＿活性化率、および細胞一つあたりの活性化率の算出＞
まず、細胞賦活化作用、すなわち活性化率を実施例１に記載の方法（すなわち、１．５．に記載の方法）で算出した。コントロールの活性化率を１００％として、ポリアミン添加条件の活性化率やアスコルビン酸添加条件の活性化率を図５Ａに示す。次いで、５．４．より算出した細胞数で活性化率を割り、細胞一つあたりの活性化率を求めた。コントロールの活性化率（すなわち、細胞一つあたりの活性化率）を１００とした指数で、ポリアミン添加条件の活性化率やアスコルビン酸添加条件の活性化率を図５Ｂに示す。なお、指数が大きい程、細胞一つあたりの活性化率が高い。
まず、細胞賦活化作用、すなわち活性化率を実施例１に記載の方法（すなわち、１．５．に記載の方法）で算出した。コントロールの活性化率を１００％として、ポリアミン添加条件の活性化率やアスコルビン酸添加条件の活性化率を図５Ａに示す。次いで、５．４．より算出した細胞数で活性化率を割り、細胞一つあたりの活性化率を求めた。コントロールの活性化率（すなわち、細胞一つあたりの活性化率）を１００とした指数で、ポリアミン添加条件の活性化率やアスコルビン酸添加条件の活性化率を図５Ｂに示す。なお、指数が大きい程、細胞一つあたりの活性化率が高い。
【0075】
＜５．６．コメント＞
図５Ａおよび図５Ｂに示すように、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞たるｈＡＤＳＣにおいて、プトレスシンでは、脱水素酵素活性を向上できなかったのに対して、スペルミジンやスペルミンでは、脱水素酵素活性を向上することができた。また、スペルミジンやスペルミンによって、アスコルビン酸よりも脱水素酵素活性を向上することができた。
図５Ａおよび図５Ｂに示すように、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞たるｈＡＤＳＣにおいて、プトレスシンでは、脱水素酵素活性を向上できなかったのに対して、スペルミジンやスペルミンでは、脱水素酵素活性を向上することができた。また、スペルミジンやスペルミンによって、アスコルビン酸よりも脱水素酵素活性を向上することができた。
【0076】
＜実施例６＞
＜６．１．使用した細胞や試薬など＞
細胞：ヒト脂肪由来間葉系幹細胞 ｈＡＤＳＣ（継代数：Ｐ１６、１０ｃｍディッシュ、７０％コンフル）
培地：ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ （１ｘ）（ｇｉｂｃｏ）（断り書きがない限り、１０％ＦＣＳ、および１％Ｐ－Ｓ含有）
細胞賦活化測定試薬：生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
＜６．１．使用した細胞や試薬など＞
細胞：ヒト脂肪由来間葉系幹細胞 ｈＡＤＳＣ（継代数：Ｐ１６、１０ｃｍディッシュ、７０％コンフル）
培地：ＭＥＭ Ａｌｐｈａ ｂａｓｉｃ （１ｘ）（ｇｉｂｃｏ）（断り書きがない限り、１０％ＦＣＳ、および１％Ｐ－Ｓ含有）
細胞賦活化測定試薬：生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）
【0077】
＜６．２．前培養＞
ｈＡＤＳＣの培養上清をアスピレート除去してＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ添加したうえで、３７℃で３～５分間インキュベートし、細胞をディッシュ底面からはがした。培地を等量添加したのち細胞を５０ｍＬ遠心チューブへ合一し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、培地適量で懸濁し、細胞計数を行った。細胞計数結果をもとに培地で８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製し、４８ウェルプレートへ２５０μＬずつ播種（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で一晩培養した。
ｈＡＤＳＣの培養上清をアスピレート除去してＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を２ｍＬ添加したうえで、３７℃で３～５分間インキュベートし、細胞をディッシュ底面からはがした。培地を等量添加したのち細胞を５０ｍＬ遠心チューブへ合一し、遠心により細胞を回収した。上清除去後、培地適量で懸濁し、細胞計数を行った。細胞計数結果をもとに培地で８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製し、４８ウェルプレートへ２５０μＬずつ播種（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で一晩培養した。
【0078】
＜６．３．試料添加および培養＞
６．２．で前培養したプレートをＣＯ２インキュベーターから取り出し、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンがそれぞれ単独で終濃度１μＭ、１０μＭおよび１００μＭとなるように添加済みの１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地で２５０μＬ／ｗｅｌｌで置換した（各条件ｎ＝３）。その後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で３日間培養した。ポリアミンを何も添加しない条件をコントロールとした。すなわち、プトレスシンもスペルミジンもスペルミンも添加しない条件をコントロールとした。
６．２．で前培養したプレートをＣＯ２インキュベーターから取り出し、プトレスシン、スペルミジン、スペルミンがそれぞれ単独で終濃度１μＭ、１０μＭおよび１００μＭとなるように添加済みの１％ＦＣＳおよび１％Ｐ－Ｓ含有培地で２５０μＬ／ｗｅｌｌで置換した（各条件ｎ＝３）。その後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で３日間培養した。ポリアミンを何も添加しない条件をコントロールとした。すなわち、プトレスシンもスペルミジンもスペルミンも添加しない条件をコントロールとした。
【0079】
＜６．４．活性化率の算出＞
３日間培養したプレートを取り出して上清除去後、１０ｖ／ｖ％ ＷＳＴ－８含有培地に２５０μＬ／ｗｅｌｌで置換した。また、空ウェル３ウェルにも、１０ｖ／ｖ％ ＷＳＴ－８含有培地を２５０μＬずつ添加した（Ｂｌａｎｋ）。このプレートを、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２時間インキュベート後、４５０ｎｍと６００ｎｍとの吸光度を測定した。その結果に基づいて、細胞賦活化作用、すなわち活性化率を実施例１に記載の方法（すなわち、１．５．に記載の方法）で算出した。コントロールの活性化率を１００％として、ポリアミン添加条件の活性化率を図６Ａに示す。
３日間培養したプレートを取り出して上清除去後、１０ｖ／ｖ％ ＷＳＴ－８含有培地に２５０μＬ／ｗｅｌｌで置換した。また、空ウェル３ウェルにも、１０ｖ／ｖ％ ＷＳＴ－８含有培地を２５０μＬずつ添加した（Ｂｌａｎｋ）。このプレートを、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５．０％）内で２時間インキュベート後、４５０ｎｍと６００ｎｍとの吸光度を測定した。その結果に基づいて、細胞賦活化作用、すなわち活性化率を実施例１に記載の方法（すなわち、１．５．に記載の方法）で算出した。コントロールの活性化率を１００％として、ポリアミン添加条件の活性化率を図６Ａに示す。
【0080】
＜６．５．細胞一つあたりの活性化率の算出＞
６．４．で吸光度の測定後、上清除去し、各ウェル中の細胞数を、実施例３に記載の方法（すなわち、３．５．に記載のＤＮＡアッセイ）により見積もった。これにより算出した細胞数で活性化率を割り、細胞一つあたりの活性化率を求めた。コントロールの活性化率（すなわち、細胞一つあたりの活性化率）を１００とした指数で、ポリアミン添加条件の活性化率を図６Ｂに示す。なお、指数が大きい程、細胞一つあたりの活性化率が高い。
６．４．で吸光度の測定後、上清除去し、各ウェル中の細胞数を、実施例３に記載の方法（すなわち、３．５．に記載のＤＮＡアッセイ）により見積もった。これにより算出した細胞数で活性化率を割り、細胞一つあたりの活性化率を求めた。コントロールの活性化率（すなわち、細胞一つあたりの活性化率）を１００とした指数で、ポリアミン添加条件の活性化率を図６Ｂに示す。なお、指数が大きい程、細胞一つあたりの活性化率が高い。
【0081】
【産業上の利用可能性】
【0082】
本発明によれば、間葉系幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、および骨細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種を賦活化することができるため、産業上の利用可能性を有する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
